ES2920288T3 - Procedimientos para la detección de melanoma - Google Patents
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Abstract
La presente invención se dirige a métodos para detectar un melanoma, métodos para determinar si un melanoma es estable o progresivo, métodos para evaluar el alcance de la resección de la cirugía en un sujeto que tiene un melanoma y métodos para determinar una respuesta por un sujeto que tiene un melanoma a una terapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimientos para la detección de melanoma
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos N° 62/511.058, presentada el 25 de marzo de 2017, cuyo contenido se incorpora al presente documento por referencia.
Incorporación por referencia del listado de secuencias
El contenido del archivo de texto denominado "LBIO-001_001WO SEQ LISTING.txt", que se creó el 12 de mayo de 2018 y que tiene un tamaño de 265 kB, se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la detección de melanoma.
Antecedentes de la invención
El melanoma es un cáncer de piel común (-24-35/100,000 incidencia - Estados Unidos), altamente agresivo, con una incidencia que sigue aumentando. Los melanomas cutáneos más comunes están asociados con la exposición a los rayos UV y la desregulación inmunitaria. Como grupo, se sabe que el melanoma tiene la mayor carga mutacional (> 10 mutaciones/Mb). Las principales mutaciones incluyen BRAF (~50%), N-Ras (~20%) y NF-1 (~5%), que juntas comprenden el 75% de todas las mutaciones. Los melanomas son dependientes de la activación de la ruta MAPK, independientemente de que los tumores muestren mutaciones en genes que codifican proteínas en esta ruta. Esto proporciona la justificación para una terapia dirigida, por ejemplo, agentes BRAF v600E, en este tumor. Otras mutaciones de ganancia de función y de pérdida de función, por ejemplo, en genes de RASopatía y amplificación de ciclina D1/cdk4 y/o mutación/pérdida del supresor tumoral PTEN, también caracterizan el tumor. Esto hace que el melanoma sea uno de los cánceres más agresivos y resistentes a terapia.
Las tasas de supervivencia a cinco años varían del 95 al 100% para el estadio I, del 65 al 93% para el estadio II, del 41 al 71% y del 9 al 28% para los estadios III y IV, respectivamente. La cirugía, la inmunoterapia y las terapias dirigidas proporcionan la base para el tratamiento, con quimioterapia y radiación como complementos. La cirugía, no obstante, desempeña un papel crítico en el cuidado del melanoma (diagnóstico, cura y paliación). La biopsia del ganglio centinela se ha generalizado, ya que proporciona información pronóstica. El melanoma, sin embargo, carece de un biomarcador de actividad de la enfermedad no invasivo clínicamente útil, por ejemplo basado en la sangre, para ayudar a guiar el tratamiento del paciente proporcionando información predictiva o pronóstica.
Los factores basados en la sangre incluyen lactato deshidrogenasa (LDH), detección de mutaciones en el ADN tumoral circulante (ct), mediciones de células tumorales circulantes (CTC) y ARNm circulante. La LDH se utiliza típicamente para identificar el comportamiento agresivo del tumor y predecir la recurrencia, pero sus métricas son muy bajas, por ejemplo, del 30-50% de precisión. Tampoco es específico para el melanoma. Las mutaciones en genes diana, tales como BRAF, pueden detectarse en la sangre en ADNtc, pero su utilidad como indicador de la eficacia terapéutica es limitada, por ejemplo, del 45-70% de precisión. Las CTC no parecen ser un marcador preciso en los melanomas y no hay consenso en cuanto a su utilidad clínica. Se han detectado microNA (miARN) circulantes, pero aún no hay evidencias de su utilidad clínica.
Los conjuntos de marcadores para el diagnóstico de melanoma y la predicción de la respuesta al tratamiento son conocidos en la técnica anterior (véase, por ejemplo, el documento US 2010248225 A1, BANKATTIS-DAVIS DANUTE). En el presente documento se divulgan biomarcadores que se pueden utilizar para supervisar la eficacia de la cirugía o la terapia farmacológica en los melanomas.
Sumario de la invención
Entre otras cosas, en el presente documento se divulga una herramienta de expresión de 28 genes para un melanoma. Posee alta sensibilidad y especificidad (> 95%) para la detección de melanoma y puede diferenciar la enfermedad agresiva no tratada de la enfermedad tratada, estable.
Un aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para detectar un melanoma en un sujeto que lo necesite, que comprende: (1) determinar el nivel de expresión de al menos 29 biomarcadores a partir de una muestra de ensayo del sujeto poniendo en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 29 biomarcadores, en el que los, al menos 29, biomarcadores comprenden ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK, YY2 y al menos un gen constitutivo;
(2) normalizar el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión del, al menos un, gen constitutivo, obteniendo así un nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (3) introducir cada nivel de expresión normalizado en un algoritmo para generar una puntuación; (4) comparar la puntuación con un primer valor de corte predeterminado; y (5) producir un informe, en el que el informe identifica la presencia de un melanoma en el sujeto cuando la puntuación es igual o superior al primer valor de corte predeterminado o identifica la ausencia de un melanoma en el sujeto cuando la puntuación es inferior al primer valor de corte predeterminado, siendo 20 el primer valor de corte predeterminado en una escala de 0 a 100.
Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para determinar si un melanoma en un sujeto es estable o progresivo, que comprende: (1) determinar el nivel de expresión de al menos 29 biomarcadores a partir de una muestra de ensayo del sujeto poniendo en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 29, biomarcadores, en el que los, al menos 29, biomarcadores comprenden ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK, YY2 y al menos un gen constitutivo; (2) normalizar el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión del, al menos un, gen constitutivo, obteniendo así un nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (3) introducir cada nivel de expresión normalizado en un algoritmo para generar una puntuación; (4) comparar la puntuación con un segundo valor de corte predeterminado; y (5) producir un informe, en el que el informe identifica que el melanoma es progresivo cuando el nivel de expresión normalizado es igual o superior al segundo valor de corte predeterminado o identifica que el melanoma es estable cuando el nivel de expresión normalizado es inferior al segundo valor de corte predeterminado, siendo 50 el segundo valor de corte predeterminado en una escala de 0 a 100.
Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para evaluar el alcance de una resección quirúrgica en un sujeto que tiene un melanoma, que comprende: (1) determinar el nivel de expresión de al menos 29 biomarcadores a partir de una muestra de ensayo del sujeto después de la resección quirúrgica poniendo en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 29, biomarcadores, en el que los, al menos 29, biomarcadores comprenden ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK, YY2 y al menos un gen constitutivo; (2) normalizar el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CfLa R, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión del, al menos un, gen constitutivo, obteniendo así un nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (3) introducir cada nivel de expresión normalizado en un algoritmo para generar una puntuación; (4) comparar la puntuación con un tercer valor de corte predeterminado; y (5) producir un informe, en el que el informe identifica que la resección quirúrgica no elimina todo el melanoma cuando el nivel de expresión normalizado es igual o superior al tercer valor de corte predeterminado o identifica que la resección quirúrgica elimina todo el melanoma cuando el nivel de expresión normalizado es inferior al tercer valor de corte predeterminado, siendo 20 el tercer valor de corte predeterminado en una escala de 0 a 100.
En algunas formas de realización, el informe identifica además que el riesgo de recurrencia del melanoma es alto cuando el nivel de expresión normalizado es igual o superior al tercer valor de corte predeterminado o identifica que el riesgo de recurrencia del melanoma es bajo cuando el nivel de expresión normalizado es inferior al tercer valor de corte predeterminado.
Otro aspecto más de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para determinar una respuesta de un sujeto que tiene un melanoma a una terapia, que comprende: (1) determinar un primer nivel de expresión de al menos 28 biomarcadores a partir de una primera muestra de ensayo del sujeto en un primer punto temporal poniendo en contacto la primera muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 28, biomarcadores, en el que los 28 biomarcadores comprenden ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (2) determinar un segundo nivel de expresión de los, al menos 28, biomarcadores a partir de una segunda muestra de
ensayo del sujeto en un segundo punto temporal poniendo en contacto la segunda muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 28, biomarcadores, en el que el segundo punto temporal es posterior al primer punto temporal y posterior a la administración de la terapia al sujeto; (3) comparar el primer nivel de expresión con el segundo nivel de expresión; y (4) producir un informe, en el que el informe identifica que el sujeto responde a la terapia cuando el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión.
En algunas formas de realización, el primer punto temporal es anterior a la administración de la terapia al sujeto. En algunas formas de realización, el primer punto temporal es posterior a la administración de la terapia al sujeto. En algunas formas de realización, la terapia comprende una inmunoterapia o una terapia dirigida (por ejemplo, un inhibidor de BRAF).
En algunas formas de realización, el, al menos un, gen constitutivo se selecciona del grupo que consiste en ALG9, SEPN, YWHAQ, VPS37A, PRRC2B, DOPEY2, NDUFB11, ND4, MRPL19, PSMC4, SF3A1, PUM1, ACTB, GAPD, GUSB, RPLP0, TFRC, MORF4L1, 18S, PPIA, PGK1, RPL13A, B2M, YWHAZ, SDHA, HPRT1, TOX4 y TPT1.
En algunas formas de realización, el, al menos un, gen constitutivo comprende TOX4 y TPT1.
En algunas formas de realización, el nivel de expresión normalizado se obtiene: (1) normalizando el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, t Xk e y Y2 al nivel de expresión de TOX4, obteniendo así un primer nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (2) normalizando el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión de TPT1, obteniendo así un segundo nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; y (3) promediando el primer nivel de expresión normalizado y el segundo nivel de expresión normalizado para obtener el nivel de expresión normalizado.
En algunas formas de realización, el procedimiento puede tener una especificidad, una sensibilidad y/o una precisión de al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. En algunas formas de realización, el procedimiento tiene una sensibilidad superior al 90%. En algunas formas de realización, el procedimiento tiene una especificidad superior al 90%.
En las formas de realización, el biomarcador es ARN. También se divulgan como biomarcadores proteína y ADNc. Cuando el biomarcador es ARN, el ARN se puede transcribir de forma inversa para producir ADNc y se detecta el nivel de expresión de ADNc producido. En algunas formas de realización, el nivel de expresión del biomarcador se detecta formando un complejo entre el biomarcador y una sonda o cebador marcado. Cuando el biomarcador es ARN o ADNc, el ARN o el ADNc puede detectarse formando un complejo entre el ARN o el ADNc y una sonda o un cebador de ácido nucleico marcado. Cuando el biomarcador es una proteína, la proteína puede detectarse formando un complejo entre la proteína y un anticuerpo marcado. En algunas formas de realización, el marcador es un marcador fluorescente.
En algunas formas de realización, la muestra de ensayo es sangre, suero, plasma o tejido neoplásico.
En algunas formas de realización, el primer valor de corte predeterminado puede derivarse de una pluralidad de muestras de referencia obtenidas de sujetos libres de una enfermedad neoplásica. El segundo valor de corte predeterminado puede derivarse de una pluralidad de muestras de referencia obtenidas de sujetos cuyos melanomas están siendo controlados adecuadamente mediante terapias tales como inmunoterapia. El tercer valor de corte predeterminado puede derivarse de una pluralidad de muestras de referencia obtenidas de sujetos cuyos melanomas se han extirpado completamente mediante cirugía y se consideran "libres de enfermedad". En algunas formas de realización, cada una de las muestras de referencia puede ser sangre, suero, plasma o tejido no neoplásico.
En algunas formas de realización, el sujeto que lo necesita es un sujeto al que se le ha diagnosticado un melanoma, un sujeto que tiene al menos un síntoma de melanoma o un sujeto que tiene una predisposición o antecedentes familiares para desarrollar un melanoma. En algunas formas de realización, el sujeto es un ser humano.
En algunas formas de realización, el algoritmo es XGB, RF, glmnet, cforest, CART, treebag, knn, nnet, SVM-radial, SVM-lineal, NB, NNET o mlp.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico que muestra la visualización de la puntuación de melanoma como un sistema de tres contribuyentes al cuadro clínico: Control, Respuesta y Progresión. Las muestras hacia cada una de las esquinas representan representaciones puras de cada grupo clínico. Las muestras en el medio se encuentran en la zona de incertidumbre tanto algorítmica como clínica.
La figura 2 es un gráfico que muestra las métricas para el ensayo en el conjunto de ensayo que oscilaron entre el 87 y el 100%.
Las figuras 3A-3C son un conjunto de gráficos que muestran la evaluación del ensayo de gen de melanoma circulante (Melanomx) en el conjunto de ensayo 2. Los valores fueron significativamente más altos en las muestras de melanoma que en los controles (figura 3A). Los pacientes que respondían a la terapia tenían valores similares a los controles. El análisis de la curva receptor-operador del conjunto de ensayo 2 que identifica el AUC para diferenciar el melanoma de los controles fue > 0,95 (figura 3B). Las métricas para el ensayo oscilaron entre el 78 y el 92% (figura 3C).
Las figuras 4A-4B son un conjunto de gráficos que muestran el efecto de la cirugía sobre el Melanomx. Los niveles se redujeron significativamente con la cirugía (p < 0,0001) (figura 4A). Los valores en el grupo NED (sin evidencia de enfermedad después de la cirugía) fueron significativamente más bajos que en aquellos con enfermedad residual después de la cirugía (p = 0,0007) (figura 4B).
La figura 5 es un gráfico que muestra el efecto de la terapia sobre la puntuación Melanomx. Los niveles se redujeron significativamente con inmunoterapia (ipilimumab) o un inhibidor de BRAF (vemurafenib).
Las figuras 6A-6B son un conjunto de gráficos que muestran la puntuación Melanomx en 3 líneas celulares de melanoma diferentes. La figura 6A identifica las líneas celulares que muestran una expresión elevada: la puntuación Melanomx oscila entre 40 (A375) y 95 (Hs294). La figura 6B identifica que la adición de estas células a la sangre de un sujeto que no tiene melanoma dio como resultado una expresión génica y puntuaciones detectables. Se pudo identificar consistentemente un mínimo de 1 célula/ml de sangre.
Las figuras 7A-7B son un conjunto de gráficos que muestran la expresión en tejido tumoral y su correlación con muestras de sangre recogidas al mismo tiempo. En la figura 7A, la puntuación Melanomx osciló entre 40 y 97 en tejido tumoral de melanoma. Por el contrario, el epitelio normal mostró valores < 20. En la figura 7B, la expresión génica en tejido tumoral se compara con muestras de sangre correspondientes. Esto es altamente concordante (correlación ~0,80).
Descripción detallada de la invención
Los detalles de la invención se exponen en la descripción adjunta siguiente. Aunque se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la puesta en práctica o el ensayo de la presente invención, en este punto se describen procedimientos y materiales ilustrativos. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones. En la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares también incluyen el plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención.
Los primeros signos de melanoma incluyen cambios en la forma o el color de los lunares existentes o, en el caso del melanoma nodular, la aparición de un nuevo bulto en cualquier parte de la piel. En etapas posteriores, el lunar puede picar, ulcerarse o sangrar. La inspección visual es la técnica diagnóstica más común. El melanoma se puede dividir en los siguientes tipos: lentigo maligno, melanoma lentigo maligno, melanoma de extensión superficial, melanoma lentiginoso acral, melanoma mucoso, melanoma nodular, melanoma polipoide y melanoma desmoplásico.
Las mediciones de transcritos de melanoma circulantes, el Melanomx, identifican los melanomas y las disminuciones en la puntuación Melanomx se correlacionan con la eficacia de las intervenciones terapéuticas, tales como la inmunoterapia y la terapia dirigida. El perfil de expresión génica dirigida del ARN se puede aislar de la sangre periférica de pacientes con melanoma. Este perfil de expresión se evalúa en un algoritmo y se convierte en un resultado (predicción). Puede identificar la enfermedad activa, proporcionar una evaluación de las respuestas al tratamiento o predecir el riesgo de recaída, junto con la evaluación clínica estándar y la obtención de imágenes.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para detectar un melanoma en un sujeto que lo necesite, que incluye: (1) determinar el nivel de expresión de al menos 29 biomarcadores a partir de una muestra de ensayo del sujeto poniendo en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 29, biomarcadores, en el que los, al menos 29, biomarcadores comprenden ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA,
HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK, YY2 y al menos un gen constitutivo; (2) normalizar el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, tXk e YY2 al nivel de expresión del, al menos un, gen constitutivo, obteniendo así un nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CfLa R, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (3) introducir cada nivel de expresión normalizado en un algoritmo para generar una puntuación; (4) comparar la puntuación con un primer valor de corte predeterminado; y (5) producir un informe, en el que el informe identifica la presencia de un melanoma en el sujeto cuando la puntuación es igual o superior al primer valor de corte predeterminado o identifica la ausencia de un melanoma en el sujeto cuando la puntuación es inferior al primer valor de corte predeterminado, siendo 20 el primer valor de corte predeterminado en una escala de 0 a 100.
En algunas formas de realización, el, al menos un, gen constitutivo se selecciona del grupo que consiste en ALG9, SEPN, YWHAQ, VPS37A, PRRC2B, DOPEY2, NDUFB11, ND4, MRPL19, PSMC4, SF3A1, PUM1, ACTB, GAPD, GUSB, RPLP0, TFRC, MORF4L1, 18S, PPIA, PGK1, RPL13A, B2M, YWHAZ, SDHA, HPRT1, TOX4 y TPT1.
En algunas formas de realización, el, al menos un, gen constitutivo comprende TOX4 y TPT1. En algunas formas de realización, el nivel de expresión normalizado se obtiene: (1) normalizando el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión de TOX4, obteniendo así un primer nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, dNa JC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (2) normalizando el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión de TPT1, obteniendo así un segundo nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; y (3) promediando el primer nivel de expresión normalizado y el segundo nivel de expresión normalizado para obtener el nivel de expresión normalizado.
Entre los procedimientos proporcionados están aquellos que son capaces de clasificar o detectar un melanoma. En algunas formas de realización, los procedimientos proporcionados pueden identificar o clasificar un melanoma en una muestra de sangre humana. En algunos ejemplos, los procedimientos pueden proporcionar dicha información con una especificidad, una sensibilidad y/o una precisión de al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
Los agentes pueden ser cualquier agente para la detección de los biomarcadores, y normalmente son polinucleótidos aislados o polipéptidos o proteínas aislados, tales como anticuerpos, por ejemplo, aquellos que se hibridan o se unen específicamente a los, al menos 29, biomarcadores.
El biomarcador puede ser ARN, ADNc o proteína. Cuando el biomarcador es ARN, el ARN se puede transcribir de forma inversa para producir ADNc (tal como por RT-PCR) y se detecta el nivel de expresión de ADNc producido. El nivel de expresión del biomarcador se puede detectar formando un complejo entre el biomarcador y una sonda o un cebador marcado. Cuando el biomarcador es ARN o ADNc, el ARN o el ADNc se detecta formando un complejo entre el ARN o el ADNc y una sonda o un cebador de ácido nucleico marcado. El complejo entre el ARN o el ADNc y la sonda o el cebador de ácido nucleico marcado puede ser un complejo de hibridación.
Cuando el biomarcador es una proteína, la proteína puede detectarse formando un complejo entre la proteína y un anticuerpo marcado. El marcador puede ser cualquier marcador, por ejemplo, un marcador fluorescente, un marcador de quimioluminiscencia, un marcador radiactivo, etc. El nivel de proteína se puede medir mediante procedimientos que incluyen, pero sin limitación, inmunoprecipitación, ELISA, análisis de inmunotransferencia Western o inmunohistoquímica utilizando un agente, por ejemplo, un anticuerpo que detecta específicamente la proteína codificada por el gen.
En algunas formas de realización, los procedimientos se realizan poniendo en contacto la muestra de ensayo con uno de los agentes proporcionados, más típicamente con una pluralidad de los agentes proporcionados, por ejemplo, un conjunto de polinucleótidos que se unen específicamente a los, al menos 29, biomarcadores. En algunas formas de realización, el conjunto de polinucleótidos incluye ADN, ARN, ADNc, APN, ADN genómico u oligonucleótidos sintéticos. En algunas formas de realización, los procedimientos incluyen la etapa de aislar el ARN de la muestra de ensayo antes de la detección, tal como por RT-PCR, por ejemplo, QPCR. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la detección de biomarcadores de melanoma, tal como los niveles de expresión de los mismos, incluye la
detección de la presencia, la ausencia o la cantidad de ARN. En un ejemplo, el ARN se detecta por PCR o por hibridación.
En algunas formas de realización, los polinucleótidos incluyen cebadores sentido y antisentido, tal como un par de cebadores que son específicos para cada uno de los, al menos 29, biomarcadores. En un aspecto de esta forma de realización, la detección de los, al menos 29, biomarcadores se lleva a cabo mediante PCR, típicamente PCR cuantitativa o en tiempo real. Por ejemplo, en un aspecto, la detección se lleva a cabo produciendo ADNc a partir de la muestra de ensayo mediante transcripción inversa; después amplificando el ADNc utilizando los pares de cebadores sentido y antisentido que se hibridan específicamente con el panel de al menos 28 biomarcadores y detectando los productos de la amplificación.
La muestra de ensayo puede ser cualquier fluido biológico obtenido del sujeto. Preferentemente, la muestra de ensayo es sangre, suero, plasma o tejido neoplásico.
El primer valor de corte predeterminado puede derivarse de una pluralidad de muestras de referencia obtenidas de sujetos libres de una enfermedad neoplásica. Cada muestra de referencia puede ser cualquier fluido biológico obtenido de un sujeto que no tenga, no muestre síntomas o no se le haya diagnosticado una enfermedad neoplásica. En algunas formas de realización, la muestra de referencia es sangre, suero, plasma o tejido no neoplásico.
El sujeto que lo necesite puede ser un sujeto al que se le ha diagnosticado un melanoma, un sujeto que tenga al menos un síntoma de melanoma o un sujeto que tenga una predisposición o antecedentes familiares a desarrollar un melanoma. El sujeto puede ser cualquier mamífero. Preferentemente, el sujeto es un ser humano. Los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan indistintamente en el presente documento.
La puntuación es la puntuación Melanomx, que tiene una escala de 0 a 100. La puntuación Melanomx es el producto de un clasificador creado a partir de algoritmos de clasificación predictivos, por ejemplo, XGB, RF, glmnet, cforest, CART, treebag, knn, nnet, SVM-radial, SVM-lineal, NB, NNET o mlp. El algoritmo analiza los datos (es decir, los niveles de expresión) y después asigna una puntuación.
El procedimiento puede incluir además el tratamiento del sujeto identificado como portador de un melanoma con cirugía, terapia farmacológica, radioterapia o una combinación de los mismos. La terapia farmacológica puede ser una inmunoterapia, una terapia dirigida, una quimioterapia o una combinación de las mismas. En algunas formas de realización, la terapia farmacológica incluye una inmunoterapia. Los ejemplos de inmunoterapias para tratar un melanoma incluyen, pero sin limitación, Imlygic (T-VEC), Yervoy en combinación con Opdivo, Opdivo (nivolumab), Keytruda (pembrolizumab), Yervoy (ipilimumab), interleucina-2 (IL-2), e interferón alfa 2-b. En algunas formas de realización, la terapia farmacológica incluye una terapia dirigida tal como un inhibidor de BRAF. Los ejemplos de terapias dirigidas para tratar un melanoma incluyen, pero sin limitación, Zelboraf en combinación con Cotellic (cobimetinib), Tafinlar en combinación con Mekinist, Tafinlar (dabrafenib), Mekinist (trametinib) y Zelboraf (vemurafenib). En algunas formas de realización, la terapia farmacológica incluye quimioterapia. En algunas formas de realización, la quimioterapia incluye dacarbazina.
La presente divulgación también proporciona un procedimiento para determinar si un melanoma en un sujeto es estable o progresivo, que incluye: (1) determinar el nivel de expresión de al menos 29 biomarcadores a partir de una muestra de ensayo del sujeto poniendo en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 29, biomarcadores, en el que los, al menos 29, biomarcadores comprenden ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK, YY2 y al menos un gen constitutivo; (2) normalizar el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión del, al menos un, gen constitutivo, obteniendo así un nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, Cf La R, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (3) introducir cada nivel de expresión normalizado en un algoritmo para generar una puntuación; (4) comparar la puntuación con un segundo valor de corte predeterminado; y (5) producir un informe, en el que el informe identifica que el melanoma es progresivo cuando el nivel de expresión normalizado es igual o superior al segundo valor de corte predeterminado o identifica que el melanoma es estable cuando el nivel de expresión normalizado es inferior al segundo valor de corte predeterminado, siendo 50 el segundo valor de corte predeterminado en una escala de 0 a 100.
El segundo valor de corte predeterminado puede derivarse de una pluralidad de muestras de referencia obtenidas de sujetos cuyos melanomas están siendo controlados adecuadamente por terapias tales como inmunoterapia.
La resección quirúrgica es un procedimiento que elimina tejidos de melanoma del sujeto que lo necesita. La presente divulgación también proporciona un procedimiento para evaluar el alcance de la resección quirúrgica en un sujeto que
tiene un melanoma, que incluye: (1) determinar el nivel de expresión de al menos 29 biomarcadores a partir de una muestra de ensayo del sujeto después de una resección quirúrgica poniendo en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 29, biomarcadores, en el que los, al menos 29, biomarcadores comprenden ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, tXk , YY2 y al menos un gen constitutivo; (2) normalizar el nivel de expresión de cada uno de At L1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión del, al menos un, gen constitutivo, obteniendo así un nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (3) introducir cada nivel de expresión normalizado en un algoritmo para generar una puntuación; (4) comparar la puntuación con un tercer valor de corte predeterminado; y (5) producir un informe, en el que el informe identifica que la resección quirúrgica no elimina todo el melanoma cuando el nivel de expresión normalizado es igual o superior al tercer valor de corte predeterminado o identifica que la resección quirúrgica elimina todo el melanoma cuando el nivel de expresión normalizado es inferior al tercer valor de corte predeterminado, siendo 20 el tercer valor de corte predeterminado en una escala de 0 a 100.
El tercer valor de corte predeterminado puede derivarse de una pluralidad de muestras de referencia obtenidas de sujetos cuya enfermedad de melanoma se ha eliminado completamente mediante cirugía y se consideran "libres de enfermedad".
Cuando se determina que la resección quirúrgica no elimina todo el melanoma, el sujeto tiene riesgo de recurrencia del melanoma. En consecuencia, en algunas formas de realización, el informe identifica además que el riesgo de recurrencia del melanoma es alto cuando el nivel de expresión normalizado es igual o superior al tercer valor de corte predeterminado o identifica que el riesgo de recurrencia del melanoma es bajo cuando el nivel de expresión normalizado es inferior al tercer valor de corte predeterminado.
La presente divulgación también proporciona un procedimiento para determinar una respuesta de un sujeto que tiene un melanoma a una terapia, que comprende: (1) determinar un primer nivel de expresión de al menos 28 biomarcadores a partir de una primera muestra de ensayo del sujeto en un primer punto temporal poniendo en contacto la primera muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 28, biomarcadores, en el que los 28 biomarcadores comprenden ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (2) determinar un segundo nivel de expresión de los, al menos 28, biomarcadores a partir de una segunda muestra de ensayo del sujeto en un segundo punto temporal poniendo en contacto la segunda muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 28, biomarcadores, en el que el segundo punto temporal es posterior al primer punto temporal y posterior a la administración de la terapia al sujeto; (3) comparar el primer nivel de expresión con el segundo nivel de expresión; y (4) determinar que el sujeto responde a la terapia cuando el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión.
En algunas formas de realización, los procedimientos pueden predecir la respuesta al tratamiento o determinar si un paciente se ha vuelto clínicamente estable tras, o si responde o no responde a, un tratamiento de melanoma, tal como una intervención quirúrgica o una terapia farmacológica (por ejemplo, una inmunoterapia o terapia dirigida). En algunos casos, los procedimientos pueden hacerlo con una especificidad, una sensibilidad y/o una precisión de al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. En algunos casos, puede diferenciar entre melanoma tratado y no tratado con una especificidad, una sensibilidad y/o una precisión de al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
En algunas formas de realización, las muestras de ensayo primera y segunda pueden ser del mismo tipo. En algunas formas de realización, las muestras de ensayo primera y segunda pueden ser de diferentes tipos.
En algunas formas de realización, la terapia puede ser una terapia farmacológica. La terapia farmacológica puede ser una inmunoterapia, una terapia dirigida, una quimioterapia o una combinación de las mismas. En algunas formas de realización, la terapia puede ser una radioterapia.
En algunas formas de realización, el primer punto temporal es anterior a la administración de la terapia al sujeto. En algunas formas de realización, el primer punto temporal es posterior a la administración de la terapia al sujeto. El segundo punto temporal puede ser unos días, unas pocas semanas o unos meses posterior al primer punto temporal. Por ejemplo, el segundo punto temporal puede ser al menos 1 día, al menos 7 días, al menos 14 días, al menos 30 días, al menos 60 días o al menos 90 días posterior al primer punto temporal.
En algunas formas de realización, el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión cuando el segundo nivel de expresión es al menos el 10% inferior al primer nivel de
expresión. En algunas formas de realización, el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión cuando el segundo nivel de expresión es al menos el 20% inferior al primer nivel de expresión. En algunas formas de realización, el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión cuando el segundo nivel de expresión es al menos el 30% inferior al primer nivel de expresión. En algunas formas de realización, el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión cuando el segundo nivel de expresión es al menos el 40% inferior al primer nivel de expresión. En algunas formas de realización, el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión cuando el segundo nivel de expresión es al menos el 50% inferior al primer nivel de expresión. En algunas formas de realización, el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión cuando el segundo nivel de expresión es al menos el 60% inferior al primer nivel de expresión. En algunas formas de realización, el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión cuando el segundo nivel de expresión es al menos el 70% inferior al primer nivel de expresión. En algunas formas de realización, el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión cuando el segundo nivel de expresión es al menos el 80% inferior al primer nivel de expresión. En algunas formas de realización, el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión cuando el segundo nivel de expresión es al menos el 90% inferior al primer nivel de expresión.
En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además determinar un tercer nivel de expresión de los, al menos 28, biomarcadores a partir de una tercera muestra de ensayo del sujeto en un tercer punto temporal poniendo en contacto la tercera muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 28, biomarcadores, en el que el tercer punto temporal es posterior al segundo punto temporal. El procedimiento puede comprender además la creación de un gráfico que muestre la tendencia del cambio del nivel de expresión.
La presente divulgación también proporciona un ensayo que comprende: (1) determinar el nivel de expresión de biomarcadores que consisten esencialmente en los siguientes 30 biomarcadores a partir de una muestra de ensayo de un paciente al que se le ha diagnosticado un melanoma o un sujeto que se sospecha que tiene un melanoma: ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, Tx K, YY2, TOX4 y TPT1, en el que el nivel de expresión se mide poniendo en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los 30 biomarcadores; (2) normalizar el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión de TOX4, obteniendo así un primer nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (3) normalizar el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión de TPT1, obteniendo así un segundo nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (4) promediar el primer nivel de expresión normalizado y el segundo nivel de expresión normalizado para obtener un nivel de expresión normalizado para cada biomarcador; (5) introducir cada nivel de expresión normalizado en un algoritmo para generar una puntuación; y (6) comparar la puntuación con un primer valor de corte predeterminado.
La presente divulgación también proporciona un ensayo que comprende: (1) determinar el nivel de expresión de biomarcadores que consisten en los siguientes 30 biomarcadores a partir de una muestra de ensayo de un paciente al que se le ha diagnosticado un melanoma o un sujeto que se sospecha que tiene un melanoma: ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK, YY2, TOX4 y TPT1, en el que el nivel de expresión se mide poniendo en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los 30 biomarcadores; (2) normalizar el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión de TOX4, obteniendo así un primer nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (3) normalizar el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión de TPT1, obteniendo así un segundo nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D,
C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2; (4) promediar el primer nivel de expresión normalizado y el segundo nivel de expresión normalizado para obtener un nivel de expresión normalizado para cada biomarcador; (5) introducir cada nivel de expresión normalizado en un algoritmo para generar una puntuación; y (6) comparar la puntuación con un primer valor de corte predeterminado.
La información de secuencia de los biomarcadores de melanoma y constitutivos se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Información sobre la secuencia de biomarcador de melanoma/constitutivo
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Definiciones
Los artículos "uno" y "una" se utilizan en la presente divulgación para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
El término "y/o" se utiliza en la presente divulgación de modo que signifique "y" u "o" a menos que se indique lo contrario.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "polinucleótido" y "molécula de ácido nucleico" se utilizan indistintamente para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y pretende que se incluyan formas de ADN monocatenario y bicatenario. Tal como se utiliza en el presente documento, una molécula de ácido nucleico o una secuencia de ácido nucleico que sirve como sonda en un análisis de micromatrices comprende preferentemente una cadena de nucleótidos, de forma más preferida ADN y/o ARN. En otras formas de realización, una molécula de ácido nucleico o una secuencia de ácido nucleico comprende otros tipos de estructuras de ácido nucleico tales como, por ejemplo, una hélice de ADN/ARN, un ácido peptidonucleico (APN), un ácido nucleico bloqueado (ALN) y/o una ribozima. Por lo tanto, tal como se utiliza en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" también abarca una cadena que comprende nucleótidos no naturales, nucleótidos modificados y/o bloques de construcción no nucleotídicos que muestran la misma función que los nucleótidos naturales.
Tal como se utilizan en el presente documento, se pretende que los términos "hibridarse", "que se hibrida", "se hibrida" y similares, utilizados en el contexto de los polinucleótidos, se refieran a condiciones de hibridación convencionales, tales como la hibridación en 50% de formamida/6XSSC/0,1% de SDS/100 pg/ml de ADNmc, en el que las temperaturas de hibridación son superiores a 37 grados y las temperaturas de lavado en 0,1 de XSSC/0,1% de SDS son superiores a 55 °C, y preferentemente a condiciones de hibridación rigurosas.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "normalización" o "normalizador" se refiere a la expresión de
un valor diferencial en términos de un valor estándar para ajustar los efectos que surgen de la variación técnica debido a la manipulación de muestras, la preparación de muestras y los procedimientos de medición en vez de la variación biológica de la concentración de biomarcadores en una muestra. Por ejemplo, cuando se mide la expresión de una proteína expresada diferencialmente, el valor absoluto de la expresión de la proteína se puede expresar en términos de un valor absoluto de la expresión de una proteína patrón que tiene una expresión sustancialmente constante.
Los términos "diagnóstico" y "diagnósticos" también abarcan los términos "pronóstico" y "pronósticos", respectivamente, así como las aplicaciones de dichos procedimientos en dos o más puntos temporales para supervisar el diagnóstico y/o el pronóstico a lo largo del tiempo, y el modelado estadístico basado en los mismos. Además, el término diagnóstico incluye: a. predicción (determinar si un paciente probablemente desarrollará una enfermedad agresiva (hiperproliferativa/invasiva)), b. pronóstico (predecir si un paciente probablemente tendrá un resultado mejor o peor en un momento preseleccionado en el futuro), c. selección de terapia, d. supervisión de fármacos terapéuticos, y e. seguimiento de recaídas.
El término "proporcionar", tal como se utiliza en el presente documento con respecto a una muestra biológica, se refiere a obtener directamente o indirectamente la muestra biológica de un sujeto. Por ejemplo, "proporcionar" puede referirse al acto de obtener directamente la muestra biológica de un sujeto (por ejemplo, mediante extracción de sangre, biopsia de tejido, lavado y similares). Asimismo, "proporcionar" puede referirse al acto de obtener indirectamente la muestra biológica. Por ejemplo, proporcionar puede referirse al acto de un laboratorio que recibe la muestra de la parte que obtuvo directamente la muestra, o al acto de obtener la muestra de un archivo.
"Precisión" se refiere al grado de conformidad de una cantidad medida o calculada (un valor notificado de ensayo) con su valor real (o verdadero). La precisión clínica se relaciona con la proporción de resultados verdaderos (verdaderos positivos (TP) o verdaderos negativos (TN) frente a resultados clasificados incorrectamente (falsos positivos (FP) o falsos negativos (FN)), y puede establecerse como sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos (PPV) o valores predictivos negativos (NPV), o como probabilidad, razón de momios, entre otras medidas.
El término "muestra biológica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier muestra de origen biológico que contenga potencialmente uno o más biomarcadores. Los ejemplos de muestras biológicas incluyen tejido, órganos o fluidos corporales, tales como sangre completa, plasma, suero, tejido, lavado o cualquier otro espécimen utilizado para la detección de enfermedades.
El término "sujeto", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un mamífero, preferentemente a un ser humano.
"Tratar" o "tratamiento", tal como se utiliza en el presente documento con respecto a una afección, puede referirse a prevenir la afección, desacelerar el inicio o la velocidad de desarrollo de la afección, reducir el riesgo de desarrollar la afección, prevenir o retrasar el desarrollo de síntomas asociados con la afección, reducir o terminar con los síntomas asociados con la afección, generar una regresión completa o parcial de la afección, o alguna combinación de los mismos.
Los niveles de biomarcadores pueden cambiar debido al tratamiento de la enfermedad. Los cambios en los niveles de biomarcadores pueden medirse mediante la presente divulgación. Los cambios en los niveles de biomarcadores pueden utilizarse para supervisar la progresión de la enfermedad o la terapia.
"Alterado", "cambiado" o "significativamente diferente" se refiere a un cambio o diferencia detectable de un estado, un perfil, una medida o similar razonablemente comparable. Dichos cambios pueden ser todos o ninguno. Pueden ser incrementales y no precisan ser lineales. Pueden ser por órdenes de magnitud. Un cambio puede ser un aumento o una disminución del 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más, o cualquier valor entre el 0% y el 100%. Alternativamente, el cambio puede ser de 1, 1,5, 2, 3, 4, 5 veces o más, o cualquier valor entre 1 vez y cinco veces. El cambio puede ser estadísticamente significativo con un valor de p de 0,1,0,05, 0,001 o 0,0001.
El término "enfermedad estable" se refiere al diagnóstico de la presencia de un melanoma, pero el melanoma ha sido tratado y permanece en una condición estable, es decir, que no es progresiva, de forma determinada mediante datos de imágenes y/o el mejor juicio clínico.
El término "enfermedad progresiva" se refiere al diagnóstico de la presencia de un estado altamente activo de un melanoma, es decir, uno que no ha sido tratado y no es estable o ha sido tratado y no ha respondido a la terapia, o ha sido tratado y la enfermedad activa permanece, de forma determinada mediante datos de imágenes y/o el mejor juicio clínico.
Ejemplos
La divulgación se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse como limitantes de la presente divulgación en alcance o espíritu a los procedimientos específicos descritos en el presente documento.
Debe entenderse que los ejemplos se proporcionan para ilustrar determinadas formas de realización y que con los mismos no se pretende limitar el alcance de la descripción.
Ejemplo 1
Derivación de un panel de genes de 28 marcadores
Intensidades de sonda brutas (n = 6.892.960 características) a partir de n = 49 muestras de sangre completa para identificar los genes que discriminaban mejor entre diferentes tipos de muestras de melanoma, por ejemplo, tratados frente a no tratados, simultáneamente. Se identificaron un total de 28 transcritos de forma imparcial como marcadores potenciales del comportamiento del melanoma (tabla 2).
Se construyó un modelo de inteligencia artificial de dinámicas de enfermedad del melanoma utilizando la expresión génica normalizada de estos 28 marcadores en sangre completa de muestras de Controles (n = 90), Respondedores/Estables (n = 68), y Progresivos (n = 66). El conjunto de datos se dividió aleatoriamente en particiones de entrenamiento (n = 169) y ensayo (n = 55) para la creación y la validación de modelos, respectivamente. Se identificaron cinco algoritmos (XGB, RF, TreeBag, SVM, NNET) que mejor predecían los datos de entrenamiento. En el conjunto de ensayo, cada algoritmo produjo puntuaciones de probabilidad que predecían la muestra. Cada puntuación de probabilidad refleja la "certeza" de un algoritmo de que una muestra desconocida pertenezca a la clase de Control, Respondedor/Estable o Progresivo. Por ejemplo, una muestra desconocida S1 puede tener el siguiente vector de probabilidad {Control = 20, Respondedor = 50, Progresivo = 30). Esta muestra se consideraría respondedora, dada una puntuación de 50, pero puede haber un potencial de progresión (probabilidad de 30) (figura 1).
Tabla 2.
(continuación)
(continuación)
(continuación)
Diagnóstico: Identificación de muestras como melanoma
En el conjunto de ensayo 1, los datos para la utilidad del ensayo para diferenciar el melanoma de los controles se incluyen en la tabla 3. Las métricas están incluidas en la figura 2. Estas son: sensibilidad > 90%, especificidad 100%, PPV 100%, NPV 87%. La precisión general es del 94%. Por lo tanto, la herramienta puede diferenciar entre controles y melanoma agresivo y estable.
Tabla 3. Matriz de confusión que muestra la precisión de clasificación del algoritmo de 5 modelos que determina si una muestra es un melanoma o un control en muestras de sangre
El ensayo se evaluó en un segundo conjunto de ensayo (conjunto de ensayo 2) que incluía 74 controles y 92 pacientes con melanoma. La puntuación Melanomx media en el grupo de melanoma fue de 73±31 frente a 10±8 en el grupo de control (figura 3A). El análisis de la curva de receptor-operador demostró que la puntuación mostraba un área bajo la curva (Au C) de 0,96 (figura 3B) y las métricas fueron del 88-100% (figura 3c ).
Correlación con la extirpación quirúrgica del melanoma.
En la serie quirúrgica (n = 46), la extirpación del melanoma disminuyó la puntuación de 74±16 a 20±12 (figura 4A). La evaluación del grupo posquirúrgico identificó que la puntuación fue significativamente diferente entre pacientes sin evidencia de enfermedad 13±6 (no diferente al grupo control) y aquellos con enfermedad residual (33±9) (figura 4B). La puntuación Melanomx puede, por lo tanto, definir el alcance de la cirugía e identificar a los que son curas quirúrgicas.
Evaluación de inmunoterapia y terapia dirigida (inhibidor de BRAF).
En la serie de terapias (n = 30), el tratamiento con ipilimumab (terapia inmunitaria dirigida a CTLA-4), nivolumab (terapia inmunitaria dirigida a PD-1) o un inhibidor de BRAF (vemurafenib) durante 5 meses redujo significativamente las puntuaciones Melanomx de 88±12 a 15±5 (p < 0,0001), 35±14 (p < 0,001) y 38±21 (p < 0,0001), respectivamente (figura 5). Todos los pacientes de los grupos tratados estaban estables. Esto indica que, por lo tanto, la puntuación Melanomx se puede utilizar para medir la eficacia de la terapia inmunológica y dirigida en el melanoma y que una disminución en la puntuación se correlaciona con la respuesta a la intervención terapéutica.
Confirmación de que la expresión génica se deriva del melanoma.
Confirmamos que el melanoma era la fuente del ensayo de expresión génica basado en sangre mediante la evaluación de la expresión en diferentes líneas celulares de melanoma, en tejido tumoral y mediante la comparación de la expresión en sangre con tejido tumoral recogido en el mismo punto temporal durante la cirugía.
Los 28 genes se expresaron altamente en las 3 líneas celulares de melanoma. Las puntuaciones variaron de 94±6 (Hs294T) a 82±5 (CHL) a 42±9 (A375) (figura 6A).
Los experimentos de adición utilizando estas 3 líneas celulares y sangre completa normal demostraron que las puntuaciones de expresión génica se detectaban cuando se añadía tan solo 1 célula a 1 ml de sangre. Se detectó una sola célula de melanoma. Las puntuaciones variaron de 21 ±4 (A375) a 30±5 (CHL) a 34±2 (H2294) (figura 6B). Las puntuaciones fueron significativamente elevadas en comparación con la sangre de control (sin incremento; p < 0,0001).
Después evaluamos la expresión génica en tejido tumoral. Los 28 genes se expresaron altamente en melanoma en comparación con el tejido normal correspondiente y las puntuaciones fueron significativamente elevadas 70±20 frente a 4±3 (p<0,0001) (figura 7A).
También comparamos la expresión génica en tejido tumoral y sangre recogida en el mismo punto temporal. La expresión génica fue altamente concordante (Pearson r: 0,74 - 0,83, mediana: 0,819), lo que identifica que la expresión génica en tejido tumoral y sangre era concordante (figura 7B).
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Claims (16)
1. Un procedimiento para detectar un melanoma en un sujeto que lo necesite, que comprende:
determinar el nivel de expresión de al menos 29 biomarcadores de ARN a partir de una muestra de ensayo del sujeto poniendo en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 29, biomarcadores de ARN, en el que los, al menos 29, biomarcadores de ARN comprenden ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK, YY2 y al menos un gen constitutivo;
normalizar el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión del, al menos un, gen constitutivo, obteniendo así un nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2;
introducir cada nivel de expresión normalizado en un algoritmo para generar una puntuación;
comparar la puntuación con un valor de corte predeterminado; e
identificar la presencia de un melanoma en el sujeto cuando la puntuación es igual o superior al valor de corte predeterminado o identificar la ausencia de un melanoma en el sujeto cuando la puntuación es inferior al valor de corte predeterminado, siendo 20 el valor de corte predeterminado en una escala de 0 a 100.
2. Un procedimiento para evaluar el alcance de una resección quirúrgica en un sujeto que tiene un melanoma, que comprende:
determinar el nivel de expresión de al menos 29 biomarcadores de ARN a partir de una muestra de ensayo del sujeto después de la resección quirúrgica poniendo en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 29, biomarcadores de ARN, en el que los, al menos 29, ARN biomarcadores incluyen ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK, YY2 y al menos un gen constitutivo; normalizar el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión del, al menos un, gen constitutivo, obteniendo así un nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2;
introducir cada nivel de expresión normalizado en un algoritmo para generar una puntuación;
comparar la puntuación con un valor de corte predeterminado; e
identificar que la resección quirúrgica no elimina todo el melanoma cuando el nivel de expresión normalizado es igual o superior al valor de corte predeterminado o identificar que la resección quirúrgica elimina todo el melanoma cuando el nivel de expresión normalizado es inferior al valor de corte predeterminado, siendo 20 el valor de corte predeterminado en una escala de 0 a 100.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el procedimiento comprende además identificar que el riesgo de recurrencia del melanoma es alto cuando el nivel de expresión normalizado es igual o superior al valor de corte predeterminado o identifica que el riesgo de recurrencia del melanoma es bajo cuando el nivel de expresión normalizado es inferior al valor de corte predeterminado.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el, al menos un, gen constitutivo se selecciona del grupo que consiste en ALG9, SEPN, YWHAQ, VPS37A, PRRC2B, DOPEY2, NDUFB11, ND4, MRPL19, PSMC4, SF3A1, PUM1, ACTB, GAPD, GUSB, RPLP0, TFRC, MORF4L1, 18S, PPIA, PGK1, RPL13A, B2M, YWHAZ, SDHA, HPRT1, TOX4 y TPT1, preferentemente en el que el, al menos un, gen constitutivo comprende TOX4 y TPT1.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el nivel de expresión normalizado se obtiene:
normalizando el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión de TOX4, obteniendo así un primer nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2;
normalizando el nivel de expresión de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2 al nivel de expresión de TPT1, obteniendo así un segundo nivel de expresión normalizado de cada uno de ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CFLAR, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2;
promediando el primer nivel de expresión normalizado y el segundo nivel de expresión normalizado para obtener el nivel de expresión normalizado.
6. Un procedimiento para determinar una respuesta de un sujeto que tiene un melanoma a una terapia, que comprende:
determinar un primer nivel de expresión de al menos 28 biomarcadores de ARN a partir de una primera muestra de ensayo del sujeto en un primer punto temporal poniendo en contacto la primera muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 28, biomarcadores de ARN, en el que los 28 biomarcadores de ARN comprenden ATL1, ATP6V0D, C1ORF21, CfLa R, CFLAR-AS1, CHP1, DDX55, DMD, DNAJC9, ENOSF1, FANCL, HJURP, HLA-DOA, HLA-DRA, HNRNPA3P1, IL23A, IQGAP1, LOC494127, LOC646471, LOH12CR, PBXIP1, RNF5, SERTAD2, SLC35G5, SPATS2L, TDRD7, TXK e YY2;
determinar un segundo nivel de expresión de los, al menos 28, biomarcadores de ARN a partir de una segunda muestra de ensayo del sujeto en un segundo punto temporal poniendo en contacto la segunda muestra de ensayo con una pluralidad de agentes específicos para detectar la expresión de los, al menos 28, biomarcadores de ARN, en el que el segundo punto temporal es posterior al primer punto temporal y posterior a la administración de la terapia al sujeto;
comparar el primer nivel de expresión con el segundo nivel de expresión; e
identificar que el sujeto responde a la terapia cuando el segundo nivel de expresión disminuye significativamente en comparación con el primer nivel de expresión.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el primer punto temporal es
(a) anterior a la administración de la terapia al sujeto; o
(b) posterior a la administración de la terapia al sujeto.
8. El procedimiento de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que la terapia comprende
(a) una inmunoterapia; o
(b) una terapia dirigida, preferentemente
en el que la terapia dirigida comprende un inhibidor de BRAF.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene
(a) una sensibilidad superior al 90%; o
(b) una especificidad superior al 90%.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el melanoma es progresivo.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de expresión de los biomarcadores de ARN se detecta formando un complejo entre los biomarcadores y las sondas o cebadores marcados, preferentemente en el que el marcador es un marcador fluorescente.
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los biomarcadores de ARN se transcriben inversamente para producir ADNc, y se detecta el nivel de expresión del ADNc producido, preferentemente en el que el ADNc se detecta formando un complejo entre el ADNc y ácidos nucleicos o cebadores marcados, preferentemente en el que el marcador es un marcador fluorescente.
13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de ensayo es sangre, suero, plasma o tejido neoplásico.
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el valor de corte predeterminado se deriva de una pluralidad de muestras de referencia obtenidas de sujetos libres de una enfermedad neoplásica, preferentemente en el que cada muestra de referencia es sangre, suero, plasma o tejido no neoplásico.
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sujeto que lo necesita es un sujeto al que se le ha diagnosticado un melanoma, un sujeto que tiene al menos un síntoma de melanoma o un sujeto que tiene predisposición o antecedentes familiares para desarrollar un melanoma, preferentemente en el que el sujeto es un ser humano.
16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en el que el algoritmo es XGB, RF, glmnet, cforest, CART, treebag, knn, nnet, SVM-radial, SVM-lineal, NB, NNET o mlp.
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