JPH11514216A - ヒト治療のための組換え抗ｃｄ４抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトＣＤ４抗原に特異的なキメラ抗体、該抗体をコードするＤＮＡ、該抗体を含む医薬組成物、および治療剤としてのその使用が教示される。これらキメラ抗体は、旧世界サル可変配列およびヒト定常ドメイン配列、好ましくはヒトガンマ１、ガンマ４またはその変異体を含む。これら抗体は、低い免疫原性、低減した（または欠失した）Ｔ細胞枯渇活性、ヒトＣＤ４に対する良好な親和性および高い安定性（インビボ半減期）を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト治療のための組換え抗ＣＤ４抗体 発明の技術分野 この出願は、米国特許出願第０８／４７６,２３７号（該出願は１９９５年１ 月２５日に出願された米国特許出願第０８／３９７,０７２号（該出願は１９９ ２年７月１０日に出願された米国特許出願第０７／９１２,２９２号（該出願は １９９２年３月２３日に出願されたニューマン（Ｎewman）らの米国特許出願第 ０７／８５６,２８１号（該出願は１９９１年７月２５日に出願された米国特許 出願第０７／７３５,０６４号の一部継続出願である）の一部継続出願である） の継続出願である）の一部継続出願である）の一部継続出願である（その図面も 含めて全体を参照のため本明細書中に引用する）。本発明は、ヒト治療に有用な ＣＤ４に特異的な組換え抗体、および該抗体の製造方法に関する。 発明の背景 ＣＤ４は、胸腺細胞の大部分および末梢Ｔ細胞の一部を含むＴリンパ球系列の 細胞の表面で主として発現される表面糖タンパク質である。ＣＤ４はまた幾つか の非リンパ性細胞によっても低レベルで発現されるが、そのような多様な細胞分 布の機能的意義は未知である。成熟Ｔ細胞上では、ＣＤ４は抗原提示細胞で発現 されるＭＨＣクラスII分子との相互作用を通じて共認識（co-recognition）機能 を果たす。ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫感染に対する Ｔ依存性応答の間にＴ細胞およびＢ細胞の機能を制御するヘルパーサブセットを 主として構成する。 自己免疫疾患の発病の間、とりわけ自己抗原に対する寛容が破壊されたときに 、ＣＤ４⁺Ｔ細胞は炎症応答に関与し、その結果、関節および組織の破壊となる 。これらプロセスは、造血系列の炎症細胞の補充、抗体、炎症性サイトカインお よびメディエーターの産生、およびキラー細胞の活性化により容易となる。 滑膜の炎症疾患である慢性関節リウマチ（ＲＡ）は自己免疫現象の一つの現れ であり、関節の糜爛、変形および破壊という結果になる。ほとんどの自己免疫疾 患と同様に、ＲＡの病因は充分に定められていない。しかしながら、ＲＡは罹患 した関節中での活性化ＣＤ４⁺Ｔリンパ球レベルが上昇している特徴を有するこ とが知られている。現在のところＲＡの治療法は存在しない。ＲＡの第一系列（ line）の療法は、ＲＡ症状の寛解をもたらし、短期間の機能的な能力を改善する ことに向けられている。基礎疾患を標的としたアザチオプリン、メトトレキセー トおよびプレドニゾロンなどの第二および第三系列の免疫抑制剤は一層重篤なケ ースで投与され、その有効性は穏やかにすぎないかまたは慢性療法で受け入れ難 い毒性を示すかのいずれかである。これらはまた、関節の破壊から保護すること はない。 ＲＡとは別に、ＣＤ４⁺細胞は、乾癬、インスリン依存性糖尿病、全身性エリ テマトーデスおよび炎症性腸疾患を含む他の慢性状態にも関与している。さらに 、ＣＤ４発現は他の自己免疫疾患に関与している可能性もある。 Ｔ細胞が自己免疫疾患の進行および維持に関与しているとするならば、免疫抑 制は重要な治療戦略となる。サイクロスポリンＡなどの利用可能な免疫抑制剤は 、移植拒絶の治療に使用するのに成功している。しかしながら、その毒性のある 副作用は免疫抑制剤による自己免疫疾患の慢性療法を受け入れ難くしている。 臨床現場におけるＣＤ４⁺サブセットを含む全Ｔ細胞集団の枯渇は、胸管排液 法、全リンパ放射線療法およびリンホフェレシス（lymphopheresis）を含む方法 により行われ、ある種の患者において臨床的改善を得ている。しかしながら、現 在の戦略は、正味の（solid）臓器毒性や主要な副作用を引き起こすことなく不 必要な免疫応答を阻止する一層選択的な薬剤に向けられている。この可能性を達 成しうる一つの方法は、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を用いた疾患媒体Ｔ細 胞の選択的除去または不活化によるものである。ＣＤ４に対するモノクローナル 抗体は、そのような一つの戦略である。自己免疫および臓器移植の動物モデルに おいて、抗ＣＤ４モノクローナル抗体は予防的または治療的に投与した場合に疾 患の進行を阻止あるいは逆転させる。さらに、ＲＡ、乾癬、炎症性腸疾患および 全身性脈管炎における抗ＣＤ４モノクローナル抗体を用いた幾つかの臨床的試み から得られた初期の結果は、潜在的な治療効能の幾つかの予備的な証拠を提供し ている。 本質的に、抗ＣＤ４モノクローナル抗体療法の目的は、とりわけ自己免疫疾患 の急性期にＣＤ４⁺細胞の自己破壊活性を阻止することである。最終的な治療目 標は、日和見感染に対する正常な宿主の防御を損なうことなく、基礎疾患を保持 している障害性（insulting）抗原（または特定の組織）に対する免疫不応答（ アネルギー）または長期にわたる寛容の状態を付与することにある。ＲＡ以外に も、ＣＤ４モノクローナル抗体は、他の自己免疫疾患、たとえばインスリン依存 性糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性腸疾患および多発性硬化症の 治療にも有益である。 免疫療法剤としての抗ＣＤ４モノクローナル抗体の重要性のため、多くの企業 や研究者グループが抗ＣＤ４モノクローナル抗体を潜在的な治療剤として報告し ている。たとえば、セントコール（Ｃentocor）は、ＣＤ４に対するキメラマウ スモノクローナル抗体であるセンタラ（Ｃentara）と称する抗ＣＤ４モノクロー ナル抗体を報告している。さらに、ジョンソン・アンド・ジョンソン／オーソ（ Ｊohnson ＆ Ｊohnson／Ｏrtho）は、ヒト化マウスモノクローナル抗体であるＯ ＫＴ−４ａ、抗ＣＤ４モノクローナル抗体を報告している。さらに、バロー・ウ エルカム（Ｂurroughs Ｗellcome）は、ＣＤ４に対するヒト化ラットモノクロー ナル抗体である抗ＣＤ４モノクローナル抗体を報告している。また、サンドス（ Ｓandoz）およびメドイミューン（ＭedＩmmune）（メルク（Ｍerck）と共同研究 ）の両者は、ＣＤ４に特異的な抗ＣＤ４マウス−ヒト化モノクローナル抗体を開 発している。さらに、ベクトン・ディッキンソン（Ｂecton Ｄickinson）、イム ノテック（Ｉmmunotech）およびベーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍann heim）は、抗ＣＤ４モノクローナル抗体を開発している。 抗ＣＤ４モノクローナル抗体とは別に、種々の免疫調節剤や薬剤がＲＡの治療 に応用可能として開示されている。そのような免疫調節剤および薬剤には、たと えば、細胞接着ブロッカー、サイトカイン受容体ブロッカー、イムノトキシンお よびＴ細胞受容体アンタゴニストが含まれる。具体例としては、ガンマインター フェロン、抗ＩＣＡＭ−１（白血球の通行（trafficking）、接着を阻止するマ ウス抗ＣＤ５４モノクローナル抗体）、カンパス（Ｃampath）−１Ｈ（ラット− ヒト化ＣＤｗ５２モノクローナル抗体）ＩＬ−１受容体、ｃＡ２（ＴＮＦ−アル ファキメラモノクローナル抗体）、ＣＤＰ５７１（抗ＴＮＦモノクローナル抗体 ）、抗ＩＬ−２Ｒ（ヒト化−マウス抗ＣＤ２５モノクローナル抗体）、ＳＤＺＣ ＨＨ３８０（マウス−ヒト化抗ＣＤ７モノクローナル抗体）、ＤＡＢ４８６ＩＬ −２（ＩＬ−２融合トキシン、ＣＤ４およびＣＤ８細胞に非特異的）、アントリ ル（Ａntril）（ＩＬ−１ＲＡ）、抗ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体サブセットを標的と するモノクローナル抗体およびタンパク質）、およびＸomaＺyme−ＣＤ５（マウ ス抗ＣＤ５トキシンコンジュゲート）が挙げられる。 また、自己免疫疾患の治療に潜在的に応用可能な他の免疫調節剤および免疫抑 制剤として、ラパマイシン（Ｒapamycin）（経口免疫抑制剤）、テラフェクチン （Ｔherafectin）、レフルノミド（Ｌeflunomide）（免疫抑制性のプロドラッグ ）、テニダップ（Ｔenidap）（サイトカインモデュレーター／ＣＯインヒビター ）、ＩＭＭ−１２５およびＲＳ−６１４４３（経口免疫抑制剤）が挙げられる。 上記のように、潜在的に治療に応用可能なＣＤ４に対する多くのモノクローナ ル抗体が報告されている。その大部分において、これら抗体はマウスモノクロー ナル抗体、キメラまたはマウス−ヒト化抗ＣＤ４モノクローナル抗体を含む。 マウスモノクローナル抗体は、急性および慢性の両者のヒト疾患、たとえば白 血病、リンパ腫、固形腫瘍（たとえば、結腸癌、乳癌、肝臓癌）、ＡＩＤＳおよ び自己免疫疾患の診断において並びに治療のための治療剤として臨床試験におい て潜在的な有用性を有する。しかしながら、マウス抗体は、しばしば該マウスモ ノクローナル抗体に対する宿主における免疫抗体応答となるため不利である。 マウス／ヒトキメラ抗体もまた報告されている。これら抗体は、親マウス抗体 の結合特性およびヒト定常領域に付随するエフェクター機能を含む。たとえば、 キャビリー（Ｃabilly）ら、米国特許第４,８１６,５６７号；シェーメーカー（ Ｓhoemaker）ら、米国特許第４,９７８,７７５号；ビーバーズ（Ｂeavers）ら、 米国特許第４,９７５,３６９号；およびボス（Ｂoss）ら、米国特許第４,８１６ ,３９７号（これらすべてを参照のため本明細書中に引用する）を参照。一般に 、 これらキメラ抗体は、すでに存在しているマウスハイブリドーマから抽出したＤ ＮＡからゲノム遺伝子ライブラリーを調製するに際して構築される［ニシュマン （Ｎishman）ら、４７ Ｃancer Ｒesearch、９９９（１９８７）］。ついで、こ のライブラリーを、正しい抗体フラグメント再配列パターンを示す重鎖および軽 鎖両者からの可変領域遺伝子についてスクリーニングする。ついで、クローニン グした可変領域遺伝子を、適当な重鎖または軽鎖ヒト定常領域遺伝子のクローニ ングカセットを含む発現ベクター中にライゲートする。ついで、これらキメラ遺 伝子を、選択細胞株、通常はマウスミエローマ株にて発現させる。 しかしながら、かかるキメラ抗体はヒト治療に用いられているとはいうものの 、若干の問題がある。マウスモノクローナル抗体と同様に、ヒト受容者はキメラ 抗体に対しても抗体を産生する。このことは、キメラ抗体を用いた継続療法の有 効性にとって不利である。 従来のキメラ抗体に対する改良として、何人かの研究者はかかる問題のないヒ トモノクローナル抗体の産生方法を開示している。たとえば、エーリッヒ（Ｅrl ich）ら、３４ Ｃlinical Ｃhemistry、１６８１（１９８８）；エーリッヒら、 ７Ｈybridoma、３８５（１９８８）；エーリッヒら、６ Ｈybridoma、１５１（ １９８７）；およびエーリッヒら、１ Ｈuman Ａntibody Ｈybridomas、２３（ １９９０）を参照。これら参考文献はまた、非ヒト霊長類の抗体、たとえばチン パンジーのモノクローナル抗体がヒト抗体と構造的に類似しているためにヒトに おいて充分に許容されるに違いないことを仮定している。しかしながら、ヒトに おける抗体の産生には明らかに倫理的な障害がある。 ヒト抗体はアカゲザルにおいて非免疫原性であるので（すなわち、抗体応答を 引き起こさないので）、エーリッヒらはまた霊長類抗体がヒトにおいて非免疫原 性であるに違いないことを予測している。エーリッヒら（上掲）は、霊長類抗体 がヒト免疫グロブリンの定常領域と同じ定常領域を有するか、または少なくとも ヒト抗体が互いに異なっている以上にはヒト免疫グロブリンとは異なることのな い構造を有するならば、抗体をヒトにおいて試験する必要はないことを示してい る。それゆえ、彼らはチンパンジー抗体がヒト治療に有用であることを示唆して いる。 ヒトにおいてしばしば抗原性を示す公知のキメラ抗体の改良として、関連出願 である米国特許出願第０８／４７６,２３７号（１９９５年６月７日出願）、同 第０８／３４７,０７２号（１９９５年１月２５日出願）、および同第０７／９ １２,２１２号（１９９２年７月１０日出願）、０７／８５６,２８１号（１９９ ２年３月２３日出願）および同第０７／７３５,０６４号（１９９１年７月２５ 日出願）明細書（すべて参照のため本明細書中に引用する）には、旧世界のサル モノクローナル抗体、およびクローニングしたヒト、チンパンジーまたは他のサ ルの定常領域または他のサルのフレームワーク領域に融合させた旧世界サル抗体 （たとえば、ヒヒまたはマカークザル）の可変ドメインを含む、組換え法により 該モノクローナル抗体から製造したキメラ抗体の製造が記載されている。これら 出願は、とりわけ、ヒト抗原に対するかかる旧世界サル抗体およびそれから由来 するキメラ抗体の製造、並びにかかるキメラ組換え抗体のヒト疾患の治療のため の免疫治療剤としての使用を記載している。 これら出願は、チンパンジーとは違って進化的に離れたサル（たとえば、ヒヒ またはマカークザル（カニクイザルおよびアカゲザルを含む））が、比較的保存 されたヒト抗原、たとえばＣＤ４およびＣＤ５４に対してさえもこれらサルにお いてヒト抗原に対する抗体を産生させうるほど充分にヒトと異なっているのみな らず、ヒト抗体に構造的に類似した抗体を有するほどヒトに充分に類似しており 、かかるサル抗体またはそれに由来する組換えキメラ抗体をヒトに導入した場合 に宿主の抗−抗体応答を生じないという驚くべき知見に基づいている。 これら出願は、かかるキメラ抗体が、ヒト治療に用いる幾つかの従来の抗体（ 公知のキメラ抗体を含む）と違って、幾つかの欠点、たとえば、（１）慢性状態 を治療するのに必要な繰り返し投与によるヒト抗−抗体（ＨＡＡ）の免疫原性お よび誘発、（２）ヒト抗体に比べると比較的短い半減期、および（３）ヒト細胞 または補体とのエフェクター機能の欠如、を有しないことを開示している。 これら欠点の欠如はヒト治療における有意な利点である。たとえば、慢性ヒト 疾患（自己免疫疾患を含む）または抗体の長期にわたる投与が必要とされる疾患 の場合、繰り返し抗体療法の主要な障害の一つは該治療抗体に対する宿主の応答 である。また、かかる応答が完全にではないにしても優勢に抗体分子の定常領域 に向けられたものであり、一旦かかる応答が存在すれば該抗体または同じイソタ イプの他の抗体を用いた治療の有効性が排斥されるかまたは低減される。上記出 願に記載された組換えキメラ抗体は、この問題を回避し、適当な特異性と所望の エフェクター機能とを有する抗体の産生、および組換え抗体の産生におけるその 使用を可能とするであろう。 これら組換え抗体は、一般に、免疫したサルに由来する抗体の可変領域の適当 な部分（抗原結合に必要である）およびヒトまたはチンパンジーに由来する抗体 の定常領域を含む。それゆえ、このことにより、サルモノクローナル抗体の特異 性および高親和性、およびヒトまたはチンパンジーの定常領域の適当な選択によ る所望のエフェクター機能を保持することが可能となる。 これら関連出願の幾つかは、とりわけＣＤ４に対する特異性を有するサル／ヒ トキメラ抗体（ＣＥ９.１と称する）を例示しており、この抗体はカニクイザル において産生した抗ＣＤ４モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変ドメイン並 びにヒト免疫グロブリン軽鎖ラムダ定常領域および重鎖ガンマ１定常領域を含む 。この抗体はある種のＴ細胞枯渇活性を有するが、該活性は従来のＣＤ４モノク ローナル抗体に比べると低いものである。しかしながら、Ｔ細胞枯渇活性がより 低いかまたは該活性を有しない抗体を産生することが望まれる。なぜなら、この ことは該抗体の治療能を高めるからである。 これら出願にはさらに、かかるキメラ抗体の産生のための好ましいベクター系 、とりわけＴＣＡＥ５.２およびＴＣＡＥ６が記載されており、該ベクター系は 下記のものを含む： （１）直列につながった４つの転写カセット： （ａ）ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域。ＴＣＡＥ５.２では、これはヒト免疫 グロブリンカッパ軽鎖定常領域（カバット（Ｋabat）番号でアミノ酸１０８−２ １４。アロタイプＫｍ３）であり、ＴＣＡＥ６では、これはヒト免疫グロブリン 軽鎖ラムダ定常領域（カバット番号でアミノ酸１０８−２１５、遺伝子型Ｏｚマ イナス、Ｍｃｇマイナス、Ｋｅマイナスのアロタイプ）である。 （ｂ）ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域；両構築物において、ヒト免疫グロブリ ン重鎖はガンマ／定常領域である（カバット番号でアミノ酸１１４−４７８ ア ロタイプＧｍ１ａ、Ｇｍ１２）。 （ｃ）ＤＨＦＲ；それ自体の真核プロモーターおよびポリアデニル化領域を含む ；および （ｄ）ＮＥＯ；これも、それ自体の真核プロモーターおよびポリアデニル化領域 を含む。 （２）ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖カセットは、免疫グロブリンの分泌の ための合成シグナル配列を含む；および （３）ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖カセットは、軽鎖および重鎖免疫グロ ブリン可変領域の挿入を可能とし、翻訳の読み取り枠を保持し、免疫グロブリン 鎖に通常認められるアミノ酸を変化させることのない、特定のＤＮＡ連結部（li nks）を含む。 しかしながら、以前に記載されていることの如何にかかわらず、ＣＤ４に対す る特異性を有し、ヒトにおける免疫原性が低く、たとえば慢性関節リウマチなど の自己免疫疾患の治療に用いることができる改良された抗体に対する必要性が当 該技術分野に依然として存在する。とりわけ、改良された特性、たとえば、一層 長い半減期を示し、および／または枯渇活性が実質的に欠いているかまたは欠失 している抗ＣＤ４抗体を産生することに対する必要性が存在する。 発明の目的 この目的のため、本発明の目的は、改良された特性、たとえば一層長い半減期 、ヒトにおける低い免疫原性および／またはＴ細胞枯渇活性の減少または不在を 有する、ＣＤ４に特異的な新規なモノクローナルおよびキメラ抗体を提供するこ とにある。さらに詳しくは、本発明の目的は、ＣＤ４に特異的な旧世界サル免疫 グロブリンの抗原認識部位およびヒトまたはサル定常ドメイン配列、とりわけヒ トカッパまたはラムダ軽鎖定常領域およびヒトガンマ１またはガンマ４またはエ フェクター機能が改変され安定性がガンマ４イソタイプよりも改善された変異ガ ンマ ４重鎖定常領域配列を含む抗ＣＤ４キメラ抗体を産生させることにある。 本発明のさらに詳しい目的は、サルまたはヒト定常ドメイン配列、好ましくは ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン配列およびヒトガンマ１またはガンマ ４定常ドメイン配列またはエフェクター機能が改変され安定性がガンマ４イソタ イプよりも改善された変異ガンマ４重鎖に融合した、図１に示す特定のサル抗Ｃ Ｄ４可変重鎖配列および図２に示すサル抗ＣＤ４可変軽鎖配列を含む新規なモノ クローナルおよびキメラ抗体を提供することにある。 本発明の他の目的は、かかる改良キメラ抗ＣＤ４抗体の発現を提供するＤＮＡ 配列および該キメラ抗ＣＤ４抗体の発現に用いるベクターおよび宿主細胞を提供 することにある。かかるベクターは上記出願（参照のため本明細書中に引用する ）において言及された発現ベクターを含むのが好ましく、宿主細胞はＣＨＯ細胞 が好ましいであろう。 本発明のさらに他の目的は、ＣＤ４関連疾患、とりわけ自己免疫疾患の治療ま たは予防に使用する医薬組成物を提供することにあり、該医薬組成物は、薬理学 的に許容しうる担体とともに該改良キメラ抗ＣＤ４抗体を予防または治療に有効 な量にて含む。 本発明のさらに他のの目的は、薬理学的に許容しうる担体とともに該新規キメ ラ抗ＣＤ４抗体を予防または治療に有効な量にて投与することによる、ＣＤ４関 連疾患、とりわけ自己免疫疾患、および免疫抑制が望まれる他の状態の治療また は予防法を提供することにある。 図面の簡単な説明 図１は、ＣＥ９.１の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を示 す。 図２は、ＣＥ９.１の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を示 す。 図３は、ＣＥ９.１に含まれるヒトラムダ可変および定常ドメインのアミノ酸 配列およびＤＮＡ配列を示す。 図４は、重鎖可変および定常ガンマ４配列をコードするＤＮＡ配列およびアミ ノ酸配列を示す。 図５は、Ｅ変異を有するヒト重鎖ガンマ４をコードするＤＮＡ配列およびアミ ノ酸配列を示す。 図６は、ＰおよびＥ変異を有するヒト重鎖ガンマ４をコードするＤＮＡ配列お よびアミノ酸配列を示す。 図７−１、図７−２および図８は、本発明において有用な種々のリーダー配列 の核酸配列を示す。 図９は、新鮮なヒトＰＭＮＣへのＣＥ９.１の結合のスキャッターグラムを示 し、ここでパネルＡ右上四分儀はＣＥ９.１およびＯＫＴ３で二重染色したリン パ球を示し、パネルＢ右上四分儀はＣＥ９.１およびＯＫＴ４で二重染色した集 団を示し、パネルＣ右上四分儀はＣＤ８およびＣＥ９.１で二重染色した細胞の 不在を示し、パネルＤ対照は通常ヒトＩｇＧで染色した細胞を示す。 図１０ａ、図１０ｂおよび図１０ｃは、ＣＥ９.１のＦｃ受容体結合特性を示 すものであり、該測定は、（ａ）γＩＦＮ誘発した新鮮な単球（陰性対照はＣＥ ９.１のＦ(ａｂ')₂フラグメントを使用）を使用した、（ｂ）γＩＦＮ誘発した または誘発しない新鮮な単球を使用した、および（ｃ）ｓＣＤ４の存在下または 抗体の不在下での、結合性線維芽細胞のＣＤ４⁺フローサイトメトリーヒストグ ラムの凝集を示す。 図１１は、ＣＥ９.１によるヒト混合リンパ球反応の抑制を示すものであり、 その際、（ａ）新鮮なヒトＰＢＬｓを応答者として用い、関連のない提供者から のマイトマイシンＣ処理した刺激細胞を所定濃度範囲のＣＥ９.１の抑制特性を 試験するために用い、抑制の測定はチミジン導入またはＩＬ−２産生の量により 行い、（ｂ）チンパンジー応答者および関連のないチンパンジー刺激者を用いた ＭＬＲ（その際、マウス抗ヒトＣＤ４抗体であるＬｅｕ３ａを対照として使用） 。 図１２は、ＣＥ９.１の抗体依存性細胞障害能を示すものであり、その際、Ｓ ｕｐＴ−１８標的細胞の溶解をγインターフェロン刺激エフェクター細胞の存在 下で行い、４Ｄ９はマウス抗ＣＤ４モノクローナル抗体ＩｇＧ２ａである。 図１３は、ＣＥ９.１の存在下または不在下でのＳｕｐＴ−１８細胞へのＣ１ ｑ の結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示すものであり、その際、１０, ０００の事象を記録し、その結果をヒストグラムとして表し、ＰＲＯ９４５は高 い抗ＣＤ４血清力価を有するサルからのポリクローナル抗体であり、陰性対照は ＣＥ９.１の不在下でのＣ１ｑプラス抗Ｃ１ｑであった。 図１４は、ＣＥ９.１の補体依存性細胞障害アッセイを示すものであり、その 際、ＳｕｐＴ−１８細胞の溶解はＣＥ９.１およびウサギ補体の存在下で行い、 ４Ｄ９は補体に結合しうるサブクラスＩｇＧ２ａのマウス抗ＣＤ４対照であり、 ＰＲＯ９６５は高い抗ＣＤ４力価を有するカニクイザルからのポリクローナル抗 体混合物である。 図１５は、６匹のチンパンジーにおける高投与量薬理学研究であり、その際、 末梢血中に１５０〜３００日の期間にわたって発現されたＣＤ４、ＣＤ８レベル を調べ、ＣＤ４調節細胞の数を示すＣＤ３−ＣＤ８曲線をも示す；上部パネル： グループ１ − チンパンジーのカウントをモニターした。矢印はＣＥ９.１投与 を示す。（２）食塩水対照グループ。中央のパネル：グループ２ − １０ｍｇ／ ｋｇのＣＥ９.１を与えたチンパンジー（２）。ＣＤ４カウントが基準線の３０ ％以内に戻ったときに投与を繰り返した。下部のパネル：グループ３ − １０ｍ ｇ／ｋｇのＣＥ９.１を与えたチンパンジー（２）。ＣＤ４カウントが基準線の ７０％以内に戻ったときに投与を繰り返した。 図１６は、ヒトγ４定常領域を得るのに適当なＰＣＲプライマーを示す。 図１７は、ＣＥ９γ４ＰＥ重鎖配列を示す。 図１８は、ＣＥ９.１、ＣＥ９γ４（Ｇ４）、ＣＥ９γ４（Ｇ４Ｅ）およびＣ Ｅ９γＰＥ（Ｇ４ＰＥ）の非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示 す。半量体分子が約８０ｋＤの分子量のところに認められる。 図１９は、ＳＰＲ進行曲線の会合相および解離相のデータを含む。 図２０は、初期ＭＬＲでのＣＤ４モノクローナル抗体構築物の効果を示す。 図２１は、ＩＦＮ−γ誘発単球細胞株ＴＨＰ−１のＣＤ４⁺線維芽細胞形質転 換体への接着を示す。 図２２は、ＣＥ９.１、ＣＥ９γ４、ＣＥ９γ４ＥおよびＣＥ９γＫのＦｃＲ およびＣＤ４^-媒体接着を示す。 図２３は、ＣＥ９γ４ＰＥ、ＣＥ９.１およびＨｕＣＤ４に対するマウス固定 抗体を用いたＣＤＣおよびＡＤＣＣの結果を示す。 図２４は、１ｍｇ／ｋｇのＣＥ９γ４ＥおよびＣＥ９γ４ＰＥを雄スプラーグ −ドーリーラットにボーラス投与後の血漿濃度を示す。 図２５は、ＨｕＣＤ４トランスジェニックマウスでの卵アルブミン特異的抗体 応答におけるモノクローナル抗体処理の効果を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、所望のサルまたはヒト定常ドメイン配列、好ましくはヒトガンマ１ 、ガンマ４または変異ガンマ４ヒト重鎖定常ドメインおよびヒトカッパまたはラ ムダ軽鎖定常ドメイン配列に融合した旧世界サル抗ＣＤ４モノクローナル抗体の 可変領域の抗原結合部分を含む、ＣＤ４に特異的な新規モノクローナルキメラ抗 体を提供する。これら抗体は従来の抗ＣＤ４モノクローナル抗体に関連して改善 された特性、たとえばヒトＣＤ４に対する高親和性およびヒトにおける免疫原性 のほとんどまたは完全な不在を示す。ガンマ４の態様はエフェクター機能、たと えばＦｃ受容体結合活性や補体結合の減少または不在を示し、Ｔ細胞枯渇活性を ほとんどまたは全く示さない。 ＣＤ４に特異的な旧世界サルモノクローナル抗体およびＣＤ４に特異的な旧世 界サルモノクローナル抗体を産生するクローンを得る方法は、上記関連特許出願 （参照のため本明細書中に引用する）に記載されている。 一般に、この方法は、旧世界サルを旧世界サルが抗ＣＤ４抗体を産生するよう な条件下でヒトＣＤ４抗原に対して免疫し、抗ＣＤ４抗体の産生を担うサルの細 胞を、たとえばハイブリドーマ融合、ヘルペス・パピオ（Ｈerpes papio）によ るウイルス形質転換、単一Ｂ細胞クローニング（いわゆる「一過性不死化」）お よび組換え免疫グロブリンのライブラリーの産生により不死化することを含む。 好ましい態様において、この方法は、サルの末梢血白血球、脾臓、骨髄またはリ ンパ節のいずれかからＢ細胞を選択し、適当な抗体を産生するコア（core）を選 択し、該不死化細胞株から該抗体をコードする免疫グロブリン遺伝子を回収し、 該遺伝子を産生細胞株（すなわち、ヒト治療に有用な抗体の充分な産生を可能と する細胞株）中で発現させることを含む。上記出願で定義されているように、旧 世界サルにはヒヒおよびマカークザル（アカゲザルおよびカニクイザルを含む） が含まれる。 上記のように、好ましい態様において本発明のキメラ抗体は、ヒト定常ドメイ ン配列に融合した、図１および図２に示す抗ＣＤ４旧世界サル可変重鎖および軽 鎖配列を含むであろう。これら特定の可変重鎖および可変軽鎖ドメイン配列を得 るのに適した手段は、１９９０年６月７日に出願した米国特許出願第０８／４７ ６,２３７号および１９９５年１月２５日に出願した同第０８／３９７,０７２号 並びに１９９２年７月１０日に出願した同第０７／９１２,２９２号（すべて参 照のためその全体を本明細書中に引用する）に詳細に記載されている。これら出 願はさらにこれら配列の全核酸配列およびアミノ酸配列を開示している。 これら可変重鎖および軽鎖ドメイン配列は、あらゆる所望のヒト定常ドメイン 配列に融合させることができる。特定の選択は、得られたキメラ抗ＣＤ４抗体の エフェクター機能に影響を及ぼすであろう。好ましくは、ヒト重鎖定常ドメイン は、ガンマ１、ガンマ４または本明細書中でガンマ４Ｅと称する変異ガンマ４定 常ドメインまたは本明細書中でガンマ４ＰＥと称する変異ガンマ４を含むであろ う。ガンマ４を選択することは、Ｔ細胞枯渇活性が欠失したまたは実質的に欠失 した（ガンマ１に比べて８０〜１００％）キメラ抗体が得られることがわかって いるので有利である。このことはガンマ４定常ドメインが補体に結合することが できないためであると思われる。定常ドメインはまた、得られるキメラ抗体の特 性たとえば安定性を高めるためおよび／または枯渇活性を除去するために変異さ せてよい。とりわけ、ガンマ４ドメインのＰおよびＥ修飾（以下に記載する）は 、活性、安定性の増大および枯渇活性の除去をもたらすヒンジ領域でのガンマ４ の修飾である。さらに、他の修飾もまた特性の高められたキメラ抗体をもたらす に違いないことが期待される。 本発明のキメラ抗ＣＤ４抗体中に含まれるヒト軽鎖定常ドメインは、ヒトカッ パまたはラムダ軽鎖定常領域であるのが好ましく、ヒトラムダ軽鎖定常領域であ るのがさらに好ましいであろう。ヒトガンマ１、ガンマ４、カッパおよびラムダ 定常ドメインをコードするアミノ酸配列およびＤＮＡ配列は当該技術分野で知ら れている。また、ヒトガンマ４およびＥおよびＰＥ変異体およびラムダ定常ドメ イン配列のアミノ酸配列および核酸配列は、それぞれ図４〜６および図３に記載 してある。 本発明の具体的態様としては、ヒトＩｇＧ１の定常ドメインとともにヒトｓＣ Ｄ４免疫カニクイザルから得られた抗原結合ドメインを含み、ＣＥ９.１と称す る特定のキメラ抗ＣＤ４モノクローナル抗体、およびそれから得られたモノクロ ーナルキメラ抗体、たとえばＣＥ９γ４、ＣＥ９γ４λＫおよびＣＥ９γ４Ｅ、 ＣＥ９γ４ＰＥ（これらはＣＥ９.１と同じ抗原結合ドメインを有するが、ヒト ＩｇＧ４Ｆｃ結合ドメインフレームワークで遺伝的に操作されている）が挙げら れる。モノクローナル抗体ＣＥ９γ４Ｅは、抗体のヒンジ領域近傍でロイシン→ グルタミン酸変異（Ｌ２３６Ｅ）を含む（Ｅ修飾）。モノクローナル抗体ＣＥ９ γ４ＰＥは、同じロイシン→グルタミン酸変異に加えてセリン→プロリン変異（ Ｓ２２９Ｐ）を含む（「Ｅ」および「Ｐ」修飾）。ＣＥ９γ４Ｋλ抗体は、ヒト Ｋサブタイプからの軽鎖定常領域をヒトλサブタイプからの軽鎖定常領域で置換 している点がＣＥ９γ４と異なっている。 これら定常ドメインのスイッチおよび変異を行ったのは、ＩｇＧ抗体の生物学 的応答がそのカルボキシ末端ドメインの構成、すなわちアイソタイプに依存する ことが知られているからである。それゆえ、抗体アイソタイプをタンパク質工学 により変えることにより、ＩｇＧ抗体、さらに詳しくは本発明のキメラ抗ＣＤ４ モノクローナル抗体の生物学的応答を修飾することが可能となる。 この操作戦略から得られる望ましい結果として、抗体のＦｃ部分のアイソタイ プのスイッチを行ってもＣＤ４抗原結合Ｆａｂ領域の結合親和性が低減すること はないということがあった。しかしながら、このことは最初からわかっていたの ではなかった。定常領域の変化またはその修飾はＣＤ４結合に悪影響を及ぼす可 能性があった。それゆえ、抗体特性、とりわけＣＤ４抗原結合に対する修飾の効 果を決定するために、得られた抗体をアッセイした。抗原結合に対する定常ドメ インスイッチが及ぼす可能性のある効果を測定するため、公知のアッセイ法を用 いることができる。とりわけ、ＣＤ４とＣＥ９.１、ＣＥ９γ４、ＣＥ９γ４λ Ｋ、ＣＥ９γ４ＥおよびＣＥ９γ４ＰＥとの相互作用の研究を、スキャッチャー ド分析および表面プラスモン共鳴（surface plasmon resonance）（ＳＰＲ）に より行った。これらアッセイの結果は、各被験抗体へのＣＤ４結合が等価である ことを示した。抗体へのＣＤ４結合の２５℃での平衡解離定数は、ＳＰＲにより すべて約１.０ナノモルであることがわかった。これら測定はさらに以下のこと を示している： （１）抗体へのＣＤ４結合は２部位独立および同一結合モデルにより起こる；お よび （２）抗原結合ドメインの機能的結合特性は、ガンマ１、ガンマ４または変異ガ ンマ４アイソタイプを含む抗体のＦｃ部分に施した構造的修飾とは独立である。 それゆえ、本発明は、ＩｇＧ１とＩｇＧ４との間でのアイソタイプスイッチが抗 原結合親和性を損なうことなく抗体、さらに詳しくはＣＤ４に対する抗体を設計 するうえで有用な戦略であるという証拠を提供する。 また、以下に記載するように、ガンマ１定常ドメインをガンマ４で置換すると 、Ｆｃ受容体結合、補体結合およびＴ細胞枯渇活性が実質的に低減され、さらに ＥおよびＰ修飾はそれぞれＦｃ受容体結合およびＴ細胞枯渇活性をさらに排除し 、抗体の安定性を高めることがわかった。それゆえ、本発明に従って製造した（ ヒトガンマ４定常ドメインまたはその変異形を含むように設計した）他のキメラ 抗体をＦｃエフェクター機能変化により選択して、Ｔ細胞枯渇活性が実質的に欠 失しているかまたは完全に欠失しているもの、および／または安定性の高められ たものとしうることは妥当なことである。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機 能、および抗体安定性のアッセイ法は当該技術分野で公知である。 それゆえ、本発明は特定の組換え抗体を提供するものであり、該抗体はヒトＣ Ｄ４抗原に向けられた霊長類／ヒトキメラモノクローナル抗体であり、改善され た特性、たとえば低いＴ細胞枯渇活性および高い安定性を示す。これら特性が得 られることにより、これら組換え抗体は免疫調節剤として特別の有用性を有し、 自己免疫疾患、たとえば慢性関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（Ｓ ＬＥ）並びに非自己免疫適応症、たとえば移植細胞対宿主病（ＧＶＨＤ）、臓器 移植拒絶、喘息およびＨＩＶの治療に特に有用である。本発明の抗体はまた、遺 伝子療法の補助としての有用性をも有する。とりわけ、本発明の抗体は、ベクタ ー（治療用ＤＮＡを含む）投与の前、同時または後に該ベクターに対する宿主体 液応答を防いだり少なくするために投与することができる。これら疾患は、ＣＤ ４関連状態の例示にすぎない。 実施例に一層詳細に記載するように、ＣＥ９.１組換え抗体は、カニクイザル からの抗原結合可変Ｆｖドメインをヒト定常領域、たとえばＩｇＧ１定常ドメイ ンに移植することにより製造される。さらに詳しくは、ＣＥ９.１抗体はヒトガ ンマ１ドメインおよびラムダ定常ドメインを含む。ＣＥ９γ４、ＣＥ９γ４λＫ 、ＣＥ９γ４ＥおよびＣＥ９γ４ＰＥは、ガンマ４定常ドメインまたはその変異 形およびラムダまたはカッパ定常領域のいずれかを含む。得られた組換え抗体配 列はヒト免疫グロブリン配列と区別することができない。その結果、これら抗体 、並びに同様の方法により製造した他のＣＤ４抗体は、ヒトにインビボ投与した ときに、ＣＤ４に対する同様のマウスモノクローナルまたはマウス−ヒトキメラ 抗体に比べて低減した免疫原性を有するかまたは免疫原性を有せず、一層遅い血 清クリアランスを示すに違いない。 ＣＥ９.１抗体はヒトのドメイン１に結合するが、マカークザルでは抗原提示 細胞上のＭＨＣクラスII分子との相互作用に関与する領域であるＣＤ４に結合す る。また、アッセイは他の例示した抗体がＣＥ９.１と同じ抗原結合特性を有す ることを示した。 ＣＥ９.１抗体についてインビトロおよびインビボの両方で強力な免疫調節活 性が観察された。これら特性、すなわちマウスまたは齧歯類由来の他の公知の抗 ヒトＣＤ４モノクローナル抗体に比べて低い免疫原性、遅い血清クリアランスお よび強力な免疫調節能を有することによって、この抗体および本明細書中に記載 する他の抗体は、免疫抑制が望まれる疾患、たとえば慢性関節リウマチなどの自 己免疫疾患および慢性炎症性疾患の長期療法に特に適している。しかしながら、 これら抗体は他の多くの疾患状態、一例として橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、 甲状腺中毒／グレイブス病、若年性悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫 性心炎、アジソン病、未熟（premature）月経、１型糖尿病、グッドパスチャー 症候群、重症筋無力症、多発性硬化症、男性不妊、尋常性天庖瘡、天庖瘡、交感 性眼炎、水晶体性（phacogenic）ぶどう膜炎、自己免疫性溶解性貧血、特発性血 小板減少性紫斑病、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝硬 変（ＨＢｓＡｇ陰性）、特発性肝硬変、炎症性腸疾患症候群、シェーグレン症候 群、乾癬、慢性関節リウマチ、皮膚筋炎、強皮症、混合組織結合性疾患（mixed tissue connective disease）、円板状エリテマトーデス、全身性脈管炎、およ び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療にも有用であるに違いないことが期 待される。 上記のように、慢性関節リウマチ（ＲＡ）は滑膜の炎症性疾患であり、関節の 糜爛、変形および破壊という結果となる自己免疫現象の一つの明示を含む。ほと んどの自己免疫疾患がそうであるようにＲＡの病因は充分に定められていないが 、罹患した関節での活性化ＣＤ４⁺Ｔリンパ球レベルが上昇しているという特徴 を有する。現在のところＲＡの治療手段はなく、この衰弱性疾患の治療はもっぱ ら症状の寛解および短期間での機能的能力の改善に向けられている。さらに、基 礎疾患に対して向けられたアザチオプリン、メトトレキセートおよびプレドニゾ ロンなどの第二および第三ラインの免疫抑制剤およびステロイド剤は一層重篤な ケースにのみ用いられており、通常、穏やかにしか有効でなく、慢性療法に用い た場合には許容しがたい毒性を示す。対照的に、本発明の抗体は、マウスまたは 齧歯類由来の他の公知の抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体に比べて低減した免疫 原性、より長い半減期および強力な免疫調節活性を示すという事実により、長期 の慢性的な投与に適しているであろうことが期待される。 本質的に、本明細書に例示する組換え抗ＣＤ４モノクローナル抗体または本発 明および上記出願（参照のため引用する）の記載に従って製造した他の抗体は、 とりわけ慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の急性相の際にＣＤ４⁺細胞の破 壊活性を阻止または変化させることにより治療作用を発現するであろうと思われ る。それゆえ、本発明による抗体の投与は、日和見感染に対する正常な宿主防御 を損なうことなく、基礎疾患を保持している障害性抗原（または特定の組織）に 対する免疫不応答（アネルギー）または長期寛容の状態を生じさせるであろう。 ＲＡに限らず、ＣＤ４モノクローナル抗体は上記疾患の治療に有利であるに違い なく、インスリン依存性糖尿病、全身性エリテマトーデス、肝硬変、炎症性腸疾 患、多発性硬化症、並びに他の自己免疫疾患の治療に特に応用できる。本発明の 抗体はまた、非自己免疫疾患、たとえば白血病、リンパ腫、移植細胞対宿主病、 臓器移植拒絶、喘息およびＨＩＶの治療にも有用である。 本発明により製造した組換え抗ＣＤ４モノクローナル抗体は、下記メカニズム の１またはそれ以上により所望のインビボ治療作用を発現する： （i）ＣＤ４とＭＨＣクラスII分子との相互作用の阻止； （ii）細胞表面ＣＤ４のダウンモデュレーション； （iii）アネルギーおよび／またはアポトーシスの誘起； （iv）ＣＤ４細胞の枯渇；または （v）自己抗原に対する寛容の誘発。 ＣＤ４⁺細胞の一過性の枯渇は免疫抑制という結果となり、おそらく、さもな くば活動の昂進した免疫系が正常化されるが、抗ＣＤ４抗体がインビボ作用を示 す主要なメカニズムは必ずしもＴ細胞枯渇に依存するものではない。むしろ、Ｃ Ｄ４分子への抗体の結合は、Ｔ細胞受容体に結合した抗原によるヘルパーＴ細胞 の活性化を防ぎ、抗原特異的なＴ細胞アネルギーまたは寛容に導くと思われる。 たとえば、ヒトガンマ１ドメインを含むＣＥ９.１抗体は実質的な免疫抑制活性 を示す。しかしながら、該抗体はチンパンジーでＣＤ４細胞を部分的に枯渇させ るにすぎない。さらに、ヒトでの結果は、該抗体が現在臨床試験されている他の モノクローナル抗体に比べて細胞枯渇が実質的に低いことを示している。 また、インビボ実験モデルにおいて、臓器移植時に投与した非枯渇性抗ＣＤ４ 抗体によって同種移植特異的寛容が誘発された。寛容状態の維持には枯渇性抗Ｃ Ｄ４抗体は必要ではないが、抗原が継続して存在することに依存すると思われる 。これら知見に基づき、本発明の組換え抗体または本発明に従って製造した他 の組換え抗ＣＤ４抗体は自己免疫疾患の治療に適していることが期待される。抗 ＣＤ４抗体による簡単な処理計画により、自己抗原に対するヘルパーＴ細胞応答 が妨害され、全身性の免疫抑制なしで長期の臨床的改善がもたらされるであろう 。 本明細書に含まれる知見に基づき、また公知の方法を用いて、当業者であれば 本明細書に例示した組換え抗ＣＤ４抗体並びに実質的に本発明に従って製造した 他の抗体の安全、寛容かつ有効な投与計画を容易に実施できる。 上記のように、ＣＥ９.１は抗ＣＤ４モノクローナルマカークザル−ヒトキメ ラ抗体であり、これはＩｇＧ１分子であってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ Ｏ）細胞で発現され、ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域と９１〜９５％の ホモロジーを示す。それゆえ、この分子はヒトにおいて免疫原性応答が低減して いるかまたは免疫原性応答を示さず、マウスモノクローナル抗体またはマウス− ヒトキメラ抗体に比べて一層長い血清半減期を示す。たとえば、該抗体が非リン パ性組織に結合するという証拠は試験において観察されていない。予想されるよ うに、該抗体は末梢血から他の臓器にいたるリンパ細胞のすべてではないが幾つ かに結合する。該抗体はまた、チンパンジーのＣＤ４⁺Ｔ細胞とは反応するが、 アカゲザル、カニクイザルまたはブタオザル、ヒヒ、ラット、マウスまたはウサ ギのＣＤ４⁺Ｔ細胞とは反応しないことがわかった。それゆえ、この反応性に基 づき、チンパンジーは関連する種を含み、該抗体のインビボでの薬理学的効果、 すなわち有効な免疫抑制剤として機能する能力が確認される。 ＣＥ９.１抗体はチンパンジーにおいて可逆性（reversible）Ｔ細胞枯渇活性 を示す。さらに、該抗体は、ヒト血清で予想される一層長い半減期および可能な 免疫学的副作用の低減によって、現行のマウスおよびマウス／キメラ抗ＣＤ４モ ノクローナル抗体に比べて改良されているようである。また、ヒト定常ドメイン 配列が存在することによって、本発明の抗体はヒトに投与したときにヒト抗体の 正常なエフェクター機能を保持しているであろうことが予想される。実際、ＣＥ ９.１抗体および他の関連抗体のエフェクター機能は幾つかの異なるアッセイに おいて評定されている。ＣＥ９.１抗体は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におい て抑制活性を示すこと、弱いＣ１ｑ結合を示すこと、しかしながら、補体媒体細 胞性細胞障害は示さないことがわかった。該抗体はまた、抗体依存性補体細胞性 細胞障害活性（ＡＤＤＣ）を示し、ＦｃＲに結合することがわかった。 ＣＥ９.１抗体はまた、チンパンジーにおいてインビボで評定され、その投与が ＣＤ４細胞の部分的な枯渇およびＣＤ４受容体の修飾を引き起こすことがわかっ た。 ＣＥ９.１を種々の投与量でチンパンジーに投与した。さらに詳しくは、０.１ 、０.３、１、５および１０ｍｇ／ｋｇの投与量を７日および１４日の間隔でチ ンパンジーに投与したときの効果を調べた。毒性についての臨床的な形跡は観察 されなかった。１ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の投与量は、投与２４時間後に循環 ＣＤ４⁺細胞の８０〜９５％の減少を引き起こした。ＣＤ４⁺細胞の有意の減退は 、１ｍｇ／ｋｇの投与７日後に観察されなかった。５ｍｇ／ｋｇの投与量の後、 循環ＣＤ４⁺細胞数は７日後にはベースラインの約４０％まで、１４日後にはベ ースラインの約６０％まで回復した。１０ｍｇ／ｋｇの投与量の後では、循環Ｃ Ｄ４⁺細胞数は処置７日後には回復せず、投与４２日後にベースラインの４０％ まで回復しただけであった。他の臨床病理パラメータにおいて変化は観察されな かった。 ＣＥ９.１抗体をヒトでも試験した。たとえば、ＣＥ９.１抗体の活性を慢性関 節リウマチ患者において単回投与−漸増相１試験（single dose-escalating pha sel）においても評定した。これらの結果は将来非常に有望なものであった。詳 しくは、投与した患者の約半分において触ると痛い関節スコア（tender joint s core）において少なくとも３０％改善され、有害な事象プロフィル（adverse ev ent profile）も極めて良性であった。さらに、以下に記載するように、最初の うちはＣＥ９.１は枯渇させると思われたが、事実は該抗体は単回投与で部分的 かつ一過性に枯渇を示しただけであった。該抗体の部分的な非枯渇特性は有益で ある。なぜなら、多くの動物試験においてＣＤ４⁺Ｔ細胞枯渇が明らかにＣＤ４ モノクローナル抗体の有効性にとって必要でないことが報告されているからであ る。［カーテロン（Ｃarteron）ら、「Ｌ３Ｔ４に対するモノクローナル抗体の 投与の間の免疫寛容の誘発はＬ３Ｔ４⁺細胞に依存しない」、Ｕnderlying Ｊour nal of Ｉmmunology、１４０：７１３〜７１６（１９８８）；カーテロンら、「 Ｆ(ａｂ')₂ 抗ＣＤ４および完全抗ＣＤ４モノクローナル抗体は狼瘡がちのＮＺＢ／ＮＺＷマ ウスの腎臓においてＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺Ｔ細胞およびＢＴＴ細胞およびＢ細 胞の蓄積を阻止する」、Ｃlinical Ｉmmunology Ｉmmunopathology、５６：３７ ３〜３８３（１９９０）を参照］。それゆえ、該抗体は、（i）ＣＤ４とそのカ ウンターレセプターＭＨＣIIとの相互作用を阻止することによって、または（ii ）細胞表面からのＣＤ４の修飾（modulation）を引き起こすことによって、古典 的な受容体アンタゴニストのように機能する。これら条件下で、ＣＤ４受容体の 参与を必要とするＣＤ４⁺Ｔ細胞応答は弱められるかまたは阻止される。本発明 のＣＥ９.１抗体がヒトにおいて枯渇活性をほとんど示さないという事実は有利 である。なぜなら、このことは安全性を高め、ＣＤ４⁺細胞数を頻繁にモニター する必要をなくし、有効性をも改善するからである。 ＣＥ９.１抗体を、Ｆｃ受容体および補体結合メカニズムによりインビボにお いてＣＤ４細胞数を減少させるようにデザインした。チンパンジーにおける研究 はＣＥ９.１がＣＤ４細胞の部分的な枯渇を引き起こすことを示しており、初期 の結果はヒトでの細胞枯渇が他の公知のモノクローナル抗体に比べてはるかに低 減することを示している。しかしながら、枯渇活性の欠如した抗体を産生させる ことも望ましい。 「非枯渇」ＣＤ４モノクローナル抗体の有用性は以下の理由により改善される ： （i）ＣＤ４細胞の枯渇はＣＤ４モノクローナル抗体の有効性に必要でない； （ii）ＣＤ４細胞枯渇の不在は安全性を高めるに違いない； （iii）安全性の向上はモノクローナル抗体を疾患プロセスの初期に使用するこ とを可能にする； （iv）ＣＤ４細胞枯渇の不在は有効性を高めるに違いない；および （v）ＣＤ４細胞枯渇の不在はＣＤ４細胞数を頻繁にモニターする必要を回避ま たは低減させ、それゆえ治療全体の便利さおよびコストが向上する。 このことは、多くの動物モデルにおいてＣＤ４⁺Ｔ細胞枯渇がＣＤ４モノクロ ーナル抗体の有効性に必要でないことが示されているという事実により支持され ている。それゆえ、非枯渇ＣＤ４モノクローナル抗体は、 （i）ＣＤ４とそのカウンターレセプターＭＨＣIIとの相互作用を阻止すること により、 （ii）細胞表面からのＣＤ４の修飾を引き起こすことにより、または （iii）Ｔ細胞アネルギーおよび／またはアポトーシスを引き起こすことにより 古典的な受容体アンタゴニストのように機能する。 それにより、ＣＤ４受容体の参与を必要とするＣＤ４⁺Ｔ細胞応答が変えられま たは阻止される。 一般に、強または高親和性の抗原により引き起こされるＴ細胞応答はＣＤ４− コレセプター機能と独立であると思われ、それゆえＣＤ４モノクローナル抗体に よっては有効に阻止されない。反対に、弱い抗原（自己抗原など）に対するＴ細 胞応答はＣＤ４−コレセプター機能を必要とし、それゆえＣＤ４モノクローナル 抗体により抑制される。通常、強い自己反応性のＴ細胞（自己抗原に対する高親 和性ＴＣＲを有するＴ細胞）は「クローン欠失」により胸腺中で排除され、それ ゆえ末梢部では出現することはない。対照的に、自己免疫応答を引き起こすＴ細 胞は、末梢寛容の正常なメカニズムを逃れた弱い自己反応性の細胞であると思わ れる。そのような細胞は、応答の完全な作動（elaboration）のためにＣＤ４な どのコレセプターの参与に依存する。それゆえ、コレセプターの阻止はこれらＴ 細胞から非常に重要なコシグナリング機能を奪い、その結果、部分的な活性化ま たはアネルギーとなる。また、上記のように、安全性の一層増大した（一層長い インビボ半減期）ＣＤ４特異的なキメラ抗体を産生することも、さらに望まれる 。 この目的のため、ガンマ４ヒト定常ドメインを含む種々のキメラ抗体を合成し た。このドメインを選択したのは、該ドメインがヒト補体やＦＣγ１受容体に明 らかに結合しないからであった。それゆえ、該定常ドメインを含むキメラ抗体は Ｔ細胞枯渇活性を欠如しているかまたは実質的に欠如していると仮定された。ま た、ガンマ４定常ドメインに公知の修飾を施した幾つかの抗体も作成した。とり わけ、幾つかの抗体はダンカン（Ｄuncan）らのＮature、３３２：５６３〜５６ ４（１９８８）およびウインター（Ｗinter）らのＷＯ８８／０７０８９（１９ ８８）に記載された「Ｅ」修飾を含んでおり、該修飾は補体およびＦＣγ１受容 体結合を低減させると開示されている。この修飾は、あらゆる残留Ｆｃ受容体結 合を軽減する２３６位（２４８カバット番号）でのロイシンのグルタミン酸への 変化を含む。また、幾つかのキメラ抗体はアンガル（Ａngal）らのＭol.Ｉmmuno l .、３０：１０５〜８（１９９３）に開示されている「Ｐ」修飾を含む。２２９ 位（２４１カバット番号）でのセリンのプロリンへの変化を含むこの修飾は、重 鎖間でのジスルフィド結合を安定化させることにより安定性（血清半減期）を高 め、該修飾を欠くキメラＩｇＧ４に比べて改善組織分布を高めると報告されてい る。 さらに詳しくは、ＣＥ９γ４の開発の理論的根拠は、補体結合を排除し、Ｆｃ Ｒ結合活性を減少させることであった。この抗体は、ヒトガンマ４定常ドメイン （ガンマ１ではなく）を含む点でＣＥ９.１と異なる。しかしながら、このこと は望ましいことであったが、その成果は日常的または予想しうる性質のものでは なかった。実際、本発明者らは非修飾γ９を含むキメラ抗体がγ２抗体と同じＦ ｃ受容体結合を有することを見出した。対照的に、ＣＥ９γ４λＫ製造の理論的 根拠はγ４構築物の生産性を高めることにあった。この抗体は、ヒトラムダ軽鎖 の代わりにヒトカッパ軽鎖を含む点でＣＥ９.１と異なる。ＣＥ９γ４抗体の刺 激単球および単球細胞株への結合を測定するＦｃ受容体結合アッセイによるイン ビトロでの該抗体の評定は、該抗体が依然としてＦｃ受容体結合活性を有してい ることを示した。さらに、このアッセイにおいてＣＥ９γ４結合はＣＥ９.１（ ガンマ１）と区別しえなかった。それゆえ、ＣＥ９γＥ製造の理論的根拠は、非 修飾γ４を含むキメラ抗体に対して残留するあらゆるＦｃＲ結合性を完全に排除 することにあった。ＣＥ９γＥは、一つの部位で修飾した（Ｅ修飾）ガンマ４定 常ドメインを含む。最後に、ＣＥ９γ４ＰＥ製造の理論的根拠は、非修飾γ４ま たは一つの部位に変異（Ｅ修飾）を含むキメラ抗体に対して安定性を高めること にあった。この抗体は、２つの部位で修飾した（ＰおよびＥ修飾）ガンマ４定常 ドメインを含む。 上記のように、ヒトγ４定常ドメインを、エフェクター機能、すなわちヒトＦ ｃγ受容体またはＣ１ｑとの反応性の排除、およびインビボでのＣＤ４⁺細胞 の枯渇の不在のためのアイソタイプとして選択した。これら４つの候補を選択し 、ＣＨＯ細胞で発現させた。 これら候補モノクローナル抗体の２つ、すなわちＣＥ９γ４ＥおよびＣＥ９γ ４ＰＥをさらに検討するために選択した。上記のように、これら抗体は両者とも 、γ４定常領域に付随する残留ＦｃＲ結合を除去するためにＣＨ２領域中にグル タミン酸置換が導入されている。さらに、ＣＥ９γ４ＰＥは、重鎖ジスルフィド 結合相互作用の安定性を高める目的でヒンジ領域中にプロリン置換を含む。 これら抗体は、ＣＤ４に対する親和性、分子量、熱変性に対する安定性、ＭＬ Ｒの抑制、ＦｃＲへの結合の不在、およびＡＤＣＣおよびＣＤＣにおける活性の 欠如において互いに区別できないことがわかった。それゆえ、これら両者抗体は 、ＦｃＲおよび補体エフェクター機能を有しない高親和性ＣＤ４モノクローナル 抗体のインビトロでの基準を示す。 ＣＥ９.１およびＣＥ９γ４ＰＥの特性を表１において比較してある。低減し たＦｃ受容体結合は、１γ１含有キメラ抗体に比べてＦｃ受容体への結合が低減 した、好ましくは少なくとも３０〜８０％低減した、より好ましくは少なくとも ５０〜８０％低減した、最も好ましくは完全に排除されたキメラ抗体を指すこと を意図したものである。しかしながら、非修飾ガンマ４キメラ抗体で得られた結 果から明らかなように、所望の成果は予想しえる性質のものではなかった。 それゆえ、これら結果から、ヒトＣＤ４に結合し、特定の定常ドメイン配列の 選択によってある種のエフェクター機能を欠くキメラ抗体を本発明に従って製造 しうることが確認された。 例示したキメラ抗ＣＤ４抗体または本発明に従って製造した他のキメラ抗体を 自己免疫疾患、たとえば慢性関節リウマチの治療のための免疫抑制剤またはＣＤ ４モジュレーターとして用いるに際して、かかる抗体を単独または特定の疾患状 態の治療に適した他の化合物とともに投与することができる。たとえば、たとえ ば、本発明の抗体は、他のタンパク質、たとえばＴＮＦ−アルファに対するモノ クローナル抗体可溶性受容体タンパク質、ＩＬ２受容体に対するモノクローナル 抗体、ＣＤ４０／ｇｐ３９相互作用をアンタゴナイズするモノクローナル抗体と 受容体との融合タンパク質、およびＢ７／ＣＤ２８相互作用をアンタゴナイズす るモノクローナル抗体中のＣＴＬＡ４−Ｉｇと組み合わせて投与してよい。また 、慢性関節リウマチの治療の場合、本発明の抗体を他の治療剤、たとえばラパマ イシン、レフルノミド、テニダップ、ＲＳ−６１４４３（マイコフェノレートモ フェチル（Ｍycophenolate Ｍofetil））、スレニル（Ｓurenyl）（ヒアルロン 酸ナトリウム）、抗ＴＣＲ（Ｖβ１７）ペプチドワクチン、アネルバＸ（Ａnerv a Ｘ）（抗ＭＨＣワクチン）、および体外プロテインＡ免疫吸着剤またはそれら の組み合わせとともに投与してよい。さらに、本発明の抗体は、本発明に従って 製造した他の抗体またはヒトＣＤ４に特異的な当該技術分野で公知の他の抗体と ともに投与してよい。このことにより、これら抗体がたとえばＣＤ４タンパク質 の異なるエピトープに結合する場合には相乗効果を示す結果となる。 下記実施例は、本発明をさらに記載するために提示するものである。 実施例１ ＣＤ４に対する特異性を有するサル／ヒトキメラ抗体のクローニングおよび発現 以下に示すのは、本発明の方法および抗体の特別の例示である。 サル不死化Ｂ細胞株の生成 成体カニクイザル（ホワイト・サンズ・ニュー・メキシコ・プライメート・セ ンター（Ｗhite Ｓands Ｎew Ｍexico Ｐrimate Ｃenter））を、標準アジュバ ントを用い、１５０〜３００μｇの可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）またはＣＤ４陽性 細胞株ＳupＴ１からの細胞膜（１×１０⁸細胞）で複数の箇所にて筋肉内で免疫 した。免疫を２〜３週間毎に合計６回繰り返した。サルの片方の腿部の鼠蹊部に １００μｇのｓＣＤ４を注射することによりブースター投与を行い、１週間後、 同腿部から水きりしたリンパ節を外科的に摘出した。リンパ節組織をかきまぜ（ slicing）、滅菌ＤＭＥＭ培地で濯ぐことにより該組織からリンパ球を取り出し た。細胞浮遊液をナイロンガーゼに通し、１０００×ｇで１０分間遠心分離にか けることにより回収した。 約１×１０⁸のリンパ球をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（１６ｍＭ、ｐＨ ７.５）中に浮遊させ、３７℃に５分間温めて赤血球を溶解させた。リンパ球を 遠心分離により回収し、Ｌ−ロイシンメチルエステル（ＬＭＥ）中に再浮遊させ 、３７℃で４５分間インキュベートした。ＬＭＥ処理した細胞をナイロンスクリ ーンで濾過し、遠心分離にかけた。１ｍｌのウシ胎仔血清を加え、細胞を浮遊さ せ、血清不含ＲＰＭＩで２回洗浄した。細胞数をカウントし、単一の５０ｍｌ容 コニカル遠心管中で同数のＫ６Ｈ６／Ｂ５ヘテロミエローマ細胞（血清不含培地 で前以て２回洗浄）と混合した。細胞を、１分間かけて穏やかに撹拌しながらゆ っくりと加えた１ｍｌの５０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）中に穏やかに 浮遊させた。ついで、穏やかに撹拌しながら５分間かけて２０ｍｌの血清不含培 地を加えて再浮遊させてＰＥＧを希釈した。血清不含培地で２回洗浄した後、２ ０％ウシ胎仔血清およびゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ培地中に５×１０⁵ ／０.１ｍｌの濃度にて再浮遊させ、０.１ｍｌ／ウエルにて９６ウエルマイクロ 組織培養プレート中に入れた。各ウエルに等容量のＨＡＴ培地（０.１ｍｌ）を 加え、スクリーニングする前にハイブリドーマを１４〜１７日間増殖させた。 抗ＣＤ４産生についての融合細胞ハイブリドーマのスクリーニング 抗ＣＤ４特異性を決定するアッセイは以下のようであった： ＥＬＩＳＡプレ ートを組換えｓＣＤ４で１００ｎｇ／ウエルの濃度にてコーティングし、ＰＢＳ 中の１％ウシ血清アルブミンでブロックした。ハイブリドーマ上澄み液の５０μ ｌアリコートを各ウエルから取り、ｓＣＤ４コーティングプレートとともに６０ 分間インキュベートした。¹²⁵Ｉ標識ヤギ抗ヒトまたはヤギ抗サルＩｇとともに ６０分間インキュベートすることにより結合を検出した。蒸留水で４回洗浄した 後、ウエルをガンマカウンター中でカウントした。陽性のウエルを２回再アッセ イし、それらウエルからのハイブリドーマ細胞を３回、最初は５細胞／ウエルに て、ついで１細胞／ウエルにて２回、サブクローニングした。この段階で抗ｓＣ Ｄ４陽性を細胞表面ＣＤ４へ結合する能力についてスクリーニングした。このこ とは、抗ＣＤ４マウスモノクローナル抗体（１Ｆ３と称する）のＣＤ４陽性細胞 株ＳupＴ１への結合の抑制により行った。簡単に説明すると、このことは、種々 の量のサル 抗ＣＤ４および１０μｇの¹²⁵Ｉ標識１Ｆ３を９６ウエルプレート中で３×１０⁵ ＳupＴ１細胞／ウエルとともに同時にインキュベートすることにより行った。室 温（約２０〜２５℃）で１時間インキュベートした後、細胞を真空によりガラス 繊維フィルター上に取った。ＰＢＳで充分に洗浄した後、フィルターをガンマカ ウンターでカウントして、１Ｆ３のＳupＴ１細胞への結合のサルハイブリドーマ 上澄み液による抑制を決定した。 １Ｆ３に対して強い抑制を示す抗体を産生する候補クローンを選択した。クロ ーンを、ヒトアイソタイプ決定試薬を用いてアイソタイプを決定したところ、ラ ムダ軽鎖を有するＩｇＧ２であることがわかった。この細胞株の免疫グロブリン 遺伝子をクローニングするため、より多数まで増殖させた。 サル不死化Ｂ細胞からの重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のクローニング グアニジニウムイソチオシアネート法を用い、１×１０⁷のサル不死化Ｂ細胞 から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡの１／１０を用い、オリゴ−ｄＴオリゴヌク レオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを作成した。一本 鎖ｃＤＮＡの１／１０を用いてＰＣＲ反応を行った。６つのＰＣＲ反応は、それ ぞれ、ＮｈｅＩ部位を含むＩｇＧ３'定常領域オリゴヌクレオチドとともにＳａ ｌ Ｉ制限部位を含む６つの５'Ｖ_Hファミリー特異的オリゴヌクレオチドプライマ ーの一つを含んでいた（ともに図７−１に示す）。同様に、ＢｇｌII部位を含む ５つの５'ラムダリーダー配列オリゴヌクレオチドプライマーの一つおよびＡｖ ｒ II部位を含む３'ラムダ定常領域プライマーを用い、５つのＰＣＲ反応を行っ た。反応条件は上記の通りであった。各ＰＣＲ反応は３回ずつ行った。重鎖およ び軽鎖増幅反応のそれぞれの生成物を１.２％アガロースゲル上の電気泳動にか けた。 ＶＨ４重鎖プライマー （ 5'- ACTAAGTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT 3' ） およびラムダプライマー （ 5' ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC 3'． ） は、アガロースゲル電気泳動上で強いバンドを与えた。これら反応の生成物を用 いてベクターＴＣＡＥ６（ヒトＩｇＧ１およびヒトラムダ定常領域配列を含む） 中にクローニングした。 発現ベクターＴＣＡＥ６中への２つの可変領域遺伝子のクローニングを順番に 行った。まず、重鎖ＰＣＲ産物およびベクターＴＣＡＥ６を制限酵素ＳａｌＩお よびＮｈｅＩで消化し、生成物をフェノール／クロロホルム抽出し、セファデッ クス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ）Ｇ−２５スピンカラムを通した。ＰＣＲ産物をＴ４Ｄ ＮＡリガーゼの存在下、１４℃にて一夜、切断ベクターにライゲートした。合計 約５００ｎｇのＤＮＡを１０μｌの容量にて挿入物／ベクターモル比１０：１で ライゲートした。ライゲートした物質を用いてＸＬ−１Ｂlueコンピテント細胞 （ストラタジーン）を形質転換し、形質転換した細胞を５０μｇ／ｍｌのアンピ シリンを含有するＬＢアガープレート上に播種した。アンピシリン耐性のコロニ ーを取り、５ｍｌのミニ培養（minicultures）として増殖させた。これら各培養 液からプラスミドＤＮＡを標準アルカリ溶解法により抽出し、制限酵素ＳａｌＩ およびＮｈｅＩで切断し、生成物を１.２％アガロースゲル上の電気泳動にかけ た。約４５０ｂｐの挿入物を有するプラスミドをその後の軽鎖可変領域のクロー ニングのための鋳型として用いた。軽鎖ＰＣＲ反応の生成物および重鎖挿入物を 含有するプラスミドを制限酵素ＢｇｌIIおよびＡｖｒIIで切断し、一緒にライゲ ートした。ＢｇｌIIおよびＡｖｒIIで切断することにより、プラスミドミニ培養 をスクリーニングした。約４００〜４５０ｂｐの挿入物を与える消化物を陽性と してスコアした。ＳａｌＩ／ＮｈｅＩおよびＢｇｌII／ＡｖｒIIの両挿入物を含 有するプラスミドをＤＮＡ配列決定のためさらに大量に増殖させた。 タンデムなキメラ抗体発現ベクターＴＣＡＥ５.２およびＴＣＡＥ６は、ベク ターＣＬＤＮに由来するものであり、ベクターＣＬＤＮ自体はベクターＲＬＤＮ １０ｂの誘導体である［２５３ Ｓcience、７７〜７９（１９９１）］。ＲＬＤ Ｎ１０ｂは発現ベクターＴＮＤの誘導体である［７ ＤＮＡ、６５１〜６６１（ １９８８）］。 ＲＬＤＮ１０ｂはベクターＴＮＤと以下の点で異なる。ジヒドロ葉酸レダクタ ーゼ（ＤＨＦＲ）転写カセット（プロモーター、ｃＤＮＡ、およびポリアデニル 化領域）を、組織プラスミノーゲンアクチベーターカセット（ｔ−ＰＡ発現カセ ッ ト）とネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）カセットとの間に、こ れら３つのカセットがタンデムになり同じ転写方向となるように置いた。さらに 、ＣＬＤＮ中のＤＨＦＲ遺伝子プロモーターはマウスベータグロビンメジャープ ロモーター［３ Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、１２４６〜５４（１９８３）］で置換され 、ｔ−ＰＡ ｃＤＮＡはポリリンカーで置換されていた。３つのすべての真核転 写カセット（発現、ＤＨＦＲ、ＮＥＯ）は、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで 消化することにより細菌プラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ９誘導体）から分離すること ができる。 ＣＬＤＮはポリリンカーの前のラウスＬＴＲがヒトサイトメガロウイルス前初 期遺伝子プロモーターエンハンサーで置換されているのでＲＬＤＮ１０ｂと異な る［４１ Ｃell、５２１（１９８５）］。 発現ベクターＴＣＡＥ５.２およびＴＣＡＥ６は以下の点でＣＬＤＮと異なる ： （１）これら発現ベクターは４つの転写カセット（３つのカセットの代わりに） をタンデムに含有する： （ａ）ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅によって得られたヒト免疫グロブリン軽鎖 定常領域。これはＴＣＡＥ５.２ではヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ定常領域（ カバット番号でアミノ酸１０８〜２１４、アロタイプＫｍ３）であり、ＴＣＡＥ ６ではヒト免疫グロブリン軽鎖ラムダ定常領域（カバット番号でアミノ酸１０８ 〜２１５、遺伝子型Ｏｚマイナス、Ｍｃｇマイナス、Ｋｅマイナスアロタイプ） である。 （ｂ）ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域；両構築物においてヒト免疫グロブリ ン重鎖はガンマ１定常領域（カバット番号でアミノ酸１１４〜４７８アロタイプ Ｇｍ１ａ、Ｇｍ１ｚ）であり、これはＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅によって得ら れたものであった。 （ｃ）ＤＨＦＲ；それ自体の真核プロモーターおよびポリアデニル化領域を含 む。 （ｄ）ＮＥＯ；これも、それ自体の真核プロモーターおよびポリアデニル化領 域を含む。 （２）ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖カセットは、免疫グロブリン鎖の分泌 のための合成シグナル配列を含む。 （３）ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖カセットは、軽鎖および重鎖免疫グロ ブリン可変領域の挿入を可能とし、翻訳読み取り枠を保持し、免疫グロブリン鎖 に通常認められるアミノ酸を変えることのない特定のＤＮＡリンカーを含む。上 記変化を導入することにより、ベクターＴＣＡＥ５.２およびＴＣＡＥ６が構築 された。抗ＣＤ４ヘテロハイブリドーマ細胞株Ｅ９.１からの免疫グロブリン軽 鎖および重鎖可変領域遺伝子のＴＣＡＥ６中へのクローニングにより、ＡＴＣＣ に寄託した構築物が得られた。寄託してありＣＥ９.１抗体をコードする構築物 は、抗ＣＤ４ハイブリドーマ細胞株Ｅ９.１からクローニングしたカニクイザル 免疫グロブリン重鎖可変領域およびカニクイザル免疫グロブリン軽鎖可変領域（ その配列は、それぞれ図１および図２に示してある）を含む。重鎖定常領域はヒ ト由来のガンマ１アイソタイプであり、Ｇｍ１ａ、Ｇｍ１ｚアロタイプである。 ラムダ軽鎖定常領域もまたヒト由来であり、Ｏｚマイナス、ｍｃｇマイナス遺伝 子型であり、Ｋｅマイナスアロタイプである。免疫グロブリン遺伝子を上記出願 （参照のため本明細書中に引用する）に記載された哺乳動物発現ベクターＴＣＡ Ｅ６中にクローニングすると、該ベクターを哺乳動物細胞株ＣＨＯ中にエレクト ポレーションしたときにサル／ヒト抗ＣＤ４キメラ抗体を産生した。本明細書に 記載したＤＮＡ構築物を用いて細菌株ＸＬ−１Ｂlueを形質転換し、抗生物質ア ンピシリンで選択し、１５％グリセリンを含有する滅菌ＬＢ培地中の細菌菌体浮 遊液として寄託した。 ＤＮＡ配列決定 プラスミドＤＮＡを培養液から調製した。これをさらに２.５Ｍ塩化ナトリウ ムと２０％ポリエチレングリコール（６容量）との混合物で氷上で１５分間沈殿 させる（１容量）ことにより精製した。１０,０００×ｇにて２０分間遠心分離 後、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、再度遠心分離し、スピーディバック （Ｓpeedivac）（サバント（Ｓavant））で乾燥させた。このＤＮＡのペレット を脱イオン水中に１５０〜２５０μｇ／ｍｌの濃度にて再懸濁させた。５μｇの 二本鎖ＤＮＡに対してサンガーの方法を用いて配列決定を行った。発現ベクター 内の軽鎖かまたは重鎖のいずれかの挿入物の上流および下流の配列に相補的なシ ークエンシングプライマーを用いた。これら挿入物を５'→３'および３'→５'の 両方向に配列決定した。ＰＣＲ反応の間にヌクレオチド変化が導入されていない か否かを決定するため、それぞれＰＣＲ反応から得られた抗ＣＤ４軽鎖の２つの クローンおよび抗ＣＤ４重鎖の２つのクローンを別々に平行して配列決定した。 選択した重鎖および軽鎖の両クローンはその全長にわたって同一であることがわ かり、増幅プロセスの間に誤りが導入されなかったことが確認された。抗ＣＤ４ 重鎖および軽鎖の配列を図１および図２に示す。 サル／ヒトキメラ抗ＣＤ４の発現 発現ベクターＴＣＡＥ５.２およびＴＣＡＥ６は細胞株Ｓｐ２／０およびＣＨ Ｏ中での安定な導入発現に用いることができるのみならず、ＳＶ４０複製起点を 含むために細胞株ＣＯＳ中でも一過性に発現することができる。ＣＯＳ細胞発現 は以下のようにして行った：ＣＯＳ細胞をトランスフェクションの１日前に播種 して翌日に５０〜７０％コンフルエント細胞となるようにした。培地を除き、細 胞をトランスフェクション緩衝液（ＴＢ − １４０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ト リス、５ｍＭ ＫＣｌ、０.５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ Ｃ ａＣｌ₂）で２回洗浄した。抗ＣＤ４サル／ヒトキメラ重鎖および軽鎖免疫グロ ブリン鎖を含有する塩化セシウム洗浄ＴＣＡＥ６プラスミド（３０μｇ）を、１ 皿当たり３ｍｌのＤＥＡＥデキストラン（ＴＢ中に１ｍｇ／ｍｌ）と混合した。 ＤＮＡを細胞とともに３７℃にて１時間インキュベートした。ＤＮＡ溶液を除き 、２０％グリセリン（３ｍｌ）と１.５〜２.５分間置換し、その後、細胞をＴＢ で２回洗浄した。細胞を１００μＭクロロキンを含有する新たな培地（５ｍｌ） 中で３７℃にて３〜５時間インキュベートし、その後、培地で２回洗浄し、通常 のＤＭＥＭとともに７２時間インキュベートした。トランスフェクションしたＣ ＯＳ細胞からの上澄み液（１００μｌ）を種々の濃度にて抗体の存在についてＥ ＬＩＳＡベースの方法によりアッセイした。ヤギ抗ヒトラムダを用いて９６ウエ ルアッセイプレートをコーティングし、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトＩ ｇＧを検 出抗体として標準ＥＬＩＳＡ条件下で用いた。ＣＯＳ細胞は１０〜４０ｎｇ／ｍ ｌのサル／ヒトキメラ抗体を産生することがわかった。より多量の上澄み液を１ ０倍に濃縮し、ＣＤ４陽性ＳupＴ１細胞に対する直接結合ＲＩＡに用いた。親の 全サル抗体および関連のないヒト抗体免疫グロブリンを、それぞれ、正および負 の対照として用いた。また、サル抗ＣＤ４およびサル／ヒトキメラ抗ＣＤ４を用 いて高親和性マウス抗ＣＤ４（１Ｆ３）抗体への結合を抑制した。これら結果は 、サル／ヒトキメラ組換え抗体（ＡＴＣＣ Ｎｏ.６９０３０）がＣＤ４陽性細胞 に結合するのみならず、全サルまたは１Ｆ３自体とほぼ同じ濃度にてＣＤ４陽性 細胞への１Ｆ３の結合を抑制しうることを示した。 実施例２ 本実施例は、Ｔ細胞増殖およびＭＬＲにおけるＩＬ−２産生に対する影響、Ｆ ｃ受容体および補体結合特性、およびＡＤＣＣおよびＣＤＣ応答を媒体する能力 を含むＣＥ９.１のインビトロ機能特性に関する。さらに、ＣＤ４受容体媒体に 対するインビボ効果および末梢血におけるリンパ球を分析した。以下のことを分 析した。以下の材料および方法を本実施例に用いた。［アンダーソン（Ａnderso n）ら、「ヒトＣＤ４に対する霊長類化モノクローナル抗体のインビトロおよび インビボ特徴付け：モノクローナル抗体はＣＤ４受容体調節を引き起こすがチン パンジーにおいてＣＤ４ Ｔ細胞枯渇は引き起こさない」］。 材料および方法 霊長類化（PRIMATIZED^TM）抗ＣＤ４の分子構築および発現 以前に記載されたようにして［ニューマン（Ｎewman,Ｒ.Ａ.）ら、「ヒトの免 疫療法のための組換え抗体の霊長類化：ヒトＣＤ４に対するマカークザル／ヒト キメラ抗体」、Ｂiotechnology、１０：１４５５（１９９２）］、可変領域免疫 グロブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ｓＣＤ４で免疫したサルから得たヘテ ロハイブリドーマからクローニングした。重鎖および軽鎖可変領域遺伝子をカセ ット発現ベクターＴＣＡＥ６中にタンデムに挿入し、ＤＨＦＲ^-ＣＨＯ細胞中に 安定に導入した後にＩｇＧ１λとして発現させた［ニューマンら、上掲］。増大 量のメトトレキセート中での３ラウンドの増幅により、８日間にわたって７５０ μｇ／ｍＬの過剰の抗体レベルを発現する細胞株が得られた。製造細胞株を生成 し、これを浮遊培養で増殖させ、中空繊維リアクターを接種する前に段階的に拡 張させた［エバンス（Ｅvans）ら、「中空繊維バイオリアクターを用いたマウス モノクローナル抗体の大スケール製造」、ＢioＴechniques ６（８）：７６２（ １９８８）］。 リアクターからの培養上澄み液を、前以てリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７.２）で １２５ｍｌ／分にて平衡化しておいたプロセプ（Ｐrosep）Ａカラム（３００ｍ ｌ、バイオプロセシング・インク（Ｂioprocessing Ｉnc.））に通すことにより モノクローナル抗体ＣＥ９.１を精製した。このカラムをベースラインが確立さ れるまでＰＢＳで洗浄し、結合抗体を５カラム容量の０.２Ｍ酢酸／０.１Ｍグリ シン緩衝液（ｐＨ４.０）で溶出した。溶出液をｐＨ５.５とし、Ｑ−セファロー スカラム（ファルマシア）に通した。ＣＥ９.１はカラムに結合し、これを２５ ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）で洗浄した。抗体を１００ｍＭ ＮａＣｌを含 有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６.５）で溶出し、ＵＳＰ注射用通常食塩 水に対する脱濾過（defiltration）（ミリポア・ペリコン（Ｍillipore Ｐellic on））により濃縮した。最後にＣＥ９.１を０.０４μｍナイロン₆₆ＮＤＰフィル ター（ポール・フィルトレーション（Ｐall Ｆiltration））で濾過した。結合特異性：ＣＥ９.１のＣＤ４⁺ＳupＴ−１８細胞への結合 ９６ウエルのＵ底マイクロタイタープレート（コーニング（Ｃoning））を、 ０.２％ウシ血清アルブミンおよび０.１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで 氷上、１時間、プレブロッキングした。同緩衝液で前以て洗浄したＳupＴ−１８ 細胞（１×１０⁵）を、種々の濃度（２.４ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ）のＣＥ ９.１と氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、第二層抗体（ ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗マウスＩｇ）とともに氷上で３０分間インキュベートした 。細胞を２回洗浄し、固定緩衝液（ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒド）中で再浮 遊させ、ファックスキャン（ＦＡＣＳcan）フローサイトメトリー（ベクトン・ ディッキンソン（Ｂecton Ｄickinson））を用いて分析した。結合特異性：ヒト末梢血白血球へのＣＥ９.１の結合のフロー分析 標準フィコール／ハイパック（Ｆicoll／Ｈypaque）遠心分離法［ボユム（Ｂo yum,Ａ.）、「血液白血球、顆粒球およびリンパ球の分離」、Ｔissue Ａntigens ４：２６９（１９７４）］を用い、単核白血球をヒト末梢血から単離した。末 梢血単核白血球（ＰＭＮＣ）を含有する界面層を取り、ハンクスの平衡塩類溶液 （ＨＢＳＳ）で洗浄し、細胞数をかぞえた。５×１０⁶細胞を２０μｌのＣＥ９. １（２５μｇ／ｍＬ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。ついで、細 胞をＨＢＳＳで洗浄し、２０μｌのヤギ抗ヒトＩＧＧ−ＦＩＴＣ（フィッシャー ・サイエンティフィック（Ｆisher Ｓcientific））とともにインキュべートし た。氷上でさらに３０分間インキュベートした後、自動補正および検量（Ｃalib rite）ビーズでの前検量を用いたベクトン・ディッキンソンファックスキャン装 置にて細胞を分析した。生きたリンパ球集団を前方（forward）光ｖｓ直角光散 乱により同定し、全リンパ球集団を他の事象をゲーティングする（gating out） ことにより単離した。その後の蛍光測定はゲーティングしたリンパ球事象のみを 反映していた。二重染色細胞の定量およびその後のチンパンジー血に対する研究 に用いたモノクローナル抗体としては、抗ヒトＣＤ３（Ｌｅｕ−４−ＦＩＴＣ； ベクトン・ディッキンソン）；フルオレセイン結合抗ヒトＣＤＳ（Ｌｅｕ−２ａ −ＦＩＴＣ；ベクトン・ディッキンソン）；フィコエリトリン結合抗ヒトＣＤ８ （Ｌｅｕ−２ａ−ＰＥ；ベクトン・ディッキンソン）；フィコエリトリン結合抗 ヒトＣＤ２０（Ｌｅｕ−１６−ＰＥ；ベクトン・ディッキンソン）；フルオレセ イン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ(ａｂ')₂（カッペル（Ｃappel））；およびフィコ エリトリン結合マウス抗ＣＤ４（ＯＫＴ４：オルソ・ファーマシューティカルズ （Ｏrtho Ｐharmaceuticals））が挙げられる。ヒト組織交差反応性 ＣＥ９.１をヒト正常組織上で交差反応性について評定した。アビジン−ビオ チンイムノペルオキシダーゼ法［ウイルチェク（Ｗilchek,Ｍ.）ら、「生物分析 的応用におけるアビジン−ビオチン複合体」、Ａnal.Ｂiochem.、１７１：１（ １９８３）］を用い、ビオチン化ＣＥ９.１を３２の異なる組織からのクリオ スタット切断凍結切片上で試験した。ＳupＴ１細胞（ＣＤ４⁺）を正の対照とし て用い、ＳＢ細胞（ＣＤ４^-）を負の対照として用いた。関連のないビオチン化 マウス／ヒト（ＩｇＧ１）キメラ抗体を負の抗体対照として用いた。 大抵の組織について３つの別々の試料を調べ、ＣＥ９.１との反応性を０〜３⁺ のスケールで評価した。幾つかの組織については組織内の異なる構造を別に評価 した。たとえば、肝臓では肝細胞、胆管およびクッパー細胞を独立に評価した。種特異性 幾つかの一般的な研究室霊長類および非霊長類からの末梢血を、ＣＤ４陽性Ｔ 細胞との可能な交差反応性を同定するためにＣＥ９.１を用いてスクリーニング した。この群には、チンパンジー、ヒヒ、アカゲザル、カニクイザル、ブタオザ オザル、ラット、マウス、ウサギおよびイヌが含まれていた。血球を全血（１〜 ５ｍＬ）から４℃での遠心分離（１５００ｒｐｍにて５分間）により単離し、等 容量のＰＢＳ中に再浮遊させて洗浄した。このプロセスをもう１回繰り返し、血 球を等容量のウシ胎仔血清中に再浮遊させた。各種からの２００μｌの血球浮遊 液を２０μｌのＣＥ９.１（２５ｍｇ／ｍＬ）とともに１５ｍＬ容のコニカル遠 心管に入れた。抗体と血球とを混合し、氷上に３０分間置き、ついでＨＢＳＳで 充分に洗浄した。ついで、２０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（フィッシャ ー・サイエンティフィック）を加え、試料を混合した。氷上でさらに３０分間イ ンギュベートした後、試料を氷から取り、前以て３７℃に温めておいた１０ｍＬ の溶解緩衝液（０.１６Ｍ塩化アンモニウムおよび０.１Ｍ ＥＤＴＡナトリウム を含有する０.０１Ｍ重炭酸カリウム、ｐＨ７.４）を加えた。試料を室温にて１ ５分間インキュベートし、ついで１５００ｒｐｍにて５分間遠心分離にかけた。 標識された血球ペレットを１％ウシ血清アルブミンおよび０.０５％アジ化ナト リウムを含有するＨＢＳＳ（ｐＨ７.４）中でさらに２回洗浄した。標識血球を 固定化緩衝液（１.０％ホルムアルデヒドを含有する０.５Ｍ塩化ナトリウム；０ .２２μｍのフィルターで濾過）中に再浮遊させることにより固定した。試料を 上記ベクター・ディッキンソンファクスキャン装置で分析した。インビトロ機能アッセイ：一者（one way）および三者（three way）混合リンパ 球反応 ヒトまたはチンパンジーＴ細胞（１.３×１０⁵）をＣＥ９.１とともにまたは ＣＥ９.１なしで、平底マイクロウエル中、それぞれヒトまたはチンパンジー由 来の関連のない提供者から得たマイトマイシンＣ処理ＰＢＭＣ（６.０×１０⁴） とともに７日間培養した。１μＣｉ／ウエルのトリチウム化チミジンを、培養の 最後の１８時間の間に培養液に加えた。マイクロタイタープレートを遠心分離に かけ、細胞ペレットをＨＢＳＳで洗浄し、ついで液体シンチレーションカウンタ ーでカウントした。各試料をを３回アッセイした。 ３つの別々の関連のないドナーをスティミュレーターおよびレスポンダー混合 物として用いてヒトＭＬＲを行った。このプロトコールを採用したのは、赤十字 バフィーコート血液のＨＬＡ特性付けされていないランダムな試料で良好な応答 が得られる機会を最大にするためであった。このプロトコールではドナー血液は いずれもマイトマイシンＣで処理することも放射線処理することもなかった。ＣＥ９.１のＦｃ受容体結合活性を測定するためのＴＨＰ−１細胞接着アッセイ このアッセイは、２つの細胞株、すなわちＣＤ４を発現する一方の細胞株とＦ ｃ受容体を発現する他方の細胞株との間での抗ＣＤ４抗体による架橋に依存する 。使用したＣＤ４発現パートナーは、ヒトＣＤ４でトランスフェクションした接 着性マウス線維芽細胞株ＤＡＰ（ＤＡＰ／ＣＤ４）であった。Ｆｃ受容体を有す る細胞はＴＨＰ−１であった。ＤＡＰ／ＣＤ４細胞を９６ウエル平底プレート中 に入れ（１００μｌ／ウエル；２５,０００細胞／ウエル）、一夜接着させた。 ＴＨＰ−１細胞を５０ｍＬのＲＰＭＩ培地中に再浮遊させ（１×１０⁶細胞／ｍ Ｌ）、５０Ｕ／ｍＬのγＩＦＮを加えることにより３７℃で２４時間誘発させた 。 γＩＦＮ誘発ＴＨＰ−１細胞をカルシン（calcine）アセトメトキシエステル （ＣＡＭ、モレキュラー・プボーブズ（Ｍolecular Ｐrobes））で以下のように して負荷した；細胞を負荷緩衝液（カルシウムおよびマグネシウムおよび０.１ ％ウシ血清アルブミンを含有するダルベッコＰＢＳ）で洗浄し、１０ｍＬの同緩 衝液中に５×１０⁶細胞／ｍＬにて再浮遊させた。ＣＡＭ（ＤＭＳＯ中に１ｍｇ ／ ｍＬ）を負荷緩衝液で希釈し（１：５０）、ＴＨＰ−１細胞浮遊液に１：１ｖ／ ｖにて加えた。室温にて２０分間インキュベートした後、２５ｍＬの新鮮な負荷 緩衝液を各４ｍＬの細胞／ＣＡＭ混合物に加え、室温にてさらに４０分間インキ ュベートした。ついで、細胞を負荷緩衝液で２回洗浄し、８×１０⁶細胞／ｍＬ にて再浮遊させた。ＰＢＳ中のＣＥ９.１の系列希釈（カルシウム、マグネシウ ムまたはＢＳＡなし）をＣＤ４⁺ＤＡＰ細胞を入れたウエルに加え、室温にて５ 分間インキュベートした。ついで、５０μｌのＣＡＭ負荷ＴＨＰ−１細胞浮遊液 を加え、プレートを暗所、室温にて１時間、インキュベートした。ＤＡＰ細胞な しの対照ウエルもアッセイした。インキュベーション後、ウエルでＰＢＳで３回 洗浄した。最後の洗浄後、ウエル当たり１００μｌのＰＢＳを加え、ついで１０ μｌの２０％トリトンＸ−１００を加えた。シェーカー上に１０〜１５秒間置い た後、プレートをフルオロスキャン（Ｆluoroscan）（ＭＴＸ・ラブ・システム ズ・インク（ＭＴＸ Ｌab Ｓystems Ｉnc.））で読み取った。ＣＥ９.１のＦｃ受容体結合活性を測定するための活性化単球結合アッセイ 以下の差異を有する他は、上記ＴＨＰ−１細胞の記載と同様にしてＦｃ受容体 アッセイを行った。単球の調製は、標準フィコール／ハイパックおよびパーコー ル（Ｐercoll）勾配分離により新鮮なヒト末梢血から行った。単球を上記のよう にしてγＩＦＮで刺激したが、刺激は４８時間行った。プレートを刺激単球で２ ４時間コーティングし、このアッセイではＣＤ４⁺細胞株supＴ−１８を上記ＣＡ Ｍで負荷した。ついで、ＳupＴ１８細胞を、上記刺激単球でコーティングしたプ レートに加えた。このアッセイの主な差異は、負荷されプレート上のＦｃ含有細 胞に加えられるＣＤ４⁺細胞株ＣＡＭである。ＴＨＰ−１細胞を用いる上記アッ セイにおいて順序は逆であった。ＦｃγIIトランスフェクションマウス線維芽細胞への結合 ヒトＦＣＲＨでトランスフェクションしたマウス線維芽細胞株（ＣＤＷ３２− Ｌ）をＡＴＣＣから得た。ＣＥ９.１をｓＣＤ４の存在下および不在下でインキ ュベートすることにより、該抗体の直接結合を決定した。ＣＥ９.１の結合の検 出は、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇ抗体（ サザー ン・バイオテク（Ｓouthern Ｂiotech））とともにインキュベートすることによ り行った。ＣＥ９.１のＦａｂフラグメントは酵素消化により得られ、負の対照 として用いた。ｓＣＤ４の存在下で細胞とともに前以てインキュベートしたＣＥ ９.１（またはＦａｂフラグメント）から得られた吸光値を、ｓＣＤ４の不在下 での抗体から得られた吸光値から差し引いた。ＡＤＣＣアッセイ（supＴ１細胞の溶解） 新鮮なヘパリン処理ヒト血液試料を回収し、ＰＭＮＣをフィコール／ハイパッ ク上での標準遠心分離手順により単離した。バフィーコート中の赤血球を塩化ア ンモニウム緩衝液で溶解し、血球をハンクの平衡塩類溶液で２回洗浄した。末梢 リンパ球（ＰＢＬ）をＲＰＭＩ／１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）１ｍＬ当たり１ ０単位のＩＬ−２で３７℃、５％ＣＯ₂にて２４時間刺激した。２４時間後、Ｐ ＢＬをＲＰＭＩ／５％ＦＣＳ中に再浮遊させた。 ＳupＴ１−１８細胞（１×１０⁶）を１００μＣｉの⁵¹Ｃｒとともに３７℃、 ５％ＣＯ₂にて１時間インキュベートすることにより標識した。細胞をＲＰＭＩ ／５％ＦＣＳで２回洗浄し、１×１０⁴細胞を各ウエルに加えた。３ロットのＣ Ｅ９.１抗体をＲＰＭＩ／５％ＦＣＳで１：２に系列希釈し、アリコートを３つ ずつＳＵＰＴ１−１８含有ウエルに３７℃、５％ＣＯ₂にて３０分間加えた。１ ００μＬの１％トリトンＸ−１００および１００μＬの培地を、それぞれ最大お よび自発的放出対照として用いた。ＩＬ−２刺激したＰＢＬ（８×１０⁵細胞） をウエルに加えた。プレートを９００ｒｐｍにて３分間遠心分離にかけ、３７℃ 、５％ＣＯ₂にて１６時間インキュベートした。各ウエルから上澄み液を回収し 、放射能の量をガンマカウンターでカウントした。アッセイは３回行った。細胞 の溶解パーセントは下記式： を用いて決定した。Ｃ１ｑ結合アッセイ Ｃ１ｑアッセイを４×１０⁶／ｍＬにて浮遊させたＳupＴ１−１８ＣＤ４陽性 細胞株を用いて行った。ＣＥ９.１および対照のアフィニティー精製サル抗ＣＤ ４抗体（５０μｌ）を２０μｇ／ｍＬの等価な濃度にて２×１０⁵ＣＤ４陽性標 的細胞に加えた。細胞浮遊液および抗体を氷上で１時間インキュベートし、つい でＰＢＳ中の１％ＢＳＡで２回洗浄した。５０μＬのヒトＣ１ｑ（１０μｇ／ｍ Ｌ）を各管に加え、氷上で１時間インキュベートした。各管を２回洗浄し、つい でウサギ抗ヒトＣ１ｑＦＩＴＣの１：１５希釈（５０μＬ）とともにインキュベ ートした（１時間、氷上、暗所）。細胞を再度２回洗浄し、０.５ｍＬの１％ホ ルムアルデヒド／ＰＢＳ中に固定した。データ取得および分析のためにコンソー ト（Consort）３０ソフトウエアを用い、細胞をベクトン・ディッキンソンファ ックスチャンフローサイトメトリーで分析した。補体媒体細胞障害アッセイ ＳupＴ１−１８細胞（１×１０⁶）を１００μＣｉの⁵¹Ｃｒとともに３７℃、 ５％ＣＯ₂にて１時間インキュベートすることにより標識した。細胞をＲＰＭＩ ／５％ＦＣＳで２回洗浄し、１×１０⁴細胞を各ウエルに加えた。ＣＥ９.１およ び対照の抗ＣＤ４抗体をＲＰＭＩ／５％ＦＣＳで１；２に系列希釈し、５０μｌ のアリコートを３つずつＳＵＰＴ１−１８含有ウエルに加えた。１００μＬの１ ％トリトンＸまたは１００μＬの培地を、それぞれ⁵¹Ｃｒの最大放出および自発 的放出を測定するためにウエルに加えた。３７℃、５％ＣＯ₂にて９０分間イン キュベートした後、ウサギ補体（カッペル）の１；５希釈をウエルに加えた。プ レートを３７℃、５％ＣＯ₂にてさらに９０分間インキュベートし、ついで９０ ０ｒｐｍにて３分間遠心分離にかけた。各ウエルから上澄み液を回収し、放射能 をガンマカウンターでカウントした。アッセイは３回行った。細胞の溶解パーセ ントは下記式： を用いて決定した。チンパンジーでのインビボ研究 ６匹のチンパンジーを各群２匹の３群に分けた：グループＩ（食塩水対照）； グループII（１０.０ｍｇ／ｋｇＣＥ９.１抗体）、およびグループIII（１０.０ ｍｇ／ｋｇＣＥ９.１抗体）。グループIIの動物は、そのＣＤ４⁺Ｔ細胞カウント がベースラインの３０％に復帰するように、３０日後に１０ｍｇ／ｋｇのＣＥ９ .１で再処理した。グループIIIの動物は、そのＣＤ４⁺Ｔ細胞カウントがベース ラインの７０％に復帰するように、３０日後に１０ｍｇ／ｋｇのＣＥ９.１で再 処理した。これら値が３０日目までに達成されない場合には、ＣＤ４⁺Ｔ細胞値 が各グループについての標的値に達するまで動物を２週間間隔でＣＤ３⁺、ＣＤ ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞値についてスクリーニングする。この時点で動物に３つ の投与量の最大まで１０.０ｍｇ／ｋｇのＣＥ９.１抗体を再度静脈内投与する。 全白血球数、リンパ球および顆粒球値、およびＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺ リンパ球亜集団のベースライン決定は、投与する前の−６日目および０日目、 そして投与後の２４時間および１４日目に行った。本研究では、各１０ｍｇ／ｋ ｇの投与量で行う３つの処理サイクルをチンパンジーに投与した。結果 モノクローナル抗体ＣＥ９.１の結合特異性 可溶性ＣＤ４へのＣＥ９.１の結合についてのＳＰＲによる親和性測定は、１. ０ｎＭのＫｄを示している（ブリガム−バーク（Ｂrigham−Ｂurke）ら、Ｎorth Ａmerican ＢＩＡsymposium １９９５（印刷中））。ＣＤ４^-細胞株に対しては 結合は認められず、抑制試験はＣＤ４⁺細胞への結合が可溶性ＣＤ４により化学 量論的に完全に阻止されることを示した。 ＣＥ９.１反応性の特異性を決定するため、新たに単離したヒトＰＢＭＣへの 結合を二重染色フローサイトメトリー分析により決定した。図９は、ＣＤ３⁺細 胞の約２／３がＣＥ９.１に結合することを示している。リンパ性の亜集団内で は、ＯＫＴ４に結合する細胞はすべてＣＥ９.１についても陽性であったが、Ｃ Ｄ８⁺細胞はすべて陰性であった。幾つかのＣＤ３^-細胞もまたＣＥ９.１との反 応性を示したが、この反応性の性質は明らかには決定されていない。 リンパ由来および非リンパ由来の３２の異なる正常ヒト組織を含むＣＥ９.１ の組織反応性を決定するため、免疫組織化学的分析を行った。非リンパ系組織と しては、主要な臓器、脳、心臓、骨格筋、皮膚、肝臓、腎臓、腺および生殖の各 組織が挙げられる。かかる分析は、リンパ節、脾臓、扁桃および末梢血などのリ ンパ由来の組織以外はいかなる組織とも交差反応性を示さなかった（データは示 していない）。リンパ凝集に限られる染色もまた、大腸、肺、食道および皮膚に おいて観察された。ＣＥ９.１によるヒトＭＬＲの抑制 Ｔ細胞応答に対するＣＥ９.１の影響を、ヒトＭＬＲによりＩＬ−２産生また は増殖応答として評定した。ＣＥ９.１は１０〜３０ｎｇ／ｍｌのＩＣ₅₀にて増 殖およびＩＬ−２産生の両方を阻止し、６０ｎｇ／ｍｌにて約８０％抑制した（ 図１０）。ＣＥ９.１のＦｃ受容体結合アッセイ ＣＥ９.１と単球上のＦｃ受容体との反応性を決定するため、ＣＤ４およびＦ ｃ受容体ベースの細胞−細胞接着アッセイを開発した。一つのアッセイ態様にお いて、単球を新鮮なＰＢＭＣからパーコール勾配遠心分離により単離し、マイク ロタイタープレート中に播種し、γＩＦＮで４８時間刺激した。４８時間後、染 料負荷したＣＤ４⁺ＳupＴ１細胞をＣＥ９.１の存在下または不在下にて活性化接 着単球に加えた。この接着アッセイの第二の態様においては、単球性の非接着性 細胞株ＴＨＰ−１をγＩＦＮで刺激した。２４時間後、活性化ＴＨＰ−１細胞に マーカー染料を負荷し、ＣＥ９.１の存在下または不在下にて、前以て（２４時 間前に）マイクロタイタープレート中に播種しておいた接着性のＣＤ４⁺線維芽 細胞トランスフェクタントに加えた。いずれの場合も、細胞−細胞接着は、一方 の細胞上のＣＤ４および他方の細胞上のＦｃ受容体へのモノクローナル抗体の結 合に依存している。 γＩＦＮ活性化新鮮単球およびＣＤ４⁺ＳupＴ１Ｔ細胞に基づいて図１０ａ、 １０ｂおよび１０ｃに示したデータは、投与量に依存した仕方で細胞−細胞接着 を媒体し、およそのＥＤ₅₀が２０ｎｇ／ｍｌであることを示している。接着はｓ ＣＤ４によって完全に阻止され、ＣＥ９.１のＦ(ａｂ')₂フラグメントによっ ては媒体されえなかった。γＩＦＮによって活性化されていない単球はＣＥ９. １には結合することはできなかった（図１０ｂ）。同様のデータは、ＴＨＰ−１ およびＣＤ４⁺線維芽細胞アッセイに基づくアッセイでも得られた（データは示 していない）。ヒトＦＣγＲII受容体でトランスフェクションしたマウス線維芽 細胞株へのＣＥ９.１の直接結合もまた観察された（データは示していない）。抗体依存性細胞媒体細胞障害（ＡＤＣＣ） ＡＤＣＣアッセイにおいて標的として用いた放射性標識ＳupＴ１細胞は、ＣＥ ９.１の存在下でエフェクター細胞により特異的に溶解されることが示された。 最大の細胞障害は約６μｇ／ｍｌで達成され、合計の特異的溶解は約５０％であ った（図１２）。正の対照としてＩｇＧ２ａアイソタイプの抗ＣＤ４（４Ｄ９） を用いた。この抗体はＣＥ９.１と非常によく似た挙動を示し、合計の細胞溶解 も同レベルであった。それゆえ、ＣＥ９.１はエフェクター細胞上のＦｃ受容体 に非常に有効に結合し、ＣＤ４⁺標的細胞株の殺戮を媒体する。ＣＥ９.１による補体結合 Ｃ１ｑの結合を上記（材料および方法）のようにしてフローサイトメトリーに より測定した。図１３に示すように、ＣＥ９.１がガンマ１サブタイプのヒト重 鎖定常領域を含むという事実にもかかわらず、Ｃ１ｑに対して最小の結合しか示 さなかった（図１３）。アフィニティー精製したサル抗ＣＤ４血清抗体はＣ１ｑ 結合を有効に媒体したので、ＣＥ９.１によるＣ１ｑ結合の欠如は該抗体に特異 的な性質であることが示唆された。ＣＥ９.１によるＣ１ｑ結合の欠如は、補体 結合の不安定さに反映される（図１４）。サル血清からアフィニティー精製した 抗ＣＤ４抗体およびマウスモノクローナルＩｇＧ２ａは、ともに同じ濃度範囲で 有意の溶解を与える。ＣＥ９.１種交差反応性 異なる種からのリンパ球のフローサイトメトリー分析は、チンパンジーおよび ヒト細胞のみがＣＥ９.１に強力に結合することを示した。ヒヒはＣＥ９.１に対 して弱い反応性を示した唯一の他の種であった（ヒヒよりも１０倍弱い）。ヒト およびチンパンジーのリンパ球はともに、該モノクローナル抗体と等しく充分に 反応した（表２）。このことは、ＣＥ９.１によるチンパンジーＭＬＲにおける Ｔ細胞増殖およびＩＬ−２産生の匹敵しうる抑制に反映されていた（データは示 していない）。 ６匹のチンパンジーにおけるインビボ研究 単一のチンパンジーにおける漸増投与量研究でのＣＤ４細胞の枯渇の欠如に基 づき、１０ｍｇ／ｋｇの投与量を４匹のチンパンジーに与えた（さらに、対照群 における２匹の動物には食塩水を与えた）。材料および方法において記載したよ うに、２つの投与量群にはそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇを該研究の０日目に与えた。 図１５は、これら動物におけるＣＤ４およびＣＤ８数に対する影響を要約してい る。抗体投与の直後からＣＤ４受容体を発現する細胞が減少しているのがわかる 。ＣＤ４数の減少は所定の抗体の各投与直後にのみ認められた。食塩水の対照群 では同様のＣＤ４数の変化は認められなかった。ＣＤ８数は処理を通じて影響を 受けなかったが、日毎ベースの変動は観察された（図１５、左のパネル、白丸） 。ＣＤ３⁺−ＣＤ８⁺集団を調べることにより、ＣＤ４数において一層劇的でない 下降が観察された。データは、ＣＤ４抗原修飾の結果であるＣＤ３⁺ＣＤ８^-Ｔ細 胞集団の出現を示唆している。修飾の正確なメカニズムは現段階では不明である が、 他のリンパ球または単球細胞上で発現されたＦｃ受容体による架橋の結果のＣＤ ４分子のインターナリゼーションまたはシェディング（shedding）が含まれる。 図１５における細胞数の比較は、主要な効果はＣＤ４受容体の修飾によるもので はあるが、ＣＤ４⁺細胞の幾らかの枯渇が起こることを示している。大抵の場合 、この修飾効果は抗体投与直後の約７〜１０日の間持続すると思われ、その後、 ＣＤ４発現はベースラインレベルの直下に戻る。 合計のＣＤ４数はベースラインの時点に比べて１０〜５０％下降したままであ るが、処理を止めると正常範囲に戻る。これらチンパンジーを１５０日まで（グ ループ１および２）または３００日まで（グループ３）の期間追跡した。グルー プ２の動物のＣＤ４数は最終処理後の８０日目に正常レベルに戻ったが、グルー プ３の動物は同じ時間枠でベースラインの２０％以内に戻った。 実施例３ 本実施例は、ＰおよびＥ変化を導入したヒトγ４アイソタイプを含むマカーク ザル／ヒトキメラ抗ＣＤ４抗体であるＣＥ９γ４ＰＥを生成するために哺乳動物 細胞に用いるＤＮＡ発現ベクターの遺伝子構築を記載する。ＤＮＡ発現ベクターの構築 それぞれＮｈｅＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を含む５'ＩＤＥＣプライマー＃ ４７９および３'ＩＤＥＣプライマー＃４６２（図１６参照）を用い、細胞株Ｔ ＰＩＴ１０.４（モリソン（Ｓ.Ｍorrison）、ＵＣＬＡ、から入手）からＰＣＲ によりヒトガンマ４重鎖遺伝子を単離した。ヒトガンマ４の全クローニング断片 の配列を決定したところ、カバットらによって記載されたもの（ＮＩＨパブリケ ーション（ＮＩＨ Ｐublication）、第５版、Ｎｏ.９１−３２４２、Ｕ.Ｓ.Ｄep t.of Ｈealth and Ｈuman Ｓervices（１９９１））と同じであることがわかっ た（図１７参照）。ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ断片を発現ベクターＡｎｅｘ２中にク ローニングした。このプラスミドからの全軽鎖および重鎖免疫グロブリン遺伝子 をＢｇｌII−ＳａｃＩ断片上にて他の発現プラスミドに移した。このプラスミド は、ＮＥＯＳＰＬＡ３Ｆ中の抗ＣＤ４（Ｇ４、Ｌ、Ｏｚ−）と称した。 ガンマ４定常領域中のアミノ酸＃２２９および２３６を変えるためにＰＣＲ突 然変異誘発を用いた。それぞれＮｈｅＩおよびＢｓｐＨＩ制限部位を含む５'プ ライマーＧＥ２１２（ミッドランド（Ｍidland））および３'ＩＤＥＣプライマ ー＃６９８を用いてＰＣＲを行い（図１６参照）、該断片を抗ＣＤ４（Ｇ４、Ｌ 、Ｏｚ−）プラスミド中に３部ライゲーション（three part ligation）により クローニングし、配列プラスミドをＮＥＯＳＰＬＡ３Ｆ中の抗ＣＤ４（Ｇ４（Ｐ Ｅ）、Ｌ、Ｏｚ−）と称した。 実施例４ チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現プラスミドの導入および抗体産生クローンの選択 ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４）（ウアラウプ（Ｕrlaub）ら、Ｓom.Ｃell Ｍol.Ｇene t.、１６：５５５〜５６６（１９８６））を、５０μＭヒポキサンチン（ＧＩＢ ＣＯ／ＢＲＬ，ＣＨＯ培地）および８μＭチミジン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，ＣＨ Ｏ培地）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII培地中で増殖させた。この培地をＣＨ Ｏ培地プラスＨＴと称する。 ０.４ｍｌ容の使い捨てキュベット中でＢＴＸ６００エレクトロポレーション 装置（ＢＴＸ、サンジエゴ、カリフォルニア）を用い、４×１０⁶細胞および５ μｇのプラスミドＤＮＡ［ＮＥＯＳＰＬＡ３Ｆ中の抗ＣＤ４（γ４（ＰＥ）、ラ ムダ、ＯＺ−）］で５つのエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレー ションの前にプラスミドをＰａｃＩで制限分解して哺乳動物細胞中で発現される 遺伝子を該プラスミドを細菌で増殖させるのに用いるプラスミド部分から分離し た。エレクトロポレーションの条件は、２３０ボルト、４００マイクロファラデ ー、１３オームであった。各エレクトロポレーションを単一の９６ウエルディッ シュに播種した（約４０,０００細胞／ウエル）。エレクトロポレーションの２ 日後、デイッシュに４００μｇ／ｍｌ活性化合物にてＧ４１８（ジェネティシン 、ＧＩＢＣＯ）を含有するＣＨＯ培地＋ＨＴを与え、その後はコロニーが生ずる まで必要に応じて与えた。コンフルエントなコロニーからの上澄み液を、ヒト抗 体に特異的なＥＬＩＳＡによりキメラ免疫グロブリンの存在についてアッセイし た。５つのプレート上で（４８０ウエルから）２８のＧ４１８耐性コロニーが生 じた。 最も抗体を発現するＧ４１８耐性コロニー（クローン５Ｃ１）は、エレクトロポ レーションの３０日後にコンフルエントであった。サザーンブロット分析は、ク ローン５Ｃ１が単一コピー挿入であることを示している（データは示していない ）。１２５ｍｌ容スピナー中で１０⁵細胞／ｍｌにて接種した４日間の培養にお いて、このクローンは２８時間毎に倍増し、抗体の産生速度は０.５ｐｇ／細胞 ／日（０.９ｍｇ／Ｌ）であった。増幅 クローン５Ｃ１をスケールアップし、ＣＨＯ培地＋５ｎＭメトトレキセート（ ＭＴＸ、シグマ（⁺）アメトプテリン（Ａmethopterin））を入れた９６ウエルデ ィッシュ中に１０⁶細胞／プレートから３×１０⁴細胞／プレートまでの種々の濃 度にて播種した。２０日後、クローン５Ｃ１−５Ｂ９は３×１０⁵細胞／プレー ト上でコンフルエントになった（このプレート上で９６ウエルのうち４９ウエル が増殖した）。このクローンをスケールアップした。Ｔ１５０中にて１０⁵細胞 ／ｍｌにて接種した４日間の培養において、このクローンは３５.５時間毎に倍 増し、抗体の産生速度は１５.３ｐｇ／細胞／日（１８ｍｇ／Ｌ）であった。ク ローン５Ｃ１−５Ｂ９をスケールアップし、ＣＨＯ培地＋５０ｎＭメトトレキセ ートを入れた９６ウエル−ディッシュ中に１００細胞／プレートから３×１０⁴ 細胞／プレートまでの種々の濃度にて播種した。３６日後、クローン５Ｃ１−５ Ｂ９ ５０Ｃ１は１０⁵細胞／プレート上で〜６０％コンフルエントになった（こ のプレート上で９６ウエルのうち５０ウエルが増殖した）。このクローンをスケ ールアップした。ＣＥ９γ４ＰＥペアレントシードストック（Ｐarent Ｓeed Ｓtock；ＰＳＳ）の フェーズＩ供給のための細胞バンク クローン５Ｃ１−５Ｂ９−５０Ｃ１の５０ｎＭ ＭＴＸ ＰＳＳを凍結させた。 これら細胞を、ＣＨＯ培地プラス５０ｎＭ ＭＴＸを入れた５００ｍｌ容スピナ ー中で培養させた。凍結時、培養液は１.１×１０⁶細胞／ｍｌの濃度に達し、生 存率は９６％で倍増時間は２９.３時間であった。抗体産生はＥＬＩＳＡにより 約２７ｐｇ／細胞／日と決定された。細胞を培養液から遠心分離し、９５％の ＪＲＨバイオサイエンスィズ（Ｂiosciences）ウシ胎仔血清および５％シグマ共 通マスター混合物（this common master mixture）中に２.０×１０⁷細胞／ｍｌ の密度にてバイアルに入れ、細胞を含む１ｍｌの凍結培地をバイアル凍結した。 バイアルを−７０℃にて凍結し、翌日、液体窒素タンクに入れた。 一つの５０ｎＭ ＭＴＸ ＰＳＳバイアルを解凍し、ＣＨＯ培地プラス５０ｎＭ ＭＴＸを入れた１００ｍｌ容スピナー中に播種した。３日後、このスピナーを２ ×１０⁵細胞／ｍｌにて２×１２５ｍｌスピナーに分けた。一方のスピナーはＣ ＨＯ培地プラス５０ｎＭ ＭＴＸを含み、他方のスピナーはＣＨＯ培地のみを含 む。 ３日後、ＣＨＯ培地単独のスピナーから１５ｍｌの細胞および培地を凍結し、 マイコプラズマ試験の考慮のため（Ｐoints to Ｃonsider Ｍycloplasma testin g）テクタジェン（Ｔektagen）に送付した。ＭＴＸを用いたおよびＭＴＸを用い ない産生を８週間継続した。テクタジェンからの結果は、ＣＨＯ；クローン５Ｃ １−５Ｂ９−５０Ｃ１ペアレントシードストック中の抗ＣＤ４（ガンマ４（ＰＥ ）、ラムダ、ＯＺ−）ＮＥＯＳＰＬＡ３Ｆがマイコプラズマ不含であることを示 した。５０ｎＭ ＮＭ ＰＳＳの１０のバイアルを液体窒素中での貯蔵に移した。マスター細胞バンク（ＭＣＢ） クローン５Ｃ１−５Ｂ９−５０Ｃ１の２つの５０ｍＭ ＭＴＸ ＰＳＳバイアル を解凍し、ＣＨＯ培地プラス５０ｎＭ ＭＴＸを入れた１００ｍｌ容スピナー中 で播種した。この培養液を、２０００ｍＬの容量、密度９.５×１０⁵および生存 率９８％を達成するまで、徐々により大きなスピナーフラスコ中に６日間拡張し た。培地から細胞を遠心分離し、９５％ＪＲＨバイオサイエンスィズウシ胎仔血 清および５％シグマハイブリマックス（Ｈybrimax）ＤＭＳＯ中に２.０×１０⁷ 細胞の密度にて再浮遊させた。凍結培地中の細胞浮遊液をＭＣＢ Ｇ４ＰＥ５０ −Ｍ−Ａとしてデザインした８０のクリオバイアルのそれぞれの中にアリコート した（１０ｍＬ）。これらバイアルを−７０℃にて凍結した。２４時間後、この 細胞バンクを液体窒素中での貯蔵に移した。 実施例５ ＣＤ４モノクローナル抗体の安定性 ＣＥ９γ４ＰＥ溶液およびＣＥ９γ４Ｅ溶液の物理的および化学的安定性を５ ℃、４０℃で３カ月間モニターし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元）、Ｉ ＥＦ、逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＥＬＩＳ Ａにより簡単に拡散される。ＲＰ−ＨＰＬＣおよび非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ る最初の試験は、ＣＥ９γ４Ｅが２つの主要な分子種、すなわち非還元の全分子 と分析条件下で２つの等価な「ハフマー」と称するユニットに分離される非共有 結合により会合した分子とからなることを示唆している。興味深いことに、これ ら２つのモノクローナル抗体の生物分析プロフィールに主要な差異は、ＳＥＣ、 ＩＥＦ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）およびＥＬＩＳＡにより観察されなかった。 図１８は、ＣＥ９γ４ＰＥおよびＣＥ９γ４Ｅの溶液でのモノマーおよび「ハフ マー」のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）分析を示す。ＣＥ９γ４Ｅでの「ハフマー 」の量は、試験したいずれの条件においても３カ月にわたって最初の試験と比べ て一定のままであった。ＣＥ９γ４ＰＥでの「ハフマー」含量は試験したいずれ の時点の条件下でも２％以下であった。ＣＥ９γ４ＥとＣＥ９γ４ＰＥとの間に は５℃および４０℃において安定性に主要な差異は観察されなかった。拡散光の 下で貯蔵したＣＥ９γ４Ｅ溶液はＣＥ９γ４ＰＥに比べて安定性がわずかに劣っ ている。これらデータは、ＣＥ９γ４Ｅの「ハフマー」が全分子の全体的な安定 性に有意の影響を及ぼさないことを示唆している。ＣＥ９γ４ＰＥ溶液とＣＥ９ γ４Ｅ溶液との間には物理的安定性において主要な差異は観察されなかった。表面プラスモン共鳴（Ｓurface Ｐlasmon Ｒesonance）によるＣＤ４モノクロー ナル抗体の親和性および化学量論 可溶性ＣＤ４の固定化モノクローナル抗体への結合の化学量論は、ＢＩＡコア （ファルマシア）上での飽和結合実験により決定することができる。ＳＰＲプロ グレスの会合相および解離相に関するデータ（図１９）を、オシャネッセイ（Ｏ 'Ｓhannessey）ら、Ａnal.Ｂiochem.、２１２：４６７〜４６８（１９９３）に 記載されているように速度式の積分形を用いて直接分析した。ＣＤ４のモル数／ モルモノクローナル抗体のモル数として表した結合データの要約を表３に示す。 こ のデータから、いずれの場合においても結合の化学量論が１.５：１よりも大き いことがわかる。ＢＩＡコアが固相相互作用系であること、および固定化プロト コールがランダムであることから、これら結果は各モノクローナル抗体の両抗原 結合部位が機能的であることを示唆している。それゆえ、ＣＤ４結合の化学量論 はすべてのモノクローナル抗体について同じであり、理論値の２.０に近いもの であった。さらに親和性測定は、親和性がすべてのモノクローナル抗体複合体に ついて同じ、すなわち約１.０ｎＭであることを示している。 実施例６ ＣＥ９γ４ＰＥのインビトロ生物学的評価要約 ＣＥ９.１、ＣＥ９γ４ＰＥ、および他のガンマ４誘導体を、Ｆａｂ領域によ り媒体される活性（ＭＬＲ）およびＦｃドメインにより媒体される活性（Ｆｃ受 容体結合、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ）について比較した。Ｆａｂ依存性の活性（Ｍ ＬＲ）はモノクローナル抗体間で差異がなかったが、Ｆｃ受容体結合特性におい ては区別された。非修飾ガンマ４誘導体であるＣＥ９γ４はＦｃ受容体に対して 驚くほど強い結合を示したが、ＣＥ９γ４ＥおよびＣＥ９γ４ＥＰにおけるＥ変 異は、この結合並びにＡＤＣＣ活性を欠失させた。混合リンパ球応答（ＭＬＲ）に対するモノクローナル抗体の作用 アロ抗原により駆動されたＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生に対するモノクロー ナル抗体構築物の効果を決定するため、三者混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセ イを行った。ＭＬＲはＣＤ４⁺Ｔ細胞の存在に依存しており、この応答の大部分 はＣＤ４受容体と抗原提示細胞上のＭＨＣクラスII分子との相互作用を介した該 受容体の参与に依存している。ＭＬＲ応答は、インビボでの臓器移植拒絶反応の インビトロ関連側面である。他の薬剤との関連では、ＭＬＲはまたシクロスポリ ンＡなどの免疫抑制剤によっても阻止される。 すべてのモノクローナル抗体は、Ｔ細胞の増殖応答およびＩＬ−２産生の両観 点からみてＭＬＲを阻止する能力において等価であった（図２０および表４）。 それゆえ、ヒトλ４構造中へのＣＥ９.１のＶドメインの移植およびヒンジドメ インおよびＣＨ２ドメイン中での「Ｐ＆Ｅ」置換は、インビトロでのＣＤ４依存 性Ｔ細胞応答を阻止するモノクローナル抗体の能力に影響を及ぼさなかった。 結論 すべてのモノクローナル抗体はＭＬＲの抑制において等価である。モノクローナル抗体のＦｃ受容体結合特性 Ｆｃ受容体結合の決定のアッセイの確認 ＣＥ９γ４ＰＥはＦｃＲ結合活性を欠失するようにデザインされていた。この 活性を測定するため、モノクローナル抗体を介した架橋によるＦｃＲとＣＤ４と に媒体された細胞の結合に基づくアッセイを開発した。このアッセイは、インビ ボでのＦｃＲとモノクローナル抗体とに媒体されたＣＤ４細胞の枯渇のインビト ロ関連として、モノクローナル抗体のＣＤ４およびＦｃＲ結合機能を同時に測定 するものである。 図２１は、ＣＥ９.１が接着アッセイにおいてＣＤ４⁺線維芽細胞（ＣＤ４でト ランスフェクションした線維芽細胞株）へのＦｃＲ発現単球（ＩＦＮ−γにより 誘発されたＴＨＰ−１細胞）の接着を容易にすることを示している。結合はモノ クローナル抗体ＣＥ９.１のＦｃドメインに依存している。なぜなら、切断後の Ｆ(ａｂ')₂は結合を容易にできなかったからである。結合にはまたＣＥ９.１上 の抗原認識部位が必要である。なぜなら、ｓＣＤ４によって該部位が占領される と細胞−細胞接着が阻止されるからである。モノクローナル抗体のＦｃ受容体結合活性の決定 モノクローナル抗体ＣＥ９.１（ＩｇＧ１）、ＣＥ９γ４（ＩｇＧ４）、ＣＥ ９γ４λＫ（ＩｇＧ４ λＫハイブリッド）、ＣＥ９γ４Ｅ（ＩｇＧ４、Ｅ変異 体）およびＣＥ９γ４ＰＥ（ＩｇＧ４、ＰＥ変異体）を、細胞表面ＣＤ４および ＦｃＲに同時に結合する能力について評価した。 予想されるように、ＣＥ９.１は本アッセイにおいて良好な結合活性を有して いた。驚くべきことに、ＩｇＧ４構築物であるＣＥ９γ４およびＣＥ９γ４λＫ はＦｃＲに対して充分な親和性を保持しており、本アッセイにおいてＣＥ９.１ と区別できないほどであった。本アッセイにおいて、ＣＥ９γ４ＥおよびＣＥ９ γ４ＰＥにおけるように「Ｅ」置換が導入された場合にのみ、活性が失われた（ 図２２参照）。ＣＥ９γ４ＰＥのインビトロＣ１ｑ結合特性 補体系は、その様々な機能的補体のなかでも、細胞溶解および破壊に導くよう な仕方である種の抗体と相互作用する能力を含む。ヒトＩｇＧ１抗体は、通常、 Ｃ１ｑに結合する能力を有しており、該抗体が特異性を有する表面抗原を含む標 的細胞を枯渇させる。ＩｇＧ４のような他のヒトアイソタイプはＣ１ｑに結合す る能力が低減しており、それゆえ標的細胞を枯渇させることができない。ガンマ ４構築物でのＣＥ９γ４ＰＥの工学設計は、理論的に補体結合を防ぐという目的 を達成し、該抗体をＣＤ４標的細胞に結合させて潜在的な破壊的副作用を排除す る。 ウサギ補体の存在下でのクロム標識ＣＤ４⁺ＳupＴ１細胞の補体媒体細胞溶解 の古典的方法を用い、ＣＥ９γ４ＰＥとＣＥ９.１とのＣＤＣエフェクター特性 を比較した。これら研究において、ＨｕＣＤ４に対するマウス補体結合性モノク ローナル抗体、４Ｄ９（ＩｇＧ２ａ）を正の対照として用いた。ＣＥ９.１およ びＣＥ９γ４ＰＥの両者ともウサギ補体を結合することはできなかった（図２３ ）。以前よりＣＥ９.１はＣ１ｑへの結合が弱く、それゆえヒト補体に結合でき ないことがわかっていた。これら結果は、両構築物が補体エフェクターメカニズ ムによって細胞溶解を促進することができないことを示している。ＣＥ９γ４ＰＥのインビトロＡＤＣＣエフェクター特性 ＦｃＲを介してモノクローナル抗体に結合することができ、細胞障害能を有す る細胞は、抗体によりコーティングされた標的細胞に対するＡＤＣＣを媒体する ことができる。ＣＤ４分子を発現するヒトＴ細胞はモノクローナル抗体ＣＥ９. １により認識され、このことがＦｃＲ含有キラー細胞、顆粒球および／またはマ クロファージによる攻撃を刺激する。ＣＥ９γ４ＰＥの工学操作の目的はモノク ローナル抗体がＦｃＲに結合する能力を除くことであり、それによってモノクロ ーナル抗体は依然として免疫抑制性でありながら補助細胞がＣＤ４標的細胞の枯 渇を媒体する能力が排除される。 クロム標識ＣＤ４⁺ＳupＴ１細胞の細胞性細胞障害の古典的方法を用い、ＣＥ ９γ４ＰＥとＣＥ９.１とのＡＤＣＣエフェクター特性を比較した。マウスＣＤ ４モノクローナル抗体４Ｄ９（ＩｇＧ２ａ、Ｋ）を正の対照として選択した。エ フェクター細胞はバフィーコートから得たヒト末梢血白血球であった。図１２は 、モノクローナル抗体４Ｄ９およびＣＥ９.１の両者がＣＤ４⁺細胞の特異的溶解 を媒体する能力を示す。同じ条件下においてＣＥ９γ４ＰＥはほとんど作用を有 しなかった。 これら結果は、ＣＥ９γ４ＰＥがＦｃＲまたは補体のいずれのメカニズムにお いても細胞溶解を媒体することができないことを示している。 実施例７ ＣＥ９γ４ＥおよびＣＥ９γ４ＰＥの比較ＰＫ分析 ２つのリードλ４モノクローナル抗体であるＣＥ９γ４ＥおよびＣＥ９γ４Ｐ Ｅ の比較薬動力学を雄スプラーグ−ドーリーラットにおいて調べた。ＣＥ９γ４Ｅ またはＣＥ９γ４ＰＥを静脈内ボーラス投与として１ｍｇ／ｋｇ（１群当たり４ 匹の動物）にて投与し、血液試料を投与４週間後に採取した。循環しているヒト ＩｇＧの存在のみならず組換えヒト可溶性ＣＤ４に結合する能力をも確かめるべ くデザインされたｓＣＤ４／抗ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡを用い、血漿 のＣＥ９γ４ＥおよびＣＥ９γ４ＰＥの濃度を決定した。 １ｍｇ／ｋｇのＣＤ４モノクローナル抗体の静脈内ボーラス投与後、ＣＥ９γ ４Ｅの血漿濃度は３相で下降したが、ＣＥ９γ４ＰＥの血漿濃度は２相で下降し た（図２４）。比較の目的のため、およびＣＥ９γ４Ｅについてはデータ時点の 数が不充分なために最終相を適切に記載することがでないことに鑑み、すべての 血漿濃度−時間プロフィールを２相モデルを用いて分析した。小さな個体間の変 動が観察された。優勢な第二相ｔ_1/2はＣＥ９γ４Ｅについては約４日であり、 ＣＥ９γ４ＰＥについては９日であり、それぞれ血漿濃度−時間曲線下の全面積 の６７％および９３％を占めていた。ＣＥ９γ４ＰＥの見かけの血漿クリアラン スは低く（６.４ｍｌ／時／ｋｇ）、ＣＥ９γ４Ｅのクリアランスの約半分であ った。それゆえ、ＰＥ変異体γ４モノクローナル抗体であるＣＥ９γ４ＰＥの薬 動力学的特性はラットにおける他のヒト化γ１モノクローナル抗体と同様である 。 ラットにおける機能的に完全なＣＥ９γ４ＰＥの長い循環半減期はまた、ヒト に投与したときにＣＥ９γ４ＰＥが一層長期間にわたって有効であることを示唆 している。 これら結果から、ＰＥ変異体であるＣＥ９γ４ＰＥが、ラットにおいてＣＥ９ γ４Ｅ変異体に比べて２倍低いクリアランスおよび一層長い半減期を有すること が確認される。 薬動力学的パラメーターの略語：ＣＬ＝全血漿クリアランス；ＡＵＣ_0-inf＝血 漿濃度ｖ時間曲線下の全面積；ＭＲＴ＝平均残存時間；Ｔ_1/2 ^-1＝最初の相にお ける見かけの半減期；Ｔ_1/2 ^-2＝第二の相における見かけの半減期；％ＡＵＣ₂＝ 第二の相の間の血漿濃度ｖ時間曲線下の面積のパーセント；Ｖ_ss＝定常状態での 分布容量 これら結果に基づき、ＣＥ９γ４ＰＥは、たとえば静脈内投与による治療的使 用に適している。他の投与経路もまた適している。 実施例８ ＨｕＣＤ４⁺トランスジェニックマウスにおけるインビボ薬理学的研究 ＨｕＣＤ４⁺トランスジェニックマウスの説明はじめに ＣＥ９.１およびＣＥ９γ４ＰＥの高度の種特異性はインビボでの効果の評価 を困難なものにしている。ＣＥ９.１については、薬理学的応答はチンパンジー において用量依存性のＣＤ４⁺細胞の枯渇により容易にモニターできた。この活 性はＣＥ９γ４ＰＥでは期待されたように存在しないので、本発明者らは効果を 評価するための他の手段を用いた。とりわけ、ＨｕＣＤ４⁺トランスジェニック マウスにおいて効果を調べた。本系における研究を以下に記載する。ＨｕＣＤ４⁺トランスジェニック ＵＣＳＦにて開発したＨｕＣＤ４トランスジェニックマウス［キレーン（Ｋil leen）ら、ＥＭＢＯ Ｊ.、１２：１５４７〜５３（１９９３）］において、 内在性のＭｕＣＤ４遺伝子を相同組換えにより破壊し、ＭｕＣＤ４プロモーター の制御下でヒトＣＤ４ミニトランスジーンを導入した。ホモ接合まで交雑育種し たこれらマウスにおいて、ＨｕＣＤ４はＭｕＣＤ４を置換している。ＨｕＣＤ４ は胸腺での正の選択および負の選択を復帰させ、正常マウスに匹敵するレベルで 単一の陽性末梢ＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺Ｔ細胞の産生へと導く。さらに、ＭｕＣＤ ４ノックアウト親と比較すると、成熟ＨｕＣＤ４ Ｔ細胞は正常マウスのＴ細胞 に類似した特性を示す：（１）インビボでの血清ＩｇＧレベルが正常レベルまで 回復されており、（２）これら動物はインビトロＮＭＲにおいて適当なＭＨＣ依 存性応答を示す。 これらマウスの遺伝的背景は、最初のノックアウト実験およびトランスジェニ ック実験において異なる株の胚性幹細胞およびマウスを使用する必要から、若干 複雑である。最初のノックアウト／トランスジェニックマウスをその後、ＭＨＣ 遺伝子座におけるホモ接合まで育種し、現在ＳＢにおいて用いているマウスはＨ −２^ddハプロタイプのものである。 結果は、これらマウスにおいて外来抗原、卵アルブミンに対する良好な応答が 得られることを示し、最初の研究はＣＥ９γ４ＰＥについてインビボ活性を示し た。ＨｕＣＤ４トランスジェニックマウスにおけるＣＥ９γ４ＰＥの予備的評価 １２匹のＨｕＣＤ４トランスジェニックマウス（Ｈ−２^dd）を入手し、ＣＥ９ γ４ＰＥをＩＦ３（マウス抗ヒトＣＤ４）およびＧＫ１.５と比較するのに用い た。マウスに−２日目、−１日目および０日目に１ｍｇの抗体を腹腔内投与し、 最後の投与の３時間後にＯＶＡで免疫した。２週間後にマウスを屠殺し、血清お よび細胞を機能的活性について評価した。ＯＶＡ特異的な抗体応答を図２５に示 す。予想されるように、マウスＣＤ４に対するモノクローナル抗体（ＧＫ１.５ ）は体液性応答に対して何ら効果を有しなかったが、ＨｕＣＤ４に対する両モノ クローナル抗体は該応答を阻止した。これら２つのモノクローナル抗体のうちで ＣＥ９γ４ＰＥは一層劇的であった。 すべてのグループのマウスがＣｏｎＡおよびＬＳに応答したが、卵アルブミン に対する応答およびＭＬＲにおいては若干の変動があった。このことは、この動 物のバッチが雄および雌の両マウスを含んでおり、異なる年齢のものであったと いう事実によるものであった。 ＭｕＣＤ４−／−（ＣＤ４ノックアウト）マウスおよびＨｕＣＤ４＋／＋（ト ランスジェニックマウス）をＣＥ９.１、ＣＥ９γ４ＰＥまたは食塩水で処理し た。この研究は２８日間行い、試料を１日目、３日目、７日目、１４日目および ２８日目に採取した。ＣＤ４⁺Ｔ細胞およびＣＤ８⁺Ｔ細胞のその後を追跡するた め、これらマウスの脾臓細胞の３色フローサイトメトリー分析を用いた。Ｔ細胞 レベルを調べるため、以下の抗体を用いた：ＣＤ３−ＰＥ、ＯＫＴ４−ＦＩＴＣ 、ＣＤ８−ＴＣ。これらマウスにおけるＴ細胞およびＢ細胞のその後を追跡する ため、以下の抗体を用いた：ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ２−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＴＣ 。ＣＥ９.１またはＣＥ９γ４ＰＥコーティング細胞のその後を追跡するため、 以下のモノクローナル抗体パネルを用いた：ＯＫＴ４−ＴＣ、Ｌｅｕ３ａ−ＦＩ ＴＣ、ＣＤ３−ＴＣ。 得られたデータは、ＣＥ９.１およびＣＥ９γ４ＰＥの両者で処理したトラン スジェニックマウス（ＨｕＣＤ４＋／＋）において、１日目にすべてのＣＤ４⁺ 細胞が抗体でコーティングされることを示した。コーティングは数日続き、２８ 日目までにはもはや検出できなかった。ＣＥ９.１処理マウスにおいて処理した ＣＤ４⁺細胞の全数は、２８日目においてさえも有意に減少した。対照的に、Ｃ Ｅ９γ４ＰＥ処理マウスでは全ＣＤ４⁺細胞の減少を示さなかった。両抗体はＣ Ｄ４受容体修飾の証拠を示した。ＣＥ９.１処理マウスにおいてＣＤ８⁺細胞パー セントの代償的な増大が認められたが、これらの絶対数が該処理によって有意に 影響されたという証拠はなかった。ＣＥ９γ４ＰＥ処理マウスにおいても同様に ＣＤ８⁺細胞数は影響を受けなかった。すべての実験において、いずれの抗体で もＢ細胞数は一定のままであった。チンパンジーにおけるインビボ研究 ６匹のチンパンジーを、１５ｍｇ／ｋｇまでの増大投与量の抗体注入後のＣＤ ４⁺Ｔ細胞の枯渇および／または細胞表面からのＣＤ４受容体の修飾につい て調べた。末梢血試料を該研究の開始の３週間および２週間前に各チンパンジー から採取し、ＣＤ４⁺Ｔ細胞のベースラインレベルを確立した。ＣＤ４⁺細胞に加 えて、ＣＤ３⁺細胞およびＣＤ８⁺細胞レベルをもフローサイトメトリーにより測 定した。ＣＤ４分子の異なる部分に結合し、ＣＥ９γ４ＰＥと結合について競合 しないモノクローナル抗体ＯＫＴ４を対照として用いた。全ＣＤ３⁺数からＣＤ ８⁺数を差し引くことによりＣＤ４⁺Ｔ細胞数の理論値を計算することができた。 この値をＯＫＴ４を求めるＣＤ４⁺細胞の測定値と比較することにより、ＣＤ４ 受容体修飾をＣＤ４⁺細胞枯渇から区別することができた。 研究の開始の際に各チンパンジーに食塩水を静脈内注入した。注入後直ちに、 および３日後および１４日後に血液試料を採取した。ＣＥ９γ４ＰＥ（０.０５ ｍｇ／ｋｇ）を各チンパンジーに注入し、血液試料を３日後および１４日後に採 取した。ＣＤ４⁺細胞をモニターし、もし正常範囲であれば次の投与量レベルの ＣＥ９γ４ＰＥを与えた。すべての場合において各チンパンジーには以下のプロ トコールを与えた：食塩水、０.０５ｍｇ／ｋｇ ＣＥ９γ４ＰＥ、１.５ｍｇ／ ｋｇ ＣＥ９γ４ＰＥ、食塩水、１５ｍｇ／ｋｇ ＣＥ９γ４ＰＥ。 食塩水または０.０５ｍｇ／ｋｇのＣＥ９γ４ＰＥを注入した後にはＣＤ４レ ベルに影響は認められなかった。１.５ｍｇ／ｋｇでは、ＣＤ４⁺細胞コーティン グが観察され、細胞表面からのＣＤ４受容体の一過性で部分的な修飾が認められ たが、ＣＤ４⁺細胞の枯渇は認められなかった。１５ｍｇ／ｋｇのＣＥ９γ４Ｐ ＥではＣＤ４⁺細胞の枯渇はいずれの動物においても認められなかったが、すべ ての動物において有意の修飾が認められた。この修飾効果は一過性のものであり 、１４〜２１日目にはベースラインに回復した。いずれの動物においても副作用 は認められなかった。ＣＥ９γ４ＰＥは投与後２日まで細胞表面上に検出され、 血清中に検出することができた。 ＣＥ９γ４ＰＥは非枯渇抗体としてデザインされたものであり、比較的高い投 与量である１５ｍｇ／ｋｇにおいてさえもいずれの動物でも枯渇は観察されなか った。ＣＥ９γ４ＰＥはチンパンジーの血清中で安定であり、２１日目まで循環 血液中に残存した。用途 本明細書に記載した方法または同等の方法により産生された抗体は、機能的な 生物学的アッセイにおいて特徴付けるためのアフィニティークロマトグラフィー とサイズ排除クロマトグラフィーとの併用により精製することができる。これら アッセイは、特異性および結合親和性並びに発現されたアイソタイプに関連する エフェクター機能、たとえばＡＤＣＣ、または補体結合の決定を含む。かかる抗 体は、Ｂ細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ、自己免疫疾患および炎症性疾患を含む感染疾 患、および臓器移植を含む、ＣＤ４発現およびＴ細胞が関与する多くのヒト疾患 に対する受動または能動治療剤として用いることができる。これら抗体は、天然 の形態か、または抗体／キレート、抗体／薬剤または抗体／毒素複合体の一部と して用いることができる。さらに、全抗体または抗体フラグメント（Ｆａｂ₂、 Ｆａｂ、Ｆｖ）を、造影剤として、または抗イディオタイプ応答を生成するため の能動免疫療法における可能なワクチンまたは免疫原として用いることができる 。 治療効果を得るのに有用な抗体の量は、当業者によく知られた標準法により決 定することができる。これら抗体は、一般に、薬理学的に許容しうる緩衝液中に て標準法により提供され、所望の経路により投与することができる。本明細書に おいて特許請求している抗体の有効性およびヒトによる寛容のため、これら抗体 をヒトにおいて種々の疾患または疾患状態を治癒するために繰り返し投与するこ とができる。 本発明の抗ＣＤ４組換え抗体（またはそのフラグメント）はまた、免疫修飾の 誘発、たとえばヒトまたは動物の免疫系の抑制の誘発にも有用である。それゆえ 、本発明は、本発明による該抗体の有効かつ非毒性量を、予防または治療を必要 とするヒトまたは他の動物に投与することによる、ヒトまたは他の動物において 予防的または治療的に免疫修飾を誘発する方法に関する。 本発明の化合物が免疫抑制を誘発する能力は、この目的に用いられる標準試験 、たとえば混合リンパ球反応試験またはチミジンの取り込みにより測定されるＴ 細胞増殖の抑制を測定する試験により示すことができる。 本発明の抗体が免疫抑制の誘発において有用性を有することは、該抗体が移植 臓器または組織（たとえば、腎臓、心臓、肺、骨髄、皮膚、角膜等）への抵抗ま たは拒絶の治療または予防；自己免疫疾患、増殖性疾患および過増殖性疾患の治 療または予防、免疫学的に投薬される疾患（たとえば、慢性関節リウマチ、エリ テマトーデス、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋 無力症、１型糖尿病、ぶどう膜炎、ネフローゼ症候群、乾癬、アトピー性皮膚炎 、接触性皮膚炎および深部湿疹性皮膚炎（further eczematous dermatitis）、 脂漏性皮膚炎、天疱瘡、水泡性天疱瘡、表皮水泡症、蕁麻疹、血管浮腫、脈管炎 、紅斑、皮膚好酸球増加症、円形脱毛症等）の皮膚提示（cutaneous manifestat ion）の治療または予防；可逆性閉塞性気道疾患（reversible obstructive airw ays disease）、消化管炎症およびアレルギー（たとえば、腹腔疾患、直腸炎、 好酸球増加性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病および潰瘍性大腸炎）および食物 関連アレルギー（たとえば、偏頭痛、鼻炎および湿疹）の治療に有用であること を意味する。本発明の抗体はまた、免疫修飾が望ましい非自己免疫状態、たとえ ば、とりわけ移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、臓器移植拒絶、喘息、ＨＩＶ、白血 病、リンパ腫の治療に潜在的な有用性を有する。 当業者であれば、日常的な実験により、免疫抑制を誘発する目的のために有効 かつ非毒性の抗体量を決定することができるであろう。しかしながら、一般に、 有効投与量は約０.０５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲であろう。 本発明の抗体（またはそのフラグメント）はまた、哺乳動物における腫瘍の治 療に有用であろう。さらに詳しくは、本発明の抗体は、腫瘍のサイズを小さくし 、腫瘍の増殖を抑制し、および／または腫瘍を有する動物の生存期間を延ばすの に有用である。従って、本発明は、有効かつ非毒性の量の抗体をヒトまたは他の 動物に投与することによる、ヒトまたは他の動物における腫瘍の治療方法にも関 する。当業者であれば、日常的な実験により、発癌性腫瘍を治療する目的のため に有効かつ非毒性の抗体量を決定することができるであろう。しかしながら、一 般に、有効投与量は約０.０５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲であろう。 本発明の抗体は、上記治療方法に従い、治療または予防効果を得るのに充分な 量にてヒトまたは他の動物に投与することができる。本発明のかかる抗体は、公 知の方法に従って本発明の抗体を通常の薬理学的に許容しうる担体または希釈剤 と混合することによって調製した通常の剤型にて、かかるヒトまたは他の動物に 投与することができる。薬理学的に許容しうる担体または希釈剤の形態および特 性が、該担体または希釈剤とともに用いる活性成分の量、投与経路および他のよ く知られた変数によって指定されつことは当業者により認識されるであろう。 本発明の抗体（またはそのフラグメント）の投与経路は、経口、非経口、吸入 または局所であってよい。本明細書において用いる非経口なる語は、静脈内、筋 肉内、皮下、直腸、膣または腹腔内投与を含む。非経口投与の皮下および筋肉内 形態が一般に好ましい。 予防的または治療的に免疫抑制を誘発するために、あるいは発癌性腫瘍を治療 するために用いる本発明の化合物の１日当たりの非経口および経口投与量は、一 般に、約０.０５〜１００ｍｇ／ｋg体重／日の範囲であるが、約０.５〜１０ｍ ｇ／ｋｇ体重／日が好ましい。 本発明の抗体はまた、吸入によっても投与することができる。「吸入」とは鼻 内および経口吸入投与を意味する。かかる投与に適した剤型、たとえばアエロゾ ル製剤または計量投与吸入器は、常法により製造することができる。使用すべき 本発明の化合物の好ましい投与量は、一般に約１０〜１００ｍｇの範囲である。 本発明の抗体はまた、局所的に投与することができる。局所投与とは、非全身 的な投与をいい、本発明の抗体（またはそのフラグメント）化合物の表皮外面へ の適用、頬面窩洞への適用および該抗体の耳、目および鼻および血流へ有意に侵 入することのない部位への点滴注入を含む。全身投与とは、経口、静脈内、腹腔 内および筋肉内投与をいう。治療的または予防的効果に必要な抗体の量は、もち ろん、選択した抗体、治療しようとする状態の性質および重篤度および治療を受 ける動物により変わるであろうし、最終的には医師の裁量に任される。本発明の 抗体の適当な局所投与量は、一般に、約１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲で あろう。製剤 抗体またはそのフラグメントを単独で投与することも可能ではあるが、医薬製 剤として投与するのが好ましい。活性成分は、局所投与の場合、製剤の０.００ １％〜１０％ｗ／ｗ、たとえば１〜２重量％を構成してよく、１０％ｗ／ｗもの 高含量を構成してもよいが、５％ｗ／ｗを越えないのが好ましく、製剤の０.１ 〜１％ｗ／ｗであるのがより好ましい。 本発明の局所製剤は、１またはそれ以上の許容しうる担体および任意の他の治 療成分とともに治療剤成分を含む。担体は、製剤中の他の成分と両立でき、投与 された者に有害でないという意味で「許容しうる」ものでなければならない。 局所投与に適した製剤としては、治療の必要な部位の皮膚を浸透するのに適し た液体または半固体製剤、たとえばリニメント剤、ローション剤、クリーム剤、 軟膏剤またはパスタ剤、および目、耳または鼻に投与するのに適した点眼剤が挙 げられる。 本発明による点眼剤は、滅菌水性または油性溶液または懸濁液を含んでいてよ く、殺菌剤および／または抗真菌剤および／または他の適当な保存剤の適当な水 溶液中に活性成分を溶解し、好ましくは界面活性剤を含ませることにより調製で きる。ついで、得られた溶液を濾過により清澄化し、適当な容器に移し、ついで 該容器を密封し、オートクレーブするかまたは９０〜１００℃にて１時間半保持 することにより滅菌する。別法として、溶液を濾過滅菌し、無菌法により容器に 移してもよい。点眼剤に含めるのに適した殺菌剤および抗真菌剤の例としては、 硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０.００２％）、塩化ベンザルコニ ウム（０.０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０.０１％）が挙げられる。油 性溶液の調製に適した溶媒としては、グリセリン、希釈アルコールおよびプロピ レングリコールが挙げられる。 本発明によるローション剤としては、皮膚または目に適用するのに適したもの が挙げられる。眼科用ローション剤は任意に殺菌剤を含む滅菌水溶液を含み、点 眼剤の製造法と同様の方法により調製できる。皮膚用のローション剤またはリニ メント剤はまた、乾燥促進剤や皮膚冷却剤、たとえばアルコールやアセトン、お よび／または湿潤剤、たとえばグリセリンまたはヒマシ油やラッカセイ油などの 油を含んでいてよい。 本発明によるクリーム剤、軟膏剤またはパスタ剤は、活性成分の外用半固体製 剤である。これら製剤は、適当な機械の助けをかりて、単独または水性または非 水性流体中の溶液または懸濁液中の細分もしくは粉末形状の活性成分を脂肪性ま たは非脂肪性基剤と混合することにより製造できる。基剤は、硬パラフィン、軟 パラフィンまたは流動パラフィン、グリセリン、蜜蝋、金属石鹸；漿剤；アーモ ンド油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然 由来の油；羊毛脂またはその誘導体、またはステアリン酸やオレイン酸などの脂 肪酸をプロピレングリコールやマクロゴールなどのアルコールとともに含んでい てよい。これら製剤はまた、陰イオン性、陽イオン性または非イオン性界面活性 剤などの適当な界面活性剤、たとえばソルビタンエステルやそのポリオキシエチ レン誘導体などを含んでいてよい。懸濁化剤、たとえば天然ゴム、セルロース誘 導体または石英シリカ（silicaceous silica）などの無機物質、およびラノリン などの他の成分も含んでいてよい。 当業者であれば、本発明の抗体またはそのフラグメントの最適量および個々の 投与の間隔が、治療しようとする状態の性質および程度、投与の形態、経路およ び部位、および治療しようとする特定の動物により決定されること、およびかか る最適さが常法により決定しうることを認識するであろう。また、当業者であれ ば、治療の最適コース、すなわち所定の日数の間に投与する本発明の抗体または そのフラグメントの投与の回数が治療決定試験の通常のコースを用いて当業者に より確認されうることがわかるであろう。 さらに労かけることなく、当業者であれば上記の記載に従い、本発明を最大限 に利用することができると思われる。それゆえ、以下に記載するのは単に例示の ためのものであって、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意 図するものではない。カプセル製剤 カプセル剤の形態の本発明の医薬組成物は、標準的なツーピースハードゼラチ ンカプセルに５０ｍｇの粉末形状の本発明の抗体またはそのフラグメント、１０ ０ｍｇの乳糖、３２ｍｇのタルクおよび８ｍｇのステアリン酸マグネシウム を充填することにより調製する。注射用非経口組成物 注射による投与に適した形態の本発明の医薬組成物は、本発明の抗体またはそ のフラグメント１.５重量％を１０容量％プロピレングリコールおよび水中で撹 拌することにより調製する。この溶液を濾過滅菌する。軟膏組成物 本発明の抗体またはそのフラグメント１.０ｇ 白色ワセリン１００.０ｇまで 本発明の抗体またはそのフラグメントを少量のビヒクル中に分散させて滑らか で均一な生成物を得る。ついで、折り畳める金属チューブに該分散液を充填する 。局所クリーム組成物 本発明の抗体またはそのフラグメント１.０ｇ ポーラワックスＧＰ２００ ２０.０ｇ 無水ラノリン２.０ｇ 白色蜜蝋２.５ｇ ヒドロキシ安息香酸メチル０.１ｇ 蒸留水１００.０ｇまで ポーラワックス、蜜蝋およびラノリンを６０℃にていっしょに加熱する。ヒド ロキシ安息香酸メチルの溶液を加え、高速撹拌により均一にする。ついで、温度 を５０℃に下げる。ついで、本発明の抗体またはそのフラグメントを加え、充分 に分散させ、低速撹拌により組成物を冷却する。局所ローション組成物 本発明の抗体またはそのフラグメント１.０ｇ ソルビタンモノラウレート０.６ｇ、ポリソルベート２０ ０.６ｇ セトステアリルアルコール１.２ｇ、グリセリン６.０ｇ ヒドロキシ安息香酸メチル０.２ｇ 精製水Ｂ.Ｐ.１００.０ｍｌまで（Ｂ.Ｐ.＝英国薬局方） ヒドロキシ安息香酸メチルおよびグリセリンを７５℃にて７０ｍｌの水中に溶 解する。ソルビタンモノラウレート、ポリソルベート２０およびセトステアリル アルコールを７５℃にていっしょに融解し、上記水溶液に加える。得られたエマ ルジョンを均一にし、連続撹拌により冷却し、本発明の抗体またはそのフラグメ ントを残りの水中の懸濁液として加える。懸濁液全体を均一になるまで撹拌する 。点眼組成物 本発明の抗体またはそのフラグメント０.５ｇ ヒドロキシ安息香酸メチル０.０１ｇ ヒドロキシ安息香酸プロピル０.０４ｇ 精製水Ｂ.Ｐ.１００.０ｍｌまで ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルを７５℃にて７ ０ｍｌの精製水中に溶解し、得られた溶液を冷却する。ついで、本発明の抗体ま たはそのフラグメントを加え、溶液をメンブランフィルター（０.０２２μｍ孔 径）で濾過滅菌し、適当な滅菌容器に無菌的に充填する。吸入による投与のための組成物 １５〜２０ｍｌ容のアエロゾル容器：１０ｍｇの本発明の抗体またはそのフラ グメントを０.２〜０.５％の滑沢剤、たとえばポリソルベート８５またはオレイ ン酸と混合し、該混合物を噴射剤、たとえばフレオン中、好ましくは（１,２ジ クロロテトラフルオロエタン）およびジフルオロクロロメタンとともに分散させ 、鼻内かまたは経口吸入投与のいずれかに適合した適当なアエロゾル容器に入れ る。 １５〜２０ｍｌ容のアエロゾル容器のための吸入投与用組成物：１０ｍｇの本 発明の抗体またはそのフラグメントをエタノール（６〜８ｍｌ）中に溶解し、０ .１〜０.２％の滑沢剤、たとえばポリソルベート８５またはオレイン酸を加え、 これを噴射剤、たとえばフレオン中、好ましくは（１,２ジクロロテトラフルオ ロエタン）およびジフルオロクロロメタンとともに分散させ、鼻内かまたは経口 吸入投与のいずれかに適合した適当なアエロゾル容器に入れる。 本発明の抗体および医薬組成物は、非経口投与、すなわち皮下、筋肉内または 静脈内投与に特に有用である。非経口投与用組成物は、一般に、適当な担体、好 ましくは水性担体中に溶解した本発明の抗体またはそのフラグメントまたはその 混合物の溶液を含むであろう。様々な水性担体、たとえば水、緩衝水溶液、０. ４％食塩水、０.３％グリシンなどを用いることができる。これら溶液は滅菌し てあり、一般に微粒子物質を含まない。これら溶液は、通常の、よく知られた滅 菌法により滅菌できる。これら組成物は、適当な生理条件に必要な薬理学的に許 容しうる添加物質、たとえばｐＨ調節剤や緩衝化剤などを含んでいてよい。かか る医薬製剤中の本発明の抗体またはそのフラグメントの濃度は、広範囲に、すな わち約０.５重量％未満、通常少なくとも約１重量％から１５または２０重量％ の高濃度までであってよく、選択した特定の投与法に従い、主として流体の容量 、粘度等に基づいて選択されるであろう。 それゆえ、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水溶液、 および５０ｍｇの本発明の抗体またはそのフラグメントを含有するように調製で きる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、２５０ｍＬの滅菌緩衝水 溶液、および１５０ｍｇの本発明の抗体またはそのフラグメントを含有するよう に調製できる。非経口投与用組成物の実際の調製方法はよく知られており、ある いは当業者には明らかであり、たとえばレミントンのファーマシューティカル・ サイエンス（Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓcience）、第１５版、マック・ パブリシング・カンパニー（Ｍack Ｐublishing Ｃompany）、イーストン、ペン シルベニア（参照のため本明細書中に引用する）に一層詳細に記載されている。 本発明の抗体（またはそのフラグメント）は貯蔵のために凍結乾燥することが でき、使用前に適当な担体中で再構成することができる。この技術は通常の免疫 グロブリンで有効であることが示されており、当該技術分野で知られた凍結乾燥 および再構成法を用いることができる。 意図する結果に応じて、本発明の医薬組成物は予防および／または治療処置の ために投与することができる。特定の適用において、すでに疾患を患う患者に該 疾患およびその合併症を治癒もしくは少なくとも部分的に阻止するのに充分な量 にて組成物を投与する。予防的な適用においては、本発明の抗体またはその混合 物を含有する組成物を、いまだ疾患状態にない患者に投与して患者の耐性を高め る。 医薬組成物の単回または多回投与を、処置に当たっな医師により選択された投 与量レベルおよび投与パターンにて行うことができる。いずれにしても、本発明 の医薬組成物は、患者を有効に処置するに充分な所定量の本発明の変異抗体（ま たはそのフラグメント）を提供する。 本発明の抗体はまた、該抗体と同じ療法に有用なペプチド性かまたは非ペプチ ド性の化合物（模倣物）のデザインおよび合成に用いることができる。たとえば 、サラゴビ（Ｓaragovi）ら、Ｓcience、２５３：７９２〜７９５（１９９１） を参照。寄託 ＣＥ９.１を発現するＴＣＡＥ６中の株ＸＬ１Ｂlue、Ａnti-ＣＤ４はＡＴＣＣ に寄託してあり、その受託番号は６９０３０である。この寄託は１９９２年７月 ９日になされた。 出願人およびその譲受人は、これら培養物が、発行された特許の期間の終了前 、培養物の最新の請求の５年後、または３０年、のうちいずれか遅くまでに死亡 した場合には該培養物を取り替える義務を有すること、およびかかる特許の発行 を寄託機関に通知する義務を有すること知っており、該特許が発行されたときに 本寄託は公衆に非変更的に入手可能となるであろう。そのときまで、本寄託は３ ７Ｃ.Ｆ.Ｒ.セクション１−１４および３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.セクション１１２の規定に 基づき、特許庁長官に入手可能とされるであろう。 他の態様は下記特許請求の範囲にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７ 39/395 39/395 Ｕ Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 レフ，ミッチェル・イー アメリカ合衆国92122カリフォルニア州 サンディエゴ、コンブ・ウェイ4166番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトＣＤ４に対して産生された旧世界サルモノクローナル抗体の可変重鎖 および軽鎖配列およびヒト定常ドメイン配列を含む、ヒトＣＤ４に特異的なキメ ラ抗体。 ２．ヒト重鎖定常ドメイン配列が、ガンマ１アイソタイプ、ガンマ４アイソタ イプ、または２３６位でのグルタミン酸によるロイシンの置換および／または２ ２９位でのプロリンによるセリンの置換により変異したガンマ４アイソタイプか ら選ばれる、請求項１に記載のキメラ抗体。 ３．該重鎖および軽鎖抗原結合配列が図１および図２に示すものである、請求 項１に記載のキメラ抗体。 ４．Ｆｃ受容体結合活性を欠くかまたはγ１キメラ抗体に比べて低減しており 、補体結合能を欠き、変化した薬動力学的プロフィールを示し、および／または インビボでのＴ細胞枯渇活性を欠く、請求項１に記載の記載抗体。 ５．アネルギーの誘発およびＴ細胞のアポトーシスを含む、ＣＤ４に関連する 免疫機能を変えるかまたは修飾する、請求項１に記載のキメラ抗体。 ６．ＣＥ９.１、ＣＥ９γ４、ＣＥ９γ４λＫ、ＣＥ９γ４Ｅ、および ＣＥ９γ４ＰＥよりなる群から選ばれたものである、請求項１に記載の抗ＣＤ４ キメラ抗体。 ７．請求項１に記載のキメラ抗体をコードする組換えＤＮＡ。 ８．請求項２に記載のキメラ抗体をコードする組換えＤＮＡ。 ９．請求項３に記載のキメラ抗体をコードする組換えＤＮＡ。 １０．請求項４に記載のキメラ抗体をコードする組換えＤＮＡ。 １１．請求項６に記載のキメラ抗体をコードし、その発現を提供する組換えＤ ＮＡ。 １２．請求項７に記載の組換えＤＮＡを組換え宿主細胞中で発現することを含 む、ＣＤ４に特異的なキメラ抗体の製造方法。 １３．請求項８に記載の組換えＤＮＡを組換え宿主細胞中で発現することを含 む、ＣＤ４に特異的なキメラ抗体の製造方法。 １４．請求項９に記載の組換えＤＮＡを組換え宿主細胞中で発現することを含 む、ＣＤ４に特異的なキメラ抗体の製造方法。 １５．請求項１０に記載の組換えＤＮＡを組換え宿主細胞中で発現することを 含む、ＣＤ４に特異的なキメラ抗体の製造方法。 １６．請求項１１に記載の組換えＤＮＡを組換え宿主細胞中で発現することを 含む、ＣＤ４に特異的なキメラ抗体の製造方法。 １７．治療的または予防的に有効な量の請求項１に記載のキメラ抗体を投与す ることを含む、ＣＤ４に関連した状態の治療または予防方法。 １８．治療的または予防的に有効な量の請求項２に記載のキメラ抗体を投与す ることを含む、ＣＤ４に関連した状態の治療または予防方法。 １９．治療的または予防的に有効な量の請求項３に記載のキメラ抗体を投与す ることを含む、ＣＤ４に関連した状態の治療または予防方法。 ２０．治療的または予防的に有効な量の請求項４に記載のキメラ抗体を投与す ることを含む、ＣＤ４に関連した状態の治療または予防方法。 ２１．治療的または予防的に有効な量の請求項６に記載のキメラ抗体を投与す ることを含む、ＣＤ４に関連した状態の治療または予防方法。 ２２．該ＣＤ４に関連した状態が自己免疫疾患である、請求項１６に記載の方 法。 ２３．該ＣＤ４に関連した状態が自己免疫疾患である、請求項１７に記載の方 法。 ２４．該ＣＤ４に関連した状態が自己免疫疾患である、請求項１８に記載の方 法。 ２５．該ＣＤ４に関連した状態が自己免疫疾患である、請求項１９に記載の方 法。 ２６．該ＣＤ４に関連した状態が自己免疫疾患である、請求項２０に記載の方 法。 ２７．該自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項２１に記載の方法。 ２８．該自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項２２に記載の方法。 ２９．該自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項２３に記載の方法。 ３０．該自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項２４に記載の方法。 ３１．該自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項２５に記載の方法。 ３２．該状態が、白血病、リンパ腫、移植片対宿主病、喘息、臓器移植拒絶お よびＨＩＶ感染より選ばれる非自己免疫疾患である、請求項１７に記載の方法。 ３３．該状態が、白血病、リンパ腫、移植片対宿主病、喘息、臓器移植拒絶お よびＨＩＶ感染より選ばれる非自己免疫疾患である、請求項１８に記載の方法。 ３４．該状態が、白血病、リンパ腫、移植片対宿主病、喘息、臓器移植拒絶お よびＨＩＶ感染より選ばれる非自己免疫疾患である、請求項１９に記載の方法。 ３５．該状態が、白血病、リンパ腫、移植片対宿主病、喘息、臓器移植拒絶お よびＨＩＶ感染より選ばれる非自己免疫疾患である、請求項２１に記載の方法。 ３６．該状態がＣＤ４⁺細胞によって媒体されるかまたはＣＤ４⁺細胞が関与す る、請求項１７に記載の方法。