NO324497B1 - Chimerisk anti-CD4-antistoff, fremgangsmate for fremstilling derav, DNA-kodende for et slikt antistoff samt anvendelse derav for fremstilling av et medikament til behandling av en ikke-autoimmun sykdom. - Google Patents
Chimerisk anti-CD4-antistoff, fremgangsmate for fremstilling derav, DNA-kodende for et slikt antistoff samt anvendelse derav for fremstilling av et medikament til behandling av en ikke-autoimmun sykdom. Download PDFInfo
- Publication number
- NO324497B1 NO324497B1 NO19980915A NO980915A NO324497B1 NO 324497 B1 NO324497 B1 NO 324497B1 NO 19980915 A NO19980915 A NO 19980915A NO 980915 A NO980915 A NO 980915A NO 324497 B1 NO324497 B1 NO 324497B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- human
- antibodies
- cell
- Prior art date
Links
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 title claims description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 220
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 53
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 31
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 29
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 10
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 9
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 6
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 6
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 5
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 claims description 5
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 5
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 claims description 4
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 claims description 4
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000004732 Systemic Vasculitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 3
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000028185 Angioedema Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004300 Atrophic Gastritis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 claims description 2
- 206010062746 Carditis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 2
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006926 Discoid Lupus Erythematosus Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 claims description 2
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 claims description 2
- 208000036495 Gastritis atrophic Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024869 Goodpasture syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000035186 Hemolytic Autoimmune Anemia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 claims description 2
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims description 2
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003250 Mixed connective tissue disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010028665 Myxoedema Diseases 0.000 claims description 2
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011152 Pemphigus Diseases 0.000 claims description 2
- 208000031845 Pernicious anaemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002500 Primary Ovarian Insufficiency Diseases 0.000 claims description 2
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039793 Seborrhoeic dermatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010042742 Sympathetic ophthalmia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004631 alopecia areata Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 claims description 2
- 208000016644 chronic atrophic gastritis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 claims description 2
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004921 cutaneous lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001564 eosinophilic gastroenteritis Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 claims description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021646 inflammation of heart layer Diseases 0.000 claims description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 claims description 2
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 claims description 2
- 208000008585 mastocytosis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003786 myxedema Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001976 pemphigus vulgaris Diseases 0.000 claims description 2
- 206010036601 premature menopause Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008742 seborrheic dermatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005057 thyrotoxicosis Diseases 0.000 claims description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims 3
- 206010027654 Allergic conditions Diseases 0.000 claims 1
- 206010063075 Cryptogenic cirrhosis Diseases 0.000 claims 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 claims 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 claims 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 claims 1
- 206010047112 Vasculitides Diseases 0.000 claims 1
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000003816 familial cirrhosis Diseases 0.000 claims 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 claims 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 claims 1
- BWMISRWJRUSYEX-SZKNIZGXSA-N terbinafine hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2C(CN(C\C=C\C#CC(C)(C)C)C)=CC=CC2=C1 BWMISRWJRUSYEX-SZKNIZGXSA-N 0.000 claims 1
- 201000004647 tinea pedis Diseases 0.000 claims 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 171
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 97
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 48
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 47
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 37
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 30
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 30
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 29
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 25
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 25
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 230000004044 response Effects 0.000 description 22
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 21
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 19
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 19
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 19
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 18
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 18
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 description 18
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 17
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 16
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 16
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 14
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 13
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 12
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 12
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 12
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 11
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 10
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 10
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 9
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 9
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 7
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 7
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 7
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 7
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 7
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 6
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 6
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 6
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 5
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 5
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 5
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 5
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 5
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 5
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 5
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 5
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 5
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 5
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 5
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 4
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100456320 Homo sapiens NR3C2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 3
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 3
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 3
- QVDXUKJJGUSGLS-LURJTMIESA-N methyl L-leucinate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CC(C)C QVDXUKJJGUSGLS-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 3
- RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N mycophenolate mofetil Chemical compound COC1=C(C)C=2COC(=O)C=2C(O)=C1C\C=C(/C)CCC(=O)OCCN1CCOCC1 RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N 0.000 description 3
- 229960004866 mycophenolate mofetil Drugs 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 3
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloro-1,1,2,2-tetrafluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(F)Cl DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 102000011767 Acute-Phase Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010062271 Acute-Phase Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010002493 Arachin Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- VOPWNXZWBYDODV-UHFFFAOYSA-N Chlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)Cl VOPWNXZWBYDODV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003979 Mineralocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000375 Mineralocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002651 Polysorbate 85 Polymers 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000017274 T cell anergy Effects 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 108050006955 Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 102100033571 Tissue-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 description 2
- 235000013871 bee wax Nutrition 0.000 description 2
- 239000012166 beeswax Substances 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 2
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000003352 cell adhesion assay Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- WNPXRNJEBMRJGV-UHFFFAOYSA-N chembl1399590 Chemical compound COC1=CC=CC(C=2N=C3C=CC=CC3=C(N3C(CCCC3)C)N=2)=C1O WNPXRNJEBMRJGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 2
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 2
- -1 hard Chemical class 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 229960000681 leflunomide Drugs 0.000 description 2
- VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N leflunomide Chemical compound O1N=CC(C(=O)NC=2C=CC(=CC=2)C(F)(F)F)=C1C VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000897 modulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000025020 negative regulation of T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229940113171 polysorbate 85 Drugs 0.000 description 2
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 2
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 229960003676 tenidap Drugs 0.000 description 2
- LXIKEPCNDFVJKC-QXMHVHEDSA-N tenidap Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N(C(=O)N)C(=O)\C1=C(/O)C1=CC=CS1 LXIKEPCNDFVJKC-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 231100000402 unacceptable toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- RJNRORZRFGUAKL-ADMBVFOFSA-N (1r)-1-[(3ar,5r,6s,6ar)-6-[3-(dimethylamino)propoxy]-2,2-dimethyl-3a,5,6,6a-tetrahydrofuro[2,3-d][1,3]dioxol-5-yl]ethane-1,2-diol;hydrochloride Chemical compound Cl.O1C(C)(C)O[C@@H]2[C@@H](OCCCN(C)C)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]21 RJNRORZRFGUAKL-ADMBVFOFSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical class OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019489 Almond oil Nutrition 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 101100166531 Drosophila melanogaster CycC gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101000759376 Escherichia phage Mu Tail sheath protein Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 241000282418 Hominidae Species 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108010064030 IMM 125 Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100029567 Immunoglobulin kappa light chain Human genes 0.000 description 1
- 101710189008 Immunoglobulin kappa light chain Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000051628 Interleukin-1 receptor antagonist Human genes 0.000 description 1
- 108700021006 Interleukin-1 receptor antagonist Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010023203 Joint destruction Diseases 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 208000027771 Obstructive airways disease Diseases 0.000 description 1
- 101100383043 Pan troglodytes CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010036774 Proctitis Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 239000008168 almond oil Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000008275 binding mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000007963 capsule composition Substances 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940082500 cetostearyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 229960002152 chlorhexidine acetate Drugs 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007822 cytometric assay Methods 0.000 description 1
- 231100000050 cytotoxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009093 first-line therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009775 high-speed stirring Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 1
- 239000003407 interleukin 1 receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 201000011486 lichen planus Diseases 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000012153 long-term therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229940071648 metered dose inhaler Drugs 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001206 natural gum Polymers 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- PDTFCHSETJBPTR-UHFFFAOYSA-N phenylmercuric nitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 PDTFCHSETJBPTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- LZFIOSVZIQOVFW-UHFFFAOYSA-N propyl 2-hydroxybenzoate Chemical class CCCOC(=O)C1=CC=CC=C1O LZFIOSVZIQOVFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCSINKKTEDDPNK-UHFFFAOYSA-N propyl propionate Chemical compound CCCOC(=O)CC MCSINKKTEDDPNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013374 right angle light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009131 signaling function Effects 0.000 description 1
- 231100000161 signs of toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 description 1
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- OULAJFUGPPVRBK-UHFFFAOYSA-N tetratriacontyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO OULAJFUGPPVRBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000002978 thoracic duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229940100611 topical cream Drugs 0.000 description 1
- 229940100617 topical lotion Drugs 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 231100000155 toxicity by organ Toxicity 0.000 description 1
- 230000007675 toxicity by organ Effects 0.000 description 1
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 1
- HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N triethanolamine hydrochloride Chemical compound Cl.OCCN(CCO)CCO HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2821—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
- C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører chimeriske antistoffer som er spesifikke for CD4 som angitt i krav 1, og som er nyttige for human terapi, samt fremgangsmåter ved fremstilling av slike antistoffer som angitt i krav 4.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
CD4 er et flateglykoprotein som hovedsaklig uttrykkes på celler av T-lymfocyttlinjen, omfattende hovedparten av trymocyt-tene og en undergruppe av de perifere T-celler. Lave mengder CD4 uttrykkes også av enkelte ikke-lymfoide celler, selv om den funksjonelle betydning av denne avvikende cellulære forde-ling er ukjent. På modne T-celler tjener CD4 en ko-gjenkjen-ningsfunksjon ved vekselspill med MHC klasse II-molekyler som uttrykkes på antigenpresenterende celler. CD4<+->T-celler utgjør hovedsaklig hjelper-undergruppen som regulerer T- og B-celle-funksjoner under T-avhengige responser på virale, bakterielle, fungale og parasittiske infeksjoner.
Under patogenesen av autoimmunsykdommer, spesielt når toleran-sen for egenantigener bryter ned, bidrar CD4<+->T-celler til de inflammatoriske responser som fører til en ødeleggelse av ledd og vev. Disse prosesser forenkles ved tilkalling av inflammatoriske celler av hematopoetisk avstamming, fremstilling av antistoffer, inflammatoriske cytokiner og mediatorer, og ved aktivering av dreperceller.
Rheumatoid artritt (RA), som er en inflammatorisk sykdom i synovium, er et uttrykk for et autoimmunfenomen som fører til erosjon, deformasjon og ødeleggelse av ledd. Liksom for de fleste autoimmunsykdommer, er etiologien av RA ikke godt definert. Det er imidlertid kjent at RA kjennetegnes av hevede mengder aktiverte CD4<+->T-lymfocytter i de angrepne ledd. Det finnes for tiden ingen helbredelse for RA. Den primære terapi for RA er utviklet for å lindre RA-symptomene og å forbedre de funksjonelle evner i det korte løp. Andre og tredje linjes immunosuppressiva og steroider, så som azatioprin, metotreksat og prednisolen, som sikter på den underliggende sykdom, administreres i mer alvorlige tilfeller, og har enten kun svak virkning, eller oppviser uakseptabel toksisitet for en kronisk terapi. Dessuten beskytter de ikke mot leddødeleggelse.
Bortsett fra RA, er CD4<+->celler også innblandet i andre kroniske tilstander omfattende psoriasis, insulinavhengig diabetes mellitus, systemisk lupus erythematosus og inflammatorisk tarmsykdom. Det er dessuten sannsynlig at CD4-ekspresjonen kan være innblandet i andre autoimmune sykdommer.
I betraktning av T-cellenes innblanding i utviklingen og fort-settelsen av autoimmune sykdommer, har immunosuppresjon blitt en viktig behandlingsstrategi. Tilgjengelige immunosuppresive legemidler, så som cyklosporin A, er blitt brukt fremgangsrikt ved behandling av transplantatavstøtning. Imidlertid gjør deres toksiske bivirkninger dem uakseptable for en kronisk terapi av autoimmune sykdommer.
Utarming (deplesjon) av hele T-cellepopulasjonen, også CD4<+->undergruppen, under kliniske betingelser, er blitt utført ved fremgangsmåter omfattende tapping av torakskanalen, fullstendig lymfebestrålning og lymfoferese, og dette har ført til en klinisk bedring hos enkelte pasienter. Dagens strategier kon-sentrerer seg imidlertid om mer selektive midler som blokkerer uønskede immunresponser uten å forårsake toksisitet på faste organer eller andre sterke bivirkninger. En måte som dette eventuelt kan oppnås på, er ved selektiv fjerning eller inak-tivering av sykdomsmedierende T-celler med monoklonale antistoffer (mAb'er). mAb'er mot CD4 representerer en slik strategi. I dyremodeller for autoimmunitet og transplantasjon, stanser eller reverserer anti-CD4-mAb'er sykdommens fremskrid-ning når de administreres profylaktisk eller terapeutisk. I tillegg har første resultater av kliniske tester med anti-CD4-mAb'er mot RA, psoriasis, inflammatorisk tarmsykdom og systemisk vaskulinitt vist tegn på å ha en potensiell terapeutisk effekt.
Hovedmålet med en anti-CD4-mAb-terapi er å stanse den selvødeleggende aktivitet av CD4<+->celler, spesielt under akutte faser av autoimmunforstyrrelser. Det endelige terapeutiske mål er å fremtvinge en tilstand med immunologisk ikke-responsivitet (anergi) eller langvarig toleranse for de forstyrrende antigener (eller bestemte vev) som opprettholder den underliggende sykdom, uten å forstyrre vertens normale forsvar mot opportunistiske infeksjoner. Foruten mot RA, kan CD4-mAb'er også være nyttige ved behandling av andre autoimmune sykdommer, f.eks. insulinavhengig diabetes mellitus, systemisk lupus erytomato-sis, psoriasis, inflammatorisk tarmsykdom og multippel sklerose .
Grunnet den potensielle betydning av anti-CD4-mAb'er som immu-noterapeutika, har tallrike bedrifter og forskningsgrupper beskrevet anti-CD4-mAb'er som potensielle terapeutiske midler. F.eks. beskriver Centocor et anti-CD4-mAb som benevnes Cen-tara, og som er et chimerisk murint mAb mot CD4. Videre beskriver Johnson & Johnson/Ortho et anti-CD4-mAb som benevnes 0KT-4a, og som er et humanisert murint mAb. Videre beskriver Burroughs Wellcome et anti-CD4-mAb som er et humanisert rotte-mAb mot CD4. Dessuten har både Sandoz og Medlmmune (i samar-beid med Merck) utviklet murine humaniserte anti-CD4-mAb'er som er spesifikke for CD4. Videre har også Becton Dickinson, Immunotech og Boehringer Mannheim utviklet anti-CD4-mAb'er.
Fra WO 93 02 108 er det kjent chimeriske antistoffer med human CD4-spesifisitet og som hovedsakelig mangler T-celleutarmende aktivitet samt har sekvensområdene til de variable tunge og lette kjedene fra et monoklonalt østape-anti-CD4-antistoff fusjonert med humane konstant tunge og lette domenesekvenser. Slike antistoffer er også kjent fra Yocum D.E. et al.: "Immu-nomodulatory effect of primatized-TM IDEC-CE9.1 an anti-CD4 monoclonal antibody, in RA". Arthritis & Rhevmatism. Vol 37, no. 9, januar 1994, s. S336.
I WO 90 15152 beskrives anvendelse av human IgG4 isotyper for å redusere T-celleutarmende aktivitet av anti-CD4-antistoffer. Fra Angal S. et al: "A single Amino Acid substitution abo-lishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody", Molecular Immunology, vol. 30, nr. 1, januar 1993, s. 105 - 108 og Duncan A.R. et al.: "Localization of the binding site for the human high-affinity FC reseptor on IgG", Nature, vol. 332, nr. 6164, 7 april 1988, s. 563 - 564 er det kjent henholdsvis å øke stabiliteten av humant IgG4 ved en serin til prolin-mutasjon eller en redusert bindingsaffinitet til Fc-reseptoren til alle humane IgG'er ved en leucin til glutaminsy-remutasj on.
Bortsett fra anti-CD4-mAb'er, er forskjellige immunomodulatorer og legemidler blitt beskrevet å ha potensiell anvendelighet ved behandling av RA. Slike immunomodulatorer og legemidler omfatter f.eks. celleadhesjonsblokkere, cytokinreseptor-blokkere, immunotoksiner og T-cellereseptorantagonister. Bestemte eksempler omfatter gamma-interferon, anti-ICAM-1 (et murint anti-CD54-mAb som blokkerer leukocyttbevegelse og adhesjon), Campath-1H (humanisert rotte-anti-CDw52-mAb) IL-l-reseptor, cA2 (et TNF-alfa-chimeriske mAb), CDP 571 (anti-TNF-mAb), anti-IL-2R (humanisert murint anti-CD25-mAb), SDZ CHH 380 (murint humant anti-CD7-mAb), DAB486 IL-2 (IL-2-fusjons-toksin, ikke-spesifikt for CD4- og CD8-celler), Antril (IL-1RA), anti-TCR (mAb'er og proteiner som tilsikter T-cellereseptor-undergrupper) og XomaZyme-CD5 (murint anti-CD5-tok-sinkonjugat).
Andre immunomodulatorer og immunosuppressiva med en potensiell anvendelighet for behandling av autoimmunsykdommer omfatter Rapamycin (oralt immunosuppressivt middel), Therafectin, Leflunomid (immunosuppressiv prodroge), Tenidap (cytokinmodu-lator/CO-inhibitor), IMM-125 og RS-61443 (et oralt immunosuppressivt middel).
Som allerede anmerket, er det blitt beskrevet tallrike monoklonale antistoffer mot CD4 som har en potensiell terapeutisk anvendelighet. Til stor del omfatter disse antistoffer murine mAb'er og chimeriske eller murine humaniserte anti-CD4-mAb'er.
Murine monoklonale antistoffer har en potensiell nytte ved di-agnostisering av humane sykdommer og i kliniske tester som terapeutika for behandling av både akutte og kroniske humane sykdommer, bl.a. leukemi, lymfomaer, faste svulster (f.eks. i colon, brystet eller leveren), AIDS og autoimmune sykdommer. Imidlertid er murine antistoffer ufordelaktige, fordi de ofte fører til en immun-antistoffrespons i verten mot de murine monoklonale antistoffer.
Muse/humane chimeriske antistoffer er også blitt beskrevet. Disse antistoffer omfatter bindingsegenskapene av det murine opphavsantistoff sammen med effektorfunksjonene som forbindes med humant konstant parti. Jfr. f.eks. Cabilly et al., US-patentet nr. 4.816.567; Shoemaker et al., US-patentet nr. 4.978.775; Beavers et al., US-patentet nr. 4.975.369; og Boss et al., US-patentet nr. 4.816.397. Generelt konstrueres disse chimeriske antistoffer ved å fremstille en genomisk gensamling uti fra DNA som er blitt trukket ut av på forhånd foreliggende murine hybridomaer (Nishman et al., 47 Cancer Research, 999
(1987)). Samlingen sorteres deretter for å finne variabelt parti-gener fra både lette og tunge kjeder, som oppviser de riktige omordningsmønstre for antistoff-fragmentet. De klonede gener fra det variable parti ligeres deretter inn i en ekspre-sjonsvektor som inneholder klonede kassetter av det aktuelle tung eller lett kjede-humant konstant parti-gen. De chimeriske gener uttrykkes deretter i en cellelinje etter valg, vanligvis en murin myelomalinje.
Mens man har brukt slike chimeriske antistoffer innen humanterapien, er de imidlertid også forbundet med enkelte problemer. På lignende måte som mot murine monoklonale antistoffer, kan den humane mottaker fremstille antistoffer mot det chimeriske antistoff. Dette er ufordelaktig for virkningen av en fortsatt terapi med det chimeriske antistoff.
Som en forbedring av de konvensjonelle chimeriske antistoffer, har enkelte forskere beskrevet fremgangsmåter ved fremstilling av humane monoklonale antistoffer som ikke skulle være beheftet med slike problemer. Jfr. f.eks. Erlich et al., 34 Clinical Chemistry, 1681 (1988); Erlich et al., 7 Hybridoma, 385
(1988); Erlich et al., 6 Hybridoma, 151 (1987) og Erlich et al., 1 Human Antibody Hybridomas, 23 (1990). Disse publikasjo-ner spekulerer også at ikke-humane primatantistoffer, f.eks. monoklonale sjimpanse-antistoffer, kunne tolereres godt av mennesker grunnet deres strukturelle likhet med humane antistoffer. Imidlertid har fremstillingen av antistoffer i mennesker åpenbare etiske begrensninger.
Fordi humane antistoffer er ikke-immunogene i Rhesus-aper (dvs. de induserer ingen antistoffrespons), tror Erlich et al. også at primatantistoffer skulle være ikke-immunogene i mennesker. Erlich et al. { Id.) antyder at testingen av antistoffer på mennesker er unødvendig hvis et primat-antistoff har et konstant parti som er identisk med det konstante parti i humant immunoglobulin, eller i det minste har en struktur som ikke skiller seg mer fra et humant immunoglobulin enn forskjellige humane antistoffer skiller seg fra hverandre. Dermed foreslår de at sjimpanse-antistoffer kunne være nyttige innen humanterapien.
Som en forbedring av kjente chimeriske antistoffer som ofte er antigene i mennesker, beskriver de beslektede søknader USSN 08/476.237, innlevert den 7. juni 1995, USSN 08/347.072, innlevert den 25. januar 1995, 07/912.212, innlevert den 10. juli 1992, 07/856.281, innlevert den 23. mars 1992, og 07/735.064, innlevert den 25. juli 1991, fremstillingen av monoklonale østape-antistoffer og chimeriske antistoffer avledet derav som fremstilles ved rekombinante metoder, og som inneholder det variable parti av et østape-antistoff (f.eks. fra bavian eller javaape) fusjonert med et klonet konstant parti fra menneske, sjimpanse eller en annen ape eller andre ape-rammepartier. Disse søknader beskriver spesielt fremstillingen av slike østape- og chimeriske antistoffer avledet derav mot humane antigener og anvendelsen av slike chimeriske rekombinante antistoffer som immunoterapeutiske midler ved behandling av sykdommer i mennesker.
Disse søknader grunner seg på det overraskende funn at aper som er evolusjonært relativt fjernt beslektet med mennesket (f.eks. bavian eller javaape (også cynomolge og Rhesus-aper)), i motsetning til sjimpanser, ikke er tilstrekkelig forskjellige fra mennesket for å tillate en dyrking av antistoffer mot humane antigener i disse aper, selv ikke mot relativt konser-verte humane antigener, f. eks. CD4 og CD54, men er tilstrekkelig like mennesket for å ha antistoffer som strukturelt ligner humane antistoffer, således at det ikke induseres noen anti-antistoffrespons i verten når slike ape-antistoffer, eller rekombinante chimeriske antistoffer avledet derav, innføres i et menneske.
Disse søknader beskriver at i forskjell til enkelte kjente antistoffer som brukes for human terapi, bl.a. kjente chimeriske antistoffer, er slike chimeriske antistoffer ikke beheftet med noen av de flere mulige ulemper, f.eks. 1) immunogenisitet og induksjon av en human anti-antistoffrespons (HAA-respons) etter den gjentatte administrasjon som er nødvendig for å behandle kroniske tilstander, 2) relativt kort halveringstid sammenlignet med humane antistoffer og 3) manglende effektorfunksjoner med humane celler eller komplementer.
Mangelen på disse ulemper er en betydelig fordel for human terapi. F. eks. i tilfellet av kroniske humane sykdommer, bl.a. autoimmune sykdommer, eller en sykdom hvor det er nødvendig med en langvarig administrasjon av et antistoff, er et av ho-vedhindringene for en gjentatt antistoffterapi vertens respons på det terapeutiske antistoff. HAA-responser er ofte uforut-sigbare, idet de er forskjellige fra pasient til pasient. Dessuten er slike responser hovedsaklig, men ikke utelukkende, rettet mot det konstante parti av antistoffmolekylet, og når de foreligger, utelukker eller nedsetter de ofte virksomheten av en terapi med dette antistoff eller med et annet antistoff med samme isotype. De rekombinante chimeriske antistoffer som beskrives i de ovennevnte søknader, vil unngå dette problem og tillate en generering av antistoffer med egnet spesifisitet og den ønskede effektorfunksjon, og deres bruk ved fremstilling av rekombinante antistoffer.
Disse rekombinante antistoffer omfatter generelt en egnet del av det variable parti av et antistoff avledet fra en immunisert ape, som er nødvendig for antigenbindingen, og det konstante parti av et antistoff fra et menneske eller en sjimpanse. Derfor tillater dette et vedlikehold av spesifisiteten og en høy affinitet av de monoklonale ape-antistoffer, og av de ønskede effektorfunksjoner ved egnet valg av humant eller sjimpanse-konstant parti.
Flere av disse beslektede søknader nevner som et eksempel spesielt et ape/humant chimerisk antistoff med en spesifisitet for CD4, som benevnes CE9.1, og som inneholder det tung- og lettkjedede variable domene av et monoklonalt anti-CD4-antistoff som fremstilles i en cynomolg ape, og humant immunoglobulin-lett kjede-lambda-konstant parti og humant immunoglobulin-tung kjede-gamma-l-konstant parti. Dette antistoff oppviser noe T-celle-utarmingsaktivitet, men denne aktivitet er lavere enn for tidligere kjente monoklonale CD4-antistoffer. Det er imidlertid ønskelig å fremstille antistoffer som har en lavere, eller som mangler, T-celle-utarmende aktivitet, fordi
dette eventuelt ville øke deres terapeutiske potensial.
Disse søknader beskriver dessuten foretrukne vektorsystemer for fremstilling av slike chimeriske antistoffer, spesielt TCAE 5.2 og TCAE 6, som omfatter det følgende:
1) Fire transkripsjonene kassetter i tandemrekkef ølge :
(a) et humant immunoglobulin-lett kjede-konstant parti. I
TCAE 5.2 er dette humant immunoglobulin-kappa-lett kjede-konstant parti (Kabat-nummerering av aminosyrer 108-214, allotype Km 3), og i TCAE 6 er det humant immunoglobulin-lett kjede-lambda-konstant parti (Kabat-nummerering av aminosyrer 108-215, genotype Oz-minus, Mcg-minus, Ke-minus-allotype); (b) humant immunoglobulin-tung kjede-konstant parti; i begge konstruksjoner er human immunoglobulin-tung kjede et gamma/konstant parti (Kabat-nummerering av aminosyrer 114-478 allotype Gmla, Gm 12); (c) DHFR; inneholdende sin egen eukaryotiske promoter og
sitt eget polyadenylasjonsparti; og
(d) NEO; også inneholdende sin egen eukaryotiske promoter og sitt eget polyadenylasjonsparti. 2) Humant immunoglobulin-lett og tung kjede-kassettene inneholder syntetiske signalsekvenser for utsondring av immunoglobulinkjedene; og 3) Humant immunoglobulin-lett og tung kjede-kassettene inneholder spesifikke DNA-koblinger som tillater en inn-føyelse av lette og tunge immunoglobulin-variable partier som vedlikeholder den translasjonene leseramme, og som ikke endrer aminosyrene som vanligvis forefinnes i immu-noglobulinkj eder.
Til tross for det ovenfor beskrevne finnes det et fortsatt behov innen faget for forbedrede antistoffer som er spesifikke for CD4, som har en lav antigenisitet i mennesker, og som kan brukes terapeutisk, f.eks. for behandling av autoimmune sykdommer, så som rheumatoid artritt. Det finnes spesielt et behov for å fremstille anti-CD4-antistoffer som oppviser forbedrede egenskaper, f.eks. en lengre halveringstid, og/eller som hovedsaklig mangler, eller mangler, en utarmende aktivitet.
GJENSTANDER FOR OPPFINNELSEN
Med dette mål er det et formål for foreliggende oppfinnelse å frembringe nye chimeriske antistoffer som er spesifikke for CD4, og som har forbedrede egenskaper, f.eks. lengre halveringstid, lav immunogenisitet i mennesker og/eller en nedsatt eller manglende T-celle-utarmende aktivitet. Nærmere bestemt er det et formål for foreliggende oppfinnelse å frembringe chimeriske anti-CD4-antistoffer som valgt fra gruppen bestående av: CE9y4 som har gamma 4 tungkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 7 og lambda lettkjede-polypeptidesekvensen vist i
SEQ ID NO: 5;
CE9y4E som har gamma 4(E) tungkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 9 og lambda lettkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 5;
CE9y4PE som har gamma gamma 4 (PE) tungkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 11 og lambda lettkjede-polypep-tidesevensen vist i SEQ ID NO: 5; og
CE9y4AK som har gamma 4 tungkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 7 og en lett kjede som har det variable område polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 5 og en konstantområde-polypeptidsekvens av en human kappa lettkjede; og
CE9y4kX som har gamma 4 tungkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 7 og en lett kjede som har det det variable område polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 5 og en konstantområde-polypeptidesekvens av en human lambda lettkjede.
Det er et nærmere bestemt formål for foreliggende oppfinnelse å frembringe slike antistoffer og som inneholder den bestemte ape-anti-CD4-variable tunge sekvens som vises på figur 1, og ape-anti-CD4-variable lette sekvens som vises på figur 2, fusjonert med ape- eller menneske-konstant domene-sekvenser, fortrinnsvis humant kappa- eller lambda-lett kjede-konstant domene-sekvens og humant gamma 1- eller gamma 4-konstant domene-sekvens eller en mutert gamma 4-tung kjede med endrede effektorfunksjoner og forbedret stabilitet sammenlignet med gamma 4-isotypen.
Det er et annet formål for foreliggende oppfinnelse å frembringe DNA-sekvenser som angitt i krav 2 og 3 og som tillater en ekspresjon av forbedrede chimeriske anti-CD4-antistoffer og vektorer og vertceller som kan brukes ved ekspresjon av slike chimeriske anti-CD4-antistoffer. Fortrinnsvis vil vertcellene være CHO-celler.
Det er enda et formål for foreliggende oppfinnelse å frembringe farmasøytiske blandinger omfattende slike chimeriske antistoff som angitt i krav 5 for bruk ved behandling eller forebyggelse av CD4-relaterte lidelser, spesielt autoimmune sykdommer, som inneholder en profylaktisk eller terapeutisk virksom mengde av de forbedrede chimeriske anti-CD4-antistoffer ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff.
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Figur 1 viser aminosyre- og DNA-sekvensen av den lette variable domene av CE9.1. Figur 2 viser aminosyre- og DNA-sekvensen av den tunge variable domene av CE9.1. Figur 3 viser aminosyre- og DNA-sekvensen av humant lambda-variabel og konstant domene som foreligger i CE9.1. Figur 4 viser DNA- og aminosyresekvensen som koder for tung kjede-variabel og konstant-gamma 4-sekvensen. Figur 5 viser DNA- og aminosyresekvensen som koder for human tung kjede-gamma 4 som inneholder E-mutasjonen. Figur 6 viser DNA- og aminosyresekvensen som koder for human tung kjede-gamma 4 som inneholder P- og E-mutasjonene. Figurene 7-1, 7-2 og 8 viser nukleinsyresekvensen for forskjellige ledersekvenser som er nyttige ifølge oppfinnelsen. Figur 9 viser et punktdiagram av bindingen av CE9.1 til ferske humane PMNC'er, hvor kvadranten øverst til høyre på felt A viser lymfocytter som var dobbelt merket med CE9.1 og 0KT3, kvadranten øverst til høyre på felt B viser en populasjon som var dobbelt merket med CE9.1 og 0KT4, kvadranten øverst til høyre på felt C viser fraværet av celler som var dobbelt merket med CD8 og CE9.1, og kontroll-felt D viser celler som var merket med normalt og humant IgG. Figurene 10a, 10b og 10c viser Fc-reseptorbindingseegenskapene av CE9.1, hvor målingene viser agglutinasjonen av et CD4<+->strømningscytometrisk histogram av bindingsfibroblastene med a) ylFN-induserte ferske monocytter, hvor en negativkontroll benyttet seg av F(ab')2-fragmenter av CE9.1, b) ferske monocytter med eller uten ylFN-induksjon, og c) i nærvær av sCD4 eller i fravær av antistoffer. Figur 11 viser den CE9.1-induserte hemming av en human blandet lymfocyttreaksjon, hvor a) ferske humane PBL'er ble brukt som respondere, og mitomycin C-behandlede stimulatorceller fra en ikke-beslektet donor ble brukt for å teste de hemmende egenskaper av forskjellige konsentrasjoner av CE9.1, og hemmingen ble målt ifølge mengden tymidininnlemmelse i IL-2-produksjonen, og b) MLR ved bruk av sjimpanse-respondere og ikke-beslektede sjimpanse-stimulatorer, idet Leu3a, som er et murint anti-humant CD4, ble brukt som kontrollforbindelse. Figur 12 viser de antistoff-avhengige cellulære cytotoksiske egenskaper av CE9.1 hvor sammensmeltingen av SupT-18-målceller i nærvær av y-interferon stimulerte effektorceller, og hvor 4D9 er et murint monoklonalt anti-CD4-antistoff IgG2a. Figur 13 viser et strømningscytometrisk diagram av bindingen av Clq til SupTl-18-celler i nærvær eller fravær av CE9.1, hvor 10.000 begivenheter ble registrert og resultatene ble uttrykt i form av histogrammer, PR0945 er polyklonale antistoffer fra en ape med høy anti-CD4-serumtiter, og negativkontrol-len var Clq og anti-Clq i fravær av CE9.1. Figur 14 viser det komplement-avhengige cytotoksisitetsassay av CE9.1, hvor sammensmeltingen av SupT-18-celler i nærvær av CE9.1 og kanin-komplement, hvor 4D9 er et murint anti-CD4-kontroll-stoff av underklassen IgG2a som kan fiksere komple-mentet, og hvor PR0965 er en polyklon blanding av antistoffer fra serumet av en cynomolg ape med høy anti-CD4-titer. Figur 15 viser en høydoses farmakologisk undersøkelse i seks sjimpanser, hvor CD4- og CD8-mengden i perifert blod uttrykkes over et tidsrom på 150-300 dager, idet CD3-CD8-kurver som antyder antallet CD4-modulerte celler, også vises. Øverste felt: Gruppe 1 - sjimpansenes målinger ble overvåket. Pilene angir CE9.1-doser. (2) saltvann-kontrollgruppe. Midtfelt: Gruppe 2 - sjimpanser (2) som fikk 10 mg/kg CE9.1. Doseringen ble gjentatt når CD4-mengden kom innen 30% av grunnlinjen. Nederste felt: Gruppe 3 - sjimpanser (2) som fikk 10 mg/kg CE9.1. Doseringen ble gjentatt når mengden kom innen 70% av grunnlinjen. Figur 16 viser egnede PCR-primere for å erholde humant y4-konstant parti.
Figur 17 viser CE9y4PE-tung kjede-sekvensen.
Figur 18 viser ikke-reduserende SDS-polyakrylamidgel-elektroforese av CE9.1, CDEy4(G4), CE9y4E(G4E) og CE9yPE(G4PE). Halvmer-molekylet er tydlig med en molekylvekt på ca. 80 kDa. Figur 19 fører opp data for assosiasjons- og dissosiasjonsfa-sene av SPR-progresjonskurvene. Figur 20 viser virkningen av CD4-mAb-konstruksjoner i primære
MLR.
Figur 21 viser adhesjonen av IFN-y-indusert monocyttisk cellelinje THP-1 til CD4<+->fibroblast-transfektanter. Figur 22 avbilder FcR- og CD4~-mediert adhesjon av CE9.1, CE9y4, CE9y4E og CE9y4yK. Figur 23 viser CDC- og ADCC-resultatene med CE9y4PE, CE9.1 og et murint fikserende mAb mot HuCDA. Figur 24 viser plasmakonsentrasjonene etter 1 mg/kg-bolus med CE9y4E og CE9y4PE i hannlige Sprague-Dawley-rotter. Figur 25 viser virkningen av en behandling med mAb'er i ovalbumin-spesif ikk antistoff respons i ffuCD4-transgene mus.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse frembringer nye monoklonale chimeriske antistoffer som er spesifikke for CD4, og som inneholder de sekvenser som er angitt i krav 1. Disse antistoffer oppviser forbedrede egenskaper sammenlignet med konvensjonelle monoklonale anti-CD4-antistoffer, f.eks. en høy affinitet for humant CD4, og har liten eller ingen immunogenisitet i mennesker. Gamma 4-versjonene oppviser en nedsatt eller manglende effektorfunksjon, f.eks. Fc-reseptorbindingsaktivitet eller komplementfiksering, og liten eller ingen T-celleutarmende aktivitet .
Fremgangsmåter ved fremstilling av monoklonale østape-antistoffer som er spesifikke for CD4, og kloner som fremstiller monoklonale østape-antistoffer som er spesifikke for CD4, forefinnes i de ovennevnte beslektede patentsøknader.
Generelt omfatter dette å immunisere en østape mot humant CD4-antigen under sådanne betingelser at østapen fremstiller anti-CD4-antistoffer; udødeliggjøre cellene av apen som har for oppgave å fremstille anti-CD4-antistoffene, f.eks. ved hybri-domafusjon, viral transformasjon med Herpes papio, enkelt B-cellekloning (også benevnt "forbigående udødeliggjørelse") og sammenstilling av en samling rekombinante immunoglobuliner. I foretrukne utførelser omfatter denne fremgangsmåte å velge en B-celle fra apen fra enten en perifer blodleukocytt, milten, benmargen eller en lymfeknute; velge en kjerne som produserer det egnede antistoff; isolere immunoglobulingener som koder for dette antistoff fra den udødeliggjorte cellelinje; og uttrykke genene i en produsent-cellelinje (dvs. en cellelinje som muliggjør en tilstrekkelig høy produksjon av antistoffet for å være nyttig i human terapi). Som beskrevet i de ovennevnte søknader, omfatter østaper bavianer og javaaper (også Rhesus-ape og cynomolg ape).
Som beskrevet ovenfor, vil de chimeriske antistoffer ifølge oppfinnelsen i den foretrukne utførelse omfatte anti-CD4-østape-variabelt tungt og variabelt lett-sekvensene som vises på figur 1 og figur 2, fusjonert med human konstant domene-sekvenser. Egnede midler for å erholde disse bestemte sekvenser for variabel tung og variabel lett domene beskrives i detalj i patentsøknadene USSN 08/476.237, innlevert den 7. juni 1990, og 08/397.072, innlevert den 25. januar 1995, og 07/912.292, innlevert den 10. juli 1992. Disse søknader oppgir dessuten den fullstendige nukleinsyre- og aminosyresekvens for disse sekvenser.
Disse sekvenser for variabel tung og lett domene kan fusjone-res med hvilke som helst ønskede humane konstant domene-sekvenser. Det bestemte valg vil påvirke effektorfunksjonen av det erholdte chimeriske anti-CD4-antistoff. Fortrinnsvis vil human tung kjede-konstant domene omfatte gamma 4- eller en mutert gamma 4-konstant domene som heri benevnes gamma 4E, eller et mutert gamma 4 som heri benevnes gamma 4PE. Valget av gamma 4 er fordelaktig fordi man har funnet at dette fører til dan-nelsen av chimeriske antistoffer som mangler eller hovedsaklig mangler T-celleutarmende aktivitet (80-100% sammenlignet med gamma 1). Dette antas å grunne seg i at gamma 4-konstant domene ikke har evnen til å binde komplement. Det konstante domene kan også muteres for å forbedre egenskapene av det erholdte chimeriske antistoff, f.eks. stabiliteten, og/eller for å fjerne utarmingsaktiviteten. Spesielt P- og E-modifikasjonene av gamma 4-domenet, som skal beskrives i det følgende, er modifikasjoner av gamma 4 i hengelpartiet, og bidrar til en forbedret stabilitet og fjerner utarmingsaktiviteten. Videre forventes det at andre modifikasjoner også kunne forbedre egenskapene av chimeriske antistoffer.
Human lett kjede-konstant domene som foreligger i de chimeriske anti-CD4-antistoffer ifølge oppfinnelsen, vil være humant kappa eller lambda-lett kjede-konstant parti, mer foretrukket humant lambda-lett kjede-konstant parti. Aminosyre- og DNA-sekvenser som koder for human gamma 1-, gamma 4-, kappa-og lambda-konstant domene, er kjent innen faget. Dessuten finnes aminosyre- og nukleinsyresekvensene for humant gamma 4 og E- og PE-mutanter og lambda-konstant domene-sekvenser på figurene 4-6 hhv. figur 3.
Utførelser av oppfinnelsen omfatter et bestemt chimerisk monoklonalt anti-CD4-antistoff som benevnes CE9.1, omfattende de antigenbindende domener erholdt fra cynomolge javaaper som var blitt immunisert med humant sCD4 (vist på figurene 1 og 2), i kombinasjon med de konstante domener av humant IgGl, og monoklonale chimeriske antistoffer avledet derav, nemlig CE9y4, CE9y4Å,K, CE9y4E og CE9y4PE, som har de samme antigenbindende domener som CE9.1, men som er blitt genetisk konstruert med en human IgG4-Fc-bindende domeneramme. Det monoklonale antistoff CE9y4E inneholder en leucin-til-glutamsyre-mutasjon (L236E) nær hengselpartiet av antistoffet (E-modifikasjonen). Det monoklonale antistoff CE9y4PE inneholder den samme leucin-til-glutamsyre-mutas j on og i tillegg en serin-til-prolin-mutasjon (S229P) ("E"- og "P"-modifikasjon). CE9y4KX-antistoffet skiller seg fra CE9y4 i at dets lett kjede-konstant parti er blitt end-ret fra human K- til human X-undertype.
Disse mutasjoner og erstatninger av konstant domene ble utført fordi det er kjent at de biologiske responser av IgG-antistoffer er avhengig av sammensetningen av deres karboksyterminale domener, dvs. deres isotype. Ved å endre antistoffets isotype ved proteinkonstruksjon, er det derfor eventuelt mulig å modi-fisere den biologiske respons av et IgG-antistoff, og nærmere bestemt av de chimeriske monoklonale anti-CD4-antistoffer ifølge oppfinnelsen.
Det ønskede resultat av denne konstruksjonsstrategi var at en variasjon av isotypen av Fc-partiet av antistoffet ikke skulle nedsette bindingsaffiniteten av CD4-antigenbindende Fab-partier. Dette var imidlertid ikke kjent i begynnelsen. Det var mulig at erstatningen av det konstante parti eller en modifikasjon derav kunne ha en ugunstig virkning på CD4-bindingen. Derfor ble de erholdte antistoffer testet for å bestemme virkningene av en modifikasjon på antistoffets egenskaper, spesielt på CD4-antigenbindingen. For å måle de mulige virkninger av utskiftingen av den konstante domene på antigenbindingen, kan man bruke kjente assaymetoder. Spesielt utførte man en un-dersøkelse av vekselspillet mellom CD4 og CE9.1, CE9y4, CE9y4XK, CE9y4E og CE9y4PE ifølge en Scatchard-analyse og fla-teplasmonresonansen (SPR). Resultatene av disse assayer viste at CD4-bindingen til hvert av de testede antistoffer var like-verdig. Man fant at alle likevektsdissosiasjonskonstantene ved 25°C for CD4-bindingen til antistoffene ifølge SPR var ca. 1,0 nanomolar. Målingene viste dessuten at: 1) CD4-bindingen til antistoffene skjer ved en to-stillings uavhengig og identisk bindingsmodell; og 2) de funksjonelle bindingsegenskaper av de antigenbindende domener er uavhengig av strukturelle modifikasjoner som utfø-res i Fc-partiet av antistoffet, omfattende gamma 1-, gamma 4-eller mutert gamma 4-isotypene. Derfor frembringer foreliggende oppfinnelse tegn på at isotypeerstatning av IgGl og IgG4 kan være en nyttig strategi ved konstruksjon av antistoffer, uten noe tap av antigenbindingsaffinitet, og spesielt, antistoffer mot CD4.
Som skal beskrives i det følgende, fant man også at en erstatning av gamma 1-konstant domene med gamma 4 senket Fc-reseptorbindingen, komplementfikseringen og T-celleutarmingsaktivi-teten betydelig, og dessuten at E- og P-modifikasjonene hver ytterligere senker Fc-reseptorbindingen og T-celleutarmingsak-tiviteten og fører til en forbedret antistoffstabilitet.
Derfor frembringer foreliggende oppfinnelse bestemte rekombinante antistoffer som er primat/humane chimeriske monoklonale antistoffer som er rettet mot humant CD4-antigen, og som oppviser forbedrede egenskaper, f.eks. en lav T-celleutarmingsak-tivitet og en høyere stabilitet. Med disse egenskaper har disse rekombinante antistoffer en spesielt høy nytte som immunomodulatorer, og de er spesielt nyttige ved behandling av autoimmune sykdommer, så som rheumatoid artritt, psoriasis, systemisk lupus erythematosus (SLE), og som ikke-autoimmune indi-kasjoner, så som "graft-vs.-host-disease" (GVHD) transplantat-utstøtning, asthma og HIV. Antistoffene ifølge oppfinnelsen er også nyttige som hjelpemidler innen genterapien. Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan spesielt administreres før, samtidig med eller etter administrasjonen av en vektor (som inneholder terapeutisk DNA) for å forebygge eller redusere vertens humorale respons mot vektoren. Disse sykdommer er eksempler på CD4-relaterte lidelser.
Som skal beskrives i større detalj i eksemplene, genereres rekombinant CE9.1-antistoff ved å pode de antigenbindende variable Fv-domener fra cynomolg javaape til humane konstante partier, f.eks. IgGl-konstante domener. Nærmere bestemt inneholder CE9.1-antistoffet en human gamma 1-domene og lambda-konstant domene. CE9y4, CE9y4XK, CE9y4E og CE9y4PE inneholder gamma 4-konstant domene eller en mutert form derav, og enten lambda-eller kappa-konstant parti. De erholdte rekombinante antistoff sekvenser kan ikke skilles fra humane immunoglobulinsek-venser. Som et resultat bør disse antistoffer, etter in vivo-administrasjon til mennesker oppvise en nedsatt eller manglende immunogenisitet og en lavere serumklaring enn lignende murine monoklonale eller mus/humane chimeriske antistoffer rettet mot CD4.
CE9.1-antistoffet bindes til domene 1 av humant CD4, men ikke av javaape-CD4, og CD4 er et parti som er innblandet i vekselspillet med MHC klasse II-molekyler på antigenpresenterende celler. Dessuten har assayer vist at de andre antistoffer som beskrives i form av eksempler, har de samme antigenbindende egenskaper som CE9.1.
Man har observert en sterk immunomodulatorisk aktivitet av CE9.1-antistoffet, både in vitro og in vivo. Med disse egenskaper, dvs. nedsatt immunogenisitet, langsommere serumklaring og sterk immunomodulasjon, sammenlignet med andre kjente anti-humant CD4-mAb'er som er av murint eller gnager-opphav, tror man at dette antistoff og de andre antistoffer som beskrives heri, vil være spesielt godt egnet for en langtids terapi av sykdommer hvor det er ønskelig med en immunosuppresjon, f.eks. autoimmune lidelser og kroniske betennelsessykdommer, så som rheumatoid artritt. Det forventes imidlertid at disse antistoffer skal være nyttige ved behandling av mange andre sykdomstilstander, f.eks. omfattende Hashimotos struma, primært myksødem, tyreotoksikose/Graves sykdom, pernisiøs anemi, autoimmun atrofisk gastritt, autoimmun karditt, Addisons sykdom, for tidlig menopause, diabetes mellitus type I, Goodpastures syndrom, myasthenia gravis, multippel sklerose, mannlig ufruktbarhet, pemfigus vulgaris, pemfigoid, sympatetisk of-talmi, phakogen uveitis, autoimmun hemolytisk anemi, idiopatisk trombocytopenisk purpura, idiopatisk leukopeni, primær biliær cirrhose, aktiv kronisk hepatitt (HBs Ag-negativ), kroptogen cirrhose, inflammatorisk tarmsykdomsyndrom, Sjøgrens syndrom, psoriasis, rheumatoid artritt, dermatomyositt, skie-roderma, blandet bindevevssykdom, diskoid lupus erythematosus, systemisk vaskulitt og systemisk lupus erythematosus (SLE).
Som nevnt ovenfor, er rheumatoid artritt (RA) en inflammatorisk sykdom i synovium som omfatter en manifestasjon av et au-toimmunt fenomen som fører til erosjon, deformasjon og ødeleggelse av ledd. Liksom er tilfellet for de fleste autoimmune sykdommer, er etiologien av RA ikke godt definert, men kjennetegnes av hevede mengder aktiverte CD4<+->T-lymfocytter i de ram-mede ledd. Det finnes for tiden ingen helbredelse for RA, og terapien for behandling av denne svekkende sykdom har kun som formål å lindre symptomene og bedre de funksjonelle evner i det korte løp. Videre gis andre og tredje linjes immunosuppressiva og steroider, så som azatioprin, metotreksat og prednisolen, som sikter på den underliggende sykdom, kun i mer alvorlige tilfeller, og har enten kun svak virkning, eller oppviser uakseptabel toksisitet for en kronisk terapi. Derimot forventes det at antistoffet ifølge oppfinnelsen vil være egnet for en langvarig og kronisk administrasjon, i betraktning av at det oppviser en nedsatt immunogenisitet, en lengre halveringstid og en sterk immunomodulatorisk virkning sammenlignet med andre kjente anti-humant CD4-mAb'er som er avledet fra mus eller gnagere.
I det vesentlige vil de rekombinante monoklonale anti-CD4-antistoffer som beskrives i foreliggende søknad i form av eksempler mediere en terapeutisk virkning ved å stanse eller endre den ødeleggende aktivitet av CD4<+->celler, spesielt under akutte faser av autoimmune lidelser, så som rheumatoid artritt. Dermed vil administrasjonen av antistoffer ifølge oppfinnelsen føre til en tilstand med immunologisk ikke-responsivitet (anergi) eller til langvarig toleranse av de forstyrrende antigener (eller bestemte vev) som vedlikeholder den underliggende sykdom, uten å kompromittere vertens normale forsvar mot opportunistiske infeksjoner. Foruten mot RA, vil monoklonale CD4-antistoffer antakelig være nyttige ved behandling av de ovennevnte sykdommer, og tillatte et spesielt bruksområde innen behandlingen av insulinavhengig diabetes meliitus, systemisk lupus erythematosus, cirrhose, inflammatorisk tarmsykdom, multippel sklerose og andre autoimmune sykdommer. De kan også være nyttige ved behandling av ikke-autoimmune sykdommer, så som leukemi, lymfom, "graft-vs.-host-disease", transplantatutstøtning, asthma og HIV.
Rekombinante monoklonale anti-CD4-antistoffer som fremstilles ifølge oppfinnelsen, antas å mediere den ønskede in vivo-terapeutiske virkning ved en eller flere av de følgende mekanismer : i) blokkering av vekselsøillet mellom CD4 og HMC klasse 2-molekyler;
ii) nedmodulering av celleflate-CD4;
iii) forårsakelse av anergi og/eller apoptose;
iv) utarming av CD4-celler; eller
v) induksjon av toleranse for autoantigener.
Selv om en forbigående utarming av CD4<+->celler fører til immunosuppresjon og muligens også normalisering av et ellers hy-peraktivt immunsystem, er hovedmekanismen ved hvilken anti-CD4-antistoffer utøver sin in vivo-virkning, ikke nødvendigvis avhengig av T-celleutarming. Man tror heller at antistoffbin-ding til CD4-molekyler forebygger en hjelper-T-celle-aktivering av antigener som er bundet til T-cellereseptor, hvilket fører til en antigenspesifikk T-celleanergi eller toleranse. F.eks. oppviser CE9.1-antistoffet som omfatter humant gamma 1-domene, en betydelig immunosuppressiv virkning. Imidlertid ut-armer den kun delvis CD4-cellene i sjimpanser. Videre tyder resultater i mennesker på at dette antistoff fører til en betydelig lavere celleutarming enn andre monoklonale antistoffer som for tiden befinner seg under klinisk testing.
I in vivo-eksperimentelle modeller har man dessuten kunnet indusere transplantatspesifikk toleranse ved ikke-utarmende anti-CD4-antistoffer som ble administrert på transplanta-sjonstidpunktet. Vedlikeholdet av toleransetilstanden krevde intet utarmende anti-CD4-antistoff, men virket imidlertid å være avhengig av antigenets fortsatte nærvær. På grunnlag av disse funn forventer man seg at de rekombinante antistoffer ifølge oppfinnelsen eller andre rekombinante anti-CD4-antistoffer som er fremstilt ifølge oppfinnelsen, vil være egnet for behandling av autoimmune sykdommer. Korte behandlingskurer med anti-CD4-antistoffer vil forstyrre hjelper-T-celleresponsene mot autoantigener, og føre til langvarige kliniske for-bedringer i fravær av en generell immunosuppresjon.
På grunnlag av informasjonen som forefinnes i foreliggende søknad, og ved bruk av kjente metoder, kan en fagmann lett bestemme en sikker, tolerert og virksom behandlingskur med de rekombinante anti-CD4-antistoffer som frembringes heri i form av eksempler.
Som allerede bemerket, er CE9.1 et monoklonalt anti-CD4-antistoff javaape/humant chimeriske antistoff som er av IgGl-mole-kylet, som uttrykkes i kinesisk hamsterovarieceller (CHO-celler), og som oppviser 91-92% homologi med humane immunoglobulin-rammepartier. Derfor antar man at dette molekyl vil oppvise en nedsatt eller fullstendig manglende immunogen respons i mennesker, og vil oppvise en lengre serumhalveringstid sammenlignet med murine monoklonale eller mus/humane chimeriske antistoffer. Dessuten oppviser antistoffet en begrenset kryssreaktivitet med humane vev. F.eks. fant man ingen tegn på binding av dette antistoff til ikke-lymfoide vev under testingen. Som forventet, binder antistoffet noen, men ikke alle, lymfoide celler fra perifert blod og andre organer. Man har dessuten funnet at dette antistoff reagerer med sjimpanse-CD4<+->T-celler, men ikke reagerer med CD4<+->T-celler fra rhesus-, cynomolge eller svinehale-javaaper, bavianer, rotter, mus eller kaniner. På grunnlag av denne reaktivitet utgjør sjimpanser en relevant art for å bekrefte dette antistoffs farmakologiske virkninger in vivo, dvs. dets evne til å virke som et virksomt immunosuppressivt middel.
CE9.1-antistoffet oppviser en reversibel T-celleutarmende aktivitet i sjimpanser. Videre anses det å være sannsynlig at antistoffet vil være forbedret sammenlignet med kjente murine og murine/chimeriske monoklonale anti-CD4-antistoffer på grunnlag av dets forventede lengre halveringstid i humant serum og dets nedsatte potensielle ugunstige immunogene virkninger. Tatt i betraktning at sekvensene for human konstant domene foreligger deri, forventes det at antistoffet ifølge oppfinnelsen etter administrasjon til mennesker, vil opprett-holde de normale effektorfunksjoner av humane antistoffer. Faktisk har man bedømt effektorfunksjonene av CE9.1-antistoffet og av de andre anførte antistoffer i flere forskjellige assayer. Man fant at CE9.1-antistoffet oppviste en hemmende virkning i en blandet lymfocytt-reaksjon (MLR) og også oppviste en svak Clq-binding, men ikke oppviste noen komplementmediert cellulær cytotoksisitet. Man fant dessuten at antistoffet oppviste en antistoffavhengig komplement-cellulær cytotoksisk aktivitet (ADDC), og at det bandt FcR. Dessuten har man bedømt CE9.1-antistoffet in vivo i sjimpanser, og man fant da at deres administrasjon førte til en delvis utarming av CD4-celler og til en modulasjon av CD4-reseptor.
CE9.1-antistoffet er blitt administrert til sjimpanser i forskjellige doseringer. Nærmere bestemt undersøkte man virkningen av doseringen av 0,1, 0,3, 1, 5 og 10 mg/kg til sjimpanser, dosert i 7 og 14 dagers intervaller. Man observerte ingen kliniske tegn på toksisitet. Doseringer på mg/kg eller mer forår-saket en 80-95% reduksjon av de sirkulerende CD4<+->celler 24 timer etter administrasjonen. Man observerte ingen nevnbar utarming av CD4<+->cellene 7 dager etter administrasjonen av 1 mg/kg. Etter en dose på 5 mg/kg klatret CD4<+->celleantallat til ca. 40% av grunnlinjen etter 7 dager, og til ca. 60% av grunnlinjen etter 14 dager. Etter en dose på 10 mg/kg hadde CD4<+->cellean-tallet ikke steget 7 dager etter behandlingen, og var kun steget til 40% av grunnlinjen 42 dager etter doseringen. Man observerte ingen endringer i andre kliniske patologiparametre.
CE9.1-antistoffet er også blitt testet på mennesker. F.eks. har man også bedømt aktiviteten av CE9.1-antistoffet i enkelt dose-eskalerende fase 1-tester i rheumatoid artritt-pasienter. Disse resultater var meget lovende. Nærmere bestemt oppviste ca. halvparten av pasientene som fikk en dose, minst en 30% forbedring på bedømmelsesskalaen for ømme vev, idet skadepro-filen var meget mild. Som beskrevet ovenfor, antok man i ut-gangspunktet at CE9.1 ville være utarmende, men faktisk oppviste dette antistoff kun en delvis og forbigående utarming etter en enkelt administrasjon. Den delvise ikke-utarmende natur av dette antistoff kan være fordelaktig fordi man i et antall dyrestudier har beskrevet at CD4<+->T-celleutarming tilsynelatende ikke er nødvendig for effekten av monoklonale CD4-antistoffer. (Jfr. Carteron et al., Induction of Immune Toler-ance During Administration of Monoclonal Antibody to L3 T4 Does Not Depend on L3 T4<+> Cells, Journal of Immunology, 140: 713-716 (1988); Carteron et al., F( ab') 2 Anti- CD4 and Intact Anti- CD4 Monoclonal Antibodies Inhibit the Accumulation of CD4<+ >T Cells, CD8<+> T Cells and BT T Cells and B cells in the Kidneys of Lupus- Prone NZB/ NZW Mice, Clinical Immunology Immunopathol-ogy, 56: 373-383 (1990).) Dermed er det mulig at dette antistoff virker som en klassisk reseptorantagonist ved å: i) blokkere vekselvirkningen av CD4 med sin motreseptor MHC II; eller ii) forårsake en modulasjon av CD4 fra celleflaten. Under disse betingelser ville CD4<+->T-celleresponser som krever deltagelsen av CD4-reseptor, svekkes eller blokkeres. Det faktum at CE9.1-antistoffet ifølge oppfinnelsen tydeligvis oppviser en lav utarmende aktivitet i mennesker, er fordelaktig fordi dette kan bedre sikkerheten, gjøre det unødvendig med en hyppig overvåking av CD4<+->celleantallet og også kan forbedre effekten.
CE9.1-antistoffet ble utviklet for å nedsette CD4-celleantal-let in vivo ved Fc-reseptor- og komplementbindingsmekanismer. Undersøkelser på sjimpanser tyder på at CE9.1 forårsaker en delvis utarming av CD4-celler, og første undersøkelser tyder på at celleutarmingen i mennesker er meget nedsatt sammenlignet med andre kjente CD4-mAb'er. Det er imidlertid også ønskelig å fremstille antistoffer som mangler en utarmende aktivitet .
Nytten av "ikke-utarmende" CD4-mAb'er forventes å være forbedret av de følgende grunner: i) en utarming av CD4-celler er ikke nødvendig for virkningen
av CD4-mAb'er;
ii) fraværet av en CD4-celleutarming antas å øke deres sikkerhet ;
iii) en økt sikkerhet tillater bruken av mAb'er tidligere i
sykdomsforløpet;
iv) fraværet av CD4-celleutarming antas å øke effekten; og
v) fraværet av CD4-celleutarming vil gjøre det unødvendig eller mindre nødvendig med en hyppig overvåking av CD4-cel-leantallet, og dermed forenkle og nedsette kostnadene av behandlingen.
Disse antakelser støttes av det faktum at man i et antall dyremodeller har kunnet vise at en CD4<+->T-celleutarming ikke er nødvendig for at CD4-mAb'er skal være virksomme. Dermed vil et ikke-utarmende CD4-mAb virke som en klassisk reseptorantagonist ved å: i) blokkere vekselspillet av CD4 med dets motreseptor MHCII,
ii) bevirke en modulasjon av CD4 fra celleoverflaten, eller iii) forårsake T-celleanergi og/eller apoptose.
Dermed ville CD4<+->T-celleresponser som krever deltakelsen av CD4-reseptor, endres eller blokkeres.
Generelt virker T-celleresponser som drives av sterke eller høyaffinitetsantigener, å være uavhengig av CD4-ko-reseptor-funksjoner, og antas derfor ikke å virksomt blokkeres av CD4-mAb'er. Derimot krever T-celleresponser på svake antigener (så som autoantigener) en CD4-ko-reseptorfunksjon, og disse vil dermed hemmes av CD4-mAb'er. Normalt fjernes sterkt autoreak-tive T-celler (T-celler med høyaffinitets TCR'er mot egen-antigener) i thymus ved en "klonal sletting", og opptrer derfor aldri i periferien. Derimot antas T-celler som driver autoim-munresponsen, å være svakt egenreaktive celler som har unn-sluppet de normale mekanismer for perifer toleranse. Slike celler er avhengig av deltakelsen av ko-reseptorer, så som CD4, for en fullstendig utfolding av en respons. Derfor vil en blokkering av ko-reseptorene befri disse T-celler for nødven-dige ko-signaliseringsfunksjoner, hvilket vil føre til en kun delvis aktivering eller til anergi. Som bemerket ovenfor, er det dessuten ønskelig å fremstille chimeriske antistoffer som er spesifikke for CD4, og som har en høyere stabilitet (lengre halveringstid in vivo).
Med dette mål syntetiserte man forskjellige chimeriske antistoffer som inneholdt gamma 4-human konstant domene. Dette domene ble valgt fordi det tydeligvis ikke binder humane komplementer eller FCyl-reseptorer. Dermed forventet man at chimeriske antistoffer som inneholdt dette konstante domene, ville mangle eller hovedsaklig mangle en T-celleutarmende aktivitet. Dessuten fremstilte man flere chimeriske antistoffer som inneholdt kjente modifikasjoner av gamma 4-konstant domene. Spesielt inneholder flere av disse antistoffer "E"-modifikasjonen som beskrives av Duncan et al., Nature, 332: 563-564 (1988), og Winter et al., WO 88/07089 (1988), hvilken modifikasjon er blitt beskrevet å nedsette komplement- og FCyl-reseptorbindingen. Denne modifikasjon omfatter en erstatning av leucin med glutamsyre i stilling 236 (248 Kabat-nummerering) for å dempe en eventuell Fc-reseptor-restbinding. Dessuten inneholder flere chimeriske antistoffer "P"-modifikasjonen som beskrives av Angal et al., Mol. Immunol., 30: 105-108 (1993). Denne modifikasjon, som omfatter å erstatte et serin i stilling 229 (241 Kabat-nummerering) med prolin, bedrer stabiliteten (halveringstiden i serum) ved å stabilisere disulfidbin-dinger mellom de tunge kjeder, og er blitt beskrevet å styrke en forbedret vevfordeling i forhold til chimeriske IgG4 som mangler denne modifikasjon.
Nærmere bestemt var grunnen for å utvikle CE9y4 å motvirke komplementfikseringen og å nedsette FcR-bindingsaktiviteten. Dette antistoff skiller seg fra CE9.1 i at det inneholder human gamma 4-konstant domene (ikke gamma 1). Mens dette var ønskelig, var resultatet imidlertid ikke av en rutinemessig eller forutsigbar natur. Faktisk fant foreliggende oppfinnere at de chimeriske antistoffer som inneholder umodifisert y9, hadde samme Fc-reseptorbinding som y2-antistoffet. Derimot var grunnen for å fremstille CE9y4XK å forbedre produktiviteten av y4-konstruksjonen. Dette antistoff skiller seg fra CE9.1 i at det inneholder human kappa-lett kjede istedenfor lambda. En bedømmelse av CE9y4 in vitro i et Fc-reseptorbindingsassay som måler bindingen av antistoffet til stimulerte monocytter og monocyttiske cellelinjer, viste at CE9y4 fortsatt hadde en betydelig Fc-reseptorbindingsaktivitet. Videre kunne man i dette assaysystem ikke skjelne mellom CE9y4-bindingen og CE9.1-bindingen (gamma 1). Dermed var grunnen for å fremstille CE9y4 å fullstendig fjerne en eventuell FcR-restbinding i forhold til chimeriske antistoffer som inneholder umodifisert y4. CE9yE inneholder gamma 4-konstant domene som er modifisert i én stilling (E-modifikasjon). Til slutt var grunnen for å fremstille CE9y4PE å øke stabiliteten sammenlignet med chimeriske antistoffer som inneholdt umodifisert y4 eller en mutasjon i én stilling (E-modifikasjon). Dette antistoff inneholder et gamma 4-konstant domene som er blitt modifisert i to stillinger (P-og E-modifikasjon).
Som beskrevet, valgte man humant y4-konstant domene som isotype for å motvirke effektorfunksjonene, dvs. reaktiviteten med humane Fcy-reseptorer eller Clq, og å utelukke utarming av CD4<+->celler in vivo. Disse fire kandidater ble valgt og uttrykt i CHO-celler.
To av disse monoklonale antistoffkandidater ble valgt for en videregående undersøkelse, nemlig CE9y4E og CE9y4PE. Som nevnt, inneholder begge disse antistoffer en glutamsyresubstitusjon i CH2-partiet, som ble innført for å fjerne en FcR-restbinding som forbindes med y4-konstant parti. I tillegg inneholder CE9y4PE en prolinsubstitusjon i hengselpartiet, og dette skal forbedre stabiliteten av den tunge kjedes disulfidbindings vekselvirkning.
Man fant at disse antistoffer hadde identisk affinitet for CD4, molekylvekt, stabilitet mot varmedenaturering, suppresjon av MLR, fravær av binding til FcR og manglende aktivitet i ADCC og CDC. Dermed oppviser begge disse antistoffer in vitro-kriteriene for et høyaffinitets CD4-mAb uten FcR- og komple-menteffektorfunksj oner.
Egenskapene av CE9.1 og CE9y4PE sammenlignes i Tabell 1. En nedsatt Fc-reseptorbinding henviser til chimeriske antistoffer som har en nedsatt binding av Fc-reseptoren sammenlignet med 1 yl-holdige chimeriske antistoffer, fortrinnsvis minst 30-80% nedsatt og mer foretrukket 50-80% nedsatt og mest foretrukket ingen binding. Som resultatene med det chimeriske antistoff med umodifisert gamma 4, var resultatene imidlertid ikke av en forutsigbar natur. Dermed bekrefter disse resultater at man ifølge oppfinnelsen kan fremstille chimeriske antistoffer som binder humant CD4, og som mangler bestemte effektorfunksjoner på grunnlag av valget av bestemte konstant domenesekvenser.
Ved bruk av de som eksempler oppførte chimeriske anti-CD4-antistoffer, som immunosuppressiva eller CD4-modulatorer for behandling av autoimmune lidelser, omfattende f.eks. rheumatoid artritt, kan disse antistoffer administreres for seg selv eller i kombinasjon med andre forbindelser som er egnet for behandling av den bestemte sykdomstilstand. F.eks. kan antistoffene ifølge oppfinnelsen administreres i kombinasjon med andre proteiner, f.eks. monoklonalt antistoff-oppløselige re-septorproteiner mot TNF-alfa, monoklonale antistoffer mot IL2-reseptor, monoklonale antistoffer og reseptorfusjonsproteiner som motvirker CD40/gp39-vekselspillet, og CTLA 4-Ig i monoklonale antistoffer som motvirker B7/CD28-vekselspillet. I tilfellet av en behandling av rheumatoid artritt, kan antistoffene ifølge oppfinnelsen også admininstreres i kombinasjon med andre terapeutika, f.eks. Rapamycin, Leflunomid, Tenidap, RS-61443 (Mycofenolat Mofetil), Surenyl (natrium-Hyaluronat), anti-TCR (Vpi8)-peptidvaksine, Anerva X (anti-MHC-vaksine) og ekstrakorporeale protein A-immunoabsorbenter eller kombinasjo-ner derav. I tillegg kan antistoffene ifølge oppfinnelsen administreres i kombinasjon med andre antistoffer som er kjent innen faget, og som er spesifikke for humant CD4. Dette kan føre til synergistiske virkninger, f.eks. hvis disse antistoffer bindes til forskjellige epitoper av CD4-proteinet.
De følgende eksempler bringes for å nærmere beskrive oppfinnelsen .
EKSEMPEL 1
KLONING OG EKSPRESJON AV ET
APE/HUMANT CHIMERISKE ANTISTOFF SOM ER SPESIFIKT FOR CD4
Det følgende er et bestemt eksempel på fremgangsmåtene og antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse.
Generering av udødeliggjorte ape - B - cellelinjer
En voksen cynomolg ape (White Sands New Mexico Primate Center) ble immunisert intramuskulært på flere steder med 150-300 \ iq oppløselig CD4 (sCD4) eller cellemembraner (1 x IO<8> celler) fra den CD4-positive cellelinje SupTl ved bruk av standard bærerstoff. Immuniseringen ble gjentatt hver 2.-3. uke, totalt seks ganger. Apen ble boosterimmunisert ved injeksjon av 100 ug sCD4 i inguenpartiet av et lår, og en uke senere ble den drenerende lymfeknute i det samme lår fjernet. Lymfocyttene ble fjernet fra lymfeknuten ved å skjære vevet i skiver og å skylle ski-vene med sterilt DMEM-medium. Cellesuspensjonen ble ført gjennom et nylonnett og samlet ved sentrifugering ved 1000 x g i 10 minutter.
Ca. lx IO<8> lymfocytter ble suspendert i Tris-ammoniumkloridbuffer (16 mM, pH 7,5) og oppvarmet til 37°C i 5 minutter for å løse opp erytrocyttene. Lymfocyttene ble samlet ved sentrifugering, gjensuspendert i L-leucinmetylester (LME) og inkubert ved 37°C i 45 minutter. De LME-behandlede celler ble filtrert gjennom et nylonnett og sentrifugert. 1 ml føtalt kalveserum ble tilsatt, og cellene ble suspendert og vasket to ganger i serumfritt RPMI. Cellene ble telt og blandet i et enkelt 50 ml konisk sentrifugerør sammen med et likt antall K6H6/B5-hetero-myelomaceller, som på forhånd var blitt vasket to ganger i serumfritt medium. Cellene ble forsiktig suspendert i 1 ml 50% PEG (polyetylenglykol) som ble tilsatt langsomt under forsiktig omrøring i løpet av 1 minutt. Cellene ble deretter gjensuspendert ved tilsetning av 20 ml serumfritt medium i løpet av 5 minutter, under forsiktig omrøring for å tynne ut PEG'en. Etter å ha blitt vasket to ganger i serumfritt medium, ble cellene gjensuspendert i konsentrasjonen 5 x 10<5>/0,1 ml i RPMI-medium som inneholdt 20 % føtalt kalveserum og gentamycin, og plassert i 96 brønners mikrovevkulturplater med 0,1 ml pr. brønn. Et likt volum HAT-medium (0,1 ml) ble tilsatt til hver brønn, og hybridene fikk vokse i 14-17 dager før sortering.
Utsortering av sammensmeltede cellehybrider for fremstilling av anti - CD4
Assayet for å bestemme anti-CD4-spesifisiteten var som følger: ELISA-plater ble bestrøket med rekombinant sCD4 i konsentrasjonen 100 ng pr. brønn, og blokkert med 1% bovint serumalbumin i PBS. 50 ^.1 alikvoter hybridomasupernatant ble fjernet fra hver brønn og inkubert med de sCD4-belagte plater i 60 minutter. Bindingen ble påvist ved inkubasjon med <125>I-merket geite-anti-humant eller geite-anti-ape-Ig i 60 minutter. Etter å ha blitt vasket fire ganger med destillert vann, ble brønnene un-dersøkt i en gamma-teller. Positive brønner ble gjentestet i hver to eksemplarer, og hybridomacellene fra disse brønner ble subklonet tre ganger, først med 5 celler pr. brønn og deretter to ganger med 1 celle pr. brønn. I dette stadium ble de anti-sCD4-positive supernatanter testet for sin evne til å bindes til celleflate-CD4. Dette ble utført ved å hemme bindingen av et murint monoklonalt anti-CD4-antistoff som benevnes 1F3, til den CD4-positive cellelinje supTl. Kort sagt ble dette utført ved å ko-inkubere forskjellige mengder ape-anti-CD4 og 10 \ iq <125>I-merket 1F3 med 3 x IO<5> supTl-celler pr. brønn i en 96-brøn-ners plate. Etter inkubasjon i 1 time ved romtemperatur (ca. 20-25°C) ble cellene fjernet ved vakuum på glassfiberfiltre. Etter en grundig vask med PBS ble filtrene undersøkt i en gamma-teller for å bestemme hemmingen av lF3-bindingen til supTl-celler som kunne tilskrives ape-hybridomasupernatantene.
En kandidatklon ble valgt som fremstilte et antistoff som oppviste sterk hemming av 1F3. Klonen ble isotypebestemt ved bruk av humane isotypereagenser, og man fant at den var et IgG2 som hadde en lambda-lett kjede. Denne cellelinje ble dyrket i større antall for å klone dess immunoglobulingener.
Kloning av tung og lett kjede - variabelt parti - gener fra udøde-liggj orte ape - B - celler
Det samlede RNA ble isolert fra 1 x IO<7> udødeliggjorte ape-B-celler ved bruk av guanidiniumisotiocyanatmetoden. En tiendedel av det samlede RNA ble brukt for å fremstille enkeltkjedet cDNA ved bruk av en oligo-dT-oligonukleotidprimer og revers transkriptase. En tiendedel av det enkeltkjedede cDNA ble brukt for å sette opp PCR-reaksjoner. De seks PCR-reaksjoner omfattet hver en av seks 5'-VH-familiespesifikke oligonukleo-tidprimere som inneholdt en Sal I-restriksjonsstilling sammen med et IgG 3'-konstant parti-oligonukleotid som inneholdt en Nhe I-stilling, som begge vises på figur 7-1. På lignende måte utførte man fem PCR-reaksjoner ved bruk av en av fem 5'-lambda-ledersekvens-oligonukleotidprimere som inneholdt en Bgl II-stilling og en 3'-lambda-konstant parti-primer som inneholdt en Avr II-stilling. Reaksjonsbetingelsene var som beskrevet ovenfor. Hver PCR-reaksjon ble utført i tre eksemplarer. Produktene av hver tung kjede- og lett kjede-amplifika-sjonsreaksjon ble ført på 1,2% agarosegel. VH4-tung kjede-pri-meren (5'-ACTAAGTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT-3') og lambda-prime-ren (5'-ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC-3') gav sterke bånd ved agarosegel-elektroforese. Produktene av disse reaksjoner ble brukt for å klones inn i vektoren TCAE 6, som inneholder sekvensene for humant IgGl og humant lambda-konstant parti.
Kloning av de to variabelt parti-gener inn i ekspresjonsvektoren TCAE 6 ble utført sekvensielt. Først ble produktet av tung kjede-PCR og vektoren TCAE 6 spaltet med restriksjonsenzymene Sal I og Nhe I, og produktene ble ekstrahert med fenol/kloro-form og ført gjennom en SEPHADEX G-25-virvelkolonne. PCR-produktet ble ligert med den skårne vektor over natten ved 14°C i nærvær av T4 DNA-ligase. Ca. 500 ng samlet DNA ble ligert i volumet 10 ^.1 med det molare forhold 10:1 mellom innføyel-se/vektor. Det ligerte materiale ble brukt for å transformere XL-1 Blue-kompetente celler (Stratagene), og de transformerte celler ble plasssert på LB-agarplater som inneholdt 50 ug/ml ampicillin. Kolonier av ampicillinresistente bakterier ble samlet og dyrket i form av 5 ml minikulturer. Plasmid-DNA ble ekstrahert fra hver av disse kulturer ifølge en standard alka-lisk oppløsningsmetode og spaltet med restriksjonsenzymene Sal I og Nhe I, og produktene ble ført på 1,2% agarosegel. Plasmider med innføyelser som var ca. 450 bp lange, ble brukt som sjabloner for den etterfølgende kloning av lett kjede-variabelt parti. Produktene av lett kjede-PCR-reaksjonen og plasmidet som inneholdt tung kjede-innføyelsen, ble spaltet med restriksjonsenzymene Bgl II og Avr II og ligert sammen. Plasmid-minikulturer ble sortert ved spaltning med Bgl II og Avr II. Spaltningsproduktene som gav en innføyelse med ca. 400-450 bp lengde, ble ansett for å teste positive. Plasmider som inneholdt både Sal I/ Nhe I- og Bgl II/ Avr II-innføyelsen, ble dyrket i større mengder for en DNA-sekvensbestemmelse.
De chimeriske antistoff-tandemekspresjonsvektorer TCAE 5.2 og TCAE 6 ble avledet fra vektoren CLDN, som er avledet fra vektoren RLDNIOb (253 Science, 77-79 (1991)). RLDNIOb i sin tur er avledet fra ekspresjonsvektoren TND (7 DNA, 651-661
(1988) ) .
RLDNIOb skiller seg fra vektoren TND på de følgende måter. Den dihydrofolatreduktasetranskripsj onelie (DHFR-transkripsj o-nelle) kassett (promoter, cDNA og polyadenylasjonsparti) ble plassert mellom vevplasminogenaktivatorkassetten (t-PA-ekspre-sjonskassetten) og neomycinfosfotransferasekassetten (NEO-kas-setten) således at alle tre kassetter ligger etter hverandre og i lik transkripsjonen retning. I tillegg har man erstattet DHFR-genpromoteren CLDN med muse-beta-globulin-hovedpromoter (3 Mol. Cell Biol., 1246-1254 (1983)), og t-PA-cDNA er blitt erstattet med en polylinker. Alle tre eukaryotiske transkripsjonene kassetter (ekspresjon, DHFR, NEO) kan separeres fra det bakterielle plasmid-DNA (pUC9-derivat) ved spaltning med restriksjonsendonuklease Not I.
CLND skiller seg fra RLDNIOb i at Rous LTR foran polylinkeren er blitt erstattet med humant cytomegalovirus-umiddelbar-tidlig gen-promoterforsterker (41 Cell, 521 (1985)) .
Ekspresjonsvektorene TCAE 5.2 og TCAE 6 skiller seg fra CLDN i at: 1) De inneholder fire transkripsjonene kassetter (istedenfor tre), i tandemrekkefølge: (a) Humant immunoglobulin-lett kjede-konstant parti avledet ved amplifikasjon av cDNA ved en polymerase-kjedereaksjon. I TCAE 5.2 er dette humant immunoglobulin-lett kjede-kappa-konstant parti (Kabat-nummerering av aminosyrer 108-214, allotype Km3), og i TCAE 6 er det humant immunoglobulin-lett kjede-lambda-konstant parti (Kabat-nummerering av aminosyrer 108-215, genotype Oz-minus, Mcg-minus, Ke-minus-allotype); (b) humant immunoglobulin-tung kjede-konstant parti; i begge konstruksjoner er humant immunoglobulin-tung kjede et gamma 1-konstant parti (Kabat-nummerering av aminosyrer 114-478 allotype Gmla, Gmlz) som ble avledet ved amplifikasjon av cDNA ved en polymerasekjedereaksjon; (c) DHFR; inneholdende sin egen eukaryote promoter og sitt eget polyadenylasjonsparti; og (d) NEO; også inneholdende sin egen eukaryote promoter og sitt eget polyadenylasjonsparti. 2) Humant immunoglobulin-lett- og tungkjede-kassettene inneholder syntetiske signalsekvenser for utsondring av immunoglobulinkjedene; og 3) Humant immunoglobulin-lett og tung kjede-kassettene inneholder spesifikke DNA-koblinger som tillater en innføyelse av lette og tunge immunoglobulin-variable partier som vedlikeholder den translasjonene leseramme, og som ikke endrer aminosyrene som vanligvis forefinnes i immunoglobulinkjeder.
Innlemmelsen av de beskrevne endringer førte til konstruksjonen av vektorene TCAE 5.2 og TCAE 6. Kloningen av genene for immunoglobulin-lett og tungt variabelt parti fra anti-CD4-he-terohybridomacellelinjen E9.1 inn i TCAE 6, førte til konstruksjonen som er deponert hos ATCC. Konstruksjonen som er deponert, og som koder for CE9.1-antistoffet, inneholder cynomolg ape-immunoglobulin-tung kjede-variabelt parti og cynomolg ape-immunoglobulin-lett kjede-variabelt parti, hvis sekvenser vises på figurene 1 hhv. 2, klonet fra anti-CD4-hybridomacel-lelinjen E9.1. Tung kjede-konstant parti er av human opprinnelse av gamma 1-isotypen og Gmla, Gmlz-allotypen. Lambda-lett kjede-konstant parti er også av human opprinnelse, av Oz-minus, mcg-minus-genotypen og Ke-minus-allotypen. Immunoglobu-lingenene ble klonet inn i pattedyrsekspresjonsvektoren TCAE 6, som beskrives i de ovennevnte søknader som er innlemmet heri ifølge henvisning dertil, som når den elektroporeres inn i pattedyrcellelinjen CHO, gav et ape/humant chimeriske anti-CD4-antistoff. DNA-konstruksjonen som beskrives heri, er blitt brukt for å transformere den bakterielle stamme XL-1 Blue, valgt i det antibiotiske middel ampicillin og deponert i form av en bakteriecellesuspensjon i sterilt LB-medium som inneholdt 15% glyserol.
DNA - sekvensiering
Plasmid-DNA ble preparert fra 100 ml kulturer. Det ble ytterligere renset ved å felle (1 volumandel) med en blanding av
2,5M natriumklorid og 20% polyetylenglykol (6 volumandeler) på is i 15 minutter. Etter sentrifugering ved 10.000 x g i 20 minutter ble pelleten vasket med 70% etanol, gjensentrifugert og tørket i en "Speedivac" (Savant). DNA-pelleten ble gjensuspendert i avionisert vann i konsentrasjonen 150-250 ug/ml. Sek-vensbestemmelsen ble utført på 5 ug dobbeltkjedet DNA ved bruk av Sangers teknikk. Sekvensieringsprimere som var homologe med
sekvenser innen ekspresjonsvektoren oppstrøms og nedstrøms fra lett kjede- og tung kjede-innføyelsene, ble brukt. Innføyel-sene ble sekvensiert både i 5'-til-3'-retningen og 3'-til-5'-retningen. To kloner av anti-CD4-lett kjede og to kloner av anti-CD4-tung kjede, som hver var blitt fremstilt under forskjellige PCR-reaksjoner, ble sekvensiert parallelt for å bestemme om det var skjedd noen nukleotidendringer under PCR-re-aks jonen. Man fant at begge de valgte tung kjede-kloner og begge de valgte lett kjede-kloner var identiske over hele sin lengde, hvilket bekreftet at det ikke var blitt innført noen feil under amplifikasjonsprosessen. Sekvensen for anti-CD4-tung og lett kjede vises på figurene 1 og 2.
Ekspresjon av ape / humant chimeriske anti - CD4
Ekspresjonsvektorene TCAE 5.2 og TCAE6 kan ikke bare brukes for en stabil integrert ekspresjon inn i cellelinjene Sp2/0 og CHO, men kan, fordi de omfatter SV4 0-opphavet, også uttrykkes forbigående i cellelinjen COS. COS-celleekspresjonen ble ut-ført som følger: COS-celler ble podet en dag før transfeksjo-nen, således at de ville være 50-70% sammenløpende på den føl-gende dag. Kulturmediet ble fjernet, og cellene ble vasket to ganger med transfeksjonsbuffer (TB: 140 mM NaCl, 25 mM Tris, 5 mM KC1, 0,5 mM Na2HP04, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) . 30 ug cesium-klorid-renset TCAE 6-plasmid som inneholdt anti-CD4-ape/humant chimeriske tung og lett-immunoglobulinkjede, ble blandet med 3 ml DEAE-dekstran pr. skål (1 mg/ml i TB). DNA' et ble inkubert med cellene i 1 time ved 37°C. DNA-oppløsningen ble fjernet og erstattet med 3 ml 20% glyserol i 1,5-2,5 minutter, hvoretter cellene ble vasket to ganger med TB. Cellene ble inkubert i 5 ml ferskt medium som inneholdt 100 ^M klorokin, i 3-5 timer ved 37°C, hvoretter de ble vasket to ganger med medium og inkubert med normalt DMEM i 72 timer. Supernatant (100 ul) fra de transfiserte COS-celler ble testet i forskjellige fortynninger for å påvise nærværet av antistoff, ifølge en ELISA-basert teknikk. Geite-anti-humant lambda ble brukt for å bestryke 96-brønners plater, og et peroksidase-merket geite-anti-humant IgG ble brukt som påvisningsantistoff, under standard ELISA-betingelser. Man fant at COS-cellene fremstilte 10-40 ng/ml ape/humant chimeriske antistoff. Større mengder supernatant ble konsentrert 10 ganger og brukt i en direkte bindings-RIA til CD4-positive SupTl-celler. Det fullstendige stam-ape-antistoff og et urelevant humant immunoglobulin ble brukt som positiv- hhv. negativkontroll. Dessuten brukte man ape-anti-CD4 og ape/humant chimeriske anti-CD4 for å hemme bindingen av et høyaffinitets muse-anti-CD4 (1F3)-antistoff. Disse resultater viste at ape/humant rekombinant antistoff (ATCC nr. 69030) ikke bare bindes til CD4-positive celler, men også har evnen til å hemme bindingen av 1F3 til CD4-positive celler, ved om-trent de samme konsentrasjoner av rent ape-antistoff eller 1F3 i og for seg.
EKSEMPEL 2
Dette eksempel vedrører den funksjonelle karakterisering av CE9.1 in vitro, omfattende dets virkninger på T-celleproliferasjonen og IL-2-produksjonen i MLR, dess Fc-reseptor- og komplementbindingsegenskaper og dess evne til å mediere ADCC-og CDC-responser. I tillegg analyserte man in vivo-virkningene på CD4-reseptormediering og lymfoide undergrupper i perifert blod. Det følgende ble analysert. De følgende materialer og fremgangsmåter ble brukt i dette eksempel [Anderson et al., " In vitro and in vivo characterization of a primatized mAb to human CD4: mAb causes CD4 reseptor modulation but not CD4 T cell depletion in chimpanzees".]
Materialer og metoder
Molekylær konstruksjon og ekspresjon av primatisert (" PRIMATIZED ") anti - CD4
Variabelt parti-immunoglobulin-gener ble amplifisert ved PCR og klonet fra et heterohybridoma avledet fra en ape som var blitt immunisert med sCD4, som beskrevet tidligere [Newman, R.A. et al., "Primatization of recombinant antibodies for immunotherapy of human disease: a macaque/human chimeric antibody against human CD4", Biotechnology, 10: 1455 (1992)]. Tung og lett kjede-variabelt parti-gener ble innføyd i kassett-ekspresjonsvektoren TCAE6, i tandemrekkefølge, og uttrykt i form av et IgGlX etter en stabil integrasjon i DHFR~-CHO-celler [Newman, R.A. et al., "Primatization of recombinant antibodies for immunotherapy of human disease: a macaque/human chimeric antibody against human CD4", Biotechnology, 10: 1455 (1992)]. Tre amplifikasjoner i økende mengder metotreksat gjorde det mulig å utvikle cellelinjer som uttrykte antistoffet i en mengde på over 750 ug/ml på 8 dager. En produksjonscellelinje ble generert, dyrket i suspensjonskultur og progressivt ekspandert før innpoding av en hulfiberreaktor [Evans et al., "Large-scale production of murine monoclonal antibodies using hollow fiber bioreactors", BioTechniques 6 (8): 762 (1988)].
Det monoklonale antistoff CE9.1 ble isolert ved å føre kultur-supernatant fra reaktoren gjennom en Prosep A-kolonne (300 ml, Bioprocessing Inc.) som på forhånd var blitt ekvilibrert med fosfatbufret saltvann, pH 7,2, ved hastigheten 125 ml/min. Kolonnen ble vasket med PBS inntil en grunnlinje var oppnådd, og det bundne antistoff ble eluert med 5 kolonnevolumer 0,2M ed-diksyre/0,lM glycinbuffer pH 4,0. Isolasjonen var ca. 90%. Eluatet ble innstilt til pH 5,5 og ført gjennom en Q-Sepha-rose-kolonne (Pharmacia). CE9.1 ble bundet til kolonnen, som ble vasket med 25 MM Tris-HCl, pH 8,5. Antistoffet ble eluert med 50 mM Tris-HCl, pH 6,5, som inneholdt 100 mM NaCl, og konsentrert ved defiltrering (Millipore Pellicon) mot USP inji-serbart normalt saltvann. CE9.1 ble til slutt filtrert gjennom et 0,04 nm Nylon66-NDP-filter (Pall Filtration) .
Bindingsspesifisitet: Binding av CE9 . 1 til CD4 +- SupT - 18 - celle
96-brønners mikroliterplater med U-formet bunn (Corning) ble på forhånd blokkert i 1 time på is med PBS som inneholdt 0,2% bovint serumalbumin og 0,1% natriumazid. SupT-18-celler (1 x IO<5>) som på forhånd var blitt vasket med den samme buffer, ble inkubert i 30 minutter på is med forskjellige konsentrasjoner av CE9.1 (2,4 pg/ml - 10 ng/ml). Cellene ble vasket to ganger
og inkubert i 30 minutter på is med et andre sjikt antistoff (FITC-merket geite-anti-mus-Ig). Cellene ble vasket to ganger, gjensuspendert i fikseringsbuffer (2 % formaldehyd i PBS) og analysert ved bruk av et FACScan strømningscytometer (Becton Dickinson).
Bindingsspesifisitet: Analyse ifølge strømningen av bindingen av CE9 . 1 til humane perifere blodleukocytter
Mononukleære celler ble isolert fra humant perifert blod ved bruk av Ficoll/Hypaque-standardsentrifugeringsteknikken [Boyum, A., "Separation of blood leukocytes, granulocytes and lympho-cytes", Tissue Antigens 4: 269 (1974)]. Mellomskiktet som inneholdt mononukleære celler fra perifert blod (PMNC) ble fjernet, vasket med Hank's balanserte saltoppløsning (HBSS) og telt. 5 x IO6 celler ble inkubert med 20 ni CE9.1 (25 ng/ml) i 30 minutter ved 4°C. Cellene ble deretter vasket med HBSS og inkubert med 20 ni geite-anti-humant IGG-FITC (Fisher Scientific) . Etter inkubasjon på is i ytterligere 30 minutter ble cellene analysert på et Becton Dickinson-FACScan-instrument ved bruk av autokompensasjon og forkalibrering med Calibrite-kuler. Levedyktige lymfocyttpopulasjoner ble identifisert ifølge en fremoverrettet vs. rettvinklet lysspredning, og den samlede lymfocyttpopulasjon ble isolert ved utelukkelse av alle andre signaler. Påfølgende målinger av fluorescensen viste kun de valgte lymfocyttsignaler. mAb'er som brukes for kvantifisering av dobbelt merkede celler og etterfølgende un-dersøkelser på sjimpanseblod, omfattet anti-humant CD3 (Leu-4-FITC; Becton Dickinson); fluorescein-konjugert anti-humant CDS (Leu-2a-FITC; Becton Dickinson); fykoerytrinkonjugert anti-humant CD8 (Leu-2a-PE; Becton Dickinson); fykoerytrinkonjugert anti-humant CD20 (Leu-16-PE; Becton Dickinson); fluorescein-konjugert geite-anti-humant IgG-F(ab')2 (Cappel) og fykoerytrinkonjugert murint anti-CD4 (OKT4; Ortho Pharmaceuticals).
Kryssreaktivitet med humane vev
CE9.1 ble bedømt for sin kryssreaktivitet med normale humane vev. Biotinylert CE9.1 ble testet på kryostatskårne frosne snitt fra 32 forskjellige vev ved bruk av avidin-biotinimmuno-peroksidaseteknikken [Wilchek, M. et al., "The avidin-biotin complex in bioanalytical applications", Anal. Biochem., 171: 1
(1983)]. SupTl-celler (CD4<+>) ble brukt som positivkontroll, og SB-celler (CD4~) ble brukt som negativkontroll-cellelinje. Et urelevant biotinylert mus/humant (IgGl) chimeriske antistoff ble brukt som antistoff-negativkontroll.
For de fleste vev undersøkte man tre forskjellige prøver, og reaktiviteten derav med CE9.1 ble bedømt på en skala fra 0 til 3+. For enkelte vev ble forskjellige strukturer innen vevet testet hver for seg. F.eks. i leveren bedømte man hepatocyt-tene, gallegangene og Kupffer-cellene hver for seg.
Artspesifisitet
Perifert blod fra flere vanlige laboratorieprimater og ikke-primater ble testet med CE9.1 for å identifisere en mulig kryssreaktivitet med CD4-positive T-celler. Gruppen omfattet sjimpanser, bavianer, rhesus-, cynomolge og svinehale-javaaper, rotter, mus, kaniner og hunder. Blodceller ble isolert fra 1-5 ml fullblod ved sentrifugering (1500 rpm i 5 minutter) ved 4°C og vasket ved gjensuspensjon i like volumer PBS. Frem-gangsmåten ble gjentatt en gang til, og cellene ble gjensuspendert i like volumer føtalt bovint serum. 200 n.1 cellesuspen-sjon fra hver art ble plassert i et 15 ml konisk sentrifugerør med 20 ni CE9.1 (25 mg/ml). Antistoffet og cellene ble blandet, plassert på is i 30 minutter og deretter vasket grundig med HBSS. 20 ni geite-anti-humant IgG-FITC (Fisher Scientific) ble deretter tilsatt, og prøvene ble blandet. Etter inkubasjon på is i ytterligere 30 minutter, fjernet man prøvene fra isen og tilsatte 10 ml lysisbuffer (0,01 M kaliumbikarbonat, pH 7,4, som inneholdt 0,16 M ammoniumklorid og 0,1 M natrium-EDTA) som på forhånd var oppvarmet til 37 °C. Prøvene ble inkubert ved romtemperatur i 15 minutter, etterfulgt av sentrifugering ved 1.500 rpm i 5 minutter. Merkede cellepelleter ble vasket ytterligere to ganger i HBSS (pH 7,4) som inneholdt 1 % bovint serumalbumin og 0,05 % natriumazid. De merkede celler ble fiksert ved å gjensuspendere dem i fikseringsbuffer (0,5 M natriumklorid som inneholdt 1,0 % formaldehyd; filtrert gjennom et 0,22 nm filter). Prøvene ble analysert på et FACScan-instrument fra Becton Dickinson som beskrevet ovenfor.
Funksjonelle assayer in vitro: En - veis og tre - veis blandet lymfocyttreaksjon
Humane eller sjimpanse-T-celler (1,3 x IO<5>) ble dyrket med eller uten CE9.1 i flatbunnede mikrobrønner i 7 dager med mitomycin-C-behandlede PBMCer (6,0 x 10<4>) erholdt fra en ubeslek-tet donor av human hhv. sjimpanse-opprinnelse. 1 uCi/brønn tritiert tymidin ble tilsatt til kulturen under de siste 18 timer av dyrkingen. Mikrotiterplatene ble sentrifugert, celle-pelletene ble vasket med HBSS og deretter telt i en væskescin-tillasjonsteller. Hver prøve ble testet i tre eksemplarer.
Humane MLR'er ble utført ved bruk av tre forskjellige, ube-slektede donorer som stimulator- og responder-blandinger. Denne protokoll ble tilpasset for å maksimere muligheten for en god respons i de HLA-ikke-karakteriserte vilkårlige prøver av "red cross buffy coat"-blod. I denne protokoll ble intet donorblod behandlet med mitomycin C eller bestrålt.
THP - l - celleadhesjonsassay for å måle Fc - reseptorbindingsakti - viteten av CE9 . 1
Dette assay er avhengig av en brodannelse mellom to cellelinjer, idet den ene uttrykker CD4 og den andre uttrykker Fc-reseptorer, ved hjelp av et anti-CD4-antistoff. Den CD4-uttryk-kende partner som ble brukt, var den klebrige murine fibroblastcellelinje DAP som var blitt transfisert med humant CD4
(DAP/CD4). De Fc-reseptorbærende celler var THP-1. DAP/CD4-cellene ble plassert i 96-brønners flatbunnede plater (100 Hl/brønn; 25.000 celler/brønn), og fikk klebe seg fast over natten. THP-l-cellene ble gjensuspendert i 50 ml RPMI-medium (1 x IO<6> celler/ml) og indusert i 24 timer ved 37°C ved tilsetning av 50 U/ml ylFN.
De ylFN-induserte THP-l-celler ble ladet med kalsinert acetome-toksyester (CAM, Molecular Probes) som følger: cellene ble vasket med ladningsbuffer (Dulbeccos PBS med kalsium og magnesium, og 0,1% bovint serumalbumin) og gjensuspendert i konsentrasjonen 5 x IO<6> celler/ml i 10 ml av den samme buffer. CAM (1 mg/ml i DMSO) ble fortynnet (1:50) med ladningsbuffer og tilsatt til THP-l-cellesuspensjonene 1:1 vol/vol. Etter inkubasjon i 20 minutter ved romtemperatur tilsatte man 25 ml fersk ladningsbuffer til hver 4 ml celle/CAM-blanding, og in-kuberte det hele i ytterligere 40 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter vasket to ganger med ladningsbuffer og gjensuspendert med 8 x IO<6> celler/ml. Serielle fortynninger av CE9.1 i PBS (uten kalsium, magnesium eller BSA) ble tilsatt til brønnene som inneholdt CD4<+->DAP-celler, og det hele ble inkubert i 5 minutter ved romtemperatur. 50 ni CAM-ladet THP-l-cellesuspens j on ble deretter tilsatt, og platene ble inkubert ved romtemperatur i 1 time i mørke. Kontrollbrønner uten DAP-celler ble også testet. Etter inkubasjonen ble brønnene vasket 3 ganger med PBS. Etter den endelige vask, tilsatte man 100 ni PBS pr. brønn, etterfulgt av 10 n1 20% Triton X-100. Etter å ha plassert det hele på et rysteapparat i 10-15 sekunder, ble platene avlest i et "Fluoroscan" (MTX Lab Systems Inc.).
Aktivert monocyttbindingsassay for å måle Fc - reseptorbindings - aktiviteten av CE9 . 1
Fc-reseptorassayet ble utført som beskrevet for THP-l-cellene ovenfor, men med de følgende forskjeller. Monocytter ble fremstilt fra ferskt humant perifert blod ifølge standard Fi-coll/Hypaque- og Percoll-gradientseparasjon. Monocyttene ble stimulert med ylFN som beskrevet ovenfor, men i 48 timer. Platene ble bestrøket med stimulerte monocytter i 24 timer, og i dette assay ble CD4<+->linjen supT-18 ladet med CAM som beskrevet ovenfor. SupT-18-celler ble deretter tilsatt til platene som var bestrøket med stimulerte monocytter, som beskrevet ovenfor. Hovedforskjellen i dette assay er at CD4<+->cellelinjen ble CAM-ladet og tilsatt til de FcR-bærende celler på platen. I det forrige assay hvor man brukte THP-l-celler, var rekkeføl-gen den motsatte.
Binding til FcyRII - transfiserte murine fibroblaster
En murin fibroblastcellelinje (CDW32-L), som var blitt transfisert med humant FCRH, ble erholdt fra ATCC. Den direkte binding av CE9.1 ble bestemt ved å inkubere antistoffet i nærvær og fravær av sCD4. Bindingen av CE9.1 ble påvist ved inkubasjon med geite-anti-humant Ig-antistoffer som var konjugert med pepperrot-peroksidase (Southern Biotech). Fab-fragmenter av CE9.1 ble generert ved enzymatisk spaltning, og disse ble brukt som negativkontroller. Absorbansverdiene som ble erholdt fra CE9.1 (og Fab-fragmentene) som var blitt inkubert med celler i nærvær av sCD4, ble subtrahert fra absorbansen som ble erholdt for antistoffene i fravær av sCD4.
ADCC - assayer ( lysis av supTl - celler )
Ferske hepariniserte humane blodprøver ble samlet, og PMNC'ene ble samlet ved standard sentrifugeringsmetoder på Fi-coll/Hypaque. Røde blodceller i "buffy coat" ble oppløst med ammoniumkloridbuffer, og cellene ble vasket to ganger i Hanks balanserte saltoppløsning. Perifere blodlymfocytter (PBL'er) ble stimulert med 10 enheter IL-2 pr. ml RPMI/10% føtalt kalveserum (FCS) i 24 timer ved 37°C, 5% C02. Etter 24 timer ble PBL'ene gjensuspendert i RPMI/5% FCS.
SupTl-18-celler (1 x IO<6>) ble merket ved å inkubere dem med 100 uCi <51>Cr i 1 time ved 37°C, 5% C02. Cellene ble vasket to ganger med RPMI/5% FCS, og 1 x 10<4> celler ble plassert i hver brønn. Tre batcher CE9.1-antistoff ble serielt fortynnet 1:2 med RPMI/5% FCS, og alikvoter ble tilsatt i tre eksemplarer til de SupTl-18-holdige brønner i 30 minutter ved 37°C, 5% C02. 100 ni 1% Triton X-100 og 100 ni medium ble brukt som kontroll for den maksimale hhv. spontane utsondring. IL-2-stimulerte PBL'er (8 x IO<5> celler) ble tilsatt til brønnene. Platene ble sentrifugert i 3 minutter ved 900 rpm og inkubert i 16 timer ved 37°C, 5% C02. Supernatanten fra hver brønn ble samlet, og mengden radioaktivitet ble bestemt i en gamma-teller. Assayet ble utført i tre eksemplarer. Prosentandelen celleoppløsning ble bestemt ifølge den følgende formel:
Clq - bindingsassay
Clq-assayet ble utført ved bruk av den CD4-positive SupTl-18-cellelinje i en suspensjon av 4 x IO<6> pr. ml. CE9.1 og kontroll-affinitetsrenset ape-anti-CD4-antistoff (50 ni) i likeverdige konsentrasjoner på 20 \ ig/ ml ble tilsatt til 2 x IO<5> CD4-positive målceller. Cellesuspensjonen og antistoffene ble inkubert i 1 time på is og deretter vasket to ganger med 1% BSA
i PBS. 50 n1 humant Clq (10 \ ig/ io. l) ble tilsatt til hvert rør, og det hele ble inkubert i 1 time på is. Hvert rør ble vasket to ganger og deretter inkubert (1 time, på is, i mørke) med en 1:15-fortynning av kanin-anti-humant Clq-FITC (50 . Cellene ble vasket igjen to ganger og fiksert i 0,5 ml 1% formaldehyd/PBS. Cellene ble analysert på et Becton Dickinson FACScan strømningscytometer ved bruk av Consort 30-software for data-innhenting og -analyse.
Komplementmediert cytotoksisitetsassay
SupTl-18-celler (1 x IO<6>) ble merket ved å inkubere dem med 100 uCi <51>Cr i 1 time ved 37°C, 5% CO2. Cellene ble vasket to ganger med RPMI/5% FCS, og 1 x IO<4> celler ble tilsatt til hver brønn. CE9.1 og kontroll-anti-CD4-antistoffer ble serielt fortynnet 1:2 med RPMI/5% FCS og 50 nl-alikvoter tilsatt in triplo til de SUPTl-18-holdige brønner. 100 ni 1% Triton X-100 eller 100 ni medium ble tilsatt til brønnene for å måle den maksimale hhv. spontane frigivning av <51>Cr. Etter 90 minutters inkubasjon ved 37°C, 5% CO2, tilsatte man en 1:5-fortynning av kaninkomplement (Cappel) til brønnene. Platene ble inkubert i ytterligere 90 minutter ved 37°C, 5% CO2 og deretter sentrifugert i 3 minutter ved 900 rpm. Supernatanten fra hver brønn ble samlet, og mengden radioaktivitet ble bestemt på en gamma-teller. Assayet ble utført i tre eksemplarer. Prosentandelen celleoppløsning ble bestemt ifølge den følgende formel:
In vivo - undersøkelser på sjimpanser
Seks sjimpanser ble delt opp i tre grupper på hver to dyr: gruppe I (saltvann-kontrollgruppe); gruppe II (10,0 mg/kg CE9.1-antistoff) og gruppe III (10,0 mg/kg CE9.1-antistoff). Dyrene i gruppe II ble etter 30 dager igjen behandlet med 10 mg/kg CE9.1, forutsatt at deres CD4<+->T-celle-antall igjen var steget til 30% av grunnverdien. Dyrene i gruppe III ble etter 30 dager igjen behandlet med 10,0 mg/kg CE9.1, forutsatt at deres CD4<+->T-celle-antall igjen var steget til 70% av grunnverdien. Hvis disse verdier ikke var nådd på dag 30, ble dyrene testet for å bestemme deres CD3<+->, CD4<+-> og CD8<+->T-celleverdier i to ukers intervaller inntil CD4<+->T-celleverdien hadde nådd målverdien for gruppen. Ved dette tidspunkt fikk dyrene igjen 10,0 mg/kg CE9.1-antistoff intravenøst, inntil maksimalt tre doser.
Bestemmelsen av grunnverdien for det samlede antall hvite blodceller, lymfocytter og granulocytter og av CD3<+->, CD4<+-> og CD8<+->lymfocyttpopulasjoner ble utført på dag -6, på dag 0 umiddelbart før administrasjon av dosen og igjen 24 timer og 14 dager etter doseringen. Tre behandlingssykluser med doser på hver 10 mg/kg ble administrert til sjimpansene i løpet av denne undersøkelse.
Resultater
Bindingsspesifisitet av det monoklonale antistoff CE9 . 1
Affinitetsmålinger ifølge SPR for bindingen av CE9.1 til opp-løselig CD4 viser Kd-verdien 1,0 nM (Brigham-Burke et al., North American BIAsymposium 1995 (befinner seg i trykk)). Det ble ikke observert noen binding til CD4~-cellelinjer, og hem-mingsundersøkelsene viste at bindingen til CD4<+->celler kunne fjernes fullstendig med oppløselig CD4 på støkiometrisk måte.
For å bestemme spesifisiteten av CE9.1-reaktiviteten, bestemte man bindingen til nylig isolerte humane PBMCer ifølge en to-farges strømningscytometrisk analyse. Figur 9 viser at ca. 2/3 av CD3<+->cellene binder CE9.1. Innen den lymfoide subpopulasjon var alle celler som bandt OKT4, også positive for CE9.1, mens alle CD8<+->cellene var negative. Enkelte CD3-celler viste også en reaktivitet med CE9.1, men naturen av denne reaktivitet er ikke blitt klart bestemt.
En immunohistokjemisk analyse ble utført for å bestemme vevets reaktivitet med CE9.1, omfattende 32 forskjellige normale humane vev av lymfoid og ikke-lymfoid opprinnelse. De ikke-lymfoide vev omfattet hovedorganene hjerne, hjerte, skjelettmusk-ler, hud, lever, nyrer, kjertelvev og reproduktive vev. Denne analyse viste ingen kryssreaktivitet med annet vev enn de som hadde lymfoid opphav, bl.a. lymfeknuter, milt, mandler og perifert blod (data ikke vist). En farging, som begrenset seg til lymfoide aggregater, ble også observert i tykktarmen, lungen, spiserøret og huden.
Hemming av humant MLR med CE9 . 1
Virkningen av CE9.1 på T-celleresponsene ble bedømt med humant MLR, i form av IL-2-produksjon eller proliferative responser. CE9.1 blokkerte både proliferasjonen og IL-2-produksjonen med ICso-verdien 10-30 ng/ml, med en ca. 80% hemming ved 60 ng/ml (figur 10).
Fc - reseptorbindingsaktiviteten av CE9 . 1
CD4- og Fc-reseptor-baserte celle/celle-adhesjonsassayer ble utviklet for å bestemme reaktiviteten av CE9.1 med Fc-reseptorer på monocyttiske celler. I én assaykonfigurasjon ble monocytter isolert fra ferske PBMCer ved percoll-gradientsentri-fugering, plassert på mikroliterplater og stimulert med ylFN i 48 timer. Etter 48 timer ble fargeladede CD4<+->SupTl-celler tilsatt til de aktiverte klebrige monocytter i nærvær eller fravær av CE9.1. I en andre konfigurasjon av dette adhesjonsassay ble den monocyttiske ikke-klebrige cellelinje THP-1 stimulert med ylFN. Etter 24 timer ble de aktiverte THP-l-celler ladet med en merkefarge og tilsatt, i nærvær eller fravær av CE9.1, til klebrige CD4<+->fibroblasttransfektanter som på forhånd (24 timer tidligere) var blitt plassert på mikroliterplater. I begge tilfeller er celle/celle-adhesjonen avhengig av bindingen av mAb'et til CD4 på én celle og til Fc-reseptorer på den andre celle.
Dataen som presenteres på figurene 10a, 10b og 10c, og som grunner seg på ylFN-aktiverte ferske monocytter og CD4<+->SupTl-T-celler, viser at CE9.1 medierer en celle/celle-adhesjon på doseavhengig måte, med en EDso-verdi rundt 20 ng/ml. Adhesjonen ble fullstendig blokkert av sCD4, og kunne ikke medieres med F(ab')2-fragmentet av CE9.1. Monocytter som ikke var blitt aktivert med ylFN, kunne ikke binde CE9.1 9 (figur 10b). Lignende data ble også erholdt med assayet som grunnet seg på THP-1- og CD4<+->fibroblastassayet (data ikke vist). En direkte binding av CE9.1 til en murin fibroblastlinje som var blitt transfisert med humant FCyRII-reseptorer, ble også observert (data ikke vist).
Antistoff - avhengig cellemediert cytotoksisitet ( ADCC )
Radiomerkede SupTl-celler, som ble brukt som mål i et ADCC-assay, viste seg å oppløses spesifikt av effektorceller i nærvær av CE9.1. En maksimal cytotoksisitet ble nådd ved ca. 6 ng/ml med en samlet spesifikk oppløsning på ca. 50% (figur 12). Som positivkontroll brukte man et murint anti-CD4 med IgG2a-isotypen (4D9). Dette antistoff betedde seg på meget lik måte som CE9.1 idet det gav en lik mengde samlet celleoppløsning. CE9.1 var dermed meget virksomt idet det bandt Fc-reseptorene på ef-fektorcellene og medierte drepingen av CD4<+->målcellelinjer.
Komplementfiksering med CE9 . 1
Bindingen av Clq ble målt ved strømningscytometri som beskrevet ovenfor (materialer og metoder). Som vist på figur 13, viste CE9.1, til tross for at det inneholdt et humant tung kjede-konstant parti av gamma 1-subtypen, kun en minimal binding av Clq (figur 13). Affinitetsrenset ape-anti-CD4-seruman-tistoffer medierte virksomt en Clq-binding, hvilket tyder på at den manglende Clq-binding av CE9.1 er en egenskap som er egen for dette antistoff. Den manglende Clq-binding av CE9.1 gjenspeiles i dets manglende evne til å fiksere komplement (figur 14). Både affinitetsrensede anti-CD4-antistoffer fra apeserum og et murint monoklonalt IgG2a gir en signifikant oppløsning ved det samme konsentrasjonsområde.
CE9 . 1 - artkryssreaktivitet
En strømningscytometrisk analyse av lymfocytter fra forskjellige arter viste at kun sjimpanse- og humane celler bandt CE9.1 sterkt. Bavian var den eneste andre art som oppviste en svak reaktivitet med CE9.1 (10 ganger lavere enn for mennesker). Humane og sjimpanse-lymfocytter reagerte like godt med mAb'et (tabell 2). Dette gjenspeiles i deres sammenlignbare hemming av T-celleproliferasjonen og IL-2-produksjonen i sjimpanse-MLR med CE9.1-antistoffet (data ikke vist).
In vivo - undersøkelse på 6 sjimpanser
På grunnlag av den manglende utarming av CD4-celler i en un-dersøkelse med eskalerende doser på en sjimpanse, gav man en dose på 10 mg/kg til 4 sjimpanser (i tillegg fikk to kontroll-dyr saltvann). Som beskrevet i avsnittet "Materialer og metoder", fikk de to doseringsgrupper hver 10 mg/kg på dag 0 av undersøkelsen. Figur 15 oppsummerer virkningen på CD4- og CD8-antallet i disse dyr. Det er tydlig at det umiddelbart etter antistoffadministrasjonen fantes et nedsatt antall celler som uttrykte CD4-reseptor. Det nedsatte antall CD4-celler var kun observerbar umiddelbart etter hver antistoffdose. Man observerte ingen lignende endring av CD4-antallet i saltvann-kont-rollgruppen. CD8-antallet ble ikke påvirket av behandlingen, selv om man observerte en variasjon fra dag til dag (figur 15, venstre felt, åpne sirkler). Ved å undersøke CD3<+-> til CD8<+->po-pulasjonen, observerte man mindre dramatisk senkede CD4-antall. Dataene tyder på opptreden av CD3<+->CD8-T-cellepopulasjo-ner, som kan være et resultat av CD4-antigenmodulasjonen. Den nøyaktige mekanisme for modulasjonen er uklar på dette tidspunkt, men kan omfatte en internalisering eller utgyting av CD4-molekyler som et resultat av kryssbindingen med Fc-reseptorer som uttrykkes på andre lymfoide eller monocyttiske celler. En sammenligning av celleantallene på figur 15 viser at det kan finne sted en svak deplesjon av CD4<+->cellene, selv om hovedvirkningen skyldes en CD4-reseptormodulasjon. I de fleste tilfeller virker den modulatoriske effekt å vare i ca. 7-10 dager umiddelbart etter administrasjon av antistoffet, hvoretter CD4-ekspresjonen igjen stiger til rett under grunnlinje-verdien.
Det samlede CD4-antall forblir ca. 10-50% lavere enn grunnverdien, men etter avsluttet behandling stiger det igjen til det normale nivå. Sjimpansene ble oppfulgt i et tidsrom på 150 dager (gruppene 1 og 2) eller 300 dager (gruppe 3). CD4-antallet i dyrene fra gruppe 2 var igjen normalt 80 dager etter den siste behandling, mens dyrene fra gruppe 3 var tilbake ved en verdi innen 20% av grunnverdien etter det samme tidsrom.
EKSEMPEL 3
Dette eksempel beskriver den genetiske konstruksjon av DNA-ekspresjonsvektoren som brukes i pattedyrceller for å fremstille CE9y4PE, som er et javaape/humant chimeriske anti-CD4-antistoff som inneholder en human y4-isotype som innlemmer P-og E-endringene.
Konstruksjon av DNA - ekspresjonsvektoren
Humant gamma 4-tung kjede-gen ble isolert ved PCR fra cellelinjen TPIT10.4 (erholdt fra S. Morrison, UCLA) ved bruk av 5'-ende IDEC-primer nr. 479 og 3'-ende IDEC-primer nr. 462 (jfr. figur 16), som inneholdt Nhe I- hhv. BamH I-stillingen. Det fullstendige klonede fragment av humant gamma 4 er blitt sekvensiert, og man fant at det var identisk med hva som beskrives av Kabat et al. (NIH Publication Fifth Edition No. 91-3242, U.S. Dept. of Health and Human Services (1991)) (jfr. figur 17). Nhe I/BamH I-fragmentet ble klonet inn i ekspresjonsvektoren Anex 2. De fullstendige lett og tung kjede-immunoglobulin-gener fra dette plasmid ble flyttet til et annet ekspresjonsplasmid på et Bgl II-til-Sac I-fragment. Dette plasmid ble benevnt anti-CD4 (G4,L,0z-) i NE0SPLA3F.
PCR-mutagenese ble brukt for å endre aminosyrene nr. 22 9 og 236 i gamma 4-konstant parti. PCR ble utført ved bruk av 5'-primeren GE212 (Midland) og IDECs 3'-primer nr. 698, som inneholder Nhe I- hhv. BspH I-restriksjonsstillingene (jfr. figur 16), og fragmentet ble klonet inn i anti-CD4-plasmidet (G4,L,0z-) i en tre delers ligering, og sekvensplasmidet ble benevnt anti-CD4 (G4(PE),L,Oz-) i NE0SPLA3F.
EKSEMPEL 4
EKSPRESJON I OVARIECELLER FRA KINESISK HAMSTER (CHO-CELLER)
Integrasjon av plasmid og utsortering av antistoff - produse-rende kloner
CHO-celler (DG44) (Urlaub et al., Som. Cell Mol. Genet., 16: 555-566 (1986)) ble dyrket i CHO-S-SFM II-medium som inneholdt (GIBCO/BRL, CHO-medium) 50 nM Hypoksantin og 8 nM tymidin (GIBCO/BRL, CHO-medium). Dette medium benevnes CHO-medium plus
HT.
Fem elektroporeringer ble utført med 4 x IO<6> celler og 5 \ ig plasmid-DNA [Anti-CD4 (y4 (PE) , lambda, Oz-) i NEOSPLA3F] ved bruk av elektroporeringsanordningen BTX 600 (BTX, San Diego, CA, USA) i 0,4 ml engangs-skåler. Før elektroporeringen var plasmidet blitt begrenset med Pac I, som adskiller genene som uttrykkes i pattedyrceller, fra plasmidpartiet som brukes for å dyrke plasmidet i bakterier. Betingelsene for elektroporeringen var 230 volt, 400 mikrofaraday, 13 ohm. Hver elektropo-rering ble plassert i en enkelt 96-brønners skål (ca. 40.000 celler/brønn). Skålene ble fylt med CHO-medium + HT som inneholdt G418 (Geneticin, GIBCO) med 400 ng/ml aktiv forbindelse, to dager etter elektroporeringen, og deretter etter behov inntil det dannedes kolonier. Supernatanten fra sammenflytende kolonier ble testet for å bestemme om det forelå chimeriske immunoglobulin ifølge et ELISA som var spesifikt for humant antistoff. 28 G418-resistente kolonier dannedes på fem plater (av 480 brønner). Den G418-resistente koloni som uttrykte mest antistoff, nemlig klon 5C1, var sammenflytende 30 dager etter elektroporeringen. En "southern blot"-analyse viste at klonen 5C1 foreligger i en enkelt kopi-integrant (data ikke vist). I en fire dagers kultur som ble podet med IO<5> celler/ml i en 125 ml virvel, fordoblet seg denne klon ver 28. time, og hadde en antistoff-produksjonshastighet på 0,5 pg/celle/dag (0,9 mg/l).
Amplifikasj on
Klonen 5C1 ble oppskalert og plassert i forskjellige konsentrasjoner fra IO<6> celler/plate til 3 x 10<4> celler/plate på 96-brønners skåler som inneholdt CHO-medium + 5 nM metotreksat (MTX, Sigma (+) Amethopterin). 20 dager senere ble klonen 5C1-5B9 sammenløpende på platen med 3 x IO<5> celler/plate (49 av de 96 brønner vokste på denne plate). Denne klon ble oppskalert.
I en fire dagers kultur som ble podet med IO<5> celler/ml i en T150, fordoblet seg denne klon hver 35,5. time, og hadde en antistoff-produksjonshastighet på 15,3 pg/celle/dag (18 mg/l). Klonen 5C1-5B9 ble oppskalert og plassert på plater i forskjellige konsentrasjoner fra 100 celler/plate til 3 x 10<4> celler/plate, på 96-brønners skåler som inneholdt CHO-medium + 50 nM metotreksat. 36 dager senere ble klonen 5C1-5B9 50C1 ca. 60% sammenflytende på platen med IO<5> celler/plate (50 av de 96 brønner vokste på denne plate). Denne klon ble oppskalert.
Cellesamlinger for fase I - forråd av CE9 / 4PE - stam - podemateriale
(" parent seed stock ", PSS )
En 50 nM MTX PSS av klonen 5C1-5B9-50C1 ble frosset. Cellene ble dyrket i en 500 ml virvel som inneholdt CHO-medium plus 50 nM MTX. Ved tidspunktet for nedfrysingen, hadde kulturen nådd en tetthet på 1,1 x IO<6> celler/ml, med 96% levedyktighet og en fordoblingstid på 29,3 timer. Antistoffproduksjonen ble bestemt ifølge skikt-ELISA, og viste seg å være ca. 27 pg/celle/dag. Cellene ble sentrifugert ut av mediet og plassert i ampuller i tettheten 2,0 x IO<7> celler/ml i 95% føtalt bovint serum fra JRH Biosciences og 5% Sigma denne felles stamblanding, 1 ml frysemedium med celler ble ampullene frosset. Ampullene ble frosset ved -70°C, og den følgende dag ble de plassert i en beholder med flytende nitrogen.
En 50 nM MTX PSS-ampull ble tint og podet inn i en 100 ml virvel som inneholdt CHO-medium plus 50 nM MTX. Tre dager senere ble denne virvel delt opp i 2 x 125 ml virvler med 2 x IO<5> celler/ml; idet den ene virvel inneholdt CHO-medium plus 50 nM MTX og den andre kun inneholdt CHO-medium.
Tre dager senere ble 15 ml av cellene og mediet tatt fra vir-velen som inneholdt kun CHO-medium, frosset og sendt til Tektagen "for Points to Consider" mykoplasmatesting. Produksjons-forsøkene både med og uten MTX fortsatte i 8 uker. Resultatene fra Tektagen viste at anti-CD4 (gamma 4 (PE), lambda, Oz-) NEOSPLA3F i CHO; klon 5C1-5B9-50C1 stam-podematerialet var fritt for mykoplasma. 10 ampuller av 50 nM NM PSS ble overført til lagring i flytende nitrogen.
Stamcellesamling (" master cell bank ", MCB )
To 50 mM MTX PSS-ampuller med klonen 5C1-5B9-50C1 ble tint og podet inn i en 100 ml virvelkolbe som inneholdt CHO-medium plus 50 nM MTX. Kulturen ble ekspandert i 6 dager til et-terhvert større virvelkolber, inntil den nådde volumet 2000 ml, med tettheten 9,5 x IO<5> og en levedyktighet på 98%. Cellene ble sentrifugert ut av mediet og gjensuspendert i tettheten 2,0 x IO<7> celler/ml i 95% føtalt bovint serum fra JRH Biosciences og 5% Hybrimax DMSO fra Sigma. Cellesuspensjonen i frysemedium ble porsjonert (10 ml) i 80 kryoampuller som ble benevnt MCB G4PE50-M-A. Ampullene ble frosset ved -70°C. 24 timer senere ble cellesamlingen overført til lagring i flytende nitrogen .
EKSEMPEL 5
Stabilitet av CD4 - mAb ' ene
Den fysikalske og kjemiske stabilitet av CE9y4PE- og CE9y4E-oppløsningene overvåkes i 3 måneder ved 5°C, 40°C og ifølge lysspredningen ifølge SDS-PAGE (redusert og ikke-redusert), IEF, revers-fase-HPLC, størrelsesutelukkende kromatografi
(SEC) og ELISA. En første testing ved RP-HPLC og ikke-redusert SDS-PAGE tyder på at CE9y4E består av to hovedarter, nemlig det ikke-reduserte hele molekyl og et ikke-kovalent forbundet molekyl som under analysebetingelsene spaltes til to like enheter som benevnes "halvmerer". Det er interessant å notere seg at man ikke observerte noen større forskjeller i de bio-analy-tiske profiler av disse to mAb'er ifølge SEC, IEF, SDS-PAGE (redusert) og ELISA. Mengden "halvmer" i CE9y4PE er mindre enn 1% ifølge enten RP-HPLC eller SDS-PAGE (ikke-redusert). Figur 18 viser resultatene av SDS-PAGE (ikke-redusert) av monomeren og "halvmeren" i oppløsninger av CE9y4PE og CE9y4E. Mengden "halvmer" i CE9y4E forble konstant i forhold til den første testing, over de tre måneder, ved alle de testede betingelser. "Halvmer"-innholdet i CE9y4PE forble under 2% ved alle de tes-
tede tidspunkter og betingelser. Man observerte ingen større forskjeller i stabiliteten av CE9y4E og CE9y4PE ved 5°C og 40°C. CE9y4E-oppløsningen som lagres under spredt lys, er noe mindre stabil enn CE9y4PE. Dataene tyder på at "halvmeren" i CE9y4E ikke har noen betydelig virkning på helhetsstabiliteten av det fullstendige molekyl. Man observerte ingen større forskjeller i den fysikalske stabilitet av CE9y4PE- og CE9y4E-oppløsning-ene.
Affinitet og støkiometri av CD4 - mAb ' ene ifølge flateplasmonre - sonansen
Støkiometrien av bindingen av oppløselig CD4 til immobiliserte mAb'er kan bestemmes ifølge metningsbindingseksperimenter på BIAcore (Pharmacia). Dataen vedrørende assosiasjons- og disso-siasjonsfåsene av SPR-fremskridningen (figur 19) ble analysert direkte ved bruk av den integrerte form av hastighetsligning-ene som beskrives av 0'Shannessey et al., Anal. Biochem., 212: 467-468 (1993). En oppsummering av denne bindingsdata, uttrykt i mol CD4/mol mAb, er oppført i tabell 3. Fra denne data er det tydlig at bindingsstøkiometrien i hvert tilfelle er over 1,5:1. I og med at BIAcore er et fastfase-vekselspillsystem og at immobiliseringsprotokollen er vilkårlig, tyder disse resultater på at begge antigenbindingsstillingene i hvert mAb er funksjonelle. Dermed var støkiometrien av CD4-bindingen lik for alle mAb'er, og nær den teoretiske verdi 2,0. Videre viser affinitetsmålinger at affiniteten er like høy for alle mAb-kompleksene, nemlig ca. 1,0 nM.
EKSEMPEL 6
BIOLOGISK IN VITRO-BEDØMMELSE AV CE9y4PE
Sammenfatning
Aktiviteten som medieres av Fab-partiet (MLR) og Fc-domene (Fc-reseptorbindingen, ADCC og CDC), av CE9.1, CE9y4PE og de andre gamma 4-derivater ble sammenlignet. Den Fab-avhengige aktivitet (MLR) var lik for alle disse mAb'er, men deres Fc-reseptorbindingsegenskaper var forskjellige. Det umodifiserte gamma 4-derivat CE9y4 viste en overraskende sterk binding til Fc-reseptorene, men E-mutasjonen i CEy4E og CE9y4PE fjernet denne binding, liksom også ADCC-aktiviteten.
Virkning av mAb ' ene på blandede lymfocyttresponser ( MLR )
Et tre-veis blandet lymfocyttresponsassay (MLR-assay) ble ut-ført for å bestemme virkningen av mAb-konstruksjonene på den allo-antigendrevne T-celleproliferasjon og EL-2-produksjonen. MLR'ene er avhengig av at det foreligger CD4<+->T-celler, og en stor andel av responsen er avhengig av at CD4-reseptor deltar med sitt vekselspill med HMC klasse II-molekyler på antigenpresenterende celler. MLR-responsen er en in vitro-egenskap som korrelerer med enkelte aspekter av transplantatutstøtning in vivo. Med hensyn til andre farmakologiske midler, blokkeres MLR'er også av immunosuppressive midler, så som cyklosporin A.
Alle mAb-konstruksjonene var likeverdige i sin evne til å blokkere MLR, både med hensyn til den proliferative respons av T-cellene og IL-2-produksjonen (figur 20 og tabell 4). Dermed påvirket podingen av V-domene av CE9.1 på humane X4-strukturer, og "P- & E"-substitusjonene i hengsel- og CH2-domenene ikke evnen av mAb'ene til å blokkere den CD4-avhengige T-celle-respons in vitro.
Konklusj on
Alle mAb'er er likeverdige i sin hemming av MLR.
Fc - reseptorbindingsegenskapene av mAb ' ene: Validering av as - sayet for bestemmelse av Fc - reseptorbindingen
CE9y4PE ble utviklet for å mangle FcR-bindende aktivitet. For å måle denne aktivitet utviklet man et assay på grunnlag av den FcR- og CD4-medierte sammenklebing av celler ved brodannelse via mAb'ene. Dette assay måler CD4- og FcR-bindingsfunksjonene av mAb'ene samtidig, idet in vitro-resultatet korrelerer med den FcR- og mAb-medierte utarming av CD4-cellene in vivo.
Figur 21 viser at CE9.1 forenkler adhesjonen av FcR-uttryk-kende monocyttiske celler (IFN-y-induserte THP-l-celler) til
CD4<+->fibroblaster (CD4-transfisert fibroblastcellelinje) i et adhesjonsassay. Bindingen er avhengig av Fc-domene i mAb'et CE9.1, fordi den avkortede F(ab')2 ikke forenklet bindingen. Bindingen krevde også antigengjenkjenningsstillingen av CE9.1, fordi en plassering av sCD4 der blokkerer celle/celle-bindingen.
Bestemmelse av Fc - reseptorbindingsaktivitetene av mAb ' ene
mAb'ene CE9.1 (IgGl), CE9y4 (IgG4), CE9y4>.K (IgG4 XK-hybrid), CE9y4E (IgG4, E-mutant) og CE9y4PE (IgG4, PE-mutant) ble bedømt med hensyn til deres evne til å simultant binde celleflate-CD4 og FcR.
Liksom man også hadde håpet, hadde CE9.1 en god bindingsakti-vitet i dette assay. På overraskende måte beholdt IgG4-konstruksjonene CE9y4 og CE9y4XK en tilstrekkelig høy affinitet for FcR til at de i dette assay ikke skilte seg fra CE9.1. Aktiviteten i dette assay gikk kun tapt når "E"-substitusjonen ble innført, så som i CE9y4E og CE9y4PE (jfr. figur 22).
Clq - bindingsegenskapene av CE9y4PE in vitro
Komplementsystemet inneholder blant sine forskjellige funksjonelle komponenter også evnen til et vekselspill med visse ty-per antistoffer, på en måte som fører til celleoppløsning og -ødeleggelse. Humane IgGl-antistoffer har normalt evnen til å binde Clq og å utarme målceller som bærer flateantigener som de er spesifikke for. Andre humane isotyper, så som IgG4, oppviser en nedsatt evne til å binde Clq, og antas dermed å være ute av stand til å utarme målceller. Konstruksjonen av Ce9y4PE i en gamma 4-konstruksjon ville teoretisk sett oppnå målet at det forebygger komplementfikseringen og tillater at antistoffet bindes til CD4-målceller og dermed unngår potensielle ødeleggende bivirkninger.
En sammenligning av CDC-effektoregenskapene av CE9yPE og CE9.1 ble oppnådd ved bruk av den klassiske metode med komplementmediert cytolyse av krom-merket CD4<+->SupTl-celler i nærvær av kaninkomplement. I disse undersøkelser brukte man et murint komplementfikserende mAb mot HuCDA, nemlig 4D9 (IgG2a), som positivkontroll. Hverken CE9.1 og CE9y4PE kunne virksomt fiksere kaninkomplement (figur 23). Det ble bemerket tidligere at CE9.1 binder Clq kun svakt, og dermed ikke har evnen til å fiksere humant komplement. Disse resultater viser at ingen av disse to konstruksjoner har evnen til å fremme en celleoppløs-ning ved komplementeffektormekanismer.
ADCC - ef f ektoregenskapene av CE9 / 4PE in vitro
Celler med et cytotoksisk potensial som kan binde mAb'er via FcR, kan mediere ADCC som re rettet mot antistoff-belagte målceller. Humane T-hjelperceller som uttrykker CD4-molekylet, gjenkjennes av mAb'et CE9.1, som utløser et cytolytisk angrep av FcR-bærende dreperceller, granulocytter og/eller makrofa-ger. Man konstruerte CE9y4PE med det mål å fjerne mAb'ets evne til å bindes til FcR'er, hvorved man ville fjerne evnen av hjelperceller å mediere en utarming av CD4-målceller, mens mAb'et fortsatt kunne være immunosuppressivt.
En sammenligning av ADCC-effektoregenskapene av CE9y4PE og CE9.1 ble utført ved bruk av den klassiske metode med cellemediert cytolyse av krom-merkede CD4<+->SupTl-celler. Det murine CD4-mAb 4D9 (IgG2a,K) ble valgt som positivkontroll. Effektor-cellene var humane perifere blodleukocytter som ble erholdt fra en "buffy coat", figur 12 viser evnen av mAb'ene 4D9 og CE9.1 til å mediere en spesifikk oppløsning av CD4<+->celler. Under identiske betingelser hadde CE9y4PE en meget svak virkning.
Disse resultater viser at CE9y4PE ikke er istand til å mediere en oppløsning, hverken ved FcR- eller komplementmekanismer.
EKSEMPEL 7
SAMMENLIGNENDE PK-ANALYSE AV CE9y4E OG CE9y4PE
Den relative farmakokinetikk av to ledende X4-mAb'er, nemlig CE9y4E og CE9y4PE, ble undersøkt i hannlige Sprague-Dawley-rotter. CE9y4E eller CE9y4PE ble administrert i form av en intra-venøs bolusdose med 1 mg/kg (fire dyr pr. gruppe), og blodprø-ver ble tatt i 4 uker etter doseringen. CE9y4E- og CE9y4PE-kon-sentrasjonene i plasma ble bestemt ved et sCD4/anti-humant IgG-skiktvis ELISA-assay som ble utviklet for å bekrefte ikke bare nærværet av sirkulerende humant IgG, men også evnen til å binde rekombinant humant oppløselig CD4.
Etter en intravenøs bolusadministrasjon av 1 mg/kg CD4-mAb, sank plasmakonsentrasjonen av CE9yE i tre faser, og plasmakonsentrasjonen av CE9y4PE sank i to faser (figur 24). For sammenligning, og grunnet et utilstrekkelig antall datapunkter for på tilfredsstillende måte å definere den terminale fase av CE9y4E, ble alle plasmakonsentrasjons-tidsprofiler analysert ved bruk av en to-fases modell. Man observerte noe variabili-tet fra dyr til dyr. Den overveiende halveringstid ti/2 i den sekundære fase var ca. 4 dager for CE9y4E og 9 dager for CE9y4PE, og utgjorde 67% hhv. 93% av det samlede areal under plasmakonsentrasjons-tidskurven. Den tilsynelatende plasmaklaring for CE9y4PE var lav (6,4 ml/time/kg), og var ca. halvparten så stor som klaringen av CE9y4E (1,0 ml/time/kg). Dermed er de farmakokinetiske egenskaper av det PE-muterte y4-mAb CE9y4PE lignende som for andre humaniserte yl-mAb'er i rotter.
Den lange halveringstid for sirkulerende funksjonelt intakt CE9y4PE i rotten tyder også på at CE9y4PE sannsynligvis vil være virksom over et lengre tidsrom når det administreres til mennesker.
Disse resultater bekrefter at PE-mutanten CE9y4PE har en to ganger lavere plasmaklaring og en lengre halveringstid enn CE9yE-mutanten i rotte.
Forkortelse for farmakokinetiske parametre: CL = samlet plasmaklaring; AUCo-inf = samlet areal under plasmakonsentrasjon-vs.-tid-kurven; MRT = midlere oppholdstid; Ti/2<-1> = tilsynelatende halveringstid i primær fase; Ti/2~<2> = tilsynelatende halveringstid i sekundær fase; % AUC2 = prosentandel av arealet under plasmakonsentrasjon-vs.-tid-kurven under den sekundære fase; Vss = fordelingsvolum i stabil tilstand.
På grunnlag av disse resultater tror man at CE9yPE vil være egnet for terapeutisk bruk, f.eks. ved iv-administrasjon. Også andre administrasjonsruter kan være egnet.
EKSEMPEL 8
FARMAKOLOGISKE UNDERSØKELSER IN VIVO I HuCD4<+->TRANSGENE MUS
Beskrivelse av HuCD4- transgene mus
Innledning
Den høye grad av artspesifisitet av CE9.1 og CE9y4PE komplise-rer bedømmelsen av virkningen in vivo. For CE9.1 kunne man lett overvåke den farmakologiske respons i sjimpanser, ifølge en doseavhengig utarming av CD4<+->celler. Den forventende manglende slik aktivitet av CE9y4PE ansporet oss til å bruke en anne måte for å bedømme virkningen. Spesielt undersøkes virkningen i HuCD4-transgene mus. Undersøkelsene i dette system beskrives i det følgende.
HuCD4 +- transgene mus
I de HuCD4-transgene mus som ble utviklet av UCSF (Killeen et al., EMBO J., 12: 1547-1553 (1993)), ble det endogene MuCD4-gen sprengt ved en homolog rekombinasjon, og et humant CD4-mini-transgen ble innføyd under reguleringen av MuCD4-promoter. I disse mus, som nå er blitt krysningsavlet til homozygo-sitet, erstatter HuCD4 MuCD4. HuCD4 opprettholder positiv- og negativ-utvalget i thymus, hvilket fører til produksjonen av enkelte positive perifere CD4<+-> eller CD8<+->T-celler i mengder som kan sammenlignes med hva som forefinnes i normale mus. Sammenlignet med MuCD4-sprengningsopphavet, demonstrerer HuCD4-T-cellene egenskaper som ligner egenskapene av deres normale murine motparter: (1) serum-IgG-nivåene in vivo tilba-keføres til de normale verdier, og (2) disse dyr oppviser de riktige MHC-avhengige responser i in vitro-NMR.
Den genetiske bakgrunn av disse mus er noe komplisert grunnet behovet for å bruke forskjellige stammer av embryoniske stam-celler og mus i de opprinnelige sprengnings- og transgenisi-tetseksperimenter. De opprinnelige sprengning/transgene mus ble deretter avlet til hymozygositet i MHC-locus, og musene som brukes idag ved SB, er av H-2dd<->haplotypen.
Resultater har vist at man oppnår en god respons på det frem-mede antigen ovalbumin i disse HuCD4-mus, og første tester har vist en in vivo-aktivitet for CE9y4PE.
Forbedømmelse av CE9y4PE i HuCD4 - transgene mus
12 HuCD4-transgene mus (H-2<dd>) ble mottatt, og disse ble brukt for å sammenligne CE9y4PE med IF3 (murint anti-humant CD4) og GK1.5. Musene fikk doser på dag -2, -1 og dg 0 med 1 mg antistoff i.p., og ble immunisert med OVA 3 timer etter den siste dose. Musene ble avlivet 2 uker senere, og serumet og cellene ble bedømt med hensyn til deres funksjonelle aktivitet. Den OVA-spesifikke antistoffrespons vises på figur 25. Som forventet, hadde mAb'et mot muse-CD4 (GK1.5) ingen virkning på den humorale respons, mens begge mAb'er mot ffuCD4 blokkerte denne respons. CE9y4PE var den sterkere av de to mAb'er.
Alle gruppene av mus viste en respons på Con A og LS, men det forelå imidlertid noe forskjellige responser på ovalbumin og MLR. Dette kan skyldes at denne dyregruppe inneholdt mus av både hann- og hunnkjønn og av forskjellige aldere.
MuCD4 -/- (CD4-sprengt) mus og ffuCD4 +/+ (transgene mus) ble behandlet med CE9.1, CE9y4PE eller saltvann. Undersøkelsen ble utført i et tidsrom på 28 dager, idet man tok prøver på dagene 1, 3, 7, 14 og 28. Tre farge-strømningscytometriske analyser av splenocytter fra disse mus ble grukt for å følge med hva som skjedde med CD4<+-> og CD8<+->T-cellene. For å undersøke T-cel-leantallet brukte man de følgende antistoffer: CD3-PE, 0KT4-FITC, CD8-TC. For å bedømme hva som skjedde med T- og B-cellene i disse mus, brukte man de følgende antistoffer: CD3-PE, CD2-FITC, CD45-TC. For å følge med hva som skjedde med CE9.1- eller CE9y4PE-belagte celler, brukte man den følgende mAb-samling: 0KT4-PE, Leu3a-FITC, CD3-TC.
Dataene viste at både i CE9.1- og CE9y4PE-behandlede transgene mus ( HuCD4 + / + ), var alle CD4<+->celler belagt med antistoff på dag 1. Belegget holdt seg i noen få dager, og kunne ikke lenger påvises på dag 28. Det samlede antall CD4<+->celler som ble behandlet i CE9.1-behandlede mus, var betydelig nedsatt, selv på dag 28. Derimot viste CE9y4PE-behandlede mus intet nedsatt samlet CD4<+->celleantall. Begge antistoffer viste tegn på en CD4-reseptormodulasjon. Selv om det fant sted en resiprok økning i prosentandelen CD8<+->celler i de CE9.1-behandlede mus, fant man ingen tegn på at deres absolutte antall var blitt merkbart påvirket av behandlingen. CD8<+->celleantallet var på lignende måte påvirket i CE9y4PE-behandlede mus. I alle ekspe-rimenter, uansett med hvilket antistoff, hvar antallet B-celler konstant.
In vivo - undersøkelser på sjimpanser
Seks sjimpanser ble undersøkt for å bedømme deres utarming av CD4<+->T-celler og/eller modulasjon av CD4-reseptor fra celleflaten etter infusjoner av økende doser antistoff CE9y4PE, inntil 15 mg/kg. Perifere blodprøver ble tatt fra hver sjimpans tre uker og to uker før begynnelsen av undersøkelsen, for å bestemme grunnmengden CD4<+->T-celler. I tillegg til CD4<+->cellene, bestemte man også antallet CD3<+-> og CD8<+->celler ved strømning-scytometri. mAb'et 0KT4, som bindes til en annen del av CD4-molekylet, og som ikke konkurrerer med CE9y4PE om bindingen, ble brukt som kontroll. Ved å subtrahere antallet CD8<+->celler fra det samlede antall CD3<+->celler, kunne man beregne en teoretisk verdi for antallet CD4<+->T-celler. Ved å sammenligne denne verdi med CD4°-cellene som ble målt ved bruk av 0KT4, kunne man skjelne mellom en CD4-reseptormodulasjon og en CD4<+->celleutarming.
I begynnelsen av undersøkelsen fikk hver sjimpanse en i.v.-infusjon av saltvann. Blodprøver ble tatt umiddelbart etter in-fusjonen og 3 og 14 dager senere. CE9y4PE (0,05 mg/kg) ble inn-ført i hver sjimpanse ved infusjon, og blodprøver ble tatt 3 og 14 dager senere CD4<+->cellene ble overvåket, og hvis deres antall lå innen det normale område, gav man den nest-høyere dose CE9y4PE. Tilsammen fikk hver sjimpanse den følgende dose-protokoll: saltvann, 0,05 mg/kg CE9y4PE, 1,5 mg/kg CE9y4PE, saltvann, 15 mg/kg CE9y4PE.
Man observerte ingen virkning på CD4-antallet etter infusjon av saltvann eller CE9y4PE i mengden 0,05 mg/kg. Med 1,5 mg/kg observerte man et CD4<+->cellebelegg og en forbigående og delvis modulasjon av CD4-reseptorer fra celleflaten, men derimot ingen CD4<+->celleutarming. Med 15 mg/ml CE9y4PE observerte man ingen CD4<+->celleutarming i noen av dyrene, men derimot observerte man en betydelig modulasjon i alle dyrene. Den modulatoriske virkning var forbigående, og verdien var tilbake ved grunnverdien etter 14-21 dager. Man observerte ingen ugunstige virkninger i noe dyr. CE9y4PE kunne påvises på celleflaten inntil 2 dager etter administrasjonen og i serumet.
CE9y4PE ble utviklet for å være et ikke-utarmende antistoff, og man observerte ingen utarming i noe dyr, selv ved den relativt høye dose på 15 mg/kg. CE9y4PE var stabilt i seraene av sjimpansene, og fortsatte å sirkulere i inntil 21 dager.
Bruk
Antistoffer som er blitt fremstilt på den ovenfor beskrevne måte, eller ved likeverdige teknikker, kan renses ved en kombinasjon av affinitets- og størrelsesutelukkende kromatografi for en videre karakterisering i funksjonelle biologiske assayer. Disse assayer omfatter bestemmelse av spesifisiteten og bindingsaffiniteten samt effektorfunksjonen forbundet med den uttrykte isotype, f.eks. ADCC, eller komplementfiksering. Slike antistoffer kan brukes som passive eller aktive terapeutiske midler mot et antall humane sykdommer som omfatter CD4-ekspresjon og T-celler, bl.a. B-cellelymfoma, smittelige sykdommer så som AIDS, autoimmune og inflammatoriske sykdommer og transplantasjon. Antistoffene kan brukes enten i sin native form, eller som en del av et antistoff/chelat-, antistoff/legemiddel- eller antistoff/toksin-kompleks. I tillegg kan hele antistoffer eller antistoffragmenter (Fab2, Fab, Fv) brukes som avbildningsreagensmidler eller som potensielle vak-siner eller immunogener innen en aktiv immunoterapi for å ge-nerere anti-idiotypiske responser.
Mengden antistoff som er nyttig for å fremkalle en terapeutisk virkning, kan bestemmes ved standardteknikker som er velkjent for fagmannen. Antistoffene vil generelt frembringes ved en standardteknikk, i en farmasøytisk akseptabel buffer, og kan administreres ved hvilken som helst ønsket rute. Grunnet effekten av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse og den gode tolerans derav hos mennesker, er det mulig å administrere disse antistoffer gjentatte ganger for å bekjempe forskjellige sykdommer eller sykdomstilstander i et menneske.
De rekombinante anti-CD4-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse er også nyttige ved induksjon av immunomodulasjon, f.eks. induksjon av suppresjon av et menneskes eller dyrs immunsystem. Denne oppfinnelse vedrører derfor en fremgangsmåte ved profylaktisk eller terapeutisk induksjon av immunomodulasjon i et menneske eller annet dyr som er i behov derav, ved å administrere en virksom, ikke-toksisk mengde av et slikt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelsen til et slikt menneske eller annet dyr.
Evnen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen til å indusere im-munmodulasjon, kan demonstreres i standardtester som brukes med dette formål, f.eks. en blandet lymfocytt-reaksjonstest eller en test som måler hemmingen av T-celleproliferasjonen, målt ifølge tymidinopptaket.
Det faktum at antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige ved induksjon av immunosuppresjon, betyr at de er nyttige ved behandling eller forebyggelse av resistens mot eller utstøtning av transplanterte organer eller vev (f.eks. nyre, hjerte, lunge, benmarg, hud, cornea osv.); behandling eller forebyggelse av autoimmune, inflammatoriske, proliferative og hyperproliferative sykdommer, og av kutane manifestasjoner av immunologisk medierte sykdommer (f.eks. rheumatoid artritt, lupus erythematosus, systemisk lupus erythematosus, Hashimotos struma, multippel sklerose, myasthenia gravis, diabetes type 1, uveitis, nefrotisk syndrom, psoriasis, atopisk dermatitt, kontaktdermatitt og andre eksematøse dermatitter, seboréisk dermatitt, lichen planus, pemfigus, bulløs pemfigus, epidermolysis bullosa, urticaria, angioødem, vaskulitt, erythema, kutan eosinofili, alopecia areata osv.); behandling av reversibel obstruktiv luftveisykdom, tarmbetennelser og allergier (f.eks. cøliaki, proktitt, eosinofil gastroenteritt, mastocy-tosis, Crohns sykdom og ulcerøs kolitt) og matforbundne allergier (f.eks. migrene, rhinitt og eksem). Antistoffene ifølge oppfinnelsen har også en potensiell nytte ved behandling av ikke-autoimmune sykdommer hvor det er ønskelig med en immunomodulasjon, f.eks. "graft-vs.-host-disease" (GVHD), transplan-tatutstøtning, asthma, HIV, leukemi, lymfom o.l.
En fagmann vil ved rutinemessig eksperimentering kunne bestemme hvor høy en virksom, ikke-toksisk mengde antistoff vil være for å indusere immunosuppresjon. Generelt vil en virksom dosering imidlertid være i området 0,05-100 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag.
Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse forventes også å være nyttige ved behandling av svulster i pattedyr. Nærmere bestemt forventes det at de vil være nyttige ved å redusere svulststørrelsen, hemme svulstveksten og/eller forlenge over-levelses tiden av svulstbærende dyr. En fagmann vil ved rutine-eksperimentering kunne bestemme hvor høy en virksom, ikke-toksisk mengde antistoff vil være for behandling av karsinogene svulster. Generelt vil en virksom dosering imidlertid være i området 0,05-100 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag.
Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan administreres til et menneske eller annet dyr ifølge de ovennevnte behandlingsfrem-gangsmåter, i en mengde som er tilstrekkelig høy for å fremkalle en slik virkning i terapeutisk eller profylaktisk grad. Slike antistoffer ifølge oppfinnelsen kan administreres til et slikt menneske eller annet dyr i en konvensjonell doserings-form som fremstilles ved å kombinere antistoffet ifølge oppfinnelsen med et konvensjonelt farmasøytisk akseptabelt bærerstoff eller fortynningsmiddel ifølge kjente teknikker. En fagmann vil kunne forstå at formen og egenskapene av det farma-søytisk akseptable bærerstoff eller fortynningsmiddel bestemmes av mengden aktiv ingrediens som det skal kombineres med, administrasjonsruten og andre velkjente variabler.
Administrasjonsruten for antistoffet (eller et fragment derav) ifølge oppfinnelsen kan være oral, parenteral, ved inhalasjon eller topisk. Anvendt heri, omfatter begrepet parenteral en intravenøs, intramuskulær, subkutan, rektal, vaginal eller intraperitoneal administrasjon. De subkutane og intramuskulære former for parenteral administrasjon foretrekkes generelt.
De daglige parenterale og orale doseringsområder for bruk av forbindelsene for en profylaktisk eller terapeutisk induksjon av immunosuppresjon, eller for å terapeutisk behandle karsinogene svulster, vil generelt være innen området 0,05-100, fortrinnsvis 0,5-10 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag.
Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan også administreres ved inhalasjon. Med "inhalasjon" menes intranasal og oral inhalasjonsadministrasjon. Egnede doseringsformer for en slik administrasjon, så som en aerosolformulering eller en inhalator med oppmålt dose, kan fremstilles ved konvensjonelle teknikker. Den foretrukne doseringsmengde for en forbindelse ifølge oppfinnelsen som skal brukes, er generelt innen området 10-100 mg.
Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan også administreres topisk. Med topisk administrasjon menes en ikke-systemisk administrasjon, og dette omfatter påføringen av en antistofforbindelse eksternt på epidermis, i kinnhulen eller innføring av et slikt antistoff i øret, øyet og nesen, og hvor det ikke i betydelig grad opptas av blodstrømmen. Med en systemisk administrasjon menes oral, intravenøs, intraperitoneal og intramuskulær administrasjon. Mengden antistoff som er nødvendig for en terapeutisk eller profylaktisk virkning, vil så klart variere ifølge det valgte antistoff, naturen og alvoret av tilstanden som skal behandles, og dyret som behandles, og den endelige avgjø-relse treffes av den behandlende lege. En egnet dose av et antistoff ifølge oppfinnelsen vil generelt ligge innen området 1-100 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag.
Formuleringer
Mens det er mulig å administrere et antistoff eller et fragment derav for seg selv, foretrekkes det å levere det i form av en farmasøytisk formulering. Den aktive ingrediens kan for topisk administrasjon utgjøre 0,001 vekt% til 10 vekt%, f.eks. 1-2 vekt% av formuleringen, men kan utgjøre inntil 10 vekt%, men fortrinnsvis ikke over 5 vekt%, og mer foretrukket fra 0,1 vekt% til 1 vekt% av formuleringen.
De topiske formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en aktiv ingrediens sammen med et eller flere bærerstoffer for den aktive ingrediens, og valgfritt også andre terapeutiske ingredienser. Bærerstoffet/bærerstoffene må være akseptable i den forstand at de er kompatible med de andre ingredienser i formuleringen, og at de ikke er skadelige for mottakeren.
Formuleringer som er egnet for en topisk administrasjon, omfatter flytende eller halvfaste preparater som er egnet for en penetrasjon gjennom huden til det sted hvor det er nødvendig med en behandling, så som linimenter, losjoner, kremer, salver eller pastaer, og dråper som er egnet for administrasjon til øyet, øret eller nesen.
Dråpene ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte sterile vandige eller oljeaktige oppløsninger eller suspensjoner, og kan fremstilles ved å oppløse den aktive ingrediens i en egnet vandig oppløsning av et bakteriedrepende og/eller soppdrepende middel og/eller et annet egnet konserveringsmiddel, og fortrinnsvis omfattende et overflateaktivt middel. Den erholdte oppløsning kan deretter klarnes ved filtrering, overføres til en egnet beholder som deretter forsegles og steriliseres ved behandling i autoklav, eller ved å holde den ved 90-100°C i en halv time. Alternativt kan oppløsningen steriliseres ved filtrering og overføres til beholderen ved en aseptisk teknikk. Eksempler på bakteriedrepende og soppdrepende midler som er egnet for å innlemmes i dråpene, er fenylkvikksølvnitrat eller -acetat (0,002%), benzalkoniumklorid (0,01%) og klorheksidina-cetat (0,01%). Egnede oppløsningsmidler for fremstilling av en oljebasert oppløsning omfatter glyserol, fortynnet alkohol og propylenglykol.
Losjonene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter slike som er egnet for påføring på huden eller øyet. En øyelosjon kan omfatte en steril vandig oppløsning som valgfritt kan inneholde et bakteriedrepende middel, og kan fremstilles ved fremgangsmåter som ligner fremgangsmåtene ved fremstilling av dråper. Losjoner eller linimenter for påføring på huden kan også omfatte et middel som fremskynder tørkingen og avkjøler huden, så som en alkohol eller aceton, og/eller et fuktemiddel så som glyserol, eller en olje, så som ricinusolje eller arachinolje.
Kremen, salvene eller pastaene ifølge foreliggende oppfinnelse er halvfaste formuleringer av den aktive ingrediens for en ut-vortes påføring. De kan fremstilles ved å blande den aktive ingrediens i finoppdelt eller pulverisert form, for seg selv eller i oppløsning eller suspensjon i et vandig eller ikke-vandig fluidum, med hjelp av egnet utstyr, med en fet eller ikke-fet basis. Basisen kan omfatte hydrokarboner, så som hardt, bløtt eller flytende parafin, glyserol, bivoks, en me-tallisk såpe; et slim; en olje av naturlig opprinnelse, så som mandelolje, kornolje, arachinolje, ricinusolje eller oliven-olje; ullfett eller dens derivater, eller en fettsyre, så som stearin- eller oleinsyre, sammen med en alkohol, så som propylenglykol eller makrogoler. Formuleringen kan innlemme hvilket som helst egnet overflateaktivt middel, så som et anionisk, kationisk eller ikke-ionisk flateaktivt middel, så som sorbi-tanestere eller polyoksyetylenderivater derav. Suspensjonsmid-ler så som naturlige gummier, cellulosederivater eller uorga-niske materialer, så som silisiumholdige silikamaterialer, og andre ingredienser, så som lanolin, kan også innlemmes.
En fagmann vil forstå at den optimale mengde og tidsrommet mellom de enkelte doseringer av et antistoff ifølge oppfinnelsen vil være avhengig av naturen og utstrekningen av tilstanden som skal behandles, formen, ruten og stedet for administrasjonen, og det bestemte dyr som skal behandles, og at slike optima kan bestemmes ved konvensjonelle teknikker. Det vil også forstås av en fagmann at det optimale behandlingsløp, f.eks. antallet doser av et antistoff ifølge oppfinnelsen som skal gis i løpet av en dag i et bestemt antall dager, kan bestemmes av en fagmann ved konvensjonelle tester for bestemmelse av behandlingsforløpet.
Uten noen ytterligere nærmere forklaring, antas det at en fagmann ved hjelp av den forutgående beskrivelse, vil kunne ut-nytte foreliggende oppfinnelse i fullstendig grad.
Kapsel sammensetning
En farmasøytisk blanding ifølge foreliggende oppfinnelse i form av en kapsel fremstilles ved å fylle en standard todelt hårdgelatinkapsel med 50 mg antistoff ifølge oppfinnelsen, i pulverisert form, 100 mg laktose, 32 mg talkum og 8 mg magne-siumstearat.
Injiserbar parenteral blanding
En farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen i en form som er egnet for administrasjon ved injeksjon, fremstilles ved å om-røre 1,5 vekt% antistoff ifølge oppfinnelsen i 10 vol% propylenglykol og vann. Oppløsningen steriliseres ved filtrering.
Salveformulering
Antistoffet ifølge oppfinnelsen dispergeres i et lite volum av vehiklet for å fremstille et glatt, homogent produkt. Metall-tuber fylles deretter med dispersjonen.
Topisk krem - sammensetning
"Polawax", bivoksen og lanolinet blandes sammen ved 60°C. En oppløsning av metylhydroksybenzoat tilsettes, og en homogeni-sering oppnås ved høyhastighets omrøring. Temperaturen får synke til 50°C. Antistoffet ifølge oppfinnelsen tilsettes deretter og dispergeres gjennom det hele, og blandingen for kjø-les ved lavhastighets omrøring. Topisk losjon - sammensetning
Metylhydroksybenzoat og glycerin oppløses i 70 ml vann ved 75°C. Sorbitanmonolaurat, polysorbat 20 og cetostearylalkohol blandes sammen ved 75°C og tilsettes til den vandige oppløs-ning. Den erholdte emulsjon homogeniseres og får avkjøles under fortsatt omrøring, og antistoffet ifølge oppfinnelsen tilsettes i form av en suspensjon i resten av vannet. Hele sus-pensjonen omrøres inntil den er homogen.
Øyedråpe - sammensetning
Metyl- og propylhydroksybenzoatene oppløses i 70 ml renset vann ved 75°C, og den erholdte oppløsning får avkjøles. Antistoffet ifølge oppfinnelsen tilsettes deretter, og oppløs-ningen steriliseres ved filtrering gjennom et membranfilter (0,022 nm porestørrelse), og pakkes aseptisk på egnede sterile beholdere.
Blanding for administrasjon ved inhalasjon
For en aerosolbeholder med et fyllvolum på 15-20 ml: bland 10 mg antistoff ifølge oppfinnelsen med 0,2-0,5% smøremiddel, så som polysorbat 85 eller oleinsyre, og disperger denne blanding i et drivstoff, så som freon, fortrinnsvis i kombinasjon med (1,2-diklortetrafluoretan) og difluorklormetan, og plasser det hele i en egnet aerosolbeholder som er tilpasset enten en intranasal eller oral inhalasjonsadministrasjon.
Blanding for administrasjon ved inhalasjon:
for en aerosolbeholder med et fyllvolum på 15-20 ml: oppløs 10 mg av et antistoff ifølge oppfinnelsen i etanol (6-8 ml), til-sett 0,1-0,2% smøremiddel, så som polysorbat 85 eller oleinsyre; og disperger det hele i et drivstoff, så som freon, fortrinnsvis i kombinasjon med (1,2-diklortetrafluoretan) og difluorklormetan, og plasser det hele i en egnet aerosolbeholder som er tilpasset enten en intranasal eller oral inhala-sj onsadministrasj on.
Antistoffene og de farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttige for en parenteral administrasjon, dvs. subkutant, intramuskulært eller intravenøst. Blandingene for en parenteral administrasjon vil vanligvis omfatte en oppløs-ning av et antistoff ifølge oppfinnelsen eller en blanding derav, oppløst i et egnet bærerstoff, fortrinnsvis et vandig bærerstoff. Forskjellige vandige bærerstoffer kan anvendes, f.eks. vann, bufret vann, 0,4% saltvann, 0,3% glycin og lignende. Disse blandinger er sterile og generelt frie for par-tikkelformet materiale. Disse oppløsninger kan steriliseres ved konvensjonelle, velkjente sterilisasjonsteknikker. Blandingene kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpestoffer, etter behov for å tilpasse dem de fysiologiske betingelser, så som pH-justerende og bufrende midler osv. Konsentrasjonen av antistoffet ifølge oppfinnelsen i en slik farmasøytisk formulering kan variere innen vide grenser, dvs. fra mindre enn ca.
0,5 vekt%, vanligvis minst 1 vekt%, opptil 15-20 vekt%, og vil velges primært på grunnlag av væskevolumene, viskositetene osv., ifølge den bestemte valgte administrasjonsmåte.
Dermed kan en farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen for intramuskulær administrasjon fremstilles således at den inneholder 1 ml sterilt bufret vann, og 50 mg antistoff ifølge oppfinnelsen. På lignende måte kan man fremstille en farmasøy-tisk blanding ifølge oppfinnelsen for intravenøs administrasjon således at den inneholder 250 ml steril Ringers oppløs-ning og 150 mg antistoff ifølge oppfinnelsen. De faktiske fremgangsmåter for fremstilling av parenteralt administrerbare blandinger er velkjent eller vil være åpenbare for fagmannen, og beskrives i større detalj i f.eks. Remington' s Pharmaceuti-cal Science, 15. utg., Mack Publishing Company, Easton, Penn-sylvania .
Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan frysetørkes for lagring og rekondisjoneres i et egnet bærerstoff før bruk. Denne teknikk har vist seg å være virksom med konvensjonelle immunoglobuliner, og man kan benytte seg av frysetørkings- og rekon-dis j oneringsteknikker som er kjent innen faget.
Avhengig av det ønskede resultat, kan den farmasøytiske blanding ifølge oppfinnelsen administreres for en profylaktisk og/eller terapeutisk behandling. Ved terapeutisk bruk administreres blandingene til en pasient som allerede lider av en sykdom, i en mengde som er tilstrekkelig for å helbrede eller i det minste delvis stanse sykdommen og dens komplikasjoner. Ved profylaktisk bruk administreres blandinger som inneholder forliggende antistoffer eller en blanding derav til en pasient som ikke allerede lider av sykdomstilstanden, for å forbedre pasientens motstand.
Enkle eller gjentatte administrasjoner av de farmasøytiske blandinger kan utføres idet doseringsmengden og -mønstret fastlegges av den behandlende lege. I hvert tilfelle bør den farmasøytiske blanding ifølge oppfinnelsen levere et tilstrekkelig antall endrede antistoffer ifølge oppfinnelsen for å virksomt behandle pasienten.
Det bør også bemerkes at antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes for utvikling og syntese av enten peptidforbindelser eller ikke-peptidforbindelser (mimetika), som ville være nyttige innen den samme terapi som antistoffet. Jfr. f.eks. Saragovi et al., Science 253: 792-795 (1991).
Deponering
Stammen "XLI Blue", Anti-CD4 i TCAE6 som uttrykker CE9.1, er blitt deponert hos ATCC, og fikk tildelt numret 69030. Denne deponering ble foretatt dem 9. juli 1992.
Claims (8)
1. Chimerisk anti-CD4-antistoff valgt fra gruppen bestående av: CE9y4 som har gamma 4 tungkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 7 og lambda lettkjede-polypeptidesekvensen vist i SEQ ID NO: 5; CE9y4E som har gamma 4(E) tungkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 9 og lambda lettkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 5; CE9y4PE som har gamma gamma 4 (PE) tungkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 11 og lambda lettkjede-poly-peptidesevensen vist i SEQ ID NO: 5; og CE9y4Ak som har gamma 4 tungkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 7 og en lett kjede som har det variable område polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 5 og en konstantområde-polypeptidsekvens av en human kappa lettkjede; og CE9y4kX som har gamma 4 tungkjede-polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 7 og en lett kjede som har det det variable område polypeptidsekvensen vist i SEQ ID NO: 5 og en konstantområde-polypeptidesekvens av en human lambda lett-kj ede.
2. Rekombinant DNA som koder for et chimerisk antistoff ifølge krav 1.
3. Rekombinant DNA ifølge krav 2 som fremskaffer ekspresjon av det chimeriske antistoff.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av et chimerisk antistoff som er spesifikt for CD4 omfattende å uttrykke det rekombinante DNA ifølge krav 2 eller krav 3 i en rekombinant vertscelle.
5. Farmasøytisk sammensetning omfattende det chimeriske antistoff ifølge krav 1 for anvendelse som et medikament.
6. Anvendelse av et chimerisk antistoff ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament omfattende en terapeutiske eller profylaktisk effektiv mengde av det chimeriske antistoff for å behandle eller forebygge en CD4+ T-celle-rela-tert autoimmun eller kronisk inflammatorisk sykdom.
7. Anvendelse av et chimerisk antistoff ifølge krav 6 for fremstilling av et medikament omfattende en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde det chimeriske antistoff for å behandle eller forebygge en sykdom valgt fra gruppen bestående av rheumatoid artritt, psoriasis, insulin-avhengig diabetes mellitus, systemisk lupus erythematosus, chirrose, multippel sklerose, Hashimotos thyroiditis, primært myxødem, thyrotoksicosis/Graves sykdom, perniciøs anemi, autoimmun atrofisk gastritt, autoimmun carditis, Addisons sykdom, prematur menopause, Goodpastures syndrom, myasthenia gravis, mannlig infertilitet, pemphigus vulgaris, pemphigoid, sympatetisk oftalima, fakogen uveitis, nefrotisk syndrom, atopisk dermatitt, kontakt-dermatitt, seborr-heisk dermatitt, eksematøs dermatitt, fotsopp, pemphigus, bulløs pemphigus, epidermolysis bullosa, utrikaria, angi-ødem, vaskulitides, erythema, kutan eosinofilia, Alopecia areata, reversible obstruktiv luftveissykdom, migrene, eksem, rhinitt som er forskjellig fra allergiske tilstander, autoimmun hemolytisk anemi, idiopatisk trombocytopenisk purpura, idiopatisk leukopenia, primær biliær chirrose, aktiv kronisk hepatitt (HBs Ag-negativ), kryptogen chirrose, Sjogrens syndrom, dermatomyositis, skleroderma, blandet bindevevssykdom, diskoid lupus erythematosus og systemisk vaskulitt samt sykdommer assosiert med tarminflammasjon innbefattende inflammatorisk tarmsykdomsyndrom, cøliaki, procitis, eosinofilisk gastroenteritt, mastocytose, Chrons sykdom og ulcerativ kolitt.
8. Anvendelse av et chimerisk antistoff ifølge krav 6 for fremstilling av et medikament omfattende en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av det chimeriske antistoff for å behandle eller forebygge en ikke-autoimmun sykdom valgt fra leukemi, lymfom, transplantat-mot-verts-sykdom, astma, transplantat-avstøtning og HIV-infeksjon.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/523,894 US6136310A (en) | 1991-07-25 | 1995-09-06 | Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy |
PCT/US1996/014324 WO1997009351A1 (en) | 1995-09-06 | 1996-09-05 | Recombinant anti-cd4 antibodies for human therapy |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO980915D0 NO980915D0 (no) | 1998-03-03 |
NO980915L NO980915L (no) | 1998-05-06 |
NO324497B1 true NO324497B1 (no) | 2007-10-29 |
Family
ID=24086874
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19980915A NO324497B1 (no) | 1995-09-06 | 1998-03-03 | Chimerisk anti-CD4-antistoff, fremgangsmate for fremstilling derav, DNA-kodende for et slikt antistoff samt anvendelse derav for fremstilling av et medikament til behandling av en ikke-autoimmun sykdom. |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6136310A (no) |
EP (1) | EP0854885B1 (no) |
JP (1) | JP3619866B2 (no) |
KR (1) | KR100491222B1 (no) |
CN (1) | CN100391978C (no) |
AP (1) | AP1193A (no) |
AT (1) | ATE348113T1 (no) |
AU (1) | AU717674B2 (no) |
BG (1) | BG64651B1 (no) |
BR (1) | BR9610404A (no) |
CA (1) | CA2231182A1 (no) |
CZ (1) | CZ291036B6 (no) |
DE (1) | DE69636760T2 (no) |
HK (1) | HK1016995A1 (no) |
HU (1) | HU221351B1 (no) |
IL (1) | IL123447A0 (no) |
MX (1) | MX9801732A (no) |
NO (1) | NO324497B1 (no) |
NZ (1) | NZ316835A (no) |
OA (1) | OA10671A (no) |
RO (1) | RO120198B1 (no) |
RU (1) | RU2232773C2 (no) |
SK (1) | SK27998A3 (no) |
WO (1) | WO1997009351A1 (no) |
Families Citing this family (145)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6136310A (en) * | 1991-07-25 | 2000-10-24 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy |
US6440418B1 (en) * | 1995-11-07 | 2002-08-27 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies |
JP2000516594A (ja) * | 1996-07-26 | 2000-12-12 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | 免疫細胞介在全身性疾患の改良された治療法 |
GB9624038D0 (en) * | 1996-11-19 | 1997-01-08 | Sandoz Ltd | Organic compounds |
US7033589B1 (en) | 1997-02-20 | 2006-04-25 | Biogen Idec Ma Inc. | γ-1 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics |
US6893636B2 (en) * | 1997-02-20 | 2005-05-17 | Biogen Idec Ma Inc. | Gamma-1 and gamma-3 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics |
WO1998058966A1 (en) * | 1997-06-24 | 1998-12-30 | Norman Godin | A composition for specific immunoprotection and method for obtaining said composition |
US7189400B2 (en) | 1998-03-17 | 2007-03-13 | Genetics Institute, Llc | Methods of treatment with antagonists of MU-1 |
US7198789B2 (en) * | 1998-03-17 | 2007-04-03 | Genetics Institute, Llc | Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity |
US6057128A (en) | 1998-03-17 | 2000-05-02 | Genetics Institute, Inc. | MU-1, member of the cytokine receptor family |
US6528624B1 (en) | 1998-04-02 | 2003-03-04 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
PL209786B1 (pl) * | 1999-01-15 | 2011-10-31 | Genentech Inc | Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna |
US6737056B1 (en) * | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US7183387B1 (en) | 1999-01-15 | 2007-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US20020028178A1 (en) * | 2000-07-12 | 2002-03-07 | Nabil Hanna | Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications |
WO2001068133A1 (en) * | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Genetics Institute, Inc. | Use of rapamycin and agents that inhibit b7 activity in immunomodulation |
US20030012781A1 (en) * | 2000-06-06 | 2003-01-16 | Anderson Darrell | Non-agonistic antibodies to human gp39, compositions containing, and therapeutic use thereof |
US20070065436A1 (en) * | 2001-01-31 | 2007-03-22 | Biogen Idec Inc. | Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies |
US20020159996A1 (en) * | 2001-01-31 | 2002-10-31 | Kandasamy Hariharan | Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders |
US20030211107A1 (en) * | 2002-01-31 | 2003-11-13 | Kandasamy Hariharan | Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders |
US20030103971A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-06-05 | Kandasamy Hariharan | Immunoregulatory antibodies and uses thereof |
AR035779A1 (es) * | 2001-02-06 | 2004-07-14 | Genetics Inst Llc | Polipeptidos de fusion derivados de glicoproteina ib alfa de plaqueta y metodos de uso de los mismos |
US6972324B2 (en) | 2001-05-18 | 2005-12-06 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies specific for CD44v6 |
GB2376466A (en) * | 2001-06-14 | 2002-12-18 | Mark Frewin | TRX1 antibody |
US7541443B2 (en) * | 2001-06-14 | 2009-06-02 | Tolerrx, Inc. | Anti-CD4 antibodies |
AU2002315534B2 (en) * | 2001-07-10 | 2008-05-22 | Biogen Idec Inc. | Inhibition of apoptosis process and improvement of cell performance |
GB2380127A (en) * | 2001-09-26 | 2003-04-02 | Isis Innovation | Treatment of chronic joint inflammation |
ES2629395T3 (es) | 2001-10-04 | 2017-08-09 | Genetics Institute, Llc | Métodos y composiciones para modular la actividad de la interleucina-21 |
NZ533056A (en) | 2001-11-16 | 2007-12-21 | Biogen Idec Inc | Polycistronic expression of antibodies |
EP2075256A2 (en) | 2002-01-14 | 2009-07-01 | William Herman | Multispecific binding molecules |
EP1572936A2 (en) * | 2002-03-05 | 2005-09-14 | Eli Lilly And Company | Heterologous g-csf fusion proteins |
US20030180292A1 (en) * | 2002-03-14 | 2003-09-25 | Idec Pharmaceuticals | Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy |
US20040016010A1 (en) * | 2002-04-17 | 2004-01-22 | Marion Kasaian | IL-21 receptor knockout animal and methods of use thereof |
EP1517701A2 (en) * | 2002-04-22 | 2005-03-30 | Recopharma AB | Lewis y epitope-containing mucin fusion polypeptide vaccines, compositions and methods of use thereof |
ES2385032T3 (es) * | 2002-04-22 | 2012-07-17 | Recopharma Ab | Vacunas de polipéptido de fusión de mucina, composiciones y métodos de uso de las mismas |
CA2483476A1 (en) * | 2002-04-22 | 2003-10-30 | Absorber, Ab | Fusion polypeptides and methods for inhibiting microbial adhesion |
MXPA05000655A (es) | 2002-07-15 | 2006-02-22 | Harvard College | Metodos y composiciones para modular el desarrollo y la funcion de las celulas t helper (th). |
AU2003263411B8 (en) * | 2002-08-09 | 2011-04-14 | Recopharma Ab | Mucin-Immunoglobulin fusion proteins |
CN101152573A (zh) * | 2002-09-27 | 2008-04-02 | 唐纳士公司 | 用于预防和治疗获得性免疫缺陷综合症的协同组合物 |
RS20050300A (en) * | 2002-10-16 | 2007-08-03 | Euro-Celtique S.A., | Antibodies that bind cell-associated ca 125/0772p and methods of use thereof |
ES2744275T3 (es) * | 2002-10-17 | 2020-02-24 | Genmab As | Anticuerpos monoclonales humanos contra CD20 para su uso en el tratamiento de esclerosis múltiple |
JP4033390B2 (ja) * | 2002-10-30 | 2008-01-16 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 不死化ナチュラルキラー細胞株 |
EP1460088A1 (en) * | 2003-03-21 | 2004-09-22 | Biotest AG | Humanized anti-CD4 antibody with immunosuppressive properties |
CA2520121A1 (en) * | 2003-04-03 | 2004-10-21 | Protein Design Labs, Inc. | Inhibitors of integrin alpha5beta1 and their use for the control of tissue granulation |
EP2522677A1 (en) * | 2003-06-11 | 2012-11-14 | Wyeth LLC | Platelet glycoprotein IB alpha variant fusion polypeptides and methods of use thereof |
GB2406094B (en) * | 2003-09-17 | 2007-06-06 | Antisoma Plc | Modified antibody comprising an amino acid substitution mutation which confers increased stability |
CA2543631A1 (en) * | 2003-11-07 | 2005-05-26 | Amgen Inc. | Monkey immunoglobulin sequences |
US7850962B2 (en) * | 2004-04-20 | 2010-12-14 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against CD20 |
US20060039902A1 (en) * | 2004-08-05 | 2006-02-23 | Young Deborah A | Antagonizing interleukin-21 receptor activity |
US7658919B2 (en) * | 2004-10-14 | 2010-02-09 | Recopharma Ab | Compositions and methods for inhibiting H. pylori adhesion and infection |
US7589182B1 (en) | 2005-01-07 | 2009-09-15 | Los Alamos National Security, Llc | Anti-sulfotyrosine antibodies |
US20060193849A1 (en) * | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Antisoma Plc | Biological materials and uses thereof |
JP5620626B2 (ja) | 2005-03-31 | 2014-11-05 | 中外製薬株式会社 | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
GT200600148A (es) * | 2005-04-14 | 2006-11-22 | Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis | |
CA2633768A1 (en) * | 2005-11-10 | 2007-05-18 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Reduction of restenosis |
EP1954714A2 (en) * | 2005-11-10 | 2008-08-13 | Receptor Biologix, Inc. | Hepatocyte growth factor intron fusion proteins |
US7495097B2 (en) * | 2005-11-23 | 2009-02-24 | Brown University | Rhodium quinonoid catalysts |
EP1806365A1 (en) | 2006-01-05 | 2007-07-11 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them |
US20090181041A1 (en) * | 2006-01-23 | 2009-07-16 | Jan Holgersson | Production of proteins carrying oligomannose or human-like glycans in yeast and methods of use thereof |
CA2637947A1 (en) * | 2006-01-23 | 2007-07-23 | Recopharma Ab | Production of proteins carrying oligomannose or human-like glycans in yeast and methods of use thereof |
EP2264060B1 (en) * | 2006-01-26 | 2014-04-23 | Recopharma AB | Compositions and methods for inhibiting viral adhesion |
US20070218062A1 (en) * | 2006-03-16 | 2007-09-20 | Genentech, Inc. | Methods of treating lupus using CD4 antibodies |
US20080279848A1 (en) * | 2006-03-16 | 2008-11-13 | Genentech, Inc. | Methods of treating lupus using CD4 antibodies |
TW200806317A (en) * | 2006-03-20 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Methods for reducing protein aggregation |
SG171599A1 (en) | 2006-03-23 | 2011-06-29 | Absorber Ab | Blood group antigens of different types for diagnostic and therapeutic applications |
US9670269B2 (en) | 2006-03-31 | 2017-06-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies |
EP4001409A1 (en) | 2006-03-31 | 2022-05-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
AU2007257683A1 (en) * | 2006-06-12 | 2007-12-21 | Symphogen A/S | Pan-cell surface receptor- specific therapeutics |
TW200817438A (en) * | 2006-08-17 | 2008-04-16 | Hoffmann La Roche | A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide |
US20090143288A1 (en) * | 2007-03-13 | 2009-06-04 | Roche Palo Alto Llc | Peptide-complement conjugates |
CA2681530C (en) | 2007-03-22 | 2017-03-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Binding proteins, including antibodies, antibody derivatives and antibody fragments, that specifically bind cd154 |
TW200902708A (en) * | 2007-04-23 | 2009-01-16 | Wyeth Corp | Methods of protein production using anti-senescence compounds |
WO2008134046A1 (en) * | 2007-04-27 | 2008-11-06 | Genentech, Inc. | Potent, stable and non-immunosuppressive anti-cd4 antibodies |
US20090022720A1 (en) | 2007-07-20 | 2009-01-22 | Stephan Fischer | Conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides |
DK2202245T3 (en) | 2007-09-26 | 2016-11-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR |
KR102467302B1 (ko) | 2007-09-26 | 2022-11-14 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항체 정상영역 개변체 |
WO2009052184A2 (en) * | 2007-10-16 | 2009-04-23 | Receptor Biologix, Inc. | Compositions comprising optimized her1 and her3 multimers and methods of use thereof |
MY177564A (en) | 2007-12-05 | 2020-09-20 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-nr10 antibody and use thereof |
SG190627A1 (en) | 2008-03-13 | 2013-06-28 | Biotest Ag | Agent for treating disease |
RU2540013C2 (ru) | 2008-03-13 | 2015-01-27 | Биотест Аг | Средство для лечения заболевания |
JP5597553B2 (ja) * | 2008-03-13 | 2014-10-01 | バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト | 疾患治療剤 |
WO2009136297A2 (en) * | 2008-05-09 | 2009-11-12 | Recopharma Ab | Compositions and methods for inhibiting toxin a from clostridium difficile |
WO2009136298A2 (en) * | 2008-05-09 | 2009-11-12 | Recopharma Ab | Compositions and methods for inhibiting shiga toxin and shiga-like toxin |
KR101679084B1 (ko) * | 2008-05-23 | 2016-11-24 | 아고스 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 | 신규 가용성 cd83 폴리펩티드, 제형 및 사용 방법 |
US20100021460A1 (en) * | 2008-07-15 | 2010-01-28 | Genentech, Inc. | Methods of Treating Autoimmune Diseases Using CD4 Antibodies |
EP2331140B1 (en) | 2008-08-11 | 2018-07-04 | Nektar Therapeutics | Multi-arm polymeric alkanoate conjugates |
TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
WO2010034590A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Biotest Ag | Composition for treating disease |
ES2699434T3 (es) * | 2008-10-31 | 2019-02-11 | Wyeth Llc | Purificación de proteínas ácidas utilizando cromatografía de hidroxiapatita cerámica |
PL2374883T3 (pl) | 2008-12-26 | 2017-05-31 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Przeciwciało anty-CD4 |
US9228017B2 (en) | 2009-03-19 | 2016-01-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody constant region variant |
US20120071634A1 (en) | 2009-03-19 | 2012-03-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody Constant Region Variant |
FR2945538B1 (fr) | 2009-05-12 | 2014-12-26 | Sanofi Aventis | Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide. |
RU2011151069A (ru) | 2009-05-15 | 2013-06-20 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Анти-axl антитело |
KR101778317B1 (ko) | 2009-08-13 | 2017-09-13 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 사람 호흡기 세포융합 바이러스(rsv)에 대한 항체 및 이용 방법 |
WO2011035205A2 (en) | 2009-09-18 | 2011-03-24 | Calmune Corporation | Antibodies against candida, collections thereof and methods of use |
US10150808B2 (en) | 2009-09-24 | 2018-12-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Modified antibody constant regions |
WO2011062997A2 (en) | 2009-11-17 | 2011-05-26 | Musc Foundation For Research Development | Human monoclonal antibodies to human nucleolin |
GB0920944D0 (en) | 2009-11-30 | 2010-01-13 | Biotest Ag | Agents for treating disease |
EP2543730B1 (en) | 2010-03-04 | 2018-10-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody constant region variant |
FR2958936A1 (fr) | 2010-04-14 | 2011-10-21 | Sanofi Aventis | Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs |
WO2011133636A1 (en) * | 2010-04-20 | 2011-10-27 | Cedars-Sinai Medical Center | COMBINATION THERAPY WITH CD4 LYMPHOCYTE DEPLETION AND mTOR INHIBITORS |
JP5744196B2 (ja) | 2010-07-09 | 2015-07-08 | クルセル ホランド ベー ヴェー | 抗ヒト呼吸器多核体ウイルス(rsv)抗体および使用の方法 |
TWI560199B (en) * | 2010-08-31 | 2016-12-01 | Sanofi Sa | Peptide or peptide complex binding to α2 integrin and methods and uses involving the same |
EP2471543A1 (en) * | 2010-12-02 | 2012-07-04 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Tolerance induction or immunosupression to prevent in particular Graft-versus-Host-Disease (GvHD) by short-term pre-incubation of transplanted cell suspensions, tissues or organs coated with ligands to cell surface molecules |
EP2654771A1 (en) | 2010-12-21 | 2013-10-30 | Recopharma Ab | Tear substitutes |
WO2012088445A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Nektar Therapeutics | Multi-arm polymeric prodrug conjugates of cabazitaxel-based compounds |
WO2012088422A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Nektar Therapeutics | Multi-arm polymeric prodrug conjugates of taxane-based compounds |
CA2820781A1 (en) | 2010-12-23 | 2012-06-28 | Sanofi | Robo1-fc fusion protein for use in the treatment of hepatocarcinoma |
ES2692268T3 (es) | 2011-03-29 | 2018-12-03 | Roche Glycart Ag | Variantes de Fc de anticuerpo |
WO2012166555A1 (en) | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Nektar Therapeutics | Water - soluble polymer - linked binding moiety and drug compounds |
AU2012328819B2 (en) | 2011-10-26 | 2017-08-03 | Elanco Tiergesundheit Ag | Monoclonal antibodies and methods of use |
CA2877009C (en) | 2012-07-05 | 2023-10-03 | Devin TESAR | Expression and secretion system |
EP3495387B1 (en) | 2012-07-13 | 2021-09-01 | Roche Glycart AG | Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases |
CN103772503B (zh) | 2012-10-22 | 2017-05-10 | 泉盛生物科技股份有限公司 | 介白素‑6抗体及其用途 |
AU2014209141B2 (en) | 2013-01-24 | 2018-05-10 | Palvella Therapeutics, Inc. | Compositions for transdermal delivery of mTOR inhibitors |
WO2014135984A2 (en) | 2013-03-07 | 2014-09-12 | Recopharma Ab | Glycosylated mucin-immunoglobulin fusion protein coated device |
EP3000478A4 (en) * | 2013-05-23 | 2017-03-15 | IDAC Theranostics, Inc. | Therapeutic or prophylactic agent for immunodeficiency virus infection |
US20160158352A1 (en) * | 2013-07-10 | 2016-06-09 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health & Human Servic | Apoptotic cell-mediated induction of antigen specific regulatory t-cells for the therapy of autoimmune diseases in animals and humans |
RU2758952C1 (ru) | 2013-09-27 | 2021-11-03 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Способ получения полипептидного гетеромультимера |
US11213583B2 (en) | 2014-02-05 | 2022-01-04 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods and compositions for treating cancer and infectious diseases |
BR112017014067B1 (pt) | 2015-02-27 | 2021-01-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6 |
JP7082484B2 (ja) | 2015-04-01 | 2022-06-08 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド異種多量体の製造方法 |
CN106188292B (zh) * | 2015-05-05 | 2019-09-24 | 北京傲锐东源生物科技有限公司 | 抗cd4蛋白单克隆抗体及其用途 |
KR20180091918A (ko) | 2015-12-28 | 2018-08-16 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | Fc 영역 함유 폴리펩타이드의 정제를 효율화하기 위한 방법 |
SG10201607778XA (en) | 2016-09-16 | 2018-04-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use |
AU2018205253B2 (en) | 2017-01-06 | 2022-01-13 | Palvella Therapeutics, Inc. | Anhydrous compositions of mTOR inhibitors and methods of use |
EP3354278A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-01 | Sanofi | Neuronal cell protective effect of antibodies specific for the protofibrillar form of the beta-amyloid peptide |
CN108690138A (zh) * | 2017-04-12 | 2018-10-23 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用 |
WO2018203545A1 (ja) | 2017-05-02 | 2018-11-08 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター | Il-6及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法 |
WO2019160907A1 (en) * | 2018-02-14 | 2019-08-22 | University Of Virginia Patent Foundation | Regulating cd4+ t cells to treat clostridium difficile infection |
JP2021518343A (ja) | 2018-03-15 | 2021-08-02 | 中外製薬株式会社 | ジカウイルスに対して交差反応性を有する抗デングウイルス抗体および使用方法 |
US11000513B2 (en) | 2018-07-02 | 2021-05-11 | Palvella Therapeutics, Inc. | Anhydrous compositions of mTOR inhibitors and methods of use |
CN113248612A (zh) * | 2020-02-13 | 2021-08-13 | 上海君实生物医药科技股份有限公司 | 抗pd-1抗体在治疗神经内分泌瘤中的用途 |
CN113244386A (zh) * | 2020-02-13 | 2021-08-13 | 上海君实生物医药科技股份有限公司 | 抗pd-1抗体在治疗肿瘤中的用途 |
CN113045661B (zh) * | 2021-04-07 | 2022-06-21 | 中美冠科生物技术(太仓)有限公司 | 新型抗cd4抗体 |
TW202321457A (zh) | 2021-08-04 | 2023-06-01 | 美商薩那生物科技公司 | 靶向cd4之病毒載體之用途 |
WO2023114949A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods and systems of particle production |
WO2023133595A2 (en) | 2022-01-10 | 2023-07-13 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
WO2023150647A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
WO2023168426A1 (en) | 2022-03-03 | 2023-09-07 | Enosi Therapeutics Corporation | Compositions and cells containing mixtures of oligo-trap fusion proteins (ofps) and uses thereof |
WO2023193015A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Sana Biotechnology, Inc. | Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies |
WO2024026377A1 (en) | 2022-07-27 | 2024-02-01 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors |
WO2024044655A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | Sana Biotechnology, Inc. | Delivery of heterologous proteins |
WO2024064838A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Sana Biotechnology, Inc. | Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8308235D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
WO1988007089A1 (en) | 1987-03-18 | 1988-09-22 | Medical Research Council | Altered antibodies |
US4978745A (en) | 1987-11-23 | 1990-12-18 | Centocor, Inc. | Immunoreactive heterochain antibodies |
US4975369A (en) * | 1988-04-21 | 1990-12-04 | Eli Lilly And Company | Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen |
DE3814887C1 (no) * | 1988-05-02 | 1989-09-21 | Medice Chem.-Pharm. Fabrik Puetter Gmbh & Co Kg, 5860 Iserlohn, De | |
IL162181A (en) * | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
AU4964290A (en) * | 1989-01-18 | 1990-08-13 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for treating or preventing aids, arc and hiv infection |
US5690933A (en) * | 1989-05-31 | 1997-11-25 | Glaxo Wellcome Inc. | Monoclonal antibodies for inducing tolerance |
GB8912497D0 (en) * | 1989-05-31 | 1989-07-19 | Cobbold Stephen P | Monoclonal antibodies |
US5308839A (en) * | 1989-12-04 | 1994-05-03 | The Research Foundation Of State University Of New York | Composition comprising non-steroidal anti-inflammatory agent tenidap and effectively non-antibacterial tetracycline |
CA2054983A1 (en) * | 1990-11-08 | 1992-05-09 | Sotoo Asakura | Suspendible composition and process for preparing the same |
EP0523949B1 (en) * | 1991-07-15 | 2003-06-25 | The Wellcome Foundation Limited | Production of antibodies |
DE69233628T2 (de) | 1991-07-25 | 2007-04-26 | Biogen Idec Inc., San Diego | Rekombinante Antikörper zur humanen Therapie |
IE922437A1 (en) * | 1991-07-25 | 1993-01-27 | Idec Pharma Corp | Recombinant antibodies for human therapy |
US6136310A (en) * | 1991-07-25 | 2000-10-24 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy |
US5756096A (en) * | 1991-07-25 | 1998-05-26 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Recombinant antibodies for human therapy |
CA2146647C (en) * | 1992-10-08 | 2009-05-05 | Marc Feldmann | Treatment of autoimmune and inflammatory disorders |
US6024957A (en) * | 1993-06-02 | 2000-02-15 | Research Corporation Technologies, Inc. | Immunomodulators and methods for the prevention and reversal of organ transplant rejection using same |
US5691183A (en) * | 1993-07-07 | 1997-11-25 | University Technology Corporation | CD4+ T-lymphoctye proteases and genes encoding said proteases |
-
1995
- 1995-09-06 US US08/523,894 patent/US6136310A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-09-05 EP EP96929936A patent/EP0854885B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-05 BR BR9610404A patent/BR9610404A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-09-05 RU RU98106117/13A patent/RU2232773C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-09-05 JP JP51141197A patent/JP3619866B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-05 NZ NZ316835A patent/NZ316835A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-09-05 IL IL12344796A patent/IL123447A0/xx unknown
- 1996-09-05 HU HU9802212A patent/HU221351B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-09-05 AT AT96929936T patent/ATE348113T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-09-05 DE DE69636760T patent/DE69636760T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-05 WO PCT/US1996/014324 patent/WO1997009351A1/en active IP Right Grant
- 1996-09-05 KR KR1019980701683A patent/KR100491222B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-09-05 RO RO98-00703A patent/RO120198B1/ro unknown
- 1996-09-05 CZ CZ1998586A patent/CZ291036B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-09-05 SK SK279-98A patent/SK27998A3/sk unknown
- 1996-09-05 AP APAP/P/1998/001209A patent/AP1193A/en active
- 1996-09-05 CA CA002231182A patent/CA2231182A1/en not_active Abandoned
- 1996-09-05 AU AU69162/96A patent/AU717674B2/en not_active Ceased
- 1996-09-05 CN CNB961979437A patent/CN100391978C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-03-03 NO NO19980915A patent/NO324497B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-03-04 MX MX9801732A patent/MX9801732A/es not_active IP Right Cessation
- 1998-03-06 OA OA9800029A patent/OA10671A/en unknown
- 1998-03-24 BG BG102343A patent/BG64651B1/bg unknown
-
1999
- 1999-05-03 HK HK99101977.7A patent/HK1016995A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-07-10 US US09/612,914 patent/US7452534B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-08-05 US US10/211,357 patent/US7338658B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-02-29 US US12/040,240 patent/US20090226430A1/en not_active Abandoned
- 2008-07-02 US US12/166,902 patent/US20090221036A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO324497B1 (no) | Chimerisk anti-CD4-antistoff, fremgangsmate for fremstilling derav, DNA-kodende for et slikt antistoff samt anvendelse derav for fremstilling av et medikament til behandling av en ikke-autoimmun sykdom. | |
US5756096A (en) | Recombinant antibodies for human therapy | |
EP0837927B1 (en) | Anti-cd80 antibodies | |
US5750105A (en) | Recombinant antibodies for human therapy | |
EP1007090B1 (en) | Identification of unique binding interactions between certain antibodies and the human b7.1 (cd80) and b7.2 (cd28) co-stimulatory antigens | |
EP1715045A2 (en) | Recombinant antibodies for human therapy | |
US7153508B2 (en) | Treatment of B cell lymphoma using anti-CD80 antibodies that do not inhibit the binding of CD80 to CTLA-4 | |
MXPA99004296A (en) | Identification of unique binding interactions between certain antibodies and the human b7.1 and b7.2 co-stimulatory antigens |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |