ES2279884T3 - Tratamiento de la inflamacion articular cronica usando un anticuerpo contra el complejo por antigeno cd3. - Google Patents
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Abstract
Uso de un anticuerpo anti CD3 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la inflamación crónica de una articulación, en el que el anticuerpo está constituido por fragmentos Fab o F(ab'')2 o es un anticuerpo mutado en la región Fc para prevenir la unión a receptores de Fc.
Description
Tratamiento de la inflamación articular crónica
usando un anticuerpo contra el complejo del antigeno CD3.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de tratamiento de una inflamación crónica de una
articulación, en particular, sinovitis inflamatoria crónica, más en
particular, artritis reumatoide y afecciones afines, usando
anticuerpos dirigidos al antígeno CD3 en el que el anticuerpo está
constituido por fragmentos Fab o F(ab')_{2}, o es un
anticuerpo mutado en la región Fc para prevenir la unión a
receptores de Fc, y al uso de tales anticuerpos para fabricar un
medicamento para uso en ese tratamiento.
La artritis reumatoide es una enfermedad
inflamatoria crónica que afecta a las articulaciones y otros tejidos
y que tiene una incidencia anual de 1 a 10 personas por cada 10.000
de la población de adultos en los países desarrollados y un arraigo
de aproximadamente 1%. Aparte del dolor y el sufrimiento que
produce esa afección, la naturaleza progresiva de la enfermedad
tiene un efecto significativo sobre la morbilidad y la mortalidad
con una relación estándar de la mortalidad de hasta 3,0. El coste
anual de la enfermedad sólo en EE.UU. se ha estimado que supera los
1.000 millones de dólares (Brooks, The Lancet, 30 de enero de 1993,
pág. 286). Los procedimientos actuales de tratamiento de la
enfermedad distan mucho de ser satisfactorios y los problemas
incluyen la dificultad de predicción de la respuesta y el hecho de
que muchos fármacos no son bien tolerados y/o tienen potencialmente
efectos adversos peligrosos. Hay otras varias enfermedades
"reumáticas" con una inflamación comparable del tejido
sinovial, entre ellas espondilitis anquilosante, artritos psoriática
y algunas formas de la osteoartritis que se pueden considerar
también bajo la denominación de inflamación sinovial crónica.
El documento WO 93/97899 se refiere al
tratamiento de la inflamación de articulaciones mediada por células
T usando un anticuerpo que reconoce el antígeno CD_{w}52, solo o
en combinación con un anticuerpo anti-CD4. Se
describe en particular el uso de un anticuerpo monoclonal
humanizado, Campath-IH, para tratar la artritis
reumatoide. Si bien esta terapia ofrece la esperanza de una mejora
significativa, implica un empobrecimiento severo de linfocitos T
sistémicos. Mientras que los niveles de los linfocitos T en el
paciente son bajos y, por ello, al menos en teoría están
inmunocomprometidos y son vulnerables a la infección, los síntomas
de enfermedad retornan. El equilibrio entre riesgo de infección y
eficacia terapéutica hace que los médicos no encuentren atractivo
el Campath-1H para afecciones crónicas tales como la
artritis reumatoide. También ha sido sugerido el uso de anticuerpos
anti.-CD4 para tratamiento de inflamaciones crónicas de
articulaciones, pero tales anticuerpos no han demostrado ser
adecuadamente eficaces en la clínica.
Se puede encontrar una discusión del antígeno
CD3 en, por ejemplo, el informe de la First International Workshop
and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens. También
se describen anticuerpos glicosilados dirigidos contra el antígeno
CD3 en los informes de esta serie de Talleres y Conferencias, en
particular en la Tercera y la Cuarta, publicadas por Oxford
University Press. Los anticuerpos anti-CD3 se han
conocido así durante aproximadamente 20 años, pero han tenido sólo
un uso limitado como agentes inmunosupresores en, por ejemplo, el
tratamiento de episodios de rechazo después de trasplantes de
aloinjertos renales, hepáticos y cardíacos debido a las reacciones
a la primera dosis, que pueden ser severas.
Es conocido que los anticuerpos monoclonales
anti-CD3 se pueden usar para sensibilizar células T
a estímulos proliferativos secundarios tales como IL1
(interleuquina 1) e IL2 (interlequina 2). Además, ciertos
anticuerpos monoclonales de CD3 son en sí mitógenos para células T.
Esta propiedad es isotipo-dependiente y es resultado
de la interacción del dominio Fc del anticuerpo de CD3 con
receptores Fc sobre la superficie de células accesorias. Se han
usado anticuerpos de CD3 de roedores para influir sobre el estado
inmunológico por supresión, intensificación o redirección de
respuestas de células T a antígenos.
La patente U.S. nº. 5.968.509 se refiere a
anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos a CD3 y describe su
uso para controlar el rechazo de injertos y tratar linfomas. La
patente U.S. nº. 5.585.097 se refiere a anticuerpos
anti-CD3 del tipo descrito en la patente U.S. nº.
5.968.509, en cuanto a que son aglicosilados y por ello tienen
efectos secundarios reducidos asociados con la "respuesta a la
primera dosis" cuando se usan en terapia.
Malfait y otros, Arthritis and Rheumatism vol.
44, nº. 5, mayo de 2001, págs. 1215-1224, se
refieren a artritis crónica inducida por colágeno en ratones DBA/1
como modelo para ensayar terapias que modifican la enfermedad e
inducen la remisión. Una terapia investigada era terapia combinada
de anticuerpo anti-CD3 más anticuerpo factor de
necrosis antitumoral administrada después de haberse manifestado los
síntomas que bloqueaban la progresión de la artritis en el ratón
durante el resto del período de estudio de 56 días.
El modelo de murino descrito antes depende mucho
del estímulo impulsado por antígeno para provocar la actividad de
células T. Hasta el momento no se han identificado tales antígenos
estimuladores para la artritis reumatoide humana, espondilitis
anquilosante o artropatía psoriática. En ausencia de indicadores de
que la enfermedad de murinos es comparable a los trastornos
sinoviales humanos, no es posible extrapolar datos sobre beneficios
terapéuticos para la artritis reumatoide humana y trastornos
sinoviales inflamatorios.
La patente U.S. nº. 5.183.657 se refiere a una
composición farmacéutica que comprende un anticuerpo contra el
factor de necrosis del tumor \alpha humano y un anticuerpo
antilinfocitos con uno o varios vehículos, excipientes o diluyentes
farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, el anticuerpo
antilinfocitos es un anticuerpo monoclonal tal como ortoclon
OKT3®.
El documento WO 00/05268 se refiere a un
anticuerpo IgG híbrido humano/de roedor para CD3 que es capaz de
ser expresado por sistemas de expresión de células de mamíferos con
rendimientos potenciados. El anticuerpo puede ser aglicosilado.
La patente CA 2224256b describe el uso
terapéutico de fragmentos F(ab')_{2} de un anticuerpo
monoclonal anti CD3 para el tratamiento de ratones NOD
manifiestamente diabéticos.
Friend y otros, Transplantation, vol. 68, nº 11,
15 de diciembre de 1999, págs. 1632-1637, describen
el uso terapéutico de una versión aglicosilada de un anticuerpo
monoclonal anti CD3 en el rechazo de trasplante renal.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
está dirigida al uso de un anticuerpo anti CD3 para la fabricación
de un medicamento para el tratamiento de una inflamación crónica de
una articulación, en el que el anticuerpo está constituido por
fragmentos Fab o F(ab')_{2} o es un anticuerpo mutado en la
región Fc para prevenir la unión a receptores Fc.
Tal como se usan aquí, los términos tienen las
definiciones que se dan:
"CD3" significa designación de grupo 3;
"aglicosilado" significa en esta memoria un
anticuerpo que ha perdido su sitio de glicosilación principal por
una mutación de asparagina en la posición 297 a alanina;
"reacción de la primera dosis" significa
una reacción de liberación de citoquinas que se sabe que sigue a la
administración de la primera dosis de anticuerpos de CD3 y
frecuentemente asociada con una morbilidad e incomodidad
significativas para el paciente;
"afinidad" en relación a un anticuerpo
significa la capacidad de cada uno de los brazos del anticuerpo de
unirse a su ligando (el antígeno).
El tratamiento usando un anticuerpo anti CD3
tiene la principal ventaja de que sólo se requiere un tratamiento a
corto plazo para proporcionar beneficios sostenidos a largo plazo.
Por ejemplo, el tratamiento se puede hacer durante un período de
hasta 2 semanas, por ejemplo de 1 a 5 días, sin una nueva
administración durante al menos 6 meses. Este tratamiento
proporciona al paciente un beneficio durante un período de como
mínimo 6 meses y, en muchos casos, mucho mayor, por ejemplo, de
hasta 24 meses o más.
El uso de un anticuerpo anti CD3 de acuerdo con
la presente invención tiene también la ventaja de que no da por
resultado el empobrecimiento de linfocitos T, como es el caso con
Compath 1-H.
La terapia con un anticuerpo anti CD3 de acuerdo
con la invención se debe realizar de manera que se eviten las
reacciones a la primera dosis asociadas con anticuerpos anti CD3 o
que al menos se reduzcan a un nivel que pueda ser tolerado por el
paciente. Las reacciones a la primera dosis se pueden reducir por
modificación del anticuerpo y, opcionalmente, administrando el
anticuerpo con otra sustancia que reduzca la reacción.
Son ejemplos de modificaciones del anticuerpo
que pueden reducir la reacciones a la primera dosis el uso de
fragmentos Fab o F(ab')_{2} u otras mutaciones en la región
Fc del anticuerpo diseñadas para prevenir la unión a receptores
Fc.
Son ejemplos de sustancias que pueden reducir
las reacciones a la primera dosis cuando se administra un anticuerpo
anti CD3, la profilaxis con esteroides y antihistaminas.
El anticuerpo anti CD3 se puede administrar con
otros agentes terapéuticos para tratar la inflamación crónica de
articulaciones y los anticuerpos se pueden usar junto con tales
agentes como parte de una terapia global para esa afección. Entre
los ejemplos de estos otros agentes terapéuticos están incluidos
esteroides y anticuerpos anti TNF. Muchas terapias para la
inflamación crónica de articulaciones son inmunosupresoras y éstas
pueden ser eficaces para reducir la reacción a la primera dosis del
anticuerpo anti CD3. Puede haber también una demora del tiempo
entre la administración del anticuerpo anti CD3 y el paciente que
experimenta cualquier beneficio terapéutico y esta demora del
tiempo puede extenderse a semanas. El uso del anticuerpo anti CD3
como parte de una estrategia global junto con otros agentes
terapéuticos puede ayudar a aliviar los síntomas de la afección
durante esta demora del tiempo.
El documento WO 00/05268 describe la secuencia
total del anticuerpo anti CD3 quimérico preferido, que es parte
humanizada, adecuada para uso en la presente invención.
Los anticuerpos preferidos para uso en el
presente procedimiento son uno o más de los anticuerpos monoclonales
humanizados, anticuerpos aglicosilados y anticuerpos que tienen los
CDRs contenidos en los anticuerpos OKT3 e YTH 12.5.14.2.
El anticuerpo OKT3 se discute en publicaciones
tales como la de Chatenoud y otros, Transplantation, 1991, 51, 334
y The New England Journal of Medicine paper, 1985, 313, 339 y
también en patente europea nº. 0 018 795 y patente U.S. nº.
4.361.539. El anticuerpo YTH 12.5.14.2 (denominada en lo que sigue
YTH 12.5) se discute en publicaciones tales como las de Cobbold,
S.P. y Waldmann, H., 1984 Nature 308, 460-462 y
Clark y otros, European J. Immunol. 1989, 19,
381-388, y los anticuerpos YTH reconformados son
objeto de la patente U.S. nº. 5.968.509 y sus equivalentes,
describiendo esta solicitud en detalle los CDRs presentes en este
anticuerpo. Si bien la presente invención no está limitada al uso
de cualquier anticuerpo anti CD3 particular, preferiblemente, los
anticuerpos de la invención tienen al menos un CDR seleccionado
entre las siguientes secuencias de aminoácidos:
| (a) | Ser-Phe-Pro-Met-Ala | (SEC. ID NO.1) |
| (b) | Thr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val-Lys-Gly | (SEC. ID NO. 2) |
| (c) | Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr | (SEC. ID NO.3) |
| (d) | Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn-Tyr-Val-His | (SEC. ID NO. 4) |
| (e) | Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp | (SEC.ID NO. 5) |
| (f) | His-Ser-Tyr-Val-Ser-Ser-Phe-Asn-Val | (SEC. ID NO.6), |
y sus variantes modificadas
conservadoramente.
El término "variantes modificadas
conservadoramente" es un término bien conocido en la técnica e
indica variantes que contienen cambios que sustancialmente no
tienen efecto sobre la afinidad
anticuerpo-antígeno.
Los CDRs están situados dentro de las regiones
de marco en la cadena pesada para (a), (b) y (c) y en la cadena
ligera para los dominios variables (d), (e) y (f). El anticuerpo
también comprende un dominio constante.
En una realización preferente, el anticuerpo
aglicosilado tiene tres CDRs que corresponden a las secuencias de
aminoácidos (a), (b) y (c) anteriores o sus variantes modificadas
conservadoramente y/o tres CDRs que corresponden a las secuencias
de aminoácidos (d), (e) y (f) o sus variantes modificadas
modificadas conservadoramente, siendo los CDRs (a), (b) y (c) de
máxima importancia:
Un anticuerpo aglicosilado preferido para el
presente uso o el procedimiento en la presente invención, que tiene
una afinidad de unión para el antígeno CD3 tiene así una cadena
pesada con al menos un CDR y particularmente tres CDRs
seleccionados entre las SECUENCIAS ID NOS. 1 a 6 (a a f) y sus
variantes modificadas conservadoramente.
Cuando un anticuerpo aglicosilado de acuerdo con
la invención contiene CDRs preferidos según se ha descrito aquí
antes, contiene convenientemente uno o más de los CDRs de cadena
pesada especificados y uno o más de los CDRs especificados de
cadena ligera. Los CDRs (a), (b) y (c) están dispuestos en la cadena
pesada en la secuencia: región marco 1/(a)/región de marco
2/(b)/región marco 3/(c)/región marco 4 en una dirección dominio
líder \rightarrow dominio constante (N terminal a C terminal), y
los CDRs (d), (e) y (f) están dispuestos en la cadena ligera en la
secuencia: región marco 1/(d)/región marco 2/(b)/región marco
3/(f)/región marco 4 en una dirección líder \rightarrow dominio
constante. Se prefiere, por tanto, que cuando todos los tres están
presentes en la cadena pesada, los CDRs estén ordenados en la
secuencia (a), (b), (c) en una dirección dominio líder
\rightarrow dominio constante en la cadena pesada y los CDRs estén
ordenados en la cadena ligera en la secuencia (d), (e), (f) en una
dirección dominio líder \rightarrow dominio
constante.
constante.
Se debe tener en cuenta, no obstante, que los
anticuerpos aglicosilados para uso de acuerdo con la presente
invención pueden contener CDRs bastante diferentes de los descritos
en lo que antecede y que, incluso cuando no sea éste el caso, puede
ser posible tener cadenas pesadas y, en particular, cadenas ligeras
que contienen sólo uno o dos de los CDRs (a), (b) y (c) y (d), (e)
y (f) respectivamente. Sin embargo, aunque la presencia de la
totalidad de los seis CDRs definidos antes no es requerida
necesariamente en un anticuerpo aglicosilado de acuerdo con la
presente invención, muy usualmente estarán presentes los seis CDRs
en los anticuerpos muy preferidos.
Por tanto, un anticuerpo aglicosilado muy
preferido tiene una cadena pesada con tres CDRs que comprenden las
secuencias de aminoácidos (a), (b) y (c) o sus variantes modificadas
conservadoramente, y una cadena ligera con tres CDRs que comprenden
las secuencias de aminoácidos (d), (e) y (f) o sus secuencias
modificadas conservadoramente, en el que los CDRs de cadena pesada
están dispuestos en el orden (a), (b), (c) en la dirección de región
líder constante y los CDRs de cadena ligera en el orden (d), (e),
(f) en la dirección de la región líder constante.
Los CDRs pueden ser de diferente origen para la
región de marco variable y/o la región constante y, puesto que
usualmente los CDRs procederán de rata o ratón, esto es ventajoso
para evitar una respuesta a la antiglobulina en personas, aunque la
invención no se extiende a anticuerpos con tales regiones
originarias de rata o ratón.
Más usualmente, los CDRs son del mismo origen
que la región marco pero de diferente origen del de la región
constante, por ejemplo, en un anticuerpo quimérico en parte humano,
o, más comúnmente, los CDRs son de un origen diferente al de la
región marco variable.
Los CDRs preferidos discutidos en lo anterior se
obtienen a partir de anticuerpo de CD3 de rata. Consecuentemente,
aunque la región marco de dominio variable puede tener varias
formas, es conveniente que sea de las derivadas de un roedor, por
ejemplo, una rata o ratón y, más preferiblemente, de origen humano o
derivado de humano. Una posibilidad para el anticuerpo es que
tenga una región marco de dominio variable que corresponda a la del
hibridoma de YTH 2.5, aunque la región constante preferiblemente
será de, o derivada de, las de origen humano. Sin embargo, el
anticuerpo de la invención, como se discute más adelante,
preferiblemente está en forma humanizada en tanto cuanto a la
región marco de dominio variable como a la dominio constante, u
otras formas no inmunógenas.
Consecuentemente, la invención comprende además
el uso de un anticuerpo aglicosilado que tiene una afinidad de
unión para el antígeno CD3 humano y en el que las regiones marco de
dominio variable y/o la región constante son de origen humano o
derivan de las de origen humano. Ciertas secuencias marco humanas de
dominio serán preferibles para el injerto de secuencias preferidas
de CDR, puesto que la conformación tridimensional de los CDRs se
mantendrá mejor en tales secuencias y el anticuerpo retendrá la
estructura de los lazos de CDR con el fin de asegurar la afinidad y
especifidad del anticuerpo para el antígeno CD3, prefiriéndose el
tipo lambda para la cadena ligera.
Los marcos de la región variable humana que son
particularmente adecuados para uso junto con los CDRs anteriores se
han identificado previamente en la patente U.S. nº. 5.968.509. Los
marcos de la región variable de la cadena pesada (V) son los
codificados por el gen VH26.D.J. de VH de tipo III humano, que es
de los hibridomas de células B de la línea 18/2 (Código de Genbank:
Huminghat, Dersimonian y otros, Journal of Immunology, 139, 2496
2501). Los marcos de regiones variables de cadena ligera son los del
gen SUT de tipo VI de VL\lambda humano (código Swissprot;
LV6CSHUm, Solomon y otros. En Glenner y otros (Eds.), Amyloidos's,
Plenum Press N.Y. 1986, pág.
449.
449.
El CDR preferido o los varios CDRs preferidos de
cadena pesada del anticuerpo anti CD3 están por tanto
preferiblemente presentes en un marco de dominio variable humano
que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos leyendo en la
dirección región líder \rightarrow región constante, indicando CDR
un CDR (a), (b) o (c) según se ha definido antes, una variante
modificada conservadoramente de él o un CDR alternativo:
(SEC. ID NO. 7/CDR/SEC. ID
NO.8/CDR/SEC. ID NO. 9/CDR/SEC. ID NO.
10)
En un anticuerpo aglicosilado que contiene los
tres CDRs preferidos, la región variable de la cadena pesada
comprende la secuencia siguiente:
(SEC. ID NO.
11).
Análogamente, el CDR preferido o los varios CDRs
preferidos de la cadena ligera del anticuerpo CD3 están por tanto
preferiblemente presentes en un marco de dominio variable humano que
tiene la siguiente secuencia de aminoácidos leyendo en la dirección
región líder \rightarrow región constante, indicando CDR un CDR
(d), (e) o (f) según lo definido antes, una variante modificada de
ellos o un CDR alternativo:
(SEC. ID NO. 12/CDR/SEC. ID NO.
13/CDR/SEC. ID 14/CDR/SEC. ID NO.
15).
En un anticuerpo aglicosilado que contiene los
tres CDRs preferidos, la región variable de la cadena ligera
comprende la siguiente secuencia
(SEC. ID NO.
16).
Los dominios variables que, por ejemplo,
comprenden uno o más CDRS preferidos según se ha descrito antes, o
preferiblemente en forma humanizada que tienen regiones marco
variables humanas derivadas de anticuerpo, están unidos a dominios
constantes apropiados.
Las regiones constantes de cadena pesada y
ligera pueden estar basadas en anticuerpos de diferentes tipos
sometidos según se desee al anticuerpo que es un anticuerpo de IgG,
pero aunque pueden ser originarios o derivados de los de rata o
ratón, preferiblemente son de origen humnano o derivados de los de
origen humano. Para la cadena ligera, preferiblemente, la región
constante es del tipo lambda y para la cadena pesada,
preferiblemente es un isotipo de IgG, especialmente IgG1,
modificado para efectuar la aglicosilación según sea apropiado. Se
sabe que todas las regiones constantes humanas del isotipo de IgG
están glicosiladas en el resto de asparagina en la posición 297, lo
que hace parte del motivo de N-glicosilación
Asparagina297-X298-Serina299 o
Treonina299, siendo X el resto de cualquier aminoácido excepto
prolina. El anticuerpo de la invención puede así estar aglicosilado
por reemplazo de Asparagina 297 en tal región constante con otro
aminoácido que no puede ser glicosilado. Potencialmente se puede
usar cualquier otro aminoácido, pero el más preferido es alanina.
Alternativamente, se puede prevenir la glicosilación en
Asparagina297 alterando uno de los otros restos del motivo, por
ejemplo, reemplazando el resto 298 por prolina, o el resto 299 por
cualquier aminoácido que no sea serina o treonina. Las técnicas
para realizar esta mutagénesis dirigida al sitio son bien conocidas
por los expertos en la técnica y se pueden realizar, por ejemplo,
usando un kit de mutagénesis dirigida al sitio tal como, por
ejemplo, el disponible comercialmente de Amersham. El procedimiento
se ejemplifica más adelante.
Es bien conocido en la técnica que la
sustitución de un aminoácido en un CDR por otro que tiene similares
propiedades, por ejemplo, la sustitución de un resto de ácido
glutámico con un resto de ácido aspártico, puede no alterar
sustancialmente las propiedades o la estructura del péptido o la
proteína en la que se hizo la sustitución o las sustituciones. Así,
los anticuerpos aglicosilados para uso en la presente invención
incluyen aquellos anticuerpos que contienen los CDRs preferidos
pero con una secuencia de aminoácidos especificada en la que ha
tenido lugar una o varias sustituciones sin alterar sustancialmente
la afinidad y especifidad de unión de los CDRs. Alternativamente,
se pueden hacer supresiones en la secuencia de restos de aminoácidos
de los CDRs o las secuencias se pueden extender en uno de los
términos N o C o en ambos mientras que se sigue reteniendo la
actividad.
\newpage
Los anticuerpos aglicosilados de acuerdo con la
presente invención son tales que la constante de afinidad para el
antígeno es de 10^{5} mol^{-1} o más, por ejemplo, de hasta
10^{12} mol^{-1}. Pueden ser adecuados para diferentes usos
ligandos de diferentes afinidades de manera que, por ejemplo, en
algunos casos puede ser apropiada una afinidad de 10^{6},
10^{7} o 10^{8} mol^{-1} o más. Sin embargo, frecuentemente
serán adecuados anticuerpos con una afinidad en el intervalo de
10^{6} a 10^{8} mol^{-1}. Es conveniente que los anticuerpos
no presenten una afinidad de unión sustancial para otros antígenos.
Las afinidades de unión del anticuerpo y la afinidad del
anticuerpo se pueden evaluar por procedimientos de ensayo tales como
los descritos en la sección de Ejemplos que figura más adelante
(ensayo de eficacia en el reapuntamiento de células) o por técnicas
tales como ELISA y otros inmunoensayos.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención son
anticuerpos de IgG CD3 aglicosilados que tiene una configuración
en forma de Y que pueden tener dos cadenas ligeras idénticas y dos
cadenas pesadas idénticas y son así bivalentes, teniendo cada sitio
de unión de antígeno una afinidad para el antígeno CD3.
Alternativamente, la invención es aplicable también a anticuerpos
en los que sólo uno de los brazos tiene una afinidad de unión para
el antígeno CD3. Tales anticuerpos pueden tener varias formas. Así,
el otro brazo puede tener una afinidad para un antígeno que no es
CD3, de manera que el anticuerpo sea un anticuerpo biespecífico, por
ejemplo, el descrito en la patente U.S. nº. 4.474.893 y las
solicitudes de patente europea n^{os}. 87907123.1 y 87907124.9.
Alternativamente, el anticuerpo puede tener sólo un brazo que
presenta afinidad, tal como un anticuerpo que se califica
"monovalente".
Los anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo)
monovalentes se pueden preparar de varias maneras. Glennie y
Stevenson (Nature, 295, 712-713, (1982)) describen
un procedimiento para preparar anticuerpos monovalentes por
digestión enzimática. Stevenson y otros describen un segundo enfoque
para la preparación de anticuerpos monoclonales en el que
fragmentos Fab' y Fe producidos enzimáticamente se reticulan
químicamente (Anticancer Drug Design, 3, 219, 230 (1989)). En estos
procedimientos, los anticuerpos monovalentes resultantes han perdido
uno de sus brazos Fab'. Se describe un tercer procedimiento de
preparación de anticuerpos monovalentes en la patente europea nº.
131424, En este enfoque, se mantiene la forma en Y del anticuerpo,
pero sólo uno de los dos dominios de Fab' se unirá al antígeno.
Esto se consigue introduciendo en el hibridoma un gen que codifica
una cadena ligera irrelevante que se combinará con la cadena pesada
del anticuerpo para producir una mezcla de productos en la que el
anticuerpo monovalente es el de interés.
Más preferiblemente, sin embargo, los
anticuerpos de CD3 aglicosilados monovalentes para uso en la
invención se preparan por el procedimiento siguiente. Éste implica
la introducción en un sistema de expresión adecuado, por ejemplo,
un sistema celular como se describe más adelante, junto con genes
que codifican cadenas pesadas y ligeras, de un gen que codifica
una cadena pesada truncada en la que no están presentes el dominio
de la región variable y el dominio de la primera región constante
de la cadena pesada, careciendo el gen de exón para cada uno de
estos dominios. Esto da por resultado la producción por el sistema
celular de una mezcla de (a) anticuerpos que son anticuerpos
completos bivalentes; (b) fragmentos de anticuerpos constituidos por
sólo dos cadenas pesadas truncadas (esto es, un fragmento Fc) y (c)
fragmentos de anticuerpo que son monovalentes para el antígeno CD3,
constituidos por una cadena pesada truncada y una cadena ligera en
asociación con la cadena pesada normal. Tal fragmento de anticuerpo
(c) es monovalente puesto que tiene sólo un brazo Fab'. Se prefiere
la producción de un anticuerpo monovalente en forma de tal fragmento
por este procedimiento por una serie de motivos. Así, el fragmento
de anticuerpo resultante es fácil de purificar a partir de una
mezcla de anticuerpos producida por el sistema celular; por
ejemplo, puede separarse simplemente sobre la base de su peso
molecular. Esto no es posible en el procedimiento de la patente
europea nº. 131424 en el que el anticuerpo monovalente producido
tiene características similares a las de un anticuerpo bivalente en
cuanto a su tamaño y aspecto exterior.
Además, la producción de un fragmento de
anticuerpo monovalente por el nuevo procedimiento utiliza
condiciones que se pueden controlar más fácilmente y así no es tan
fortuito como un procedimiento de digestión/acoplamiento químico
que requiere la separación de un producto de reacción complejo, con
la ventaja adicional de que la línea de células usada continuará
para producir fragmentos de anticuerpo monoclonal sin necesidad de
procedimientos continuos de síntesis, requeridos en el
procedimiento de digestión con enzimas/acoplamiento químico.
Los anticuerpos aglicosilados para uso en el
procedimiento de la presente invención se producen sintéticamente
por varios procedimientos. Muy convenientemente, sin embargo, se
obtienen separadamente construcciones apropiadas de genes para las
regiones constante y variable de las cadenas pesadas y ligeras que
están presentes en el anticuerpo y luego se insertan en un sistema
de expresión adecuado.
Se pueden producir los genes que codifican los
dominios variables de un ligando de la estructura deseada y unir a
genes que codifican los dominios constantes de un anticuerpo que ha
experimentado mutagénesis dirigida al sitio. Estos genes constantes
se puede obtener a partir de cDNA de hibridoma o de DNA cromosómico
y han experimentado mutagénesis (dirigida al sitio) para producir
las regiones aglicosiladas constantes. También se pueden derivar
genes que codifican las regiones variables por técnicas de síntesis
usadas en la identificación de los CDRS contenidos aquí. Las
técnicas de clonación adecuadas para DNA pueden ser de varios
tipos.
La expresión de estos genes mediante cultivo de
un sistema de células para producir un ligando de CD3 monofuncional
se efectúa muy convenientemente por transformación de un sistema
adecuado de células procarióticas o particularmente células
eucarióticas, en particular una línea de células de mamífero
inmortalizadas, por ejemplo, la célula de mieloma de rata
YB2/3,0I/Ag2O (denominada en lo que sigue YO), o células de ovario
de hamster chino (aunque también es de interés el uso de células de
plantas), con vectores de expresión que incluyen DNA que codifica
varias regiones del antígeno, y cultivando luego el sistema de
células transformadas para producir el anticuerpo deseado. Tales
técnicas generales de uso para la preparación de ligandos de acuerdo
con la presente invención son conocidas en la técnica muy
considerable de la ingeniería genética y se describen en
publicaciones tales como Molecular Cloning, por Sambrook,
Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989 (2ª
edición). Las técnicas se ilustran más con los Ejemplos contenidos
en esta memoria.
Los anticuerpos para uso de acuerdo con la
invención se pueden formular para administración a pacientes
administrando el mencionado anticuerpo junto con un diluyente o
vehículo fisiológicamente aceptable. Preferiblemente, los
anticuerpos se administran en forma inyectable junto con tal
diluyente o vehículo, que es estéril y está exento de pirógenos. La
dosis de anticuerpo a administrar a un paciente dependerá de la
afección del paciente y es a discreción del médico que le atiende.
Por ejemplo, se pueden usar dosis de aproximadamente 1 a 40 mg al
día, preferiblemente de 10 a 30 mg al día. La dosis total a lo largo
de un período de hasta 10 días estará en el intervalo de
aproximadamente 50 a 100 mg, preferiblemente será de aproximadamente
60 a 80 mg.
El beneficio terapéutico de la terapia de
acuerdo con la invención puede estimarse por la reducción de la
inflamación local/sistémica con la reducción concomitante del dolor
y la mejora de la capacidad funcional y la calidad de vida. Esto se
puede estimar por los criterios de respuesta EULAR o ACR (véase Van
Gestel y otros, Arthritis Rheum., 1996; 39: 34-40,
y Felson y otros, Arthritis Rheum., 1995; 38:
727-35).
La invención se ilustra con los ejemplos
siguientes.
Se produjo una forma quimérica de anticuerpo CD3
aglicosilado usando un montaje de PCR para unir la región variable
de cadena ligera de CD3 de rata a la región constante lambda humana
usando cebadores que introducen sitios de enzimas de restricción
Hind III y EcoR1 para permitir la clonación en el vector PEE12 de
expresión de Celltech (véase Bebington y otros, (1992)
Biotechnology 10, 169). Las secuencias del cebador para poder
clonar en PEE12 la forma de CD3 de cadena ligera son las
siguientes:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Cebador Hind 111: \+ GAC TAC AAG CTT ACA CAG GAC CTC ACC ATG CGA
TGG \+ (SEC. ID NO 17).\cr Cebador EcoR1: \+ GAT GCT GAA TTC TGC
AGC TCT AGT CTC CCG TGG TGG \+ (SEC. ID NO
18).\cr}
Se secuenció la construcción final y se clonó en
PEEI2 que contenía ya la cadena pesada de aglicosilo de CD3
humanizado y ésta se transfectó en la línea de células de mieloma
N50 (ECACC nº. 851 10503 -Galfre y Milstein (1981), Enzymology 73
(B) 3-46) por electroporación. Los clones
resultantes se exploraron respecto a la producción de anticuerpo
usando ELISA para IgGI humano y la cadena ligera lambda humana y
sobre FACS para unión a la línea de células Jurkat de clones de
células I humanae. El ELISA usa IgFc antihumano de cabra (Sigma
12136) como anticuerpo de captura e IgG antihumano de oveja
biotinilado (Amersham RPN 1003) o cadena ligera lambda antihumana
de cabra biotinilada (Amersham RPN 1188) como anticuerpo detector
(véase Routledge y otros, Eur. J. Immunol (1991)
21:2717-2725).
Después de una transfección, de 16 clones
expresados de 60 \mug/ml a 100 \mug/ml, los transfectantes es
clonaron por clonación a dilución limitativa y algunos de estos
mejoraron a 120 \mug/ml. Estos permanecieron estables en cultivo
a largo plazo y producción de anticuerpo a gran escala sin problemas
en el crecimiento de las células.
Se administraron en vehículo acuoso, esto es,
solución salina normal, a una dosis de 70 mg durante 5 días, a
cuatro pacientes, un anticuerpo anti CD3 aglicosilado divalente que
tenía cadena pesada humanizada, cadena ligera variable de rata que
contenía CDRs que correspondían en cuanto a la secuencia a los de
anticuerpo de rata YTH 12.5, y una región constante lambda
humanizada como se describe en el Ejemplo 1 de PCTIGB99102380
(véase Ejemplo 1 anterior).
Paciente
1
El paciente era una mujer de 50 años con una
historia de 5 años de artritis reumatoide seropositiva. No había
manifestaciones articulares adicionales pero tenía el síndrome de
Felty. Las terapias previas habían incluido sulfasalazina y
ciclosporina A. Cuando se le reclutó para el estudio estaba tomando
metotrexato, 20 mg a la semana y prednisona a 20 mg/día. Estaba
seriamente incapacitada a causa de su enfermedad y había perdido su
empleo como enfermera dental. Era incapaz de vestirse por sí o de
lavarse el pelo. Encontraba también que era difícil levantarse de
la silla o acostarse o levantarse de la cama. No podía cortar la
carne que comía ni abrir un envase de leche. Le era difícil
bañarse, como lo era estirarse y flexionarse. Era incapaz de agarrar
cosas tales como grifos o jarras y no podía comprar por sí
misma.
misma.
Se le administró aglicosil anti CD3 durante 5
días. Se le prescribieron 30 mg para el primer día y luego 10 mg en
los siguientes 4 días. No se le administró premedicación alguna. La
primera infusión se complicó por náuseas y vómitos y la fiebre
alcanzó 40,5ºC y estaba asociada con hipotensión y diarrea. Se
administró un agente expansivo del plasma. Estos síntomas duraron
36 horas y la segunda infusión se demoró 24 horas. Con la segunda
infusión, sin embargo, se había reducido ya el dolor y la
inflamación de las articulaciones afectadas. Las posteriores 4
infusiones se dieron sin complicaciones.
Su artritis reumatoide se manifestó el día 43 y
se trató con una única dosis de depomedrona intramuscular. Se
continuó durante el tratamiento anti CD3 su medicación de línea de
base y reumatoide. Se han cumplido 21 meses desde que el paciente
recibió terapia. La paciente no ha requerido medicación adicional
para su artritis reumatoide y actualmente se siente mucho mejor que
con la línea de base. Su enfermedad no está en fase de remisión
pero ahora puede tener una existencia relativamente normal y realiza
por sí muchas tareas de las que antes era incapaz. Se ha reducido
marcadamente el número de articulaciones dolorosas y delicadas como
también su puntuación global. Antes de la terapia, su CRP estaba
consistentemente entre 100 y 200 mg/l. Actualmente está entre 40 y
60 mg/l. El recuento de linfocitos está en el intervalo normal.
Paciente
2
El paciente era un varón de 62 años con una
historia de 30 años de artritis reumatoide nodular seropositiva. En
las terapias previas están incluidos oro intramuscular, penicilamina
y metotrexato. Nunca recibió esteroides orales. En el momento que
entró en el estudio estaba tomando intramuscularmente 25 mg de
metotrexato una vez a la semana y 150 mg de ciclosporina A
diariamente. Estaba menos incapacitado que el paciente 1, pero tenía
dificultades con la mayor parte de las tareas diarias. Se le había
prescrito un régimen de tratamiento de 10 mg del anticuerpo el día
1 y luego 20 mg los siguientes 4 días. El plan era de infundir
lentamente la primera dosis. Se le aconsejó suspender la
ciclosporina A pero continuar con el metotrexato durante la
terapia.
El día 1 se manifestó rigor después de 1 hora y
a las 8 horas se manifestó diarrea y vómitos que duraron otras 12
horas y que estaban asociados con una caída menor de la presión
sanguínea. Estos síntomas se trataron con hidrocortisona y
petidina. El día 2 se manifestó una erupción macular ampliamente
extendida que duró varias semanas. El tratamiento completo se
administró en el transcurso del tiempo establecido. No hubo efectos
adversos los días 2-5.
A diferencia del paciente 1, no había un
beneficio agudo del tratamiento y el día 22 empeoró su enfermedad,
requiriéndose una dosis intramuscular de metilprednisolona. Sus
dolores articulares eran refractarios al tratamiento con esteroides
parenterales. El día 42 se empezó con sulfasalazina, Ig bd, y
prednisolona 7,5 mg diariamente. Se continuó con metotrexato
intramuscular. La terapia con sulfadsalazin se interrumpió
aproximadamente el día 150 como resultado de dolores de cabeza y
recibió una dosis única de 80 mg de triamcinolona por inyección
intramuscular. A partir de este momento mejoró su enfermedad
sustancialmente. Él describió una caída completa de sus síntomas y
capacidad para tener una vida normal sin tener unas articulaciones
hinchadas o delicadas. Su CRP antes del tratamiento variaba entre
70 y 90 mg/l. Usualmente a los 18 meses del tratamiento está en el
intervalo normal (<10 mg/l) o es marginalmente elevado. El título
del factor reumatoide ha caído también de 1:1280 a 1:40. En
comparación con antes del anti CD3, ahora está tomando 7,5 mg de
prednisolona al día pero actualmente está estrechando la dosis de
esta medicación. Además, la prednisolona no era tan efectiva cuando
se comenzó el día 42.
Paciente
3
El paciente era un señor mayor refractario a
terapias reumatoides estándar que también tenía enfermedad cardíaca
isquémica y enfermedad obstructiva de vías respiratorias. Estaba
seriamente discapacitado. El plan era como el de un paciente pero
con premedicación el día uno con metilprednisolona.
La premedicación con metilprednisolona el día 1
no produjo reacción. El día 2, sin premedicación, el paciente tuvo
una severa diarrea e insuficiencia respiratoria. La infusión se paró
después de haber infundido aproximadamente un cuarto y no se dieron
más infusiones. No había evidencia de eficacia a corto plazo ni a
largo plazo (hoy, aproximadamente el día 300).
Paciente
4
El paciente era una mujer de 58 años con
artritis reumatoide seropositiva con una duración de 30 años.
Previamente había sido tratada con penicilamina, sulfasalazina,
ciclosporina A, hidroxicloroquina, metotrexato, leflunomida, que
fracasaron. Además de la artritis reumatoide, sufría diabetes
controlada con dieta y posible angina. La única terapia que estaba
tomando para su artritis reumatoide cuando fue admitida era 2,5 mg
de prednisolona al día. Estaba significativamente discapacitada por
su enfermedad y requería ayuda para vestirse, y también tenía una
movilidad.limitada. Raras veces salía de casa. Podía subir escaleras
y se esforzaba para lavarse y vestirse. La terapia planeada era 10
mg de anticuerpo los días 1-3 y 20 mg los días
4-5. La primera dosis estuvo precedida por 50 mg de
una proteína de fusión de IgG1 humano receptor de NF soluble como
profilaxis contra la reacción de la primera dosis. Durante la
primera infusión, sufrió broncoespasmo con cierto dolor de pecho.
Tenía mucha ansiedad y estaba periféricamente cianosada. La presión
sanguínea llegó a ser de 225/100 mm de Hg. Esta reacción se trató
con salbutamol nebulizado e hidrocortisona intravenosa.
Posteriormente tuvo rigor. Su temperatura alcanzó 39ºC durante la
infusión. Su segunda infusión fue premedicada usando
metilprednisolona y no fue complicada, como tampoco la tercera. El
día 4 se despertó con dificultad respiratoria y opresión en el
pecho, sufriendo seguidamente un ligero fallo cardíaco con un ECG
hisquémico. El elcocardiograma posterior reveló una moderada
regurgitación mitral con una atrio izquierdo dilatado. También había
una suave regurgitación aórtica en un ventrículo izquierdo
ligeramente dilatado. El perfil enzimático cardíaco era normal
durante los días de las infusiones y no había así evidencia de
infarto miocárdico al tiempo de tratamiento anti CD3. A pesar de la
mejora clínica en su actividad de RA (posiblemente secundaria a la
premedicación con TNFR-Ig), no recibió las
infusiones 4 y 5.
A aproximadamente dos semanas, tuvo serios
dolores de las articulaciones y el desarrollo posterior fue bastante
similar al del paciente 2 a corto plazo. Los síntomas de las
articulaciones eran refractarios a esteroides parenterales y
finalmente ella comenzó el día 35 con 20 mg de prednisolona al día.
Fue vista últimamente el día 90. Actualmente está tomando 10 mg al
día de prednisolona. Su CRP estaba entre 100-200 al
pretratamiento, inmediatamente después del pretratamiento cayó a 30
mg por litro el día 7 (lo que puede reflejar el concurrente bloqueo
de TNF-\alpha). Posteriormente el CRP subió a
niveles próximos a la línea de base. Desarrollo una linfocitosis
que se evidenció primeramente en torno al día 23 pero que se
resolvió posteriormente.
Cuatro pacientes fueron así tratados con anti
CD3\cdotaglicosilado. Dos de ellos con terapia completa (70 mg de
anticuerpo en total) y parece que tienen una buena respuesta a largo
plazo. El paciente 3 recibió menos de 13 mg divididos entre dos
infusiones y no ha habido obvios efectos beneficiosos. El paciente 4
recibió 25-30 mg en tres dosis. A los tres meses,
no hay evidencia de eficacia terapéutica pero se continúa el
seguimiento.
<110> Isis Innovation Limited
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<120> TRATAMIENTO DE UNA INFLAMACIÓN
CRÓNICA DE UNA ARTICULACIÓN
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<130> JIM/G17311WO
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<160> 18
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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\sa{Thr Ile Ser Thr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr
Arg Asp Ser Val Lys}
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Tyr}
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Val His}
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Val Gln Pro Gly Gly}
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Phe Thr Phe Ser}
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Trp Val Ser}
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Thr Leu Tyr Leu Gln}
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Val Tyr Tyr Cys Ala Lys}
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Ser}
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\sa{Asp Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser
Glu Ser Pro Gly Lys}
\sac{Thr Val Ile Ile Ser Cys}
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\sa{Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Arg Ala Pro Thr
Thr Val Ile Phe}
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\sa{Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp
Arg Ser Ser Asn Ser}
\sac{Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Thr
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr}
\sac{Tyr Cys}
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<213> rattus
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\sa{Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
Leu}
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Claims (24)
1. Uso de un anticuerpo anti CD3 para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de la
inflamación crónica de una articulación, en el que el anticuerpo
está constituido por fragmentos Fab o F(ab')_{2} o es un
anticuerpo mutado en la región Fc para prevenir la unión a
receptores de Fc.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el anticuerpo anti CD3 es un anticuerpo de IgG
aglicosilado.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación
2, en el que el anticuerpo aglicosilado tiene una afinidad de unión
para el complejo antígeno CD3 humano.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación
2 o 3, en el que el anticuerpo aglicosilado tiene regiones marco de
dominio variable que son de origen de rata o ratón o derivan de los
de origen de rata o ratón.
5. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en el que el anticuerpo aglicosilado tiene
CDRs que son de un origen diferente al de la región marco
variable.
6. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2, 3 o 5, en el que el anticuerpo aglicosilado
tiene regiones marco de dominio variable que son de origen humano o
derivan de los de origen humano.
7. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6, en el que el anticuerpo aglicosilado tiene
dominios constantes que son de origen de rata o ratón o derivan de
los de origen de rata o ratón.
8. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 7, en el que el anticuerpo aglicosilado tiene
CDRs de diferente origen al de la región constante.
9. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2-6 u 8, en el que el anticuerpo
aglicosilado tiene dominios constantes que son de origen humano o
derivan de los de origen humano.
10. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 9, en el que el anticuerpo aglicosilado tiene
una región constante que es un isotipo de IgG.
11. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 10, en el que el anticuerpo aglicosilado tiene
sólo uno de sus brazos con afinidad para el antígeno CD3.
12. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 11, en el que el anticuerpo aglicosilado es
monovalente.
13. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 12, en el que el anticuerpo aglicosilado tiene
la mitad del anticuerpo constituida por una cadena pesada completa y
una cadena ligera y la otra mitad está constituida por una cadena
pesada similar pero truncada que carece del sitio de unión para la
cadena ligera.
14. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo está en forma
de una composición farmacéutica que comprende un diluyente o
vehículo fisiológicamente aceptable.
15. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento es para uso
en un procedimiento en el que el anticuerpo se administra a lo largo
de un período de hasta 2 semanas sin posterior readministración
después de este período durante como mínimo 6 meses.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación
15, en el que el anticuerpo se administra a lo largo de un período
de 1 a 5 días.
17. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo se administra
junto con una sustancia que reduce la respuesta a la primera
dosis.
18. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento es para el
tratamiento de la sinovitis inflamatoria crónica.
19. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento es para el
tratamiento de la artritis reumatoide.
20. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento es para uso
en un tratamiento caracterizado porque da por resultado la
reducción de la inflamación local y sistémica.
21. Uso de acuerdo con la reivindicación
20, en el que el tratamiento se caracteriza porque se
invierte sustancialmente la inflamación local y sistémica.
22. Uso de acuerdo con la reivindicación 15
o 16, en el que el medicamento es para uso en un procedimiento en
el que el anticuerpo se administra a un ser humano adulto a una
dosis total de 50 a 100 mg.
23. Uso de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en el que el medicamento es para uso en
un procedimiento en el que el anticuerpo se administra junto con
otro agente terapéutico para el tratamiento de la inflamación
crónica de articulaciones.
24. Uso de acuerdo con la reivindicación
23, en el que el agente terapéutico adicional es un esteroide o un
anticuerpo anti TNF.
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