CZ58698A3 - Rekombinantní protilátky anti-CD4 pro humánní terapii a způsoby jejich produkce - Google Patents

Rekombinantní protilátky anti-CD4 pro humánní terapii a způsoby jejich produkce Download PDF

Info

Publication number
CZ58698A3
CZ58698A3 CZ98586A CZ58698A CZ58698A3 CZ 58698 A3 CZ58698 A3 CZ 58698A3 CZ 98586 A CZ98586 A CZ 98586A CZ 58698 A CZ58698 A CZ 58698A CZ 58698 A3 CZ58698 A3 CZ 58698A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
human
cells
chimeric
antibodies
Prior art date
Application number
CZ98586A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ291036B6 (cs
Inventor
Nabil Hanna
Roland A. Newman
Mitchell E. Reff
Original Assignee
Idec Pharmaceuticals Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Idec Pharmaceuticals Corporation filed Critical Idec Pharmaceuticals Corporation
Publication of CZ58698A3 publication Critical patent/CZ58698A3/cs
Publication of CZ291036B6 publication Critical patent/CZ291036B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2821—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

(57) Anotace:
Chimérické protilátky specifické k lidskému antigenu CD4, které v podstatě nemají depleční aktivitu pro T buňky, farmaceutické přípravky obsahující kódující DNA a jejich použití jako léčiva. Chimérické protilátky obsahují sekvence variabilních oblastí opic Starého světa a sekvence lidských konstantních domén, výhodně lidské gama 4 nebo jejich mutovaných forem. Tyto protilátky mají žádoucí terapeutické vlastnosti včetně nízké antigenicity, snížené /nebo chybějící/ depleční aktivity pro T buňky, dobrou afinitu k lidskému CD4 a zvýšenou stabilitu /biologický poločas in vivo/.
• φ φ
Φ ♦ · · · φ φ φ φ φ · φ φ ΦΦΦ· • · · φ φ φ φφ · · · Φ ♦· • · Φ Φ Φ ΦΦΦ
Rekombinantni protilátky způsoby jejich produkce anti-CD4 pro humánní terapii a
Oblast techniky
Tato přihláška je patentu Spojených Států pokračovaci k patentu
25. ledna přihláška č. 08/476
Spojených 1995, který
Států č. 07/912 292, podaného 10. přihláškou částečně pokračovaci
Států č.
částečně pokračovaci k 237, který je částečně Států č. 08/397 072, podaného Spoj ených který je přihlášce podané 23. března patentové přihlášky 25. července 1991, tímto v odkazech.
je pokračování patentu července 1992, k patentové 07/856 281, pokračováním 064, podané včetně obrázků, zahrnuty týká rekombinantnich jsou použitelné pro takových protilátek.
částečným č. 07/735
Newmana et al. Spojených 1992, která je Spojených Států jež jsou celé,
Tento vynález se protilátek specifických k CD4, které humánní terapii a také způsobů produkce
Dosavadní stav techniky
CD4 je povrchový glykoprotein primárně exprimovaný na buňkách linie lymfocytů T včetně většiny thymocytů a podskupiny periferních T buněk. Nízké hladiny CD4 jsou také exprimovány některými nelymfoidními buňkami, ačkoliv funkční význam této odchylné buněčné distribuce je neznámý. Na zralých T buňkách vykonává CD4 rozpoznávací funkci prostřednictvím interakce s molekulami MHC II. třídy (MHC = hlavní histokompatibilni sytém, které jsou exprimovány na buňkách prezentujících antigen. T buňky CD4+ tvoří primárně podskupinu pomahačských („helper)buněk, které řídí funkce T • · • · a B buněk během imunitních odpovědí na virové, bakteriální, mykotické a parazitární infekce, závislých na T buňkách.
Během patogeneze autoimunitních nemocí, zejména když selže tolerance k vlastním antigenům, T buňky CD4+ přispívají k zánětlivým odpovědím, které mají za následek poškozeni kloubu a tkáně. Těmto procesům napomáhá doplňováni zánětlivými buňkami hemopoetické linie, produkce protilátek, zánětlivých cytokinů a mediátorů a aktivace zabiječských („killer) buněk.
Revmatoidni artritida (RA), zánětlivá nemoc synovia, je jeden projev autoimunitniho jevu, který má za následek erozi, deformitu a zničeni kloubů. Jako u většiny autoimunitních nemocí není etiologie RA dobře poznána. Avšak je známo, že RA je charakterizována zvýšenými hladinami aktivovaných T lymfocvtů CD4+ v postižených kloubech. V současnosti neexistuje vyléčení RA. První linie léčby RA poskytuje úlevu od příznaků RA a zlepšuje během krátké doby funkční zdatnost. Druhá a třetí linie imunosupresiv a steroidů, jako .je azathioprin, metotrexát a prednisolon, zacílené na vlastní nemoc, jsou podávané ve vážnějších případech a jsou buď pouze slabě účinné nebo projevují nepřijatelnou toxicitu pro chronickou terapii. Neochraňují také před zničením kloubu.
Nezávisle na RA, buňky CD4+ se účastní také dalších chronických stavů včetně psoriázy, diabetů mellitu závislého na inzulínu, systémového lupus erytematosus a zánětlivých střevních nemocí. Kromě toho je pravděpodobné, že exprese CD4 je zapojena i do dalších autoimunitních nemocí.
Při daném zapojení T buněk do rozvoje a udržování autoimunitních nemocí se důležitou léčebnou strategií stala imunosuprese. Dostupné imunosupresivní léky, jako cyklosporin A, jsou úspěšně používány pro léčbu rejekce ·
9 9 9
9
transplantátů. Avšak jejich toxické vedlejší účinky je činí nepřijatelnými pro chronickou léčbu autoimunitních nemocí.
Deplece (vyčerpání) veškeré T buněčné populace, včetně podskupiny CD4+, se v klinických podmínkách uskuteční metodami ozářením pacientů zahrnujícími drenáž ductus thoracicus, lymfoidní tkáně a lymfoferezou, což má u za následek klinické zlepšení. Současná zaměřena na selektivnější aniž je však nežádoucí imunitní odpovědi, solidní způsob, selektivní orgány nebo jiné jak toto může odstranění zprostředkovávajících protilátek (mAbs) . Jednu k CD4. Ve větší být nebo nemoc takovou zvířecích modelech celkovým některých strategie přípravky, které blokují by způsobily toxicitu pro vedlejší účinky. Jeden potenciálně dosaženo, je inaktivace buněk monoklonálních představují mAbs a transplantace, když jsou anti-CD4, profylakticky nebo tyto protilátky ruší Kromě toho, počáteční výsledky použitím strategii autoimunity terapeuticky podávány mAbs nebo zvrátí progresi nemoci, některých klinických zkoušek s mAbs anti-CD4 u RA, psoriázy, zánětlivé střevní nemoci a systémové vaskulitidy poskytly určitý předběžný důkaz potenciální terapeutické účinnosti.
Cílem léčby mAbs anti-CD4 je v podstatě zrušit autodestruktivní aktivitu buněk CD4+, zejména během akutních fází autoimunitní poruchy. Konečný léčebný cíl je navodit stav imunologické neodpovídavosti (anergii) nebo dlouhodobou toleranci na škodlivé antigeny (nebo specifické tkáně), které udržují vlastní nemoc, aniž by se ohrozila normální obrana hostitele proti oportunním infekcím. Nehledě na RA, mAbs CD4 mohou být také prospěšné pro léčbu dalších autoimunitních nemocí, např. diabetů mellitu závislého na inzulínu, systémového lupus erytematosus, psoriázy, zánětlivé střevní nemoci a sclerosis multiplex.
Φ · 0 0 0 ·
Vzhledem k potenciální důležitost mAbs anti-CD4 jako imunoterapeutika publikovali již četné společnosti a výzkumné skupiny mAbs anti-CD4 jako potenciální léčebné přípravky. Například Centocor publikoval mAbs anti-CD4 nazývané Centara, což je chimérická myší monoklonální protilátka (mAb) k CD4. Dále Johnson & Johnson/Ortho publikovali 0KT-4a, mAb anti-CD4, která je humanizovaná myší mAb. Dále publikovali Burroughs Wellcome mAb anti-CD4, která je humanizovaná potkaní mAb k CD4. Jak Sandoz, tak i Medlmmune (ve spolupráci s firmou Měrek) vyvinuli anti-CD4 myší humanizované mAbs specifické k CD4. Dále vyvinuli mAbs anti-CD4 také Becton Dickinson, Immunotech a Boehringer Mannheim.
Nehledě na mAbs anti-CD4, byly objeveny různé imunomodulátory a léky potenciálně použitelné pro léčbu RA. Takové imunomodulátory a léky zahrnují např. blokátory buněčné adheze, blokátory cytokinových receptorů, imunotoxiny a antagonisty T buněčných receptorů. Specifické příklady zahrnují interferon gama, anti-ICAM-1 (myší mAb anti-CD54, která blokuje leukocytární transport, adhezi), Campath-1H (potkaní humanizovaná mAb anti-CDw52) receptor IL-1, cA2 (TNF-alfa chimérická mAb), CDP 571 (mAb anti-TNF), anti-IL-2R (humanizovaná myší mAb anti-CD25), SDZ CHH 380 (myší lidská mAb anti-CD7), DAB486 IL-2 (IL-2 fúzní toxin, nespecifický pro buňky CD4 a CD8), Antril (I1-1RA), anti-TCR (mAbs a proteiny, jejichž cílem jsou podskupiny T buněčného receptoru) a Xoma-Zyme-CD5 (myší konjugát anti-CD5 toxinu).
Další imunomodulátory a imunosupresiva mající potenciální použití pro léčbu autoimunitních nemocí zahrnují Rapamycin (perorální imunosupresivum), Therafectin, Leflunomid (imunosupresivní předléky), Tenidap (cytokinová • · modulátor/CO- inhibitor), IMM-125 a RS-61443 (perorálni imunosupresivum).
Jak bylo již zmíněno, byly publikovány četné monoklonálni protilátky k CD4, mající potenciální léčebné použití. Z velké většiny tyto protilátky zahrnují myší mAbs, chimérické nebo myší humanizované mAbs anti-CD4.
Myší monoklonálni protilátky mají potenciální využití pro diagnózu lidských onemocnění stejně jako v klinických zkouškách jako léčivo pro léčbu jak akutních, tak chronických lidských onemocnění, včetně leukémií, lymfomů, solidních nádorů (např. střeva, prsu, jaterní nádory), AIDS a autoimunitních nemocí. Avšak myší protilátky jsou nevýhodné, protože mají často za následek imunitní protilátkovou odpověď hostitele proti myším monoklonálním protilátkám.
Byly také publikovány chimérické myší/lidské protilátky, základní
Tyto protilátky obsahují vazebné myší protilátky a efektorové funkce lidskou konstantní oblastí.
Spojených
Států č.
567, Shoemaker
Spojených
Států
978 775, Beavers vlastnosti sdružené s al.
patent et al., et al., patent patent
Spoj ených
Států č.
Států č. 4
816 397,
Všeobecně jsou tyto genomové existujících myších
975 369 a Boss et al., patent Spojených všechny chimérické genové knihovny z hybridomů jsou zahrnuty v odkazech.
protilátky získávány
DNA extrahované (Nishman et al., pomoci z již
Cancer
Research, 47, 999, přítomnost genů pro
1987). Knihovna se poté testuje na variabilní oblasti jak těžkého tak i lehkého řetězce, které vykazují správné typy přeskupení protilátkových fragmentů. Klonované geny variabilní oblasti se poté ligují do expresního vektoru, který obsahuje klonované kazety příslušného genu pro lidskou konstantní • ♦ « · • · • ·
9 9 99 • ♦ • ·
999
9 9 99
999 9999
9 99999
9 99
9 9 999 9 oblast těžkého nebo lehkého řetězce. Chimérické geny exprimují v buněčné linii dle výběru, obvykle myší myelomové linii.
se poté
Avšak, použity v problémy, protilátek, proti účinnost dlouhodobé jakmile jsou lidské
Podobně mohou takové chimérické protilátky objevují se také některé to u myších monoklonálních produkovat protilátky což je nevýhodné pro terapii, jako je lidští příjemci těmto chimérickým protilátkám, terapie chimérickou protilátkou.
obvyklé chimérické způsoby nevyskytují. Viz
34, 1681, 1988,
Ehrlich et al., pro badatelů produkce se tyto et al., protilátky lidských problémy
Clinical Chemistry, 7, 385, 1988,
Hybridoma,
Human Antibody Hybridomas, také vyslovuje hypotéza,
Jako zlepšení vyjevilo několik monoklonálních protilátek, u např. Ehrlich
Ehrlich et al., Hybridoma,
6, 151, 1987 a Ehrlich et al.,
1, 23, 1990. V těchto odkazech se že protilátky primátů, šimpanzí monoklonální protilátky, by mohly být tolerovány kvůli své strukturní podobnosti protilátkami. Avšak produkce protilátek v samozřejmé etické zábrany.
Protože lidské protilátky nejsou imunogenní Rhesus (tj. nevyvolávají protilátkovou odpověď), al. předpovídají, že protilátky primátů budou neimunogenni u lidí. Ehrlich et al.
např.
lidmi dobře s lidskými lidech má u opic rodu
Ehrlich et (viz výše) naznačují, že testování není nezbytné, jestliže protilátka oblast totožnou se stejnou oblastí která není protilátek na lidech primáta má konstantní lidského imunoglobulinu, nebo alespoň strukturu, odlišná od lidského imunoglobulinu více, než se lidské protilátky od sebe navzájem. Navrhují liší různé tedy, že šimpanzí protilátky mohou být užitečné v lidské terapii.
Jako vylepšeni známých chimérických protilátek, které jsou často u lidi antigenni, popisuji příbuzné přihlášky Spojených Států č. 08/476 237, podaná 7. června 1995, č. 08/347 072, podaná 25. února 1995 a 07/912 212, podaná 10. července 1992, 07/856 281, podaná 23. března 1992 a 07/735 064, podaná 25. července 1991, všechny zahrnuté v odkazech, přípravu monoklonálních protilátek u opic Starého světa a chimérických protilátek z nich odvozených tvořených rekombinantnimi metodami, které obsahují variabilní doménu protilátky opice Starého světa (např. pavián nebo makak), fúzovanou s klonovanou konstantní oblastí lidskou, šimpanzi nebo z jiné opice nebo kostrovou oblastí protilátky jiné opice. Tyto aplikace konkrétně popisují přípravu takových opičích (z opic Starého světa) a chimérických protilátek z nich odvozených proti lidským antigenům, a také použití těchto chimérických rekombinantních protilátek jako imunoterapeutických přípravků pro léčbu lidských nemocí.
Tyto aplikace jsou založeny na překvapujícím odhalení, že opice evolučně vzdálené (např. opice pavián nebo makak, včetně opic Macaca fascicularis a Macaca rhesus) , jsou na rozdíl od šimpanzů nejenom dostatečně odlišné od lidí, takže je možné, aby v těchto opicích byly pěstovány protilátky proti lidským antigenům, dokonce proti relativně konzervovaným lidským antigenům jako CD4 a CD54, ale tyto opice jsou dostatečně podobné člověku, aby měly protilátky, které jsou strukturálně podobné lidským protilátkám, takže když jsou tyto opičí protilátky nebo z nich odvozené chimérické protilátky podány člověku, nevyvolá se u lidí žádná hostitelská proti-protilátková odpověď.
Tyto aplikace vyjevuji, že na rozdíl od některých předchozích protilátek používaných pro lidskou terapii, včetně známých chimérických protilátek, tyto nové chimérické • · ♦ * · · • · • Φ· ♦ protilátky netrpí mnoha nedostatky, např. a) imunogenicita a indukce lidské proti-protilátkové (HAA) odpovědi při opakovaném podávání nezbytném při léčbě chronických stavů, 2) relativně krátký poločas rozpadu ve srovnání s lidskými protilátkami a 3) nedostatek efektorových funkci s lidskými buňkami nebo komplementem.
Nepřítomnost těchto nedostatků je významná výhoda pro lidskou terapii. Například v případě chronické lidské nemoci, včetně autoimunitních nemocí, nebo jakékoliv nemoci, kde je nezbytné dlouhotrvající podávání protilátky, je jednou z hlavních překážek opakované léčby protilátkami hostitelova odpověď na léčebnou protilátku. Odpovědi HAA jsou často nepředvídatelné od pacienta k pacientovi. Také jsou takové odpovědi převážně, i když ne výlučně, namířeny proti konstantní oblasti protilátkové molekuly, a jakmile se jednou objeví, často zabraňuji nebo snižují účinnost terapie s touto protilátkou nebo jinou protilátkou stejného izotypu. Rekombinantní chimérické protilátky popsané ve výše odkazovaných aplikacích obchází tento problém a umožní vytvoření protilátek příslušné specifity a požadované efektorové funkce a jejich použití v produkci rekombinantních protilátek.
Tyto rekombinantní protilátky všeobecně zahrnují příslušnou část variabilní oblasti protilátky pocházející z imunizované opice, která je nezbytná pro vazbu antigenu, a konstantní oblast protilátky člověka nebo šimpanze. Toto tedy umožní udržení specifit a vysokých afinit opičích monoklonálních protilátek a požadované efektorové funkce příslušnou selekcí lidské nebo šimpanzí konstantní oblasti.
Někkteré z těchto podobných aplikaci uvádějí jako příklad konkrétně opičí/lidskou chimérickou protilátku se specifitou pro CD4, nazývanou CE9.1, která obsahuje • ·· ·· 4444 44··
4 4 4 4 44«·· • 4 · 4 4 4 * 4 44 4 • 4 · 4 4 · · 444 44
4 44 4444
444 4444 44 44« 4444 variabilní doménu těžkého a lehkého řetězce monoklonální protilátky anti-CD4 tvořené v opici Macaca fascicularis a konstantní oblast lehkého řetězce lambda lidského imunoglobulinu a konstantní oblast těžkého řetězce gama 1 lidského imunoglobulinu. Tato protilátka má určitou depleční aktivitu pro T buňky, ale tato aktivita je nižší ve srovnání s předešlými monoklonálními protilátkami CD4. Avšak je žádoucí produkovat protilátky, které mají menší depleční aktivitu nebo které tuto aktivitu pro T buňky postrádají, protože to může zvyšovat jejich terapeutický potenciál.
Tyto aplikace dále popisují výhodné vektorové systémy pro produkci takových chimérických protilátek, zejména TCAE
5.2 a TCAE 6, které obsahuji následující:
1) čtyři transkripční kazety v tandemovém uspořádání:
a) konstantní oblast lehkého řetězce lidského imunoglobulinu. V TCAE 5.2 je to konstantní oblast lehkého řetězce kappa lidského imunoglobulinu (aminokyseliny 108214, číslované dle Kabata, alotyp Km 3) a v TCAE 6 konstantní oblast lehkého řetězce lambda lidského imunoglobulinu (aminokyseliny 108-215, číslované dle Kabata, genotyp Oz minus, Mcg minus, alotyp Ke minus),
b) konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, v obou konstruktech je to konstantní oblast těžkého řetězce gama lidského imunoglobulinu (aminokyseliny 114-478, číslované dle Kabata, alotyp Gmla, Gm 12,
c) DHFR, obsahující svůj vlastní eukaryotický promotor a polyadenylační oblast, a
d) NEO, také obsahující svůj vlastní eukaryotický promotor a polyadenylační oblast.
2) kazety lehkého a těžkého řetězce lidského imunoglobulinu obsahují syntetické signální sekvence pro sekreci imunoglobulinových řetězců, a
00 0· 0090 00 00
• 0 • 0 9 ♦ 9 9 9
0 0 0 0 09 9 0 00
0 • 0 0 9 * 0·· 9 •
• 0 0 9 • • 0
• 0040 0 0 ··· 9 9 0 0
3) kazety lehkého a těžkého řetězce lidského imunoglobulinu obsahuji specifické spojky DNA, které umožňuji inzerci variabilních oblastí lehkého a těžkého řetězce imunoglobulinu, které udržují translační čtecí rámec a nemění aminokyseliny normálně nalézané v imunoglobulinových řetězcích.
Avšak nehledě na to, co bylo dříve popsáno, v oboru stále existuje potřeba vylepšených protilátek, které jsou specifické pro CD4, mají pro člověka nízkou antigenicitu a které mohou být terapeuticky použity, např. pro léčbu autoimunitních nemocí, jako je revmatoidní artritida. Konkrétně je zde potřeba produkovat protilátky anti-CD4, které projevují zlepšené vlastnosti, např. delší poločas rozpadu a/nebo které podstatně postrádají nebo jsou zbavené depleční aktivity.
Předměty vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout nové monoklonálni a chimérické protilátky specifické pro CD4, které mají zlepšené vlastnosti, např. delší poločas rozpadu, nízkou imunogenicitu u lidí a/nebo sníženou nebo nepřítomnou depleční aktivitu pro T buňky. Konkrétněji je předmětem vynálezu produkovat chimérické protilátky anti-CD4, které obsahují oblast rozeznávající antigen imunoglobulinu opic Starého světa specifickou pro CD4 a lidské nebo opičí sekvence konstantní domény, zejména konstantní oblast lidského lehkého řetězce kappa nebo lambda a sekvence konstantní oblasti lidského těžkého řetězce gama 1 nebo gama 4 nebo mutovaného gama 4 se změněnými efektorovými funkcemi a zlepšenou stabilitou proti izotypu gama 4.
• ·· ·· · · • · • · • ♦ • 49 9··· ·♦ ···· • ·· • ·· · 4 • ·*4 • 49
99999
9999
9 99 • ·99
999 99
99
9999
Konkrétnějším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout nové monoklonální a chimérické protilátky obsahující specifickou opičí variabilní těžkou sekvenci anti-CD4, ukázanou na obrázku 1 a opičí variabilní lehkou sekvenci anti-CD4, ukázanou na obrázku 2, fúzovanou s opičími nebo lidskými sekvencemi konstantní domény, výhodně sekvencemi konstantní domény lidského lehkého řetězce kappa nebo lambda a sekvencemi lidské konstantní domény těžkého řetězce gama 1 nebo gama 4 nebo mutovaného gama 4 se změněnými efektorovými funkcemi a zlepšenou stabilitou proti izotypu gama 4.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout sekvence DNA, které zajišťují expresi těchto zlepšených chimérických protilátek anti-CD4 a vektory a hostitelské buňky, které mohou být použity pro expresi těchto chimérických protilátek anti-CD4. Takové vektory výhodně obsahují expresní vektory citované v aplikacích, které jsou zde zahrnuty v odkazech, a hostitelské buňky jsou výhodně buňky CHO.
Ještě dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout farmaceutické přípravky pro použití v léčbě nebo profylaxi poruch spojených s CD4, zejména autoimunitních nemocí, které obsahuji profylakticky nebo terapeuticky účinné množství předmětných zlepšených protilátek anti-CD4 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
Ještě dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsoby léčení nebo profylaxe poruch spojených s CD4, zejména autoimunitních nemocí a dalších stavů, kde je žádoucí imunosuprese podáváním terapeuticky nebo profylakticky účinného množství předmětných nových chimérických protilátek anti-CD4 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
• to • to •
• >
• ··♦· ··to « ·· ·· • · · · • · ·· ·· · · · • · · • to ··
Popis obrázků
Obrázek 1 zobrazuje aminokyselinovou a DNA sekvenci
variabilní domény lehkého řetězce CE9.1.
Obrázek 2 zobrazuje aminokyselinovou a DNA sekvenci
variabilní domény těžkého řetězce CE9.1.
Obrázek 3 zobrazuje aminokyselinovou a DNA sekvenci
lidských variabilních a konstantních domén lambda obsažených v CE9.1.
Obrázek 4 zobrazuje DNA a aminokyselinovou sekvenci kódující sekvenci variabilní a konstantní oblasti těžkého řetězce gama 4.
Obrázek 5 zobrazuje DNA a aminokyselinovou sekvenci kódující lidský těžký řetězec gama 4 obsahující mutaci E.
Obrázek 6 zobrazuje DNA a aminokyselinovou sekvenci kódující lidský těžký řetězec gama 4 obsahující mutace P a E.
Obrázky 7-1, 7-2 a 8 ukazují sekvenci nukleové kyseliny různých vedoucích sekvencí použitelných ve vynálezu.
Obrázek 9 ukazuje distribuční graf vazby CE9.1 k čerstvým lidským PMNC, kde pravý horní kvadrant panelu A ukazuje lymfocyty dvojitě značené s CE9.1 a 0KT3, pravý horní kvadrant panelu B ukazuje populaci dvojitě značenou s CE9.1 a OKT4, pravý horní kvadrant panelu C ukazuje nepřítomnost buněk dvojitě značených CD8 a CE9.1 a kontrolní panel D ukazuje buňky značené normálním a lidským IgG.
Obrázky 10a, 10b a 10c ukazují vazebné charakteristiky receptorů Fc CE9.1, kde měření ukazují aglutinaci CD4+ průtokovým cytometrickým histogramem vazebných fibroblastů s a) ylFN indukovanými čerstvými monocyty, kde negativní • ·· ·* ···· ·· 9 9 ♦ ··· · » · 9 « ·9 · · 9 999 9 999
9 9 9 9 9 9 999 99
9 9 9 9 9 99
999 9999 99 999 9999 kontrola využívá fragmenty f(ab')2 z CE9.1, b) čerstvými monocyty s nebo bez indukce ylFN, a c) v přítomnosti sCD4 nebo za chybění protilátky.
Obrázek 11 ukazuje inhibici smíšené reakce lidských lymfocytů způsobenou CE9.1, kde a) jako odpovídající buňky byly použity čerstvé lidské PBLs a stimulátorové buňky z nepříbuzného dárce ošetřené mitomycinem C byly použity pro testování inhibičních vlastností koncentrační řady CE9.1 a inhibice se měřila produkci buňky a
IL-2, a b) nepříbuzné množstvím inkorporovaného
MLR používající šimpanzí šimpanzí stimulátory, kde thymidinu v odpovídaj ící Leu3a, myší proti-lidská CD4, byla použita jako kontrola.
Obrázek 12 ukazuje buněčné cytotoxické vlastnosti CE9.1 závislé na protilátce, kde lýze cílových buněk SupT-18 v přítomnosti interferonu γ stimulovala efektorové buňky a kde 4D9 je myší anti-CD4 monoklonáiní protilátka IgG2a.
Obrázek 13 ukazuje průtokový cytometrický histogram vazby Clq k buňkám SupTl v přítomnosti a nepřítomnosti CE9.1, kde bylo zaznamenáváno 10 000 jevů a výsledky jsou vyjádřeny jako histogram, PRO945 jsou polyklonální protilátky z opice s vysokým titrem anti-CD4 v séru, a negativní kontrola byla Clq a anti-Clq v nepřítomnosti
CE9.1.
Obrázek 14 ukazuje cytotoxický test CE9.1 závislý na komplementu, kde lýze buněk SupT-18 v přítomnosti CE9.1 a králičího komplementu, kde 4D9 je myší anti-CD4 kontrola podtřídy IgG2a, která je schopna fixovat komplement, a kde PRO965 je polyklonální směs protilátek ze séra opice Maca ca fascicularis s vysokým titrem anti-CD4.
Obrázek 15 ukazuje farmakologickou studii vysoké dávky u šesti šimpanzů, kde hladiny CD4 a CD8 v periferní krvi exprimované po období 150-300 dnů, křivky CD3-CD8
9 · • to · · ♦· · • to ·· ··· • · ♦ · · * «t· 9 • toto 9999 99999
9999 «·* • to toto • to to to· • toto
9999 vyznačující počet CD4 modulovaných buněk jsou také ukázány. Horní panel: skupina 1 - počty monitorovaných šimpanzů. Šipky vyznačují dávky CE9.1. 2) kontrolní skupin s fyziologickým roztokem, střední panel: skupina 2 - šimpanzi (2) dostávající 10 mg/kg CE9.1. Dávkováni se opakovalo, když se počty CD4 vrátily do rozmezí 30% od základní linie. Spodní panel: skupina 3 - šimpanzi (2) dostávající 10 mg/kg CE9.1. Dávkování se opakovalo, když se počty CD4 vrátily do rozmezí 70% od základní linie.
Obrázek 16 zobrazuje vhodné primery pro metodu PCR pro získání konstantní oblasti lidského γ4.
Obrázek 17 zobrazuje sekvenci těžkého řetězce ΟΕ9γ4ΡΕ.
Obrázek 18 zobrazuje výsledky elektroforézy v neredukujícím SDS-polyakrylamidovém gelu CE9.1, CE9y4(G4), CE9y4E(G4E) a ΟΕ9γΡΕ(G4PE). Je vidět poloviční molekula
(„polo-mer) o molekulové hmotnosti přibližně 80 kD.
Obrázek 19 obsahuje data pro asociační a disociační
fáze progresivních křivek SPR.
Obrázek 20 ukazuj e účinek konstruktů CD4 mAb na
primární MLR.
Obrázek 21 ukazuje adhezi monocytární linie THP-1
indukované IFN-γ k fibroblastovým transfektantám CD4+.
Obrázek 22 zobrazuje FcR a CD4+ zprostředkovanou adhezi CE9.1, CE9y4, CE9y4E a CE9y4yK.
Obrázek 23 ukazuje CDC a ADCC výsledky s CE9y4PE, CE9.1 a myší fixující mAb na HuCO4.
Obrázek 24 ukazuje plazmatické koncentrace následující bolus 1 mg/kg ΟΕ9γ4Ε a CE9y4PE u laboratorního potkana kmene Sprague-Dawley.
Obrázek 25 zobrazuje účinek ošetření s mAbs v protilátkové odpovědi specifické pro ovalbumin u transgenních myší HuCD4.
·· ··· · • · • ·· ·· φ φ •9 • ··
999 9999
99
999 9
99
99
99999
9 9· • ·99
99999
99
9999
Detailní popis vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje nové monoklonálni chimérické protilátky specifické pro CD4, které obsahuji část vázající antigen variabilní oblasti anti-CD4 monoklonálni protilátky z opice Starého světa fúzovanou k požadovaným sekvencím konstantní domény opice nebo člověka, výhodně konstantní doméně těžkého řetězce gama 1, gama 4 nebo mutovaného gama 4, a lidské sekvenci konstantní domény lehkého řetězce kappa nebo lambda. Tyto protilátky projevují zlepšené vlastnosti ve vztahu k obvyklým monoklonálním protilátkám anti-CD4, např. vysokou afinitu k lidským CD4+ a mají u lidí malou nebo žádnou imunogenicitu. Verze gama 4 ukazují sníženou nebo chybějící efektorovou funkci, např. vazebnou aktivitu pro receptor Fc nebo fixaci komplementu, a malou nebo žádnou T buněčnou depleční aktivitu.
Způsoby získávání monoklonálních protilátek z opic Starého světa specifickým k CD4 a klonů, které produkují monoklonálni protilátky z opic Starého světa specifické k CD4, mohou být nalezeny ve výše odkazovaných příbuzných patentových přihláškách, které jsou zde zahrnuty v odkazech.
Všeobecně to zahrnuje imunizaci opice Starého světa proti lidskému antigenu CD4 za podmínek, které jsou takové, že opice Starého světa produkuje protilátky anti-CD4, opičí buňky, které jsou zodpovědné za produkci protilátek antiCD4, se imortalizují, např. hybridomovou fúzí, virovou transformací s Herpes papio, jednoduchým B buněčným klonováním (také nazývaným „přechodná imortalizace), a vytvoření knihovny rekombinantních imunoglobulinů. Ve výhodných provedeních tento způsob zahrnuje výběr opičí •4 4444 sleziny, kostní dřeně které tvoří příslušnou o ... . 16
4 • 4 •
4444 •4
4 4 •
444
44 • 4 44 • 444 »4 4 44 • 44
4444
B buňky z leukocytů periferní krve, nebo lymfatické uzliny, výběr jádra, protilátku, získání imunoglobulinových genů kódujících tuto protilátku z imortalizované buněčné linie, a expresi genů v produkční buněčné linii (tj. buněčné linii, která umožňuje dostatečnou produkci protilátky použitelné pro lidskou terapii). Jak je definováno ve výše zmíněných přihláškách, opice Starého světa rhesus zahrnují paviány a opice rodu makak a Macaca fascicularis) .
Jak je pojednáno chimérické protilátky výše, zahrnují variabilní lehké sekvence anti-CD4 z opic Starého obrázku 1 a obrázku 2, fúzované k ve výhodném provedení předmětné těžké a variabilní světa ukázané na konstantní domény. Prostředky vhodné specifických sekvencí variabilní těžké domény 08/476 lidským sekvencím pro získání těchto a variabilní lehké ledna, jsou detailně popsány v přihlášce Spojených Států č. 237, podané 7. června, 1990 a 08/397
1995, a také 07/912 292, podané
10.
072, podané 25. července, 1992, všechny jsou zahrnuté v odkazech ve přihlášky dále vyjevují úplnou sekvenci aminokyselinovou sekvenci těchto sekvencí.
své úplnosti.
nukleové
Tyto kyseliny a
Tyto sekvence variabilních domén mohou být jakýmikoliv požadovanými sekvencemi lidské domény. Konkrétní výběr ovlivní efektorovou funkci výsledné chimérické protilátky anti-CD4. Výhodně konstantní domény lidského těžkého řetězce zahrnují konstantní doménu gama 1, gama 4 fúzovány s konstantní nebo nebo mutovanou gama 4, zde nazývanou jako mutovanou gama 4, zde nazývanou jako gama gama 4 je výhodný, protože bylo shledáno, gama 4E,
4PEPTID.
Výběr následek chimérické protilátky postrádající nebo podstatně postrádající T buněčnou depleční aktivitu (80-100 % relativně ke gama 1) . Věří se, že tomu tak je, protože že má za φφφφ φ
φ φ φ φ φ ΦΦΦ φ · φ φ φ ΦΦΦ
φ φ φφφφ konstantní doména gama 4 není schopná vazby s komplementem. Konstantní doména může být také mutována tak, aby se zesílily vlastnosti výsledné chimérické protilátky, např. stabilita, a/nebo aby se eliminovala depleční aktivita. Konkrétně modifikace P a E domény gama 4, které jsou popsány níže, jsou modifikace gama 4 v ohybové oblasti, které propůjčuji aktivitě zvýšenou stabilitu a odstraňují depleční aktivitu. Kromě toho se očekává, že další modifikace by také měly poskytnout chimérické protilátky mající zesílené vlastnosti.
Konstantní doména lidského lehkého řetězce obsažená v předmětných chimérických protilátkách anti-CD4 je výhodně konstantní oblast lidského lehkého řetězce kappa nebo lambda, výhodněji konstantní oblast lidského lehkého řetězce lambda. Aminokyselinové a DNA sekvence, které kódují lidské konstantní domény gama 1, gama 4, kappa a lambda, jsou v oboru známy. Aminokyselinové sekvence a sekvence nukleové kyseliny pro lidskou gama 4 a mutanty E a PEPTID a sekvence konstantní domény lambda je také možno nalézt na obrázcích 4 až 6 a obrázku 3.
Provedení vynálezu doložená příklady zahrnují specifickou chimérickou monoklonální protilátku anti-CD4, nazývanou CE9.1, která obsahuje domény vázající antigen získané z opic Macaca fascicularis imunizovaných lidským sCD4 (ukázáno na obrázcích 1 a 2), v kombinaci s konstantními doménami lidského IgGl a monoklonálními chimérickými protilátkami z nich pocházejícími, např. CE9y4, ΟΕ9γ4λΚ a CE9y4E, CE9y4PE, které mají tytéž domény vázající antigen z CE9.1, ale byly získány metodami genového inženýrství z kostry vazebné domény Fc lidského IgG4. Monoklonální protilátka ΟΕ9γ4Ε obsahuje mutaci, a sice změnu leucinu na kyselinu glutamovou (L236E) blízko ohybové ·* φφφφ φφ · · ··· φφφφ φ φφφ ··· φ φ φφ * φφφφ φ φ φφφ φ φ • φ · · φ φφφ φφφ φφφφ φφ φφφ φφ φφ oblasti protilátky (modifikace Ε) . Monoklonálni protilátka CE9y4PE obsahuje tutéž mutaci leucinu na kyselinu glutamovou a mutaci šeřinu na prolin (S229P) (modifikace „E a „P). Protilátka ΟΕ9γ4λΚ se liší od CE9y4 nahrazením konstantní oblasti jejího lehkého řetězce z lidského subtypu K na subtyp λ.
Tyto výměny a mutace konstantní domény byly učiněny proto, že je známo, že biologické odpovědi protilátek IgG závisí na složení jejich domén na karboxy- koncích, tj. na jejich izotypu. Tedy změnou protilátkového izotypu metodami proteinového inženýrství je potenciálně možné, aby se modifikovala biologická odpověď protilátky IgG, a přesněji předmětné chimérické monoklonálni protilátky anti-CD4.
Požadovaným výsledkem této strategie bylo to, aby výměna izotypu části Fc protilátky nesnížila vazebnou aktivitu oblastí Fab vázajících antigen CD4. Avšak toto nebylo na začátku známo. Bylo možné, že změna konstantní oblasti nebo její modifikace by mohly nepříznivě ovlivnit vazbu CD4. Proto byly výsledné protilátky testovány, aby se určily účinky modifikace na vlastnosti protilátek, zejména vazbu antigenů CD4. Aby se zjistily možné účinky výměny konstantní domény na vazbu antigenů, byly použity známé testovací způsoby. Konkrétně studie interakce mezi CD4 a CE9.1, CE9y4, ΟΕ9γ4λΚ, CE9y4E a ΟΕ9γ4ΡΕ byla provedena Scatchardovou analýzou a povrchovou plasmonovou rezonancí (SPR). Výsledky těchto analýz dokázaly, že vazby CD4 ke každé z testovaných protilátek byly rovnocenné. Při SPR bylo shledáno, že ekvilibrační disociační konstanty v 25 °C pro vazbu CD4 k protilátkám byly všechny přibližně 1.0 nmol. Měření dále dokázala, že:
1) vazba CD4 k protilátkám nastává dle dvoustranného nezávislého a identického vazebného modelu, a ·· ···· • 9 « ···
99 «9 9
9 9 9
999« 9
9 9
9« 99 •99 ♦ · 99 • 99
999 9999
9·<
99
9999«
2) funkční vazebné vlastnosti domén vázajících antigen jsou nezávislé na strukturálních modifikacích učiněných v části Fc protilátky včetně izotypu gama 1, gama 4 nebo mutovaného gama 4. Proto předkládaný vynález poskytuje důkaz, že výměna izotypu mezi IgGl a IgG4 je použitelnou strategií pro konstrukci protilátek bez ztráty afinity vázající antigen, a přesněji protilátek k CD4.
Také, jak popsáno níže, bylo zjištěno, že substituce konstantní domény gama 1 doménou gama 4 podstatně snižuje vazbu receptoru Fc, fixaci komplementu a T buněčnou depleční aktivitu a dále, že modifikace E a P odstraňují vazbu receptoru Fc a T buněčnou depleční aktivitu a zajišťují zvýšenou stabilitu protilátky. Proto je rozumné předpokládat, že další chimérické protilátky tvořené podle vynálezu (konstruované tak, aby obsahovaly lidskou konstantní doménu gama 4 nebo její mutované formy) jsou vybrány ty, které mají pozměněnou efektorovou funkci Fc, a které podstatně postrádají nebo jsou úplně zbaveny T buněčné depleční aktivity a/nebo které projevují zvýšenou stabilitu. Způsoby testování T buněčné depleční aktivity, efektorové funkce Fc a stability protilátky jsou v oboru známé.
Předkládaný vynález tedy poskytuje specifické rekombinantní protilátky, které jsou chimérické monoklonální protilátky z primátů/člověka a jsou namířeny proti lidskému antigenu CD4, a které projevují zlepšené vlastnosti, např. nízkou T buněčnou depleční aktivitu a větší stabilitu. Při těchto vlastnostech jsou tyto rekombinantní protilátky konkrétně použitelné jako imunomodulátory a jsou užitečné zejména pro léčbu autoimunitních nemocí, jako je revmatoidní artritida, psoriáza, systémový lupus erytematosus (SLE), a také v imunitních indikacích jiného než autoimunitního původu, jako je nemoc štěp-proti-hostiteli (GVHD) • 9 9»
9 · 9 • 9 99 · 9 9
9 9
9· 99 • 4 ·«·* transplantační rejekce, astma a HIV. Předmětné protilátky jsou také prospěšné jako doplněk genové terapie. Konkrétně mohou být předmětné protilátky podávány před, současně nebo po podávání vektoru (obsahujícího terapeutickou DNA), aby odvrátily nebo redukovaly hostitelskou humorální odpověď na uvedený vektor. Tyto nemoci jsou příklady CD4 příbuzných stavů.
Jak je detailněji popsáno v příkladech, rekombinantní protilátka CE9.1 vzniká připojením variabilních domén Fv vázajících antigen z Macaca fascicularis k lidským, konstantním oblastem, např. konstantních domén IgGl. Konkrétněji protilátka CE9.1 obsahuje lidskou doménu gama 1 a konstantní doménu lambda. CE9y4, CE9y4ÁK, CE9y4E a CE9y4PE obsahují konstantní doménu gama 4 nebo její mutovanou formu a konstantní oblast lambda nebo kappa. Sekvence výsledné rekombinantní protilátky jsou nerozlišitelné od sekvencí lidského imunoglobulinu. Jako výsledek by měly tyto protilátky, a také další protilátky CD4 tvořené podobnými způsoby, projevit při podání in vivo u lidí sníženou nebo žádnou imunogenicitu a pomalejší vymizení ze séra (sérovou clearance) ve srovnání s podobnými myšími monoklonálními nebo myšími-lidskými chimérickými protilátkami namířenými proti CD4.
Protilátka CE9.1 se váže k doméně 1 lidského CD4, ale ne makaka, což je oblast, která je zapojena do interakce s molekulami MHC třídy II na buňkách prezentujících antigen. Testy také dokázaly, že další protilátky uvedené v příkladech mají stejné vlastnosti pro vazbu antigenu jako CE9.1.
U protilátky CE9.1 byla pozorována silná imunomodulační aktivita jak in vitro, tak in vivo. Při těchto vlastnostech, tj. snížené imunogenicitě, pomalejší sérové clearanci a • ·· φφ φφφφ φφ φφ ♦ · · · · · φ φ φ · · • · φ φ Φ· φ ···· • » · · · ···«··· • · · · · « · · ··« ΦΦΦΦ φφ Φφφ φ« φ0 silné imunomodulaci, při srovnání s jinými známými protilidskými mAbs CD4, které pocházejí z myší nebo hlodavců, je tato protilátka, stejně jako další protilátky zde popsané, obzvláště vhodná pro dlouhodobou terapii nemoci, kdy je žádoucí imunosuprese, např. autoimunitní poruchy a chronické zánětlivé nemoci, jako je revmatoidní artritida. Očekává se však, že tyto protilátky budou použitelné pro léčbu mnoha dalších chorobných stavů, včetně, například, Hashimotovy tyreoiditidy, primárního myxedému, tyreotoxikózy - Gravesovy nemoci, perniciózní anémie, autoimunitní atrofické gastritidy, autoimunitní karditidy, Addisonovy nemoci, ’ předčasné menopauzy,' diabetů mellitu typu I, Goodpastureova syndromu, myastenie gravis, sclerosis multiplex, mužské infertility, pemfigus oftalmie, fakogenní anémie, idiopatické leukémie, primární hepatitidy (HBsAg negativní), zánětlivé nemoci střevní, vulgaris, pemfigoidu, uveitidy, autoimunitní trombocytopenické purpury, biliární cirhózy, aktivní kryptogenní cirhózy, Sjogrenova syndromu, de rma t omyo z i t i dy, diskoidního sympatické hemolytické idiopatické chronické revmatoidní artritidy, smíšené systémové nemoci pojivá, vaskulitidy a syndromu psoriázy, sklerodermie,
Jak pojednáno výše, zánětlivá autoimunitniho jevu, destrukci kloubů.
lupus erytematosus, systémového revmatoidní lupus erytematosus artritida (RA) je která zahrnuje manifestaci nemoc synovia, který má za následek erozi, deformitu a
Jak platí nemoci, etiologie charakterizována
RA není lymfocytů neexistuje nemoci je zvýšenými postižených vyléčení RA a terapie navržena pouze tak, aby
CD4+ v pro většinu autoimunitních dobře definována, ale je hladinami aktivovaných T kloubech. V současnosti pro léčbu této oslabující krátkodobě poskytla úlevu ·· ···· • · • ··· ·· ·· •· · · •· ·· ··· ·· • ·· • 4·· od příznaků a zlepšení ve funkčních schopnostech. Kromě toho, ímunosupresiva a steroidy druhé a třetí linie, jako je azathioprin, metotrexát a prednisolon, které cílí na základní nemoc, jsou podávány pouze ve vážnějších případech a jsou obvykle mírně účinné nebo projevují nepřijatelnou toxicitu pro používáni v chronické léčbě. Na rozdíl od toho se očekává, že předmětná protilátka je vhodná pro dlouhotrvající a chronické podávání díky faktu, že projevuje sníženou imunogenicitu, delší poločas rozpadu a silnou imunomodulační aktivitu ve srovnání s jinými známými protilidskými mAbs CD4, které pocházejí od myší nebo hlodavců.
V podstatě rekombinantní monoklonální protilátky antiCD4, uvedené jako příklady v této přihlášce, nebo jiné protilátky, tvořené podle předkládaného vynálezu a popsané v již výše citované přihlášce (zahrnuté v odkazech), pravděpodobně zprostředkovávají léčebnou aktivitu zastavením nebo pozměněním destrukční aktivity buněk CD4+, zejména během akutních fází autoimunitních poruch jako je revmatoidní artritida. Podávání protilátek podle vynálezu má tedy za následek stav imunologické neodpovídavosti (anergie) nebo dlouhodobé tolerance ke škodlivým antigenům (nebo specifickým tkáním), které udržují základní nemoc, aniž by se ohrozila normální obrana hostitele proti oportunním infekcím. Nehledě na RA, monoklonální protilátky CD4 mohou být prospěšné pro léčbu výše zmíněných nemocí a umožňují konkrétní aplikaci pro léčbu diabetů mellitu závislého na inzulínu, systémového lupus erytematosus, cirhózy, zánětlivé střevní nemoci, sclerosis multiplex, a také dalších autoimunitních nemocí. Mohou být použitelné také v léčení neautoimunitních nemocí, jako je leukémie, lymfom, reakce štěpu proti hostiteli, transplantační rejekce, astma a HIV.
• ·
Rekombinantní monoklonální protilátky anti-CD4, tvořené podle vynálezu, zprostředkovávají požadovaný terapeutický účinek in vivo prostřednictvím jednoho nebo více následujících mechanismů:
i) blokování interakce CD4 s molekulami MHC II. třídy, ii) utlumení CD4 na buněčném povrchu iii) způsobení anergie a/nebo apoptózy, iv) deplece buněk CD4, nebo
v) indukce tolerance k autoantigenům.
Ačkoliv přechodná deplece buněk CD4+ má za následek imunosupresi a snad normalizaci jinak hyperaktivního imunitního systému, hlavní mechanismus, kterým protilátky anti-CD4 projevují svůj účinek in vivo není nezbytně závislý na depleci T buněk. Má se spíše za to, že vazba protilátky k molekule CD4 zabraňuje aktivaci pomahačských T buněk antigeny vázanými k T buněčnému receptorů, což vede k antigen-specifické T buněčné anergii nebo toleranci. Například protilátka CE9.1, která obsahuje lidskou doménu gama 1, projevuje podstatnou imunosupresivní aktivitu, avšak u šimpanzů vyčerpává buňky CD4 pouze částečně. Kromě toho nyní výsledky klinických zkoušek u lidí naznačují, že tato protilátka má za následek podstatně menší buněčnou depleci ve srovnání s jinými monoklonálními protilátkami.
Také v experimentálních modelech in vivo, byla aloštěpů navozena nedeplečními podávanými v čase transplantace, nevyžaduje depleční protilátku antizávislé na nepřerušovaném výskytu těchto zjištění se očekává, že protilátky nebo jiné rekombinantní protilátky anti-CD4 tvořené podle vynálezu jsou vhodné pro specifická tolerance protilátkami
Udržení stavu
CD4, ale antigenu.
anti-CD4 tolerance zdá
Na se být základě rekombinantní léčbu autoimunitních nemocí. Krátká léčebná schémata s
protilátkami anti-CD4 interferují s odpověďmi pomahačských T buněk proti autoantigenům, což vede k dlouhotrvajícím klinickým zlepšením v nepřítomnosti generalizované imunosuprese.
Na základě informací v předmětné přihlášce a za použití známých metod, odborník může snadno zjistit bezpečný, tolerovaný a účinný režim doložených rekombinantních protilátek anti-CD4 zde vyjevených, a také dalších protilátek tvořených v podstatné shodě s vynálezem.
Jak bylo zmíněno, CE9.1 je monoklonální protilátka antí-CD4, makak/lidská chimérická protilátka molekuly IgGl, která je exprimována v buňkách ovarií čínského křečka (buňky CHO) , která projevuje 91-92% homologii s kostrou molekuly lidského imunoglobulinu.
Proto tato molekula u lidí projevuje sníženou nebo dokonce žádnou imunitní odpověď a projevuje delší poločas rozpadu v séru při srovnání s myšími monoklonálními nebo myšími/lidskými chimérickými protilátkami. Protilátka projevuje také omezenou zkříženou reaktivitu s lidskými tkáněmi. Například při testováni nebyl pozorován žádný důkaz vazby této protilátky k nelymfoidním tkáním. Jak se očekávalo, protilátka se váže k některým, ale ne ke všem lymfoidním buňkám periferní krve a dalších orgánů. Bylo také nalezeno, že tato protilátka reaguje s šimpanzími T buňkami CD4+, ale nereaguje s T buňkami CD4+
Macaca rhesus, Macaca fascicularis nebo Macaca nemestrina, paviánů, krys, myší nebo králíků. Vzhledem k této reaktivitě, šimpanzi obsahují příslušné druhy k potvrzení farmakologických účinků této protilátky in vivo, tj. její schopnost působit jako účinné imunosupresivum.
Protilátka CE9.1 projevuje reverzibilní T buněčnou depleční aktivitu u šimpanzů. Kromě toho je pravděpodobné, že bude lepší oproti současným myším a myším/chimérickým · · · · · monoklonálním protilátkám anti-CD4 pro svůj očekávaný delší poločas rozpadu v lidském séru a snížených potenciálních nepříznivých imunogenních účinků. Vzhledem k přítomnosti sekvencí lidské konstantní domény se také očekává, že předmětná protilátka bude při podávání lidem udržovat normální efektorové funkce lidských protilátek. Vskutku byly efektorové funkce protilátky CE9.1, a také dalších zmíněných protilátek, vyhodnoceny v několika odlišných testech. Bylo shledáno, že protilátka CE9.1 projevuje inhibiční aktivitu ve smíšené lymfocytární reakci (MLR), projevuje slabou vazbu Clq, ale neprojevuje buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou komplementem. Bylo také zjištěno, že projevuje buněčnou cytotoxickou aktivitu komplementu závislou na protilátce (ADDC) a váže se k FcR. Protilátka CE9.1 byla také vyhodnocena in vivo na šimpanzech, kde bylo zjištěno, že podávání má za následek částečnou depleci buněk CD4 a modulaci receptoru CD4.
Protilátka CE9.1 byla podávána šimpanzům v různých dávkách. Přesněji byly u šimpanze studovány dávky 0,1; 0,3; 1; 5; a 10 mg/kg, které byly podávány v intervalech 7 až 14 dnů. Nebyl pozorován žádný důkaz toxicity. Dávky 1 mg/kg nebo větší způsobily 80-95% redukci v cirkulaci buněk CD4+ 24 hodin po podání dávky. Významné snížení buněk CD4+ nebyl pozorován sedm dní po dávce 1 mg/kg. Po dávce 5 mg/kg počty cirkulujících buněk CD4+ nabyly znovu přibližně 40 % výchozího stavu po sedmi dnech a přibližně 60 % výchozího stavu po čtrnácti dnech. Po dávce 10 mg/kg se počty cirkulujících buněk CD4+ po sedmi dnech neobnovily a nabyly znovu pouze 40 % výchozího stavu čtyřicetdva dnů po podání dávky. V dalších klinickopatologických parametrech nebyly pozorovány žádné změny.
Protilátka CE9.1 byla také testována na lidech. Například aktivita protilátky CE9.1 byla vyhodnocena u pacientů s revmatoidní artritidou v jednofázových zkouškách stoupající jednotlivé dávky. Výsledky byly velmi slibné. Přesněji, u poloviny pacientů, kterým byla protilátka podávána, se projevilo alespoň 30% zlepšení stavu malých kloubů, a profil nepříznivých příhod byl extrémně benigní. Kromě toho, jak diskutováno výše, zatímco se původně předpokládalo, že CE9.1 je depleční, ve skutečnosti tato protilátka projevila pouze částečnou a přechodnou depleci po jednom podání. Částečně nedepleční povaha této protilátky může být prospěšná, protože v několika studiích provedených na zvířatech bylo publikováno, že deplece T buněk CD4+ není zjevně nezbytná pro účinnost monoklonálních protilátek CD4. (Viz Carteron et al., Induction of Immune Tolerance During Administration of Monoclonal Antibody to L3 T4 Does Not Depend on L3 T4+ Cells, Underlying Journal of Immunology, 140, 713-716, 1988, Carteron et al., F(ab')2 Anti-CD4 and Intact Anti-CD4 Monoclonal Antibodies Inhibit the Accumulatíon of CD4+ T Cells, CD8+ T Cells a BT T Cells a B Cells in the kidneys of Lupus-Prone NZB/NZW Mice, Clinical Immunology Immunopathology, 56, 373-383, 1990). Tato protilátka může tedy působit jako klasický receptorový antagonista tím, že: i) blokuje interakci CD4 svým opačným receptorem MHC II, nebo ii) způsobuje modulaci CD4 z buněčného povrchu. Za těchto podmínek jsou T buněčné odpovědi CD4+, které vyžadují zapojení receptoru CD4, oslabeny nebo blokovány. Fakt, že předmětná protilátka CE9.1 zjevně projevuje málo depleční aktivity u lidí, je výhodný, protože zlepšuje bezpečnost, odstraňuje potřebu častého sledování počtu buněk CD4+ a také zlepšuje účinnost.
·· ···· • ·
Protilátka CE9.1 byla navržena tak, aby snižovala počty buněk CD4 in vivo prostřednictvím receptoru Fc a mechanismů vázajících komplement. Studie na šimpanzech naznačují, že CE9.1 způsobuje částečnou depleci buněk CD4 a počáteční výsledky naznačují, že buněčná deplece u lidí je velmi snížena při srovnání s jinými mAbs CD4. Avšak je také žádoucí produkovat protilátky, které jsou zbaveny depleční aktivity.
Použitelnost „nedeplečních mAbs CD4 může být zlepšena vzhledem k následujícím faktům:
i) pro účinnost mAbs CD4 není vyžadována deplece buněk CD4, ii) chybění buněčné deplece CD4 zvyšuje bezpečnost protilátky, iii) větší bezpečnost umožňuje, že mAbs jsou použity dříve v průběhu nemoci, iv) chybění buněčné deplece CD4 zlepší účinnost, a
v) chybění buněčné deplece CD4 odstraňuje nebo snižuje potřebu častého monitorování počtu buněk CD4, a tak zvyšuje výhodnost a cenu celkového léčení.
Toto podporují fakta, že na několika zvířecích modelech bylo ukázáno, že pro účinnost mAbs CD4 není vyžadována T buněčná deplece CD4+. Tedy nedepleční mAb CD4 působí jako klasický receptorový antagonista tím, že:
i) blokují interakci CD4 se svým opačným receptorem MHCII, ii) způsobují modulaci CD4 z buněčného povrchu, nebo iii) způsobují T buněčnou anergii a/nebo apoptózu.
Tudíž T buněčné odpovědi CD4+, které vyžadují účast receptoru CD4, jsou změněny nebo blokovány.
Všeobecně, T buněčné odpovědi, které jsou řízeny silnými nebo vysokoafinitními antigeny se zdají být
nezávislé na koreceptorových funkcích CD4 a nejsou tedy účinně blokovány mAbs CD4. Naopak T buněčné odpovědi na slabé antigeny (jako autoantigeny) vyžadují koreceptorové funkce CD4 a proto jsou inhibovány mAb CD4. Normálně silně autoreaktivní T buňky (T buňky s vysokou afinitou TCR k vlastním antigenům) jsou v thymu odstraněny „klonální delecí a nikdy se tudíž neobjeví v periferii. Na rozdíl od toho T buňky, které řídí autoimunitní odpovědi, se považují za slabě autoreaktivní buňky, které unikly normálním mechanismům periferní tolerance. Takové buňky jsou pro plné zpracování odpovědi závislé na součinnosti koreceptorů, jako je CD4. Proto blokování koreceptorů zbavuje tyto T buňky kritických společných signálních funkcí, které mají za následek částečnou aktivaci nebo anergii. Také, jak zmíněno výše, je dále žádoucí, aby se tvořily chimérické protilátky specifické pro CD4 mající větší stabilitu (delší biologický poločas in vivo) .
Co se toho týče, byly syntetizovány různé chimérické protilátky, které obsahují lidskou konstantní doménu gama 4. Tato doména byla vybrána, protože podle všeho neváže lidský komplement nebo receptory FCyl. Proto vznikla hypotéza, že chimérické protilátky obsahující tuto konstantní doménu postrádají nebo podstatně postrádají T buněčnou depleční aktivitu. Byly také vytvořeno několik chimérických protilátek, které obsahovaly známé modifikace konstantní domény gama 4. Konkrétně několik obsahuje modifikaci „E, která je popsána Duncanem et al., Nátuře, 332, 563-564, 1988, a Winterem et al., WO 88/07089, 1988, kteréžto modifikace byly vyjeveny jako modifikace redukující vazbu komplementu a receptoru FCyl. Tato modifikace obsahuje změnu leucinu na kyselinu glutamovou v pozici 236 (248 Kabatova číslování), aby se zrušila jakákoliv reziduální vazba • t ···· receptoru Fc. Také několik chimérických protilátek obsahuje modifikaci „P, která je popsána Angalem et al., Mol. Immunol., 30, 105-8, 1993. Tato modifikace, které obsahuje změnu šeřinu v pozici 229 (241 Kabatova číslování) na prolin, zvyšuje stabilitu (biologický poločas v séru) stabilizací disulfidových vazeb mezi těžkými řetězci a bylo publikováno, že zvyšuje zlepšenou tkáňovou distribuci v porovnání s chimérickým IgG4, který postrádá tuto modifikaci.
Přesněji, základním důvodem pro vývoj CE9y4 bylo .
odstranění fixace komplementu a snížení vazebných aktivit FcR. Tato protilátka se liší od CE9.1 v tom, že obsahuje lidskou konstantní doménu gama 4 (ne gama 1). Avšak, zatímco bylo toto vyžadováno, výsledek nebyl rutinní nebo předpověditelné povahy. Přítomní vynálezci vskutku nalezli, že chimérické protilátky obsahující nemodifikovanou γ9, měly tutéž vazbu receptoru Fc jako protilátka γ2. Na rozdíl od toho, základním důvodem pro tvorbu ΟΕ9γ4λΚ bylo zvýšit produktivitu konstruktu γ4. Tato protilátka se od CE9.1 liší v tom, že obsahuje lidský lehký řetězec kappa a nikoliv lambda. Hodnoceni CE9y4 in vitro vazebným testem na receptor Fc, který měří vazbu protilátky na stimulované monocyty a monocytární buněčné linie, ukázalo, že CE9y4 stále má významnou vazebnou aktivitu pro receptor Fc. Nadto vazba CE9y4 byla v tomto testovacím systému nerozlišitelná od CE9.1 (gama 1). Základním důvodem pro výrobu CE9y4 tedy bylo kompletně odstranit jakoukoliv reziduální vazbu FcR ve srovnání k chimérickým protilátkám obsahujícím nemodifikovanou γ4. CE9y4 obsahuje konstantní doménu gama 4 modifikovanou v jednom místě (modifikace E) . Konečně, základní důvod pro výrobu CE9y4PE bylo zvýšení stability oproti chimérickým protilátkám obsahujícím nemodifikovanou γ4
• toto ·· ···· • · ··
• toto · • · • • · • ·
• · • · • · « • · • ·
• · • · to • • ·· · • ·
• · • · • • to to
·· · · · ·· ·· to·· • · • ·
nebo mutaci v jednom místě (modifikace E) . Tato protilátka obsahuje konstantní doménu gama 4 modifikovanou ve dvou místech (modifikace P a E).
Jak bylo již diskutováno, lidská konstantní doména γ4 byla vybrána jako izotyp pro odstranění efektorových funkcí, t j. reaktivity s lidskými receptory Fcy nebo Clq, a nepřítomnost deplece buněk CD4+ in vivo. Tito čtyři.kandidáti byli vybráni a exprimováni v buňkách CHO.
Dvě z těchto monoklonálních protilátek byly vybrány pro rozsáhlejší studii, tj. CE9y4E a CE9y4PE. Jak zmíněno, obě obsahují substituci kyselinou glutamovou v oblasti CH2 vnesenou proto, aby eliminovala reziduální vazbu FcR sdruženou s konstantní oblastí gama 4. Kromě toho CE9y4PE obsahuje substituci prolinem v ohybové oblasti, zamýšlenou zvýšit stabilitu interakce disulfidové vazby těžkého řetězce.
Bylo nalezeno, že tyto protilátky jsou nerozeznatelné v jejich afinitě pro CD4, molekulové hmotnosti, stabilitě k tepelné denaturaci, supresi MLR, chybění vazby k FcR a nedostatku aktivity v ADCC a CDC. Tedy obě tyto protilátky splňují in vitro kritéria pro vysokoafinitní mAb CD4, které nemají žádné efektorové funkce FcR a komplementu.
Vlastnosti CE9.1 a CE9y4PE jsou srovnány v tabulce 1. Snížená vazba receptorů Fc se vztahuje k chimérickým protilátkám, které vážou k receptorů Fc méně než 1 chimérickou protilátku obsahující γΐ, výhodné je sníženi alespoň o 30 až 80 % ve srovnání s tím, a výhodnější je snížení alespoň o 50 až 80 % a ne j výhodně j ší je úplné odstranění. Avšak, jak doloženo výsledky s nemodifikovanou chimérickou protilátkou gama 4, požadovaný výsledek nebyl předpověditelné povahy.
• · · · · ·
Tabulka 1
Srovnání efektorových funkcí CE9.1 a CE9y4PE
Aktivita CE9.1 CE9y4 PE
In ví tro
MLR ano ano
Vazba Clq slabá ne
CDC ne ne
ADCC ano ne
Vazba FcR ano ne
In vivo (šimpanz)
Deplece buněk CD4 částečná ne
Modulacereceptoru CD4 ano ano
In vivo (transgenní myši HuCD4+)
Deplece buněk CD4 částečná ne
Modulace receptoru CD4 ano ano
ADCC = buněčná cytotoxicita závislá na protilátce
CDC = buněčná cytotoxicita zprostředkovaná komplementem
FcR = receptor Fc
MLR = smíšená lymfocytární reakce
Tyto výsledky tedy potvrzují, že podle vynálezu jsou tvořeny chimérické protilátky, které váží lidský CD4, které postrádají určité efektorové funkce následkem selekce specifických sekvencí konstantních domén.
Při použití chimérických protilátek anti-CD4 doložených v příkladech nebo jiných chimérických protilátek tvořených podle vynálezu jako imunosupresiv nebo modulátorů CD4 pro léčbu autoimunitních nemocí, včetně například revmatoidní artritidy, jsou takové protilátky podávány samotné nebo v kombinaci s dalšími sloučeninami vhodnými pro léčbu ·» ·»·· • · · · konkrétního chorobného stavu. Například předmětná protilátka může být podávána v kombinaci s dalšími proteiny, jako jsou například monoklonální protilátkové rozpustné receptorové proteiny k TNF-alfa, monoklonální protilátky k receptoru IL2, monoklonální protilátky a receptorové fúzní proteiny, které antagonizují interakci CD40/gp39 a CTLA 4-IgG v monoklonálních protilátkách, které antagonizují interakci B7/CD28. Také, v případě léčby revmatoidní artritidy, mohou být předmětné protilátky podávány v kombinaci s dalšími léčivy, jako je například Rapamycin, Leflunomid, Tenidap, · RS-61443 (mykofenolát mofetil), Surenyl (hyaluronát sodný), peptidová vakcína anti-TCR (νβ17), Anerva X (vakcína antiMHC) a extrakorporální imunoabsorbenty proteinu A nebo jejich kombinace. Dodatečně může být předmětná protilátka podávána v kombinaci s dalšími protilátkami tvořenými podle vynálezu nebo v oboru známými, které jsou specifické pro lidský CD4. To má za následek synergické účinky, například jestliže se tyto protilátky váží k odlišným epitopům proteinu CD4.
Následující příklady jsou uvedeny pro další popis vynálezu.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Klonování a exprese opičí/lidské chimérické protilátky se specifitou k CD4
Následující popis je specifický příklad způsobů a protilátek tohoto vynálezu.
•4 *··♦ • * « ··<
Vytváření imortalizovaných linii opičích B buněk
Dospělá opice Macaca fascicularis (White Sands New Mexico Primáte Center) byla intramuskulárně imunizována na četných místech 150-300 pg rozpustného CD4 (sCD4) nebo buněčnými membránami (lxlO8 buněk) z CD4 pozitivní buněčné linie SupTl za použití standardního adjuvans. Imunizace se opakovala každé 2-3 týdny celkem šestkrát. Opici byla dána druhá injekce 100 ug sCD4 do ingvinální oblasti stehna a o týden později byla chirurgicky odstraněna drenážní lymfatická uzlina z téhož stehna. Lymfocyty byly z lymfatické uzliny odstraněny nařezáním tkáně na plátky a propláchnutím sterilním médiem DMEM. Buněčná suspenze byla procezena skrze nylonové sítko a sebrána odstředěním v 1000 x g po dobu 10 minut.
Přibližně 1 x 108 lymfocytů bylo suspendováno v Trisamonium chloridovém pufru (16 mM, pH 7,5) a zahřáto na 37 °C po dobu 45 minut. Buňky ošetřené LME byly filtrovány přes nylonový filtr a stočeny. Přidal se 1 ml fetálniho telecího séra, buňky se suspendovaly a dvakrát promyly v RPMI bez séra. Buňky byly spočítány a promíchány v jedné 50mililitrové kónické centrifugační zkumavce se stejnými množstvím heteromyelomových buněk K6H6/B5, předem dvakrát promytých v médiu bez séra. Buňky byly jemně suspendovány v 1 ml 50% PEG (polyetylenglykol) přidávaném pomalu s jemným mícháním po dobu 1 minuty. Buňky byly poté resuspendovány přidáním 20 ml média bez séra po dobu 5 minut za mírného mícháni, aby se rozředil PEG. Po dvojím promytí médiem bez séra byly buňky resuspendovány v koncentraci 5 x 105/0,l ml v médiu RPMI, obsahujícím 20% fetální telecí sérum a gentamycin a umístěny na 96jamkové mikrodestičky pro tkáňové kultury v množství 0,1 ml na jamku. Do každé jamky byl
9 ·· ·· • •00 ·· ··
·· · · 9 · • • · · 0
• · • · ··· • · • 0
• · • · · 0 · ♦ ·· · •
• · • · • « a •
··♦ ···· 00 ··· ·· 00
přidán stejný objem média HAT (0,1 ml) a hybridům bylo umožněno růst po dobu 14-17 dnů před testováním.
Testováni fúzovaných buněčných hybridů na tvorbu anti-CD4
Test na určování specifity anti-CD4 byl proveden, jak je popsáno dále: destičky pro ELISA byly povlečeny rekombinantní sCD4 v koncentraci 100 ng na jamku a blokovány 1% bovinním sérovým albuminem v PBS. Z každé jamky byly odstraněny poměrné části 50 μΐ hybridomového supernatantu a nechaly se inkubovat po dobu 60 minut s destičkami povlečenými sCD4. Vazba byla detekována inkubaci s kozím proti-lidským nebo kozím proti-opičím IgG značeným 125I po dobu 60 minut. Po promytí čtyřikrát destilovanou vodou byly jamky vzhodnoceny počítačem impulzů gama. Pozitivní jamky byly v duplikátech testovány znovu a hybridomové buňky z těchto jamek byly třikrát subklonovány, poprvé v 5 buňkách na jamku a poté dvakrát v 1 buňce na jamku. V tomto stadiu byly pozitivní anti-sCD4 testovány na schopnost vázat se k CD4 na buněčném povrchu. To bylo provedeno inhibicí vazby myší monoklonální anti-CD4, nazývané 1F3, k CD4 pozitivní buněčné linii supTl. V krátkosti to bylo provedeno společnou inkubací různých množství opičí anti-CD4 a 10 gg 1F3 značené 125I s 3 x 105 buněk supTl na 1 jamku v 96jamkové destičce. Po 1 hodině inkubace při teplotě místnosti (20-25 °C) byly buňky pomocí vakua přemístěny na filtry ze skleněných vláken. Po důkladném promytí PBS byly filtry vyhodnoceny počítačem impulzů gama, aby se určila inhibice vazby 1F3 na buňky supTl supernatanty opičích hybridomů.
Byl vybrán klon, který tvořil protilátku, která vykazovala silnou inhibici proti 1F3. Klon byl izotypizován za použití lidských izotypizujících reagencií a bylo shledáno, že je IgG2 a má lehký řetězec lambda. Tato buněčná • · ··· · ···· · · · ···· • · · · · · · · ··· • · · · · · · ···· · • · · · · · · · ······· ·· ··· ·· ·· linie byla pěstována do velkého množství pro klonování jejích imunoglobulinových genů.
Klonování genů variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce z opičích imortalizovaných B buněk
Z 1 x 107 opičích imortalizovaných B buněk byla izolována celková RNA za použiti guanidiniumizothiokyanátové metody. Jedna desetina celkové RNA byla použita, aby se vytvořila jednovláknová cDNA za použiti oligonukleotidového primeru oligo-dT a reverzní transkriptázy. Jedna desetina množství jednovláknové cDNA byla použita pro reakce PCR (polymerázová řetězová reakce). Každá ze šesti reakcí PCR obsahovala jeden ze šesti 5' oligonukleotidových primerů specifických pro rodinu VH obsahujících restrikční místo Sal I spolu s 3' oligonukleotidem pro konstantní oblast IgG obsahujících místo Nhe I, obojí je ukázáno na obrázku 7-1. Podobně probíhalo pět reakcí PCR, které využívají jeden z pěti 5' oligonukleotidových primerů pro vedoucí sekvenci lambda obsahujících místo Bgl II a 3' primer pro konstantní oblast lambda obsahující místo Avr II. Reakční podmínky byly jak popsáno výše. Každá reakce PCR byla provedena v trojnásobném opakování. Produkty z každé amplifikační reakce pro těžký a lehký řetězec byly analyzovány na 1,2% agarózových gelech. Primer pro těžký řetězec CH4 (5'ACTAAGTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT-3') a primer lambda (5'ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTTCTCCTCC-3') dávaly silné pásy při elektroforéze v agarózovém gelu. Produkty těchto reakcí byly použity pro klonování do vektoru TCAE 6, který obsahuje sekvence konstantní oblasti lidského IgGl a lambda.
Klonování dvou genů variabilní oblasti do expresního vektoru TCAE 6 bylo prováděno postupně. Zaprvé byly produkt
PCR těžkého řetězce a vektor TCAE 6 štěpeny restrikčními
enzymy Sal I a Nhe I, produkty byly poté extrahovány fenolem/chloroformem a přečištěny přes centrifugačni kolonu SEPHADEX G-25. Produkt PCR byl ligován do naštěpeného vektoru přes noc ve 14 °C v přítomnosti DNA ligázy T4. Přibližně 500 ng celkové DNA se ligovalo v objemu 10 μΐ v molárním poměru inzert/vektor 10:1. Ligovaný materiál se použil k transformaci kompetentních buněk XL-1 Blue (Stratagene) a transformované buňky byly vysety na misky s agarem LB obsahujícím ampicilin v koncentraci 50 gg/ml. Kolonie bakterií rezistentních na ampicilin byly sebrány a pěstovány jako 5 mililitrové tkáňové minikultury. Z každé z těchto kultur byla extrahována plazmidová DNA standardní metodou alkalické lýzy, naštěpena restrikčními enzymy Sal I a Nhe I a produkty byly rozděleny na 1,2% agarózovém gelu. Plazmidy s inzerty o přibližné velikosti 450 bp byly použity jako templáty pro následné klonování variabilních oblastí lehkého řetězce. Produkty reakce PCR pro lehký řetězec, a také plazmid obsahující inzert těžkého řetězce byly naštěpeny restrikčními enzymy Bgl II a Avr II a ligovány k sobě. Plazmidové minikultury byly testovány štěpením s Bgl II a Avr II. Štěpné produkty, které udávaly inzert přibližné velikosti 400-450 bp byly považovány za pozitivní. Plazmidy obsahující oba inzerty Sal Ι/Nhe I a Bgl II/Avr II byly pěstovány ve větším množství pro sekvenování DNA.
Expresní vektory TCAE 5.2 a TCAE 6 pro tandemové chimérické protilátky byly odvozeny z vektoru CLDN, který sám je derivát vektoru RLDNIOb (Science, 253, 77-79, 1991). RLDNIOb opět je derivátem expresního vektoru TND (DNA, 7, 651-661, 1988).
RLDNIOb se Liší od vektoru TND v následujícím.
Transkripční kazeta (promotor, cDNA a polyadenylační oblast) pro dihydrofolátreduktázu (DHFR) byla umístěna mezi kazetu tkáňového aktivátoru plazminogenu (t-PA expresní kazeta) a kazetu neomycinfosfotransferázy (NEO) kazety jsou zařazené jedna za druhou orientaci. Navíc promotor genu DHFR tak, že a v téže všechny tři transkripční byl nahrazen hlavním promotorem myšího beta globinu (Mol. Cell Biol., 3, 1246-54, 1983) a cDNA t-PA nahrazena mnohočetným klonovacím místem (polylinker). Všechny tři eukaryotické kazety (expresní, DHFR, NEO) mohou být bakteriální plazmidové DNA (derivát pUC9) restrikční endonukleázou Not I.
v CLON transkripční odděleny od štěpením s
CLDN se liší od RLDNIOb, protože před polylinkerem byl nahrazen promotorovým časného genu lidského cytomegaloviru (Cell, 41, 521, 1985).
se liší od CLDN v
LTR z
Rousova viru zesilovačem
Expresní vektory TCAE 5.2 tom, že:
a TCAE
1) obsahují čtyři transkripční za sebou:
kazety
a) konstantní oblast lehkého imunoglobulinu získaného prostřednictvím amplifikace cDNA polymerázovou řetězovou reakcí. V TCAE 5.2 to je konstantní oblast lehkého řetězce kappa lidského imunoglobulinu (Kabatovo číslování aminokyselin 108-214, alotyp Km3), a v
TCAE 6 konstantní oblast lehkého řetězce lambda imunoglobulinu (Kabatovo číslování aminokyselin genotyp Oz minus, Mcg minus, alotyp Ke minus), konstantní oblast těžkého řetězce lidského
108-215, lidského imunoglobulinu, v obou konstruktech to byla konstantní oblast gama 1 těžkého řetězce lidského imunoglobulinu (Kabatovo číslování aminokyselin 114-748, alotyp Gmla, Gmlz), která byla odvozena prostřednictvím amplifikace cDNA polymerázovou řetězovou reakcí, • · φφφφ ·· φφ • · · · φ · · φφφφ • · · ···· · ··· • · · φ φ φ · · · · · · • φ * · φ φφφ φφφφφφφ φφ φφφ φφ φφ
c) DHFR, obsahující svůj vlastní eukaryotický promotor a polyadenylační oblast,
d) NEO, také má svůj vlastní eukaryotický promotor a polyadenylační oblast.
2) Kazety lehkého a těžkého řetězce lidského imunoglobulinu obsahují syntetické signální sekvence pro sekreci imunoglobulinových řetězců.
3) Kazety lehkého a těžkého řetězce lidského imunoglobulinu obsahují specifické spojky DNA, které umožňují inzerci variabilních oblastí . lehkého a těžkého řetězce imunoglobulinu, které udržují translační čtecí rámec a nepozměňují aminokyseliny normálně nalézané v imunoglobulinových řetězcích. Zavedení popsaných změn vedlo ke konstrukci vektorů TCAE 5.2 a TCAE 6. Klonování genů pro variabilní oblasti lehkého a těžkého řetězce imunoglobulinu z buněčné heterohybridomové linie anti-CD4 E9.1 do TCAE 6 vedlo ke konstruktu, který je uložen v ATCC. Konstrukt, který byl uložen, a který kóduje protilátku CE9.1, obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu Macaca fascicularis a variabilní oblast lehkého řetězce imunoglobulinu Macaca fascicularis, jejichž sekvence jsou ukázány na obrázcích 1 a 2, klonované z anti-CD4 buněčné hybridomové linie E9.1. Konstantní oblast těžkého řetězce je lidského původu izotypu gama 1 a alotypu Gmla, Gmlz. Konstantní oblast lehkého řetězce lambda je také lidského původu, genotypu Oz minus, mcg minus a alotypu Ke minus. Imunoglobulinové geny jsou klonovány do savčího expresního vektoru TCAE 6, popsaném ve výše zmíněných aplikacích zahrnutých v odkazech, který, je-li zaveden elektroporací do savčí buněčné linie CHO, tvoří chimérickou opičí/lidskou protilátku anti-CD4. Konstrukt DNA popsaný v tomto textu byl použit pro transformaci bakteriálního kmene XL-1 Blue, • · · · • · · · • · · · ··· ···· • · · ···· · · · · • · · · · · · ···· · • · · · · ··· ······· ·e ··· 4 · ·· vybrán pomoci antibiotika ampicilinu a uložen jako bakteriální buněčná suspenze ve sterilním živném médiu LB obsahujícím 15% glycerol.
Sekvenováni DNA
Plazmidová DNA byla připravena ze lOOmililitrových kultur. Byla dále purifikována precipitací (1 objem) se směsí 2,5 M chloridu sodného a 20% polyetylenglykolu (6 objemů) na ledu po 15 minut. Po stočení v 10 000 x g po dobu 20 minut byla peleta omyta 70% etanolem, opět stočena a usušena v přístroji Speedivac (Savant). Peleta DNA byla resuspendována v deionizované vodě v koncentraci 150-250 μρ/πιΐ. Sekvenováni se provádělo s 5 μς dvoj vláknové DNA za použití techniky dle Sangera. Byla použity sekvenační primery, které byly homologní k sekvencím v expresním vektoru v protisměru a po směru čtení každého z inzertů lehkého řetězce a těžkého řetězce. Inzerty byly sekvenovány v obou směrech, 5' až 3' a 3' až 5'. Dva klony lehkého řetězce anti-CD4 a dva klony těžkého řetězce anti-CD4, které vznikly z nezávislých reakcí PCR, byly sekvenovány paralelně, aby se určilo, zda nebyla zavedena nějaká nukleotidová změna během reakcí PCR. Oba z vybraných klonů těžkého řetězce a oba klony lehkého řetězce byly shledány identickými po celé délce, což potvrdilo, že během amplifikačního procesu nebyly zavedeny žádné chyby. Sekvence anti-CD4 lehkých a těžkých řetězců jsou ukázány na obrázcích 1 a 2.
Exprese opičí/lidské chimérické anti-CD4
Expresní vektory TCAE 5.2 a TCAE 6 jsou schopné nejen trvalé exprese v buněčných liniích Sp2/0 a CHO, ale protože obsahují počátek SV40, jsou také schopné přechodné exprese v buněčné linii COS. Exprese v buňce COS byla provedena, jak • * · · · · následuje: buňky COS byly vysety den před transfekcí, takže mohly následující den z 50-70 % splývat. Kultivační médium bylo odstraněno a buňky byly dvakrát promyty transfekčním pufrem (TB- 140 mM NaCl, 25 mM Tris, 5 mM KC1, 0,5 mM Na2HPO4, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) . 30 μρ plazmidu TCAE 6, purifikovaného chloridem česným a obsahujícího anti-CD4 opičí/lidské chimérické imunoglobulinové těžké a lehké řetězce, se smísilo se 3 ml DEAE dextranu na misku (1 mg/ml v TB) . DNA se inkubovala s buňkami po 1 hodinu ve 37 °C.
Roztok DNA byl odstraněn a nahrazen 3 ml 20% glycerolu po dobu 1,5-2,5 minuty, po které byly buňky dvakrát promyty TB. Buňky se inkubovaly v 5 ml čerstvého média obsahujícího 100 μΜ chlorochin po 3-5 hodin ve 37 °C, a poté byly dvakrát promyty médiem a inkubovaly se 72 hodin s normálním DMEM. Supernatant (100 μΐ) z transfekovaných buněk COS byl testován v různých ředěních na přítomnost protilátky technikou založenou na testu ELISA. Kozí proti-lidská lambda byla použita k povlečení 96jamkových testovacích destiček a jako detekční protilátka byl použit kozí proti-lidský IgG značený peroxidázou, za standardních podmínek pro testy ELISA. Bylo shledáno, že buňky COS tvoří mezi 10 a 40 ng/ml opičí/lidské chimérické protilátky. Větší objemy supernatantu byly lOx koncentrovány a použity pro přímý vazebný test RIA k CD4 pozitivním buňkám SupTl. Jako pozitivní a negativní kontroly byly použity parentální celá opičí protilátka a irelevantní lidský imunoglobulin. Opičí anti-CD4 a opičí/lidská chimérická anti-CD4 byly také použity pro inhibici vazby vysoce afinitní myší protilátky anti-CD4 (1F3). Tyto výsledky dokázaly, že opičí/lidská rekombinantní protilátka (ATCC č. 69030) se nejenom váže k CD4 pozitivním buňkám, ale je schopná inhibovat vazbu 1F3 k
CD4 pozitivním buňkám v přibližně týchž koncentracích celé opičí protilátky nebo samotné 1F3.
Příklad 2
Tento přiklad se týká in vitro funkční charakterizace CE9.1, včetně jejího působení na T buněčnou proliferaci a produkci IL-2 v MLR, jejích vazebných vlastností k receptoru Fc a komplementu, a její kapacity zprostředkovávat odpovědi ADCC a CDC. Kromě toho, byly analyzovány účinky in vivo na mediaci receptoru CD4 a lymfoidních podskupin v periferní krvi. Bylo analyzováno následující. V tomto příkladě byly použity následující materiály a metody. (Anderson et al., „In vitro and in vivo characterization of a primatized mAb to human CD4: mAb causes CD4 receptor modulation but not CD4 T cell depletion in chimpanzees).
Materiál a metody
Molekulární konstrukce a exprese PRIMATIZED™ anti-CD4
Variabilní oblasti imunoglobulinových genů byly amplifikovány PCR a klonovány z heterohybridomů pocházejících z opice imunizované sCD4, jak bylo dříve popsáno (Newman, R.A., et al., „Primatization of recombinant antibodies for immunotherapy of human disease: a macaque/human chimeric antibody against human CD4, Biotechnology, 10, 1455, 1992). Geny variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce byly vloženy do kazetového expresního vektoru, TCAE 6, zařazené za sebou, a exprimovány jako IgGIX po trvalé integraci do buněk CHO DHFR' (Newman, výše). Tři béhy amplifikace při zvyšujících se množstvích metotrexátu umožnily vývoj buněčných linií, které exprimovaly více než 750 μς/πιΐ protilátky po dobu 8 dnů.
• · · · « ·
Vznikla produktivní buněčná linie, která byla pěstována v suspenzní kultuře a progresivně expandovala před inokulací do bioreaktoru z dutých vláken (Evans et al., „Large-scale production of murine monoclonal antibodies using hollow fiber bioreactors, BioTechniques, 6(8) , 762, 1988).
mAb CE9.1 byla purifikována průchodem supernatantu tkáňové kultury z reaktoru přes kolonu Prosep A (300 ml, Bioprocessing inc.), která byla předem ekvilibrována fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem, pH 7,2, rychlostí 125 ml/min. Kolona byla promývána PBS dokud nebyl dosažen základní výchozí stav, a navázaná protilátka pak byla eluovana 5nasobkem objemu kolony 0,2 M kyseliny octové/0,1 M glycinovým pufrem, Eluát byl upraven na pH 5,5 Q-Sepharose (Pharmacia). CE9.1 promyta 25 mM Tris-HCl, pH 8,5.
pH 4,0. Výtěžek byl 90%. a přečištěn přes kolonu navázaná na kolonu byla Protilátka byla eluována 50 mM Tris-HCl, pH 6,5, obsahujícím 100 mM NaCl a koncentrována filtrací (Millipore
Pellicon) proti normálnímu fyziologickému roztoku pro injekce dle USP. CE9.1 se nakonec filtrovala přes filtr 0,04 pm Nylon6s NDP (Pall
Filtration).
Vazebná specifita: vazba CE9.1 k buňce SupT-18 CD4+
Devadesátišestijamkové mikrotitrační destičky se dnem jamek ve tvaru U (Corning) byly předem blokovány po 1 hodinu na ledu s PBS obsahujícím 0,2% bovinní sérový albumin a 0,1% azid sodný. Buňky SupT-18 (1 x 105) , předem promyté týmž pufrem, byly 30 minut inkubovány na ledu s různými koncentracemi CE9.1 (2,4 pg/ml - 10 gg/ml). Buňky byly dvakrát promyty a inkubovány 30 minut na ledu s protilátkou druhé vrstvy (kozí proti-myší Ig značený FITC). Buňky byly dvakrát promyty, resuspendovány ve fixačním pufru (2% • · · · formaldehyd v PBS) a analyzovány za použití průtokového cytometru FACScan (Becton Dickinson).
Vazebná specifita: průtoková analýza vazby CE9.1 k lidským leukocytům periferní krve
Mononukleární buňky byly izolovány z lidské periferní krve za použití standardní centrifugační techniky s Ficoll/Hypaque (Boyum, A., „Separation of blood leukocytes, granulocytes and lymphocytes, Tissue Antigens, 4, 269,
1974) . Vrstva na rozhraní . (interfáze) obsahující mononukleární buňky periferní krve (PMNC) byla odebrána, promyta Hanksovým izotonickým roztokem (HBSS) a buňky byly spočítány. 5 x 10° buněk se inkubovalo s 20 μΐ CE9.1 (25 gg/ml) , po 30 minut ve 4 °C. Buňky byly poté promyty s HBSS a inkubovány s 20 μΐ kozího proti-lidského IGG-FITC (Fisher Scientific) . Po inkubaci na ledu po dalších 30 minut byly buňky analyzovány na přístroji FACScan firmy Becton Dickinson za použití autokompenzace a prekalibrace s kuličkami Calibrite. Živé lymfocytární populace byly rozpoznány rozptylem přímého a pravoúhlého světelného paprsku a byla tak ohraničena celková populace lymfocytů. Následná měřeni fluorescence zaznamemávala pouze vymezené lymfocytární jevy. mAbs použité pro kvantifikaci dvojitě značených buněk a následné studie na šimpanzí krvi zahrnovaly proti-lidský CD3 (Leu-4-FITC, Becton Dickinson), proti-lidský ODS konjugovaný s fluoresceinem (Leu-2a-FITC, Becton Dickinson), proti-lidský CD8 konjugovaný s fykoerytrinem (Leu-2a-PE, Becton Dickinson), proti-lidský CD20 konjugovaný s fykoerytrinem (Leu-16-PE, Becton Dickinson), kozí proti-lidský IgG F(ab')2 konjugovaný s fluoresceinem (Cappel) a myši anti-CD4 konjugovaný s fykoerytrinem (OKT4, Ortho Pharmaceuticals).
·· ····
Zkřížená reaktivita lidské tkáně
Hodnotila se zkřížená reaktivita CE9.1 na normální lidské tkáni. Biotinylovaná CE9.1 se testovala na zmrazených tkáňových řezech nařezaných na kryostatu ze 32 různých tkání za použití avidin-biotinové imunoperoxidázové techniky (Wilchek, M., et al., „The avidin-biotin complex in bioanalytical applications, Anal. Biochem., 171, 1, 1983). Buňky SupTl (CD4 + ) byly použity jako pozitinví kontrola a buňky SB (CD4“) jako negativní kontrolní buněčná linie. Irelevantní biotinylovaná myší/lidská (IgGl) chimérická protilátka byla použita jako negativní protilátková kontrola.
Pro většinu tkání byly vyšetřovány tři nezávislé vzorky a reaktivita s CE9.1 byla hodnocena ve škále od 0 do 3+. V některých tkáních byly různé struktury ve tkáni hodnoceny odděleně. Například v játrech byla hodnoceny nezávisle hepytocyty, žlučovody a Kupfférový buňky.
Druhová specifita
Periferní krev několika běžných laboratorních primátů a jiných zvířat byla testována s CE9.1 na rozpoznáni možné zkřížené reaktivity T buněk CD4 pozitivních. Skupina zahrnovala šimpanze, paviány, Macaca rhesus, Macaca fascicularis a Macaca nemestrina, krysy, myši, králíky a psy. Krevní buňky byly izolovány z 1-5 ml plné krve odstředěním (1500 rpm po 5 min) ve 4 °C a promyty resuspendováním ve stejných objemech PBS. Procedura se opakovala ještě jednou a buňky se resuspendovaly ve stejných objemech fetálního bovinního séra. Dvě stě mikrolitrů buněčné suspenze od každého druhu bylo umístěno do 15miliiitrové kónické centrifugační zkumavky s 20 μΐ CE9.1 <· ····
9999 • 9 9 9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 999 99 99
9 99 · 9 · 99999
9 9 9 9 9 99
9 9 999 99 999 9 9 99 (25 mg/ml). Protilátka a buňky se smíchaly, umístily na led po 30 minut, a poté se důkladně promyly s HBSS. Pak se přidalo 20 μΐ kozího proti-lidského IgG-FITC (Fisher Scientific) a vzorky se promíchaly. Po inkubaci na ledu po dalších 30 minut byly vzorky z ledu odstraněny a bylo přidáno 10 ml lyžujícího pufru (0,01 M hydrogenuhličitan draselný, pH 7,4, obsahující 0,16 M chlorid amonný a 0,1 M EDTA sodnou sůl), předehřátého na 37 °C. Vzorky se inkubovaly při teplotě místnosti po 15 minut, následovalo odstředění v 1500 rpm po 5 minut. Označené buněčné pelety byly ještě dvakrát promyty v HBSS (pH 7,4) obsahujícím 1% bovinní sérový albumin a 0,05% azid sodný. Označené buňky se fixovaly resuspendováním ve fixačním pufru (0,5 M chlorid sodný obsahující 1,0% formaldehyd, filtrován přes 0,22 μιπ filtr). Vzorky se analyzovaly na přístroji FACScan firmy Becton Dickinson, jak popsáno výše.
Funkční testy in vitro: jednocestná a trojcestná smíšená lymfocytární reakce
Lidské nebo šimpanzí T buňky (1,3 x 105) byly pěstovány s nebo bez CE9.1 v mikrojamkách s plochým dnem po sedm dnu s PBMC (6,0 x 104) ošetřenými mitomycinem C, získanými od nepříbuzného dárce lidského nebo šimpanzího původu. Během posledních 18 hodin kultivace byl do kultur přidán 3Hthymidin, a sice 1 μθί/jamka. Mikrotitrační destičky byly stočeny, buněčné pelety promyty HBSS a poté se počítaly impulzy kapalinovým scintilačním počítačem. Každý vzorek se vyhodnocoval ve třech opakováních.
Lidské MLR se prováděly se vzorky od tří nezávislých nepříbuzných dárců, které byly užity jako stimulátorové a odpovídavé směsi. Tento laboratorní protokol byl použit, aby se maximalizovala možnost dobré odpovědi u náhodných, na HLA necharakterizovaných vzorků krve „buffy coat) dárců z Červeného nebyl žádný dárcovský vzorek krve ozářen.
Adhezivní test receptorů Fc pro
Tento test buněk THP-1 pro
CE9.1 ošetřen měření ·· • to to • to • · • ••to krevních
V tomto toto toto·· •· ··· •· ·· ··· to ♦ ·· ·« toto •· · · •· ·· ····· to·to • to ·· buněk protokolu mitomycinem C ani vazebné aktivity buněčných linií,
CD4 a druhé receptor účastník exprimující CD4 buněčná
Fc, byla byla Buňky nesoucí receptor umístěny
000 linie DAP, která závisí na přemostění dvou jedné exprimující receptor protilátkou anti-CD4. Použitý adherující myší fibroblastová transfekována lidskou CD4 (DAP/CD4). Fc byly THP-1. Buňky DAP/CD4 byly destičky s plochým dnem (100 μΐ/jamka), a nechaly se přes noc adherovat. resuspendovány v indukovány po 24
Buňky THP-1 methoxyacetátem, buňky byly promyty vápníkem a hořčíkem resuspendovány v množství 5 x 106 buněk/ml pufru. CAM (1 mg/ml v DMSO) byl naředěn pufrem a přidán k buněčným suspenzím THP-1 (objem/objem). Po inkubaci po 20 minut místnosti, bylo přidáno ke každým 4 ml směsi buňky/CAM 20 ml čerstvého plnicího pufru a inkubace pokračovala dalších 40 minut při teplotě místnosti. Buňky byly poté dvakrát promyty plnicím pufrem Sériová ředění se přes ml média RPMI (1 hodin ve 37 °C přidáním indukované ylFN byly obarveny CAM
Buňky x 106 na 96jamkové buněk/jamka)
THP-1 byly buněk/ml) a
U/ml ylFN. kalcinovaným následovně:
(Molecular Probes), a to plnicím pufrem (PBS dle a 0,1% bovinním sérovým albuminem) a v 10 ml téhož
Dulbecca s (1:50) plnicím v poměru 1:1 při teplotě byla přidána inkubována po a resuspendovány v množství 8 x 106 buněk/ml. CE9.1 v PBS (bez vápníku, hořčíku nebo BSA) do jamek obsahujících buňky DAP CD4+ a 5 minut při teplotě místnosti. Poté bylo • ···· ·♦ ··»· • · • ··♦ • · · « · ·· ·· * ♦ · ·
přidáno 50 μΐ buněčné suspenze THP-1 obarvené CAM a destičky se inkubovaly 1 hodinu při teplotě místnosti ve tmě. Testovaly se také kontrolní jamky bez buněk DAP. Po inkubaci byly jamky třikrát promyty s PBS. Po závěrečném promytí se přidalo 100 μΐ PBS na jamku, následováno 10 μΐ 20% Tritonu X-100. Po umístění na třepačce po 10-15 sekund, se destičky odečítaly na přístroji Fluoroscan (MTX Lab systems lne.).
Vazebný test s aktivovanými monocyty pro měření vazebné aktivity receptoru Fc pro CE9.1
Test receptoru Fc byl proveden, jak bylo popsáno pro buňky THP-1 výše, kromě následujících odlišností. Monocyty byly připraveny z čerstvé lidské periferní krve standardní gradientovou separací pomocí Ficoll/Hypaque a Percoll. Monocyty byly stimulovány s ylFN, jako výše, ale po dobu 48 hodin. Destičky byly povlékány stimulovanými monocyty po 24 hod., a v tomto testu byla CAM, popsaným výše, obarvena linie SupT-18 CD4+. Buňky SupT-18 byly poté přidány na destičky povlečené stimulovanými monocyty. Hlavní rozdíl v tomto testu je buněčná linie CD4+ obarvená CAM a přidaná k buňkám na destičce nesoucím FcR. Ve výše uvedeném testu používajícím buňky THP-1 byl pořádek obrácený.
Vazba k myším fibroblastům transfekovaným FcyRII
Myší fibroblastová buněčná linie (CDW32-L), která byla transfekována lidským FCRH, byla získána od ATCC. Přímá vazba CE9.1 byla stanovena inkubací protilátky v přítomnosti a nepřítomnosti sCD4. Vazba CE9.1 se detekovala inkubací s kozími proti-lidskými Ig-protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou (Southern Biotech). Fragmenty Fab CE9.1 vznikaly enzymatickým štěpením a byly použity jako negativní kontroly. Hodnoty absorbance získané z CE9.1 (a fragmentů
φφφφ ·♦ φφ • · φ φ φ φφφ • ΦΦΦ · φ φ φ φφ φφ
Fab) preinkubovaných s buňkami za přítomnosti sCD4 byly odečteny od absorbancí získaných pro protilátky v nepřítomnosti sCD4 .
Test ADCC (lýze buněk SupTl)
Byly odebírány čerstvé vzorky heparinizované lidské krve a izolovány PMNC standardními centrifugačními postupy na Ficoll/Hypaque. Červené krvinky z interfáze se lyžovaly pufrem s chloridem amonným a buňky byly dvakrát promyty v Hanksově izotonickém roztoku. Lymfocyty periferní krve (PBLs) se stimulovaly 10 jednotkami IL-2 na ml RPMI/10% fetálniho telecího séra (FCS) po 24 hodin ve 37 °C a 5% CO2. Po 24 hodinách byly PBLs resuspendovány v RPMI/5% FCS.
Buňky SupTl-18 (1 x 10s) byly značeny inkubaci se 100 pCi 51Cr po 1 hodinu ve 37 °C a 5% C02. Buňky byly dvakrát promyty s RPMI/5% FCS a 1 x 104 buněk bylo přidáno do každé jamky. Tři dávky protilátky CE9.1 byly sériově naředěny 1:2 s RPMI/5% FCS a poměrné části byly přidány ve třech opakováních do jamek obsahujících SupTl-18 po 30 minut ve 37 °C a 5% CO2. Jako kontrola maximálního a spontánního uvolnění bylo použito 100 μΐ 1% Tritonu X-100 a 100 μΐ média. Do jamek se přidaly PBLs stimulované IL-2 (8 x 10s buněk) . Destičky se stočily 3 minuty v 900 rpm a inkubovaly 16 hodin ve 37 °C a 5% CO2. Byl odebrán supernatant z každé jamky a množství radioaktivity se odečítalo počítačem impulzů gama. Test byl proveden v trojnásobném opakování. Procento buněčné lýzy se určilo za použití následujícího vzorce:
% lýzy=(počet impulzů vzorku - spontánní počet) xlOO maximální počet impulzů - spontánní • 4 4 ·· ·· • ♦ 4* ·44 · · · · · · 4·4 · ·
4 4 4 4« 4 4
44* ···· ·· ··· ·4«4
Clq vazebný test
Clq vazebný test se prováděl pomocí CD4 pozitivní buněčné linie SupT-18 v suspenzi 4 x 10s/ml. K cílovým buňkám CD4 pozitivním v množství 2 x 10s byla přidána CE9.1 a kontrolní afinitní purifikovaná opičí anti-CD4 protilátka (50 μΐ) ve stejné koncentraci 20 gg/ml. Buněčná suspenze a protilátky byly inkubovány po 1 hodinu na ledu, a poté dvakrát promyty 1% BSA v PBS. Do každé zkumavky bylo přidáno 50 μΐ lidského Clq (10 μς/πιΐ) a inkubováno 1 hodinu na ledu. Každá zkumavka byla dvakrát promyta a fixována v 0,5 ml 1% formaldehydu/PBS. Buňky se analyzovaly na průtokovém cytometru FACScan firmy Becton Dickinson za použití programového vybavení Consort 30 pro sběr a analýzu dat.
Test cytotoxicity zprostředkované komplementem
Buňky SupT-18 1 x 106 byly značeny inkubací se 100 μθί 51Cr po 1 hodinu ve 37 °C, 5% CO2. Buňky byly dvakrát promyty s RPMI/5% FCS a do každé jamky bylo přidáno 1 x 104 buněk. Protilátky CE9.1a kontrolní anti-CD4 byly sériově naředěny 1:2 s RPMI/5% FCS a poměrné části 50 μΐ byly přidány v triplikátech do jamek obsahujících SupT-18. Do jamek se přidalo 100 μΐ 1% Tritonu X-100 nebo 100 μΐ média, aby se změřilo maximální a spontánní uvolňování 51Cr. Po 90 minutách inkubace ve 37 °C, 5% CO2 byl do jamek přidán králičí komplement (Cappel) naředěný 1:5. Destičky se inkubovaly dalších 90 minut ve 37 °C, 5% CO2, a poté se stočily 3 minuty v 900 rpm. Z každé jamky byl odebrán supernatant a množství radioaktivity se odečítalo na počítači impulzů gama. Test byl proveden v trojnásobném opakování. Procento buněčné lýze se určilo za použití následujícího vzorce:
« · % 1ýzy=(počet impulzů vzorku - spontánní počet) x100 maximální počet impulzů - spontánní
Studie na šimpanzech in vivo
Šest šimpanzů bylo rozděleno do tří skupin po dvou zvířatech: skupina I (kontrolní fyziologický roztok), skupina II (10,0 mg/kg protilátky CE9.1) a skupina III (10,0 mg/kg protilátky CE9.1). Zvířata ve skupině II byla ošetřena znovu 10,0 mg/kg CE9.1 po 30 dnech, pod podmínkou, že se počet jejich T buněk CD4+ vrátil na 30 % výchozího stavu. Zvířata ve skupině II byla ošetřena znovu 10,0 mg/kg CE9.1 po 30 dnech, pod podmínkou, že se počet jejich T buněk CD4 + vrátil na 70 % výchozího stavu. Jestliže tyto hodnoty nebyly 30. den dosaženy, byla zvířata testována na hodnoty T buněk CD3+, CD4+ a CD8 + ve dvoutýdenních intervalech dokud hodnoty T buněk CD4+ nedosáhly příslušnou cílovou hodnotu pro danou skupinu. V ten okamžik zvířata obdržela intravenózně opět 10,0 mg/kg protilátky CE9.1, až do maxima tří dávek.
Určení výchozího stavu celkového počtu bílých krvinek, hodnot lymfocytů a granulocytů, a subpopulací lymfocytů CD3+, CD4+ a CD8+ se prováděly v den -6, v den 0 těsně před podáním dávky a opět 24 hodin a 14 dnů po podání dávky. V této studii byly poskytnuty šimpanzům tři ošetřovací cykly, každý s dávkou 10,0 mg/kg.
Výsledky
Vazebná specifita mAb CE9.1
Měření afinity SPR vazby CE9.1 k rozpustnému CD4 ukázalo Kd 1,0 nM (Brigham-Burke et al., North Američan BIAsymposium 1995, v tisku). Nebyla pozorována žádná vazba k buněčným liniím CD4~ a inhibiční studie prokázaly, že vazba k * · · · • 4 »4 • ♦ ♦ « · 4 » ♦ ·· · • 4
buňkám CD4+ je kompletně zrušena rozpustným CD4 způsobem odpovídajícím stechiometrickým poměrům.
Pro stanoveni specifity reaktivity
CE9.1 byla zjišťována vazba k čerstvě izolovaným lidským PBMC průtokovou cytometrii při použití dvojího značení. Obrázek 9 ukazuje, že 2/3 buněk CD3+ váže CE9.1. V lymfoidní subpopulaci všechny buňky, které vážou OKT4 jsou také pozitivní pro CE9.1, zatímco buňky CD8+ byly všechny negativní. Některé buňky CD3 také vykazovaly reaktivitu s CE9.1, ačkoliv povaha této reaktivity nebyla jasně určena.
Imunohistochemická analýza byla provedena pro určení tkáňové reaktivity CE9.1, včetně 32 různých normálních lidských tkání lymfoidního a nelymfoidního původu. Nelymfoidní tkáně zahrnovaly hlavní orgány, mozek, srdce, kosterní svalstvo, kůži, játra, ledviny, tkáně žláz a reprodukčních orgánů. Tato analýza neprokázala zkříženou reaktivitu k jakékoliv jiné tkáni než lymfoidního původu, včetně lymfatických uzlin, sleziny, tonzil a periferní krve (data nejsou uvedena). Značení omezené na lymfoidní agregáty bylo také pozorováno v tlustém střevě, plicích, jícnu a kůži.
Inhibice lidské MLR CE9.1
Účinek CE9.1 na T buněčné odpovědi byl vyhodnocován lidskou MLR, jako produkce IL-2 nebo proliferační odpovědi. CE9.1 blokovala jak proliferaci, tak produkci IL-2 s IC50 1030 ng/ml, s 80% inhibicí v 60 ng/ml (obrázek 10).
Vazebná aktivita receptoru Fc pro CE9.1
Adhezní testy „buňka-buňka založené na CD4 a receptoru Fc byly vyvinuty, aby se určila reaktivita CE9.1 s receptory Fc na monocytárních buňkách. V jednom uspořádání testu jsou «·ιι « ·« ·· · · • · • · · • · · · · Λ · · « · · a · ·· · « ·· • ·· ·· ··· • 4·4
4 ·4
4·· ·· · 4·
4·
1*··· izolovány monocyty z čerstvých PBMC stočením na perkolovém gradientu, vysazeny na mikrotitrační destičky a stimulovány ylFN po 48 hodin. Po 48 hodinách byly k aktivovaným adherovaným monocytům přidány značené buňky SupTl CD4+ v přítomnosti nebo nepřítomnosti CE9.1. V dalším uspořádání tohoto adhezního testu byla ylFN stimulována monocytární neadherentni buněčná linie THP-1. Po 24 hodinách byly aktivované buňky THP-1 označeny a přidány, v přítomnosti nebo nepřítomnosti CE9.1, k adherovaným CD4+ fibroblastovým transfektantám, které byly předtím (o 24 hodin dříve) vysety · na mikrotitrační destičky. V obou případech je adheze „buňka-buňka závislá na vazbě mAb k CD4 na jedné buňce a k receptorům Fc na buňce druhé.
Data uvedená na obrázcích 10a, 10b a 10c, založená na čerstvých monocytech a T buňkách SupTl CD4+ aktivovaných ylFN, ukazují, že CE9.1 zprostředkovává adhezi „buňka-buňka” způsobm závislým na dávce, s přibližnou EDsq 20 ng/ml. Adheze byla kompletně blokována sCD4 a nemůže být zprostředkována fragmentem F(ab')2 z CE9.1. Monocyty neaktivované ylFN nebyly schopné vázat CE9.1 (obrázek 10b). Podobná data byla také získána v testu založeném na THP-1 a CD4+ fibroblastovém testu (data nejsou ukázána). Byla také pozorována přímá vazba CE9.1 k myší fibroblastové linii transfekované lidskými receptory FCyRII (data nejsou ukázána).
Buňkami zprostředkovaná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC)
Ukázalo se, že buňky SupTl značené radioizotopem použité jako cíle v testu ADCC, jsou specificky lyžovány cytotoxicity bylo dosažaeno při přibližně μρ/ml s celkovou efektorovými buňkami v přítomnosti
CE9.1. Maximální specifickou lýzou 50% (obr. 12) . Jako pozitivní kontrola ·· 9·Λ· byla použita myší anti-CD4 izotypu IgG2a (4D9). Tato protilátka se chovala velmi podobně jako CE9.1 a poskytovala stejný stupeň celkové buněčné lýzy. CE9.1 byla proto velice účinná ve vazbě na receptory Fc na efektorových buňkách a při zprostředkování usmrcování CD4+ cílových buněčných linií.
Fixace komplementu CE9.1 měřila průtokovou cytometrií, jak bylo ukázáno na obrázku
Vazba Clq se popsáno výše (Materiál a metody). Jak je 13, navzdory faktu, že CE9.1 obsahuje lidského těžkého řetězce subtypu gama minimální vazbu Clq (obr. 13). Afinitně sérové konstantní
1, vykazuje purifikované vazby oblast pouze opičí ve zprostředkování protilátky anti-CD4 byly účinné nepřítomnost vazby Clq protilátku. neschopnosti purifikované myší monoklonální IgG2a je vlastnost Nepřítomnost vazby ( fixovat komplement
CE9.1 pro tuto odráží v
Af initně z opičího séra a protilátky anti-CD4 způsobují obě významnou lýzu ve stejném rozmezí koncentrací.
Druhová zkřížená reaktivita CE9.1
Analýza lymfocvtů z různých druhů pomocí průtokové cytometrie ukázala, že pouze šimpanzí a lidské buňky váží silně CE9.1. Jediný další druh, který vykazoval slabou reaktivitu s CE9.1 (lOx slabší než člověk), byl pavián. Lidské a šimpanzí lymfocyty reagovaly stejně dobře s mAb (tabulka 2). To se odrazilo ve srovnatelné inhibici T buněčné proliferace a produkce IL-2 v šimpanzích MLR protilátkou CE9.1 (data nejsou uvedena).
• ·· ·· ···· ·· ··
·· > · • 0 • • · • ·
• · • · • ·· • 0 ··
• · • · · • · ··· • ·
• · » · • • • ·
·«····· »· ··· ·· 0·
Tabulka 2
Druh Reaktivita
Člověk +++
Šimpanz +++
Pavián
Macaca rhesus -
Macaca fascicularis -
Macaca nemestrina -
Pes -
Králík -
Potkan -
Myš -
Studie in vivo na šesti šimpanzech
Vzhledem k nepřítomnosti deplece buněk CD4 ve studii při použití stoupající dávky u jednoho šimpanze, byla 4 šimpanzům podána dávka 10 mg/kg (kromě toho 2 zvířata v kontrolní skupině obdržela fyziologický roztok). Jak je popsáno v Materiálu a metodách, dvěma skupinám bylo podáno 10 mg/kg v den 0 studie. Obrázek 15 sumarizuje účinky na počet CD4 a CD8 u těchto zvířat. Je možné pozorovat, že byly sníženy buňky exprimující receptor CD4 okamžitě po podání protilátky. Snížení četnosti CD4 bylo vidět pouze okamžitě po každé dávce podané protilátky. V kontrolní skupině s fyziologickým roztokem nebyla pozorována žádná podobná změna ve stavu CD4. Počet CD8 zůstal neovlivněn v průběhu ošetření, ačkoliv byla pozorována denní variabilita (obr. 15, panel vlevo, prázdné kroužky). Při vyšetření populace CD3+ - CD8+ byly pozorovány méně výrazné poklesy v počtu CD4. Data naznačují výskyt CD3+ CD8“ T buněčných populací, které mohou být výsledek modulace antigenem CD4. Přesný mechanismům modulace je v tomto stadiu nejasný, ale může zahrnovat internalizaci nebo ztrátu molekul CD4 jako výsledek zkřížené vazby receptory Fc exprimovanými na jiných lymfoidních nebo monocytárních buňkách. Srovnání buněčných počtů na obrázku 15 ukazuje, že určitá deplece buněk CD4+ může nastat, ačkoliv hlavní účinek je způsobený modulací receptoru CD4. Zdá se, že ve většině případů modulační účinek trvá 7-10 dnů přímo po podávání protilátky, po kterých se exprese CD4 vrátí právě pod výchozí hodnoty.
Celkový počet CD4 zůstává snížen relativně k výchozímu stavu o 10-50 %, ale po ukončení ošetření se vrací do normálního rozmezí. Šimpanzi byli sledováni po dobu až 150 dnů (skupiny 1 a 2) nebo 300 dnů (skupina 3) . Počet CD4 u zvířat skupiny 2 se vrátil k normálním hodnotám 80 dnů po konečném ošetření, zatímco u zvířat ze skupiny 3 se vrátil ve stejném časovém rámci na 20 % výchozího stavu.
Příklad 3
Tento příklad popisuje genetickou konstrukci expresního vektoru DNA použitého v savčích buňkách k produkci CE9y4PE, což je makaková/lidská chimérická protilátka anti-CD4, obsahující lidský izotyp γ4 zahrnující změny P a E.
Konstrukce expresníhi vektoru DNA
Lidský gen těžkého řetězce gama 4 byl izolován metodou PCR z buněčné linie TPIT10.4 (získané od S. Morrisona, UCLA) za použití 5' IDEC primeru č. 47 9 a 3' IDEC primeru č. 4 62 (viz obr. 16), které obsahují místa Nhe I a BamH I. Celý klonovaný fragment lidského gama 4 byl sekvenován a shledán identickým s fragmentem popsaným v Kabat et al., (NIH Publication Fifth Edition No. 91-3242, U.S. Dept. Of Health and Human Services, 1991) (viz obr. 17). Fragment • · • · · ···· · ··· • φ ·· φ φφ Φ·Φ· · • · φφ φ φ φ · φφφ φφφφ ·· ··· ·· ··
Nhe I/BamH I byl klonován do expresního vektoru Anex 2. Celé geny lehkého a těžkého řetězce imunoglobulinu z tohoto plazmidu byly přesunuty do jiného expresního plazmidu do fragmentu Bgl II až Sac I. Tento plazmid byl nazván anti-CD4 (G4, L, Oz-) v NEOSPLA3F.
Mutageneze PCR byla použita ke změně aminokyselin č. 229 a 236 v konstantní oblasti gama 4. PCR bylo provedeno za použití 5' primeru GE212 (Midland) a 3' IDEC primeru č. 698, které obsahují restrikční místa Nhe I a BspH I (viz obr. 16) a fragment byl klonován do anti-CD4 (G4, L, Oz-) plazmidu ligací tří částí a sekvenční plazmid byl nazván anti-CD4 · (G4(PE), L, Oz-) v NE0SPLA3F.
Příklad 4
Exprese v buňkách ovaria čínského křečka (CHO)
Integrace plazmidu a výběr klonů produkujících protilátku
Buňky CHO (DG44) (Urlaub et al., Som. Cell. Mol. Genet., 16, 555-566, 1986) byly pěstovány v živném médiu
CHO-S-SFM II obsahujícím (GIBCO/BRL, média CHO) 50 μΜ hypoxanthin a 8 μΜ thymidin (GIBCO/BRL, média CHO). Tato média se nazývají média CHO a HT.
Bylo provedeno 5 elektroporací se 4 x 106 buněk a 5 μς plazmidové DNA (anti-CD4(γ4(PE) , lambda, Oz-) v NEOSPLA3F) za použití elektroporačního zařízení BTX 600 (BTX, San Diego, CA) v kyvetách na jedno použití o objemu 0,4 ml. Před elektroporací byl plazmid naštěpen s Pac I, což oddělilo geny exprimované v savčích buňkách od části plazmidu používané pro růst plazmidu v baktériích. Podmínky pro elektroporací byly 230 V, 400 μΕ, 13 Ω. Buňky z každé elektroporace byly vysety na jednu 96jamkovou destičku (40 000 buněk/jamka) . Destičky byly naplněny médiem obsahujícím G418 (Geneticin, GIBCO),
CHO + HT sloučeniny, dva dny po elektroporaci,
400 pg/ml poté dle dokud kolonie rostly. Supernatant ze (konfluentních) kolonií byl testován aktivní potřeby slévajících se na přítomnost specifickým pro chimérického imunoglobulinu testem ELISA lidskou protilátku. Dvacet osm kolonií rezistentních na G418 rostlo na pěti destičkách (ze 480 jamek). Kolonie rezistentní na G418 exprimující nejvíce protilátky, klon 5C1, byly konfluentní 30 dnů po elektroporaci. Analýza metodou Southernova přenosu ukázala, že klon 5C1 začlenil jednu kopii (data neuvedena). Ve čtyřdenní kultuře vyseté v koncentraci 105 buněk/ml do 125mililitrové kultivační nádoby se tento klon každých 28 hodin zdvojnásobil a rychlost produkce protilátky byla 0,5 pg/buňka/den (0,9 mg/1).
Amplifikace
Klon 5C1 byl rozmnožen a vyset v různých koncentracích od 106 buněk/destička do 3 x 104 buněk/destička na 96jamkové destičky obsahující média CHO + 5 nM metotrexát (MTX, Sigma (*) Amethopterin) . Dvacet dnů později se klon 5C1-5B9 stal konfluentním při 3 x 105 buněk/destička (49 z 96 jamek rostlo na této destičce). Tento klon byl namnožen. Ve čtyřdenní kultuře vyseté v koncentraci 105 buněk/ml v T150 se tento klon zdvojnásobil každých 35,5 hodin a rychlost produkce protilátky byla 15,3 pg/buňka/den (18 mg/1). Klon 5C1-5B9 byl rozmnožen a vyset v různých koncentracích od 100 buněk/destička do 3 x 104 buněk/destička na 96jamkové destičky obsahující média CHO + 50 nM metotrexát. Třicet šest dnů později byl klon 5C1-5B9 50C1 konfluentní z 60 % při 105 buněk/destička (50 z 96 jamek rostlo na této destičce). Tento klon byl namnožen.
Buněčné banky fáze I rodičovského zásobního kmene CE9y4PE pro vysévání (PSS, parent seed stock)
PSS klonu 5C1-5B9-50C1 s 50 nM MTX bylo zmraženo. Buňky byly nejdříve kultivovány v 500mililitrové kultivační nádobě obsahující médium CHO a 50 nM MTX. V okamžiku mražení kultura dosáhla hustoty 1,1 x 106 buněk/ml s 96% životaschopností a časem zdvojnásobení 29,3 hodiny. Produkce protilátky se určovala „sendvičovým testem ELISA a byla přibližně 27 pg/buňka/den. Buňky byly stočením odděleny od média a dávkovány do ampulek v hustotě 2,0 107 buněk/ml v 95% fetálním bovinním séru od JRH Biosciences a 5% obecné hlavní směsi Sigma, přičemž v ampulkách byl zmražen 1 ml mrazicího média s buňkami. Ampulky byly zmrazený v -70 °C a následující den umístěny do nádoby s tekutým dusíkem.
Jedna ampulka PSS s 50 nM MTX byla rozmražena a obsah byl vyset do lOOmililitrové kultivační nádoby obsahující médium CHO a 50 nM MTX. Tři dny později byl obsah kultivační nádoby rozdělen do dvou kultivačních nádob o obsahu 125 ml, hustota buněk byla 105 buněk/ml, jedna nádoba obsahovala médium CHO a 50 nM MTX a druhá pouze médium CHO.
Tři dny později bylo 150 ml buněk s médiem z kultivační nádoby se samotným médiem CHO zmraženo a posláno na vyhodnocení a testování mykoplazmat do Tektagenu. Produkce pokračovala osm týdnů, s MTX i bez něho. Výsledky z Tektagenu prokázaly, že PSS klon 5C1-5B9-50C1, anti-CD4 (gama 4(PEPTID), lambda, Oz-) NEOSPLA3F v CHO, je bez přítomnosti mykoplazmat. Deset ampulek PSS s 50 nM NM bylo přeneseno do tekutého dusíku pro uskladnění.
• · ·· · · • · « ·
Hlavní buněčná banka (MCB)
Dvě ampulky PSS s 50 mM MTX klonu 5C1-5B9-50C1 byly rozmraženy a jejich obsah vyset do lOOmililitrové kultivační láhve obsahující médium CHO a 50 nm MTX. Kultura se rozmnožovala 6 dnů do postupně větších kultivačních lahví, dokud nedosáhla objem 2000 ml, s hustotou 9,5 x 105 a životaschopností 98 %. Buňky byly stočením odděleny od média a resuspendovány v hustotě 2,0 x 107 buněk/ml v 95% fetálním bovinnim séru od JRH Biosciences a 5% Hybrimax DMSO od Sigmy. Buněčná suspenze v zamrazovacím médiu byla rozdělena do poměrných částí (10 ml) do 80 zmrazovacích ampulek označených jako MCB G4PE50-M-A. Ampulky byly zmrazený v -70 °C. Dvacet čtyři hodiny později byla buněčná banka přenesena do tekutého dusíku pro uskladnění.
Příklad 5
Stabilita mAbs CD4
Fyzická a chemická stabilita roztoků CE9y4PE a CE9y4E se sledovala po dobu 3 měsíců v 5 °C, 40 °C a rozptýleném světle pomocí SDS-PAGE (redukující a neredukující) , IEF, reverzní fázovou HPLC, vylučovací chromatografii (SEC) a testem ELISA. Počáteční testování RP-HPLC a neredukující SDS-PAGE svědčí pro to, že CE9y4E je složena ze dvou hlavních druhů, a to neredukované celé molekuly a nekovalentně přidružené molekuly, která se v podmínkách analýzy štěpí do dvou stejných jednotek označených jako „polo-mer („halfmer). Je zajímavé, že nebyly pozorovány žádné větší rozdíly v bio-analytických profilech těchto dvou mAbs při použití metod SEC, IEF, SDS-PAGE (redukující) a ELISA. Množství „polo-merů v CE9y4E je méně než 1 % jak při RPHPLC, tak SDS-PAGE (neredukující) . Obrázek 18 ukazuje • · • ·
4 4 4 • ••4 «44 4 φ 4* · · 4··· ····
4 · · · ·« ·· · ··
44 4444 ······· ·· « « · · · · ·
SDS-PAGE (neredukující) analýzu monomeru a „polo-meru v roztocích CE9y4PE a CE9y4E. Množství „polo-meru v CE9y4E zůstávalo konstantní vzhledem k počátečnímu testování po dobu tří měsíců v jakýchkoliv testovacích podmínkách. Obsah „polo-meru v ΟΕ9γ4ΡΕ zůstával pod 2 % po celou dobu za všech testovacích podmínek. Žádný větší rozdíl ve stabilitě mezi CE9y4E a CE9y4PE nebyl pozorován v 5 °C a 40 °C. Roztok CE9y4E skladovaný při rozptýleném světle je poněkud méně stabilní než ΟΕ9γ4ΡΕ. Data naznačují, že „polo-mer ΟΕ9γ4Ε nemá významný účinek na všeobecnou stabilitu celé molekuly. Žádné větší rozdíly ve fyzikální stabilitě roztoků CE9y4PE a CE9y4E nebyly pozorovány.
Afinita a stechiometrie mAbs CD4 stanovené povrchovou plasmonovou rezonancí (SPR)
Stechiometrie vazby rozpustného CD4 k imobilizovaným mAbs může být určena saturačními vazebnými experimenty na přístroji BIAcore (Pharmacia). Data pro asociační a disociační fáze procedury SPR (obrázek 19) byla analyzována přímo za použití integrované formy rychlostních rovnic, jak je popsali 0'Shanessey et al., Anal. Biochem., 212, 467-468, 1993. Shrnutí výsledných údajů o vazbě, vyjádřených v mol CD4/mol mAb, je ukázáno v tabulce 3. Z těchto dat je možné vidět, že ve všech případech je stechiometrie vazby větší než 1,5:1. Vzhledem k tomu, že BIAcore je systém pro interakce v pevné fázi a že imobilizační protokol je náhodný, tyto výsledky naznačují, že obě místa vázající antigen u každé mAb jsou funkční. Stechiometrie vazby CD4 byla tedy tatáž pro všechny mAb a přitom blízká teoretické hodnotě 2,0. Měření afinity dále ukázala, že afinita byla shodná pro všechn komplexy mAb, a to 1,0 nM.
φ φ
Tabulka 3
Stechiometrie a afinita vazby měřená povrchovou piasmonovou rezonancí
Protilátka Stéčhiómétřiě dle BIAcore Afinita (nM 25 °C)
CE9.1 1,56 0,99
CE9y4 1,61 1,34
CE9y4E 1,72 1,43
CE9y4ZK 1,67 1,08
CE9y4PE 1,09
Přiklad 6
Biologické hodnocení CE9y4PE in vitro
Shrnutí
Aktivita zprostředkovaná oblastí Fab (MLR) a doménou Fc (vazba receptoru Fc, ADCC a CDC) byla srovnávána u CE9.1, CE94PE a dalších derivátů gama 4. Aktivita závislá na Fab (MLR) se mezi protilátkami nelišila, ale byly rozdílné ve vazebných vlastnostech pro receptor Fc. Nemodifikovaný derivát gama 4 CE9y4 vykázal překvapivě silnou vazbu k receptorům Fc, ale mutace E v CE9y4E a CE9y4PE odstranila tuto vazbu, stejně jako aktivitu ADCC.
Účinky mAbs na odpovědi smíšených lymfocytů (MLR)
Test troj směrné odpovědi smíšených lymfocytů (MLR) se prováděl pro určení účinku konstruktů mAb na T buněčnou proliferaci řízenou alo-antigenem a na produkci IL-2. MLR · 9 • · • *99 ·<· · 999 • * · · · ♦ · ·· ♦ 99 • 9 99 9999 • 99 ···· 99 999 «φ φ* jsou závislé na přítomnosti T buněk CD4+ a velká část odpovědi je závislá na účasti receptorů CD4 prostřednictvím interakce s molekulami MHC II. třídy na buňkách prezentujících antigen. Odpověď MLR je in vitro korelát aspektů transplantační rejekce in vivo. Co se týče dalších farmakologických přípravků jsou MLR také blokováony imunosupresivními přípravky, jako je cyklosporin A.
Všechny konstrukty mAb měly stejnou schopnost blokovat MLR, a to jak proliferační odpověď T buněk, tak produkci IL2 (obr. 20 a tab. 4). Tedy přesunutí domény V z CE9.1 na struktury lidské λ4 a substituce „P a E v ohybové a CH2 doméně neovlivnily schopnost mAbs blokovat T buněčné odpovědi závislé na CD4 in vitro.
Tabulka 4
Účinek mAbs na MLR - shrnutí
Protilátka Prolifěráče (IC50) Produkce IL-2 (IC50)
CE9.1 20 ng/ml 5 ng/ml
CE9y4 20 ng/ml 5 ng/ml
CE9y4E 20 ng/ml 10 ng/ml
CE9y4XK 20 ng/ml 20 ng/ml
CE9y4PE 20 ng/ml neurčeno
Závěr
Všechny mAbs jsou rovnocenné v inhibici MLR.
Vazebné vlastnosti mAbs pro receptor Fc
Ověření testu pro určení vazby receptoru Fc
CE9y4PE byla navržena tak, aby neměla aktivity vázající FcR. Pro měření této aktivity byl vyvinut test založený na vazbě buněk zprostředkované FcR a CD4 při přemostění pomocí mAbs. Tento test měří současně funkce mAbs vázajících FcR, jako in vitro korelát deplece buněk CD4 in vivo zprostředkované FcR a mAb.
Obrázek 21 ukazuje, že CE9.1 usnadňuje adhezi monocytárních buněk exprimujících FcR (buňky THP-1 indukované IFN-γ) k fibroblastům CD4+ (fibroblastová buněčná linie transfekovaná CD4) v adhezním testu. Vazba je závislá na doménách Fc mAb CE9.1, protože zkrácený F(ab')2 vazbu neumožňuje. Vazba také vyžaduje místo rozpoznávající antigen na CD4, protože jeho obsazení sCD4 blokuje spojení buňka-buňka.
Určení vazebných aktivit mAbs pro receptor Fc mAbs CE9.1(IgGl), ΟΕ9γ4 (IgG4), ΟΕ9γ4λΚ (hybrid IgG4 λΚ), ΟΕ9γ4Ε (IgG4, mutant E) a ΟΕ9γ4ΡΕ (IgG4, mutant PE) byly hodnoceny z hlediska schopnosti současně vázat CD4 buněčného povrchu a FcR.
Jak se očekávalo, CE9.1 má v tomto testu dobrou vazebnou aktivitu. Překvapivě konstrukty IgG4 CE9y4 a ΟΕ9γ4λΚ si podržely dostatečnou afinitu pro FcR, že byly v tomto testu nerozeznatelné od CE9.1. Aktivita v tomto testu se ztratila pouze když byla zavedena substituce „E, jako v CE9y4E a CE9y4PE (viz obr. 22).
Vazebné vlastnosti CE9y4PE pro Clq in vitro
Komplementový systém zahrnuje, mezi svými různými funkčními složkami, schopnost interagovat s určitými typy φ · · ·
Φ • φφφ* protilátek způsobem, který vede k buněčné lýze a destrukci. Lidské protilátk IgGl jsou normálně schopné vázat Clq a vyčerpat cílové buňky nesoucí povrchové antigeny, pro které jsou specifické. Jiné lidské izotypy, jako IgG4, projevují sníženou schopnost vázat Clq a jsou tedy neschopné deplece cílových buněk. Úprava CE9y4PE v konstruktu gama 4 může do určité míry dosáhnout takového cíle, že zabrání fixaci komplementu a umožni vazbu protilátky na CD4 cílové buňky při eliminaci potenciálních destruktivních vedlejších účinků
Srovnání CDC efektorových vlastností CE9y4PE a CE9.1 se provedlo za použití klasické metody komplementem zprostředkované cytolýzy buněk SupTl CD4+ značených chromém v přítomnosti králičího komplementu. V těchto studiích byl jako pozitivní kontrola použit myší komplement fixující mAb k HuCD4, 4D9 (IgG2a). Jak CE9.1 tak i CE9y4PE byly neúčinné ve fixaci králičího komplementu (obr. 23) . Jak bylo zmíněno již dříve, CE9.1 váže slabě Clq a je tedy neschopná fixovat lidský komplement. Tyto výsledky ukazují, že oba konstrukty jsou neschopné podpořit buněčnou lýzu prostřednictvím komplementového efektorového mechanismu.
ADCC efektorové vlastnosti CE9y4PE in vitro
Buňky s cytotoxickým potenciálem, které mohou vázat mAbs prostřednictvím FcR mohou zprostředkovat ADCC namířenou na cílové buňky pokryté antigenem. Lidské T pomahačské buňky exprimující molekulu CD4 jsou rozpoznávány mAb CE9.1, která spouští cytolytický útok zabíječských buněk nesoucích FcR, granuloccytů a/nebo makrofágů. Cílem konstrukce CE9y4PE bylo odstranit schopnost mAb vázat se k FcR, což by odstranilo schopnost přídatných buněk zprostředkovat depleci cílových ·· · · • 9 « • ♦ · · t ♦ ♦ ·· ♦ φ >
9a 9 9 9 9 · 9 ··>·«·· ·· «·· to· toto buněk CD4, zatímco by stále umožňovalo mAb, aby zůstala imunosupresivní.
Srovnání ADCC efektorových vlastností CE9y4PE a CE9.1 se provádělo za použití klasické metody buňkou zprostředkované cytolýzy buněk SupTl CD4+ značených chromém. Myší CD4 mAb 4D9 (IgG2a, K) byla vybrána jako pozitivní kontrola. Efektorové buňky byly leukocyty lidské periferní krve získané z interfáze v hustotním gradientu („buffy coat). Obrázek 12 ukazuje schopnosti obou mAbs 4D9 a CE9.1 zprostředkovat specifickou lýzu buněk CD4+. Za stejných podmínek má ΟΕ9γ4ΡΕ velice malý účinek.
Tyto výsledky ukazují, že ΟΕ9γ4ΡΕ je neschopná zprostředkovat buněčnou' lýzu prostřednictvím mechanismu FcR nebo komplementu.
Příklad 7
Komparativní PK analýza CE9y4E a ΟΕ9γ4ΡΕ
Komparativní farmakokinetika dvou vedoucích λ4 mAbs, ΟΕ9γ4Ε a CE9y4PE, se vyšetřovala na samcích laboratorního potkana linie Sprague-Dawley. CE9y4E nebo CE9y4PE se podávala jako bolus i.v. v dávce 1 mg/kg (čtyři zvířata ve skupině) a 4 týdny po dávce se odebíraly krevní vzorky. Plazmatické koncentrace CE9y4E a CE9y4PE se určovaly za použití „sendvičového testu ELISA s SCD4/proti-lidským IgG navrženém tak, aby potvrdil nejenom přítomnost cirkulujícího lidského IgG, ale také schopnost vázat rekombinantní lidský rozpustný CD4.
Po podání intravenózního bolusu 1 mg/kg CD4 mAb se plazmatická koncentrace ΟΕ9γ4Ε snižovala troj fázovým způsobem a plazmatická koncentrace ΟΕ9γ4ΡΕ se snižovala dvoj fázovým způsobem (obr. 24). Za účelem srovnání a kvůli • · ·♦«9 nedostatečnému počtu dat pro adekvátní popis terminální fáze pro CE9y4E, byly všechny profily plazmatické koncentrace v čase analyzovány za použití dvoufázového modelu. Byla pozorována malá variabilita mezi případy. Převládající sekundární fáze ti/2 byla přibližně 4 dny pro CE9y4E, a 9 dnů pro CE9y4PE a odpovídala za 67% a 93% celkové plochy pod křivkou závislosti plazmatická koncentrace-čas. Zjevná plazmatická clearance pro CE9y4PE byla nízká (6,4 ml/hod/kg) a byla přibližně polovina clearance CE9y4E (1,0 ml/hod/kg). Farmakokinetické vlastnosti PE mutanta λ4 mAb, CE9y4E, jsou tedy podobné jiným humanizovaným λΐ mAbs u laboratorního potkana.
Dlouhý poločas cirkulace funkčně intaktní CE9y4PE u laboratorního potkana také svědčí pro to, že CE9y4PE je při podání člověku pravděpodobně účinná delší dobu.
Tyto výsledky potvrzují, že mutant PE CE9y4PE má u laboratorního potkana dvakrát nižší plazmatickou clearanci a delší biologický poločas, než mutant CE9y4E.
Tabulka 5
Farmakokinetické parametry (průměr ± SD) CE9y4E a CE9y4PE po
i.v. bolusu 1 mg/kg podaném laboratorním potkanům SpragueDawley
mAb CD4 CL MRT Tl/2 1 Tl/2 %auc2 Vss
(ml/h/kg) ^gxh/ml) (h) (h) (h) (ml/kg)
ΟΕ9γ4Ε 0,999+137 1010+130 109±12 15,2+3,8 97,7+29,5 55,7+14,2 109+14
CE9y4E 1,32+0,30 760+138 79,5+16,0 16,6+6,9 95,3±30,8 52,l±20,0 103+18
CE9y4PE 0,410±0,074 2500±440 295±43 9,9±3,3 224±3,3 93,4±2,2 119±16
• φ ·· ···· *· ·· • · ♦· •· ·· ♦ · · ♦* • «· ··♦·
Zkratky farmakokinetických parametrů v tab.5 : CL = celková plazmatická clearance, AUC0-inf = celková plocha pod křivkou závislosti plazmatická koncentrace na čase, MRT = střední rezidenční čas, Ti/2 _1 = zjevný poločas rozpadu v počáteční fázi, T1/22 = zjevný poločas rozpadu v sekundární fázi, %AUC2 = procento plochy pod křivkou závislosti plazmatická koncentrace na čase během sekundární fáze, Vss = distribuční objem v rovnovážném stavu.
Vzhledem k těmto výsledkům, CE9y4PE by měla být vhodná pro terapeutické použití, např. při i. v. podávání. Také další způsoby podávání jsou vhodné.
Příklad 8
Farmakologické studie na vivo
Popis transgenních myších #uCD4
Úvod
Vysoký stupeň druhové specifity CE9.1 a CE9y4PE komplikuje stanovení účinnosti in vivo. Farmakologická odpověď na CE9.1 může být u šimpanze snadno sledována, skrze depleci CD4+ buněk závislé na dávce. Očekávaná nepřítomnost této aktivity u CE9y4PE nás přimělo k použití jiných prostředků pro stanovení účinnosti. Konkrétně, účinnost se studuje na transgenních myších HuCD4. Studie v tomto systému jsou popsány níže.
Transgenní myši HuCD4+
U transgenních myší HuCD4 vypěstovaných v UCFS (Killeen et al., EMBO J., 12, 1547-53, 1993), byl endogenní
• ·« 9» ···♦ 99 • 9
99 9 · • 9 9 9 9 9 9
• 9 • 9 • 9-9 • 9 99
9 ♦ 9 9 9 9 9 99 9 9 •
• 9 9 9 • 9 9 9
9 9 9 · 9 9 9 9 9 • 99 • 9 99
gen MuCD4 porušen homologní rekombinací a lidský minitransgen CD4 byl zaveden tak, aby podléhal regulaci promotorem MuCD4. U těchto myší, které byly kříženy do vzniku homozygotního potomstva, byl MuCD4 nahrazen jHíjCD4 . HuCD4 obnovuje pozitivní a negativní selekci v thymu, vedoucí k produkci nezávislých pozitivních periferních T buněk CD4 + nebo CD8+, a to v úrovni srovnatelné se stupněm nalezeným u normálních myší. Kromě toho, ve srovnání s rodičovskou generací s vyřazeným genem MuCD4 („MuCD4 knockout), vykazují zralé T buňky HuCD4 vlastnosti blízké jejich normálním myším protějškům: 1) in vivo, sérové hladiny IgG jsou navráceny k normálním hodnotám a 2) tato zvířata vykazují příslušné odpovědi závislé na MHC v in vitro NMR.
Genetické pozadí těchto myší je dosti složité kvůli tomu, že bylo třeba použít různé kmeny embryonálních kmenových buněk a myší v původních pokusech s vyřazeným genem („knockout) a transgenních pokusech. Původní knockout/transgenní myši byly postupně kříženy tak, aby byly v lokusu MHC homozygotní, a tedy myši nyní používané v SB jsou haplotypu H-2dd.
Výsledky ukázaly, že u těchto myší se získá dobrá odpověď na cizorodý antigen, ovalbumin, a počáteční studie prokázaly in vivo aktivitu pro CE9y4PE.
Předběžné vyhodnocení CE9y4PE u transgenních myší HuCD4
Dostali jsme dvanáct transgenních myší ffuCD4 (H-2dd), které byly použity ke srovnáni CE9y4PE s IF3 (myší protilidský CD4) a GK1.5. Myším byla podány dávka v den -2, -1 a 0, a to 1 mg protilátky i.p. a byly imunizovány OVA 3 hodiny po poslední dávce. Myši se usmrtily 2 týdny později a sérum a buňky se hodnotily na funkční aktivitu. Protilátková • Φ φφφφ
• * φ • φ φ φ · • φ φ φ φ φ • · · · · φφ φφ « Φ Φ Φ
Φ Φ ΦΦ
ΦΦΦΦ Φ • Φ Φ
ΦΦ ΦΦ odpověď specifická pro OVA je ukázána na obrázku 25. Jak se očekávalo, mAb k myšímu CD4 (GK1.5) neměla žádný účinek na humorální odpověď, zatímco obě mAbs k HuCD4 tuto odpověď blokovaly. Z těchto dvou mAbs byla výraznější CE9y4PE.
Všechny skupiny myší odpovídaly však na Con A a LS, bylo zde však určité kolísání v odpovědi na ovalbumin a v MLR. To může být způsobeno faktem, že tento soubor zvířat obsahoval jak myší samce, tak samice různého věku.
Myši MuCD4 -/- (CD4 knockout) a HuCO4 +/+ (transgenní myši) byly ošetřeny s CE9.1, ΟΕ9γ4ΡΕ nebo fyziologickým roztokem. Studie se prováděla po dobu 28 dnů se vzorky odebíranými ve dnech 1, 3, 7, 14 a 28. Pro sledování osudu T buněk CD4+ a CD8+ byla použita analýza průtokovou cytometrií se třemi značeními splenocytů těchto myší. Pro vyšetření hladiny T buněk byly použity následující protilátky: CD3-PE, OKT4-FITC, CD8-TC. Pro sledování osudu T a B buněk u těchto myší byly použity následující protilátky: CD3-PE, CD2-FITC, CD45-TC. Pro sledování osudu buněk povlečených CE9.1 nebo CE9y4PE byl použit následující panel mAb: OKT4-PE, Leu3a-FITC, CD3-TC.
Data ukázala, že u transgenních myší (flúCD4 +/+) ošetřených CE9.1 a CE9y4PE byly všechny CD4+ buňky pokryty protilátkou v 1. den. Povlak přetrvával po několik dnů a 28. den nebyl detekovatelný. Celkový počet buněk CD4+ u myší ošetřených CE9.1 se významně snížil, dokonce 28. den. Na rozdíl od toho myši ošetřené CE9y4PE nevykázaly žádné snížení celkového počtu buněk CD4+. U obou protilátek byla dokázána, modulace receptoru CD4. Ačkoliv se procento buněk CD8+ u myší ošetřených CE9.1 recipročně zvýšilo, nebylo prokázáno, že tato absolutní čísla byla významně ovlivněna ošetřením. Podobně byly počty buněk CD8+ neovlivněny u myší ošetřených
• · « • 4 • •♦4 44 44
♦ 4 · t • 4 • 4 4 • •
• 4 4 4 ··· • 4 44
• 4 • 4 4 4 4 >4 4 4 4
• 4 « 4 4 • • •
444 4··· • 4 ··· • 4 44
ΊΟ
CE9y4PE. Ve všech pokusech s kteroukoliv protilátkou zůstával počet B buněk konstantní.
Studie na šimpanzech in vivo
U šesti šimpanzů se vyšetřovala deplece T buněk CD4+ a/nebo modulace receptoru CD4 buněčného povrchu po infúzích zvyšujících se dávek CE9y4PE až do 15 mg/kg. Každému šimpanzi se odebíraly vzorky periferní krve tři a dva týdny před začátkem studie, aby se stanovil výchozí stav počtu T buněk CD4+. Kromě buněk CD4+ se průtokovou cytometrií měřily také hladiny buněk CD3+ a CD8+. Jako kontrola byla použita mAb OKT4, která se váže k odlišným částem molekuly CD4 a nesoutěží o vazbu s CE9y4PE. Subtrakcí počtu CD8+ od celkového počtu CD3+ mohla být vypočítána teoretická hodnota pro počet T buněk CD4+. Srovnáním této hodnoty s buňkami CD4+ měřenými pomocí 0KT4, mohla být rozlišena modulace receptoru CD4 od deplece buněk CD4.
Na začátku studie obdržel každý šimpanz i. v. infúzi fyziologického roztoku. Vzorky krve se odebíraly okamžitě po infúzi a 3 a 14 dnů později. Každému šimpanzi se podala infúzi CE9y4PE (0,05 mg/kg) a 3 a pak 14 dnů později se odebíraly krevní vzorky. Sledoval se počet buněk CD4+ a jestliže byl v normálním rozmezí, podala se další dávka CE9y4PE. Každý šimpanz byl ošetřen podle následujícího schématu: fyziologický roztok, 0,05 mg/kg CE9y4PE, 1,5 mg/kg CE9y4PE, fyziologický roztok, 15 mg/kg CE9y4PE.
Po infúzích fyziologického roztoku nebo CE9y4PE v dávce 0,05 mg/kg nebyl pozorován žádný účinek na hladiny CD4. Při dávce 1,5 mg/kg byl pozorován povlak buněk CD4+ a přechodná a částečná modulace receptoru CD4 buněčného povrchu, ačkoliv nebyla pozorována žádná buněčná deplece CD4 + . Při dávce 15 mg/kg CE9y4PE nebyla pozorována buněčná deplece CD4+ u ··99
9 ·*
999
9 99
9·
9999 žádného zvířete, ačkoliv u všech zvířat byla pozorována významná modulace. Modulační účinek byl přechodný a vrátil se k výchozímu stavu během 14-21 dnů. U žádného zvířete nebyly pozorovány žádné vedlejší účinky. CE9y4PE mohla být detekována na buněčném povrchu a v séru do dvou dnů po podávání.
CE9y4PE byla navržena tak, aby neměla depleční účinek a u žádného zvířete nebyla pozorována deplece, dokonce ani při relativně vysoké dávce 15 mg/kg. CE9y4PE byla v sérech šimpanzů stabilní a zůstávala v oběhu až 21 dnů.
Použití
Protilátky tvořené způsobem popsaným výše nebo rovnocennými technikami mohou být pro charakterizaci ve funkčních biologických testech purifikovány kombinací afinitní a velikostní chromatografie. Tyto testy zahrnují určení specifity a vazebné afinity, a také efektorové funkce přidružené k exprimovanému izotypu, např. ADCC nebo fixace koraplementu. Takové protilátky jsou užívány jako pasivní nebo aktivní terapeutické přípravky proti řadě lidských nemocí, které postihují expresi CD4 a T buňky, včetně B buněčného lymfomu, infekčních nemocí včetně AIDS, autoimunitních a zánětlivých nemocí a transplantace.
Protilátky mohou být použity buď jako část komplexu protilátka/chelát, protilátka/toxin. Kromě toho mohou protilátky reagencie imunogeny idiotypové ve své nativní formě nebo protilátkové fragmenty (Fat pro zobrazování, potenciální v aktivní imunoterapii pro použity
Fab, Fv) vakcíny vyvolání nebo nebo celé jako nebo antiodpovědi.
Množství terapeutického protilátky použitelné účinku může být vyvolání určeno standardními • 00 ·· *···
0 · « * 0 • 000 00« • 0 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 • 00 000« 00 «00 technikami odborníkům dobře známými. Protilátky budou všeobecně poskytovány standardní technikou ve farmaceuticky přijatelném pufrem a mohou být podávány jakýmkoliv žádoucím způsobem. Vzhledem k účinnosti předkládaných nárokovaných protilátek a jejich toleranci člověkem je možné tyto protilátky podávat opakovaně, aby se bojovalo proti různým nemocem nebo chorobným stavům u člověka.
Rekombinantní protilátky anti-CD4 (nebo jejich fragmenty) tohoto vynálezu jsou také použitelné pro navození imunomodulace, např. navozeni imunosuprese lidského nebo zvířecího imunitního systému. Tento vynález se proto týká způsobu, který profylakticky nebo terapeuticky navozuje imunomodulaci u člověka nebo zvířete, který toho potřebuje, podáváním účinného netoxického množství protilátky podle tohoto vynálezu člověku nebo zvířeti.
Schopnost sloučenin tohoto vynálezu navodit imunomodulaci může být prokázána standardními testy pro tento účel používanými, jako je například test smíšené lymfocytární reakce nebo test měřící inhibici T buněčné proliferace měřením vychytávání thymidinu.
Fakt, že protilátky podle tohoto vynálezu jsou užitečné v navození imunosuprese, znamená, že jsou použitelné v rezistence k transplantovaným orgánům srdce, plíce, kostní dřeň, jejich rejekce, zánětlivých, nebo prevenci tkáním (např.
rohovka atd.) ledviny, nebo autoimunitních, hyperproliferačních imunologicky zprostředkovaných nemocí (např. artritida, lupus erytematosus, systémový lupus
Hashimotovy tyreoiditidy, sclerosis multiplex, nemocí, léčbě nebo kůže, léčbě nebo prevenci proliferačních kožních manifestací revmatoidní erytematosus, myastenia gravis, diabetes I. typu, uveitida, nefrotický syndrom, psoriáza, atopická dermatitida, kontaktní dermatitida a • · další ekzematózní dermatitidy, seboroická dermatitida, lichen planus, pemfigus, bulózní pemfigus, epidermolysis, kopřivka, angioedém, vaskulitidy, bulózní erytém, kožní eosinofilie, alopecia areata, léčba reverzibilní obstrukční nemoci dýchacích cest, střevní záněty a alergie (např. celiakie, proktitida, eosinofilni gastroenteritida, mastocytóza, Crohnova nemoc a ulcerativní kolitida) a potravinové alergie (např. migréna, rýma a ekzém). Předmětné protilátky jsou také potenciálně použitelné pro léčbu neautoimunitních stavů, kde je žádoucí imunomodulace, jako je kromě jiného např. reakce štěpu proti hostiteli (GVHD), transplantační rejekce, astma, HIV, leukémie, lymfom.
Odborník by byl schopný rutinními pokusy určit jaké účinné netoxické množství protilátky by bylo vhodné k navození imunosuprese.
Protilátky (nebo jejich fragmenty) podle tohoto vynálezu jsou také použitelné pro léčení nádorů u savců. Konkrétněji jsou použitelné pro zmenšení nádoru, inhibici nádorového růstu a/nebo prodloužení doby přežití zvířat majících nádor. Tento vynález se tudíž také týká způsobu léčení nádorů u lidí nebo zvířat podáváním účinného netoxického množství protilátky takovému člověku nebo zvířeti. Odborník by byl schopen rutinními pokusy určit jaké účinné netoxické množství protilátky by bylo vhodné k léčení karcinogenních nádorů. Všeobecně se očekává, že účinné dávkování je v rozmezí od 0,05 do 100 mg/kg tělesné váhy/den.
Protilátky podle vynálezu mohou být podávány člověku nebo zvířeti podle výše zmíněných způsobů léčení ve množství dostatečném k vyvolání takového účinku na terapeutickém nebo profylaktickém stupni. Protilátky podle vynálezu mohou být
9* 99 • «9 ·
9 99
4»r 9 · 9
9 ·
99
9
999 podávány takovému člověku nebo zvířeti v obvyklé dávkovači formě připravené kombinací protilátky podle vynálezu s obvyklým farmaceuticky přijatelným nosičem nebo podle známých technik. Odborníkovi bude zřejmé, že charakter farmaceuticky přijatelného množství aktivní složky, způsobu podávání a dalších protilátky (nebo jejího fragmentu) být perorální, parenterální, inhalací parenterální, jak se zde používá, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, nebo intraperitoneální podávání, subkutánní a intramuskulární formy nosiče nebo ředidlem forma a ředidla závisí na se kterou se bude kombinovat,
Způsob podávání podle vynálezu může nebo místní. Termín známých proměnných, j ej ího zahrnuje rektální, vaginální i se preferují parenterálního podávání.
Denní parenterální použití sloučenin podle terapeuticky navozovaly ošetřily nádory, budou všeobecně v rozmezí od 0,05 do 100, ale výhodně od 0,5 do 10 mg/kg tělesné váhy/den.
Protilátka podle vynálezu se míní
Všeobecně inhalací.
Inhalací perorální dávkovači schémata pro vynálezu, aby profylakticky nebo imunosupresi nebo terapeuticky inhalační podávání, odměřuj ící
Příslušné aerosolový se připraví může být také podávána intranazální a perorální dávkové formy pro takové přípravek nebo inhalátor obvyklými technikami, která bude použita, podávání.
jako je dávku,
Preferovaná dávka sloučeniny vynálezu, je všeobecně v rozmezí od 10 do 100 mg.
Protilátka podle vynálezu může být také podávána lokálně. Lokálním podáváním se míní nesystémové podávání a zahrnuje aplikaci protilátkové (nebo jejích fragmentu) sloučeniny podle vynálezu externě na epidermis, bukálně a instilaci této protilátky do ucha, oka a nosu, a kde nevstoupí významně do krevního řečiště. Systémovým podáváním • · ·» Φ··Φ ·· φφ · · φ * φ φ
φ φ φ φ φφ *
φφφ φ φ φ φ φ «φ φφ se mini perorální, intravenózní, intraperitoneální a intramuskulární podávání. Množství protilátky vyžadované pro terapeutický nebo profylaktický účinek bude ovšem kolísat podle vybrané protilátky, povahy a vážnosti léčeného stavu a zvířete podstupujícího léčení a závisí konečně na úsudku lékaře. Vhodná lokální dávka protilátky podle vynálezu bude všeobecně v rozmezí od 1 do 100 mg/kg tělesné váhy/den.
Přípravky
Ačkoliv je možné, aby protilátka nebo její fragment byly podávány samotné, je výhodné je podávat jako farmaceutický přípravek. Aktivní složka pro lokální podávání může být od 0,001 % do 10 % (hmotnostních), např. od 1 % do 2 % hmotnosti přípravku, ačkoliv může být až 10 % (hmotnostních) , ale výhodně ne více než 5 % (hmotnostních) a výhodněji od 0,1 % do 1 % (hmotnostních) přípravku.
Přípravky pro lokální použití předkládaného vynálezu obsahují aktivní složku spolu s jedním nebo více přijatelnými nosiči a jakoukoliv další volitelnou složku. Nosič musí být „přijatelný ve smyslu kompatibility s dalšími složkami přípravku a nesmí být škodlivý pro příj emce.
Přípravky vhodné pro lokální podávání zahrnují tekuté nebo polotekuté léky vhodné pro penetraci skrze kůži na místo, kde se vyžaduje léčení, jako mazání, locion, krém, mast nebo pasta a kapky vhodné pro podávání do oka, ucha nebo nosu.
Kapky podle předkládaného vynálezu obsahují sterilní vodné nebo olejnaté roztoky nebo suspenze a jsou připravovány rozpuštěním aktivní složky ve vhodném vodném roztoku baktericidního a/nebo fungicidniho přípravku a/nebo jakéhokoliv dalšího vhodného konzervačního prostředku a ·· ···« • A výhodně zahrnující povrchově aktivní přípravek. Výsledný roztok je poté čištěn filtrací, přenesen do vhodné nádobky, která je poté těsně uzavřena a sterilizována v autoklávu nebo udržováním teploty 90 °C až 100 °C půl hodiny. Alternativně může být roztok sterilizován filtrací a přenesen do nádobky asepticky. Příklady baktericidnich a fungicidních přípravků vhodných pro zahrnutí do kapek jsou dusičnan nebo octan fenylrtuťnatý (0,002%), benzalkoniumchlorid (0,01%) a chlorhexidin (0,01%). Vhodná rozpouštědla pro přípravu olejnatého roztoku zahrnují glycerol, naředěný alkohol a propylenglykol.
Lociony podle předkládaného vynálezu zahrnují takové, které jsou vhodné pro aplikaci na kůži nebo do oka. Oční locion zahrnuje sterilní vodný roztok, který volitelně obsahuje baktericidní látku a může byt připraven způsoby podobnými jako pro přípravu kapek. Lociony nebo linimenta pro použití na kůži mohou také obsahovat přípravek pro urychlené osychání a chlazení kůže, jako alkohol nebo aceton, a/nebo zvlhčovač jako glycerol nebo olej, jako ricinový olej nebo podzemnicový olej.
Krémy, masti nebo pasty podle předkládaného vynálezu jsou polotuhé přípravky aktivní složky pro vnější použití. Mohou být tvořeny míšením aktivní složky v jemně oddělené nebo práškové formě, samotné nebo v roztoku nebo suspenzi v tekutině vodné nebo jiné povahy, pomocí vhodného zařízení, v mastném nebo nemastném základu. Základ může obsahovat uhlovodíky, jako je tvrdý, měkký nebo tekutý parafin, glycerol, včelí vosk, kovové mýdlo, arabskou gumu, olej přírodního původu, jako mandlový, kukuřičný, podzemnicový, ricinový nebo olivový olej, tuk z ovčí vlny, nebo jeho deriváty, nebo mastné kyseliny, jako je stearová nebo olejová spolu s alkoholem, jako je propylenglykol nebo
• ·· • 4 ···· • 4 44
·· · 4 • 4 9 • · 4 •
♦ 4 • • 4 44 • · 44
• · 4 • 9 4 9 • 44 4 4
• · 4 4 • 4 4 4
··· ·· e·· • 9 44
ΊΊ makrogol. Přípravek může zahrnout jakékoliv vhodné povrchově aktivní činidlo, jako jsou estery sorbitanu nebo jeho polyoxyetylénové deriváty. Mohou být také zahrnuta suspendující činidla, jako jsou přírodní gumy, deriváty celulózy nebo anorganické látky, jako jsou oxidy křemíku, a další složky, jako je lanolín.
Odborníkovi je známo, že optimální kvantitu a odstup jednotlivých dávek protilátky podle vynálezu nebo jejích fragmentů určí povaha a stupeň léčeného stavu, forma, způsob a místo podáváni a konkrétní léčené zvíře, a že taková optima mohou být určena obvyklými technikami. Odborníkem bude také oceněno, že optimální léčebný postup, tj. počet dávek protilátky vynálezu nebo jejího fragmentu podávaný denně po definovaný počet dnů, může být odborníky zjištěn při použití testů, které určují obvyklý průběh léčby.
Věříme, že odborník může za použití předchozího popisu využít předkládaný vynález v plném rozsahu bez dalšího podrobného rozpracování. Proto je následující chápáno pouze jako ilustrativní příklad a ne jako omezení rozsahu předkládaného vynálezu jakýmkoliv způsobem.
Přípravek ve formě tobolky
Farmaceutický přípravek podle tohoto vynálezu ve formě tobolky se připraví naplněním standardní tvrdé želatinové tobolky složené ze dvou částí 50 mg protilátky vynálezu nebo jejího fragmentu, ve formě prášku, 100 mg laktózy, 32 mg talku a 8 mg stearanu hořečnatého.
Injekční parenterální přípravek
Farmaceutický přípravek tohoto vynálezu ve formě vhodné pro podávání injekcí se připraví mícháním 1,5 % (hmotnostního) protilátky vynálezu nebo jejího fragmentu v
• 44 ·· ···· 44 • 4
44 4 4 • 4 • • 4 4 •
• · • · ··· • 4 ··
• · • 4 4 • 4 ··· 4 •
• · • 4 4 • 4 4
···«··· • 4 ··· 44 ··
10% (objemovém) propylenglykolu a vodě. Roztok se sterilizuje filtrací.
Přípravek ve formě masti
Protilátka vynálezu nebo její fragment 1,0 g.
Měkký bílý parafín do 100,0 g.
Protilátka vynálezu nebo její fragment se disperguje v malém objemu vehikula tak, aby vznikl hladký homogenní produkt. Disperzí se poté plní mačkatelné kovové tuby.
Přípravek ve formě krému pro lokální podávání
Protilátka vynálezu nebo její fragment 1,0 g.
Polawax GP 200 20,0 g.
Bezvodý lanolín 2,0 g.
Bílý včelí vosk 2,5 g.
Metylhydroxybenzoan 0,1 g. Destilovaná voda do 100 g.
Polawax, včelí vosk a lanolín dohromady se zahřejí v 60 °C. Přidá se roztok metylhydroxybenzoanu a při použití míchání vysokou rychlostí se dosáhne homogenizace. Poté se ponechá teplota poklesnout na 50 °C. Pak se přidá protilátka podle vynálezu nebo její fragment a celé množství se důkladně rozptýlí a přípravek se ponechá chladnout za pomalého míchání.
Přípravek ve formě locionu pro lokální podávání
Protilátka vynálezu nebo její fragment 1,0 g.
Sorbitan monolaurát 0,6 g. Polysorban 20 0,6 g. Cetostearylalkohol 1,2 g. Glycerin 6,0 g. Metylhydroxybenzoan 0,2 g.
Purifikovaná voda B.P. do 100,00 ml. (B.P. = lékopis) britský • · ·
* « · · • · • · · • · · · • · · vody a
Metylhydroxybenzoan a glycerin se rozpustí v 70 v 75 °C. Sorbitan monolaurát, cetostearvlalkohol se rozpustí dohrorr. se k vodnému roztoku. Výsledná emulze ponechá se chladnout za stálého protilátka vynálezu nebo její zbývající vodě. Celá suspenze nehomogenizuje.
polysorban °C a .ady v 7 5 se míchání fragment jako míchá, se
Přípravek ve formě očních kapek Protilátka vynálezu nebo její fra Metylhydroxybenzoan 0,1 g. Propylhydroxybenzoan 0,04 g. Purifikovaná voda B.P. do 100,00 ml.
ml přidáj i homogenizuje, a přidá se suspenze ve dokud se plně gment 0,5 g.
Metyl a propylhydroxybenzoany se purifikované vody v 75 °C a výsledný chladnout. Poté se přidá protilátka vynálezu filtrací přes a aseóticky balí rozpustí v 70 ml roztok fragment a roztok se sterilizuje filtr (velikost pórů 0,022 pm), sterilních nádobek.
se ponechá nebo její membránový do vhodných
Přípravek pro podávání inhalací
Pro aerosolovou nádobku s mg protilátky podle vynálezu činidla, jako rozptyl tuto směs kombinaci
0,5 % lubrikačního kapacitou 15-20 ml: nebo j kyselina olejová, a je freon, výhodně v a difluorochlorometanu a vlož do ejího fragmentu s j^ polysorban 85 v pohonné látce, (1,2-diéhlorotetrafluoroetanu) smíchej
0,2nebo jako nádobky upravené buď pro inhalační podávání. Přípravek pro aerosolovou nádobku s kapacitou 15příslušné aerosolové intranažální nebo perorální podávání inhalací pro 20 ml: rozpusť 10 mg protilátky podle vynálezu nebo jejího fragmentu v etanolu • φ • · · · · · · · ··· • · ·· · · · · · ♦ · · ·· · · · ··· ··· ···· ·· ··· €· ·· (6-8 ml), přidej 0,1-0,2 % lubrikačního činidla, jako je polysorban 85 nebo kyselina olejová, a rozptyl v pohonné látce, jako je freon, výhodně v kombinaci (1,2 dichlorotetrafluoroetanu) a difluorochlorometanu a vlož do příslušné aerosolové nádobky upravené buď pro intranazální nebo perorální inhalační podávání.
Protilátky a farmaceutické přípravky podle vynálezu jsou obzvláště vhodné pro parenterální podávání, tj . subkutánně, intramuskulárně nebo intravenózně. Přípravky pro parenterální podávání obecně obsahují roztok protilátky podle vynálezu nebo jejího fragmentu nebo jejich směsi rozpuštěný v přijatelném nosiči, výhodně ve vodném. Může být použita celá řada vodných nosičů, např. voda, pufrovaná voda, 0,4% fyziologický roztok, 0,3% glycin, a podobně. Tyto roztoky jsou sterilní a bez částic. Tyto roztoky jsou sterilizovány obvyklými, dobře známými sterilizačními technikami. Přípravky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky, jak se vyžaduje při přiblížení se fyziologickým podmínkám, jako jsou pufrující činidla a činidla upravující pH, atd. Koncentrace protilátky podle vynálezu nebo jejího fragmentu v takovém farmaceutickém přípravku může široce kolísat, tj. od méně než 0,5 %, obvykle alespoň 1 %, až do 15 nebo 20 % (hmotnostních) , a vybírá se primárně podle objemů tekutin, viskozit atd., podle konkrétního vybraného způsobu podáváni.
Farmaceutický přípravek vynálezu pro intramuskulární injekci se připraví tak, aby obsahoval 1 ml sterilní pufrované vody a 50 mg protilátky vynálezu nebo jejího fragmentu. Podobně farmaceutický přípravek vynálezu pro intravenózní infúzi je vyroben tak, že obsahuje 250 ml sterilního Ringerova roztoku a 150 mg protilátky vynálezu nebo jejího fragmentu. Současné způsoby přípravy • · • · parenterálně podavatelných přípravků jsou dobře známy nebo jsou odborníkům zjevné, a jsou detailněji popsány například v Remington's Pharmaceutical Science, 15. vyd., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, zahrnuto v odkazech.
Protilátky podle vynálezu (nebo jejich fragmenty) mohou být lyofilizovány pro uskladnění a před použitím rekonstituovány ve vhodném nosiči. Tato technika se ukázala být účinná u obvyklých imunoglobulinů a mohou být použity lyofilizační a rekonstituční techniky v oboru známé.
V závislosti na zamýšlených výsledcích může být farmaceutický přípravek vynálezu podáván pro profylaktické a/nebo léčebné ošetření. Při léčebné aplikaci se přípravky podávají pacientovi, který již nemocí trpí, v množství postačujícím pro vyléčení nebo alespoň částečně zastavujícím nemoc a její komplikace. U profylaktických aplikacích se přípravky obsahující předkládané protilátky nebo jejich směsi podávají pacientovi, který ještě není v chorobném stavu, aby se posílila jeho odolnost.
Jedno nebo více podávání farmaceutických přípravků se provádí dávkami a způsobem, který vybral ošetřující lékař. V každém případě farmaceutický přípravek podle vynálezu poskytne množství pozměněných protilátek (nebo jejich fragmentů) vynálezu postačující účinně léčit pacienta.
Je třeba také poznamenat, že protilátky tohoto vynálezu mohou být použity pro navržení a syntézu buď peptidových nebo nepeptidových sloučenin (mimetik), které mohou být použitelné v téže léčbě, jako protilátka. Viz např. Saragovi et al., Science, 253: 792-795, 1991.
• · · · · ·
Uloženi
Kmen XL1 Blue, anti-CD4 v TCAE 6, který exprimuje CE9.1, byl uložen ve sbírce ATCC pod číslem 69030. Toto uložení bylo učiněno 9. července 1992.
Žadatelé a jejich zmocněnci potvrzují svou zodpovědnost nahradit tyto kultury, kdyby zahynuly před koncem termínu platnosti patentu na ně vydaného, nebo v období 5 let po poslední žádosti o kulturu, nebo po dobu 30 let (přičemž platí nejdelší termín), a svou zodpovědnost uvědomit sbírku o vydání patentu, a od této doby pak bude depozit nezvratně dostupný veřejnosti. Do této doby bude depozit přístupný patentovému zmocněnci za podmínek 37 C.F.R. Oddíl 1-14 a 35 U.S.C. Oddíl 112.
Další provedení jsou v následujících patentových nárocích.
• · ·· · ·
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 420 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: variabilní doména lehkého řetězce CE9.1 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 4...420 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: hotový peptid (B) POZICE: 61...420 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
GAC ATG AAA CAC His CTG Leu TGG Trp -15 TTC TTC CTC CTC CTG Leu -10 GTG GCA GCC CCC AGA Arg -5 48
Met Lys -19 Phe Phe Leu Leu Val Ala Ala Pro
TGG GTC TTG TCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG GCG GGC CCA GGA CTG. GTG 96
Trp Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ala Gly Pro Gly Leu Val
1 5 10
AAG CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC AGT GTC TCT GGT GGC TCC 144
Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser
15 20 25
ATC AGC GGT GAC TAT TAT TGG TTC TGG ATC CGC CAG TCC CCA GGG AAG 192
Ile Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Phe Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Lys
30 35 40
GGA CTG GAG TGG ATC GGC TAC ATC TAT GGC AGT GGT GGG GGC ACC AAT 240
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn
45 50 55 60
····
TAC AAT CCC TCC CTC Leu 65 AAC AAT CGA GTC TCC ATT TCA Ser ATA GAC ACG Thr 75 TCC Ser 288
Tyr Asn Pro Ser Asn Asn Arg Val Ser 70 Ile Ile Asp
AAG AAC CTC TTC TCC CTG AAA CTG AGG TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG 336
Lys Asn Leu Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
80 85 90
GCC GTC TAT TAC TGT GCG AGT AAT ATA TTG AAA TAT CTT CAC TGG TTA 384
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Leu His Trp Leu
95 100 105
TTA TAC TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC 420
Leu Tyr Trp Gly Gin Gly Val Leu Val Thr Val Ser
110 115 120
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 139 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
Met -19 Lys His Leu Trp Phe -15 Phe Leu Leu Leu -10 Val Ala Ala Pro Arg -5 Trp
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ala Gly Pro Gly Leu Val Lys
1 5 10
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile
15 20 25
Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Phe Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly
30 35 40 45
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys
65 70 75
Asn Leu Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
80 85 90
Val Tyr Tyr cys Ala Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Leu His Trp Leu Leu
95 100 105
Tyr Trp Gly Gin Gly Val Leu Val Thr Val Ser
110 115 120
* ·· · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 387 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: variabilní doména těžkého řetězce CE9.1 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 4...387 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: hotový peptid (B) POZICE: 61...387 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
ACC ATG Met -19 GCC Ala TGG Trp GCT Ala CTG Leu ' -15 CTG Leu CTC Leu CTC Leu GGC Gly CTC Leu -10 CTT Leu GCT Ala CAC His TTT Phe ACA Thr -5 48
GAC TCT GCG GCC TCC TAT GAG TTG AGT CAG CCT CGC TCA GTG TCC GTG 96
Asp Ser Ala Ala Ser 1 Tyr Glu Leu Ser 5 Gin Pro Arg Ser Val 10 Ser Val
TCC CCA GGA CAG ACG GCC GGG TTC ACC TGT GGG GGA GAC AAC GTT GGA 144
Ser Pro Gly 15 Gin Thr Ala Gly Phe 20 Thr Cys Gly Gly Asp 25 Asn Val Gly
AGG AAA agt’ GTA CAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA CCG CAG GCC CCT GTG 192
Arg Lys 30 Ser Val Gin Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Pro 40 Gin Ala Pro Val
CTG GTC ATC TAT GCT GAC AGC GAA CGG CCC TCA GGG ATC CCT GCG CGA 240
Leu 45 Val Ile Tyr Ala Asp 50 Ser Glu Arg Pro Ser 55 Gly Ile Pro Ala Arg 60
TTC TCT GGC TCC AAC TCA GGG AAC ACC GCC ACC CTG ACC ATC AGC GGG 288
Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly
70 75
GTC GAG GCC GGG GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT CAG GTG TGG GAC AGT 336
Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr .Cys Gin Val Trp Asp Ser
80 85 9 0
ACT GCT GAT CAT TGG GTC TTC GGC GGA GGG ACC CGG CTG ACC GTC CTA 384
Thr Ala Asp His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
95 100 1Ό5
387
GGT
Gly (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 128 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
Met Ala -19 Trp Ala Leu Leu Leu Glu Leu Leu Gly Leu Leu Ala -10 His Val 10 Phe Thr Asp
Ala -15 Ser Tyr 1 Ser -5 Val Ser
Ser Ala Ser 5 Gin Pro Arg Ser
Pro Gly Gin Thr Ala Gly Phe Thr Cys Gly Gly Asp Asn Val Gly Arg
15 20 25
Lys Ser Val Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Pro Gin Ala Pro Val Leu
30 35 40 45
Val Ile Tyr Ala Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75
Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Val Trp Asp Ser Thr
80 85 90
Ala Asp His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly
95 100 105
• 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 702 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: konstantní a variabilní domény lehkého řetězce lambda CE9.1
ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS
(B) POZICE: 4...702
ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: hotový peptid
(B) POZICE: 1...702
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
ATG GCC TGG GCT CTG CTG CTC CTC GGC CTC CTT GCT CAC TTT ACA GAC 48
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ala His Phe Thr Asp
1 5 10 15
TCT GCG GCC TCC TAT GAG TTG AGT CAG CCT CGC TCA GTG TCC GTG TCC 96
Ser Ala Ala Ser Tyr G1U Leu Ser Gin Pro Arg Ser Val Ser Val Ser
20 25 30
CCA GGA CAG ACG GCC GGG TTC ACC TGT GGG GGA GAC AAC GTT GGA AC-G 144
Pro Gly Gin Thr Ala Gly Phe Thr cys Gly Gly Asp Asn Val Gly Arg
35 40 45
AAA AGT GTA CAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA CCG CAG GCC CCT GTG CTG 192
Lys Ser Val Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Pro Gin Ala Pro Val Leu
50 55 60
GTC ATC TAT GCT GAC AGC GAA CGG ccc TCA GGG ATC CCT GCG CGA TTC 240
Val Ile Tyr Ala Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe
65 70 75 80
TCT GGC TCC AAC TCA GGG AAC ACC GCC ACC CTG ACC ATC AGC GGG GTC 288
Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
90 95 • 444 • 4 • · • 4 • 44· f ♦ 4 4 4 · ·4 • 4 4 4 ·«· ·4 • · ·· 4 4 · · 4 4 ·· • · · · · 4 ··
44· 4444 ·· ··· 99··
GAG G1U GCC Ala GGG Gly GAT As o 100 GAG Glu GCT Ala GAC Asp TAT TAC TGT Cys CAG Gin GTG Val TGG Trp GAC Asp 110 AGT Ser ACT Thr 336
Tyr Tyr 105
GCT GAT CAT TGG GTC TTC GGC GGA GGG ACC CGG CTG ACC GTC CTA GGT 384
Ala Asp His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly
115 120 125
CAG CCC AAG GCT GCC CCC TCG GTC ACT CTG TTC CCG CCC TCC TCT GAG 432
Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
GAG CTT CAA GCC AAC AAG GCC ACA CTG GTG TGT CTC ATA AGT GAC TTC 480
G1U Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
145 150 155 160
TAC CCG GGA GCC GTG ACA GTG GCC TGG AAG GCA GAT AGC AGC CCC GTC 528
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Sér Ser Pro Val
165 170 175
AAG GCG GGA GTG GAG ACC ACC ACA CCC TCC AAA CAA AGC AAC AAC AAG 576
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys
130 185 190
TAC GCG GCC AGC AGC TAC CTG AGC CTG ACG CCT GAG CAG TGG AAG TCC 624
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser
195 200 205
CAC AGA AGC TAC AGC TGC CAG GTC ACG CAT GAA GGG AGC ACC GTG GAG 672
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
210 215 220
AAG ACA GTG GCC CCT ACA GAA TGT TCA TGA 702
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser *
225 230
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 234 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein • · ♦ · (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6
Met Ala Trp 1 Ala Leu 5 Leu Leu Leu Gly Leu Leu 10 Ala His Phe Thr 15 Asp
Ser Ala Ala Ser Tyr Glu Leu Ser Gin Pro Arg Ser Val Ser Val Ser
20 25 30
Pro Gly Gin Thr Ala Gly Phe Thr Cys Gly Gly Asp Asn Val Gly Arg
35 40 45
Lys Ser Val Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Pro Gin Ala Pro Val Leu
50 5 5 60
Val Ile Tyr Ala Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
85 90 95
Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Val Trp Asp Ser Thr
100 105 110
Ala Asp His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly
115 120 125
Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
165 170 175.
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys
180 185 190
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser
195 200 205
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
210 215 220
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser ★
225 230
·· ···· ♦ ♦ ♦ · • · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1404 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: variabilní a konstantní oblasti gama 4 těžkého řetězce (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENí: CDS (B) POZICE: 1...1404 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: hotový peptid (B) POZICE: 1...1404 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
ATG Met 1 AAA Lys CAC CTG TGG Trp 5 TTC Phe TTC Phe CTC Leu CTC CTG GTG GCA Val Ala GCC Ala CCC Pro AGA Arg 15 TGG Trp 48
His Leu Leu Leu 10
GTC TTG TCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GC-C CCA GGA CTG GTG AAG 96
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC AGT GTC TCT GGT GGC TCC ATC 144
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 4-5
AGC GGT GAC TAT TAT TGG TTC TGG ATC CGC CAG TCC CCA GGG AAG GGA 192
Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Phe Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly
50 55 60
CTG GAG TGG ATC GGC TAC ATC TAT GGC AGT GGT GGG GGC ACC AAT TAC 240
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr
65 70 75 80
AAT CCC TCC CTC AAC AAT CGA GTC TCC ATT TCA ATA GAC ACG TCC AAG 288
Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys
85 90 95
AAC CTC TTC TCC CTG AAA CTG AGG TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG GCC 336
Asn Leu Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
GTC TAT TAC TGT GCG AGT AAT ATA TTG AAA TAT CTT CAC TGG TTA TTA 384
Val Tyr Tyr cys Ala Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Leu His Trp Leu Leu
115 120 125
• ·· ·· ···· ··44
4» · 4 4 · ♦ ·4 • · 4 4 4 44 4 444 • 4 9 4 · * · ··· ♦* • 4 44 4444
444 4444 4» ··« ····
TAC Tyr TGG GGC CAG Gin GGA GTC Gly Val CTG GTC ACC GTC Val TCC TCA GCT AGC ACC Thr AAG Lys 432
Trp 13 0 Gly Leu 135 Val Thr Ser Ser 140 Ala Ser
GGC CCA TCC GTC TTC CCC CTG GCG CCC TGC TCC AGG AGC ACC TCC GAG 480
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
145 150 155 160
AGC ACA GCC GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG 528
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC 576
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG 624
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205 •
GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACG AAG ACC TAC ACC TGC AAC 672
Val Thr Val Pro Ser S GX Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
210 215 220
GTA GAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AGA GTT GAG TCC 720
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
225 230 235 240
AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA TCA TGC CCA GCA CCT GAG TTC CTG GGG 768
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
245 250 255
GGA CCA TCA GTC TTC CTG TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACT CTC ATG 816
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
ATC TCC CGG ACC CCT 'GAG' GTC ACG TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAG 864
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin
275 280 285
GAA GAC CCC GAG GTC CAG TTC AAC TGG TAC GTG GAT GGC GTG GAG GTG 912
Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TTC AAC AGC ACG TAC 960
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAC GGC 1008
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GGC CTC CCG TCC TCC ATC 1056
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
340 345 350
GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAG CCA CAG GTG 1104
G1U Lys Thr Ile Šer Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
ΦΦ ΦΦ
Φ Φ Φ ·
Φ Φ ΦΦ
ΦΦΦΦ Φ • Φ Φ • Φ ΦΦ • ΦΦΦ φ Φ· φφ ·· •φ φ φφ φ φ
ΦΦΦ ΦΦΦΦ
ΦΦΦΦ • ΦΦ
ΦΦΦΦ* • Φ Φ·
Φ Φ·
ΦΦ ΦΦΦ
TAC ACC Tyr Thr 370 CTG Leu CCC Pro CCA Pro TCC Ser CAG Gin 375 GAG G1U GAG G1U ATG ACC AAG Lys 380 AAC Asn CAG Gin GTC Val AGC Ser 1152
Met Thr
CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAC CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG 1200
Leu Thr cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC 1248
Trp G1U Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AGG CTA ACC GTG 1296
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
420 425 430
GAC AAG AGC AGG TGG CAG GAG GGG AAT GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG 1344
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACA CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT 1392
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
CTG GGT AAA TGA 1404
Leu Gly Lys *
465 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 468 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
Met 1 Lys His Leu Trp 5 Phe Phe Leu Leu Leu 10 Val Ala Ala Pro Arg 15 Trp
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser C-ly Gly Ser Ile
35 40 45
• * · ♦ ί · •99
9· •9
9 9 999
9 9 99
99
9999
99
99
9·999
99
9 9 9
999
99999
99
9999
Ser Leu 65 Gly Asp Tyr Tyr Trp Tyr 70 Phe Trp 55 Ile Arg Gin Ser 60 Gly Pro Gly Lys Gly Tyr 8.0
50 Glu Trp Gly Thr Asn
Ile Gly Ile Tyr Gly Ser Gly 75
Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Leu Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
8 Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Leu His Trp Leu Leu
115 120 125
« Tyr Trp Gly Gin Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130' 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
145 150 155 160
Ser Thr Ala Ala. Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
130 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
210 215 220
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
225 230 235 2 4 0-
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
245 250 255
- Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
- Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Vál- Val Asp Val Ser Gin
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 'Val
290 295 3 00
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
340 345 350
«·♦·
Glu Lys Thr 355 Ile Ser Lys Ala Lys Gly 360 Gin Pro Arg Glu 365 Pro Gin Val
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
9 405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
4 420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Gly Lys *
465 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1404 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: těžký řetězec gama 4 s » mutací E (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...1404 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: hotový peptid (B) POZICE: 1...1404 ·· ··*· (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
ATG AAA CAC CTG Leu TGG TTC TTC CTC Leu CTC Leu CTG Leu 10 GTG Val GCA GCC CCC AGA TGG 48
Met Lys 1 His Trp 5 Phe Phe Ala Ala Pro Arg 15 Trp
GTC TTG TCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG 96
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC AGT GTC TCT GGT GGC TCC ATC 144
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile
40 45
AGC GGT GAC TAT Tyr TAT Tyr TGG Trp TTC TGG Phe Trp 55 ATC CGC Ile Arg CAG Gin TCC Ser 60 CCA Pro GGG Gly AAG Lys GGA Gly 192
Ser Gly 50 Asp
CTG GAG TGG ATC GGC TAC ATC TAT GGC AGT C-GT GGG GGC ACC AAT TAC 240
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tvr
65 70 75 80
AAT CCC TCC CTC AAC AAT CGA GTC TCC ATT TCA ATA GAC ACG TCC AAG 288
Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys
85 90 95
AAC. CTC TTC TCC CTG AAA CTG AGG TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG GCC 336
Asn Leu Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
GTC TAT TAC TGT GCG AGT AAT ATA TTG AAA ψ (p CTT CAC TGG TTA TTA 384
Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Leu His Trp Leu Leu
115 120 125
TAC TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCT AGC ACC AAG 432
Tyr Trp Gly Gin Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
13 0 135 140
GGG CCA TCC GTC TTC CCC CTG GCG CCC TGC TCC AGC- AGC ACC TCC GAG 480
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
145 150 155 160
AGC ACA GCC GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG 528
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC 576
Val Thr Val Ser .Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG 624
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACG AAG ACC TAC ACC TGC AAC 672
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
210 215 220
GTA Val 225 GAT Asp CAC His AAG Lys CCC Pro AGC Ser 230 AAC Asn ACC Thr AAG Lys GTG Val GAC Asp 235 AAG Lys AGA Arg GTT GAG TCC 720
Val Glu Ser 240
AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA TCA TGC CCA GCA CCT GAG TTC GAG GGG 768
Lys Tyr Gly Pro Pro cys Pro Ser cys Pro Ala Pro G1U Phe G1U Gly
245 250 255
GGA CCA TCA GTC TTC CTG TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACT CTC . ATG 816
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACG TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAG 864
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin
275 280 285
GAA GAC CCC GAG GTC CAG TTC AAC TGG TAC GTG GAT GGC GTG GAG GTG 912
G1U Asp Pro G1U Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val •
290 295 300
CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TTC AAC AGC ACG TAC 960
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAC GGC 1008
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GGC CTC CCG TCC TCC ATC 1056
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
340 345 350
GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA 7* CAG CCC CGA GAG CCA CAG GTG 1104
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg G1U Pro C-ln Val
355 360 365
TAC ACC CTG CCC CCA TCC CAG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC 1152
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
370 '375 380
CTG ACC TGC CTG GTC AAA. GGC TTC TAC CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG 1200
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC 1248
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AGG CTA ACC GTG 1296
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
420 425 430
GAC AAG AGC AGG TGG CAG GAG GGG AAT GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG 1344
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
··«« • · • ♦· ·· ·· · · ♦ 99 • « φ 9 999
9 9 9 99
9 9 99
999 9999 99999
CAT His GAG Glu 450 GCT Ala CTG Leu CAC His AAC Asn CAC His 455 TAC Tyr ACA Thr CAG Gin AAG Lys AGC Ser 460 CTC Leu TCC Ser CTG Leu TCT Ser 1392
CTG Leu 465 GGT Gly AAA Lys TGA * 1404
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 468 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
Met Lys 1 His Leu Trp 5 Phe Phe Leu Leu Leu 10 Val Ala Ala Pro Arg 15 Trp
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 3 0’
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 •40 45
Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp ph θ Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr
65 70 75 30
Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Leu· Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 no
Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Leu His Trp Leu Leu
115 120 125
Tyr Trp Gly Gin Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 13 5 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
145 150 155 160
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu· Pro
165 170 17 5
Val Thr Val Ser 180 Trp Asn Ser Gly
Phe Pro Ala 195 Val Leu Gin Ser Ser 200
Val Thr 210 Val Pro Ser Ser Ser 215 Leu
* Val 225 Asp His Lys Pro Ser 230 Asn Thr
Lys . Tyr Gly Pro Pro 245 Cys Pro Ser
Gly Pro Ser Val 260 Phe Leu Phe Pro
Ile Ser Arg 275 Thr Pro Glu Val Thr 280
Glu Asp 290 Pro Glu Val Gin Phe 295 Asn
His 305 Asn Ala Lys Thr Lys 310 Pro Arg
Arg Val Val Ser Val 325 Leu Thr Val
Lys Glu Tyr Lys 340 Cys Lys Val Ser
Glu Lys Thr 355 Ile Ser Lys Ala Lys 3 60
Tyr Thr 370 Leu Pro Pro Ser Gin 375 Glu
Leu 335 Thr Cys Leu Val Lys 390 Gly Phe
4 Trp Glu Ser Asn Gly 405 Gin Pro Glu
Val Leu Asp Ser 420 Asp Gly Ser Phe
Asp Lys Ser 435 Arg Trp Gin Glu Gly 440
His Glu 450 Ala Leu His Asn His 455 Tyr
Leu 465 Gly Lys *
• ·· • a a » a • · a • a · a a a · • · * ·4I· ·· tta a ta a a a a a · • · 9 • a • a ··· • a 99 99 a a 99 999 9 9 9 9 9 99 99
Ala 185 Leu Thr Ser Gly Val 190 His Thr
Gly Leu Tyr Ser Leu 205 Ser Ser Val
Gly Thr Lys Thr 220 Tyr Thr Cys Asn
Lys Val Asp 235 Lys Arg Val Glu Ser 240
Cys Pro 250 Ala Pro Glu Phe Glu 255 Gly
Pro 265 Lys Pro Lys Asp Thr 270 Leu Met
Cys Val Val Val Asp 285 Val Ser Gin
Trp Tyr Val Asp 300 Gly Val Glu Val
Glu Glu Gin 315 Phe Asn Ser Thr Tyr 320
Leu His 330 Gin Asp Trp Leu Asn 335 Gly
Asn 345 Lys Gly Leu Pro Ser 350 Ser Ile
Gly Gin Pro Arg Glu 365 Pro Gin Val
Glu Met Thr Lys 380 Asn Gin Val Ser
Tyr Pro Ser 395 Asp Ile Ala Val Glu 400
Asn Asn 410 Tyr Lys Thr Thr Pro 415 Pro
Phe 425 Leu Tyr Ser Arg Leu 430 Thr Val
Asn Val Phe Ser Cys 445 Ser Val Met
Thr Gin Lys Ser 460 Leu Ser Leu Ser
• ·· • to • ••to • to ··
toto · · • 9 • to · • •
• · • • ··· • · ··
• to • · • • · ··· • •
• to • • • • • •
• toto···· • to ··· ·· • ·
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1404 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: těžký řetězec gama 4 s mutací P a E (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...1404 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: hotový peptid (B) POZICE: 1...1404 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
ATG Met 1 AAA Lys CAC CTG TGG TTC Phe TTC Phe CTC Leu CTC CTG GTG GCA GCC CCC Pro AGA Arg 15 TGG Trp 48
His Leu Trp 5 Leu Leu 10 Val Ala Ala
GTC TTG TCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG 96
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin G1U Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC AGT GTC TCT GGT GGC TCC ATC 144
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 45
AGC GGT GAC TAT TAT TGG TTC TGG ATC CGC CAG TCC CCA GGG AAG GGA 192
Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Phe Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly
50 55 60
CTG GAG TGG ATC GGC TAC ATC TAT GGC AGT GGT GGG GGC ACC AAT TAC 240
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr
65 70 75 80
AAT ccc TCC CTC AAC AAT CGA GTC TCC ATT TCA ATA GAC ACG TCC AAG 288
Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys
85 90 95
AAC CTC TTC TCC CTG AAA CTG AGG TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG GCC 336
Asn Leu Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
• · ·· · · · · ·
100
GTC TAT TAC Tyr 115 TGT Cys GCG Ala AGT Ser AAT ATA TTG Leu AAA Lys TAT Tyr CTT Leu CAC His 125 TGG Trp TTA Leu TTA Leu 384
Val Tyr Asn Ile 120
TAC TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCT AGC ACC AAG 432
Tyr Trp Gly Gin Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
GGG CCA TCC GTC TTC CCC CTG GCG CCC TGC TCC AGG AGC ACC TCC GAG 480
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
145 150 155 160
AGC ACA GCC GCC C-TG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG 528
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC 576
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG 624
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACG AAG ACC TAC ACC TGC AAC 672
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
210 215 220
GTA GAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AGA GTT GAG TCC 720
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser'
225 230 23*5 240
AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA CCA TGC CCA GCA CCT GAG TTC GAG GGG 768
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
245 250 255
GGA CCA TCA GTC TTC CTG TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACT CTC ATG 816
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACG TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAG 864
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin
275 280 285
GAA GAC CCC GAG GTC CAG TTC AAC TGG TAC GTG GAT GGC GTG GAG GTG 912
Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TTC AAC AGC ACG TAC 960
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAC •GGC 1008
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
• · • ·
101
AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GGC CTC CCG TCC TCC ATC 1056
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
340 345 350
GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAG CCA CAG GTG 1104
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
355 360 365
TAC ACC CTG CCC CCA TCC CAG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC 1152
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu G1U Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
370 375 380
CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAC CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG 1200
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TÁC AAG ACC ACG CCT CCC 1248
Trp G1U Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AGG CTA ACC GTG 1296
Val Leu Asp Ser Asp Gly ' Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
420 425 430
GAC AAG AGC AGG TGG CAG GAG GGG AAT GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG 1344
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACA CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT 1392
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
1404
CTG GGT AAA TGA
Leu Gly Lys *
465 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 468 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
102 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
Met 1 Lys His Leu Trp 5 Phe Phe Leu Leu Leu 10 Val Ala Ala Pro Arg 15 Trp
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys·
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 45
Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Phe Trp Ile Arg Gin Ser. Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Leu Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 no
Val Tyr Tyr cys Ala Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Leu His Trp Leu Leu
115 120 125
Tyr Trp Gly Gin Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
13 0 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
145 150 155 160
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
130 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
19 5 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
210 215 220
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
225 230 235 240
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin
275 280 285
• ·
103
Glu Asp 290 Pro Glu Val Gin Phe 295 Asn Trp Tyr Val Asp 3 00 Gly Val Glu Val
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp .Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
420 425- 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Gly Lys *
65 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne
104 (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: vedoucí sekvence VH1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
ACTAAGTCGA CATGGACTGG ACCTGG 26 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: vedoucí sekvence VH2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
ACTAAGTCGA CATGGACATA CTTTGTTCCA C 31 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 29 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice φ φφ φφ φ φ φ φ φ · · • ·
105 (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: vedoucí sekvence VH3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
ACTAAGTCGA CATGGAGTTT GGGCTGAGC 29 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: vedoucí sekvence VH4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
ACTAAGTCGA CATGAAACAC CTGTGGTTCT T 31 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: vedoucí sekvence VH5 • · 9 ·
106 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
ACTAAGTCGA CATGGGGTCA ACCGCCATCC T (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: vedoucí sekvence VH6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
ACTAAGTCGA CATGTCTGTC TCCTTCCTCA T 31 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: vedoucí sekvence VH1 s místem Mlul (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
GGCAGCAGCY ACGCGTGCCC ACTCCGAGGT
107 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: vedoucí sekvence VH2 s místem Mlul (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
GACCGTCCCG ACGCGTGTYT TGTCCCAGGT 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: vedoucí sekvence VH3 s místem Mlul (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
GCTATTTTCACGCGTGTCCA GTGTGAG 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:
···· • · ·
108 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: vedoucí sekvence VH4 s místem Mlul (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:
GCGGCTCCCA CGCGTGTCCT GTCCCAG 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lir.eární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: vedoucí sekvence VH5 s místem Mlul (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
GGCTGTTCTC ACGCGTGTCT GTGCCGAGGT 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží ·· ···· • * « · ·· ·· • · · · • · ·· ··· · · ·· ·· • ···· ♦· •· •· •· • · ♦
• · · ···
109 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv)
OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (vili) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT:
Xhol
VH1, 3a, 5 primer s místem (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S
IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (vili) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: VH2 primer s místem Xhol (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:
CAGGTCAACT TACTCGAGTC TGG 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární ··♦« • 9 99 • 9 9 9 » 9 9« • 999 9 9
9 9
99 • 99 • 99 9 9 • 9·
9· ♦ ·999
110 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: VH3b primer s místem Xhol (xí) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
GAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGG 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: VH4 primer s místem Xhol (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice •4 4444
44
4 4
4·
444 4444
44
44 4 4
4 44
44
44444
44
4 44
444
4 44
44
4444
111 (vili) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: VH6 primer s místem Xhol (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:
CAGGTACAGC TGCTCGAGTC AGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: IgGl-4 primer s místem Nhel (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:
GGCGGATGCG CTAGCTGAGG AGACGG 26 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 38 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec kappa s místem BglII «* ··<··
112 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:
ATCACAGATC TCTCACCATG GTGTTGCAGA CCCAGGTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 37 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vili) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec kappa s místem BglII (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:
ATCACAGATC TCTCACCATG GRGWCCCCWG CKCAGCT 37 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 41 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec kappa s místem BglII (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:
ATCACAGATC TCTCACCATG GACATGAGGG TCCCCGCTCA G ····
113 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 41 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec kappa s místem BglII (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:
ATCACAGATC TCTCACCATG GACACVAGGG CCCCCACTCA G 41 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:
(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec lambda s místem BglII (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:
ATCACAGATC TCTCACCATG GCCTGGGCTC TGCTGCTCC • ·· φ* φφφφ φφ φφ φφ · φ φφφ φφφφ φ · φ φφφφ φ «φφ φ φφφφ φ φ φφφ φ φ • φ φφ « φφφ
ΦΦΦ ···· ·· φφφ φφ φφ
114 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec lambda s místem BglII (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:
ATCACAGATC TCTCACCATG GCCTGGGCTC CACTACTTC 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (vili) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec lambda s místem BglII (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:
ATCACAGATC TCTCACCATG ACCTGCTCCC CTCTCCTCC ♦· ··♦»
115 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec lambda s místem BglII (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:
ATCACAGATC TCTCACCATG GCCTGGACTC CTCTCTTTC 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 38 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec lambda s místem BglII (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:
ATCACAGATC TCTCACCATG ACTTGGACCC CACTCCTC
·* ·· ··
• · · • • · · • •
• · • ··· <· ♦ ··
e · · • • · ··♦ • •
• · • • · • •
* « « · · · · ··· »· ··
116 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec kappa s místy KpnI a BsiWl (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:
CCGTTTGATT TCCAGCTTGG TACCTCCACC GAACGT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec kappa s místy KpnI a BsiWl (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:
TGCAGCATCC GTACGTTTGA TTTCCAGCTT
117 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec lambda s místy HindlII a KpnI (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:
ACCTAGGACG GTAAGCTTGG TACCTCCGCC 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec lambda s místem KpnI (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:
ACCTAGGACG GTCASSTTGG TACCTCCGCC GAACAC
118 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: člověk nebo opice (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: primer pro lehký řetězec lambda s místem AvrlI (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:
CTTGGGCTGA CCTAGGACGG TCAGCCG 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: variabilní oblast VH1 těžkého řetězce (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:
CCATGGACTG GACCTGG 17 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina • · · ·· ···· ·· ·· • · · · ··· ···· • · · · · · · · · · · · ·· · · · ·· · · · ·· ·· · · · · ··· ···· ·· ··· ·· ··
119 (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
(li) TYP MOLEKULY: DNA (genomová)
(iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne
(viii) 1 POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: variabilní oblast VH2 těžkého řetězce (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:
ATGGACATAC TTTGTTCCAC 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: variabilní oblast VH3 těžkého řetězce (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:
CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (viii) POZICE V GENOMU:
• ·· · · ···· · · ·· ···· · · · ····
120 (A) CHROMOZOM/SEGMENT: variabilní oblast VH4 těžkého řetězce (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:
ATGAAACACC TGTGGTTCTT 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: variabilní oblast VH5 těžkého řetězce (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48:
ATGGGGTCAA CCGCCATCCT 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: variabilní oblast VH6 těžkého řetězce (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:
ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT ··· · • ·
121 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ív) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: konstantní oblast těžkého řetězce IgM (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:
TTGGGGCGGA TGCACT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: konstantní oblast těžkého řetězce IgGl-4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:
GATGGGCCCT TGGTGGA 17 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární • ·· ·· · · φ · φ φ φ φ φφφφ · · ♦ · · · · φ φ φ φφφφ φ φφφ φ φ φφ φ φφ φφφφ φ φφ ·· · φφφ φφφ φφφφ φφ ··· φφ φφ
122 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: variabilní oblast lehkého řetězce kappa (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:
GATGACCCAG TCTCCAKCCT C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: variabilní oblast lehkého řetězce lambda (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:
CTCAYTYRCT GCMCAGGGTC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: konstantní oblast lehkého řetězce kappa (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54:
AAGACAGATG GTGCAGCCA • ·· ····** 9 99 · ···· 9 9 9 9 9 99
9 9 9 999 9 999
9 99 9 99 99999
9 9 9 9 9 99
999 9999 99 999 9999
123 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:
(i.) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: konstantní oblast lehkého řetězce lambda (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:
GGAACAGAGT GACCGAGGGG 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: PCR primer pro lidskou konstantní oblast gama 4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:
GGGGGGATCC TCATTTACCC AGAGACAGGG 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) ·· ·« ··*·
124 (viii)
POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: PCR primer pro konstantní oblast gama 4 lidskou (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:
GGGGGCTAGC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT C (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 58:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 96 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: mutageneze PCR lidské gama 4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 58:
CCGGGAGATC ATGAGAGTGT CCTTGGGTTT TGGGGGGAAC AGGAAGACTG 50
ATGGTCCCCC CTCGAACTCA GGTGCTGGGC ATGGTGGGCA TGGGGG 96 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: mutageneze PCR lidské gama 4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:
TCCTCAGCTA GCACCAAGGG GCCATCC

Claims (32)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Chimérická protilátka specifická k lidskému CD4, která podstatně postrádá deplečni aktivitu pro T buňky, a která obsahuje sekvence variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce monoklonální protilátky opice Starého světa tvořené proti lidskému CD4, a lidské sekvence konstantních domén těžkého a lehkého řetězce.
  2. 2. Chimérická protilátka podle nároku 1, kde sekvence konstantní domény lidského těžkého řetězce jsou vybrány z (1) nemodifikovaných konstantních domén lidského izotypu gama 4, (2) konstantních domén izotypu gama 4, které byly modifikovány mutagenezou tak, aby se snížila vazba komplementu, vazba receptorů Fcyl a/nebo se zvýšila stabilita, a (3) konstantních domén izotypu gama 4 mutovaných v pozici 236 substitucí kyseliny glutamové leucinem a/nebo v pozici 229 substitucí prolinu serinem.
  3. 3. Chimérická protilátka podle nároku 1, kde sekvence vázající antigen variabilního těžkého a lehkého řetězce jsou vyloženy na obrázcích 1 a 2.
  4. 4. Chimérická protilátka podle nároku 1, která zahrnuje jednu nebo více z následujících vlastností: (i) postrádá nebo vykazuje sníženou vazebnou aktivitu receptorů Fc vzhledem k chimérickým protilátkám γΐ, (ii) projevuje sníženou nebo chybějící schopnost fixace komplementu, a (iii) projevuje pozměněný farmakokinetický profil.
    • · • 99 99 999999 • 9 99 999*999
    9 9 9 9*99 ·999 * 9 9 9 9 9 9 999 99
    99 9 9 9999 ··· 9999 99 *99 9999
    126
  5. 5. Chimérická protilátka podle nároku 1, která pozměňuje nebo reguluje imunitní funkce mající vztah k CD4 včetně navození anergie a apoptózy T buněk.
  6. 6. Chimérická protilátka anti-CD4, která je vybrána ze skupiny sestávající z CE9y4, CE9y4ÁK, CE9y4E a CE9y4PE.
    7. Rekombinantní podle nároku 1. DNA, která 8. Rekombinantní podle nároku 2. DNA, která 9. Rekombinantní podle nároku 3. DNA, která 10. Rekombinantní podle nároku 4. DNA, která
    kóduje chimérickou protilátku kóduje chimérickou protilátku kóduje chimérickou protilátku kóduj e chimérickou protilátku
    11. Rekombinantní DNA, která kóduje a zajišťuje expresi chimérické protilátky podle nároku 6.
    12. Způsob produkce chimérické protilátky specifické k CD4 vyznačující se tím, že obsahuje expresi rekombinantní DNA podle nároku
  7. 7 v rekombinantní hostitelské buňce.
    13. Způsob produkce chimérické protilátky specifické k CD4 vyznačující se tím, že obsahuje expresi rekombinantní DNA podle nároku
  8. 8 v rekombinantní hostitelské buňce.
    • · ····
    99 99
  9. 9 9 9 9
    9 9 99 • «♦ ·· · ·
    999 999 9
    9 99
    9 99 99
    9 9 99
    9 99
    99999
    127
  10. 14. Způsob produkce chimérické protilátky specifické k CD4 vyznačující se tím, že obsahuje expresi rekombinantní DNA podle nároku 9 v rekombinantní hostitelské buňce.
  11. 15. Způsob produkce chimérické protilátky specifické k CD4 vyznačující se tím, že obsahuje expresi rekombinantní DNA podle nároku 10 v rekombinantní hostitelské buňce.
  12. 16. Způsob produkce chimérické protilátky specifické k CD4 vyznačující se tím, že obsahuje expresi rekombinantní DNA podle nároku 11 v rekombinantní hostitelské buňce.
  13. 17. Způsob léčení nebo prevence stavu majícího vztah k CD4 vyznačující se tím, že obsahuje podávání terapeuticky nebo profylakticky účinného množství chimérické protilátky podle nároku 1.
  14. 18. Způsob léčení nebo prevence stavu majícího vztah k CD4 vyznačující se tím, že obsahuje podávání terapeuticky nebo profylakticky účinného množství chimérické protilátky podle nároku 2.
  15. 19. Způsob léčení nebo prevence stavu majícího vztah k CD4 vyznačující se tím, že obsahuje podávání terapeuticky nebo profylakticky účinného množství chimérické protilátky podle nároku 3.
  16. 20. Způsob léčení nebo prevence stavu majícího vztah k CD4 vyznačující se tím, že obsahuje podávání • * ··« · • · • · · a
    128 terapeuticky nebo profylakticky účinného množství chimérické protilátky podle nároku 4.
  17. 21. Způsob léčení nebo prevence stavu majícího vztah k CD4 vyznačující se tím, že obsahuje podávání terapeuticky nebo profylakticky účinného množství chimérické protilátky podle nároku 6.
  18. 22. Způsob podle nároku 16 vyznačujícíse tím, že stav mající vztah k CD4 je autoimunitní porucha.
  19. 23. Způsob podle nároku 17 vyznačujícíse tím, že stav mající vztah k CD4 je autoimunitní porucha.
  20. 24. Způsob podle nároku 18 vyznačujícíse tím, že stav mající vztah k CD4 je autoimunitní porucha.
  21. 25. Způsob podle nároku 19 vyznačujícíse tím, že stav mající vztah k CD4 je autoimunitní porucha.
  22. 26. Způsob podle nároku 20 vyznačujícíse tím, že stav mající vztah k CD4 je autoimunitní porucha.
  23. 27. Způsob podle nároku 21 vyznačujícíse tím, že autoimunitní porucha je revmatoidní artritida, zánětlivá střevní nemoc, psoriáza, diabetes mellitus závislý na inzulínu, systémový lupus erytematosus, cirhóza a sclerosis multiplex.
  24. 28. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že autoimunitní porucha je revmatoidní artritida, zánětlivá střevní nemoc, psoriáza, diabetes mellitus závislý • · ··· ·
    129
    na inzulínu, systémový lupus erytematosus, cirhóza a sclerosis multiplex. 29. Způsob podle nároku 23 v yznačuj i cl se t i m, že autoimunitní porucha je revmatoidní artritida,
    zánětlivá střevní nemoc, psoriáza, diabetes mellitus závislý na inzulínu, systémový lupus erytematosus, cirhóza a sclerosis multiplex.
  25. 30. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že autoimunitní porucha je revmatoidní artritida, zánětlivá střevní nemoc, psoriáza, diabetes mellitus závislý na inzulínu, systémový lupus erytematosus, cirhóza a sclerosis multiplex.
  26. 31. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že autoimunitní porucha je revmatoidní artritida, zánětlivá střevní nemoc, psoriáza, diabetes mellitus závislý na inzulínu, systémový lupus erytematosus, cirhóza a sclerosis multiplex.
  27. 32. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že uvedený stav je porucha jiné povahy než autoimunitní, vybraná ze skupiny sestávající z leukémie, lymfomu, reakce štěpu proti hostiteli, astmatu, transplantační rejekce· a infekce HIV.
  28. 33. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že uvedený stav je porucha jiné povahy než autoimunitní, vybraná ze skupiny sestávající z leukémie, lymfomu, reakce štěpu proti hostiteli, astmatu, transplantační rejekce a infekce HIV.
    •Φ ··«·
    130
  29. 34. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že uvedený stav je porucha jiné povahy než autoimunitní, vybraná ze skupiny sestávající z leukémie, lymfomu, reakce štěpu proti hostiteli, astmatu, transplantační rejekce a infekce HIV.
  30. 35. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že uvedený stav je porucha jiné povahy než autoimunitní, vybraná ze skupiny sestávající z leukémie, lymfomu, reakce štěpu proti hostiteli, astmatu, transplantační rejekce a infekce HIV.
  31. 36. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že uvedený stav je porucha jiné povahy než autoimunitní, vybraná ze skupiny sestávající z leukémie, lymfomu, reakce štěpu proti hostiteli, astmatu, transplantační rejekce a infekce HIV.
  32. 37. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že uvedený stav je zprostředkován buňkami CD4+ nebo se jich týká.
CZ1998586A 1995-09-06 1996-09-05 Rekombinantní protilátky anti-CD4 pro humánní terapii a způsoby jejich produkce CZ291036B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/523,894 US6136310A (en) 1991-07-25 1995-09-06 Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ58698A3 true CZ58698A3 (cs) 1998-08-12
CZ291036B6 CZ291036B6 (cs) 2002-12-11

Family

ID=24086874

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1998586A CZ291036B6 (cs) 1995-09-06 1996-09-05 Rekombinantní protilátky anti-CD4 pro humánní terapii a způsoby jejich produkce

Country Status (23)

Country Link
US (5) US6136310A (cs)
EP (1) EP0854885B1 (cs)
JP (1) JP3619866B2 (cs)
KR (1) KR100491222B1 (cs)
CN (1) CN100391978C (cs)
AP (1) AP1193A (cs)
AT (1) ATE348113T1 (cs)
AU (1) AU717674B2 (cs)
BG (1) BG64651B1 (cs)
BR (1) BR9610404A (cs)
CA (1) CA2231182A1 (cs)
CZ (1) CZ291036B6 (cs)
DE (1) DE69636760T2 (cs)
HU (1) HU221351B1 (cs)
IL (1) IL123447A0 (cs)
MX (1) MX9801732A (cs)
NO (1) NO324497B1 (cs)
NZ (1) NZ316835A (cs)
OA (1) OA10671A (cs)
RO (1) RO120198B1 (cs)
RU (1) RU2232773C2 (cs)
SK (1) SK27998A3 (cs)
WO (1) WO1997009351A1 (cs)

Families Citing this family (156)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136310A (en) * 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
US6440418B1 (en) * 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
EP0938334A4 (en) * 1996-07-26 2004-12-15 Smithkline Beecham Corp IMPROVED METHOD FOR TREATING IMMUNE-MEDIATED SYSTEMIC DISEASES
GB9624038D0 (en) * 1996-11-19 1997-01-08 Sandoz Ltd Organic compounds
US7033589B1 (en) * 1997-02-20 2006-04-25 Biogen Idec Ma Inc. γ-1 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
US6893636B2 (en) * 1997-02-20 2005-05-17 Biogen Idec Ma Inc. Gamma-1 and gamma-3 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
AU3044697A (en) * 1997-06-24 1999-01-04 Norman Godin A composition for specific immunoprotection and method for obtaining said comp osition
US6057128A (en) * 1998-03-17 2000-05-02 Genetics Institute, Inc. MU-1, member of the cytokine receptor family
US7189400B2 (en) 1998-03-17 2007-03-13 Genetics Institute, Llc Methods of treatment with antagonists of MU-1
US7198789B2 (en) * 1998-03-17 2007-04-03 Genetics Institute, Llc Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity
US6528624B1 (en) * 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HUP0104865A3 (en) * 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US20020028178A1 (en) * 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
WO2001068133A1 (en) * 2000-03-14 2001-09-20 Genetics Institute, Inc. Use of rapamycin and agents that inhibit b7 activity in immunomodulation
US20030012781A1 (en) * 2000-06-06 2003-01-16 Anderson Darrell Non-agonistic antibodies to human gp39, compositions containing, and therapeutic use thereof
US20020159996A1 (en) * 2001-01-31 2002-10-31 Kandasamy Hariharan Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
US20030211107A1 (en) * 2002-01-31 2003-11-13 Kandasamy Hariharan Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
US20070065436A1 (en) * 2001-01-31 2007-03-22 Biogen Idec Inc. Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies
US20030103971A1 (en) * 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
AR035779A1 (es) * 2001-02-06 2004-07-14 Genetics Inst Llc Polipeptidos de fusion derivados de glicoproteina ib alfa de plaqueta y metodos de uso de los mismos
US6972324B2 (en) 2001-05-18 2005-12-06 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Antibodies specific for CD44v6
US7541443B2 (en) * 2001-06-14 2009-06-02 Tolerrx, Inc. Anti-CD4 antibodies
GB2376466A (en) * 2001-06-14 2002-12-18 Mark Frewin TRX1 antibody
CA2452005C (en) * 2001-07-10 2011-03-15 Idec Pharmaceutical Corporation Inhibition of apoptosis process and improvement of cell performance
GB2380127A (en) * 2001-09-26 2003-04-02 Isis Innovation Treatment of chronic joint inflammation
EP1432431B1 (en) 2001-10-04 2017-05-10 Genetics Institute LLC Methods and compositions for modulating interleukin-21 activity
MXPA04004634A (es) 2001-11-16 2004-08-12 Idec Pharma Corp Expresion policistronica de anticuerpos.
US20050069549A1 (en) 2002-01-14 2005-03-31 William Herman Targeted ligands
EP1572936A2 (en) * 2002-03-05 2005-09-14 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
US20030180292A1 (en) * 2002-03-14 2003-09-25 Idec Pharmaceuticals Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US20040016010A1 (en) * 2002-04-17 2004-01-22 Marion Kasaian IL-21 receptor knockout animal and methods of use thereof
AU2003233008B2 (en) * 2002-04-22 2008-04-24 Recopharma Ab Fusion polypeptides and methods for inhibiting microbial adhesion
US20040001844A1 (en) * 2002-04-22 2004-01-01 Jan Holgersson Lewis Y epitope-containing mucin fusion polypeptide vaccines, compositions and methods of use thereof
EP1517700B1 (en) * 2002-04-22 2012-03-28 Recopharma AB Mucin fusion polypeptide vaccines, compositions and methods of use thereof
BR0312738A (pt) * 2002-07-15 2007-06-26 Wyeth Corp processos e composições para a modulação do desenvolvimento e da função de células t auxiliares (th)
NZ538629A (en) * 2002-08-09 2008-05-30 Recopharma Ab Mucin-immunoglobulin fusion proteins
CN101152573A (zh) * 2002-09-27 2008-04-02 唐纳士公司 用于预防和治疗获得性免疫缺陷综合症的协同组合物
SI2891666T1 (sl) * 2002-10-16 2017-11-30 Purdue Pharma L.P. Protitelesa, ki vežejo s celicami povezan antigen CA 125/O722P, in metoda za njihovo uporabo
KR20110140142A (ko) * 2002-10-17 2011-12-30 젠맵 에이/에스 Ｃｄ20에 대한 인간 모노클로날 항체
JP4033390B2 (ja) * 2002-10-30 2008-01-16 独立行政法人科学技術振興機構 不死化ナチュラルキラー細胞株
EP1460088A1 (en) 2003-03-21 2004-09-22 Biotest AG Humanized anti-CD4 antibody with immunosuppressive properties
WO2004089988A2 (en) * 2003-04-03 2004-10-21 Protein Design Labs, Inc Inhibitors of integrin alpha5beta1 and their use for the control of tissue granulation
ZA200510331B (en) 2003-06-11 2007-03-28 Wyeth Corp Platelet glycoprotein IB alpha variant fusion polypeptides and methods of use thereof
GB2406094B (en) * 2003-09-17 2007-06-06 Antisoma Plc Modified antibody comprising an amino acid substitution mutation which confers increased stability
US20070212301A1 (en) * 2003-11-07 2007-09-13 Amgen, Inc. Monkey Immunoglobulin Sequences
JP5848861B2 (ja) * 2004-04-20 2016-01-27 ジェンマブ エー／エスＧｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ Ｃｄ２０に対するヒトモノクローナル抗体
CA2568336A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-22 Genentech, Inc. Method for treating lupus
JP2008508885A (ja) * 2004-08-05 2008-03-27 ワイス インターロイキン−２１受容体活性を中和すること
JP2008517073A (ja) * 2004-10-14 2008-05-22 レコファーマ アーベー Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ付着およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ感染を阻害するための組成物ならびに方法
US7589182B1 (en) 2005-01-07 2009-09-15 Los Alamos National Security, Llc Anti-sulfotyrosine antibodies
US20060193849A1 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Antisoma Plc Biological materials and uses thereof
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
GT200600148A (es) * 2005-04-14 2006-11-22 Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis
JP2009517339A (ja) * 2005-11-01 2009-04-30 ノバルティス アーゲー 抗ｃｄ４０抗体の使用
US20090202531A1 (en) * 2005-11-01 2009-08-13 Novartis Ag Uses of anti-cd40 antibodies
WO2007054183A1 (en) * 2005-11-10 2007-05-18 Schering Aktiengesellschaft Reduction of restenosis
BRPI0618488A2 (pt) * 2005-11-10 2011-08-30 Receptor Biologix Inc proteìnas de fusão de ìntron de fator de crescimento de hepatócito
US7495097B2 (en) * 2005-11-23 2009-02-24 Brown University Rhodium quinonoid catalysts
EP1806365A1 (en) 2006-01-05 2007-07-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
US20090181041A1 (en) * 2006-01-23 2009-07-16 Jan Holgersson Production of proteins carrying oligomannose or human-like glycans in yeast and methods of use thereof
WO2007087420A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 Recopharma Ab Production of proteins carrying oligomannose or human-like glycans in yeast and methods of use thereof
EP2264060B1 (en) 2006-01-26 2014-04-23 Recopharma AB Compositions and methods for inhibiting viral adhesion
JP2009530290A (ja) * 2006-03-16 2009-08-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｃｄ４抗体を使用するループスの治療方法
US20080279848A1 (en) * 2006-03-16 2008-11-13 Genentech, Inc. Methods of treating lupus using CD4 antibodies
TW200806317A (en) * 2006-03-20 2008-02-01 Wyeth Corp Methods for reducing protein aggregation
SG171598A1 (en) 2006-03-23 2011-06-29 Absorber Ab Blood group antigens of different types for diagnostic and therapeutic applications
EP2009101B1 (en) 2006-03-31 2017-10-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
EP2006381B1 (en) 2006-03-31 2016-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
SG172692A1 (en) * 2006-06-12 2011-07-28 Symphogen As Pan-cell surface receptor- specific therapeutics
TW200817438A (en) * 2006-08-17 2008-04-16 Hoffmann La Roche A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide
US20090143288A1 (en) * 2007-03-13 2009-06-04 Roche Palo Alto Llc Peptide-complement conjugates
LT2125894T (lt) 2007-03-22 2019-03-25 Biogen Ma Inc. Prisijungiantys baltymai, įskaitant antikūnus, antikūno dariniai ir antikūno fragmentai, kurie specifiškai suriša cd154, ir jų panaudojimas
TW200902708A (en) * 2007-04-23 2009-01-16 Wyeth Corp Methods of protein production using anti-senescence compounds
WO2008134046A1 (en) * 2007-04-27 2008-11-06 Genentech, Inc. Potent, stable and non-immunosuppressive anti-cd4 antibodies
CL2008002092A1 (es) 2007-07-20 2009-05-29 Hoffmann La Roche Conjugado que contiene dos o mas peptidos antifusogenicos y un anticuerpo anti-cd-4; metodo de produccion; composicion farmaceutica que lo comprende; polipeptidos antifusogenicos y uso del conjugado para tratar infecciones viricas.
JP5334319B2 (ja) 2007-09-26 2013-11-06 中外製薬株式会社 Ｃｄｒのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
ES2566957T3 (es) 2007-09-26 2016-04-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
US20100278801A1 (en) * 2007-10-16 2010-11-04 Shepard H Michael Compositions comprising optimized her1 and her3 multimers and methods of use thereof
JP5682995B2 (ja) 2007-12-05 2015-03-11 中外製薬株式会社 抗ｎｒ１０抗体、およびその利用
ES2610327T3 (es) 2008-03-13 2017-04-27 Biotest Ag Régimen de dosificación de anticuerpos anti-CD4 para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias
BRPI0909048A2 (pt) * 2008-03-13 2015-11-24 Biotest Ag composição farmacêutica, e, método de tratamento de uma doença autoimune
ES2569217T3 (es) 2008-03-13 2016-05-09 Biotest Ag Agente para tratar enfermedades
US20090280134A1 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 Recopharma Ab Compositions and methods for inhibiting toxin a from clostridium difficile
AU2009245358A1 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 Recopharma Ab Compositions and methods for inhibiting shiga toxin and shiga-like toxin
RU2535340C2 (ru) * 2008-05-23 2014-12-10 Аргос Терапьютикс, Инк. Новые растворимые полипептиды cd83, композиции и способы их применения
TW201016233A (en) * 2008-07-15 2010-05-01 Genentech Inc Methods of treating autoimmune diseases using CD4 antibodies
AU2009282413B2 (en) 2008-08-11 2014-07-17 Nektar Therapeutics Multi-arm polymeric alkanoate conjugates
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
RU2531548C2 (ru) * 2008-09-29 2014-10-20 Биотест Аг Композиция для лечения заболевания
ES2699434T3 (es) * 2008-10-31 2019-02-11 Wyeth Llc Purificación de proteínas ácidas utilizando cromatografía de hidroxiapatita cerámica
PT2374883T (pt) 2008-12-26 2016-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Anticorpo anti-cd4
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
TWI682995B (zh) 2009-03-19 2020-01-21 日商中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
CA2761891A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-axl antibody
IN2012DN01328A (cs) 2009-08-13 2015-06-05 Crucell Holland Bv
WO2011035205A2 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Calmune Corporation Antibodies against candida, collections thereof and methods of use
JP5837821B2 (ja) 2009-09-24 2015-12-24 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US9260517B2 (en) 2009-11-17 2016-02-16 Musc Foundation For Research Development Human monoclonal antibodies to human nucleolin
GB0920944D0 (en) 2009-11-30 2010-01-13 Biotest Ag Agents for treating disease
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
FR2958936A1 (fr) 2010-04-14 2011-10-21 Sanofi Aventis Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
WO2011133636A1 (en) * 2010-04-20 2011-10-27 Cedars-Sinai Medical Center COMBINATION THERAPY WITH CD4 LYMPHOCYTE DEPLETION AND mTOR INHIBITORS
EP2591000B1 (en) 2010-07-09 2017-05-17 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use
UY33578A (es) * 2010-08-31 2012-03-30 Sanofi Sa PÉPTIDO O COMPLEJO PEPTÍDICO QUE SE UNE A INTEGRINA a(ALFA) Y MÉTODOS Y USOS QUE IMPLICAN A LOS MISMOS
EP2471543A1 (en) 2010-12-02 2012-07-04 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Tolerance induction or immunosupression to prevent in particular Graft-versus-Host-Disease (GvHD) by short-term pre-incubation of transplanted cell suspensions, tissues or organs coated with ligands to cell surface molecules
JP2014501748A (ja) 2010-12-21 2014-01-23 リコファーマ アーベー 涙代用物
US10894087B2 (en) 2010-12-22 2021-01-19 Nektar Therapeutics Multi-arm polymeric prodrug conjugates of cabazitaxel-based compounds
US20130331443A1 (en) 2010-12-22 2013-12-12 Nektar Therapeutics Multi-arm polymeric prodrug conjugates of taxane-based compounds
AU2011347250B2 (en) 2010-12-23 2015-06-04 Sanofi Robo1-Fc fusion protein for use in the treatment of hepatocarcinoma
SG193554A1 (en) 2011-03-29 2013-11-29 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
US20140088021A1 (en) 2011-05-27 2014-03-27 Nektar Therapeutics Water-Soluble Polymer-Linked Binding Moiety and Drug Compounds
EP3378489A1 (en) 2011-10-26 2018-09-26 Elanco Tiergesundheit AG Monoclonal antibodies and methods of use
WO2014008391A1 (en) 2012-07-05 2014-01-09 Genentech, Inc. Expression and secretion system
AU2013288641B2 (en) 2012-07-13 2017-07-06 Roche Glycart Ag Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
US9234035B2 (en) 2012-10-22 2016-01-12 Fountain Biopharma Inc. Antibodies to interleukin-6
DK2948134T3 (da) 2013-01-24 2020-06-02 Palvella Therapeutics Inc Sammensætninger til transdermal indgivelse af mtor-inhibitorer
WO2014135984A2 (en) 2013-03-07 2014-09-12 Recopharma Ab Glycosylated mucin-immunoglobulin fusion protein coated device
US20160108122A1 (en) * 2013-05-23 2016-04-21 Idac Theranostics, Inc. Therapeutic or prophylactic agent for immunodeficiency virus infection
EP3019193B1 (en) * 2013-07-10 2019-09-25 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Apoptotic cell-mediated induction of antigen specific regulatory t-cells for the therapy of autoimmune diseases in animals and humans
KR102441231B1 (ko) 2013-09-27 2022-09-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법
CN105979961B (zh) 2014-02-05 2020-12-18 西达-赛奈医疗中心 用于治疗癌症和感染性疾病的方法和组合物
ES2967627T3 (es) 2015-02-27 2024-05-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composición para tratar enfermedades relacionadas con IL-6
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
CN106188292B (zh) * 2015-05-05 2019-09-24 北京傲锐东源生物科技有限公司 抗cd4蛋白单克隆抗体及其用途
BR112018009312A8 (pt) 2015-12-28 2019-02-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd método para promover eficiência de purificação de polipeptídeo contendo região de fc
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
JP7108631B2 (ja) 2017-01-06 2022-07-28 パルヴェラ セラピューティクス、インク． ｍＴＯＲ阻害剤の無水組成物およびその使用方法
EP3354278A1 (en) 2017-01-31 2018-08-01 Sanofi Neuronal cell protective effect of antibodies specific for the protofibrillar form of the beta-amyloid peptide
CN108690138A (zh) * 2017-04-12 2018-10-23 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
WO2019160907A1 (en) * 2018-02-14 2019-08-22 University Of Virginia Patent Foundation Regulating cd4+ t cells to treat clostridium difficile infection
CN116327926A (zh) 2018-03-15 2023-06-27 中外制药株式会社 对寨卡病毒具有交叉反应性的抗登革热病毒抗体及使用方法
JP2021530463A (ja) 2018-07-02 2021-11-11 パルヴェラ セラピューティクス、インク． ｍＴＯＲ阻害剤の無水組成物および使用方法
CN113248612A (zh) * 2020-02-13 2021-08-13 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-1抗体在治疗神经内分泌瘤中的用途
CN113244386A (zh) * 2020-02-13 2021-08-13 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-1抗体在治疗肿瘤中的用途
CN113045661B (zh) * 2021-04-07 2022-06-21 中美冠科生物技术（太仓）有限公司 新型抗cd4抗体
US20240344083A1 (en) 2021-08-04 2024-10-17 Sana Biotechnology, Inc. Use of cd4-targeted viral vectors
US20250059560A1 (en) 2021-12-16 2025-02-20 Sana Biotechnology, Inc. Methods and systems of particle production
EP4463135A2 (en) 2022-01-10 2024-11-20 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
EP4473097A1 (en) 2022-02-02 2024-12-11 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023168426A1 (en) 2022-03-03 2023-09-07 Enosi Therapeutics Corporation Compositions and cells containing mixtures of oligo-trap fusion proteins (ofps) and uses thereof
US20250222027A1 (en) 2022-04-01 2025-07-10 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
WO2024026377A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Sana Biotechnology, Inc. Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors
WO2024044655A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Sana Biotechnology, Inc. Delivery of heterologous proteins
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
EP4622631A1 (en) 2022-11-23 2025-10-01 University of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of use thereof for increasing immune responses
EP4627096A1 (en) 2022-12-02 2025-10-08 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same
WO2024186690A2 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Enosi Therapeutics Corporation Oligo-trap fusion proteins (ofps) and uses thereof
WO2024220597A2 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Digital droplet based assay for detecting replication competent lentiviral vector
WO2024243340A1 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Sana Biotechnology, Inc. Tandem fusogens and related lipid particles
WO2025104604A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Anti-respiratory syncytial virus antibodies and uses thereof
GB202401501D0 (en) 2024-02-05 2024-03-20 T Balance Therapeutics Gmbh Medical use of regulatory t cell activator
WO2025184529A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles with fusogen display and related compositions and methods

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
RU2014845C1 (ru) * 1987-03-23 1994-06-30 Хайвер Лимитед Способ получения вакцины против спида
US4978745A (en) 1987-11-23 1990-12-18 Centocor, Inc. Immunoreactive heterochain antibodies
US4975369A (en) * 1988-04-21 1990-12-04 Eli Lilly And Company Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen
DE3814887C1 (cs) * 1988-05-02 1989-09-21 Medice Chem.-Pharm. Fabrik Puetter Gmbh & Co Kg, 5860 Iserlohn, De
IL162181A (en) * 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
CA2045583A1 (en) * 1989-01-18 1990-07-19 Norman L. Letvin Compositions and methods for treating or preventing aids, arc and hiv infection
US5690933A (en) * 1989-05-31 1997-11-25 Glaxo Wellcome Inc. Monoclonal antibodies for inducing tolerance
GB8912497D0 (en) * 1989-05-31 1989-07-19 Cobbold Stephen P Monoclonal antibodies
JPH0353894A (ja) * 1989-07-21 1991-03-07 Calpis Food Ind Co Ltd:The 抗ヒトｃｄ４ペプチドに対するモノクローナル抗体
US5120642A (en) * 1989-11-28 1992-06-09 Coulter Corporation Monoclonal antibody which distinguishes helper inducer and suppressor inducer cd4+ lymphocytes
US5308839A (en) * 1989-12-04 1994-05-03 The Research Foundation Of State University Of New York Composition comprising non-steroidal anti-inflammatory agent tenidap and effectively non-antibacterial tetracycline
IE65341B1 (en) * 1990-11-08 1995-10-18 Fujisawa Pharmaceutical Co Suspensions containing tricyclic compounds
WO1993002190A1 (en) * 1991-07-15 1993-02-04 The Wellcome Foundation Limited Production of antibodies
US6136310A (en) * 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
IE922437A1 (en) * 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
DE69233011T2 (de) 1991-07-25 2003-11-06 Idec Pharmaceuticals Corp., San Diego Rekombinante antikörper zur humanen therapie
US5756096A (en) * 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
DE69312077T2 (de) * 1992-10-08 1997-10-30 Kennedy Inst Of Rheumatology Behandlung von autoimmun- und entzundungskrankheiten
US6024957A (en) * 1993-06-02 2000-02-15 Research Corporation Technologies, Inc. Immunomodulators and methods for the prevention and reversal of organ transplant rejection using same
US5691183A (en) * 1993-07-07 1997-11-25 University Technology Corporation CD4+ T-lymphoctye proteases and genes encoding said proteases

Also Published As

Publication number Publication date
OA10671A (en) 2002-11-25
NO980915D0 (no) 1998-03-03
WO1997009351A1 (en) 1997-03-13
CZ291036B6 (cs) 2002-12-11
DE69636760D1 (de) 2007-01-25
KR100491222B1 (ko) 2006-03-14
BG102343A (en) 1999-04-30
KR19990044436A (ko) 1999-06-25
US20090221036A1 (en) 2009-09-03
BG64651B1 (bg) 2005-10-31
US20030077275A1 (en) 2003-04-24
RO120198B1 (ro) 2005-10-28
EP0854885A1 (en) 1998-07-29
HU221351B1 (en) 2002-09-28
NO980915L (no) 1998-05-06
JP3619866B2 (ja) 2005-02-16
US7338658B2 (en) 2008-03-04
CA2231182A1 (en) 1997-03-13
AU6916296A (en) 1997-03-27
RU2232773C2 (ru) 2004-07-20
MX9801732A (es) 1998-08-30
EP0854885B1 (en) 2006-12-13
EP0854885A4 (en) 2002-12-04
HK1016995A1 (zh) 1999-11-12
ATE348113T1 (de) 2007-01-15
AP9801209A0 (en) 1998-03-31
IL123447A0 (en) 1998-09-24
JPH11514216A (ja) 1999-12-07
HUP9802212A2 (hu) 1999-01-28
HUP9802212A3 (en) 2001-02-28
BR9610404A (pt) 1999-07-06
SK27998A3 (en) 1998-11-04
CN100391978C (zh) 2008-06-04
US20090226430A1 (en) 2009-09-10
US7452534B1 (en) 2008-11-18
US6136310A (en) 2000-10-24
AP1193A (en) 2003-08-01
NO324497B1 (no) 2007-10-29
NZ316835A (en) 1999-09-29
CN1200737A (zh) 1998-12-02
AU717674B2 (en) 2000-03-30
DE69636760T2 (de) 2007-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ58698A3 (cs) Rekombinantní protilátky anti-CD4 pro humánní terapii a způsoby jejich produkce
US5756096A (en) Recombinant antibodies for human therapy
US5750105A (en) Recombinant antibodies for human therapy
AP307A (en) Recombinant antibodies for human therapy.
HK1016995B (en) Recombinant anti-cd4 antibodies for human therapy
HK1096708A (en) Recombinant antibodies for human therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20100905