NL195022C - Antilichamen en actieve fragmenten daarvan die dienen voor het hiermee versterken van B-celuitbreiding. - Google Patents
Antilichamen en actieve fragmenten daarvan die dienen voor het hiermee versterken van B-celuitbreiding. Download PDFInfo
- Publication number
- NL195022C NL195022C NL8701371A NL8701371A NL195022C NL 195022 C NL195022 C NL 195022C NL 8701371 A NL8701371 A NL 8701371A NL 8701371 A NL8701371 A NL 8701371A NL 195022 C NL195022 C NL 195022C
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- cells
- cell
- bcgf
- antibodies
- mab
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0635—B lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/74—Inducing cell proliferation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
c 1 195022 ' Antilichamen en actieve fragmenten daarvan die dienen voor het hiermee versterken van B-celuitbreiding
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een in essentie zuiver antilichaam of actief fragment daarvan 5 dat bindt aan een polypeptide dat specifiek aanwezig is op het oppervlak van menselijke B-cellen.
Een dergelijk antilichaam is bekend uit een publicatie in Proc. Natl. Acad Sci USA vol 82, blz. 1766-1770 (1985) van E.A. Clark et al. Deze publicatie noemt monoklonale antilichamen (mAB’s) 2H7 en 1F5 tegen een 35-kDa polypeptide (Bp35), dat is gehecht aan het oppervlak van menselijke B-cellen. Het mAB 1F5 kan de uitbreiding van menselijke B-cellen stimuleren. Fab fragmenten van dit antilichaam hebben die 10 werking niet.
In een publicatie van J.T. Golay et al (waarbij één der auteurs E.A. Clark is) in Journal of Immunology 135 3795-3801 (1985) wordt vermeld dat het monoklonale antilichaam 1F5 tegen Bp35 rustende B-cellen groter doet worden en de RNA synthese hiervan snel doet toenemen, waaruit blijkt dat de menselijke B-cellen worden geactiveerd van de G0 naar de G^fase. Hoewel hierbij ook de [3H]-thymidine opname 5- tot 15 10-voudig wordt vergroot treedt geen celdeling van de B-cellen op, zodat duidelijk is dat zij niet overgaan in de S-fase.
1F5 verhindert de vorming van immonoglobulinen door B-cellen.
In het relevante vakgebied zijn nieuwe middelen gewenst die gebruikt kunnen worden voor het stimuleren van menselijke B-celuitbreiding.
20 Er is gevonden dat voor een dergelijk doel een nieuw antilichaam of actief fragment daarvan gebruikt kam worden dat bindt aan een ander polypeptide dat specifiek aanwezig is op het oppervlak van B-cellen.
De uitvinding wordt gekenmerkt doordat (a) het antilichaam bindt aan een 50 kDa menselijke B-cel specifiek oppervlaktepolypeptide (Bp50), (een dergelijk antilichaam is het door hybridomacellijn ATCC HB91120 geproduceerde monoklonaal antilichaam 25 G28-5), en (b) na binding aan Bp50, dat op het oppervlak van een met anti-Bp35 of anti-1g geactiveerde B-cel aanwezig is, de uitbreiding van de geactiveerde B-cel zoals in vitro gemeten door pHj-thymidine opname, bij een concentratie van 0,1 tot 0,5 pg/ml, versterkt. Hierbij treedt wel celdeling van de B-cellen op.
30 1. Achtergrond van de uitvinding
De activering van rustende B-cellen door overgang van de G0 naar de G^fase van de celcydus en de daaropvolgende inductie van geactiveerde B-cellen tot uitbreiding in de S-fase zijn onderscheiden stappen die van elkaar verschillende regelmechanismen vereisen. Volgens A.L. De Franco et al J. Immunol. 135 91) 87-94 (1985) worden B-cellen in de G0-fase door anti IgM antilichamen (anti μ) in lage concentratie (1-5 35 pg/ml) slechts in de G^fase gebracht. Om de B-cellen in de S-fase te brengen zijn 5 tot 50 maal hogere concentraties nodig.
E.M. Rabin et al Proc. Natl. Aced. Sci USA 82 2935-2939 (1985) noemen een van T-cellen afkomstige B-cel stimulerende factor 1 (BSF-1) die werkzaam is op B-cellen van muizen. Door de werkzaamheid van BSF-1 gaan rustende B-cellen van de G0-fase over naar de G^fase. Bij aanwezigheid van BSF-1 zijn lage 40 concentraties anti IgM antilichamen (5 pg/ml) voldoende om de B-cellen in de S-fase te brengen.
Y Noma et al Nature 319 640-646 (1986) beschrijven het kloneren en het bepalen van de sequentie van een cDNA, die een van muizen afkomstige 1gG1 inductiefactor codeert die vermoedelijk overeenkomt met BSF1.
G.D. Wetzel et al J. Immunol. 133 (5) 23272332 (1984) noemen LPS en DXS als activans voor B-cellen. 45 Onder invloed van LPS doorlopen de B-cellen de gehele cyclus, terwijl DXS de cellen uit de G0-fase haalt.
Volgens S.A. Mutaguchi et al J. Immunol 132,176-180 (1984) worden menselijke B-cellen door anti IgM antilichamen (anti p) van de G0 naar de G,-fase gebracht, terwijl een monoklonale B-celgroeifactor, BCGF, afkomstig uit menselijke T-T hybridoma deze B-cellen uit de G, naar de S-fase brengt.
J.H. Kehrl et al Immun Rev 1984 No 78 blz. 75-96 bespreken de stimulerende werking van verschillende 50 factoren op menselijke B-cellen waaronder anti p, een anti-lg reagens afkomstig van een Staphylococcus aureus stam (SAC), de menselijke B-cel groeifactor BCGF, de menselijke B-cel differentiatie factor BCDF, Interleukine 1 (IL1), IL2 en interferon. De rechtstreekse werking van IL2 op Bcellen wordt in twijfel getrokken.
Door L.K.L. Jung et al: J. Exp. Med. 160 1597-1602 (1984), wordt echter met behulp van een monoklo-55 naai antilichaam aangetoond dat rustende B-cellen niet, maar met behulp van anti IgM geactiveerde B-cellen wel een receptor voor IL2 bevatten en de IL2 de uitbreiding van deze geactiveerde B-cellen ook stimuleert, maar niet zo sterk als BCEF (BSF).
195022 2
Ook door R.H. Zubler: J. Exp. Med. 160,1170-1183 (1984) wordt gevonden dat rustende B-cellen en B-cellen die slechts door lipofolysaccharide (LPS) waren geactiveerd niet reageerde op IL-2, maar dat IL-2 uitbreiding teweeg bracht bij B-cellen die door LPS samen met anti IgM waren gestimuleerd.
Uit de hierboven genoemde literatuur blijkt al dat er een aantal factoren bestaan die de groei van 5 B-cellen bevorderen, zowel voor muizen B-cellen als voor menselijke B-cellen. Deze omvatten B-celgroeifactoren (BCGF), die afgeleid zijn van verscheidene uiteenlopende bronnen waaronder T-cellijnen of hybridoma’s, B-cellijnen, of dendrietcellen. Hoewel zowel interleukine-1 (IL-1) als interleukine-2 (IL-2) hebben bewezen om de B-celgroei te versterken, zijn ze kennelijk verschillend van bepaalde BCGFs. Bijvoorbeeld geven monoklonale antilichamen (mAb) tegen een muizen-BCGF (J. Ohara, et al., 1985, 10 Nature (Lond.) 315:333-336) of menselijke BCGF (hoog) (J.L. Ambrus, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1319— 1335) blokkering van de BCGF activiteit maar niet van de IL-1 of IL-2 activiteit. De BCGFs zelf lijken heterogeen te zijn. Bijvoorbeeld is 60-kilodalton (kDa) hoogmoleculairgewicht menselijk BCGF, BCGF (hoog) geïdentificeerd dat door dit moleculairgewicht verschilt van een 12-kDa laagmoleculairgewichtvorm, BCGF (laag) (J.L. Ambrus, et al., 1985, J. Clin. Invest. 75:732-739).
15 Deze-activering-en groeisignalen reguleren vermoedelijk B-cellen door een interactie met specifieke B-celoppervlaktestructuren. Naast het antigeen-specifieke signaal door middel van oppervlakte IgM, zijn verscheidene andere kandidaat B-celoppervlaktepolypeptiden geïdentificeerd die op enige wijze een rol kunnen spelen in de activering of groei van B-cellen. Onlangs zijn functionele IL-2 receptoren op B-cellen geïdentificeerd (R.H. Zuibler, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1170-1183; L.K.L. Jung, et al., 1984, J. Exp.
20 Med. 160:1597-1602; A. Muraguchi, et al., 1985, J. Exp. Med. 161:181-197).
Verscheidene kandidaat B-celoppervlaktepolypeptiden zijn geïdentificeerd die op enige wijze een rol kunnen spelen in de activering of groei van B-cellen. Bijvoorbeeld is door B-Subbarao en Mosier (D.E. Subbarao, et al., 1983, Immunol. Rev. 69:81-97) gevonden dat monoklonale antilichamen (mAb) tegen het muizen-B-cel antigeen Lyb2 activering van B-cellen kunnen geven, en onlangs is bewijsmateriaal versche-25 nen dat erop wijst dat Lyb2 de receptor voor BSF-1 kan zijn (H. Yakura, 1985, Fed. Proc. 44:1532). Evenzo is door ons gevonden dat geschikt mAb (1F5) tegen een 35 kDa polypeptide, Bp35, menselijke B-cellen activeert van G0 tot G, (E.A. Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770; J.T. Golay, et al., J. Immunol. 135:3795-3801). Geaggregeerde C3d of antilichaam tegen de 140 kDa C3d receptor, Bp140, veroorzaken uitbreiding van B-cellen die T-cel afhankelijk zijn (F. Melchers, et al., 1985, Nature 317:264-30 267; G.R. Nemerow, et al., 1985, J. Immunol. 135:3068-3073; R. Frade, et al., 1985, Eur. J. Immunol. 15:73-76). Hoewel BCGFs in zowel de muis als de mens zijn geïdentificeerd, zijn de receptors voor deze factoren nog niet geïsoleerd. Door Wang en medewerkers (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) is een polyklonaal antiserum bereid dat een 54 kDa polypeptide (gp54) op menselijke B-cellen identificeerde en is aangetoond dat het konijnen-antiserum tegen gp54 tonsillaire B-cellen aanzette tot 35 deling. Onlangs werd door L.K.L. Jung en S.M. Fu (Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924) een mAb (AB-1) tegen een 55-kDa, tot geactiveerde B-cellen beperkt antigeen geïsoleerd dat BCGF-afhankelijke uitbreiding blokkeert. Of anti-gp54 of AB-1 al dan niet een BCGF receptor herkennen, is echter nog niet bekend.
40 2. Samenvatting van de uitvinding
De onderhavige uitvinding is gericht op antilichamen of fragmenten daarvan die (a) binden aan Bp50, een 50kDa B-cel-specifiek oppervlaktepolypeptide dat hierin is beschreven, en (b) de uitbreiding van geactiveerde B-cellen versterken.
De onderhavige uitvinding omvat antilichamen, monoklonale antilichamen en het fragment F(ab% van 45 deze antilichaammoleculen die de met het antigeen combinerende plaats bevatten. Zij kunnen worden gebruikt voor stimuleren van menselijke B-celuitbreiding.
De onderhavige uitvinding is gebaseerd op de vondst dat twee menselijke B-celdifferentiatieantigenen, Bp35 en het hierin beschreven B-celantigeen, Bp50, kennelijk onderscheiden functies hebben als signaalre-ceptors in B-celactivering. Monoklonale antilichamen (mAb) tegen Bp35 en Pb50 geven allebei positieve 50 signalen aan B-cellen die hun doorlopen van de celcyclus stimuleren. Monoklonale antilichamen tegen Bp35, evenals anti-lgM antilichamen, functioneren in principe door activering van rustende B-cellen tot competentie voor het betreden van de Gn-fase van de celcyclus. Daarentegen functioneert een hierin beschreven monoklonaal antilichaam of zijn fragment tegen Bp50, een 50 kDa polypeptide dat op alle B-cellen tot expressie komt, door stimulering van geactiveerde B-cellen tot doorlopen van de cellcyclus 55 en versterkt het de uitbreiding van geactiveerde B-cellen. Monoklonale antilichamen tegen Bp35, evenals anti-lgM antilichamen, activeren tonsillaire B-cellen en wekken lage niveaus van B-celuïtbreiding op. Daarentegen leidt anti-Bp50 monoklonaal antilichaam alleen noch tot activering van B-cellen, noch tot het 3 195022 ’ opwekken van uitbreiding van B-cellen, maar samen met anti-Bp35 of anti-lgM antilichamen, versterkt het B-celuitbreiding. In dit opzicht lijkt de werking van anti-Bp50 antilichaam op de activiteit van B-celgroeifactoren (BCGF)· Slechts een geringe hoeveelheid van 0,05 pg/ml van anti-Bp50 is nodig om uitbreiding te versterken en evenals BCGF is anti-Bp50 zelfs effectief wanneer het 12-24 uur nadat B-cellen 5 zijn geactiveerd met anti-lgM of anti-Bp35 is toegevoegd. Zonder bijkomende exogene signalen, wekken anti-Bp35 en anti-Bp50 antilichamen samen een sterke uitbreiding van gezuiverde rustende B-cellen op.
Deze resultaten wijzen in de richting dat de Bp35 en Bp50 oppervlaktemoleculen een rol spelen in de regulering van B-celactivering en voortgang door de celcyclus. Vanwege de betekenis die anti-Bp35 en soortgelijke moleculen hebben op het effect en de werking van de liganden volgens de onderhavige 10 uitvinding, dient de publicatie van E.A. Clark et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:1766-1770 hier door verwijzing opgenomen te worden geacht.
Hoewel de activiteit van anti-Bp50 lijkt op die van BCGF (laag) omdat zowel anti-Bp50 als BCGF (laag) met dezelfde middelen constimulerend werken en zowel anti-Bp50 als BCGF (laag) alleen invloed uitoefenen op geactiveerde B-cellen en in een oplosbare vorm werken, kan de activiteit van anti-Bp50 worden 15- onderscheiden-van de activiteit van BCGF (laag), doordat de uitbreiding van B-cellen die met optimale hoeveelheden van anti-Bp50 en anti-Bp35 (of anti-lgM) is gestimuleerd, verder kan worden versterkt met BCGF (laag) en doordat zowel B-cellen in het bloed als bepaalde B-cellymfoma’s op een verschillende wijze reageren op anti-Bp50 versus BCGF. Voor optimale activiteit dient anti-Bp50 binnen 12 uur na B-celactivering te worden toegevoegd, terwijl BCGF (laag) een optimale activiteit behoudt, zelfs wanneer het 20 24 uur na activering wordt toegevoegd. Bovendien wordt Bp50 op alle B-cellen tot expressie gebracht, terwijl receptors voor BCGF (laag) beperkt zijn tot geactiveerde B-cellen. Derhalve kunnen anti-Bp50 en BCGF (laag) beide op gecoördineerde wijze B-celgroei reguleren, maar kennelijk doen ze dat via verschillende signalen.
In één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, kunnen de antilichamen die aan Bp50 binden en 25 de uitbreiding van geactiveerde B-cellen versterken, worden gebruikt voor het vergroten van een immuun-respons. Bijvoorbeeld kunnen deze antilichamen die Bp50 binden worden gebruikt als ’’adjuvans” om een immuunrespons op een vaccin te vergroten. Anderzijds kunnen deze antilichamen worden gebruikt om de immuunrespons van een in een toestand van immunosuppressie verkerend individu te vergroten.
De antilichamen of hun fragmenten volgens de uitvinding kunnen in vitro ook worden gebruikt voor het 30 identificeren of scheiden van cellen die het Bp50 antigeen tot expressie brengen en/of voor het onderzoeken van lichaamsvloeistoffen op de aanwezigheid van het Bp50 antigeen dat al dan niet aan een cel is gebonden. Bovendien kunnen de antilichamen volgens de uitvinding in vivo worden gebruikt voor het verkrijgen van een beeld ’’imaging” van cellen of tumoren die het Bp50 antigeen tot expressie brengen.
35 2.1. Definities
Zoals hierin gebruikt zullen de volgende afkortingen de aangegeven betekenissen hebben: AO = acridine oranje BCGF = B-celgroeifactor
BCGF (hoog) a een 60 kDa humaan BCGF
40 BCGF (laag) = een 12 kDa humaan BCGF
Bp35 = een 35 kDa B-cel-specifiek oppervlaktepolypeptide (CD20) gedefinieerd door mAb 1F5
Bp50 = een 50 kDa B-cel-specifiek oppervlaktepolypeptide gedefinieerd door mAb G28-5
Fv = het variabele gebied of de antigeen-combinerende plaats van een antilichaammole- cuul. Dit kan elk fragment zijn dat het idiotype van het molecuul bevat, waaronder 45 (zonder beperking daartoe) Fab, F(ab02· Fab', en dergelijke IF = immunofluorescentie
Ig = immunoglobulins IL-1 = interleukine 1 IL-2 = interleukine 2 50 kDa = kilodalton mAb - monoklonaal antilichaam SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese TPA = 12-0-tetradecanoylforbol-13-acetaat 55 3. Figuurbeschrijving
Figuur 1. Expressie van Bp50 is beperkt tot Bp35± B-cellen. Een twee-kleuren stroom cytometrische analyse van 50.000 cellen werd uitgevoerd op de wijze als beschreven door E.A. Clark, et al., 1985, Proc.
195022 4
Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770. De gegevens zijn uitgezet als aantal cellen versus de logaritme van groene fluorescentie en de logaritme van rode fluorescentie waarbij 4-5 stippen ongeveer een verdubbeling van fluorescentie vertegenwoordigen, De gegevens worden verstrekt om autofluorescente negatieve cellen te tonen. PE (rood) -anti-Bp35 (1F5) versus FITC (groen) -anti-Bp50 (G28-5) kleuring toont dat alle Bp50+ 5 cellen ook Bp35+ zijn.
Figuur 2. Immunologische vergelijking van Bp50 polypeptide met andere B-celoppervlakteantlgenen. Immunoprecipitatie van Bp50 van aan het oppervlak van 125l-gelabelde tonsillaire cellen werd uïtgevoerd op de beschreven wijze. Geïsoleerde antigenen werden elektroforetisch behandeld op 10% SDS polyacrylamide slab-gels zonder reductie. De gels werden zichtbaar gemaakt met autoradiografie en versterkings-10 schermen.
Paneel A: laan 1, anti-Bp50 (G28-5); laan 2, anti-Bp95 (G28-8); laan 3, sefarose-geit anti-muis Ig alleen.
Belichtingstijd: 4 dagen.
Paneel B: laan 1, anti-Bp50 (G28-5); laan 2, anti-Bp45 (BLAST-2); laan 3, anti-Bp39 (G28-1); laan 4, anti-Bp39 (41-H16); laan 5, sefarose-geit anti-muis Ig alleen.
15 Een belichtingstijd van 2 dagen werd gekozen zodat de banden in de lanen 2-4 niet overbelicht werden en met betrekking tot Bp50 duidelijk konden worden onderscheiden.
Figuur 3. Twee-kleuren immunofluorescentie-analyse van Bp50 expressie. Periferaal bloed of tonsillaire mononucleaire cellen werden door centrifugering op Ficoll geïsoleerd en gekleurd met PE (rood)-geconjugeerd G28-5 (anti-Bp50) in combinatie met fluoresceïne (groen)-geconjugeerde referentie-20 antiiichamen, omvattende 2C3 (anti-lgM); 1F5 (anti-Bp35); HB10a (anti-DR); en 9.6 (anti-CD2), E receptor). Cellen werden geanalyseerd met een FACS IV, uitgerust met vier decade logversterkers in zowel rode als groene dimensies. Voorwaartse en onder een rechte hoek lichtverstrooiing werd gebruikt om monocyten uit te sluiten. Ongekleurde cellen bevinden zich aan de achterkant van het rooster; rode fluorescentie aan de rechter zijde en groene fluorescentie aan de linker zijde.
25 Figuur 4. Dosisresponskrommen voor versterking van uitbreiding van dichte tonsillaire Er- B-cellen door anti-Bp50 antiiichamen zoals aangegeven: Media alleen; anti-Bp50 mAb alleen; anti-Bp35 mAb (5 pg/ml) alleen; BCGF alleen; anti-Bp35 mAb plus BCGF; anti-Bp35 mAb plus getrapte doses van anti-Bp50. Gemiddelde uitbreiding ± standaardfout van monsters in viervoud werd gemeten op dag 3.
Figuur 5. Anti-Bp50 mAb zijn zeer effectief in versterking van uitbreiding indien toegevoegd na een 30 B-celactiveringssignaal. Dichte tonsillaire Er- B-cellen werden gedurende 4 dagen geïncubeerd met media alleen, anti-Bp50 mAb (0,5 pg/ml) toegevoegd op verschillende tijdstippen na incubatie, anti-Bp35 mAb (5 pg/ml) toegevoegd op verschillende tijdstippen na incubatie; anti-Bp50 mAb constant gehouden waaraan later op verschillende tijdstippen anti-Bp35 mAb werd toegevoegd; anti-Bp35 mAb constant gehouden waaraan anti-Bp50 mAb werd toegevoegd aan culturen op verschillende tijdstippen. Gedurende de laatste 35 10 uur werd 3H-thymidine toegevoegd en zijn opname gemeten.
Figuur 6. Vergelijking van het vermogen van anti-Bp35 en anti-Bp50 om rustende tonsillaire B-cellen aan te zetten tot verlaten van het G0 stadium van de celcyclus. Dag 3 na behandeling media alleen (-), anti-Bp35 alleen (—); en anti-lgM alleen (.....), A, geen extra toevoegingen; B, anti-Bp50 (0,5 pg/ml) toegevoegd aan elke groep; C, 5% BCGF toegevoegd aan elke groep. De gegevens zijn uitgezet als relatief 40 aantal cellen versus de logaritme van AO rode fluorescentie (RNA).
Figuur 7. Kinetiek van B-celuitbreiding na stimulering met anti-Bp50 versus BCGF. Dichte tonsillaire E-B-cellen werden gestimuleerd met media alleen; 10% BCGF alleen; anti-Bp35 alleen; anti-Bp50 alleen; anti-Bp35 + 10% BCGF; anti-Bp35 + anti-Bp50; en anti-Bp35 + anti-Bp50 + 10% BCGF. Uitbreiding werd gemeten op de aangegeven dagen 18 uur na een stoot 3H-thymidine. Uitbreiding werd gemeten in viervoud 45 en standaardfouten zijn aangegeven. Eén van drie experimenten.
Figuur 8. Tijden na stimulering met anti-Bp35 waarop anti-Bp50 (A) of BCGF (B) de uitbreiding optimaal versterken, dichte tonsillaire E- B-cellen werden op de getoonde wijze gestimuleerd en de uitbreiding werd gemeten 18 uur na een stoot van 3H-thymidine op dag 3. Media; anti-Bp35 alleen toegevoegd op de aangegeven tijdstippen; anti-Bp50 of BCGF alleen; anti-Bp35 toegevoegd bij het begin van de kweek 50 gevolgd door toevoeging van anti-Bp50 of BCGF op de aangegeven tijdstippen; anti-Bp50 of BCGF
toegevoegd bij het begin van de kweek gevolgd door anti-Bp35. Eén van twee experimenten. De uitbreiding werd gemeten in viervoud en standaardfouten zijn aangegeven. De gebruikte doses: anti-Bp35, 5 pg/ml; anti-Bp50, 0,2 pg/ml; GCGF (laag) 5%. De gebruikte concentraties waren als volgt: anti-Bp35, 5 pg/ml; anti-Bp50, 0,2 pg/ml; BCGF, 5%.
55 Figuur 9. Anti-Bp50 en BCGF hebben additieve effecten op de B-celuitbreiding. Dichte tonsillaire E-B-cellen werden gestimuleerd met getrapte doses van BCGF (laag) samen met anti-Bp50 alleen; anti-Bp35 alleen; anti-lgM-korrels alleen; anti-Bp35 + anti-Bp50; of anti-Bp50 + anti-lgM. De uitbreiding werd gemeten 5 195022 ' op dag 3 18 uur na stimulering met een stoot van 3H-thymidine. De uitbreiding werd gemeten in viervoud en standaardfouten zijn aangegeven. Eén van vier experimenten. De gebruikte doses voor 10® cellen: anti-Bp35, 5 pg/ml; anti-Bp50, 0,2 pg/ml; anti-lgM-korrels, 50 pg/ml.
Figuur 10. Vergelijkende effecten van anti-Bp50 en BCGF op normale en maligne B-cellen. Periferale 5 bloed E- B-cellen (A) of dichte tonsillaire E- B-cellen (C) werden gestimuleerd met of zonder TPA (75 ng/ml) in tegenwoordigheid van 10% BCGF of 1 pg/ml anti-Bp50. Twee aparte B-cellymfoma’s (panelen B en D) werden op dezelfde wijze gestimuleerd. De uitbreiding werd gemeten op dag 3 door opname van 3H-thymidine 12 uur nadat een stoot hiervan was toegevoegd. De uitbreiding werd gemeten in viervoud en standaardfouten zijn aangegeven.
10 4. Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding
De onderhavige uitvinding is gericht op in essentie zuivere antilichamen die (a) binden aan Bp50, een 50 kDA B-cel-specifiek oppervlaktepolypeptide, en (b) de uitbreiding van geactiveerde B-cellen versterken.
De onderhavige uitvinding omvat antilichaammoleculen, monoklonale antilichaammoleculen de fragmen-15 ten F(ab% van deze antilichaammoleculen die de antigeen-combinerende plaats bevatten die aan de Bp50 receptor binden.
Wanneer het antilichaam een monoklonaal antilichaam tegen Bp50 of het fragment F(ab02 daarvan is, kan het worden bereid volgens elke techniek die leidt tot de productie van antilichamen door een cultuur van continue cellijnen. Bijvoorbeeld behoren de hybridomatechniek die oorspronkelijk ontwikkeld is door Kohier 20 en Milstein (1975, Nature 256:495-497) evenals andere technieken die meer recent beschikbaar zijn gekomen zoals de humane B-celhybridomatechniek (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) en de EBV-hybridomatechniek voor het bereiden van humane monoklonale antilichamen (cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pag. 77-96) en dergelijke tot de omvang van de onderhavige uitvinding.
25 Een F(ab% fragment kan verkregen worden door het antilichaam te behandelen met pepsine. Een F(ab')2 fragment kan ook verkregen worden door het antilichaammolecuul te behandelen met papaïne.
De onderstaande subsecties beschrijven de nieuwe, 50-kDa B-celoppervlaktemerker, Bp50, die kennelijk in B-celuitbreiding een rol speelt. Verder worden volgens de onderhavige uitvinding een monoklonaal antilichaam dat Bp50 definieert alsmede zijn F(ab')2 fragmenten beschreven die evenals BCGF 30 B-celuitbreiding versterken. Anders dan anti-Bp35 mAb, dat rustende B-cellen in G0 kan opwekken tot overgang naar G1( geeft anti-Bp50 mAb geen activering van rustende B-cellen. Anti-Bp35 en anti-Bp50 mAb samen, zonder enige additionele exogene signalen, induceren een sterke activering en uitbreiding van gezuiverde B-celien.
De onderstaand beschreven experimenten laten ook zien dat anti-Bp50 activiteit lijkt op BCGF activiteit 35 maar dat anti-Bp50 verschilt van laag moleculair gewicht BCGF omdat anti-Bp50 en laagmoleculair gewicht BCGF duidelijk additief zijn en verschillend werken op verscheidene B-celsubsets of maligniteiten.
4.1. Methoden, gebruikt voor karakterisering van de Bp50 receptor Celpreparaten 40 Mononucleaire cellen werden geïsoleerd van normaal of leukemisch, met heparine behandeld periferaal bloed door Ficoll-Hypaque gradiënten (Pharmacia, Piscataway, NJ). Mononucleaire cellen werden verkregen van tonsillaire weefsels zoals beschreven door E=(E.A. Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). Een verarming aan T-cellen werd verkregen met AET-behandelde schapeërythrocytrozet-vorming en Ficoll-Hypaque gradiëntscheiding. In sommige experimenten werd een verrijking aan bloed 45 B-cellen gerealiseerd door een nylonwol hechtende cellen te isoleren. Monocyten werden verwijderd door incubatie op kunststof petrischalen, één of twee keer gedurende 45 minuten bij 37°C, tenzij anders is aangegeven. Bovendrijvende of dichte tonsillaire B-cel fracties werden geïsoleerd door Percoll stapgradiën-ten zoals beschreven door (E.A. Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). dichte tonsillaire B-celpreparaten bevatten consistent meer dan 95% slg+ Bp35+ cellen. Preparaten die verrijkt 50 waren aan B-cellen van het bloed bevatten 60-85% slg+ cellen. B-cellymfomacellen werden geïsoleerd door voorzichtig lymfomacellen in het medium in beweging te brengen gevolgd door Ficoll-Hypaque gradiëntcen-trifugatie.
Monoklonale antilichamen
Het G28-5 antilichaam tegen Bp50 werd verkregen door BALB/c muizen te immuniseren met menselijke 55 E- tonsillaire lymfocyten en immuunmiltcellen van deze muizen te fuseren met het NS-1 myeloma (Kohier, et al., 1975, Nature 256:495-497; J.A. Ledbetter, et al., 1979, Immunol. Rev. 47:63-82). Hybridecelculturen die een antilichaam uitscheiden dat reageerde tonsillaire B-cellen en niet met T-cellen werden geïdentificeerd 195022 6 met behulp van indirecte immunofluorescentie (IF) en analyse met een FACS IV celsorteerder; culturen met antilichaam dat soortgelijke histogrampatronen geeft als bekende mAb tegen pan B-celmerkers (b.v. Bp35) werd gekloneerd en voor verder onderzoek geselecteerd. De G28-5 kloon produceerde een IgG, mAb dat alleen met normale of maligne B-cellen of B-cellijnen reageerde. Andere mAb, die in dit onderzoek werden 5 gebruikt, zijn in detail beschreven (E.A. Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770; E.A. dark, et al., 1986, Human Immunol. 16:100; J.A. Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15:30-44; J.A. Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, pag. 325-340). Deze omvatten 1F5 (lgG2a) anti-Bp35, HB10a (lgG2a). anti-HLA-DR, 2C3 (IgG,) anti-μ keten, G19-4 (IgG,) anti-CD3, FC-2 (lgG2a) anti-Fc receptor CD16, en 9.6 (lgG2a) anti-CD2 (E receptor) geleverd 10 door Dr. Paul J. Martin (Martin, et al., 1983, J. Immunol. 131:180). De IgG, mAbs werden gezuiverd door precipitatie met behulp van 45% of 50% verzadigd ammoniumsulfaat en DEAE Sephacryl kolom-chromatografie, en de lgG2a mAbs werden gezuiverd met behulp van proteïne A Sepharose kolommen. De F(ab')2 fragmenten van G28-5 werden bereid met de methode van Parham (Parham, et al., 1983, J. Immunol. 131:2895), gezuiverd op een 2-meter lange Sephacryl S200-kolom, en getest op zuiverheid door 15 SDS-PAGE (J.A. Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135:1819). Het 2C3 mAb tegen μ-ketens werd geconjugeerd aan Sepharose 4B-korrels (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) waarbij cyanogeen-bromidekoppeling werd gebruikt Fluoresceïne en fycoêrythrineconjuugtaties
Gezuiverde mAb werden hetzij direct gebonden aan fluoresceïne door gebruik te maken van 20 fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC; Molecular Probes) (groen) volgens de methode van Goding (J.W.
Goding, et al., 1976, J. Immunol. Meth. 13:215-226), hetzij gebonden aan R-phycoërythrine (PE) (rood) met behulp van SPDP (Pharmacia) met een methode welke gedetailleerd door ons is beschreven in J.A. Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-129. Lymfoïdecellen werden geïncubeerd in rond-bodem microtiterplaten gedurende 30 minuten met 25 een geschikte verdunning van groen en/of rood mAb, tweemaal gewassen, en daarna geanalyseerd op een FACS IV celsorteerder.
Twee-kleuren immunofluorescentie
Twee-kleuren onderzoeken werden uitgevoerd met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS IV: Becton-Dickinson, Mountain View, CA) waarbij gebruik werd gemaakt van een 560-nm dichroïsche 30 spiegel om de bundel te splitsen en een 580 lang-doorlaatfilter en 540 kort-doorlaatfilter (Ditric Opties, Hudson, MA) opgesteld voor respectievelijk de rode en de groene fotomultiplicatorbuizen. Bovendien werd een twee-kleuren compensator (T. Nozaki, Stanford University) gebruikt om te corrigeren voor ondergeschikt overlopen van groene en rode signalen. Voor elke twee-kleuren kleuring, werden gegevens van 40.000 cellen verzameld en opgeslagen op floppydisks. Gegevens worden weergegeven als aantal cellen (verticaal) 35 versus de logaritme van de groene fluorescentie versus de logaritme van de rode fluorescentie op een 64 x 64 stippenrooster. Ongeveer 4,5 stippen vertegenwoordigen een verdubbeling van de fluorescentie. Ongekleurde cellen bevinden zich aan de achterste hoek van het rooster, rode fluorescentie is aan de rechter kant en groene fluorescentie aan de linker kant. Ons stroomcytometriesysteem voor twee-kleuren IF met fluoresceïne en fycoërythrine is uitvoeriger beschreven door J.A. Ledbetter, et al., in Perspectives in 40 Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6,119-129 en 325-340.
Celcultuur: B-cellen afkomstig uit bloeden of tonsillaire lymfoïde B-cellen werden in viervoud gekweekt uitgaande van 5-10 x 105 cellen per ml op microtiterplaatjes met 96 putjes die 200 μΙ RPM1-1640 medium bevatten, aangevuld met 15% foetaal runderserum, antibiotica, flutamine en pyruvaat (R15). Na 1-7 dagen werd aan de allen een "sloot” van 3H-thymidine toegediend van 0,5 μ Ci per putje (New England Nucleair, 45 6, 7 Ci/mmol; 1 Ci = 37 x 10® desintegratie/sec = 37 x 109 becquerel.
De cellen werden vervolgens na 18 uur afgescheiden op glasvezelfilters en radioactiviteit, die een maal is voor de uitbreiding werd gemeten met een scintillatieteller. In sommige experimenten werden antilichamen of ander stimulerende factoren na het begin van de kweek toegevoegd. De uitbreiding van de cellen bij deze experimenten werd gemeten op dag 3.
50 Costimulerende factoren
Gezuiverd BCGF werd gekocht bij Cytokine Technology (Buffalo, New York) en bevatte geen detecteerbare IL-1, IL-2 of interferonactiviteit. Dit BCGF was bereid met de methode volgens A. Maizel en medewerkers (A. Maizel, et al., 1982, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79:5998-6002), die hebben aangetoond dat de belangrijkste BCGF activiteit in dit materiaal schuilt in een 12-kDA species dat verder wordt aangeduid als 55 "BCGF (laag)” (S.R. Mehta, et al., 1985, J. Immunol. 135:3298-3302). De zuiveringsstappen omvatten preparatieve schaal DEAE affiniteitschromatografie gevolgd door hydroxylapatietkolomchromatografie. IL-1 gezuiverd tot homogeniteit was een genereuze gift van Dr. Steven Dower (S.K. Dower, et al., 1985, J. Exp.
7 195022
' Med. 162:501-515). De Cetus Corporation was zo vriendelijk om recombinant IL-2 te leveren. TPA
(12-O-tetradeconoylforbol 13-acetaat) werd gekocht bij Sigma.
Detectie van celactivering
Veranderingen in celvolume, opgeroepen door mAb en/of andere stimulerende factoren, werden gemeten 5 met een celsorteerder (cellsorter) en een voorwaartse hoeklichtverstrooiend (formed angle light scatter). Celcyclusveranderingen in cellulaire RNA en DNA niveaus werden gemeten door geactiveerde cellen te kleuren met acridine oranje en het relatieve cellulaire RNA (rood) en DNA (groen) gehalte te meten met een celsorteerder volgens de methode van Z. Darzynkiewicz et al. (Z. Darzynkiewics, et al., 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:6996-6699). Veranderingen in relatieve gehaltes van celoppervlakte-antigenen werden 10 gevolgd door gebruik te maken van mAb, die direct gebonden is aan fluoresceïne, en daarna kwantitatief bepaald door directe IF fluorescentieniveaus met een Epics V celsorteerder.
Immunologische karakterisering van Bp50
Immunoprecipitatie van Bp50 van aan het oppervlak met 125l-gelabelde tonsillaire cellen werd uitgevoerd op de beschreven wijze (J.A. Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 134:4250-4254). Geïsoleerde antigenen 15—werden_aan_elektroforese onderworpen op 10% SDS polyacrylamide slabgels zonder reductie. De antigenen in de gels werden zichtbaar gemaakt met behulp van autoradiografie bij -70°C en Cronex belichting plus versterkingsschermen (Dupont).
4.2. Karakterisering van de Bp50 receptor 20 De onderstaande subsecties beschrijven de resultaten van de experimenten die met de bovenstaand beschreven methoden werden uitgevoerd.
4.2.1. Identificatie van een B-cel-specifieke 50 kDa celoppervlaktemerker, Bp50 Een mAb tegen Bp50 werd opgewekt door BALB/c muizen te immuniseren met menselijke tonsillaire 25 lymfocyten en immuunmiltcellen te fuseren met de NS-1 myeloma. Eén kloon, G28*5, produceerde een lgG1 mAb dat niet de NS-1 lichte keten bevatten. Na onderzoek met IF analyse, bleek G28-5 alleen te reageren met normale of maligne B-cellen of B-cellijnen. Uit een uitgebreid onderzoek van normale weefsels volgens bekende methoden (E.A. Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770; J.A. Ledbetter et al., 1986, Human Immunol. 15:30-44; J.A. Ledbetter, 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocom-30 patibility, ASHI, New York, 6, pag. 325-340) bleek dat het G28-5 antilichaam reageert met E rozet-negatieve (Er-) cellen uit bloed of tonsillen maar niet met niet aan nylonwol hechtende T-cellen, PHA-geïnduceerde T-celblasts, of met bloedgranulocyten, monocyten, rode cellen, of plaatjes. Het reageerde sterk met alle zeven geteste B lymfoblastoïdecellijnen en met drie Burkitt’s lymfomalijnen (Raji, Daudi, Namalwa), maar niet vier T-cellijnen (CEM, HSB-2, JURKAT, en HPB-ALL). Alle geteste chronische 35 lymfocytische leukemieën (3/3) en 90% (9/10) van geteste B lymfoma’s reageerden positief op de Bp50 merker terwijl bij slechts 28% (2/7) van non T, non B CALLA+ acute lymfocytische leukemieën Bp50 kon worden aangetoond.
De beperkte distributie van Bp50 op normale weefsels werd verder bevestigd door kwantitatieve twee-kleuren immunofluorescentie (twee-kleuren IF) analyses.
40 Onder toepassing van een R-fycoërythrine (PE)-geconjugeerd antilichaam (rood) tegen het pan B-celantigeen Bp35 (BI, CD20) en fluoresceïne-geconjugeerd anti-Bp50 antilichaam (groen), vonden wij dat Bp50 slechts werd aangetoond op Bp35+ B-cellen (figuur 1) in bloed of tonsillen. B-cellen van bloed toonden consistent iets lagere niveaus van Bp50 aan dan tonsillaire B-cellen; dit vertoont overeenstemming met HLA-DR expressie, (J.A. Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15-30-40) en met gp54 expressie 45 (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) die eveneens lager zijn aan bloed B-cellen. Bp50 werd in overeenkomstige niveaus aangetoond op tonsillaire B-celsubpopulaties die gescheiden waren op Percoll gradiënten tot bovendrijvende en dichte fracties. Gebruikmakend van ons PE-geconjugeerd mAb tegen de T-celmerker, CD3(T3), en NK cel-gebonden merker, CD16 (Fc receptor) (J.A. Ledbetter, et al., 1979, Immunol. Rev. 47:63-82), vonden wij dat Bp50 niet kon worden aangetoond op T-cellen of NK-cellen.
50 Gebruikmakend van twee-kleuren IF, vonden wij ook dat CD3+ PHA blasts die hoge niveaus van IL-2 receptoren bleken te bevatten, Bp50 niet kon worden aangetoond.
Het G28-5 antilichaam reageerde met één enkel polypeptide op tonsillaire lymfocyten, dat volgens elektroforese met SDS onder niet-reducerende omstandigheden een molecuulgewicht van ongeveer 50 Ka bezat (figuur 2A). Dit molecuul is groter dan eerder beschreven B-celmerkers in hetzelfde molecuulgewichts-55 bereik zoals Bp39 of Bp45 (Zipf, et al., 1983, J. Immunol. 131:3064-3072; Ch. Kintner, et al., 1981, Nature 294, 458-460); E.A. Clark, et al., 1986, in Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, et al., Springer Verlag,
Berlijn, hoofdstuk 12 vol. 2, 155-167; Slovin, et al., 1982, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79:2649-2653; D.A.
195022 8
Thorley-Lawson, et al., 1985, J. Immunol. 134:3007-3012 en figuur 2B).
De belichtingstijd werd voor deze gel zo gekozen dat de molecuulgewichten van de andere B-celmerkers gemakkelijk kon vergeleken met Bp50. De Bp39 merker, kan in tegenstelling tot Bp50 worden aangetoond op granulocyten en Bp45 is in tegenstelling tot Bp50 beperkt tot B-celblasts. Antilichamen tegen Bp39 5 (41-H16) en BP45 (MNM6, Blast-1, Blast-2) die ter beschikking waren gekomen via een internationale workshop (E.A. Clark, et al., 1986, in Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlijn, hoofdstuk 12 Vol. 2,155-167) gaven geen blokkering van de binding van gefluoresceïneerde anti-Bp50 antilichamen aan B-cellen. Gebaseerd op weefselverdeling, biochemische analyse, en blokkerings-onderzoeken, herkent derhalve het G28-5 monoklonaal antilichaam een 50*Kd structuur die verschilt van 10 andere bekende B-cel antigenen.
4.2.2. De aanwezigheid van Bp50 is beperkt tot B-cellen
Zowel uit verdelingsonderzoeken aan hematopoietisch weefsel en cellijnen als gedetailleerde twee-kleuren stroomcytometrische analyses bleek dat Bp50 alleen op B lymfocyten kan worden aangetoond. Zoals 15 weergegeven in figuur 3, bleek de aanwezigheid van Bp50 op een kleine subset van bloedlymfocyten en op een grote populatie van tonsillaire lymfocyten. Nagenoeg alle Bp50+ cellen in zowel bloed als tonsillen bleken ook Bp35 en HLA-DR te bevatten, maar hierop kon niet het CD2 (figuur 1) of CD3, T-celmoleculen of de IgG Fc receptoren die op NK-cellen worden aangetroffen, worden aangetoond. Verder vertoonden ConA-geactiveerde CD3+ T-celblasts de aanwezigheid van IL-2 receptoren, maar hierop kon geen Bp50 20 worden aangetoond.
Twee-kleuren stroomcytometrische analyses maken een kwantitatieve meting mogelijk van het dichtheidsverband tussen twee aan de oppervlakte aanwezige antigenen. Eerder is door ons aangetoond dat de dichte, rustende B-cellen in de mantelzone van secundaire follikels IgM en geringe niveaus van Bp35 bleken te bevatten, terwijl de bovendrijvende, geactiveerde B-cellen in het germinale centrum IgM-negatief 25 zijn en verhoogde niveaus van Bp35 vertoonden (J.A. Ledbetter, et al., Human Immunol. 15:30).
Figuur 3 laat zien dat zowel IgM-positieve als IgM-negatieve B-celsubsets Bp50 in gelijke hoeveelheden bleken te bevatten, hetgeen erop wijst dat Bp50 zowel op rustende B-cellen als op B-cellen die in vivo geactiveerd zijn tot expressie komt.
30 4.3. Versterking van B-celuitbreiding met anti-Bp50 antilichaam
Zoals eerder uitgelegd kunnen B-cellen worden geactiveerd met lage doses van anti-μ keten-specifieke antilichamen. Onlangs werd door ons gevonden dat de B-cel-specifieke merker Bp35 (B1), een 35-kDa polypeptide, eveneens in vroege B-celactivering een rol kan spelen: het 1F5 mAb tegen Bp35 activeert, evenals lage doses van anti-μ antilichaam, B-cellen tot een vergroting van celvolume en RNA gehalte en tot 35 uitbreiding met behulp van BCGF (E.A. Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770); J.T. Golay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Het was daarom interessant om het effect van anti-Bp50 mAb in de uitbreiding van onbehandelde B-cellen of B-cellen, geactiveerd met hetzij anti-Bp35 hetzij anti-μ antilichamen te vergelijken (tabel A). Anti-Bp35 in oplossing of aan Sepharose-korrels gebonden anti-μ antilichamen konden onder gepaste omstandigheden alleen enige B-celuitbreiding stimuleren (tabel A, regel 40 1); daarentegen stimuleerden anti-Bp50 antilichamen alleen geen uitbreiding (tabel A, regel 2). Anti-Bp50 mAb versterkte echter de uitbreiding aanzienlijk bij kweken met anti-μ korrels of met anti-Bp35. In dit opzicht leek anti-Bp50 of BCGF (tabel A, regel 3). Het was derhalve belangrijk om te bepalen of anti-Bp50 en BCGF samen B-celuitbreiding konden opwekken. Zoals geïllustreerd in tabel A, regel 4, werd door anti-Bp50 en BCGF samen geen uitbreiding opgewekt, maar werd uitbreiding van hetzij anti-μ hetzij anti-BP35 45 geactiveerde cellen iets meer versterkt dan door elk stimuleringsmiddel alleen. BCGF had, indien toegepast met anti-Bp50 zonder activerende stoffen, geen effect op de uitbreiding van dichte B-cellen, zelfs niet wanneer anti-Bp50 werd gebruikt in doses variërend van 0,1 tot 10 pg/ml.
TABEL A
50 Versterking van anti-lg of anti-Bp35 geïnduceerde B-celuitbreiding met ant»-BP50 antilichamen
Gemiddelde uitbreiding ± S.E. van B-cellen (gemeten als cpm), gekweekt met: regel Co-stimulans media anti-p-korreis anti-Bp35 55---- 1 geen 1.212 ±547 10.219 ± 462 5.539 ± 308 9 195022 TABEL A (vervolg)
Versterking van anti-lg of anti-Bp35 geïnduceerde B-celuitbreiding met anti-BP50 antilichamen
Gemiddelde uitbreiding ± S.E. van B-cellen (gemeten als cpm), gekweekt met: 5 ----- regel Co-stimulans media anti-p-korrels anti-Bp35 2 anti-Bp50 719 ±718 38.792 ±1.329 25.465 ± 616 3 BCGF 456 ±217 14.217 ± 445 9.443 ± 343 10 4 anti-Bp50 + BCGF 1.456 ±126 54.393 ± 537 46.488 ±3.387 i Uitbreiding van dichte Er- tonsillaire B-cellen (95% oppervlak IgM* cellen) werd op de beschreven wijze op dag 3 gemeten. In het kort werden 2x10* cellen/200 pi putje gekweekt in viervoud gedurende 48 uur met RPM11640 medium dat 15% foetaal runderserum plus additieven bevatte zonder antilichaam of met hetzij 2C3 monoklonaal antilichaam tegen μ-ketens gekoppeld aan sefarosekorrels ("anti-μ 15 -korrels’V50 pg/ml) hetzij vrij 1F5 anti-BP35 antilichaam (5 pg/ml). Cultures die media, "anti-μ korrels", of anti-BP35 antilichaam bevatten, werden alleen of met BCGF (5% eindconcentratie, Cytokine Technology, Buffalo, New York; zonder detecteerbare IL-1 of IL-2 activiteit), met anti-BP50 (1:1000 verdunning van ascites) als co-stimuleringsmiddelen gekweekt. Na 40 uur werd aan de cellen een hiervoor genoemde stoot 3H-thymidine gegeven, en de aantallen tellingen per minuut werden na 18 uur gemeten.
20 4.3.1. Anti-BP50 mAb versterkt uitbreiding alleen nadat B-cellen zijn geactiveerd door anti-Bp35 of anti-μ antilichamen
De resultaten in tabel A wijzen erop dat anti-Bp50 mAb op zichzelf niet in staat zijn om uitbreiding te induceren. Zoals getoond in figuur 4 hadden doses van anti-Bp50 mAb (G28-5) variërend van 0,05 pg tot 2,0 pg/ml geen effect op de opname van 3H-thymidine. In tegenwoordigheid van optimale niveaus van 25 anti-Bp35 mAb echter versterkten hoeveelheden anti-Bp50 antilichamen van slechts 0,-1 tot 0,5 pg/ml de uitbreiding aanzienlijk. Hoewel niet aangegeven in figuur 4 waren zelfs 50.000 tot 70.000 cpm detecteerbaar bij het optimale tijdstip van uitbreiding wanneer sterk gezuiverde B-cellen met anti-Bp35 antilichamen plus anti-Bp50 antilichamen werden gekweekt. Verder werd waargenomen dat doses van anti-Bp40 mAb die groter waren dan 2-5 pg/ml minder effectief waren dan doses in het gebied van 100-200 ng.
30 Deze resultaten wezen erop dat anti-Bp50 mAb alleen kunnen functioneren nadat B-cellen door andere signalen zijn geactiveerd. De in figuur 5 getoonde gegevens wijzen erop dat dit inderdaad het geval is. Wanneer B-cellen eerst geactiveerd werden met anti-Bp35, kon als anti-Bp50 mAb pas na 24-48 uur later worden toegevoegd deze toch uitbreiding op dag 4 versterken. Daarentegen was anti-Bp35 mAb, in het geval dat de cellen eerst met anti-Bp50 werden behandeld, alleen effectief wanneer het binnen een paar uur 35 na het begin van de kweek werd toegevoegd. Soortgelijke resultaten werden gevonden wanneer anti-p in plaats van anti-BP35 mAb werd gebruikt.
4.3.2. Anti-Bp50 mAb geven geen activering van B-cellen uit G0 maar induceren wel geactiveerde B-cellen tot verder doorlopen van de celcydus 40 Eerder werd door ons gevonden dat anti-Bp35 mAb, evenals geringe doses van anti-lgM, rustende tonsillaire B-cellen in G0 tot vergroting opwekken (E.A. Clark, et al., 1986, Leukocyte Typing II, eds.,
Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlijn, Vol. 2, 455-462) en tot overgang van de G1 fase van de celcyclus (J.T. Golay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Het was daarom belangwekkend om het vermogen van anti-Bp50 mAb te vergelijken met dat van anti-Bp35 mAb voor wat betreft hun effecten op de 45 B-celactivering. Zoals getoond in figuur 6A, hadden niet gestimuleerde dichte tonsillaire B-cellen zelfs na 3-4 dagen in cultuur een uniform RNA profiel dat karakteristiek is voor cellen in G0 (Z. Darzynkiewicz, 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:6696-6699). Ongeveer 15-30% van het anti-Bp35 mAb of anti-lgM gestimuleerde cellen had echter en verhoogd RNA gehalte dat duidt op overgang van Gv In tegenstelling daarmee induceerden noch anti-Bp50 mAb (figuur 6B) noch BCGF (figuur 6C) alleen een overgang van significante 50 aantallen van B-cellen naar Gv Bijvoorbeeld induceerden 2 dagen na de activering anti-Bp35 mAb en anti-lgM mAb respectievelijk 13,5% en 20,9% van tonsillaire cellen tot overgang naar G,, terwijl cellen die alleen met anti-Bp50 mAb (2,7%) of BCGF (3,2%) waren behandeld, op mediacontroleniveaus bleven (2,2%). Wanneer echter hetzij anti-Bp50 mAb hetzij BCGF samen met anti-Bp35 mAb of anti-lgM werden toegevoegd, steeg de hoeveelheid cellen die overgingen naar G, dramatisch. Evenzo gaven anti-Bp50 en 55 BCGF alleen geen inductie van B-cellen tot overgang naar de S fase (tabel B), maar samen met hetzij anti-B35 hetzij anti-lgM leidden zij tot een twee- tot drievoudige verhoging van het aantal cellen in de S fase.
195022 10
TABEL B
Effect van anti-Bp50 en BCGF op voortgang van de celcyclus in tonsillaire lymfocyten
Competentiesignaal Progressie- G0 % Cellen G, S/Ga/M
5 signaal media geen 89,9 7,1 2,5 anti-Bp35 geen 80,4 14,5 3,7 anti-lgM geen 65,6 27,6 5,7 10 media anti-BP50 83,6 12,0 3,3 anti-Bp35 anti-BP50 54,1 35,5 9,7 anti-lgM anti-BP50 43,6 36,2 16,2 media BCGF 85,4 11,7 2,2 anti-Bp35 BCGF 56,6 32,6 11,6 15 anti-lgM BCGF 48,4 36,1 14,1
Percentage van cellen in G0, Gv of S en G2 bepaald met behulp van de acridine oranje-kleuringsprocedure (Z. Darzynkiewicz, et al., 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:6696-6699); 1 x 10® dichte tonsillaire lymfocyten met anti-Bp35 (r pg/ml), anti-lgM op korrels (50 pg/ml), anti-BpSO (0,4 pg/ml), BCGF (5%) of combinaties zoals getoond.
20 4.3.3. Optimale condities voor versterking van B-celuitbreiding met anti-Bp50 antilichamen Antilichamen tegen Bp50 hebben op zichzelf weinig of geen aantoonbaar effect op dichte rustende B-cellen (tabel C). Bij aanwezigheid van middelen die B-cellen kunnen activeren zoals anti-lgM, anti-Bp35 en TPA, versterkte anti-Bp50 mAb echter de uitbreiding duidelijk.
25 Anti-Bp50 vertoonde echter geen duidelijke versterking van uitbreiding bij aanwezigheid van verschillende interleukines, zoals gezuiverd IL-1, recombinant IL-2 en BCGF (laag). Een vergelijking van de effecten van anti-Bp50 met die van BCGF (laag) liet zien dat dezelfde middelen die constimulatie met anti-Bp50 mAb gaven, ook costimulatie gaven met BCGF (laag) (tabel C). Van bijzonder belang was de vondst dat BCGF en anti-Bp50 mAb tezamen geen costimulatie van rustende cellen gaven.
30
TABEL C
Versterking van B-celuitbreiding met anti-Bp50 antilichamen of B-celgroeifactor
Gemiddelde uitbreiding ± S.E. van B-cellen (gemeten als cpm) gekenmerkt met: 35 -
Co-stimulans media anti-Bp50 (200 ng/ml) BCGF (5%) geen 96 ± 1 267 ± 15 285 ± 74 anti-lgM 5.833 ± 391 41.634 ±2.103 25.094 ± 61 40 anti-Bp35 (5 pg/ml) 457 ± 45 8.143 ± 280 1.733 ± 32 TPA (2 ng/ml) 7.361 ± 537 21.163 ± 871 13.063 ±1.030 IL-1 (10 U/ml) 264 ± 2 308 ± 23 221 ± 8 IL-2 (100 U/ml) 204 ± 34 350 ± 7 220 ± 11 BCGF (5%) 220 ± 7 851 ± 28 270 ± 18 45 -------
Dichte Er- tonsillaire B-cellen (meer dan 95% slgM* cellen) gekweekt gedurende 48 uur bij 2 x 105 cellen/putje, gevolgd door een stoot van 3H-thymidine voordat na 24 uur geteld werd.
Het verloop in de tijd van de door anti-Bp50 mAb versterkte uitbreiding is in figuur 7 aangegeven. De grootste uitbreiding vond plaats op dag 4 en nam daarna af ongeacht of de cellen met anti-Bp35 mAb of 50 andere activatoren zoals anti-lgM of TPA waren geactiveerd. Het verloop van de door BCGF of door anti-Bp50 mAb versterkte uitbreiding was hetzelfde.
Een hoeveelheid anti-Bp50 antilichamen van slechts 0,05 pg versterkte de uitbreiding. Een optimale dosis van 0,3 pg/ml werd in daaropvolgende onderzoeken gebruikt. Er werd steeds waargenomen dat wanneer hele antilichaammoleculen werden gebruikt, doses van anti-PB50 die groter waren dan 2 pg/ml 55 minder effectief waren dan doses in het bereid van 0,1-0,5 pg/ml.
Menselijke B-cellen zijn buitengewoon gevoelig voor remmende werkingen die via de Fc receptoren van aan oppervlakte Ig bindende antilichamen worden uitgeoefend (Parker, 1980, Immunol. Rev. 52:115; M.K.
11 195022 ' Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1825-1836). Het was derhalve belangrijk om de werkzaamheid van volledig anti-Bp50 mAb te vergelijken met die van anti-Bp50 Fjab^ fragmenten. Over een 100-voudig dosisbereik waren F(ab')2 fragmenten duidelijk even effectief als of effectiever dan volledig antilichaam voor wat betreft de versterking van B-celuitbreiding (tabel D). Derhalve is het Fc domein van anti-Bp50 mAb niet 5 nodig voor anti-Bp50 om zijn effect uit te oefenen en kan het hoogstens remmend werken.
TABEL D
Het Fc domein van anti-Bp50 antilichamen is niet vereist voor versterking van B-celuitbreiding 10 Gemiddelde uitbreiding van B-cellen, gemeten als cpm gekweekt met:
Anti-Bp50 Dosis (pg/ml) media anti-Bp35 geen - 295 ±16 269 ± 27 15 volledig Ab 0,125 278 ±32 5.140 ± 20 1.25 275 ± 24 4.686 ± 342 12,5 163 ±15 3.852 ±203 F(ab')2) 0,125 594 ±21 10.635 ±449 1.25 531 ± 3 10.893 ±575 20 12,5 279 ± 8 9.411 ±870
De celcultuurcondities waren zoals beschreven in tabel C.
4.3.4. Verschillen tussen anti-Bp50 mAb en BCGF (laag) activiteit
Anti-Bp50 mAb en BCGF (laag) hadden een vergelijkbaar effect op B-cellen en waren costimulatoir met 25 dezelfde middelen (tabel C). Er zijn echter verschillende aanwijzingen dat anti-Bp50 en het in dit onderzoek gebruikte BCGF via verschillende signalen werken. Op de eerste plaats worden Bp50 moleculen, anders dan BCGF (laag) receptoren, (M.K. Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1825-1836) al tot expressie gebracht op rustende bloed B-cellen (figuur 3). Op de tweede plaats, hoewel zowel anti-Bp50 als BCGF (laag) het meest effectief functioneren wanneer ze worden toegevoegd na anti-Bp35 of anti-lgM, was 30 anti-Bp50 mAb duidelijk het effectiefst wanneer het 12 uur na het begin van de kweek werd toegevoegd (figuur 8A). Daarentegen kon BCGF (laag) zelfs indien het 24 uur na de start van de cultures wordt toegevoegd nog een optimale versterking van de uitbreiding geven (figuur 8B). Deze experimenten, die de benadering van Howard en Paul (1983, Ann. Rev. Immunol. 1:307), als model gebruikten, wijzen erop dat een Bp50-afhankelijk signaal normaal zijn effect kan uitoefenen voor BCGF.
35 Zowel anti-Bp50 mAb als BCGF (laag) versterkten uitbreiding van B-cellen die geactiveerd waren met anti-Bp35 of anti-lgM (tabel C). Het effect van anti-Bp50 mAb en BCGF (laag) was echter in veel experimenten additief (figuur 7). Figuur 9 toont de invloed van de concentratie van BCGF (laag) in een experiment waarin anti-Bp50 mAb werd gebruikt in zijn optimale concentratie (0,2 pg/ml). BCGF (laag) kon verder de uitbreiding van rustende B-cellen versterken in tegenwoordigheid van anti-Bp50 na activering met anti-lgM 40 of met anti-Bp35. Optimale concentraties van BCGF (laag) waren 5-10%, terwijl vanaf 25% er een remmende werking optrad. Wanneer derhalve anti-Bp50 en BCGF (laag) allebij in hun optimale concentraties werden toegepast, vertoonden ze nog steeds additieve effecten op de B-celuitbreiding.
Tenslotte verschilden zowel normale als maligne B-celsubsets in hun reacties op anti-Bp50 mAb en op BCGF (laag). Bijvoorbeeld reageerden sommige bloed B-cellen op BCGF (laag) maar niet op anti-Bp50 45 mAb (tabel E). Een extra activeringssignaal zoals anti-Bp35 (tabel E) of TPA (figuur 10) was consistent nodig om mogelijk te maken dat bloed B-cellen reageerden op anti-Bp50 mAb. Terwijl dichte tonsillaire B-cellen in het algemeen niet reageerden op BCGF of anti-Bp50 mAb, reageerden bovendrijvende B-cellen wel (tabel E). Maligne B-cellen verschilden ook in hun respons op anti-Bp50 mAb versus BCGF. Bijvoorbeeld reageerden sommige B-cellymfoma’s op TPA plus BCGF (laag), maar niet op TPA plus G28-5 50 anti-Bp50 (figuur 10B en D). Daarentegen reageerden dichte tonsillaire B-cellen en periferale bloed B-cellen op TPA plus hetzij BCGF (laag) hetzij G28-5 anti-Pb50 (figuur 10A en C).
195022 12
TABEL E
B-celsubsets verschillen in hun respons op anti-Bp50 of BCGF
Gemiddelde uitbreiding (± S.E.M.) gemeten als cpm van lymfocyten uit: 5 ------—-
Bloed Tonsillen
Stimulans Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 dicht bovendrijvend 10 geen 527 ± 70 659 ± 133 906 ±106 385 ± 43 387 ± 12 BCGF 13.918 ±1.082 37.594 ± 2.023 3.347 ±174 332 ± 33 1.451 ± 57 anti-Bp50 (0,5 pg/ml) 519 ± 28 1.013 ± 81 1.151 ± 28 472 ± 8 1.543 ± 20 anti-Bp35 (5 pg/ml) 554 ± 90 645 ± 89 665 ±115 2.415 ± 80 1.129 ± 68 anti-Bp50 + anti-Bp35 - 12.274 ± 546 15.667 ± 333 36.589 ±1.335 4.843 ±136 15 anti-Bp50 + BCGF - - 3.943 ±115 1.342 ± 19 2.899 ± 91
De celkweekcondities waren zoals beschreven in tabel A. Aan nylonwol hechtende lymfocyten van het bloed (B-cellen plus monocytes) werden verarmd aan monocyten door incubatie gedurende een nacht in kunststofschalen voordat de stimulering plaatsvond (Exp. 1 en Exp. 2). in Exp. 3 werden bloed B-lymfocyten verarmd aan monocyten door incubatie gedurende 1 uur in kunststofschalen, voorafgaande 2q aan de stimulering. Tonsillaire B,-lymfocyten werden gefractioneerd met behulp van Percoll gradiënten tot dichte (pellet) of bovendrijvende (fractie 1) subsets (32).
4.4. Toepassingen van anti~Bp50 antilichamen
De anti-Bp50 antilichamen volgens de onderhavige uitvinding kunnen in vivo of in vitro worden gebruikt als 25 "adjuvans” voor het vergroten van een immuunrespons op een vaccin of voor het vergroten van de immuunrespons van een individu dat in een toestand van immunosuppressie verkeert.
De anti-Bp50 antilichamen volgens de onderhavige uitvinding kunnen in vitro worden gebruikt voor de bepaling of voor de afscheiding van cellen die het Bp50 antigeen bevatten en/of voor de detectie van eventueel vrijgekomen Bp50 in lichaamsvloeistoffen. In dit geval zou het anti-Bp50 antilichaam gelabeld 30 kunnen worden bijvoorbeeld met een radiolabel, fluorescerende verbinding, enzym, enzymsubstraat of een kleurstof. Voor het afscheiden van cellen het Bp50 antigeen bevatten kan het anti-Bp50 mAb gekoppeld zijn aan een vaste drager.
4.4.1. Toepassingen van anti-Bp50 antilichamen versterking van B-celuitbreiding 35 Uit voorgaande onderzoeken bleek dat de bij de overgang van B-cellen van G0 naar de G1o naar de G-fase teweeg brengen maar weinig of geen effect op B-celuitbreiding hebben. Toch kunnen deze zelfde middelen B-cellen brengen tot een punt in de celactivering waar ze gevoelig zijn voor groeifactoren. In tegenstelling daarmee hebben groeifactoren zoals BCGF of IL-2 alleen geen effect op rustende B-cellen maar versterken zij wel de groei van geactiveerde B-cellen.
40 Hoewel anti-Bp35 mAb B-cellen activeerde tot het overgaan naar de G^fase van de celcyclus induceerde het alleen weinig of geen uitbreiding. Anti-Bp50 mAb had het tegengestelde effect. Het kon rustende B-cellen niet activeren, maar zelfs indien het pas 12-24 uur na de activering werd toegevoegd, kon het B-celgroei induceren.
Voorgaande onderzoeken hebben verschillende t-cel-afgeleide BCGFs geïdentificeerd die evenals 45 anti-Bp50 de uitbreiding van B-cellen versterken. Zowel hoge als lage molecuulgewichtsvormen van B-celgroeifactoren zijn geïdentificeerd en voor verschillende typen is aangetoond dat ze additieve effecten hebben (J.H. Kehrl, et al., 1984, Immunol. Rev. 78:75-96; T. Kishimoto, 1985, Ann. Rev. Immunol. 3:133-157; S.L. Swain, et al., 1983, J. Exp. Med. 158:822-835; M. Howard, et al., 1984, Immunol. Rev. 78:185-210; J.L. Ambrus, et al., J. Clin. Invest. 75:732-739; J.L. Ambrus, 1985, J. Exp. Med. 162:1319-50 1335). Bp50 zou derhalve een receptor voor één van deze factoren kunnen zijn.
Met de uitzondering van IL-2 receptoren en de C3d receptor, zijn de receptoren op B-cellen voor groeisignalen nog niet geïdentificeerd. Het mAb AB-1 reageert met een B-celmerker die alleen tot expressie kom top geactiveerde B-cellen en BCGF-afhankelijke uitbreiding blokkeert, en derhalve de BCGF receptor of een verwante structuur zou kunnen herkennen. Bp50 blijkt van de AB-1 merker te verschillen omdat het 55 AB-1 mAb niet de binding van het G28-5 anti-Bp50 antilichaam blokkeert, en anders dan het G28-5 alleen reageert met geactiveerde B-cellen (L.K.L. Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924). Bp50 bevindt zich op alle B-cellen, hetgeen op basis van absorptie-analyse en directe bindingstests niet het geval blijkt te 13 195022 ' zijn voor BCGF receptoren. Onze huidige gegevens wijzen erop dat Bp50 en de receptor voor laag- moleculairgewicht BCGF onderscheiden structuren zijn. Gebruikmakend van een konijnenhetero-antiserum, is door Wang en medewerkers (Wang, 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) eerder een 54-kDa glycopro-teïne beschreven, gp54, dat evenals Bp50 tot expressie komt op alle B-cellen maar in lager niveaus op 5 bloed B-cellen dan op tonsillaire B-cellen. Het is mogelijk, maar onwaarschijnlijk, dat het konijnenhetero-antiserum en anti-Bp50 dezelfde of verwante structuren herkennen: anders dan anti-Bp50 mAb, was het konijnenantiserum tegen gp54 alleen voldoende om de uitbreiding van B-cellen te stimuleren.
Anti-Bp35 alleen kan anders dan anti-Bp50 B-cellen activeren van G0 naar G, en kan derhalve worden aangeduid als een ’’activerings” signaal. Of Bp35 al dan niet alleen in vroege B-celactivering functioneert is 10 nog niet duidelijk omdat anti-Bp35 antilichamen sommige B-cellen kunnen stimuleren tot deling (E.A. Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). Evenzo is mogelijk dat Bp50 niet uitsluitend functioneert als een ’’groei” signaal: anti-Bp50 antilichamen samen met activeringssignalen (anti-Bp35 of ' anti-μ) leidt niet alleen tot versterking van de uitbreiding maar ook tot vergroting van het totaal aantal B-cellen dat in G1 overgaat (tabel B). Met andere woorden leidt anti-Bp50 als constimulans tot bevordering 15 van de progressie van zowel de activering (G0 naar G.,) als de groei (G naar S) fasen van de celcyclus. Het in deze onderzoeken toegepaste BCGF had eveneens een soortgelijke activiteit (figuur 6C). Anti-Bp35 en anti-Pb50 (of BCGF) blijken derhalve zeer analoog te zijn aan de ’’competentie" en "progressie” factoren die in onderzoeken van fibroblast groeiregulering zijn beschreven. Hoe B-cellen reageren op anti-Bp35 of anti-Bp50 kan duidelijk afhangen van hun toestand van differentiatie of activering.
20 Hierin hebben wij aangetoond dat twee mAb, anti-Bp35 (een "competentie” signaal) en anti-Bp50 (een "progressie” signaal), samen een aanzienlijke uitbreiding van sterk gezuiverde B-cellen in afwezigheid van antigeen of andere bekende factoren kunnen induceren. De natuurlijke liganden voor deze structuren zijn nog niet bekend. Aangezien mAb tegen geschikte epitopen echter zowel oplosbare factoren als door cel-cel-interacties gemedieerde signalen kan imiteren, kunnen wellicht geschikte combinaties van mAb 25 worden gebruikt om humane B-celuitbreiding of differentiatie te sturen en reguleren. Dit zal op zijn beurt bijdragen aan het ontwerpen van strategieën in vivo voor de beheersen van menselijke ziekten zoals B-celmaligniteiten, immunodeficiënties en bepaalde auto-immuunziekten.
Het nieuwe monoklonale antilichaam G28-5, dat reageert met een enkele ketenpolypeptide van ongeveer 50 Kd dat op het oppervlak van humane B-cellen tot expressie komt, is slechts één monoklonaal anti-30 lichaam tegen Bp50. Er kan worden verwacht dat ook andere antilichamen tegen Bp50 de uitbreiding van geactiveerde B-cellen kunnen versterken. Omdat uitbreiding van menselijke B-cellen eveneens kan worden versterkt door van T-cel afkomstige BCGFs waaronder laag- en hoogmoleculairgewicht BCGF, is door ons de activiteit van anti-Bp50 G28-5 vergeleken met die van een BCGF preparaat dat overwegend laag-moleculairgewicht BCGF bevat. Anti-Bp50 G28-5 en BCGF (laag) vertoonden grote gelijkenis doordat ze 35 met dezelfde activeringsmiddelen constimulatie gaven (anti-lgM, anti-Bp35 en TPA),maar geen constimulatie gaven met elkaar of met IL-1 of IL-2. Verder was de activiteit van anti-Bp50 G28-5 niet afhankelijk van zijn Fc domein omdat Ftab^ fragmenten van G28-5 functioneel actief waren. Dit wijst erop dat oplosbaar anti-Bp50 evenals oplosbaar BCGF geen Fc-receptor-dragende accessoire cellen nodig heeft om een effect uit te oefenen. Verder zijn zowel anti-Bp50 als BCGF alleen effectief in tegenwoordigheid van een 40 activeringsprikkel. Met andere woorden zijn anti-Bp50 en BCGF geen "competentie” factoren, maar bevorderen eerder de "progressie” van B-cellen door de celcyclus.
Verscheidene resultaten wijzen erop dat Bp50 niet de receptor voor het in dit onderzoek toegepaste BCGF (laag) is. Bp50 komt tot expressie op ongeactiveerde B-cellen terwijl BCGF (laag) receptoren daarop niet tot expressie komen. Kandidaatstructuren voor de PCGF (laag) receptor komen anders dan Bp50 alleen 45 tot expressie op geactiveerde B-cellen. Verder verschillen zowel normale als maligne B-celpopulaties in hun respons op anti-Bp50 versus BCGF (laag) (tabel E en figuur 10). Bijvoorbeeld vertonen sommige B-lymfoma’s uitbreiding in respons op BCGF (laag), maar niet in respons op anti-Bp50. Tenslotte riepen in een aantal experimenten optimale concentraties van anti-Bp50 en BCGF samen meer uitbreiding op dan elk van beide alleen. Anti-Bp50 imiteert de activiteit van ander BCGF, zoals BCGF (hoog) die costimulatie 50 geven met anti-lgM (J.L. Ambrus, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1319; J.L. Ambrus, et al., 1985, J. Clin. Invest. 75:732). Dit wijst erop dat Bp50 zou kunnen functioneren als de receptor voor BCGF (hoog).
Hoewel Bp50 een receptor kan zijn voor een oplosbaar ligand, kan Bp50 anderzijds functioneren als een receptor voor een cel-cel-gemedieerd signaal dat BCGF receptorgehaltes en/of autocrineproductie reguleert. Aanwijzingen voor het dienst doen van differentiatie-antigenen zoals versterkers van een autocrine-55 receptorroute komen uit onderzoeken met T-cellen. Monoklonaal antilichaam tegen het Lp220 algemene leukocytantigeen versterkt de uitbreiding door verhoging van de IL-2 receptorexpressie op geactiveerd T-cellen (J.A. Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135:1819). Een analoog mechanisme zou kunnen weiken
Claims (2)
1. In essentie zuiver antilichaam of actief fragment daarvan dat bindt aan een polypeptide dat specifiek aanwezig is op het oppervlak van menselijke B-cellen, met het kenmerk, dat 40 (a) het antilichaam bindt aan een 50 kDa menselijke B-cel specifiek oppervlaktepolypeptide (Bp50), (b) na binding aan Bp50, dat op het oppervlak van een met anti-Bp35 of anti-lg geactiveerde B-cel aanwezig is, de uitbreiding van de geactiveerde B-cel zoals in vitro gemeten door [3H]-thymidine opname, bij een concentratie van 0,1 tot 0,5 pg/ml, versterkt.
2. Antilichaam of actief fragment daarvan volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat dit het door hybrido-45 macellijn ATCC HB 9110 geproduceerde monoklonale antilichaam G28-5 of een actief fragment daarvan is. Hierbij 10 bladen tekening
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87388486A | 1986-06-13 | 1986-06-13 | |
| US87388486 | 1986-06-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8701371A NL8701371A (nl) | 1988-01-04 |
| NL195022C true NL195022C (nl) | 2003-06-18 |
Family
ID=25362524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8701371A NL195022C (nl) | 1986-06-13 | 1987-06-12 | Antilichamen en actieve fragmenten daarvan die dienen voor het hiermee versterken van B-celuitbreiding. |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0762040B2 (nl) |
| KR (1) | KR910004100B1 (nl) |
| AT (1) | AT398437B (nl) |
| AU (1) | AU617087B2 (nl) |
| BE (1) | BE1000587A4 (nl) |
| CA (1) | CA1338781C (nl) |
| CH (1) | CH676600A5 (nl) |
| CY (1) | CY1681A (nl) |
| DE (1) | DE3719398C2 (nl) |
| DK (1) | DK173940B1 (nl) |
| FR (1) | FR2607136B1 (nl) |
| GB (1) | GB2191494B (nl) |
| GR (1) | GR870930B (nl) |
| HK (1) | HK10293A (nl) |
| IE (1) | IE60486B1 (nl) |
| IL (1) | IL82841A (nl) |
| IT (1) | IT1208649B (nl) |
| LU (1) | LU86919A1 (nl) |
| NL (1) | NL195022C (nl) |
| PT (1) | PT85073B (nl) |
| SE (1) | SE504675C2 (nl) |
| SG (1) | SG118992G (nl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5506126A (en) * | 1988-02-25 | 1996-04-09 | The General Hospital Corporation | Rapid immunoselection cloning method |
| US5397703A (en) | 1992-07-09 | 1995-03-14 | Cetus Oncology Corporation | Method for generation of antibodies to cell surface molecules |
| RS50101B (sr) * | 1996-02-24 | 2009-01-22 | Boehringer Ingelheim International Gmbh., | Farmaceutski preparati za imunomodulaciju |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4443427A (en) * | 1982-06-21 | 1984-04-17 | Sidney Farber Cancer Institute, Inc. | Monoclonal antibody |
| EP0117705A3 (en) * | 1983-02-24 | 1985-09-25 | The Regents Of The University Of California | Monoclonal antibody specific for monocytes and blast cells |
| FR2547731A1 (fr) * | 1983-06-27 | 1984-12-28 | Centre Nat Rech Scient | Immunotoxine antitumorale, preparations pharmaceutiques la contenant et son utilisation in vitro |
| US4585742A (en) * | 1983-12-14 | 1986-04-29 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Monoclonal antibody with specificity to human small cell carcinoma and use thereof |
-
1987
- 1987-06-10 BE BE8700641A patent/BE1000587A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1987-06-10 IL IL82841A patent/IL82841A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-06-11 GB GB8713650A patent/GB2191494B/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-11 DE DE3719398A patent/DE3719398C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-12 NL NL8701371A patent/NL195022C/nl not_active IP Right Cessation
- 1987-06-12 DK DK198703022A patent/DK173940B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-06-12 IE IE156387A patent/IE60486B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-12 JP JP62146811A patent/JPH0762040B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-12 KR KR1019870005969A patent/KR910004100B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-06-12 FR FR878708245A patent/FR2607136B1/fr not_active Expired
- 1987-06-12 PT PT85073A patent/PT85073B/pt unknown
- 1987-06-12 LU LU86919A patent/LU86919A1/fr unknown
- 1987-06-12 IT IT8720899A patent/IT1208649B/it active
- 1987-06-12 SE SE8702463A patent/SE504675C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1987-06-12 CA CA000539506A patent/CA1338781C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-15 AT AT0151387A patent/AT398437B/de not_active IP Right Cessation
- 1987-06-15 AU AU74214/87A patent/AU617087B2/en not_active Expired
- 1987-06-15 GR GR870930A patent/GR870930B/el unknown
- 1987-06-15 CH CH2240/87A patent/CH676600A5/de not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-11-10 SG SG1189/92A patent/SG118992G/en unknown
-
1993
- 1993-02-11 HK HK102/93A patent/HK10293A/xx not_active IP Right Cessation
- 1993-10-10 CY CY1681A patent/CY1681A/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ledbetter et al. | Antibodies to common leukocyte antigen p220 influence human T cell proliferation by modifying IL 2 receptor expression. | |
| US5182368A (en) | Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation | |
| US5786456A (en) | Bp 50-specific antibodies and fragments thereof | |
| Clark et al. | Activation of human B cells mediated through two distinct cell surface differentiation antigens, Bp35 and Bp50. | |
| Perussia et al. | Human natural killer cells analyzed by B73. 1, a monoclonal antibody blocking Fc receptor functions. I. Characterization of the lymphocyte subset reactive with B73. 1. | |
| Fleischer | A novel pathway of human T cell activation via a 103 kD T cell activation antigen. | |
| US5601819A (en) | Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding | |
| Yokochi et al. | B lymphoblast antigen (BB-1) expressed on Epstein-Barr virus-activated B cell blasts, B lymphoblastoid cell lines, and Burkitt's lymphomas. | |
| Ledbetter et al. | Augmentation of normal and malignant B cell proliferation by monoclonal antibody to the B cell-specific antigen BP50 (CDW40). | |
| Perussia et al. | A human NK and K cell subset shares with cytotoxic T cells expression of the antigen recognized by antibody OKT8. | |
| Freedman et al. | B7, a B-cell-restricted antigen that identifies preactivated B cells. | |
| Harada et al. | Identification of early plasma cells in peripheral blood and their clinical significance | |
| Clark et al. | Activation of human B cell proliferation through surface Bp35 (CD20) polypeptides or immunoglobulin receptors. | |
| Ledbetter et al. | Surface phenotype and function of tonsillar germinal center and mantle zone B cell subsets | |
| Degos et al. | Syndrome of neutrophil agranulocytosis, hypogammaglobulinemia, and thymoma | |
| JPH0638789A (ja) | 抗ｃｄ３刺激ｔ細胞の増殖を阻害するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体 | |
| Seiler et al. | Monoclonal antibodies: their chemistry, functions, and possible uses | |
| Vaickus et al. | Interferon gamma augments Lym-1-dependent, granulocyte-mediated tumor cell lysis | |
| NL195022C (nl) | Antilichamen en actieve fragmenten daarvan die dienen voor het hiermee versterken van B-celuitbreiding. | |
| Yamamoto et al. | Induction of Tac antigen and proliferation of myeloid leukemic cells by ATL-derived factor: comparison with other agents that promote differentiation of human myeloid or monocytic leukemic cells | |
| de Palazzo et al. | Potentiation of tumor lysis by a bispecific antibody that binds to CA19-9 antigen and the Fcγ receptor expressed by human large granular lymphocytes | |
| Payne et al. | Lymphocyte markers in non-Hodgkin's lymphomas | |
| US5028424A (en) | Antibodies to receptor and antigen for natural killer and non-specific cytotoxic cells | |
| Jewett et al. | Pentoxifylline suppresses interleukin-2-mediated activation of immature human natural killer cells by inhibiting endogenous tumor necrosis factor-alpha secretion | |
| EP0325489B1 (en) | Leu 23: Monoclonal antibody for monitoring leukocyte activation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| NP1 | Patent granted (not automatically) | ||
| V4 | Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent |
Effective date: 20070612 |