KR910004100B1 - B-세포의 증식을 촉진시키는 방법 및 배위자 - Google Patents

B-세포의 증식을 촉진시키는 방법 및 배위자 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

제 1 도는 녹색형광의 기록과 적색형광의 로그치 대 세포의 수를 도시한 것임.
제 2 도는 Bp50 폴리펩티드와 기타 B-세포표면 항원과의 생화학적 비교도.
제 3 도는 Bp50 발현의 2가지 색상의 면역형광 분석도.
제 4 도는 표지된 바와 같이 항 Bp50 항체에 의한 조밀 편도선 Er-B-세포의 증식에 있어서의 투여량 반응곡선.
제 5 도는 항-Bp50 mAb가 B-세포 활성 시그날 후 첨가될 때 가장 효과 적임을 나타내는 도면.
제 6 도는 항-Bp35와 항-Bp50이 휴지기의 편도선 B-세포를 세포 사이클의 G0단계로부터 순환하도록 유도하는 능력을 비교한 도면.
제 7 도는 항-Bp50으로 촉진시킨 후의 B-세포증식 대 BCGF로 촉진시킨 후의 B-세포증식의 키네틱곡선.
제 8 도는 항-Bp50(A) 또는 BCGF(B)가 최적으로 증식을 촉진시킨 때의 항-Bp35 자극 후의 시간을 나타낸 곡선.
제 9 도는 공통 자극제로써 BCGF 적정시의 BCGF투여량(%)에 대한 평균 증식량을 도시한 것임.
제 10 도는 정상 및 악성종양세포에 대한 항-Bp50과 BCGF의 효과비교도임.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 B-세포증식에 있어서 기능을 갖지만 초기 B-세포 활성화에 있어서는 기능을 갖지 않는 50kDa B-세포표면 마커(이하 Bp50이라 칭함)에 결합하는 항체분자 또는 항체분자의 단편과 같은 배위자 또는 림포카인과 같은 기타 배위자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 Bp50 B-세포항원 그 자체에 관한 것이기도하다. 본 발명의 특정 구체예에서 모노클로날항체 G28-5는 Bp50을 규정하며, 활성화된 B-세포의 증식에 있어서는 어떠한 역할을 하지만 휴지중인 B-세포의 증식에 있어서는 이렇다할 효과를 나타내지 않는 것으로 보인다.
본 발명의 항체, 림포카인 및 이들의 단편과 같은 배위자는 인체 B-세포의 증식 및/또는 분화를 조절하는데 사용될 수 있다. 이에 이어서 본 발명의 배위자는 Bp50 항원을 발현하는 악성종양 세포를 처리 및/또는 검출하는데 사용할 수 있는 기타 화합물과 결합시켜 변형시킬 수 있다.
세포사이클의 G0단계에서 G1단계로의 휴지 B-세포의 활성화와 이 활성화된 B-세포를 증식시키는 후속적인 유도는 상이한 조절 메카니즘을 요구하는 별개의 단계이다. 쥐과동물의 B-세포 촉진인자-pl(BSF-pl)을 포함하는 몇가지 시약(Rabin 외, 1985, Proc, Nat. Acad. Sci, USA 82, 2935-2939) 또는 소량의 항면역 글로불린(항-Ig) (DeFranco 외, 1985, J. Immunol, 135 : 87-94 ; Wetzel 외, 1984, J. Immunol. 133 ; 2327-2332 ; Defranco 외, 1982. J. Exp.Med. 155 : 1532-1536 : Muraguchi 외, 1984, J. Immunol. 132 : 176-180)은 "활성화(activation)" 또는 "컴피턴스(competence)"인자들이다. 즉, 이들은 B-세포를 확대시키도록 유도하고 더 많은 RNA를 합성하여 G1단계로 들어가게 하지만 단독으로는 B-세포내에서 DNA 합성을 유도시키지 않는다. 인체 B-세포 성장인자(BCGF) 및 인터류킨-2(IL-2)와 같은 기타 "성장"인자들은 활성화된 B-세포로하여금 세포사이클을 전진하게하여 S단계로 들어가게 하지만, 휴지기의 B-세포에는 영향을 미치지 않는다(Kehrl 외, 1984, Immunol.Rev. 18:75-96; Muraguchi 외, 1984, J. Immunol.132 : 176-180 ; Zubler 외, 1984, J. Exp.Med.160 : 1170-1183 ; Jung 외, J. Exp. Med. 160 : 1597-1604).
B-세포의 성장을 촉진시키는 여러가지 인자가 이제 쥐과동물과 인체계의 관찰자에 의해서 설명되고 있다. 이들은 T-세포주 또는 하이 브리도마, B-세포주 또는 수지상세포를 포함하는 여러가지 상이한 소스로부터 유도된 B-세포 성장인자(BCGF)를 포함한다. 인터류킨-1-(IL-1)과 인터류킨-2(IL-2)가 모두 B-세포 성장을 촉진시키는 것으로 나타났지만, 이들은 특정 BCGF와는 분명히 다르다, 예를들어 쥐과 동물의 BCGF (O'Hara 외, 1985, Nature(Lone.)315:333) 또는 인체 BCGF(Ambrus 외, 1985, J. Exp, Ned.162-1319)에 대한 모노클로날항체(mAb)는 BCGF 활성을 차단하지만 IL-1 또는 IL-2의 활성은 차단하지 않는다. IL-1 또는 IL-2와는 다르지만 BCGF 자체는 생화학적 데이타 및 상이한 B-세포 서브세트에 대한 상이한 또는 공통 자극분석에 기초할 때 이질적인 것으로 나타났다. 예를들면 60킬로달톤(kDa)의 고분자량의 인체 BCGF, 즉 BCGF(고분자)는 12kDa의 저분자량 형태 BCGF(저분자량)와는 다르다는 사실이 확인되었다(Ambrus 외, 1985, J. Clin. Invest. 75 : 732). 잠정적으로 B-세포 촉진인자 pl(BSF-pl)로 표시된, 20-kDa 쥐과동물의 BCGF를 코드하는 cDNA가 최근 클로닝되어 그 배열이 분석된 바 있다(Noma 외, 1986, Nature 319 : 640). 제조합 림포카인은 BCGF 활성을 가질 뿐만 아니라 휴지 B-세포도 활성화시키며 IgG1생성세포의 분화도 유도한다 ; 따라서 이것은 분자량과 활성범위에 있어 인체 BCGF(고분자) 및 BCGF(저분자)와는 차이가 있다.
이러한 활성화 및 성장 시그날은 아마도 특수한 B-세포표면 구조와 상호 반응하여 세포를 적절히 조절하는듯 하다. 표면 Ig를 통한 항원-특이신호에 덧붙여, 몇가지 방식으로 B-세포의 활성화 또는 생장에 기여하는 기타 여러가지 후보 B-세포표면 폴리펩티드가 동정되었다. 예를들어, 1L-1(Dower 외, 1985, J. Exp. Med. 160 : 501)과 IL-2(Robb 외 1984, J. Exp, Med. 160 : 1126)에 대한 세포표면의 섭수체가 특징화 되었으며, 최근에 B-세포상의 기능적 IL-2 섭수체가 동정되었다(Zubler 외, 1984, J. Exp, Med, 160 : 1170 ; Jung 외, 1984, J. Exp. Med. 160 : 1597 ; Muraguchi 외, 1985, J. Exp. Med. 161 : 181). 그런데 B-세포성장 및 활성화 인자에 대한 섭수체는 아직 완전히 그 특성이 밝혀져 있지 않다. 여러가지 후보 B-세포표면 폴리펩티드가 B-세포의 활성 또는 성장에 어떤방법으로 기능을 발휘할 수 있음이 확인되었다.
예를들어, 수바라오와 모지르(Subbarao 외, 1983, Immunol. Rev. 69 : 81-97)는 쥐과동물의 B-세포항원 Lyb2에 대한 모노클로날항체(mAb)는 B-세포를 활성화시킨다는 사실을 알았으며 최근에 제안된 Lyb2가 BSF-pl에 대한 섭수체일 것이라는 증거가 제시되었다(Yakura, 1985, Fed.Proc. 44 : 1532). 이와 유사하게, 본 발명자들은 35kDa 폴리펩티드인 Bp35에 대한 적절한 mAb(1F5)가 인체 B-세포를 G0로부터 G1으로 활성화시킨다는 사실을 발견하였다(Clark 외, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 : 1776-1770 ; Gollay 외, 1985, J. Immunol. 135 : 3795-3801). 괴상 C3d 또는 140kDa C3d 섭수체인 Bp140에 대한 항체는 T-세포 의존성인 B-세포를 증식시킨다(Melchers 외, 1985, Nature 317 : 264-267 ; Nemetow 외, 1985, J. Immunol, 135 : 3068-3073 ; Frade 외, 1985, Eur.J.Immunol. 15 : 73-76). BCGF들이 새앙쥐와 인체에서 확인되었지만 이들 인자들에 대한 섭수체들은 아직 단리되지 않았다. 왕과 그의 공동 연구자(Wang 외, 1979, J. Exp. Med. 149 : 1424-1433)는 인체 B-세포상에서 54-kDa 폴리펩티드(gp54)를 확인한 폴리클로날 항혈청을 제조하여 gp54에 대한 토끼의 항혈청이 편도선 B-세포를 유발하여 분화시킨 사실을 보여주었다. 최근에 정과 푸(Jung 외, 1984, J. Exp. Med. 160 : 1919-1924)는 BCGF-의존성 증식을 차단하는 활성화 B-세포로 한정된 55kDa 항원에 대한 mAb(AB-1)를 단리시켰다. 그런데 항-gp54 또는 AB-1가 BCGF 섭수체를 인지하는지에 대해서는 아직 알려지지 않았다.
본 발명은 (a) 전술한 Bp50, 즉 50kDa B-세포 특이표면 폴리펩티드에 결합하고, (b) 활성화된 B-세포의 증식을 촉진시키는 배위자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 모노클로날항체 G28-5에 의해 규정되고 활성화된 B-세포를 증식시키는데 어떠한 기능을 갖는 Bp50 항원자체에 관한 것이기도 하다. 이에 더하여 본 발명은 Bp50에 결합하지만 활성 B-세포의 증식을 촉진시키는 등의 생물학적 영향 또는 기능을 나타내지는 않는 배위자에 관한 것이다.
본 발명의 배위자에는 항체분자, 모노클로날항체 분자 및 항체 결합위치 또는 화학적으로 변형된 항체 및 단편들을 포함하여, 이들 항체분자들의 단편들이 포함된다. 이러한 단편들로는 Fv.Fab, F(ab')2, Fab'등이 있으나 이것들로 한정시키지는 않는다. 이에 더하여 본 발명의 배위자에는 화학적으로 변형된 림포카인 뿐만 아니라 인체 B-세포 성장인자가 포함될 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 배위자는 어떤 화합물을 예를들어 배위자와 결합시키거나 커플링 반응시켜 화학적으로 변형시킬 수 있다. 이런 화합물로서는 세포독소제, 치료제, 화학적치료제, 방사능표지, 염료, 효소, 방사능 불투과 화합물과 같은 표지물질등을 들 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 배위자는 변형되었거나 또는 변형되지 않은 형태로 인체 B-세포증식 및/또는 분화를 조절 및 변화시키는데 사용될 수 있다.
본 발명은 2가지 인체 B-세포 분화항원, 즉 Bp35와 상기 B-세포항원 Bp50이 B-세포의 활성화에 있어 시그날 섭수체로서 분명이 상이한 역할을 한다는 사실의 발견에 기초를 두고 있다. Bp35와 Bp50에 대한 모노클로날항체(mAb)는 세포사이클을 통한 이들의 전이를 촉진시키는 포지티브신호를 B-세포에 보내게 된다. 항-Ig 항체와 같은 Bp35에 대한 MAb는 주로 휴지기의 B-세포가 세포사이클중의 G1단계에 들어갈 수 있을만큼 수용(competent)적이 되도록 이를 활성화시키는 기능을 한다. 이와 대조적으로, 모든 B-세포상에서 발현되는, 50-kDa 폴리펩티드인 Bp50에 대한 전술한 모노클로날항체 또는 그의 F(ab')2단편은 활성화된 B-세포가 세포사이클을 순환하도록 자극하는 기능을 하여 활성화 B-세포의 증식을 촉진시킨다. 항-Ig 항체와 같은 Bp35에 대한 모노클로날항체는 편도선 B-세포를 활성화시켜 낮은 수준의 B-세포증식을 유도한다. 이와 대조적으로, 항-Bp50 모노클로날항체는 단독으로 B-세포를 활성화시키지도 않고, B-세포를 증식시키지도 않는다. 그러나 항-Bp35 또는 항-Ig 항체들과 함께라면 B-세포의 증식을 촉진시킨다. 이점에 있어서, 항-Bp50 항체의 작용은 B-세포 성장인자(BCGF)의 작용과 비슷하다. 중식을 촉진시키는데는 불과 0.05㎍/ml 정도의 미량의 항-Bp50의 필요하며, BCGF와 마찬가지로, 항-Bp50은 B-세포가 항-Ig나 항-Bp35에 의해 활성화된지 12-24시간 후에 첨가되어도 효과가 있다. 추가적인 외부 시그날없이 항-Bp35 및 항-Bp50 항체는 다같이 정제된 휴지 B-세포의 대량증식을 유발시킨다. 이와 같은 결과는 Bp35와 Bp50 표면분자가 B-세포 활성화의 조절적 통제 및 세포사이클을 통한 진행에 기여한다는 것을 시사해준다.
본 발명의 배위자의 효과 및 활성에 미치는 항-Bp35와 이와 유사한 분자의 중요성 때문에 이에대한 클라크와 그의 공동연구자의 연구결과를(1985, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 82 : 1766-1770) 본 발명의 참고문헌으로 포함시킨다.
항-Bp50과 BCGF(저분자)가 모두 같은 시약과 공통자극적이고 서로와는 그렇지 않으며 항-Bp50과 BCGF(저분자)가 모두 활성화된 B-세포에만 영향을 미치고 가용성 형태로만 작용을 하기 때문에 항-Bp50의 작용이 BCGF(저분자)의 작용과 비슷하기는 하지만, 적당량의 항-Bp50과 항-Bp35(또는 항-Ig)로 자극된 B-세포의 증식은 BCGF(저분자)에 의해 더 촉진될 수 있고, 혈액 B-세포와 특정의 B-세포임파종 모두가 항-Bp50과 BCGF에 대해 상이하게 반응하기 때문에, 항-Bp50의 작용은 BCGF(저분자)의 작용과 구별될 수 있다. 최적의 활성을 위하여 항-Bp50은 B-세포의 활성화 후 12시간내에 첨가시켜야하는 반면, BCGF(저분자)는 활성 후 24시간이 지나서 첨가시킬지라도 최적의 활성을 유지한다. 이에 더하여 Bp50이 모든 B-세포상에서 발현되는데 대하여 BCGF(저분자)의 섭수체는 활성화된 B-세포에만 국한된다. 따라서 항-Bp50과 BCGF(저분자)는 B-세포의 생장을 대등하게 조절한다고 할 수 있지만 분명히 상이한 시그날에 의한다.
본 발명의 일 실시예로서 Bp50에 결합하고 활성화 B-세포의 증식을 촉진시키는 배위자는 면역반응을 증가시키는데 사용될 수 있다. 예를들어 Bp50과 결합하는 이들 배위자들은 왁진에의 면역반응을 증가시키기 위한 "첨가제"로서 사용될 수 있다. 별법으로 이들 배위자들은 면역억압된 개체의 면역반응을 증가시키는데 사용될 수 있다.
다른 실시예에서 본 발명의 배위자는 그 배위자가 결합하는 세포가 사멸되도록 화학적으로 변이시킬 수 있다. 모든 B-세포가 Bp50 항원을 발현시키므로 이러한 접근은 면역반응의 억압을 초래하게 된다. 예를들면 본 발명의 배위자에 결합된 세포독소제는 이식환자에 있어서의 조직순응성 장애를 차단하기 위해 생체내에서 면역억압을 일으키는데 사용될 수 있다 ; 별개의 방법으로 이들 개선된 배위자는 자기면역 질환을 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시예로 Bp50를 발현하는 종양세포와 같은 악성종양은 암질환을 치료하는데 유용되는 화학요법제에 결합시킨 본 발명의 배위자를 사용하여 치료할 수 있다. 이와 같이 변형된 배위자는 생체내에서, B-세포는 아니나 Bp50을 발현하는 세포를 비롯하여 Bp50 항원을 발현하는 어떠한 악성종양제 세포에도 화학요법제를 지향시키는데 사용될 수 있다. B-세포의 증식을 촉진시키는 본 발명의 배위자를 사용하게 되면 그 배위자에 결합된 화학요법제가 증식세포를 사멸시키는데 더 효과적인 것으로 구성되어 있는 경우 B-세포악성종양을 치료할 때에 특히 유리하다는 것을 알게된다.
또한 본 발명의 배위자는 시험관내에서 Bp50 항원을 발현하는 세포를 확인하거나 분리시키는데 사용하거나 또는 탈각되거나 되지않는 Bp50 항원의 존재에 대하여 체액을 분석하는데 사용될 수 있다. 이에 더하여 본 발명의 배위자는 Bp50 항원을 발현하는 세포 또는 종양을 생체내에서 비추어 보는데 사용될 수 있다.
본 발명의 정제된 Bp50 항원은 항체를 제조하고 본 발명의 기타 배위자를 제조 또는 설계하는데 사용될 수 있다. 이에 더하여 Bp50 항원은 진단면역 분석과 같은 분석시에 사용될 수 있으며 더욱이 Bp50 그 자체는 생체내 또는 시험관내에서 세포면역성의 조정제로서 사용될 수 있다.
이하 본 발명의 명세서에 인용된 약자들에 대하여 설명하고자 한다.
AO=아크리딘 오렌지
BCGF=B-세포 성장인자
BCGF(고분자)-60kDa 인체 BCGF
BCGF(저분자)-12kDa 인체 BCGF
Bp35=mAb 1F5에 의해 규정되는 35kDa B-세포 특이표면 폴리펩티드(CD20)
Bp50=mAb G28-5에 의해 규정되는 50kDa B-세포 특이표면 폴리펩티드
Fv=항체분자의 가변부 또는 항체결합부위. 이것은 분자의 이디오타잎을 포함한 단편으로서 Fab, Fa(ab')2, Fab', 등을 들 수 있으며 이에 한정하지 않는다.
IF=면역형광
Ig=면역글로불린
IL-1=인터류킨 1
IL-2=인터류킨 2
kDa=킬로달론
mAb=모노클로날항체
SDS-PAGE=도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
TPA=12-0-테트라데카노일포르볼-13 아세테이트
이하 첨부된 도면에 대하여 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제 1 도 Bp50의 발형은 Bp35±B-세포로 한정되어 있다. 50,000개 세포의 2가지 색상의 혈구계산 분석을 공지의 방법(Clark 외, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 82 : 1766-1770)과 같이 수행하였다. 이 데이타를 세포수 대 녹색형광의 로그치 및 적색형광의 로그치로 플로팅하였다. 여기서 4-5개의 점은 형광의 배가를 나타낸다. 이 데이타는 자동형광 네가티브세포를 나타내기 위하여 제공된 것이다. PE(적색)-항-Bp35(1F5) 대 FITC(녹색)-항-Bp50(G28-5) 염색은 모두 Bp50+ 세포가 또한 Bp35+ 이다는 사실을 나타낸다.
제 2 도 Bp50 폴리펩티드를 기타 B-세포표면 항원과 생물학적으로 비교하였다. 표면125I-라벨 편도선 세포로부터 Bp50의 면역침전은 공지의 방법에 따라 수행하였다. 단리시킨 항원은 환원시키지 않고 10% SDS 폴리아크릴아미드 슬랩(slab) 겔상에서 전기영동시켰다. 겔은 자동방사선 사진으로 촬영하여 확대스크린에 나타내었다. 패널 A : 레인1, 항-Bp(G28-5) ; 레인2, 항-Bp95(G28-8) ; 레인3, 세파로스-고우트(sepharose-goat)항마우스 Ig 단독. 노출시간 : 4일. 패널 B : 레인1, 항-Bp50(G28-5) ; 레인2, 항-Bp45(BLAST-2) ; 레인3, 항-Bp35(G28-1) ; 레인4, 항-Bp3a(41-H16) ; 레인5, 세파로스-고우트 항마우스 Ig 단독. 레인2-4중의 밴드가 과도노출되지 않고 Bp50과 비교하여 현저하게 다를 수 있도록 2일동안 노출시켰다. 세차례 시험중의 한차례 실시함.
제 3 도 Bp50 발현의 2가지 색상의 형광항체분석 상태를 도시하였다. 말초혈액 또는 편도선 단핵세포를 피콜상에서 원심분리시켜 단리시킨다. 음 2C3(항-IgM), 1F5(항-Bp35), HB10a(항-DR)와, 9.6(항-CD2, E섭수체)를 포함하는 형광(녹색)-결합된 참조항체와 결합시켜 PE(적색)-접합 G28-5(항-Bp50)로 염색하였다. 세포는 적색 및 녹색 위상의 40로그 앰플리파이어를 설치한 FACS IV로서 분석하였다. 전방 직사광선 산란기가 단핵세포를 추출하는데 사용되었다. 비염색세포는 그리드의 뒤편에 위치한다. 적색형광은 우측에 있고 녹색형광은 좌측에 있다.
제 4 도는 나타낸 바와 같이 항-Bp50에 의한 조밀 Ef-B세포의 증식촉진의 투여량 반응 곡선이다 : 배지단독 ; 항-Bp50 단독 ; 항-Bp35(5㎍/ml)단독 ; BCGF 단독 ; 항-Bp35+BCGF ; 항-Bp35+항-Bp50의 등급별 투여량에 대하여 표시하였다. 네가지 시료의 평균증식량±표준편차를 3일째 되는날 측정하였다.
제 5 도 항-Bp50 mAb가 B-세포 활성화 시그날 후에 첨가된다면 가장 효과적으로 증식촉진이 이루어짐을 알 수 있다. 조밀편도선 Er-B-세포를 배지 단독으로 4일동안 배양하고 항-Bp50(0.5μ/g/ml)은, 배양 후 각기 다른 시간에 첨가시키며, 또한 항-Bp35(5㎍/ml)도 배양 후 각기 다른 시간에 첨가시키고, 각기 다른 시간에 항-Bp535는 후자에 첨가시킨 후 항-Bp50을 일정하게 유지시켰으며, 항-Bp50을 각기 다른 시간에 배지에 첨가시킨 후 항-Bp35을 일정하게 유지시켰다. 최후 10시간 동안3H-티미딘을 첨가시키고 그의 인코포레이션을 측정하였다.
제 6 도 휴지 편도선 B-세포가 세포사이클의 G0단계를 벗어나도록 유도시키는데 있어서의 항-Bp35와 항-Bp50의 능력을 비교도시하였다. 3일 후 배지 단독(――), 항-Bp35 단독(­­­), 및 Ig단독(……)을 처리하였다. A, 부가적인 첨가제 없음, B, 각 그룹에 첨가된 항-Bp50(0.5㎍/ml), C, 각 그룹에 첨가된 5% BCGF, 데이타는 AO 적색형광(RNA)의 기록에 대하여 상대세포수로서 나타냈다.
제 7 도 BCGF대 항-Bp50으로 활성화시킨 후의 B-세포증식의 운동곡선을 나타낸다. 밀집 편도선 Er-B 세포는 배지 단독, 10% BCGF 단독, 항-Bp35단독, 항-Bp50 단독, 항-Bp35+10%, BCGF, 항-Bp35+항-Bp50, 및 항-Bp35+항-Bp50+10% BCGF 활성화시켰다. 증식량은3H 티미딘의 18시간 동안의 펄스에 의해서 나타난 일자수에 측정하였다. 증식은 4차례 측정하여 표준오차를 계산하였다. 3차례 시험중의 한차례임.
제 8 도 항-Bp35을 활성화시킨 후 항-Bp50(A) 또는 BCGF(B)가 증식을 촉진시킬 때를 표시하였다. 밀집 편도선 Er-B-세포는 도시된 바와 같이 활성화되었으며 제 3 일에3H 티미딘의 18시간 동안의 펄스에 의해 증식을 측정하였다. 배지 ; 지시된 때에 첨가시킨 항-Bp35 단독 ; 항-Bp50 또는 BCGF 단독, 지시된 때에 항-Bp50 또는 BCGF의 첨가에 따른 배양시점에서 첨가된 항-Bp50, 항-Bp35 첨가 후 배양시에 첨가시킨 항-Bp50 또는 BCGF, 2차례 시험중의 한차례임.
중식은 4차례 측정하여 표준오차를 계산하였다. 사용량 : 항-Bp35, 5㎍/ml, 항-Bp50, 0.2㎍/ml, BCGF(저분자) 5%, 사용된 농도 : 항-Bp35, 5㎍/ml, 항-Bp50, 0.2㎍/ml BCGF 5%.
제 9 도 항-Bp50과 BCGF는 B-세포증식에 대한 가산적인 효과를 갖는다. 밀집된 편도선 Er-B-세포를 항-Bp50 단독, 항-Bp35 단독, 항-Ig-비드단독, 항-Bp35+항-Bp50, 또는 항-Bp50+항-Ig의 함께 BCGF(저분자)의 등급별 투여량으로 활성화시켰다.3H-티미딘의 18시간 동안의 펄스에 의해 활성화시킨 후 증식을 측정하였다. 4차례 시험중의 한차례임.
106세포에의 사용량 ; 항-Bp35 5㎍/ml, 항-Bp50 0.2㎍/ml, 항-Ig-비드 50㎍/ml.
제 10 도 정상 및 악성 B-세포에 대한 항-Bp50 및 BCGF의 효과를 비교하였다. 말초혈액 Er-B-세포(A) 또는 밀집된 편도선 Er-B-세포(C)를 10% BCGF 또는 1㎍/ml 항-Bp50의 존재하에 TPA(75㎍/ml)를 사용하거나 사용하지 않고 활성화시켰다. 2가지의 분리된 B-세포 임파구(패널 B 및 패널 D)를 동일방법으로 활성화시켰다.3H 티미딘의 12시간 동안의 혼입에 의해 제 3 일에 증식을 측정하였다. 증식량을 4차례 측정하여 표준오차를 측정하였다.
본 발명은 (a)50kDa B-세포 특이표면 폴리펩티드인 Bp50 결합하고, (b) 활성화된 B-세포의 증식을 촉진시키는 배위자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 모노클로날항체 G28-5에 의해 규정되고 B-세포증식에 있어 어떤 역할을 하는 Bp50 항원 자체에도 관련된다. 이에 더하여, 본 발명은 Bp50에 결합하지만 활성화된 B-세포의 증식을 촉진시키는 것과 같은 생물학적 효과 또는 기능을 나타내지는 않는 배위자에 관한 것이다.
본 발명의 배위자로는 항체분자, 모노클로날 항체분자 및 화학적으로 변형된 항체를 포함하여 Bp50 섭수체에 결합하는 항원결합부위를 함유하는 이들 항체분자의 단편을 들 수 있으며 이러한 단편들로는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab'등이 있다(그러나 이것들로 한정시키는 것은 아니다). 이에 더하여 본 발명의 배위자는 Bp50 섭수체에 결합하는 림포카인도 포함된다. 이들 배위자는 BCGF는 물론 화학적으로 변이된 림포카인 등을 포함한다(그러나 이것으로 한정시키는 것은 아니다). 본 발명의 림포카인은 면역반응을 변형 및 조절시키기 위하여 변형시키거나 변형시키지 않는 형태로 사용할 수 있으며 Bp50 항원을 발현시키는 악성종향의 치료에 사용될 수 있다. 이들의 용도에 대하여는 다음에 더욱 상세히 설명하고자 한다.
배위자가 모노클로날항체 또는 그 단편이라면 모노클로날항체는 배양체중 수립세포주(continuous cell lines)에 의하여 항체분자를 생산하는 기술을 이용하여 Bp50에 대하여 제조할 수 있다. 예를들면 Kohler와 Milstein(1975, Nature 256 : 495-497)에 의해 개발된 하이브리도마 기술과 좀 더 최근에 개발된 기술, 예컨대 인체 모노클로날항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole등, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)과 인체 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor등, 1983, Immunology Today 4 : 72)이 본 발명의 범위내에 속한다.
그 분자의 이디오타잎을 함유하는 항체단편은 공지의 기술에 의해서 생성될 수 있다. 예를들면, 이러한 단편에는 항체 분자를 펩신으로 처리함으로 생산될 수 있는 F(ab')2단편 : 이 F(ab')2단편의 디설파이드 결합을 환원시킴으로써 생산될 수 있는 Fab' 단편 ; 항체분자를 파파인으로 처리함으로써 생산될 수 있는 F(ab')2단편 ; 및 항체 분자를 파파인과 디설파이드 결합을 환원시키기 위한 환원제로써 처리함으로써 생산될 수 있는 2Fab 또는 Fab 단편등이 있다. 그러나 본 발명의 범위를 이것들로써 제한시키고자 하는 것은 아니다.
Bp50에 결합하는 배위자가 림포카인인 경우, 이 림포카인은 천연자원으로부터 얻을 수 있으며, 만약 그 아미노산 배열이 공지되어 있거나 추측되면 이 림포카인은 화학적인 합성법으로 합성할 수 있다. 다른 한편, 림포카인의 유전자 배열이 공지되어 있다면 유전자 배열의 전사 및 번역수단을 제공하는 발현 벡터내에 삽입된 유전자를 적절한 숙주 세포내로 클로닝시키기 위해 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다.
의도된 용도에 따라 배위자 또는 그 배위자의 적당한 단편을 본 기술분야에 공지된 커플링 기술을 이용하여 배위자에 여러가지 화합물을 결합시킴으로써 화학적으로 변형시킬 수 있다. 이러한 기술을 몇가지 지적하면 카르보디이미드, 시아노겐브로마이드, 글루타르알데히드, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP)와 같은 2관능기 시약의 이용, 쉬프염기반응, 술프히드릴 부분에서의 결합, 소듐 이소티오시 아네이트의 이용 또는 효소결합 등이 있다. 그러나 이것들로써 한정시키고자 하는 것은 아니다. 방사능동위 원소를 배위자에 결합시키고자 한다면 이것은 효소적 방법, 산화적 치환, 킬레이트 반응에 의해서 수행될 수 있다. 단백질 변형에 사용될 수 있는 화학시약에 관해서는 Lundblad 및 Noyes의 Chemical Reagents for Protein Modification, II권, (CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida), 5장, 123-139면(1984)참고.
배위자에의 화합물의 화학적 결합 또는 커플링은 Bp50에의 결합에 참여하지 않은 부위에 지향시킬 수 있다. 이것은 커플링 반응을 수행하기 전에 배위자의 결합위치를 보호시킴으로써 행할 수 있다. 예를들어 Bp50 결합위치를 보호하기 위하여 먼저 배위자를 Bp50에 결합시킨 다음 요구되는 화합물을 배위자-Bp50 착화합물상의 가능한 결합부위에 결합시키는 커플링 반응을 수행할 수 있다, 커플링 반응이 완료되면 착화합물을 분해시켜 소망스런 화합물이 부착된 변형된 배위자가 생성됨으로써 분자의 Bp 결합부위에 미치는 영향을 최소화할 수 있다. 배위자가 G28-5와 같은 모노클로날항체, 즉 그의 Fc영역이 배위자가 효과를 발휘하는데 요망되지 않는 항체인 경우에는(37면 이후 참고), 소망되는 화합물을 분자의 Fc영역에 커플링시키는 것이 유리할 것이다.
이하에, B-세포를 증식시키는데 확실한 기능을 갖는 새로운 50-kDa B-세포표면 마커인 Bp50과 새로운 50kDa 섭수체에 결합하는 배위자 및 이들의 용도에 관하여 설명한다. 본 발명의 일 실시예로서 BCGF와 마찬가지로 B-세포증식을 촉진하는 Bp50를 규정하는 모노클로날항체와 그의 F(ab')2단편에 대해서도 설명한다. 휴지기의 B-세포를 G0에서 G1단계로 유도할 수 있는 항-Bp35 mAb와 달리 항Bp50 mAb는 휴지 B-세포를 활성화시키지 않는다. 항-Bp35와 항-Bp50 mAb는 함께 부수적인 외부 시그날 없이 정제된 B-세포의 강력한 활성화 및 증식을 유발시킨다.
다음에 설명되는 실험역시 항-Bp50의 활성이 BCGF의 활성과 유사하기는 하지만 항-Bp50은 BCGF와는 다르다는 사실을 입증하며 이는 항-Bp50과 저분자량의 BCGF가 명백히 가산적이고 여러가지 B-세포의 부분집합 또는 악성종양에 대해 다르게 작용하기 때문이다. Bp50은 BCGF생산 또는 BCGF 섭수체의 발현을 조절하는 투과막 시그날 또는 별개의 BCGF의 섭수체일 수 있다.
Bp50 섭수체의 특성을 밝히는데 사용된 방법
[세포제조]
Ficoll-Hypaque 구배(Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해 단핵세포를 정상적인 또는 백혈병 헤파린화 말초혈액으로부터 분리시켰다. 단핵세포는 Clark등의 방법(1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 : 1766-1770)에 의해 편도선 조직으로부터 얻었다. AET-처리된 양의 적혈구 로제팅 및 Ficoll-Hypaque 구배분리에 의해 T세포를 제거시켰다. 몇차례 실험에서 나일론을 접착세포를 단리시킴으로써 혈액 B-세포를 풍부하게 하였다. 단핵세포는 특별히 언급하지 않는 한 37℃에서 45분 동안 1 또는 2차례 플라스틱 페트리 접시에서 배양하여 제거시켰다. 부유성(buoyant) 또는 조밀한(dense) 편도선 B-세포유분을 Percoll 스텝식구배에 의해서 단리 시켰다(Clark등,1985, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 82 : 1766-1770). 조밀한 편도선 B-세포제제는 꾸준히 95%이상의 sIg+Bp35+세포를 유지하였다. 이 혈액 B-세포-풍부제제는 60-85% sIg+세포를 보유하였다. B-세포 임파종세포는 배지내로 임파종 세포를 가볍게 자극시킨 뒤에 Ficoll-Hypaque 구배 원심분리에 의해서 단리시켰다.
[모노클로날항체]
Bp50에 대한 G28-5 항체는 BALB/c 마우스를 사람의 E-편도선 임파구로써 면역화시키고 면역비장 세포를 NS-1 골수종 세포와 융합시킴으로써 제조하였다(Kohler 등, 1975, Nature 256 : 495-497 ; Ledbetter 등, 1979, Immunol. Rev. 47 : 63-82). 편도선 B-세포와는 반응하고 T세포와는 반응하지 않는 항체를 분비하는 하이브리드 세포의 배양체를 간접 면역형광(IF)을 사용하고 FACS IV 세포 분류기로 분석함으로써 동정하였다 ; 팬(pan) B-세포마커(예, Bp35)에 대한 공지의 mAb와 유사한 막대그래프 형태를 제공하는 항체로 배양체를 클로닝시켜 다음 연구를 위하여 선별하였다. G28-5 클론은 정상적인 또는 악성종양 B-세포 또는 B-세포주와만 반응하는 IgG1mAb를 생산하였다. 이 연구에 사용된 기타 mAb는 다음의 문헌에 상세히 설명되어 있다 ; 즉(Clark 등, 1985, Proc.Nat.Acad. Sci. USA 82 : 1766-1770 ; Clark 등, 1986, Human Immunol. 16 : 100 ; Ledbetter, 등. 1986, Human Immunol.15 : 30-44 ; Ledbetter, 등, 1985, in Perspectives in Immunogentics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, pp. 325-340). 이 항체들로는 1F5(IgG2a) 항-Bp35, HB10a(IgG2a), 항-HLA-DR, 2C3(IgG1) 항-u체인, G19-4(IgG1) 항-CD3, FC-2(IhG2a) 항-Fc 섭수체 CD16, 및 Paul Martin 박사가 제공한 9.6(IgG2a) 항-CD2(E 섭수체)(Martin, 등, 1983, J. Immunol. 131 : 180)등이 있다. IgG1mAb는 45% 또는 50% 포화 황산암모늄과 DEAE 세파크릴 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 침전시킴으로써 정제하고 Ig G2a mAb는 단백질 A 세포로오스 칼럼을 사용하여 정제하였다. G28-5의 F(ab')2단편은 파르함의 방법에 의해서 제조하고(Parham, 등, 1983, J. Immunol. 131 : 2895)2m 길이의 세파크릴 S200 컬럼에서 정제하여 SDS-PAGE에 의해서 순도를 분석하였다(Ledbetter, 등, 1985, J. Immunol. 135 : 1819). U-체인에 대한 2C3 mAb를 시아노겐 브로마이드 커플링반응을 이용하여 세파로오스 4B비드와 콘쥬게이트(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden).
[플루어리신과 피코에리트린과의 콘쥬게이션]
정제한 mAb를 플루어리신-이소티오시아네트(FITC : Molecular Probes)(녹색)을 사용하여 고딩법(Goding 등, 1976, J. Immunol. Meth. 13 : 215-226)에 의하여 플루어리신과 직접 접합시키거나 SPDP(Pharmacia)를 사용하여 레드베터의 방법(Ledbetter 등, 1985, Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New Youk, 6, 119-129)으로 R-피코에리트린(PE)에 콘쥬게이트시켰다. 임파양 세포를 녹색 및/또는 적색 mAb을 적당히 희석하여 30분 동안 둥근 밑면 마이크로 적정판에서 배양하여 두차례 세척한 다음 FACS IV 세포 분리기에서 분석하였다.
[2색 면역형광]
2색연구는 광선을 분열시키기 위한 560-nm 이색 거울과 적색 및 녹색광배율기 관의 전면에 580-nm 롱패스필터와 540 쇼트패스필터(Ditric Optics, Hudson, MA)를 각각 사용하여 형광 활성화 세포분리기(FACS IV : Becton-Dickinson, Mountain view, CA)로써 수행하였다. 이에더하여 2색 보정기(T. Nozaki, Stanford University)를 이용하여 녹색 및 적색시그날을 보정하였다. 각각의 2가지 색의 염색에 대해, 40,000개의 세포에서 얻은 데이타를 수집하여 플로피디스크에 저장하였다. 데이타는 64×64 도트그리드상에 세포수(수직) 대 로그 녹색형광 대 로그 적색형광으로서 나타낸다. 약 4.5도트는 형광의 중첩을 나타낸다. 비염색 세포는 그리드의 뒷면코너에 위치된다 ; 적색형광은 우측에 녹색형광은 좌측에 있다. 플루어리신과 피코에리트린을 이용한 2색 IF를 위한 본 발명자의 유동 혈계산기에 대해서는 다음문헌 즉, Ledbetter 등, 1985, Perspectives in Immunogentics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-129 및 325-340)에 상세히 기술되어 있다.
[세포배양]
혈액 또는 편도선 임파양 세포를 15% 소의 태아 혈청, 항생제, 글루타민 및 피루베이트(R15)가 보강된 200ul RPMI-1640 배지를 함유하는 96-웰 마이크로적정판에서 4차례에 걸쳐 5-10×105ml 배양하였다. 1-7일 후에 세포를3H 티미딘 0.5uCi/웰(New England Nuclear, 6.7Ci/mmol ; 1Ci-37)로써 18시간동안 펄스시켰다. 그후 세포를 세포배양기를 구비한 유리섬유 필터에서 배양하여 섬광 계수기로써 방사능을 측정하였다. 몇차례 시험에서 항체 또는 인자들을 배양시작후 여러 시간대에 첨가시켰다 : 이들 시험에서 증식을 3일째 되는날 측정하였다.
[공통자극인자]
정제한 BCGF는 Cytokine Technology사(Buffalo, New York)에서 구입하였으며 검색가능한 IL-1, IL-2 또는 인터페론 활성을 나타내지 않았다. 이 BCGF는 Maizel 및 그의 공동연구자의 방법(Maizel 등, 1982, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 79 : 5998)에 의해서 제조하였다. 상기 연구자들은 이 물질의 주요 BCGF 활성은 12-kDa 표본(이후 "BCGF(저분자)"라 칭함)에 존재함을 밝혔다(Mehta외, 1985, J. Immunol 135 : 3298).
정제공정은 실험규모의 DEAE 친화 크로마토그라피를 실시한 다음 히드록실아타라이트 컬럼 크로마토그래피를 실시하는 공정으로 이루어진다. 균일하게 정제한 IL-1은 Steven Dower 박사가 기증하였다(Dower 등, 1985, J. Exp. Med. 162 : 501). 재조합 IL-2는 Cetus Corporation사에 의해서 공급되었다. TPA(12-0 테트라데코노일 포르볼 13-아세테이트)는 시그마사에서 구입하였다.
[세포활성 검색]
mAb 및/또는 인자들에 의해서 유도된 세포량의 변화를 세포분류기와 전방각 빛-산란기(forward angle light-scatter)를 이용하여 측정하였다. 활성화된 세포를 아크리딘 오렌지로 염색하고 세포 분류기를 이용하여 세포의 상대적인 RNA(적색) 및 DNA(녹색) 함량을 측정함으로써 세포의 RNA 및 DNA 농도에 있어서의 세포사이클 변화를 측정하였다. (Darzynkiewicz 등, 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77 : 6697-6702 참고). 세포표면항원의 상대적인 농도변화는 플루어리신과 직접 콘쥬게이트시킨 mAb를 사용하여 검사한 다음 Epics V 세포분류기로써 직접 IF 형광농도를 측정하여 정량하였다.
[Bp50의 생화학적 특성]
표면125I-라벨 편도선 세포로부터의 Bp50의 면역침전은 Ledbetter의 공동연구자가 발표한 방법(Ledbetter외, 1985, J. Immunol. 134 : 4250-4254)에 의해서 수행하였다. 단리된 항원된 환원시키기 않고 10% SDS 폴리아크릴아미드 슬랩 겔 상에서 전기연동시켰다. 겔은 -70℃에서 오토라디오그래피와 사진과 크로넥스(Cronex) 조명보강스크린(Dupon사)을 사용하여 가시화시켰다.
[Bp50의 섭수체의 특성분석]
다음의 소절들은 상기 방법을 이용하여 실시한 실험결과를 설명한 것이다.
B-세포 특이 50 kDa 세포 표면마커인 Bp50의 동정
Bp50에 대한 mAb는 인체편도선 임파구로써 BALB/c 마우스를 면역화시킨다음 NS-1 골수종과 면역비장세포를 융합시킴으로써 제조하였다. 클론 G28-5는 NS-1 라이트 체인을 함유하지 않은 IgG1mAb를 생성시켰다. IF 분석에 대한 검사로 G28-5는 정상 또는 악성종양 B-세포 또는 B-세포주에만 반응한다는 것을 발견하였다. Clark외 공동연구자의 방법(Clark외, 1985, Proc. Nat. Acad.Sci. USA 82 : 1766-1770 : Ledbetter외, 1986, Human Immunol.15 : 30-44 ; Ledbetter, 1985, Perspectives in Immunogenetics and histocompatibility, ASHI, New York, 6, pp. 325-340)에 의한 정상조직의 포괄적인 선별작업으로 G28-5 항체가 혈액 또는 편도선으로부터 얻은 E 로제트 네가티브(Er-)(그러나 나일론을 비접착성 T세포, PHA 유발 T-세포의 아세포는 아님) 또는 혈액과립구, 단핵세포, 적혈구 또는 소판과 반응한다는 사실을 알게되었다. 이것은 시험된 7가지 B 임파아구 세포주 모두와 3가지 버키트(Burkitt) 임파종계(Raji, Daudi, Namalwa)와는 강력하게 반응하였으나, 4가지 T세포주(CEM, HSB-2, JURKAT 및 HPB-ALL)와는 반응하지 않았다. 시험한 모든 만성임파구 백혈병(3/3)과 시험한 B 임파종의 90%(9/10)는 Bp50 마커를 발현하는 반면에 비 T, 비 B CALLA+급성임파구 백혈병은 28%(2/7)만이 Bp50을 발현하였다.
정상조직상의 Bp50의 한정적 분포는 정량적인 2색 면역형광(2색 IF) 분석에 의해서 다시 확인되었다. 팬 B-세포항원 Bp35(B1, CD20)와 플루어리신-콘쥬게이트된 항-50항체(녹색)에 대한 피코에리트린(PE)-콘쥬게이트항체(적색)를 사용하여 Bp50이 혈액 또는 편도선 내에서 Bp35+B-세포에만 발현된다는 사실을 발견하였다(제 1 도). 혈액 B-세포는 편도선 B-세포보다 약간 적게 Bp50을 발현하였다 ; 이것은 또한 혈액 B-세포에서보다 적은 HLA-DR발현(Ledbetter외, 1986, Human Immunol. 15 : 30-44)와 gp54 발현수준(Wang외, 1979. J. Exp.Med. 149 : 1424-1433)과 비슷하다. Bp50은 Percoll 구배상에서 부유성 분획과 조밀한 분획으로 분리된 편도선 B-세포 아개체군에서 비슷한 수준으로 발현되었다. T세포마커, CD3(T3) 및 NK세포관련마커, CD16(FC 섭수체)(Ledbetter 등, 1979, Immunol, Rev. 47 : 63-82)에 대한 본 발명자의 PE-콘쥬게이트 mAb를 사용하여, Bp50이 T세포 또는 NK세포상에서 발현되지 않는다는 사실을 발견하였다. 또한 2색 IF를 사용함으로써 높은 수준의 IL-2 섭수체를 발현하는 CD3+ PHA 아세포가 Bp50을 발현하지 않는다는 사실을 발견하였다.
G28-5 항체는 비환원 조건하에서 약 50Kd정도 이동하는 편도선 임파구상의 단일 폴리펩티드와 반응하였다. 이 분자는 Bp39 또는Bp45와 같이 동일한 분자량 범위내의 전술한 B-세포 마커보다 더 크다(Zipf외, 1983, J. Immunol. 131 : 3064-3072 ; Kitner외, 1981, Nature 294, 458-460 : Clark외, 1986, Leukocyte Typing II, eds. Reinherz외, Springer Verlag, Berlin, 12장, 2권, 155-167 ; Slovin외, 1982, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79 : 2649-2653 ; Thorley-Lawson외, 1985, J. Immunol. 134 : 3007-3012, 및 Fix.2B). 이 겔의 노출시간은 기타 B-세포마커의 분자량이 Bp50과 쉽게 대비될 수 있도록 정한다. Bp39 마커는 Bp50과는 달리 과립구상에서 발현되며 Bp45는 Bp50과는 달리 B-세포의 아세포에 한정된다. Bp39(41-H16)과 Bp45(MNM6, Blast-1, Blast-2)에 대한 항체는 국제워크숍을 통하여 구득된 것으로(Clark 등, 1986, Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, 등. Springer Verlag, Berlin, (2장, 2권, 155-167 참조) B-세포에 플루어리신화된 항-Bp50항체의 결합을 중단시키지 않는다. 따라서, 조직분포, 생화학분석 및 차단연구에 기초할 때 G28-5 모노클로날 항체는 기타 공지된 B-세포 항원과는 분명하다는 50-Kd 구조를 인지한다.
[Bp50의 발현은 B-세포의 한정됨]
조혈조직과 세포계 분포연구 및 상세한 2색 유통 혈구계산 분석으로 Bp50이 B임파구상에만 발현된다는 사실을 알았다. 제 3 도에 도시한 바와같이, Bp50은 혈액임파구의 서브세트와 대부분의 편도선 임파구상에 발현된다. 실제로 혈액과 편도선 모두에 있는 모든 Bp50+세포역시 Bp35와 HLA-DR을 발현시키거나, NK 세포상에서 발견되는 IgG Fc섭수체나 T-세포분자, CD2(제 1 도) 또는 CD3은 발현시키지 않았다. 더구나 ConA-활성화 CD3+T세포의 아세포는 IL-2 섭수체를 발현하였으나 Bp50은 발현시키지 않았다.
2색유동혈구계산으로 2가지 표면항원간의 밀도관계를 정량적으로 측정할수 있다. 본 발명자들은 제 2 여포의 맨틀부위의 조밀한 휴지 B-세포는 IgM과 소량의 Bp35를 발현시키는 반면, 생식중심의 부유성 활성세포는 IgM-네가티브로서 Bp35를 고농도로 발현시킨다는 것을 밝힌 바 있다(Ledbetter 등, Human Immunol. 15 : 30). 제 3 도는 IgM-포지티브 및 IgM-네가티브 B-세포의 서브세트가 동량으로 Bp50을 발현시킴을 나타내며, 이는 Bp50이 생체내 활성화된 B-세포와 휴지기의 B-세포 모두에서 발현됨을 가리킨다.
[항-Bp50 항체에 의한 B-세포의 증식촉진]
전술한 바와 같이 B-세포는 항-u체인 특이항체의 소량투여로도 활성화시킬 수 있다. 본 발명자들은 최근에 B-세포-특이마커 Bp35(BI)인 35-kDa 폴리펩티드 역시 초기단계의 B-세포 활성화에서 어떤 역할을 한다는 사실을 발견하였다. 항-u 항체의 소량투여시와 같이 Bp35에 대한 1F5mAb는 B-세포를 활성화시켜서 세포용량과 RNA 함량을 증가시켜 BCGF와 반응성이 되도록 한다(Clark 등, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 : 1766-1770 : Gollay 등, 1985, J. Immunol. 135 : 3795-3801). 그러므로 항-Bp35 또는 항-u 항체로서 활성화된 B-세포 또는 비처리 B-세포의 증식에 있어 항-Bp50 mAb의 효과를 비교해 보는 것은 흥미롭다(표 1 참조), 용액중의 항-Bp35 또는 적당한 조건하의 세파로스 비드에 결합된 항-u 항체는 단독으로 약간의 B-세포의 증식을 촉진시키며(표1, 1라인참조) 이에비해서 항-Bp50 항체 단독은 증식촉진기능이 없었다. (표1, 2 라인참조). 그러나, 항-Bp50 mAb는 항-u비드 또는 항 Bp35와 배양할때 증식효과가 상당히 촉진되었다. 이와 관련해서 항-Bp50은 BCGF와 유사하다(표1, 3라인 참조). 따라서, 항-Bp50과 BCGF가 다함께 B-세포의 증식을 유발시킬 수 있는지에 대하여 결정하는 것은 중요하다.
표1, 4라인에 예시된 것과 같이 항-Bp50과 BCGF는 함께해서는 증식을 유발시키지 않았다. 그러나 촉진제 단독보다 약간 더 많은 항-u 또는 항-Bp35 활성세포의 증식을 촉진시켰다. 기타 시그날없이 항-Bp50과 같이 사용될 때 3-로그범위의 BCGF는 항-Bp50을 0.1-10㎍/ml 범위로 투여한 경우에 조차 조밀한 B-세포의 증식에 아무런 효과를 나타내지 않았다.
[표 1]
항-Ig 또는 항-Bp35에 유도된 B세포증식의 항-Bp50 항체에 의한 촉진
Figure kpo00001
위 표에서 조밀한 Er-편도선 B-세포(95% 표면 IgM+세포)의 증식은 전술한 바와같이 3일째 되는날에 측정하였다. 간단히 말해서 2×105세포/200 ul웰을 세파로스 비드("항-u비드", 50㎍/ml) 또는 유리된 1F5항-Bp35 항체(5㎍/ml)에 커플링된 u체인에 2C3 모노클로날항체와 함께 또는 항체없이 첨가제를 가한 15% 소의 태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지와 함께 48시간동안 4차례 배양하였다. 배지인 1F5 항-Bp35 항체(5㎍/ml)를 함유하는 배양주는 단독 또는 공통촉진제로서 항-Bp50(1 : 000희석)을 가한 BCGF(5% 최종농도, Cytokine Technology, 버팔로, 뉴욕, IL-1 또는 IL-2 활성이 검출되지 않음)로써 배양하였다. 40시간후에 새로운3H-티미딘과 함께 펄스시키고 18시간후에 혼입된 수를 측정하였다.
B-세포가 항-Bp35 또는 항-u-항체에 의해 활성화된 후에야 항-Bp50 mAb는 증식을 촉진시킴.
표 1의 결과로 항-Bp50 mAb가 그 단독으로는 증식을 유도할 수 없다는 사실을 알 수 있다. 제 4 도에 도시된 바와같이 0.05㎍-2.0㎍/ml 범위의 항-Bp50의 투여량은3H-티미딘 업테이크(uptake)에 대해 아무런 영향을 나타내지 않는다. 50,000-70,000cpm 정도로 많은 양을 사용하므로써 고도로 정제된 B-세포를 항-Bp35+ 항-Bp50만으로 배양될때 최고적합한 증식시간을 결정할 수 있다. 지속적인 관찰결과 항-Bp50을 더 많은 양으로 투여하면(2-5㎍/ml 보다 많은) 100-200ng 범위로 투여할 때보다 더 효과가 낮다는 사실을 알았다.
이와 같은 결과로부터 B-세포가 기타 시그날에 의해서 활성화된 후에만이 항-Bp50가 작용한다는 사실을 알 수 있다. 제 5 도에 나타낸 데이타는 이것이 사실이라는 것을 시사해 주고 있다. 만약 B-세포가 먼저 항-Bp35로써 활성화된다면 항-Bp50은 24-48시간후에도 첨가시킬 수 있었으며, 4일째 되는날까지도 여전히 증식을 촉진시킬 수 있을 것이다. 이에 대하여 세포가 항-Bp50으로 먼저 처리된다면 항-Bp35는 배양 시작후에 몇시간내에 첨가될 때만이 유효하다. 항-Bp35외에 항-u를 사용할 때 이와 유사한 결과가 나타났다.
항-Bp50 mAb는 B-세포를 G0단계로부터 활성화시키지는 않지만 활성화된 B-세포를 유도하여 세포사이클을 진행시키도록 만든다.
앞서, 본 발명자들은 소량의 항-u 항체와 같이 항-Bp35는 G0내의 휴지 편도선 B-세포를 확장시켜(Clark 등, 1986, Leukocyte Typing II, eds., Reinherz등, Springer Verlag, Berlin, Vol.2, 455-462) 세포사이클의 G1상태로 들어가도록 유도한다는 사실을 발견하였다(Gollay 등, 1985, J. Immunol.135 : 3795-3801). 그래서 B-세포 활성화에 미치는 항-Bp35 mAb대 항-Bp50의 효력을 비교하는 것은 관심을 끌어왔다. 제 6a 도에 도시된 바와같이 배양후 3-4일이 지나도 자극되지 않은 편도선 B-세포는 G0상태에 잇는 세포와 동일한 RNA 특성을 가졌다(Darzynkiewicz, 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77 : 6697-6702). 그러나, 항-Bp35 또는 항-u로써 활성화시킨 세포의 약 15-30%는 RNA 함량이 증가되었으며 이는 G1단계로의 유입을 가리킨다. 이에비하여 항-Bp50(제 6b 도)이나 BCGF(제 6c 도) 단독으로는 상당량의 B-세포가 G1으로 들어가는 것을 유도하지는 않는다. 예를들면 활성화시킨 후 2일째 되는날 항-Bp35와 항-Ig mAb는 각각 편도선 세포의 13.5%와 20.9%를 G1로 들어가도록 유도한반면 항-Bp50(2.7%) 또는 BCGF(3.2%)만으로 처리된 세포는 배지 대조군수준(2.2%)에 머물러 있다. 그러나, 항-Bp50 또는 BCGF를 항-Bp35 또는 항-u항체와 함께 첨가시킬 때는 G1으로 들어가는 세포의 비율은 극적으로 증가하였다. 이와 유사하게, 항-Bp50과 BCGF 단독으로는 B-세포를 S 단계로 들어가도록 유도하지 못하였다(표 2 참조). 그러나 항-Bp35 또는 항-u를 함께 사용하면 S 단계의 세포수가 2-3배정도 증가하였다.
[표 2]
편도선 임파구의 세포사이클의 진행에 있어 항-Bp50과 BCGF의 효과
Figure kpo00002
상기 표에서 G0, G1또는 S 및 G2상태의 세포의 백분률(%)은 아크리딘 오렌지색 염색방법을 이용하여 측정하였다(Darzynkiewicz, 등, 1980 Proc.Nat.Acad. Sci.USA 77 : 6697-6702) ; 항-Bp35(5㎍/ml), 비드상의 항-u(50㎍/ml), 항-Bp50(0.4㎍/ml), B CGF(5%) 또는 이들의 혼합물과 1×105조밀한 편도선 임파구.
[항-Bp50 항체에 의해 B-세포증식을 촉진시키기 위한 최적조건]
Bp50 단독에 대한 항체는 조밀한 휴지 B-세포에 대하여 거의 또는 전혀 영향을 주지 않는다(표3 참조). 그러나 항-Ig, 항-Bp35 및 TPA와 같이 B-세포를 활성화시킬 수 있는 시약의 존재하에서는 항-Bp50 mAb는 분명히 증식을 촉진시켰다. 항-Bp50은 정체된 IL-1, 재조합 IL-2의 BCGF(low)등과 같은 여러가지 인터류킨과 함께 활성화시키지 않았다. 항-Bp50의 효과를 BCGF(low)의 것과 비교하면 항-Bp50과 공통자극적인 동일시약 역시 BCGF와 공통자극적인임을 알수 있다(표 3 참조). 그중에서도 흥미로운것은 BCGF와 항-Bp50은 함께해서도 여전히 휴지세포에 대해 공통 촉진적이지 않았다는 것이다.
[표 3]
항-Bp50은 항체 또는 B-세포성장인자에 대한 B-세포증식의 촉진
Figure kpo00003
상기 표 3에서, 조밀한 Er-편도선 B-세포(＞95%, slgM+세포)는 계수하기전에 48시간동안 2×105세포/웰을 배양한 후 24시간동안3H-티미딘으로 펄스시켰다.
항-Bp50에 의해서 촉진된 증식에 대한 동력학을 제 7 도에 나타내었다. 증식의 절정은 4일째 되는날에 일어났으며 그후 세포가 항-Ig 또는 TPA와 같은 항-Bp35 또는 기타 활성제로써 활성화되었는지의 여부에 관계없이 감소되었다. BCGF 또는 항-Bp50에 의해서 촉진된 증식에 대한 동력학은 위와 유사하였다.
항-Bp50 항체는 0.05㎍정도의 소량으로도 증식을 촉진시켰다. 최적 투여량 0.3㎍/ml를 다음 연구에 사용하였다. 계속적인 관찰로 전체 항체분자를 사용할 때 항-Bp50을 더 많이 투여하면(2-5㎍/ml보다 많이) 0.1-5.0㎍/ml 범위로 투여할때 보다 더 효과가 적다는 사실을 알았다.
인체 B-세포는 표면 Ig에 결합하는 항체의 Fc 섭수체에 의하여 조정된 억제효과에 특히 예민하였다(Parker, 1980, Immunol. Rev. 52 : 115 ; Bijsterbosch등, 1985, J. Exp. Med. 162 : 1825). 따라서 전체 항-Bp50 mAb의 영향력과 항-Bp50 F(ab')2단편의 영향력을 서로 비교하는 것이 중요하다. 투여량범위가 100배가 넘으면 F(ab')2단편은 B-세포증식을 촉진시키는데 있어 전체 항체만큼 효과적이거나 또는 효과가 더 크다(표 4 참조). 따라서, 항-Bp50 mAb의 Fc 영역은 항-Bp50이 그의 그 효과를 나타내는데 필요하지 않으며 만약 효과가 있다면 억제하는 것일 것이다. 다시말하면 BCGF와 같이, 항-Bp50은 Fc 섭수체 조정보조세포기능의 협조없이 가능성 중개자로서 작용할 수 있다.
[표 4]
항-Bp50 항체의 Fc 영역은 B-세포증식을 촉진시키는데 필요하지 않다.
Figure kpo00004
세포배양조건은 표 3에서 설명한 것과 같다.
[항-Bp50 활성과 BCGF(저분자) 활성의 차이]
항-Bp50과 BCGF(저분자)는 B-세포에 대하여 비슷한 효과를 가지며 동일한 시약에 대하여 공통 촉진적이다(표 3). 그러나 여러가지 계통의 증거는 이 연구에 사용된 항-Bp50과 BCGF가 분명히 서로 다른 시그날을 통하여 작용한다는 것을 가리킨다. 첫째로 BCGF(저분자) 섭수체(Bijsterbosch등, 1985, J. Exp. Med. 162 : 1825)와는 달리 Bp50 분자는 휴지기의 혈액 B-세포상에서 발현된다(제 3 도 참조). 둘째로, 항-Bp35 또는 항-Ig를 첨가한 후에 첨가시킬 때 항-Bp50과 BCGF(저분자)는 가장 효과적인 기능을 발휘하지만 항-Bp50은 시작된 후 12시간후에 첨가시킬 때 분명히 최적의 효과를 나타냈다. 이에비하여 BCGF(저분자)는 배양이 시작된지 24시간후에 첨가시킬 수 있으며 증식을 최대로 촉진시킨다(제 8b 도 참조), 하우어드와 폴리 방법을 이용하여(1983, Ann. Rev. Immunol. 1 : 307) 설계된 이들의 동력학적 실험으로 Bp50-종속 시그날은 통상 BCGF에 앞서 그 효과를 발휘할 수 있다는 사실을 시사해주고 있다.
항-Bp50과 BCGF(저분자)는 항-Bp35 또는 항-Ig로써 활성화된 B-세포의 증식을 촉진시켰다(표 3 참조). 그러나 항-Bp50 또는 항-Ig(저분자)의 효과는 여러차례 실험에서 가산적으로 나타났다(제 7 도 참조). 제 9 도는 항-Bp50을 최적의 농도(0.2㎍/ml)로 사용한 실험에서의 BCGF(저분자)의 적정량을 보여준다. BCGF(저분자)는 항-Ig 또는 항-Bp35로 활성화시킨 후 항-Bp50의 존재하에 휴지기의 B-세포증식을 더욱 촉진시킬 수 있었다. BCGF(저분자)의 최적농도는 5-10%인 반면에 25%는 억제적이었다. 그러므로, 항-Bp50과 BCGF(저분자)가 이들의 최적농도로 사용될 때 이들은 B-세포의 증식에 가산적인 효과를 나타냈다.
마지막으로, 정상 및 악성종량 B-세포의 서브세트는 항-Bp50과 BCGF(저분자)에 대한 그들의 반응에 있어 차이가 있었다. 예를들면 몇몇 혈액 B-세포는 BCGF(저분자)에 반응하지만 항-Bp50에는 반응하지 않는다(표 5 참조). 항-Bp35(표 5) 또는 TPA(제 10 도와 같은 가산적인 활성시그날은 혈액 B-세포를 항-Bp50와 반응시키는데 꾸준히 필요하였다. 일반적으로 조밀한 편도선 B-세포는 BCGF 또는 항-Bp50와 반응하지 않는 한편 부유성 B-세포는 반응하였다(표 5 참조). 또한 B-세포 악성종양은 BCGF 대 항-Bp50에 대한 그들의 반응성에 있어서 다른점이 있다. 예를들면 몇가지 B-세포 임파종은 TPA+BCGF(저분자)에 반응하지만 TPA+G28-5 항-Bp50에는 반응하지 않는다(제 10b 및 d 도 참조). 이에 비하여 조밀한 편도선 B-세포와 말초혈액 B-세포는 TPA-BCGF(저분자) 또는 항-Bp50에 반응하였다(제 10a 및 c 도 참조).
[표 5]
B-세포 서브세트는 항-Bp50 또는 BCGF에 대한 그들의 반응성이 다름
Figure kpo00005
표 5에서 세포배양조건은 표 1에 기재된 것과 같다. 혈액 나일론을 접착임파구(B세포+단핵세포)는 자극시키기 전에 플라스틱 접시상에서 한밤동안 배양시켜 단핵세포를 감소시켰다(실시예 1 및 2참조) 실시예 3에서 혈액 E-임파구는 자극시키기 전에 1시간동안 플라스틱 접시상에서 배양하여 단핵세포를 제거시켰다. 편도선 Er--임파구를 Percoll 구배를 이용하여 조밀한(펠릿) 또는 부유성(유분1) 서브세트(32)으로 분류하였다.
[항-Bp50 배위자와 Bp50의 용도]
본 발명의 배위자는 생체내에 또는 생체외에 면역반응을 조절하기 위하여 변형되지 않은 또는 변형된 형태로 사용될 수 있다. 예를들면 배위자 그 자체를 백신에 대한 면역반응을 증가시키기 위하여 또는 면역억압된 개체의 면역반응을 증가시키기 위하여 "매체"로서 사용할 수 있다. 별법으로 만약 세포독소 또는 항증식제를 배위자에 커플링시킨다면, 이들 변형된 배위자들은 예를들어 자기면역질환이나 또는 이식환자에 있어서 조직이식거부를 방지하기 위하여 면역반응을 저하시키는데 사용될 수 있다. 변형된 배위자는 그 악성질환이 B-세포에 기원하는지의 여부에 관계없이 Bp50 항원을 발현하는 세포 또는 종양에 의한 악성질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 배위자와/또는 Bp50 그 자체는 시험관내에 사용될 수 있다. 이러한 응용은 Bp50 항원을 발현하는 세포를 발견하고/또는 확산 Bp50 항원(체액중에 있다면)을 발견하기 위한 면역분석과 같은 시험관내 분석등에 응용된다. 그 예로서 배위자 또는 Bp50은 방사능라벨, 광물질, 효소, 효소물질, 염로등으로 라벨을 붙일 수 있다. 이에 더하여, Bp50항원을 발현시키는 세포를 분리 및/또는 동정하는데 이 배위자를 이용할 수 있으며, 이 경우, 배위자를 고정상 지지체나 또는 FACS(형광 활성화 세포 분류기)에 사용될 수 있는 형광물질에 커플링 시킬 수 있다.
본 발명의 배위자와 Bp50의 여러가지 용도에 대해서는 다음에 상세히 논하기로 한다.
B-세포증식을 촉진시키기 위한 항-Bp50과 같은 배위자의 용도 및 Bp50 섭수체
종래의 연구에서는 B-세포를 세포사이클의 G0로부터 G1단계로 유도하는데 관련된 인자들은 S단계로 들어가기 위한 인자 또는 요소와는 다르다고 제안되었다. 이러한 모델은 소량의 항-Ig B세포 활성화 인자나, 항-Bp35 단독으로는 B-세포증식에 거의 또는 전혀 효과를 미치지 않는다는 연구에 기초한 것이다. 그러나, 이와 같은 시약은 B-세포들을 세포활성화에 있어서 이들의 성장인자에 감작되는 지점까지 유도할 수 있다. 이에 비하여 BCGF 또는 IL-2와 같은 성장인자는 단독으로는 휴지 B-세포에 아무런 영향을 끼치지 않지만 활성화된 B-세포의 성장을 촉진시킨다.
본 발명을 어떤 이론 또는 설명에 한정시키는 것은 아니지만 여기에 나타난 결과는 B-세포의 활성화와 성장단계가 분명히 서로 다르게 조절된다는 이론을 가산적으로 뒷받침해준다. 여기서 본 발명자들은 인체 B-세포에 있어서의 활성화 및 증식 시그날이 서로 다른 세포 표면구조를 통하여 전달될 수 있음을 보여준바 있다. 비록 항-Bp35 mAb는 단독으로 B세포를 세포사이클의 G1단계로 들어가도록 활성화시키기는 하지만, 증식은 거의 또는 전혀 시키지 않았다. 항-Bp50 mAb는 반대효과를 나타냈다 ; 즉, 이것은 B-세포를 활성화시키지 않았지만 활성화 후 12-24시간 후에 첨가시킬 때 조차 B-세포성장을 유도할 수 있었다.
일반적으로 Bp50 분자는 가용성 성장인자와 같은 배위자에 대한 섭수체나 세포-세포접촉을 통하여 매개되는 시그날(즉, 또다른 세포의 표면상에서 발견되는 배위자)에 대한 섭수체로서 기능을 할 수 있을 것이다. 종전의 연구에서 항-Bp50과 같은 T세포-유도된 BCGF가 B-세포 증식을 촉진한다는 것이 동정되었다. B-세포 성장인자의 고분자 및 저분자 형태가 모두 동정되었으며 상이한 유형이 가산적인 효과를 갖는다는 것이 밝혀졌다(Kehrl외, 1984, Immunol, Rev. 18 : 75-96 ; Kishimoto, 1985, Ann. Rev. Immunol. 3 : 133-157 ; Swain 외, 1983, J. Exp. Med. 158 : 822-835 : Howard 외, 1984, Immunol. Rev. 78 : 185-210 ; Ambrus 외, J. Clin. Inverst. 75 : 732-739 : Ambrus, 1985, J. Exp. Med. 162 : 1319-1335). 따라서, Bp50은 이들 인자들 중의 한가지에 대한 섭수체일 수 있다.
IL-2 섭수체와 C3d 섭수체를 제외하고는, 성장 시그날에 대한 B-세포상의 섭수체는 아직 확인되지 않았다. mAb AB-1은 활성화된 B-세포상에만 발현된 B-세포마커와 반응하고 BCGF-의존성증식을 차단시키므로, BCGF 섭수체 또는 관련구조를 인식할 수 있다. AB-1 mAb는 G28-5 항-Bp50 항체의 결합을 중단시키지 아니하며 G28-5 mAb와는 달리 활성화된 B-세포와만 반응하므로(Jumg, 등, 1984, J. Exp. Med. 160 : 1919-1924) Bp50은 AB-1 마커와는 다른 것으로 보인다. Bp50은 모든 B-세포상에 있고, 흡수분석과 직접 결합분석을 근거로 할 때 BCGF 섭수체와는 경우가 다른 것으로 나타난다. 본 발명자의 최근 데이타는 Bp50과 저분자량의 BCGF에 대한 섭수체가 서로 다른 구조를 가짐을 가리킨다. 토끼의 헤테로 항 혈청을 이용하여 Wang과 그의 공동연구자(Wang 1979, J. Exp. Med. 149 : 1424-1433)는 54-kDa 당단백질인 gp54가 Bp50과 마찬가지로 모든 B-세포상에서 발현되나 그 발현정도는 편도선 B-세포에서 보다는 혈액 B-세포에서 더 낮다고 기술한 바 있다. 토끼의 헤테로 항 혈청과 항-Bp50은 동일한 구조나 또는 관련된 구조를 인지할 수도 있겠으나 그다지 있음직한 일은 아니다 ; 항-Bp50은 mAb와는 달리 gp54에 대한 토끼의 항 혈청은 단독으로도 B-세포증식을 촉진시키는데 충분하였다.
항-Bp50는 달리 항-Bp35는 단독으로 B-세포를 G0에서 G1로 활성화시킬 수 있다. 그러므로 "활성화" 시그날이라고 말할 수 있다. 항-Bp35 항체는 몇가지 B-세포가 분화되도록 자극시킬 수 있으므로 이것이 초기 B-세포 활성화에만 작용하는지의 여부는 아직 불명확하다(Clark 외, 1985, Proc. Nat. Acad, Sci. USA 82 : 1766-1770). 이와 마찬가지로 Bp50 역시 "성장" 시그날로서만 작용한다고는 할 수 없다 : 항-Bp50 항체는 활성화 시그날(항-Bp35 또는 항-u)과 함께하여 증식을 촉진시킬 뿐만 아니라 G1단계로 들어가는 B-세포의 총수도 증가시킨다(표 2 참조). 다시말하면 공통 촉진제로서의 항-Bp50은 세포사이클의 활성화(G0에서 G1로) 및 성장(G에서 S로) 단계의 진행을 모두 촉진시키는 작용을 한다. 또한 이들 연구에 사용된 BCGF는 유사한 활성도를 갖는다(제 6c 도). 따라서 항-Bp35와 항-Bp50(또는 BCGF)는 섬유아세포 성장조절의 연구에서 설명된 "컴피던스" 및 "진행"인자에 가장 비슷한 것으로 나타난다. B-세포가 항-Bp35 또는 항-Bp50에 반응하는 방법은 그들의 분화 또는 활성화의 상태에 따라 분명히 달라진다.
여기서 본 발명자들은 두가지 mAb, 즉 항-Bp35("컴피턴스"시그날)와 항-Bp50("진행"시그날)이 함께 항원 또는 기타 공지의 인자들의 부재하에서 고도로 정제왼 B-세포를 실질적으로 증식시키도록 유도할 수 있음을 증명하였다. 이들 구조에 대한 천연배위자는 아직 알려져 있지 않다. 그러나, 적합한 에피토프에 대한 mAb는 가용성 인자와 세포-세포 상호반응에 의해 매개되는 시그날 모두를 모방할 수 있으므로 인체 B-세포의 증식 또는 분화를 지향 및 조절하는 mAb를 적절히 배합하여 사용할 수 있다. 이것은 B-세포 악성종양, 면역결핍증 및 어떠한 자기면역질환과 같은 사람의 질병을 제어하기 위한 생체내 전략을 세우는데 도움이 된다.
인체 B-세포의 표면에 발현된 약 50Kd의 단일가닥 폴리펩티드와 반응하는 새로운 모노클로날 항체인 G28-5는 활성화된 B-세포의 증식을 촉진할 수 있는 본 발명의 배위자의 특수한 예에 불과하다. 인체 B-세포의 증식은 저분자 및 고분자량의 BCGF를 포함하여 T-세포유도된 BCGF에 의해서 유사하게 촉진될 수 있으므로 본 발명자들은 주로 저 분자량의 BCGF를 함유하는 BCGF 제제와 항-Bp50 G28-5의 활성을 비교하였다. 항-Bp50 G28-5 및 BCGF(저분자)는 이들이 동일한 활성화제(항-Ig, 항-Bp35 및 TPA)와는 공통 촉진적이지만 서로 또는 IL-1 또는 IL-2와는 공통 촉진적이지 않다는 점에서 매우 유사하였다. 더우기 항-Bp50 G28-5의 활성은 G28-5의 F(ab')2단편이 기능면에서 활성이기 때문에 그의 Fc 영역에는 의존하지 아니하였다. 이것은 가용성 BCGF와 같이 가용성 항-Bp50이 효과를 나타내기 위하여 Fc-섭수체를 산생하는 보조세포를 필요로하지 않는다는 것을 암시해주고 있다. 또한 항-Bp50과 BCGF 모두는 활성화 촉진제의 존재하에서만 효과가 있다. 다시말하면 항-Bp50과 BCGF는 "컴피던스" 인자가 아니며, 그보다는 세포사이클을 통한 B-세포의 "진행"을 촉진시킨다.
Bp50은 B-세포 성장인자와 같은 배위자에 대한 섭수체로서의 기능을 가질 수 있는 한편 몇가지 결과는 Bp50이 적어도 본 연구에 사용된 BCGF(저분자)에 대한 섭수체는 아님을 시사하고 있다 : Bp50은 혈액 B-세포상에서 발현되는 반면에 BCGF(저분자) 섭수체는 발현되지 않는 것이 분명하다. 또한 Bp50과는 달리 BCGF(저분자) 섭수체에 대한 대표적 구조는 활성화된 B-세포에서만 발현된다. 더우기 정상 및 악성종양 B-세포군은 모두 항-Bp50 대 BCGF(저분자)에 대한 반응성에 있어 차이가 있다(표 5와 제 10 도 참조). 예를들면, 몇몇 B 임파종은 BCGF(저분자)에 반응하여 증식하지만 항-Bp50에는 반응하지 않는다. 최종적으로 여러차례의 실험에서 항-Bp50과 BCGF가 함께 했을 때의 최적농도는 이들이 각각 단독인때 보다 더 증식을 촉진시켰다. 항-Bp50은 항-IgM과 공통-촉진적인 BCGF(고분자)와 같은 기타 BCGF의 활성을 모사한다(Ambrus 외, 1985, J. Exp. Med. 162 : 1319 : Ambrus 등, 1985, J. Clin. Invest. 75 : 732). 이것은 Bp50이 BCGF(고분자)에 대한 섭수체로서 작용할 수 있음을 암시해 주고 있다.
Bp50이 가용성 배위자에 대한 섭수체일 수 있는 한편, 별도로 Bp50은 BCGF 섭수체의 농도 및/또는 오토크린 생산을 조절하는 세포-세포매개 시그날에 대한 섭수체로서도 기능을 발휘할 수 있다. 오토크린-섭수체 경로의 확장제로서 역할을 하는 분화항원에 대한 우위는 T세포 연구결과에서 비롯된다. Lp220 일반백혈구 항원에 대한 MAb는 활성화된 T세포상에의 IL-2 섭수체 발현을 상승시킴으로써 증식을 촉진시킨다(Ledbetter 외, 1985, J. Immunol. 135 : 1819). 항-Bp50과 특수 BCGF 섭수체의 발현에 있어서도 유사한 메카니즘이 작용할 수 있을 것이다. Bp50 및 BCGF(저분자)는, IL-1 및 IL-2 섭수체와 같이, BCGF가 특정한 백혈병 세포상에서 Bp50의 발현을 촉진시키므로 어떤 동위조정하에 있다. 또한 Bp50 분자는 IL-2 생산에 영향을 끼칠 수 있는 Tp44 분자와 유사성을 갖는다. 본 발명자들과 다른 사람들은 9.3 항-Tp44항체가 항-CD3 또는 TPA에 의해서 활성화된 T세포의 증식을 촉진시킨다는 사실을 보인 바 있다(Ledbetter 외, 1985, J. Immunol. 135 : 2331 : Hara 외, 1985, J. Exp. Med. 161 : 1513). 이와 마찬가지로 항-Bp50은 항-Bp35 또는 TPA에 의해서 활성화된 B-세포의 증식을 촉진시킨다. Tp44 시그날은 T세포의 성장을 촉진시킴에 의하기 보다 IL-2 성장을 촉진시킴으로써 기능을 발휘한다. Bp50 시그날은 아마도 B-세포의 오토크린 생성을 촉진시킴으로써 유사한 방법으로 기능을 발휘할 수 있다고 추측된다(Gorden 외, 1984.Nature, Loud. 310 : 145).
[악성종양의 치료 또는 면역억압용으로 사용되는 변형배위자]
본 실시예에 따라서 Bp50 항원을 발현시키는 세포를 사멸시키기 위해 본 발명의 배위자에 항증식체를 부착시켜 이를 변형시킬 수 있다. 이렇게 변형된 배위자는 B-세포의 증식을 억압하기 위하여 자기면역증을 치료하는데 사용될 수 있으므로 자기면역 반응을 억제시킬 수 있다. 또한 이들 변형배위자는 조직이식의 거부반응을 예방하기 위하여 이식환자를 면역억압시키는데 사용할 수도 있다. 따라서 면역반응을 억압시키는데 사용되는 세포독소제를 본 발명의 배위자에 결합시킬 수 있다. B-세포의 중식을 촉진시키는 배위자를 사용하면, 그 약제가 B-세포를 증식시키는데 지향될 것이기 때문에 그 효과가 증가될 것이다.
또다른 실시예로 항증식제를 결합시킴으로써 변형시킨 본 발명의 배위자를 Bp50 항원을 발현하는 세포 또는 종양과 관련된 악성종양을 치료하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 배위자에 이들 화학요법제를 결합시키면 악성종양세포에 대한 아주 우수한 약제를 얻을 수 있다. 더우기 비증식세포 보다 증식하는 세포를 사멸하는데 더 효과적인 세포 독소에 결합된 배위자를 이용하여 B-세포 악성종양을 치료할 경우 유리한 효과가 얻어진다 : 이러한 배위자로써 치료하면 세포독소의 작용을 배가시키게 된다. 따라서, 본 발명의 배위자에 결합될 수 있는 항증식제 또는 화학요법제는 Goodman과 Gilman에 의해서 유도된 것으로 표 6에 기재된 시약을 포함한다(그러나 이에 한정되는 것은 아님)(Goodman 및 Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 제 6 판, MacMillan Publishing Co., Inc, New York, pp.1249-1313, 1980 참조).
[표 6]
Figure kpo00006
Figure kpo00007
화학요법 또는 항증식제에 배위자를 결합시키는데 본 기술분야에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 이와 같은 방법의 실시예는 이미 여러가지 곳에서 예시되어 있다.
[배위자 및 Bp50의 기타용도]
치료적 이용에 부가하여 배위자와 Bp50 그 자체는 시험관내와 생체내의 진단분석, 분리기구 등의 기타 용도를 갖는다.
Bp50 섭수체는 본 발명의 배위자를 제조하고/또는 설계하는데 사용할 수 있다. 또한 Bp50은 샘플중에서 검색된 Bp50의 양을 정량하기 위한 표준치가 필요로되는 시험관내 분석에 있어서 본 발명의 배위자와 함께 사용될 수 있다. 결국 Bp50 그 자체는 예컨대 림포카인과 함께 면역성을 매개하는 가용성 인자로서 사용할 수 있다.
치료방법 및 진단분석 등과 같은 용도에 부가하여 본 발명의 배위자는 Bp50 항원을 발현하는 세포를 확인 또는 분리시키는데 사용될 수 있다. 이에 더하여 적당한 방사능라벨 또는 방사능불투과 화합물이 배위자에 결합된 경우 이 배위자는 Bp50 항원을 발현하는 종양을 생체내에서 이미지하는데 사용될 수 있다. 기타 용도는 상기 설명으로부터 기술분야에 숙련된자들에게 분명하게 될 것이다. 세포주의 기탁.
다음의 하이브리도마는 1987년12월11일자 한국과학기술원(KCTC)에 기탁되고 미합중국 메릴랜드주 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬추어콜렉션(ATCC)에 기탁되어 다음의 기탁번호를 부여받았다. 즉,
하이브리도마 KCTC(기탁번호(괄호안은 ATCC기탁번호임)
G28-5 KCTC 8325P(HB 9110)
기탁된 하이브리도마는 본 발명의 한가지 특징을 단순히 예시하기 위한 것이므로 본 발명을 기탁된 하이브리도마의 범위로 한정시키는 것은 아니며 기능적으로 대등한 어떤 세포주라도 본 발명의 범위내에 속한다. 상술한 것에 부가하여 본 발명의 여러가지 개선은 전술한 상세한 설명과 첨부된 도면으로부터 본 기술분야에 숙련자들에 의하여 명백해질 것이며 이러한 개선은 발명의 범위내에 속한다.
B-세포의 증식을 촉진시키는 방법 및 배위자

Claims (50)

  1. 모노클로날 항체 G28-5에 의해 규정되는 50킬리달톤 B-세포표면 항원인 Bp50에 결합하는 것이 특징인 순수한 배위자.
  2. 모노클로날 항체 G28-5에 의해 규정되는 순수한 50킬로달톤 B-세포표면 항원.
  3. 제 2 항에 있어서, 폴리펩티드로 구성된 것이 특징인 순수한 50킬로달톤 항원.
  4. 모노클로날 항체 G28-5에 의해 규정되는 50킬로달톤 B-세포표면 항원인 Bp50에 결합하는 배위자의 유효량으로 활성화된 B-세포를 처리함으로써, 활성화된 B-세포가 세포사이클을 진행하도록 하여 증식을 촉진시킴을 특징으로 하는 B-세포의 증식을 촉진시키는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, B-세포를 35킬로달톤 B-세포표면 항원인 Bp35에 결합하는 제 2 배위자의 유효량으로 처리하여 활성화시킴으로써 B-세포를 세포사이클의 G0에서 G1단계로 진행시킴을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 생체내에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 시험관내에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 배위자가 Bp50에 결합하는 항체분자, 또는 Bp50 결합하는 항체분자의 Fv, Fab, F(ab')2또는 Fab' 부분으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 배위자가 Bp50에 결합하는 모노클로날 항체분자 또는 Bp50에 결합하는 모노클로날 항체분자의 Fv, Fab, F(ab')2또는 Fab' 부분으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 모노클로날 항체분자가 KCTC 8325P(ATCC 기탁번호 제HB9110호)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 G28-5 또는 그의 Fv, Fab, F(ab')2또는 Fab' 부분으로 구성된 것이 특징인 방법.
  11. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 배위자가 림포카인으로 구성된 것이 특징인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 림포카인이 B-세포 성장인자로 구성된 것이 특징인 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 림포카인이 세포표면상에 있는 것이 특징인 방법.
  14. 제 5 항에 있어서, 제 2 배위자가 Bp35에 결합하는 항체분자인 것이 특징인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, Bp35에 결합하는 항체가 모노클로날 항체인 것이 특징인 방법.
  16. 제 5 항에 있어서, 활성화된 B-세포를 Bp35에 결합하는 제 2 배위자에 의해서 활성화시킨후 약 12시간내에 Bp50에 결합하는 배위자로써 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 항증식제와 커플링되어 있고 Bp50에 결합하는 배위자의 유효량을 사용하여 Bp50을 발현시키는 세포를 처리함을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 G28-5에 의해 규정되는 50킬로달톤 B-세포표면 항원인 Bp50을 발현시키는 세포의 증식을 억제하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, Bp50을 발현시키는 세포가 B-세포로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, Bp50을 발현시키는 세포가 악성종양 세포로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서, 생체내에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 17 항에 있어서, 시험관내에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 17 항에 있어서, 배위자가 항체분자 또는 그 항체분자의 Fv, Fab, F(ab')2또는 Fab' 부분으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 항체분자가 모노클로날 항체분자 또는 그 모노클로날 항체분자의 Fv, Fab, F(ab')2또는 Fab'부분으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 모노클로날 항체가 KCTC 제8325P(ATCC 기탁번호 제HB9110호)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 G28-5 또는 그의 Fv, Fab, F(ab')2또는 Fab'부분으로 구성된 것이 특징인 배위자.
  25. 제 17 항에 있어서, 배위자가 림포카인으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 림포카인이 B-세포성장인자로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 17 항, 22항, 또는 제 25 항에 있어서, 항증식제가 알킬화제로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 17 항, 22항, 또는 제 25 항에 있어서, 항증식제가 항대사제로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 17 항, 22항, 또는 제 25 항에 있어서, 항증식제가 항생제로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 17 항, 22항, 또는 제 25 항에 있어서, 항증식제가 빈카 알칼로이드로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 17 항, 22항, 또는 제 25 항에 있어서, 항증식제가 효소로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 17 항, 22항, 또는 제 25 항에 있어서, 항증식제가 백금 배위결합 착염으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 17 항, 22항, 또는 제 25 항에 있어서, 항증식제가 방사능 동위원소로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 1 항에 있어서, 활성화된 B-세포에 결합한 다음에는 활성화된 B-세포가 세포사이클을 진행하도록 자극하여 B-세포의 증식을 촉진시킴을 특징으로 하는 순수한 배위자.
  35. 제 1 항 또는 34항에 있어서, 배위자가 항체분자 또는 그의 Fv, Fab, F(ab')2또는 Fab'부분으로 구성된 것이 특징인 배위자.
  36. 제 35 항에 있어서, 항체분자가 모노클로날 항체분자 또는 그의 Fv, Fab, F(ab')2또는 Fab'부분으로 구성된 것이 특징인 배위자.
  37. 제 36 항에 있어서, 모노클로날 항체분자가 KCTC 제8325P(ATCC 기탁번호 제HB9110호)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 G28-5 또는 그의 Fv, Fab, F(ab')2또는 Fab'부분으로 구성된 것이 특징인 배위자.
  38. 제 1 항, 또는 34항에 있어서, 배위자가 림포카인으로 구성된 것이 특징인 배위자.
  39. 제 38 항에 있어서, 림포카인이 B-세포 성장인자로 구성된 것이 특징인 배위자.
  40. 제 38 항 또는 39항에 있어서, 림포카인이 세포표면상에 있는 것이 특징인 배위자.
  41. 제 1 항, 34항, 또는 38항에 있어서, 배위자는 그에 커플링된 화합물을 함유하는 것이 특징인 배위자.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 화합물이 항증식제로 구성된 것이 특징인 배위자.
  43. 제 41 항에 있어서, 상기 화합물이 알킬화제로 구성된 것이 특징인 배위자.
  44. 제 41 항에 있어서, 상기 화합물이 항대사제로 구성된 것이 특징인 배위자.
  45. 제 41 항에 있어서, 상기 화합물이 항생제로 구성된 것이 특징인 배위자.
  46. 제 41 항에 있어서, 상기 화합물이 빈카 알킬로이드로 구성된 것이 특징인 배위자.
  47. 제 41 항에 있어서, 상기 화합물이 효소로 구성된 것이 특징인 배위자.
  48. 제 41 항에 있어서, 상기 화합물이 백금 배위결합 착염으로 구성된 것이 특징인 배위자.
  49. 제 41 항에 있어서, 상기 화합물이 방사능 동위원소로 구성된 것이 특징인 배위자.
  50. 제 41 항에 있어서, 상기 화합물이 형광 화합물로 구성된 것이 특징인 배위자.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4443427A (en) * 1982-06-21 1984-04-17 Sidney Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibody
EP0117705A3 (en) * 1983-02-24 1985-09-25 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibody specific for monocytes and blast cells
FR2547731A1 (fr) * 1983-06-27 1984-12-28 Centre Nat Rech Scient Immunotoxine antitumorale, preparations pharmaceutiques la contenant et son utilisation in vitro
US4585742A (en) * 1983-12-14 1986-04-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibody with specificity to human small cell carcinoma and use thereof

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