CN111218504A - hsa-miR-320d作为辐射暴露诊断的分子标志物的用途 - Google Patents

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董娟聪
原雅艺
王婧洁
党旭红
孟倩倩
张忠新
任越
王超
左雅慧
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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，涉及hsa‑miR‑320d作为辐射暴露诊断的分子标志物的用途。利用本发明的hsa‑miR‑320d作为辐射暴露诊断的分子标志物的用途，能够便捷、准确、定量的进行辐射暴露诊断。

Description

hsa-miR-320d作为辐射暴露诊断的分子标志物的用途
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及hsa-miR-320d作为辐射暴露诊断的分子标志物的用途。
背景技术
随着电离辐射技术的发展，从事放射性职业的工作人员日趋增多，电离辐射对放射性工作人员的健康的影响也成为高度关注的热点问题。因此，如何有效进行放射性工作人员健康管理工作，提升他们的职业健康状况成为当前一个重要的研究课题。
对放射工作人员职业健康管理是放射卫生工作的重点之一，其中包括职业健康监护。放射工作人员的健康监护除了进行健康状况的分析和个体工作适任性评价外，还要发现健康的异常变化，尽可能防止疾病发生和发展，促进健康康复。目前对放射工作人员的健康检查除常规体检外，主要为淋巴细胞染色体畸变和微核的分析，但此二项检查也无法检测到辐射诱导的早期损伤。
因此，为了提高健康监护能力，及早发现放射工作人员的健康异常状况，急需研发可用于检测早期辐射损伤的技术，从而为放射工作人员健康保驾护航。
电离辐射对机体的损伤最早会引起机体分子水平的改变，因此从分子水平上选择检测指标能在很大程度上克服现有检测手段的不足。miRNA是一类广泛存在于真核生物中的转录后调节因子，其表达水平受到电离辐射的影响，又调控电离辐射相关的各种基因的表达，进而参与辐射诱导的DNA损伤及修复、细胞周期进程改变、细胞凋亡等一系列辐射所致生物学效应的调控。
此外，人类体液中miRNA耐酸、耐碱，物理性状非常稳定，很适合作为一种生物标志物。hsa-miR-320d与肿瘤的增殖、凋亡、侵袭迁移等相关，在肝癌、前列腺癌、淋巴细胞瘤以及结肠癌等肿瘤的诊断及预测预后方面有报道，但hsa-miR-320d与电离辐射损伤之间的相关研究在国内外未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供hsa-miR-320d作为辐射暴露诊断的分子标志物的用途，以能够便捷、准确、定量的进行辐射暴露诊断。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供hsa-miR-320d作为辐射暴露诊断的分子标志物的用途，所述的hsa-miR-320d的序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种优选的实施方案中，本发明提供hsa-miR-320d作为辐射暴露诊断的分子标志物的用途，其中所述的辐射损伤为局部或全身的组织器官不良反应(如恶心、呕吐、食欲减退、白细胞下降和/或皮肤发红变痒等)。
本发明的有益效果在于，利用本发明的hsa-miR-320d作为辐射暴露诊断的分子标志物的用途，能够便捷、准确、定量的进行辐射暴露诊断。
本发明通过高通量miRNA测序技术筛选辐射差异的miRNA分子，并通过观察电离辐射对其靶基因表达情况的影响，进一步确定辐射敏感的miRNA分子。实验结果表明电离辐射作用后miR-320d表达显著变化，可作为分子标志物用于辐射损伤早期暴露诊断的试剂的制备。
具体实施方式
通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限于如下的实施例。
实施例1：
1、用于辐射损伤诊断的miRNA分子标志物的初步筛选
利用miRNA高通量测序技术，通过检测0.2Gy、2.0Gyγ射线照射后6小时，人外周血中不同miRNA的差异表达，初步筛选用于辐射暴露诊断的miRNA分子标志物。
1)细胞总miRNA的提取、定量、质检和纯化
将人外周血经0.2Gyγ射线照射后6h，采用外周血miRNA提取试剂盒提取miRNA，miRNA样品经琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop进行质检定量。
2)文库的构建
使用每个样品的总RNA制备miRNA测序文库，主要步骤为：3’接头连接；5’接头连接；cDNA合成；PCR扩增；挑选135-155bp的PCR扩增片段(对应15-35nt的小RNA)，用Agilent2100Bioanalyzer进行文库质量测定。
3)测序
混合好的不同样品的测序文库，通过0.1M NaOH变性生成单链DNA，在Illminaflow cell上捕获，原位扩增为簇，并根据供应商说明，在Illumina NextSeq 500测序仪上进行51个循环。
4)数据分析
使用edgeR进行组间miRNAs的差异表达分析，设定阈值为1.5倍差异，p值≤0.05来筛选差异表达的miRNA，差异倍数正值表示上调，负值表示下调。
通过分析可见，与假照组相比，二个剂量组共同差异表达的部分基因的差异倍数与辐射照射剂量存在剂量依赖关系，部分差异基因列于表1。
进一步对差异miRNA的靶基因进行分析，发现hsa-miR-320d在不同剂量作用后，均诱导靶基因的表达显著变化，如表2所示。故选取hsa-miR-320d基因进行进一步PCR验证。
表1存在剂量效应的共同差异表达miRNA
Figure BDA0002371629550000031
表2不同剂量作用后hsa-miR-320d差异靶基因表达情况
Figure BDA0002371629550000032
Figure BDA0002371629550000041
2、PCR验证确认hsa-miR-320d基因作为分子标志物用于辐射早期损伤诊断的可行性
外周血miRNA提取试剂盒提取miRNA，miRNA样品经琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop进行质检定量。按逆转录试剂盒说明书反转录cDNA，取适量辐射照射组和对照组样本cDNA，对hsa-miR-320d差异表达基因进行PCR验证。其引物序列及PCR扩增条件见表3。对其进行进一步PCR验证发现：验证结果与测序结果一致，见表4。
表3 RT-PCR扩增基因的引物序列及扩增条件
Figure BDA0002371629550000042
表4 RT-PCR扩增的相对定量结果
Figure BDA0002371629550000043
上述实验结果表明，经电离辐射作用后，人外周血中hsa-miR-320d的表达水平均较对照组上调，并且随剂量增加，差异倍数增大。因此筛选hsa-miR-320d作为电离辐射暴露早期损伤的分子标志物，作为受照人员健康监护的一项指标。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。
序列表
<110> 中国辐射防护研究院
<120> hsa-miR-320d作为辐射暴露诊断的分子标志物的用途
<130> -
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
aaaagcuggg uugagagga 19
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
aucacauugc cagugauuac cc 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
ugcuggauca gugguucgag uc 22
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
ccucaccacc ccuucugccu gca 23

Claims (2)

1.hsa-miR-320d作为辐射暴露诊断的分子标志物的用途，所述的hsa-miR-320d的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的辐射损伤为局部或全身的组织器官不良反应。
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