KR100491222B1 - 사람치료를 위한 재조합 항-cd4 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 실질적으로 비 T-세포 소모 활성을 갖는 사람 CD4 항원에 특이적인 키메라 항체, 이를 함유하는 DNA 코드화 약제 조성물 및 치료제로서의 용도에 관한 것이다. 이들 키메라 항체는 구세계 원숭이 가변 서열 및 사람 불변 도메인 서열, 바람직하게는 사람 감마 4 또는 이의 돌연변이 형태를 함유한다. 이들 항체는 낮은 항원성, 감소(또는 부재)된 T 세포 소모 활성, 사람 CD4에 대한 우수한 친화성 및 증대된 안정성(생체내 반감기)을 포함하는 바람직한 치료 특성을 갖는다.

Description

사람 치료를 위한 재조합 항-CD4 항체 {RECOMBINANT ANTI-CD4 ANTIBODIES FOR HUMAN THERAPHY}
본발명은 사람 치료에 유용한 CD4에 대한 특이적 재조합 항체 및 이러한 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
CD4는 대부분의 흉선 세포 및 일부의 말초 T 세포를 포함하는 T 림프구 계통의 세포상에서 주로 발현되는 표면 당단백질이다. 낮은 수준의 CD4가 일부 비림프계 세포에서도 또한 발현되기는 하지만, 이러한 확산 세포 분포의 기능의 유의성은 공지되어 있지 않다. 성숙한 T 세포상에서, CD4는 항원 제시 세포에서 발현되는 MHC 클래스 분자와의 상호작용을 통한 공동인지 기능을 갖는다. CD4+ T 세포는 바이러스, 박테리아, 균질 및 기생충 감염에 대한 T-의존적 반응시에 T 및 B 세포 기능을 조절하는 헬퍼 서브세트를 주로 구성한다.
자가면역 질환의 발병 동안, 특히 자가 항원에 대한 내성이 파괴됐을 때, CD4+ T 세포는 관절 및 조직 파괴를 유도하는 염증 반응에 기여한다. 이러한 작용은 조혈 계통의 염증 세포의 점증, 항체, 염증 사이토킨 및 매개체의 생성, 및 살세포의 활성화에 의해 촉진된다.
류마티스성 관절염(RA), 즉 활막의 염증 질환은 관절의 진무름, 변형 및 파괴를 초래하는 자가면역 현상중의 한 징후이다. 대부분의 자가면역 질환과 같이, RA의 병인은 충분히 밝혀지지 않았다. 그러나, RA는 이에 걸린 관절에서 활성화된 CD4+ T 림프구의 수준이 증가됨을 특징으로 한다. 일반적으로, RA에 대한 치료법은 없다. RA에 대한 제 1 라인 치료는 RA 증상을 경감시키고, 단기간에 걸쳐 작용 능력을 증가시키도록 설계되었다. 기초 질환을 표적으로 하는 아자티오프린, 메토트렉세이트 및 프레드니솔론과 같은 제 2 및 제 3 라인 면역억제제 및 스테로이드는 더욱 중증인 환자에 투여되어, 단지 약간 효과적이거나 만성 치료에 대한 허용될 수 없는 독성을 나타낸다. 또한, 상기 물질은 관절 파괴를 방지하지 못한다.
CD4+ 세포는 RA 이외에, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신성의 홍반성 루푸스 및 염증성 장질환을 포함하는 다른 만성 질환에 또한 관계되어 있다. 또한, CD4 발현은 다른 자가면역 질환에 관계될 수도 있다.
자가면역 질환의 발병 및 유지에 T 세포가 관여한다면, 면역억제는 중요한 치료법이 되었을 것이다. 시클로스포린 A와 같은 이용가능한 면역억제 약제는 이식 거부반응의 치료에 성공적으로 이용되어 왔다. 그러나, 이들의 부작용은 이들을 자가면역 질환의 만성 치료에 허용 불가능한 것으로 만들었다.
임상 세팅에서 CD4+ 서브세트를 포함하는 전체 T 세포 개체군의 제거(depletion)는 흉관 배액법, 총 림프구 방사선 조사 및 림프구 생성을 포함하는 방법에 의해 달성되며, 이는 일부 환자에게서 임상적 개선을 유도한다. 그러나, 통용되는 방법은 고형 기관 독성 또는 다른 주요 부작용을 초래하지 않으면서, 원하지 않는 면역 반응을 차단하는 보다 선택적인 제제에 초점이 맞춰진다. 달성될 수 이러한 방법은 모노클로널 항체(mAbs)로 T 세포를 매개함으로써 질병의 선택적 제거 또는 불활성에 의한 것이다. CD4에 대한 mAbs는 이러한 방법중 하나를 대표한다. CD4 mAbs는 이들이 예방 또는 치료학적으로 투여될 경우, 질병 진행을 정지시키거나 역행시킬 수 있다. 또한, RA, 건선, 염증성 장 질환 및 전신성 혈관염에서의 항-CD4에 대한 일부 임상 실험으로부터의 초기 결과는 잠재적인 치료학적 효과의 일부 예비적 증거를 제공한다.
실질적으로, 항-CD4 mAbs 치료의 목적은 특히, 자가면역 질환의 급성 단계 동안에 CD4+ 세포의 자멸 활성을 정지시키는 것이다. 최종적인 치료 목적은 기회 감염에 대한 보통의 숙주 방어를 손상시키지 않으면서, 기초 질환을 유지하는 면역학적 불응답(아네르기)의 상태 또는 발작 항원(또는 특이적 조직)에 대한 장기간 내성을 부과하는 것이다. CD4 mAbs는 RA 이외에, 다른 자가면역 질환, 예를 들어 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스, 건선, 염증성 장 질환 및 다발성 경화증(multiple sclerosis)의 치료에 또한 이로울 수 있다.
면역 치료법상으로서 항-CD4 mAbs의 잠재적 중요성 때문에, 수 많은 회사 및 연구 기관에서 잠재적 치료 제제로서의 항-CD4 mAbs가 연구되어 왔다. 예를 들어 센터코(Centercor)사는 CD4에 대한 키메라 뮤린 mAb인 센트라(Centra)로서 언급된 항-CD4 mAb를 보고하였다. 또한, 존슨 앤 존슨/오르토(Johson & Johson/Ortho)사는 OKT-4a 즉, 인간화된 뮤린 mAb인 항-CD4 mAb를 보고하였다. 또한, 부로우그스 웰컴(Burroughs Wellcome)사는 CD4에 대한 인간화된 뮤린 mAb인 항-CD4 mAb를 보고하였다. 또한, 산도즈(Sandoz)사 및 메드이뮨(MedImmune)(메릭(Merck)사와 공동으로)사는 CD4에 특이적인 항-CD4 뮤린-인간화된 mAb를 개발하였다. 또한, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 이뮤노티크(Immunotech) 및 베링거 만하임(Boehringer Mannheim)사는 모두 항-CD4 mAb를 개발하였다.
항-CD4 mAb 이외에, 다양한 면역조절제 및 약제가 RA 치료를 위한 잠재적 적용성을 지닌 것으로 발표된 바 있다. 이러한 면역조절제 및 약제는 예를 들어, 세포 부착 차단제, 사이토킨 수용체 차단제, 면역독소 및 T 세포 수용체 길항 물질을 포함한다. 특정 예는 감마 인터페론, 항-CAM-1(백혈구 운송, 부착을 차단하는 뮤린 항-CD54 mAb), 캄파스(Campath)-1H(래트-인간화된 항-CDw52 mAb), IL-1 수용체, cA2(TNF-알파 키메라 mAb), CDP 571(항-TNF mAb), 항-IL-2R(인간화된-뮤린 항-CD25 mAb), SDZ CHH 380(뮤린-사람 항-CD7 mAb), DAB486 IL-2(IL-2 융합 독소, CD4 및 CD8 세포에 비특이적), 안트릴(Antril)(IL-1RA), 항-TCR(T 세포 수용체 서브세트를 표적으로 하는 mAb 및 단백질) 및 코마짐(XomaZyme)-CD5(뮤린 항-CD5 독소 컨쥬게이트)을 포함한다.
또한, 자가면역 질환의 치료에 대한 잠재적 적용성을 갖는 다른 면역조절제 및 면역억제제는 라파마이신(경구 면역억제제), 테라펙틴(Therafectin), 레플루노미드(Leflunomide)(면역억제제 프러드러그), 테니댑(Tenidap)(사이토킨 조절제/CO-억제제), IMM-125 및 RS-61443(경구 면역억제제)를 포함한다.
상기에 언급한 바와 같이, 잠재적 치료학적의 적용성을 갖는 CD4에 대한 다수의 모노클로널 항체가 보고되었다. 대부분에 있어서, 이러한 항체는 뮤린 mAb, 키메라 또는 뮤린-인간화된 항체-CD4 mAb를 포함한다.
뮤린 모노클로널 항체는 백혈병, 림프종, 고형 종양(예를 들어, 결장, 가슴, 간장 종양), AIDS 및 자가면역 질환을 포함하는 급성 및 만성 사람 질환 모두의 치료를 위한 치료법으로서의 진단 및 임상적 실험에서 잠재적 유용성을 가진다. 그러나, 뮤린 항체는 뮤린 모노클로널 항체에 대한 숙주에서 면역 항체 반응을 종종 유도하기 때문에 불리하다.
마우스/사람 키메라 항체가 또한 보고되었다. 상기 항체는 사람 불변 영역과 관련된 부모 마우스 항체의 결합 특징 및 이펙터 기능을 포함한다. 문헌[Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Shoemaker et al., U.S. Patent No. 4, 978,775; Beavers et al., U.S. Patent No. 4,975,369; 및 Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,397]은 모두 본원에서 참고 문헌으로 인용되었다. 통상적으로, 상기 키메라 항체는 기존의 뮤린 하이브리도마로부터 추출된 DNA로부터 작성된 지놈 유전자 라이브러리로 구성되어 있다[참조 문헌: Nishman et al., 47 Cancer Research, 999 (1987)]. 그 후, 라이브러리는 정확한 항체 단편 재배열 패턴을 나타내는 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역 유전자에 대해 스크린되었다. 그 후, 클로닝된 가변 영역 유전자는 충분한 중쇄 또는 경쇄 사람 불변 영역 유전자의 클로닝된 카세트를 함유하는 발현 벡터로 라이게이션된다. 그 후, 키메라 유전자는 선택된 세포계통, 통상적으로 뮤린 골수종 계통에서 발현된다.
그러나, 이러한 키메라 항체가 사람 치료에 이용된다 하더라도, 이들은 또한 일부 문제를 갖는다. 뮤린 모노클로널 항체와 유사하게, 사람 수용자는 키메라 항체에 대한 항체를 생성할 수 있다. 이것은 키메라 항체로의 계속된 치료의 효능에 불리하다.
통상적인 키메라 항체에 대한 개선에 있어서, 일부 연구가는 이러한 문제를 일으키지 않는 사람 모노클로널 항체를 제조하기 위한 방법을 발견하였다. [참조 문헌: Erlich et al., 34 Clinical Chemistry, 1681 (1988); Erlich et al., 7 Hybridoma, 385 (1998); Erlich et al., 6 Hybridoma, 151 (1987) 및 Erlich et al., 1 Human Antibody Hybridomas, 23 (1990)]. 상기 참조 문헌은 또한 비사람 영장류 항체, 예를 들어 침팬지 모노클로널 항체가 사람 항체와의 구조적 유사성 때문에 사람에서 우수한 내성을 갖는다는 것을 가설로 한 것이다. 그러나, 사람에서 항체 생성은 도덕적으로 금기된다.
사람 항체가 붉은 털 원숭이에서 비 면역원성이기 때문에(즉, 항체 반응을 야기하지 않음), 엘리크(Erlich) 등은 또한 영장류 항체가 사람에서 비면역원성일 거라고 예견했다. 엘리크 등(Id.)은 영장류 항체가 사람 면역글로불린의 항체와 동일한 불변 영역을 갖거나, 적어도, 서로 다른 사람의 항체 구조가 서로 상이한 정도로 구조가 사람의 면역글로불린과 상이하다면, 사람에서 항체의 시험은 불필요하다는 것을 지적하였다. 따라서, 이들은 침팬지 항체가 사람 치료에 유용할 수 있음을 암시한다.
사람에서 종종 항원성인 공지된 키메라 항체에 대한 개선은 본원에서 참조 문헌으로 인용된 U.S 출원 번호 제 08/476,237호(1995년 6월 7일 출원), 제 08/347,072호(1995년 1월 25일 출원), 제 07/912,212호(1992년 7월 10일 출원), 제 07/856,281호(1992년 3월 23일 출원) 및 제 07/735,064호(1991년 7월 25일 출원)와 관련되어 있으며, 구세계(Old World) 원숭이(예를 들어, 비비 또는 짧은 꼬리 원숭이) 모노클로널 항체 및 이들로부터 유도된 키메라 항체의 제조가 구세계 원숭이 항체의 가변 도메인을 함유하는 재조합 방법에 의해 생성되고, 클로닝된 사람, 침팬지 또는 다른 원숭이 불변 영역 또는 다른 원숭이 프레임워크 영역에 융합시키는 방법이 설명되어 있다. 특히, 상기 출원에는 사람 항원에 대한 상기 구세계 원숭이 항체 및 이들로부터 유도된 키메라 항체의 제조 및 사람 질병의 치료를 위한 면역치료학적 제제로서의 이러한 키메라 재조합 항체의 사용법이 설명되어 있다.
상기 출원들은 침팬지와는 달리, 진화적으로 거리가 있는 원숭이(예를 들어, 비비 또는 짧은꼬리원숭이(게잡이 원숭이 및 붉은 털 원숭이를 포함))는, 이러한 원숭이에서 예를 들어 CD4 및 CD54와 같이 비교적 보존적인 사람 항원에 대해서 조차 사람 항원에 대한 항체를 허용할 만큼 충분히 사람과 상이하며, 사람 항체와 구조적으로 유사한 항체를 가질 만큼 충분히 사람과 유사해서, 이러한 원숭이 항체 또는 이들로부터 유도된 재조합 키메라 항체가 사람으로 도입됐을 때, 숙주 항-항체 반응이 일어나지 않는다는 놀라운 발견에 기초한다.
상기 출원들에는 공지된 키메라 항체를 포함하는 사람 치료에 이용된 일부의 종래 항체와 달리, 이러한 키메라 항체는 몇가지 단점, 예를 들어, 1) 만성 질환을 치료하는데 필요한 반복 투여에 대한 사람 항-항체(HAA) 반응의 면역원성 및 유도, 2) 사람 항체와 비교하여 비교적 짧은 반감기, 및 3) 사람 세포 또는 보체화의 이펙터 작용 결여와 같은 단점을 받지 않는다.
이러한 단점의 결여는 사람 치료에 있어서 아주 유리하다. 예를 들어, 자가면역 질환, 또는 항체의 장기 투여를 필요로 하는 또 다른 질병을 포함하는 만성 사람 질환의 경우, 반복적인 항체 치료에 대한 주요한 장애 중 하나는 치료 항체에 대한 숙주 반응이다. HAA 반응은 한 환자로부터 또 다른 환자에서 종종 예측할 수 없다. 또한, 이러한 반응은 항체 분자의 불변 영역 대해, 배타적이지는 않지만 두드러지게 유도되고, 상기 반응은 항체 또는 동일한 이소타입의 또 다른 항체를 이용한 치료 효과를 방해하거나 감소시킨다. 상술된 출원들에 설명된 재조합 키메라 항체는 이러한 문제를 피할 수 있으며, 적합한 특이성 및 원하는 이펙터 기능의 항체의 생성을 허용하고, 재조합 항체의 생성에서 상기 항체를 이용할 수 있다.
상기 재조합 항체는 항원 결합에 필요한 면역화된 원숭이로부터 유도된 항체의 가변 영역 및 사람 또는 침팬지로부터의 항체의 불변 영역의 적합한 부분을 포함한다. 따라서, 이들은 사람 또는 침팬지 불변 영역의 적합한 선택에 의해 원숭이 모노클로널 항체의 특이성 및 고친화도, 및 원하는 이펙터 기능의 유지를 가능케 한다.
이러한 관련 출원 중 몇몇은 특히 CE9.1로 언급되는 CD4에 대한 특이성을 갖는 원숭이/사람 키메라 항체를 예증하며, 상기 항체는 게잡이 원숭이 및 사람 면역글로불린 경쇄 람다 불변 영역에서 생성된 항-CD4 모노클로널 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인, 및 사람 면역글로불린 중쇄 감마 1 불변 영역을 함유한다. 상기 항체는 일부 T 세포 제거 활성을 갖지만, 이전의 CD4 모노클로널 항체와 비교해 볼 때 더 낮은 활성을 갖는다. 그러나, 보다 낮은 활성을 갖거나 T 세포 제거 활성이 없는 항체를 제조하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이것이 상기 항체의 치료학적 가능성을 향상시킬 수 있기 때문이다.
또한, 상기 출원들에는 이러한 키메라 항체, 특히 하기 특징을 포함하는 TCAE 5.2 및 TCAE 6의 제조에 바람직한 벡터 시스템이 설명되어 있다:
1) 직렬식의 4개의 전사 카세트:
(a) 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역: TCAE 5.2에서, 이들은 사람 면역글로불린 카파 경쇄 불변 영역(카바트(Kabat) 번호 아미노산 108 내지 214, 알로타입 Km 3)이고, TCAE 6에서는 사람 면역글로불린 경쇄 람다 불변 영역(카바트 번호 아미노산 108 내지 215, 유전자형 Oz 마이너스, Mcg 마이너스, Ke 마이너스 알로타입)이다.
(b) 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 두 구조물 모두에서 사람 면역글로불린 중쇄가 감마/불변 영역(카바트 번호 아미노산 114 내지 478 알로타입 Gm1a, Gm 12)이다.
(c) DHFR; 이들 자신의 진핵세포 프로모터 및 폴리아데닐화 영역 함유; 및
(d) NEO; 또한 이들 자신의 진핵세포 프로모터 및 폴리아데닐화 영역 함유.
2) 사람 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카세트는 면역글로불린 사슬의 분비를 위한 합성 시그날 서열을 함유하며;
3) 사람 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카세트는 특이적 DNA를 함유하며, 상기 DNA는 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 가변 영역의 삽입을 허용하고, 번역 리딩 프레임을 유지시키며, 면역글로불린 사슬에서 통상적으로 발견되는 아미노산을 변화시키지 않는다.
그러나, 상기에서 설명된 바에도 불구하고, 당분야에서 여전히 CD4에 특이적이고, 사람에서 낮은 항원성을 지닌 개선된 항체가 필요하며, 이는 예를 들어, 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환의 치료에 치료학적으로 이용될 수 있다. 특히, 개선된 특성, 예를 들어 더 긴 반감기를 나타내고/거나 실질적으로 제거 활성이 결핍되거나 결여된 항-CD4 항체를 제조하는 것이 필요하다.
본 발명의 목적
이 부분에 있어서, 본 발명의 목적은 개선된 특성, 예를 들어 보다 긴 반감기, 사람에서 보다 낮은 면역원성 및/또는 T 세포 제거 활성의 감소 또는 부재의 특징을 갖는, CD4에 특이적인 신규한 모노클로널 키메라 항체를 제공하는 데에 있다. 특히, 본 발명의 목적은 CD4, 및 사람 또는 원숭이 불변 도메인 서열에 특이적이고, 특히 감마 4 이소타입에 걸쳐 변형된 이펙터 기능 및 개선된 안정성을 갖는 사람 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 및 사람 감마 1, 감마 4 또는 변형된 감마 4 사람 중쇄 불변 영역 서열에 특이적인 구세계 원숭이 면역글로불린의 항원 인지 부분을 함유하는 항-CD4 키메라 항체를 제조하는 데에 있다.
본 발명의 더욱 구체적인 목적은, 원숭이 및 사람 불변 도메인 서열, 바람직하게는 사람 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 서열 및 사람 감마 1 또는 감마 4 불변 도메인 서열 또는 감마 4 이소타입에 비해 변형된 이펙터 기능 및 개선된 안정성을 갖는 사람 돌연변이된 감마 4 중쇄에 융합된, 도 1에 도시된 특이적 원숭이 항-CD4 가변 중쇄 서열 및 도 2에 도시된 원숭이 항-CD4 가변 경쇄 서열을 함유하는 신규한 모노클로널 키메라 항체를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이러한 개선된 키메라 항-CD4 항체 및 벡터, 및 상기 키메라 항-CD4 항체의 발현에 이용될 수 있는 벡터 및 숙주 세포를 제공하는 데에 있다. 바람직하게는, 이러한 벡터는 본원에서 참조문헌으로 인용된 출원에서 참조된 발현 벡터를 포함할 것이며, 숙주 세포는 CHO 세포가 바람직할 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CD4가 관련된 질병, 특히 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 데에 있으며, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 예방 또는 치료학적 유효량의 본 발명의 개선된 키메라 항-CD4 항체를 함유한다.
본 발명의 또 다른 목적은 CD4 관련 질병, 특히 자가면역 질환 및 다른 질환의 치료법 또는 예방법을 제공하는 데에 있으며, 여기에서, 면역억제는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께, 예방 또는 치료학적으로 유효량의 본 발명의 신규한 키메라 항-CD4 항체의 투여에 의한 것이 바람직하다.
도면의 간단한 설명
도 1은 CE9.1의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한 것이다.
도 2는 CE9.1의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한 것이다.
도 3은 CE9.1에서 사람 람다 가변 및 불변 도메인의 아미노산 서열 및 DNA 서열을 도시한 것이다.
도 4는 중쇄 가변 및 불변 감마 4 서열을 코드화하는 DNA 및 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 5는 E 돌연변이를 함유하는 사람 중쇄 감마 4를 코드화하는 DNA 및 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 6은 P 및 E 돌연변이를 함유하는 사람 중쇄 감마 4를 코드화하는 DNA 및 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 7-1, 7-2 및 8은 본 발명에 유용한 다양한 리더 서열의 핵산 서열을 도시한 것이다.
도 9는 신선한 사람 PMNC에 CE9.1가 결합하는 스캐터그램(scattergram)을 도시한 것이며, 여기에서 정 사분면의 패널 A는 CE9.1 및 OKT3으로 이중으로 염색된 림프구를 나타내며, 패널 B는 CE9.1 및 OKT4로 이중으로 염색된 집단을 나타내며, 패널 C는 CD8 및 CE9.1로 이중으로 염색된 세포의 부재를 나타내며, 패널 D 대조군은 정상적 및 사람 IgG로 얼룩진 세포를 나타낸다.
도 10a, 10b 및 10c는 CE9.1의 Fc 수용체 결합 특성을 도시한 것이며, 여기에서 측정은 a) IFN 유도된 신선한 단핵세포(여기에서, 네거티브 대조군으로 CE9.1의 F(ab')2 단편이 이용됨), b) IFN 유도되거나 유도되지 않은 신선한 단핵세포 및 c) sCD4의 존재하 또는 항체의 부재하에서의 INF 유도된 신선한 단핵세포를 갖는 결합 섬유아세포의 CD4+ 응집의 유세포 히스토그램(flow cytometric histogram)을 도시한 것이다.
도 11은 CE9.1에 의한 사람 혼합 림프구 반응의 억제를 도시한 것이며, 여기에서 a) 신선한 사람 PBL은 반응제로서 이용되고, 관련되지 않은 제공자로부터 마이토신 C-처리 자극제 세포는 CE9.1의 농도 범위 억제 특성을 시험하기 위해 이용되며, 억제는 IL-2 생성물의 티미딘 혼입의 양에 의해 측정되고, b) 침팬지 반응제 및 관련되지 않은 침팬지 자극제(Leu3a, 뮤린 항-사람 CD4)를 이용하는 MLR을 대조군으로서 이용하였다.
도 12는 CE9.1의 항체 의존 세포의 세포독성를 도시한 것이며, 여기에서 인터페론의 존재하에 SupT-18 표적 세포의 용해는 이펙터 세포를 자극하고, 4D9는 뮤린 항-CD4 모노클로널 항체 IgG2a이다.
도 13은 CE9.1의 존재 및 부재하에 SupT1-18 세포로의 C1q 결합의 유세포 히스토그램을 도시한 것이며, 여기에서 10,000 이벤트가 기록되었고, 결과를 막대그래프로서 나타내었고, PR0945는 높은 항-CD4 혈청 적정 농도를 갖는 원숭이로부터의 폴리클로널 항체이고, 네거티브 대조군은 CE9.1의 존재하에 C1q 및 항-C1q이다.
도 14는 CE9.1의 보체 의존적 세포독성 분석을 도시한 것이며, 여기에서 세포독성은 CE9.1 및 토끼 보체의 존재하에서 SupT-18 세포의 용해이며, 4D9는 보체에 고정될 수 있는 서브클래스 IgG2a의 뮤린 항-CD4 대조군이며, PR0965는 높은 항-CD4 적정 농도를 갖는 게잡이 원숭이의 혈청으로부터의 항체의 폴리클로널 혼합물이다.
도 15는 여섯 마리 침팬지에서 고용량 약리 연구를 도시한 것이며, 여기서 말초혈에서의 CD4, CD8 수준은 150 내지 300일 기간에 걸쳐 발현되며, CD4 조절 세포의 수를 나타낸 CD3-CD8 곡선이 또한 도시되어 있다; 상부 패널: 그룹 1 - 모니터된 침팬지 수. 화살표는 CE9.1 투여량을 나타낸다. (2) 식염 대조군, 중간 패널: 그룹 2 - 10mg/kg의 CE9.1을 수여받은 침팬지(2). CD4의 수가 바셀린의 30%내로 다시 되돌아 왔을 때, 투여를 반복한다. 하부 패널: 그룹 3 - 10mg/kg의 CE9.1를 수여받은 침팬지(2). CD4의 수가 바셀린의 70% 내로 다시 돌아왔을 때, 투여를 반복한다.
도 16은 사람 4 불변 영역을 수득하기에 적합한 PCR 프라이머를 도시한 것이다.
도 17은 CE94PE 중쇄 서열을 도시한 것이다.
도 18은 CE9.1, CE94(G4), CE94E(G4E) 및 CE9PE(G4PE)의 비환원 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 도시한 것이다. 할프머(halfmer) 분자는 약 80kD의 분자량을 나타낸다.
도 19는 SPR 진행 곡선의 연합 및 해리에 대한 데이터를 함유한다.
도 20은 1차 MLR에서 CD4 mAb 구성물의 효과를 도시한 것이다.
도 21은 CD4+ 섬유아세포 트랜스펙턴트(transfectnat)로의 IFN- 유도된 단핵세포주 THP-1의 부착을 도시한 것이다.
도 23은 CE94PE, CE9.1 및 HuCD4에 대한 뮤린 고정 mAb를 이용하는 CDC 및 ADCC 결과를 도시한 것이다.
도 24는 마우스 스프라그-도울리(Sprague-Dawley)쥐에서 1mg/kg의 CE94E 및 CE94PE의 환약을 투여한 후 플라스마 농도를 도시한 것이다.
도 25는 HuCD4 트랜스제닉 마우스에서 난알부민-특이적 항체 반응에서의 mAb로 치료하는 효과를 도시한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 원하는 원숭이 또는 사람 불변 도메인 서열, 바람직하게는 감마 1, 감마 4 또는 돌연변이된 감마 4 사람 중쇄 불변 도메인 및 사람 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 서열에 융합된, 구세계 원숭이 항-CD4 모노클로널 항체의 가변 영역의 항원 결합 부분을 함유하는 CD4에 특이적인 신규한 모노클로널 키메라 항체를 제공한다. 이러한 항체는 통상적인 항-CD4 모노클로널 항체에 관하여 개선된 특성, 예를 들어 사람 CD4에 대해 높은 친화도를 나타내고, 사람에서 면역원성을 거의 갖지 않거나 완전히 갖지 않는 특성을 나타낸다. 감마 4 버전은 이펙터 기능, 예를 들어 Fc 수용체 결합 활성 또는 보체 고정의 감소 또는 부재를 나타내고, T 세포 제거 활성(T cell depleting activity)을 거의 갖지 않거나 완전히 갖지 않는다.
CD4에 특이적인 구세계 원숭이 모노클로널 항체를 수득하기 위한 방법 및 CD4에 특이적인 구세계 원숭이 모노클로널 항체를 생성하는 클론은 본원에 참고 문헌으로 인용된 상기 참조된 관련 특허 출원에서 알아낼 수 있다.
통상적으로, 이들은 구세계 원숭이가 항-CD4 항체를 생성하는 것과 같은 조건하에 사람 CD4에 대한 구세계 원숭이 면역화; 및 예를 들어, 하이브리도마 융합, 헤르페스 파피오(Herpes papio)를 이용한 바이러스 형질전환, 단일 B-세포 클로닝(또한 "일과성 불멸화"로 불림) 및 재조합 면역글로불린의 라이브러리의 생성에 의해 항-CD4 항체 생성을 초래하는 원숭이 세포의 불멸화를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이 방법은 말초혈 백혈구, 지라, 골수 및 림프절로부터의 원숭이의 B-세포 선택; 적합한 항체를 생성하는 코어 선택; 불멸화된 세포주로부터 항체를 코드화하는 면역글로불린 유전자 구제; 및 생산자 세포주(즉, 사람 치료에 유용한 항체를 충분히 생산할 수 있는 세포주)에서 유전자 발현을 포함한다. 상기 참조된 문헌에 정의된 바와 같이, 구세계 원숭이는 비비 및 짧은 꼬리 원숭이(붉은 털 원숭이 및 게잡이 원숭이를 포함)를 포함한다.
상기에서 언급한 바와 같이, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 키메라 항체는 사람 불변 도메인 서열로 융합되는 도 1 및 도 2에 도시된 항-CD4 구세계 원숭이 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함할 것이다. 이러한 특이적 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인 서열을 수득하기 위한 적합한 방법은 U.S 출원 제 08/476,237호(1990년 6월 7일 출원), 제 08/397,072호(1995년 1월 25일 출원) 및 제 07/912,292호(1992년 7월 10일 출원)에 설명되어 있고, 이들 모두는 본원에 참조 문헌으로 이용되었다. 또한, 상기 출원에는 상기 서열의 전체 핵산 및 아미노 서열이 기록되어 있다.
이러한 가변 중쇄 도메인 서열은 임의의 원하는 사람 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 특정 선택이 생성 키메라 항-CD4 항체의 이펙터 기능에 영향을 미칠 것이다. 바람직하게는, 사람 중쇄 불변 도메인은 감마 1, 감마 4, 또는 본원에서 감마 4E로서 언급된 변형된 감마 4 불변 도메인 또는 본원에서 4PE로 언급된 변형된 감마 4를 포함할 것이다. 감마 4의 선택은 유용한데, 그 이유는 T 세포가 부족하거나 실질적으로 T 세포 제거 활성이 부족한(감마 1와 비례하여 80 내지 100%) 키메라 항체를 생성하는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 이것은 감마 4 불변 도메인이 보체에 결합할 수 없기 때문인 것으로 여겨진다. 또한, 불변 도메인은 생성 키메라 항체의 특성, 예를 들어 안정성을 향상시키기 위하고/거나 제거 활성을 제거하기 위해 변형될 수 있다. 특히, 하기에 설명된 감마 4 도메인의 P 및 E 변형은 안정성이 향상된 활성을 제공하고 제거 활성을 제거하는 힌지(hinge) 영역에서 감마 4의 변형이다. 또한, 다른 변형은 향상된 특성을 갖는 키메라 항체를 제공하는 것으로 예상된다.
주요 키메라 항-CD4 항체에 함유된 사람 경쇄 불변 도메인이 사람 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 사람 람다 경쇄 불변 영역이다. 사람 감마 1, 감마 4, 카파 및 람다 불변 도메인을 코드화하는 아미노산 및 DNA 서열이 또한 당분야에 공지되어 있다. 또한, 사람 감마 4, 및 E 및 PE 돌연변이에 대한 아미노산 및 핵산 서열, 및 람다 불변 도메인 서열이 도 4 내지 6 및 도 3에 각각 도시되어 있다.
본 발명의 예시된 구체예는 사람 IgG1의 불변 도메인과 함께 사람 sCD4-면역화된 게잡이 원숭이로부터 수득된 항원 결합 도메인을 함유하는 CE9.1로 언급된 특이적인 키메라 항-CD4 모노클로널 항체 및 이들로부터 유도된 모노클로널 키메라 항체, 예를 들어 CE94, CE94K, CE94E, 및 CE94PE를 포함하며, 상기 유도된 모노클로널 키메라 항체는 CE9.1의 동일한 항원 결합 도메인을 가지지만, 유전공학에 의해 조작된 사람 IgG4 Fc 결합 도메인 프레임워크를 갖는다. 모노클로널 항체 CE94E는 항체의 힌지 영역 근처에서 류신이 글루탐산으로 치환된 돌연변이(L236E)를 함유한다(E 변형). 모노클로널 항체 CE94PE는 상기 류신이 글루탐산으로 치환된 돌연변이 및 세린이 프롤린으로 치환된 돌연변이(S229P)를 함유한다("E" 및 "P" 변형). CE94K 항체는 사람 K에서 사람 서브타입까지의 이들의 경쇄 불변 영역의 대체에 의해 CE94와 다르다.
IgG 항체의 생물학적 반응이 이들의 카르복시-말단 도메인의 조성물 즉, 이들의 이소타입에 의존적인 것으로 공지되어 있기 때문에, 상기 불변 도메인 스위치 및 돌연변이가 생성된다. 따라서, 단백질 공학에 의한 항체 이소타입의 변형에 의해, IgG 항체, 더욱 상세하게는 주요 키메라 항-CD4 모노클로널 항체의 생물학적 반응을 변형시키는 것이 가능할 수 있다.
이러한 공학적 방법의 바람직한 성과는 항체의 Fc 부분의 이소타입 스위칭이 Fab 영역과 결합하는 CD4 항원의 결합 친화도를 감소시키지 않는다는 것이다. 그러나, 이것은 처음부터 공지된 것은 아니다. 따라서, 불변 영역의 변화 및 이들의 변형이 CD4 결합에 악영향을 미칠 수 있다는 것이 가능하였다. 따라서, 생성된 항체는 항체 특성, 특히 CD4 항원 결합 특성에 대한 변형의 효과를 측정하기 위해 분석되었다. 항원 결합에 대한 불변 도메인 스위칭의 가능한 효과를 측정하기 위해 공지된 분석법이 이용될 수 있다. 특히, CD4와 CE9.1, CE94, CE94k, CE94E 및 CE94PE 사이의 상호작용의 연구는 스캣차드(Scatchard) 분석 및 표면 플라스몬 반응(SPR)에 의해 수행되었다. 이러한 분석의 결과는 시험된 항체 각각에의 CD4 결합이 동일함을 입증하였다. 25에서 항체에 결합한 CD4의 평균 해리정수는 약 1.0nanomolar 인 것으로 SPR에 의해 밝혀졌다. 또한 측정은 하기 사항을 입증한다:
1) 항체에의 CD4 결합은 2-부위에 독립적이고 동일한 결합 모델에 의해 발생하며,
2) 항원 결합 도메인의 기능성 결합 특성은 감마 1, 감마 4, 또는 변형된 감마 4 이소타입을 포함하는 항체의 Fc 부분에 대해 생성된 구조적 변형에 독립적이다. 따라서, 본 발명은 IgG1과 IgG4사이의 이소타입 스위칭이 항원 결합 특히 CD4에 대한 항원 결합 친화도의 손실 없이 처리 항체의 방법에 유용할 수 있다.
또한, 하기에 언급되는 바와 같이, 감마 1 불변 도메인을 감마 4로의 대체는 실질적으로 Fc 수용체 결합, 보체 고정 및 T 세포 제거 활성을 감소시키고, 또한 E 및 P 변형은 각각 Fc 수용체 결합 및 T 세포 제거 활성을 추가로 제거하고, 향상된 항체 활성을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라 생성된 다른 키메라 항체(사람 감마 4 불변 도메인 또는 이들의 변형된 형태로 처리된 항체)가 T 세포 제거 활성을 실질적으로 결핍시키거나 완저히 제거되고/거나 향상된 안정성을 나타내는 변형된 Fc 이펙터 기능이 선택될 수 있음을 추측하는 것은 합당하다. T 세포 제거 활성, Fc 이펙터 기능 및 항체 안정성의 분석법이 당분야에 공지되어 있다.
따라서, 본 발명은 개선된 특성, 예를 들어, 낮은 T 세포 제거 활성 및 보다 향상된 안정성을 나타내는 사람 CD4 항원에 대해 유도된 영장류/사람 키메라 모노클로널 항체인 특이적 재조합 항체를 제공한다. 상기 특성이 제공된 상기 재조합 항체는 면역-조절인자로서의 특정 유용성을 가지며, 류마티스성 관절염, 건선, 전신 홍반성 루푸스(SLE) 뿐만아니라, 이식편대숙주병(GVHD), 이식 거부증, 천식 및 HIV와 같은 비자가 면역 징후의 치료에 특히 유용하다. 또한, 본 발명의 항체는 유전자의 치료에서 보조제로서 유용성을 갖는다. 특히, 본 발명의 항체는 벡터(치료학적 DNA 함유)의 투여 전, 동시 또는 후에 투여되어, 상기 벡터에 대한 숙주 체액성 반응을 방해하거나 감소시킬 수 있다. 상기 질병은 CD4 관련 질병이다.
실시예에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, CE9.1 재조합 항체는 게잡이 원숭이로부터의 항원 결합 가변 Fv 도메인을 사람 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 도메인으로 이식시킴으로서 생성되었다. 더욱 상세하게는, CE9.1 항체는 사람 감마 1 도메인, 람다 불변 도메인을 함유한다. CE94, CE94K, CE94E 및 CE94PE는 감마 4 불변 도메인 또는 이들의 변형된 형태, 및 람다 또는 카파 불변 영역을 함유한다. 생성 재조합 항체 서열은 사람 면역글로불린 서열과 구별할 수 없다. 그 결과, 상기 항체 및 다른 CD4 항체는 유사한 방법에 의해 제조되며, 사람에서 생체내 투여되는 경우, CD4로부터 유도된 마우스-사람 키메라 항체와 비교하여 감소된 면역원성 또는 비 면역원성, 및 유사한 뮤린 모노클로널 또는 더 낮은 혈청 제거율을 나타낸다.
CE9.1 항체는 사람의 도메인 1에 결합하지만, 항원 표출 세포상의 MHC 클래스 분자와의 상호작용에 관련된 영역인 짧은 꼬리 원숭이의 CD4에는 결합하지 않는다. 또한 분석은 다른 예시된 항체가 CE9.1로서의 동일한 항원 결합 특성을 포함함을 입증한다.
잠재적인 면역조절 활성은 생체 내 및 생체 외 모두의 CE9.1 항체를 이용하여 관찰되었다. 주어진 이러한 특성, 즉 뮤린 또는 설치 동물로부터 유도된 기타의 공지된 항-사람 CD4 mAb와 비교하여 감소된 면역원성, 더 낮은 혈청 제거율 및 잠재적인 면역조절율을 갖는 상기 항체 및 본원에서 설명된 다른 항체는 면역억제가 요구되는 질환, 예를 들어 자가면역 질환 및 류마티스성 관절염과 같은 만성 염증과 같은 질환의 오랜 기간의 치료에 적합하다. 그러나, 상기 항체는 많은 다른 질병, 예를 들어, 하시모토 갑상선염, 제 1 형 점액 수종증, 갑상선 중독증/그레이브스 병, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 병, 조기 폐경증, 타입 -당뇨병, 구드패스츄어 증후군, 중증근무력증, 다발성 경화증, 남성 불임증, 심상성 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 파코제닉(phacogenic) 포도막염, 자가면역 용혈 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 특발성 백혈구감소증(leucopenia), 제 1기 담즙성 간경변, 활성 만성 간염(HBs Ag 네거티브), 잠복성 경변증, 염증성 장 질환 증후군, 쇼그렌 증후군, 건선, 류마티스성 관절염, 피부근염, 피부경화증, 혼합성 결합조직 병, 원반 홍반성 루푸스, 전신성 맥관염 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 포함하는 질병의 치료에 유용한 것으로 예상된다.
상기에 논의된 바와 같이, 류마티스성 관절염(RA)는 관절의 진무름, 변형 및 파괴를 유도하는 자가면역 현상의 한 징후를 포함하는 활액의 염증 질환이다. 대부분 자가면역 질환에 있어서, RA의 병인은 잘 정의되지 않지만, 침범된 관절에서 활성화된 CD4+ T-림프구의 증가된 수준을 특징으로 한다. 현재, RA를 치료법은 없으며, 질병을 쇠약하게 하는 치료법이 단지 짧은 기간에 걸친 증상의 경감 및 기능적 능력의 개선을 제공하기 위해 설계되었다. 또한, 근원적인 질병에서 제 2 및 제 3 라인 면역억제제, 및 아자티오프린, 메토트렉세이트 및 프레드니솔론 아미드와 같은 스테로이드는 단지 병이 더욱 심한 경우에 제공되며, 만성 치료에 사용될 경우, 통상적으로 약간 효과적이거나 허용될 수 없는 독성을 나타낸다. 이와 반대로, 주요 항체가 뮤린 또는 설치 동물에서 유도된 다른 공지된 항-사람 CD4 mAb와 비교해서 감소된 면역원성, 더 길어진 반감기 및 효능 있는 면역조절 활성을 나타낸다는 사실이 제공된 연장되고 만성인 투여에 적합할 것이라는 것이 예상된다.
본질적으로, 예시된 상기 출원에 설명된 재조합 항-CD4 모노클로널 항체 또는 상기 출원을 참조 문헌으로 인용한 본 발명에 따라 제조된 다른 항체는 특히 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환의 급성 상태동안 CD4+ 세포의 파괴 활성을 정지시키거나 변형시킴으로서 치료학적 활성을 조정할 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 항체 투여는 면역학적 비반응성(아네르기)의 상태, 또는 기회주의적 감염에 대한 정상적 숙주 방어를 절충시키지 않고 근원적 질병을 유지하는 손상 항원(또는 특이적 조직)에 대한 장기간의 내성을 유도할 것이다. RA는 별문제로 하고, CD4 모노클로널 항체는 상기 동일한 질병의 치료에 유익하며, 인슐린 의존 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스, 경변증(cirrhosis), 염증성 장 질환, 다발성 경화증 및 다른 자가면역 질환의 치료에 대한 특정한 적용이 가능하다. 또한, 이들은 백혈병 림프종 이식편 대 숙주 질환, 이식 거부반응, 천식 및 HIV의 치료에 유용하다.
본 발명에 따라 제조된 재조합 항-CD4 모노클로널 항체는 하기 메카니즘 중 하나 이상을 통하여 원하는 생체내 치료학적 효과를 조정할 수 있다:
1) MHC 클래스 2 분자와 CD4의 상호작용 차단;
2) 세포 표면 CD4의 하향 조절;
3) 아네르기 및/또는 아폽토시스 유발;
4) CD4 세포의 제거; 또는
5) 자가항원에 대한 내성의 유도.
CD4+ 세포의 일시적 제거가 면역억제 및 아마도 다른 과활성적 면역 시스템의 정상화를 유도함에도 불구하고, 항-CD4 항체가 이들의 생체내 효과를 나타내는 주요 메카니즘이 반드시 T 세포 제거에 의존적인 것은 아니다. 오히려, CD4 분자에 대한 항체 결합이 항원-특이적 T 세포 아네르기 또는 내성을 유도하는 T 세포 수용체에 결합하는 항원에 의해 헬퍼(helper) T 세포 활성을 방해하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 사람 감마 1 도메인을 포함하는 CE9.1 항체는 실질적인 면역억제 활성을 나타낸다. 그러나, 침팬지에서 CD4 세포를 단지 부분적으로 제거시킨다. 또한, 사람에서의 생성물은 임상 시험에서 상기 항체가 다른 모노클로널 항체와 비교하여 실질적으로 더 적은 세포 제거를 유도함을 나타낸다.
또한, 생체내 실험 모델에서, 타가 이식 특이적 내성은 이식할 때 투여된 비제거 항-CD4 항체에 의해 유도되어 왔다. 내성 상태의 유지는 항-CD4 항체 제거를 필요로 하지 않지만 항원의 계속된 존재에 의존적으로 나타난다. 항-CD4 항체를 이용한 간단한 처리 스케줄은 일반화된 면역억제의 부재하에 오래 지속되는 임상적 개선점을 유도하는 자가 항원에 대한 헬퍼 T 세포 반응을 방해할 것이다.
주요 출원에 함유된 정보에 기초하고, 공지된 방법을 이용하여, 당분야에 숙련된 사람은 본원에 발표된 예시된 재조합 항-CD4 항체 및 본 발명에 따라 실질적으로 제조된 다른 항체의 안정적이며, 내성 있고, 효과적인 방식을 쉽게 확인할 수 있다.
이미 언급한 바와 같이, CE9.1은 항-CD4 모노클로널 항체 짧은 꼬리 원숭이-사람 키메라 항체이며, 이는 사람 면역글로불린 프레임워크 영역과 91 내지 92%의 상동관계를 나타내는 중국 햄스터 난소(CHO)에서 발현되는 IgG1 분자이다. 따라서, 상기 분자는 사람에서 감소된 면역유전적 반응 또는 비면역유전적 반응을 나타낼 수 있고, 뮤린 모노클로널 또는 마우스-사람 키메라 항체와 비교하여 더 긴 혈청 반감기를 나타낼 수 있다. 또한, 항체는 사람 조직과 제한된 교차 반응성을 나타낸다. 예를 들어, 상기 항체가 비-림프계 조직에 결합하는 증거가 실험에서 관찰되지 않았다. 예상된 바와 같이, 항체는 말초혈 및 다른 기관으로부터 림프성 세포의 전부에는 결합하지 않고 일부에만 결합한다. 또한, 상기 항체가 침팬지 CD4+ T 세포와 반응하지만, 붉은 털 원숭이, 게잡이 원숭이 또는 돼지 꼬리 원숭이, 비비, 쥐, 마우스, 또는 토끼로부터의 CD4+ T 세포와는 반응하지 않는다. 따라서, 상기 반응성에 기초를 두어, 침팬지는 상기 항체의 생체내 약학적 영향 즉, 효과적인 면역억제제로서의 기능에 대한 이들의 능력을 확증하기 위해 관련된 종을 포함한다.
CE9.1 항체는 침팬지에서 가역적인 T 세포 제거 활성을 나타낸다. 또한, 사람 혈청에서 상기 항체의 예상되는 더 긴 반감기 및 면역유전적 효과에 반하는 잠재성의 감소에 의해 통용되는 뮤린 및 뮤린/키메라 항-CD4 모노클로널 항체가 개선되어 질 것 같다. 또한, 사람에 투여되자 마자, 사람 불변 도메인 서열의 존재가 제공된 본 발명의 항체는 사람 항체의 정상적 이펙터 기능을 유지할 것으로 예상된다. 사실상, CE9.1 항체 및 다른 참조된 항체의 이펙터 기능은 여러 상이한 분석으로 평가되어 왔다. CE9.1 항체는 혼합된 림프구 반응(MLR)에서 억제된 활성 및 약한 C1q 결합을 나타내지만, 보체 매개 세포독성은 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한, 항체 의존성 보체 세포독성 활성(ADDC)를 나타내고, FcR에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 또한, CE9.1 항체는 투여가 CD4 세포의 부분적 제거 및 CD4 수용체의 모듈레이션을 유도하는 것으로 밝혀진 침팬지에서 생체내 평가되었다.
CE9.1 항체는 다양한 투여량으로 침팬지에 투여되었다. 더욱 상세하게는, 0.1, 0.3, 1, 5 및 10 mg/kg의 투여 효과를 7 내지 14일 간격을 두고 투여된 침팬지에서 연구하였다. 독성의 임상적 증거는 관찰되지 않았다. mg/kg 단위의 더 많은 투여량이 투여후 24시간 후에 순환하는 CD4+ 세포에서 80 내지 95%의 감소를 유도하였다. CD4+ 세포의 현저한 억제가 1 mg/kg의 투여후 7일 동안 관찰되지 않았다. 5mg/kg의 투여 후, 순환하는 CD4+ 세포 수가 7일 후 베이스 라인(base line)의 약 40%로 회복되었고, 14일 후에는 베이스 라인의 60%로 회복되었다. 10mg/kg의 투여 후, 순환하는 CD4+ 세포 수는 치료후 7일 동안 회복되지 않았고, 투여후 42일에 단지 베이스 라인의 40%만이 회복되었다. 다른 임상적 병리 파라미터에서의 변화는 관찰되지 않았다.
CE9.1 항체는 사람에서 시험되었다. 예를 들어, CE9.1 항체의 활성은 류마티스성 관절염 환자에서 단일 투여량 증가 단계 1 시험으로 평가되었다. 상기 결과는 매우 유망하였다. 특히, 투여된 환자의 약 절반이 이들의 약한 관절 스코어에서 30% 이상의 개선을 나타내었으며, 극단적인 포지티브인 반대의 프로필을 나타냈다. 또한, 상기에서 논의된 바와 같이, CE9.1이 제거되는 것으로 초기에 가정되었지만, 사실 상기 항체는 단일 투여에서 단지 부분적 및 일시적 제거를 나타냈다. 상기 항체의 부분적 비제거 성질은 유리할 수 있으며, 그 이유는 다수의 동물 연구에서, CD4+ T 세포 제거가 CD4 모노클로널 항체의 효능에 명백히 필요하지 않다는 것이 보고되었기 때문이다. [참조 문헌: Carteron et al., Induction of Immune Tolerance During Administration of Monoclonal Antibody to L3 T4 Does not Depend on L3 T4+ Cells, Underlying Journal of Immunology, 140: 713-716(1988); Carteron et al, F(ab')2 Anti-CD4 and Intact Anti-CD4 Monoclonal Antibodies Inhibit the Accumulation of CD4+ T Cells, CD8+ T cells and BTT Cells and B cells in the Kidneys of Lupus -Prone NZB/NZW Mice, Clinical Immunology Immunopathology, 56:373-383(1990)]. 이와 같이, 상기 항체는 ) CD4와 이의 상대 수용체 MHC 와의 상호작용 차단; 또는 ) 세포 표면의 CD4를 모듈레이션함에 의해 통상적인 수용체 길항제와 같이 작용할 수 있다. 이러한 조건 하에서, CD4 수용체의 참여를 필요로 하는 CD4+ T 세포 반응이 감소하거나 차단될 것이다. 본 발명의 CE9.1 항체가 사람에서 제거 활성을 거의 보이지 않는다는 사실이 유용한데, 그 이유는 이것이 안정성을 향상시키며, CD4+ 세포 수의 빈번한 모니터링을 제거할 수 있고, 또한 효능을 향상시킬 수 있기 때문이다.
CE9.1 항체는 Fc 수용체 및 보체 결합 메카니즘을 통하여 생체내에서 CD4 세포 수를 감소시키도록 설계되었다. 침팬지에서의 연구는 CE9.1이 CD4 세포의 부분적인 제거를 유발함을 지적하며, 초기 결과는 사람에서 세포 제거가 다른 공지된 CD4 mAb와 비교하여 감소됨을 암시한다. 그러나, 제거 활성이 없는 항체를 제조하는 것이 또한 바람직하다.
"비-제거" CD4 mAb의 유용성은 하기와 같은 이유 때문에 개선되어야 한다:
1) CD4 세포의 제거는 CD4 mAb의 효능을 위해서 필요하지 않다;
2) CD4 세포 제거가 없다면 이들의 안전성이 향상된다;
3) 우수한 안전성은 mAb가 질병 과정의 초기에 이용될 수 있도록 한다;
4) CD4 세포 제거가 없다면 효능이 향상된다; 및
5) CD4 세포 제거의 부재는 CD4 세포 수의 빈번한 모니터를 제거하거나 감소시키며, 따라서, 총체적인 치료의 편익과 비용을 증가시킨다.
이것은 다수의 동물 모델에서, CD4+ T 세포 제거가 CD4 mAb의 효능에 필요하지 않음을 나타내는 사실에 의해 지지된다. 따라서, 비제거 CD4 mAb는
1) CD4의 상대 수용체 MHC 와 CD4의 상호반응의 차단,
2) 세포 표면의 CD4 모듈레이션, 또는
3) T 세포 아네르기 및/또는 아폽토시스 유발에 의해 통상적인 수용체 길항제와 같이 작용한다. 따라서, CD4 수용체의 관여를 필요로 하는 CD4+ T 세포 반응은 변형되거나 차단될 것이다.
통상적으로, 강하거나 높은 친화도를 갖는 항원에 의해 유발된 T 세포 반응은 CD4-공동 수용체 기능에 무관한 것으로 보이며, 따라서, CD4 mAb에 의해 효과적으로 차단되지 않는다. 이와 반대로, 일단 항원(예를 들어, 자가항원)에 반응하는 T 세포는 CD4-공동 수용체 기능을 필요로 하며, 따라서, CD4 mAb에 의해 억제된다. 정상적으로, 강한 자가반응적 T 세포(자기 항원에 대해 높은 친화성 TCR을 갖는 T 세포)는 "클로널 제거"에 의해 흉선에서 제거되고, 따라서, 말초에서 절대 나타나지 않는다. 이와 반대로, 자가면역 반응을 유발하는 T 세포는 말초 내성의 정상적인 메카니즘을 벗어나는 약한 자가 반응 세포로 여겨진다. CD4와 같은 이러한 세포는 반응의 완전한 합성을 위한 공동 수용체의 관계에 의존적이다. 따라서, 공동 수용체의 차단은 이러한 T 세포에서 부분적 활성 또는 아네르기를 유도하는 결정적인 공동 시그날링 기능을 빼앗는다. 또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 더 큰 안정성(생체내에서 더 긴 반감기)을 갖는 CD4에 특이적인 키메라 항체를 제조하는 것이 또한 바람직하다.
상기 목적에 있어서, 감마 4 불변 도메인을 함유하는 다양한 키메라 항체가 합성된다. 상기 도메인이 사람 보체 또는 FC1 수용체에 명백하게 결합할 수 없기 때문에 선택되었다. 따라서, 상기 불변 도메인을 함유하는 키메라 항체는 T 세포 제거 활성이 결여되거나 실질적으로 결여된 것으로 가정된다. 또한, 수개의 키메라 항체는 감마 4 불변 도메인의 공지된 변형을 함유하는 것으로 제조된다. 더욱 상세하게는, 수개의 키메라 항체는 문헌[Duncan et al., Nature, 332:563-564(1988) and Winter et al., WO 88/07089 (1988)]에 설명된 "E" 변형을 함유하며, 상기 변형은 상보적 및 FC1 수용체 결합을 감소시키는 것으로 기록되어 있다. 상기 변형은 임의의 잔기 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 위치 236(248 카벳 번호)에서 류신을 글루탐산으로 교환시킴을 포함한다. 또한 수개의 키메라 항체는 문헌[Angal et al., Mol. Immunol., 30:105-8(1993)]에 설명된 "P" 변형을 함유한다. 위치 229(241 카벳 번호)에서 세린을 프롤린으로 교환시킴을 포함하는 상기 변형은 중쇄 사이의 이황산염 결합을 안정화시킴으로써 안정성(혈청 반감기)을 향상시키고, 키메라 IgG4 결핍 변형에 대한 개선된 조직 분포가 향상되는 것으로 보고되어 왔다.
더욱 정확히 말하면, CE94의 개발에 대한 원리는 보체 고정을 폐기하고, FcR 결합 활성을 감소시키는 것이다. 상기 항체는 사람 감마 4 불변 도메인(감마 1이 아님)을 함유한다는 점에서 CE9.1과 상이하다. 그러나, 결과가 정기적이거나 예측할 수 있는 성질을 갖지 않는 것이 바람직하다. 실제로, 본 발명자는 비변형된 9를 함유하는 키메라 항체가 2 항체와 동일한 Fc 수용체 결합을 가짐을 발견하였다.
이와 반대로, CE94K를 제조하기 위한 원리는 4 구조의 생산성을 향상시킨다. 상기 항체는 람다보다는 사람 카파 경쇄를 함유한다는 점에서 CE9.1과 상이하다. 자극된 단핵세포 및 단핵세포적 세포주로의 항체 결합을 측정하는 Fc 수용체 결합 분석에 의한 생체외 CD94의 평가는 CD94가 여전히 현저한 Fc 수용체 결합 활성을 가짐을 나타낸다. 또한, 상기 분석 시스템에서, CE94 결합은 CE9.1(감마 1)과 구별할 수 없다. 따라서, CE9E의 제조에 대한 원리는 비변형된 4를 함유하는 키메라 항체에 걸쳐 임의의 잔기 FcR 결합을 완전히 폐기하였다. CE9E는 한 부위에서 변형된 감마 4 불변 도메인을 함유한다(E 변형). 최종적으로, CE94PE의 제조에 대한 원리는 한 부위에서 변형된 4 또는 돌연변이를 함유하는 키메라 항체에 걸쳐 안정성을 향상시킨다(E 변형). 상기 항체는 두 부위에서 변형된 감마 4 불변 도메인을 함유한다(P 및 E 변형).
상기에서 논의된 바와 같이, 사람 4 불변 도메인은 이펙터 기능의 폐지를 위한, 즉 생체내 사람 Fc 수용체 또는 C1q와의 반응성의 제거 및 CD4+ 세포 소모의 부재를 위한 이소타입으로서 선택되었다. 이러한 네가지 후보가 선택되었고, CHO 세포에서 발현되었다.
이러한 후보 모노클로널 항체중 두 개는 더욱 광범위한 연구, 즉 CE94E 및 CE94PE 연구를 위해 선택되었다. 상기에 논의된 바와 같이, 상기 둘 모두는 4 불변 영역과 결합된 잔기 FcR 결합을 제거하기 위해 삽입된 CH2 영역에서 글루탐산 치환를 함유한다. 또한, CE94PE는 힌지 영역에서 프롤린 치환을 함유하며, 이는 중쇄 이황산염 결합 상호작용의 안정성을 향상시키는 경향을 갖는다.
상기 항체들은 CD4에 대한 이들의 친화도, 분자량, 열분해에 대한 안정성, MLR의 억제, FcR로의 결합 부재, 및 ADCC 및 CDC에서의 활성 결여에 있어서 구별할 수 없는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 항체 둘 모두는 FcR이 없는 고친화도 CD4 mAb 및 상보적 이펙터 기능에 대한 생체외 표준을 나타낸다.
CE9.1 및 CE94PE의 특성은 표 1에서 비교되었다. Fc 수용체 결합의 감소는 1 1 함유 키메라 항체보다 더 적게, 바람직하게는 30% 내지 80% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 내지 80% 이상 감소되어, 가장 바람직하게는 전체적으로 폐지되어 Fc 수용체에 결합하는 키메라 항체로 언급되어 진다. 그러나, 비변형된 감마 4 키메라 항체를 이용한 결과에서 증명되는 바와 같이, 원하는 결과는 예측할 수 있는 성질이 아니다.
표 1.
CE9.1 및 CE94PE의 이펙터 기능의 비교
활성 CE9.1 CE94PE
생체외MLRC1q 결합CDCADCCFcR 결합 있음약함없음있음있음 있음없음없음없음없음
생체내(침팬지)CD4 세포의 고갈CD4 수용체 조절 부분적있음 없음있음
생체내(HuCD4+ 트랜스제닉 마우스)CD4 세포의 고갈CD4 수용체 조절 부분적있음 없음있음
ADCC= 항체 의존 세포의 세포독성CDC 보체 매개된 세포의 세포독성FcR Fc 수용체MLR 혼합된 림프구 반응
이와 같이, 상기 결과로부터 사람 CD4에 결합하고, 특이적 불변 도메인 서열의 선택에 의해 소정의 이펙터 기능이 결여된 키메라 항체가 본 발명에 따라 제조됨을 확인할 수 있다.
예를 들어, 류마티스성 관절염을 포함하는 자가면역 질환의 치료를 위한 면역억제제 또는 CD4 조절제로서 본 발명에 따라 제조된 예시된 키메라 항-CD4 항체 또는 다른 키메라 항체의 사용에 있어서, 이러한 항체는 특정 질병 질환의 치료에 적합한 다른 화합물과 함께 또는 단독으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 다른 단백질, 예를 들어, TNF-알파에 대한 모노클로널 항체 가용성의 수용체 단백질, IL2 수용체에 대한 모노클로널 항체, CD40/gp39 상호작용에 반대로 작용하는 수용체 융합 단밸질, 및 B7/CD28 상호작용에 반대로 작용하는 모노클로널 항체중의 CTLA 4-Ig와 함께 투여될 수 있다. 또한, 류마티스성 관절염의 치료에 있어서, 주요 항체는 다른 치료제, 예를 들어, 라파마이신, 레플루노미드(Leflunomide), 테이답(Tenidap), RS-61443(미코페놀레이트 모페틸(Mycophenolate Mofetil)), 수레닐(Surenyl)(소듐 하이알루로네이트(Hyaluronate)), 항-TCR(V 17) 펩티드 백신, 아네르바(Anerva) X(항-MHC 백신), 및 체외 단백질 A 면역흡착제 또는 이들의 조합물과 함께 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 본 발명에 따라 제조된 또는 사람 CD4에 특이적이 당분야에 공지된 다른 항체와 함께 투여될 수 있다. 이것은 상승적인 효과, 예를 들어, 이러한 항체와 CD4 단백질의 상이한 에피토프와의 상이한 결합을 유도한다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한 것이다.
실시예 1
CD4에 특이성을 갖는 원숭이/사람 키메라 항체의 클로닝 및 발현
하기는 본 발명의 방법 및 항체의 특정한 예이다.
원숭이 불멸화된 B-세포주의 생성
성체 게잡이 원숭이(화이트 샌드스 뉴 멕시코 프리메이트 센터(White Sands New Mexico Primate Center)를 표준 애쥬번트를 이용한 CD4 포지티브 세포주 SupT1으로부터 150 내지 300의 가용성 CD4(sCD4) 또는 세포막(1 x 108 세포)으로 여러 부위에서 근내로 면역화시켰다. 면역화를 매 2 내지 3주 마다 총 6회 반복하였다. 원숭이의 한쪽 넓적 다리의 서혜부에 100의 sCD4를 주입하여 두 번째 면역화시키고, 일 주일 후에 동일한 넓적 다리로부터의 유출 림프절를 외과적으로 제거하였다. 조직을 잘라내고 멸균 DMEM 배지로 세정하여 림프구를 림프절로부터 제거하였다. 세포 현탁액을 나일론 거즈로 걸러내고, 100 x g로 10분 동안 원심분리시켜 모았다.
약 1 x 108 림프구를 트리스-암모늄 클로라이드 완충액(16mM, pH 7.5) 중에 현탁시키고, 37에서 5분 동안 따뜻하게 하여 적혈구를 용해시켰다. 림프구를 원심분리에 의해 모으고, L-류신 메틸 에스테르(LME)에 재현탁시키고, 37에서 45분 동안 인큐베이션시켰다. LME 처리된 세포를 나일론 스크린을 통하여 여과시키고, 원심분리하였다. 1ml의 송아지 태아 혈청을 첨가하고, 세포를 현탁시키고, 혈청이 없는 RPMI로 2회 세척하였다. 세포수를 세고, 50ml의 원추 원심분리 튜브에 이미 혈청이 없는 배지로 2회 세척한 같은 수의 K6H6/B5 이형골수종 세포와 혼합시켰다. 1분에 걸쳐 약한 교반하에서 1ml의 50% PEG(폴리에틸렌 글리콜)에 세포를 천천히 첨가하여 적당히 현탁시켰다. 그 후, 세포를 PEG로 희석하여 가볍게 혼합시키면서 5분에 걸쳐 20ml의 혈청이 없는 배지를 첨가하여 재현탁시켰다. 혈청이 없는 배지로 2회 세척한 후, 세포를 20%의 송아지 태아의 혈청 및 젠타마이신을 함유하는 RPMI 배지에 5 x 105/0.1ml의 농도로 재현탁시키고, 96웰 미세 조직 배양 플레이트에 웰당 0.1ml로 배치시켰다. 동부피의 HAT 배지(0.1ml)를 각각의 웰에 첨가하고, 스크리닝 전에 14 내지 17일 동안 성장시켜 하이브리드화시켰다.
항-CD4의 생성을 위한 융합된 세포 하이브리드의 스크리닝
항-CD4 특이성을 측정하기 위한 분석법은 하기와 같다: ELISA 플레이트를 웰당 100ng의 농도의 재조합 sCD4로 코팅시키고, PBS에서 1% 소 혈청 알부민으로 차단시켰다. 50 부분표본의 하이브리도마 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고, 60분 동안 sCD4로 코팅된 플레이트에 인큐베이션시켰다. 125I 표지된 염소 항-사람 또는 염소 항-원숭이 Ig를 60분 동안 인큐베이션시켜 결합을 탐지하였다. 증류수로 4회 세척한 후, 감마 카운터로 웰을 계수하였다. 세 번 즉, 첫 번째는 웰당 5 세포, 그 다음 두 번은 웰당 1 세포로 서브클로닝된 상기 웰로부터 복제 및 하이브리도마 세포가 있는 포지티브 웰을 재분석하였다. 이 단계에서, 항-sCD4 포지티브를 세포 표면 CD4에 결합시키는 능력에 대해 스크리닝시켰다. 항-CD4 뮤린 모노클로널, 즉 용어 1F3를 CD4 포지티브 세포주 supT1에 결합시키는 것을 억제시킴으로써 이를 수행하였다. 간단하게 상이한 양의 원숭이 항-CD4 및 3 x 105 supT1 세포/웰을 갖는 10의 125I-표지된 1F3을 공동 인큐베이션시킴으로써 수행하였다. 실온(약 20 내지 25)에서 1 시간 동안 인큐베이션 시킨 후, 유리 섬유 필터상에서 진공에 의해 제거하였다. PBS로 광범위하게 세척한 후, 필터를 감마 카운터로 세어서, 원숭이 하이브리도마 상청액에 의해 supT1 세포로의 1F3 결합 억제를 측정하였다.
1F3에 대해 강한 억제를 나타내는 항체를 제조하는 후보 클론을 선택하였다. 클론을 사람 이소타입화 제제를 이용하여 이소타입화시켰고, 람다 경쇄를 갖는 IgG2로 발견되었다. 상기 세포주를 이들의 면역글로불린 유전자의 클로닝을 위한 더 많은 수로 성장시켰다.
원숭이 불멸화된 B-세포로부터 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 클로닝
전체 RNA를 구아니디늄 이소티오시아네이트 방법을 이용하여 1 x 107 원숭이 불멸화된 B-세포로부터 분리하였다. 전체 RNA의 1/10을 올리고-dT 올리고누클레오티드 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 단일 가닥 cDNA를 만들기 위해 사용하였다. 단일 가닥 cDNA의 총량의 1/10을 PCR 반응을 수행하는데 이용하였다. 여섯 개의 PCR 반응은 각각 Nhe 부위를 함유하는 IgG 3' 불변 영역 올리고누클레오티드와 함께 Sal 제한 부위를 함유하는 여섯 개의 5' VH 계 특이적 올리고누클레오티드 프라이머중 하나를 포함하며, 이 둘 모두는 도 7-1에 도시되어 있다. 이와 유사하게, Bal II 부위를 함유하는 다섯 개의 5' 람다 리더 서열 올리고누클레오티드 프라이머 중 하나 및 Avr II 부위를 함유하는 3' 람다 불변 영역 프라이머를 이용하는 다섯 개의 PCR 반응을 수행하였다. 반응 조건은 상기에 설명된 바와 같다. 각각의 PCR 반응을 3중으로 수행하였다. 중쇄 및 경쇄 증폭 반응의 각각의 생성물을 1.2% 아가로스 겔에서 수행하였다. VH4 중쇄 프라이머(5'-ACTAAGTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT-3') 및 람다 프라이머(5'-ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC-3')은 아가로스 겔 전기영동에서 강한 밴드를 제공한다. 상기 반응의 생성물을 사람 IgG1 및 사람 람다 불변 영역 서열을 함유하는 벡터 TCAE 6으로의 클로닝을 위해 사용하였다.
두 개의 가변 영역 유전자의 발현 벡터 TCAE 6로의 클로닝을 잇달아 수행하였다. 먼저, 중쇄 PCR 생성물 및 벡터 TCAE 6을 제한 효소 Sal 및 Nhe 로 효소분해시키고, 생성물을 페놀/클로로포름으로 추출하였고, SEPHADEX G-25 스핀 칼럼을 통과시켰다. PCR 생성물을 T4 DNA 리가아제 존재하에 14에서 밤새 절단 벡터와 라이게이션시켰다. 약 500ng의 총 DNA를 10:1의 삽입물/벡터 몰비를 갖도록 10의 부피로 라이게이션시켰다. 라이게이션된 물질을 XL-1 블루 컴피턴트(competent) 세포(스트라타진(Stratagene))을 형질전환시키는데 이용하였고, 형질전환된 세포를 50/ml 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트상에 위치시켰다. 암피실린 내성 박테리아의 콜로니를 가려내어 5의 미니배양물로서 배양하였다. 플라스미드 DNA를 표준 알칼리 용해법에 의해 각각의 배양물로부터 추출하고, 제한 효소 Sal I 및 Nhe I로 절단하고, 생성물을 1.2% 아가로오스 겔상에 올려두었다. 약 450bp의 삽입물을 갖는 플라스미드를 경쇄 가변 영역의 후속 클로닝을 위한 주형으로서 사용하였다. 경쇄 CPR 반응 생성물 및 경쇄 삽입물을 함유하는 생성물을 제한 효소 Bgl II 및 Avr II로 절단하고, 함께 라이게이션시켰다. 플라스미드 미니배양물을 Bgl II 및 Avr II로 절단하므로써 스크리닝하였다. 약 400 내지 450 bp의 삽입물을 제공하는 효소분해물을 포지티브로 표시하였다. Sal I/ Nhe I 및 Bgl II/Avr II 삽입물을 둘다 함유하는 플라스미드를 DNA 배열을 위해 보다 다량으로 배양하였다.
직렬 키메라 항체 발현 벡터 TCAE 5.2 및 TCAE 6을 그 자체가 벡터 RLDN10b(253 Science, 77-79(1991))의 유도체인 벡터 CLDN으로부터 유도하였다. 또한, RLDN10b는 발현 벡터 TND(7 DNA, 651-661(1988))의 유도체이다.
RLDN10b는 하기 방법으로 벡터 TND와 다르게 된다. 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 전사 카세트(프로모터, cDNA 및 폴리아데닐화 영역)를 조직 플라스미노겐 활성제 카세트(t-PA 발현 카세트) 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NEO) 카세트 사이에 위치하도록 하여 세개의 카세트 모두가 직렬 상태 및 동일한 전사 배향이 되도록 하였다. 또한, CLDN에서 DHFR 유전자 프로모터를 마우스 베타 글로빈 주 프로모터(3 Mol. Cell Biol., 1246-54(1983))로 대체하고, t-PA cDNA를 폴리링커로 대체하였다. 세개의 진핵 전사 카세트(발현물, DHFR, NEO) 모두는 제한 엔도누클레아제 NotI로 분해되므로써 박테리아 플라스미드 DNA(pUC9 유도체)로부터 분리될 수 있다.
CLDN은 폴리링커 전방의 Rous LRT이 사람 시토메칼로바이러스 인접 조기 유전자 프로모터 인핸서에 의해 대체되었기 때문에 RLDAN10b와는 다르다(41 Cell, 521, (1985)).
발현 벡터 TCAE 5.2 및 TCAE 6은 하기와 같은 점에서 CLDN과 다르다:
1) 상기 벡터는
a) 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 cDNA의 증폭에 의해 유도된 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역. TCAE 5.2에서, 상기 영역은 사람 면역글로불린 경쇄 카파 불변 영역(카바트 아미노산 번호 108 내지 214, 알로타입 Km3)이고, TCAE 6에서는 사람 면역글로불린 경쇄 람다 불변 영역(카바트 아미노산 번호 108 내지 215, 제노타입 Oz 마이너스, Mcg 마이너스, Ke 마이너스 알로타입)이다.
(b) 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 두 구성물에서 사람 면역글로불린 중쇄는 감마 1 불변 영역(카바트 아미노산 번호 114 내지 478, 알로타입 Gm1a, Gm1z)이고, 이 영역은 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 cDNA 증폭에 의해 유도된다.
(c) DHFR; 자체의 진핵 프로모터 및 폴리아데닐화 영역 함유.
(d) NEO; 자체의 진핵 프로모터 및 폴리아데닐화 영역 함유와 같은 4개의 전사 카세트(3개 대신에)를 직렬 순서로 함유한다.
2) 사람 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카세트는 면역글로불린 사슬의 분비에 대한 합성 시그날 서열을 함유한다.
3) 사람 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카세트는 전사 판독 프레임을 유지하고 면역글로불린 사슬에서 일반적으로 발견되는 아미노산을 변경하지 않는 경쇄 및 중쇄의 면역글로불린 가변 영역의 삽입을 허용하는 특이적인 DNA 링커를 함유한다. 상술된 변이체의 혼입은 벡터 TCAE 5.2 및 TCAE 6을 구성하도록 한다. 항 CD4 헤테로하이브리도마 세포주 E 9.1로부터 TCAE 6으로의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 유전자의 클로닝은 ATCC에 기탁된 구성물이 되도록 한다. 기탁되었으며, CE9.1 항체에 대해 코드화하는 상기 구성물은 게잡이 원숭이 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 게잡이 원숭이 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 함유하며, 이들의 서열은 각각 도 1 및 2에 기재되어 있으며, 항 CD4 하이브리도마 세포주 E9.1로부터 클로닝된 것이다. 중쇄 불변 영역은 감마 1 이소타입 및 Gmla, Gmlz 알로타입의 사람 기원이다. 람다 경쇄 불변 영역은 또한 Oz 마이너스, mcg 마이너스 제노타입 및 Ke 마이너스 알로타입의 사람 기원이다. 면역글로불린 유전자는 본원에 참고문헌으로 인용된 상기 출원서에 기재된 포유동물 발현 벡터 TCAE 6으로 클로닝되며, 포유 동물 세포주 CHO로 일렉트로포레이션(electroporation)되는 경우에 원숭이/사람 항 CD4 키메라 항체가 생성된다. 본원에 기술된 DNA 구성물은 항생작용의 암피실린에서 선택되고 15% 글리세롤을 함유하는 살균 LB 배지에서 박테리아 세포 현탁액으로 기탁된 박테리아 균주 XL-1 블루를 형질전환시키는데 사용되어 왔다.
DNA 서열분석
플라스미드 DNA를 100의 배양물로부터 제조하였다. 2.5M 염화나트륨 및 20% 폴리에틸렌 글리콜(6 부피)의 혼합물을 15분 동안 얼음위에서 침전시키므로써(1 부피) 추가 정제하였다. 10,000 xg에서 20분 동안 원심분리시킨 후, 팰릿을 70% 에탄올로 세척하고, 재원심분리시키고, 스피디백(Speedivac, Savant)에서 건조시켰다. DNA의 팰릿을 150 내지 250/의 농도로 탈이온수에서 재현탁시켰다. 서열분석은 상거(Sanger)의 기법을 사용하여 5의 이중 가닥 DNA로 수행하였다. 경쇄 또는 중쇄 삽입물의 발현 벡터 상류 및 하류내 서열에 대해 상동인 배열 프라이머를 사용하였다. 상기 인서트를 5'에서 3'으로 및 3' 에서 5'으로의 양방향으로 서열분석하였다. 각각의 PCR 반응으로부터 각각 생성된 항CD4 경쇄의 두 클론 및 항CD4 중쇄의 두 클론을 평행하게 배열하여 뉴클레오티드 변이체가 PCR 반응 동안에 도입되었는가를 결정하였다. 선택된 두 중쇄 및 두 경쇄 클론은 전체 길이에 걸쳐 동일한 것으로 밝혀졌으며, 이는 증폭 과정 동안에 에러가 없었음을 확인하게 하는 것이다. 항 CD4 중쇄 및 경쇄의 서열이 도 1 및 2에 도시되어 있다.
원숭이/사람 키메라 항 CD4의 발현
발현 벡터 TCAE 5.2 및 TCAE 6은 세포주 Sp2/0 및 CHO으로의 안정된 일체의 발현에 사용될 뿐만 아니라, SV40 기원을 포함하고 있기 때문에, 세포주 COS에서 일시적으로 발현될 수 있다. COS 세포 발현은 하기와 같이 수행되었다: COS 세포를 트랜스펙션하기 하루 전에 시딩하여, 그 다음날 50 내지 70% 컨플루언시(confluency)를 형성하도록 하였다. 배지를 빼내어 세포를 트랜스펙션 완충액(TB-140mM NaCl, 25mM 트리스, 5mM KCl, 0.5mM Na2HPO4, 1mM MgCl2, 1mM CaCl2)으로 2회 세척하였다. 항CD4 원숭이/사람 키메라 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 함유하는 30의 염화세슘 정제된 TCAE 6 플라스미드를 디쉬당 3의 DEAE 덱스트란(TB중 1/)과 혼합하였다. DNA를 1 시간 동안 37에서 상기 세포와 함께 인큐베이션시켰다. DNA 용액을 제거하고 1.5 내지 2.5분 동안 3의 20% 글리세롤로 대체한 후 세포를 TB로 2회 세척하였다. 세포를 3 내지 5 시간 동안 37에서 100uM 클로로퀸을 함유하는 5의 새로운 배지에서 인큐베이션시킨 후 배지로 2회 세척하고, 72 시간 동안 정상 DMEM과 함께 인큐베이션시켰다. 트랜스펙션된 COS 세포로부터의 상청액(100)을 ELISA를 기초로 하는 기법에 의해 항체의 존재에 대해 여러 희석율로 검정하였다. 표준 ELISA 조건하에서 염소 항-사람 람다를 96 웰 분석 플레이트를 코팅시키는데 이용하였고, 검출 항체로서 퍼옥시다아제-표지 염소 항-사람 IgG를 이용하였다. COS 세포는 10 내지 40 ng/의 원숭이/사람 키메라 항체를 생성시키는 것으로 밝혀졌다. 더 많은 부피의 상청액을 10배 농축시키고, CD4 포지티브 SupT1 세포에 대한 RIV의 직접 결합에 사용하였다. 원래의 전체 원숭이 항체 및 관계 없는 사람 면역 글로불린을 각각 포지티브 및 네가티브 대조군으로서 사용하였다. 또한, 원숭이 항-CD4 및 원숭이/사람 키메라 항-CD4를 고친화성 마우스 항-CD4(1F3) 항체의 결합을 억제하는 데에 사용하였다. 상기 결과는 원숭이/사람 재조합 항체(ATCC No. 69030)이 CD4 포지티브 세포에 결합할 뿐만 아니라, 거의 동일한 농도의 전체 원숭이 항체 또는 1F3 자체에서 CD4 포지티브 세포에 대한 1F3의 결합을 억제할 수 있음을 나타내었다.
실시예 2
본 실시예는 MLR에서의 T 세포 증식 및 IL-2 생성에 대한 CE9.1의 효과, CE9.1의 Fc 수용체 및 보체 결합 성질, 및 ADCC 및 CDC 반응을 매개하기 위한 CE9.1의 능력을 포함하는 CE9.1의 생체외 작용 특성에 관한 것이다. 그외에, 말초혈액에서 CD4 수용체 매개 및 림프계 서브세트에 대한 생체내 효과를 분석하였다. 하기와 같이 분석하였으며, 하기의 재료 및 방법을 본 실시예에 사용하였다 [참고문헌 : Anderson et al, "In vitro and in vivo characterization of a primatized mAb to human CD4 : mAb caused CD4 receptor modulation but not CD4 T cell depletion in chimpanzees"].
재료 및 방법
영장화된(PRIMATIZED)(상표명) 항-CD4의 분자 구조물 및 발현
가변 영역 면역 글로불린 유전자를 상기 기술된 바와 같이, PCR에 의해 증폭시키고, sCD4로 면역시킨 원숭이로부터 유도된 헤테로하이브리도마로부터 클로닝시켰다 [참고 문헌 : Newman, R.A., et al, "Primatization of recombinant antibodies for immunotherapy of human disease : a macaque/human chimeric antibody against human CD4", Biotechnology, 10:1455 (1992)]. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 직렬 방식으로 카세트 발현 인자, 즉 TCAE 6 내에 삽입시키고, DHFR- CHO 세포 내로의 안정한 인테그레이션 후에 IgG1로서 발현시켰다 [참고 문헌 : Newman, 상기에 언급됨]. 증가량의 메토트렉세이트 중에서의 3회의 증폭으로, 항체의 수준을 8일에 걸쳐 750ug/ 과량으로 발현시키도록 세포주를 발달시킬 수 있었다. 현탁 배양액 중에서 성장시키고, 중공 섬유 반응기에 주입하기 전에 점진적으로 팽창하는 세포주의 생성이 발생하였다 [참고 문헌 : Evans et al, "Large-scale production of murine monoclonal antibodies using hollow fiber bioreactors", BioTechniques 6(8) : 762 (1988)].
mAb CE9.1을 배지로부터의 배양 상청액을 인산염 완충 식염(pH 7.2)으로 사전에 평형시킨 Prosep A 칼럼(300, 바이오프로세싱 인코포레이티드)을 통해 125/분의 속도로 통과시켜서 정제하였다. 칼럼을 기준선(baseline)이 설정될 때까지 PBS로 세척하고, 결합된 항체를 5개 칼럼 부피의 0.2M 아세트산/0.1M 글리신 완충액(pH 4.0)으로 용리시켰다. 회수율은 약 90%이었다. 용리물을 pH 5.5로 만들고, Q-세파로오스 칼럼(파마시아)을 통해 통과시켰다. CE9.1이 25MM Tris-HCl(pH 8.5)로 세척시킨 칼럼에 결합되었다. 항체를 100mM NaCl을 함유하는 50mM Tris-HCl(pH 6.5)로 용리시키고, USP 주사용 정상 식염에 대한 탈여과(밀리포어 펠리컨)에 의해 농축시켰다. CE9.1을 최종적으로 0.04um Nylon66 NDP 필터(폴 필트레이션(Pall Filtration)의 제품)을 통해 여과시켰다.
결합 특이성 : CD4 + SupT-18 세포에 대한 CE9.1의 결합
96-웰 U-바닥 마이크로리터 플레이트(클로닝)를 얼음 상에서 1시간 동안 0.2% 소혈청 알부민 및 0.1% 소듐 아지드를 함유하는 PBS로 사전 블록킹시켰다. 동일한 완충액으로 사전 세척한 SupT-18 세포(1x105)를 얼음 상에서 30분 동안 농도를 변화시킨 CE9.1(2.4pg/ml-10/ml)와 인큐베이션시켰다. 세포를 2회 세척하고, 얼음 상에서 30분 동안 제 2 항체(FITC-표지된 염소 항-마우스 Ig)와 인큐베이션시켰다. 세포를 2회 세척하고, 고정 완충액(PBS 중의 2% 포름알데히드) 중에 재현탁시키고, FACScan 유세포분석계(flow cytometer)(Becton Dickinson)을 사용하여 분석하였다.
결합 특이성 : 사람 말초혈 백혈구에 대한 CE9.1의 결합의 흐름에 의한 분석
단핵 세포를 표준 "Ficoll/Hypaque " 원심분리 기술을 사용하여 사람 말초혈로부터 단리시켰다 [참고 문헌 : Boyum A. "Separation of blood leukocytes, granulocytes and lymphocytes", Tissue Antigens 4:269 (1974)]. 말초혈 단핵 세포(PMNC)를 함유하는 계면층을 제거하고, 행크(Hank)의 균형 염 용액(HBSS)으로 세척하고, 계수하였다. 5x106개의 세포를 4에서 30분 동안 20의 CE9.1(25/)로 인큐베이션시켰다. 세포를 HBSS로 세척하고, 20의 염소 항-사람 IGG-EITC[Fisher Scientific)]와 인큐베이션시켰다. 얼음 상에서 추가 30분 동안 인큐베이션시킨 후에, 세포를 자동 보충(auto compensation) 및 칼리브라이트 비이드에 의한 사전 측정을 사용하여 벡톤 디킨슨 FACScan 기기 상에서 분석하였다. 생존가능한 림프구 집단을 전방 대 직각 광 산란기에 의해 확인하고, 전제 림프구 집단을 모든 다른 사건을 게이팅시킴으로써 단리시켰다. 후속 형광 측정은 단지 게이팅된 림프구 사건을 반영하는 것이다. 이중으로 오염된 세포의 정량화 및 침팬지 혈액에 대한 후속 연구를 위해 사용되는 mAb는 항-사람 CD3 (Leu-4-FITC; 벡톤 디킨슨); 플루오레세인-컨쥬게이션된 항-사람 CDS(Leu-2a-FITC; 벡톤 디킨슨); 피코에리트린-컨쥬게이션된 항-사람 CD8(Leu-2a-PE; 벡톤 디킨슨); 피코에리트린-컨쥬게이션된 항-사람 CD20(Leu-16-PE; 벡톤 디킨슨); 플루오레세인-컨쥬게이션된 염소 항-사람 IgG F(ab')2 (카펠); 및 피코에리트린-컨쥬게이션된 뮤린 동물 항-CD4(OKT; 오르토 파마슈티컬즈)를 포함한다.
사람 조직 교차 반응성
CE9.1을 정상 사람 조직에 대한 교차 반응성에 대해 평가하였다. 비오틴일화된 CE9.1을 아비딘-비오틴 면역 퍼옥시다아제 기술을 사용하여 32개의 상이한 조직으로부터 저온 유지 절단 동결 단편에 대해 시험하였다 [참고 문헌 : Wilchek, M. et al, "The avidine-biotin complex in bioanalytical application", Anal. Biochem., 171:1 (1983)]. SupT1 세포(CD4+)를 포지티브 대조군으로서 사용하고, SB 세포(CD4-)를 네가티브 대조군 세포주로서 사용하였다. 관계 없는 비오틴일화된 마우스/사람(IgG) 키메라 항체를 네가티브 항체 대조군으로서 사용하였다.
대부분의 조직에 대해, 3가지 분리 시편을 시험하고, CE9.1과의 반응성을 0 내지 3+에 대해 기록하였다. 일부 조직에서, 조직 내에서의 상이한 구조를 분리적으로 기록하였다. 예를 들어, 간에서, 간세포, 담관 및 쿠퍼(Kupffer) 세포를 독립적으로 기록하였다.
종 특이성
수개의 공통적인 실험실 영장류 및 비영장류로부터의 말초혈을 CD4 포지티브 T 세포의 가능한 교차 반응성의 확인을 위해 CE9.1로 스크리닝하였다. 이러한 그룹은 침팬지, 비비, 붉은털 원숭이, 게잡이 원숭이 및 피그테일 짧은 꼬리 원숭이 쥐, 마우스, 토끼 및 개를 포함한다. 혈액 세포를 4에서 원심분리(5분 동안 1500rpm)에 의해 전혈 1 내지 5로부터 단리시키고, 동일한 부피의 PBS 중의 재현탁에 의해 세척하였다. 이러한 과정을 1회 더 반복하고, 세포를 동일 부피의 소 태아 혈청 중에 재현탁시켰다. 각각의 종으로부터의 세포 현탁액 200를 20의 CE9.1(25/)를 갖는 15 원뿔형 원심분리관 내에 넣었다. 항체 및 세포를 혼합시키고, 20분 동안 얼음 위에 위치시킨 후, HBSS로 골고루 세척시켰다. 그다음, 20ul의 염소 항-사람 IgG-FITC(피셔 사이언티픽)을 첨가하고, 샘플을 혼합시켰다. 추가로 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션시킨 후, 샘플을 얼음으로부터 분리시키고, 37로 예온시킨 10의 세포 용해물 완충액(0.16M 염화 암모늄 및 0.1M 나트륨 EDTA를 함유하는 0.01M 중탄산 칼륨, pH 7.4)를 첨가하였다. 샘플을 실온에서 15분 동안 인큐베이션시키고, 5분 동안 1500rpm에서 원심분리시켰다. 표지된 세포 펠릿을 1% 소 혈청 알부민 및 0.05% 아지드화 나트륨을 함유하는 HBSS(pH 7.4) 중에서 추가로 2회 세척하였다. 표지된 세포를 고정 완충액(1.0% 포름알데히드를 함유하는 0.5M 염화 나트륨; 0.22um 필터를 통해 여과시킴) 중에 재현탁시켜서 고정시켰다. 샘플을 상기한 바와 같이 벡톤 디킨슨 FACScan 기기에서 분석하였다.
시험관내 작용성 분석 : 한가지 방식 및 세가지 방식으로 혼합된 림프구 반응
사람 또는 침팬지 T 세포(1.3 x 105)를 평평한 바닥 마이크로웰 중에서 CE9.1를 사용하거나 사용하지 않고, 각각 사람 또는 침팬지 기원의 관계 없는 공여자로부터 수득한 미토마이신 C 처리된 PBMC(6.0 x 104)로 7일 동안 배양시켰다. 트리티에이트화된(tritiated) 티미딘 1uCi/웰을 최종 18시간 배양시키는 동안 배양액에 첨가하였다. 마이크로 적정판을 원심분리시키고, 세포 펠릿을 HBSS로 세척시킨 후, 액체 섬광 계수기로 계수하였다. 각각의 샘플을 3회 검정하였다.
사람 MLR을 3개의 분리되고 관계 없는 공여자를 시뮬레이터 및 리스판더(responder)로서 사용하여 수행하였다. 이러한 프로토콜을 적색 크로스 담황색 코트 혈액의 HLA-비특징화된 랜덤 샘플 중에서 양호한 반응의 가능성을 최대화시키도록 변형시켰다. 상기 프로토콜에서, 공여자 혈액 중 어느 것도 미토마이신 C으로 처리하거나 방사선 조사하지 않았다.
CE9.1의 Fc 수용체 결합 활성을 검정하기 위한 THP-1 세포 부착 검정
본 검정은 2가지 세포주의 브릿징에 의존하며, 항-CD4 항체에 의해, 하나의 세포는 CD4를 발현시키고, 나머지 하나의 세포는 Fc 수용체를 발현시켰다. 사용되는 CD4 발현 파트너는 사람 CD4로 형질전환시킨 점착성 뮤린 섬유아세포주 DAP(DAP/CD4)이다. Fc 수용체 함유 세포는 THP-1이다. DAP/CD4 세포를 96-웰 평평한 바닥 플레이트(100ul/웰; 25,000 세포/웰) 중에 위치시키고, 밤새 고정시켰다. THP-1 세포를 RPMI 배지(1 x 106 세포/) 50 중에 재현탁시키고, IFN 50U/의 첨가에 의해 37에서 24시간 동안 유도하였다.
IFN-유도 THP-1 세포를 하기와 같이 하소(calcine) 아세토메톡시 에스테르(CAM; 몰레큘라 프로브즈)로 로딩시켰다 : 세포를 로딩 완충액(칼슘 및 마그네슘 및 0.1% 소 혈청 알부민을 갖는 듈베코(Dulbecco) PBS)으로 세척하고, 동일한 완충액 10 중에 5 x 106 세포/로 재현탁시켰다. CAM(DMSO 중의 1/)를 로딩 완충액으로 희석시키고(1:50), THP-1 세포 현탁액(1:1 v/v)에 첨가하였다. 실온에서 20분 동안 인큐베이션시킨 후, 새로운 로딩 완충액 25를 각각의 세포/CAM 혼합물 4에 첨가하고, 실온에서 추가로 40분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 로딩 완충액으로 2회 세척하고, 8 x 106 세포/로 재현탁시켰다. PBS(칼슘, 마그네슘 또는 BSA 비함유) 중의 CE9.1의 혈청 희석액을 CD4+ DAP 세포를 함유하는 웰에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. CAM 로딩된 THP-1 세포 현탁액 50ul을 첨가하고, 플레이트를 암실에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. DAP 세포를 함유하지 않는 대조군 웰을 또한 검정하였다. 인큐베이션 후에, 웰을 PBS로 3회 세척하였다. 최종 세척 후에, 웰 1개당 PBS 100ul을 첨가한 후, 10ul의 20% 트리톤 X-100을 첨가하였다. 10 내지 15초 동안 진탕기 상에 위치시킨 후, 플레이트를 Fluoroscan(MTX Lab systems Inc.)에서 판독하였다.
CE9.1의 Fc 수용체 결합 활성을 측정하기 위한 활성화된 단핵 세포 결합 검정
Fc 수용체 검정을 하기의 상이점을 제외하고는, 상기 THP-1 세포에 대해 기술한 바와 같이 수행하였다. 단핵 세포를 표준 피콜(Ficoll)/하이파크(Hypaque) 및 퍼콜(Percoll) 농도구배 분리에 의해 신선한 사람 말초혈로부터 제조하였다. 단핵 세포를 상기와 같이, 그러나 48시간 동안 IFN으로 자극하였다. 플레이트를 자극한 단핵 세포로 24시간 동안 코팅시키며, 이 검정에서, CD4+ 계통 SupT-18을 상기 기술된 바와 같이 CAM으로 로딩시켰다. SupT-18 세포를 상기 기술한 바와 같이 자극된 단핵 세포로 코우팅시킨 플레이트에 첨가하였다. 상기 검정에서의 주된 차이점은 CD4+ 세포주 CAM이 플레이트 상의 FcR 함유 세포에 로딩되고 첨가된다는 점이다. THP-1 세포를 사용하는 상기 검정에서는, 순서를 반대로 하였다.
FcRII 트랜스펙션된 뮤린 섬유아세포에 대한 결합
사람 FCRH로 트랜스펙션시킨 뮤린 섬유아세포주(CDW32-L)를 ATCC로부터 입수하였다. CE9.1의 직접 결합을 sCD4의 존재 및 부재하에 항체를 인큐베이션시킴으로써 측정하였다. CE9.1의 결합을 양고추냉이 과산화효소(서던 바이오테크)에 컨쥬게이션시킨 염소 항-사람 Ig-항체로 인큐베이션시킴으로써 검출하였다. CE9.1의 Fab 단편을 효소 분해에 의해 생성시키고, 네가티브 대조군으로서 사용하였다. sCD4의 존재하에 세포로 사전 인큐베이션시킨 CE9.1(및 Fab 단편)으로부터 수득한 흡광도를 sCD4의 부재하에 항체에 대해 얻어진 흡광도로부터 감산하였다.
ADCC 검정(supT1 세포의 용해)
신선한 헤파린화된 사람 혈액 샘플을 수집하고, Ficoll/Hypaque 상에서의 표준 원심분리 공정에 의해 PMNC를 단리시켰다. 담황갈색 코우트 중의 적혈구를 염화 암모늄 완충액으로 용해시키고, 세포를 행크 밸런스 염 용액 중에서 2회 세척하였다. 말초혈 림프구(PBL)을 37, 5% CO2에서 24시간 동안 RPMI/10% 송아지 태아 혈청(FCS) 1당 IL-2 10단위로 자극하였다. 24시간 후에, PBL을 RPMI/5% FCS 중에 재현탁시켰다.
SupT1-18 세포(1x106)를 37, 5% CO2에서 1시간 동안 100 uCi 51Cr로 인큐베시팅시켜서 표지시켰다. 세포를 RPMI/5% FCS로 2회 세척하고, 1 x 104 세포를 각각의 웰에 첨가하였다. 세가지의 CE9.1 항체를 RPMI/5% FCS로 1:2로 연속 희석시키고, 분취량을 37, 5% CO2에서 30분 동안 SUPT1-18 함유 웰에 3회 첨가하였다. 100uL의 1% 트리톤 X-100 및 100uL의 배지를 각각 최대 및 자발 방출 대조군으로서 사용하였다. IL-2 자극 PBL(8 x 105 세포)를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 30분 동안 900 rpm으로 원심분리시키고, 37, 5% CO2에서 16시간 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 웰로부터의 상청액을 수집하고, 방사능의 양을 감마 계수기에서 계수하였다. 검정을 3회 수행하였다. 세포 용해율을 하기의 방정식을 사용하여 측정하였다 :
용해율 % =[(샘플 계수 - 자발적 방출)/(최대 방출 -자발적 방출)] X 100
Clq 결합 검정
Clq 검정을 4 x 106/의 현탁액 중에서 SupT1-18 CD4 포지티브 세포를 사용하여 수행하였다. 20ug/의 동등한 농도의 CE9.1 및 대조군 친화성 정제 원숭이 항-CD4 항체(50ul)를 2 x 105 CD4 포지티브 표적 세포에 첨가하였다. 세포 현탁액 및 항체를 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, PBS 중의 1% BSA로 2회 세척하였다. 50uL의 사람 Clq(10ug/)를 각각의 관에 첨가하고, 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 관을 2회 세척한 후, 토끼 항-사람 Clq FITC(50uL)의 1:15 희석액으로 인큐베이션시켰다 (암실에서, 얼음 위에서 1시간). 세포를 다시 2회 세척하고, 0.5의 1% 포름알데히드/PBS 중에 고정시켰다. 세포를 데이터 획득 및 분석용 콘소트(Consort) 30 소프트웨어를 사용하여 벡톤 디킨슨 FACScan 유세포 분석계에서 분석하였다.
보체 매개된 세포독성 검정
SupT1-18 세포(1x106)를 37, 5% CO2에서 1시간 동안 100 uCi 51Cr로 인큐베시팅시켜서 표지시켰다. 세포를 RPMI/5% FCS로 2회 세척하고, 1 x 104 세포를 각각의 웰에 첨가하였다. CE9.1 및 대조군 항-CD4 항체를 RPMI/5% FCS로 1:2로 연속 희석시키고, 분취량 50ul을 SUPT1-18 함유 웰에 3회 첨가하였다. 100uL의 1% 트리톤 X-100 또는 100uL의 배지를 각각 51Cr의 최대 및 자발 방출을 측정하기 위해 웰에 첨가하였다. 37, 5% CO2에서 90분 동안 인큐베이션시킨 후, 토끼 보체(Cappel)의 1:5 희석액을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37, 5% CO2에서 추가로 90분 동안 인큐베이션시킨 후, 900 rpm으로 30분 동안 원심분리시켰다. 각각의 웰로부터의 상청액을 수집하고, 방사능의 양을 감마 계수기에서 계수하였다. 검정을 3회 수행하였다. 세포 용해율을 하기의 방정식을 사용하여 측정하였다 :
용해율 % =[(샘플 계수 - 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출)] X 100
침팬지의 생체내 연구
6마리의 침팬지를 각각 2마리씩 3개의 그룹으로 나누었다: 그룹 I(식염 대조군), 그룹 II(CE9.1 항체 10.0/) 및 그룹 III(CE9.1 항체 10.0/). 그룹 II 동물을 30일 후에 CE9.1 10.0/으로 재처리하였으며, 단, 이들의 CD4+ T 세포의 계수를 기준선의 30%로 회복시켰다. 그룹 III 동물을 30일 후에 CE9.1 10.0/으로 재처리하였으며, 단, 이들의 CD4+ T 세포의 계수를 기준선의 70%로 회복시켰다. 이들 값이 30일 까지 도달되지 않았으면, 동물을 CD4+ T 세포 값이 상기 그룹에 대한 각각의 목표값에 도달할 때 까지 2주 간격으로 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 값에 대해 스크리닝하였다. 이 때에, 동물에게 다시 3가지 용량이 최대가 될 때까지 CE9.1 항체 10.0/을 정맥내 투여하였다.
전체 백혈구 계수, 림프구 및 과립구 값, 및 CD3+, CD4+ 및 CD8+ 림프구 아군의 기준선 측정을 투여 직전 -6일째 및 0일째에 수행하고, 다시 투여후 24시간째 및 14일째에 수행하였다. 10/ 용량에 의한 3가지 처리 사이클을 각각 본 연구에서 침팬지에 투여하였다.
결과
mAb CE9.1의 결합 특이성
가용성 CD4에 대한 CE9.1의 결합에 대한 SPR에 의한 친화성 측정은 Kd가 1.0nM임을 보여주었다 [참조 : Brigham-Burke et al. North American BIAsymposium 1995 (in press)]. CD4- 세포주에 대한 결합은 나타나지 않았으며, 억제 연구는 CD4+ 세포에 대한 결합이 화학양론적 방식으로 가용성 CD4+에 의해 완전히 억제될 수 있음을 입증하였다.
CE9.1 반응성의 특이성을 결정하기 위해, 새로 단리시킨 사람 PBMC에 대한 결합을 이중 색 유세포 분석계 분석에 의해 측정하였다. 도 9는 CD3+ 세포의 약 2/3이 CE9.1에 결합함을 보여준다. 림프계 아군 내에서, OKT4에 결합하는 모든 세포는 또한 CE9.1에 대해 포지티브이며, 반면에 CD8+ 세포는 모두 네가티브이다. 반응성의 상태가 명백히 결정되지는 않지만, 일부 CD3- 세포는 또한 CE9.1과의 반응성을 나타낸다.
림프계 및 비림프계 기원의 32개의 상이한 정상 사람 조직을 포함하는 CE9.1의 조직 반응성을 측정하기 위해, 면역 조직화학적 분석을 수행하였다. 비림프계 조직은 대부분의 기관, 뇌, 심장, 골격근 피부, 간, 신장, 선 및 재생 조직을 포함한다. 이러한 분석은 림프절, 지라, 편도선 및 말초혈(데이터는 나타내지 않음)을 포함하는 림프계 기원의 조직과는 상이한 임의의 조직에 대한 교차반응성을 나타내지 않는다. 림프계 응집체로 한정된 얼룩을 또한 많은 장, 폐, 식도 및 피부에서 관찰하였다.
CE9.1에 의한 사람 MLR의 억제
T 세포 반응에 대한 CE9.1의 효과를 IL-2 생성 또는 증식성 반응으로서 사람 MLR에 의해 평가하였다. CE9.1은 10 내지 30ng/의 IC50으로 증식 및 IL-2 생성을 둘 모두 억제하였으며, 60ng/에서 약 80% 억제를 나타내었다 (도 10).
CE9.1의 Fc 수용체 결합 활성
CD4 및 Fc 수용체에 기초한 세포-세포 부착 검정을 단핵세포 상에서 Fc 수용체와의 CE9.1의 반응성을 측정하도록 개발하였다. 하나의 검정 구성에서, 단핵세포를 퍼콜(percoll) 농도구배 원심분리에 의해 새로운 PBMC로부터 단리시키고, 마이크로리터 플레이트 내에 시딩하고, 48시간 동안 IFN으로 자극하였다. 48시간 후, 염료 로딩된 CD4+ SupT1 세포를 CE9.1의 존재 또는 부재하에 활성화된 접착성 단핵세포에 첨가하였다. 이러한 부착 검정의 제 2 구성에서, 단핵 비부착 세포주, 즉 THP-1 세포를 IFN으로 자극하였다. 24시간 후, 활성화된 THP-1 세포를 마아커 염료로 로딩시키고, CE9.1의 존재 또는 부재하에 마이크로리터 플레이트 내에 사전에(24시간 전) 플레이팅시킨 접착성 CD4+ 섬유아세포 형질전환물에 첨가하였다. 두 경우 모두에서, 세포-세포 부착은 하나의 세포상에서 CD4 및 나머지 하나의 세포상에서 Fc 수용체에 대한 mAb의 결합에 의존한다.
IFN 활성화된 새로운 단핵세포 및 CD4+ SupT1 T 세포를 기본으로 하는, 도 10a, 10b 및 10c에 제공된 데이터는 약 20ng/의 ED50으로, CE9.1이 용량 의존 방식으로 세포-세포 부착을 매개함을 보여준다. 부착은 sCD4에 의해 완전히 억제되고, CE9.1의 F(ab') 2 단편에 의해 매개될 수 없다. IFN에 의해 활성화되지 않는 단핵세포는 CE9.1을 결합시킬 수 없다 (도 10b). 유사한 데이터는 또한 THP-1 및 CD4+ 섬유아세포 검정을 기준으로 한 검정으로 얻어진다 (데이터는 기재하지 않음). 사람 FCRII 수용체로 형질전환시킨 뮤린 섬유아 세포주가 또한 관찰된다 (데이터는 기재하지 않음).
항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)
ADCC 검정에서 표적으로서 사용되는 방사성 표지된 SupT1 세포는 CE9.1의 존재하에 이펙터 세포에 의해 특이적으로 용해되는 것으로 입증되었다. 최대 세포독성은 약 50%의 전체 특이적 용해로 약 6ug/에서 도달된다 (도 12). 포지티브 대조군으로서, IgG2a 이소타입(4D9)의 뮤린 항-CD4를 사용하였다. 상기 항체는 CE9.1과 성질이 매우 유사하여, 동일한 수준의 전체 세포 용해를 제공한다. 따라서, CE9.1은 이펙터 세포에 Fc 수용체를 결합시키고, CD4+ 표적 세포주의 치사를 매개하는 데에 매우 효과적이다.
CE9.1에 의한 보체 고정
Clq의 결합을 상기한 바와 같이(재료 및 방법), 유세포분석계에 의해 측정하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, CE9.1이 감마 1 서브타입의 사람 중쇄 일정 영역을 함유한다는 사실에도 불구하고, 이것은 단지 Clq의 최소 결합만을 나타낸다 (도 13). 친화성 정제된 원숭이 항-CD4 혈청 항체는 Clq 결합을 매개하는 데에 효과적이며, 이는 CE9.1에 의한 Clq 결합의 결여가 상기 항체에 대해 성질 특이성임을 제시하는 것이다. CE9.1에 의한 Clq 결합의 결여는 보체를 고정시키기 위한 불가능성으로 반영된다. 원숭이 혈청으로부터의 친화성 정제된 항-CD4 항체 및 뮤린 모노클로널 IgG2a 둘 모두는 동일한 농도 범위에 걸쳐 상당한 용해를 발생시킨다.
CE9.1 종 교차 반응성
상이한 종으로부터의 림프구의 흐름 세포 측정 분석은 단지 침팬지 및 사람 세포만이 CE9.1을 강하게 결합시킴을 보여준다. 비비는 CE9.1과의 약한 반응성(사람 보다 10배 낮음)을 나타내는 유일한 종이다. 사람 및 침팬지 림프구는 mAb와 동등하게 반응한다 (표 2). 이것은 CE9.1 항체에 의한 침팬지 MLR에서 T 세포 증식 및 IL-2 생성의 유사한 억제로 반영된다.
표 2
종 반응성
사람 침팬지 비비 붉은털원숭이 게잡이원숭이 피그테일 짧은 꼬리 원숭이 개 토끼 쥐 마우스 +++ +++ + - - - - - - -
6마리의 침팬지에서의 생체내 연구
1마리의 침팬지에서의 확대 용량 연구에서 CD4 세포의 제거의 결여에 근거하여, 4마리의 침팬지에 10/의 용량을 제공하였다 (그외에, 대조군 중의 2마리의 동물에는 식염을 제공함). 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이, 2가지 투여군에 각각 연구 0일째에 10/을 제공하였다. 도 15는 이들 동물에서 CD4 및 CD8 계수에 대한 효과를 요약한 것이다. 항체 투여 직후에 CD4 수용체를 발현시키는 세포가 감소함을 알 수 있었다. CD4 계수의 감소는 다지 주어진 항체의 각각의 투여 직후에 나타난다. CD4 계수의 유사한 변동은 식염 대조군에서 나타나지 않았다. CD8 계수는 매일 기준으로 가변성이 관찰되더라도, 처리 과정에 걸쳐 영향받지 않고 유지된다 (도 15, 좌측 패널, 개방원). CD3+- CD8+ 개체를 시험함으로써, CD4 수의 다소 누그러진 감소가 관찰되었다. 데이터는 CD4 항원 매개의 결과일 수 있는 CD3+ CD8- T 세포군의 출현을 제시한다. 정확한 조절 메카니즘은 상기 단계에서 불명료하지만, 다른 림프구 또는 단핵세포에서 발현되는 Fc 수용체의 내면화 또는 발산을 포함할 수 있다. 도 15에서 세포수의 비교는, 주된 효과가 CD4 수용체 매개로 인한 것이더라도, CD4+ 세포의 일부 제거가 발생할 수 있음을 나타낸다. 대부분의 경우에, 조절 효과는 항체 투여 직후 약 7 내지 10일 동안 지속되는 것으로 보이며, 그 후에, CD4 발현은 기준선 바로 아래로 되돌아간다.
전체 CD4 계수는 10 내지 50% 까지 기준선 시점에 비해 저하되어 유지되지만, 처리의 중지 후에, 정상 범위로 되돌아간다. 침팬지는 150일(그룹 1 및 2) 또는 300일(그룹 3) 까지의 기간동안 유지된다. 그룹 2의 동물의 CD4 계수는 최종 처리 80일 후에 정상 수준으로 되돌아가는 반면, 그룹 3의 동물은 동일한 시간 범위에서 기준선의 20% 내로 되돌아간다.
실시예 3
본 실시예는 P 및 E 변형을 포함하는 사람 4 이소타입을 함유하는 붉은털원숭이/사람 키메라 항-CD4 항체인 CE94PE를 생성시키기 위해 포유동물 세포에서 사용되는 DNA 발현 벡터의 유전적 구성을 설명하는 것이다.
DNA 발현 벡터의 구성
사람 감마 4 중쇄 유전자를 Nhe I 및 BamH I 자리를 각각 함유하는 5' IDEC 프라이머 #479 및 3' IDEC 프라이머 #462(도 16 참조)를 사용하여 세포주 TPIT10 (UCLA의 에스. 모리슨으로부터 입수함)으로부터 PCR에 의해 단리시켰다. 사람 감마 4의 전체 클론화 단편을 서열화시켰으며, 카바트(Kabat) 등의 문헌[NIH Publication Fifth Edition No. 91-3242, U. S. Dept. of Health and Human Services (1991)]에 기술된 것과 동일한 것으로 밝혀졌다 (도 17 참조). Nhe I/BamH I 단편을 발현 인자 Anex 2 내로 클로닝시켰다. 상기 플라스미드로부터의 전체 경쇄 및 중쇄 면역 글로불린 유전자를 Bgl II 내지 Sac I 단편 상의 또다른 발현 플라스미드로 이동시켰다. 상기 플라스미드를 NEOSPLA3F에서 항-CD4 (G4,L,Oz)으로 명명하였다.
감마 4 불변 영역에서 아미노산 #229 및 236을 변경시키기 위해 PCR 돌연변이원을 사용하였다. PCR을 Nhe II 및 BspH I 제한 부위를 각각 함유하는 5' 프라이머 GE212(Midland) 및 3' IDEC 프라이머 #698을 사용하여 수행하고, 단편을 3개 부분의 라이게이션에서 항 CD4(G4,L,Oz-) 내로 클로닝시키고, 서열 플라스미드를 NEOSPLA3F에서 항-CD4(G4(PE),L,Oz-)으로 명명하였다.
실시예 4
차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포내에서의 발현
플라스미드의 인테그레이션 및 항체 생성 클론의 선별
CHO 세포(DG44)를 50uM 하이포크산틴 및 8uM의 티미딘(GIBCO/BRL, CHO 배지)를 함유하는 CHO-S-SFM(GIBCO/BRL, CHO 세포)에서 성장시켰다 [참고 문헌 : Urlaub et al., Som. Cell Mol. Genet., 16:555-566 (1986)]. 상기 배지를 CHO 배지 플러스 HT로 명명하였다.
5회의 전기영동을 0.4 페기가능한 크벳 중에서 BTX 600 전기영동 장치(캘리포니아, 샌디에고의 BTX)를 사용하여 4 x 106 세포 및 5ug의 플라스미드 DNA[NEOSPLA3F 중의 항-CD4(4(PE), Lambda, OZ-)으로 수행하였다. 전기영동 전에, 플라스미드를 포유동물 세포에서 발현되는 유전자를 분리시키는 Pac I로 제한하였으며, 플라스미드의 일부는 박테리아에서 플라스미드를 성장시키는 데에 사용하였다. 전기영동을 위한 조건은 230V, 400 F, 13이다. 각각의 전기영동을 하나의 96-웰 접시(약 40,000 세포/웰) 내로 플레이팅시켰다. 전기영동 2일 후, 그리고 필요하다면, 콜로니가 발생할 때 까지, 접시에 400 ug/ 활성 화합물로, G418을 함유하는 CHO 배지 + HT(Geneticin, GIBCO)를 공급하였다. 컨플루언스를 형성한(confluent) 콜로니로부터의 상청액을 사람 항체에 대해 특이적인 ELISA에 의해 키메라 면역 글로불린의 존재에 대해 분석하였다. 28개의 G418 저항성 콜로니가 (480 웰로부터의) 5개의 플레이트에서 발생하였다. 대부분의 항체, 클론, 5Cl을 발현시키는 G418 저항성 콜로니는 전기영동 30일 후에 공류하였다. 서던 블롯 분석은 클론 5Cl이 단일 복제 성분(도시되지 않음)임을 보여주었다. 125 방사구에서 105 세포/로 뿌려진 4일 배양액에서, 상기 클론은 매 28시간 마다 2배가 되었으며, 항체 생성율은 0.5pg/세포/일(0.9/L)이었다.
증폭
클론 5Cl을 칭량하고, 106 세포/플레이트 내지 3 x 104 세포/플레이트의 다양한 농도로, CHO 배지 + 5nM 메토트렉세이트를 함유하는 96-웰 접시(MTX, Sigma (*) 아메토프테린) 내로 플레이팅시켰다. 20일 후에, 클론 5Cl-5B9는 3 x 105 세포/플레이트 상에서 컨플루언스를 형성하였다(96-웰 중 49개가 상기 플레이트에서 성장하였다.). 상기 클론을 칭량하였다. T150에서 105 세포/로 시딩된 4일 배양액에서, 상기 클론은 매 35.5시간 마다 2배가 되었으며, 항체 감소율은 15.3pg/세포/일(18/L)이었다. 클론 5Cl-5B9를 칭량하고, 100 세포/플레이트 내지 3 x 104 세포/플레이트의 다양한 농도로, CHO 배지 + 5nM 메토트렉세이트를 함유하는 96-웰 접시 내로 플레이팅시켰다. 36일 후에, 클론 5Cl-5B9 50Cl은 105 세포/플레이트 상에서 약 60% 컨플루언스를 형성하였다(96-웰 중 50개가 상기 플레이트에서 성장하였다.). 상기 클론을 칭량하였다.
CE94PE 어미 시드 원액(PSS)의 상 I 공급을 위한 세포 뱅크
클론 5Cl-5B9-50Cl의 50nM MTX PSS를 동결시켰다. 세포를 CHO 및 50nM MTX를 함유하는 500 스피너에서 배양시켰다. 동결시에, 배양액은 96% 변동율 및 29.3시간의 배가 시간으로, 1.1 x 106 세포/의 밀도에 도달하였다. 항체 생성은 샌드위치 ELISA에 의해, 약 27pg/세포/일인 것으로 측정되었다. 세포를 배지로부터 원심분리시키고, 95% JRH 바이오사이언스 소혈청 및 5% 시그마 (공통 마스터 혼합물) 중에서 2.0 x 107 세포/의 밀도로 유리병에 담았으며, 세포를 갖는 동결 배지 1를 유리병에서 동결시켰다. 유리병을 -70에서 동결시키고, 다음날 액체 질소 탱크에 넣었다.
하나의 50nM MTX PSS 유리병을 해동시키고, CHO 배지 및 50nM MTX를 함유하는 100ml 스피너에 시딩하였다. 3일 후, 상기 스피너를 2 x 105 세포/ml에서 2 x 125ml 스피너로 분리시켰다; CHO 배지와 50nM MTX를 함유하는 하나의 스피너 및 CHO 배지만을 함유하는 다른 스피너.
3일 후, 단지 스피터의 CHO 배지로부터의 15ml의 세포 및 배지를 동결시키고, 콘시더 미코플라스마(Consider Mycoplasma) 시험에 대한 포인트를 대해서 텍타겐(Tektagen)으로 보냈다. MTX 존재 또는 부재하에 둘 모두의 생성 수행을 8주 동안 계속하였다. 텍타겐으로부터의 결과는 CHO에서의 항-CD4(감마 4(PE), 람다, OZ-) NEOSPLA3F; 미코플라스마가 없는 클론 5C1-5B9-50C1 어미 시드 스톡(Parent Seed Stock)를 나타내는 것이다. 50nM NM PSS의 열 개 유리병을 액체 질소에 보관하기 위해 옮겼다.
마스터 세포 뱅크(MCB)
클론 5C1-5B9-50C1의 50mM MTX PSS 유리병 2개를 해동시키고, CHO 배지 및 50nM MTX를 함유하는 100ml 스피너 플라스크내로 시딩하였다. 9.5 x 105 의 밀도 및 98%의 변동률을 갖는 2000ml의 부피를 수득할 때 까지, 배양물 더 큰 스피너 플라스크로 6일 동안 확장 팽창시켰다. 세포를 배지로부터 원심분리시키고, 95%의 JRH 바이오사이언스 페탈 보빈 세룸(Biosciences Fetal Bovin Serum) 및 5%의 시그마 히브리막스(Sigma Hybrimax) DMXO에서 2.0 x 107 세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 동결 배지에서의 세포 현탁액을 MCB G4PE50-M-A로서 설계된 각각의 80 저온유리병에 나누었다(10ml). 유리병을 -70에서 동결시켰다. 24시간 후, 세포 뱅크를 액체 질소에 저장하기 위해 옮겼다.
실시예 5
CD4 mAb의 안정성
CE94PE 및 CE94E 용액의 물리적 및 화학적 안정성을 3달에 걸쳐 5, 40에서 모니터하고, SDS-PAGE(감소된 및 비감소된), IEF, 역상-HPLC, 크기 제외 크로마토그래피(SEC) 및 ELISA에 빛을 확산시켰다. RP-HPLC 및 비감소된 SDS-PAGE에 의한 초기 시험은 CE94PE가 두 개의 주요 종, 즉 비감소된 전체 분자 및 비공유적으로 결합된 분자로 구성되어 있으며, 이들이 분석 조건하에 "할프머"로 표지된 두 개의 동일한 단위로 분리됨을 시사한다. 흥미있게도, 상기 두 mAb의 바이오-분석 프로필에서의 주요한 차이점이 SEC, IEF, SDS-PAGE(감소된) 및 ELISA에 의해 관찰되지 않는다. RP-HPLC 또는 SDS-PAGE(비감소된)에 의한 CE94PE에서 "할프머"의 양은 1% 미만이다. 도 18에는 CE94PE 및 CE94E의 용액에서 모노머 및 "할프머"의 SDS-PAGE(비감소된)가 도시되어 있다. CE94E에서 "할프머"의 양은 3달에 걸친 시험된 어느 조건하에서도 초기 시험에 관하여 일정함을 유지한다. CE94PE에서 "할프머"의 내용물은 시험된 모든 시간 조건에서 2% 미만을 유지하였다. CE94E와 CE94PE의 안정성에 있어서의 차이점은 5 및 40에서 관찰되지 않았다. 빛의 확산하에 저장된 CE94E는 CE94PE보다 조금 덜 안정적이다. 데이터는 CE94E에서의 "할프머"가 전체 분자의 전반적인 안정성에 현저한 영향을 끼지지 못함을 시사한다. CE94PE와 CE94E의 물리적 안정성에서의 주요한 차이점은 관찰되지 않았다.
표면 플라스몬 공명에 의한 CD4 mAb의 친화도 및 화학량론
고정된 mAb에 대한 가용성 CD4 결합의 화학량론을 BIAcore(팔마시아(Pharmacia))에서 포화 결합 실험에 의해 측정할 수 있다. SPR 과정의 회합 및 해리 단계에 대한 데이터(도 19)를 문헌[O'Shannessey et al., Anal. Biochem., 212:467-468 (1993)]에 설명된 바와 같은 속도 방정식의 적분 형태를 이용하여 곧바로 분석하였다. 몰 CD4/몰 mAb로 표현된 결합 데이터의 요약은 표 3에 나타나 있다. 상기 데이터로부터 모든 경우에서, 결합의 화학량론이 1.5:1보다 더 크다는 것을 알 수 있다. BIAcore 가 고체상 상호작용 시스템이고, 고정화 프로토콜이 임의적인 경우에, 상기 결과는 각각의 mAb의 둘 모두의 항원 결합 영역이 기능적이라는 것을 시사한다. 따라서, CD4 결합의 화학량론은 모든 mAb에 대해 동일하고, 이론상의 값 2.0에 근접하다. 또한, 친화도 측정은 모든 mAb 복합체에 대해 동일한 친화도, 즉 약 1.0nM을 나타낸다.
표 3
표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 결합의 화학량론 및 친화도
항체 BIAcore 화학량론 친화도(nM 25)
CE9.1 1.56 0.99
CE94 1.61 1.34
CE94E 1.72 1.43
CE94K 1.67 1.08
CE94PE 1.09
실시예 6
CE94PE의 생체외 생물학적 평가
요약
CE9.1, CE94PE 및 다른 감마 4 유도체를 Fab 영역(MLR) 및 Fc 도메인(Fc 수용체 결합, ADCC 및 CDC)에 의해 매개되는 활성에 대하여 비교하였다. Fab 의존 활성(MLR)은 mAb 간에 상이하지 않았지만, 이들의 Fc 수용체 결합 특성은 상이하였다. 비변형된 감마 4 유도 CE94는 Fc 수용체에 대한 놀랄만큼 강한 결합을 나타내지만, CE4E 및 CE94PE에서의 E 돌연변이는 상기 결합 및 ADCC 활성이 제거되었다.
혼합된 림프구 반응(MLR)에서 mAb의 효과
세 가지 방법으로 혼합된 림프구 반응(MLR) 분석을 수행하여, 모든 항원 유도 T 세포 증식 및 EL-2 생성에 대한 mAb 구성의 효과를 측정하였다. MLR은 본 발명의 CD4+ T 세포에 의존적이며, 대부분의 반응은 세포에 존재하는 항원상의 MHC 글래스 II 분자와 상호작용을 통한 CD4 수용체의 참여에 의존적이다. MLR 반응은 생체내 이식 거부의 관점에 대한 시험관내 상호관계를 나타낸다. 기타 약물의 관점에서, MLR은 또한 시클로스포린 A와 같은 면역억제제에 의해 차단된다.
모든 mAb 구성물은 MLR을 차단능에 있어서 동등하며, T 세포의 증식 반응 및 IL-2 생성으로서 둘다 판독되었다(도 20 및 표 4). 따라서, 사람 4구조물상의 CE9.1의 V 도메인 조직이식 및 힌지에서의 "P & E" 치환물 및 CH2 도메인은 시험관내 CD4 의존 T 세포 반응물을 차단하는 mAb의 능력에 영향을 미치지 않았다.
표 4
MLR에 대한 mAb의 효과 - 요약
항체 증식(IC50) IL-2 생성(IC50)
CE9.1 20 ng/ 5 ng/
CE94 20 ng/ 5 ng/
CE94E 20 ng/ 10 ng/
CE94K 20 ng/ 20 ng/
CE94PE 20 ng/ ND
결론
모든 mAb는 MLR의 억제에 있어서 동등하였다.
mAb의 Fc 수용체 결합 특성
Fc 수용체 결합의 측정에 대한 검정 확인
CE94PE를 FcR 결합 활성이 제거되도록 설계하였다. 이러한 활성을 측정하기 위해, 브릿징을 통해 mAb에 의한 세포의 FcR 및 CD4 매개된 부착을 기초로 검정을 전개하였다. 이러한 검정은 생체내 CD4 세포의 FcR 및 mAb 매개된 제거에 대한 시험관내 상호 관련으로써 mAb의 CD4 및 FcR 결합 기능을 동시에 측정하였다.
도 21은 CE9.1이 부착 검정에서 FcR 발현 단구 세포(IFN--유도된 THP-1 세포)의 CD4+ 섬유아 세포(CD4 트랜스펙션된 섬유아세포 세포주)에의 부착을 용이하게 함을 입증하는 것이다. 양말단이 잘린 F(ab')2가 결합을 용이하게 할 수 없기 때문에 결합은 mAb CE9.1의 Fc 도메인에 의존한다. 결합은 또한 sCD4와의 점유가 세포-세포 부착을 차단하기 때문에 CE9.1의 항원 인식 영역을 필요로 한다.
mAb의 Fc 수용체 결합 활성의 측정
mAb CE9.1(IgG1), CE94(IgG4), CE94K(IgG4 K, 하이브리드), CE94E(IgG4, E 돌연변이체) 및 CE94PE(IgG4, PE 돌연변이체)는 세포 표면 CD4 및 FcR를 동시에 결합시키는 능력에 대해서 평가하였다.
기대한 바와 같이, CE9.1은 본 검정에서 우수한 결합 활성을 가졌다. 놀랍게도, IgG4 구성물, CE94 및 CE94K은 본 검정에서 CE9.1과 구별할 수 없는, FcR에 대한 친화성을 충분히 보유하였다. 본 검정에서의 활성은 CE94E 및 CE94PE에서와 같이 "E" 치환체가 도입되는 경우에만 손실되었다(도 22 참조),
CE94PE의 시험관내 Clq 결합 특성
보체계는 여러 기능 요소중에서 세포 용해 및 파괴를 유발하는 방법으로 항체의 특정 유형과 상호작용하는 능력을 함유한다. 사람 IgG1 항체는 일반적으로 Clq를 결합시키고 특이성을 갖는 표면 항원을 함유하는 표적 세포를 제거하는 능력을 갖는다. IgG4와 같은 기타 사람 이소타입은 Clq를 결합시키는 능력이 감소됨을 보이며, 따라서 표적 세포를 제거시킬 수 없을 것이다. 감마 4 구성물중에서 CE94PE의 조작은 이론상으로 보체 결합을 억제하는 목적을 달성하고, 항체가 잠재적인 파괴성 부작용을 제거하는 CD4 표적 세포에 결합하도록 할 수 있을 것이다.
CE94PE 및 CE9.1의 CDC 이펙터 특성을 토끼 보체의 존재하에서 크롬 표지된 CD4+ SupT1 세포의 보체 매개된 세포용해의 고전적인 방법을 사용하여 비교하였다. 이들 연구에서, HuCD4, 4D9(IgG2a)로의 뮤린 보체 결합 mAb이 포지티브 대조군으로 사용되었다. CE9.1 및 CE94PE는 모두 토기 보체를 결합시키는데 비효과적이었다(도 23). CE9.1이 Clq와 불완전하게 결합하고, 따라서 사람 보체를 결합시킬 수 없다는 것은 보다 일찍 알려졌다. 이러한 결과는 두 구성물이 보체 이펙터 메카니즘을 통해 세포 용해를 촉진시킬 수 없음을 보여준다.
CE94PE의 시험관내 ADCC 이펙터 특성
FcR에 의해 mAb를 결합시킬 수 있는 잠재적인 세포독성을 갖는 세포는 항체 코팅된 표적 세포로 유도된 ADCC를 매개할 수 있다. CD4 분자를 발현시키는 사람 T 헬퍼 세포는 FcR 함유 킬러 세포, 과립백혈구 및/또는 매크로파지에 의해 세포 분해 공격을 자극하는 mAb CE9.1에 의해 인식된다. CE94PE의 조작에 있어서 목적은 mAb의 FcR로의 결합능을 제거하는 것으로, 이는 CD4 표적 세포의 제거를 매개하는 보조 세포의 능력을 제거하는 반면 mAb가 면역억제성은 여전히 보유하도록 한다.
CE94PE 및 CE9.1의 ADCC 이펙터 특성의 비교는 크롬 표지된 CD4+ SupT1 세포의 세포 매개된 세포용해의 고전적인 방법을 사용하여 달성하였다. 뮤린 CD4 mAb 4D9(IgG2a, K)를 포지티브 대조군으로 선택하였다. 이펙터 세포는 연막으로부터 얻은 사람 말초혈 백혈구였다. 도 12는 CD4+ 세포의 특이적 용해를 매개하는 mAb 4D9 및 CE9.1의 능력을 나타낸 것이다. 동일한 조건하에서 CE94PE는 거의 효과를 나타내지 않았다.
이들 결과는 CE94PE가 FcR 또는 보체 메카니즘을 통해 세포 용해를 매개할 수 없음을 보여준다.
실시예 7
CE94E 및 CE94PE의 약력학적 비교 분석
2개의 리드 4 mAb, CE94E 및 CE94PE의 약력학적 비교를 수컷 스프라그-도울리 쥐로 조사하였다. CE94E 또는 CE94PE를 정맥내 환약으로서 1/(각군당 4마리)으로 투여하고, 혈액 샘플을 투여후 4주 동안 취하였다. 혈장 CE94E 및 CE94PE 농도를 순환하는 사람 IgG의 존재 뿐만 아니라 재조합 사람 가용성 CD4를 결합하는 능력을 확인하기 위해 설계된 sCN4/항 사람 IgG 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하였다.
CD4 mAB, CE94E 혈장의 1/ 정맥내 환약 투여 후, 농도를 3단계 방법으로 감소시키고, CE94PE 혈장 농도를 2단계 방법으로 감소시켰다(도 24). 비교의 목적과 CE94E에 대한 완료 상태를 적절히 기술하는 데 불충분한 수의 데이타 포인트로 인해, 모든 혈장 농도-시간 프로파일을 2단계 모델을 사용하여 분석하였다. 내부물의 변화가 약간 관찰되었다. 우세한 제 2 단계 t1/2는 CE94E에 대해 약 4일이었고, CE94PE에 대해서는 9일이었으며, 각각 혈장 농도-시간 곡선하의 총면적의 67% 및 93%로 계산되었다. CE94PE의 겉보기 혈장 제거율은 낮았으며(6.4/hr/), CE94E의 제거율의 약 절발(1.0/hr/)이었다. 따라서, PE 돌연변이체 4 mAb, CE94PE의 약력학적 특징은 쥐에서 기타 사람화된 1 mAb와 유사하다.
쥐내에서 기능적으로 손상되지 않은 CE94PE의 긴 순환 반감기는 또한 CE94PE가 사람에 투여되는 경우 연장된 기간 동안 효과적일 것임을 시사한다.
이러한 결과는 PE 돌연변이체 CE94PE가 쥐에서의 CE9E 돌연변이체보다 2배 낮은 혈장 클리어런스와 긴 반감기를 가짐을 확인시켜 준다.
표 5
스프라그-도울리 쥐에 1/의 환약을 투여한 후 CE94E 및 CE94PE의 약력학적 파라미터(평균 ±SD)
CD4 mAb CL(/hr/) AUC(ug % hr/) MRT(hr) T1/2 -1(hr) T1/2 -2(hr) %AUC2 VSS(/)
CE94E 0.999±37 1010±30 109±2 15.2±.8 97.7±9.5 55.7±4.2 109±4
CE94E 1.32±.30 760±38 79.5±6.0 16.6±.9 95.3±0.8 52.1±0.0 103±8
CE94PE 0.410±.074 2500±40 295±3 9.9±.3 224±3 93.4±.2 119±6
약리학적 파라미터의 약어: CL = 총 플라스마 클리어런스; AUC0-inf = 시간 곡선에 대한 플라스마 농도하의 총면적; MRT = 평균 체류 시간; T1/2 -2 = 제 2 단계에서의 겉보기 반감기; % AUC2 = 제 2 단계 동안 시간 곡선에 대한 플라스마 농도하의 면적%; VSS = 정지상에서의 분포 용적
상기 결과를 기초로 하여, CE94PE는 예를 들어 생체내 투여에 의해, 치료용으로 적합해야 한다. 또한, 기타 투여 경로가 또한 적합할 수 있다.
실시예 8
HuCD4 + 유전자 이식 마우스의 생체내 약력학적 연구
HuCD4 유전자 이식 마우스에 대한 설명
서론
CE91 및 CE94PE의 고도의 종 특이성이 생체내 효율을 평가하기 어렵게 한다. CE9.1에 대한 약력학적 반응은 CD4+ 세포의 투여량 의존 제거를 통해 침팬지에서 용이하게 관찰될 수 있다. CE94PE에서의 기대된 상기 활성의 부재는 효능을 평가하기 위한 다른 수단을 사용하도록 유도하였다. 특히, 효능은 HuCD4 유전자 이식 마우스에서 관찰된다. 이 시스템에서의 연구가 하기에 기술된다.
HuCD4 + 유전자 이식물
UCSF(Killeen et al., EMBO J., 12:1547-53(1993))에서 개발된 HuCD4 유전자 이식 마우스에서, 내인성 MuCD4 유전자를 상동 재조합에 의해 분열시키고, 사람 CD4 미니 유전자 이식을 MuCD4 프로모우터의 조절하에 도입하였다. 마우스에서는 상형접합성(homozygosity)에 대해 이종교배된 이들 마우스에 있어서 HuCD4는 MuCD4를 대신한다. HuCD4는 흉선에서 포지티브 및 네거티브 선택을 회복시키며, 이는 정상적인 마우스에서 발견되는 것들로 계산될 수 있는 수분에서 단일의 포지티브 말초 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 도입을 유도한다. 또한, MuCD4 녹아웃(knockout) 어미와 비교하여 성숙한 HuCD4 T 세포는 이들의 정상적인 뮤린 상응물과 유사한 특성을 증명한다: (1) 생체내, 혈청 IgG 수준이 정상적인 수준으로 회복되며, (2) 이러한 동물들은 시험관내 NMR 반응에서 적합한 MHC 의존 반응을 보인다.
이들 마우스의 유전자 배경은 배아 간세포와 마우스, 그리고 초기 녹아웃 및 유전자 이식 실험에서 상이한 균주를 사용할 필요성으로 인해 다소 복잡하다. 초기 녹아웃/유전자 이식 마우스를 이어서 MHC 위치에서 상형접합성에 대해 이종 교배시켰으며, SB에서 사용중인 마우스는 H-2dd 하플로타입(haplotype)이다.
결과는 외래 항원, 난알부민에 대해 양호한 반응이 이들 HuCD4 마우스에서 얻어지는 것으로 나타났으며, 초기 연구는 CE94PE에 대한 생체내 활성을 입증하였다.
HuCD4 유전자 이식 마우스에서 CE94PE의 예비 평가
12 마리의 HuCD4 유전자 이식 마우스(H-2dd)를 수용하여, CE94PE를 IF3(뮤린 항사람 CD4) 및 GK1.5와 비교하는데 사용하였다. -2, -1 및 0일 째에 마우스에 1의 항체를 복강내 투여하고, 마지막 투여 3시간 후에 OVA로 면역시켰다. 마우스는 2주 후에 희생되었으며, 기능 활성에 대해 혈청 및 세포를 평가하였다. OVA 특이적 항체 반응은 도 25에 도시되어 있다. 예상된 바와 같이, 마우스 CD4(GK 1.5)에 대한 mAb는 체액 반응에는 전혀 효과가 없는 반면, HuCD4에 대한 두개의 mAb는 상기 반응을 차단하였다. CE94PE는 두개의 mAb 보다 극적이다.
그러나, Con A 및 LS에 반응한 모든 마우스 그룹에는 난알부민에 대한 반응 및 MLR에서 약간의 변화가 있었다. 이는 상기 동물의 일군이 수컷 및 암컷을 모두 포함하며, 연령이 다르다는 사실에 기인한 것일 수 있다.
MuCD4-/-(CD4 녹아웃) 마우스 및 HuCD4 +/+ (유전자 이식 마우스)를 CE9.1, CE94PE 또는 염수로 처리하였다. 이 연구는 28일 기간 동안 수행하였으며, 샘플을 1, 3, 7, 14 및 28일째에 취하였다. 이들 마우스로부터 비장세포의 3색 유량 혈구계산 분석법이 사용되어 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 희생시켰다. T 세포 수준을 측정하기 위해 하기 항체를 사용하였다: CD3-PE, OKT4-FITC, CD8-TC. 이들 마우스에서 T 및 B 세포를 희생시키기 위해 하기 항체를 사용하였다: CD3-PE, CD2-FITC, CD45-TC. CE9.1 또는 CE94PE 코팅된 세포를 희생시키기 위해, 하기 mAb 판넬을 사용하였다: OKT4-PE, Leu3a-FITC, CD3-TC.
CE9.1 또는 CE94PE 처리된 유전자 이식 마우스(HuCD4 +/+) 둘 다에 있어서, 모든 CD4+ 세포를 1 일째에 항체로 코팅하였다. 코팅은 수일 동안 유지되었으며, 28일 째에는 더 이상 검출되지 않았다. CE9.1 처리된 마우스에서 처리된 CD4+ 세포의 총수는 28일째에서도 상당히 감소되었다. 대조적으로, CE94PE 처리된 마우스에는 총 CD4+ 세포가 감소하지 않았다. 항체는 둘다 CD4 수용체 변화의 증거를 나타내었다. CE9.1 처리된 마우스에서 CD8+ 세포의 %는 상호 증가하지만, 이러한 절대적 수치가 상기 처리에 의해 상당히 영향을 받는다는 증거는 없다. 이와 유사하게 CD8+ 세포의 수는 CE94PE 처리된 마우스에 영향을 받지 않았다. 모든 실험에서, 어느 한 항체의 경우, B 세포의 수는 일정하게 존재하였다.
침팬지에서의 생체내 연구
6마리의 침팬지를, 항체 CE94PE의 투여량을 15/까지 증가시켜 주입한 후, CD4+ T 세포의 제거 및/또는 세포 표면으로부터 CD4 수용체의 변화에 대해 관찰하였다. 말초혈 샘플을 각각의 챔팬지로부터 취한 후, 3주 및 2주 후에 CD4 T 세포에 대해 기준선을 확립시키기 위해 연구하기 시작하였다. CD4+ 세포 이외에, CD3+ 및 CD8+ 세포 수준을 또한 유량 혈구계산법에 의해 측정하였다. CD4 분자의 상이한 부분에 결합하며, CE94PE와의 결합에 대해 경합하지 않는 mAb OKT4를 대조군으로 사용하였다. 총 CD3+ 카운트에서 CD8+ 카운트를 공제하므로써, CD4+ 세포의 수에 대한 이론값이 계산될 수 있다. 이 값은 OKT4를 구하여 측정된 CD4+ 세포와 비교하므로써, CD4 수용체 변화는 CD4+ 세포 제거와 구별될 수 있을 것이다.
상기 연구의 개시시에, 각각 침팬치에 염수를 정맥내 주사하였다. 혈액 샘플을, 주사후 3일 및 14일 후에 즉시 취하였다. CE94PE(0.05/)을 각각의 침팬지에 주사하고, 혈액 샘플을 3일 및 14일 후에 취하였다. CD4+ 세포를 관찰하고, 이들이 정상적인 범위내에 있는 경우, 후속 수준의 투여량으로 CE94PE의 제공하였다. 모든 경우에 있어서, 각각의 침팬지는 하기의 원안에 따른다: 염수, O.05/ CE94PE, 1.5/ CE94PE, 염수, 15/ CE94PE.
0.05/으로 염수 또는 CE94PE를 주사한 후, CD4 수준에는 아무런 효과가 없었다. 1.5/에서, CD4+ 세포 코팅이 관찰되었으며, CD4+ 세포 제거가 없었지만 세포 표면으로부터 CD4 수용체의 일시적이고 부분적인 변화가 관찰되었다. CE94PE 15/에서, CD4+ 세포 제거는 어느 동물에서도 관찰되지 않았지만, 모든 동물에서 상당한 변화가 관찰되었다. 상기 변화 효과는 일시적이며 14 내지 21일후 기본선으로 회복되었다. 어느 동물에서도 나쁜 결과는 관찰되지 않았다. CE94PE는 투여후, 2일까지 세포 표면상에서, 그리고 혈청에서 관찰될 수 있었다.
CE94PE는 비제거 항체인 것으로 설계되었으며, 15/의 비교적 높은 투여량으로도, 모든 동물에서도 제거가 관찰되지 않았다. CE94PE는 침팬지의 혈청에서 안정하였으며, 21일까지 순환 혈액에 존재하였다.
용도
상기 기술된 방법으로, 또는 동등한 기법으로 생성된 항체는 기능적 생물학적 검정으로 특징화시키기 위해 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합에 의해 정제될 수 있다. 이들 검정은 특이성 및 결합 친화성 뿐만 아니라 발현된 이소타입, 예를 들어, ADCC와 연관된 이펙터 기능 또는 보체 결합의 측정을 포함한다. 이러한 항체는 B 세포 림프종을 포함하여, CD4 발현 및 T 세포와 관련된 수많은 사람 질병, AIDS, 자가면역 및 염증성 질병을 포함하는 감염성 질병 및 이식에 대한 수동적 또는 활성 치료제로서 사용될 수 있다. 상기 항체는 천연형으로, 또는 항체/킬레이트, 항체/약제 또는 항체/톡소 복합체의 일부로서 사용될 수 있다. 추가로, 항체 전체 또는 항체 단편(Fab2, Fab, Fv)은 항유전형 반응의 발생에 대한 활성 면역 치료에 있어서 영상화제로서 또는 효능있는 백신 또는 면역원으로서 사용될 수 있다.
치료 효과를 얻는 데 유용한 항체의 양은 당업자들에게 널리 공지된 표준 기법에 의해 결정될 수 있다. 항체는 일반적으로 약제학적으로 허용되는 완충 범위내에서 표준 기법에 의해 제공될 것이며, 바람직한 경로에 의해 투여될 수 있다. 본원에 청구된 항체의 효능 및 사람에 의한 이들의 내성으로 인해, 이들 항체를 각각 투여하므로써 사람의 여러 질병 또는 질병 상태를 구제할 수 있다.
본 발명의 항 CD4 재조합 항체(또는 이들의 단편)는 또한 면역조절을 유도하는 데, 예를 들어 사람 또는 동물의 면역 계통을 억제하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 상기와 같은 항체를 사람 또는 기타 동물에 비독성의 유효량으로 투여하므로써 이를 필요로 하는 사람 또는 기타 동물에 예방적으로 또는 치료적으로 면역조절을 유도시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물의 면역조절 유도능은 이러한 목적에 사용되는 표준 시험, 예를 들어, 혼합 림프구 반응 시험 또는 티미딘 흡수에 의해 측정되는 T 세포 증식 억제를 측정하는 시험에서 입증될 수 있다.
본 발명의 항체가 면역 억제 방법을 유도하는 데 이용된다는 사실은 본 발명의 항체가 이식된 기관 또는 조직(예를 들어, 신장, 심장, 폐, 골수, 피부, 각막 등)의 치료 또는 저항성 예방 또는 거부; 자가면역, 염증성, 증식성 및 과증식 질환의 치료 또는 예방, 및 면역적으로 매개된 질병(예를 들어, 류마티스성 관절염, 홍반성 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 중증군무력증, 제 1형 당뇨병, 포도막염, 신증후군, 건선, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염 및 또 다른 습진성 피부염, 지루성 피부염, 편평 태선, 천포창, 수포성 천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부성 호산구증가증, 원형 탈모증 등)의 피부 징후의 치료 또는 예방; 가역적 폐쇄 기도 질병, 장 염증 및 알레르기(예를 들어, 복강 질병, 직장염, 호산구성 위소장염, 비만세포증, 크론 질병 및 궤양성 대장염) 및 음식물 관련 알레르기(예를 들어, 편두통, 비염 및 습진)의 치료에 유용하다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 항체는 면역조절이 바람직한 비자가면역 상태, 예를 들어, 이식편대숙주병(GVHD), 이식 거부, 천식, HIV, 백혈병, 림프종 등을 치료하는 데 유용하다.
당업자는 일반적인 실험에 의해 면역 억제를 위한 항체의 비독성 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로, 유효 투여량은 일당 체중 당 약 0.05 내지 100일 것이다.
본 발명의 항체(또는 이들의 단편)은 또한 포유 동물의 종양을 치료하는데 유용할 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 항체는 종양이 있는 동물에게서 종양 크기를 감소시키고, 종양 성장을 억제하고, 및/또는 생존 기간을 연장시키는데 유용할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 사람 또는 동물에 비독성 유효량의 항체를 투여하므로써 종양을 치료하는 방법에 관련된다. 당업자는 일반적인 실험에 의해 발암성 종양을 치료하기 위한 항체의 비독성 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 일반적으로, 유효 투여량은 일당 체중 당 약 0.05 내지 100인 것으로 예상된다.
본 발명의 항체는 치료 또는 예방 효과를 낼 수 있는 충분량으로 상기 치료 방법에 따라 사람 또는 기타 동물에 투여될 수 있다. 본 발명의 이러한 항체는 본 발명의 항체를 공지된 기법에 따라 종래의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 제조된 종래의 투여 형태로 사람 또는 기타 동물에 투여될 수 있다. 당업자에게는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특징이 조합하려는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 기타 널리 공지된 변수에 의해 결정됨을 인지할 것이다.
본 발명의 항체(또는 이들의 단편)의 투여 경로는 흡입에 의한 경구, 비경구, 또는 국소일 수 있다. 본원에서 사용되는 비경구적이란 용어는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 또는 복강내 투여를 포함한다. 비경구 투여의 피하 및 근육내 형태가 일반적으로 바람직하다.
예방적으로 또는 치료적으로 면역 억제를 유도하거나 발암성 종양을 치료학적으로 치료하는데 본 발명의 화합물을 사용하기 위한 일일 비경구 및 경구 투여량은 일당 체중 당 일반적으로, 약 0.05 내지 100mg, 바람직하게는 약 0.5 내지 10일 것이다.
본 발명의 항체는 또한 흡입에 의해 투여될 수 있다. "흡입"은 비강내 및 경구 흡입 투여를 의미한다. 에어로졸 제형 또는 투여량 계측 흡입기와 같은, 상기 투여에 대한 적합한 투여 형태는 종래의 기법에 의해 제조될 수 있다. 사용하려는 본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 일반적으로 약 10 내지 100이다.
본 발명의 항체는 또한 국소적으로 투여될 수 있다. 국소 투여는 비전신성 투여를 의미하며, 본 발명의 항체(또는 이들의 단편) 화합물을 표피, 협면 와동에 외부적으로 도포하는 것과 이러한 항체를 귀, 눈 코, 및 혈류가 상당히 유입하지 않는 곳에 주입하는 것을 포함한다. 전신성 투여는 경구, 정맥내, 복강내 및 근육내 투여를 의미한다. 치료 또는 예방 효과에 요구되는 항체의 양은 선택된 항체, 치료받는 상태의 특성 및 심각도, 및 치료중인 동물에 의해 달라질 것이며, 최종적으로는 의사에 의해 결정된다. 본 발명의 항체의 적합한 국소적 투여량은 일반적으로 일당 체중 당 약 1 내지 100일 것이다.
제형
항체 또는 이의 단편은 단독으로 투여될 수 있지만, 약제학적 제형으로 존재하는 것이 바람직할 수 있다. 국소 투여에 대해, 활성 성분은 제형의 0.001 내지 10%(w/w), 예를 들어 1 내지 2 중량%를 포함할 수 있지만, 제형의 10%(w/w) 만큼 포함할 수 있으며, 5%(w/w)를 초과하지 않는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1%(w/w)를 포함할 수 있다.
본 발명의 국소 제형은 활성 성분과 함께 이를 위한 하나 이상의 허용되는 담체 및 임의로 기타 치료적 성분을 포함한다. 상기 담체는 제형의 나머지 성분들과 상용성이 있다는 의미에서 허용되어야 하며, 이의 부형제에 대해 유해하지 않아야 한다.
국소 투여에 적합한 제형에는 도고제, 로션, 크림, 연고 또는 페이스트와 같은, 피부를 통해 치료가 필요한 부위에 침투하기에 적합한 액체 또는 반액체 제조물을 포함한다.
본 발명에 대한 점적제는 살균된 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있으며, 살균 및/또는 살진균제 및/또는 기타 적합한 방부제(및, 바람직하게는 계면활성제를 포함)의 적합한 수성 용액중에 활성 성분을 용해시키므로써 제조될 수 있다. 형성된 용액을 이후 여과에 의해 정제하고, 적합한 용기로 옮긴 후 밀봉하고, 고압솥처리 또는 30분 동안 90 내지 100에서 유지시키므로써 살균처리한다. 선택적으로, 상기 용액은 여과에 의해 살균처리하고, 방부 기법에 의해 용기에 옮길 수 있다. 점적제에 포함되는 적합한 살균제 및 살진균제의 예로는 페닐수은 니트레이트 또는 아세테이트(0.002%), 벤즈알코늄 클로라이드(0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트(0.01%)가 있다. 오일성 용액의 제조에 적합한 용매에는 글리세롤, 희석된 알코올 및 프로필렌 글리콜이 포함된다.
본 발명에 따른 로션은 피부 또는 눈에 적용하기에 적합한 것들이 포함된다. 눈에 적합한 로션은 임의로 살균제를 포함하는 살균 수성 용액을 포함할 수 있으며, 점적제의 제조를 위한 것들과 유사한 방법으로 제조될 수 있다. 피부에 적용하기 위한 로션 또는 도고제는 또한 알코올 또는 아세톤과 같은 피부 건조를 촉진시키고 피부를 시원하게 하는 제제, 및/또는 글리세롤 또는 카스트르 오일 또는 아라키스 오일과 같은 오일과 같은 습윤제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 크림, 연고 또는 페이스트는 외부 적용을 위한 활성 성분의 반고체형의 제형이다. 이들은 활성 성분을 미세 분할된 또는 분말화된 형태로, 단독으로 또는 용액으로 또는 수성 또는 비수성 유체의 현탁액으로 적합한 기계의 도움으로, 유지성 또는 비유지성 기제와 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다. 상기 기제는 경질, 연질 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속성 비누와 같은 탄화수소; 점액; 아몬드, 옥수수, 아라키스, 카스토르 또는 올리부 오일과 같은 천연 오일; 양모지 또는 이의 유도체, 또는 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산과 프로필렌 글리콜 또는 매크로골(macrogol)과 같은 알코올을 포함할 수 있다. 상기 제형은 소르비탄 에스테르 또는 이들의 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은, 음이온성, 양이온성 또는 비이온성 계면 활성제와 같은 적합한 계면 활성제를 혼입시킬 수 있다. 천연 검, 셀룰로오스 유도체 또는 실리카성 실리카, 및 라놀린과 같은 기타 성분이 또한 포함될 수 있다.
당업자에게는 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 최적량 및 각각의 투여 간격이 치료받는 상태의 특성 및 정도, 투여 형태, 경로 및 영역, 및 치료받는 특정 동물에 의해 결정되며, 이러한 최적량은 종래의 기법에 의해 결정될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 당업자는 최적의 투여과정, 정의된 날수 동안 하루에 주어지는 본 발명의 항체 또는 단편의 투여수가 종래의 치료 측정 시험의 과정을 사용하여 당업자들에 의해 확인될 수 있음을 인지할 것이다.
더 이상 추가하지 않고, 당업자는 상기 설명을 이용하여 본 발명을 전부 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 내용은 단지 예시적 실시예로서 해석되며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
캡슐 조성물
캡슐 형태의 본 발명의 약제 조성물을 2부분으로 된 경질 젤라틴 캡슐을 분말 형태의 본 발명의 항체 또는 이의 단편 50, 락토오스 100, 탈크 32 및 마그네슘 스테아레이트 8으로 충전시키므로써 제조한다.
주사가능한 비경구적 조성물
주사에 의한 투여에 적합한 형태의 본 발명의 약제 조성물을 10부피%의 프로필렌 글리콜 및 물중에서 본 발명의 1.5 중량%의 항체 또는 이의 단편을 교반시키므로써 제조한다. 이 용액을 여과에 의해 살균처리한다.
연고 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 1.0g
100.0g이 되도록 하는 백색 연질 파라핀
본 발명의 항체 또는 이의 단편을 소량의 비히클중에서 분산시켜 부드러운 균질의 생성물을 제조한다. 이후, 금속 압출 튜브에 상기 분산액을 채운다.
국소 크림 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 1.0g
폴라왁스(Polawax) GP 200 20.0g
무수 라놀린 2.0g
백색 밀랍 2.5g
메틸 히드록시벤조에이트 0.1g
100g이 되도록 하는 증류수
폴라왁스, 밀랍 및 라놀린을 함께 60로 가열한다. 메틸 히드록시벤조에이트를 첨가하고, 고속 교반으로 균질화시킨다. 이후 온도를 50로 낮춘다. 이후, 본 발명의 항체 또는 단편을 첨가하고, 분산시키고, 조성물을 느린 속도로 교반하면서 냉각시킨다.
국소용 로션 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 1.0g
소르비탄 모노라우레이트 0.6g
폴리소르베이트 20 0.6g
세토스테아릴 알코올 1.2g
글리세린 6.0g
메틸 히드록시벤조에이트 0.2g
100.00가 되도록 하는 정제수 B.P.(British Pharmacopeia)
메틸 히드록시벤조에이트 및 글리세린을 75에서 70의 물중에 용해시킨다. 소르비탄 모노라우레이트, 폴리소르베이트 20 및 세토스테아릴 알코올을 함께 75에서 용해시키고, 수용액에 가한다. 형성된 에멀션을 균질화시키고, 지속적인 교반으로 냉각시키고, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 나머지 물중의 현탁액으로서 가한다. 현탁액 전부를 균질하게 될 때까지 교반시킨다.
안약 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 0.5g
메틸 히드록시벤조에이트 0.01g
프로필 히드록시벤조에이트 0.04g
100.00가 되도록 하는 정제수 B.P.
메틸 및 프로필 히드록시벤조에이트를 75에서 70의 정제수에 용해시키고, 생성된 용액을 냉각시킨다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 첨가하고, 상기 용액을 막 필터(다공 크기 0.022)를 통과시켜 여과하여 살균처리하고, 방부적으로 적합한 살균 용기에 충전한다.
흡입에 의한 투여용 조성물
15 내지 20 용량의 에어로졸 용기에 대해: 10의 본 발명의 항체 또는 이의 단편과 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 0.2 내지 0.5% 윤활제를 혼합하고, 프레온과 같은 추진제중에, 바람직하게는 (1,2 디클로로테트라플루오로에탄) 및 디플루오로클로로메탄의 조합물중에 상기 혼합물을 분산시키고, 비강내 또는 경구 흡입 투여에 적용되는 적합한 에어로졸 용기에 주입한다.
15 내지 20 용량의 에어로졸 용기에 대한 흡입에 의한 투여용 조성물: 에탄올(6 내지 8)중에서 10의 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 용해시키고, 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 0.1 내지 0.2%의 윤활제를 첨가하고, 프레온과 같은 추진제중에, 바람직하게는 (1,2 디클로로테트라플루오로에탄) 및 디플루오로클로로메탄의 조합물중에 상기 혼합물을 분산시키고, 비강내 또는 경구 흡입 투여에 적용되는 적합한 에어로졸 용기에 주입한다.
본 발명에 따른 항체 및 약제 조성물은 비경구적 투여, 즉, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여에 특히 유용하다. 비경구 투여용 조성물은 일반적으로 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 용액 또는 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체중에 용해된 이들의 혼합물을 포함할 것이다. 예를 들어, 물, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등과 같은 여러 수성 담체가 사용될 수 있다. 이들 용액은 살균되어 있으며 일반적으로 미립물을 함유하지 않는다. 이들 용액은 종래의 널리 공지된 살균 기법에 의해 살균처리될 수 있다. 상기 조성물은 pH 조절 및 완충액 등과 같은 적합한 생리적 조건에 요구되는 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 이러한 약제 제형에서 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 농도는 약 0.5중량% 미만, 일반적으로 약 1중량% 이상에서 15 내지 20중량%로 매우 다양할 수 있으며, 주로 선택된 특정 투여 형태에 따라 유체 용적, 점도 등을 기준으로 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주입을 위한 본 발명의 약제 조성물은 1의 살균 완충수 및 50의 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥에 주입을 위한 본 발명의 약제 조성물은 250의 살균 링거 용액, 및 150의 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 함유하여 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실질적인 방법은 공지되어 있으며, 또는 문헌에 보다 상세하게 기술되어 있다[참조예: Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publisheing Company, Easton, Pennsylvanina, 본원에서 참고문헌의 인용됨] .
본 발명의 항체(또는 이의 단편)은 저장하기 위해 동결건조될 수 있으며, 사용전에 적합한 담체중에서 재구성될 수 있다. 본 기법은 종래의 면역 글로불린과 함께 효과적인 것으로 나타났으며, 공지된 동결 건조법 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.
의도된 결과에 의존하여, 본 발명의 약제 조성물은 예방 및/또는 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적으로 적용되는 경우, 조성물은 질병 및 이의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 이미 질병을 앓고 있는 환자에 투여된다. 예방적으로 적용되는 경우, 본 발명의 항체를 함유하는 조성물 또는 이의 혼합물은 환자의 내성을 증가시키기 위해 아직은 질병 상태에 있지 않은 환자에게 투여된다.
약제 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택되는 투여량의 수준 및 형태로 수행될 수 있다. 어떠한 경우에도, 본 발명의 약제 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 변형된 항체(또는 이의 단편)를 제공할 것이다.
또한, 본 발명의 항체는 항체로서 동일한 치료에 사용될 수 있는 펩티드 또는 비펩티드 화합물(모방체)의 구성 및 합성에 사용될 수 있음을 유의한다[참조예: Saragovi et al., Science, 253:792-795(1991)]
기탁물
균주 XL1 블루, CE9.1을 발현시키는 TCAE6중의 항CD4는 ATCC에 기탁되었으며, 기탁번호는 69030이다. 기탁일은 1992년 7월 9일이다.
출원인 및 이들의 양수인은 공고된 특허의 기간이 완료되기 전, 배양물에 대한 마지막 요청후 5년, 또는 30년(둘중 보다 긴 것)전에 이러한 배양물을 대체시킬 의무 및 이러한 특허 공고의 기탁을 알려야 하는 의미가 있으며 이 기간 동안 기탁은 변경될 수 없이 대중에게 입수될 수 있다. 37 C.F.R 섹션 1-14 및 35 U.S.C. 섹션 112항에서 특허청장에게 입수될 수 있다. 기타 양태는 하기 청구범위내에 포함된다.
서열목록
(1) 일반적 사항
(i) 출원인: 한나, 나빌
뉴만, 롤란드 에이.
레프, 미첼 이.
(ii) 발명의 명칭: 사람 치료에 이용하기 위한 재조합 항-CD4 항체
(ⅲ) 서열의 수: 59개
(ⅳ) 연락처:
(A) 주소: 번스, 돈, 스웩커 & 마티스
(B) 스트리트: 699 프린스 스트리트
(C) 도시: 알렉산드리아
(D) 주: 버지니아
(E) 국가: 미국
(F) 우편 번호: 22314-3187
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS / MS-DOS
(D)소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 # 1.30
(vi) 현재 출원 상황:
(A) 출원 번호: US 08/523,894
(B) 출원일: 1995-9-6
(C) 분류:
(ⅷ) 변리사/대리인 상황:
(A) 성명: 테스킨, 로빈 엘.
(B) 등록 번호: 35,030
(C) 참고/서류 번호: 012712-165
(ⅸ) 통신처:
(A) 전화: (703) 836-6620
(B) 팩스: (703) 836-2021
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 420 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: CE9.1의 중쇄 가변 도메인
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재 위치: 4..420
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 매트(mat)_단백질
(B) 존재 위치: 61..420
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :1:
(2) 서열 번호 2에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 139 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: 단백질
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :2:
(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 387 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: CE9.1의 경쇄 가변 도메인
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재 위치: 4..387
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 매트_단백질
(B) 존재 위치: 61..387
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :3:
(2) 서열 번호 4에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 128 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: 단백질
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :4:
(2) 서열 번호 5에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 702 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 호모 사피엔스
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: CE9.1에서 람다 가변 및 불변 도메인
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재 위치: 1..702
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 매트_단백질
(B) 존재 위치: 1..702
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :5:
(2) 서열 번호 6에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 234 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: 단백질
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :6:
(2) 서열 번호 7에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 1404 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: 중쇄 가변 및 불변 감마 4
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재 위치: 1..1404
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 매트_단백질
(B) 존재 위치: 1..1404
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :7:
(2) 서열 번호 8에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 468 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: 단백질
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :8:
(2) 서열 번호 9에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 1404 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 호모 사피엔스
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: E 돌연변이를 갖는 중쇄 감마 4
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재 위치: 1..1404
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 매트_단백질
(B) 존재 위치: 1..1404
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :9:
(2) 서열 번호 10에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 468 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: 단백질
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :10:
(2) 서열 번호 11에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 1404 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 호모 사피엔스
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: P 및 E 돌연변이를 갖는 중쇄 감마 4
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재 위치: 1..1404
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 매트_단백질
(B) 존재 위치: 1..1404
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :11:
(2) 서열 번호 12에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 468 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: 단백질
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :12:
(2) 서열 번호 13에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 26 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH2 리더 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :13:
(2) 서열 번호 14에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 31 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH2 리더 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :14:
(2) 서열 번호 15에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 29 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH3 리더 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :15:
(2) 서열 번호 16에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 31 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH4 리더 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :16:
(2) 서열 번호 17에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 31 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH5 리더 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :17:
(2) 서열 번호 18에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 31 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH6 리더 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :18:
(2) 서열 번호 19에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: MulⅠ 영역을 갖는 VH4 리더 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :19:
(2) 서열 번호 20에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: MluⅠ 영역을 갖는 VH2 리더 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :20:
(2) 서열 번호 21에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 27 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: MulⅠ 영역을 갖는 VH3 리더 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :21:
(2) 서열 번호 22에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 27 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: MulⅠ 영역을 갖는 VH4 리더 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :22:
(2) 서열 번호 23에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: MulⅠ 영역을 갖는 VH5 리더 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :23:
(2) 서열 번호 24에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 23 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Xho Ⅰ 영역을 갖는 VH1, 3a, 5 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :24:
(2) 서열 번호 25에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 23 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Xho Ⅰ 영역을 갖는 VH2 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 25
(2) 서열 번호 26에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 23 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Xho Ⅰ 영역을 갖는 VH3b 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :26:
(2) 서열 번호 27에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 23 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Xho Ⅰ 영역을 갖는 VH4 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :27:
(2) 서열 번호 28에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 23 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Xho Ⅰ 영역을 갖는 VH6 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :28:
(2) 서열 번호 29에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 26 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: NheⅠ 영역을 갖는 IgG1-4 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :29:
(2) 서열 번호 30에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 38 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Bgl Ⅱ 영역을 갖는 카파 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :30:
(2) 서열 번호 31에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 37 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Bgl Ⅱ 영역을 갖는 카파 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :31:
(2) 서열 번호 32에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 41 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Bgl Ⅱ 영역을 갖는 카파 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :32:
(2) 서열 번호 33에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 41 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Bgl Ⅱ 영역을 갖는 카파 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :33:
(2) 서열 번호 34에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 39 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Bgl Ⅱ 영역을 갖는 람다 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :34:
(2) 서열 번호 35에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 39 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Bgl Ⅱ 영역을 갖는 람다 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :35:
(2) 서열 번호 36에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 39 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Bgl Ⅱ 영역을 갖는 람다 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :36:
(2) 서열 번호 37에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 39 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Bgl Ⅱ 영역을 갖는 람다 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :37:
(2) 서열 번호 38에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 38 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Bgl Ⅱ 영역을 갖는 람다 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :38:
(2) 서열 번호 39에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 36 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 예
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Kpn1 및 BsiW1 영역을 갖는 카파 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :39:
(2) 서열 번호 40에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 예
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Kpn1 및 BsiW1 영역을 갖는 카파 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :40:
(2) 서열 번호 41에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 예
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Hind Ⅲ 및 Kpn1 영역을 갖는 카파 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :41:
(2) 서열 번호 42에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 36 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 예
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: Kpn1 영역을 갖는 람다 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :42:
(2) 서열 번호 43에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 27 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 예
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: AvrⅡ 영역을 갖는 람다 경쇄 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :43:
(2) 서열 번호 44에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 17 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅵ) 기원:
(A) 생물명: 사람 또는 원숭이
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH1 중쇄 가변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :44:
(2) 서열 번호 45에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH2 중쇄 가변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :45:
(2) 서열 번호 46에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH3 중쇄 가변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :46:
(2) 서열 번호 47에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH4 중쇄 가변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :47:
(2) 서열 번호 48에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH5 중쇄 가변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :48:
(2) 서열 번호 49에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 아니오
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: VH6 중쇄 가변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :49:
(2) 서열 번호 50에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 16 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 예
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: IgM 중쇄 불변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :50:
(2) 서열 번호 51에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 17 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 예
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: IgG1-4 중쇄 불변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :51:
(2) 서열 번호 52에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 21 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: 카파 경쇄 가변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :52:
(2) 서열 번호 53에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 21 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: 람다 경쇄 가변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :53:
(2) 서열 번호 54에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 예
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: 카파 경쇄 불변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :54:
(2) 서열 번호 55에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅳ) 안티센스: 예
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: 람다 경쇄 불변 영역
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :55:
(2) 서열 번호 56에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: 사람 감마 4 불변 영역을 위한 PCR 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :56:
(2) 서열 번호 57에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 31 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: 사람 감마 4 불변 영역을 위한 PCR 프라이머
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :57:
(2) 서열 번호 58에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 96 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: 사람 감마 4의 PCR 돌연변이원
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :58:
(2) 서열 번호 59에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 27 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: DNA (지놈)
(ⅷ) 유전체 내에서의 위치:
(A) 염색체/단편명: 사람 감마 4의 PCR 돌연변이원
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :59:

Claims (42)

  1. 서열번호 2(도 1)에 도시된 구세계(Old World) 원숭이 모노클로널 항체의 중쇄 가변영역 폴리펩티드 서열,
    서열번호 4(도 2)에 도시된 구세계 원숭이 모노클로널 항체의 경쇄 가변영역 폴리펩티드 서열,
    사람 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 및
    서열번호 8(도 4)에 도시된 아미노산 서열에서 236번 잔기(248번 잔기, 카바트 넘버링)에 해당하는 위치에서 류신이 글루탐산으로 변경됨에 의해 돌연변이된 사람 감마-4(E) 중쇄 불변 영역 및 서열번호 8(도 4)에 도시된 아미노산 서열에서 236번 잔기(248번 잔기, 카바트 넘버링)에 해당하는 위치에서 류신이 글루탐산으로 변경되고, 229번 잔기(241번 잔기, 카바트 넘버링)에 해당하는 위치에서 세린이 프롤린으로 변경됨에 의해 돌연변이된 사람 감마-4(PE) 중쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이된 사람 감마-4 중쇄 불변 영역을 포함하고, T 세포 제거 활성이 실질적으로 결핍된, 사람 CD4에 특이적으로 결합하는 키메라 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 경쇄가 서열번호 6(도 3)에 도시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 사람 람다 경쇄임을 특징으로 하는 키메라 항체.
  3. 제 1항에 있어서, 중쇄가 서열번호 10(도 5)에 도시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 돌연변이된 사람 감마-4(E) 중쇄임을 특징으로 하는 키메라 항체.
  4. 제 1항에 있어서, 중쇄가 서열번호 12(도 6)에 도시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 돌연변이된 사람 감마-4(PE) 중쇄임을 특징으로 하는 키메라 항체.
  5. 제 2항에 있어서, 중쇄가 서열번호 10(도 5)에 도시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 돌연변이된 사람 감마-4(E) 중쇄임을 특징으로 하는 키메라 항체.
  6. 제 2항에 있어서, 중쇄가 서열번호 12(도 6)에 도시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 돌연변이된 사람 감마-4(PE) 중쇄임을 특징으로 하는 키메라 항체.
  7. 제 1항에 따른 키메라 항체를 코드화하는 재조합 DNA.
  8. 제 2항에 따른 키메라 항체를 코드화하는 재조합 DNA.
  9. 제 3항에 따른 키메라 항체를 코드화하는 재조합 DNA.
  10. 제 4항에 따른 키메라 항체를 코드화하는 재조합 DNA.
  11. 제 6항에 따른 키메라 항체를 코드화하고 이 키메라 항체의 발현을 제공하는 재조합 DNA.
  12. 재조합 숙주 세포에서 제 7항의 재조합 DNA를 발현시키는 것을 포함하여, CD4에 특이적인 키메라 항체를 생성시키는 방법.
  13. 재조합 숙주 세포에서 제 8항의 재조합 DNA를 발현시키는 것을 포함하여, CD4에 특이적인 키메라 항체를 생성시키는 방법.
  14. 재조합 숙주 세포에서 제 9항의 재조합 DNA를 발현시키는 것을 포함하여, CD4에 특이적인 키메라 항체를 생성시키는 방법.
  15. 재조합 숙주 세포에서 제 10항의 재조합 DNA를 발현시키는 것을 포함하여, CD4에 특이적인 키메라 항체를 생성시키는 방법.
  16. 재조합 숙주 세포에서 제 11항의 재조합 DNA를 발현시키는 것을 포함하여, CD4에 특이적인 키메라 항체를 생성시키는 방법.
  17. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 1항에 따른 키메라 항체를 포함하는 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포와 관련된 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  18. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 2항에 따른 키메라 항체를 포함하는 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포와 관련된 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  19. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 3항에 따른 키메라 항체를 포함하는 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포와 관련된 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  20. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 4항에 따른 키메라 항체를 포함하는 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포와 관련된 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  21. 제 17항에 있어서, 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애, 또는 질환이 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스, 경변증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 18항에 있어서, 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애, 또는 질환이 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스, 경변증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 19항에 있어서, 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애, 또는 질환이 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스, 경변증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 20항에 있어서, 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애, 또는 질환이 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스, 경변증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  25. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 1항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 백혈병, 림프종, 이식편대숙주병, 천식, 이식 거부증 및 HIV 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  26. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 2항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 백혈병, 림프종, 이식편대숙주병, 천식, 이식 거부증 및 HIV 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  27. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 3항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 백혈병, 림프종, 이식편대숙주병, 천식, 이식 거부증 및 HIV 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  28. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 4항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 백혈병, 림프종, 이식편대숙주병, 천식, 이식 거부증 및 HIV 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  29. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 6항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 백혈병, 림프종, 이식편대숙주병, 천식, 이식 거부증 및 HIV 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  30. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 1항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 류마티스성 관절염, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루프스, 경변증, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선염, 제 1 형 점액 수종증, 갑상선 중독증/그레이브스 병, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 병, 조기 폐경증, 구드패스츄어 증후군, 중증근무력증, 남성 불임증, 심상성 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 파코제닉(phacogenic) 포도막염, 신증후군, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 습진 피부염, 편평 태선, 천포창, 수포성 천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부성 호산구증가증, 원형 탈모증, 가역적 폐쇄 기도 질병, 편두통, 습진, 비염, 자가면역 용혈 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 특발성 백혈구감소증(leucopenia), 제 1기 담즙성 간경변, 활성 만성 간염(HBs Ag 네거티브), 잠복성 경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 피부경화증, 혼합성 결합조직 병, 원반 홍반성 루푸스, 전신성 맥관염, 복강 질병, 직장염, 호산구성 위소장염, 비만세포증, 크론 질병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포에 관련된 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  31. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 2항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 류마티스성 관절염, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루프스, 경변증, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선염, 제 1 형 점액 수종증, 갑상선 중독증/그레이브스 병, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 병, 조기 폐경증, 구드패스츄어 증후군, 중증근무력증, 남성 불임증, 심상성 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 파코제닉(phacogenic) 포도막염, 신증후군, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 습진 피부염, 편평 태선, 천포창, 수포성 천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부성 호산구증가증, 원형 탈모증, 가역적 폐쇄 기도 질병, 편두통, 습진, 비염, 자가면역 용혈 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 특발성 백혈구감소증(leucopenia), 제 1기 담즙성 간경변, 활성 만성 간염(HBs Ag 네거티브), 잠복성 경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 피부경화증, 혼합성 결합조직 병, 원반 홍반성 루푸스, 전신성 맥관염, 복강 질병, 직장염, 호산구성 위소장염, 비만세포증, 크론 질병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포에 관련된 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  32. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 3항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 류마티스성 관절염, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루프스, 경변증, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선염, 제 1 형 점액 수종증, 갑상선 중독증/그레이브스 병, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 병, 조기 폐경증, 구드패스츄어 증후군, 중증근무력증, 남성 불임증, 심상성 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 파코제닉(phacogenic) 포도막염, 신증후군, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 습진 피부염, 편평 태선, 천포창, 수포성 천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부성 호산구증가증, 원형 탈모증, 가역적 폐쇄 기도 질병, 편두통, 습진, 비염, 자가면역 용혈 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 특발성 백혈구감소증(leucopenia), 제 1기 담즙성 간경변, 활성 만성 간염(HBs Ag 네거티브), 잠복성 경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 피부경화증, 혼합성 결합조직 병, 원반 홍반성 루푸스, 전신성 맥관염, 복강 질병, 직장염, 호산구성 위소장염, 비만세포증, 크론 질병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포에 관련된 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  33. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 4항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 류마티스성 관절염, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루프스, 경변증, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선염, 제 1 형 점액 수종증, 갑상선 중독증/그레이브스 병, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 병, 조기 폐경증, 구드패스츄어 증후군, 중증근무력증, 남성 불임증, 심상성 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 파코제닉(phacogenic) 포도막염, 신증후군, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 습진 피부염, 편평 태선, 천포창, 수포성 천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부성 호산구증가증, 원형 탈모증, 가역적 폐쇄 기도 질병, 편두통, 습진, 비염, 자가면역 용혈 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 특발성 백혈구감소증(leucopenia), 제 1기 담즙성 간경변, 활성 만성 간염(HBs Ag 네거티브), 잠복성 경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 피부경화증, 혼합성 결합조직 병, 원반 홍반성 루푸스, 전신성 맥관염, 복강 질병, 직장염, 호산구성 위소장염, 비만세포증, 크론 질병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포에 관련된 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  34. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 6항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 류마티스성 관절염, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루프스, 경변증, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선염, 제 1 형 점액 수종증, 갑상선 중독증/그레이브스 병, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 병, 조기 폐경증, 구드패스츄어 증후군, 중증근무력증, 남성 불임증, 심상성 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 파코제닉(phacogenic) 포도막염, 신증후군, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 습진 피부염, 편평 태선, 천포창, 수포성 천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부성 호산구증가증, 원형 탈모증, 가역적 폐쇄 기도 질병, 편두통, 습진, 비염, 자가면역 용혈 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 특발성 백혈구감소증(leucopenia), 제 1기 담즙성 간경변, 활성 만성 간염(HBs Ag 네거티브), 잠복성 경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 피부경화증, 혼합성 결합조직 병, 원반 홍반성 루푸스, 전신성 맥관염, 복강 질병, 직장염, 호산구성 위소장염, 비만세포증, 크론 질병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포에 관련된 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  35. 제 5항에 따른 키메라 항체를 코드화하고 이 키메라 항체의 발현을 제공하는 재조합 DNA.
  36. 재조합 숙주 세포에서 제 35항의 재조합 DNA를 발현시키는 것을 포함하여, CD4에 특이적인 키메라 항체를 생성하는 방법.
  37. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 5항에 따른 키메라 항체를 포함하는 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포에 관련된 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애, 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물,
  38. 제 37항에 있어서, 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애 또는 질환이 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스, 경변증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  39. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 5항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 류마티스성 관절염, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루프스, 경변증, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선염, 제 1 형 점액 수종증, 갑상선 중독증/그레이브스 병, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 병, 조기 폐경증, 구드패스츄어 증후군, 중증근무력증, 남성 불임증, 심상성 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 파코제닉(phacogenic) 포도막염, 신증후군, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 습진 피부염, 편평 태선, 천포창, 수포성 천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부성 호산구증가증, 원형 탈모증, 가역적 폐쇄 기도 질병, 편두통, 습진, 비염, 자가면역 용혈 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 특발성 백혈구감소증(leucopenia), 제 1기 담즙성 간경변, 활성 만성 간염(HBs Ag 네거티브), 잠복성 경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 피부경화증, 혼합성 결합조직 병, 원반 홍반성 루푸스, 전신성 맥관염, 복강 질병, 직장염, 호산구성 위소장염, 비만세포증, 크론 질병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포에 관련된 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  40. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 5항에 따른 키메라 항체를 포함하는, 백혈병, 림프종, 이식편대숙주병, 천식, 이식 거부증 및 HIV 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물.
  41. 치료적 또는 예방적 유효량의 제 6항에 따른 키메라 항체를 포함하는 CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포에 관련된 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애, 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 조성물,
  42. 제 41항에 있어서, 자가면역 또는 만성 염증성 질병, 장애 또는 질환이 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스, 경변증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
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