TW202128995A - 用於生物樣品和ｒｎａ安定化之組成物、方法及套組 - Google Patents

用於生物樣品和ｒｎａ安定化之組成物、方法及套組 Download PDF

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艾旻 蒙德里
伊能 卓斗
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聖克里斯多福商液態生物檢體研究公司
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Abstract

本揭露提供包含至少一種離液劑、至少一種螯合劑及至少一種非離子界面活性劑之緩衝劑，其中該緩衝劑在約室溫下安定生物樣品至少約一天。

Description

用於生物樣品和ＲＮＡ安定化之組成物、方法及套組
本申請案揭露用於生物樣品和RNA安定化之組成物、方法及套組。 相關申請案
本申請案主張美國臨時申請案號62/913,458 (2019年10月10日提出申請)之優先權及權益，其全文內容以引用方式併入本文。 序列表
本案包含序列表，該序列表業已經由EFS-Web以ASCII格式提出，藉此以參照方式將其整體納入。該ASCII副本(建立於2020年10月6日)被命名為「LBIO-006_SeqList.txt」且檔案大小為約42.1 KB。
已知生物樣品(包括血液樣品及唾液樣品)會隨時間降解。更具體而言，已知在生物樣品內的RNA會隨時間降解，其中當生物樣品係在室溫下長時間儲存或在給定量的時間經受廣泛範圍的溫度時(稱為熱偏移(thermal excursion)或溫度偏移)，降解特別會造成問題。因此，為了保存生物樣品以用於後續診斷、治療及研究方法，需要特殊設備及供應品，包括能夠維持樣品在超低溫度諸如  -80℃下的急速冷凍試劑及冷凍器。另外，亦已知冷凍過程會損害生物樣品及該些樣品中含有的RNA。因此，所屬技術領域中對於用於安定化生物樣品(包括血液樣品及唾液樣品)之替代性組成物、方法及套組存在需求。該等安定化組成物、方法及套組可與多種不同的診斷、治療及研究方法組合使用，該等方法包括但不限於診斷、預後、治療及監測胃腸胰(GEP)神經內分泌腫瘤(GEP-NEN)的方法以及診斷病毒感染諸如SARS-CoV-2感染的方法。
本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.05 M至約4.95 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.09%至約0.11% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度約18 mM至約22 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH低於約4.5。在一些態樣中，安定化緩衝劑可包含：(a)濃度約4.275 M至約4.725 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.095%至約0.105% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度約19 mM至約21 mM之EDTA。在一些態樣中，安定化緩衝劑可包含：(a)濃度約4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.1% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度約20 mM之EDTA。在一些態樣中，安定化緩衝劑的pH可介於約4.05與約4.11之間。
在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑可進一步包含：(d)濃度約72 mM至約88 mM之檸檬酸；及(e)濃度約108 mM至約132 mM之檸檬酸鈉。在一些態樣中，安定化緩衝劑可包含：(d)濃度約76 mM至約84 mM之檸檬酸；及(e)濃度約114 mM至約126 mM之檸檬酸鈉。在一些態樣中，安定化緩衝劑可包含：(d)濃度80 mM之檸檬酸；及(e)濃度120 mM之檸檬酸鈉。
本揭露提供安定化緩衝劑，其中該安定化緩衝劑包含：(a)濃度約4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.1% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度約20 mM之EDTA；(d)濃度80 mM之檸檬酸；及(e)濃度120 mM之檸檬酸鈉，其中該安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。
本揭露提供組成物，其包含下列之混合物：(a)前述安定化緩衝劑中之任一者；及(b)自個體單離之生物樣品。在一些態樣中，生物樣品可包含至少一種RNA轉錄物，其中該至少一種RNA轉錄物的量在該組成物在室溫下經培育至少一天後降低不超過約5%，較佳地其中該至少一種RNA轉錄物的量降低不超過約1%，較佳地其中該至少一種RNA轉錄物的量降低不超過約0.5%。
本揭露提供套組，其包含前述安定化緩衝劑中之任一者。在一些態樣中，安定化緩衝劑可在至少一個樣品收集管中。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可經K2-EDTA預先塗佈。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為6ml、16x100 mm樣品收集管。在一些態樣中，6ml、16x100 mm樣品收集管可經至少約10.8 mg的K2-EDTA預先塗佈。
本揭露提供安定化來自個體之生物樣品之方法，該方法包含使該生物樣品與前述安定化緩衝劑中之任一者接觸，藉此產生經安定化之生物樣品。在一些態樣中，該生物樣品可包含至少一種RNA轉錄物，其中在約室溫下培育該經安定化之生物樣品至少24小時之後所測量之在該經安定化之生物樣品中該至少一種RNA轉錄物的表現水準係在該樣品收集之後不超過1小時所測量之該至少一種RNA轉錄物的表現水準的約5%以內(±5%)、較佳地約1%以內(±1%)、較佳地約0.5%以內(±0.5%)。在一些態樣中，至少一種RNA轉錄物的表現水準可使用定量PCR測量。
本揭露之方法可進一步包含：i)自該經安定化之生物樣品萃取RNA；ii)在該經萃取之RNA中測定至少一種RNA轉錄物的表現水準；及iii)診斷該個體患有疾病及/或病症、向該個體提供治療建議、監測疾病及/或病症在該個體的進展、或基於該至少一種RNA轉錄物的表現水準向該個體投予至少一種治療劑。在一些態樣中，在經萃取之RNA中測定至少一種RNA轉錄物的表現水準可包含使用定量PCR。在一些態樣中，在使用定量PCR之前，該至少一種RNA轉錄物可經反向轉錄以產生cDNA。
疾病或病症可為癌症、胃腸胰(GEP)神經內分泌腫瘤(GEP-NEN)、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、漿細胞惡液質、未知臨床意義的單株球蛋白症(MGUS)、結腸癌、前列腺癌或SARS-CoV-2感染。癌症可為癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤、白血病、腦癌、乳癌、血癌、骨癌、肺癌、皮膚癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、甲狀腺癌、胰臟癌、食道癌、前列腺癌、子宮頸癌或結直腸癌。
生物樣品可包含血液、血漿、血清、尿液、乳汁、腦脊髓液、黏液、胃液、腹膜液、胸膜液、唾液、皮脂、精液、汗液、淚液、陰道分泌物、嘔吐物、內淋巴、周邊淋巴或彼等之任何組合。生物樣品可為血液樣品。血液樣品可為藉由靜脈穿刺獲得之全血樣品。血液樣品可為藉由指尖穿刺獲得之血液樣品。生物樣品可為唾液樣品。
任何上述態樣可與任何其他態樣組合。
除非另行定義，此處所使用之所有技術及科學用語和本揭露所屬技術領域中具有通常知識者所通常瞭解之意義相同。在本說明書中，單數形式亦包括複數形，除非上下文另外清楚地說明；舉例來說，用語「一(a, an)」及「該(the)」被理解為單數或複數且用語「或(or)」被理解為包括性。舉例來說，「一元件」係指一或多個元件。在本說明書中，用語「含(comprising)」或變化形諸如「包含(comprises)」或「含有(comprising)」將被理解為意指包括被敘述之元件、整數或步驟或元件、整數或步驟之群，但不排除任何其他元件、整數或步驟或元件、整數或步驟之群。約可理解為在所述數值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%以內。除非自上下文清楚可見，否則在本文中提供之所有數值皆經用語「約」修飾。
雖然與此處所描述之方法及材料類似或相等者可被用於實施或測試本揭露，以下描述適當之方法及材料。所有此處所提及之公開資料、專利申請案、專利及其他參考文獻係以參照方式被整體納入。此處之引證文獻並不被承認為本申請專利之發明的現有技術。若發生衝突，以本說明書(包括定義)為主。此外，該等材料、方法及實施態樣僅用來示例而非意圖限制。本揭露之其他特徵及優點將可自以下之詳細說明及申請專利範圍中顯見。
詳細說明
本揭露之各種組成物、套組及方法係在本文中詳細描述。
組成物
本揭露提供包含至少一種離液劑、至少一種螯合劑及至少一種非離子界面活性劑之緩衝劑，其中該緩衝劑在約室溫下安定生物樣品至少約一天。如本文中所使用，此緩衝劑可稱為「安定化緩衝劑(stabilization buffer)」。
在一些態樣中，至少一種離液劑可為胍鹽酸鹽。在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以至少約4.5 M之濃度存在。在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以至少約0.5 M、或至少約1.0 M、或至少約1.5 M、或至少約2.0 M、或至少約2.5 M、或至少約3.0 M、或至少約3.5 M、或至少約4.0 M、或至少約4.5 M、或至少約5.0 M、或至少約5.5 M、或至少約6.0 M、或至少約6.5 M之濃度存在。
在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以至少4.5 M之濃度存在。在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以至少0.5 M、或至少1.0 M、或至少1.5 M、或至少2.0 M、或至少2.5 M、或至少3.0 M、或至少3.5 M、或至少4.0 M、或至少4.5 M、或至少5.0 M、或至少5.5 M、或至少6.0 M、或至少6.5 M之濃度存在。
在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以約4.5 M之濃度存在。在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以4.5 M之濃度存在。
在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以約3.6 M至約5.4 M之濃度存在。在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以約4.05 M至約4.95 M之濃度存在。在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以約4.275 M至約4.725 M之濃度存在。
在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以3.6 M至5.4 M之濃度存在。在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以4.05 M至4.95 M之濃度存在。在一些態樣中，胍鹽酸鹽可以4.275 M至4.725 M之濃度存在。
在一些態樣中，至少一種非離子界面活性劑可為Triton X-100。在一些態樣中，Triton X-100可以至少約0.1%(體積/體積；v/v)之濃度存在。在一些態樣中，Triton X-100可以至少約0.1% (v/v)、或至少約0.2% (v/v)、或至少約0.3% (v/v)、或至少約0.4% (v/v)、或至少約0.5% (v/v)、或至少約0.6% (v/v)、或至少約0.7% (v/v)、或至少約0.8% (v/v)、或至少約0.9% (v/v)、或至少約1.0% (v/v)、或至少約1.5% (v/v)、或至少約2.0% (v/v)、或至少約2.5% (v/v)、或至少約3.0% (v/v)、或至少約3.5% (v/v)、或至少約4.0% (v/v)、或至少約4.5% (v/v)、或至少約5.0% (v/v)、或至少約5.5% (v/v)、或至少約6.0% (v/v)、或至少約6.5% (v/v)、或至少約7.0% (v/v)、或至少約7.5% (v/v)、或至少約8.0% (v/v)、或至少約8.5% (v/v)、或至少約9.0% (v/v)、或至少約9.5% (v/v)、或至少約10% (v/v)之濃度存在。
在一些態樣中，Triton X-100可以至少0.1% (v/v)之濃度存在。在一些態樣中，Triton X-100可以至少0.1% (v/v)、或至少0.2% (v/v)、或至少0.3% (v/v)、或至少0.4% (v/v)、或至少0.5% (v/v)、或至少0.6% (v/v)、或至少0.7% (v/v)、或至少0.8% (v/v)、或至少0.9% (v/v)、或至少1.0% (v/v)、或至少1.5% (v/v)、或至少2.0% (v/v)、或至少2.5% (v/v)、或至少3.0% (v/v)、或至少3.5% (v/v)、或至少4.0% (v/v)、或至少4.5% (v/v)、或至少5.0% (v/v)、或至少5.5% (v/v)、或至少6.0% (v/v)、或至少6.5% (v/v)、或至少7.0% (v/v)、或至少7.5% (v/v)、或至少8.0% (v/v)、或至少8.5% (v/v)、或至少9.0% (v/v)、或至少9.5% (v/v)、或至少10% (v/v)之濃度存在。
在一些態樣中，Triton X-100可以約0.1% (v/v)之濃度存在。在一些態樣中，Triton X-100可以0.1% (v/v)之濃度存在。
在一些態樣中，Triton X-100可以約0.08%至約0.12% (v/v)之濃度存在。在一些態樣中，Triton X-100可以約0.09%至約0.11% (v/v)之濃度存在。在一些態樣中，Triton X-100可以約0.095%至約0.105% (v/v)之濃度存在。
在一些態樣中，Triton X-100可以0.08%至0.12% (v/v)之濃度存在。在一些態樣中，Triton X-100可以0.09%至0.11% (v/v)之濃度存在。在一些態樣中，Triton X-100可以0.095%至0.105% (v/v)之濃度存在。
在一些態樣中，至少一種螯合劑可為伸乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些態樣中，EDTA可以至少約20 mM之濃度存在。在一些態樣中，EDTA可以至少約10 mM、或至少約15 mM、或至少約20 mM、或至少約25 mM、或至少約30 mM、或至少約35 mM、或至少約40 mM、或至少約45 mM、或至少約50 mM、或至少約55 mM、或至少約60 mM、或至少約65 mM、或至少約70 mM、或至少約75 mM、或至少約80 mM、或至少約85 mM、或至少約90 mM、或至少約95 mM、或至少約100 mM之濃度存在。
在一些態樣中，EDTA可以至少20 mM之濃度存在。在一些態樣中，EDTA可以至少10 mM、或至少15 mM、或至少20 mM、或至少25 mM、或至少30 mM、或至少35 mM、或至少40 mM、或至少45 mM、或至少50 mM、或至少55 mM、或至少60 mM、或至少65 mM、或至少70 mM、或至少75 mM、或至少80 mM、或至少85 mM、或至少90 mM、或至少95 mM、或至少100 mM之濃度存在。
在一些態樣中，EDTA可以約20 mM之濃度存在。在一些態樣中，EDTA可以20 mM之濃度存在。
在一些態樣中，EDTA可以約16 mM至約24 mM之濃度存在。在一些態樣中，EDTA可以約18 mM至約22 mM之濃度存在。在一些態樣中，EDTA可以約19 mM至約21 mM之濃度存在。
在一些態樣中，EDTA可以16 mM至24 mM之濃度存在。在一些態樣中，EDTA可以18 mM至22 mM之濃度存在。在一些態樣中，EDTA可以19 mM至21 mM之濃度存在。
在一些態樣中，本揭露之緩衝劑可為酸性。在一些態樣中，本揭露之緩衝劑可具有酸性pH。在一些態樣中，緩衝劑的pH可低於約4.5。在一些態樣中，緩衝劑的pH可介於約4.05與約4.11之間。在一些態樣中，緩衝劑的pH可介於約3.2與約4.9之間。在一些態樣中，緩衝劑的pH可介於約3.7與約4.5之間。在一些態樣中，緩衝劑的pH可介於約3.9與約4.3之間。在一些態樣中，緩衝劑的pH可介於4.05與4.11之間。在一些態樣中，緩衝劑的pH可介於3.2與4.9之間。在一些態樣中，緩衝劑的pH可介於3.7與4.5之間。在一些態樣中，緩衝劑的pH可介於3.9與4.3之間。
在一些態樣中，緩衝劑的pH可為約4.08。在一些態樣中，緩衝劑的pH可為4.08。
在一些態樣中，本揭露之緩衝劑可包含檸檬酸鈉。檸檬酸鈉可以至少約120 mM之濃度存在。在一些態樣中，檸檬酸鈉可以至少約80 mM、或至少約90 mM、或至少約100 mM、或至少約110 mM、或至少約120 mM、或至少約130 mM、或至少約140 mM、或至少約150 mM、或至少約160 mM之濃度存在。
檸檬酸鈉可以至少120 mM之濃度存在。在一些態樣中，檸檬酸鈉可以至少80 mM、或至少90 mM、或至少100 mM、或至少110 mM、或至少120 mM、或至少130 mM、或至少140 mM、或至少150 mM、或至少160 mM之濃度存在。
檸檬酸鈉可以約120 mM之濃度存在。檸檬酸鈉可以120 mM之濃度存在。
在一些態樣中，檸檬酸鈉可以約96 mM至約144 mM之濃度存在。在一些態樣中，檸檬酸鈉可以約108 mM至約132 mM之濃度存在。在一些態樣中，檸檬酸鈉可以約114 mM至約126 mM之濃度存在。
在一些態樣中，檸檬酸鈉可以96 mM至144 mM之濃度存在。在一些態樣中，檸檬酸鈉可以108 mM至132 mM之濃度存在。在一些態樣中，檸檬酸鈉可以114 mM至126 mM之濃度存在。
在一些態樣中，本揭露之緩衝劑可包含檸檬酸。檸檬酸可以至少約80 mM之濃度存在。在一些態樣中，檸檬酸可以至少約40 mM、或至少約50 mM、或至少約60 mM、或至少約70 mM、或至少約80 mM、或至少約90 mM、或至少約100 mM、或至少約110 mM、或至少約120 mM之濃度存在。
在一些態樣中，檸檬酸可以至少40 mM、或至少50 mM、或至少60 mM、或至少70 mM、或至少80 mM、或至少90 mM、或至少100 mM、或至少110 mM、或至少120 mM之濃度存在。
檸檬酸可以約80 mM之濃度存在。檸檬酸可以80 mM之濃度存在。
在一些態樣中，檸檬酸可以約64 mM至約96 mM之濃度存在。在一些態樣中，檸檬酸可以約72 mM至約88 mM之濃度存在。在一些態樣中，檸檬酸可以約76 mM至約84 mM之濃度存在。
在一些態樣中，檸檬酸可以64 mM至96 mM之濃度存在。在一些態樣中，檸檬酸可以72 mM至88 mM之濃度存在。在一些態樣中，檸檬酸可以76 mM至84 mM之濃度存在。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度至少約4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度至少約0.1% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度至少約20 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH低於約4.5。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.1% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度約20 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH低於約4.5。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.1% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度20 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH低於4.5。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度至少約4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度至少約0.1% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度至少約20 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.1% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度約20 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.1% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度20 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH係介於4.05與4.11之間。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約3.6 M至約5.4 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.08%至約0.12% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度約16 mM至約24 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH低於約4.5。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.05 M至約4.95 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.09%至約0.11% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度約18 mM至約22 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH低於約4.5。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.275 M至約4.725 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.095%至約0.105% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度約19 mM至約21 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH低於約4.5。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約3.6 M至約5.4 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.08%至約0.12% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度約16 mM至約24 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.05 M至約4.95 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.09%至約0.11% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度約18 mM至約22 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.275 M至約4.725 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.095%至約0.105% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度約19 mM至約21 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度3.6 M至5.4 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.08%至0.12% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度16 mM至24 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH低於4.5。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.05 M至4.95 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.09%至0.11% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度18 mM至22 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH低於4.5。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.275 M至4.725 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.095%至0.105% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度19 mM至21 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH低於4.5。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度3.6 M至5.4 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.08%至0.12% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度16 mM至24 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH係介於4.05與4.11之間。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.05 M至4.95 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.09%至0.11% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度18 mM至22 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH係介於4.05與4.11之間。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.275 M至4.725 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.095%至0.105% (v/v)之Triton X-100；及(c)濃度19 mM至21 mM之EDTA，其中安定化緩衝劑的pH係介於4.05與4.11之間。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度至少約4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度至少約0.1% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度至少約20 mM之EDTA；(d)濃度至少約80 mM之檸檬酸；及(e)濃度至少約120 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH低於約4.5。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.1% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度約20 mM之EDTA；(d)濃度約80 mM之檸檬酸；及(e)濃度約120 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH低於約4.5。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.1% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度20 mM之EDTA；(d)濃度80 mM之檸檬酸；及(e)濃度120 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH低於4.5。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度至少約4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度至少約0.1% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度至少約20 mM之EDTA；(d)濃度至少約80 mM之檸檬酸；及(e)濃度至少約120 mM之檸檬酸鈉，其中緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.1% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度約20 mM之EDTA；(d)濃度約80 mM之檸檬酸；及(e)濃度約120 mM之檸檬酸鈉，其中緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.5 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.1% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度20 mM之EDTA；(d)濃度80 mM之檸檬酸；及(e)濃度120 mM之檸檬酸鈉，其中緩衝劑的pH係介於4.05與4.11之間。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約3.6 M至約5.4 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.08%至約0.12% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度約16 mM至約24 mM之EDTA；(d)濃度約64 mM至約96 mM之檸檬酸；及(e)濃度約96 mM至約144 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH低於約4.5。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.05 M至約4.95 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.09%至約0.11% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度約18 mM至約22 mM之EDTA；(d)濃度約72 mM至約88 mM之檸檬酸；及(e)濃度約108 mM至約132 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH低於約4.5。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.275 M至約4.725 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.095%至約0.105% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度約19 mM至約21 mM之EDTA；及(d)濃度約76 mM至約84 mM之檸檬酸；及(e)濃度約114 mM至約126 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH低於約4.5。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約3.6 M至約5.4 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.08%至約0.12% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度約16 mM至約24 mM之EDTA；(d)濃度約64 mM至約96 mM之檸檬酸；及(e)濃度約96 mM至約144 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.05 M至約4.95 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.09%至約0.11% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度約18 mM至約22 mM之EDTA；(d)濃度約72 mM至約88 mM之檸檬酸；及(e)濃度約108 mM至約132 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度約4.275 M至約4.725 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度約0.095%至約0.105% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度約19 mM至約21 mM之EDTA；及(d)濃度約76 mM至約84 mM之檸檬酸；及(e)濃度約114 mM至約126 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度3.6 M至5.4 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.08%至0.12% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度16 mM至24 mM之EDTA；(d)濃度64 mM至96 mM之檸檬酸；及(e)濃度96 mM至144 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH低於4.5。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.05 M至4.95 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.09%至0.11% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度18 mM至22 mM之EDTA；(d)濃度72 mM至88 mM之檸檬酸；及(e)濃度108 mM至132 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH低於4.5。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.275 M至4.725 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.095%至0.105% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度19 mM至21 mM之EDTA；及(d)濃度76 mM至84 mM之檸檬酸；及(e)濃度114 mM至126 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH低於4.5。
在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度3.6 M至5.4 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.08%至0.12% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度16 mM至24 mM之EDTA；(d)濃度64 mM至96 mM之檸檬酸；及(e)濃度96 mM至144 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH係介於4.05與4.11之間。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.05 M至4.95 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.09%至0.11% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度18 mM至22 mM之EDTA；(d)濃度72 mM至88 mM之檸檬酸；及(e)濃度108 mM至132 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH係介於4.05與4.11之間。在一些態樣中，本揭露提供安定化緩衝劑，其包含：(a)濃度4.275 M至4.725 M之胍鹽酸鹽；(b)濃度0.095%至0.105% (v/v)之Triton X-100；(c)濃度19 mM至21 mM之EDTA；及(d)濃度76 mM至84 mM之檸檬酸；及(e)濃度114 mM至126 mM之檸檬酸鈉，其中安定化緩衝劑的pH係介於4.05與4.11之間。
方法
本揭露提供安定化來自個體之生物樣品之方法，該方法包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之生物樣品。
本揭露提供安定化來自個體之生物樣品之方法，該方法包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之生物樣品，以使該經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後，該經安定化之生物樣品中至少一種RNA轉錄物的量降低不超過約0.1%、或不超過約0.5%、或不超過約1%、或不超過約2.5%、或不超過約5%、或不超過約10%。在一些態樣中，給定時間期間可為約24小時、或約48小時、或約72小時、或約4天、或約5天、或約6天、或約7天、或約8天、或約9天、或約10天、或約11天、或約12天、或約13天、或約14天、或約15天、或約16天、或約17天、或約18天、或約19天、或約20天、或約21天、或約22天、或約23天、或約24天、或約25天、或約26天、或約27天、或約28天、或約29天或約30天。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為約如本文中定義之室溫。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-10℃至18℃範圍內之任何溫度。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-22℃至40℃範圍內之任何溫度。
安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在該經安定化之生物樣品內之RNA的降解。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下經過給定時間期間之該RNA的降解，相較於在相同溫度下經過相同時間期間之未與安定化緩衝劑接觸之對應生物樣品中的RNA降解，降低至少約10%、或至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99.5%或至少約100%。在一些態樣中，給定時間期間可為約24小時、或約48小時、或約72小時、或約4天、或約5天、或約6天、或約7天、或約8天、或約9天、或約10天、或約11天、或約12天、或約13天、或約14天、或約15天、或約16天、或約17天、或約18天、或約19天、或約20天、或約21天、或約22天、或約23天、或約24天、或約25天、或約26天、或約27天、或約28天、或約29天或約30天。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為約如本文中定義之室溫。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-10℃至18℃範圍內之任何溫度。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-22℃至40℃範圍內之任何溫度。
安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在該經安定化之生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過1小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約10%以內(±10%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在該經安定化之生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過1小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約5%以內(±5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在該經安定化之生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過1小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約2.5%以內(±2.5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過1小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約1%以內(±1%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在經安定化之生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過1小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約0.5%以內(±0.5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在經安定化之生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過1小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約0.1%以內(±0.1%)。在一些態樣中，給定時間期間可為約24小時、或約48小時、或約72小時、或約4天、或約5天、或約6天、或約7天、或約8天、或約9天、或約10天、或約11天、或約12天、或約13天、或約14天、或約15天、或約16天、或約17天、或約18天、或約19天、或約20天、或約21天、或約22天、或約23天、或約24天、或約25天、或約26天、或約27天、或約28天、或約29天或約30天。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為約如本文中定義之室溫。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-10℃至18℃範圍內之任何溫度。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-22℃至40℃範圍內之任何溫度。
安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在經安定化之生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過12小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約10%以內(±10%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在經安定化之生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過12小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約5%以內(±5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在經安定化之生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過12小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約2.5%以內(±2.5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過12小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約1%以內(±1%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在經安定化之生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過12小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約0.5%以內(±0.5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在生物樣品內之RNA的降解，以使在給定溫度或溫度範圍下培育經安定化之生物樣品達給定時間期間之後所測量之在經安定化之生物樣品中至少一種RNA轉錄物的表現水準係在樣品收集之後不超過12小時所測量之至少一種RNA轉錄物的表現水準的約0.1%以內(±0.1%)。在一些態樣中，給定時間期間可為約24小時、或約48小時、或約72小時、或約4天、或約5天、或約6天、或約7天、或約8天、或約9天、或約10天、或約11天、或約12天、或約13天、或約14天、或約15天、或約16天、或約17天、或約18天、或約19天、或約20天、或約21天、或約22天、或約23天、或約24天、或約25天、或約26天、或約27天、或約28天、或約29天或約30天。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為約如本文中定義之室溫。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-10℃至18℃範圍內之任何溫度。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-22℃至40℃範圍內之任何溫度。
在一些態樣中，至少一種RNA轉錄物的表現水準係使用定量PCR測量。
安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過1小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約10%以內(±10%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過1小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約5%以內(±5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過1小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約2.5%以內(±2.5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過1小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約1%以內(±1%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過1小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約0.5%以內(±0.5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過1小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約0.1%以內(±0.1%)。在一些態樣中，給定時間期間可為約24小時、或約48小時、或約72小時、或約4天、或約5天、或約6天、或約7天、或約8天、或約9天、或約10天、或約11天、或約12天、或約13天、或約14天、或約15天、或約16天、或約17天、或約18天、或約19天、或約20天、或約21天、或約22天、或約23天、或約24天、或約25天、或約26天、或約27天、或約28天、或約29天或約30天。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為約如本文中定義之室溫。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-10℃至18℃範圍內之任何溫度。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-22℃至40℃範圍內之任何溫度。
安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過12小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約10%以內(±10%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過12小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約5%以內(±5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過12小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約2.5%以內(±2.5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過12小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約1%以內(±1%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過12小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約0.5%以內(±0.5%)。安定化生物樣品可包含使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸，以使安定化緩衝劑防止在經安定化之生物樣品內之RNA的降解，以使經安定化之生物樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後自經安定化之生物樣品萃取之RNA的RNA完整數(RIN)係在樣品收集之後不超過12小時自生物樣品萃取之RNA的RIN的約0.1%以內(±0.1%)。在一些態樣中，給定時間期間可為約24小時、或約48小時、或約72小時、或約4天、或約5天、或約6天、或約7天、或約8天、或約9天、或約10天、或約11天、或約12天、或約13天、或約14天、或約15天、或約16天、或約17天、或約18天、或約19天、或約20天、或約21天、或約22天、或約23天、或約24天、或約25天、或約26天、或約27天、或約28天、或約29天或約30天。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為約如本文中定義之室溫。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-10℃至18℃範圍內之任何溫度。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-22℃至40℃範圍內之任何溫度。
RIN值可使用所屬技術領域中標準的方法及技術計算，如所屬技術領域中具有通常知識者所將理解。
在一些態樣中，生物樣品可為血液樣品。在一些態樣中，血液樣品可為靜脈穿刺血液樣品。在一些態樣中，血液樣品可為指尖穿刺血液樣品。在一些態樣中，生物樣品可為唾液樣品。在一些態樣中，樣品可為鼻咽拭子樣品。在一些態樣中，生物樣品可為體液樣品。體液樣品可包含血液、血漿、血清、尿液、乳汁、腦脊髓液、黏液、胃液、腹膜液、胸膜液、唾液、皮脂、精液、汗液、淚液、陰道分泌物、嘔吐物、內淋巴、周邊淋巴或彼等之任何組合。
本揭露提供安定化來自個體之血液樣品之方法，該方法包含使血液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之血液樣品。
本揭露提供安定化來自個體之血液樣品之方法，該方法包含使血液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之血液樣品，以使該經安定化之血液樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後，該經安定化之血液樣品中至少一種RNA轉錄物的量降低不超過約0.1%、或不超過約0.5%、或不超過約1%、或不超過約2.5%、或不超過約5%、或不超過約10%。在一些態樣中，給定時間期間可為約24小時、或約48小時、或約72小時、或約4天、或約5天、或約6天、或約7天、或約8天、或約9天、或約10天、或約11天、或約12天、或約13天、或約14天、或約15天、或約16天、或約17天、或約18天、或約19天、或約20天、或約21天、或約22天、或約23天、或約24天、或約25天、或約26天、或約27天、或約28天、或約29天或約30天。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為約如本文中定義之室溫。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-10℃至18℃範圍內之任何溫度。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-22℃至40℃範圍內之任何溫度。
本揭露提供安定化來自個體之唾液樣品之方法，該方法包含使唾液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之唾液樣品，以使該經安定化之唾液樣品在給定溫度或溫度範圍下培育達給定時間期間之後，該經安定化之唾液樣品中至少一種RNA轉錄物的量降低不超過約0.1%、或不超過約0.5%、或不超過約1%、或不超過約2.5%、或不超過約5%、或不超過約10%。在一些態樣中，給定時間期間可為約24小時、或約48小時、或約72小時、或約4天、或約5天、或約6天、或約7天、或約8天、或約9天、或約10天、或約11天、或約12天、或約13天、或約14天、或約15天、或約16天、或約17天、或約18天、或約19天、或約20天、或約21天、或約22天、或約23天、或約24天、或約25天、或約26天、或約27天、或約28天、或約29天或約30天。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為約如本文中定義之室溫。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-10℃至18℃範圍內之任何溫度。在一些態樣中，給定溫度或溫度範圍可為在-22℃至40℃範圍內之任何溫度。
本揭露提供安定化來自個體之唾液樣品之方法，該方法包含使唾液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之唾液樣品。
本揭露提供安定化來自個體之血液樣品之方法，該方法包含使血液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之血液樣品。在一些態樣中，安定化緩衝劑與血液樣品可經接觸以使緩衝劑之體積對血液樣品之體積的比例係至少約2比1。在一些態樣中，安定化緩衝劑與血液樣品可經接觸以使緩衝劑之體積對血液樣品之體積的比例係至少約4比1。在一些態樣中，安定化緩衝劑與血液樣品可經接觸以使緩衝劑之體積對血液樣品之體積的比例係介於約2比1與約4比1之間。在一些態樣中，血液樣品之體積可為至少約35 µl、或至少約50 µl、或至少約70 µl。在一些態樣中，安定化緩衝劑之體積可為至少約100 µl、或至少約140 µl、或至少約200 µl。
在一些態樣中，生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑可在至少一個樣品收集管中接觸，該至少一個樣品收集管係經K2-EDTA預先塗佈。在一些態樣中，生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑可在至少一個樣品收集管中接觸，該至少一個樣品收集管係經K3-EDTA預先塗佈。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可經至少約10.8 mg的K2-EDTA預先塗佈。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可經至少約1 mg、或至少約2 mg、或至少約3 mg、或至少約4 mg、或至少約5 mg、或至少約6 mg、或至少約7 mg、或至少約8 mg、或至少約9 mg、或至少約10 mg、或至少約11 mg、或至少約12 mg、或至少約13 mg、或至少約14 mg、或至少約15 mg、或至少約16 mg、或至少約17 mg、或至少約18 mg、或至少約19 mg、或至少約20 mg的K2-EDTA預先塗佈。
在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為6ml、16x100 mm樣品收集管。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為經K2-EDTA預先塗佈之6ml、16x100 mm樣品收集管。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為經至少約10.8 mg的K2-EDTA預先塗佈之6ml、16x100 mm樣品收集管。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為經至少約1 mg、或至少約2 mg、或至少約3 mg、或至少約4 mg、或至少約5 mg、或至少約6 mg、或至少約7 mg、或至少約8 mg、或至少約9 mg、或至少約10 mg、或至少約11 mg、或至少約12 mg、或至少約13 mg、或至少約14 mg、或至少約15 mg、或至少約16 mg、或至少約17 mg、或至少約18 mg、或至少約19 mg、或至少約20 mg的K2-EDTA預先塗佈之6ml、16x100 mm樣品收集管。
在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為塑膠材質。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為玻璃材質。
在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與生物樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對生物樣品之體積的比例係至少約2比1。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與生物樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對生物樣品之體積的比例係至少約4比1。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與生物樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對生物樣品之體積的比例係至少約2.2比1、或至少約2.4比1、或至少約2.6比1、或至少約2.8比1、或至少約3.0比1、或至少約3.2比1、或至少約3.4比1、或至少約3.6比1、或至少約3.8比1、或至少約4.0比1、或至少約4.2比1、或至少約4.4比1、或至少約4.6比1、或至少約4.8比1、或至少約5.0比1。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與生物樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對生物樣品之體積的比例係介於約2比1與約4比1之間。
在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與血液樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對血液樣品之體積的比例係至少約2比1。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與血液樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對血液樣品之體積的比例係至少約4比1。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與血液樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對血液樣品之體積的比例係至少約2.2比1、或至少約2.4比1、或至少約2.6比1、或至少約2.8比1、或至少約3.0比1、或至少約3.2比1、或至少約3.4比1、或至少約3.6比1、或至少約3.8比1、或至少約4.0比1、或至少約4.2比1、或至少約4.4比1、或至少約4.6比1、或至少約4.8比1、或至少約5.0比1。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與血液樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對血液樣品之體積的比例係介於約2比1與約4比1之間。
在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與唾液樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對唾液樣品之體積的比例係至少約2比1。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與唾液樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對唾液樣品之體積的比例係至少約4比1。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與唾液樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對唾液樣品之體積的比例係至少約2.2比1、或至少約2.4比1、或至少約2.6比1、或至少約2.8比1、或至少約3.0比1、或至少約3.2比1、或至少約3.4比1、或至少約3.6比1、或至少約3.8比1、或至少約4.0比1、或至少約4.2比1、或至少約4.4比1、或至少約4.6比1、或至少約4.8比1、或至少約5.0比1。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑與唾液樣品可經接觸以使安定化緩衝劑之體積對唾液樣品之體積的比例係介於約2比1與約4比1之間。
在一些態樣中，生物樣品之體積可為至少約35 µl。在一些態樣中，生物樣品之體積可為至少約50 µl。在一些態樣中，生物樣品之體積可為至少約2 ml。在一些態樣中，生物樣品之體積可為至少約10 µl、或至少約15 µl、或至少約20 µl、或至少約25 µl、或至少約30 µl、或至少約35 µl、或至少約40 µl、或至少約45 µl、或至少約50 µl、或至少約55 µl、或至少約60 µl、或至少約65 µl、或至少約70 µl、或至少約75 µl、或至少約80 µl、或至少約85 µl、或至少約90 µl、或至少約95 µl、或至少約100 µl、或至少約105 µl、或至少約110 µl、或至少約120 µl、或至少約130 µl、或至少約140 µl、或至少約150 µl、或至少約200 µl、或至少約500 µl、或至少約1 ml、或至少約1.5 ml、或至少約2 ml、或至少約2.5 ml、或至少約3 ml、或至少約3.5 ml、或至少約4 ml、或至少約4.5 ml、或至少約5 ml、或至少約6 ml、或至少約7 ml、或至少約8 ml、或至少約9 ml、或至少約10 ml。
在一些態樣中，血液樣品之體積可為至少約35 µl。在一些態樣中，血液樣品之體積可為至少約50 µl。在一些態樣中，血液樣品之體積可為至少約2 ml。在一些態樣中，血液樣品之體積可為至少約10 µl、或至少約15 µl、或至少約20 µl、或至少約25 µl、或至少約30 µl、或至少約35 µl、或至少約40 µl、或至少約45 µl、或至少約50 µl、或至少約55 µl、或至少約60 µl、或至少約65 µl、或至少約70 µl、或至少約75 µl、或至少約80 µl、或至少約85 µl、或至少約90 µl、或至少約95 µl、或至少約100 µl、或至少約105 µl、或至少約110 µl、或至少約120 µl、或至少約130 µl、或至少約140 µl、或至少約150 µl、或至少約200 µl、或至少約500 µl、或至少約1 ml、或至少約1.5 ml、或至少約2 ml、或至少約2.5 ml、或至少約3 ml、或至少約3.5 ml、或至少約4 ml、或至少約4.5 ml、或至少約5 ml、或至少約6 ml、或至少約7 ml、或至少約8 ml、或至少約9 ml、或至少約10 ml。
在一些態樣中，唾液樣品之體積可為至少約35 µl。在一些態樣中，唾液樣品之體積可為至少約50 µl。在一些態樣中，唾液樣品之體積可為至少約2 ml。在一些態樣中，唾液樣品之體積可為至少約10 µl、或至少約15 µl、或至少約20 µl、或至少約25 µl、或至少約30 µl、或至少約35 µl、或至少約40 µl、或至少約45 µl、或至少約50 µl、或至少約55 µl、或至少約60 µl、或至少約65 µl、或至少約70 µl、或至少約75 µl、或至少約80 µl、或至少約85 µl、或至少約90 µl、或至少約95 µl、或至少約100 µl、或至少約105 µl、或至少約110 µl、或至少約120 µl、或至少約130 µl、或至少約140 µl、或至少約150 µl、或至少約200 µl、或至少約500 µl、或至少約1 ml、或至少約1.5 ml、或至少約2 ml、或至少約2.5 ml、或至少約3 ml、或至少約3.5 ml、或至少約4 ml、或至少約4.5 ml、或至少約5 ml、或至少約6 ml、或至少約7 ml、或至少約8 ml、或至少約9 ml、或至少約10 ml。
在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑的體積可為至少約70 µl。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑的體積可為至少約100 µl。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑的體積可為至少約140 µl。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑的體積可為至少約200 µl。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑的體積可為至少約4 ml。在一些態樣中，本揭露之安定化緩衝劑的體積可為至少約10 µl、或至少約15 µl、或至少約20 µl、或至少約25 µl、或至少約30 µl、或至少約35 µl、或至少約40 µl、或至少約45 µl、或至少約50 µl、或至少約55 µl、或至少約60 µl、或至少約65 µl、或至少約70 µl、或至少約75 µl、或至少約80 µl、或至少約85 µl、或至少約90 µl、或至少約95 µl、或至少約100 µl、或至少約105 µl、或至少約110 µl、或至少約120 µl、或至少約130 µl、或至少約140 µl、或至少約150 µl、或至少約160 µl、或至少約170 µl、或至少約180 µl、或至少約190 µl、或至少約200 µl、或至少約500 µl、或至少約1 ml、或至少約1.5 ml、或至少約2 ml、或至少約2.5 ml、或至少約3 ml、或至少約3.5 ml、或至少約4 ml、或至少約4.5 ml、或至少約5 ml、或至少約5.5 ml、或至少約6.0 ml、或至少約6.5 ml、或至少約7.0 ml、或至少約7.5 ml、或至少約8.0 ml、或至少約8.5 ml、或至少約9 ml、或至少約9.5 ml、或至少約10 ml。
在本揭露之方法的一些態樣中，在使生物樣品(例如，血液樣品或唾液樣品)與安定化緩衝劑接觸之後，所得混合物係儲存在約室溫下至少約一天。在本揭露之方法的一些態樣中，在使生物樣品(例如，血液樣品或唾液樣品)與安定化緩衝劑接觸之後，所得混合物係儲存在約室溫下至少約一天、或至少約二天、或至少約三天、或至少約四天、或至少約五天、或至少約六天、或至少約七天、或至少約八天、或至少約九天、或至少約十天、或至少約11天、或至少約12天、或至少約13天、或至少約14天。在一些態樣中，在使生物樣品(例如，血液樣品或唾液樣品)與安定化緩衝劑接觸之後，所得混合物係儲存在約室溫下至少約一週、或至少約二週、或至少約三週。
在一些態樣中，室溫係約22℃。在一些態樣中，室溫可為約21℃至約28℃。在一些態樣中，室溫可為約20℃至約30℃。在一些態樣中，室溫可為約至少20℃、或至少約21℃、或至少約22℃、或至少約23℃、或至少約24℃、或至少約25℃、或至少約26℃、或至少約27℃、或至少約28℃、或至少約29℃、或至少約30℃。
本揭露提供方法，該方法包含：藉由使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之生物樣品來安定化來自個體之生物樣品；及自經安定化之生物樣品萃取核酸。本揭露提供方法，該方法包含：藉由使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之生物樣品來安定化來自個體之生物樣品；及自經安定化之生物樣品萃取RNA。本揭露提供方法，該方法包含：藉由使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之生物樣品來安定化來自個體之生物樣品；及自經安定化之生物樣品萃取DNA。本揭露提供方法，該方法包含：藉由使生物樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之生物樣品來安定化來自個體之生物樣品；及自經安定化之生物樣品萃取DNA及RNA。
本揭露提供方法，該方法包含：藉由使血液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之血液樣品來安定化來自個體之血液樣品；及自經安定化之血液樣品萃取核酸。本揭露提供方法，該方法包含：藉由使血液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之血液樣品來安定化來自個體之血液樣品；及自經安定化之血液樣品萃取RNA。本揭露提供方法，該方法包含：藉由使血液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之血液樣品來安定化來自個體之血液樣品；及自經安定化之血液樣品萃取DNA。本揭露提供方法，該方法包含：藉由使血液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之血液樣品來安定化來自個體之血液樣品；及自經安定化之血液樣品萃取DNA及RNA。
本揭露提供方法，該方法包含：藉由使唾液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之唾液樣品來安定化來自個體之唾液樣品；及自經安定化之唾液樣品萃取核酸。本揭露提供方法，該方法包含：藉由使唾液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之唾液樣品來安定化來自個體之唾液樣品；及自經安定化之唾液樣品萃取RNA。本揭露提供方法，該方法包含：藉由使唾液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之唾液樣品來安定化來自個體之唾液樣品；及自經安定化之唾液樣品萃取DNA。本揭露提供方法，該方法包含：藉由使唾液樣品與本揭露之安定化緩衝劑接觸以產生經安定化之唾液樣品來安定化來自個體之唾液樣品；及自經安定化之唾液樣品萃取DNA及RNA。
在一些態樣中，可使用所屬技術領域中已知之核酸萃取方法自經安定化之血液樣品萃取核酸(包括RNA、DNA或RNA及DNA)。在非限制性實例中，可使用包含使用TRIzol LS之方法自經安定化之血液樣品萃取RNA。在非限制性實例中，可使用包含使用TRIzol LS及氯仿之方法自經安定化之血液樣品萃取RNA。在非限制性實例中，可使用包含珠(磁珠或矽石塗佈珠)之方法自經安定化之血液樣品萃取RNA。在非限制性實例中，可使用包含使用苯酚之方法自經安定化之血液樣品萃取RNA。在一些態樣中，可使用市售套組自經安定化之血液樣品萃取RNA，市售套組包括但不限於：Qiagen PAXgene血液miRNA套組、用於經安定化之血液試管RNA單離套組之Thermo Fisher MagMAX、及Norgen Biotek保存血液RNA純化套組I及套組II、Qiagen QIAsymphony、Thermo Fisher MagMAX Express-96磁粒子處理器、RNAqueous套組(Thermo Fisher)、Micro-to-midi總RNA純化系統(Thermo Fisher)、NucleoSpin RNA II (Becton and Dickinson)、GenElute哺乳動物總RNA套組(MilliporeSigma)、RNeasy mini套組(Qiagen)及TRIzol LS試劑(Thermo Fisher)。
在一些態樣中，自經安定化之生物樣品(例如，血液樣品或唾液樣品)萃取RNA可包含使經安定化之生物樣品與TRIzol LS接觸。在一些態樣中，經安定化之生物樣品可在與TRIzol LS接觸之前經稀釋。
在非限制性實例中，在添加750 µl的TRIzol LS之前，150 µl經安定化之生物樣品可經100 µl的不含RNA酶之水稀釋成總體積250 µl。在經安定化之生物樣品或經稀釋之經安定化之生物樣品與TRIzol LS接觸之後，可將所得混合物在室溫下震盪及培育。在非限制性實例中，在經安定化之生物樣品或經稀釋之經安定化之生物樣品與TRIzol LS接觸之後，可將所得混合物在室溫下震盪至少約10秒且培育至少約5分鐘。在室溫下震盪及培育之後，可使混合物與氯仿接觸。在非限制性實例中，每毫升的Trizol LS-經安定化之血液樣品混合物可添加至少約200 µl的氯仿。在與氯仿接觸之後，可將所得混合物震盪。在非限制性實例中，可將所得混合物震盪至少約15秒。在震盪之後，可在室溫下培育混合物。在非限制性實例中，可在室溫下培育混合物至少約3分鐘。在室溫下培育之後，可將混合物離心。在非限制性實例中，可在約4℃下將混合物以13,000x g離心至少約25分鐘。在離心之後，可將水相(顏色一般為黃色至透明，位於上層)轉移至新的樣品管。經轉移之水相接著可與異丙醇接觸。在非限制性實例中，經轉移之水相可與至少約500 µl的異丙醇接觸。在與異丙醇接觸之後，可在室溫下培育所得混合物。在非限制性實例中，可在室溫下培育所得混合物至少約10分鐘。在培育10分鐘之後，可將混合物離心以得出團塊。在非限制性實例中，可在約4℃下將混合物以13,000x g離心至少約10分鐘。在離心之後，可自團塊移除所得上清液。接著可添加70%乙醇至團塊。在非限制性實例中，可添加至少約1000 µl的70%乙醇至團塊。接著可將團塊重懸於該經添加之70%乙醇中。在重懸團塊之後，可將所得混合物離心。在非限制性實例中，可在約4℃下將所得混合物以10,000x g離心至少約5分鐘以得出團塊。在離心之後，可移除上清液且允許團塊乾燥至少約10分鐘。在乾燥之後，可將團塊以至少約100 µl的不含RNA酶之水重懸且允許在室溫下溶解。接著可使用所屬技術領域中標準的技術進一步純化RNA，該技術包括但不限於使用市售套組諸如Qiagen RNeasy Mini套組。
在一些態樣中，本揭露之方法可進一步包含：在使經安定化之生物樣品與至少一種特異性檢測至少一種生物標記之表現的藥劑接觸之前，自經安定化之生物樣品萃取RNA。在一些態樣中，本揭露之方法可進一步包含：在使經安定化之生物樣品與至少一種特異性檢測至少一種生物標記之表現的藥劑接觸之前，自經安定化之生物樣品萃取核酸。在一些態樣中，本揭露之方法可進一步包含：在使經安定化之生物樣品與至少一種特異性檢測至少一種生物標記之表現的藥劑接觸之前，自經安定化之生物樣品萃取DNA。在一些態樣中，可使用包含使經安定化之生物樣品與TRIzol LS接觸之方法萃取RNA。在一些態樣中，在使經安定化之生物樣品與TRIzol LS接觸之前，可稀釋經安定化之生物樣品。在一些態樣中，在經安定化之生物樣品與TRIzol LS接觸之後，可使所得混合物與氯仿接觸。
本揭露提供預後、預測、診斷及治療性方法，該方法包含：i)自使用本揭露之方法及/或組成物安定化之生物樣品萃取RNA；ii)在該經萃取之RNA中測定至少一種RNA轉錄物的表現水準；及iii)診斷該個體患有疾病及/或病症、向該個體提供治療建議、監測疾病及/或病症在該個體的進展、或基於該至少一種RNA轉錄物的表現水準向該個體投予至少一種治療劑。
在一些態樣中，測定至少一種RNA轉錄物的表現水準可包含使用定量PCR。如所屬技術領域中具有通常知識者所將理解的，可使用任何所屬技術領域中已知之定量PCR方法以測定至少一種RNA轉錄物的表現水準。
在一些態樣中，在使用定量PCR之前，該至少一種RNA轉錄物可經反向轉錄以產生cDNA，且該cDNA的表現水準可使用定量PCR測量。如所屬技術領域中具有通常知識者所將理解的，可使用所屬技術領域中標準的任何反向轉錄技術。
在一些態樣中，在使用定量PCR之前，該至少一種RNA轉錄物可經反向轉錄以產生cDNA，接著該cDNA可經擴增且接著該經擴增之cDNA的表現水準可使用定量PCR測量。如所屬技術領域中具有通常知識者所將理解的，可使用所屬技術領域中標準的任何核酸擴增技術(例如，選擇性PCR)及任何反向轉錄技術。
在一些態樣中，疾病及/或病症可為癌症、胃腸胰(GEP)神經內分泌腫瘤(GEP-NEN)、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、漿細胞惡液質、未知臨床意義的單株球蛋白症(MGUS)、結腸癌、前列腺癌或SARS-CoV-2感染。
用語「癌症(cancer)」及「癌性(cancerous)」係指稱或描述哺乳動物中一般以未受調節之細胞生長為特徵的生理狀況。此定義包括良性及惡性癌症。癌症之實例包括但不限於癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤、白血病及生殖細胞腫瘤。該等癌症之更具體實例包括腎上腺皮質癌、膀胱泌尿上皮癌、侵入性乳癌、子宮頸鱗狀細胞癌、內子宮頸腺癌、膽管癌、結腸腺癌、淋巴樣腫瘤瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、食道癌、多形性神經膠質母細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、腎嫌色細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、急性骨髓樣白血病、腦低惡性度神經膠質瘤、肝臟肝細胞癌、肺腺癌、肺部鱗狀細胞癌、間皮瘤、卵巢漿液性囊腺癌、胰腺癌、嗜鉻細胞瘤、副神經節瘤、前列腺腺癌、直腸腺癌、肉瘤、皮膚黑色素瘤、胃腺癌、睪丸生殖細胞腫瘤、甲狀腺癌、胸腺瘤、子宮癌肉瘤、葡萄膜黑色素瘤。其他實例包括乳癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、結直腸癌、卵巢癌、膀胱癌、腎癌或胃癌。癌症的進一步實例包括神經內分泌癌症、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌、膽道癌、食道癌、肛門癌、唾腺癌、外陰癌、子宮頸癌、急性淋巴胚細胞白血病(ALL)、急性骨髓樣白血病(AML)、腎上腺腫瘤、肛門癌、膽管癌症、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦腫瘤、乳癌、原發位置不明癌症(CUP)、擴散至骨的癌症、擴散至腦的癌症、擴散至肝臟的癌症、擴散至肺部的癌症、類癌、子宮頸癌、兒童癌症、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、結直腸癌、耳癌、子宮內膜癌、眼癌、濾泡性樹突細胞肉瘤、膽囊癌、胃癌、胃食道接合處癌症、生殖細胞腫瘤、妊娠滋養層疾病(GIT))、髮樣細胞白血病、頭頸癌、霍奇金氏淋巴瘤、Kaposi氏肉瘤、腎癌、喉頭癌、白血病、皮革胃(Gastric linitis plastica)、肝癌、肺癌、淋巴瘤、惡性神經鞘瘤、縱膈生殖細胞腫瘤、黑色素瘤皮膚癌、男性癌症、Merkel氏細胞皮膚癌、間皮瘤、胎塊性妊娠、口及口咽癌、骨髓瘤、鼻腔及副鼻竇癌症、鼻咽癌、神經胚細胞瘤、神經內分泌腫瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、食道癌、卵巢癌、胰臟癌、陰莖癌、持續性滋養層細胞疾病及絨毛膜癌、嗜鉻細胞瘤、前列腺癌、腹膜假黏液瘤、直腸癌、視網膜胚細胞瘤、唾液腺癌、繼發性癌症、戒環細胞癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、胃癌、T細胞兒童期非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、舌癌、扁桃腺癌、腎上腺腫瘤、子宮癌、陰道癌、陰門癌、Wilms氏腫瘤、子宮癌症及婦科癌症。癌症之實例亦包括但不限於血液學惡性病、淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓樣白血病、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、膽管癌、肝細胞癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、腎細胞癌、胰臟癌、膀胱癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、Merkel氏細胞癌、葡萄膜黑色素瘤或多形性神經膠質母細胞瘤。
在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與關於檢測及治療胃腸胰(GEP)神經內分泌腫瘤(GEP-NEN)(亦稱為胃腸胰神經內分泌腫瘤及神經內分泌腫瘤(NET))的預後、預測、診斷及治療方法組合使用。在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與WO2012/119013、美國專利第9,988,684號、WO2016/044330及美國專利第10,407,730號所描述之預後、預測、診斷及治療方法組合使用，彼等之全部內容併入本文中。這些預後、預測、診斷及治療方法可包括NETest分數的計算，如所屬技術領域中具有通常知識者所理解的，其係指自分類演算法(即，SVM、LDA、KNN及Bayes)之組合所生成之數學衍生性分類器演算法的輸出。此分數的範圍係介於0與100%之間。來自測試樣品之表現水準分數在與參考或對照樣品之表現水準分數比較之後，可用於診斷GEP-NEN的存在、GEP-NEN的不同分期、預測罹患GEP-NEN分期的風險或判定治療後人類患者復發GEP-NEN的風險。GEP-NEN疾病狀態之間的區別係基於如本申請案中進一步定義之預定表現水準分數臨限及/或範圍(見WO/2012/119013、美國專利第9,988,684號、WO/2016/044330及美國專利第10,407,730號)。
在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與關於黑色素瘤的預後、預測、診斷及治療方法組合使用。在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與WO2018/217627及US 2018-0340934 A1所描述之預後、預測、診斷及治療方法組合使用，彼等之全部內容併入本文中。
在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與關於多發性骨髓瘤、漿細胞惡液質、未知臨床意義的單株球蛋白症(MGUS)或任何其他相關疾病/病症的預後、預測、診斷及治療方法組合使用。在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與WO2019/018540及US 2019-0025311 A1所描述之預後、預測、診斷及治療方法組合使用，彼等之全部內容併入本文中。
在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與關於預測對肽受體放射療法(PRRT)之反應的預後、預測、診斷及治療方法組合使用。在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與WO2019/108734及US 2019-0160189 A1所描述之預後、預測、診斷及治療方法組合使用，彼等之全部內容併入本文中。
在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與關於結腸癌的預後、預測、診斷及治療方法組合使用。在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與WO 2019/144099及US 2019-0226030 A1所描述之預後、預測、診斷及治療方法組合使用，彼等之全部內容併入本文中。
在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與關於前列腺癌的預後、預測、診斷及治療方法組合使用。在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與WO 2019/165021及US 2019-0259471 A1所描述之預後、預測、診斷及治療方法組合使用，彼等之全部內容併入本文中。
在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可與關於SARS-CoV-2感染的預後、預測、診斷及治療方法組合使用。如所屬技術領域中具有通常知識者將理解的，SARS-CoV-2係造成2019年冠狀病毒疾病(COVID-19)的病毒。在一些態樣中，本揭露之安定化組成物、方法及套組可用於安定化唾液樣品以用於後續RNA萃取及分析SARS-CoV-2 RNA的水準。
在一些態樣中，本揭露提供識別個體感染SARS-CoV-2之方法，該方法包含：(a)自個體獲得唾液樣品；(b)使唾液樣品與本揭露之至少一種安定化緩衝劑接觸，藉此產生經安定化之唾液樣品；(c)自經安定化之唾液樣品萃取RNA；(d)在經萃取之RNA中測定至少一種SARS-CoV-2特異性轉錄物的表現水準；(e)比較至少一種SARS-CoV-2特異性轉錄物的表現水準與預定臨界值；及(f)當至少一種SARS-CoV-2特異性轉錄物的表現水準高於或等於預定臨界值時，判定個體患有SARS-CoV-2感染。
在一些態樣中，至少一種SARS-CoV-2特異性轉錄物包含SARS-CoV-2基因體(SEQ ID NO: 1)之片段。在一些態樣中，至少一種SARS-CoV-2特異性轉錄物包含編碼核鞘「N」之SARS-CoV-2基因體的部分(SEQ ID NO: 2)。在一些態樣中，至少一種SARS-CoV-2特異性轉錄物包含編碼核鞘「N」之SARS-CoV-2基因體的部分之片段。在一些態樣中，編碼核鞘蛋白質之SARS-CoV-2基因體的部分之片段可包含下列核苷酸序列、基本上由下列核苷酸序列組成或由下列核苷酸序列組成：GACCCCAAAATCAG CGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGA (SEQ ID NO: 3)，以下稱為「N1」。在一些態樣中，編碼核鞘蛋白質之SARS-CoV-2基因體的部分之片段可包含下列核苷酸序列、基本上由下列核苷酸序列組成或由下列核苷酸序列組成：TTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGC (SEQ ID NO: 4)，以下稱為「N3」。
在前述方法之一些態樣中，在經萃取之RNA中測定至少一種SARS-CoV-2特異性轉錄物的表現水準包含測定N1的表現水準。在前述方法之一些態樣中，在經萃取之RNA中測定至少一種SARS-CoV-2特異性轉錄物的表現水準包含測定N3的表現。在前述方法之一些態樣中，在經萃取之RNA中測定至少一種SARS-CoV-2特異性轉錄物的表現水準包含測定N1及N3的表現水準。
在一些態樣中，前述方法進一步包含測量至少一種陽性對照基因的表現水準。在一些態樣中，陽性對照基因可在方法的任何步驟被加標至樣品中。在一些態樣中，陽性對照基因係包含至少一種SARS-CoV-2特異性基因的對照質體。
在一些態樣中，前述方法進一步包含測量至少一種品質控制基因的表現水準。在不希望受到理論束縛下，可使用品質控制基因的表現水準來判定唾液樣品是否經適當收集及處理。在一些態樣中，如果品質控制基因的表現水準太高(即，高於預定臨界值)，則樣品可被視為經不正確處理且因此丟棄。在一些態樣中，至少一種品質控制基因係RNA酶。在一些態樣中，至少一種品質控制基因係RNA酶P (染色體10 (10q23.31)；UniGene ID: Hs.139120；RefSeq：NC_000010.11)。
在前述方法之一些態樣中，在經萃取之RNA中測定至少一種SARS-CoV-2特異性轉錄物的表現水準可包含使用定量PCR以在經萃取之RNA中測量至少一種轉錄物的表現水準，其中使用所屬技術領域中已知之標準定量PCR技術。在前述方法之一些態樣中，在經萃取之RNA中測定至少一種SARS-CoV-2特異性轉錄物的表現水準可包含使用所屬技術領域中標準的技術反向轉錄經萃取之RNA以形成cDNA，如所屬技術領域中具有通常知識者所將理解。呈cDNA之至少SARS-CoV-2特異性轉錄物的表現水準接著可使用定量PCR定量，如所屬技術領域中具有通常知識者所將理解。
在其中N1的表現水準係使用定量PCR測定之前述方法之態樣中，表1所呈現之SARS-CoV-2_N1正向擴增引子、SARS-CoV-2_N1反向擴增引子及SARS-CoV-2_N1檢測探針中之至少一者可用於定量PCR反應。
在其中N1的表現水準係使用定量PCR測定之前述方法之態樣中，表1所呈現之SARS-CoV-2_N3正向擴增引子、SARS-CoV-2_N3反向擴增引子及SARS-CoV-2_N3檢測探針中之至少一者可用於定量PCR反應。
在其中RNA酶P的表現水準係使用定量PCR測定之前述方法之態樣中，表1所呈現之RNA酶P正向擴增引子、RNA酶P反向擴增引子及RNA酶P檢測探針中之至少一者可用於定量PCR反應。
Figure 02_image001
套組
本揭露提供套組，其包含至少一個量的本揭露之至少一種安定化緩衝劑。在一些態樣中，套組可進一步包含至少一個樣品收集管。在一些態樣中，至少一個量的本揭露之至少一種安定化緩衝劑可含有在樣品管中。
在一些態樣中，本揭露之套組可進一步包含至少一複數個之至少一個擴增引子。在非限制性實例中，擴增引子可為表1所引述之擴增引子之任一者。在一些態樣中，本揭露之套組可包含複數個表1所引述之擴增引子之各者。在一些態樣中，本揭露之套組可進一步包含至少一複數個之至少一個探針。在非限制性實例中，探針可為表1所引述之探針之任一者。在一些態樣中，本揭露之套組可包含複數個表1所引述之探針之各者。
本揭露提供套組，其包含至少一個樣品收集管，其中至少一個樣品收集管包含至少約70 µl的本揭露之安定化緩衝劑。本揭露提供套組，其包含至少一個樣品收集管，其中至少一個樣品收集管包含至少約100 µl的本揭露之安定化緩衝劑。本揭露提供套組，其包含至少一個樣品收集管，其中至少一個樣品收集管包含至少約4 ml的本揭露之安定化緩衝劑。
本揭露提供用於安定化在室溫下至少一天之至少一個生物樣品之套組，其包含至少一個樣品收集管，其中至少一個樣品收集管包含至少約70 µl的本揭露之安定化緩衝劑。本揭露提供用於安定化在室溫下至少一天之至少一個生物樣品之套組，其包含至少一個樣品收集管，其中至少一個樣品收集管包含至少約100 µl的本揭露之安定化緩衝劑。本揭露提供用於安定化在室溫下至少一天之至少一個生物樣品之套組，其包含至少一個樣品收集管，其中至少一個樣品收集管包含至少約4 ml的本揭露之安定化緩衝劑。
本揭露提供用於安定化在室溫下至少一天之至少一個血液樣品之套組，其包含至少一個樣品收集管，其中至少一個樣品收集管包含至少約70 µl的本揭露之安定化緩衝劑。本揭露提供用於安定化在室溫下至少一天之至少一個血液樣品之套組，其包含至少一個樣品收集管，其中至少一個樣品收集管包含至少約100 µl的本揭露之安定化緩衝劑。本揭露提供用於安定化在室溫下至少一天之至少一個血液樣品之套組，其包含至少一個樣品收集管，其中至少一個樣品收集管包含至少約4 ml的本揭露之安定化緩衝劑。
本揭露提供套組，其包含至少一個樣品收集管，其中該至少一個樣品收集管包含至少約10 µl、或至少約15 µl、或至少約20 µl、或至少約25 µl、或至少約30 µl、或至少約35 µl、或至少約40 µl、或至少約45 µl、或至少約50 µl、或至少約55 µl、或至少約60 µl、或至少約65 µl、或至少約70 µl、或至少約75 µl、或至少約80 µl、或至少約85 µl、或至少約90 µl、或至少約95 µl、或至少約100 µl、或至少約105 µl、或至少約110 µl、或至少約120 µl、或至少約130 µl、或至少約140 µl、或至少約150 µl、或至少約160 µl、或至少約170 µl、或至少約180 µl、或至少約190 µl、或至少約200 µl、或至少約500 µl、或至少約1 ml、或至少約1.5 ml、或至少約2 ml、或至少約2.5 ml、或至少約3 ml、或至少約3.5 ml、或至少約4 ml、或至少約4.5 ml、或至少約5 ml、或至少約5.5 ml、或至少約6.0 ml、或至少約6.5 ml、或至少約7.0 ml、或至少約7.5 ml、或至少約8.0 ml、或至少約8.5 ml、或至少約9 ml、或至少約9.5 ml、或至少約10 ml的本揭露之安定化緩衝劑。
在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為6ml、16x100 mm樣品收集管。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為經K2-EDTA預先塗佈之6ml、16x100 mm樣品收集管。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為經至少約10.8 mg的K2-EDTA預先塗佈之6ml、16x100 mm樣品收集管。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為經至少約1 mg、或至少約2 mg、或至少約3 mg、或至少約4 mg、或至少約5 mg、或至少約6 mg、或至少約7 mg、或至少約8 mg、或至少約9 mg、或至少約10 mg、或至少約11 mg、或至少約12 mg、或至少約13 mg、或至少約14 mg、或至少約15 mg、或至少約16 mg、或至少約17 mg、或至少約18 mg、或至少約19 mg、或至少約20 mg的K2-EDTA預先塗佈之6ml、16x100 mm樣品收集管。
在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為塑膠材質。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可為玻璃材質。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可經密封。在一些態樣中，至少一個樣品收集管可經處理以使空氣被排出該至少一個樣品收集管。
在一些態樣中，本揭露之套組可包含使用說明。說明可為書面說明。本揭露之套組可用於本文所述之任何方法。
在一些態樣中，本揭露之套組可包含至少約1、或至少約2、或至少約3、或至少約4、或至少約5、或至少約6、或至少約7、或至少約8、或至少約9、或至少約10、或至少約11、或至少約12、或至少約13、或至少約14、或至少約15、或至少約16、或至少約17、或至少約18、或至少約19、或至少約20、或至少約21、或至少約22、或至少約23、或至少約24、或至少約25、或至少約26、或至少約27、或至少約28、或至少約29、或至少約30、或至少約31、或至少約32、或至少約33、或至少約34、或至少約35、或至少約36、或至少約37、或至少約38、或至少約39、或至少約40種試劑，該試劑特異性檢測至少約1、或至少約2、或至少約3、或至少約4、或至少約5、或至少約6、或至少約7、或至少約8、或至少約9、或至少約10、或至少約11、或至少約12、或至少約13、或至少約14、或至少約15、或至少約16、或至少約17、或至少約18、或至少約19、或至少約20、或至少約21、或至少約22、或至少約23、或至少約24、或至少約25、或至少約26、或至少約27、或至少約28、或至少約29、或至少約30、或至少約31、或至少約32、或至少約33、或至少約34、或至少約35、或至少約36、或至少約37、或至少約38、或至少約39、或至少約40種生物標記的表現。在一些態樣中，特異性檢測至少一種生物標記的表現之試劑可包含引子、引子對、正義及反義引子對、與生物標記特異性雜交之多核苷酸或彼等之任何組合。
在本揭露之方法的一些態樣中，生物標記可為RNA、cDNA或蛋白質。在本揭露之方法的一些態樣中，其中生物標記係RNA，該RNA可經反向轉錄以產生cDNA，且可檢測所產生之cDNA的表現水準。在一些態樣中，生物標記之表現水準可藉由在生物標記與經標示之探針或引子之間形成複合物來檢測。在本揭露之方法的一些態樣中，其中生物標記係蛋白質，該蛋白質可藉由在蛋白質與經標示之抗體之間形成複合物來檢測。在本揭露之一些態樣中，其中生物標記係RNA及/或cDNA，該RNA及/或cDNA可藉由在RNA及/或cDNA與經標示之核酸探針或引子之間形成複合物來檢測。在RNA或cDNA與經標示之核酸探針或引子之間的複合物可為雜交複合物。在一些態樣中，標示可為螢光標示。
用語「診斷(diagnosis)」及「診斷學(diagnostics)」亦分別涵蓋用語「預後(prognosis)」及「預後學(prognostics)」以及在二個或超過二個時間點施用該程序以監測隨時間的診斷及/或預後及基於彼等之統計模型構建。另外，用語診斷包括：a.預測(判定患者是否將有可能發展侵略性疾病(過度增生性/侵入性))；b.預後(預測患者在未來的預先選定時間是否將有可能具有較佳或較差結果)；c.療法選擇；d.治療性藥物監測；及e.復發監測。
如本文中所使用之用語「個體(subject)」係指哺乳動物，較佳係人類。
如本文中所使用之關於病況之「治療(treating或treatment)」可指預防病況、減緩病況的開始或發展速度、減少發展病況的風險、預防或延緩與病況相關聯之症狀的發展、減少或結束與病況相關聯之症狀、產生病況的完全或部分消退或彼等之一些組合。
生物標記水準可因疾病治療而變化。生物標記水準的變化可藉由本揭露之方法測量。生物標記水準的變化可用於監測疾病進展或療法。
「改變(altered)」、「變化(changed)」或「顯著不同(significantly different)」係指與合理可相比之狀態、輪廓、測量值或類似物可檢測的變化或差異。該變化可為全部或全無。變化可為漸增且不需要呈線性。變化可為數量級的。變化可為增加或降低1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或超過100%、或介於0%與100%之間的任何值。替代地，變化可為1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或超過5倍、或介於1倍與5倍之間的任何值。變化可具有統計顯著性，其中p值為0.1、0.05、0.001或0.0001。
如本文中所使用，用語「表現水準(expression level)」及「量(amount)」可互換使用以指稱存在給定生物樣品或來自萃取自生物樣品之生物材料的特定分子(例如，特定RNA轉錄物)的量。
實例
實例1-使用本揭露之安定化緩衝劑及方法安定血液及血液RNA。
下列非限制性實例顯示本揭露之安定化緩衝劑及方法可有效安定生物樣品，諸如血液樣品。四位神經內分泌腫瘤患者藉由靜脈穿刺收集血液，接著按照標準規程立即儲存在-80℃下之EDTA塗佈管中或以樣品體積對緩衝劑體積1:2之比例收集至安定化緩衝劑中。安定化緩衝劑包含濃度至少約4.5 M之胍鹽酸鹽、濃度至少約0.1%(體積/體積)之Triton X-100、濃度至少約20 mM之EDTA、濃度至少約80 mM之檸檬酸；及濃度至少約120 mM之檸檬酸鈉。安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。樣品接著在室溫下(21℃至28℃)培育1、2或3天。評估經單離之RNA的濃度及品質，如藉由PCR擴增之基因數，並使用本揭露之方法計算各樣品之神經內分泌腫瘤分數(NETest)。
如圖1之左圖所示，按照標準規程收集且在 -80℃下冷凍然後單離之RNA濃度水準(7.2±0.3 ng/mL)與在室溫下安定化24小時(7.6±1.3 ng/mL)、安定化48小時(5.3±0.5 ng/mL)或安定化72小時(7.2±1.1 ng/mL)之後的水準類似。如圖1之右圖所示，RNA完整數(RIN)在安定化血液(平均：8.2)中顯著高於(p ＜0.05)標準血液收集(6.4±0.2)。
如圖2之左圖所示，基因擴增在標準收集樣品(48至49)及經安定化之樣品(47至50)兩者中類似。如圖2之右圖所示，NETest分數在標準收集樣品(33±4.7)與經安定化之樣品(35±6)之間無顯著不同。
這些結果顯示本揭露之安定化緩衝劑及方法可有效安定血液樣品。事實上，本揭露之安定化緩衝劑及方法比起在-80℃下冷凍之既有標準規程更大程度地保存血液樣品。
實例2-使用不同體積之經安定化之血液所測量之基因表現及NETest分數
下列非限制性實例顯示本揭露之安定化緩衝劑及方法可有效安定生物樣品，諸如血液樣品。五位神經內分泌腫瘤患者及四位對照患者經由靜脈穿刺收集血液。將血液樣品直接收集至實例1的安定化緩衝劑中。經安定化之血液樣品接著在室溫下(21℃至28℃)培育72小時。接著測量及分析不同血液體積(範圍介於5與50 µl之間)的經安定化之血液中的基因表現及NETest分數。
如圖3左上圖所示，RNA濃度水準的範圍為0.2至0.8 ng/ml(5至35 µl)且在50 µl樣品中顯著(p＜0.0001)較高。如圖3右上圖所示，RIN值的範圍為6.8至7.6，且在樣品之間並無顯著不同。如圖3左下圖所示，5至35 µl的目標基因表現(循環數)為約38。以50 µl而言，循環時間顯著較低(與較高基因表現一致)：35±0.2 (p ＜0.0005)。如圖3右下圖所示，NETest分數範圍為5.9±2(5 µl的經安定化之血液)至32.6±6.5(50 µl經安定化之血液)。
這些結果表明各種體積(包括範圍為5至50 µl使用本揭露之方法及組成物安定化之血液體積)皆可用於後續診斷、預後及治療性應用。
實例3-使用不同體積的藉由靜脈穿刺或指尖穿刺收集且使用本揭露之方法及組成物安定化之血液所測量之RNA濃度及NETest分數。
下列非限制性實例顯示本揭露之安定化緩衝劑及方法可有效安定各種樣品體積的生物樣品，諸如血液樣品。七位神經內分泌腫瘤患者經由靜脈穿刺或指尖穿刺直接收集血液至實例1的安定化緩衝劑中。經安定化之血液樣品接著在室溫下(21℃至28℃)培育72小時。樣品容量35 µl及50 µl的血液係藉由指尖穿刺收集且樣品容量50 µl的血液係藉由靜脈穿刺收集。經單離之RNA的濃度及品質係於各個經安定化之樣品中評估，如個別基因表現及神經內分泌腫瘤分數(NETest)。
如圖4左圖所示，經安定化之全血/靜脈穿刺樣品的RNA濃度水準(3.8±0.8 ng/mL)與經安定化之50 µl指尖穿刺樣品的水準(2.7±0.8 ng/mL)類似。經安定化之35 µl指尖穿刺樣品中的水準(0.95±0.47 ng/mL)係顯著(p ＜0.03)較低。如圖4右圖所示，經安定化之全血樣品(7.2±0.4 ng/mL)與經安定化之50 µl指尖穿刺樣品(6.8±0.6 ng/mL)之間的RNA完整數(RIN)類似，但在經安定化之35 µl指尖穿刺樣品中顯著較低(5±1.5 ng/mL,p ＜0.03)。
如圖5所示，回歸分析顯示，經安定化之全血與經安定化之50 µl指尖穿刺樣品之間的基因表現係非常密切地相關(R2 =0.91-0.99，中位數：0.95)。經安定化之35 µl指尖穿刺樣品的相關性較低(R2 ：0.87-0.95，中位數：0.94)。
經安定化之35 µl指尖穿刺樣品中的水準(22±11)較低且包括二個被分類為「正常」的樣品。
這些結果表明各種體積的收集血液(包括範圍為35至50 µl之血液體積)可使用本揭露之方法及組成物來安定化以用於後續診斷、預後及治療性應用。
實例4-使用本揭露之組成物及方法安定化之靜脈穿刺血液。
十三位神經內分泌腫瘤患者及6位正常受試者藉由靜脈穿刺直接收集血液至安定化緩衝劑中。經安定化之靜脈穿刺血液樣品接著在室溫下(21℃至28℃)培育0至28天。比較每個時間點的NETest分數以識別該標誌在室溫下有多安定。
如圖7左圖所示，比較2、3、4及5天室溫安定化與一天室溫安定化的基因表現評估識別此在所選的二個病例中顯著一致。相關性的範圍介於患者#1的0.96-0.99 (p ＜0.0001)至患者#2的0.97-0.985 (p ＜0.0001)之間。
如圖7右圖所示，第0天的NETest分數係31.1±6.2。分數維持同一直到第7天(所有天數：31.1±6.2)。在室溫下安定化緩衝劑中9天之後，分數係30.3±6.1。自此之後，分數顯著(p＜0.0001)降低至23.7±5(第14天)、至15±4.8 (第21天)、至12.6±4(第28天)。
如圖7右圖所示，具有高分數(80至100，其對疾病進展具預後性)的所有患者展現穩定分數直到第7天。具有較低分數(20-50)的所有患者展現穩定分數直到第7天。因此，這些結果顯示本揭露之安定化方法及組成物可有效安定化血液樣品達至少7天以供後續用於診斷、預後及治療性應用，包括NETest。
實例5-安定化緩衝劑製備
下列非限制性實例描述製備本揭露之安定化緩衝劑的方法。
首先，藉由下列製備100 ml的0.3M EDTA： a.   稱量8.768g的EDTA且放入250mL玻璃燒杯； b.   添加約70mL水(不含RNA酶)至燒杯且在板上以低熱攪拌； c.   添加NaOH顆粒且以pH探針測量直到pH開始達到7；及 d.   當目視可見EDTA溶解時，添加水至燒杯的100mL標示處。0.3M的最終pH應為大約7.5。EDTA將在pH 7.5之前溶解。100mL溶液的最終pH必須介於7.4至7.5之間 接著，藉由下列製備1000 ml的安定化緩衝劑： a.   稱量429.88g的胍鹽酸鹽、35.3g的檸檬酸鈉、15.36g的檸檬酸且添加至清潔燒杯； b.   添加剛好足夠使試劑溶解的水(約500 ml)至燒杯且開始在板上攪拌； c.   吸量66.6 mL的0.3M EDTA原液至燒杯中； d.   使用微量吸量管吸量1000 μL的Triton X-100至燒杯中。以燒杯中的液體上下吸放微量吸量管尖多餘的Triton X-100； e.   在加熱板上加熱燒杯。Triton將在液體中顯示為凝膠樣的水滴鏈。持續加熱並以攪拌子攪拌直到無目視可見的Triton及其他固體； f.    添加水至燒杯的1000mL標示處； g.   以pH探針測量緩衝劑的pH。最終pH將為大約4.05。pH通常介於4.05至4.1之間。
接著可藉由注射4ml的最終緩衝劑至經K2-EDTA(10.8mg/管)預先塗佈的6ml (16x100mm)玻璃或塑膠管中，將安定化緩衝劑分配至樣品管。
實例6-使用TRIzol及本揭露之安定化方法及組成物萃取RNA
下列非限制性實例描述自使用本揭露之組成物及方法安定化之生物樣品萃取RNA之例示性方法。
可使用下列規程自使用本揭露之安定化方法及組成物安定化之血液樣品萃取RNA： a.   測定起始材料(在安定化緩衝劑中之血液)的體積。起始材料一般將為150 μL的經安定化之血液。藉由添加100 μL的不含RNA酶之水，將總體積加至250 μL； b.   添加750 μL的TRIzol LS至該250 μL的經稀釋、經安定化之血液樣品達1 ml的最終體積； c.   將TRIzol LS及樣品震盪10秒且在室溫下培育5分鐘； d.   每1mL的TRIzol/樣品添加200 μL的氯仿並將試管蓋子蓋緊； e.   高速震盪混合物15秒； f.    將混合物在室溫下培育3分鐘； g.   將混合物在4℃下以13,000xg離心25分鐘； h.   使用200 μL吸量管將水相(黃色至透明顏色層)轉移至新試管； i.    添加500 μL的異丙醇至該經轉移之水相，接著將試管倒轉四次； j.    將混合物在室溫下培育10分鐘； k.   將混合物在4℃下以13,000xg離心10分鐘； l.    在不擾亂團塊下倒掉上清液，輕柔印乾邊緣上任何多餘的上清液； m.  添加1000 μL的70%乙醇至團塊； n.   輕彈且倒轉試管以使團塊漂浮； o.   將混合物在4℃下以10,000xg離心5分鐘； p.   倒掉上清液且輕柔印乾邊緣上任何多餘的上清液； q.   允許團塊風乾10分鐘； r.   添加100 μL的不含RNA酶之水至團塊且讓團塊在室溫下溶解達10分鐘。
進行RNA清潔規程(例如，使用市售套組諸如Qiagen RNeasy Mini套組)。
實例6-使用本揭露之組成物及方法安定化之唾液樣品及唾液RNA
下列非限制性實例顯示本揭露之組成物及方法可用於在多種不同溫度下長時間安定化唾液樣品，更具體地唾液樣品中之RNA。
在非限制性應用中，使用本揭露之組成物及方法安定化之唾液樣品及唾液RNA可用來作為個體SARS-CoV-2感染之診斷測試的一部分。如所屬技術領域中具有通常知識者將理解的，SARS-CoV-2係造成2019年冠狀病毒疾病的病毒。SARS-CoV-2的非限制性實例係本揭露中描述的3-基因分子診斷測試。簡言之，SARS-CoV-2 3-基因分子診斷測試藉由使用自個體唾液樣品萃取之RNA所轉錄之cDNA進行定量PCR來測量三個基因(2個病毒目標基因及1個陽性對照基因)的表現水準。二個病毒基因係編碼病毒殼體之N1及N3。陽性對照基因可為所屬技術領域中已知且使用之任何陽性對照核酸，包括但不限於特定SARS-CoV-2對照質體。再者，可測量品質控制基因(諸如但不限於RNA酶P)的表現水準，以判定唾液樣品是否經適當收集及處理。
首先使用拭子自個體單離唾液樣品。單離可發生在例如，醫生辦公室、遠距測試機構或甚至在個體家中。接著可使用本揭露之組成物及方法安定化唾液樣品。在安定化之後的任何時間，可使用所屬技術領域中標準的技術(例如使用來自QIAgen的QIAmp病毒RNA mini套組)自樣品單離及純化RNA。接著可使用所屬技術領域中標準的技術(例如使用ThermoFisher高產量cDNA反轉錄套組)將經純化的RNA轉錄成cDNA。二個病毒基因及陽性對照基因稀釋曲線的表現水準接著可使用定量PCR使用所屬技術領域中具有通常知識者將理解的標準技術測量。接著可比較所測量的二個病毒基因之循環臨限(cT)與陽性對照基因稀釋曲線之cT值，以識別樣品為SARS-CoV-2病毒陽性或陰性。亦可監測品質控制基因(諸如RNA酶P)的表現水準。
實例 6a
唾液樣品係自SARS-CoV-2陽性個體收集至本揭露之安定化緩衝劑中，該安定化緩衝劑包含濃度約4.5 M之胍鹽酸鹽、濃度約0.1% (v/v)之Triton X-100、濃度約20 mM之EDTA、濃度約80 mM之檸檬酸、濃度約120 mM之檸檬酸鈉，且pH係介於約4.05與約4.11之間。
接著將各唾液樣品分成二個子樣品。
其中一個子樣品在如上述之樣品採集之後立即評估。自子樣品單離及純化RNA，且使用定量PCR測量診斷基因(N1、N3及RNA酶P)的表現水準。
在RNA單離及定量PCR分析之前，允許另一子樣品在室溫下(22℃)培育5天(120 hrs)。
二個子樣品之定量PCR分析的結果顯示於表2及圖8。在樣品採集之後立即分析之子樣品在表2及圖8中稱為「第0天」樣品，且允許在室溫下培育5天之子樣品稱為「第5天」樣品。
Figure 02_image003
如表2及圖8所示，在第0天子樣品及第5天子樣品中測量之各基因的表現水準(Ct值)大約相同。再者，所有12個樣品經正確診斷為SARS-CoV-2陽性。在不希望受到理論束縛下，這些結果表明本揭露之安定化緩衝劑安定化唾液樣品，以使RNA在5天室溫培育的時程內免於被降解。
實例 6b
唾液樣品係自個體收集至本揭露之安定化緩衝劑中，該安定化緩衝劑包含濃度約4.5 M之胍鹽酸鹽、濃度約0.1% (v/v)之Triton X-100、濃度約20 mM之EDTA、濃度約80 mM之檸檬酸、濃度約120 mM之檸檬酸鈉，且pH係介於約4.05與約4.11之間。
接著將各唾液樣品分成二個子樣品。
其中一個子樣品在如上述之樣品採集之後立即評估。自子樣品單離及純化RNA，且使用定量PCR測量診斷基因(N1、N3及RNA酶P)的表現水準。
在RNA單離及定量PCR分析之前，使另一子樣品根據表3呈現的輪廓經受22至40℃之溫度範圍的熱偏移達56小時。
Figure 02_image005
二個子樣品之定量PCR分析的結果顯示於表4及圖9。在樣品採集之後立即分析之子樣品在表4及圖9中稱為「評估前」樣品，且經受56小時熱偏移之子樣品稱為「56小時輪廓1」樣品。
Figure 02_image007
如表4及圖9所示，在評估前子樣品及56小時輪廓1子樣品中測量之各基因的表現水準(Ct值)大約相同。再者，在56小時輪廓1子樣品中檢測出38中之37個(97%)加標樣品。正確檢測出23中之22個(96%)低病毒力價樣品，且檢測出所有較高病毒力價樣品。所有對照(無加標)為SARS-CoV-2檢測陰性。在不希望受到理論束縛下，這些結果表明本揭露之安定化緩衝劑安定化唾液樣品，以使RNA在56小時溫度偏移的時程內免於被降解，其中溫度範圍為22至40℃。
實例 6c
唾液樣品係自個體收集至本揭露之安定化緩衝劑中，該安定化緩衝劑包含濃度約4.5 M之胍鹽酸鹽、濃度約0.1% (v/v)之Triton X-100、濃度約20 mM之EDTA、濃度約80 mM之檸檬酸、濃度約120 mM之檸檬酸鈉，且pH係介於約4.05與約4.11之間。
接著將各唾液樣品分成二個子樣品。
其中一個子樣品在如上述之樣品採集之後立即評估。自子樣品單離及純化RNA，且使用定量PCR測量診斷基因(N1、N3及RNA酶P)的表現水準。
在RNA單離及定量PCR分析之前，使另一子樣品根據表5呈現的輪廓經受-10至18℃之溫度範圍的熱偏移達56小時。
Figure 02_image009
二個子樣品之定量PCR分析的結果顯示於表6及圖10。在樣品採集之後立即分析之子樣品在表6及圖10中稱為「評估前」樣品，且經受56小時熱偏移之子樣品稱為「56小時輪廓2」樣品。
Figure 02_image011
如表6及圖10所示，在評估前子樣品及56小時輪廓1子樣品中測量之各基因的表現水準(Ct值)大約相同。再者，檢測出所有加標樣品(38/38, 100%)，且所有對照(10/10無加標)為SARS-CoV-2檢測陰性。在不希望受到理論束縛下，這些結果表明本揭露之安定化緩衝劑安定化唾液樣品，以使RNA在56小時溫度偏移的時程內免於被降解，其中溫度範圍為-10至18℃。
上述及進一步特徵當搭配隨附圖式時將從下列詳細說明更清楚地理解。
[圖1]的一系列圖表顯示在冷凍的標準血液中或在使用本揭露之組成物及方法安定化且接著在室溫下培育24至72 hrs之血液樣品中的RNA品質。右圖的圖表顯示RNA濃度且右圖的圖表顯示RNA完整數(RIN)。
[圖2]的一系列圖表顯示自冷凍的標準血液樣品或使用本揭露之組成物及方法安定化且接著在室溫下培育24至72 hrs之血液樣品的基因擴增數(左圖)及經計算的NETest分數(右圖)。
[圖3]的一系列圖表顯示使用本揭露之組成物及方法安定化之各種體積的血液樣品中的RNA品質。左上圖顯示各種樣品中的RNA濃度，右上圖顯示RNA完整數(RIN)，左下圖顯示所測量之管家基因的表現及右下圖顯示所計算的NETest分數。
[圖4]的一系列圖表顯示使用本揭露之組成物及方法安定化之全血(WB)樣品或指尖穿刺血液樣品中的RNA品質。左圖顯示RNA濃度且右圖顯示RNA完整數(RIN)。
[圖5]的一系列圖表顯示在6位不同的NET患者中，全血樣品與50 µl指尖穿刺血液樣品或35 µl指尖穿刺血液樣品之基因表現之間的相關性。血液樣品係使用本揭露之方法及組成物安定化。
[圖6]的圖表顯示使用本揭露之方法及組成物安定化之全血樣品或指尖穿刺血液樣品的最終NETest分數。
[圖7]的一系列圖表顯示來自二位不同的NET患者的血液樣品在室溫下安定化24 hrs之後相較於在室溫下安定化48至120 hrs之後基因表現之間的相關性(左圖)，及在13位神經內分泌腫瘤患者及6位對照患者中，自經安定化之血液樣品計算的隨時間改變之NETest分數。
[圖8]的圖表顯示使用本揭露之組成物及方法安定化之唾液樣品在室溫下培育120小時之定量PCR分析的結果。
[圖9]的圖表顯示使用本揭露之組成物及方法安定化之唾液樣品經過22至40℃之溫度範圍的56小時熱偏移後之定量PCR分析的結果。
[圖10]的圖表顯示使用本揭露之組成物及方法安定化之唾液樣品經過-10至18℃之溫度範圍的56小時熱偏移後之定量PCR分析的結果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
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Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022

Claims (27)

  1. 一種安定化緩衝劑，其包含： (a)濃度約4.05 M至約4.95 M之胍鹽酸鹽； (b)濃度約0.09%至約0.11% (v/v)之Triton X-100；及 (c)濃度約18 mM至約22 mM之EDTA， 其中該安定化緩衝劑的pH低於約4.5。
  2. 如請求項1之安定化緩衝劑，其中該安定化緩衝劑包含： (a)濃度約4.275 M至約4.725 M之胍鹽酸鹽； (b)濃度約0.095%至約0.105% (v/v)之Triton X-100；及 (c)濃度約19 mM至約21 mM之EDTA。
  3. 如前述請求項中任一項之安定化緩衝劑，其中該安定化緩衝劑包含： (a)濃度約4.5 M之胍鹽酸鹽； (b)濃度約0.1% (v/v)之Triton X-100；及 (c)濃度約20 mM之EDTA。
  4. 如前述請求項中任一項之安定化緩衝劑，其中該安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。
  5. 如前述請求項中任一項之安定化緩衝劑，其進一步包含： (d)濃度約72 mM至約88 mM之檸檬酸；及 (e)濃度約108 mM至約132 mM之檸檬酸鈉。
  6. 如請求項5之安定化緩衝劑，其中該安定化緩衝劑包含： (d)濃度約76 mM至約84 mM之檸檬酸；及 (e)濃度約114 mM至約126 mM之檸檬酸鈉。
  7. 如請求項6之安定化緩衝劑，其中該安定化緩衝劑包含： (d)濃度80 mM之檸檬酸；及 (e)濃度120 mM之檸檬酸鈉。
  8. 如前述請求項中任一項之安定化緩衝劑，其中該安定化緩衝劑包含： (a)濃度約4.5 M之胍鹽酸鹽； (b)濃度約0.1% (v/v)之Triton X-100； (c)濃度約20 mM之EDTA； (d)濃度80 mM之檸檬酸；及 (e)濃度120 mM之檸檬酸鈉， 其中該安定化緩衝劑的pH係介於約4.05與約4.11之間。
  9. 一種組成物，其包含下列之混合物： (a)如前述請求項中任一項之安定化緩衝劑；及 (b)自個體單離之生物樣品。
  10. 如請求項9之組成物，其中該生物樣品包含血液、血漿、血清、尿液、乳汁、腦脊髓液、黏液、胃液、腹膜液、胸膜液、唾液、皮脂、精液、汗液、淚液、陰道分泌物、嘔吐物、內淋巴、周邊淋巴或彼等之任何組合。
  11. 如請求項9之組成物，其中該生物樣品係血液樣品，較佳地其中該血液樣品係： a)藉由靜脈穿刺獲得之全血樣品；或 b)藉由指尖穿刺獲得之血液樣品。
  12. 如請求項10之組成物，其中該生物樣品係唾液樣品。
  13. 如請求項9至12中任一項之組成物，其中該生物樣品包含至少一種RNA轉錄物，其中該至少一種RNA轉錄物的量在該組成物在室溫下經培育至少一天後降低不超過約5%，較佳地其中該至少一種RNA轉錄物的量降低不超過約1%，較佳地其中該至少一種RNA轉錄物的量降低不超過約0.5%。
  14. 一種套組，其包含如請求項1至8中任一項之安定化緩衝劑。
  15. 如請求項13之套組，其包含該安定化緩衝劑在至少一個樣品收集管中，較佳地其中該至少一個樣品收集管係經K2-EDTA預先塗佈。
  16. 如請求項14之套組，其中該至少一個樣品收集管係6ml之16x100 mm樣品收集管，較佳地其中該至少一個樣品管係經至少約10.8 mg的K2-EDTA預先塗佈。
  17. 一種安定化來自個體之生物樣品之方法，該方法包含使該生物樣品與如請求項1至8中任一項之安定化緩衝劑接觸，藉此產生經安定化之生物樣品。
  18. 如請求項9之組成物，其中該生物樣品包含血液、血漿、血清、尿液、乳汁、腦脊髓液、黏液、胃液、腹膜液、胸膜液、唾液、皮脂、精液、汗液、淚液、陰道分泌物、嘔吐物、內淋巴、周邊淋巴或彼等之任何組合。
  19. 如請求項9之組成物，其中該生物樣品係血液樣品，較佳地其中該血液樣品係： a)藉由靜脈穿刺獲得之全血樣品；或 b)藉由指尖穿刺獲得之血液樣品。
  20. 如請求項10之組成物，其中該生物樣品係唾液樣品。
  21. 如請求項17至20中任一項之方法，其中該生物樣品包含至少一種RNA轉錄物，其中在約室溫下培育該經安定化之生物樣品至少24小時之後所測量之在該經安定化之生物樣品中該至少一種RNA轉錄物的表現水準係在該樣品收集之後不超過1小時所測量之該至少一種RNA轉錄物的表現水準的約5%以內(±5%)、較佳地約1%以內 (±1%)、較佳地約0.5%以內(±0.5%)。
  22. 如請求項21之方法，其中該至少一種RNA轉錄物的表現水準係使用定量PCR測量。
  23. 如請求項17至22中任一項之方法，該方法進一步包含： i)自該經安定化之生物樣品萃取RNA； ii)在該經萃取之RNA中測定至少一種RNA轉錄物的表現水準；及 iii)診斷該個體患有疾病及/或病症、向該個體提供治療建議、監測疾病及/或病症在該個體的進展、或基於該至少一種RNA轉錄物的表現水準向該個體投予至少一種治療劑。
  24. 如請求項23之方法，其中在該經萃取之RNA中測定該至少一種RNA轉錄物的表現水準包含使用定量PCR。
  25. 如請求項24之方法，其進一步包含在使用定量PCR之前，反向轉錄該至少一種RNA轉錄物以產生cDNA。
  26. 如請求項23至25中任一項之方法，其中該疾病或病症係癌症、胃腸胰(GEP)神經內分泌腫瘤(GEP-NEN)、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、漿細胞惡液質、未知臨床意義的單株球蛋白症(MGUS)、結腸癌、前列腺癌或SARS-CoV-2感染。
  27. 如請求項26之方法，其中該癌症係癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤、白血病、腦癌、乳癌、血癌、骨癌、肺癌、皮膚癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、甲狀腺癌、胰臟癌、食道癌、前列腺癌、子宮頸癌或結直腸癌。
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