MX2008012291A

MX2008012291A - Miembro que enlaza al receptor gm-csf.

Info

Publication number: MX2008012291A
Application number: MX2008012291A
Authority: MX
Inventors: Ralph Raymond Minter; Matthew Alexander Sleeman; Emma Suzanne Cohen; Paula Rosamund Harrison; Andrew Donald Nash; Louis Jerry Fabri
Original assignee: Medimmune Ltd
Priority date: 2006-03-27
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2009-01-12
Also published as: AU2007231128A1; RU2012157042A; CN101443360A; US20210147559A1; PL2423229T3; CA2647449C; DK2423229T3; SI2423230T1; US20190309077A1; KR101481844B1; BRPI0709259A2; SI2423229T1; PT1999152E; PT2423229E; RU2008137763A; JP2013121350A; WO2007110631A1; EP2423230A1; BRPI0709259B1; EP2423229B1

Abstract

Se describen miembros de enlace para una cadena alfa de receptor para el factor estimulante de colonia de macrófago de granulocito (GM-CSFRcL), especialmente moléculas de anticuerpo. También se describe el uso de miembros de enlace en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias, por ejemplo artritis reumatoide, asma, respuesta alérgica, esclerosis múltiple, leucemia mieloide y ateroesclerosis.

Description

MIEMBRO QUE ENLAZA AL RECEPTOR GM-CSF CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a miembros que enlazan a la cadena alfa del Receptor de Factor que estimula a la Colonia de Granulocitos/Macrófagos (GM-CSFRa, por sus siglas en inglés), especialmente las moléculas del anticuerpo anti-GMCSFRa. También se refiere al uso de estos miembros de enlace en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, respiratorias y autoinmunitarias mediadas a través de GMCSFRa (que incluye la artritis reumatoide, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y esclerosis múltiple.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El GM-CSF es un tipo de citoquina proinflamatoria tipo I que mejora la supervivencia, proliferación y/o diferenciación de un intervalo amplio de tipos celulares hematopoyéticos que incluyen a los neutrófilos, eosinófilos, macrófagos y sus células progenitoras . El receptor GM-CSF es un miembro de la superfamilia del receptor de de la hematopoyétina . Es heterodimérico, que consiste de una subunidad alfa y beta. La subunidad alfa es altamente especifica para GM-CSF considerando que la subunidad beta se comparta con otros receptores de citoquina, que incluyen IL3 e IL5. Esto se refleja en una distribución del tejido más amplia de la Ref . : 196531 subunidad de receptor beta. La subunidad alfa, GM-CSFRa se expresa principalmente en las células mieloide y células no hematopoyéticas , tales como los neutrófilos, .macrófagos, eosinófilos, células dendriticas, células endoteliales y células epiteliales respiratorias. La longitud completa GM-CSFRa es una glicoproteina de la membrana tipo I de 400 aminoácidos que pertenece a la familia del receptor de citosina tipo I, y consiste de un péptido de señal de 22 aminoácidos (posiciones 1-22), un dominios extracelular de 298 aminoácidos (posiciones 23-320), un dominio de transmembrana de las posiciones 321-345 y Un dominio intracelular de 55 aminoácidos corto. El péptido de señal se desdobla para proporcionar la forma madura de GM-CSFRa como una proteina de 378 aminoácidos. Los clones del cADN del GM-CSFRa humano y murino están disponibles y, al nivel de la proteina, las subunidades del receptor tienen 36% de identidad. El GM-CSF es capaz de enlazarse con afinidad relativamente baja a la subunidad a solo (Kd 1-5 nM) pero no a toda la subunidad ß exclusivamente. Sin embargo, la presencia de ambas subunidades a y ß resulta en un complejo de ligando-receptor de alta afinidad (Kd « ?????) . La señalización del GM-CSF ocurre a través de su enlace inicial a la cadena GM-CSFR a y entonces se retícula con una subunidad más grande a la cadena ß común para generar la interacción de afinidad alta, que fosforila la trayectoria JAK-STAT. El GM-CSFR que enlaza al GMCSF se revisa en la ref . [1] . Esta interacción también es capaz de señalar a través de la fosforilación de la tirosina y activación de la trayectoria de la cinasa MAP. Patológicamente, el GM-CSF ha demostrado jugar un papel exacerbado en las enfermedades inflamatorias, respiratorias y enfermedades autoinmunitarias . La neutralización de GM-CSF que enlaza a GM-CSFRa es por consiguiente, una metodología terapéutica para tratar las enfermedades y condiciones mediadas a través del GM-CSFR. Nicola et al. [2] describe un anticuerpo murino contra GM-CSFRa humano designado 2B7-17-A o "2B7" que fue reportado por tener una afinidad relativamente alta para GM-CSFRa humano y ser un inhibidor potente de la acción biológica del GM-CSF humano en varios bioensayos diferentes. El anticuerpo 2B7 está disponible comercialmente de Chemicon como MAB1037, y la Hoja de Datos de Producto para MAB1037 nota que es un inhibidor potente de la acción biológica de GM-CSF. Se describió 2B7 también en la WO94/09149. Usando una combinación de selecciones en las colecciones del fago scFv sin tratar, la mutagénesis aleatoria y los ensayos bioquímicos y biológicos apropiadamente diseñados (vea la Parte Experimental debajo), se han identificado moléculas del anticuerpo muy potentes que enlazan al GM-CSFRa humano e inhiben la acción del GM-CSF humano en su receptor. Los resultados presentados en la presente indican que nuestros anticuerpos enlazan a una región diferente o epitopo de GM-CSFRa comparado con el anticuerpo anti-GM-CSFRa conocido 2B7, y sorprendentemente es aún más potente que 2B7 como se ha demostrado en una variedad de ensayos biológicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En consecuencia, esta invención se refiere a miembros de enlace que enlazan a GM-CSFRa humano e inhiben el enlace de GM-CSF humano a GM-CSFRa. Los miembros de enlace de la invención pueden ser antagonistas de GM-CSFR. Los miembros de enlace pueden ser inhibidores reversibles competitivos de GM-CSF que señalan a través de GM-CSFR. Los anticuerpos y otros miembros de enlace de la invención son de valor particular en el enlace y neutralización de GM-CSFRa, y por lo tanto, son de uso en los tratamientos para enfermedades mediadas por GM-CSFRa, que incluyen las enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias , como se ha indicado por la experimentación contenida en la presente y apoyada adicionalmente por la literatura técnica. Por ejemplo, se ha demostrado en los ensayos basados en células que los anticuerpos de la invención son capaces de inhibir la liberación de citoquinas (por ejemplo IL-6 y TNFa) inducido por el GM-CSF nativo que enlaza a su receptor. Como se explica con mayor detalle debajo, la inhibición de la actividad GM-CSF que bloquea el enlace a GM- CSFRa es una metodología terapéutica para tratar tales enfermedades como la artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), asma, inflamación de las vía respiratorias inducidas por el fumar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés), respuesta alérgica, esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés), leucemia mieloide y ateroesclerosis . Los miembros de enlace de acuerdo a la invención generalmente enlazan al dominio extracelular de GM-CSFRa. Preferiblemente, un miembro de enlace de la invención enlaza a por lo menos a un residuo de Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln (YLDFQ) , SEQ ID NO: 201, en las posiciones 226 a 230 de GM-CSFRa humano maduro (SEQ ID NO: 206) . El miembro de enlace puede enlazar por lo menos un residuo en la secuencia de YLDFQ de GM-CSFRa humano, por ejemplo puede enlazar a uno, dos, tres o cuatro residuos de la secuencia de YLDFQ. Así, el miembro que enlaza puede reconocer uno o más residuos dentro de esta secuencia, y opcionalmente también puede enlazar residuos de flanqueo adicionales o residuos estructuralmente adyacentes en el dominio extracelular de GM-CSFRa. El enlace puede determinarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, puede usarse una exploración enlazada al péptido, tal como un inmunoensayo ligado a la enzima basada en PEPSCAN (ELISA, por sus siglas en inglés), como se describe en detalle en otra parte en la presente. En una exploración enlazada al péptido, tal como el tipo proporcionado por los sistemas de PEPSCAN, los péptidos de superposición o traslape cortos derivados del antigeno se separan por exclusión sistemáticamente para enlazar a un miembro de enlace. Los péptidos pueden acoplarse covalentemente a una superficie de apoyo para formar una configuración de péptidos. Brevemente, una exploración enlazada al péptido (por ejemplo "PEPSCAN") involucra identificar (por ejemplo, usando ELISA) un conjunto de péptidos al cual el miembro de enlace se enlaza, en donde los péptidos tienen secuencias de aminoácidos que corresponden a los fragmentos de la SEQ ID NO: 206 (por ejemplo, los péptidos de aproximadamente 15 residuos contiguos de la SEQ ID NO: 206), y alineando los péptidos para determinar un espacio ocupado de residuos enlazados por el miembro que enlaza, donde el espacio ocupado comprende residuos comunes a los péptidos traslapados. De acuerdo con la invención, el espacio ocupado identificado por la exploración que enlaza al péptido o PEPSCAN puede comprender por lo menos un residuo de YLDFQ que corresponde a las posiciones 226 a 230 de la SEQ ID NO: 206. El espacio ocupado puede comprender uno, dos, tres, cuatro o todos los residuos de YLDFQ. Un miembro de enlace de acuerdo a la invención puede enlazar a un fragmento del péptido (por ejemplo, de 15 residuos) de la SEQ ID NO: 206 que comprenden uno o más, Preferiblemente todos, de residuos YLDFQ que corresponden a las posiciones 226 a 230 de la SEQ ID NO: 206, por ejemplo, determinadas por una exploración enlazada al péptido o método PEPSCAN descrito en la presente. Asi, un miembro de enlace de la invención puede enlazar a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de 15 residuos contiguos de la SEQ ID NO: 206, en donde la secuencia de 15 residuos comprende por lo menos un residuo de, o por lo menos parcialmente traslapado con, YLDFQ en las posiciones 226 a 230 de la SEQ ID NO: 206. Los detalles de un método de exploración enlazada al péptido adecuado para determinar el enlace establecido en detalle en otra parte en la presente. Otros métodos que son bien conocidos en el arte y podrían usarse para determinar los residuos enlazados por un anticuerpo, y/o confirmar los resultados de la exploración enlazada al péptido (por ejemplo, PEPSCAN), incluyen mutagénesis dirigida en el sitio, intercambio de deuterio de hidrógeno, espectrometría de masa, RMN, y cristalografía de rayos X. Por lo tanto, un miembro de enlace de la invención neutraliza preferiblemente GM-CSFRa. Neutralización significa reducción o inhibición de la actividad biológica de GM-CSFRa, por ejemplo, reducción o inhibición de GM-CSF que enlaza a GM-CSFRa, o señalización de GM-CSFR por ejemplo, medido mediante las respuestas de GM-CSFRa. La reducción o inhibición en la actividad biológica puede ser parcial o total. El grado en el que un anticuerpo neutraliza GM-CSFR está referenciado como su potencia de neutralización. La potencia puede determinarse o medido usando uno o más ensayos conocidos por la persona experimentada y/o como descrita o referenciada en la presente. Por ejemplo, el miembro de enlace puede tener actividad de neutralización en uno o más de los siguientes ensayos: Ensayo que enlaza al ligando bioquímico. Ensayo de proliferación TF-1. Ensayo de cambio de forma de granulocitos humano. Ensayo de cambio de forma de granulocito de primate no humano manos macacos Ensayo de liberación TNFa de monocitos Ensayo de supervivencia de granulocitos. Ensayo de formación de la colonia (inhibición de diferenciación mediada por GM-CSF in vitro de progenitores de células sanguíneas). Inhibición de bioactividad de GM-CSF in vivo por ejemplo, en ratones quiméricos con la médula ósea transgénica que expresa GM-CSFR humano. Ensayo que libera la citoquina celular monuclear sanguínea periférica. La potencia normalmente se expresa como un valor de IC50, en pM a menos que se declare lo contrario. En los ensayos funcionales, IC50 es la concentración que reduce una respuesta biológica mediante 50% de su máximo. En estudios de enlace de ligandos, la IC50 es la concentración que reduce el enlace del receptor mediante 50% de nivel de enlace específico máximo. La IC50 puede calcularse graficando el % de respuesta biológica máxima (representada por ejemplo, mediante la proliferación celular, que puede medirse como la incorporación de 3H timidina en cpm, en un ensayo de proliferación, mediante el cambio de forma en un ensayo de cambio de forma, mediante la liberación de TNFa en un ensayo de liberación de TNFa, supervivencia en un ensayo de supervivencia, el número de colonias en un ensayo de formación de la colonia, o mediante un incremento en el peso del bazo o disminución de monocitos circulantes en los ratones quiméricos con médula ósea transgénica que expresa GM-CSFR humano en una prueba de bioactividad) o % del receptor especifico que se enlaza como una función log de la concentración del miembro de enlace, usando un programa del software como el Prism (GraphPad) para fijar una función sigmoidal a los datos para generar los valores de IC50. Un valor de IC50 puede representar la media de una pluralidad de medidas. Asi, por ejemplo, pueden obtenerse valores de IC50 a partir de los resultados de experimentos por triplicado, y un valor de IC50 medio puede entonces calcularse . En el ensayo de proliferación TF-1, los miembros de enlace de la invención tienen normalmente un IC50 de menos de 1500 pM. Por ejemplo, el IC50 puede ser < 300, < 60, < 10, o < 1.5 pM por ejemplo, aproximadamente 1.0 pM. Normalmente IC50 es por lo menos 0.5 o 1.0 NM. El anticuerpo 2B7 de murino conocido tuvo un IC50 de aproximadamente 1600 pM en este ensayo. El ensayo de proliferación TF-1 usado en la presente tuvo una concentración final de 7 pM GM-CSF humano. Asi, la potencia de neutralización IC50 en el ensayo de proliferación TF-1 representa la capacidad de un miembro de enlace para inhibir la proliferación de células TF-1 inducida por 7 pM de GM-CSF humano. Para detalles adicionales ver la sección de Métodos y Materiales de Ensayo. Un miembro de enlace de la invención puede tener un pA2 más negativo que -6, -7, -8, -9, -10, -10.5 o -11 en el ensayos de proliferación de TF-1. Por ejemplo, pA2 pueden ser de aproximadamente -10.5 o -11. Se discuten el cálculo e importancia de valores pA2 en detalle en la Parte Experimental bajo los Métodos y Materiales de Ensayo. En el ensayo de cambio de forma de granulocito humano, los miembros de enlace de la invención tienen normalmente un IC50 de menos de 100 pM, por ejemplo, menos de 50 pM o menos de 30, 25, 20, 15 o 10 pM. Normalmente IC50 es por lo menos 5, 6 o 7 pM. El anticuerpo 2B7 murino conocido en contraste, es menos potente con un IC50 medido de 477 pM en este ensayo. El ensayo de cambio de forma del granulocito humano usado en la presente tuvo una concentración final de 7 pM GM-CSF humano. Asi, la potencia de neutralización IC50 en el ensayo de cambio de forma del granulocito humano representa la capacidad de un miembro de enlace para inhibir el cambio de forma de los granulocitos humanos inducida por 7 pM GM-CSF humano. Para más detalles ver la sección de Métodos y Materiales de Ensayo. En el ensayo de cambio de forma de granulocitos de manos macacos, los miembros de enlace de la invención tienen normalmente un IC50 de menos de 20 pM, típicamente menos de 10, 5 o 2.5 pM. El IC50 puede ser por lo menos de 0.5, 1 o 1.5 pM. El anticuerpo 2B7 de murino conocido tuvo un IC50 de 26 pM cuando se probó en este ensayo. El ensayo de cambio de forma del granulocitos de manos macacos usado en la presente tuvo una concentración final de 7 pM GM-CSF humano. Así, la potencia de neutralización IC50 en el granulocitos de manos macacos representa la capacidad de un miembro de enlace para inhibir el cambio de forma de los granulocitos manos macacos inducida por GM-CSF 7 pM humano. Para detalles adicionales ver la sección de Métodos y Materiales, del Ensayo. Un miembro de enlace de la invención puede tener un pA2 más negativo que -6, -7, -8, -9, -10, -10.5 u -11 en el humano y/o en los ensayos de cambio de forma del cynomologus. Preferiblemente el pA2 es aproximadamente -10 o -11. En el ensayo de liberación de TNFa en el monocito, los miembros de enlace de la invención normalmente tienen un IC50 de menos de 150 pM, típicamente menos de 110 pM, por ejemplo menos de ?????. El IC50 puede ser de por lo menos 30 o 40 pM. El ensayo de liberación de TNFa en el monolito usado en la presente tuvo una concentración final de 1 nM de GM-CSF humano. Asi, la potencia de neutralización IC50 en el ensayo de liberación de TNFa del monolito representa la capacidad de un miembro de enlace para inhibir la liberación de TNFa de monocitos humanos estimulados con 1 nM GM-CSF humano. Para detalles adicionales ver la sección de Métodos y Materiales de Ensayo . En el ensayo de supervivencia del granulocito, los miembros de enlace de la invención tienen normalmente un IC50 de menos de ??????, típicamente menos de 850 pM. El IC50 puede ser de menos de 500, 250, 150, 100, 50, 30, 20 o 10 pM, . El IC50 puede ser por lo menos de 5 pM. El anticuerpo 2B7 de murino conocido es inactivo en este ensayo hasta una concentración de 83nM. El ensayo de supervivencia del granulocito usado en la presente tuvo una concentración final de 7 pM GM-CSF humano. Así, la potencia de neutralización IC50 en el ensayo de supervivencia del granulocito representa la capacidad de un miembro de enlace para inhibir la supervivencia de granulocitos humanos inducida por 7 pM GM-CSF humano. Para detalles adicionales ver la sección de Métodos y Materiales de Ensayo. En el ensayo de formación de la colonia, los miembros de enlace de la invención pueden tener un IC50 de menos de 5, menos de 2.5, menos de 1 o menos de 0.3 µg/ml. Preferiblemente el IC50 es de 0.25 g/ml o menos, por ejemplo, menos de 0.1 µ?/???. El IC50 puede ser al menos 0.05 µ?/p??. El anticuerpo 2B7 de murino conocido tiene poca de cualquier actividad en este ensayo hasta una concentración de 10 µg/ml (67nM) . El ensayo de formación de la colonia usado en la presente tuvo una concentración final de 10 ng/ml GM-CSF humano. Asi, la potencia de neutralización de IC50 en el ensayo de formación de la colonia representa la capacidad de un miembro de enlace para inhibir la formación de la colonia inducida por 10 ng/ml GM-CSF humano. Para detalles adicionales ver la sección de Métodos y Materiales. Un miembro de enlace de la invención puede mostrar una capacidad dependiente de la dosis para inhibir el aumento en el peso del bazo y/o inhibir una disminución inducida por GM-CSF en los monocitos circulantes en los ratones quiméricos con la médula ósea transgénica que expresa GM-CSFR humano, que se trata con GM-CSF humano. El IC50 para la inhibición de peso del bazo incrementado puede ser de menos de 5, menos de 2.5, menos de 2, menos de 1 o menos de 0.75 mg/kg. El IC50 puede ser por lo menos de 0.5 mg/kg en algunas modalidades. Adicionalmente , puede determinarse la cinética de enlace y afinidad de los miembros de enlace para GM-CSFRa humano, por ejemplo mediante la resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo usando BIAcore. Los miembros de enlace de la invención normalmente tienen un KD de menos de 5 nM y más Preferiblemente menos de 4 , 3, 2 o 1 nM. Preferiblemente, el KD es de menos de 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 o 0.15 nM. Los miembros de enlace de la invención normalmente enlazan a GM-CSFRa de primate no humano, por ejemplo, GM-CSFRa manos macacos además de GM-CSFRa humano. Como existe una homología baja entre el humano y el receptor de GM-CSF de murino (aproximadamente 36%), los miembros de enlace de la invención generalmente no enlazarán o reaccionarán en forma cruzada con el receptor murino. Normalmente, un miembro de enlace de la invención comprende una molécula del anticuerpo, por ejemplo, un fragmento del anticuerpo o anticuerpo completo, como se discute con mayor detalle debajo. Preferiblemente, una molécula del anticuerpo de la invención es una molécula del anticuerpo humana. Un miembro de enlace de la invención normalmente comprende un anticuerpo VH y/o dominio VL . También se proporcionan los dominios VH y dominios VL de los miembros de enlace como parte de la invención. Dentro de cada uno de los dominios VH y VL se encuentran las regiones que determinan la complementariedad ("CDR", por sus siglas en inglés), y regiones de estructura, ("FR", por sus siglas en inglés). Un dominio VH comprende un conjunto de HCDR y un dominio VL comprende un conjunto de LCDR. Una molécula del anticuerpo comprende típicamente un anticuerpo del dominio VH que comprende un VH CDR1, CDR2 y CDR3 y una estructura. Puede alternativamente o también comprender un dominio VL del anticuerpo que comprende un VL CDR1, CDR2 y CDR3 y una estructura. Un dominio VH o VL comprende cuatro regiones de estructura, FR1, FR2, FR3 y FR4 , esparcidas con CDR en la siguiente estructura: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.

Ejemplos de dominios de VL y VH del anticuerpo, FRs y CDRs de acuerdo a la presente invención son como se listan en el listado de la secuencia anexada que forma parte de la presente descripción. Todas las secuencias CDR, secuencias VH y VL, conjuntos de CDRs y conjuntos de HCDRs y conjuntos de LCDRs descritos en la presente representan los aspectos y modalidades de la invención. Asi, un aspecto de la invención es un dominio VH de un miembro de enlace de acuerdo a la invención. Un "conjunto de CDRs" comprende CDR1, CDR2 y CDR3. Asi, un conjunto de HCDRs significa HCDRl, HCDR2 y HCDR3, y un conjunto de LCDRs significa LCDR1, LCDR2 y LCDR3. A menos que se declare lo contrario, un "conjunto de CDRs" incluye HCDRs y LCDRs. Típicamente, los miembros de enlace de la invención son anticuerpos monoclonales (mAb) . Como se describe con mayor detalle en la Parte Experimental, se ha identificado un panel de moléculas del anticuerpo que enlazan GM-CSFRa. Se han identificado ciertos residuos dentro de la complementariedad que determina las regiones (CDRs) de los dominios VH y VL que son especialmente importantes para la potencia de neutralización y enlace del receptor. Puesto que los CDRs son principalmente responsables para determinar el enlace y especificidad de un miembro de enlace, uno o más CDRs que tienen residuos apropiados como los definidos en la presente pueden usarse y pueden incorporarse en cualquier estructura adecuada, por ejemplo, una estructura del anticuerpo VH y/o dominio VL, o un andamio de proteina sin anticuerpos, como se ha descrito con mayor detalle en la presente. Por ejemplo, uno o más CDRs o un conjunto de CDRs de un anticuerpo pueden unirse en una estructura (por ejemplo, una estructura humana) para proporcionar una molécula del anticuerpo o moléculas del anticuerpo diferentes. Por ejemplo, una molécula del anticuerpo puede comprender CDRs como se ha descrito en la presente y regiones de la estructura de las secuencias del segmento del gen de linea germinal humana. Un anticuerpo puede proporcionarse con un conjunto de CDRs dentro de una estructura que puede estar sujeta a una linea germinal, dónde uno o más residuos dentro de la estructura se cambian para coincidir los residuos en la posición equivalente en la estructura de la linea germinal humana más similar. Asi, las regiones de estructura del anticuerpo son Preferiblemente la linea germinal y /o humano.

Se ha llevado a cabo una investigación en la que los residuos de un anticuerpo candidato fue importante para el reconocimiento del antigeno, siguiendo el método establecido en la sección experimental, y entonces se realizó un análisis de secuencia de 160 clones que muestra una potencia de por lo menos 5 veces más alta que el clon del anticuerpo progenitor en un ensayo biológico. Los resultados indicaron las siguientes posiciones que contribuyen al enlace del antigeno: residuos Kabat 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 y 96 en el dominio VL y residuos Kabat 17, 34, 54, 57, 95, 97, 99 y 100B en el dominio VH . En modalidades preferidas de la invención, uno o más de estos residuos Kabat es el residuo Rabat presente a esa posición para uno o más de los clones del anticuerpo numerados 1, 2 y 4-20 cuyas secuencias se describen en el listado de la secuencia anexada. En varias modalidades, el residuo puede ser igual que, o puede diferir de, el presente residuo a esa posición en el anticuerpo 3. El análisis actual indicó 4 posiciones del residuo en los CDRs que tiene una influencia particularmente fuerte en el enlace del receptor: H97, H100B, L90 y L92 (numeración Kabat) . Preferiblemente, H97 de VH CDR3 es S. El residuo serina en esta posición se observó en todos los 160 clones y por consiguiente representa un residuo importante para el reconocimiento del antigeno. Preferiblemente, un VH CDR3 comprende uno o más de los siguientes residuos: V, N, A o L en el residuo Kabat H95, más Preferiblemente V; S, F, H, P, T o W en el residuo Kabat H99, más Preferiblemente S; A, T, P, S, V o H en el residuo Kabat H100B, más Preferiblemente A o T. Preferiblemente, el residuo Kabat H34 en VH CDR1 es I. Preferiblemente, VH CDR2 comprende E en el residuo Kabat H54 y/o I en el residuo Kabat H57. Cuando el miembro de enlace comprende un dominio VH del anticuerpo, el residuo Kabat H17 en la estructura del dominio VH es Preferiblemente S. El residuo Kabat H94 es Preferiblemente I o una substitución conservadora de la misma (por ejemplo L, V, A o M) . Normalmente H94 es I. Preferiblemente, un VL CDR3 comprende uno o más de los siguientes residuos: S, T o en el residuo Kabat L90, más Preferiblemente S o T; D, E, Q, S, M o T en el residuo Kabat L92, más Preferiblemente D o E; A, P, S, T, I, L, o V en el residuo Kabat L96, más Preferiblemente S, P, I o V, sobre todo S. El residuo Kabat L95A en VL CDR3 es Preferiblemente S. Preferiblemente, un VL CDR1 comprende uno o más de lo siguientes residuos: S en residuo Kabat 27A; N en residuo Kabat 27B; I en residuo Kabat 27C; D en residuo Kabat 32. Preferiblemente, un VL CDR2 comprende uno o más de lo siguientes residuos: N en residuo Kabat 51; N en residuo Kabat 52; K en residuo Kabat 53. En una modalidad preferida, un miembro de enlace de la invención comprende uno o más CDRs seleccionados de VH y VL CDRs, es decir un VH CDR1, 2 y/o 3 y/o un VL CDR 1, 2 y/o 3 de cualquiera de los anticuerpos 1, 2 ó 4 a 20 como se muestra en el listado de secuencia, o del anticuerpo 3 progenitor. En una modalidad preferida, un miembro de enlace de la invención comprende un VH CDR3 de cualquiera de las siguientes moléculas del anticuerpo: Anticuerpo 1 (SEQ ID NO 5); Anticuerpo 2 (SEQ ID NO 15); Anticuerpo 3 (la SEQ ID NO 25); Anticuerpo 4 (la SEQ ID NO 35); Anticuerpo 5 (la SEQ ID NO 45); Anticuerpo 6 (SEQ ID NO 55); Anticuerpo 7 (SEQ ID NO 65); Anticuerpo 8 (SEQ ID NO 75); Anticuerpo 9 (SEQ ID NO 85); Anticuerpo 10 (SEQ ID NO 95); Anticuerpo 11 (SEQ ID NO 105); Anticuerpo 12 (SEQ ID NO 115); Anticuerpo 13 (SEQ ID NO 125); Anticuerpo 14 (SEQ ID NO 135); Anticuerpo 15 (SEQ ID NO 145); Anticuerpo 16 (SEQ ID NO 155); Anticuerpo 17 (SEQ ID NO 165); Anticuerpo 18 (SEQ ID NO 175); Anticuerpo 19 (SEQ ID NO 185); Anticuerpo 20 (SEQ ID NO 195). Preferiblemente, el miembro de enlace comprende adicionalmente un VH CDR1 de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 173 y/o un VH CDR2 de la SEQ ID NO: 4. Preferiblemente, un miembro de enlace que comprende VH CDR3 de la SEQ ID NO: 175 comprende un VH CDR1 de la SEQ ID NO: 173, pero puede comprender alternativamente un VH CDR1 de la SEQ ID NO: 3. Preferiblemente, el miembro de enlace comprende un conjunto de VH CDRs de uno de los siguientes anticuerpos: Anticuerpo 1 (SEQ ID 3-5); Anticuerpo 2 (SEQ ID 13-15); Anticuerpo 3 (SEQ ID 23-25); Anticuerpo 4 (SEQ ID 33-35); Anticuerpo 5 (SEQ ID 43-45); Anticuerpo 6 (SEQ ID 53-55); Anticuerpo 7 (SEQ ID 63-65); Anticuerpo 8 (SEQ ID 73-75); Anticuerpo 9 (SEQ ID 83-85); Anticuerpo 10 (SEQ ID 93-95); Anticuerpo 11 (SEQ ID 103-105); Anticuerpo 12 (SEQ ID 113-115); Anticuerpo 13 (SEQ ID 123-125); Anticuerpo 14 (SEQ ID 133-135); Anticuerpo 15 (SEQ ID 143-145); Anticuerpo 16 (SEQ ID 153-155); Anticuerpo 17 (SEQ ID 163-165); Anticuerpo 18 (SEQ ID 173-175) ; Anticuerpo 19 (SEQ ID 183-185) ; Anticuerpo 20 (SEQ ID 193-195). Opcionalmente también puede comprender un conjunto de VL CDRs de uno de estos anticuerpos, y VL CDRs puede ser del mismo o un anticuerpo diferente tal como los CDR VH. Generalmente, un dominio VH se alinea con un dominio VL para proporcionar un sitio que enlaza al antigeno, aunque en 1 algunas modalidades, un dominio VH o VL solo puede usarse para enlazar al antigeno. Se establece bien la promiscuidad de la cadena ligera en el arte, y por lo tanto, el dominio VH y VL no necesita ser el mismo clon, como se ha descrito en la presente. Un miembro de enlace puede comprender un conjunto de H y/o L CDRs de cualquiera de los anticuerpos 1 a 20 con una o más substituciones, por ejemplo diez o menos, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro o cinco, substituciones dentro del conjunto descrito de H y/o L CDRs. Las substituciones preferidas se encuentran en los residuos Kabat distintos de los residuos Kabat 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 y 96 en el dominio VL y residuos Kabat 34, 54, 57, 95, 97, 99 y 100B en el dominio VH, . Cuando se elaboran las substituciones en estas posiciones, la substitución es Preferiblemente para un residuo indicado en la presente como un residuo preferido en esa posición . En una modalidad preferida, un miembro de enlace de la invención es una molécula del anticuerpo humana aislada, que tiene un dominio VH que comprende un conjunto de HCDRs en una estructura de la linea germinal humana, por ejemplo, la estructura de la linea germinal humana de la cadena pesada VH1 o familia VH3. En una modalidad preferida, la molécula del anticuerpo humano aislada tiene un dominio VH que comprende un conjunto de HCDRs en una estructura de la linea germinal humano VH1 DP5 o VH3 DP47. Asi, las regiones de estructura del domino VH pueden comprender regiones de la estructura del segmento de gen de la linea germinal humana VH1 DP5 o VH3 DP47. La secuencia del aminoácido de VH FRl puede ser la SEQ ID NO: 251. La secuencia del aminoácido de VH FR2 puede ser la SEQ ID NO: 252. La secuencia del aminoácido de VH FR3 puede ser la SEQ ID NO: 253. La secuencia del aminoácido de VH FR4 puede ser la SEQ ID NO: 254. Normalmente, el miembro de enlace también tiene un dominio VL que comprende un conjunto de LCDRs, Preferiblemente en una estructura de la linea germinal humana, por ejemplo, una estructura de la linea germinal humana de la familia de la cadena ligera Vlambda 1 o Vlambda 6. En una modalidad preferida, la molécula del anticuerpo humana aislada tiene un dominio VL que comprende un conjunto de LCDRs en una estructura de la linea germinal humana VLambda 1 DPL8 o VLambda 1 DPL3 o VLambda 6_6a. Asi, la estructura del dominio VL puede comprender regiones de estructura del segmento del gen de linea germinal humano VLambda 1 DPL8, VLambda 1 DPL3 o VLambda 6 _6a. El dominio VL FR4 puede comprender una región de la estructura de segmento JL2 del gen de la linea germinal humana. La secuencia del aminoácido de VL FRl puede ser la SEQ ID NO: 255. La secuencia del aminoácido VL FR2 puede ser la SEQ ID NO: 256. La secuencia del aminoácido VL FR3 puede ser 257. La secuencia del aminoácido VL FR4 puede ser la SEQ ID NO: 258. Un anticuerpo sin linea germinal tiene los mismos CDRs, pero estructuras diferentes, comparados con un anticuerpo de la linea germinal. Un miembro de enlace de la invención puede competir por enlazar a GM-CSFRa con cualquier miembro de enlace descrito en la presente por ejemplo, el anticuerpo 3 o cualquiera de los anticuerpos 1, 2 o 4-20. Asi, un miembro de enlace puede competir por enlazar a GM-CSFRa con una molécula del anticuerpo que comprende el dominio VH y el dominio VL de cualquiera de los anticuerpos 1, 2 o 4-20. La competición entre los miembros de enlace puede ensayarse fácilmente in vitro, por ejemplo, etiquetando una molécula reportero a un miembro de enlace que puede detectarse en presencia de uno o más de otros miembros de enlace no etiquetados, para habilitar la identificación de los miembros de enlace que enlazan al mismo epitopo o un epitopo de superposición o traslape. La competición puede determinarse por ejemplo, usando ELISA en la cual por ejemplo, el dominio extracelular de GM-CSFRa, o un péptido del dominio extracelular, se inmoviliza a una placa y un primer miembro de enlace etiquetado junto con uno o más de otros miembros de enlace no etiquetados a la placa. La presencia de un miembro de enlace no etiquetado que compite con el miembro de enlace etiquetado se observa por una disminución en la señal emitida por el miembro de enlace etiquetado. Semejantemente, un ensayo de resonancia del plasmón en superficie puede usarse para determinar la competición entre los miembros de enlace. En la prueba de competición, puede emplearse un fragmento del péptido del antigeno, sobre todo un péptido que incluye o consiste esencialmente de un epitopo o región de enlace de interés. Puede usarse un péptido que tiene el epitopo o secuencia objetivo más uno o más aminoácidos en cualquier extremo. Los miembros de enlace de acuerdo a la presente invención pueden ser tales que su enlace para el antigeno se inhibe por un péptido con o que incluye la secuencia dada. Pueden aislarse miembros de enlace que enlazan a un péptido por ejemplo, de una colección de presentación del fago mediante el cribado con los péptidos. La presente invención también proporciona el uso de un miembro de enlace como el de arriba para medir los niveles del antigeno en un ensayo de competición, es decir, un método para medir el nivel del antigeno en una muestra empleando un miembro de enlace como el que se proporciona en la presente invención, en un ensayo de competición. Esto puede ser cuando la no se requiere separación física de enlace a partir del antígeno no enlazado. El enlace de una molécula reportero al miembro de enlace para que ocurra un cambio físico u óptico es una posibilidad. La molécula reportero puede directamente o indirectamente generar señales perceptibles, y Preferiblemente medibles. El enlace de las moléculas reportero puede ser directamente o indirectamente, covalente, por ejemplo vía un enlace del péptido o no covalentemente . El enlace vía un enlace del péptido puede estar como resultado de la expresión recombinante de una fusión del gen que codifica a un anticuerpo y una molécula reportero. La presente invención también proporciona medir los niveles del antigeno directamente, empleando a un miembro de enlace de acuerdo a la invención, por ejemplo, en un sistema biosensor. La presente invención proporciona un método que comprende causar o permitir el enlace de un miembro de enlace como se proporciona en la presente para GM-CSFRa. Tal enlace puede tener lugar in vivo, por ejemplo, siguiendo la administración de un miembro de enlace, o ácido nucleico que codifica a un miembro de enlace, o puede tener lugar in vitro, por ejemplo, en ELISA, Western blot, inmunohistoquimica, inmuno-precipitación, cromatografía de afinidad, o ensayos basados en células tales como el ensayo TF-1. Puede determinarse la cantidad de enlace del miembro de enlace para GM-CSFRa. La cuantificación puede estar relacionada con la cantidad del antígeno en una muestra de la prueba, que puede ser de interés para el diagnóstico o el pronóstico . Un kit que comprende un miembro de enlace o molécula del anticuerpo de acuerdo a cualquier aspecto o modalidad de la presente invención también se proporciona como un aspecto de la invención presente. En un kit de la invención, el miembro de enlace o molécula del anticuerpo puede ser etiquetada para permitir su reactividad en una muestra a ser determinada, por ejemplo como se describe con mayor detalle debajo. Los componentes de un kit generalmente están esterilizados y en frascos sellados u otros recipientes. Pueden emplearse kits en un análisis de diagnóstico u otros métodos para los cuales las moléculas del anticuerpo son útiles. Un equipo puede contener instrucciones de empleo de los componentes en un método, por ejemplo, un método de acuerdo con la presente invención. Los materiales auxiliares para ayudar en o permitir la realización de tal método pueden incluirse dentro de un kit de la invención. Las reactividades de anticuerpos en una muestra pueden ser determinadas por cualquier medio apropiado. El radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) es una posibilidad. El antigeno radiactivo etiquetado se mezcla con el antigeno no etiquetado (la muestra de la prueba) y se permite enlazar al anticuerpo. El antigeno enlazado se separa físicamente del antígeno no enlazado y se determina la cantidad de antígeno radiactivo enlazado al anticuerpo. El antígeno que más existe en la muestra de la prueba es menos radiactivo que el antígeno se enlazará al anticuerpo. Un ensayo de enlace competitivo también puede usarse con el antígeno no radiactivo, usando un antígeno o un análogo enlazado a una molécula reportero. La molécula reportero puede ser un fluorocromo, fósforo o tinte de láser con absorción espectralmente aislada o características de emisión. Los fluorocromos adecuados incluyen fluoresceína , rodamina, ficoeritrina y Rojo de Texas. Los tintes cromogénicos adecuados incluyen diaminobencidina . Otros reporteros incluyen partículas coloidales macromoleculares o material de particulado tal como cuentas de látex que están coloreadas, magnéticas o paramagnéticas , y agentes biológicamente o químicamente activos que causan directamente o indirectamente señales perceptibles para ser observadas visualmente, electrónicamente detectadas o en otro caso registradas. Estas moléculas pueden ser enzimas que catalizan las reacciones que por ejemplo, cambian el color o provocan cambios en las propiedades eléctricas. Estas pueden ser molecularmente excitables, tal que las transiciones electrónicas entre los estados de energía resultan en absorciones o emisiones espectrales características. Estas pueden incluir entidades químicas usadas junto con los biosensores. Pueden emplearse Biotina/avidina o biotina/estreptavidina y sistemas de detección de fosfatasa alcalinos. Las señales generadas mediante los conjugados anticuerpo-reportero individuales pueden usarse para derivar datos absolutos o relativos cuantificables del anticuerpo de enlace relevante en las muestras (normal y prueba) . En aspectos adicionales, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un miembro de enlace, dominio VH y/o dominio VL de acuerdo a la presente invención. El ácido nucleico puede incluir ADN y/o ARN, y puede ser totalmente o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia del nucleótido establecida en la presente abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U se sustituye por T, a menos que el contexto requiera lo contrario. En un aspecto preferido, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica a un CDR o conjunto de CDRs o dominio VH o dominio VL o sitio que enlaza al antigeno del anticuerpo o molécula del anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgGl o IgG4, de la invención como se ha definido en la presente. La presente invención también proporciona constructor en la forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden por lo menos como un polinucleótido como arriba. Un aspecto adicional es una célula hospedera transformada con o que contiene ácido nucleico de la invención. Tal célula hospedera puede estar in vitro y puede estar en el cultivo. Tal célula hospedera puede estar in vivo. La presencia de la célula hospedera in vivo puede permitir la expresión intracelular de los miembros de enlace de la presente invención como " intracuerpos" o anticuerpos intracelulares . Los intracuerpos pueden usarse para la terapia de gen. Un aspecto todavía adicional proporciona un método que comprende introducir tales ácidos nucleicos en una célula hospedera. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucarióticas , las técnicas adecuadas pueden incluir la transfección de fosfato de calcio, DEAE-Dextran, electroporación, transfección mediada por los liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo vaccinia o, para las células de insecto, baculovirus. Para la introducción de ácidos nucleicos en la célula hospedera, en particular una célula eucariótica puede usarse un sistema viral o un sistema basado en plasmados. El sistema de plasmados puede mantenerse episomalmente o puede incorporarse en la célula hospedera o en un cromosoma artificial. La incorporación o puede ser ya sea aleatoria o mediante una integración dirigida a una o más copias en sitios múltiples o simples. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transformación del cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos . La introducción puede seguirse causando o permitiendo la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, mediante el cultivo de las células hospedadoras bajo condiciones en las que se exprese al gen. En una modalidad, el ácido nucleico de la invención se integra en el genoma (por ejemplo, el cromosoma) de la célula hospedera. La integración puede promoverse por la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con las técnicas normales. La presente invención también proporciona un método que comprende usar un constructo como se ha declarado anteriormente en un sistema de expresión para expresar a un miembro de enlace o polipéptido como arriba. Asi, los métodos para preparar un miembro de enlace, un dominio VH y/o un dominio VL de la invención, son aspectos adicionales de la invención. Un método puede comprender expresar dichos ácidos nucleicos bajo las condiciones para provocar la producción de dicho miembro de enlace, dominio VH y/o dominio VL, y recuperarlo. Tal método puede comprender cultivar células hospedadoras bajo condiciones para la producción de dicho miembro de enlace o dominio del anticuerpo. Un método de producción puede comprender una etapa de aislamiento y/o purificación del producto. Un método de producción puede comprender formular el producto en una composición que incluye por lo menos un componente adicional, tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los sistemas para clonar y la expresión de un polipéptido en una variedad de células hospedadoras diferentes son bien conocidos. Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, células mamífero, células de plantas, levadura y sistemas de baculovirus y plantas transgénicas y animales. La expresión de anticuerpos y fragmentos del anticuerpo en las células procarióticas se establece bien en el arte [3] . Una hospedadora bacteriana preferida es E. coli. La expresión en las células eucarióticas en el cultivo también están disponibles por aquellos experimentados en el arte como una opción para la producción de un miembro de enlace [4, 5, 6]. Las líneas de células mamífero disponibles en el arte para la expresión de un polipéptido heterólogo incluye las células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), células HeLa, células de riñon de hámster bebé, células de melanoma de ratón NSO, células de rata YB2/0, células de riñon embrionarias humanas, células de retina embrionarias humanas y muchas otras. Los vectores adecuados pueden escogerse o construirse, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias mejoradoras, genes marcador y otras secuencias como sea apropiado. Los vectores pueden ser plás idos por ejemplo, fagémido, o viral por ejemplo xfago, como sea apropiado [7]. Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de los ácidos nucleicos, por ejemplo en la preparación de constructor de ácidos nucleicos, mutagénesis , secuenciación, la introducción de ADN en células y expresión del gen, y análisis de proteínas, se describe en detalle en Ausubel et al. [8]. La presente invención proporciona un método para obtener a uno o más miembros de enlace capaz de enlazar el antígeno, el método incluye traer en contacto a una colección de miembros de enlace de acuerdo a la invención y dicho antígeno, y seleccionar uno o más miembros de enlace de la colección capaz de enlazar al antígeno. La colección puede presentarse en partículas o complejos moleculares, por ejemplo, paquetes genéticos replicables tales como la levadura, partículas bacterianas o bacteriófagos (por ejemplo T7) o sistemas covalentes, ribosomal u otros sistemas de presentación in vitro, cada partícula o complejo molecular que contiene ácidos nucleicos que codifican al dominio variable VH del anticuerpo presentado en, y opcionalmente también un dominio VL desplegado si está presente. Siguiendo la selección de miembros de enlace capaces de enlazar al antígeno y presentados en bacteriófagos u otras partículas de la colección o complejos moleculares, el ácido nucleico puede tomarse desde un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que presenta al miembro de enlace seleccionado. Tal ácido nucleico puede usarse en la producción subsiguiente de un miembro de enlace o un anticuerpo VH o dominio VL variable mediante la expresión del ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico tomada de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que despliega a un miembro de enlace seleccionado . Un dominio variable VH de anticuerpo con la secuencia del aminoácido de un dominio variable VH de anticuerpo de un miembro del miembro de enlace seleccionado puede proporcionarse en la forma aislada, como puede ser un miembro del enlace que comprende un dominio VH . Un dominio variable VL de anticuerpo con la secuencia del aminoácido de un dominio variable VL de anticuerpo de un miembro del enlace seleccionado puede proporcionarse en la forma aislada como puede ser un miembro de enlace que comprende tal dominio VL . La capacidad para enlazar el GM-CSFR puede además probarse, también la capacidad para completarse con cualquiera de los anticuerpos 1 hasta 20 (por ejemplo, en el formato scFv y/o formato IgG, por ejemplo, IgGl o IgG4) para enlazar al GM-CSFRa. La capacidad para neutralizar el GM-CSFRa puede probarse . Las variantes de los dominios VH y VL y los CDR de la presente invención, incluyendo aquellos para los cuales las secuencias de aminoácidos se establecen en la presente pueden obtenerse por medio de los métodos de alteración o mutación de la secuencia y separado por exclusión, y pueden emplearse en los miembros de enlace para GM-CSFRa. Siguiendo la carga de química computacional en las técnicas de análisis de datos multivariables aplicados a la estructura/relaciones de actividad apropiadas [9], las relaciones apropiadas de actividad cuantitativas de los anticuerpos pueden derivarse usando técnicas matemáticas bien conocidas tales como regresión estadística, reconocimiento de patrones y clasificación [10,11,12,13,14,15]. Las propiedades de los anticuerpos pueden derivarse de los modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, análisis de los residuos de contacto probables o propiedad fisicoquímica calculada) de la secuencia del anticuerpo, estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades pueden considerarse sencillamente y en combinación . Un sitio enlazado al antígeno del anticuerpo que está compuesto de un dominio VH y un dominio VL se forma por seis rizos del polipéptido: tres del dominio variable de cadena ligera (VL) y tres del dominio variable de cadena pesada (VH) . El análisis de los anticuerpos de la estructura atómica conocida tiene relaciones aclaradas entre la secuencia y la secuencia tridimensional de los sitios combinados del anticuerpo [16,17] . Estas relaciones implican que, excepto para la tercera región (rizo) en los dominios VH, los rizos del sitio de enlace tienen una de un número pequeño de conformaciones de cadena principal : estructuras canónicas. La estructura canónica formada en un rizo particular se muestra para determinarse por su tamaño y la presencia de ciertos residuos en los sitios claves en tanto el rizo y en las regiones de la estructura [16, 17] . Este estudio de la relación de la estructura-secuencia puede usarse para la predicción de aquellos residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, que son importantes en mantener la estructura tridimensional de sus rizos CDR y por lo tanto mantener el enlace. Estas predicciones pueden soportarse por la comparación de las predicciones a la producción de los experimentos de optimización de carga. En un enfoque estructural, un modelo puede crearse de la molécula del anticuerpo [18] usando cualquier paquete comercial o disponible libremente tal como WAM [19] . Un paquete de software de análisis y visuali zación de la proteina tal como el Insight II (Accelerys, Inc.) o Deep View [20] puede entonces usarse para evaluar las substituciones posibles en cada posición en el CDR. Esta información puede luego usarse para hacer las substituciones posiblemente para tener un efecto mínimo o benéfico en la actividad. Las técnicas requeridas para hacer substituciones dentro de la secuencia del aminoácido de los CDR, dominios VH o VL del anticuerpo y miembros del enlace generalmente están disponibles en el arte. Las secuencias variantes pueden hacerse, con substituciones que pueden o no predecirse para tener un efecto mínimo o benéfico en la actividad, y probarse para la capacidad para enlazar y/o neutralizar el GM-CSFRa y/o para cualquier otra propiedad deseada. Las variantes de la secuencia del aminoácido de dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL cuyas secuencias son específicamente descritas en la presente pueden emplearse de acuerdo con la presente invención, como se discute. Las variantes particulares pueden incluir una o más alteraciones de la secuencia de aminoácido (adición, eliminación, substitución y/o inserción de un residuo del aminoácido) , pueden ser menos de alrededor de 20 alteraciones, menos de alrededor de 15 alteraciones, menos de alrededor de 10 alteraciones o menos de alrededor de 5 alteraciones, pueden ser 5, 4, 3, 2, ó 1. Las alteraciones pueden hacerse en uno o más regiones de la estructura y/o uno o más de los CDR. Preferiblemente las alteraciones no resultan en pérdida de función, de manera que el miembro de enlace comprende una secuencia de aminoácido así alterada que preferiblemente retiene una capacidad para enlazar y/o neutralizar el GM-CSFRa. Más preferiblemente, mantiene la misma capacidad de enlace cuantitativo y/o neutralizante como el miembro de enlace en el cual no se hace la alteración, por ejemplo, como se mide en un ensayo descrito en la presente. Más preferiblemente, el miembro de enlace que comprende una secuencia de aminoácido asi alterada tiene una capacidad mejorada para enlazar o neutralizar el GM-CSFRa comparado con un miembro de enlace en el cual no se hace la alteración, por ejemplo, como se mide en un ensayo descrito en la presente. La alteración puede comprender reemplazar uno o más residuos del aminoácido con un aminoácido que no se presenta naturalmente o no estándar, modificando uno o más residuos del aminoácido en una forma que no se presenta naturalmente o no estándar, o se inserta en uno o más aminoácidos que no se presentan naturalmente o no estándar en la secuencia. Los números y ubicaciones preferidas de las alteraciones en las secuencias de la invención se describen en cualquier parte en la presente. Los aminoácidos que se presentan naturalmente incluyen los 20 aminoácidos L "estándar" identificados como G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E por sus códigos de letra sencilla estándar. Los aminoácidos no estándar incluyen cualquier otro residuo que puede incorporarse en una estructura del polipéptido o resulta de la modificación de un residuo del aminoácido existente. Los aminoácidos no estándar pueden presentarse naturalmente o no presentarse naturalmente. Diversos aminoácidos no estándar que se presentan naturalmente son conocidos en el arte, tales como 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina , 3-metilhistidina , N-acetilserina , etc. [21]. Aquellos residuos del aminoácido que se derivan en su posición N-alfa deberán solamente localizarse en la terminal N de una secuencia del aminoácido. Normalmente en la presente invención un aminoácido es un aminoácido L, pero en algunas modalidades pueden ser un aminoácido D. La alteración puede por lo tanto comprender modificar un aminoácido L en, o reemplazar este con, un aminoácido D. Las formas metiladas, acetiladas y/o fosforiladas de los aminoácidos también son conocidas, y los aminoácidos en la presente invención pueden someterse a tal modificación. Las secuencias del aminoácido en los dominios del anticuerpo y miembros de enlace de la invención pueden comprender los aminoácidos no naturales o no estándar descritos arriba. En algunas modalidades los aminoácidos no estándar (por ejemplo, aminoácidos D) pueden incorporarse en una secuencia del aminoácido durante la síntesis, mientras en otras modalidades los aminoácidos no estándar pueden introducirse por modificación o reemplazo de los aminoácidos estándar "originales" después de la síntesis de la secuencia del aminoácido. El uso de los aminoácidos no estándar y/o que no se presentan naturalmente incrementan la diversidad estructural y funcional y pueden así incrementar el potencial para alcanzar el enlace GM-CSFRa deseado y las propiedades neutralizantes en un miembro de enlace de la invención. Adicionalmente , los aminoácidos D y análogos se han mostrado para tener mejores perfiles farmacocinéticos comparados con los aminoácidos L estándar, adecuados para la degradación in vivo de los polipéptidos que tienen los aminoácidos L después de la administración a un animal. Como se nota arriba, una secuencia del aminoácido CDR substancialmente como se establece en la presente se lleva a cabo preferiblemente como un CDR en un dominio variable del anticuerpo humano o una porción substancial del mismo. Las secuencias HCDR3 substancialmente como se establecen en la presente representan modalidades preferidas de la presente invención y se prefiere que cada una de estas se transporte como un HCDR3 en un dominio variable de cadena de pasada humana o una porción substancial del mismo. Los dominios variables empleados en la invención pueden obtenerse o derivarse de cualquier linea germinal o dominio variable humano reconfigurado, o puede ser un dominio variable sintético basado en las secuencias de consenso o actuales de los dominios variables humanos conocidos. Una secuencia CDR de la invención (por ejemplo, CDR3) puede introducirse en un repertorio de dominios variables que carecen de un CDR (por ejemplo, CDR3), usando la tecnología de ADN recombinante . Por ejemplo, Marks et al. (1992) [22] describe los métodos para producir repertorios de dominios variables del anticuerpo en los cuales los cebadores de consenso se dirigen a o están adyacentes a la terminal 5' del área de dominio variable usados en conjunto con los cebadores de consenso en la tercera región de la estructura de los genes VH humanos para proporcionar un repertorio de los dominios variables VH que carecen de un CDR3. Marks et al., además describe cómo este repertorio puede combinarse con un CDR3 de un anticuerpo particular. Usando las técnicas análogas, las secuencias derivadas del CDR3 de la presente invención pueden entremezclarse con los repertorios de los dominios VH o VL que carecen de un CDR3, y los dominios VH o VL completos entremezclados combinarse con un dominio VL o VH consanguíneo para proporcionar los miembros de enlace de la invención. El repertorio puede luego exhibirse en un sistema hospedero adecuado como el sistema de de exhibición de fago de WO92/01047 o cualquiera de un gran cuerpo subsecuente de la literatura, incluyendo la ref. [23], de manera que los miembros de enlace adecuados pueden seleccionarse. Un repertorio puede consistir de cualquiera desde 104 miembros individuales 5', por ejemplo, desde 106 hasta 108 ó 1010 miembros. Otros sistemas hospederos adecuados incluyen exhibición en levadura, exhibición en bacterias, exhibición en T7, exhibición en virus, exhibición en células, exhibición en ribosomas y exhibición covalente. Las técnicas de combinación o entremezclado análogas también se describen por Stemmer (1994) [24], quien describe la técnica en relación a un gen ß-lactamasa pero se observa que el enfoque puede usarse para la generación de anticuerpos.

Una alternativa adicional es generar regiones VH o VL nuevas que portan secuencias derivadas de CDR de la invención usando la mutagénesis aleatoria de uno o más genes VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones dentro del dominio variable completo. Tal técnica se describe por Gram et al. (1992) [25], quien usa el PCR propenso al error. En las modalidades preferidas una o dos substituciones del aminoácido se hacen dentro de un conjunto de HCDR y/o LCDR. Otro método que puede usarse se dirige a la mutagénesis para la regiones CDR de los genes VH o VL [26,27]. Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para obtener un sitio enlazado al antigeno del anticuerpo para el antigeno GM-CSFRa, el método comprende proporcionar a modo de adición, eliminación, substitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia del aminoácido de un dominio VH establecido en la presente un dominio VH el cual es una variante de la secuencia del aminoácido del dominio VH, opcionalmente combinar el dominio VH asi proporcionado con uno o más de los dominio VL, y probar el dominio VH o la combinación VH/VL o combinaciones para identificar un miembro de enlace o un sitio enlazado al antigeno del anticuerpo para el antigeno GM-CSFRa y opcionalmente con una o más propiedades preferidas, preferiblemente la capacidad para neutralizar la actividad de GM-CSFRa. El dominio VL puede tener una secuencia de aminoácido la cual es substancialmente como se establece en la presente . Un método análogo puede emplearse en el cual una o más variantes de la secuencia de un dominio VL descritas en la presente se combinan con uno o más dominios VH. Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para preparar un miembro del enlace para el antigeno GM-CSFRa, cuyo método comprende: (a) proporcionar un repertorio de partida de los ácidos nucleicos que codifican un dominio VH el cual ya sea incluye un CDR3 para ser reemplazado o carece de una región codificada CDR3; (b) combinar el repertorio con un ácido nucleico donante que codifica una secuencia del aminoácido substancialmente como se establece en la presente por un VH CDR3 tal que el donante de ácido nucleico se inserta en la región CDR3 en el repertorio, de manera que proporciona un repertorio del producto de los ácidos nucleicos que codifican un dominio VH; (c) expresar los ácidos nucleicos del repertorio del producto; (d) seleccionar un miembro de enlace para GM-CSFRa; y (e) recuperar el miembro de enlace o ácido nucleico que codifica este. Nuevamente, un método análogo puede emplearse en el cual un VL CDR3 de la invención se combina con un repertorio de los ácidos nucleicos que codifican un dominio VL que ya sea incluyen un CDR3 para ser reemplazado o que carece de una región codificada CDR3. Similarmente, uno o más, o los tres CDR pueden injertarse en un repertorio de dominios VH o VL que se separan por exclusión para un miembro de enlace o miembros de enlace para el GM-CSFRa. En una modalidad preferida, uno o más HCDR1, HCDR2 y HCDR3, por ejemplo, un conjunto de los HCDR de Anticuerpo 1 (SEQ ID NOS: 3-5); Anticuerpo 2 (SEQ ID NOS: 13-15); Anticuerpo 4 (SEQ ID NOS: 33-35); Anticuerpo 5 (SEQ ID NOS: 43-45); Anticuerpo 6 (SEQ ID NOS: 53-55); Anticuerpo 7 (SEQ ID NOS: 63-65); Anticuerpo 8 (SEQ ID NOS: 73-75); Anticuerpo 9 (SEQ ID NOS: 83-85); Anticuerpo 10 (SEQ ID NOS: 93-95); Anticuerpo 11 (SEQ ID NOS: 103-105); Anticuerpo 12 (SEQ ID NOS: 113-115); Anticuerpo 13 (SEQ ID NOS: 123-125); Anticuerpo 14 (SEQ ID NOS: 133-135); Anticuerpo 15 (SEQ ID NOS: 143-145); Anticuerpo 16 (SEQ ID NOS: 153-155); Anticuerpo 17 (SEQ ID NOS: 163-165); Anticuerpo 18 (SEQ ID NOS: 173-175); Anticuerpo 19 (SEQ ID NOS: 183-185) o Anticuerpo 20 (SEQ ID NOS: 193-195); u opcionalmente el Anticuerpo 3 (SEQ ID NOS: 23-25), puede emplearse, y/o uno o más LCDRl, LCDR2 y LCDR3 por ejemplo, un conjunto de los LCDR del Anticuerpo 1 (SEQ ID NOS: 8-10); Anticuerpo 2 (SEQ ID NOS: 18-20); Anticuerpo 4 (SEQ ID NOS: 38-40); Anticuerpo 5 (SEQ ID NOS: 48-50); Anticuerpo 6 (SEQ ID NOS: 58-60); Anticuerpo 7 (SEQ ID NOS: 68-70); Anticuerpo 8 (SEQ ID NOS: 78-80); Anticuerpo 9 (SEQ ID NOS: 88-90); Anticuerpo 10 (SEQ ID NOS: 98-100); Anticuerpo 11 (SEQ ID NOS: 108-110); Anticuerpo 12 (SEQ ID NOS: 118-120); Anticuerpo 13 (SEQ ID NOS: 128-130); Anticuerpo 14 (SEQ ID NOS: 138-140); Anticuerpo 15 (SEQ ID NOS: 148-150); Anticuerpo 16 (SEQ ID NOS: 158-160); Anticuerpo 17 (SEQ ID NOS: 168-170); Anticuerpo 18 (SEQ ID NOS: 178-180); Anticuerpo 19 (SEQ ID NOS: 188-190) o Anticuerpo 20 (SEQ ID NOS: 198-200); o opcionalmente el Anticuerpo 3 (SEQ ID NOS: 28-30), pueden emplearse . Una porción substancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprenderá al menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones de la estructura intervenidas. Preferiblemente, la porción también incluirá al menos alrededor de 50% de cualquiera o ambas de la primera y cuarta regiones de la estructura, el 50% siendo el 50 % de la terminal C de la primera región de la estructura y el 50% de la terminal N de la cuarta región de la estructura. Los residuos adicionales en el extremo de la terminal N o terminal C de la parte substancial del dominio variable pueden ser aquellos que nos e asocian normalmente con las regiones de dominio variable que se presenten naturalmente. Por ejemplo, la construcción de los miembros de enlace de la presente invención hecha por las técnicas de ADN recombinantes pueden resultar en la introducción de los residuos de la terminal N o C codificadas por la ligaduras introducidas para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación. Otras etapas de manipulación incluyen la introducción de ligadores para unir los dominios variables de la invención a las secuencias de la proteina adicionales que incluyen las regiones constantes del anticuerpo, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de los diacuerpos) o etiquetas detectables/funcionales como se discute en más detalle en otra parte en la presente. No obstante que en un aspecto preferido de la invención los miembros de enlace que comprenden un par de los dominios VH y VL se prefieren, los dominios de enlace sencillos basados en ya sea las secuencias de dominio VH o VL forman los aspectos adicionales de la invención. Se conoce que los dominios de inmunoglobulina sencillos, específicamente los dominios VH, son capaces de enlazar a antígenos objetivos. Por ejemplo, ver la discusión de los dAbs en otra parte en la presente . En el caso de cualquiera de los dominios de enlace sencillos, estos dominios pueden usarse para separar por exclusión los dominios complementarios capaces de formar un miembro de enlace de dos dominios capaz de enlazar al GM-CSFRa. Esto puede alcanzarse por los métodos de separación por exclusión que exhiben fagos usando el enfoque de combinación doble llamado jerárquico como se describe en la WO92/01047, en el cual una colonia individual que contiene ya sea un clon de cadena H o L usado para infectar una colección completa de clones que codifican otra cadena (L o H) y el miembro de enlace de dos cadenas resultante se selecciona de conformidad con las técnicas de exhibición de fago tales como aquellas descritas en aquella referencia y [22]. Los aspectos adicionales de la presente invención proporcionan composiciones que contienen los miembros de enlace de la invención y al menos un componente adicional, por ejemplo, una composición que comprende un miembro de enlace y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden usarse en los métodos para inhibir o neutralizar GM-CSFra, incluyendo métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal por la terapia. La invención proporciona preparaciones heterogéneas que comprenden las moléculas del anticuerpo GM-CSFRa. Por ejemplo, tales preparaciones pueden ser mezclas de los anticuerpos con las cadenas pesadas de longitud completa y las cadenas pesadas carecen de la lisina de terminal C, con diversos grados de glicosilación y/o con aminoácidos derivados, tales como ciclización de un ácido glutámico de terminal N para formar un residuo de ácido piroglutámico . Los aspectos de la invención incluyen los métodos del tratamiento que comprenden la administración de un miembro de enlace como se proporciona, las composiciones farmacéuticas que comprenden tal miembro de enlace, y uso de tal miembro de enlace en la manufactura de un medicamento, por ejemplo, en un método para hacer un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el miembro de enlace con un excipiente farmacéuticamente aceptable. El tratamiento anti-GM-CSFRa puede darse oralmente (por ejemplo, nanocuerpos) , por inyección (subcutáneamente, intravenosamente, intra-arterialmente , intra-articularmente, intraperitoneal o intramuscularmente ) , por inhalación, por la ruta intravesicular (instilación de la vejiga urinaria) o tópicamente (por ejemplo, intraocular, intranasal, rectal, en las heridas o en la piel). El tratamiento puede administrarse por infusión de pulso, particularmente con dosis reducidas del miembro de enlace. La ruta de administración puede determinarse por las características fisicoquímicas del tratamiento, por consideraciones especiales para la enfermedad o por el requerimiento para optimizar la eficacia o minimizar los efectos colaterales. Se considera que el tratamiento anti-GM-CSFRa no se restringirá para uso clínico. Por lo tanto, la inyección subcutánea usando dispositivo libre de aguja también se prefiere. Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultáneamente o secuencialmente dependiendo de la condición a ser tratada. Los tratamientos de combinación pueden usarse para proporcionar los efectos sinérgicos importantes, particularmente la combinación de un miembro de enlace anti-GM-CSFRa con uno o más de otros fármacos. Un miembro de enlace de conformidad a la presente invención puede proporcionarse en combinación o adición a uno o más de los siguientes: NASID (por ejemplo, inhibidores cox tales como Celecoxib y otros inhibidores cox2 similares), corticosteroides (por ejemplo, prednisona) y fármacos ant irreumáticos que modifican la enfermedad (DMARDs) por ejemplo, Humira (adalimumab) , metotrexato, arava, Enbrel ( Etanercept ) , Remicade ( Infliximab) , Kineret (Anakinra), Rituxan (Rituximab) , Orencia (abatacept), sales de oro, antimateriales, sulfasalazina, d-penicilina , ciclosporina A, diclofenac, ciclofosfamida y zatioprina. De conformidad con la presente invención, las composiciones proporcionadas pueden administrarse a los individuos. La administración es preferiblemente en una "cantidad terapéuticamente efectiva", que es suficiente para mostrar el beneficio a un paciente. Tal beneficio puede ser al menos el alivio de al menos un síntoma. La cantidad actual administrada, y la relación y el tiempo de curso de la administración, dependerá de la naturaleza y severidad de lo que se trate. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones en dosificación etc., está dentro de la responsabilidad de los practicantes generales y otros doctores médicos y puede depender en la severidad de los síntomas y/o progreso de una enfermedad a ser tratada. Las dosis apropiadas del anticuerpo son bien conocidas en el arte [28,29]. La dosis específicas indicadas en la presente, o en el Physician' s Desk Reference (2003) como es apropiado para el tipo del medicamento a administrarse, pueden usarse. Una cantidad terapéuticamente efectiva o dosis adecuada de un miembro de enlace de la invención puede determinarse al comparar su actividad in vítro y actividad in vivo en un modelo animal. Se conocen los métodos para la extrapolación de las dosificaciones efectivas en ratones y otros animales de prueba hasta humanos. La dosis precisa dependerá del número de factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico o para el tratamiento, el tamaño y ubicación del área a ser tratada, la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo completo, fragmento o diacuerpo), y la naturaleza de cualquier etiqueta detectable u otra molécula enlazada al anticuerpo. Una dosis del anticuerpo típica deberá estar en el intervalo desde 100 hasta 1 g para las aplicaciones sistémicas, y 1 µg hasta 1 mg para las aplicaciones tópicas. Típicamente, el anticuerpo será un anticuerpo completo, preferiblemente IgGl, IgG2 ó más preferiblemente IgG4. Hay una dosis para un tratamiento sencillo de un paciente adulto, el cual puede ajustarse proporcionalmente para los bebes y niños, y también se ajusta para otros formatos del anticuerpo en proporción al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse diariamente, dos veces a la semana, o en intervalos de semanalmente o mensualmente , a discreción del médico. En modalidades preferidas de la presente invención, el tratamiento es periódico, y el periodo entre las administraciones es alrededor de dos semanas o más, preferiblemente alrededor de de tres semanas o más, más preferiblemente alrededor de cuatro semanas o más o alrededor de un mes. En otras modalidades preferidas de la invención, el tratamiento puede darse antes y/o después de la cirugía, y más preferiblemente puede administrarse o aplicarse directamente al sitio anatómico del tratamiento quirúrgico. Los miembros de enlace de la presente invención usualmente se administrarán en la forma de una composición farmacéutica, la cual puede comprender al menos un componente además del miembro de enlace. Así las composiciones farmacéuticas de conformidad a la presente invención, y para uso de conformidad con la presente invención pueden comprender, además del ingrediente activo, un excipiente, portador, solución amortiguadora, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por aquellos de experiencia en el arte. Tales materiales deberán ser no tóxicos y no deberán interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá en la ruta de administración, la cual puede ser oral o por la inyección, por ejemplo, intravenosa. Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden estar en la forma de tabletas, cápsulas, polvo, liquido o semi-sólido. Una tableta puede comprender un portador sólido tal como la gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas liquidas generalmente comprenden un portador liquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. La solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol , propilenglicol o polietilenglicol pueden incluirse. Para la inyección intravenosa o inyección en el sitio del mal, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable la cual está libre de pirógenos y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos de capacidad relevante en el arte serán capaces de preparar la solución adecuada usando, por ejemplo, los vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección Ringer, inyección Ringer lactada. Los conservadores, estabilizadores, soluciones amortiguadoras, antioxidantes y/o otros aditivos pueden incluirse como se requiera. Los miembros de enlace de la presente invención pueden formularse en formas de líquidos, semi-sólidos o sólidos dependiendo en las propiedades fisicoquímicas de la molécula y la ruta de liberación. Las formulaciones pueden incluir los excipientes o combinaciones de los excipientes, por ejemplo: azúcares, aminoácidos y tensoactivos . Las formulaciones liquidas pueden incluir un amplio intervalo de las concentraciones del anticuerpo y el pH . Las formulaciones sólidas pueden producirse por liofilización, secado por rocío, o secado por tecnología de fluido supercrítica , por ejemplo. Las formulaciones del anti-GM-CSFRa dependerán de la ruta pretendida de liberación: por ejemplo, las formulaciones para la administración pulmonar puede consistir de las partículas con las propiedades físicas que aseguran la penetración en el pulmón profundo durante la inhalación; las formulaciones tópicas pueden incluir los agentes modificadores de viscosidad, los cuales prolongan el tiempo que el fármaco reside en el sitio de la acción. En ciertas modalidades, el miembro de enlace puede prepararse con un portador que protegerá el miembro de enlace contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo los implantes, parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulada . Los polímeros biodegradables, biocompatibles pueden usarse, tal como acetato de etilen vinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones son conocidos por aquellos de experiencia en el arte. Ver, por ejemplo, Robinson, 1978 [30]. Los miembros de enlace de conformidad a la invención pueden usarse en un método para el tratamiento o diagnóstico del cuerpo humano o animal, tal como un método de tratamiento (el cual puede incluir el tratamiento profiláctico) de una enfermedad o trastorno en un paciente humano que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un miembro de enlace de la invención. Las condiciones tratables de conformidad con la presente invención incluyen cualquiera en las cuales GM-CSFRa juega un papel. La literatura técnica publicada indica un papel del GM-CSF en diversas enfermedades y condiciones, como se resume a continuación. Ya que el GM-CSF enlaza específicamente al GM-CSFRa, los efectos patológicos y/o sintomáticos del GM-CSF pueden contarse al inhibir el enlace del GM-CSF al GM-CSFRa. Así, la evidencia publicada, además de los datos in vivo e in vitro farmacológicos presentados para las moléculas del anticuerpo descritas en la presente en la parte experimental, indican que los miembros de enlace de la invención pueden usarse para tratar las condiciones autoinmunitarias e/o inflamatorias, enfermedades y trastornos, por ejemplo, artritis reumatoide, asma, respuesta alérgica, esclerosis múltiple, leucemia mieloide y ateroesclerosis . La evidencia publicada en estas condiciones se resume a continuación: Asma y Respuestas Alérgicas El asma bronquial es un trastorno inflamatorio persistente común del pulmón caracterizado por hiper-sensibilidad en las vías respiratorias, sobreproducción de mucosidad, fibrosis y niveles elevados de IgE. La hiper-sensibilidad en las vías respiratorias (AHR, por sus siglas en inglés) es la constricción exagerada de las vías respiratorias para a un estimulo no especifico. Tanto la AHR como la sobreproducción de mucosidad se considera que son responsables de la obstrucción de las vías respiratorias variable que llevan a acortar las características de respiración de los ataques de asma (exacerbaciones) y las cuales son responsables para la mortalidad asociada con esta enfermedad (alrededor de 2000 muertes/año en el Reino Unido) . Los estudios recientes han demostrado que el GM-CSF y su receptor se sobreregulan en tanto la proteína como el nivel de mARN en el asma. Adicionalmente , los niveles de expresión se correlacionan a la severidad de la enfermedad. El incremento en la producción de GM-CSF se mide en el fluido de lavado bronquioalveolar (BAL, por sus siglas en inglés), células BAL, esputo, células epiteliales bronquiolares , y células mononucleares sanguíneas periféricas estimuladas del antígeno de los pacientes con asma cuando se compara a los sujetos no asmáticos [31, 32]. Adicionalmente, el nivel de la expresión de las vías respiratorias del GM-CSF después del enfrentamiento con el alérgeno ha mostrado correlacionarse con el grado de eosinofilia del tejido y la severidad de la respuesta asmática de la última fase [33]. Los últimos estudios ligan la expresión GM-CSFR sobreregulada al asma no atópica o intrínseca, correlacionando los niveles de expresión a los datos de la función del pulmón [34] . En un modelo de ratón de sensibilización de la ovoalbúmina y enfrentamiento, la neutralización de la actividad del GM-CSF con un anticuerpo policlonal de cabra, por la administración intranasal previa al enfrentamiento de ovoalbúmina, previene la hiper-sensibilidad de las vías respiratorias y reduce tanto la infiltración de eosinofilos como la secreción de la mucosidad en las vías respiratorias [35]. Similarmente en un modelo de ratón de la enfermedad respiratoria alérgica iniciada por la administración intranasal de las partículas de escape de diesel, la neutralización del GM-CSF nuevamente por la administración intranasal de un anticuerpo policlonal de cabra previene la hipersensibilidad en las vías respiratorias a la metacolina, reduce las cuentas de eosinofilos BAL y también disminuye la expresión de la mucosidad producida por las células caliciformes en el epitelio de las vías respiratorias [36] . El papel del GM-CSF en las respuestas alérgicas se ha investigado además en los modelos murinos de la tolerancia inducida. Los ratones expuestos a dosis diarias repetidas de ovoalbúmina nebulizada sin sensibilización previa desarrollan tolerancia a la ovoalbúmina y falla para producir inflamación eosinofilica de las vías respiratorias. La expresión del pulmón del GM-CSF por medio del constructo adenoviral altera la respuesta de estos animales y favorece el influjo de los eosinofilos en el BAL, la generación de histología fenotípicamente alérgica e hiperplasia de células caliciformes asociada. Esta generación de una respuesta Th2 típica se pone en evidencia además al incrementar las concentraciones en suero y BAL del IL-5 y IL-4 en suero. El trabajo adicional en este modelo, utilizando un ratón MHC II KO indica que el GM-CSF modula la interacción entre el antígeno que presenta las células y células T en las vías respiratorias por ello facilitando las respuestas mediadas por las células T a la ovoalbúmina [37]. Significativamente, la actividad del GM-CSF como un activador potente de la respuesta Th2 puede también demostrarse en los ratones que carecen de IL-13 e/o IL-4, indicando que la neutralización de la actividad del GM-CSF presenta una trayectoria terapéutica alternativa distinta de la actividad de estas citoquinas. Se han hecho observaciones similares en otro modelo murino en el cual la exposición intranasal repetida a la ambrosia resulta en la sensibilización del tipo Th2 y la inflamación media de las vías respiratorias en la reexposición al antígeno [38]. La administración de los anticuerpos anti-GM-CSF en conjunto con la ambrosia disminuye la producción de la citoquina asociada con Th2, presumiblemente por la inhibición del GM-CSF endógeno. En contraste, la liberación de la ambrosia a un microambiente de las vías respiratorias enriquecido con GM-CSF, ya sea por la co-administración múltiple del GM-CSf recombinante o una liberación sencilla de un vector adenoviral que porta el transgen GM-CSF, resulta en inflamación de las vías respiratorias eosinofi licas considerablemente aumentada y respuestas de memoria Th2 específicas de la ambrosia.

Artritis Reumatoide (RA) La RA (por sus siglas en inglés) es una enfermedad inflamatoria crónica y destructiva de las articulaciones que afecta aproximadamente al 1% de la población en el mundo industrializado. La RA se caracteriza por hiperplasia e inflamación de la membrana sinovial, inflamación dentro del fluido sinovial y destrucción progresiva del hueso y cartílago circundante que lleva comúnmente a una discapacidad importante . Aunque la causa de la RA se mantiene desconocida, hay evidencia acumulada para el papel de GM-CSF en el progreso de la RA. La RA se cree que se inicia y se maneja a través de un proceso específico del antígeno, mediado por célula T. En breve, la presencia de un antígeno no identificado en un hospedero susceptible se considera que inicia una respuesta a célula T que lleva a la producción de las citoquinas de células T con el reclutamiento consecuente de células inflamatorias, incluyendo neutrófilos, macrofagos y células B.

Muchas citoquinas pro y anti-inflamatorias se producen en la articulación reumatoide. Sin embargo, el progreso de la enfermedad, reactivación y silenciado se median por medio de cambios dinámicos en la producción de la citoquina dentro de la articulación. En particular, el TNF-a e IL-1 se consideran que ejercen papeles cruciales en la patogénesis de RA y muchas de las terapias más nuevas desarrolladas, o en desarrollo, para la enfermedad se observan para inhibir la actividad de estas dos citoquinas pro-inflamatorias. Estudios recientes en modelos de roedores sugieren un papel central y no redundante para GM-CSF en el desarrollo y progreso de la RA. La administración del GM-CSF recombinante exógeno aumenta la patología en dos diferentes modelos de ratón de la artritis inducida por colágeno RA (CIA, por sus siglas en inglés) [39] y un modelo de artritis monoarticular [40] . Además de esto, se ha demostrado que los ratones GM-CSF atímicos (GM-CSF"7") son resistentes al desarrollo de CIA y que los niveles de IL-1 y el factor de necrosis de tumor (TNFa) en el fluido de articulación sinovial se redujo en comparación con los ratones de tipo silvestre [41, 42]. Similarmente , la inducción de la monoartritis usando la inyección intra-articular de la albúmina de suero de bovino metilada e IL-1 en los ratones GM-CSF"7" resulta en la severidad de la enfermedad reducida en comparación con los ratones de tipo silvestre [43] . Adicionalmente , la administración de anti-GM-CSF mAb de murino alivia significativamente la severidad de la enfermedad en CIA y los modelos de artritis monoarticular . En el modelo CIA, el tratamiento mAb fue efectivo en tratar el progreso de la enfermedad establecida, histopatologia y disminución significativa de niveles IL-1 y TNF-a en la articulación. Además, el tratamiento mAb previo al inicio de la artritis disminuye la severidad de la enfermedad CIA [44, 43] . Un número de estudios han analizado los niveles de la citoquinas y receptores presentes en el fluido sinovial artrítico y muestras de biopsia de membrana del tejido humano. Las células mononucleares circulantes en 27 pacientes con RA, 13 voluntarios sanos y 14 pacientes con osteoporosis se evaluaron para niveles de GM-CSFR al usar GM-CSF etiquetado en PE [45] . En este estudio se demostró que dos veces como máximo las células positivas receptoras se detectaron en los pacientes con RA (53%), en comparación con los controles sanos (20%) y parecientes que experimentan investigación para osteoporosis (25%), sugiriendo de esta manera que los monocitos pueden primariamente responder GM-CSF producido localmente. La expresión del gen de citoquina de los pacientes con RA [46] usando hibridización in situ de células SF demuestran niveles elevados de GM-CSF, IL-1, TNF-a e IL-6.

Adicionalmente , los sinoviocitos derivados del fibroblasto aislados y cultivados de los voluntarios normales demuestran niveles de proteina elevados de GM-CSF en respuesta a IL-la, IL-?ß, TNF-a y TNF-ß [47]. La cuantificación de los niveles de suero GM-CSF en pacientes con RA [48] muestran que los niveles de la proteina se incrementaron en paciente con RA severa (366 pg/ml, n = 26) y moderada (376 pg/ml, n = 58) comparados al grupo de control (174 pg/ml, n = 43), adicionalmente también se demostró que el GM-CSF se elevó significantemente en el SF de los pacientes con AR (1300 pg/ml). Previamente se ha observado que la administración del GM-CSF recombinante en los pacientes tratados por neutropenia podría causar una exacerbación de la RA [49]. Observaciones similares se hicieron por un paciente con síndrome Felty después del tratamiento con GM-CSF recombinante [50] .

Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (COPD) La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés) se define como un estado de enfermedad caracterizada por la limitación del flujo de aire que no es reversible completamente. La limitación del flujo de aire crónico es usualmente tanto progresiva como asociada con una respuesta inflamatoria anormal de los pulmones a las partículas nocivas o gases. Esta limitación del flujo de aire se causa por una mezcla de enfermedades de las vías respiratorias pequeñas (bronquiolitis obstructiva) y destrucción parenquimal (enfisema), las contribuciones relativas de las cuales varia de persona a persona. Los síntomas característicos resultantes de la COPD son tos, producción de esputo y disnea durante el esfuerzo. La COPD es un problema de salud pública principal y es la cuarta causa principal de la morbilidad crónica y mortalidad en los Estados Unidos de América. La enfermedad se trata actualmente con fármacos desarrollados originalmente para el asma tales como corticosteroides orales o inhalados con o sin broncodilatadores incluyendo agonistas ß. Sin embargo, ninguno de estos fármacos ha mostrado reducir el progreso de COPD [51]. Por ejemplo, los corticosteroides que suprimen marcadamente la inflamación eosinofílica en asma no parecen tener ningún efecto en la inflamación observada en COPD que es predominantemente mediada por neutrófilos [52]. Por lo tanto, hay una necesidad para desarrollar tratamiento nuevos para COPD que dirigen específicamente el proceso inflamatorio subrayando la patofisiología de esta enfermedad. El GM-CSF, no obstante su papel en la función de neutrófilo y macrófago, puede jugar un papel importante en la patogénesis del COPD. En un estudio usando PCR cuantitativa se mostró que en esputo COPD alineado por edad contra GMSCF de esputo de fumador no obstruido el número de copias se elevó significativamente [53]. Además, en un modelo de roedor de fumador de cigarrillos que induce la inflamación del pulmón, los animales tratados intranasalmente con un anticuerpo para GM-CSF 2 días, 4 horas y 1 hora previo a la exposición de humo demostraron una reducción importante en los neutrófilos, macrófagos y niveles MMP-9 del BAL cuando se compara con el anticuerpo de control de isotipo 5 días después del enfrentamiento [54]. Estos estudios también se soportan por las propias observaciones que investigan los niveles GM-CSF en el esputo inducido de pacientes con un intervalo de severidades COPD. En estos estudios se muestra que el GM-CSF se elevó en el esputo de aproximadamente 40% de los pacientes COPD probados sin tener en cuenta la severidad de la enfermedad, con niveles GMCSF cercanos a 500 pg/ml en algunos casos. El GMCSF no parece ser elevado en pacientes de control alineados de fumadores y no fumadores. Estos datos sugieren que el GM-CSF puede ser uno de los mediadores claves en la inflamación de las vías respiratorias y COPD inducido por humo .

Esclerosis Múltiple (MS) El GM-CSF se ha implicado en la esclerosis múltiple de la enfermedad autoinmunitaria . Por la administración del antigeno de glicoproteina de oligodendrocito de mielina (MOG, por sus siglas en inglés) a roedores, puede inducirse un modelo de esclerosis múltiple humana que demuestra muchos de los fenotipos del MS tales como la inflamación del sistema nervioso central y desmielinación que puede resultar en una parálisis tipo MS . En los ratones agénicos GM-CSF MOG no fue capaz de inducir el fenotipo EAE [55] . Adicionalmente, se mostró que estos ratones tienen proliferación de célula T reducida para el antigeno MOG y una disminución en la producción de las citoquinas Thl IL-6 e IFN-?. La administración de los anticuerpos neutralizantes GM-CSF al mismo tiempo que el enfrentamiento al antigeno previene el inicio de la enfermedad por 10 días después del tratamiento con la evidencia de lesiones reducidas. Si se administra después del inicio de la enfermedad los ratones se recuperan completamente dentro de los 20 días del tratamiento [55].

Leucemia El GM-CSF también está implicado en la leucemia mieloide, leucemia mieloide crónica juvenil (JCML, por sus siglas en inglés). Esta condición es una trastorno mieloproliferativo que primariamente afecta pacientes con menos de 4 años de edad. Los progenitores del macrofago de granulocito de sangre periférica JCML in vitro (CFU-GM) demuestran la proliferación espontánea a densidades celulares bajas, una observación que no se describe previamente para otros trastornos mieloproliferativos . Adicionalmente, la eliminación de monolitos de estos cultivos suprime esta proliferación.

Posteriormente se ha demostrado que esta proliferación espontánea está mediada por medio de una hipersensibilidad de los progenitores JCML al GM-CSF de citoquina derivado de monocito [56, 57, 58, 59, 60, 61]. En vez de una sobreproducción o niveles elevados de GM-CSF en los pacientes JCML, la hipersensibilidad de los progenitores JCML parece que es a través de una trayectoria de transducción de señal ras inducida por GM-CSF desregulada [62]. Los recientes estudios con un análogo GM-CSF (E21R) , que antagonizan la acción del GM-CSF en ambos estudios de enlace y ensayos funcionales, ha mostrado que al inhibir la acción del GM-CSF se puede reducir significativamente la carga de la célula JCML en un modelo de xenoinjerto de ratón combinado inmunodeficiente/diabético no obeso severo (SCID/NOD) de JCML [63] . La dosificación sistémica profiláctica de E21R al momento del injerto previene que los progenitores JCML se establezcan en la medula ósea y la dosificación de E21R 4 semanas después del injerto induce la remisión del JCML, con una reducción en la carga celular. Adicionalmente, la administración de E21R a ratones SCID/NOD co-inj ertados con médula ósea humana normal y medula ósea JCML causa una reducción en la carga JCML sin embargo las células de la médula ósea normales se mantienen no afectadas.

Ateroesolerosis La enfermedad cardiaca isquémica es la causa más común de muerte en todo el mundo. En los últimos años el concepto de que la inflamación juega un papel importante en la patogénesis de la ateroesclerosis se ha incrementado, con la acumulación de la célula inflamatoria que se presenta mano a mano con la acumulación de lipidos en las paredes de las arterias. Una vez residente en las células inflamatorias de la pared arteria, tales como los monolitos y macrófagos, participa y perpetúa la respuesta inflamatoria local. Estos macrófagos también expresan receptores depuradores para un intervalo de lipoproteinas y asi contribuye a diferenciación de células en las "células espumosas". Es la muerte de estas "células espumosas" la que contribuye al desarrollo del núcleo lipido, una característica clásica de estas lesiones. Ya que la inflamación continua dentro de estas placas atereoescleróticas estas células inflamatorias activadas liberan mediadores fibrogénicos y factores de crecimiento que promueven la proliferación de células de músculo liso (SMC, por sus siglas en inglés) y fibrosis de la placa. Además de promover la fibrosis, estas células también liberan enzimas proteolíticas , tales como metaloproteinasas de matriz (MMP, por sus siglas en inglés) que contribuyen a un debilitamiento de la placa fibrótica, de esta manera haciéndolas propensas a disrupción. Estas placas una vez que rompen hebras de célula liberada y factores de coagulación, tales como factor de tejido, en el vaso estimulan la cascada de coagulación y el desarrollo de trombos. La trombosis arterial resultante puede luego llevar a isquemia o infarto del miocardio. Recientemente el GM-CSF se ha implicado en muchos aspectos del progreso de la enfermedad en lesiones ateroesclerosis . En las lesiones ateroescleróticas de conejos alimentados con colesterol GM-CSF se encontró para colocalizarse con los macrofagos y a células endoteliales en menor grado y SMC [64]. Adicionalmente , también se muestra que la expresión de GM-CSF se aumenta en los vasos ateroescleróticos humanos en los sitios de acumulación del macrófago y dentro de SMCs medios y células endoteliales [65]. Este incremento en los niveles GM-CSF es, en parte, atribuido al contacto célula-célula directo del monocitos/macrofagos y células endoteliales durante la formación y patogénesis de la lesión ateroesclerótica [66]. Otro elemento clave en la lesión aterótica es la "célula espumosa" que es macrófago que toma lipoproteinas de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés) oxidadas por medio de los receptores depuradores en la superficie. Esta reabsorción in vitro del Ox-LDL puede además estimular los macrofagos para proliferar por medio un mecanismo dependiente de GM-CSF [67]. Como la ateroesclerosis es un proceso inflamatorio crónico, se han investigado agentes anti-inflamatorios tales como glucocorticoides . La dexametasona , un glucocorticoide anti-inflamatorio, suprime el desarrollo de la ateroesclerosis en diversos modelos animales experimentales [68, 69, 70, 71]. La eficacia de lo cual se atribuye a la inhibición de la migración SMC [72] y proliferación [73], y reducción en la quimiotaxis de los monocitos y leucocitos circulantes [74]. Los recientes estudios muestran que el Ox-LDL puede inducir la liberación GM-CSF de los macrófagos perifonéales de ratón [75]. Además, después del tratamiento con la dexametasona, esta liberación de GM-CSF se inhibió de forma dependiente de la dosis, lo que sugiere que los efectos anti-inflamatorios de la dexametasona están mediados por la inhibición de producción de GM-CSF inducida por ox-LDL. Como GM-CSF parece tener un papel central en la ateroesclerosis , una alternativa a los glucocorticoides podrían inhibir la actividad GM-CSF en esta indicación .

Terminología "Y/o" cuando se usan en la presente se toman como descripción específica de cada una de las dos características específicas o componentes con o sin el otro. Por ejemplo "A y/o B" se toma como la descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, justo como si cada uno se establece individualmente en la presente.

GM-CSFRa y GM-CSF El GM-CSFRa es la cadena alfa del receptor para el factor que estimula la colonia del macrófago del granulocito. La secuencia de longitud completa del GM-CSFRa humano se deposita bajo el número de acceso S06945 (gi:106355) [76] y se establece en la presente como la SEQ ID NO: 202. La forma madura del GM-CSFRa humano, esto es, con el péptido de señal desdoblado, se establece en la presente como la SEQ ID NO: 206. A menos de que indique de otra manera por el contexto, las referencias en la presente a GM-CSFRa se refieren a GM-CSFRa de primate humano o no humano (por ejemplo, manos macacos), normalmente humano. El GM-CSFRa puede ser el GM-CSFRa que se presenta naturalmente o el GM-CSFRa recombinante .

El dominio extracelular de 298 aminoácidos del receptor GM-CSFa humano tienen la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 205. A menos de que se indique de otra manera por el contexto, las referencias en la presente a GM-CSF se refiere a GM-CSF de humano o primate no humano (por ejemplo, manos macacos), normalmente humano. El GM-CSF se enlazan normalmente al dominio extracelular (SEQ ID NO: 205) de la cadena alfa del receptor GM-CSF maduro (SEQ ID NO: 206) . Como se describe en cualquier parte en la presente, este enlace se inhibe por los miembros de enlace de la invención. Las variantes de empalme que se presentan naturalmente del GM-CSFRa se identifican - ver por ejemplo las referencias [77 y 78] . El dominio extracelular es altamente conservado en estas variantes de empalme. Los miembros de enlace de la invención pueden o no enlazarse a una o más variantes de empalme del GM-CSFRa, y pueden o no inhibir el enlace de GM-CSF a una o más variantes de empalme de GM-CSFRa.

Miembro de Enlace Este describe un miembro de un par de moléculas que se enlazan uno al otro. Los miembros de un par de enlace pueden derivarse naturalmente o producirse completamente o parcialmente de forma sintética. Un miembro del par de moléculas tiene un área en su superficie, o una cavidad, la cual se enlaza y por lo tanto es complementaria a una organización espacial particular y polar de otro miembro del par de moléculas. Los ejemplos de tipos de pares de enlace son antigeno-anticuerpo, bitoina-avidina , hormona-receptor de la hormona, receptor-ligando, enzima-substrato. La presente invención concierne a las reacciones de tipo antigeno-anticuerpo . Un miembro de enlace normalmente comprende una molécula que tiene un sitio enlazado al antigeno. Por ejemplo, un miembro de enlace puede ser una molécula de anticuerpo o una proteina de no anticuerpo que comprende un sitio enlazado al antigeno. Un sitio enlazado al antigeno puede proporcionarse por medio de configuración de CDRs en andamiajes de la proteína de no anticuerpo tales como fibronectina o citocromo B etc. [80, 81, 82], o por residuos de aminoácido aleatorios o mutantes de un rizo dentro de un andamiaje de proteína para conferir el enlace a un objetivo deseado. Los andamiajes para los sitios de enlace novedosos procesados por ingeniería en las proteínas se han revisado en detalle [82]. Los andamiajes de proteína para los imitadores de anticuerpo se describen en WO/0034784 en la cual los inventores describen proteínas (imitadores de anticuerpo) que incluyen un dominio de fibronectina tipo III que tiene al menos un rizo aleatorio. Un andamiaje adecuado en el cual se injertan uno o más CDRs, por ejemplo un conjunto de HCDRs, puede proporcionarse por cualquier miembro del dominio de la superfamilia del gen de inmunoglobulina . El andamiaje puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un andamiaje de proteína de no anticuerpo es que puede proporcionar un sitio enlazado al antígeno en una molécula de andamiaje que es más pequeña y/o fácil de fabricar que al menos algunas moléculas de anticuerpo. El tamaño pequeño de un miembro de enlace puede conferir propiedades fisiológicas útiles tales como una capacidad para entrar a las células, penetrar profundo en los tejidos o alcanzar objetivos dentro de otras estructuras, o para enlazarse dentro de las cavidades de la proteína del antígeno objetivo. El uso de los sitios enlazados al antígeno en los andamiajes de proteina de no anticuerpo se revisa en la ref. [79]. Típicas son las proteínas que tienen una estructura estable y uno o más rizos variables, en las cuales la secuencia de aminoácido del rizo o rizos es específicamente o aleatoriamente mutada para crear un sitio enlazado al antígeno que tiene el enlace del antígeno objetivo. Tales proteínas incluyen los dominios enlazados a IgG de la proteína A de S. aureus, transferina, tetranectina , fibronectina (por ejemplo 10° dominio de fibronectina tipo III) y lipocalinas. Otros enfoques incluyen "Microcuerpos" sintéticos (Selecore GmbH) , que se basan en ciclótidos - proteínas pequeñas que tienen enlaces de disulfuro intra-molecular . Además de las secuencias de anticuerpo y/o un sitio enlazado al antígeno, un miembro de enlace de acuerdo a la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, formando un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado, o para impartir a la molécula otra característica funcional además para capacitar el antígeno enlazado. Los miembros de enlace de la invención pueden portar una etiqueta detectable, o pueden conjugarse a una toxina o una porción o enzima objetivo (por ejemplo por medio de un enlace o ligadura de peptidilo) . Por ejemplo, un miembro de enlace puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo en un dominio de enzima) así como un sitio enlazado al antígeno, en donde el sitio enlazado al antígeno enlaza al antígeno y de esta manera se dirige al sitio catalítico al antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica, del antígeno, por ejemplo por desdoblamiento. Aunque, como se anote, los CDRs pueden llevarse a cabo por andamiajes tales como fibronectina o citocromo B [80, 81, 82], la estructura para portar un CDR o un conjunto de CDRs de la invención generalmente será de una secuencia de cadena pesada o ligera o porción substancial del mismo en la cual el CDR o o conjunto de CDRs se ubica en una ubicación correspondiente al CDR o conjunto de CDRs de dominios variables de anticuerpo VH y VL que se presentan naturalmente codificados por genes de inmunoglobulina reconfigurados . Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar por referencia a (Kabat, et al., 1987 [98], y actualizaciones de los mismos, ahora disponibles en la Internet (http://immuno.bme.nwu.edu o encontrado "Kabat" usando cualquier ingeniería de búsqueda) . Los miembros de enlace de la presente invención pueden comprender regiones constantes de anticuerpo o partes de los mismos, preferiblemente regiones constantes de anticuerpo humano o partes de los mismos. Por ejemplo, un dominio VL puede enlazarse a su extremo de terminal C para los dominios constantes de cadena ligera del anticuerpo incluyendo cadenas CK O C , preferiblemente cadenas CX. De manera similar, un miembro de enlace basado en un dominio VH puede enlazarse a su extremo de terminal C a todo o parte (por ejemplo un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo IgG, IgA, IgE e IgM y cualquiera de las sub-clases de isotipo, particularmente IgGl, IgG2 e IgG4. Se prefiere el IgGl, IgG2 o IgG . Se prefiere el IgG4 debido no se enlaza el complemento y no crea funciones efectoras. Cualquier variante de región sintética u otra constante que tiene estas propiedades y estabiliza las regiones variables también se prefiere para usarse en modalidades de la presente invención. Los miembros de enlace de la invención pueden etiquetarse con una etiqueta detectable o funcional. Las etiquetas detectables incluyen radioetiquetas tales como 131I o 99Tc, que pueden enlazarse a anticuerpos de la invención usando química convencional conocida en la técnica de procesamiento por imagen del anticuerpo. Las etiquetas también incluyen etiquetas de enzima tales como peroxidasa de raíz de rábano. Las etiquetas incluyen además porciones químicas tales como biotina que pueden detectarse por medio de enlace a una porción detectable congnada específica, por ejemplo avidina etiquetada. De esta manera, un miembro de enlace o molécula de anticuerpo de la presente invención puede estar en la forma de un conjugado que comprende el miembro de enlace y una etiqueta, opcionalmente unido por medio de una ligadura tal como un péptido. El miembro de enlace puede conjugarse por ejemplo a enzimas (por ejemplo peroxidasa, fosfatasa alcalina) o una etiqueta fluorescente incluyendo, pero no limitado a, biotina, fluorocromo, proteina fluorescente verde. Además, la etiqueta puede comprender una porción de toxina tal como una porción de toxina seleccionada de un grupo de exotoxina de Pseudomonas (PE o un fragmento citotóxico o mutante del mismo) , toxina de difteria (un fragmento citotóxico o mutante del mismo) , una toxina A de botulinum a tráves de F, ricina o un fragmento citotóxico del mismo, abrina o un fragmento citotóxico del mismo, saponina o un fragmento citotóxico del mismo, toxina antiviral de ambrosia o un fragmento citotóxico del mismo y briodina 1 o un fragmento citotóxico del mismo. Donde el miembro de enlace comprende una molécula de anticuerpo, el miembro de enlace etiquetado puede referirse como un inmunoconj ugado .

Molécula de anticuerpos Esto describe una inmunoglobulina si es natural o parcialmente o completamente producida sintéticamente. El término también cubre cualquier polipéptido o proteina que comprende un sitio enlazado al antigeno del anticuerpo. Los fragmentos del anticuerpo que comprenden un sitio enlazado al antigeno del anticuerpo son moléculas tales como Fab, F(ab')2, Fab' , Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos. Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que mantienen la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden involucrar introducir el ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina, o los CDRs, de un anticuerpo para las regiones constantes, o regiones constantes más regiones de estructura, de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo, EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400, y un cuerpo grande de literatura posterior. Un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo se puede someter a mutación genética u otros cambios, que pueden o no pueden alterar el enlace objetivo de los anticuerpos producidos. Como los anticuerpos se pueden modificar en un número de formas, el término "molécula de anticuerpo" deberá construirse como se cubre cualquier miembro de enlace o substancia que tiene un sitio enlazado al antígeno del anticuerpo. De esta manera, el término cubre los fragmentos del anticuerpo y derivados, incluyendo cualquier polipéptido que comprende un sitio enlazado al antígeno del anticuerpo, si es natural o completamente o prcialmente sintético. Las moléculas quiméricas comprenden un sitio enlazado al antígeno del anticuerpo, o equivalentes, fusionadas a otro polipéptido por lo tanto se incluyen. La clonación y expresión de los anticuerpos quiméricos se describen en EP-A-0120694 y EP-A-0125023, y un cuerpo grande de la literatura posterior.

Las técnicas adicionales disponibles en la técnica del anticuerpo procesado por ingeniería se hacen posibles para aislar anticuerpos humanos y humanizados. Los anticuerpos humanos y humanizados son modalidades preferidas de la invención, y pueden producirse usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, los hibridomas humanos se pueden hacer. [83] . El fago muestra, otra técnica establecida para generar miembros de enlace se han descrito en detalle en muchas publicaciones tales como ref. [83] y O92/01047 (discutida además a continuación. Los ratones transgénicos en los cuales los genes de anticuerpo de los ratones están inactivados y reemplazados funcionalmente con genes de anticuerpo humano mientras que dejan intactos otros componentes del sistema inmunitario de los ratones, se pueden usar para aislar anticuerpos humanos [84] . Los anticuerpos humanizados se pueden producir usando técnicas conocidas en el arte tales como aquellas descritas en por ejemplo WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 565,332 y WO93/17105. Además, 02004 / 006955 describe métodos para humanizar anticuerpos, con base en secuencias de estructura de región variable seleccionada de genes de anticuerpo humano al comparar los tipos de estructura CDR canónica para secuencias CDR de la región variable de un anticuerpo no humano a tipos de estructura CDR canónica para CDRs correspondiente de una colección de secuencias de anticuerpo humano, por ejemplo segmentos del gen de anticuerpo de linea germinal. Las regiones variables de anticuerpo humano tienen tipos de estructura CDR canónica similar a los CDRs no humanos que forman un subconjunto de secuencias de anticuerpo humano del miembro de las cuales se seleccionan las secuencias de estructura humana. Los miembros del subconjunto pueden clasificarse además por aminoácidos de manera similar entre las secuencias CDR humanas y no humanas. En el método de W02004 / 006955 , las secuencias humanas clasificadas superiores se seleccionan para proporcionar las secuencias de estructura para construir un anticuerpo quimérico que reemplaza funcionalmente las secuencias CDR humanas con las contra partes CDR no humanas usando las estructuras humanas del miembro del subconjunto seleccionado, por ello proporciona un anticuerpo humanizado de alta afinidad y baja inmunogenicidad sin necesidad de comparar las secuencias de estructura entre los anticuerpos humanos y no humanos. Los anticuerpos quiméricos se hacen de acuerdo al método también se describen. Las moléculas de anticuerpo sintético se pueden crear por expresión de genes generadas por medio de o 1 i gonu c 1 e ót i do s sintetizados y ensamblados dentro de los vectores de expresión adecuados [85, 86] . Se ha mostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de enlazar los antigenos. Los ejemplos de los fragmentos enlazados son (i) el fragmento Fab consiste de dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd consiste de los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv consiste de los dominios VL y VH de un anticuerpo sencillo; (iv) el fragmento dAb [87, 88, 89] que consiste de un dominio VH o VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab' )2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv) , en donde un dominio VH y un dominio VL se ligan por una ligadura de péptido que permite a los dos dominios asociarse para formar un sitio enlazado al antigeno [90, 91] ; (viii) dimeros Fv de cadena sencilla biespecifica ( PCT / U S 92 / 09965 ) y (ix) "diacuerpos" , fragmentos muí t i va 1 ent e s o multiespecificos construidos por fusión del gen (WO94/13804; [92] ) . Las moléculas Fv, scFv o de diacuerpo se pueden estabilizar por la incorporación de puente de disulfuro que ligan a los dominios VH y VL [93] . Los minicuerpos comprenden un scFv unido a un dominio CH3 también puede hacerse [94] . Un dAb (anticuerpo de dominio, por sus siglas en inglés) es un fragmento enlazado al antigeno monomérico pequeño de un anticuerpo, nombrado la región variable de una cadena ligera o pesada del anticuerpo [89] . Los VH dAbs que se presentan naturalmente en los camélidos (por ejemplo camello, llama) y pueden producirse al inmunizar un camélido con un antigeno objetivo, aislarse de células B especificas del antigeno y directamente clonar genes dAb de células B individuales. Los dAbs también son producibles en cultivo celular. Su tamaño pequeño, buena solubilidad y estabilidad de temperatura hacen particularmente de manera fisiológica útiles y adecuados para selección y maduración de afinidad. Un miembro de enlace de la presente invención puede ser un dAb que comprende un dominio VH o VL substancialmente como se establecen en la presente, o un dominio VH o VL que comprende un conjunto de CDRs substancialmente como se establecen en la presente. Por "substancialmente como se establecen en la presente" significa que el dominio CDR o VH o VL relevante de la invención será ya sea idéntico o altamente similar a las regiones especificas de las cuales la secuencia se establece en la presente. Por "altamente similar" se contempla que desde 1 hasta 5, preferiblemente desde 1 hasta 4 tal como 1 hasta 3 ó 1 ó 2, ó 3 ó 4, substituciones de aminoácidos se pueden hacer en el dominio CDR y/o VH o VL. Donde los anticuerpos biespecificos son para usarse, estos pueden ser anticuerpos biespecificos convencionales, que pueden hacerse en una variedad de formas [95], por ejemplo preparados químicamente o de hibridomas de híbrido, o pueden ser cualesquiera de los fragmentos de anticuerpo biespecífico mencionados arriba. Los ejemplos de anticuerpos biespecificos incluyen aquellos de la tecnología BiTE™ en la cual los dominios de enlace de dos anticuerpos con diferente especificidad se pueden usar y ligarse directamente por medio de péptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos en una cadena de polipéptido sencilla corta. Los diacuerpos y scFv se pueden construir sin una región Fe, usando solamente dominios variables, potencialmente reduciendo los efectos de reacción anti-idiotípica . Los diacuerpos biespecificos , al contrario de anticuerpos completos biespecificos , también pueden ser útiles particularmente debido a que pueden construirse fácilmente y expresarse en E.coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tales como fragmentos de anticuerpo) de especificidades de enlace apropiado se pueden seleccionar fácilmente usando exhibición de fago (WO94/13804) de colecciones. Si una extremidad del diacuerpo es para mantenerse constante, por ejemplo, se dirige contra GM-CSFRa, luego una colección puede hacerse donde la otra extremidad varia y un anticuerpo del enlace objetivo apropiado seleccionado. Los anticuerpos completos biespecificos se pueden hacer por botones en agujeros preparados por ingeniería [96].

Sitio enlazado al antígeno Esto describe la parte de una molécula que se enlaza a y es complementaria a todo o parte del antígeno objetivo. En una molécula de anticuerpo se refiere como el sitio enlazado al antígeno del anticuerpo, y comprende la parte del anticuerpo que enlaza a y es complementaria a todo o parte del antígeno objetivo. Donde un antígeno es grande, un anticuerpo puede solamente enlazarse a una parte particular del antígeno, cuya parte se nombra un epítopo. Un sitio enlazado al antígeno del anticuerpo puede proporcionarse por uno o más dominios variables del anticuerpo. Preferiblemente, un sitio enlazado al antígeno del anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) .

Numeración Kabat Los residuos de las secuencias de anticuerpo en la presente se refieren generalmente usando numeración Kabat como se define en Kabat et al., 1971 [97]. Ver también refs. [98, 99] .

Aislado Esto se refiere al estado en el cual los miembros de enlace de la invención, o ácido nucleico codifica tales miembros de enlace, generalmente serán de acuerdo con la presente invención. Los miembros aislados y ácido nucleico aislado será libre o substancialmente libre de material con el cual se asocian naturalmente tales como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los cuales se encuentran en su ambiente natural, o el ambiente en el cual se preparan (por ejemplo cultivo celular) cuando tal preparación es por tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los miembros y ácido nucleico pueden formularse con diluyente o adyuvantes y todavía para propósitos prácticos aislarse - por ejemplo los miembros normalmente se mezclarán con gelatina u otros portadores si se usan para recubrir placas de microtitulación para usarse en inmunoensayos , o se mezclarán con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se usan en diagnóstico o terapia. Los miembros de enlace pueden glicosilarse , ya sea naturalmente o por sistemas de células eucarióticas heterólogas (por ejemplo células CHO o NSO (ECACC 85110503)), o pueden (por ejemplo si se producen por expresión en una célula procariótica ) no glicosilarse.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1D. El análisis pA2 de dos anticuerpos anti-G -CSFRa en el ensayo de proliferación TF-1. La proliferación de las células TF-1 se indujo con concentraciones incrementadas de GM-CSF en la presencia de concentraciones incrementadas de dos IgG4 optimizado, anticuerpo 6 (Figura 1A) y anticuerpo 1 (Figura IB), respectivamente. Para los datos mostrados en la figura 1A y figura IB la incorporación de timidina tritiada se medió y el EC50 de GM-CSF en cada concentración del anticuerpo se calculó. Para los datos se muestran en la figura 1C y figura ID las relaciones de dosis luego se calcularon y analizaron por regresión Schild con objeto de obtener valores pA2. Figuras 2A-2D. Análisis pA2 de un anticuerpo anti-GM-CSFRa, Anticuerpo 6, en los ensayos de cambio de forma de granulocito. Los granulocitos humanos (figuras 2A y 2C) o de manos macacos (figuras 2B u 2D) se trataron con concentraciones incrementadas de GM-CSF en la presencia de concentraciones incrementadas de IgG4. El cambio en la forma de los granulocitos se midió usando citometria de flujo y el EC50 de GM-CSF en cada concentración del anticuerpo se calculó (figura 2A y figura 2B) . Las relaciones de dosis luego se calcularon y analizaron por regresión Schild con objeto de obtener valores pA2 (figura 2C y figura 2D) . Figura 3. Potencia antagonista de dos anticuerpos, Anticuerpos 1 y 6, respectivamente, como IgG4s en una proliferación de medición por ensayo de las células TF-1 inducida por GM-CSF humano 7pM. También se muestran datos para control positivo IgG4 2B7 y para un control de isotipo IgG4. Los datos representan el medio con barras de desviación estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento . Figura 4. La potencia antagonista de dos anticuerpos, Anticuerpos 1 y 6, respectivamente, como IgG4s en un ensayo que mide el cambio de la forma de los granulocitos humanos inducidos por GM-CSF humano 7pM. También se muestran datos para control IgG4 2B7 y para un control de isotipo IgG4. Los datos representan el medio con barras de desviación estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento. Figura 5. La potencia antagonista de dos anticuerpos, Anticuerpos 1 y 6, respectivamente, como IgG4s en un ensayo que mide la liberación TNFa de monolitos humanos estimulados con GM-CSF humano InM. También se muestran datos para anticuerpo de control 2B7 y para un control de isotipo IgG . Los datos representan el medio con barras de desviación estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento . Figura 6. La potencia antagonista de dos anticuerpos, Anticuerpos 1 y 6, respectivamente, como IgG4s en un ensayo que mide sobrevivencia de granulocito humano inducido por GM- CSF huraño 7pM. También se muestran datos para el anticuerpo de control 2B7 y para un control de isotipo IgG4. Los datos representan el medio con barras de desviación estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento. Figura 7. La afinidad de los mAbs de humano maduros del Anticuerpo 1 y anticuerpo 6, pero sin el mAb 28G5 humano precursor (Anticuerpo 3) o el anticuerpo de murino 2B7 conocido, inhibe la diferenciación manejada por GM-CSF de progenitores hemapoyéticos humanos. Las células mononucleares descongeladas 5xl04 de una muestra de aféresis se cultivaron en agar semi-sólido en la presencia de 10 ng/ml GM-CSF y la concentración indicada de mAb. Las colonias se contaron en el día 14. La figura muestra el número de colonias contra la concentración mAb en g/ml. Figura 8. El análisis de respuesta a la dosis de la eficacia de la afinidad de mAb maduro en ratones quiméricos huGM-CSFR Tg. Los grupos de 5 ratones quiméricos Tg se trataron con 500 ng de huGM-CSF (o PBS) s.c dos veces al día durante 4 días (D.1-D.4) y cualquier mAb de control (CAT001) o de prueba (Anticuerpo 6) a las concentraciones indicadas en D.O. Los pesos del bazo se evaluaron en el D.5. Figuras 9A-9B. El análisis de respuesta a la dosis de la eficacia del Anticuerpo 6 en un ensayo de liberación de citoquina endógena de célula mononuclear de sangre periférica humana. Las células lxlO6 se cultivaron durante 72hrs en la presencia y ausencia del anticuerpo y un IL-6 y TNFa ELISA realizado en los sobrenadantes. Los datos representan el medio de inhibición con barras de desviación estándar de determinaciones en duplicado dentro del mismo experimento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Parte Experimental Antecedentes Fragmentos de anticuerpos humanos se pueden seleccionar in vitro a partir de repertorios desplegados en la superficie de bacteriófago filamentoso. Este proceso se conoce como despliegue de fagos y proporciona un medio para derivar fragmentos de anticuerpos humanos. El proceso se puede usar para aislar especificidades humanas anti-humanas y se puede preparar para derivar anticuerpos de características de afinidad particulares. Fragmentos de anticuerpos que consisten solamente de los dominios variables de cadena pesada (VH) y variables de cadena ligera (VL) se unen juntos por una ligadura corta de péptidos que contiene toda la información que es necesaria para determinar el enlace a antígenos. Tales fragmentos se conocen como Fv de cadena sencilla (scFv) . Cuando se despliega en la superficie del fago, los scFv se ha demostrado que se pliegan correctamente y se enlazan al antígeno. Los repertorios grandes de scFv humanos se han construido de esta manera, y han proporcionado una fuente a partir de la cual los clones individuales se pueden aislar para el desarrollo como candidatos del fármaco. Los scFv candidato luego se pueden volver a formatear como moléculas IgG enteras (típicamente IgG humana) para aplicaciones terapéuticas.

Resumen Se llevaron a cabo las selecciones en una colección de despliegue de fagos scFv derivada de linfocitos del bazo humano con objeto de enriquecer las poblaciones de fagos que se enlazan al GM-CSFRa humano. Se aislaron anticuerpos scFv que tienen las características seleccionadas y se convirtieron estos scFv en IgG4. Al usar una variedad de ensayos, se aisló un panel de anticuerpos, se optimizó y se formó la línea germinal para producir IgG4 con la especificación apropiada para un anticuerpo terapéutico. 19 clones de anticuerpos, cuyas secuencias se muestran como anticuerpos 1, 2 y 4-20 en el listado de secuencias, se derivaron de un anticuerpo precursor. El precursor se muestra como anticuerpo 3 en el listado de secuencias, y también se refiere en la presente como 28G5. Los 19 clones se seleccionaron como que muestran propiedades particularmente buenas en un intervalo de ensayos biológicos, como se describe en la Parte Experimental, y se designaron números de anticuerpos 1, 2 y 4 a 20.

Se diseñaron los bioensayos para reflejar la naturaleza inflamatoria de las enfermedades tales como la artritis reumatoide. Por ejemplo, el cambio de forma de los neutrófilos necesario para su reclutamiento en el sitio de acción, la liberación de los factores proinflamatorios por monocitos y la supervivencia aumentada de tipos de células inflamatorias en respuesta a las señales en particular. Los anticuerpos muestran una potente actividad de neutralización en estos ensayos. Los protocolos detallados de los métodos de ensayo usados se proporcionan a continuación en la sección titulada "Materiales y Métodos de Ensayo" .

Aislamiento guiado por anticuerpos Se usó una colección de anticuerpos humanos FV (scFv) de cadena sencilla grande para las selecciones. Esto se derivó de linfocitos del bazo a partir de 20 donantes sanos y se clonó en un vector fagémido. Se aislaron los scFv que reconocieron GM-CSFRa a partir de una colección de despliegue de fagos en una serie de ciclos de selección repetidos sobre GMCSF-Ra purificado derivado de la sobreexpresión de un dominio extracelular soluble, etiquetado para purificación del receptor en las células HEK293T. Esto se logra esencialmente como se describe en Vaughan et al [102] . En resumen, después de la exposición del receptor biotinilado a la colección de fagos, se capturó la protelna con el fago enlazado sobre perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina . Se lavó por completo el fago sin enlazar. Los fagos enlazados luego se rescataron como se describe por Vaughan et al y se repitió el proceso de selección. Se llevaron a cabo tres rondas de selección a concentraciones reductoras de antigeno. Una proporción representativa de los scFvs de la salida de las rondas de selección se sometieron a formación de secuencias de ADN. Después de estas selecciones iniciales de la colección de despliegue de fagos, un panel de scFv únicos se identificaron en un ensayo de enlace al ligando, el cual se diseñó para identificar anticuerpos scFv que expresan fagos que pudieron inhibir el enlace de GM-CSF al dominio extracelular purificado GM-CSFRa. Al neutralizar la potencia de estos scFv en el ensayo de enlace a ligandos en el intervalo desde 0.65 a 3.3 nM. Los anticuerpos que estuvieron activos en el ensayo de enlace del ligando bioquímico se evaluaron por su actividad biológica en un ensayo de proliferación TF-1, el cual midió la potencia de neutralización al ensayar la capacidad de los anticuerpos para inhibir la proliferación de células TF-1 estimuladas con GM-CSF. TF-1 es una línea celular humana premieloide establecida a partir de un paciente con eritroleucemia . Esta línea celular depende del factor para la supervivencia y proliferación y se mantiene rutinariamente en el GM-CSF humano. La proliferación dependiente de la inhibición de GM-CSF se determinó al medir la reducción en la incorporación de timidina tritiada dentro del ADN recientemente sintetizado de las células de división. Todos los scFv tuvieron potencia mesurable en este ensayo, con valores IC50 en el intervalo desde alrededor de 180 hasta 1200 nM. Los clones más potentes de scFv se volvieron a formatear como moléculas de anticuerpos IgG4 humanos con un dominio constante de cadena pesada gamma 4 humano y un dominio constante de cadena ligera lambda humano. Se construyeron los vectores para los clones más potentes scFv con objeto de permitir la expresión de los anticuerpos como anticuerpo entero IgG4 como se describe por Persic et al. [100] con unas cuantas modificaciones. Un fragmento oriP se incluyó en los vectores para facilitar el uso con las células HEK-EBNA 293 y permitir la replicación episomal. El dominio variable VH se clonó dentro de la poliligadura entre la secuencia líder de secreción y el dominio constante humano gamma 4 del vector de expresión pEU8.1(+). El dominio VL variable se clonó dentro de la poliligadura entre la secuencia líder de secreción y el dominio constante humano lambda del vector de expresión pEU4.1(-). Las células HEK-EBNA 293 se co-trans fectaron con los constructos que expresan cadena ligera y pesada y se purificó el anticuerpo complete a partir de los medios acondicionados al usar cromatografía de afinidad de proteína A. Las preparaciones purificadas de anticuerpos se filtraron de forma estéril y se almacenaron a 40C en solución salina amortiguada de fosfato (PBS) previo a la evaluación. La concentración de proteínas se determinó al medir la absorbancia a 280nm al usar el método BCA (Pierce) . Las IgG re-formateadas se compararon con el anticuerpo murino conocido 2B7 en el ensayo de proliferación TF-1. Los IgG4s retuvieron o ganaron actividad en este ensayo, con valores IC50 en el intervalo desde 6 hasta alrededor de 1600 nM. En la enfermedad inflamatoria, el cambio de forma de los neutrófilos es necesario para su reclutamiento al sitio de acción. Un ensayo de cambio de forma del granulocito humano se diseño para imitar esta respuesta biológica al usar selección de células activadas por fluorescencia (FACS) para medir el cambio en forma de los granulocitos aislados a partir de sangre después de su exposición a G -CSF. Se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-G -CSFRD IgG4 para inhibir la respuesta de cambio en la forma de los neutrófilos para GM-CSF, y los valores IC50 de los clones seleccionados estuvieron en el intervalo desde alrededor de 15 a 350 nM. Un anticuerpo representativo 28G5 neutralizó el GMCSF-R de manos macacos en el ensayo de cambio de forma de granulocitos de manos macacos con un IC50 de alrededor de 5 nM. El anticuerpo murino conocido 2B7 también pudo neutralizar la respuesta biológica que resulta del enlace de GM-CSF al receptor de manos macacos. La afinidad de enlace del receptor de los anticuerpos luego se midió al usar BIAcore, con valores calculados KD en el intervalo desde 32 a 377 nM.

Optimización En un esfuerzo por mejorar la potencia de 28G5, se inició un programa de optimización. Se produjeron colecciones de anticuerpos en donde se llevó a cabo la mutagénesis aleatoria de los CDR3s de la VH o VL . Cada CDR3 se colocó de forma aleatoria en dos bloques de 6 aminoácidos con objeto de cubrir la CDR completa, al producir colecciones Hl (bloque en el N terminal de 6 aa VH CDR3), H2 (bloque en el C terminal de 6 aa en VH CDR3) , Ll (bloque en el N terminal de 6 aa en VL CDR3) y L2 (bloque en el C terminal de 6 aa en VL CDR3) . Las colecciones resultantes se sometieron a ciclos repetidos de selección para enlazar al GM-CSFRD humano. Los clones aislados de este proceso de selección se usaron luego para construir una colección de fagos combinada la cual contenia scFv con ambos, CDR3s de cadena pesada mutada y CDR3s de cadena ligera mutada. Estas colecciones también se sometieron al mismo procedimiento de selección. En cada etapa del proceso de optimización, los scFv que pudieron inhibir el enlace de 28G5 IgG4 al receptor GM-CSF se identificaron al usar un ensayo de competición de epitopos con 28G5 y el receptor, y luego se evaluaron en el ensayo de proliferación TF-1, como se describe a continuación. Después de la mutagénesis aleatoria de las secuencias de cadena pesada de CDR3 de 28G5, se identificó un panel de scFv con potencia de neutralización mesurable en el ensayo TF-1. La mayoría de las mejoras en la potencia se obtuvieron cuando el extremo 3' del VH CDR3 se puso de forma aleatoria. Después de la mutagénesis aleatoria de las secuencias de cadena ligera CDR3 de 28G5, un panel de scFv se identificó con potencia de neutralización mesurable en el ensayo TF-1. Todas las mejoras en potencia se obtuvieron cuando el extremo 3' del VL de CDR3 se puso de forma aleatoria. Después de la combinación de las colecciones de CDR3 de cadena ligera y pesada de mutagénesis aleatoria, se identificó un panel de scFvs con potencia mejorada en el ensayo de proliferación TF-1 sobre el scFv 28G5 precursor. Se aislaron los scFv con mejoras de potencia de >60000 veces sobre el 28G5 precursor. Todas las combinaciones de las colecciones resultaron en scFv mejorados, es decir, Hl/Ll, H1/L2, H2/L1, H2/L2. Esto es de interés particular debido a que ningunos scFvs mejorados se aislaron de la colección Ll. Un panel de 19 scFv identificados durante la optimización de 28G5 se volvieron a formatear y expresar como IgG4s, al usar los métodos antes descritos. El panel estuvo compuesto de clones de anticuerpos 1, 2 y 4 hasta 20. Algunos de los clones más potentes en este panel se obtuvieron de las colecciones con mutagénesis combinadas de CDR3 H y L. Los anticuerpos IgG4 en este panel se evaluaron por su actividad en el ensayo de proliferación TF-1 y se compararon con el anticuerpo murino conocido 2B . Todos los IgG4s optimizados fueron más potentes que el 2B7 en este ensayo. En esta ocasión, 2B7 tuvo un IC50 calculado de alrededor de 1.6 nM, mientras que los clones tuvieron valores calculados de IC50 en el intervalo desde alrededor de 1 pm hasta alrededor de 1100 pM. Se presentan los datos en la Tabla 1 a continuación y se resumen como siguen: IC50 <1500 pM Anticuerpos 1, 2 y 4 a 20 IC50 <300 pM Anticuerpos 1, 2, 4-12 y 14-20 IC50 <60 pM Anticuerpos 1, 2, 4-6, 8-11, 14 y 16-20 IC50 <10 pM Anticuerpos 1, 5, 6, 11 y 20. La Figura 3 ilustra la potencia antagonista de dos anticuerpos representativos de la invención, El anticuerpo 1 y el anticuerpo 6, en comparación con el anticuerpo conocido 2B7 en el ensayo de proliferación TF-1. El sistema BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor) se usó para evaluar los parámetros cinéticos de la interacción de algunos de los IgG4s optimizados guia con el dominio extracelular del receptor GM-CSF etiquetado por purificación recombinante . Se mejoró mucho la afinidad de los anticuerpos, con valores calculados de KD desde 0.127 nM hasta alrededor de 5 nM. Los datos se muestran en la Tabla 2. Se obtuvieron las mejoras en ambas, relaciones activas y relaciones inactivas. La correlación entre la afinidad de los IgG4s para el dominio extracelular soluble de GM-CSFR ? y su desempeño en el ensayo TF-1 fue muy buena con un coeficiente de Pearson de 0.85 (p<0.0001) . A manera de comparación, el KD de 2B7 se calculó por separado y se mostró que era alrededor de 7 nM. Los anticuerpos IgG4 identificados durante la optimización de 28G5 se evaluaron en el ensayo de cambio de forma de granulocitos humanos y se compararon con el anticuerpo murino conocido 2B7. Todos los anticuerpos que se evaluaron en este ensayo (anticuerpos 1, 2, 5, 6, 9-11, 16 y 20) fueron muy potentes con IC50s en el intervalo desde 7.8 a 90 pM. De estos, los anticuerpos 1, 2, 5, 6, 9, 16 y 20 tuvieron IC50s menores de 50 pM, y los anticuerpos 1, 2, 6, 16 y 20 tuvieron IC50s menores de 25 pM. Nuestros anticuerpos fueron más potentes que 2B7, el cual tuvo un IC50 de 477pM. Los datos se muestran en la Tabla 3. La Figura 4 ilustra la potencia antagonista de dos anticuerpos representativos de la invención, Anticuerpo 1 y el Anticuerpo 6, en comparación con el anticuerpo conocido 2B7 en el ensayo del cambio de forma del granulocito humano. Los anticuerpos IgG4 identificados durante la optimización de 28G5 se evaluaron en el ensayo de cambio de forma de granulocitos de manos macacos. Todos los anticuerpos pudieron neutralizar la actividad de GM-CSF en el receptor de manos macacos asi como en el receptor humano y todos los anticuerpos fueron más potentes que 2B7. 2B7 tuvo un IC50 de 26 pM mientras que los anticuerpos representativos (Anticuerpo 6, Anticuerpo 1 y Anticuerpo 2) del panel tuvieron valores IC50 de 1.73, 2.03 y 3.2 pM, respectivamente. Un panel de los IgG4s identificados durante la optimización de 28G5 se evaluaron por su potencia de neutralización en el ensayo de liberación TNFa de monocitos. Este ensayo prueba la capacidad de inhibir la liberación del factor TNFa pro-inflamatorio a partir de los monocitos humanos cuando se tratan con GM-CSF. Los anticuerpos 1, 2, 5, 6, 9 y 10 se probaron y todos estuvieron activos en este ensayo y pudieron neutralizar por completo la acción de GM-CSF en su receptor (IC50 en el intervalo desde alrededor de 43 a 139) mientras que a una concentración de 333nM, 2B7 solamente pudo lograr un 50% de la inhibición de la liberación de TNFa inducida por GM-CSF, lo que indica que este anticuerpo es solamente un inhibidor parcial en este ensayo. La Figura 5 ilustra la potencia antagonista de dos anticuerpos representativos de la invención en comparación con el anticuerpo conocido 2B7 en el ensayo de liberación de TNFa de monocitos. Los datos se muestran en la Tabla 4 y se resumen 7 como sigue: <150 pM Anticuerpos números 1, 2, 5, 6, 9 & 10 <110 pM Anticuerpos números 1, 2, 5, 6 & 9 <100 pM Anticuerpos números 1, 5, 6 & 9 Un aspecto distintivo de la enfermedad inflamatoria es la supervivencia mejorada de los tipos de células inflamatorias en respuesta a las señales en particular. Los granulocitos pueden sobrevivir por más tiempo en la presencia de GM-CSF y asi la capacidad de los anticuerpos IgG4 aislados durante la optimización de 28G5 para inhibir esta respuesta se evaluó en un ensayo de supervivencia de granulocitos. Todos los IgG4 de anti-G -CSFRa de la optimización guia estuvieron activos en este ensayo, y las potencias de neutralización representativas (IC50) estuvieron en el intervalo desde 7.0 a 843.7pM. Esto está en contraste con el anticuerpo murino conocido 2B7 el cual estuvo completamente inactivo hasta una concentración de 83nM. La Figura 6 ilustra la potencia antagonista de dos anticuerpos representativos de la invención, el Anticuerpo 1 y el Anticuerpo 6, en comparación con el anticuerpo conocido 2B7 en el ensayo de supervivencia de granulocitos. Estos datos, como se ilustran en las Figuras 3 a 6, indican que nuestros anticuerpos tienen propiedades significativamente diferentes comparados con el anticuerpo murino conocido 2B7. Por ejemplo, los anticuerpos representativos de la invención inhibieron la supervivencia de granulocitos y la proliferación de TF-1 estimulada con 7 pM GM-CSF en los ensayos de la supervivencia de granulocitos y ensayo de proliferación TF-1 respectivamente, mientras que el 2B7 no inhibió la supervivencia de granulocitos pero inhibió la proliferación de TF-1 (aunque a un menor grado que nuestros anticuerpos) . Los datos indican que los miembros de enlace de la invención tienen mayor afinidad y capacidad mejorada para inhibir una variedad de efectos biológicos mediados a través de GM-CSF-R comparado con los anticuerpos anti-GM-CSFRa conocidos. La secuencia derivada de aminoácidos de 28G5 y sus derivados se alinearon a las secuencias de la linea germinal humana conocida en la base de datos VBASE y la linea germinal más cercana identificada por la similitud de secuencias. La linea germinal más cercana para el dominio VH de 28G5 y sus derivados se identificó como VH1 DP5. La VH de 28G5 tuvo 14 cambios a partir de la linea germinal VH 1-24 (DP5) dentro de las regiones de estructura. La linea germinal más cercana para el dominio VL es Vlambdal VL 1-e (DPL8), la cual tuvo solamente 5 cambios a partir de la linea germinal dentro de las regiones de estructura. Las regiones de estructura de 28G5 y sus derivados se regresaron a la linea germinal por mutagénesis dirigida al sitio para coincidir idénticamente con los anticuerpos humanos nativos. Todos excepto un aminoácido se pudieron convertir a la linea germinal con solamente cambios modestos en la potencia de los anticuerpos. El aminoácido de isoleucina en la posición 94 de la numeración de la cadena pesada (al usar la numeración de Kabat, Kabat et al. 1971) no se pudo cambiar a la linea germinal de treonina sin una pérdida completa de actividad. Este cambio simple de la linea germinal se mantuvo por lo tanto en la región de estructura del anticuerpo. Un análisis completo de pA2 de dos de los anticuerpos anti-GM-CSFRa, el Anticuerpo 6 y el Anticuerpo 1, se llevó a cabo en el ensayo de proliferación TF-1. Los datos confirman que estos anticuerpos son anatgonistas altamente potentes en este sistema con valores calculados de pA2 de -11.3+0.2 y -11.0±0.2 respectivamente (Figuras 1A-1D) . Un análisis completo pA2 de uno de los anticuerpos anti-GM-CSFRa, el Anticuerpo 6, se llevó a cabo en los ensayos de cambio de forma de granulocitos de humano y manos macacos. Los datos confirman que este anticuerpo es un antagonista altamente potente en estos sistemas con valores calculados de pA2 de -10.58 y -10.78 en los ensayos de humano y manos macacos respectivamente (Figuras 2A-2D) . GM-CSF impulsa la diferenciación de células progenitoras hemopoyéticas dentro de las colonias de granulocitos y macrófagos en ensayos con agar semi-sólido. El Anticuerpo 6 y el Anticuerpo 1, el Anticuerpo 3 mAb precursor (28G5) y un control negativo (CAT001) se evaluaron por lo tanto por su capacidad para antagonizar esta actividad especifica de GM-CSF al usar células progenitoras derivadas de sangre periférica, en un ensayo de formación de colonias. Los datos presentados en la Figura 7 demuestran que ambos mAbs representativos madurados por afinidad fueron inhibidores potentes de la formación de colonias hemopoyéticas in vitro mediadas por el GM-CSF humano. Los valores aproximados de IC50 fueron 0.08 pg/ml (Anticuerpo 6) y 0.25 g/ml (Anticuerpo 1) para el mAb madurado por afinidad. De forma interesante, el anticuerpo murino conocido 2B7 pareció tener poca si es que alguna actividad inhibidora en este ensayo hasta una concentración de 66nM. En experimentos de control el mAb madurado por afinidad no tuvo efecto en la formación de colonias mediada por la combinación de SCF + IL-3 + G-CSF como se esperaba y, en la ausencia de citoquinas, fue despreciable la formación de colonias (<4 colonias / cultivo) . Para el análisis in vivo de la actividad antagonista de mAb especifica de huGM-CSFRa, se puede usar el transplante de médula ósea de ratones transgénicos (Tg) que expresan tanto las cadenas a y la ß de GM-CSFR humano dentro de los ratones de tipo silvestre, para generar animales quiméricos tales que la expresión del huGM-CSFR transgénico se limite a las células hemopoyéticas derivadas de médula ósea y asi se asemeje más de cerca al perfil de expresión del receptor endógeno. En estos ratones quiméricos Tg, la administración de huGM-CSF conduce a un incremento en el peso del bazo y la marginalización de monocitos sanguíneos en circulación. El Anticuerpo 6 madurado por afinidad y un control negativo mAb, CAT001 se evaluaron por su capacidad para antagonizar estas respuestas in vivo mediadas por GM-CSF. Para el análisis de respuesta de dosis, 6 grupos de 5 ratones quiméricos Tg se trataron con 500 ng de huGM-CSF s.c dos veces al día por 4 días (día 1-4) y un séptimo grupo de control de cinco animales recibió solamente PBS . Cuatro de los 6 grupos de animales tratados con huGM-CSF recibieron el mAb de prueba (Anticuerpo 6) a 16 mg/kg, 5.3 mg/kg, 1.78 mg/kg o 0.59 mg/kg a D.O mientras que un quinto grupo de los animales tratados con huGM-CSF recibieron CAT001 de control a 16 mg/kg a D.O. Los resultados presentados en la Figura 8 demuestran que, comparado con el PBS de control, el tratamiento con huGM-CSF indujo un incremento importante en el peso del bazo y una disminución en los monocitos sanguíneos en circulación. Como se esperaba, el tratamiento con 16 mg/kg de control CAT001 no tuvo efecto ya sea en el incremento en el peso del bazo o la disminución en los monocitos sanguíneos. En contraste hubo un claro efecto de respuesta a la dosis después del tratamiento con el Anticuerpo 6 mAb de prueba, ya que a 16 mg/kg este anticuerpo eliminó el incremento en el peso del bazo y, aunque todavía evidente, el efecto se redujo ampliamente a 0.59 mg/kg de mAb. El IC50 parecería estar en algún lugar entre 0.59 mg/kg y 1.78 mg/kg. Se observó un resultado similar para la disminución inducida por GM-CSF en monocitos en circulación - el tratamiento con el Anticuerpo 6 mAb de prueba a 16 mg/kg eliminó la disminución, mientras que mAb a 0.59 mg/kg solamente tuvo un impacto menor en esta respuesta. Estos datos muestran que el anticuerpo anti-GM-CSFRa es un antagonista de GM-CSFRa humano in vivo. Para investigar además las propiedades anti-inflamatorias de estos anticuerpos anti-GM-CSFRa, el anticuerpo 6 se evaluó en un ensayo de liberación de citoquina de células mononucleares de sangre periférica. En este ensayo TNFa y IL-6 se pueden liberar de manera endógena dependiendo del donante. En este ensayo el GM-CSF también se produce de manera endógena por las células, más que añadirse exógenament e , y por lo tanto los resultados observados en este ensayo representan la inhibición de los efectos biológicos del GM-CSF endógeno nativo enlazado a su receptor . Después de la administración del Anticuerpo 6 ambas de estas citoquinas se inhibieron dependient emente de la dosis como se ilustra en la figura 9. Estos datos indican que estos anticuerpos pueden inhibir la actividad del GM-CSF nativo y que al inhibir la señalización GM-CSF se puede inhibir las citoquinas pr o - i n f 1 ama t o r i a s claves, tales como IL-6 y TNFa, ambas de las cuales están implicadas en un número de indicaciones inflamatorias tales como artritis reumatoide. Adicionalmente , con base en estos resultados con el Anticuerpo 6 se puede esperar que cada uno de los anticuerpos 1 hasta 20 deberían también demostrar la inhibición en este ensayo, ya que todos los anticuerpos 1 hasta 20 se cree que enlazan a la misma región del GM-CSFRa.

Mapeo de Residuos Importantes para el Reconocimiento de Antígenos, y Análisis de Secuencias Se determinó la variabilidad de los residuos en las posiciones en la secuencia scFv del anticuerpo 6 de la línea germinal con objeto de identificar que posiciones se conservan normalmente para el enlace del ligando y cuales posiciones son variables en un anticuerpo que todavía mantiene la actividad del enlace del ligando. Las posiciones que contribuyen al enlace de antígenos parecen ser los residuos Kabat 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 y 96 en el dominio VL y los residuos Kabat 17, 34, 54, 57, 95, 97, 99 y 100B en el dominio VH . Siete posiciones que parecen ser importante para el enlace de antígenos se identificaron: H95, H97, H99, H100B, L90, L92 y L96. Luego se analizaron los residuos en estas posiciones en las secuencias de 160 variantes aisladas durante el proceso de optimización del anticuerpo 28G5, todos de los cuales muestran una mejora de 5 veces mínimo en la potencia en el ensayo de proliferación TF-1. Los datos en la Tabla 5 a continuación resumen los diferentes aminoácidos (de 20 posibles) que se observaron en cada una de estas posiciones, y en L95A. Donde las posiciones están fuertemente conservadas para los aminoácidos presentes en 28G5 y/o el Anticuerpo 6, hay una buena evidencia de que aquellos aminoácidos son claves para enlazar al antígeno. Por ejemplo, los residuos en las siguientes posiciones están fuertemente conservados: H97, H100B, L90, L92.

Método La secuencia de ADN que codifica el anticuerpo 6 scFv de línea germinal madurado por afinidad se convirtió al formato que exhibe la ribosoma, esencialmente como se describe en la referencia [101] . La PCR propensa al error se llevó a cabo en la secuencia del anticuerpo 6, usando las condiciones de mutación altas (7.2 mutaciones por 1,000 pb) en el protocolo del fabricante (BD Bioscience), con objeto de crear una colección de las secuencias 574D04 variantes que contienen las mutaciones aleatorias de punto. Esta colección se expresó en los ribosomas y se incubó con el GM-CSFRa etiquetado de purificación para permitir que el enlace se presente. Las variantes capaces de enlazar el GMCSFRa objetivo se capturaron y se removieron usando las perlas paramagnéticas recubiertas con la proteina G (Dynal). Las variantes sin enlace restantes en la población se agregan a un grupo de cuatro anticuerpos anti-idiotipicos biotinilados , los cuales previamente se derivan de la colección que exhibe el fago del anticuerpo humanos grande descrito en la referencia [102] y son conocidos para enlazar el anticuerpo 6 scFv. El enlace de las variantes por los anticuerpos anti-idiotipicos biotinilados se capturaron con perlas de estreptavidina mientras las variantes sin enlace se lavan en la misma manera. Este proceso se repitió durante dos rondas adicionales de la sección de exhibición de ribosomas, siguiendo la metodología general de la referencia [101]. Una proporción representativa de las variantes del rendimiento de selección se clonó en un vector de fagemido y las variantes scFv se expresaron en el fago para probarse por ELISA, usando el mismo método como se describe en Edwards BM et al (2003) Journal de Molecular Biology Vol 334:103. Aquellas variantes que no exhiben el enlace para el etiquetado por purificación GM-CSFRa se probaron por enlazar el grupo de cuatro anticuerpos anti-idiotípicos los cuales se usaron en la selección. Las variantes las cuales, en el ensayo de enlace anti-idiotipo, demostraron enlace que fue igual o mayor que el scFv del Anticuerpo 6 se formaron en secuencias y las secuencias se analizaron para encontrar las posiciones en las cuales había una elevada frecuencia de mutación. La relación de mutación promedio de la población de variantes se encontró que es de 3.05 aminoácidos por cadena VH o VL, usando 486 secuencias por la cadena VH y 451 secuencia por la cadena VL. Estas se analizaron para los puntos calientes, frecuencia de lote de mutación en la relación a su posición a lo largo del scFv. El enfoque del análisis en aquellos clones con al menos una mutación CDR por VH y VL y menos de 4 mutaciones por VH y VL. A partir de este panel de 123 secuencias VH y 148 secuencias VL, los puntos calientes se definieron como aquellos que tienen una frecuencia mutacional de 5% o más. Siete posiciones dentro del VHCDR3 y VLCDR3 del anticuerpo 6 fueron eventos más importantes como posiciones supuestas importantes para enlace del antígeno usando el método de selección negativa que exhibe la ribosoma. Un análisis luego se llevo a cabo en 160 variantes de secuencias aisladas durante los procesos de optimización del anticuerpo 28G5, en las cuales las secuencias VHCDR3 y VLCDR3 completas fueron aleatorias y se selecciona por la alta afinidad. Todas las secuencias (incluyendo el anticuerpo 6) son variantes del 28G5 las cuales mostraron un mínimo de mejora de 5 veces en la potencia en el ensayo de proliferación TF-1.

Determinación del Epitopo Lineal Se separaron por exclusión el Anticuerpo 6 y el anticuerpo 2B7 conocido contra los 2442 péptidos, cada uno representa regiones cortas de la secuencia del aminoácido de la porción extracelular del GM-CSFR-a, usando un método PEPSCAN. Las señales de enlace de cada anticuerpo contra todos los péptidos se promediaron para generar una señal de respaldo media y para cada péptido una relación señal/respaldo de cuatro o más se continuó como una señal especifica, positiva. Las secuencias de los péptidos que dieron una señal especifica, positiva se analizaron por las porciones de enlace conservadoras y se encontró que el anticuerpo 6 se enlaza preferentemente a una porción YLDFQ, correspondiente a los residuos 226 hasta 230 del GM-CSFRa humano maduro, y el enlace del anticuerpo 2B7 preferentemente enlazado a una porción DVRI, correspondiente a los residuos 278 hasta 281 del GM-CSFRa humano maduro. La secuencia del aminoácido se enumera por el receptor maduro como se establece en la SEQ ID NO: 206.

Método PEPSCAN (escaneo de enlace del péptido) Los péptidos sintéticos 15-mer principalmente traslapados tienen las secuencias derivadas del GMCSF que se sintetizaron y se separaron por purificación usando las tarjetas mini-PEPSCAN formado tarjeta de crédito (455-pozo-placa con 3 ul pozos) como se describe previamente [103].

El enlace de los anticuerpos para cada péptido se probó en un ensayo inmuno ligado de enzima basado en PEPSCAN (ELISA) . Las 455 cartas de polipropileno de formato tarjeta de crédito pozo que contienen los péptidos ligados covalentemente se incubaron con la muestra (por ejemplo, 10 pg/ml del anticuerpo y suero diluido 1/1000 en una solución PBS la cual tiene 5% de suero de caballo (v/v) y 5% del ovalbumina (p/v)) y 1% de Tween80 o en el caso de bloqueo suave en una solución PBS con 4% de suero de caballo (v/v) y 1% de Tween80 (4°c, durante la noche) . Después del lavado, los péptidos se incubaron con un anti-cuerpo de peroxidasa (dilución 1/100, por ejemplo, peroxidasa de conejo anti-ratón, Dako) (1 hr, 25°C) y subsecuentemente después del lavado el sulfonato de 2 , 2 ' -azino-di-3-et ilbenzotiazol del substrato de peroxidasa (ABTS) y 2 ul/ml 3% de H202 se agregaron. Después de 1 hr el desarrollo del color se midió. El desarrollo del color de ELISA se cuantificó con una cámara CCD y un sistema procesador de imagen. La estructura consiste de un cámara CCD y un lentes de 55 mm (Cámara de video Sony CCD XC-77RR, lentes Nikon micro-nikkor 55 mm f/2.8), un adaptador de la cámara (Adaptador de Cámara Sony DC-77RR) y el paquete óptimo de Software procesador de imágenes, versión 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, U.S.A.) . Trayectorias óptimas en un sistema de computadora Pentium.

Materiales y Métodos del Ensayo Ensayo del Enlace del Ligando Bioquímico Las preparaciones scFv purificadas se prepararon como se • describe en el ejemplo 3 del W001/66754 [104]. Las concentraciones de la proteína de las preparaciones scFv purificadas se determinaron usando el método BAC [105]. Las placas de microtitulación de 96 pozos Fluoronunc™ se recubrieron durante la noche a 4°C con 50 µ?/???? del IgG4 anti-humano diluido hasta 2.5 pg/ml en PBS. Las placas se lavaron 3 veces con 300 µ?/???? de PBS/0.1% Tween-20 antes del bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente con 300 µ?/???? de 3% de BSA en la PBS. Las placas se lavaron nuevamente 3 veces con 300 µ?/???? de PBS/0.1% de Tween-20 y luego 50 µ? del GM-CSFRa humano diluido hasta 62.5 ng/ml en 1% de BSA/PBS se agregó a cada pozo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después lavar 3 veces como se describe arriba, 25 µ? del material de la muestra se agregó a cada pozo seguido por 25 µ? de GM-CSF biotinilado diluido hasta 2nM en 1% de BSA/PBS. Para definir el enlace total, solamente se usó la solución amortiguadora como el material de muestra. Para definir el enlace no específico, el GM-CSF no etiquetado diluido hasta ????? en 1% de BSA se usó como el material de muestra. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente antes de lavarse 3 veces como se describe arriba. 50 µ? de est reptavidina etiquetada de propio ( Per kinElmer ) diluido hasta 100ng/ml en la solución amortiguadora del ensayo DELFIATM se agregó a cada pozo de la placa y se incubó durante 30-60 minutos a temperatura ambiente antes se lavó 7 veces con solución amortiguadora de lavado DELFIA™. 50 µ?/???? de la solución aumentada DELFIA™ Se agregó a las placas y las muestras se leyeron a 615nm en una placa lectora.

Ensayo de Proliferación TF-1 Las células TF-1, obtenidas de los sistemas R&D y rutinariamente mantenidas en RPMI 1640, 10% FBS, 1 mM de piruvato de sodio y 4ng/ml GM-CSF, se pusieron en ayuno por lavado 3 veces en el medio de ensayo (RPMI 1640, 5% FBS, 1 mM de piruvato de sodio) , se resuspendió en un medio de ensayo y se incubó durante 7-24 horas a 37°C en 5% de C02. Las células luego se resuspendieron a lxloVml en el medio de ensayo y 100 µ? se agregó a cada pozo de una placa de cultivo de tejido de fondo plano. Las muestras se prueba se prepararon por el filtrado estéril de la muestra en existencia previo a la dilución en el medio de ensayo. 50 µ? del material de prueba luego se agregó a cada pozo de las células y estas se incubaron durante 45-60 minutos a 37°C en 5% de CO2. 50 µ? de GM-CSF se diluyó al valor EC8o en el medio de ensayo (o 0.4ng/ml para los mismos lotes de GM-CSF) luego se agregó a cada pozo y las placas se incubaron durante 16 horas a 37°C en 5% de CO2 en una cámara humidificada . Esta representa una concentración final de 7 pM de GM-CSF. Con objeto de medir la proliferación de las células, 20 µ? de 3H-timidina diluida hasta 5.0 µ??/p?? en el medio de ensayo se agregó a cada pozo de la placa y las placas se incubaron durante 4 horas ± 30 minutos a 37°C en 5% de C02. Las células luego se cosecharon en placas GF/C Unifilter™ de 96 pozos usando un cosechado de placas y lavado. Después de agregar 50 µ? de MicroScint 20TM a cada pozo de la placa de filtro, las placas se sellaron y se contaron en un lector de placas TopCount.

Ensayo del Cambio de Forma del Granulocito Humano Las capas leucociticas humanas (paquete de sangre humana del servicio de transfusión sanguíneo) se mezclaron en un volumen igual de 3% de Dextrano T-500 en 0.9% de NaCl. La mezcla luego se incubó en una posición arriba a la derecha hasta que una inferíase se formó. La capa superior se cosechó y la capa en la superficie de una histoplaca 1.007 de gradiente de densidad el cual luego se centrifugó a 400 g durante 40 minutos y permite detenerse sin romperse. La capas superiores de esta gradiente se removieron dando el paletizado granulocito. Cualquier célula sanguínea roja restante en el paletizado se liso por la resuspensión de las células en 20 mi de agua enfriada en hielo durante 30 segundos seguido por la adición inmediata de enfriamiento en hielo 1.8% de cloruro de sodio. Las células luego se volvieron a peletizar a 1200 rpm y se volvieron a suspender en el medio de ensayo (RPMI1640, 10% de FBS, 100u/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 25 m de HEPES) a lxl06/ml. 100 µ? de las células luego se agregó a cada pozo de una placa de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos. Las muestras de prueba se prepararon por la filtración estéril de las muestras en existencia y se diluyeron como sea apropiado por el medio de ensayo. Para guiar el aislado, 50 µ? de la muestra de prueba luego se agregó a las células y las placas se incubaron durante 45-60 minutos a 37°C en 5% de C02. Esto representa una concentración final de 7 pM de GM-CSF. Estos se siguió por la adición de 50 µ? del GM-CSF diluido hasta 0.4ng/ml en el medio de ensayo para cada pozo y una incubación de 4 horas a 37 °C en 5% de C02 en una cámara humidificada . Para guiar la optimización, el IgG4s filtrado se diluye en el medio de ensayo se mezclan con un volumen igual de GM-CSF a 0.4ng/ml en el medio de ensayo. Este representa una concentración final de 7 pM de GM-CSF. Los 100 µ? de la mezcla de anticuerpo/GM-CSF luego se agregaron a cada pozo. Esto se siguió por una incubación de 3 horas a 37 °C en 5% de CO2 en una cámara humidificada . El formaldehido frío se agregó a una concentración final de 1.25% y las células se fijaron durante la noche a 4°C. 2000-5000 eventos para cada pozo se analizaron por citometría de flujo. El medio geométrico de la disposición delantera (FSC) para cada muestra luego se deriva usando el CellQuest.

Las células se ingresan para excluir las poblaciones irrelevantes (por ejemplo, células muertas/partículas) cuando se calcula el medio geométrico. Ensayo de Cambio de Forma de Granulocitos de manos macacos Los anticuerpos se evaluaron en un ensayo que mide el cambio de forma de los granulocitos de manos macacos siguiendo la estimulación con GM-CSF. Los granulocitos se purificaron de la sangre de manos macacos completa y el ensayo se llevo a cabo esencialmente como se describe por el ensayo de cambio de forma de granulocito humano.

Datos de afinidad de enlace usando el análisis del biosensor El sistema BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor) se usó para evaluar los parámetros cinéticos de la interacción entre scFv y IgG4s con los receptores recombinantes . El biosensor usa los efectos ópticos de la resonancia del plasmo de superficie para los cambios de estudios en la concentración de la superficie resultando de la interacción de una molécula de analito con una molécula de ligando que se enlazan covalentemente a una matriz de dextrano. Típicamente las especies de analito en la solución libre se pasa sobre el ligando acoplado y cualquier enlace se detecta como un incremento en la señal SPR local. Esto es seguido por un periodo de lavado, durante el cual la disociación de las especies de analito se observan como una disminución en la señal SPR, después de la cual cualquier analito restante depurador del ligando y el procedimiento se repite en varias concentraciones analito diferentes. Una serie de controles son usualmente empleados durante un experimento para garantizar ya sea la capacidad de enlace absoluta o perfil cinético del ligando acoplado que cambia significativamente. Una solución amortiguadora salina HEPES de propiedad (HBS-EP) se usa típicamente como el diluyente principal de muestras de analitos y disociación de fase solvente. Los datos experimentales se registran en unidades de resonancia (directamente correspondiente a la señal SPR) con respecto al tiempo. Las unidades de resonancia son directamente proporcional a el tamaño y cantidad de de analito enlazado. El software de BIAevaluación empaquetado luego puede usarse para asignar la relación constante a la fase de disociación (unidades de relación de disociación s-1) y fase de asociación (unidades de relación de asociación M-l s-1). Estas Figuras luego permiten el cálculo de Asociación y Disociación de Constante de Afinidad. La afinidad de IgG4 se estimó usando un ensayo sencillo en que el IgG4 fue capturado no covalentemente por proteina de amina A de superficie. Una serie de diluciones de dominio extracelular del receptor GM-CSF etiquetado de purificación recombinante , desde 100 hasta 6.25nM luego secuencialmente pasaron sobre el IgG4. La molaridad del receptor se calculó usando la concentración (Bradford) y la masa del polipéptido maduro modificado no post-traduccionalmente predicho (39.7 kDa) . Cada uno de los dos conjuntos separados de datos se analizaron en formatos idénticos. Los datos correctos de célula de referencia se sometió al ajuste usando el conjunto de modelo langmuir 1:1 para calculación global simultanea de las relaciones de asociación y disociación, con el conjunto de valor Rmax para global. El nivel de IgG4 capturado durante cada ciclo se valoró para permitir que la cantidad capturada restante estable durante el experimento completo. Adicionalmente , la relación de disociación del IgG4 se valoró para determinar si una corrección para flujo de linea de bases se requirió. Sin embargo, ambas interacciones de la proteina A se proveen para ser suficientemente reproducibles y estables. La validez de los datos se forzó por el chi2 y valor T calculado (valor de parámetro/compensación) , que tiene para ser <2 y >100 respectivamente. La producción de dominio extracelular GM-CSFRa etiquetado de purificación: Un vector de expresión pEFBOS [106] incorporando una secuencia codificada del dominio extracelular a del receptor GM-CSF humano (SEQ ID NO: 205, representando aminoácidos 1 hasta 298 del GM-CSF R maduro) con una secuencia de señal IL-3 de murina e incorporando una etiqueta de purificación de4 la terminal N, se usó para producir polipéptido de dominio extracelular del receptor GM-CSF etiquetado de la terminal N recombinante (ECD) . El polipéptido ECD etiquetado se expresó en células CHO usando el vector pEFBOS usando procedimientos estándares. Este polipéptido también puede referirse como dominio extracelular GM-CSFR purificado, o como el dominio extracelular soluble de GM-CSFRa. Cualquier etiqueta de purificación adecuada puede usarse por ejemplo, péptido Flag (DYKDDDE - SEQ ID NO: 204), Fe, biotina o his tag. La purificación puede conducirse usando cualquier técnica apropiada, por ejemplo un Flag-polipéptido ECD etiquetado (SEQ ID NO: 203) puede purificarse en una columna de cromatografía de afinidad M2 y eluirse con péptido FLAG.

Ensayo de liberación de TNFa de monocitos La purificación de Monocitos (Kit de aislado de Monocito - Miltenyi Biotec - 130-053-301) : Las capas leucocíticas humanas (paquete de sangre humana del servicio de transfusión de sangre) se colocaron en capas de un histopaque de gradiente de densidad 1.077 (Sigma, Cat No. 1077-1) y las células se centrifugaron a 400 xg durante 40 minutos. No se aplica un freno cuanto se detuvo el centrifugado. Las células PBMC luego se cosecharon de la inferíase. Las células se lavaron en PBS y se peletizaron a 300 xg durante 10 minutos antes las células de glóbulos rojos restante se lizo por volver a suspender en 20 mi de agua enfriada en hielo durante 15 segundos seguido por la adición inmediata del enfriamiento en hielo 1.8% de NaCl. Las células luego se peletizaron a 12000 rpm durante 5 minutos y se volvieron a suspender en 600 µ? de la solución amortiguadora MACS (PBS, 2mM EDTA) . 200µ1 del reactivo de bloqueo Fe se proporciona con el kit se agregó a las células y se mezcló antes de agregar 200 µ? del cóctel del anticuerpo Hapten (también proporcionado con el kit) y se mezcló. Las células luego se incubaron a 4°C durante 15 minutos antes de lavarse dos veces en 50 mi de solución amortiguadora MACS. El paletizado celular se volvió a suspender en 600 µ? de solución amortiguadora MACS antes de agregar 200 1 del reactivo de bloqueo Fe y se mezcló seguido por 200 µ? de las microperlas anti-hapten MACS y se mezcló. Las células se incubaron durante 45 minutos a 4°C antes de lavarse en 50 mi de solución amortiguadora MACS y se volvieron a suspender en 500 µ? de solución amortiguadora MACS. Una columna sencilla (Miltenyi Biotec 130-042-401) se preparó por lavado con 3 mi de solución amortiguadora MACS antes la suspensión celular se aplicó a la columna. El efluente se colectó como la fracción de monocito enriquecida. La columna se lavó con 2x3 mi de solución amortiguadora MACS y el efluente se colectó. La pureza del monocito se revisó por teñido con anti-CD14-PE usando los métodos de citometria de flujo estándar. Las células se volvieron a suspender finalmente a 4xl06/ml en el medio de ensayo (RPMI 1640, 10% FCS, 100U/ml penicilina, 100 pg/ml estreptomicina) .

Estimulación de Monocitos : 50 µ? de las células se agregaron a cada pozo de una placa de cultivo de tejido plano-redondo de 96 pozos Costar. 25 µ? de 150 g/ml rhlFNy (R&D systyems) se agregó a todos los pozos. Los IgG4s filtrados diluidos en el medio de ensayo se mezclaron con un volumen igual de GM-CSF a 56ng/ml (4nM) en el medio de ensayo. Este representa una concentración final de 1 nM GM-CSF. 75 µ? de la mezcla de anticuerpo/GM-CSF luego se agregó a cada pozo. Los controles se colocaron en pozos con GM-CSF solamente o sin GM-CSF y sin el anticuerpo. Las placas luego se incubaron durante 18 horas a 37 °C con 5% de C02 en una cámara humidificada . El sobrenadante luego se cosecho para probar durante los niveles TNF-a por ELISA.

TNFa ELISA (R&D Systems ELISA Development System DY210) : Las placas ELISA inmunosorbente fluoronunc se recubrieron durante la noche a temperatura ambiente con 100 µ? del anticuerpo de captura a 4 µq/ l en PBS . Las placas luego se lavaron tres veces con PBS/0.1% de Tween y se bloquearon con 300 µ?/???? de 3% de Marvel en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con PBS/0.1% de Tween. 100 µ? del sobrenadante de las placas de ensayo se transfirió a la placa ELISA y una titulación del TNF-a diluido en el medio de ensayo se agregó a los pozos de control. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas antes de lavarse 4-5 veces con PBS/0.1% de Tween. 100 µ? de la detección del anticuerpo diluido a 300 ng/ml en 1% de arvel/PBS se agregó a cada pozo de la placa y las placas se incubaron durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente antes de lavarse 4-5 veces con PBS/0.1% de Tween. La estrepatividina-europio (PerkinElmer 1244-360) se diluyó 1:1000 en solución amortiguadora de ensayo DELFIA (PerkinElmer 4002-0010) y se agregó a 100 µ?/???? antes de incubarse durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las placas luego se lavaron 7 veces en DELFIA se lavó la solución amortiguadora antes de la adición de 100 µ?/???? del aumento de solución (PerkinElmer 4001-0010) y se leyó a 615 nm en un lector de placas.

Ensayo de supervivencia de granulocitos Las células se purificaron de capas leucociticas humanas como se describe por el ensayo de activación de neutrófilo (ensayo de cambio de forma) lavado en medio de ensayo (RPMI-1640 Glutamax, FBS al 10%, 100 U/ml Penicilina, 100 µ?/p?? estreptomicina) y resuspendió a 1 x 106/ml en medios de ensayo. 100 µ? de células se agregaron a cada pozo de una placa de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos Costar. Reservas filtradas de anticuerpo se diluyeron en medio de ensayo y mezclaron con un volumen igual de GM-CSF a 0.4 ng/ml. Esto representa una concentración final de 7 pM GM-CSF. Pozos control contienen solo medios o solo GM-CSF. 100 µ? de la mezcla de muestra de prueba/GM-CSF se agregó luego a cada pozo en la placa y las células se incubaron durante 68 horas a 37°C/C02 5% en una cámara humidificadora . 20 µ? de AlamarBlue se agregó a cada pozo y las placas se incubaron durante 24 horas adicionales a 37°C/C02 5% en una cámara humidificadora . Las placas luego se leyeron a 560nm y 590nm en un lector de placas .

Análisis pA2 de anticuerpos anti-GM-CSFRa en el ensayo de proliferación y en los ensayos de cambio en forma de granulocito humano y de manos macacos La herramienta farmacológica principal para cuantificar la afinidad de un antagonista competitivo es análisis Schild. Usando este enfoque medios independientes de sistema para estimar la afinidad de antagonista en un ensayo funcional se puede determinar. El método se basa en el concepto de que la concentración de antagonista y su afinidad determina el antagonismo de la respuesta agonista. Ya que el antagonismo se puede cuantificar y la concentración del antagonista se conoce, la afinidad del antagonista se puede determinar. Este antagonismo se cuantifica al medir la relación de concentraciones equitativas de agonistas, medidas en la presencia y ausencia del antagonista, referidas como relaciones de dosis (DR) . Las relaciones de dosis se pueden calcular al tomar la relación del EC50 de agonista (típicamente GM-CSF) en la ausencia del miembro de enlace al EC50 del agonista en la presencia de una concentración sencilla de miembro de enlace. Las relaciones de dosis, expresadas como log(DR-l) se pueden luego usar en una regresión lineal en log [miembro de enlace] para producir una regresión Schild. Así, para cada concentración de miembro de enlace habrá un valor DR correspondiente; estos se delinean como la regresión de log(DR-l) sobre log [miembro de enlace] . Si el antagonismo es competitivo, habrá una relación lineal entre log (DR-1) y log [miembro de enlace] de acuerdo con la ecuación Schild en donde la ecuación es como sigue Log (DR - 1) = [A] - log K¾ Bajo estas circunstancias, un valor de cero para el ordenado dará un intercepción de los ejes x donde log [a] = log KA. Por lo tanto la concentración de miembro de enlace que produce un log (DR-1) = 0 será igual al log KA, la constante de disociación de equilibrio del complejo miembro - receptor de enlace. Este es un sistema independiente de cuantificación de la afinidad del miembro de enlace que debe ser exacta para cada sistema celular que contiene el receptor. Ya que los valores KA se obtienen de un lote logarítmico, que se distribuyen normalmente como log. El logaritmo negativo de esta concentración particular se refiere empíricamente como pA2 , la concentración de antagonista que produce un cambio dos veces de la curva de respuesta de dosis de agonista. La potencia antagonista se puede cuantificar al calcular pA2 de una concentración sencilla de antagonista que produce un valor sencillo para la relación de dosis de la ecuación, en donde pA2 = log (DR-1) -log [a] [a] = concentración molar de antagonista que hace necesario al doble la concentración de agonista para obtener la respuesta submáxima original. DR = la relación de dosis se cuantifica al medir la relación de concentraciones equiactivas de agonistas medidos en la presencia y ausencia del antagonista. pA2 se puede calcular de datos de ensayo de respuesta de dosis.

Inhibición de diferenciación mediada por G -CSF in vitro de progenitores de células sanguíneas en ensayo de formación de colonia Las células mononucleares sanguíneas periféricas enriquecidas por células hematopoyéticas progenitoras se obtuvieron a partir de donantes que habían sufrido movilización de célula progenitora y aféresis como parte de su manejo clínico estándar. Las muestras se de-identificaron y células no se crioconservaron antes de su uso. 5xl04 células mononucleares se cultivaron en agar semi-sólido [107] en la presencia de GM-CSF humano en una concentración final de 10 ng/ml. Afinidad de prueba mAbs humana madura, y el anticuerpo 2B7 de murino conocido, se agregaron a cultivos de agar en una concentración final de 10, 5, 1, 0.5, 0.1 ó 0.05 g/ml. El mAb 28G5 humano precursor y un mAb humano de control negativo combinado con isotipo, CAT001, se evaluaron a una concentración sencilla de 10 g/ml. Para propósitos de control mAbs se evaluaron también por su capacidad para bloquear formación de colonia estimulada por una combinación de SCF, IL-3 y G-CSF (Croker et al., 2004) y por su impacto en formación de colonia en la ausencia de citoquinas. La formación de colonia (agregados de > 40 células) se evaluó después de 14 días de incubación a 37 °C con 10% C(¾ en aire. Las colonias se fijaron con gluteraldehído y contaron usando un microscopio de disección en un aumento de 35X.

Inhibición de actividad biológica GM-CSF in vivo en ratones transgénicos GM-CSFRa Los ratones transgénicos (Tg) que expresan ambos las cadenas a y ß del GM-CSFR humano bajo el control de un promotor de clase I MHC se han generado y bazo in vivo y respuestas de célula sanguínea para administración de huGM-CSF se han descrito [108] . Para análisis in vivo de actividad antagonista mAb especifica huGM-CSFRa, transplante de médula ósea de los ratones Tg en ratones tipo silvestre se puede usar para generar animales quiméricos tal que expresión huGM-CSFRaP transgénica se limita a médula ósea derivada de células hematopoyéticas y asi se asemeja más el perfil de expresión del receptor endógeno. En estos ratones quiméricos Tg huGM-CSFRc$ la administración de huGM-CSF lleva a un aumento en el peso del bazo y la marginación de monocitos sanguíneos en circulación.

Generación de ratones quiméricos Tg: El fémur y la tibia de ratones Tg donantes se removieron y la médula ósea mojado con suero de ternera fetal al 3% (FCS) más PBS estéril. Los tapones de médula ósea luego se elaboraron a través de un aguja 23G para obtener una suspensión celular sencilla, luego células se lavaron una vez con PBS frío + FCS al 3% y se pasaron a través de una malla de acero inoxidable. Las células rojas se removieron luego por lisis en solución amortiguadora de cloruro de amonio 0.168 , después de lo cual las células se lavaron dos veces más con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) + 3% FCS antes de nuevamente pasar a través de una malla de acero inoxidable. Para eliminar además células muertas y debris celular la suspensión se centrifugó a través de un amortiguador FCS. Las células viables se recuperan en el precipitado, se lavaron una vez con PBS y re-suspendieron en PBS a 2.5 x 107/ml. ratones C57/BL6 beneficiarios de 5 hasta 8 semanas de edad se irradiaron mortalmente con 2 dosis de 550 Rad, 3 horas aparte. Los ratones beneficiarios se inyectaron por vía intravenosa (i.v) con suspensión celular 0.2 mi (esto es, 5 x 106 células/ratón) y posteriormente alojados en cajas encapuchadas con neomicina 0.02 M en su agua potable durante 3 semanas. La reconstitución se evaluó después de 6 semanas por análisis FACS de sangre periférica usando mAbs especifico para las cadenas huGMCSFRa y P- Tratamiento GM-CSF y análisis posterior de ratones quiméricos Tg: Los ratones quiméricos Tg se trataron dos veces al día por medio de vía subcutánea (s.c) con 500 ng de huGM-CSF durante 4 días. Para análisis de grupos de actividad antagonista de anticuerpo de 5 ratones se administraron dosis seleccionadas de' mAb (ver abajo) por medio de via intraperitoneal (i.p) 1 día antes del inicio de tratamiento GM-CSF. En día 5, 0.2 mi de sangre se mostró para análisis de poblaciones de leucocito de circulación, en particular monocitos sanguíneos, usando un Sistema Hematológico ADVIA™ (Bayer Diagnostics ) . Los animales se sacrificaron luego y los bazos se eliminaron para medición de peso.

Inhibición de TNFa humano endógenamente expresado y IL-6 de células mononucleares sanguíneas periféricas humanas Las capas leucocíticas humanas (paquete de sangre humana del servicio de Transfusión Sanguínea) se recubrieron en capas en la parte superior de un histoplaca gradiente de densidad 1.077 (Sigma, Cat No. 1077-1) y células se centrifugaron a 400 xg durante 40 minutos. Sin freno se aplicó cuando se detuvo el centrifugo. Las células PBMC se cosecharon luego de la interfaz. Las células se lavaron en PBS y peletizaron a 300 xg durante 10 mins antes de que las células sanguíneas rojas restantes se lizaron por resuspensión en 20 mi de agua enfriada en hielo durante 15 s seguido por la adición inmediata de NaCl 1.6% enfriado en hielo. Las células se peletizaron luego a 1200 rpm durante 5 mins y re-suspendieron en 10 mi de 10% FBS/RPMI y penicilina estreptomicina al 1%. Las células se diluyeron luego a 5 x 106/ml. 110 µ? de células se dispensaron por pozo (5.5 x 105/pozo) y las células permitieron para colocar durante 1 hr a 37°C, CO2 5%. Los siguientes reactivos se agregaron como controles de concentración final sencillos; PHA (5 g/ml), LPS (25 ug/ml), GM-CSF (10ng/ml) y control isotipo (50 ug/ml). El Anticuerpo 6 se agregó a una concentración de partida final de 50 g/ml con una serie de dilución de cinco veces. Las placas se incubaron luego durante 72 hrs a 37°C, C02 5%. Los sobrenadantes se cosecharon después de 72 hrs y los niveles de TNFa y IL-6 se calcularon usando los siguientes kits R&D ELISA (hTNF-a R&D Duoset sistema de desarrollo ELISA DY210 y hIL-6 R&D Duoset sistema de desarrollo ELISA DY206) . Los ELISA se desarrollaron de acuerdo a recomendaciones de proveedores.

Tabla 1: Inhibición de proliferación inducida por GM-CSF de células TF-1 por anticuerpos no germinados IgG4 aislados de optimización de 28G5. La proliferación de células TF-1 se indujo con una concentración sencilla de GM-CSF en presencia de concentraciones incrementadas de anticuerpos IgG4. La incorporación de timidina tritiada se midió y los valores IC50 para los anticuerpos se calcularon. Los datos son representativos de n=3. Se muestra el SEM (error estándar del medio) is shown. IgG4 IC50 ± SEM (pM) 2B7 1575 490.5 anticuerpo 1 5.3±0.33 anticuerpo 2 15.0+4.71 anticuerpo 4 48.0±8.33 anticuerpo 5 9.3±5.39 anticuerpo 6 0.97±0.033 anticuerpo 7 93.8±24.6 anticuerpo 8 34.5±2.63 anticuerpo 9 40.8±7.15 anticuerpo 10 55.3±3.73 anticuerpo 11 9.0±1.0 anticuerpo 12 246.3±19.8 anticuerpo 13 1106.0±174.9 anticuerpo 14 16.3+4.9 anticuerpo 15 163.8±7.3 anticuerpo 16 12.8±3.3 anticuerpo 17 14.3+2.8 anticuerpo 18 13.3±3.4 anticuerpo 19 23.814.3 anticuerpo 20 9.8±2.8 Tabla 2: Análisis cinético de anticuerpos anti-GM-CSFRa no germinados IgG4 aislados durante la optimización de 28G5. Los anticuerpos IgG4 se inmovilizaron a la superficie de una microplaqueta cubierta de proteina A y una serie de diluciones GM-CSF Ra ECD etiquetadas por purificación se pasaron sobre el IgG4. Los datos se sometieron a ajuste usando el Langmuir 1:1 simultáneo ka kd permitiendo el transporte de masa.

Los datos para los anticuerpos 9 y 11 fueron bifásicos.

Tabla 3: Inhibición de GM-CSF induce un cambio de forma de granulocitos humanos por anticuerpos IgG4 no germinados aislados durante la optimización de 28G5. Los granulocitos humanos se trataron con una concentración sencilla de GM-CSF en presencia de concentraciones incrementadas de anticuerpo IgG . El cambio en la forma de los granulocitos se midió usando citometria de flujo y los valores IC50 para los anticuerpos se calcularon.

IgG4 IC50 ± SD (pM) 2B7 477±491 anticuerpo 1 12. 6±8.0 anticuerpo 2 20 7±11.0 anticuerpo 5 30 0 anticuerpo 6 13 3±11.8 anticuerpo 9 44 0 anticuerpo 10 62 0 anticuerpo 11 90 0 anticuerpo 16 16 0 anticuerpo 20 7. i 3 Tabla 4: Inhibición de liberación inducida por GM-CSF de TNF de los monocitos. Los monocitos humanos se trataron con una concentración sencilla de GM-CSF en presencia de concentraciones incrementadas de anticuerpo no germinado IgG4. La libreación de TNFa se midió por ELISA y los valores IC50 para los anticuerpos se calcularon.

IgG4 IC50 ± SD (pM) anticuerpo 1 78.8±54.6 anticuerpo 2 103.3163.1 anticuerpo 5 67.0 anticuerpo 6 43.0±19.7 anticuerpo 9 74.0 anticuerpo 10 139.0 IZl Claves para el Listado de Secuencias En el listado de secuencias adjunto, las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos ("PTR" se enlistan para 20 clones de anticuerpo, que comprenden el clon precursor y los 19 clones del panel optimizado. Los anticuerpos se enumeran Abl hasta Ab20. El clon precursor es el anticuerpo 3, representados por las SEQ ID. NOS. 21-30 y SEQ ID. NOS. 211-212. La siguiente lista identifica por número las SEQ ID. NOS. en las cuales las secuencias de las moléculas indicadas se muestran: (nt = secuencia de nucleotide; aa = secuencia de aminoácidos Anticuerpo 01 VH nt 26 Anticuerpo 03 VL nt Anticuerpo 01 VH aa 27 Anticuerpo 03 VL aa Anticuerpo 01 VH CDR1 aa 28 Anticuerpo 03 VL CDR1 aa Anticuerpo 01 VH CDR2 aa 29 Anticuerpo 03 VL CDR2 aa Anticuerpo 01 VH CDR3 aa 30 Anticuerpo 03 VL CDR3 aa Anticuerpo 01 VL nt 31 Anticuerpo 04 VH nt Anticuerpo 01 VL aa 32 Anticuerpo 04 VH aa Anticuerpo 01 VL CDR1 aa 33 Anticuerpo 04 VH CDR1 aa Anticuerpo 01 VL CDR2 aa 34 Anticuerpo 04 VH CDR2 aa Anticuerpo 01 VL CDR3 aa 35 Anticuerpo 04 VH CDR3 aa Anticuerpo 02 VH nt 36 Anticuerpo 04 VL nt Anticuerpo 02 VH aa 37 Anticuerpo 04 VL aa Anticuerpo 02 VH CDR1 aa 38 Anticuerpo 04 VL CDR1 aa Anticuerpo 02 VH CDR2 aa 39 Anticuerpo 04 VL CDR2 aa Anticuerpo 02 VH CDR3 aa 40 Anticuerpo 04 VL CDR3 aa Anticuerpo 02 VL nt 41 Anticuerpo 05 VH nt Anticuerpo 02 VL aa 42 Anticuerpo 05 VH aa Anticuerpo 02 VL CDR1 aa 43 Anticuerpo 05 VH CDR1 aa Anticuerpo 02 VL CDR2 aa 44 Anticuerpo 05 VH CDR2 aa Anticuerpo 02 VL CDR3 aa 45 Anticuerpo 05 VH CDR3 aa Anticuerpo 03 VH nt 46 Anticuerpo 05 VL nt Anticuerpo 03 VH aa 47 Anticuerpo 05 VL aa Anticuerpo 03 VH CDR1 aa 48 Anticuerpo 05 VL CDR1 aa Anticuerpo 03 VH CDR2 aa 49 Anticuerpo 05 VL CDR2 aa Anticuerpo 03 VH CDR3 aa 50 Anticuerpo 05 VL CDR3 aa Anticuerpo 06 VH nt 76 Anticuerpo 08 VL nt Anticuerpo 06 VH aa 77 Anticuerpo 08 VL aa Anticuerpo 06 VH CDR1 aa 78 Anticuerpo 08 VL CDR1 aa Anticuerpo 06 VH CDR2 aa 79 Anticuerpo 08 VL CDR2 aa Anticuerpo 06 VH CDR3 aa 80 Anticuerpo 08 VL CDR3 aa Anticuerpo 06 VL nt 81 Anticuerpo 09 VH nt Anticuerpo 06 VL aa 82 Anticuerpo 09 VH aa Anticuerpo 06 VL CDR1 aa 83 Anticuerpo 09 VH CDR1 aa Anticuerpo 06 VL CDR2 aa 84 Anticuerpo 09 VH CDR2 aa Anticuerpo 06 VL CDR3 aa 85 Anticuerpo 09 VH CDR3 aa Anticuerpo 07 VH nt 86 Anticuerpo 09 VL nt Anticuerpo 07 VH aa 87 Anticuerpo 09 VL aa Anticuerpo 07 VH CDR1 aa 88 Anticuerpo 09 VL CDR1 aa Anticuerpo 07 VH CDR2 aa 89 Anticuerpo 09 VL CDR2 aa Anticuerpo 07 VH CDR3 aa 90 Anticuerpo 09 VL CDR3 aa Anticuerpo 07 VL nt 91 Anticuerpo 10 VH nt Anticuerpo 07 VL aa 92 Anticuerpo 10 VH aa Anticuerpo 07 VL CDR1 aa 93 Anticuerpo 10 VH CDR1 aa Anticuerpo 07 VL CDR2 aa 94 Anticuerpo 10 VH CDR2 aa Anticuerpo 07 VL CDR3 aa 95 Anticuerpo 10 VH CDR3 aa Anticuerpo 08 VH nt 96 Anticuerpo 10 VL nt Anticuerpo 08 VH aa 97 Anticuerpo 10 VL aa Anticuerpo 08 VH CDR1 aa 98 Anticuerpo 10 VL CDR1 aa Anticuerpo 08 VH CDR2 aa 99 Anticuerpo 10 VL CDR2 aa Anticuerpo 08 VH CDR3 aa 100 Anticuerpo 10 VL CDR3 aa 101 Anticuerpo 11 VH nt 126 Anticuerpo 13 VL nt 102 Anticuerpo 11 VH aa 127 Anticuerpo 13 VL aa 103 Anticuerpo 11 VH CDR1 aa 128 Anticuerpo 13 VL CDR1 aa 104 Anticuerpo 11 VH CDR2 aa 129 Anticuerpo 13 VL CDR2 aa 105 Anticuerpo 11 VH CDR3 aa 130 Anticuerpo 13 VL CDR3 aa 106 Anticuerpo 11 VL nt 131 Anticuerpo 14 VH nt 107 Anticuerpo 11 VL aa 132 Anticuerpo 14 VH aa 108 Anticuerpo 11 VL CDR1 aa 133 Anticuerpo 14 VH CDR1 aa 109 Anticuerpo 11 VL CDR2 aa 134 Anticuerpo 14 VH CDR2 aa 110 Anticuerpo 11 VL CDR3 aa 135 Anticuerpo 14 VH CDR3 aa 111 Anticuerpo 12 VH nt 136 Anticuerpo 14 VL nt 112 Anticuerpo 12 VH aa 137 Anticuerpo 14 VL aa 113 Anticuerpo 12 VH CDR1 aa 138 Anticuerpo 14 VL CDR1 aa 114 Anticuerpo 12 VH CDR2 aa 139 Anticuerpo 14 VL CDR2 aa 115 Anticuerpo 12 VH CDR3 aa 140 Anticuerpo 14 VL CDR3 aa 116 Anticuerpo 12 VL nt 141 Anticuerpo 15 VH nt 117 Anticuerpo 12 VL aa 142 Anticuerpo 15 VH aa 118 Anticuerpo 12 VL CDR1 aa 143 Anticuerpo 15 VH CDR1 aa 119 Anticuerpo 12 VL CDR2 aa 144 Anticuerpo 15 VH CDR2 aa 120 Anticuerpo 12 VL CDR3 aa 145 Anticuerpo 15 VH CDR3 aa 121 Anticuerpo 13 VH nt 146 Anticuerpo 15 VL nt 122 Anticuerpo 13 VH aa 147 Anticuerpo 15 VL aa 123 Anticuerpo 13 VH CDR1 aa 148 Anticuerpo 15 VL CDR1 aa 124 Anticuerpo 13 VH CDR2 aa 149 Anticuerpo 15 VL CDR2 aa 125 Anticuerpo 13 VH CDR3 aa 150 Anticuerpo 15 VL CDR3 aa 151 Anticuerpo 16 VH nt 176 Anticuerpo 18 VL nt 152 Anticuerpo 16 VH aa 177 Anticuerpo 18 VL aa 153 Anticuerpo 16 VH CDR1 aa 178 Anticuerpo 18 VL CDR1 aa 154 Anticuerpo 16 VH CDR2 aa 179 Anticuerpo 18 VL CDR2 aa 155 Anticuerpo 16 VH CDR3 aa 180 Anticuerpo 18 VL CDR3 aa 156 Anticuerpo 16 VL nt 181 Anticuerpo 19 VH nt 157 Anticuerpo 16 VL aa 182 Anticuerpo 19 VH aa 158 Anticuerpo 16 VL CDR1 aa 183 Anticuerpo 19 VH CDR1 aa 159 Anticuerpo 16 VL CDR2 aa 184 Anticuerpo 19 VH CDR2 aa 160 Anticuerpo 16 VL CDR3 aa 185 Anticuerpo 19 VH CDR3 aa 161 Anticuerpo 17 VH nt 186 Anticuerpo 19 VL nt 162 Anticuerpo 17 VH aa 187 Anticuerpo 19 VL aa 163 Anticuerpo 17 VH CDR1 aa 188 Anticuerpo 19 VL CDR1 aa 164 Anticuerpo 17 VH CDR2 aa 189 Anticuerpo 19 VL CDR2 aa 165 Anticuerpo 17 VH CDR3 aa 190 Anticuerpo 19 VL CDR3 aa 166 Anticuerpo 17 VL nt 191 Anticuerpo 20 VH nt 167 Anticuerpo 17 VL aa 192 Anticuerpo 20 VH aa 168 Anticuerpo 17 VL CDR1 aa 193 Anticuerpo 20 VH CDR1 aa 169 Anticuerpo 17 VL CDR2 aa 194 Anticuerpo 20 VH CDR2 aa 170 Anticuerpo 17 VL CDR3 aa 195 Anticuerpo 20 VH CDR3 aa 171 Anticuerpo 18 VH nt 196 Anticuerpo 20 VL nt 172 Anticuerpo 18 VH aa 197 Anticuerpo 20 VL aa 173 Anticuerpo 18 VH CDR1 aa 198 Anticuerpo 20 VL CDR1 aa 174 Anticuerpo 18 VH CDR2 aa 199 Anticuerpo 20 VL CDR2 aa 175 Anticuerpo 18 VH CDR3 aa 200 Anticuerpo 20 VL CDR3 aa 201 secuencia de residuo lineal 222 Anticuerpo 8 VL aa GM-CSFRa 223 Anticuerpo 9 VL nt 202 secuencia de aminoácido de 224 Anticuerpo 9 VL aa longitud completa de GM-CSFRa humano 225 Anticuerpo 10 VL nt 203 dominio extracellular GM-CSFRa 226 Anticuerpo 10 VL aa humano etiquetado a FLAG 227 Anticuerpo 11 VL nt 204 péptido FLAG 228 Anticuerpo 11 VL aa 205 secuencia de aminoácido de 229 Anticuerpo 12 VL nt dominio extracellular GM-CSFRa humano 230 Anticuerpo 12 VL aa 206 GM-CSFRa maduro 231 Anticuerpo 13 VL nt 207 Anticuerpo 1 VL nt 232 Anticuerpo 13 VL aa 208 Anticuerpo 1 VL aa 233 Anticuerpo 14 VL nt 209 Anticuerpo 2 VL nt 234 Anticuerpo 14 VL aa 210 Anticuerpo 2 VL aa 235 Anticuerpo 15 VL nt 211 Anticuerpo 3 VL nt 236 Anticuerpo 15 VL aa 212 Anticuerpo 3 VL aa 237 Anticuerpo 16 VL nt 213 Anticuerpo 4 VL nt 238 Anticuerpo 16 VL aa 214 Anticuerpo 4 VL aa 239 Anticuerpo 17 VL nt 215 Anticuerpo 5 VL nt 240 Anticuerpo 17 VL aa 216 Anticuerpo 5 VL aa 241 Anticuerpo 18 VL nt 217 Anticuerpo 6 VL nt 242 Anticuerpo 18 VL aa 218 Anticuerpo 6 VL aa 243 Anticuerpo 19 VL nt 219 Anticuerpo 7 VL nt 244 Anticuerpo 19 VL aa 220 Anticuerpo 7 VL aa 245 Anticuerpo 20 VL nt 221 Anticuerpo 8 VL nt 246 Anticuerpo 20 VL aa 247 Anticuerpo 6 VH nt 248 Anticuerpo 6 VH aa 249 Anticuerpo 6 VL nt 250 Anticuerpo 6 VL aa 251 VH FR1 aa 252 VH FR2 aa 253 VH FR3 aa 254 VH FR4 aa 255 VL FR1 aa 256 VL FR2 aa 257 VL FR3 aa 258 VL FR4 aa Las secuencias de nucleótido del dominio VL de los anticuerpo 1 hasta 20 no incluyen el codón gcg mostrado en el extremo 3' en SEQ ID NOS: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186 y 196. Correspondientemente, las secuencias de aminoácidos no incluyen el residuo Ala de terminal C (residuo 113) en SEQ ID NOS: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187 and 197, respectivamente. El residuo Alall3 y el correspondiente codón gcg no se expresaron en los Anticuerpo 1 hasta 20. Una comparación de secuencias escritas con segmentos de genes de linea germinal, especialmente JL2 , indica que el residuo Ala y el codón gcg correspondiente no forman parte del dominio VL. El residuo Gly en la posición 112 se presentó en las secuencia scFv e IgG expresadas. Sin embargo, este residuo no se presenta en las secuencias de segmento j de línea germinal humano que forman la región 4 de estructura del dominio VL, por ejemplo JL2. El residuo Gly no se considera una parte del dominio VL. Para expresar la cadena ligera del IgG, se proporcionó una secuencia de nucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo, que comprende un primer exon que codifca el dominio VL, un exon que codifica el dominio CL, y un intrón que separa el primer exón y el segundo exón. Bajo circunstancias normales, el intrón se divide por maquinaria de procesamiento de mAR celular, uniendo el extremo 3' del primer exón al extremo 5' del segundo exón. De esta manera, cuando el ADN tiene la secuencia de nucleótido se expresó como AR , el primero y segundo exones se dividen en conjunto. La traducción del ARN dividido produce un polipéptido que comprende el VL y el dominio CL. Después de dividir, el Gly en la posición 112 se codifica por la última base (g) de la secuencia de estructura 4 de dominio VL y las primeras dos bases (gt) del dominio CL. La secuencia de dominio VL de anticuerpos 1 hasta 20 son SEQ ID NOS: 186 hasta 246 como se indica arriba. El extremo de secuencias de nucleótido de dominio VL con cta como el codón final, y Leu es el residuo de aminoácido final en las correspondientes secuencias de aminoácidos de dominio VL. Las secuencias de dominio VH y VL no formadas en línea germinal del Anticuerpo 6 se muestran en las SEQ ID NOS: 247 -250, además de las secuencias de dominio VH y VL en línea germinal mostradas en las SEQ ID NOS: 51, 52, 56, 57, 216 y 217.

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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un miembro de enlace aislado para GM-CSFRa humano, caracterizado porque inhibe el enlace de GM-CSF a GM-CSFRa y en donde el miembro de enlace enlaza al menos un residuo de Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln en las posiciones 226 a 230 de GM-CSFRa humano como se muestra en SEQ ID NO: 206, y en donde el miembro de enlace se enlaza a un dominio extracelular humano
GM-CSFR con una afinidad (KD) de 5 nM o menos en un ensayo de resonancia de superficie de plasmón. 2. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una molécula de anticuerpo. 3. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende un conjunto de regiones complementariamente determinantes CDRl, CDR2 y CDR3 y una estructura, en donde el conjunto de regiones complementariamente determinantes comprende un CDRl con una secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 173, un CDR2 con una secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 4, y un CDR3 con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 25; SEQ ID
NO: 35; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 185; y SEQ ID NO: 195; o comprende tal conjunto de secuencias CDR con una o dos substituciones de aminoácidos.
4. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 2 ó la reivindicación 3, caracterizado porque comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende regiones complementariamente determinantes CDRl , CDR2 y CDR3 y una estructura, y en donde el residuo Kabat H97 en VH CDR3 es S.
5. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque VH CDR3 comprende además uno o más de los siguientes residuos: V, N, A o L en el residuo Kabat H95; S, F , H , P , T o W en el residuo Kabat H99; A, , P, S, V o H en el residuo Kabat H100B.
6. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el residuo Kabat H95 es V.
7. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, caracterizado porque el residuo Kabat H99 es S.
8. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 5 hasta 7, caracterizado porque el residuo Kabat H100B es A o T.
9. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque VH CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 185 y SEQ ID NO: 195.
10. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 4 hasta 9, caracterizado porque el residuo Kabat H34 en VH CDRl es I.
11. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 4 hasta 10, caracterizado porque VH CDRl tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
12. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 4 hasta 11, caracterizado porque VH CDR2 comprende E en el residuo Kabat H54 e/o I en el residuo Kabat H57.
13. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 4 hasta 12, caracterizado porque VH CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4.
14. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 4 hasta 13, caracterizado porque el residuo abat H17 en la estructura de dominio VH es S .
15. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 4 hasta 14, caracterizado porque comprende un dominio VL de anticuerpo que comprende regiones complementariamente determinantes CDRl , CDR2 y CDR3 y una estructura .
16. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque VL CDR3 comprende uno o más de los siguientes residuos: S, T o M en el residuo Kabat L90; D, E, Q, S, M o T en el residuo Kabat L92; S, P, I o V en el residuo Kabat L96.
17. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el residuo Kabat L90 es S.
18. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, caracterizado porque el residuo Kabat L92 es D o E.
19. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16 hasta 18, caracterizado porque el residuo Kabat L95A es S.
20. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16 hasta 19, caracterizado porque el residuo Kabat L96 es S.
21. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 15 o 16, caracterizado porque VL CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 200.
22. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 15 hasta 21, caracterizado porque VL CDRl comprende uno o más de los siguientes residuos: S en el residuo Kabat 27A; N en el residuo Kabat 27B; I en el residuo Kabat 27C; D en el residuo Kabat 32.
23. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 15 hasta 22, caracterizado porque VL CDRl tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8.
24. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 15 hasta 23, caracterizado porque VL CDR2 comprende uno o más de los siguientes residuos: N en el residuo Kabat 51; N en el residuo Kabat 52; K en el residuo Kabat 53.
25. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 15 hasta 24, caracterizado porque VL CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9.
26. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2 hasta 25, caracterizado porque comprende un dominio VH de anticuerpo en el cual el residuo Kabat H94 es I.
27. Un miembro de enlace aislado para GM-CSFRa humano, caracterizado porque inhibe el enlace de GM-CSF a GM-CSFRa, y en donde el miembro de enlace enlaza un dominio extracelular humano GM-CSFRa con una afinidad (KD) de 5 nM o menos en un ensayo de resonancia de superficie de plasmón, y en donde el miembro de enlace (i) tiene una potencia neutralizante IC50 de 60 pM o menos en un ensayo de proliferación de célula TF-1 con 7 pM de GM-CSF humano; (ü) tiene una potencia neutralizante IC50 de 50 pM o menos en un ensayo de cambio de forma de granulocito humano con 7 pM de GM-CSF humano; ylo (iii) tiene una potencia neutralizante IC50 de 100 pM o menos en un ensayo de liberación de TNFa de monocito con 1 nM de GM-CSF humano.
28. Un miembro de enlace aislado para GM-CSFRa humano, caracterizado porque un conjunto de regiones determinantes de complementar!edad HCDRl , HCDR2 y HCDR3 , LCDRl , LCDR2 y LCDR3 , en donde : HCDRl es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 173; HCDR2 es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; HCDR3 es una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 185; y SEQ ID NO: 195; LCDRl es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8; LCDR2 es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9; y LCDR3 es una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 200.
29. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque: HCDRl es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3; HCDR2 es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; HCDR3 es la secuencia de aminoácidos ID NO: 55; LCDRl es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8; LCDR2 es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9; y LCDR3 es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 60.
30. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 27, reivindicación 28 o reivindicación 29, caracterizado porque comprende una molécula de anticuerpo.
31. Un miembro de enlace aislado para GM-CSFRa humano, caracterizado porque enlaza el dominio extracelular de GM-CSFRa humano con una afinidad de (KD) de 5 nM o menos en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie, inhibe el enlace de GM-CSF a GM-CSFRa, y comprende una molécula de anticuerpo humana o humanizada que compite para enlazar el dominio extracelular de GM-CSFRa humano con una molécula de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID. NO: 52 de dominio VH y una secuencia de aminoácidos SEQ ID. NO: 57 del dominio VL .
32. Un miembro de enlace aislado para GM-CSFRa humano, caracterizado porque inhibe el enlace de GM-CSF a GM-CSFRa y en donde el miembro de enlace comprende una molécula de anticuerpo comprende un dominio VH de anticuerpo comprende un conjunto de regiones complementariamente determinantes HCDRl , HCDR2 y HCDR3 y una estructura, y un dominio VL de anticuerpo que comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad LCDRl, LCDR2 y LCDR3 y una estructura, en donde el conjunto de regiones complementariamente determinantes comprende un HCDRl con una secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 173, un HCDR2 con una secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 4, un HCDR3 con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 185; y SEQ ID NO: 195, un LCDRl con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8; un LCDR2 con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9; y un LCDR3 con la secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 200.
33. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2 hasta 26 o cualesquiera de las reivindicaciones 30 hasta 32, caracterizado porque la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo humana o humanizada.
34. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la estructura de dominio VH es una línea germinal humana VHl DP5 o estructura VH3 DP47.
35. El miembro de enlace de conformidad con la reivindicación 33 o la reivindicación 34, caracterizado porque comprende un dominio VL en donde la estructura de dominio VL es una línea germinal humana VLambda 1 DPL8, VLambda 1 DPL3 o una estructura VLambda 6_6.
36. Una molécula de anticuerpo aislada para GM-CSFR humano, caracterizada porque inhibe el enlace de GM-CSF a GM-CSFRa, en donde el miembro de enlace une el dominio extracelular de GM-CSRFa humano con una afinidad (KD) de 5 nM o menos en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie, y en donde el miembro de enlace comprende un dominio VH con la secuencia de aminoácidos del dominio VH mostrada en SEQ ID NO: 52 o una variante de la misma con una o dos alteraciones de aminoácidos, y un dominio VL con la secuencia de aminoácidos del dominio VL en SEQ ID NO: 57 o una variante de la misma con una o dos alteraciones de aminoácidos; en donde las alteraciones de aminoácidos son seleccionadas del grupo que consiste de substituciones, inserciones y eliminaciones.
37. El miembro de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2 hasta 26 ó 30 hasta 35, o una molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la molécula de anticuerpo es IgG4.
38. El miembro de enlace o una molécula de anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 37, caracterizado porque enlaza el dominio extracelular humano GM-CSFRa con una afinidad (KD) de 1 nM o menos en un ensayo de resonancia de superficie de plasmón.
39. El miembro de enlace o molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque enlaza el dominio extracelular humano GM-CSFRa con una afinidad (KD) de 0.5 nM o menos en un ensayo de resonancia de superficie de plasmón.
40. El miembro de enlace o molécula de anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque tiene una potencia neutralizante IC50 de 60 pM o menos en ensayo de proliferación de célula TF-1 con 7 pM de GM-CSF humano.
41. El miembro de enlace o molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque tiene una potencia neutralizante IC50 de 10 pM o menos en el ensayo de proliferación de célula TF-1 con 7 pM de GM-CSF humano .
42. El miembro de enlace o molécula de anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque tiene una potencia neutralizante IC50 de 50 pM o menos en un ensayo de cambio de forma de granulocito humano con 7 pM de GM-CSF humano.
43. El miembro de enlace o molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque tiene una potencia neutralizante IC50 de 25 pM o menos en un ensayo de cambio de forma de granulocito humano con 7 pM de GM-CSF humano.
44. El miembro de enlace o molécula de anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque tiene una potencia neutralizante IC50 de 100 pM o menos en un ensayo de liberación de TNFa de monocito con 1 nM de GM-CSF humano.
45. Una composición, caracterizada porque comprende el miembro de enlace o molécula de anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
46. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el miembro de enlace o molécula de anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 44.
47. Una célula hospedera in vi tro, caracterizada porque contiene una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 44.
48. Un método para producir el miembro de enlace o molécula de anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 44, caracterizado porque comprende cultivar células hospederas de conformidad con la reivindicación 47.
49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque comprende purificar el miembro de enlace .
50. Un método para producir una molécula de anticuerpo para GM-CSFRa humano, caracterizado porque comprende proporcionar, a modo de inserción, eliminación o substitución de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH precursor que comprende HCDRl , HCDR2 y HCDR3 , un dominio VH que es una variante de secuencia de aminoácido del dominio VH precursor; en donde el VH CDRl precursor tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3; el VH CDR2 precursor tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; y el VH CDR3 precursor tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO : 25; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 185; y SEQ ID NO: 195; O en donde el VH CDRl precursor tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 173, el VH CDR2 precursor tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 174, y el VH CDR3 precursor tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 175; y combinar opcionalmente el dominio VH proporcionado de esta manera con uno o más dominios VL para proporcionar una o más combinaciones VH/VL; y probar el dominio VH o la combinación VH/VL o combinaciones para identificar una molécula de anticuerpo para GM-CSFRa, que comprende probar la capacidad de la molécula de anticuerpo APRA enlazar y neutralizar GM-CSFRa, en donde la molécula de anticuerpo inhibe el enlace de GM-CSF a GM-CSFRa, enlace a dominio extra-celular GM-CSFRa humano con una afinidad (KD) de 5 nM o menos en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie, y: (i) enlaza al menos un residuo de Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln en las posiciones 226 hasta 230 de GM-CSFRa humano como se muestra en la SEQ ID NO: 206; (ii) tiene una potencia neutralizante IC50 de 60 pM o menos en un ensayo de proliferación de célula TF-1 con 7 pM de GM-CSF humano; (iii) tiene una potencia neutralizante IC50 de 50 pM o menos en un ensayo de cambio de forma de granulocito humano con 7 pM de GM-CSF humano; y/o (iv) tiene una potencia neutralizante IC50 de 100 pM o menos en un ensayo de liberación de TNFa de monocito con 1 nM de GM-CSF humano.
51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque uno o más dominios VL se proporciona a modo de inserción, eliminación o substitución de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del dominio VL precursor que comprende LCDRl, LCDR2 y LCDR3 ; en donde el VL CDRl precursor tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 ; el VL CDR2 precursor tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9; y el VL precursor CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 200.
52. El método de conformidad con la reivindicación 50 ó la reivindicación 51, caracterizado porque comprende probar la molécula de anticuerpo para capacidad para inhibir el enlace de GM-CSF humano a GM-CSFRa humano .
53. un método para producir una composición de molécula de anticuerpo, caracterizado porque comprende obtener una molécula de anticuerpo usando un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 50 hasta 52, y formular la molécula de anticuerpo en una composición que comprende al menos un componente adicional.
54. El uso del miembro de enlace o molécula de anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 44 en la manufactura de un medicamento para tratar una condición o enfermedad inflamatoria, respiratoria o autoinmunitaria o para tratar leucemia mieloide.
55. El uso de conformidad con la reivindicación 54, en donde la condición o enfermedad es artritis reumatoide, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, respuesta alérgica, esclerosis múltiple o ateroesclerosis.