PT2423229E - Membro de ligação para o recetor de gm-csf - Google Patents

Membro de ligação para o recetor de gm-csf Download PDF

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Paula Harrison
Matthew Sleeman
Andrew Nash
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Description

1
DESCRIÇÃO "MEMBRO DE LIGAÇÃO PARA O RECETOR DE GM-CSF" A presente invenção refere-se a membros de ligação para a cadeia alfa do Recetor do Fator de Estimulação de Colónias de Granulócitos/Macrófagos (GM-CSFRa), especialmente moléculas de anticorpo anti-GMCSFRa. Refere-se também à utilização destes membros de ligação no tratamento de doenças inflamatórias, respiratórias e autoimunes mediadas pelo GMCSFRa, incluindo artrite reumatoide, doença pulmonar obstrutiva crónica e esclerose múltipla. 0 GM-CSF é uma citocina pró-inflamatória de tipo I que melhora a sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação de uma grande gama de tipos de células hematopoiéticas incluindo neutrófilos, eosinófilos, macrófagos e suas células progenitoras. 0 recetor de GM-CSF é um membro da superfamilia de recetores de hematopoietina. É heterodimérico, consistindo de uma subunidade alfa e uma beta. A subunidade alfa é altamente especifica para o GM-CSF, enquanto que a subunidade beta é partilhada com outros recetores de citocinas, incluindo IL3 e IL5. Isto reflete-se numa distribuição mais ampla no tecido da subunidade recetora beta. A subunidade alfa, GM-CSFRa, é principalmente expressada em células mieloides e células não hematopoiéticas, tais como neutrófilos, macrófagos, eosinófilos, células dendriticas, células endoteliais e células epiteliais respiratórias. 0 GM-CSFRa inteiro é uma glicoproteina de membrana de tipo I com 400 aminoácidos que faz parte da familia de recetores de citocina de tipo I, e consiste de um péptido sinal de 22 aminoácidos (posições 1-22), um domínio extracelular de 298 aminoácidos (posições 23-320), um domínio transmembranar das posições 321 - 345 e 2 um domínio intracelular curto de 55 aminoácidos. 0 péptido sinal é dissociado para proporcionar a forma madura de GM-CSFRa como uma proteína de 378 aminoácidos. Encontram-se disponíveis clones de ADNc do GM-CSFRa humano e murídeo e, ao nível da proteína, as subunidades do recetor têm 36% de identidade. 0 GM-CSF é capaz de ligar-se com afinidade relativamente baixa à subunidade α sozinha (Kd 1-5 nM) mas de modo nenhum à subunidade β sozinha. No entanto, a presença de ambas as subunidades α e β resulta num complexo ligando-recetor de afinidade elevada (Kd « ΙΟΟρΜ). A sinalização de GM-CSF ocorre através da sua ligação inicial à cadeia α do GM-CSFR e, em seguida, reticulação com uma subunidade maior a cadeia β comum para gerar a interação de afinidade elevada, gue fosforila a via JAK-STAT. A ligação do GM-CSFR ao GMCSF é revista na ref. [1] . Esta interação também é capaz de sinalizar através da fosforilação da tirosina e ativação da via de MAP-cinase.
Patologicamente, foi demonstrado que o GM-CSF desempenha um papel na exacerbação de doenças inflamatórias, respiratórias e autoimunes. A neutralização da ligação de GM-CSF ao GM-CSFRa é, por conseguinte, uma abordagem terapêutica para o tratamento de doenças e condições mediadas pelo GM-CSFR.
Nicola et al. [2] descreveram um anticorpo murídeo contra o GM-CSFRa humano, designado 2B7-17-A ou "2B7", o qual foi descrito como tendo uma afinidade relativamente elevada para o GM-CSFRa humano e como sendo um inibidor potente da ação biológica do GM-CSF humano em vários bioensaios diferentes. 0 anticorpo 2B7 encontra-se comercialmente disponível de Chemicon como MAB1037, e a Folha de Dados de Produto para ο MAB1037 indica que é um inibidor potente da ação biológica do GM-CSF. 0 2B7 foi também divulgado na WO94/09149. 3
Utilizando uma combinação de seleções de bibliotecas de fagos de scFv naturais, mutagénese aleatória e ensaios bioquímicos e biológicos apropriadamente concebidos (ver a Parte Experimental abaixo), nós identificámos moléculas de anticorpo altamente potentes que se ligam ao GM-CSFRa humano e inibem a ação do GM-CSF humano no seu recetor. Os resultados aqui apresentados indicam que os nossos anticorpos ligam uma região ou epítopo diferente do GM-CSFRa em comparação com o anticorpo anti-GM-CSFRa conhecido 2B7, e surpreendentemente são ainda mais potentes do que o 2B7 como demonstrado numa variedade de ensaios biológicos.
Por conseguinte, esta invenção refere-se a membros de ligação que ligam o GM-CSFRa humano e inibem a ligação de GM-CSF humano ao GM-CSFRa, como explicitado nas reivindicações 1 a 6 apensas. Os membros de ligação da invenção podem ser antagonistas de GM-CSFR. Os membros de ligação podem ser inibidores reversíveis competitivos da sinalização de GM-CSF através de GM-CSFR.
Os anticorpos e outro membros de ligação da invenção são particularmente valiosos na ligação e neutralização de GM-CSFRa e, deste modo, são úteis em tratamentos para doenças mediadas pelo GM-CSFRa, incluindo doenças inflamatórias e autoimunes, como indicado pelas experiências aqui contidas e literatura técnica comprovante. Por exemplo, nós demonstrámos em ensaios baseados em células que os anticorpos da invenção são capazes de inibir a libertação de citocinas (por exemplo IL-6 e TNFa) induzida pela ligação de GM-CSF nativo ao seu recetor. Como explicado em mais pormenor abaixo, a inibição da atividade do GM-CSF através do bloqueio da ligação ao GM-CSFRa é uma abordagem terapêutica para o tratamento de doenças tais como artrite reumatoide (RA), asma, inflamação das vias aéreas induzida 4 por fumo, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), resposta alérgica, esclerose múltipla (MS), leucemia mieloide e aterosclerose.
Os membros de ligação de acordo com a invenção geralmente ligam o domínio extracelular de GM-CSFRa. Preferencialmente, um membro de ligação da invenção liga pelo menos um resíduo de Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln (YLDFQ), SEQ ID NO: 201, nas posições 226 a 230 do GM-CSFRa humano maduro (SEQ ID NO: 206) . O membro de ligação pode ligar pelo menos um resíduo na sequência YLDFQ do GM-CSFRa humano, por exemplo ele pode ligar um, dois, três ou quatro resíduos da sequência YLDFQ. Assim, o membro de ligação pode reconhecer um ou mais resíduos dentro desta sequência, e opcionalmente pode também ligar resíduos flanqueadores adicionais ou resíduos estruturalmente próximos no domínio extracelular de GM-CSFRa. A ligação pode ser determinada por qualquer método adequado, por exemplo, pode ser utilizado um varrimento de ligação de péptidos, tal como um imunoensaio ligado a enzima (ELISA) baseado em PEPSCAN, como descrito em pormenor aqui noutro sítio. Numa varrimento de ligação de péptidos, tal como o tipo proporcionado pelos Sistemas PEPSCAN, péptidos sobrepostos curtos derivados do antigénio são sistematicamente rastreados no que se refere à ligação a um membro de ligação. Os péptidos podem ser covalentemente acoplados a uma superfície de suporte para formar uma matriz de péptidos. Resumidamente, um varrimento de ligação de péptidos (por exemplo "PEPSCAN") envolve a identificação (por exemplo, utilizando ELISA) de um conjunto de péptidos ao qual o membro de ligação se liga, em que os péptidos têm sequências de aminoácidos que correspondem a fragmentos de SEQ ID NO: 206 (por exemplo, péptidos de cerca de 15 resíduos contíguos de SEQ ID NO: 5 206), e o alinhamento dos péptidos para determinar uma impressão de residuos ligada pelo membro de ligação, em que a impressão compreende residuos comuns aos péptidos sobrepostos. De acordo com a invenção, a impressão identificada pelo varrimento de ligação de péptidos ou PEPSCAN pode compreender pelo menos um residuo de YLDFQ que corresponde às posições 226 a 230 de SEQ ID NO: 206. A impressão pode compreender um, dois, três, quatro ou todos os residuos de YLDFQ. Um membro de ligação de acordo com a invenção pode ligar um fragmento de péptido (por exemplo de 15 residuos) de SEQ ID NO: 206 compreendendo um ou mais, preferencialmente todos os residuos YLDFQ correspondentes às posições 226 a 230 de SEQ ID NO: 206, por exemplo como determinado por um varrimento de ligação de péptidos ou método PEPSCAN aqui descrito. Assim, um membro de ligação da invenção pode ligar um péptido possuindo uma sequência de aminoácidos de 15 residuos contíguos de SEQ ID NO: 206, em que a sequência de 15 residuos compreende pelo menos um residuo de, ou, pelo menos, sobrepõe-se parcialmente com, YLDFQ nas posições 226 a 230 de SEQ ID NO: 206. Os detalhes de um método de varrimento de ligação de péptidos adequado para determinar a ligação são explicitados em pormenor aqui noutro sitio. Outros métodos que são bem conhecidos na técnica e poderiam ser utilizados para determinar os resíduo ligados por um anticorpo, e/ou para confirmar os resultados do varrimento de ligação de péptidos (por exemplo PEPSCAN), incluem a mutagénese especifica de um locus, troca hidrogénio deutério, espetrometria de massa, RMN e cristalografia de raios X.
Por conseguinte, um membro de ligação da invenção neutraliza preferencialmente o GM-CSFRa. Neutralização significa redução ou inibição da atividade biológica de GM-CSFRa, por exemplo redução ou inibição da ligação do GM-CSF ao GM-CSFRa, ou da sinalização pelo GM-CSFRa, por exemplo 6 como medido pelas respostas mediadas pelo GM-CSFRa. A redução ou inibição da atividade biológica pode ser parcial ou total. 0 grau em que um anticorpo neutraliza o GM-CSFRa é referido como a sua potência de neutralização. A potência pode ser determinada ou medida utilizando um ou mais ensaios conhecidos do especialista e/ou como descrito ou referido aqui. Por exemplo, o membro de ligação pode ter atividade de neutralização em um ou mais dos seguintes ensaios: • Ensaio bioquímico de ligação a ligando • Ensaio de proliferação de TF-1 • Ensaio de alteração da forma de granulócitos humanos • Ensaio de alteração da forma de granulócitos de primatas não humanos em Cynomolgus • Ensaio de libertação de TNFa de monócitos • Ensaio de sobrevivência de granulócitos • Ensaio de formação de colónias (inibição da diferenciação mediada por GM-CSF in vitro de progenitores de células sanguíneas) • Inibição da bioatividade de GM-CSF in vivo por exemplo em ratos quiméricos com medula óssea transgénica que expressa o GM-CSFR humano • Ensaio de libertação de citocinas de células mononucleares do sangue periférico A potência é normalmente expressada como um valor de IC50, em pM salvo indicação em contrário. Nos ensaios funcionais, a IC50 é a concentração que reduz uma resposta biológica em 50 % do seu máximo. Nos estudos de ligação a ligando, a IC50 é a concentração que reduz a ligação ao recetor em 50 % do nivel máximo de ligação especifica. A IC50 pode ser calculada representando graficamente a % de resposta biológica máxima (representada, por exemplo, pela 7 proliferação celular, a qual pode ser medida como a incorporação de 3H timidina em cpm, num ensaio de proliferação, pela alteração de forma num ensaio de alteração de forma, pela libertação de TNFa num ensaio de libertação de TNFa, pela sobrevivência num ensaio de sobrevivência, pelo número de colónias num ensaio de formação de colónias, ou pelo aumento do peso do baço ou pela diminuição dos monócitos circulantes em ratos quiméricos com medula óssea transgénica que expressa o GM-CSFR humano num teste de bioatividade) ou % de ligação especifica ao recetor como uma função do log da concentração do membro de ligação, e utilizando um programa de software tal como o Prism (GraphPad) para ajustar uma função sigmoide aos dados para gerar valores de IC50.
Um valor de IC50 pode representar a média de uma multiplicidade de medições. Assim, por exemplo, os valores de IC50 podem ser obtidos a partir dos resultados de experiências em triplicado, e pode ser depois calculado um valor de IC50 médio.
No ensaio de proliferação de TF-1, os membros de ligação da invenção têm normalmente uma IC50 inferior a 1500 pM. Por exemplo, a IC50 pode ser < 300, < 60, < 10 ou < 1,5 pM, por exemplo, cerca de 1,0 pM. Normalmente, a IC50 é pelo menos 0,5 ou 1,0 nM. O anticorpo murideo conhecido 2B7 tinha uma IC50 de cerca de 1600 pM neste ensaio. 0 ensaio de proliferação de TF-1 aqui utilizado foi com uma concentração final de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de proliferação de TF-1 representa a aptidão de um membro de ligação para inibir a proliferação de células TF-1 induzida por 7 pM de GM-CSF humano. Para mais detalhes ver a secção de Métodos de Ensaio e Materiais.
Um membro de ligação da invenção pode ter uma pA2 mais negativa do que -6, -7, -8, -9, -10, -10,5 ou -11 no ensaio de proliferação de TF-1. Por exemplo, a pA2 pode ser de cerca de -10,5 ou -11. O cálculo e o significado dos valores de pA2 são discutidos em pormenor na Parte Experimental sob Métodos de Ensaio e Materiais.
No ensaio de alteração da forma de granulócitos humanos, os membros de ligação da invenção têm normalmente uma IC50 inferior a 100 pM, por exemplo inferior a 50 pM ou inferior a 30, 25, 20, 15 ou 10 pM. Normalmente, a IC50 é pelo menos 5, 6 ou 7 pM. Em contraste, o anticorpo murideo conhecido 2B7 é menos potente com uma IC50 medida de 477 pM neste ensaio. O ensaio de alteração da forma de granulócitos humanos aqui utilizado foi com uma concentração final de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de alteração da forma de granulócitos humanos representa a aptidão de um membro de ligação para inibir a alteração de forma de granulócitos humanos induzida por 7 pM de GM-CSF humano. Para mais detalhes ver a secção de Métodos de Ensaio e Materiais.
No ensaio de alteração da forma de granulócitos de cynomolgus, os membros de ligação da invenção têm normalmente uma IC50 de menos de 20 pM, tipicamente inferior a 10, 5 ou 2,5 pM. A IC50 pode ser de pelo menos 0,5, 1 ou 1,5 pM. O anticorpo murideo conhecido 2B7 tinha uma IC50 de 26 pM quando testado neste ensaio. O ensaio de alteração da forma de granulócitos de cynomolgus aqui utilizado foi com uma concentração final de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de alteração da forma de granulócitos de cynomolgus representa a aptidão de um membro de ligação para inibir a alteração de forma de granulócitos de cynomolgus induzida 9 por 7 pM de GM-CSF humano. Para mais detalhes ver a secção de Métodos de Ensaio e Materiais.
Um membro de ligação da invenção pode ter uma pA2 mais negativa do que -6, -7, -8, -9, -10, -10,5 ou -11 no ensaio de alteração de forma humano e/ou cynomologus. Preferencialmente a pA2 é de cerca de -10 ou -11.
No ensaio de libertação de TNFa de monócitos, os membros de ligação da invenção têm normalmente uma IC50 inferior a 150 pM, tipicamente inferior a 110 pM, por exemplo, inferior a ΙΟΟρΜ. A IC50 pode ser pelo menos 30 ou 40 pM. O ensaio de libertação de TNFa de monócitos aqui utilizado foi com uma concentração final de 1 nM de GM-CSF humano. Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de libertação de TNFa de monócitos representa a aptidão de um membro de ligação para inibir a libertação de TNFa a partir de monócitos humanos estimulados com 1 nM de GM-CSF humano. Para mais detalhes ver a secção de Métodos de Ensaio e Materiais.
No ensaio de sobrevivência de granulócitos, os membros de ligação da invenção têm normalmente uma IC50 inferior a 1000 pM, tipicamente inferior a 850 pM. A IC50 pode ser inferior a 500, 250, 150, 100, 50, 30, 20 ou 10 pM. A IC50 pode ser de pelo menos 5 pM. O anticorpo murideo conhecido 2B7 é inativo neste ensaio até uma concentração de 83nM. O ensaio de sobrevivência de granulócitos aqui utilizado foi com uma concentração final de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de sobrevivência de granulócitos representa a aptidão de um membro de ligação para inibir a sobrevivência de granulócitos humanos induzida por 7 pM de GM-CSF humano. Para mais detalhes ver a secção de Métodos de Ensaio e Materiais. 10
No ensaio de formação de colónias, os membros de ligação da invenção podem ter uma IC50 inferior a 5, inferior a 2,5, inferior a 1 ou inferior a 0,3 yg/mL. Preferencialmente, a IC50 é 0,25 yg/mL ou menos, por exemplo inferior a 0,1 yg/mL. A IC50 pode ser de pelo menos 0,05 yg/mL. O anticorpo murideo conhecido 2B7 tem pouca, se é que alguma, atividade neste ensaio até uma concentração de lOyg/mL (67nM). O ensaio de formação de colónias aqui utilizado foi com uma concentração final de 10 ng/mL de GM-CSF humano. Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de formação de colónias representa a aptidão de um membro de ligação para inibir a formação de colónias induzida por 10 ng/mL de GM-CSF humano. Para mais detalhes ver a secção de Métodos de Ensaio e Materiais.
Um membro de ligação da invenção pode apresentar uma aptidão dependente da dose para inibir o aumento de peso do baço e/ou para inibir uma diminuição dos monócitos circulantes induzida por GM-CSF em ratos quiméricos com medula óssea transgénica que expressa o GM-CSFR humano, que são tratados com GM-CSF humano. A IC50 para a inibição do aumento de peso do baço pode ser inferior a 5, inferior a 2,5, inferior a 2, inferior a 1 ou inferior a 0,75 mg/kg. Nalgumas formas de realização, a IC50 pode ser de pelo menos 0,5 mg/kg.
Adicionalmente, a cinética e afinidade de ligação de membros de ligação para o GM-CSFRa humano podem ser determinadas, por exemplo por ressonância plasmónica superficial, por exemplo, utilizando BIAcore. Os membros de ligação da invenção têm normalmente uma KD inferior a 5 nM e mais preferencialmente inferior a 4, 3, 2 ou 1 nM. Preferencialmente, a KD é inferior a 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,15 nM. 11
Os membros de ligação da invenção normalmente ligam o GM-CSFRa de primatas não humanos, por exemplo GM-CSFRa de cynomolgous além de GM-CSFRa humano. Como existe uma homologia baixa entre o recetor de GM-CSF humano e murideo (aproximadamente 36%), os membros de ligação da invenção geralmente não se ligarão ou reagirão de forma cruzada com o recetor murideo.
Normalmente um membro de ligação da invenção compreende uma molécula de anticorpo, por exemplo um anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo, como discutido em mais pormenor abaixo. Preferencialmente, uma molécula de anticorpo da invenção é uma molécula de anticorpo humano.
Um membro de ligação da invenção compreende normalmente um dominio VH e/ou VL de anticorpo. Dentro de cada um dos domínios VH e VL encontram-se regiões determinantes de complementaridade ("CDRs") e regiões estruturais ("FRs"). Um domínio VH compreende um conjunto de HCDRs e um domínio VL compreende um conjunto de LCDRs. Uma molécula de anticorpo compreende tipicamente um domínio VH de anticorpo compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 e uma estrutura de VH. Aquela pode, alternativa ou adicionalmente, compreender um domínio VL de anticorpo compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 e uma estrutura de VL. Uma estrutura do domínio VH ou VL compreende quatro regiões estruturais, FR1, FR2, FR3 e FR4, interpoladas com CDRs na estrutura seguinte: FR1 - CDR1 FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.
Os exemplos de domínios VH e VL de anticorpo, FRs e CDRs de acordo com a presente invenção são como listados na listagem de sequências apensas que fazem parte da presente divulgação. Um "conjunto de CDRs" compreende CDR1, CDR2 e CDR3. Assim, um conjunto de HCDRs significa HCDR1, HCDR2 e 12 HCDR3, e um conjunto de LCDRs significa LCDR1, LCDR2 e LCDR3. Salvo indicação em contrário, um "conjunto de CDRs" inclui HCDRs e LCDRs. Tipicamente, os membros de ligação da invenção são anticorpos monoclonais (mAb).
Como descrito em mais pormenor na Parte Experimental, nós identificámos um painel de moléculas de anticorpo que ligam o GM-CSFRcx. Nós também identificámos certos resíduos dentro das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) dos domínios VH e VL que são especialmente importantes para a ligação ao recetor e para a potência de neutralização. Uma vez que as CDRs são os responsáveis primários pela determinação da ligação e especificidade de um membro de ligação, uma ou mais CDRs possuindo os resíduos apropriados como aqui definidos podem ser utilizadas e incorporadas em qualquer estrutura adequada, por exemplo uma estrutura do domínio VH e/ou VL de anticorpo, ou uma armação proteica não anticorpo, como descrita em mais pormenor aqui noutro sítio. Por exemplo, uma ou mais CDRs ou um conjunto de CDRs de um anticorpo podem ser enxertadas numa estrutura (por exemplo estrutura humana) para proporcionar uma molécula de anticorpo ou diferentes moléculas de anticorpo. Por exemplo, uma molécula de anticorpo pode compreender CDRs como aqui divulgadas e regiões estruturais de sequências de segmentos do gene da linha germinal humana. Pode ser proporcionado um anticorpo com um conjunto de CDRs dentro de uma estrutura que pode ser sujeita a manipulação germinal, onde um ou mais resíduos dentro da estrutura são alterados para condizer com os resíduos na posição equivalente na estrutura da linha germinal humana mais semelhante. Assim, as regiões estruturais do anticorpo são preferencialmente de linhas germinais e/ou humanas. Nós realizámos uma investigação para determinar quais os resíduos de um anticorpo candidato eram importantes para 13 reconhecimento do antigénio, seguindo o método explicitado na secção experimental, e em seguida realizámos a análise da sequência de 160 clones que exibiram uma potência pelo menos 5 vezes superior à do clone de anticorpo parental num ensaio biológico. Os resultados indicaram as seguintes posições como contribuindo para a ligação ao antigénio: residuos Kabat 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 e 96 no dominio VL e residuos Kabat 17, 34, 54, 57, 95, 97, 99 e 100B no dominio VH. Em formas de realização preferidas da invenção, um ou mais destes residuos Kabat é o residuo
Kabat presente nessa posição para um ou mais dos clones de anticorpo numerados 1, 2 e 4-20, cujas sequências são divulgadas na listagem de sequências apensa. Em várias formas de realização, o residuo pode ser o mesmo, ou pode diferir, do residuo presente nessa posição no anticorpo 3. A nossa análise indicou 4 posições de residuos nas CDRs que têm uma influência particularmente forte na ligação do recetor: H97, H100B, L90 e L92 (numeração Kabat).
Preferencialmente, ο H97 da CDR3 de VH é S. O residuo de serina nesta posição foi observado em todos os 160 clones e, por conseguinte, representam um residuo importante para reconhecimento do antigénio.
Preferencialmente, uma CDR3 de VH compreende um ou mais dos seguintes residuos: V, N, A ou L no residuo Kabat H95, muito preferencialmente V; S, F, Η, P, T ou W no residuo Kabat H99, muito preferencialmente S; A, T, P, S, V ou H no residuo Kabat H100B, muito preferencialmente A ou T. 14
Preferencialmente, o resíduo Kabat H34 na CDR1 de VH é I. Preferencialmente, a CDR2 de VH compreende E no resíduo Kabat H54 e/ou I no resíduo Kabat H57.
Nos casos em que o membro de ligação compreende um domínio VH de anticorpo, o resíduo Kabat H17 na estrutura do domínio VH é preferencialmente S. 0 resíduo Kabat H94 é preferencialmente I ou uma substituição conservadora do mesmo (por exemplo L, V, A ou M). Normalmente, ο H94 é I.
Preferencialmente, uma CDR3 de VL compreende um ou mais dos seguintes resíduos: S, T ou M no resíduo Kabat L90, muito preferencialmente S ou T; D, E, Q, S, M ou T no resíduo Kabat L92, muito preferencialmente D ou E; A, P, S, T, I, L, M ou V no resíduo Kabat L96, muito preferencialmente S, P, I ou V, especialmente S. 0 resíduo Kabat L95A na CDR3 de VL é preferencialmente S.
Preferencialmente, uma CDR1 de VL compreende um ou mais dos seguintes resíduos: S no resíduo Kabat 27A; N no resíduo Kabat 27B; 1 no resíduo Kabat 27C; D no resíduo Kabat 32.
Preferencialmente, uma CDR2 de VL compreende um ou mais dos seguintes resíduos: N no resíduo Kabat 51; N no resíduo Kabat 52; K no resíduo Kabat 53. 15
Numa forma de realização preferida, um membro de ligação da invenção compreende uma ou mais CDRs selecionadas das CDRs de VH e VL, isto é, uma CDR1, 2 e/ou 3 de VH e/ou uma CDR 1, 2 e/ou 3 de VL de qualquer um dos anticorpos 1, 2 ou 4 a 20 como mostrados na listagem de sequências. Numa forma de realização preferida, um membro de ligação da invenção compreende uma CDR3 de VH de qualquer uma das seguintes moléculas de anticorpo: Anticorpo 1 (SEQ ID NO 5) ; Anticorpo 2 (SEQ ID NO 15); Anticorpo 4 (SEQ ID NO 35); Anticorpo 5 (SEQ ID NO 45); Anticorpo 6 (SEQ ID NO 55); Anticorpo 7 (SEQ ID NO 65); Anticorpo 8 (SEQ ID NO 75); Anticorpo 9 (SEQ ID NO 85); Anticorpo 10 (SEQ ID NO 95); Anticorpo 11 (SEQ ID NO 105) ; Anticorpo 12 (SEQ ID NO 115); Anticorpo 13 (SEQ ID NO 125); Anticorpo 14 (SEQ ID NO 135); Anticorpo 15 (SEQ ID NO 145); Anticorpo 16 (SEQ ID NO 155); Anticorpo 17 (SEQ ID NO 165); Anticorpo 18 (SEQ ID NO 175); Anticorpo 19 (SEQ ID NO 185); Anticorpo 20 (SEQ ID NO 195) . Preferencialmente, o membro de ligação compreende adicionalmente uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 173 e/ou uma CDR2 de VH de SEQ ID NO: 4. Preferencialmente, um membro de ligação compreendendo a CDR3 de VH de SEQ ID NO: 175 compreende uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 173, mas pode alternativamente compreender uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 3.
Preferencialmente, o membro de ligação compreende um conjunto de CDRs de VH de um dos seguintes anticorpos: Anticorpo 1 (SEQ ID 3-5); Anticorpo 2 (SEQ ID 13-15); Anticorpo 4 (SEQ ID 33-35); Anticorpo 5 (SEQ ID 43-45); Anticorpo 6 (SEQ ID 53-55); Anticorpo 7 (SEQ ID 63-65); Anticorpo 8 (SEQ ID 73-75); Anticorpo 9 (SEQ ID 83-85); Anticorpo 10 (SEQ ID 93-95); Anticorpo 11 (SEQ : ID 103-105); Anticorpo 12 (SEQ ID 113-115); Anticorpo 13 (SEQ ID 123-
125); Anticorpo 14 (SEQ ID 133-135); Anticorpo 15 (SEQ ID 143-145); Anticorpo 16 (SEQ ID 153-155); Anticorpo 17 (SEQ 16 ID 163-165); Anticorpo 18 (SEQ ID 173-175); Anticorpo 19 (SEQ ID 183-185); Anticorpo 20 (SEQ ID 193-195). Opcionalmente também pode compreender um conjunto de CDRs de VL de um destes anticorpos e os CDRs de VL podem ser do mesmo ou de um anticorpo diferente que as CDRs de VH. Geralmente, um domínio VH é emparelhado com um domínio VL para proporcionar um sítio de ligação de antigénio de anticorpo, embora nalgumas formas de realização um domínio VH ou VL possa ser utilizado sozinho para ligar o antigénio. A promiscuidade da cadeia leve está bem estabelecida na técnica e, deste modo, os domínios VH e VL não têm de ser do mesmo clone como aqui divulgado.
Um membro de ligação pode compreender um conjunto de H e/ou L CDRs de qualquer um dos anticorpos 1 a 20 com uma ou mais substituições, por exemplo dez ou menos, por exemplo uma, duas, três, quatro ou cinco, substituições dentro do conjunto divulgado de H e/ou L CDRs. As substituições preferidas são nos resíduos Kabat que não os resíduos Kabat 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 e 96 no domínio VL e resíduos Kabat 34, 54, 57, 95, 97, 99 e 100B no domínio VH. Nos casos em que as substituições são feitas nestas posições, a substituição é preferencialmente por um resíduo aqui indicado como sendo um resíduo preferido nessa posição.
Numa forma de realização preferida, um membro de ligação da invenção é uma molécula de anticorpo humano isolada possuindo um domínio VH compreendendo um conjunto de HCDRs num estrutura de linha germinal humana, por exemplo estrutura de linha germinal humana da família da cadeia pesada VH1 ou VH3. Numa forma de realização preferida, a molécula de anticorpo humano isolada tem um domínio VH compreendendo um conjunto de HCDRs numa estrutura de linha germinal humana VH1 DP5 ou VH3 DP47. Assim, as regiões 17 estruturais do domínio VH podem compreender regiões estruturais do segmento VH1 DP5 ou VH3 DP47 do gene da linha germinal humana. A sequência de aminoácidos da FR1 de VH pode ser a SEQ ID NO: 251. A sequência de aminoácidos da FR2 de VH pode ser a SEQ ID NO: 252. A sequência de aminoácidos da FR3 de VH pode ser a SEQ ID NO: 253. A sequência de aminoácidos da FR4 de VH pode ser a SEQ ID NO: 254 .
Normalmente, o membro de ligação também tem um domínio VL compreendendo um conjunto de LCDRs, preferencialmente numa estrutura de linha germinal humana por exemplo uma estrutura de linha germinal humana da cadeia leve da família Vlambda 1 ou Vlambda 6. Numa forma de realização preferida, a molécula de anticorpo humano isolada tem um domínio VL compreendendo um conjunto de LCDRs numa estrutura de linha germinal humana VLambda 1 DPL8 ou VLambda 1 DPL3 ou VLambda 6_6a. Assim, a estrutura do domínio VL pode compreender regiões estruturais do segmento VLambda 1 DPL8, VLambda 1 DPL3 ou VLambda 6_6a do gene da linha germinal humana. A FR4 do domínio VL pode compreender uma região estrutural do segmento JL2 do gene da linha germinal humana. A sequência de aminoácidos da FR1 de VL pode ser a SEQ ID NO: 255. A sequência de aminoácidos da FR2 de VL pode ser a SEQ ID NO: 256. A sequência de aminoácidos da FR3 de VL pode ser a 257. A sequência de aminoácidos da FR4 de VL pode ser a SEQ ID NO: 258.
Um anticorpo de não-linha germinal tem as mesmas CDRs, mas estruturas diferentes, em comparação com um anticorpo de linha germinal.
Um membro de ligação da invenção pode competir pela ligação ao GM-CSFRa com qualquer membro de ligação aqui divulgado, por exemplo o anticorpo 3 ou quaisquer dos anticorpos 1, 2 18 ou 4-20. Assim, um membro de ligação pode competir pela ligação ao GM-CSFRa com uma molécula de anticorpo compreendendo o domínio VH e o domínio VL de qualquer um dos anticorpos 1, 2 ou 4-20. A competição entre membros de ligação pode ser facilmente analisada in vitro, por exemplo adicionando uma molécula repórter a um membro de ligação que pode ser detetado na presença de um ou mais de outros membros de ligação não marcados, para possibilitar a identificação de membros de ligação que ligam o mesmo epítopo ou um epitopo sobreposto.
Por exemplo, a competição pode ser determinada utilizando um ELISA, no qual, por exemplo, o dominio extracelular de GM-CSFRa, ou um péptido do dominio extracelular, é imobilizado numa placa e é adicionado à placa um primeiro membro de ligação marcado juntamente com um ou mais de outros membros de ligação não marcados. A presença de um membro de ligação não marcado que compete com o membro de ligação marcado é observada por uma diminuição no sinal emitido pelo membro de ligação marcado. Analogamente, pode ser utilizado um ensaio de ressonância plasmónica superficial para determinar a competição entre membros de ligação.
Ao testar quanto à competição pode ser utilizado um fragmento de péptido do antigénio, especialmente um péptido incluindo ou consistindo essencialmente de um epítopo ou região de ligação de interesse. Pode ser utilizado um péptido possuindo o epitopo ou a sequência alvo juntamente com um ou mais aminoácidos em quaisquer das extremidades. Os membros de ligação de acordo com a presente invenção podem ser de tal forma que a sua ligação ao antigénio é inibida por um péptido com ou incluindo a sequência dada. 19
Os membros de ligação que ligam um péptido podem ser isolados, por exemplo, a partir de uma biblioteca de apresentação de fagos por combinação com o(s) péptido(s).
Um membro de ligação como acima pode ser utilizado para medir niveis de antigénio num ensaio de competição, ou seja um método de medição do nivel de antigénio numa amostra utilizando um membro de ligação como proporcionado pela presente invenção num ensaio de competição. Isto pode ser o caso quando não é necessária separação fisica do antigénio ligado do não ligado. A ligação de uma molécula repórter ao membro de ligação de modo que ocorra uma alteração fisica ou ótica aquando da ligação é uma possibilidade. A molécula repórter pode gerar direta ou indiretamente sinais detetáveis, e preferencialmente mensuráveis. A ligação de moléculas repórter pode ser direta ou indiretamente, de forma covalente, por exemplo via uma ligação peptídica, ou não covalente. A ligação via uma ligação peptidica pode ser o resultado da expressão recombinante de uma fusão de gene que codifica o anticorpo e a molécula repórter.
Os niveis de antigénio também podem ser medidos diretamente, utilizando um membro de ligação de acordo com a invenção, por exemplo, num sistema biossensor. A ligação de um membro de ligação como aqui proporcionado ao GM-CSFRa pode ocorrer in vivo, por exemplo após administração de um membro de ligação, ou ácido nucleico que codifica um membro de ligação, ou pode ocorrer in vitro, por exemplo em ELISA, transferência de Western, imunocitoquímica, imunoprecipitação, cromatografia de afinidade, ou ensaios baseados em células tal como um ensaio de TF-1. 20
Pode determinar-se a quantidade de ligação do membro de ligação ao GM-CSFRoí. A quantificação pode ser relacionada com a quantidade de antigénio numa amostra de ensaio, a qual pode ser de interesse diagnóstico ou prognóstico. É também descrito um kit compreendendo um membro de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com qualquer aspeto ou forma de realização da presente invenção. No kit, o membro de ligação ou molécula de anticorpo pode ser marcado para permitir que se determine a sua reatividade numa amostra, por exemplo como descrito mais abaixo. Os componentes de um kit são geralmente estéreis e estão em frascos selados ou outros recipientes. Os kits podem ser utilizados em análise de diagnóstico ou outros métodos para os quais são úteis as moléculas de anticorpo. Um kit pode conter instruções de utilização dos componentes num método. Num kit da invenção podem ser incluidos materiais auxiliares para ajudar ou permitir a realização de um tal método.
As reatividades dos anticorpos numa amostra podem ser determinadas por qualquer meio apropriado. O radioimunoensaio (RIA) é uma possibilidade. Antigénio marcado radioativo é misturado com antigénio não marcado (a amostra de ensaio) e deixado ligar-se ao anticorpo. O antigénio ligado é fisicamente separado do antigénio não ligado e determinada a quantidade de antigénio radioativo ligado ao anticorpo. Quanto mais antigénio existe na amostra de ensaio, tanto menos antigénio radioativo se ligará ao anticorpo. Pode ser também utilizado um ensaio de ligação competitiva com antigénio não radioativo, utilizando o antigénio ou um análogo ligado a uma molécula repórter. A molécula repórter pode ser um fluorocromo, corante de fósforo ou para laser com caracteristicas de absorção ou emissão espetralmente isoladas. Os fluorocromos adequados incluem fluoresceina, rodamina, ficoeritrina e 21
Vermelho do Texas. Os corantes cromogénicos adequados incluem diaminobenzidina. Outros repórteres incluem partículas coloidais macromoleculares ou material em partículas tais como esferas de látex que são coloridas, magnéticas ou paramagnéticas, e agentes biológica ou quimicamente ativos que podem originar, direta ou indiretamente, sinais detetáveis que podem ser observados visualmente, detetados eletronicamente ou registados de outro modo. Estas moléculas podem ser enzimas, as quais, por exemplo, catalisam reações que desenvolvem ou alteram cores, ou originam alterações nas propriedades elétricas. Elas podem ser molecularmente excitáveis, de tal forma que transições eletrónicas entre estados de energia resultam em absorções ou emissões espetrais características. Elas podem incluir entidades quimicas utilizadas em conjunto com biossensores. Podem ser utilizados sistemas de deteção de biotina/avidina ou biotina/estreptavidina e fosfatase alcalina.
Os sinais gerados por conjugados anticorpo-repórter individuais podem ser utilizados para obter dados absolutos ou relativos quantificáveis da ligação do anticorpo relevante em amostras (normal e ensaio). É também descrito um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica um membro de ligação, dominio VH e/ou dominio VL como aqui explicitado. 0 ácido nucleico pode incluir ADN e/ou ARN, e pode ser total ou parcialmente sintético. A referência a uma sequência de nucleótidos como aqui explicitada abrange uma molécula de ADN com a sequência especificada e abrange uma molécula de ARN com a sequência especificada na qual T é substituída por U, a menos que o contexto exija de outro modo. 0 ácido nucleico pode codificar um CDR ou conjunto de CDRs ou dominio VH ou dominio VL ou sitio de ligação de antigénio de anticorpo ou 22 molécula de anticorpo, por exemplo scFv ou IgGl ou IgG4, da invenção como aqui definida. As construções podem ser proporcionadas na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleótido como acima.
Uma célula hospedeira pode ser transformada com, ou pode conter, o ácido nucleico. Uma tal célula hospedeira pode estar in vitro e pode estar em cultura.
Esse ácido nucleico pode ser introduzido numa célula hospedeira. A introdução pode utilizar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, as técnicas adequadas podem incluir transfeção com fosfato de cálcio, DEAE-Dextrano, electroporação, transfeção mediada por lipossomas e transdução utilizando retrovírus ou outros vírus, por exemplo vaccinia ou, para células de inseto, baculovírus. A introdução de ácido nucleico na célula hospedeira, em particular uma célula eucariótica, pode utilizar um sistema virai ou baseado em plasmídeo. 0 sistema de plasmídeo pode ser mantido epissomicamente ou pode ser incorporado na célula hospedeira ou num cromossoma artificial. A incorporação pode ser por integração aleatória ou dirigida de uma ou mais cópias em sítios únicos ou múltiplos. No caso de células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir transformação com cloreto de cálcio, electroporação e transfeção utilizando bacteriófagos. A introdução pode ser seguida de originar ou permitir a expressão do ácido nucleico, por exemplo cultivando as células hospedeiras sob condições para expressão do gene.
Numa forma de realização, o ácido nucleico da invenção é integrado no genoma (por exemplo cromossoma) da célula 23 hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas correntes. A presente invenção também proporciona um método que compreende a utilização de uma construção como especificada acima num sistema de expressão para expressar um membro de ligação como acima. Um método pode compreender a expressão do referido ácido nucleico sob condições para provocar a produção do referido membro de ligação e recuperá-lo. Um tal método pode compreender cultivar as células hospedeiras sob condições para produzir o referido membro de ligação.
Um método de produção pode compreender um passo de isolamento e/ou purificação do produto. Um método de produção pode compreender a formulação do produto numa composição incluindo pelo menos um componente adicional, tal como um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Os sistemas para clonagem e expressão de um polipéptido numa variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. As células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamífero, células vegetais, levedura e sistemas de baculovírus e plantas e animais transgénicos. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpo nas células procarióticas está bem estabelecido na técnica [3]. Um hospedeiro bacteriano comum, preferido é a E. coli. A expressão em células eucarióticas em cultura está também disponível para os especialistas na técnica como uma opção para a produção de um membro de ligação [4,5,6]. As linhas de células de mamíferos disponíveis na técnica para expressão de um polipéptido heterólogo incluem células de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa, células renais de cria de hamster, células de melanoma de rato NSO, 24 células de mieloma de ratazana YB2/0, células de rim embrionário humano, células de retina embrionária humana e muitas outras.
Podem ser escolhidos ou construidos vetores adequados, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências, consoante apropriado. Os vetores podem ser plasmideos por exemplo fagomideo, ou virais por exemplo 'fago, consoante apropriado [7]. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácido nucleico, por exemplo na preparação de construções de ácido nucleico, mutagénese, sequenciação, introdução de ADN em células e expressão de genes, e análise de proteinas, são descritos em pormenor em Ausubel et al. [8].
Um ou mais membros de ligação capazes de ligar o antigénio podem ser obtidos por um método que inclui pôr em contacto uma biblioteca de membros de ligação de acordo com a invenção e o referido antigénio, e selecionar um ou mais membros de ligação da biblioteca capazes de ligar o referido antigénio. A biblioteca pode ser apresentada sobre partículas ou complexos moleculares, por exemplo pacotes genéticos replicáveis tais como partículas de levedura, bacterianas ou de bacteriófagos (por exemplo T7), ou sistemas de apresentação in vitro covalentes, ribossómicos ou outros, contendo cada partícula ou complexo molecular o ácido nucleico que codifica o domínio variável VH de anticorpo apresentado sobre o mesmo e, opcionalmente, também um domínio VL apresentado, se presente. Após seleção dos membros de ligação capazes de ligar o antigénio e apresentação em bacteriófagos ou outras partículas ou 25 complexos moleculares da biblioteca, o ácido nucleico pode ser retirado de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular que apresente o referido membro de ligação selecionado. Esse ácido nucleico pode ser utilizado na produção posterior de um membro de ligação ou um domínio variável VH ou VL de anticorpo por expressão a partir de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico retirada de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular que apresenta o referido membro de ligação selecionado.
Um domínio variável VH de anticorpo com a sequência de aminoácidos de um domínio variável VH de anticorpo de um referido membro de ligação selecionado pode ser proporcionado na forma isolada, como pode um membro de ligação compreendendo um tal domínio VH.
Um domínio variável VL de anticorpo com a sequência de aminoácidos de um domínio variável VL de anticorpo de um referido membro de ligação selecionado pode ser proporcionado na forma isolada, como pode um membro de ligação compreendendo um tal domínio VL. A aptidão para ligar o GM-CSFRa pode ser adicionalmente testada, bem como a aptidão para competir com quaisquer dos anticorpos 1 a 20 (por exemplo no formato de scFv e/ou formato de IgG, por exemplo IgGl ou IgG4) para se ligar ao GM-CSFRa. Pode ser testada a aptidão para neutralizar o GM-CSFRa.
As variantes dos domínios VH e VL e das CDRs da presente invenção, incluindo aquelas para as quais são aqui explicitadas sequências de aminoácidos, podem ser obtidas por meio de métodos de alteração de sequência ou mutação e seleção, e podem ser utilizadas em membros de ligação para o GM-CSFRa. Seguindo a orientação da química computacional 26 na aplicação de técnicas de análise multivariada de dados às relações estrutura/propriedade-atividade [9], as relações atividade quantitativa-propriedade dos anticorpos podem ser derivadas utilizando técnicas matemáticas bem conhecidas tais como regressão estatística, reconhecimento e classificação de padrões [10,11,12,13,14,15]. As propriedades dos anticorpos podem ser derivadas a partir de modelos empíricos e teóricos (por exemplo, análise de resíduos de contacto provável ou propriedade físico-química calculada) de sequência de anticorpos, estruturas funcionais e tridimensionais e estas propriedades podem ser consideradas isoladamente e em combinação.
Um sítio de ligação de antigénio de anticorpo constituído por um domínio VH e um domínio VL é constituído por seis ansas de polipéptido: três do domínio variável de cadeia leve (VL) e três do domínio variável de cadeia pesada (VH). A análise de anticorpos de estrutura atómica conhecida esclareceu relações entre a sequência e estrutura tridimensional de sítios de combinação dos anticorpos [16,17]. Estas relações implicam que, exceto para a terceira região (ansa) nos domínios VH, as ansas do sítio de ligação possuam uma de um número pequeno de conformações da cadeia principal: estruturas canónicas. Foi demonstrado que a estrutura canónica que se forma numa ansa particular é determinada pelo seu tamanho e pela presença de certos resíduos em sítios chave tanto na ansa como em regiões estruturais [16,17].
Este estudo da relação sequência-estrutura pode ser utilizado para prever os resíduos num anticorpo de sequência conhecida, mas de uma estrutura tridimensional desconhecida, que são importantes para manter a estrutura tridimensional das suas ansas de CDR e, deste modo, manter a ligação. Estas previsões podem ser corroboradas pela 27 comparação das previsões com o resultado de experiências de otimização de lider. Numa abordagem estrutural pode ser criado um modelo da molécula de anticorpo [18] utilizando qualquer pacote comercial ou livremente disponivel tal como o WAM [19]. Um pacote de software de visualização e análise de proteínas tal como o Insight II (Accelerys, Inc.) ou Deep View [20] pode ser depois utilizado para avaliar as substituições possiveis em cada posição da CDR. Esta informação pode ser depois utilizada para fazer substituições com probabilidade de ter um efeito minimo ou benéfico na atividade.
As técnicas necessárias para fazer substituições nas sequências de aminoácidos de CDRs, dominios VH ou VL de anticorpo e membros de ligação estão geralmente disponíveis na técnica. Podem ser preparadas sequências variantes, com substituições que podem ou não ser previstas como tendo um efeito minimo ou benéfico na atividade, e testadas quanto à aptidão para ligarem e/ou neutralizarem o GM-CSFRoí e/ou quanto a qualquer outra propriedade desejada.
Como discutido, de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas variantes da sequência de aminoácidos do dominio variável de qualquer um dos dominios VH e VL, cujas sequências são aqui especificamente divulgadas. As variantes particulares podem incluir uma ou mais alterações da sequência de aminoácidos (adição, supressão, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), podem ser menos de cerca de 20 alterações, menos de cerca de 15 alterações, menos de cerca de 10 alterações ou menos de cerca de 5 alterações, podem ser 5, 4, 3, 2 ou 1. Podem ser feitas alterações em uma ou mais regiões estruturais e/ou uma ou mais CDRs. 28
Preferencialmente, as alterações não resultam na perda de função, pelo que um membro de ligação compreendendo uma sequência de aminoácidos assim alterada retém preferencialmente uma aptidão para ligar e/ou neutralizar o GM-CSFRa. Mais preferencialmente, ele retém a mesma ligação quantitativa e/ou aptidão de neutralização que um membro de ligação em que não é feita a alteração, por exemplo como medida num ensaio aqui descrito. Muito preferencialmente, o membro de ligação compreendendo uma sequência de aminoácidos assim alterada tem uma melhor aptidão para ligar ou neutralizar o GM-CSFRa em comparação com um membro de ligação em que não é feita a alteração, por exemplo como medida num ensaio aqui descrito. A alteração pode compreender substituir um ou mais residuos de aminoácido por um aminoácido não natural ou não corrente, modificar um ou mais residuos de aminoácido em uma forma não natural ou não corrente, ou inserir um ou mais aminoácidos não naturais ou não correntes na sequência. Os números e as localizações preferidas das alterações nas sequências da invenção são aqui descritas noutro sitio. Os aminoácidos naturais incluem os 20 L-aminoácidos "correntes" identificados como G, A, V, L, I, Μ, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E pelos seus códigos padrão de uma letra. Os aminoácidos não correntes incluem qualquer outro residuo que possa ser incorporado numa estrutura de polipéptido ou resulte da modificação de um residuo de aminoácido existente. Os aminoácidos não correntes pode ser naturais ou não naturais. Vários aminoácidos não correntes naturais são conhecidos na técnica, tais como 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metil-histidina, N-acetilserina, etc. [21]. Aqueles residuos de aminoácido que estão derivatizados na sua posição N-alfa encontrar-se-ão apenas localizados na extremidade N-terminal de uma sequência de aminoácidos. 29
Normalmente, na presente invenção um aminoácido é um L-aminoácido, mas nalgumas formas de realização pode ser um D-aminoácido. Por conseguinte, alteração pode compreender modificar um L-aminoácido em, ou substitui-lo por, um D-aminoácido. São também conhecidas formas metiladas, acetiladas e/ou fosforiladas dos aminoácidos, e os aminoácidos na presente invenção podem ser sujeitos a esse tipo de modificação.
As sequências de aminoácidos nos dominios de anticorpo e membros de ligação da invenção podem compreender os aminoácidos não naturais ou não correntes descritos acima. Nalgumas formas de realização, os aminoácidos não correntes (por exemplo D-aminoácidos) podem ser incorporados numa sequência de aminoácidos durante a síntese, enquanto noutras formas de realização os aminoácidos não correntes podem ser introduzidos por modificação ou substituição dos aminoácidos correntes "originais" após síntese da sequência de aminoácidos. A utilização de aminoácidos não correntes e/ou não naturais aumenta a diversidade estrutural e funcional, e podem, deste modo, aumentar o potencial para conseguir as propriedades de ligação e neutralização do GM-CSFRa desejadas num membro de ligação da invenção. Além disso, foi demonstrado que os D-aminoácidos e análogos têm melhores perfis farmacocinéticos em comparação com os L-aminoácidos correntes, devido à degradação in vivo dos polipéptidos possuindo L-aminoácidos após administração a um animal.
Como assinalado acima, uma sequência de aminoácidos de CDR substancialmente como aqui explicitada é preferencialmente transportada como uma CDR num domínio variável de anticorpo humano ou uma porção substancial do mesmo. As sequências de 30 HCDR3 substancialmente como aqui explicitadas representam formas de realização preferidas da presente invenção e é preferido que cada uma destas seja transportada como uma HCDR3 num domínio variável de cadeia pesada humana ou numa porção substancial do mesmo.
Os domínios variáveis utilizados na invenção podem ser obtidos ou derivados de qualquer linha germinal ou domínio variável humano rearranjado, ou pode ser um domínio variável sintético baseado em sequências consenso ou reais de domínios variáveis humanos conhecidos. Uma sequência CDR da invenção (por exemplo CDR3) pode ser introduzida num reportório de domínios variáveis que carecem de uma CDR (por exemplo CDR3), utilizando tecnologia de ADN recombinante.
Por exemplo, Marks et al. (1992) [22] descrevem métodos de produção de reportórios de domínios variáveis de anticorpo em que são utilizados iniciadores consenso dirigidos para ou adjacentes à extremidade 5' da área do domínio variável em conjunto com iniciadores consenso para a terceira região estrutural dos genes de VH humano para proporcionar um reportório de domínios variáveis VH que carecem de uma CDR3. Marks et al. descrevem ainda como este reportório pode ser combinado com uma CDR3 de um anticorpo particular. Utilizando técnicas análogas, as sequências derivadas de CDR3 da presente invenção podem ser misturadas de forma aleatória com reportórios de domínios VH ou VL que carecem de uma CDR3, e os domínios VH ou VL completos misturados de forma aleatória combinados com um domínio VL ou VH cognato para proporcionar membros de ligação da invenção. O reportório pode ser depois apresentado num sistema hospedeiro adequado tal como o sistema de apresentação em fago da W092/01047 ou qualquer um de um grande corpo de literatura posterior, incluindo ref. [23], de modo que 31 possam ser selecionados membros de ligação adequados. Um reportório pode consistir de qualquer coisa como desde 104 membros individuais para cima, por exemplo desde 106 a 108 ou 1010 membros. Outros sistemas hospedeiros adequados incluem apresentação em levedura, apresentação bacteriana, apresentação em T7, apresentação virai, apresentação em células, apresentação em ribossomas e apresentação covalente. Técnicas de mistura aleatória ou combinatórias análogas são também divulgadas por Stemmer (1994) [24], o qual descreve a técnica em relação a um gene de β-lactamase mas refere que a abordagem pode ser utilizada para a geração de anticorpos.
Uma outra alternativa consiste em gerar novas regiões VH ou VL portadoras de sequências derivadas de CDR da invenção utilizando mutagénese aleatória de um ou mais genes de VH e/ou VL selecionados para gerar mutações dentro de todo o domínio variável. Uma técnica desse tipo é descrita por Gram et al. (1992) [25], os quais utilizaram PCR propensa a erro. Em formas de realização preferidas são feitas uma ou duas substituições de aminoácidos dentro de um conjunto de HCDRs e/ou LCDRs. Outro método que pode ser utilizado é a mutagénese dirigida a regiões CDR de genes de VH ou VL [26,27] .
Um sitio de ligação de antigénio de anticorpo para o antigénio de GM-CSFRa pode ser obtido por um método que compreende proporcionar, por meio de adição, supressão, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos de um domínio VH aqui explicitado, um domínio VH que é uma variante da sequência de aminoácidos do domínio VH, combinando opcionalmente o domínio VH assim proporcionado com um ou mais domínios VL, e testando o domínio VH ou combinação ou combinações VH/VL para identificar um membro de ligação ou um sítio de 32 ligação de antigénio de anticorpo para o antigénio de GM-CSFRa e, opcionalmente, com uma ou mais propriedades preferidas, preferencialmente aptidão para neutralizar a atividade do GM-CSFRa. 0 referido dominio VL pode ter uma sequência de aminoácidos que é substancialmente como aqui explicitada.
Pode ser utilizado um método análogo em que uma ou mais variantes da sequência de um dominio VL aqui divulgado são combinadas com um ou mais domínios VH.
Um membro de ligação para o antigénio de GM-CSFRa pode ser preparado por um método que compreende : (a) proporcionar um reportório de partida de ácidos nucleicos que codificam um domínio VH, os quais incluem uma CDR3 a ser substituída ou carecem de uma região de codificação de CDR3; (b) combinar o referido reportório com um ácido nucleico dador que codifica uma sequência de aminoácidos substancialmente como aqui explicitada para uma CDR3 de VH de tal forma que o referido ácido nucleico dador é inserido na região CDR3 no reportório, de forma a proporcionar um reportório-produto de ácidos nucleicos que codificam um domínio VH; (c) expressar os ácidos nucleicos do referido reportório-produto; (d) selecionar um membro de ligação para o GM-CSFRa; e (e) recuperar o referido membro de ligação ou ácido nucleico que o codifica.
Mais uma vez, pode utilizar-se um método análogo em que uma CDR3 de VL da invenção é combinada com um reportório de ácidos nucleicos que codificam um domínio VL que incluem 33 uma CDR3 a ser substituída ou carecem de uma região de codificação de CDR3.
Analogamente, uma ou mais, ou todas as três CDRs podem ser enxertadas num reportório de domínios VH ou VL que são depois pesquisados quanto a um membro de ligação ou membros de ligação para o GM-CSFRa.
Numa forma de realização preferida podem ser utilizadas uma ou mais HCDR1, HCDR2 e HCDR3, por exemplo um conjunto de HCDRs de Anticorpo 1 (SEQ ID NOS: 3-5); Anticorpo 2 (SEQ ID NOS: 13-15); Anticorpo 4 (SEQ ID NOS: 33-35); Anticorpo 5 (SEQ ID NOS: 43-45); Anticorpo 6 (SEQ ID NOS: 53-55); Anticorpo 7 (SEQ ID NOS: 63-65); Anticorpo 8 (SEQ ID NOS:
73-75); Anticorpo 9 (SEQ ID NOS: 83-85); Anticorpo 10 (SEQ
ID NOS: 93-95); Anticorpo 11 (SEQ ID NOS: 103-105); Anticorpo 12 (SEQ ID NOS: 113-115); Anticorpo 13 (SEQ ID NOS: 123-125); Anticorpo 14 (SEQ ID NOS: 133-135);
Anticorpo 15 (SEQ ID NOS: 143-145); Anticorpo 16 (SEQ ID NOS: 153-155); Anticorpo 17 (SEQ ID NOS: 163-165);
Anticorpo 18 (SEQ ID NOS: 173-175); Anticorpo 19 (SEQ ID NOS: 183-185) ou Anticorpo 20 (SEQ ID NOS: 193-195); ou opcionalmente Anticorpo 3 (SEQ ID NOS: 23-25), e/ou podem ser utilizadas uma ou mais LCDR1, LCDR2 e LCDR3 por exemplo um conjunto de LCDRs de Anticorpo 1 (SEQ ID NOS: 8-10);
Anticorpo 2 (SEQ ID NOS: 18-20); Anticorpo 4 (SEQ ID NOS:
38-40); Anticorpo 5 (SEQ ID NOS: 48-50); Anticorpo 6 (SEQ
ID NOS: 58-60); Anticorpo 7 (SEQ ID NOS: 68-70); Anticorpo 8 (SEQ ID NOS: 78-80); Anticorpo 9 (SEQ ID NOS: 88-90); Anticorpo 10 (SEQ ID NOS: 98-100); Anticorpo 11 (SEQ ID NOS: 108-110); Anticorpo 12 (SEQ ID NOS: 118-120);
Anticorpo 13 (SEQ ID NOS: 128-130); Anticorpo 14 (SEQ ID NOS: 138-140); Anticorpo 15 (SEQ ID NOS: 148-150);
Anticorpo 16 (SEQ ID NOS: 158-160); Anticorpo 17 (SEQ ID NOS: 168-170); Anticorpo 18 (SEQ ID NOS: 178-180); 34
Anticorpo 19 (SEQ ID NOS: 188-190) ou Anticorpo 20 (SEQ ID NOS: 198-200); ou opcionalmente Anticorpo 3 (SEQ ID NOS: 28-30).
Uma porção substancial de um dominio variável de imunoglobulina compreenderá pelo menos as três regiões de CDR, em conjunto com a suas regiões estruturais intermédias. Preferencialmente, a porção incluirá também pelo menos cerca de 50% de uma ou de ambas das primeira e quarta regiões estruturais, sendo os 50% os 50% da extremidade C-terminal da primeira região estrutural e os 50% da extremidade N-terminal da quarta região estrutural. Os residuos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles que não estão normalmente associados a regiões naturais do domínio variável. Por exemplo, a construção de membros de ligação da presente invenção feitos por técnicas de ADN recombinante pode resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminais codificados por unidades de ligação introduzidas para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação. Os outros passos de manipulação incluem a introdução de unidades de ligação para unir domínios variáveis da invenção a outras sequências de proteínas incluindo regiões constantes de anticorpo, outros domínios variáveis (por exemplo na produção de diacorpos) ou etiquetas detetáveis/funcionais como discutido em mais pormenor aqui noutro sítio.
Sabe-se que domínios de imunoglobulina simples, especialmente domínios VH, são capazes de ligar antigénios alvo. Por exemplo, ver a discussão de dAbs aqui noutro sítio.
No caso de qualquer um dos domínios de ligação individuais, estes domínios podem ser utilizados para selecionar 35 domínios complementares capazes de formar um membro de ligação de dois domínios capaz de ligar o GM-CSFRa. Isto pode ser conseguido por métodos de seleção de apresentação em fago utilizando a chamada abordagem combinatória dupla hierárquica como divulgada na W092/01047, na qual uma colónia individual contendo um clone da cadeia H ou L é utilizada para infetar uma biblioteca completa de clones que codificam a outra cadeia (L ou H) e o membro de ligação de duas cadeias resultante é selecionado de acordo com as técnicas de apresentação em fago tais como as descritas nessa referência e [22].
Outros aspetos da presente invenção proporcionam composições contendo membros de ligação da invenção e pelo menos um componente adicional, por exemplo uma composição compreendendo um membro de ligação e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem ser utilizadas em métodos de inibição ou neutralização de GM-CSFRa, incluindo métodos de tratamento do corpo humano ou animal por terapia. A invenção proporciona preparações heterogéneas compreendendo moléculas de anticorpo anti-GM-CSFRa. Por exemplo, tais preparações podem ser misturas de anticorpos com cadeias pesadas inteiras e cadeias pesadas que carecem da lisina C-terminal, com vários graus de glicosilação e/ou com aminoácidos derivatizados, tal como ciclização de um ácido glutâmico N-terminal para formar um resíduo de ácido piroglutâmico. São aqui descritos métodos de tratamento compreendendo a administração de um membro de ligação como proporcionado, composições farmacêuticas compreendendo um tal membro de ligação e a utilização desse membro de ligação no fabrico de um medicamento, por exemplo num método de preparação de 36 um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo a formulação do membro de ligação com um excipiente farmaceuticamente aceitável. 0 tratamento anti-GM-CSFRa pode ser dado por via oral (por exemplo nanocorpos), por injeção (por exemplo, por via subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intra-articular, intraperitoneal ou intramuscular) , por inalação, pela via intravesicular (instilação na bexiga urinária) ou por via tópica (por exemplo intraocular, intranasal, retal, em feridas, sobre a pele). 0 tratamento pode ser administrado por infusão pulsada, particularmente com doses decrescentes do membro de ligação. A via de administração pode ser determinada pelas caracteristicas fisico-quimicas do tratamento, por considerações especiais quanto à doença ou pelo requisito de otimizar a eficácia ou minimizar efeitos secundários. Prevê-se que o tratamento anti-GM-CSFRa não se restrinja à utilização clinica. Por conseguinte, é também preferida a injeção subcutânea utilizando um dispositivo sem agulha.
Uma composição pode ser administrada sozinha ou em associação com outros tratamentos, quer simultaneamente ou sequencialmente dependendo da condição a ser tratada. Podem ser utilizados tratamentos de associação para proporcionar efeitos sinérgicos significativos, em particular a associação de um membro de ligação anti-GM-CSFRa com um ou mais de outros fármacos. Um membro de ligação de acordo com a presente invenção pode ser proporcionado em associação ou adicionalmente a um ou mais dos seguintes: NSAIDs (por exemplo inibidores de cox tais como Celecoxib e outros inibidores de cox2 semelhantes), corticosteroides (por exemplo, prednisona) e fármacos antirreumáticos modificadores da doença (DMARDs) por exemplo Humira (adalimumab) , metotrexato, Arava, Enbrel (Etanercept), 37
Remicade (Infliximab), Kineret (Anakinra), Rituxan (Rituximab), Orencia (abatacept), sais de ouro, antimaláricos, sulfassalazina, d-penicilamina, ciclosporina A, diclofenac, ciclofosfamida e azatioprina.
De acordo com a presente invenção, as composições proporcionadas podem ser administradas a indivíduos. A administração é preferencialmente numa "quantidade terapeuticamente eficaz", sendo esta suficiente para mostrar benefícios para um doente. Esse benefício pode ser pelo menos a melhoria de pelo menos um sintoma. A quantidade efetiva administrada, e a taxa e duração da administração, dependerá da natureza e gravidade do que está a ser tratado. A prescrição do tratamento, por exemplo decisão sobre dosagem etc, está dentro da responsabilidade dos clínicos gerais e outros médicos, e pode depender da gravidade dos sintomas e/ou progressão de uma doença a ser tratada. As doses apropriadas de anticorpo são bem conhecidas na técnica [28,29]. Podem ser utilizadas dosagens específicas indicadas aqui ou no Physician's Desk Reference (2003) consoante apropriado para o tipo de medicamento a ser administrado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dose adequada de um membro de ligação da invenção pode ser determinada comparando a sua atividade in vitro e atividade in vivo num modelo animal. Os métodos de extrapolação das dosagens eficazes em ratos e outros animais de ensaio para os humanos são conhecidos. A dose exata dependerá de um número de fatores, incluindo se o anticorpo é para diagnóstico ou para tratamento, o tamanho e localização da área a ser tratada, a natureza exata do anticorpo (por exemplo anticorpo inteiro, fragmento ou diacorpo) , e a natureza de qualquer etiqueta detetável ou de outra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose de anticorpo típica situar-se-á na gama de 100yg a 1 g para aplicações sistémicas, e lpg a lmg para aplicações 38 tópicas. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpo inteiro, preferencialmente IgGl, IgG2 ou mais preferencialmente IgG4. Esta é uma dose para um tratamento único de um doente adulto, que pode ser ajustada proporcionalmente para crianças e bebés, e também ajustada para outros formatos de anticorpo em proporção ao peso molecular. Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, de duas vezes por semana, semanais ou mensais, à discrição do médico. Em formas de realização preferidas da presente invenção, o tratamento é periódico e o período entre administrações é de cerca de duas semanas ou mais, preferencialmente cerca de três semanas ou mais, mais preferencialmente cerca de quatro semanas ou mais, ou cerca de uma vez por mês. Noutras formas de realização preferidas da invenção, o tratamento pode ser dado antes e/ou após cirurgia, e, mais preferencialmente, pode ser administrado ou aplicado diretamente no sítio anatómico do tratamento cirúrgico.
Os membros de ligação da presente invenção serão geralmente administrados na forma de uma composição farmacêutica, a qual pode compreender pelo menos um componente além do membro de ligação. Assim, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para serem utilizadas de acordo com a presente invenção, podem compreender, além do ingrediente ativo, um excipiente, transportador, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos dos especialistas na técnica. Esses materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza exata do transportador ou outro material dependerá da via de administração, a qual pode ser oral ou por injeção, por exemplo intravenosa. As composições farmacêuticas para administração oral podem estar na forma de comprimido, cápsula, pó, líquido ou semissólido. Um comprimido pode 39 compreender um transportador sólido tal como gelatina ou um adjuvante. As composições farmacêuticas liquidas compreendem geralmente um veiculo liquido tal como água, vaselina, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Pode ser incluídos soro fisiológico, solução de dextrose ou outro sacárido, ou glicóis tais como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol. No caso de injeção intravenosa, ou injeção no sitio afetado, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa aceitável por via parentérica, a qual é apirogénica e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os especialistas com pericia relevante na técnica sabem como preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotónicos tais como injeção de Cloreto de Sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer Lactada. Podem ser incluídos conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos, consoante necessário. Os membros de ligação da presente invenção podem ser formulados em formas líquidas, semissólidas ou sólidas dependendo das propriedades físico-químicas da molécula e da via de administração. As formulações podem incluir excipientes, ou associações de excipientes, por exemplo: açúcares, aminoácidos e tensioativos. As formulações líquidas podem incluir uma vasta gama de concentrações de anticorpo e pH. As formulações sólidas podem ser produzidas, por exemplo, por liofilização, secagem por pulverização ou secagem por tecnologia de fluido supercrítico. As formulações de anti-GM-CSFRa dependerão da via de administração pretendida: por exemplo, as formulações para administração pulmonar podem consistir de partículas com propriedades físicas que garantem a penetração no pulmão profundo após inalação; as formulações tópicas podem incluir agentes de modificação da viscosidade, que prolongam o tempo que o fármaco reside no sítio de ação. Em certas formas de realização, o membro de 40 ligação pode ser preparado com um veículo que protegerá o membro de ligação contra libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de administração microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, tais como acetato de vinilo etileno, polianidridos, poli(ácido glicólico), colagénio, poliortoésteres e poli(ácido láctico). Muitos métodos para a preparação de tais formulações são conhecidos dos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Robinson, 1978 [30] .
Os membros de ligação de acordo com a invenção podem ser utilizados num método de tratamento ou diagnóstico do corpo humano ou animal, tal como um método de tratamento (o qual pode incluir tratamento profilático) de uma doença ou distúrbio num doente humano, o qual compreende administrar ao referido doente uma quantidade eficaz de um membro de ligação da invenção. As condições que podem ser tratadas de acordo com a presente invenção incluem qualquer uma em que o GM-CSFRa desempenha um papel. A literatura técnica publicada indica um papel para o GM-CSF em várias doenças e condições, como se resume abaixo. Uma vez que o GM-CSF se liga especificamente ao GM-CSFRa, os efeitos patológicos e/ou sintomáticos do GM-CSF podem ser neutralizados inibindo a ligação do GM-CSF ao GM-CSFRa. Assim, a evidência publicada, além dos dados farmacológicos in vivo e in vitro apresentados para as moléculas de anticorpo aqui descritas na Parte Experimental, indica que os membros de ligação da invenção podem ser utilizados no tratamento de condições, doenças e distúrbios autoimunes e/ou inflamatórios, por exemplo artrite reumatoide, asma, resposta alérgica, esclerose múltipla, leucemia mieloide e aterosclerose. A evidência publicada sobre estas condições é resumida abaixo: 41
Asma e Respostas Alérgicas A asma brônquica é um distúrbio inflamatório persistente comum do pulmão, que se caracteriza por hipersensibilidade das vias aéreas, produção excessiva de muco, fibrose e niveis elevados de IgE. A hipersensibilidade das vias aéreas (AHR) é a constrição exagerada das vias aéreas a estímulos não específicos. Julga-se que tanto a AHR como a produção excessiva de muco sejam responsáveis pela obstrução variável das vias aéreas que leva às caracterí sticas de falta de ar dos ataques de asma (exacerbações) e que é responsável pela mortalidade associada a esta doença (cerca de 2000 mortes/ano no Reino Unido).
Estudos recentes demonstraram que o GM-CSF e o seu recetor estão regulados positivamente tanto ao nível da proteína como do ARNm na asma. Além disso, os níveis de expressão correlacionam com a gravidade da doença. Foi medido um aumento de produção de GM-CSF no líquido de lavagem broncoalveolar (BAL), células do BAL, expetoração, células epiteliais bronquiolares e células mononucleares de sangue periférico estimuladas com antigénio de doentes asmáticos quando comparado com indivíduos não asmáticos [31,32]. Além disso foi demonstrado que o nível de expressão de GM-CSF nas vias aéreas após exposição a alergénio correlaciona com o grau de eosinofilia tecidular e a gravidade da resposta asmática de fase tardia [33]. Estudos posteriores relacionaram a expressão regulada positivamente do GM-CSFR com asma intrínseca ou não atópica, correlacionando os níveis de expressão com os dados da função pulmonar [34]. Num modelo de rato de exposição e sensibilização à ovalbumina, a neutralização da atividade do GM-CSF com um anticorpo policlonal de cabra, por administração intranasal 42 antes da exposição à ovalbumina, preveniu a hipersensibilidade das vias aéreas e reduziu tanto a infiltração de eosinófilos como a secreção de muco nas vias aéreas [35] . Analogamente, num modelo de rato de doença respiratória alérgica iniciada pela administração intranasal de partículas de exaustão de diesel, a neutralização do GM-CSF mais uma vez pela administração intranasal de um anticorpo policlonal de cabra preveniu a hipersensibilidade das vias aéreas à metacolina, reduziu a contagem de eosinófilos no BAL e também diminuiu a expressão de células caliciformes produtoras de muco no epitélio das vias aéreas [36]. 0 papel do GM-CSF nas respostas alérgicas foi ainda investigado em modelos murídeos de tolerância induzida. Ratos expostos a doses diárias repetidas de ovalbumina nebulizada sem sensibilização anterior desenvolvem tolerância à ovalbumina e não desencadeiam inflamação eosinofílica das vias aéreas. A expressão pulmonar de GM-CSF via uma construção adenoviral altera as respostas destes animais e favorece o influxo de eosinófilos para o BAL, a geração de histologia fenotipicamente alérgica e hiperplasia associada das células caliciformes. Esta geração de uma resposta Th2 típica é ainda evidenciada pelo aumento das concentrações de IL-5 no soro e BAL e de IL-4 no soro. Trabalho adicional neste modelo, utilizando um rato com MHC II anulada indica que o GM-CSF modula a interação entre as células apresentadoras de antigénio e as células T nas vias aéreas, facilitando desse modo as respostas mediadas por células T à ovalbumina [37]. De modo significativo, a atividade do GM-CSF como um ativador potente de respostas Th2 também pode ser demonstrada em ratos que carecem de IL-13 e/ou IL-4, indicando que a neutralização da atividade do GM-CSF apresenta uma via 43 terapêutica alternativa distinta da atividade destas citocinas.
Foram feitas observações semelhantes noutro modelo murideo em que a exposição intranasal repetida a tasneira resulta em sensibilização de tipo Th2 e inflamação ligeira das vias aéreas quando da reexposição ao antigénio [38]. A administração de anticorpos anti-GM-CSF em conjunto com a tasneira diminui a produção de citocinas associadas à Th2, presumivelmente pela inibição do GM-CSF endógeno. Em contraste, a administração de tasneira a um microambiente das vias aéreas enriquecido com GM-CSF, quer por coadministrações múltiplas de GM-CSF recombinante ou uma administração única de um vetor adenoviral portador do transgene de GM-CSF, resultou em inflamação eosinofilica das vias aéreas consideravelmente aumentada e respostas de memória de Th2 especificas para a tasneira.
Artrite Reumatoide (RA) A RA é uma doença articular inflamatória e destrutiva crónica que afeta aproximadamente 1% da população do mundo industrializado. A RA caracteriza-se por hiperplasia e inflamação da membrana sinovial, inflamação no liquido sinovial e destruição progressiva do osso e cartilagem circundantes que conduz geralmente a incapacidade significativa.
Embora a causa da RA permaneça desconhecida, há evidência acumulada para o papel do GM-CSF no progressão da RA. Julga-se que a RA é iniciada e conduzida através de um processo especifico ao antigénio, mediado por células T. Em resumo, julga-se que a presença de um antigénio não identificado num hospedeiro suscetível inicia uma resposta de células T que leva à produção de citocinas de células T 44 com o recrutamento consequente de células inflamatórias, incluindo neutrófilos, macrófagos e células B.
Muitas citocinas pró- e anti-inflamatórias são produzidas na articulação reumatoide. Além do mais, a progressão, reativação e silenciamento da doença são mediados via alterações dinâmicas na produção de citocinas dentro da articulação. Em particular, considera-se que o TNF-α e a IL-1 exercem papéis essenciais na patogénese da RA e muitas das terapias desenvolvidas mais recentes, ou em desenvolvimento, para a doença visam inibir a atividade destas duas citocinas pró-inflamatórias.
Estudos recentes em modelos de roedores sugeriram um papel central e não redundante para o GM-CSF no desenvolvimento e progressão da RA. A administração de GM-CSF recombinante exógeno intensifica a patologia em dois modelos de rato diferentes de artrite RA induzida por colagénio (CIA) [39] e num modelo de artrite monoarticular [40]. Além disso foi demonstrado que ratos com GM-CSF anulado (GM-CSF_/_) são resistente ao desenvolvimento de CIA e que os niveis de IL-1 e do fator de necrose tumoral (TNFa) encontrados no liquido sinovial da articulação estavam reduzidos em comparação com os ratos de tipo selvagem [41,42]. Analogamente, a indução de monoartrite utilizando injeção intra-articular de albumina de soro bovino metilada e IL-1 em ratos GM-CSF_/_ resulta em gravidade de doença reduzida em comparação com os ratos de tipo selvagem [43].
Além disso, a administração de mAb murideo anti-GM-CSF melhora significativamente a gravidade da doença em modelos de CIA e artrite monoarticular. No modelo de CIA, o tratamento com mAb foi eficaz no tratamento da progressão de doença estabelecida, histopatologia e reduziu significativamente os niveis de IL-1 e TNF-α na 45 articulação. Além disso, o tratamento com mAb antes do inicio da artrite diminuiu a gravidade da doença de CIA [44,43].
Um número de estudos analisou os niveis de citocinas e recetores presentes em amostras de liquido sinovial artrítico e biópsia da membrana de tecido humano. As células mononucleares circulantes em 27 doentes com RA, 13 voluntários saudáveis e 14 doentes com osteoporose foram avaliadas quanto aos níveis de GM-CSFR utilizando GM-CSF marcado com PE [45] . Neste estudo foi demonstrado que foi detetado o dobro das células positivas para recetor em doentes com RA (53%), em comparação com controlos saudáveis (20%) e doentes sujeitos a investigação no que se refere à osteoporose (25%), sugerindo com isso que os monócitos podem ser preparados para responder a GM-CSF produzido localmente. A expressão de genes de citocinas a partir de doentes com RA [46] utilizando hibridização in situ de células SF demonstrou níveis elevados de GM-CSF, IL-1, TNF-α e IL-6. Além disso, sinoviócitos derivados de fibroblastos isolados e cultivados de voluntários normais demonstraram níveis elevados de proteína de GM-CSF em resposta a IL-la, IL-Ιβ, TNF-a e TNF-β [47]. A quantificação dos níveis de GM-CSF no soro em doentes com RA [48] mostrou que os níveis de proteína estavam aumentados em doentes com RA grave (366 pg/mL, n=26) e moderada (376 pg/mL, n=58) em comparação com o grupo de controlo (174 pg/mL, n=43), além disso foi também mostrado que o GM-CSF estava significativamente aumentado nas SF de doentes com RA (1300 pg/mL).
Foi anteriormente observado que a administração de GM-CSF recombinante a doentes que estão a ser tratados para a neutropenia poderia provocar uma exacerbação da RA [49] . Foram feitas observações semelhantes para um doente com 46 síndrome de Felty após tratamento com GM-CSF recombinante [50] .
Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica (COPD) A Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica (COPD) é definida como um estado patológico caracterizado por limitação do fluxo de ar que não é completamente reversível. A limitação de fluxo de ar crónica é geralmente progressiva e associada a uma resposta inflamatória anormal dos pulmões a partículas ou gases nocivos. Esta limitação de fluxo de ar é provocada por uma mistura de doença das vias aéreas pequenas (bronquiolite obstrutiva) e destruição do parênquima (enfisema), cujas contribuições relativas variam de pessoa para pessoa. Os sintomas característicos resultantes da COPD são tosse, produção de expetoração e dispneia ao exercício. A COPD é um problema de saúde pública importante e é a quarta causa principal de morbidade crónica e mortalidade nos EUA. A doença é atualmente tratada com fármacos originariamente desenvolvidos para a asma tais como os corticosteroides orais ou inalados com ou sem broncodilatadores incluindo agonistas β. No entanto, nenhum destes fármacos mostrou abrandar a progressão da COPD [51]. Por exemplo, os corticosteroides que suprimem acentuadamente a inflamação eosinofílica na asma não parecem ter qualquer efeito na inflamação observada na COPD, a qual é predominantemente mediada por neutrófilos [52]. Por conseguinte, há uma necessidade de desenvolver novos tratamentos para a COPD que visem especificamente os processos inflamatórios subjacentes à fisiopatologia desta doença. O GM-CSF, através do seu papel na função de neutrófilos e macrófagos, pode desempenhar um papel importante na patogénese da COPD. 47
Num estudo utilizando PCR quantitativa foi demonstrado que 0 número de cópias de GMCSF na expetoração de fumadores com COPD versus expetoração de fumadores não obstruídos com idade condizente estava significativamente aumentado [53]. Além disso, num modelo de roedor de inflamação pulmonar induzida por fumo de cigarro, animais tratados por via intranasal com um anticorpo contra o GM-CSF 2 dias, 4 h e 1 h antes da exposição ao fumo demonstraram uma redução significativa nos níveis de neutrófilos, macrófagos e MMP-9 do BAL quando comparados com o anticorpo de controlo de isotipo 5 dias após exposição [54]. Estes estudos são também corroborados pelas nossas próprias observações ao investigar os níveis de GM-CSF em expetoração induzida de doentes com uma gama de gravidades de COPD. Nestes estudos nós mostramos que o GM-CSF era elevado na expetoração de aproximadamente 40% dos doentes com COPD testados independentemente da gravidade da doença, com níveis de GMCSF que se aproximavam dos 500pg/mL em alguns casos. O GMCSF não parecia estar aumentado em doentes de controlo não fumadores e fumadores equiparados. Estes dados sugerem que o GM-CSF pode ser um dos mediadores chave na inflamação das vias aéreas induzida por fumo e COPD.
Esclerose múltipla (MS) O GM-CSF foi implicado na doença autoimune esclerose múltipla. Através da administração de antigénio de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) a roedores pode ser induzido um modelo de esclerose múltipla humana que demonstra muitos dos fenótipos de MS, tal como a inflamação e desmielinização do sistema nervoso central que pode resultar numa paralisia semelhante à MS. Em ratos sem GM-CSF, a MOG foi incapaz de induzir o fenótipo EAE [55] . Além disso, foi demonstrado que estes ratos tinham uma menor proliferação de células T relativamente ao antigénio 48 de MOG e uma menor produção das citocinas de Thl, IL-6 e IFN-γ. A administração de anticorpos neutralizantes de GM-CSF ao mesmo tempo que a exposição ao antigénio preveniu o inicio da doença durante 10 dias após tratamento com evidência de lesões reduzidas. Se administrados após o inicio da doença, os ratos recuperaram completamente em menos de 20 dias de tratamento [55].
Leucemia O GM-CSF foi também implicado na leucemia mieloide, leucemia mieloide crónica juvenil (JCML). Esta condição é um distúrbio mieloproliferativo que afeta principalmente doentes com menos de 4 anos de idade. Os progenitores de granulócitos-macrófagos do sangue periférico (CFU-GM) de JCML in vitro demonstram proliferação espontânea a densidades celulares baixas, uma observação que não tinha sido anteriormente descrita para outros distúrbios mieloproliferativos. Além disso, a depleção de monócitos destas culturas anulou esta proliferação. Foi subsequentemente demonstrado que esta proliferação espontânea é mediada via uma hipersensibilidade dos progenitores de JCML à citocina derivada de monócitos GM-CSF [56,57,58,59,60,61]. Ao invés de uma produção excessiva ou niveis elevados de GM-CSF em doentes com JCML, a hipersensibilidade dos progenitores de JCML parece ocorrer através de uma via de transdução de sinal Ras induzida por GM-CSF desregulada [62]. Estudos recentes com um análogo de GM-CSF (E21R) , que antagoniza a ação de GM-CSF em estudos de ligação e ensaios funcionais, mostrou que ao inibir a ação do GM-CSF é possivel reduzir significativamente a carga de células JCML num modelo de xenoenxerto de JCML em rato imunodeficiente / diabético obeso combinado grave (SCID/NOD) [63]. A administração sistémica profilática de E21R na altura do enxerto impediu que os progenitores de 49 JCML se estabelecessem na medula óssea e a administração de E21R 4 semanas após o enxerto induziu a remissão de JCML, com uma redução da carga celular. Além disso, a administração de E21R a ratos SCID/NOD co-enxertados com medula óssea humana normal e medula óssea com JCML provocou uma redução da carga de JCML, contudo as células da medula óssea normal permaneceram não afetadas.
Aterosclerose A doença cardiaca isquémica é a causa mais comum de morte em todo o mundo. Nos últimos anos tem aumentado o conceito de que a inflamação desempenha um papel significativo na patogénese da aterosclerose, ocorrendo a acumulação de células inflamatórias a par com a acumulação de lipidos nas paredes das artérias.
Uma vez residentes na parede arterial, as células inflamatórias, tais como os monócitos e macrófagos, participam e perpetuam a resposta inflamatória local. Estes macrófagos também expressam recetores de depuração para uma gama de lipoproteinas e contribuem, deste modo, para a diferenciação das células em 'células vacuolizadas'. É a morte destas 'células vacuolizadas' que contribui para o desenvolvimento do núcleo lipídico, uma característica clássica destas lesões. À medida que a inflamação prossegue nestas placas ateroscleróticas, estas células inflamatórias ativadas libertam mediadores fibrogénicos e fatores de crescimento que promovem a proliferação de células do músculo liso (SMC) e a fibrose da placa. Além de promover a fibrose, estas células também libertam enzimas proteoliticas, tais como metaloproteinases da matriz (MMPs), que contribuem para um enfraquecimento da placa fibrótica, tornando-as assim propensas a rutura. Uma vez rompidas, estas placas libertam fragmentos celulares e 50 fatores de coagulação, tal como o fator tecidular, para os vasos sanguíneos estimulando a cascata de coagulação e o desenvolvimento de trombos. A trombose arterial resultante pode depois levar a isquemia ou enfarte do miocárdio.
Recentemente, o GM-CSF foi implicado em muitos aspetos da progressão da doença na aterosclerose. Nas lesões ateroscleróticas de coelhos alimentados com colesterol, constatou-se que o GM-CSF se co-localiza com macrófagos e, em menor grau, com células endoteliais e SMC [64]. Além disso, demonstrou-se também que a expressão de GM-CSF está aumentada em vasos ateroscleróticos humanos nos sitios de acumulação de macrófagos e em SMCs centrais e células endoteliais [65]. Este aumento dos niveis de GM-CSF é atribuído, em parte, ao contacto direto célula-célula de monócitos/macrófagos e células endoteliais durante a formação e patogénese da lesão aterosclerótica [66]. Outro elemento chave na lesão aterótica é a 'célula vacuolizada', isto é macrófagos que captaram lipoproteínas de baixa densidade (LDL) oxidadas via recetores de depuração na superfície. In vitro, esta captação de LDL-Οχ pode estimular ainda mais os macrófagos para proliferar via um mecanismo dependente de GM-CSF [67]. Como a aterosclerose é um processo inflamatório crónico foram investigados agentes anti-inflamatórios tais como os glucocorticoides. A dexametasona, um glucocorticoide anti-inflamatório, suprime o desenvolvimento de aterosclerose em vários modelos animais experimentais [58,69,70,71]. A eficácia da mesma foi atribuída à inibição da migração [72] e proliferação [73] de SMC, e à redução da quimiotaxia dos monócitos e leucócitos circulantes [74]. Estudos recentes mostraram que a LDL-ox pode induzir a libertação de GM-CSF a partir de macrófagos peritoneais de rato [75]. Além disso, após tratamento com dexametasona, esta libertação de GM-CSF foi inibida de forma dependente com a dose, sugerindo que os 51 efeitos anti-inflamatórios da dexametasona são mediados pela inibição da produção de GM-CSF induzida pela LDL-ox. Como o GM-CSF parece ter um papel central na aterosclerose, uma alternativa aos glucocorticoides poderia ser a inibição da atividade do GM-CSF nesta indicação.
Terminologia "E/ou" onde aqui utilizado é para ser considerado como uma divulgação especifica de cada uma das duas caracteristicas ou componentes especificados com ou sem o outro. Por exemplo "A e/ou B" é para ser considerado como uma divulgação especifica de cada um de (i) A, (ii) B e (iii) A e B, como se cada um fosse aqui explicitado individualmente.
GM-CSFRa e GM-CSF GM-CSFRa é a cadeia alfa do recetor para o fator de estimulação de colónias de granulócitos macrófagos. A sequência inteira do GM-CSFRa humano encontra-se depositada sob o Número de acesso S06945 (gi:106355) [76] e é aqui explicitada como SEQ ID NO: 202. A forma madura do GM-CSFRa humano, isto é, com o péptido sinal dissociado, é aqui explicitada como SEQ ID NO: 206. Salvo indicação em contrário pelo contexto, as referências aqui a GM-CSFRa referem-se ao GM-CSFRa humano ou de primata não humano (por exemplo cynomolgus), normalmente humano. O GM-CSFRa pode ser GM-CSFRa natural ou GM-CSFRa recombinante. O dominio extracelular com 298 aminoácidos do recetor de GM-CSF α humano tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 205. 52
Salvo indicação em contrário pelo contexto, as referências aqui a GM-CSF referem-se ao GM-CSF humano ou de primata não humano (por exemplo cynomolgus), normalmente humano. 0 GM-CSF liga-se normalmente ao domínio extracelular (SEQ ID NO: 205) da cadeia alfa do recetor de GM-CSF maduro (SEQ ID NO: 206) . Como descrito aqui noutro sítio, esta ligação é inibida pelo membros de ligação da invenção.
Foram identificadas variantes de excisão-união naturais do GM-CSFRa - ver, por exemplo, refs. [77 e 78] . O domínio extracelular é altamente conservado nestas variantes de excisão-união. Os membros de ligação da invenção podem, ou não, ligar-se a uma ou mais variantes de excisão-união do GM-CSFRa, e podem, ou não, inibir a ligação do GM-CSF a uma ou mais variantes de excisão-união do GM-CSFRa.
Membro de ligação
Isto descreve um membro de um par de moléculas que se ligam uma à outra. Os membros de um par de ligação podem ser derivados naturalmente ou produzidos total ou parcialmente por via sintética. Um membro do par de moléculas tem uma área na sua superfície, ou uma cavidade, que se liga e é, portanto, complementar a uma organização espacial e polar particular do outro membro do par de moléculas. Os exemplos de tipos de pares de ligação são antigénio-anticorpo, biotina-avidina, hormona-recetor da hormona, recetor-ligando, enzima-substrato. A presente invenção refere-se a reações de tipo antigénio-anticorpo.
Um membro de ligação compreende normalmente uma molécula possuindo um sítio de ligação de antigénio. Por exemplo, um membro de ligação pode ser uma molécula de anticorpo ou uma proteína não-anticorpo que compreende um sítio de ligação 53 de antigénio. Um sítio de ligação de antigénio pode ser proporcionado por meio de rearranjo de CDRs nas armações proteicas não anticorpo tais como fibronectina ou citocromo B etc. [80, 81, 82], ou por aleatorização ou mutação de resíduos de aminoácido de uma ansa dentro de uma armação proteica para conferir ligação a um alvo desejado. As armações para construir novos sítios de ligação em proteínas foram revistas em pormenor [82]. As armações proteicas para simuladores de anticorpo são divulgadas em WO/0034784, na qual os inventores descrevem proteínas (simuladores de anticorpo) que incluem um domínio de tipo III de fibronectina possuindo pelo menos uma ansa aleatorizada. Uma armação adequada onde se pode enxertar uma ou mais CDRs, por exemplo um conjunto de HCDRs, pode ser proporcionada por qualquer membro de domínio da superfamília dos genes de imunoglobulina. A armação pode ser uma proteína humana ou não humana.
Uma vantagem de um armação proteica não anticorpo é que ela pode proporcionar um sítio de ligação de antigénio numa molécula-armação que é mais pequena e/ou mais fácil de fabricar do que pelo menos algumas moléculas de anticorpo. O tamanho pequeno de um membro de ligação pode conferir propriedades fisiológicas úteis tais como uma aptidão para entrar nas células, penetrar profundamente nos tecidos ou atingir alvos noutras estruturas, ou para se ligar dentro de cavidades proteicas do antigénio alvo.
A utilização de sítios de ligação de antigénio em armações proteicas não anticorpo é revista na ref. [79]. As típicas são proteínas possuindo um esqueleto estável e uma ou mais ansas variáveis, em que a sequência de aminoácidos da ansa ou ansas é especifica ou aleatoriamente mutada para criar um sítio de ligação de antigénio para ligar o antigénio alvo. Tais proteínas incluem os domínios de ligação de IgG 54 da proteína A de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por exemplo, o 10° domínio de tipo III da fibronectina) e lipocalinas. Outras abordagens incluem "Microcorpos" sintéticos (Selecore GmbH), os quais se baseiam em ciclotidos - pequenas proteínas possuindo ligações dissulfureto intramoleculares.
Além das sequências de anticorpo e/ou um sítio de ligação de antigénio, um membro de ligação de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, por exemplo para formar um péptido ou polipéptido, tal como um domínio dobrado, ou para conferir à molécula outra característica funcional além da aptidão para ligar o antigénio. Os membros de ligação da invenção podem ter uma etiqueta detetável, ou podem ser conjugados com um toxina ou uma unidade de orientação ou enzima (por exemplo via uma ligação peptidilo ou unidade de ligação). Por exemplo, um membro de ligação pode compreender um sítio catalítico (por exemplo, num domínio enzimático) bem como um sítio de ligação de antigénio, em que o sítio de ligação de antigénio se liga ao antigénio e direciona, deste modo, o sítio catalítico para o antigénio. O sítio catalítico pode inibir a função biológica do antigénio, por exemplo, por dissociação.
Embora, como referido, as CDRs possam ser transportadas por armações tais como fibronectina ou citocromo B [80, 81, 82], a estrutura para transportar uma CDR ou um conjunto de CDRs da invenção será geralmente de uma sequência de cadeia pesada ou leve do anticorpo ou uma porção substancial da mesma em que a CDR ou conjunto de CDRs está localizado num local correspondente à CDR ou conjunto de CDRs dos domínios variáveis VH e VL naturais de anticorpo codificados por genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e localizações dos domínios variáveis de imunoglobulina podem 55 ser determinadas por referência a (Kabat, et al., 1987 [98], e atualizações da mesma, agora disponíveis na Internet (http://immuno.bme.nwu.edu ou pesquisar "Kabat" utilizando qualquer motor de busca).
Os membros de ligação da presente invenção podem compreender regiões constantes de anticorpos ou partes das mesmas, preferencialmente regiões constantes de anticorpos humanos ou partes das mesmas. Por exemplo, um domínio VL pode estar ligado na sua extremidade C-terminal aos domínios constantes da cadeia leve de anticorpo incluindo as cadeias Ck ou CX humanas, preferencialmente cadeias CX. Analogamente, um membro de ligação baseado num domínio VH pode estar ligado na sua extremidade C-terminal à totalidade ou parte (por exemplo um domínio CHI) de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo IgG, IgA, IgE e IgM e de qualquer uma das subclasses de isotipo, em particular IgGl, IgG2 e IgG4. É preferida a IgGl, IgG2 ou IgG4. A IgG4 é preferida porque não se liga ao complemento e não cria funções efetoras. Qualquer variante sintética ou outra da região constante que possua estas propriedades e estabilize as regiões variáveis também é preferida para ser utilizada em formas de realização da presente invenção.
Os membros de ligação da invenção podem ser marcados com uma etiqueta detetável ou funcional. As etiquetas detetáveis incluem etiquetas radioativas tais como 131I ou "Tc, as quais podem ser ligadas aos anticorpos da invenção utilizando química convencional conhecida na técnica de visualização de anticorpos. As etiquetas incluem também etiquetas enzimáticas, tal como a peroxídase de rábano silvestre. As etiquetas incluem ainda unidades químicas tais como biotina que podem ser detetadas via ligação a uma unidade detetável cognata específica, por exemplo avidina 56 marcada. Assim, um membro de ligação ou molécula de anticorpo da presente invenção pode estar na forma de um conjugado compreendendo o membro de ligação e uma etiqueta, opcionalmente ligada através de uma unidade de ligação tal como um péptido. 0 membro de ligação pode ser conjugado, por exemplo, com enzimas (por exemplo peroxídase, fosfatase alcalina) ou com uma etiqueta fluorescente incluindo, mas não se limitando a, biotina, fluorocromo, proteína fluorescente verde. Além disso, a etiqueta pode compreender uma unidade de toxina tal como uma unidade de toxina selecionada de um grupo de exotoxina de Pseudomonas (PE ou um fragmento citotóxico ou mutante da mesma), toxina da Difteria (um fragmento citotóxico ou mutante da mesma), uma toxina botulínica de A a F, ricina ou um fragmento citotóxico da mesma, abrina ou um fragmento citotóxico da mesma, saporina ou um fragmento citotóxico da mesma, toxina antiviral da erva-tintureira ou um fragmento citotóxico da mesma e briodina 1 ou um fragmento citotóxico da mesma. Nos casos em que o membro de ligação compreende uma molécula de anticorpo, o membro de ligação marcado pode ser referido como um imunoconjugado.
Molécula de anticorpo
Isto descreve uma imunoglobulina natural ou produzida parcial ou totalmente por via sintética. 0 termo também abrange qualquer polipéptido ou proteína compreendendo um sítio de ligação de antigénio de anticorpo. Os fragmentos de anticorpo que compreendem um sítio de ligação de antigénio de anticorpo são moléculas tais como Fab, F(ab')2/ Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd; e diacorpos. É possível selecionar anticorpos monoclonais e outros e utilizar técnicas de tecnologia de ADN recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que 57 retêm a especificidade do anticorpo original. Tais técnicas podem envolver a introdução de ADN que codifica a região variável de imunoglobulina, ou as CDRs, de um anticorpo nas regiões constantes, ou regiões constantes mais regiões estruturais, de uma imunoglobulina diferente. Ver, por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400, e um grande corpo de literatura posterior. Um hibridoma ou outra célula que produz um anticorpo pode ser submetida a mutação genética ou outras alterações, as quais podem, ou não, alterar a ligação ao alvo dos anticorpos produzidos.
Como os anticorpos podem ser modificados de um número de maneiras, o termo "molécula de anticorpo" deve ser interpretado como abrangendo qualquer membro de ligação ou substância possuindo um sitio de ligação de antigénio de anticorpo. Assim, este termo abrange fragmentos e derivados de anticorpo, incluindo qualquer polipéptido compreendendo um sitio de ligação de antigénio de anticorpo, quer natural ou total ou parcialmente sintético. Portanto, estão incluídas moléculas quiméricas compreendendo um sitio de ligação de antigénio de anticorpo, ou equivalentes, fundidas com outro polipéptido. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritas em EP-A-0120694 e EP-A-0125023, e um grande corpo de literatura posterior.
Outras técnicas disponíveis na técnica de manipulação de anticorpos tornaram possivel isolar anticorpos humanos e humanizados. Os anticorpos humanos e humanizados são formas de realização preferidas da invenção, e podem ser produzidos utilizando qualquer método adequado. Por exemplo, podem ser preparados hibridomas humanos [83]. A apresentação em fago, outro técnica estabelecida para gerar membros de ligação foi descrita em pormenor em muitas publicações tais como a ref. [83] e W092/01047 (discutida mais abaixo). Ratos transgénicos em que os genes de 58 anticorpo de rato são inativados e substituídos funcionalmente por genes de anticorpo humano, enquanto se deixam intactos outros componentes do sistema imunitário do rato, podem ser utilizados para isolar anticorpos humanos [84] . Os anticorpos humanizados podem ser produzidos utilizando técnicas conhecidas na técnica tais como aquelas divulgadas, por exemplo, em WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 565,332 e WO93/17105. Além disso, a W02004/006955 descreve métodos para humanizar anticorpos, com base na seleção de sequências estruturais da região variável de genes de anticorpo humano comparando tipos estruturais canónicos de CDR para sequências de CDR da região variável de um anticorpo não humano com tipos estruturais canónicos de CDR para as CDRs correspondentes de uma biblioteca de sequências de anticorpos humanos, por exemplo segmentos de genes de anticorpos de linha germinal. As regiões variáveis de anticorpos humanos que têm tipos estruturais canónicos de CDR semelhantes às CDRs não humanas formam um subconjunto de sequências de anticorpos humanos do membro, a partir do qual se seleciona as sequências estruturais humanas. Os membros do subconjunto podem ser ainda classificados por semelhança de aminoácidos entre as sequências da CDR humana e não humana. No método da W02004/006955, as sequências humanas com melhor classificação são selecionadas para proporcionar as sequências estruturais para construir um anticorpo quimérico que substitui funcionalmente as sequências da CDR humana pelas CDR não humanas correspondentes utilizando as estruturas humanas do membro do subconjunto selecionado, proporcionando desse modo um anticorpo humanizado com alta afinidade e baixa imunogenicidade sem a necessidade de comparar as sequências estruturais entre os anticorpos não humanos e humanos. São também divulgados anticorpos quiméricos preparados de acordo com o método. 59
As moléculas de anticorpo sintético podem ser criadas pela expressão de genes gerados por meio de oligonucleótidos sintetizados e reunidos dentro de vetores de expressão adequados [85, 86].
Foi demonstrado que fragmentos de um anticorpo inteiro podem realizar a função de ligação de antigénios. Os exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab consistindo dos dominios VL, VH, CL e CHI; (ii) o fragmento Fd consistindo dos dominios VH e CHI; (iii) o fragmento Fv consistindo dos dominios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb [87, 88, 89] o qual consiste de um domínio VH ou um domínio VL; (v) regiões de CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento divalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas de Fv de cadeia simples (scFv) , em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por uma unidade de ligação peptídica que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação de antigénio [90, 91]; (viii) dímeros de Fv de cadeia simples biespecíficos (PCT/US92/09965) e (ix) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de genes (WO94/13804; [92]). As moléculas de Fv, scFv ou diacorpo podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes de dissulfureto a ligar os domínios VH e VL [93]. Podem ser também preparados minicorpos compreendendo um scFv ligado a um domínio CH3 [94].
Um dAb (anticorpo de domínio) é um pequeno fragmento monomérico de ligação de antigénio de um anticorpo, nomeadamente a região variável de uma cadeia pesada ou leve do anticorpo [89]. Os dAbs de VH ocorrem naturalmente em camelídeos (por exemplo, camelo, lama) e podem ser produzidos imunizando um camelídeo com um antigénio alvo, isolando células B específicas para o antigénio e clonando 60 diretamente os genes de dAb de células B individuais. Os dAbs também podem ser produzidos em culturas de células. O seu tamanho pequeno, boa solubilidade e estabilidade à temperatura torna-os particularmente úteis em termos fisiológicos e adequados para seleção e maturação por afinidade. Um membro de ligação da presente invenção pode ser um dAb compreendendo um domínio VH ou VL substancialmente como aqui explicitado, ou um domínio VH ou VL compreendendo um conjunto de CDRs substancialmente como aqui explicitado. Por "substancialmente como explicitado" entende-se que a CDR ou o domínio VH ou VL relevante da invenção será idêntico ou altamente semelhante às regiões especificadas cuja sequência é aqui explicitada. Por "altamente semelhante" considera-se que podem ser feitas desde 1 a 5, preferencialmente desde 1 a 4, tal como 1 a 3 ou 1 ou 2, ou 3 ou 4, substituições de aminoácidos na CDR e/ou no domínio VH ou VL.
Nos casos em que forem utilizados anticorpos biespecificos, estes podem ser anticorpos biespecificos convencionais, os quais podem ser fabricados de várias maneiras [95], por exemplo preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos, ou podem ser quaisquer dos fragmentos de anticorpo biespecífico mencionados acima. Os exemplos de anticorpos biespecificos incluem aqueles da tecnologia BiTE™ em que podem ser utilizados os domínios de ligação de dois anticorpos com especificidade diferente e ligados diretamente através de péptidos flexíveis curtos. Esta combina dois anticorpos numa única cadeia polipeptídica curta. Os diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, utilizando apenas os domínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos de reação anti-idiotípica. 61
Os diacorpos biespecíficos, por oposição aos anticorpos inteiros biespecificos, também podem ser particularmente úteis porque podem ser facilmente construídos e expressados em E.coli. Os diacorpos (e muitos outros polipéptidos tais como fragmentos de anticorpo) com especificidades de ligação apropriadas podem ser facilmente selecionados utilizando apresentação em fago (WO94/13804) de bibliotecas. Se um braço do diacorpo tiver de ser mantido constante, por exemplo, dirigido contra GM-CSFRa, pode ser então preparada uma biblioteca em que o outro braço é modificado e selecionado um anticorpo de ligação ao alvo apropriado. Os anticorpos inteiros biespecíficos podem ser preparados por engenharia botões-em-buracos [96]. Sítio de ligação de antigénio
Isto descreve a parte de uma molécula que se liga e é complementar a todo ou parte do antigénio alvo. Numa molécula de anticorpo, é referido como o sítio de ligação de antigénio de anticorpo, e compreende a parte do anticorpo que se liga e é complementar a todo ou parte do antigénio alvo. No caso de um antigénio ser grande, um anticorpo pode ligar-se apenas a uma parte particular do antigénio, parte essa que é denominada um epítopo. Um sítio de ligação de antigénio de anticorpo pode ser proporcionado por um ou mais domínios variáveis de anticorpo. Preferencialmente, um sítio de ligação de antigénio de anticorpo compreende uma região variável da cadeia leve (VL) de anticorpo e uma região variável da cadeia pesada (VH) de anticorpo.
Numeração de Kabat 62
Os resíduos das sequências de anticorpo são aqui geralmente referidos utilizando a numeração de Kabat como definida em Kabat et al., 1971 [97]. Ver também refs. [98, 99].
Isolado
Isto refere-se ao estado em que os membros de ligação da invenção, ou ácido nucleico que codifica tais membros de ligação, estarão geralmente de acordo com a presente invenção. Os membros isolados e ácido nucleico isolado estarão isentos ou substancialmente isentos de material com o qual estão naturalmente associados, tais como outros polipéptidos ou ácidos nucleicos com os quais estão presentes no seu ambiente natural ou no ambiente em que são preparados (por exemplo, cultura de células) quando essa preparação é pela tecnologia de ADN recombinante praticada in vitro ou in vivo. Os membros e ácido nucleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e, mesmo assim, para fins práticos, estarem isolados - por exemplo, os membros serão normalmente misturados com gelatina ou outros veículos se utilizados para revestir placas microtítulo a serem utilizadas em imunoensaios, ou serão misturados com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis quando utilizados em diagnóstico ou terapia. Os membros de ligação podem ser glicosilados, quer naturalmente ou por sistemas de células eucarióticas heterólogas (por exemplo, células CHO ou NSO (ECACC 85110503)), ou podem permanecer não glicosilados (por exemplo, se produzidos por expressão numa célula procariótica).
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1. Análise de pA2 de dois anticorpos anti-GM-CSFRa no ensaio de proliferação de TF-1. A proliferação de células TF-1 foi induzida com concentrações crescentes de 63 GM-CSF na presença de concentrações crescentes de duas IgG4 otimizadas, Anticorpo 6 (Figura IA) e Anticorpo 1 (Figura 1B), respetivamente. Para os dados mostrados no gráfico IA e gráfico 1B foi medida a incorporação de timidina tritiada e foi calculada a EC50 de GM-CSF a cada concentração de anticorpo. Para os dados mostrados no gráfico 1C e gráfico 1D, as relações de dose foram em seguida calculadas e analisadas por regressão de Schild a fim de obter os valores de pA2.
Figura 2. Análise de pA2 de um anticorpo anti-GM-CSFRcx, Anticorpo 6, nos ensaios de alteração de forma de granulócitos. Os granulócitos humanos (gráfico 2A e 2C) ou de cynomolgus (2B e 2D) foram tratados com concentrações crescentes de GM-CSF na presença de concentrações crescentes de IgG4. A alteração na forma dos granulócitos foi medida utilizando citometria de fluxo e foi calculada a EC50 de GM-CSF a cada concentração de anticorpo (gráfico 2A e gráfico 2B). As relações de dose foram em seguida calculadas e analisadas por regressão de Schild a fim de obter os valores de pA2 (gráfico 2C e gráfico 2D).
Figura 3. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos 1 e 6, respetivamente, como IgG4s num ensaio que mede a proliferação de células TF-1 induzida por 7pM de GM-CSF humano. São também mostrados os dados para o controlo positivo IgG4 2B7 e para um controlo de isotipo IgG4. Os dados representam a média com barras de desvio padrão de determinações em triplicado na mesma experiência.
Figura 4. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos 1 e 6, respetivamente, como IgG4s num ensaio que mede a alteração de forma de granulócitos humanos induzida por 7pM de GM-CSF humano. São também mostrados os dados para o controlo IgG4 2B7 e para um controlo de isotipo 64
IgG4. Os dados representam a média com barras de desvio padrão de determinações em triplicado na mesma experiência.
Figura 5. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos 1 e 6, respetivamente, como IgG4s num ensaio que mede a libertação de TNFa a partir de monócitos humanos estimulados com lnM de GM-CSF humano. São também mostrados os dados para o anticorpo de controlo 2B7 e para um controlo de isotipo IgG4. Os dados representam a média com barras de desvio padrão de determinações em triplicado na mesma experiência.
Figura 6. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos 1 e 6, respetivamente, como IgG4s num ensaio que mede a sobrevivência de granulócitos humanos induzida por 7pM de GM-CSF humano. São também mostrados os dados para o anticorpo de controlo 2B7 e para um controlo de isotipo IgG4. Os dados representam a média com barras de desvio padrão de determinações em triplicado na mesma experiência.
Figura 7. Os mAbs humanos amadurecidos por afinidade, Anticorpo 1 e Anticorpo 6, mas não o mAb humano parental 28G5 (Anticorpo 3) ou o anticorpo murídeo conhecido 2B7, inibem a diferenciação estimulada por GM-CSF de progenitores hematopoiéticos humanos. 5xl04 células mononucleares descongeladas de uma amostra de aférese foram cultivadas em ágar semissólido na presença de 10 ng/mL de GM-CSF e a concentração indicada de mAb. As colónias foram contadas no dia 14. O gráfico mostra o número de colónias contra a concentração de mAb em yg/mL.
Figura 8. Análise dose-resposta da eficácia do mAb amadurecido por afinidade em ratos quiméricos Tg huGM-CSFR. Grupos de 5 ratos quiméricos Tg foram tratados com 500 ng 65 de huGM-CSF (ou PBS) s.c. duas vezes por dia durante 4 dias (D.1-D.4) e com controlo (CAT001) ou mAb de ensaio (Anticorpo 6) às concentrações indicadas no D.O. Os pesos dos baços foram avaliados no D.5.
Figura 9. Análise dose-resposta da eficácia do Anticorpo 6 num ensaio de libertação de citocinas endógenas a partir de células mononucleares de sangue periférico humano. lxlO6 células foram cultivadas durante 72 h na presença e ausência de anticorpo e foi realizado um ELISA para a IL-6 e TNFa nos sobrenadantes. Os dados representam a inibição média com barras de desvio padrão de determinações em duplicado na mesma experiência.
Parte Experimental
Antecedentes
Os fragmentos de anticorpo humano podem ser selecionados in vitro a partir de reportórios apresentados na superfície de bacteriófagos filamentosos. Este processo é conhecido como apresentação em fago e proporciona um meio para obter fragmentos de anticorpo humano. 0 processo pode ser utilizado para isolar especificidades anti-humanas humanas e pode ser ajustado para obter anticorpos com caracteristicas de afinidade particulares.
Os fragmentos de anticorpo consistindo apenas dos domínios variável da cadeia pesada (VH) e variável da cadeia leve (VL) ligados em conjunto por uma unidade de ligação peptídica curta contêm toda a informação que é necessária para determinar a ligação ao antigénio. Tais fragmentos são conhecidos como Fv de cadeia simples (scFv). Foi mostrado que, quando apresentados na superfície do fago, os scFv 66 dobram-se corretamente e ligam-se ao antigénio. Reportórios grandes de scFv humano foram construídos deste modo e proporcionaram uma fonte, a partir da qual podem ser isolados clones individuais para desenvolvimento como candidatos a fármacos. Os scFv candidatos são em seguida reformatados como moléculas de IgG inteira (tipicamente IgG humana) para aplicações terapêuticas.
Sumário
Foram realizadas seleções numa biblioteca de apresentação de fagos de scFv obtida a partir de linfócitos de baço humano para enriquecer relativamente a populações de fagos que se ligam ao GM-CSFRa humano. Nós isolamos anticorpos de scFv possuindo características selecionadas e convertemos estes scFv em IgG4. Utilizando uma variedade de ensaios, um painel de anticorpos foi isolado, otimizado e tratado com linha germinal para produzir IgG4 com especificação apropriada para um anticorpo terapêutico.
Foram obtidos 19 clones de anticorpo, cujas sequências são mostradas como anticorpos 1, 2 e 4-20 na listagem de sequências, a partir de um anticorpo parental. O anticorpo parental é mostrado como anticorpo 3 na listagem de sequências e é também aqui referido como 28G5. Os 19 clones foram selecionados como exibindo propriedades particularmente boas numa gama de ensaios biológicos, como descrito na Parte Experimental, e foram designados com os números de anticorpos 1, 2 e 4 a 20.
Os bioensaios foram concebidos para espelhar a natureza inflamatória de doenças tais como a artrite reumatoide. Por exemplo, a alteração de forma dos neutrófilos necessária para o seu recrutamento para o sítio de ação, a libertação de fatores pró-inflamatórios por monócitos e o aumento da 67 sobrevivência dos tipos de células inflamatórias em resposta a sinais particulares. Os anticorpos exibem atividade de neutralização potente nestes ensaios.
Os protocolos detalhados dos métodos de ensaio utilizados são proporcionados abaixo na secção intitulada "Materiais e Métodos de Ensaio".
Isolamento do lider de anticorpo
Foi utilizada uma biblioteca grande de anticorpos humanos de FV de cadeia simples (scFv) para as seleções. Esta foi obtida a partir de linfócitos do baço de 20 dadores saudáveis e clonada num vetor de fagomideo. Os ScFv que reconheceram o GM-CSFRa foram isolados a partir da biblioteca de apresentação de fagos numa série de ciclos de seleção repetidos em GMCSF-Ra purificado obtido a partir da sobreexpressão de um domínio extracelular, solúvel, marcado para purificação do recetor em células HEK293T. Isto foi conseguido essencialmente como descrito em Vaughan et al [102]. Em resumo, após exposição do recetor biotinilado à biblioteca de fagos, a proteína com o fago ligado foi capturada sobre esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Os fagos não ligados foram eliminados por lavagem. Os fagos ligados foram em seguida recuperados como descrito por Vaughan et al e o processo de seleção foi repetido. Foram realizados três ciclos de seleção a concentrações cada vez menores de antigénio. Uma proporção representativa dos scFvs resultantes dos ciclos de seleção foram submetidos a sequenciação de ADN.
Após estas seleções iniciais a partir da biblioteca de apresentação de fagos, foi identificado um painel de scFv únicos num ensaio de ligação a ligando, o qual foi concebido para identificar fagos que expressam anticorpos 68 scFv que eram capazes de inibir a ligação de GM-CSF ao dominio extracelular de GM-CSFRa purificado. A potência de neutralização destes scFv no ensaio de ligação a ligando variou desde 0,65 a 3,3 nM.
Os anticorpos que foram ativos no ensaio bioquímico de ligação a ligando foram avaliados quanto à atividade biológica num ensaio de proliferação de TF-1, que mediu a potência de neutralização avaliando a aptidão dos anticorpos para inibir a proliferação de células TF-1 estimuladas com GM-CSF. A TF-1 é uma linha de células pré-mieloides humanas provenientes de um doente com eritroleucemia. Esta linha de células é dependente de fator para sobrevivência e proliferação e é rotineiramente mantida em GM-CSF humano. A inibição da proliferação dependente de GM-CSF foi determinada medindo a redução na incorporação de timidina tritiada no ADN sintetizado de novo de células em divisão. Todos os scFv tinham potência mensurável neste ensaio, com valores de IC50 que variam desde cerca de 180 a 1200 nM.
Os clones de scFv mais potentes foram reformatados como moléculas de anticorpo de IgG4 humana com um domínio constante da cadeia pesada gama 4 humana e um domínio constante da cadeia leve lambda humana. Foram construídos vetores para os clones de scFv mais potentes para permitir a expressão dos anticorpos como anticorpo de IgG4 inteiro como descrito por Persic et al. [100] com algumas modificações. Foi incluído um fragmento oriP nos vetores para facilitar a utilização com as células HEK-EBNA 293 e para permitir a replicação epissómica. O domínio variável VH foi clonado no poliligador entre a sequência líder de secreção e o domínio constante gama 4 humano do vetor de expressão pEU8.1(+). O domínio variável VL foi clonado no poliligador entre a sequência líder de secreção e o domínio 69 constante lambda humano do vetor de expressão pEU4.1(-). As células HEK-EBNA 293 foram co-transfetadas com as construções que expressam a cadeia pesada e leve, e o anticorpo inteiro foi purificado do media condicionado utilizando cromatografia de afinidade de proteína A. As preparações de anticorpo purificadas foram esterilizadas por filtração e conservadas a 4°C em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) antes da avaliação. A concentração de proteína foi determinada medindo a absorvância a 280nm utilizando o método BCA (Pierce).
As IgG reformatadas foram comparadas com o anticorpo murídeo conhecido 2B7 no ensaio de proliferação de TF-1. As IgG4s conservaram ou ganharam atividade neste ensaio, com valores de IC50 que variam desde 6 até cerca de 1600 nM.
Na doença inflamatória é necessária a alteração de forma dos neutrófilos para o seu recrutamento para o sítio de ação. Foi concebido um ensaio de alteração da forma de granulócitos humanos para imitar esta resposta biológica utilizando triagem celular ativada por fluorescência (FACS) para medir a alteração da forma dos granulócitos isolados do sangue após a sua exposição a GM-CSF. Foi avaliada a aptidão dos anticorpos de IgG4 anti-GM-CSFRa para inibir a resposta de alteração de forma dos neutrófilos ao GM-CSF, e os valores de IC50 de clones selecionados variou desde cerca de 15 a 350 nM. Um anticorpo representativo 28G5 neutralizou o GMCSF-R de cynomolgus no ensaio de alteração de forma granulócitos de cynomolgous com uma IC50 de cerca de 5 nM. O anticorpo murídeo conhecido 2B7 foi também capaz de neutralizar a resposta biológica resultante da ligação do GM-CSF ao recetor de cynomolgus. 70 A afinidade de ligação ao recetor dos anticorpos foi então medida utilizando BIAcore, com valores de KD calculados a variar desde 32 a 377 nM.
Otimização
Num esforço para melhorar a potência do 28G5 foi iniciado um programa de otimização. Foram produzidas bibliotecas de anticorpos onde se realizou a mutagénese aleatória das CDR3s de VH ou VL. Cada CDR3 foi aleatorizada em dois blocos de 6 aminoácidos para cobrir toda a CDR, produzindo as bibliotecas Hl (bloco N-terminal de 6 aa da CDR3 de VH), H2 (bloco C-terminal de 6 aa da CDR3 de VH), LI (bloco N-terminal de 6 aa da CDR3 de VL) e L2 (bloco C-terminal de 6 aa da CDR3 de VL). As bibliotecas resultantes foram submetidas a ciclos de seleção repetidos quanto à ligação ao GM-CSFRa humano. Os clones isolados deste processo de seleção foram em seguida utilizados para construir uma biblioteca de fagos combinada que continha scFv com CDR3s da cadeia pesada mutadas e CDR3s da cadeia leve mutadas. Estas bibliotecas foram também submetidas ao mesmo procedimento de seleção.
Em cada fase do processo de otimização, as scFv que foram capazes de inibir a ligação da IgG4 de 28G5 ao recetor de GM-CSF foram identificadas utilizando um ensaio de competição de epítopos com o 28G5 e o recetor, e foram em seguida avaliadas no ensaio de proliferação de TF-1, como descrito abaixo.
Após mutagénese aleatória das sequências CDR3 da cadeia pesada de 28G5 foi identificado um painel de scFv com potência de neutralização mensurável no ensaio de TF-1. A maioria das melhorias de potência foram obtidas quando foi aleatorizada a extremidade 3' da CDR3 de VH. 71
Após mutagénese aleatória das sequências CDR3 da cadeia leve de 28G5, foi identificado um painel de scFv com potência de neutralização mensurável no ensaio de TF-1. Todas as melhorias de potência foram obtidas quando foi aleatorizada a extremidade 3' da CDR3 de VL.
Após combinação das bibliotecas de mutagénese aleatória da CDR3 da cadeia pesada e leve, foi identificado um painel de scFvs com potência melhorada no ensaio de proliferação de TF-1 relativamente ao scFv parental 28G5. Foram isoladas as ScFv com melhorias de potência >60000 vezes relativamente ao 28G5 parental. Todas as combinações das bibliotecas resultaram em scFv melhorados, isto é Hl/Ll, H1/L2, H2/L1, H2/L2. Isto é particularmente interessante porque não foram isolados quaisquer scFvs melhorados a partir da biblioteca LI.
Um painel de 19 scFv identificados durante a otimização do 28G5 foi reformatado e expressado como IgG4s, utilizando os métodos descritos acima. O painel era constituído pelos clones de anticorpo 1, 2 e 4 a 20. Alguns dos clones mais potentes neste painel foram obtidos das bibliotecas mutadas de CDR3 de H e L combinadas. Os anticorpos de IgG4 neste painel foram avaliados quanto à sua atividade no ensaio de proliferação de TF-1 e foram comparados com o anticorpo murideo conhecido 2B7. Todas as IgG4s otimizadas eram mais potentes do que ο 2B7 neste ensaio. Nesta ocasião, ο 2B7 tinha uma IC50 calculada de cerca de 1,6 nM, enquanto que os clones tinham valores de IC50 calculadas que variavam desde cerca de 1 pm até cerca de 1100 pM. Os dados são apresentados no Quadro 1 abaixo e resumidos como se segue: IC50 <1500 pM Anticorpos 1, 2 e 4 a 20 72 72 IC50 <300 i pM Anticorpos 1, 2 IC50 <60 pM Anticorpos 1, 2 IC50 <10 pM Anticorpos 1, 5 4-12 e 14-20 4-6, 8-11, 14 e 16-20 6, 11 e 20. A Figura 3 ilustra a potência antagonista de dois anticorpos representativos da invenção, Anticorpo 1 e Anticorpo 6, em comparação com o anticorpo conhecido 2B7 no ensaio de proliferação de TF-1. O sistema BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor) foi utilizado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação de algumas das IgG4s otimizadas para o lider com o dominio extracelular de recetor de GM-CSF marcado para purificação recombinante. A afinidade dos anticorpos foi muito melhorada, com valores de KD calculados desde 0,127 nM até cerca de 5 nM. Os dados são mostrados no Quadro 2. Foram obtidas melhorias tanto nas velocidades de ativação como nas velocidades de desativação. A correlação entre a afinidade das IgG4s para o dominio extracelular solúvel do GM-CSFR oí e o seu desempenho no ensaio de TF-1 foi muito boa com um coeficiente de Pearson de 0,85 (p<0,0001). A titulo de comparação, a KD do 2B7 foi calculada separadamente e era de cerca de 7 nM.
Os anticorpos de IgG4 identificados durante a otimização do 28G5 foram avaliados no ensaio de alteração da forma de granulócitos humanos e foram comparados com o anticorpo murideo conhecido 2B7. Todos os anticorpos que foram avaliados neste ensaio (anticorpos 1, 2, 5, 6, 9-11, 16 e 20) foram muito potentes com IC50s que vão desde 7,8 a 90 pM. Destes, os anticorpos 1, 2, 5, 6, 9, 16 e 20 tinham IC50s inferiores a 50 pM, e os anticorpos 1, 2, 6, 16 e 20 tinham IC50s inferiores a 25 pM. Os nossos anticorpos foram mais potentes do que ο 2B7, o qual tinha uma IC50 de 477pM. Os dados são mostrados no Quadro 3. A Figura 4 ilustra a 73 potência antagonista de dois anticorpos representativos da invenção, Anticorpo 1 e Anticorpo 6, em comparação com o anticorpo conhecido 2B7 no ensaio de alteração da forma de granulócitos humanos.
Os anticorpos de IgG4 identificados durante a otimização do 28G5 foram avaliados no ensaio de alteração da forma de granulócitos de cynomolgus. Todos os anticorpos foram capazes de neutralizar a atividade do GM-CSF no recetor do cynomolgus bem como no recetor humano, e todos os anticorpos foram mais potentes do que ο 2B7. 0 2B7 tinha uma IC50 de 26 pM enquanto que anticorpos representativos (Anticorpo 6, Anticorpo 1 e Anticorpo 2) do painel tinham valores de IC50 de 1,73, 2,03 e 3,2 pM, respetivamente.
Um painel das IgG4s identificadas durante a otimização do 28G5 foi avaliado quanto à sua potência de neutralização no ensaio de libertação de TNFa de monócitos. Este ensaio testa a aptidão para inibir a libertação do fator pró-inflamatório TNFa a partir de monócitos humanos quando estes são tratados com GM-CSF. Os anticorpos 1, 2, 5, 6, 9 e 10 foram testados e foram todos ativos neste ensaio e foram capazes de neutralizar completamente a ação do GM-CSF no seu recetor (IC50 que vão desde cerca de 43 a 139) enquanto que a uma concentração de 333nM ο 2B7 só conseguiu 50% de inibição da libertação de TNFa induzida por GM-CSF, indicando que este anticorpo é apenas um inibidor parcial neste ensaio. A Figura 5 ilustra a potência antagonista de dois anticorpos representativos da invenção em comparação com o anticorpo conhecido 2B7 no ensaio de libertação de TNFa de monócitos. Os dados são mostrados no Quadro 4 e são resumidos como se segue:
<150 pM
Anticorpo nos 1, 2, 5, 6, 9 e 10 <110 pM Anticorpo nos 1, 2, 5, 6 e 9 <100 pM Anticorpo nos 1, 5, 6 e 9
Uma marca distintiva da doença inflamatória é o aumento da sobrevivência dos tipos de células inflamatórias em resposta a sinais particulares. Os granulócitos são capazes de sobreviver durante mais tempo na presença de GM-CSF e, deste modo, avaliou-se a aptidão dos anticorpos de IgG4 isolados durante a otimização do 28G5 para inibir esta resposta, num ensaio de sobrevivência de granulócitos. Todas as IgG4s anti-GM-CSFRa da otimização de lider foram ativas neste ensaio e as potências de neutralização (IC50) representativas variaram desde 7,0 a 843,7 pM. Isto contrasta com o anticorpo murideo conhecido 2B7 que foi completamente inativo até uma concentração de 83 nM. A Figura 6 ilustra a potência antagonista de dois anticorpos representativos da invenção, Anticorpo 1 e Anticorpo 6, em comparação com o anticorpo conhecido 2B7 no ensaio de sobrevivência de granulócitos.
Como ilustrado nas Figuras 3 a 6, estes dados indicam que os nossos anticorpos têm propriedades significativamente diferentes em comparação com o anticorpo murideo conhecido 2B7. Por exemplo, os anticorpos representativos da invenção inibiram a sobrevivência de granulócitos e a proliferação de TF-1 estimulada com 7 pM de GM-CSF nos ensaios de sobrevivência de granulócitos e proliferação de TF-1 respetivamente, enquanto que ο 2B7 não inibiu a sobrevivência de granulócitos mas inibiu a proliferação de TF-1 (se bem que em menor grau do que os nossos anticorpos). Os dados indicam que os membros de ligação da invenção têm maior afinidade e melhor aptidão para inibir uma variedade de efeitos biológicos mediados através do GM-CSF-R em comparação com anticorpos anti-GM-CSFRa conhecidos. 75
As sequências de aminoácidos derivada de 28G5 e dos seus derivados foram alinhadas com as sequências conhecidas da linha germinal humana na base de dados VBASE e a linha germinal mais próxima identificada pela semelhança de sequência. A linha germinal mais próxima para o domínio VH de 28G5 e seus derivados foi identificado como VH1 DP5. A VH do 28G5 tem 14 alterações relativamente à linha germinal VH 1-24 (DP5) em regiões estruturais. A linha germinal mais próxima para o domínio VL é a Vlambdal VL 1-e (DPL8), que tem apenas 5 alterações relativamente à linha germinal nas regiões estruturais. As regiões estruturais do 28G5 e seus derivados foram restituídos à linha germinal por mutagénese específica de um locus para condizer identicamente com anticorpos humanos nativos. Todos, à exceção de um aminoácido, poderiam ser convertidos na linha germinal apenas com alterações modestas na potência do anticorpo. 0 aminoácido isoleucina na posição 94 da cadeia pesada (utilizando a numeração de Kabat, Kabat et al. 1971) não podia ser modificado para a treonina da linha germinal sem uma perda total de atividade. Por conseguinte, esta única alteração relativamente à linha germinal foi mantida na região estrutural do anticorpo.
Foi realizada uma análise pA2 completa de dois dos anticorpos anti-GM-CSFRa, Anticorpo 6 e Anticorpo 1, no ensaio de proliferação de TF-1. Os dados confirmam que estes anticorpos são antagonistas altamente potentes neste sistema com valores de pA2 calculados de -11,3±0,2 e -11,0±0,2, respetivamente (Figura 1).
Foi realizada uma análise pA2 completa de um dos anticorpos anti-GM-CSFRa, Anticorpo 6, nos ensaios de alteração de forma de granulócitos humanos e de cynomolgus. Os dados confirmam que este anticorpo é um antagonista altamente 76 potente nestes sistemas com valores de pA2 calculados de -10,58 e -10,78 nos ensaios humano e de cynomolgus, respetivamente (Figura 2). O GM-CSF estimula a diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas em colónias de granulócitos e macrófagos em ensaios em ágar semissólido. Por conseguinte, o Anticorpo 6 e Anticorpo 1 amadurecidos por afinidade, o mAb parental Anticorpo 3 (28G5) e um controlo negativo (CAT001) foram avaliados quanto à sua aptidão para antagonizar esta atividade especifica do GM-CSF utilizando células progenitoras derivadas de sangue periférico, num ensaio de formação de colónias. Os dados apresentados na Figura 7 demonstram que ambos os mAbs representativos amadurecidos por afinidade foram inibidores potentes da formação de colónias hematopoiéticas in vitro mediada pelo GM-CSF humano.
Os valores de IC50 aproximados foram 0,08 pg/mL (Anticorpo 6) e 0,25 pg/mL (Anticorpo 1) para o mAb amadurecido por afinidade. Curiosamente, o anticorpo murideo conhecido 2B7 pareceu ter pouca, se é que alguma, atividade inibidora neste ensaio até uma concentração de 66nM.
Em experiências de controlo, o mAb amadurecido por afinidade não tinha qualquer efeito na formação de colónias mediada pela combinação de SCF + IL-3 + G-CSF como esperado e, na ausência de citocinas, a formação de colónias foi insignificante (<4 colónias / cultura).
Para a análise in vivo da atividade antagonista do mAb especifico para huGM-CSFRa, pode ser utilizado o transplante de medula óssea de ratos transgénicos (Tg) que expressam ambas as cadeias α e β do GM-CSFR humano em ratos de tipo selvagem para gerar animais quiméricos em que a 77 expressão de huGM-CSFR transgénico esteja limitada às células hematopoiéticas derivadas da medula óssea e, deste modo, se assemelhe mais de perto com o perfil de expressão do recetor endógeno. Nestes ratos quiméricos Tg a administração de huGM-CSF leva a um aumento do peso do baço e à marginalização dos monócitos sanguíneos circulantes. 0 Anticorpo 6 amadurecido por afinidade e um mAb de controlo negativo, CAT001, foram avaliados quanto à sua aptidão para antagonizar estas respostas in vivo mediadas por GM-CSF. Para a análise dose-resposta, 6 grupos de 5 ratos quiméricos Tg foram tratados com 500 ng de huGM-CSF s.c. duas vezes por dia durante 4 dias (dia 1-4) e um sétimo grupo de controlo de cinco animais recebeu apenas PBS. Quatro dos 6 grupos de animais tratados com huGM-CSF receberam mAb de ensaio (Anticorpo 6) a 16 mg/kg, 5,3 mg/kg, 1,78 mg/kg ou 0,59 mg/kg no D.O enquanto que um quinto grupo dos animais tratados com huGM-CSF recebeu o controlo CAT001 a 16 mg/kg no D.O. Os resultados apresentados na Figura 8 demonstram que, em comparação com o controlo de PBS, o tratamento com huGM-CSF induziu um aumento significativo no peso do baço e uma diminuição dos monócitos sanguíneos circulantes. Como esperado, o tratamento com 16 mg/kg do controlo CAT001 não teve qualquer efeito sobre o aumento de peso do baço ou sobre a diminuição dos monócitos sanguíneos. Em contraste, houve um efeito dose-resposta claro após tratamento com o mAb de ensaio Anticorpo 6, já que a 16 mg/kg este anticorpo anulou o aumento de peso do baço e, embora ainda evidente, o efeito foi fortemente reduzido a 0,59 mg/kg de mAb. A IC50 parecia situar-se algures entre 0,59 mg/kg e 1,78 mg/kg. Um resultado semelhante foi observado para a diminuição induzida por GM-CSF nos monócitos circulantes - o tratamento com o mAb de ensaio Anticorpo 6 a 16 mg/kg anulou a diminuição, enquanto o mAb a 0,59 mg/kg teve apenas um impacto menor nesta resposta. Estes dados mostram 78 que o anticorpo anti-GM-CSFRa é um antagonista de GM-CSFRa humano in vivo. A fim de investigar adicionalmente as propriedades anti-inflamatórias destes anticorpos anti-GM-CSFRa, o Anticorpo 6 foi avaliado numa ensaio de libertação de citocinas de células mononucleares do sangue periférico. Neste ensaio, o TNFa e a IL-6 podem ser libertados endogenamente, dependendo do dador. Neste ensaio, o GM-CSF também é produzido endogenamente pelas células, ao invés de adicionado exogenamente, e, por conseguinte, os resultados observados neste ensaio representam a inibição dos efeitos biológicos da ligação do GM-CSF endógeno nativo ao seu recetor.
Após administração do anticorpo 6, ambas estas citocinas foram inibidas de forma dependente com a dose, como ilustrado na figura 9. Estes dados indicam que estes anticorpos podem inibir a atividade de GM-CSF nativo e que ao inibir a sinalização de GM-CSF é possível inibir citocinas pró-inflamatórias chave, tais como IL-6 e TNFa, as quais estão ambas implicadas num número de indicações inflamatórias tais como a artrite reumatoide.
Além disso, com base neste resultado com o Anticorpo 6 pode esperar-se que cada um dos anticorpos 1 a 20 também poderia demonstrar inibição neste ensaio, uma vez que se acredita que todos os anticorpos 1 a 20 se ligam à mesma região do GM-CSFRa.
Mapeamento de Resíduos Importantes para o Reconhecimento do Antigénio, e Análise da Sequência Nós determinado a variabilidade de resíduos em posições da sequência do scFv do Anticorpo 6 tratado com linha germinal 79 para identificar quais as posições que são normalmente conservadas para ligação a ligando e quais as posições que são variáveis num anticorpo que conserva ainda atividade de ligação a ligando.
As posições que contribuem para a ligação ao antigénio parecem ser os resíduos Kabat 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 e 96 no domínio VL e os resíduos Kabat 17, 34, 54, 57, 95, 97, 99 e 100B no domínio VH.
Foram identificadas sete posições que pareceram ser importantes para ligação ao antigénio: H95, H97, H99, H100B, L90, L92 e L96. Nós analisamos em seguida os resíduos nestas posições em sequências de 160 variantes isoladas durante o processo de otimização do anticorpo 28G5, as quais exibiram todas uma melhoria mínima de 5 vezes na potência no ensaio de proliferação de TF-1.
Os dados no Quadro 5 abaixo resumem os diferentes aminoácidos (dos 20 possíveis) que foram observados em cada uma destas posições e em L95A. Quando as posições são fortemente conservadas em relação aos aminoácidos presentes no 28G5 e/ou Anticorpo 6, isto é uma boa evidência de que aqueles aminoácidos são chave para ligar o antigénio. Por exemplo, os resíduos nas seguintes posições são fortemente conservados: H97, H100B, L90, L92. Método A sequência de ADN que codifica o scFv do Anticorpo 6 tratado com linha germinal e amadurecido por afinidade foi convertida no formato de apresentação de ribossoma, essencialmente como descrito na ref. [101] . Foi realizada PCR propensa a erro na sequência do Anticorpo 6, utilizando as condições de alta mutação (7,2 mutações per 1 000 bp) do 80 protocolo do fabricante (BD Bioscience), para criar uma biblioteca de sequências 574D04 variantes contendo mutações pontuais aleatórias. Esta biblioteca foi expressada em ribossomas e incubada com GM-CSFRa marcado para purificação para permitir a ocorrência de ligação. As variantes capazes de se ligarem ao GM-CSFRa marcado foram capturadas e removidas utilizando esferas paramagnéticas revestidas com proteína G (Dynal) . As variantes não ligadas que permaneceram na população foram adicionadas a uma mistura de quatro anticorpos anti-idiotípicos biotinilados, os quais tinham sido previamente obtidos a partir da grande biblioteca de apresentação de fagos de anticorpos humanos descrita na ref. [102] e que se sabia que se ligavam ao scFv do Anticorpo 6. As variantes ligadas pelos anticorpos anti-idiotípicos biotinilados foram capturadas com esferas de estreptavidina, enquanto que as variantes não ligadas foram eliminadas por lavagem. Este processo foi repetido durante mais dois ciclos de seleção de apresentação de ribossoma, seguindo a metodologia geral da ref. [101] .
Uma proporção representativa das variantes resultantes da seleção foi clonada num vetor de fagomídeo e as variantes de scFv foram expressadas em fago para avaliação por ELISA, utilizando o mesmo método como descrito em Edwards BM et al (2003) Journal of Molecular Biology Vol 334:103. Aquelas variantes que não exibiram ligação ao GM-CSFRa marcado para purificação foram avaliadas quanto à ligação à mistura de quatro anticorpos anti-idiotípicos que foram utilizados na seleção. As variantes que, no ensaio de ligação anti-idiótipo, demonstraram ligação que era igual ou superior à do scFv do Anticorpo 6 foram sequenciadas e as sequências foram analisadas para encontrar posições em que havia uma alta frequência de mutação. 81
Constatou-se que a taxa de mutação média da população de variantes era de 3,05 aminoácidos por cadeia Vh ou Vl, utilizando 486 sequências para as cadeias Vh e 451 sequências para as cadeias Vl. Elas foram analisadas quanto à presença de pontos quentes mutacionais, representando graficamente a frequência de mutação em relação à sua posição ao longo do scFv. A análise centrou-se naqueles clones com pelo menos uma mutação na CDR por Vh e VL e menos de 4 mutações por Vh e Vl. A partir deste painel de 123 sequências Vh e 148 sequências VL, os pontos quentes foram definidos como aqueles que tinham uma frequência mutacional de 5% ou mais.
Destacaram-se sete posições nas VHCDR3 e VlCDR3 do Anticorpo 6 como posições putativas importantes para ligação ao antigénio utilizando o método de seleção negativa de apresentação de ribossoma. Foi então realizada uma análise sobre 160 variantes de sequência isoladas durante o processo de otimização do anticorpo 28G5, na qual as sequências inteiras das VHCDR3 e VlCDR3 foram aleatorizadas e selecionadas relativamente a uma maior afinidade. Todas as sequências (incluindo o Anticorpo 6) são variantes de 28G5 que exibiram uma melhoria minima de 5 vezes em termos de potência no ensaio de proliferação de TF-1.
Determinação do Epítopo Linear Nós rastreamos o Anticorpo 6 e o anticorpo conhecido 2B7 contra 2442 péptidos, representando cada um regiões curtas da sequência de aminoácidos da porção extracelular do GM-CSFR-α, utilizando um método PEPSCAN. Foi determinada a média dos sinais de ligação para cada anticorpo contra todos os péptidos para gerar um sinal de fundo médio e para cada péptido foi calculada uma razão sinal / ruído. Para 82 ambos, Anticorpo 6 e 2B7, uma razão sinal / ruido de quatro ou mais foi contado como um sinal positivo especifico. As sequências de péptidos que originaram um sinal positivo especifico foram analisadas quanto à presença de motivos de ligação conservados e verificou-se que o Anticorpo 6 se ligava preferencialmente a um motivo YLDFQ, que corresponde aos resíduos 226 a 230 do GM-CSFRa humano maduro, e o anticorpo 2B7 ligava-se preferencialmente a um motivo DVRI, que corresponde aos resíduos 278 a 281 do GM-CSFRa humano maduro. A numeração da sequência de aminoácidos para o recetor maduro é como indicada na SEQ ID NO: 206. Método PEPSCAN (varrimento de ligação de péptidos)
Foram sintetizados péptidos sintéticos 15-meros na maioria sobrepostos possuindo sequências derivadas de GMCSF e rastreados utilizando cartões mini-PEPSCAN em formato de cartão de crédito (placa de 455 poços com poços de 3 uL) como anteriormente descrito [103]. A ligação de anticorpos a cada péptido foi testada num imunoensaio ligado a enzima (ELISA) baseado em PEPSCAN. Os cartões de polipropileno em formato de cartão de crédito de 455 poços contendo os péptidos covalentemente ligados foram incubados com amostra (por exemplo 10 ug/mL de anticorpo ou soro diluído a 1/1000 numa solução de PBS que contém 5% de soro de cavalo (v/v) e 5% de ovalbumina (p/v) ) e 1% de Tween80 ou no caso de bloqueio suave numa solução de PBS com 4% de soro de cavalo (v/v) e 1% de Tween80 (4°C, de um dia para o outro). Depois de lavar, os péptidos foram incubados com uma peroxídase anti-anticorpo (diluição a 1/1000, por exemplo peroxídase anti-rato de coelho, Dako) (1 h, 25°C) e, subsequentemente, depois de lavar, foram adicionados o substrato de peroxídase sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) e 2 uL/mL de H202 a 3%. Após 1 h, mediu-se o desenvolvimento de cor. O desenvolvimento de cor do ELISA 83 foi quantificado com uma câmara CCD e um sistema de processamento de imagem. A montagem consiste de uma câmara CCD e uma lente de 55 mm (Sony CCD Video Camara XC-77RR, Nikon micro-nikkor, lente de 55 mm f/2,8), um adaptador de câmara (Sony Camara adaptor DC-77RR) e o pacote de Software de Processamento de Imagem Óptimas, versão 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, E.U.A.). O Óptimas corre num sistema computador pentium.
Materiais e Métodos de Ensaio
Ensaio bioquímico de ligação a ligando
Foram preparadas preparações de scFv purificado como descrito no Exemplo 3 da W001/66754 [104]. As concentrações de proteína das preparações de scFv purificado foram determinadas utilizando o método BCA [105]. Placas microtítulo de 96 poços Fluoronunc™ foram revestidas de um dia para o outro a 4°C com 50yL/poço de IgG4 anti-humana diluída a 2,5pg/mL em PBS. As placas foram lavadas 3 vezes com 300yL/poço de PBS/0,1% de Tween-20, antes de serem bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente com 300yL/poço de 3% de BSA em PBS. As placas foram novamente lavadas 3 vezes com 300yL/poço de PBS/0,1% de Tween-20 e em seguida foram adicionados 50yL de GM-CSFRa humano diluído a 62,5ng/mL em 1% de BSA/PBS a cada poço e as placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de lavar 3 vezes como descrito acima, foram adicionados 25yL de material de amostra a cada poço, seguidos de 25yL de GM-CSF biotinilado diluído a 2nM em 1% de BSA/PBS. Para definir a ligação total foi utilizado apenas tampão como o material de amostra. Para definir a ligação não específica foi utilizado GM-CSF não marcado diluído a lOOnM em 1% de BSA como o material de amostra. As placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente, antes de se lavar 3 84 vezes como descrito acima. Foram adicionados 50 pL de estreptavidina marcada com európio (PerkinElmer) diluida a lOOng/mL em tampão de ensaio DELFIA™ a cada poço da placa e foi incubada durante 30-60 minutos à temperatura ambiente, antes de se lavar 7 vezes com tampão de lavagem DELFIA™. Foram adicionados 50pL/poço de solução de otimização DELFIA™ às placas e as amostras foram lidas a 615nm num leitor de placas.
Ensaio de proliferação de TF-1 Células TF-1, obtidas de R&D Systems e conservadas rotineiramente em RPMI 1640, 10% de FBS, piruvato de sódio lmM e 4ng/mL de GM-CSF, foram privadas de nutriente lavando 3 vezes em meio de ensaio (RPMI 1640, 5% de FBS, piruvato de sódio lmM), ressuspendendo em ensaio meio e incubando durante 7-24 horas a 37°C em 5% de CO2. As células foram em seguida ressuspensas a lxl05/mL em meio de ensaio e foram adicionados 100 pL a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços. As amostras de ensaio foram preparadas por filtração estéril da amostra-mãe antes da diluição em meio de ensaio. Foram então adicionados 50pL de material de ensaio a cada poço de células e estas foram incubadas durante 45-60 min a 37 °C em 5% de CO2. Foram então adicionados 50pL de GM-CSF diluído ao valor de ECso em meio de ensaio (ou 0,4ng/mL para alguns lotes de GM-CSF) a cada poço e as placas foram incubadas durante 16 horas a 37°C em 5% de CO2 numa câmara humidificada. Isto representa uma concentração final de 7 pM de GM-CSF. A fim de medir a proliferação das células, foram adicionados 20pL de 3H-timidina diluida a 5,0plCi/mL em meio de ensaio a cada poço da placa e as placas foram incubadas durante 4 horas ± 30 min a 37°C em 5% de CO2. As células foram em seguida colhidas em placas GF/C Unifilter™ de 96 poços utilizando 85 um coletor de placas e lavadas. Depois de adicionar 50yL de MicroScint 20” a cada poço da placa de filtração, as placas foram seladas e contadas num leitor de placas TopCount.
Ensaio de alteração da forma de granulócitos humanos
Camadas leucocitárias humanas (bolsa de sangue humano do Serviço de Transfusão de Sangue) foram misturadas num volume igual de 3% de Dextrano T-500 em NaCl a 0,9%. A mistura foi então incubada numa posição vertical até se formar uma interface. A camada superior foi colhida e aplicada sobre um gradiente de densidade histopaque 1.077, o qual foi em seguida centrifugado a 400g durante 40 minutos e deixado parar sem travar. As camadas superiores deste gradiente foram removidas deixando o sedimento de granulócitos. Quaisquer glóbulos vermelhos remanescentes no sedimento foram submetidos a lise ressuspendendo as células em 20 mL de água gelada durante 30s, seguida de adição imediata de cloreto de sódio a 1,8% gelado. As células foram em seguida re-sedimentadas a 1200rpm e ressuspensas em meio de ensaio (RPMI1640, 10% de FBS, lOOu/mL de
Penicilina, 100pg/mL de estreptomicina, HEPES 25 mM) a lxl06/mL. Foram então adicionados 100yL de células a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços. As amostras de ensaio foram preparadas por filtração estéril das amostras-mãe e diluição, consoante apropriado, em meio de ensaio.
Para isolamento do lider, foram então adicionados 50pL de amostra de ensaio às células e as placas foram incubadas durante 45-60 min a 37°C em 5% de CO2. Isto representa uma concentração final de 7 pM de GM-CSF. Isto foi seguido da adição de 50pL de GM-CSF diluido a 0,4ng/mL em meio de 86 ensaio a cada poço e de uma incubação de 4 horas a 37°C em 5% de CO2 numa câmara humidificada.
Para otimização do lider, as IgG4s filtradas diluidas em meio de ensaio foram misturadas com um volume igual de GM-CSF a 0,4ng/mL em meio de ensaio. Isto representa uma concentração final de 7 pM de GM-CSF. Foram então adicionados 100yL da mistura anticorpo/GM-CSF a cada poço. Isto foi seguido de uma incubação de 3 horas a 37°C em 5% de CO2 numa câmara humidificada.
Foi adicionado formaldeido frio a uma concentração final de 1,25% e as células foram fixadas de um dia para o outro a 4°C. Foram analisados 2000-5000 eventos por poço por citometria de fluxo. A média geométrica da dispersão direta (FSC) para cada amostra foi então obtida utilizando CellQuest. As células foram controladas para excluir populações irrelevantes (por exemplo células mortas/detritos) quando se calcula a média geométrica.
Ensaio de alteração da forma de granulócitos de cynomolgus
Os anticorpos foram avaliados num ensaio que mede a alteração da forma de granulócitos de cynomolgus após estimulação com GM-CSF. O granulócitos foram purificados de sangue completo de cynomolgus e o ensaio foi realizado essencialmente como descrito para o ensaio de alteração da forma de granulócitos humanos.
Dados de afinidade de ligação utilizando análise em biossensor O sistema BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor) foi utilizado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação entre scFvs e IgG4s com os recetores recombinantes. O Biossensor 87 utiliza os efeitos óticos da ressonância plasmónica superficial para estudar alterações na concentração superficial resultantes da interação de uma molécula de analito com uma molécula de ligando que está ligada covalentemente a uma matriz de dextrano. Tipicamente, a espécie do analito em solução livre é feita passar sobre o ligando acoplado e qualquer ligação é detetada como um aumento no sinal de SPR local. Isto é seguido de um periodo de lavagem, durante o qual a dissociação da espécie do analito é observada como uma diminuição no sinal de SPR, após o que qualquer analito remanescente é retirado do ligando e o procedimento repetido a várias concentrações diferentes de analito. É geralmente utilizada uma série de controlos durante uma experiência para garantir que nem a capacidade de ligação absoluta nem o perfil cinético do ligando acoplado se alteram significativamente. Um soro fisiológico tamponado com hepes patenteado (HBS-EP) é tipicamente utilizado como o diluente principal da amostras de analito e o solvente da fase de dissociação. Os dados experimentais são registados em unidades de ressonância (correspondendo diretamente ao sinal de SPR) em relação ao tempo. As unidades de ressonância são diretamente proporcionais ao tamanho e quantidade de analito ligado. 0 pacote de software BIAevaluation pode ser depois utilizado para atribuir constantes de velocidade à fase de dissociação (unidades da velocidade de dissociação s_1) e fase de associação (unidades da velocidade de associação M_1 s_1) . Estes valores permitem, em seguida, calcular as Constantes de Afinidade de Associação e Dissociação. A afinidade da IgG4 foi estimada utilizando um único ensaio em que a IgG4 foi capturada não covalentemente pela superfície amina da proteína A. Uma série de diluições do domínio extracelular do recetor de GM-CSF marcado para purificação recombinante, desde 100 a 6,25nM, foi em seguida feita passar sequencialmente sobre a IgG4. A molaridade do recetor foi calculada utilizando a concentração (Bradford) e a massa prevista para o polipéptido maduro não modificado após a tradução (39,7 kDa) . Cada um dos dois conjuntos de dados separados foi analisado em formatos idênticos. Os dados corrigidos em relação à célula de referência foram submetidos a ajuste utilizando o modelo de langmuir 1:1 ajustado para cálculo global simultâneo das velocidades de associação e dissociação, com o valor de Rmax ajustado para global. 0 nivel de IgG4 capturada durante cada ciclo foi avaliado para assegurar que a quantidade capturada permanecia estável durante toda a experiência. Adicionalmente, a velocidade de dissociação da IgG4 foi avaliada para determinar se era necessária uma correção para a deriva da linha de base. No entanto, ambas as interações da proteina A provaram ser suficientemente reprodutíveis e estáveis. A validade dos dados foi restringida pelos valores de chi2 e T calculados (valor/desvio do parâmetro), os quais tinham de ser <2 e >100, respetivamente.
Produção do domínio extracelular de GM-CSFRa marcado para purificação: Foi utilizado um vetor de expressão pEFBOS [106] que incorpora uma sequência que codifica o domínio extracelular do recetor de GM-CSF α humano (SEQ ID NO: 205, que representa os aminoácidos 1 a 298 do GM-CSFR maduro) com uma sequência sinal de IL-3 de murídeo e que incorpora uma etiqueta de purificação N-terminal para produzir o polipéptido do domínio extracelular (ECD) do recetor de GM-CSF marcado na extremidade N-terminal recombinante. O polipéptido de ECD marcado foi expressado nas células CHO utilizando o vetor pEFBOS utilizando procedimentos correntes. Este polipéptido também pode ser referido como domínio extracelular de GM-CSFRa purificado ou como o domínio extracelular solúvel de GM-CSFRa. 89
Pode ser utilizada qualquer etiqueta de purificação adequada, por exemplo, péptido Flag (DYKDDDE - SEQ ID NO: 204), Fc, biotina ou etiqueta de his. A purificação pode ser realizada utilizando qualquer técnica apropriada, por exemplo um polipéptido de ECD marcado com Flag (SEQ ID NO: 203) pode ser purificado numa coluna de cromatografia de afinidade M2 e eluido com o péptido FLAG.
Ensaio de libertação de TNFa de monócitos
Purificação de Monócitos (Kit de Isolamento de Monócitos -Miltenyi Biotec - 130-053-301):
Camadas leucocitárias humanas (bolsas de sangue humano do Serviço de Transfusão de Sangue) foram aplicadas sobre um gradiente de densidade histopaque 1.077 (Sigma, N° cat. 1077-1) e as células foram centrifugadas a 400xg durante 40 minutos. Não foi aplicada qualquer travagem quando se parava a centrifugadora. As células PBMC foram em seguida colhidas da interface. As células foram lavadas em PBS e sedimentadas a 300xg durante 10 min, antes dos glóbulos vermelhos remanescentes serem submetidos a lise ressuspendendo em 20mL de água gelada durante 15s, seguida da adição imediata de NaCl a 1,8% gelado. As células foram em seguida sedimentadas a 1200rpm durante 5 min e ressuspensas em 600yL de tampão MACS (PBS, EDTA 2mM). Foram adicionados 200yL do reagente de bloqueio de Fc proporcionado com o kit às células e misturados, antes da adição de 200yL de cocktail de Hapteno-anticorpo (também proporcionou com o kit) e mistura. As células foram em seguida incubadas a 4°C durante 15 min, antes de lavar duas vezes em 50mL de tampão de MACS. O sedimento celular foi ressuspenso em 600yL de tampão de MACS, antes da adição de 90 200yL de reagente de bloqueio de Fc e mistura, seguidos de 200yL de microesferas anti-hapteno MACS e mistura. As células foram incubadas durante 45 min a 4°C, antes de lavar em 50mL de tampão de MACS e ressuspender em 50 0yL de tampão de MACS. Foi preparada uma única coluna (Miltenyi Biotec 130-042-401) lavando com 3mL de tampão de MACS antes da suspensão celular ter sido aplicada à coluna. O efluente foi recolhido como a fração de monócitos enriquecida. A coluna foi lavada com 2x3mL de tampão de MACS e o efluente foi recolhido. A pureza dos monócitos foi verificada por revelação com anti-CD14-PE utilizando métodos correntes de citometria de fluxo. As células foram finalmente ressuspensas a 4 x 106/mL em meio de ensaio (RPMI 1640, 10% de FCS, lOOU/mL de penicilina, lOOyg/mL de estreptomicina).
Estimulação de Monócitos:
Foram adicionados 50yL de células a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços Costar. Foram adicionados 25yL de 150yg/mL de rhlFNy (R&D Systems) a todos os poços. As IgG4s filtradas diluidas em meio de ensaio foram misturadas com um volume igual de GM-CSF a 56ng/mL (4nM) em meio de ensaio. Isto representa uma concentração final de 1 nM de GM-CSF. Foram então adicionados 75yL de mistura de anticorpo/GM-CSF a cada poço. Os controlos foram poços apenas com GM-CSF ou sem GM-CSF e sem anticorpo. As placas foram em seguida incubadas durante 18 horas a 37 °C com 5% de CO2 num câmara humidificada. O sobrenadante foi então colhido para ser testado quanto ao niveis de TNF-α por ELISA. ELISA para TNFa (R&D Systems Sistema de Desenvolvimento de ELISA DY210): Placas de ELISA Immunosorb Fluoronunc foram revestidas de um dia para o outro à temperatura ambiente 91 com 100yL de anticorpo de captura a 4yg/mL em PBS. As placas foram em seguida lavadas três vezes com PBS/0,1% de Tween e bloqueadas com 300yL/poço de 3% de Marvel em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS/0,1% de Tween. Foram transferidos 100yL do sobrenadante das placas de ensaio para a placa de ELISA e foi adicionada uma titulação de TNF-α diluído em meio de ensaio aos poços de controlo. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas, antes de serem lavadas 4-5 vezes com PBS/0,1% de Tween. Foram adicionados 100yL de anticorpo de deteção diluída a 300 ng/mL em 1% de Marvel/PBS a cada poço da placa e as placas foram incubadas durante mais 2 horas à temperatura ambiente, antes de serem lavadas 4-5 vezes com PBS/0,1% de Tween. Estreptavidina-Európio (PerkinElmer 1244-360) foi diluída a 1:1000 em tampão de ensaio DELFIA (PerkinElmer 4002-0010) e adicionada a 100yL/poço antes da incubação durante 45min à temperatura ambiente. As placas foram em seguida lavadas 7 vezes em tampão de lavagem DELFIA, antes da adição de 100yL/poço de solução de otimização (PerkinElmer 4001-0010) e leitura a 615nm num leitor de placas.
Ensaio de sobrevivência de granulócitos
As células foram purificadas de camadas leucocitárias humanas como descrito para o ensaio de ativação de neutrófilos (ensaio de alteração de forma), lavadas em meio de ensaio (RPMI-1640 Glutamax, 10% de FBS, lOOU/mL de Penicilina, 100yg/mL de estreptomicina) e ressuspensas a 1 x 106/mL em meio de ensaio. Foram adicionados 100yL de células a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços Costar. Os lotes filtrados de anticorpo foram diluídos em meio de ensaio e misturados com 92 um volume igual de GM-CSF a 0,4ng/mL. Isto representa uma concentração final de 7 pM de GM-CSF. Os poços de controlo continham apenas meio ou GM-CSF sozinho. Foram então adicionados 100yL da mistura amostra de ensaio/GM-CSF a cada poço numa placa e as células foram incubadas durante 68 horas a 37°C/5% de CO2 num câmara humidificada. Foram adicionados 20yL de AlamarBlue a cada poço e as placas foram incubadas durante mais 24 horas a 37°C/5% de CO2 numa câmara humidificada. As placas foram em seguida lidas a 560nm e 590nm num leitor de placas.
Análise pA2 de anticorpos anti-GM-CSFRa no ensaio de proliferação de TF-1 e nos ensaios de alteração da forma de granulócitos humanos e de cynomolgus A principal ferramenta farmacológica para quantificar a afinidade de um antagonista competitivo é a análise de Schild. Utilizando esta abordagem pode ser determinado um meio independente do sistema para estimar a afinidade antagonista num ensaio funcional. 0 método baseia-se no conceito de que a concentração do antagonista e a sua afinidade determina o antagonismo da resposta agonista. Uma vez que o antagonismo pode ser quantificado e a concentração do antagonista é conhecida pode determinar-se a afinidade do antagonista. Este antagonismo é quantificado medindo a razão de concentrações igualmente ativas de agonistas, medidas na presença e ausência do antagonista, e referido como relações de dose (DR).
As relações de dose podem ser calculadas determinando a razão da EC50 do agonista (tipicamente GM-CSF) na ausência do membro de ligação relativamente à EC50 do agonista na presença de uma única concentração do membro de ligação. As relações de dose, exprimidas como log(DR-l), podem ser depois utilizadas numa regressão linear do log [membro de 93 ligação] para produzir uma regressão de Schild. Assim, para cada concentração do membro de ligação haverá um valor de DR correspondente; estes são representados graficamente como a regressão de log(DR-l) em função do log [membro de ligação]. Se o antagonismo é competitivo, haverá uma relação linear entre o log (DR-1) e o log [membro de ligação] de acordo com a equação de Schild em que a equação é como se segue
Log(DR-1) = log [A] - log KA
Nestas circunstâncias, um valor de zero para a ordenada dará uma interceção do eixo dos x em que log [a] = log Ka. Por conseguinte, a concentração do membro de ligação que produz um log (DR-1) = 0 será igual ao log KA, a constante de dissociação de equilíbrio do complexo membro de ligação - recetor. Esta é uma quantificação independente do sistema da afinidade do membro de ligação que deve ser exata para todos os sistemas celulares contendo o recetor.
Uma vez que os valores de KA são obtidos a partir de uma representação gráfica logarítmica, eles são logaritmos normalmente distribuídos. 0 logaritmo negativo desta concentração particular é referido empiricamente como pA2, a concentração de antagonista que produz um desvio duplo da curva de resposta em função da dose. A potência antagonista pode ser quantificada calculando pA2 a partir de uma única concentração de antagonista que produz um único valor para a relação de dose a partir da equação, em que pA2 = log (DR-1) - log[a] 94 [a] = concentração molar de antagonista que torna necessário duplicar a concentração de agonista para desencadear a resposta submáxima original. DR = a relação de dose é quantificada medindo a relação de concentrações de agonista igualmente ativas, medidas na presença e ausência do antagonista pA2 pode ser calculado a partir dos dados de ensaio dose-resposta.
Inibição da diferenciação mediada por GM-CSF in vitro de progenitores de células sanguíneas no ensaio de formação de colónias
As células mononucleares de sangue periférico enriquecidas em células progenitoras hematopoiéticas foram obtidas de dadores que sofreram mobilização de células progenitoras e aférese como parte do seu tratamento clinico padrão. As amostras foram desidentifiçadas e as células não foram
conservadas criogenicamente antes da utilização. 5xl04 células mononucleares foram cultivadas em ágar semissólido [107] na presença de GM-CSF humano a uma concentração final de 10 ng/mL. Os mAbs humanos amadurecidos por afinidade de ensaio, e o anticorpo murideo conhecido 2B7, foram adicionados a culturas de ágar a uma concentração final de 10, 5, 1, 0,5, 0,1 ou 0,05 yg/mL. O mAb humano parental 28G5 e um mAb humano de controlo negativo de isotipo condizente, CAT001, foram avaliados a uma única concentração de 10 yg/mL. Para efeitos de controlo, os mAbs foram também avaliados quanto à sua aptidão para bloquear a formação de colónias estimulada por uma combinação de SCF, IL-3 e G-CSF (Croker et al., 2004) e quanto ao seu impacto na formação de colónias na ausência de citocinas. A 95 formação de colónias (agregados de > 40 células) foi avaliada após 14 dias de incubação a 37°C com 10% de CO2 em ar. As colónias foram fixadas com gluteraldeido e contadas utilizando um microscópio de dissecção a uma ampliação de 35X.
Inibição da atividade biológica do GM-CSF in vivo em ratos transgénicos com ΰΜ-ΟβΡΙίαβ humano
Foram gerados ratos transgénicos (Tg) que expressam ambas as cadeias cx e β do GM-CSFR humano sob o controlo de um promotor de MHC de classe I e foram descritas as respostas do baço e células sanguíneas in vivo à administração de huGM-CSF [108]. Para a análise in vivo da atividade antagonista de mAbs específicos para huGM-CSFRa, pode utilizar-se o transplante da medula óssea de ratos Tg em ratos de tipo selvagem para gerar animais quiméricos de tal forma que a expressão de huGM-CSFRo^ transgénico está limitada às células hematopoiéticas derivadas da medula óssea, assemelhando-se, deste modo, mais de perto ao perfil de expressão do recetor endógeno. Nestes ratos quiméricos Tg com huGM-CSFRo^ a administração de huGM-CSF leva a um aumento do peso do baço e à marginalização dos monócitos sanguíneos circulantes.
Geração de ratos quiméricos Tg:
Os fémures e tíbias de ratos Tg dadores foram removidos e a medula óssea retirada com PBS estéril contendo 3% de soro fetal de vitelo (FCS). Os tampões de medula óssea foram em seguida sugados através de uma agulha 23G para obter uma suspensão de células simples, em seguida as células foram lavadas uma vez com PBS + 3% de FCS frio e feitas passar através de uma malha de aço inoxidável. Os glóbulos 96 vermelhos foram em seguida removidos por lise em tampão de cloreto de amónio 0,168 M, após o que as células foram lavadas mais duas vezes com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) + 3% de FCS, antes de terem sido feitas novamente passar através de uma malha de aço inoxidável. Para remover melhor as células mortas e os detritos celulares a suspensão foi centrifugada através de um leito de FCS. As células viáveis são recuperadas no sedimento, lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em PBS a 2,5 x 107/mL. Ratos C57/BL6 recetores com 5 a 8 semanas de idade foram irradiados letalmente com 2 doses de 550 Rad, com um intervalo de 3 horas. Os ratos recetores foram injetados por via intravenosa (i.v) com 0,2 mL da suspensão de células (isto é, 5 x 106 células/rato) e subsequentemente alojados em caixas cobertas com 0,02 M de neomicina na água de abeberamento durante 3 semanas. A reconstituição foi avaliada após 6 semanas através da análise de sangue periférico por FACS utilizando mAbs específicos para as cadeias α e β do huGMCSFR.
Tratamento com GM-CSF e análise subsequente de ratos quiméricos Tg:
Ratos quiméricos Tg foram tratados duas vezes por dia por via subcutânea (s.c.) com 500 ng de huGM-CSF durante 4 dias. Para análise da atividade antagonista do anticorpo, grupos de 5 ratos foram administrados com doses selecionadas de mAb (ver abaixo) por via intraperitoneal (i.p.) 1 dia antes do início do tratamento com GM-CSF. No dia 5, colheu-se 0,2 mL de sangue para análise das populações de leucócitos circulantes, em particular monócitos sanguíneos, utilizando um sistema de hematologia ADVIA™ (Bayer Diagnostics). Os animais foram em seguida sacrificados e os baços retirados para medição dos pesos. 97
Inibição de TNFa e IL-6 humanos expressados endogenamente a partir de células mononucleares de sangue periférico humano: Camadas leucocitárias humanas (bolsa de sangue humano do Serviço de Transfusão de Sangue) foram aplicadas sobre um gradiente de densidade histopaque 1.077 (Sigma, N° cat. 1077-1) e as células foram centrifugadas a 400xg durante 40 minutos. Não foi aplicada qualquer travagem para parar a centrifugadora. As células PBMC foram em seguida colhidas da interface. As células foram lavadas em PBS e sedimentadas a 300xg durante 10 min, antes de os glóbulos vermelhos remanescentes terem sido submetidos a lise ressuspendendo em 20mL de água gelada durante 15s, seguida da adição imediata de NaCl a 1,6% gelado. As células foram em seguida sedimentadas a 1200rpm durante 5 min e ressuspensas em lOmL de 10% de FBS/RPMI e 1% de penicilina estreptomicina. As células foram em seguida diluida a 5 x 106/mL. Foram fornecidos 110yL de células por poço (5,5 x 105/poço) e as células deixadas depositar durante lha 37 °C, 5% de CO2. Os seguintes reagentes foram adicionados como controlos de concentração final única; PHA (5pg/mL), LPS (25yg/mL), GM-CSF (lOng/mL) e controlo de isotipo (50yg/mL). O Anticorpo 6 foi adicionado a uma concentração de partida final de 50yg/mL com uma diluição sucessiva de cinco vezes. As placas foram em seguida incubadas durante 72h a 37°C, 5% de CO2. Os sobrenadantes foram colhidos após 72h e os niveis de TNFa e IL-6 foram calculados utilizando os seguintes kits R&D ELISA (sistema de desenvolvimento ELISA para hTNF-cx R&D Duoset DY210 e sistema de desenvolvimento ELISA para hIL-6 R&D Duoset DY206). Os ELISA foram realizados de acordo com as recomendações dos fornecedores. 98
Quadro 1: Inibição da proliferação de células TF-1 induzida por GM-CSF pelos anticorpos de IgG4 de não-linha germinal isolados a partir da otimização de 28G5. A proliferação de células TF-1 foi induzida com uma única concentração de GM-CSF na presença de concentrações crescentes de anticorpos de IgG4. Foi medida a incorporação de timidina tritiada e foram calculados os valores de IC50 para os anticorpos. Os dados são representativos de n^3. É mostrado o SEM (erro padrão da média).
IgG4 IC50 ± SEM (pM) 2B7 1575+490,5 anticorpo 1 5,3±0,33 anticorpo 2 15,0+4,71 anticorpo 4 48,0+8,33 anticorpo 5 9,3+5,39 anticorpo 6 0,97+0,033 anticorpo 7 93,8+24,6 anticorpo 8 34,5+2,63 anticorpo 9 40,8+7,15 anticorpo 10 55,3+3,73 anticorpo 11 9, 0 + 1,0 anticorpo 12 246, 3 + 19, 8 anticorpo 13 1106,0+174,9 anticorpo 14 16,3+4,9 anticorpo 15 163,8+7,3 anticorpo 16 12,8+3,3 anticorpo 17 14,3+2,8 anticorpo 18 13,3+3,4 anticorpo 19 23,8+4,3 anticorpo 20 9, 8 + 2,8
Quadro 2: Análise cinética de anticorpos de IgG4 de não-linha germinal anti-GM-CSFRa isolados durante a otimização do 28G5. Os anticorpos de IgG4 foram imobilizados na superfície de um chip revestido com proteina-A e uma série 99 de diluições de ECD de GM-CSF Ra marcados para purificação foram feitas passar sobre a IgG4. Os dados foram sujeitos a ajuste utilizando a Langmuir 1:1 simultânea ka kd com permissão de transporte de massa.
IgG4 KD (nM) anticorpo 1 0,264 anticorpo 2 0,376 anticorpo 4 4,07 anticorpo 5 0,847 anticorpo 6 0,139 anticorpo 7 3, 93 anticorpo 8 0,552 anticorpo 10 1,50 anticorpo 12 3, 02 anticorpo 14 0,502 anticorpo 15 1,03 anticorpo 16 1,14 anticorpo 17 0,193 anticorpo 19 0,388 anticorpo 20 0,127 Os dados para os anticorpos 9 e 11 foram difásicos
Quadro 3: Inibição da alteração da forma de granulócitos humanos induzida por GM-CSF pelos anticorpos de IgG4 de não-linha germinal isolados durante a otimização do 28G5. Os granulócitos humanos foram tratados com uma única concentração de GM-CSF na presença de concentrações crescentes de anticorpo de IgG4. A alteração na forma dos granulócitos foi medida utilizando citometria de fluxo e foram calculados os valores de IC50 para os anticorpos.
IgG4 IC50 ± SD (pM) 2B7 477±4 91 anticorpo 1 12,6±8,0 anticorpo 2 20,7±11,0 100
IgG4 IC50 ± SD (pM) anticorpo 5 30,0 anticorpo 6 13,3±11,8 anticorpo 9 44,0 anticorpo 10 62,0 anticorpo 11 90,0 anticorpo 16 16,0 anticorpo 20 7,8
Quadro 4: Inibição de libertação de TNFcx a partir de monócitos induzida por GM-CSF. Os monócitos humanos foram tratados com uma única concentração de GM-CSF na presença de concentrações crescentes de anticorpo de IgG4 de não- linha germinal. A libertação de TNFa foi medida por ELISA e foram calculados os valores de IC50 para os anticorpos.
IgG4 IC50 ± SD (pM) anticorpo 1 78,8±54,6 anticorpo 2 103,3±63,1 anticorpo 5 67,0 anticorpo 6 43,0±19,7 anticorpo 9 74,0 anticorpo 10 139, 0 101 Quadro aj 0 3 H tò Φ M 1 H 0 a t u 0 0 0 Φ Ό ã φ íS a 0 u Í) & r* 3,125 f*l in ca Ό d ICl ca 03 d «o ca VO d P *n c> 00 ϊ—< M o v> ca W o o ‘-Cl ici P 4,375 A */*> CS f ·*α cn c^ m d cs 90 θ' 4ΤΪ CS \D v> g o in ca r·"^ * RJ o Á > O O >c cí IC <N 05 jd. O O s t© c- 60 — — â vi Γ- οο MO O tC, ca d m ca Ό jS?1 o o ΚΊ d 1—4 > tr> ca Ό O r~ s o V> ca d *A ca v© c$ H CS vo vn 00 rs Q s VM H Vi CS tH cn Ç*5 O Vl CS o tTí t^· tn jsL >•*3 o IO ca T*** H LO CS \o Q tft o o io cS s VD C> p *r> *>> oc r">i <Λ 5Λ o o o in m c- oe vd <n y> »n ca vp O' Γ- Eh o c> «n c| H *n C~* m a\ H tn CS VO o. p O vi CS T—- PM 26,250 O *T> cs ΓΛ O o o o Pm O ca s m fS 1—1 rn ^3 o o o o 0\ w? 2,500 P Vi Γ- ιη .Sl| < o m CS T-H HaajT !> t» W i* H M ta 03 5D8£ > ca CQ rti ca O ta ta XVffSS 3Q onaisaa tn a% & r- Cr> 8 <Ti a\ W Λ o o rH « o <n (PI Cl CTi ►3 «si in <Λ 4 IO <Λ M3 102
Chave para a Listagem de Sequências
Na listagem de sequências apensa são listadas as sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos ("PRT") para 20 clones de anticorpo, compreendendo o clone parental e os 19 clones do painel de otimização. Os anticorpos são numerados Abl a Ab20. O clone parental é o anticorpo 3, representado pelas SEQ ID NOS: 21-30 e SEQ ID NOS: 211-212. A lista seguinte identifica por número as SEQ ID NOS nas quais são mostradas as sequências das moléculas indicadas: (nt = sequência de nucleótido; aa = sequência de aminoácidos 1 nt de VH de Anticorpo 01 2 aa de VH de Anticorpo 01 3 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 01 4 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 01 5 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 01 6 nt de VL de Anticorpo 01 7 aa de VL de Anticorpo 01 8 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 01 9 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 01 10 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 01 11 nt de VH de Anticorpo 02 12 aa de VH de Anticorpo 02 13 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 02 14 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 02 15 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 02 16 nt de VL de Anticorpo 02 17 aa de VL de Anticorpo 02 18 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 02 19 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 02 20 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 02 103 nt de VH de Anticorpo 03 aa de VH de Anticorpo 03 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 03 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 03 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 03 nt de VL de Anticorpo 03 aa de VL de Anticorpo 03 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 03 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 03 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 03 nt de VH de Anticorpo 04 aa de VH de Anticorpo 04 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 04 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 04 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 04 nt de VL de Anticorpo 04 aa de VL de Anticorpo 04 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 04 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 04 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 04 nt de VH de Anticorpo 05 aa de VH de Anticorpo 05 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 05 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 05 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 05 nt de VL de Anticorpo 05 aa de VL de Anticorpo 05 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 05 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 05 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 05 nt de VH de Anticorpo 06 aa de VH de Anticorpo 06 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 06 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 06 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 06 104 nt de VL de Anticorpo 06 aa de VL de Anticorpo 06 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 06 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 06 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 06 nt de VH de Anticorpo 07 aa de VH de Anticorpo 07 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 07 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 07 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 07 nt de VL de Anticorpo 07 aa de VL de Anticorpo 07 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 07 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 07 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 07 nt de VH de Anticorpo 08 aa de VH de Anticorpo 08 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 08 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 08 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 08 nt de VL de Anticorpo 08 aa de VL de Anticorpo 08 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 08 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 08 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 08 nt de VH de Anticorpo 09 aa de VH de Anticorpo 09 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 09 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 09 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 09 nt de VL de Anticorpo 09 aa de VL de Anticorpo 09 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 09 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 09 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 09 105 nt de VH de Anticorpo 10 aa de VH de Anticorpo 10 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 10 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 10 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 10 nt de VL de Anticorpo 10 aa de VL de Anticorpo 10 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 10 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 10 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 10 nt de VH de Anticorpo 11 aa de VH de Anticorpo 11 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 11 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 11 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 11 nt de VL de Anticorpo 11 aa de VL de Anticorpo 11 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 11 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 11 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 11 nt de VH de Anticorpo 12 aa de VH de Anticorpo 12 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 12 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 12 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 12 nt de VL de Anticorpo 12 aa de VL de Anticorpo 12 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 12 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 12 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 12 nt de VH de Anticorpo 13 aa de VH de Anticorpo 13 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 13 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 13 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 13 106 nt de VL de Anticorpo 13 aa de VL de Anticorpo 13 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 13 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 13 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 13 nt de VH de Anticorpo 14 aa de VH de Anticorpo 14 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 14 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 14 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 14 nt de VL de Anticorpo 14 aa de VL de Anticorpo 14 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 14 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 14 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 14 nt de VH de Anticorpo 15 aa de VH de Anticorpo 15 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 15 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 15 aa de CDR3 de VH Anticorpo 15 nt de VL de Anticorpo 15 aa de VL de Anticorpo 15 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 15 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 15 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 15 nt de VH de Anticorpo 16 aa de VH de Anticorpo 16 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 16 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 16 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 16 nt de VL de Anticorpo 16 aa de VL de Anticorpo 16 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 16 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 16 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 16 107 nt de VH de Anticorpo 17 aa de VH de Anticorpo 17 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 17 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 17 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 17 nt de VL de Anticorpo 17 aa de VL de Anticorpo 17 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 17 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 17 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 17 nt de VH de Anticorpo 18 aa de VH de Anticorpo 18 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 18 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 18 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 18 nt de VL de Anticorpo 18 aa de VL de Anticorpo 18 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 18 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 18 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 18 nt de VH de Anticorpo 19 aa de VH de Anticorpo 19 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 19 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 19 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 19 nt de VL de Anticorpo 19 aa de VL de Anticorpo 19 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 19 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 19 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 19 nt de VH de Anticorpo 20 aa de VH de Anticorpo 20 aa de CDR1 de VH de Anticorpo 20 aa de CDR2 de VH de Anticorpo 20 aa de CDR3 de VH de Anticorpo 20 108 nt de VL de Anticorpo 20 aa de VL de Anticorpo 20 aa de CDR1 de VL de Anticorpo 20 aa de CDR2 de VL de Anticorpo 20 aa de CDR3 de VL de Anticorpo 20
Sequência de resíduos linear de GM-CSFRoí
Sequência de aminoácidos completa de GM-CSFRoí humano
Domínio extracelular de GM-CSFRoí humano marcado com
FLAG
Péptido FLAG
Sequência de aminoácidos do domínio extracelular de GM-CSFRoí humano GM- -CSFRoí maduro nt de VL de Anticorpo 1 aa de VL de Anticorpo 1 nt de VL de Anticorpo 2 aa de VL de Anticorpo 2 nt de VL de Anticorpo 3 aa de VL de Anticorpo 3 nt de VL de Anticorpo 4 aa de VL de Anticorpo 4 nt de VL de Anticorpo 5 aa de VL de Anticorpo 5 nt de VL de Anticorpo 6 aa de VL de Anticorpo 6 nt de VL de Anticorpo 7 aa de VL de Anticorpo 7 nt de VL de Anticorpo 8 aa de VL de Anticorpo 8 nt de VL de Anticorpo 9 aa de VL de Anticorpo 9 nt de VL de Anticorpo 10 aa de VL de Anticorpo 10 nt de VL de Anticorpo 11 aa de VL de Anticorpo 11 109 229 nt de VL de Anticorpo 12 230 aa de VL de Anticorpo 12 231 nt de VL de Anticorpo 13 232 aa de VL de Anticorpo 13 233 nt de VL de Anticorpo 14 234 aa de VL de Anticorpo 14 235 nt de VL de Anticorpo 15 236 aa de VL de Anticorpo 15 237 nt de VL de Anticorpo 16 238 aa de VL de Anticorpo 16 239 nt de VL de Anticorpo 17 240 aa de VL de Anticorpo 17 241 nt de VL de Anticorpo 18 242 aa de VL de Anticorpo 18 243 nt de VL de Anticorpo 19 244 aa de VL de Anticorpo 19 245 nt de VL de Anticorpo 20 246 aa de VL de Anticorpo 20 247 nt de VH de Anticorpo 6 248 aa de VH de Anticorpo 6 249 nt de VL de Anticorpo 6 250 aa de VL de Anticorpo 6 251 aa de VH de FR1 252 aa de VH de FR2 253 aa de VH de FR3 254 aa de VH de FR4 255 aa de VL de FR1 256 aa de VL de FR2 257 aa de VL de FR3 258 aa de VL de FR4 As sequências de nucleótidos do dominio VL dos anticorp a 20 não incluem o codão gcg mostrado na extremidade 3' SEQ ID NOS : ( δ, 16, 26, 36 i, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186 e 196.
Em 110 conformidade, as sequências de aminoácidos do domínio VL não incluem o resíduo Ala C-terminal (resíduo 113) nas SEQ ID NOS: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187 e 197, respetivamente. O resíduo Alall3 e codão gcg correspondente não foram expressados nos Anticorpos 1 a 20. Uma comparação das sequências escritas com os segmentos de genes da linha germinal, especialmente JL2, indica que o resíduo Ala e o codão gcg correspondente não fazem parte do domínio VL. O resíduo de Gly na posição 112 estava presente nas sequências de scFv e IgG expressadas. No entanto, este resíduo não está presente nas sequências do segmento j da linha germinal humana que formam a região estrutural 4 do domínio VL, por exemplo JL2. O resíduo de Gly não é considerado como parte do domínio VL.
Para expressar a cadeia leve da IgG foi proporcionada uma sequência de nucleótidos que codifica a cadeia leve de anticorpo, compreendendo um primeiro exão que codifica o domínio VL, um segundo exão que codifica o domínio CL, e um intrão que separa o primeiro exão e o segundo exão. Em circunstâncias normais, o intrão é excisado pela maquinaria de processamento do ARNm celular, unindo a extremidade 3' do primeiro com a extremidade 5' do segundo exão. Assim, quando o ADN que possui a referida sequência de nucleótidos foi expressado como ARN, o primeiro e segundo exões foram unidos em conjunto. A tradução do ARN unido produz um polipéptido compreendendo os domínios VL e CL. Após excisão-união, a Gly na posição 112 é codificada pela última base (g) da sequência da estrutura 4 do domínio VL e pelas duas primeiras bases (gt) do domínio CL.
As sequências do domínio VL dos Anticorpos 1 a 20 são as SEQ ID NOS: 186 a 246, como indicado acima. As sequências 111 de nucleótidos do domínio VL terminam com cta como o codão final, e a Leu é o resíduo de aminoácido final nas sequências de aminoácidos correspondentes do domínio VL.
As sequências dos domínios VH e VL não tratados com linha germinal do Anticorpo 6 são mostradas nas SEQ ID NOS: 247 -250, além das sequências dos domínios VH e VL tratados com linha germinal mostradas nas SEQ ID NOS: 51, 52, 56, 57, 216 e 217.
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<120> MEMBRO DE LIGAÇÃO PARA O RECETOR DE GM-CSF <130> HMK/FP6768196 <140> EP <141> 2007-03-27 <150> EP 07712963.3 <151> 2007-03-27 <150> PCT/GB2007/001108 <151> 2007-03-27 <150> US 60/786569 117 <151> 2006-03-27 <160> 258 <170> Software de patentes Cambridge Antibody Technology versão 1.0 <210> 1 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Abl <400> 1 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaag tttccggata caccctcact gaactgtcca tccactgggt gcgacaggct 120 cccggaaaag gacttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacggcctac 240 atggaactga gcagcctgag atccgaggac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300 tctttcagtg gcatcgccta tcgcccctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcctca 360 <210> 2 <211> 120
<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 118 <4Ο0> 2
Gin Vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser Val Lys vai Ser Cys Lys vai 20
Ser Ile Hi S Trp Val Arg Gin Al a 35 40 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn 50 55 Gin Gly Arg val Thr Met Thr Glu 65 70 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85 Al a ile Val Gly Ser Phe Ser Gly 100 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <21 ( 3> 3 <21: 1> 5 <212> PRT <21: 3> Homo sapien lS <22 ( D> <22: 3> Abl
Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 45
Glu lie Val Tyr Ala Gin Arg Phe 60
Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 75 80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95
Ile Ala Tyr Arg Pro Trp Gly Gin 105 110 119 <4Ο0> 3
Glu Leu Ser ile His 5
<210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl <400> 4
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
Gly
<210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl <400> 5
Vai Gly Ser Phe Ser Gly lie Ala Tyr Arg Pro 5 10
<210> 6 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens 120 <220> <223> Abl <400> 6 cagtctgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagctc gatcagcacg 300 attttcggcg gagggaccaa gctcaccgtc ctaggtgcg 339
<210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abl <400> 7 121
Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Ser Ile Ser Thr lie Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 110
Ala
<210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl <400> 8
Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp vai Ser 5 10 122 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl <4 Ο Ο> 9
His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl <4 O 0> 10
Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Ser lie Ser Thr ile 5 10 <210> 11 <211> 360
<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab2 <4 0 0> 11 123 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120
cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac ISO gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300 tctttcagtg gccccgccct gcgcccctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360
<210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab2 <4 0 0> 12 124
Gin Vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala S 10 15
Ser val Lys vai Ser Cys Lys lie 20
Ser lie His Trp vai Arg Gin Thr 35 40
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn 50 55
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu 65 70
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg ser 85
Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 25 30
Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 45
Glu ile val Tyr Ala Gin Arg Phe 60
Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 75 80
Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95
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<210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab2 <4 0 0> 13
Glu Leu Ser ile His 5 125 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab2 <4 0 0> 14 Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu lie Val Tyr Ala Gin Arg Phe 5 10 15
Gly
<210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab2 <4 0 0> 15 val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Ala Leu Arg Pro 5 10 <210> 16 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab2 126 <4 Ο 0> 16 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcc 339
<210> 17 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <400> 17
Gin Ala val Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr hís Asn Asn Lys Arg pro Ser Gly val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 127
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr Vai Leu Gly
Ala 100 105 110 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab2 <4 0 0> 18
Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp vai Ser 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> <22 0> Homo sapiens <223> Ab2 <4 0 0> 19
His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5 128 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> Λ oo CM CM V Ab2 <400> 20
Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser vai 5 10
<210> 21 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab3 <400> 21 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300 tctttcagtg gctgggcctt tgactactgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360 <210> 22 <211> 120 129
<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab3 <400> 22
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser Ile His Trp Vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser ile Vai Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens 130 <22 0> <223> Ab3 <4 0 0> 23 Glu Leu i Ser ile His 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab3 <4 0 0> 24 Gly Phe ! Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gin Arg Phe 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab3 <4 0 0> 25 val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr 5 10 <210> 26 131
<211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Ab3 <400> 26 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339 <210> 27
<211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab3 <400> 27
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn ile Gly Ala Pro 30 20 25 132
Tyr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr vai Leu Gly 100 105 110
Ala
<210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab3 <400> 28
Thr Gly ser Gly Ser Asn ile Gly Ala Pro Tyr Asp vai ser 5 10
<210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens 133 <22 0> <223> Ab3 <4Ο0> 29
His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab3 <4 0 0> 30 Gin Sei r Tyr Asp Ser Ser 5 <210> 31 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab4
Ser vai 10 <400> 31 134 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300 tctttcagtc ccccgaccta cgggtactgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360
<210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab4 <400> 32
Gin vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser vai Lys Vai Ser Cys Lys lie Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30 135
Ser Ile His Trp Vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ile vai Gly Ser Phe Ser Pro Pro Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met Vai Thr vai Ser Ser 115 120
<210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab4 <400> 33 Glu Leu Ser Ile His 5
<210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens 136 <22 0> <223> Ab4 <4Ο0> 34
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
Gly
<210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab4 <400> 35
Vai Gly Ser Phe Ser Pro Pro Thr Tyr Gly Tyr 5 10 <210> 36 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Ab4 <400> 36 137 caggctgtgc tgacteagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339
<210> 37 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab4 <400> 37 138
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr vai Leu Gly 100 105 110
Al a
<210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab4 <400> 38
Gly Ala Pro Tyr Asp vai Ser
Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile 5 10 139 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab4 <4 0 0> 39 His Asn i Asn Lys Arg Pro 5 Ser <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab4 <4 0 0> 40 Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Vai 5 10 <210> 41 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab5 <400> 41 140 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300 tctttcagtg gctaccctta ccgcccgtgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcgagt
<210> 42 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab5 <400> 42
Gin val Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser val Lys val Ser Cys Lys lie Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu
Ser ile His Trp val Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40
4S
Phe
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu ile val Tyr Ala Glr» Arg 50 55 60 141
Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Glu Asp Thr ser Xle Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala lie Vai Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Pro Tyr Arg Pro Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Met Vai Thr vai Ser ser 115 120
<210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> < 2 2 3 > Ab 5 <400> 43
Glu Leu Ser lie His 5
<210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> < 2 2 3 > Ab 5 <400> 44 142
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu lie vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
Gly <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Alb5 <4 0 0> 45 vai Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Pro Tyr Arg Pro 5 10 <210> 46 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab5 <400> 46 143 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339
<210> 47 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> < 2 2 3 > Ab 5 <400> 47
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg Vai Thr ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60 144
Ser Ala ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp 61 u Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr vai Leu Gly 100 105 110
Ala <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab5 <4 0 0> 48
Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp vai Ser 5 10
<210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> < 2 2 3 > Ab 5 <400> 49
His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5 145 <210> 50 <211> 11 <212> <213> Homo sapiens <220> <223> Ab5 <400> 50 Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser vai 5 10 <210> 51 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab6 <400> 51
PRT caggtccagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcatgtaaag tttccggata caccctcact gaactgtcca tccactgggt gcgacaggct cccggaaaag gacttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacggcctac atggaactga gcagcctgag atccgaggac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg tctttcagtc ccttgacctt gggcctctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcctca <210> 52 <211> 120 60 120 180 240 300 360 146
<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> < 2 2 3 > Ab 6 <400> 52
Gin vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 IS
Ser val Lys val Ser Cys Lys vai Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30
Ser lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met: 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu lie Val Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ile Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Met val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens 147 <22 0> <223> Ab6 <4Ο0> 53
Glu Leu Ser lie His 5 <21 0> 54 <21 1> 17 <212> PRT <21 3> Homo sapiens <22 0> <22 3> Ab6 <40 0> 54 Gly Phe ! ASp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe 5 10 15
Gly <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab6 <4 0 0> 55
Vai Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu 5 10 <210> 56 148
<211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Ab6 <400> 56 cagtctgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc gcgaccgttg aggccggcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtgcg 339
<210> 57 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab6 <400> 57 149
Gin Ser vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Vai Glu Ala Gly 85 90 95
Leu Ser Gly Ser Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 110
Ala
<210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab6 <400> 58
Gly Ala Pro Tyr Asp vai Ser
Thr Gly Ser Gly Ser Asn ile 5 10 150 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab6 <4 0 0> 59 HÍS Α5Γ 1 Asn Lys Arg Pro <210> 60 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> < 2 2 3 > Ab 6 <400> 60
Ala Thr Vai Glu Ala Gly Leu Ser Gly Ser vai 5 10 <210> 61 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Ab7 <400> 61 151 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg tctttcagtg gccccgtgta cggcctctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt
<210> 62 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab7 <400> 62
Gin val Gin Leu vai Gin Ser Gly Alla Va^ LYS Lys Pr0 Ala 5 10 15
Ser val Lys Vai Ser Cys Lys lie Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser He His Trp val Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 40 45 60 120 180 240 300 360 35 152
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn 61u ile vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg vai Thr Met Thr Glu Asp Thr ser ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ile Vai Gly Ser Phe Ser Gly Pro Vai Tyr Gly Leu Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met vai Thr vai Ser Ser 115 120
<210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> < 2 2 3 > Ab 7 <400> 63
Glu Leu Ser ile His 5
<210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> < 2 2 3 > Ab 7 153 <400> 64
Gly phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
Gly
<210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab7 <400> 65 val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Vai Tyr Gly Leu 5 10 <210> 66 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab7 <4 0 0> 66 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 180 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 154 154 240 300 339 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg
<210> 67 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab7 <400> 67
Gin Ala Vai teu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 15585 90 95
Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr vai Leu Gly 100 105 110
Ala <210> 68 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab7 <4 0 0> 68
Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Vai Ser 5 10 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab7 <4 0 0> 69 His Asn Asn Lys Arg Pro <210> 70 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens 156 <22 0> <223> Ab7 <4Ο0> 70
Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser vai 5 10
<210> 71 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab8 <400> 71 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300 tctttcagtc ccccggccta ccgcccctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360
<210> 72 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens 157 <22 0> <223> Ab8 <4Ο0> 72
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys lie Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser ile His Trp vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ile Vai Gly Ser Phe Ser Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met Vai Thr vai Ser Ser 115 120
<210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab8 158 <4 0 0> 73 Glu Leu Ser ile His 5 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab8 <4 0 0> 74 Gly Phe ! ASp Pro Glu Glu 5 Gly <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab8 <4 0 0> 75 Vai Gly Ser Phe Ser Pro 5 <210> 76 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens 10 15 10 159 <22 0> <223> Ab8 <400> 76 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339
<210> 77 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab8 <400> 77 160
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg Vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr vai Leu Gly 100 105 110
Al a
<210> 78 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab8 <400> 78
Gly Ala Pro Tyr Asp Vai Ser
Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile 5 10 161 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab8 <4 0 0> 79 His Asn Asn Lys Arg Pro 5 Ser <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab8 <4 0 0> 80 Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Vai 5 10 <210> 81 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab9 <400> 81 162 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300 tctttcagtc cggtcacgta cggcctctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360
<210> 82 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab9 <400> 82
Gin val Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala S 10 15
Ser val Lys Val Ser Cys Lys Ile ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser ile His Trp Val Arg Gin Thr pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45 163
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asrt 50 55 Gin Gly Arg val Thr Met Thr Glu 65 70 Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85 Ala rle Val Gly Ser Phe Ser Pro 100 Gly Thr Met val Thr val Ser Ser 115 120
Glu lie Vai Tyr Ala Gin Arg Phe 60
Asp Thr Ser lie Asp Thr Ala Tyr 75 80
Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 90 95 val Thr Tyr Gly Leu Trp Gly Gin 105 110
<210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab9 <400> 83
Glu Leu ser ile His 5
<210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab9 164 <4Ο0> 84
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu lie Vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
Gly <210> 85 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab9 <4 0 0> 85 Vai Gl; / Ser Phe Ser Pro <210> 86 5 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab9 10 <400> 8 6 165 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339
<210> 87 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab9 <400> 87
Gin Ala val Leu Thr Gin Pro Ser ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin
Arg val Thr lie Ser cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn He Gly Ala Pro 166 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr vai Leu Gly 100 105 110
Ala
<210> 88 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab9 <400> 88
Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro Tyr Asp Vai Ser 5 10
<210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens 167 <22 0> <223> Ab9 <4Ο0> 89
His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab9 <4 0 0> 90 Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser 5 10 <210> 91 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 0 <400> 91 168 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300 tctttcagtg gcctcgcgta caggccctgg ggcaaaggga caatggtcac catctcgagt 360
<210> 92 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl0 <400> 92
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser vai Lys Vai Ser Cys Lys He Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser lie His Trp Vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn G^u I^e Val Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60 169
Gl Π Gly Arg val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser ASp Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Ile val Gly Ser Phe Ser Gly Leu Ala Tyr Arg Pro Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Met val Thr ile Ser Ser 115 120 <21 0> 93 <21 1> 5 <212> PRT <21 3> Homo sapiens <22 0> <22 3> Abl 0 <40 0> 93 Glu Leu Ser ile ! Hl! 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> AblΟ <4 Ο Ο> 94 170
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu lie vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
Gly <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 0 <4 0 0> 95 vai Gly Ser Phe Ser Gly Leu Ala Tyr Arg Pro 5 10 <210> 96 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 0 <4 0 0> 96 171 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggcce cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc etcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggeg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg
<210> 97 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> AblO <400> 97
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu He Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 172
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr vai Leu Gly 100 105 110
Ala <210> 98 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 0 <4 0 0> 98
Thr Gly Ser Gly Ser Asn ile Gly Ala pro Tyr Asp vai Ser 5 10 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 0 <4 0 0> 99
His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5 173
<210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> AblO <400> 100
Gin Ser Tyr Asp Ser ser Leu Ser Gly Ser Vai 5 10
<210> 101 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl1 <4 0 0> 101 caggtgcagc tggtgcaatc tggcgctgag gtgaagaagc ctgaggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa ttccgggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300 tctttcagtc cgatcacgta cggcctctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360 <210> 102 <211> 120 174
<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl1 <4 0 0> 102
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Glu Ala 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ile Pro Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser Ile His Trp Vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser lie Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ile Vai Gly Ser Phe Ser Pro ile Thr Tyr Gly Leu Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 103 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> 175 <223> Abl 1 <4 0 0> 103
Glu Leu Ser ile His 5 <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 1 <4 0 0> 104
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin
Gly 5 10 15 <210> 105 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 1 <4 0 0> 105
Val Gly Ser Phe Ser Pro Ile Thr Tyr Gly Leu 5 10 <210> 106 176
<211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abll <4 0 0> 106 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggtcc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339
<210> 107 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abll <4 0 0> 107 177
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser ser vai Ser Gly vai Pro Gly Gin 5 10 15
Arg val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110
Ala
<210> 108 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl1 <4 0 0> 108
Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser 5 10 178
<210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl1 <4 0 0> 109
His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5
<210> 110 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl1 <4 0 0> 110
Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser vai 5 10
<210> 111 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl2 <4 0 0> 111 179 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300 tctttcagtg gctgggcctt tgactactgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360
<210> 112 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl2 <4 0 0> 112
Gin Vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser vai Lys Vai Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser ile His Trp vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Tyr Ala Gin Arg Phe 60
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu He vai 50 55 180
Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Glu 65 70
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85
Ser lie Vai Gly Ser Phe Ser Gly 100
Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 113 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl2 <4 0 0> 113 Glu Leu Ser Ile His 5
<210> 114 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl2
Asp Thr Ser ile Asp Thr Ala Tyr 75 80 ASP Asp Thr Al a Vai Tyr Tyr Cys 90 95 Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Lys 105 110 <4 0 0> 114 181
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
Gly
<210> 115 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl2 <4 0 0> 115
Vai Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr 5 10 <210> 116 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl2 <4 0 0> 116 182 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcgagcc gaccgagatc 300 cgcttcgggg gagggaccaa gctcaccgtc ctaggtgcg
<210> 117 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl2 <4 0 0> 117
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg Vai Thr He ser Cys Thr Gly Ser Gly ser Asn ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly T^r A^a Pro Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val pro AsP Ar9 p^e 50 55 60 183
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Glu 85 90 95
Pro Thr Glu ile Arg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 110
Ala
<210> 118 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl2 <4 0 0> 118
Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro Tyr Asp Vai Ser 5 10 <210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl2 <4 0 0> 119 HlS AS n Asn Lys Arg Pro 5 184 184 <210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl2 <4 0 0> 120 Gin Ser Tyr Asp Ser Glu Pro Thr Glu Ile Arg
<210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl2 <4 0 0> 120
Gin Ser Tyr Asp Ser Glu Pro Thr Glu ile Arg 5 10
<210> 121 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl3 <4 0 0> 121 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300 tctttcagtg gctgggcctt tgactactgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360 <210> 122 <211> 120 185
<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl3 <4 0 0> 122
Gin Vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser Ile His Trp vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu ile vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser ile Vai Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met vai Thr vai Ser Ser 115 120
<210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens 186 <22 0> <223> Abl3 <4 Ο 0> 123 Glu Leu Ser ile His 5
<210> 124 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl3 <4 0 0> 124
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
<210> 125 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl3 <4 0 0> 125 Vai Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr 5 10 <210> 126 <211> 339 <212> ADN 187 <213> Homo sapiens <220> <223> Abl3 <400> 126 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcaggac gggcatcatc gtcttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg
<210> 127 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl3 <4 0 0> 127
Vai ser Gly Ala Pro Gly Gin 10 15 Gly Ser Asn lle 6ly Ala Pro 30
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser ser 5
Arg vai Thr ile Ser Cys Thr Gly ser 20 25
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 45 60 120 180 240 300 339
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu 35 40 188
Leu lie Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Arg 85 90 95
Thr Gly ile ile vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr vai Leu Gly 100 105 110
Ala
<210> 128 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl3 <4 0 0> 128
Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Vai Ser 5 10 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl3 <4 0 0> 129 189
His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5
<210> 130 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl3 <4 0 0> 130
Gin Ser Tyr Asp Ser Arg Thr Gly Ile Ile vai 5 10
<210> 131 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Abl4 <400> 131 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 180 240 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatattgggg 300 360 agcgtgaccg cctgggcctt tgactactgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 190
<210> 132 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl4 <4 0 0> 132
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser Vai Lys vai Ser Cys Lys lie Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser lie His Trp Vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu lie vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser Ile Leu Gly Ser Vai Thr Ala Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 133 191
<211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl4
<4 0 0> 133 Glu Leu Ser Ile His 5 <210> 134 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl4 <400> 134
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
Gly
<210> 135 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl4 <4 0 0> 135 192
Leu Gly Ser vai Thr Ala Trp Ala Phe Asp Tyr 5 10
<210> 136 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Abl4 <400> 136 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcgagga caggatgacg 300 gagttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339
<210> 137 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abl4 <4 0 0> 137 193
Gin Ala vai Leu Thr Gin pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg Vai Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Glu 85 90 95
Asp Arg Met Thr Glu Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr vai Leu Gly 100 105 110
Al a
<210> 138 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl4 <4 0 0> 138
Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp vai Ser 5 10 194
<210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl4 <4 0 0> 139
His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5
<210> 140 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl4 <4 0 0> 140
Gin Ser Tyr Asp Ser Glu Asp Arg Met Thr Glu 5 10
<210> 141 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl5 <4 0 0> 141 195 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagccggg 300 agcatccccg gctgggcctt tgactactgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360
<210> 142 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl5 <400> 142
Gin vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser ile His Trp Vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly phe Glu Trp Met 35 40 45 196
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu ile vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser lie Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser lie Ala Gly Ser Ile Pro Gly Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 143 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl5 <4 0 0> 143 Glu Leu Ser ile His 5
<210> 144 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl5 197 <4 Ο 0> 144
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
Gly
<210> 145 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl5 <4 0 0> 145
Ala Gly Ser ile Pro Gly Trp Ala Phe Asp Tyr 5 10
<210> 146 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl5 <4 0 0> 146 198 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagccagtt gattagcgcc 300 gccttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339
<210> 147 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl5 <400> 147
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg Vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60 75 80
Ser Ala ser Lys Ser Gly Thr ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly teu 65 70 199
Gin Al a Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr cys Gin Ser Tyr Asp Ser 85 90 95 Leu II e Ser Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr Vai Leu 100 105 110 Ala <21 0> 148 <21 1> 14 <212> PRT <21 3> Homo sapiens <22 0> <22 3> Abl5 <40 0> 148 Thr Gl y Ser Gly Ser Asn ile Gly Ala Pro Tyr Asp Vai Ser 5 10 <210> 149 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl5 <4 0 0> 149 His Asr i Asn Lys Arg Pro <210> 150 5 <211> 11
<212> PRT 200 <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl5 <4 0 0> 150
Gin Ser Tyr Asp Ser Gin Leu Ile Ser Ala Ala 5 10
<210> 151 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl6 <4 0 0> 151 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300 tctttcagtc cgttgaccat gggcctctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360
<210> 152 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens 201 <22 0> <223> Abl6 <4 0 0> 152
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser Vai Lys vai Ser Cys Lys ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser lie His Trp vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser Ile vai Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Met Gly Leu Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 153 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl6 202 <4 0 0> 153
Glu Leu Ser Ile His 5
<210> 154 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl6 <4 0 0> 154
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu ile vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
Gly <210> 155 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 6 <4 0 0> 155 val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Met Gly Leu 5 10 <210> 156 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> 203 <223> Abl6 <400> 156 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc gcgacctccg acgagatcct gagtggttcg 300 gttttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339
<210> 157 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl6 <400> 157
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 IS
Arg vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 204
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe SO 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Glu Ile S5 90 95
Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr vai Leu Gly 100 105 110
Ala <210> 158 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 6 <4 0 0> 158
Thr Gly Ser Gly Ser Asn ile Gly Ala Pro Tyr Asp Vai Ser 5 10
<210> 159 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl6 <4 0 0> 159 205
His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5
<210> 160 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abl6 <400> 160
Ala Thr Ser Asp Glu ile Leu Ser Gly Ser vai 5 10
<210> 161 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl7 <4 0 0> 161 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag·gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300 360 tctttcagtc ccctgacgat ggggttgtgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 206 <210> 162 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 7 <4 0 0> 162
Gin vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser Ile His Trp vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser ile Vai Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Met Gly Leu Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met vai Thr vai Ser Ser 115 120 <210> 163 <211> 5 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 7 <4 0 0> 163 Glu Leu Ser Ile His <210> 164 5 <211> 17
<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl7 <4 0 0> 164
Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu lie Vai Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 5 10 15
Gly <210> 165 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 7 <4 0 0> 165 vai Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Met Gly Leu 5 10 208
<210> 166 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl7 <4 0 0> 166 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc gcgaccgtcg aggacggcct gagtggttcg 300 gttttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339
<210> 167 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl7 <400> 167 209
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala pro Gly Gin 5 10 15
Arg Vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr vai Gl u Asp Gly 85 90 95
Leu Ser Gly Ser Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr Vai Leu Gly 100 105 110
Al a
<210> 168 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl7 <4 0 0> 168
Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp vai Ser 5 10 210
<210> 169 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 7 <4 0 0> 169 His Asr i Asn Lys Arg Pro 5 <210> 170 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl7 <4 0 0> 170
Ala Thr Vai Glu Asp Gly Leu Ser Gly Ser vai 5 10
<210> 171 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl8 <4 0 0> 171 211 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgttca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aacagtgggg 300 tctttcagtg ggcccgccct tcacctctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360
<210> 172 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl8 <400> 172
Gin vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pf'0 Ala S 10 15
Ser vai Lys vai Ser cys Lys lie Ser Gly His Ser Leu ser Glu Leu 20 25 30
Phe ile Hls Trp vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60 212
Gin Gly Arg vai Thr Met Thr Glu ASP Thr Ser ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser ASp ASp Thr Ai a vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Thr Vai Gly Ser Phe Ser Gly Pro Ala Leu His Leu Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <21 0> 173 <21 1> 5 <212> PRT <21 3> Homo sapiens <22 0> <22 3> Abl 8 <40 0> 173 Glu Leu i Phe ile Hl 5 5 <210> 174 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 8 <4 Ο 0> 174 213 dy Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu He vai Tyr Ala Gln Arg Phe Gln 213 5 10 15
Gly
<210> 175 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl8 <4 0 0> 175 val Gly Ser phe Ser Gly Pro Ala Leu His Leu 5 10 <210> 176 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 8 <4 0 0> 176 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagccagtg gaaccagccc 60 120 180 240 300 214 214 339 ctcttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg
<210> 177 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl8 <4 0 0> 177
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg Vai Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Gin 85 90 95
Trp Asn Gin Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr Vai Leu Gly 100 105 110
Ala 215 <210> 178 <211 > 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 8 <4 0 0> 178 Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro Tyr Asp vai 5 10 <210> 179 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 8 <4 0 0> 179 HÍS Α5Π i Asn Lys Arg Pro <210> 180 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 8 <4 Ο 0> 180 216
Gin Ser Tyr Asp Ser Gin Trp Asn Gin Pro Leu
<210> 181 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl9 <4 0 0> 181 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300 tctgtcagtc gcatcacgta cggcttctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360
<210> 182 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl9 <4 0 0> 182 217
Gin val Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ile Val Gly Ser Val Ser Arg Ile Thr Tyr Gly Phe Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met Val Thr val Ser Ser 115 120
<210> 183 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl9 <4 0 0> 183
Glu Leu Ser Ile His 5 218 <210> 184 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 9 <4 0 0> 184 Gly Phe Asp pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gin Arg Phe 5 10 15 Gly <210> 185 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 9 <4 0 0> 185 val Gly Ser vai ser Arg Ile Thr Tyr Gly Phe 5 10 <210> 186 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 9 <4 0 0> 186 219 219 60 120 180 240 300 339 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagccggaa cccccacgtc atcttcgggg gagggaccaa gctcaccgtc ctaagtgcg
<210> 187 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl9 <400> 187
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin S 10 15
Arg vai Thr ile Ser Cys Thr Gly ser Gly ser Asn ile Gly Ala Pro 20 25 30 ryr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 220
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Arg 85 90 95
Asn Pro His Vai lie Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Ser 100 105 110
Ala <210> 188 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 9 <4 0 0> 188
Thr Gly Ser Gly Ser Asn ile Gly Ala Pro Tyr Asp vai Ser 5 10 <210> 189 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 9 <4 0 0> 189 His Asn i Asn Lys Arg Pro <210> 190 5 <211> 11
<212> PRT 221 <213> Homo sapiens <220> <223> Abl9 <400> 190
Gin Ser Tyr Asp Ser Arg Asn Pro His Vai Ile
<210> 191 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Ab20 <4 0 0> 191 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300 tctttcagtc ccctgacgct gggcctctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360
<210> 192 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens 222 <22 0> <223> Ab2Ο <4 Ο 0> 192
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser ile His Trp vai Arg Gin Thr pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser ile Vai Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met Vai Thr vai Ser Ser 115 120
<210> 193 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab20 223 <400> 193 Glu Leu Ser ile His 5 <210> 194 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab2 0 <4 0 0> 194 Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Vai Tyr Ala Gin Arg Phe 5 10 15
Gly
<210> 195 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab20 <4 0 0> 195
Vai Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu 5 10 <210> 19 6 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens 224 <220> <223> Ab20 <4 Ο 0> 196 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc gcgaccgtgg acgaggccct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaagtgcg 339
<210> 197 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab20 <4 0 0> 197
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg Vai Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 45 40 225
Leu lie Tyr His Asn Asn Lys Arg 50 55
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser 65 70
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr 85
Leu Ser • Gly Ser Val Phe Gly Gly 100 Ala <210> 198 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab2 0 <4 0 0> 198
Thr Gly Ser Gly ser Asn ile Gly 5
Pro Ser Gly vai pro Asp Arg Phe 60
Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 75 80
Tyr Cys Ala Thr Vai Asp Glu Ala 90 95
Gly Thr Lys Vai Thr Vai Leu Ser 105 110
Ala Pro Tyr Asp vai Ser 10 <210> 199 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab2 0 <4 0 0> 199 226
His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5
<210> 200 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab20 <400> 200
Ala Thr Vai Asp Glu Ala Leu Ser Gly Ser Vai 5 10
<210> 201 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Tyr Leu Asp Phe Gin 5
<210> 202 <211> 385 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 227
Met Leu Leu Leu vai Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu pro His Pro 15 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Lys Ser Asp Leu Arg Thr Vai Ala Pro 20 25 30
Ala Ser Ser Leu Asn vai Arg Phe Asp Ser Arg Thr Met Asn Leu Ser 35 40 45
Trp Asp Cys Gin Glu Asn Thr Thr Phe Ser Lys Cys Phe Leu Thr Asp 50 55 60
Lys Lys Asn Arg vai Vai Glu Pro Arg Leu Ser Asn Asn Glu Cys Ser 65 70 75 80
Cys Thr Phe Arg Glu ile Cys Leu His Glu Gly vai Thr Phe Glu vai 85 90 95
His vai Asn Thr Ser Gin Arg Gly phe Gin Gin Lys Leu Leu Tyr Pro 100 105 110
Asn Ser Gly Arg Glu Gly Thr Ala Ala Gin Asn Phe Ser Cys Phe ile 115 120 125
Tyr Asn Ala Asp Leu Met Asn Cys Thr Trp Ala Arg Gly pr0 T^r A^a 130 135 140
Pro Arg Asp vai Gin Tyr Phe Leu Tyr ile Arg Asn Ser Lys Arg Arg 145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Cys Pro Tyr Tyr He Gin Asp Ser Gly Thr His Va1 165 170 175 228
Gly Cys His Leu Asp Asn Leu Ser Gly Leu Thr Ser Arg Asn Tyr phe 180 18S 190
Leu vai Asn Gly Thr Ser Arg Glu ile Gly ile Gin Phe Phe Asp Ser 195 200 205
Leu Leu Asp Thr Lys Lys ile Glu Arg Phe Asn Pro Pro Ser Asn vai 210 215 220
Thr val Arg cys Asn Thr Thr His Cys Leu vai Arg Trp Lys Gin Pro 225 230 235 240
Arg Thr Tyr Gin Lys Leu Ser Tyr Leu Asp Phe Gin Tyr Gin Leu Asp 245 250 255 val His Arg Lys Asn Thr Gin Pro Gly Thr Glu Asn Leu Leu He Asn 260 265 270 val Ser Gly Asp Leu Glu Asn Arg Tyr Asn Phe Pro Ser Ser Glu Pro 275 280 285
Arg Ala Lys His ser val Lys ile Arg Ala Ala Asp val Arg ile Leu 290 295 300
Asn Trp Ser ser Trp Ser Glu Ala ile Glu Phe Gly Ser Asp Asp Gly 305 310 315 320
Asn Leu Gly Ser val Tyr lie Tyr val Leu Leu lie val Gly Thr Leu 325 330 335 val Cys Gly ile val Leu Gly Phe Leu Phe Lys Arg Phe Leu Arg ile 340 345 350 229
Gin Arg Leu Phe Pro Pro vai pro Gin lie Lys Asp Lys Leu Asn Asp 355 360 365
Asn His Glu Vai Glu Asp Glu lie Ile Trp Glu Glu Phe Thr Pro Glu 370 375 380
Glu 385
<210> 203 <211> 316 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <223> Humano sequência com <400> 203
Ala Ser Ile Ser Ala Arg Gin Asp 1 5
Arg Gin Glu Lys Ser Asp Leu Arg 20
Asn val Arg Phe Asp Ser Arg Thr 35 40
Glu Asn Thr Thr Phe Ser Lys Cys 50 55 val val Glu Pro Arg Leu Ser Asn 65 70 FLAG etiqueta
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Thr 10 15
Thr Val Ala Pro Ala Ser Ser Leu 25 30
Met Asn Leu Ser Trp Asp Cys Gin 45
Phe Leu Thr Asp Lys Lys Asn Arg 60
Asn Glu Cys Ser Cys Thr Phe Arg 80 75 230
Glu xle Cys Leu His Glu Gly vai Thr Phe Glu vai His vai Asn Thr g5 90 95 ser Gin Arg Gly Phe Gin Gin Lys teu Leu Tyr Pro Asn Ser Gly Arg 100 IO5 1:l-0
Glu Gly Thr Ala Ala Gin Asn Phe Ser Cys Phe lie Tyr Asn Ala Asp 115 120 125
Leu Met Asn cys Thr Trp Ala Arg Gly Pro Thr Ala Pro Arg Asp vai 130 135 140
Gin Tyr Phe Leu Tyr Ile Arg Asn Ser Lys Arg Arg Arg Glu Ile Arg 145 150 155 160
Cys Pro Tyr Tyr He Gin Asp Ser Gly Thr His vai Gly cys His Leu 165 120 175
Asp Asn Leu Ser Gly Leu Thr Ser ISO
Thr ser Arg Glu Ile Gly Ile Gin 195 200
Lys Lys ile Glu Arg Phe Asn Pro 210 215
Asn Thr Thr his Cys Leu vai Arg 225 230
Lys Leu Ser Tyr Leu Asp Phe Gin 245
Asn Thr Gin Pro Gly Thr Glu Asn
Arg Asn Tyr Phe Leu va1 Asn Gly 185 190
Phe Phe Asp Ser Leu Leu Asp Thr 205 pro Ser Asn vai Thr vai Arg Cys 220
Trp Lys Gin Pro Arg Thr Tyr Gin 235 240
Tyr Gin Leu Asp Vai His Arg Lys 250 255
Leu teu ile Asn vai ser Gly A$P 260 265 270 231 231 Pro Ser Ser Glu Pro Arg Ala Lys His 280 255 Asp Vai Arg ile Leu Asn Trp Ser Ser 300 Gly Ser Asp Asp Gly 315
Leu Glu Asn Arg Tyr Asn Phe 275
Ser vai Lys Ile Arg Ala Ala 290 295
Trp Ser Glu Ala ile Glu Phe 305 310 <210> 204 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético FLAG péptido <400> 204
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> 205 <211> 298 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 205
Glu Lys Ser Asp Leu Arg Thr vai Ala Pro Ala Ser Ser Leu Asn vai 15 10 15
Arg Phe Asp Ser Arg Thr Met Asn Leu Ser Trp Asp Cys Gin Glu Asn 20 25 30
Thr Thr Phe Ser Lys Cys Phe Leu Thr Asp Lys Lys Asn Arg vai Vai 35 40 45 232
Glu ργο Arg teu Ser Asn Asn Glu Cys Ser Cys Thr Phe Arg Glu lie 50 55 60
Cys Leu His Glu Gly Vai Thr Phe Glu Vai His Vai Asn Thr Ser Gin 65 70 75 80
Arg Gly Phe Gin Gin Lys Leu Leu Tyr Pro Asn Ser Gly Arg Glu Gly
85 90 9S
Thr Ala Ala Gin Asn Phe Ser Cys Phe ile Tyr Asn Ala Asp Leu Met 100 105 110
Asn Cys Thr Trp Ala Arg Gly Pro Thr Ala Pro Arg Asp vai Gin Tyr 115 120 125
Phe Leu Tyr Ile Arg Asn Ser Lys Arg Arg Arg Glu He Arg Cys Pro 130 135 140
Tyr Tyr He Gin Asp Ser Gly Thr His vai Gly Cys His Leu Asp Asn 145 150 155 160
Leu Ser Gly Leu Thr Ser Arg Asn Tyr Phe Leu vai Asn Gly Thr Ser 165 170 175
Arg Glu He Gly He Gin Phe Phe Asp Ser Leu Leu Asp Thr Lys Lys 180 185 190
He Glu Arg Phe Asn Pro Pro Ser Asn Vai Thr Vai Arg cys Asn Thr ig5 200 205 rhr His Cys Leu vai Arg Trp Lys Gin Pro Arg Thr Tyr Gin Lys Leu 210 215 220 ser Tyr Leu Asp Phe Gin Tyr Gin Leu Asp vai His Arg Lys Asn Thr 230 235 240 225 233
Gin Pro Gly Thr Glu asií Leu Leu Ile Asn Vai Ser Gly Asp Leu Glu 245 250 255
Asn Arg Tyr Asn Phe Pro Ser Ser Glu Pro Arg Ala Lys His Ser vai 260 265 270
Lys ile Arg Ala Ala Asp vai Arg ile Leu Asn Trp ser Ser Trp Ser 275 280 285
Glu Ala Ile Glu Phe Gly Ser Asp Asp Gly 290 295 <210> 206 <211> 378 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 206 Glu Lys ; Ser Asp Leu Arg Thr val Ala Pro Ala Ser Ser Leu Asn val 1 5 10 15
Arg Phe Asp Ser Arg Thr Met Asn Leu Ser Trp Asp Cys Gin Glu Asn 20 25 30
Thr Thr Phe Ser Lys Cys Phe Leu Thr Asp Lys Lys Asn Arg vai vai 35 40 45
Glu Pro Arg Leu Ser Asn Asn Glu Cys Ser Cys Thr Phe Arg Glu Ile 50 55 60
Cys Leu His Glu Gly Val Tlir Phe 61« Val His Vai Asn Thr Ser Gin 65 70 75 80
Arg Gly Phe Gin Gin Lys Leu Leu Tyr Pro Asn ser Gly Arg Glu Gly 85 90 95 234
Thr Ala Ala Gin Asn Phe Ser Cys Phe Ile xyr Asn Ala Asp Leu Met 100 10S 110
Asn Cys Thr Trp Ala Arg Gly pro Thr Ala Pro Arg Asp vai Gin Tyr 115 120 125
Phe Leu Tyr Ile Arg Asn Ser Lys Arg Arg Arg Glu Ile Arg Cys Pro 130 135 140
Tyr Tyr ile Gin Asp Ser Gly Thr His vai Gly Cys His Leu Asp Asn 145 ISO 155 160
Leu Ser Gly Leu Thr ser Arg Asn Tyr Phe Leu vai Asn Gly Thr Ser 165 170 175
Arg Glu Ile Gly ile Glr> Phe Phe Asp Ser Leu Leu Asp Thr Lys Lys 180 185 I90 ile Glu Arg Phe Asn Pro Pro Ser Asn Vai Thr vai Arg cys Asn Thr 195 200 205
Thr His Cys Leu Vai Arg Trp Lys Gin Pro Arg Thr Tyr Gin Lys Leu 210 215 220
Ser Tyr Leu Asp Phe Gin Tyr Gin Leu Asp Vai His Arg Lys Asn Thr 225 230 235 240
Gin Pro Gly Thr Glu Asn Leu Leu Ile Asn vai Ser Gly AsP *-eu Olu 245 250 255
Asn Arg Tyr Asn Phe Pro Ser Ser Glu Pro Arg Ala tys His Ser Vai 260 265 270 235
Lys ile Arg Ala Ala Asp Vai Arg Ile Leu Asn Trp ser Ser Trp ser 275 280 285
Glu Ala Ile Glu Phe Gly Ser Asp Asp Gly Asn Leu Gly Ser Vai Tyr 290 295 300
Ile Tyr Vai Leu Leu Ile Vai Gly Thr Leu vai Cys Gly Ile Vai Leu 305 310 315 320
Gly Phe Leu Phe Lys Arg Phe Leu Arg Ile Gin Arg Leu Phe Pro Pro 325 330 335
Vai Pro Gin ile Lys Asp Lys Leu Asn Asp Asn His Glu Vai Glu Asp 340 345 350
Glu ile Ile Trp Glu Glu Phe Thr Pro Glu Glu Gly Lys Gly Tyr Arg 355 360 365
Glu Glu Vai Leu Thr Vai Lys Glu Ile Thr 370 375
<210> 207 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl <400> 207 236 cagtctgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagctc gatcagcacg B00 attttcggcg gagggaccaa gctcaccgtc cta 333
<210> 208 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl <400> 208
Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60 237
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 6S 70 7S 80
Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 8$ 90 95
Ser ile Ser Thr Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu 100 105 110
<210> 209 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab2 <400> 209 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333 <210> 210 <211> 111
<212> PRT <213> Homo sapiens 238 <22 0> <223> Ab2 <4Ο0> 210
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp val ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly val Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser val Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Thr val Leu 100 105 110
<210> 211 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab3 <400> 211 239 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcetatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta <210> 212 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab3 <400> 212 Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 10 15
Arg val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly τ^γ Ala Pro tys Leu 35 40 45 Leu lie Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly val Pro Asp Arg phe 60 50 55 240
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gin Al a ASP Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gl n Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Ser Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr Vai Leu 100 105 110
<210> 213 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab4 <400> 213 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 ctteeaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaea acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 214 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens 241 <220> <223> Ab4 <4Ο0> 214
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr vai Leu 100 105 110
<210> 215 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab5 <400> 215 242 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta
<210> 216 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab5 <400> 216
Glr» Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 43
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 243
Ser Ala Ser Lys Ser Gly rhr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly Gly T^r Lys Va1 Thr vai Leu 100 105 110
<210> 217 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Ab6 <400> 217 cagtctgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcacettatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagect ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc gcgaccgttg aggccggcct gagtggttcg gttttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta
<210> 218 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens 244 <22 0> < 2 2 3 > Ab 6 <4Ο0> 218
Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr vai Glu Ala Gly 85 90 95
Leu Ser Gly Ser Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110
<210> 219 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> < 2 2 3 > Ab 7 <400> 219 245 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 220 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab7 <400> 220
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai ser Gly Ala Pro Gly Gin
Arg vai Thr ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 45 35 40 G1y Vai Pro Asp Arg Phe 60
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 50 55 246 246 Gly Leu 80 Ser Ser 95 Leu
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr 65 70 75
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp 35 90
Leu Ser Gly Ser Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr Vai 100 105 110 <210> 221 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab8 <4 0 0> 221 60 120 180 240 300 333 caggetgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta
<210> 222 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab8 247 <400> 222
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin S 10 15
Arg vai Thr ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr vai Leu 100 105 HO
<210> 223 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab9 <400> 223 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 120 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 248 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 224 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab9 <400> 224
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr ile Ser cys Thr Gly Ser Gly ser Asn lie Gly Ala Pro 20 2S 30
Tyr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu He Tyr His Asn Asn tys Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80 249
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser ser 85 90 95
Leu Ser Gly ser vai phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr vai Leu 100 105 110 <210> 225 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> AblO <400> 225 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actccteatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 226 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> AblO 250 <400> 226
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Thr val Leu 100 105 110
<210> 227 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl1 <400> 227 251 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggtcc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 228 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abll <400> 228
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Vai Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly ser Asn ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr His Asn A$n Lys Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80 252
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyj- xyr cyS Gin ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95
Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr vai Leu 100 105 110 <210> 229 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Abl2 <400> 229 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcgagcc gaccgagatc 300 cgcttcgggg gagggaccaa gctcaccgtc cta 333
<210> 230 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abl2 253 <4Ο0> 230
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg Vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Glu 85 90 95 pro Thr Glu ile Arg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leu 100 105 110
<210> 231 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl3 <400> 231 254 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcaggac gggcatcatc gtcttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta
<210> 232 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl3 <400> 232
Gin Ala Vai Leu Thr Gin pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala pro tys L€U 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg pro Ser Gly vai Pro Asp Arg phe 50 55 60 255 Ser Ala Ser 65
Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser 70
Leu Ala ile Thr Gly Leu 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Arg 85 90 95
Thr Gly xle ile Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Thr Vai Leu 100 105 110 <210> 233 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Abl4 <4 0 0> 233 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcgagga caggatgacg 300 gagttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 234 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens 256 <22 0> <223> Abl4 <4Ο0> 234
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg Vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly val Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Glu 85 90 95
Asp Arg Met Thr Glu Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Thr val Leu 100 105 110
<210> 235 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl5 <400> 235 257 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagccagtt gattagcgcc 300 gccttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 236 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl5 <400> 236
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr lie ser cy$ Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60 258
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala He Thr Giy Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr cys Gin Ser Tyr Asp Ser Gin 85 90 95
Leu Ile Ser Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr vai Leu 100 105 no
<210> 237 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Abl6 <400> 237 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct cectggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc gcgacctccg acgagatcct gagtggttcg 300 gttttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 238 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens 259 <22 0> <223> Abl6 <4Ο0> 238
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly val Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Glu ile 85 90 95
Leu Ser Gly Ser val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr val Leu 100 105 110
<210> 239 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl7 <400> 239 260 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc gcgaccgtcg aggacggcct gagtggttcg 300 gttttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 240 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl7 <400> 240
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser ser vai ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr ile Ser cys Thr Gly Ser Gly ser Asn ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 261
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr tyr cys Ala Thr vai Glu Asp Gly SS go 95
Leu ser Gly ser vai Phe Gly Gly Giy Thr Lys Val Thr vai Leu iOO 105 110 <210> 241 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Abl 8 <4 0 0> 241 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 120 180 240 300 333 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagccagtg gaaccagccc ctcttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta
<210> 242 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abl8 262 <4Ο0> 242
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg Vai Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Gin 85 90 95
Trp Asn Gin Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr Vai Leu 100 105 110
<210> 243 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl9 <400> 243 263 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagccggaa cccccacgtc 300 atcttcgggg gagggaccaa gctcaccgtc cta 333 <210> 244 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Abl 9 <400> 244
Gin Ala vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg vai Thr Ile Ser Cys rhr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp vai ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe SO 55 60 264 264 Ala Xle Thr G]y Leu 80 ser xyf ASP Ser Ar9 95 Leu Thr val Leu
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu 65 70 75
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin 85 90
Asn Pro His val lie Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 <210> 245 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Ab20 <400> 245 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc gcgaccgtgg acgaggccct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 246 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens 265 265 Linha Germinal <22 0> <223> Ab2Ο <4Ο0> 246
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser 5
Arg Vai Thr Ile Ser Cys Thr Gly 20
Tyr Asp Vai Ser Trp Tyr Gin Gin 35 40
Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg 50 55
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser 65 70
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr 85
Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly 100
<210> 247 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab 6 Não Tratado com
Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 10 15
Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 25 30
Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 45
Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 60
Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 75 80
Tyr Cys Ala Thr Val Asp Glu Ala 90 95
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 105 110 <400> 247 266 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300 tctttcagtc cgctaacgtt gggcctctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360
<210> 248 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab 6 Não Tratado com Linha Germinal <400> 248
Gin vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser vai Lys vai Ser Cys Lys ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30
Ser He His Trp Vai Arg Gin Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile vai Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60 267
Gin Gly ΑΓ9 Va1 Thr Met Thr 6lu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr L" 70 75 *>
Leu Thr (_eu ser ser Leu Arg ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser ile vai Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu Trp Gly Lys 100 105 110
Gly Thr Met vai Thr vai Ser Ser 115 120
<210> 249 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab 6 Não Tratado com Linha Germinal <400> 249 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc gcgacggtcg aggccggcct gagtggttcg 300 gttttcgggg gagggaccaa gctcaccgtc cta 333 <210> 250 <211> 111 268
<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab 6 Não Tratado com Linha Germinal <400> 250
Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn lie Gly Ala Pro 20 25 30
Tyr Asp val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Val Glu Ala Gly 85 90 95
Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110
<210> 251 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens 269 <22 0> < 2 2 3 > Ab 6 <4Ο0> 251
Gin val Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr 20 25 30 <210> 252 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab 6 <4 0 0> 252 Trp Val Arg ( 5ln Ala Pro <210> 253 5 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab 6 10 <400> 253 270
Arg vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys Ala lie 20 25 50
<210> 254 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> < 2 2 3 > Ab 6 <400> 254
Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr vai Ser Ser 5 10
<210> 255 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> < 2 2 3 > Ab 6 <400> 255
Gin Ser vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 5 10 15
Arg val Thr ile Ser Cys 20 <210> 256 <211> 15 271 271 <212> PRT <21 3> Homo sapiens <22 0> <22 3> Ab 6 <40 0> 256 Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 5 10 15 <210> 257 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab 6 <4 0 0> 257
Lys Ser Gly Thr ser Ala Ser 10 15 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 30
Gly vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 5
Leu Ala ile Thr Gly Leu Gin Ala Glu 20 25 <210> 258 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Ab 6 <400> 258 272
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 5 10
Lisboa, 30 de julho de 2013

Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Membro de ligação isolado para a cadeia alfa do Recetor do Fator de Estimulação de Colónias de Granulócitos/Macrófagos (GM-CSFRa) humanos, em que o membro de ligação: inibe ligação de GM-CSF ao GM-CSFRa humano; e tem uma KD inferior a 5 nM para a ligação de GM-CSFRa humano como determinado por ressonância plasmónica superficial; e em que o membro de ligação compreende: um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de VH: CDR1 de VH compreendendo a SEQ ID NO: 53, CDR2 de VH compreendendo a SEQ ID NO: 54 e CDR3 de VH compreendendo a SEQ ID NO: 55, opcionalmente com até 10 substituições de aminoácidos no referido conjunto de CDRs de VH, numa estrutura de domínio VH de anticorpo ou uma armação proteica, e opcionalmente um conjunto de CDRs de VL: CDR1 de VL compreendendo a SEQ ID NO: 00 LO CDR2 de VL compreendendo a SEQ ID NO: 59 e CDR3 de VL compreendendo a SEQ ID NO: 60, opcionalmente com até 10 substituições de aminoácidos no referido conjunto de CDRs de VL, numa estrutura de domínio VL de anticorpo ou armação proteica.
2. Membro de ligação de acordo com a reivindicação 1, em que o membro de ligação é uma molécula de anticorpo compreendendo um domínio VH de anticorpo compreendendo CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH e um domínio VL de 2 anticorpo compreendendo CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL.
3. Membro de ligação de acordo com a reivindicação 2, em que o dominio VH compreende: s no residuo Kabat Hl 7 da estrutura de VH; I no residuo Kabat H34 da CDR1 de VH; E no residuo Kabat H54 da CDR2 de VH; I no residuo Kabat H57 da CDR2 de VH; I, L, V, A ou M no residuo Kabat H94 da estrutura de VH; v, N, A ou L no residuo Kabat H95 da CDR3 de VH; S no residuo Kabat H97 da CDR3 de VH; s, F, Η, P, T ou W no residuo Kabat H99 da CDR3 de VH; A, T, P, S, V ou H no residuo Kabat H100B da CDR3 de VH.
4. Membro de ligação de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, em que o dominio VL compreende: S no residuo Kabat 27A da CDR1 de VL; N no residuo Kabat 27B da CDR1 de VL; I no residuo Kabat 27C da CDR1 de VL; 3 D no residuo Kabat 32 da CDR1 de VL; N no resíduo Kabat 51 da CDR2 de VL; N no resíduo Kabat 52 da CDR2 de VL; K no resíduo Kabat 53 da CDR2 de VL; S, T ou M no resíduo Kabat L90 da CDR3 de VL; D. E, Q , s, M ou T no resíduo Kabat L92 da CDR3 de VL; e/ou S, P, I ou V no resíduo Kabat L96 da CDR3 de VL. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, em que o conjunto de CDRs de VH compreende CDR1 de VH com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 173, CDR2 de VH com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e CDR3 de VH com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 185; e SEQ ID NO: 195; e em que o conjunto de CDRs de VL compreende a CDR1 de VL com a SEQ ID NO: 8, CDR2 de VL com a SEQ ID NO: 9 e CDR3 de VL com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 190 e SEQ ID NO: 200. 4 Membro de ligação de acordo com a reivindicação 5, compreendendo um domínio VH e um domínio VL selecionados dos seguintes: domínio VH de SEQ ID NO: 2 e domínio VL de SEQ ID NO: 208; domínio VH de SEQ ID NO: 12 e domínio VL de SEQ ID NO: 210; domínio VH de SEQ ID NO: 32 e domínio VL de SEQ ID NO: 214; domínio VH de SEQ ID NO: 42 e domínio VL de SEQ ID NO: 216; domínio VH de SEQ ID NO: 52 e domínio VL de SEQ ID NO: 218; domínio VH de SEQ ID NO: 62 e domínio VL de SEQ ID NO: 22 0; domínio VH de SEQ ID NO: 72 e domínio VL de SEQ ID NO: 222; domínio VH de SEQ ID NO: 82 e domínio VL de SEQ ID NO: 224; domínio VH de SEQ ID NO: 92 e domínio VL de SEQ ID NO: 22 6; domínio VH de SEQ ID NO : 102 e domínio VL de SEQ ID NO: 228 r domínio VH de SEQ ID NO : 112 e domínio VL de SEQ ID NO: 230 r domínio VH de SEQ ID NO : 122 e domínio VL de SEQ ID NO: 232 r domínio VH de SEQ ID NO : 132 e domínio VL de SEQ ID NO: 234 r domínio VH de SEQ ID NO : 142 e domínio VL de SEQ ID NO: 236 r domínio VH de SEQ ID NO : 152 e domínio VL de SEQ ID NO: 238; 5 domínio NO: 240; VH de SEQ ID NO: 162 e domínio VL de SEQ ID domínio NO: 242; VH de SEQ ID NO: 172 e domínio VL de SEQ ID domínio NO: 244; VH e de SEQ ID NO: 182 e domínio VL de SEQ ID domínio NO: 246. VH de SEQ ID NO: 192 e domínio VL de SEQ ID
7. Método de produção de um membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo cultivar uma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o membro de ligação, em seguida purificar o membro de ligação. Lisboa, 30 de julho de 2013
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