DK173940B1 - Ligander og fremgangsmåder til forøgelse af B-celle-proliferation samt B-celle-overfladeantigen Bp50 - Google Patents

Ligander og fremgangsmåder til forøgelse af B-celle-proliferation samt B-celle-overfladeantigen Bp50 Download PDF

Info

Publication number
DK173940B1
DK173940B1 DK198703022A DK302287A DK173940B1 DK 173940 B1 DK173940 B1 DK 173940B1 DK 198703022 A DK198703022 A DK 198703022A DK 302287 A DK302287 A DK 302287A DK 173940 B1 DK173940 B1 DK 173940B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
cells
cell
bcgf
proliferation
ligand
Prior art date
Application number
DK198703022A
Other languages
English (en)
Other versions
DK302287A (da
DK302287D0 (da
Inventor
Jeffrey A Ledbetter
Edward A Clark
Original Assignee
Oncogen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncogen filed Critical Oncogen
Publication of DK302287D0 publication Critical patent/DK302287D0/da
Publication of DK302287A publication Critical patent/DK302287A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK173940B1 publication Critical patent/DK173940B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

DK 173940 B1
Den foreliggende opfindelse angår ligander, såsom antlstof-moleky-ler eller -fragmenter af antistof-molekyler eller andre ligander, såsom lymphokiner, der binder til en 50kDa B-celle overflademarkør, der her betegnes Bp50, som fungerer ved B-celle proliferation men ikke ved tid-5 lig B-celle aktivering. Den foreliggende opfindelse angår også selve Bp50 B-celle antigenet. I en særlig udførelsesform af den foreliggende opfindelse beskrives et monoklonalt antistof, G28-5, der definerer Bp50 og synes at spille en rolle ved proli ferationen af aktiverede B-celler, men Ikke har nogen påviselig virkning på proliferationen af hvilende ΒΙΟ celler.
Liganderne, såsom antistoffer, lymphokiner og fragmenter deraf ifølge opfindelsen, kan anvendes til at styre og regulere human B-celle proliferation og/eller differentiation. Endvidere kan liganderne ifølge den foreliggende opfindelse modificeres ved at fastgøre andre forbindel-15 ser dertil, som kan anvendes til behandling og/eller påvisning af maligne celler, der udtrykker Bp50-antigenet.
Aktiveringen af hvilende B-celler fra GQ til Gj fase 1 cellens cyklus og den efterfølgende Induktion af aktiverede B-celler til at formere sig er adskilte trin, som kræver adskilte regulerende mekanismer.
20 Nogle midler, herunder murin B-celle stimulerende faktor-pl (BSF-pl) (Rabin, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 2935-2939) eller lave doser af antiimmunoglobulin (Anti-Ig) (DeFranco, et al., 1985, J. Immunol. 135:87-94; Wetzel, et al., 1984, J. Immunol. 133:2327-2332; DeFranco, et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1523-1536; Muraguchi, et al., 25 1984, 0. Immunol. 132:176-180) er "aktiver1ngsn-eller "kompetence"-faktorer. Det vil sige, at de inducerer B-celler til at vokse, syntetisere mere RNA og Indtræde i Gj, men alene inducerer de ikke DNA-syntese i B-celler. Andre "vækst"-faktorer, såsom human B-celle vækstfaktor (BCGF) og 1nterleukin-2 (IL-2) får aktiverede B-celler til at gennemgå celle-30 cyklen og indtræde i S-fase, men aktiverer ikke hvilende B-celler (Kehrl, et al., 1984, Immunol. Rev. 18:75-96; Muraguchi, et al., 1984, J. Immunol. 132:176-180; Zubler, et al. 1984, J. Exp. Med. 160:1170-1183; Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1597-1604).
Et antal faktorer, der fremmer væksten af B-celler, er nu blevet 35 beskrevet af forskere inden for både murine og humane systemer. Disse omfatter B-celle vækstfaktorer (BCGF) afledt fra en række forskellige kilder, herunder T-celle linier eller hybridomer, B-celle linier eller dendritiske celler. Selvom både interleukin-1 (IL-1) og 1nterleukin-2 2 DK 173940 B1 (IL-2) er blevet påvist at forøge B-celle vækst, er de tilsyneladende forskellige fra visse BCGF'er. F. eks. vil monoklonale antistoffer (mAb) mod en murin BCGF (O'Hara, et al., 1985, Nature (Lond.) 315:333) eller human BCGF (Ambrus, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1319) blokere BCGF-5 aktivitet, men ikke IL-1 eller IL-2 aktivitet. Selvom BCGF'erne er forskellige fra IL-1 eller IL-2, synes de i sig selv at være heterogene baseret på biokemiske data og differentiel aktivitet på forskellige B-celle-undergrupper eller i kostimulerings-forsøg. For eksempel er der blevet identificeret 60-kilodalton (kDa) højmolekylvægt human BCGF, BCGF 10 (høj), som er forskellig fra en 12-kDa lavmolekylvægtsform, BCGF (lav) (Ambrus, et al., 1985, J. Cl in. Invest. 75:732). cDNA'en, som koder for en 20-kDa murin BCGF, forsøgsvis kaldet B-celle stimulerende faktor pi (BSF-pl), er fornylig blevet klonet og sekvensbestemt (Noma et al., 1986, Nature 319:640). Rekombinant-lymphokinet har ikke alene BCGF-15 aktivitet, men kan også aktivere hvilende B-celler og inducere differentiation af IgGj-producerende celler. Det afviger således fra human BCGF (høj) og BCGF (lav) både med hensyn til molekylvægt og med hensyn til aktivitetsområde.
Disse aktiverings- og vækstsignaler regulerer antageligt celler ved 20 at Interagere med specifikke B-celle overfladestrukturer. Foruden det antigen-specifikke signal gennem overflade-Ig, er adskillige andre mulige B-celle overflade-polypeptider blevet identificeret, som på en eller anden måde kan fungere ved aktiveringen eller væksten af B-celler. F.eks. er celle-overfladereceptorerne for IL-1 (Dower, et al., 1985, 0.
25 Exp. Med. 160:501) og IL-2 (Robb et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1126) blevet karakteriseret, og fornylig er funktionelle IL-2-receptorer blevet identificeret på B-celler (Zubler, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1170; Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1597; Muraguchi, et al-, 1985, J. Exp. Med. 161:181). Receptorer for B-celle vækst og aktive-30 ringsfaktorer mangler imidlertid endnu at blive fuldt karakteriseret. Adskillige mulige B-celle overflade-polypeptider er blevet identificeret, som på en eller anden måde kan virke ved aktiveringen eller væksten af B-celler. F.eks. fandt Subbarao og Hosier (Subbarao, et al., 1983, Immunol. Rev. 69:81-97) at monoklonale antistoffer (mAb) mod det murine 35 B-celle antigen Lyb2 aktiverer B-celler, og der er fornylig fremlagt dokumentation for, at Lyb2 skulle være receptoren for BSF-pl (Yakura, 1985, Fed. Proc. 44:1532). Tilsvarende har de foreliggende opfindere fundet, at passende mAb (1F5) mod et 35 kDa polypeptid, Bp35, aktiverer 3 DK 173940 B1 humane B-celler fra Gq til Gj (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 82:1766-1770; Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Aggregeret C3d eller antistoffer mod 140 kDa C3d receptoren, Bpl40, forårsager proliferation af B-celler, der er T-celle afhængige (Melchers, 5 et al., 1985, Nature 317:264-267; Nemerow, et al., 1985, J. Immunol. 135:3068-3073; Frade et al., 1985, Eur. J. Immunol. 15:73-76). Selvom BCGF'er blevet identificeret i både mus og mennesker, er receptorerne for disse faktorer endnu Ikke blevet isoleret. Wang og medarbejdere (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) fremstillede et poly-10 clonalt antiserum, der identificerede et 54-kDa polypeptid (gp54) på humane B-celler, og viste at kanin-antiserum mod gp54 inducerede tonsillæ-re B-celler til deling, fornylig isolerede Jung og Fu (Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924) et mAb (AB-1) mod et 55-kDa antigen begrænset til aktiverede B-celler, der blokerer BCGF-afhæng1g prolifera-15 tion. Hvorvidt en anti-gp54 eller AB-1 genkender en BCGF receptor er imidlertid fortsat uvist.
Den foreliggende opfindelse angår ligander, der (a) binder til Bp50, et her beskrevet 50kDa B-celle-specifikt overflade-polypeptid, og (b) forøger proli ferationen af aktiverede B-celler. Opfindelsen angår 20 også selve Bp50-antigenet, der defineres af monoklonalt antistof G28-5 og virker ved proliferation af aktiverede B-celler. Endvidere angår opfindelsen ligander, der binder til Bp50, men ikke udviser en biologisk virkning eller funktion, såsom forøgelse af proliferationen af aktiverede B-celler.
25 Liganderne ifølge den foreliggende opfindelse omfatter antistof molekyler, monoklonale antistof-molekyler og fragmenter af disse antistof-molekyler, som Indeholder det antigen-kombinerende sted eller kemisk modificerede antistoffer og fragmenter, hvilke fragmenter omfatter, men er Ikke begrænset til Fv, Fab, F(ab')2, Fab' og lignende. Endvidere 30 omfatter liganderne ifølge den foreliggende opfindelse lymphokiner, som kan omfatte, men ikke er begrænset til, humane B-celle vækstfaktorer samt kemisk modificerede lymphokiner. Liganderne ifølge opfindelsen kan være kemisk modificerede, f.eks. ved binding eller kobling af en forbindelse til liganden. Sådanne forbindelser omfatter, men er ikke be-35 grænset til, cytotoxiske midler, terapeutiske midler, kemoterapeutiske midler, mærkninger, såsom radioaktive mærkninger, farvestoffer, enzymer, radioopaque forbindelser og lignende. Liganderne ifølge den foreliggende opfindelse kan 1 deres modificerede eller ikke- modificerede form an- DK 173940 B1 4 vendes til at styre, regulere og modificere human B-celle proliferation og/eller differentiation.
Den foreliggende opfindelse er baseret på opdagelsen af, at to humane B-celle differentiationsantigener, Bp35 og det her beskrevne B-5 celle-antigen, Bp50, tilsyneladende spiller distinktive roller som signalreceptorer ved B-celle aktivering. Monoklonale antistoffer (mAb) mod Bp35 og Bp50 afgiver begge positive signaler til B-celler, som simulerer deres omdannelse gennem cellens cyklus. mAb mod Bp35 fungerer ligesom ant1-Ig-antistoffer principielt ved at aktivere hvilende B-celler til at 10 blive kompetente til at indtræde i Gj-fasen for cellens cyklus. I modsætning hertil fungerer et her beskrevet monoklonalt antistof eller dets F(ab')2-fragment mod Bp50, et 50-kDa polypeptid, som udtrykkes på alle B-celler, således at aktiverede B-celler stimuleres til at gennemgå cellens cyklus og forøger proli ferationen af aktiverede B-celler. Monoklo-15 nåle antistoffer mod Bp35 aktiverer, ligesom antl-Ig- antistoffer, ton-sillære B-celler og inducerer B-celle proliferation på lavt niveau. I modsætning hertil aktiverer anti-Bp50 monoklonalt antistof alene ikke B-celler og inducerer heller ikke B-celler til at formere sig, men forøger sammen med anti-Bp35 eller anti-Ig-ant1stoffer B-celle proliferation. I 20 denne henseende ligner virkningen af anti-Bp50-anti$tof aktiviteten af B-celle vækstfaktorer (BCGF). Så lidt som 0,05 jig/ml anti-Bp50 er nødvendig for at forøge proliferation, og ligesom BCGF er anti-Bp50 effektiv, selv når det tilsættes 12 til 24 timer efter, at B-celler er blevet aktiveret med anti-Ig eller anti-Bp35. Uden yderligere exogene 25 signaler, inducerer anti-Bp35 og anti-Bp50 antistoffer sammen stærk proliferation af rensede hvilende B-celler. Disse resultater lader formode, at Bp35- og Bp50-overflade-molekylerne fungerer i den regulerende kontrol af B-celle aktiveringen og progressionen gennem cellens cyklus. På grund af den betydning anti-Bp35 og lignende 30 molekyler har på effekten og virkningen af liganderne ifølge den foreliggende opfindelse, Inkorporeres Clark et al., 1985, Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 82:1766-1770 som en del af den foreliggende beskrivelse.
Selvom aktiviteten af anti-Bp50 ligner aktiviteten af BCGF (lav), 35 eftersom både anti-Bp50 og BCGF (lav) er kostimulatoriske med de samme midler, men ikke med hinanden, og både anti-Bp50 og BCGF (lav) kun indvirker på aktiverede B-celler og virker i en opløst form, kan aktiviteten af anti-Bp50 skelnes fra aktiviteten af BCGF (lav), eftersom proli- DK 173940 B1 5 ferationen af B-celler, der er stimuleret med optimale mængder anti-Bp50 og anti-Bp35 (eller anti-Ig), kan forøges yderligere med BCGF (lav), og såvel blod B-celler som visse B-celle lymphomer reagerer forskelligt på anti-Bp50 og BCGF. For optimal aktivitet bør anti-Bp50 tilsættes inden 5 for 12 timer fra B-celle aktivering, hvorimod BCGF (lav) bevarer optimal aktivitet, selv ved tilsætning 24 timer efter aktivering. Endvidere udtrykkes Bp50 på alle B-celler, mens receptorer eller BCGF (lav) er begrænset til aktiverede B-celler. Således kan anti-Bp50 og BCGF (lav) koordinerende regulere B-celle vækst, men tilsyneladende vil dette ske 10 gennem distinkte signaler.
I en udførelsesform af den foreliggende opfindelse kan liganderne, som binder til Bp50 og forøger proli ferationen af aktiverede B-celler, anvendes til at forøge en Immunreaktion. F.eks. kan disse ligander, som binder Bp50, anvendes som en "adjuvant" til at forøge en immunreaktion 15 på en vaccine. Alternativt kan disse ligander anvendes til at forøge 1mmunreakt1onen hos et immunosuppresivt individ.
I en anden udførelsesform kan Uganderne ifølge opfindelsen modificeres kemisk, således at de celler, hvortil liganderne binder, dræbes.
Da alle B-celler udtrykker Bp50-antigenet, vil denne variant resultere i 20 suppression af immunresponset. F.eks. kan et cytotoxisk lægemiddel, der er bundet til en ligand ifølge den foreliggende opfindelse, anvendes in vivo til at bevirke immunosuppression for at krydse histokompatibili-tets-barrierer hos transplantationspatienter. Alternativt kan disse modificerede ligander anvendes til at bekæmpe autoimmune sygdomme.
25 I en anden udførelsesform af den foreliggende opfindelse kan malig- niteter, såsom tumorceller, der udtrykker Bp50, behandles ved at anvende en ligand ifølge opfindelsen bundet til et kemoterapeutisk middel, der er nyttigt til behandling af sådanne neoplasti ske sygdomme. Disse modificerede ligander kan anvendes 1n vivo til at rette det kemoterapeutiske 30 middel mod enhver type malign celle, der udtrykker Bp50-antigenet, herunder celler som ikke er B-celler, men som udtrykker Bp50. Når man anvender liganderne ifølge opfindelsen, som forøger B-celle proliferation, skulle en særlig fordel kunne opnås, når man behandler B-celle malignl-teter, hvor det til liganden bundne kemoterapeutiske middel omfatter et, 35 som er mere effektivt til at dræbe prol i fererende celler. I dette tilfælde skulle en forstærkning af lægemiddel virkningen kunne opnås.
Alternativt kan liganderne Ifølge opfindelsen anvendes in vitro til at identificere eller adskille celler, som udtrykker Bp50-antigenet 6 DK 173940 B1 og/eller til at undersøge legemsvæsker for tilstedeværelsen af Bp50-antlgenet, som eventuelt kan være spredt. Endvidere kan liganderne ifølge opfindelsen anvendes in vivo til at fange celler eller tumorer, som udtrykker Bp50-antigenet.
5 Det rensede Bp50-antigen Ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes til at fremstille antistoffer og til at fremstille eller designe andre ligander ifølge opfindelsen. Endvidere bør Bp50-antigenet kunne anvendes til undersøgelser, såsom diagnostiske immunoundersøgelser. Endvidere kan Bp50 i sig selv anvendes som en mediator for celle-Immunitet 10 in vivo eller in vitro.
DEFINITIONER
Som anvendt her vil følgende forkortelser have følgende betydninger: 15 AO * acridin-orange BC6F B-celle vækstfaktor
BCGF (høj) = en 60 kDa human BCGF
BCGF (lav) = en 12 kDa human BCGF
Bp35 “ et 35 kDa B-celle-specifikt overflade-polypeptid 20 (CD20) defineret af mAb 1F5
Bp50 * et 50 kDa B-celle-specifikt overflade-polypeptid defineret af mAb G28-5
Fv = den variable region eller det antigen-kombineren de sted i et antistofmolekyle. Dette kan være ethvert 25 fragment, som Indeholder idiotypen af molekylet, herunder, men ikke begrænset til Fab, FJab'^, Fab' og lignende.
IF - Immunofluorescens
Ig « Immunoglobulin 30 il-I = interleukin 1 IL-2 * interleukin 2 kDa = kilodalton mAb - monoklonalt antistof SDS-PAGE = natriumdodecylsulphat-polyacrylamid gel elektroforese 35 TPA - 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetat 7 DK 173940 B1
BESKRIVELSE AF FIGURERNE
Fig. 1. Ekspression af Bp50 er begrænset til Bp35± B-celler. Tofarvet flowcytometrisk analyse af 50.000 celler foretoges som beskrevet 5 (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). Resultaterne er plottede som celleantal versus log af grøn fluorescens og log af rød fluorescens, hvor 4-5 pletter repræsenterer omtrentlig en fluorescensfordobling. Resultaterne er præsenteret, så de viser autofluor-escente negative celler. PE (rød) -anti-Bp35 (1F5) versus FITC (grøn) -10 anti-Bp50 (G28-5) pletning viser, at alle Bp50+ celler også er Bp35+.
Fig. 2. Biokemisk sammenligning af Bp50-polypeptid med andre B-cel- 125 le overflade-antigener. Immunoudfældning af Bp50 fra overflade I-mær-kede tonsillære celler foretoges som beskrevet. Isolerede antigener elektroforeseredes på 10% SDS-polyacrylam1d pladegeler uden reduktion.
15 Geler visualiseredes med autoradiografi og intensiverende skærme. Plade A: spor 1, anti-Bp50 (G28); spor 2, anti-Bp95 (G28-8); spor 3, sepha-rose-ged-anti-mus Ig alene. Exponeringstid: 4 dage. Plade B: spor 1, ant1-Bp50 (G28-5); spor 2, anti-Bp45 (BLAST-2); spor 3, anti-Bp39 (G28- 1); spor 4 anti-Bp39 (41-H16); spor 5, sepharose-ged-anti-mus Ig alene.
20 En exponeringstid på 2 dage valgtes, således at båndene i spor 2 til 4 ikke blev overeksponerede og klart kunne skelnes i forhold til Bp50. Ét ud af 3 forsøg.
Fig. 3. To-farve Immunofluorescensanalyse af Bp50 ekspression. Perifere blod- eller tonsillære mononucleære celler isoleredes ved centrl-25 fugering på Ficoll og plettedes med PE (rød)-konjugeret G28-5 (anti-Bp50) i kombination med fluorescin (grøn) -konjugerede reference antistoffer, herunder 2C3 (anti-IgM); 1F5 (anti-Bp35); HBlOa (anti-DR); og 9,6 (anti-CD2, E receptor). Celler analyseredes med et FACS IV forsynet med fire decade-log-forstærkere 1 både røde og grønne dimensioner.
30 Lysspredning forfra og fra højre anvendtes til at fange monocyter. Uplettede celler befinder sig bagest i gitteret, rød fluorescens er til højre, og grøn fluorescens er til venstre.
Fig.4. Dos1s-reakt1onskurver for forøgelse af proliferation af tætte tonsillære Er- B-celler ved hjælp af anti-Bp50-antistoffer, som vist: 35 Medium alene, anti-Bp50 alene, anti-Bp35 (5/ig/ml) alene, BCGF alene, anti-Bp35 plus BCGF, anti-Bp35 plus graduerede doser af anti-Bp50. Middel -proli feration ± standard afvigelse på kvadropllcat-prøver måltes på dag 3.
8 DK 173940 B1
Fig. 5. Ant1-Bp50 mAb er mest effektive til forøgelse af proliferation, såfremt tilsætning sker efter et B-celle aktiveringssignal. Tætte tonslllære Er- B-celler Inkuberedes i 4 dage med medium alene, anti-Bp50 (0,5 /ig/ml) tilsat til forskellige tidspunkter efter inkubation, anti-5 Bp35 (5 /ig/ml) tilsat til forskellige tidspunkter efter Inkubation, anti-Bp50 holdt konstant, hvortil anti-Bp35 var tilsat senere til forskellige tidspunkter, anti-Bp35 holdt konstant, hvortil anti-Bp50 sattes til kulturer til forskellige tidspunkter. Over de sidste 10 timer ti 1 -sattes H-thymidin, og dets indkorporering måltes.
10 Fig. 6. Sammenligning af evnen hos anti-Bp35 og anti-Bp50 til at inducere hvilende tonsillære B-celler til at forlade Gø-stadiet for cellens cyklus. Dag 3 efter behandling media alene (_), anti-Bp35 alene (--------); og Ig alene (.........), A, ingen yderligere additi ver; B, anti-Bp50 (0,5 /ig/ml) tilsat hver gruppe; C, 5% BCGF tilsat hver 15 gruppe. Resultaterne er afbildet som relativt celleantal versus log til A0 rød fluorescens (RNA).
Fig. 7. Kinetik for B-celle proliferation efter stimulering med anti-Bp50 versus BCGF. Tætte tonsillære E- B-celler stimuleredes med medium alene, 10% BCGF alene, anti-Bp35 alene, anti-Bp50 alene, anti-20 Bp35 + 10% BCGF, anti-Bp35 + anti-Bp50; og anti-Bp50 + anti-Bp50 + 10% BCGF. Proliferation måltes på de angivne dage med en 18 timers impuls af 3 H-thym1din. Proliferation måltes i kvadroplicat, og standardafvigelser er vist. Ét ud af tre forsøg.
Fig. 8. Tider efter anti-Bp35 stimulering, hvor anti-Bp50 (A) eller 25 BCGF (B) forøger proliferation optimalt. Tætte tonsillære E- B-celler stimuleredes som vist, og proliferation måltes ved hjælp af en 18 timers o impuls af H-thymidin på dag 3. Medium, anti-Bp35 alene tilsat til de angivne tidspunkter, anti-Bp50 eller BCGF alene, anti-Bp35 tilsat ved kulturens start efterfulgt af tilsætning af anti-Bp50 eller BCGF til de 30 angivne tidspunkter, anti-Bp50 eller BCGF tilsat ved kulturens start efterfulgt af anti-Bp35. Ét ud af to forsøg. Proliferation måltes i kvadroplicat, og standardafvigelser er vist. Anvendte doser: anti-Bp35, 5 /ig/ml, anti-Bp50, 0,2 /ig/nl, BCGF (lav) 5%. Anvendte koncentrationer var følgende: anti-Bp35, 5 /ig/ml, anti-Bp50, 0,2 Mg/ml, BCGF, 5%.
35 Fig. 9. Anti-Bp50 og BCGF har additive virkninger på B-celle proli feration. Tætte tonsillære E- B-celler stimuleredes med graduerede doser af BCGF (lav) sammen med anti-Bp50 alene, anti-Bp35 alene, anti-Ig-per-ler alene, anti-Bp35 + anti-Bp50, eller anti-Bp50 + anti-Ig. Prolifera- 9 DK 173940 B1 3 tion måltes på dag 3 efter stimulering med en 18 timers impuls af H-thymidin. Proliferation måltes i kvadroplicat, og standardafvigelser er
C
vist. Ét ud af fire forsøg. Anvendte doser til 10 celler: anti-Bp35, 5 /ig/ml, anti-Bp50, 0,2 /ig/ml, anti-Ig-perler, 50 /ig/ml.
5 Fig. 10. Sammenlignende virkninger af anti-Bp50 og BCGF på normale og maligne B-celler. Perifere blod E- B-celler (A) eller tætte tonsillære E- B-celler (C) stimuleredes med eller uden TPA (75 ng/ml) i nærværelse af 10% BCGF eller 1 /ig/ml anti-Bp50. To separate B-celle lymphomer (plade B og D) stimuleredes på samme måde. Proliferation måltes på dag 3 3 10 ved indkorporering af H thymidin i løbet af en 12 timers impuls. Proliferation måltes i kvadroplicat, og standardafvigelser er vist.
DETALJERET BESKRIVELSE
Den foreliggende opfindelse angår ligander, som (a) binder til Bp50, et 50kDa B-celle-specifikt overflade-polypeptid, og (b) forøger 15 proli feratIonen af aktiverede B-celler. Opfindelsen angår også selve Bp50-antigenet, der defineres af mAb G28-5 og virker ved B-celle proliferation. Endvidere angår opfindelsen ligander, som binder til Bp50, men ikke udviser en biologisk virkning eller funktion, såsom forøgelse af proliferation af aktiverede B-celler.
20 Liganderne Ifølge den foreliggende opfindelse omfatter antistof molekyler, monoklonale antistof-molekyler og fragmenter af disse antistof-molekyler, som indeholder det antigen-kombinerende sted, som binder til Bp50-receptoren, herunder kemisk modificerede antistoffer og fragmenter, hvilke fragmenter omfatter, men er ikke begrænset til, Fv, Fab, 25 F(ab')2, Fab' og lignende. Endvidere omfatter liganderne ifølge den foreliggende opfindelse lymphokiner, som binder til Bp50-receptoren. Disse kan omfatte, men er ikke begrænset til, BCGF'er samt kemisk modificerede lymphokiner og lignende. Liganderne ifølge opfindelsen kan anvendes i deres modificerede eller ikke-modificerede former til module-30 ring og regulering af immunresponser og i terapien af maligniteter, som udtrykker Bp50-ant1genet. Disse anvendelser er nærmere diskuteret 1 afsnit 4 nedenfor.
Når liganden er et monoklonalt antistof eller et fragment deraf, kan det monoklonale antistof mod Bp50 fremstilles ved anvendelse af en-35 hver teknik, der bevirker fremstilling af antistof-molekyler ved hjælp af kontinuerte celle-linier i kultur. F.eks. kan anvendes den af Kohier og Milstein oprindeligt udviklede hybridom-teknik (1975, Nature 256:495-497) samt andre teknikker, der mere nyligt er blevet tilgængelige, såsom 10 DK 173940 B1 den humane B-celle hybridom-teknik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) og EBV-hybridom-teknikken til fremstilling af humane monoklonale antistoffer (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p. 77-96) og lignende, der alle 5 falder Inden for opfindelsens rammer.
Antistof-fragmenter, der indeholder idiotypen af molekylet, antages at kunne genereres ved hjælp af kendte teknikker. Sådanne fragmenter omfatter f.eks., men er ikke begrænset til: F(ab')2-fragmentet, som kan genereres ved at behandle antistof-molekylet med pepsin, Fab'-fragmen-10 terne, der kan genereres ved at reducere disulfid-broer i F(ab')2-frag-mentet, F(ab')2*fragmentet, som kan genereres ved behandling af antistof-molekylet med papain og 2Fab- eller Fab-fragmenterne, som kan genereres ved at behandle antistof-molekylet med papain og et reduktionsmiddel til reduktion af disulfid-broerne.
15 Når liganden, som binder Bp50, er en lymphokin, kan lymphokinen op nås ud fra naturlige kilder, eller, såfremt dens amlnosyresekvens er kendt eller udledt, kan lymphokinen syntetiseres via kemiske syntesemetoder. Alternativt kan, såfremt gen-sekvensen af lymphokinen er kendt, rekombinant-DNA-teknik anvendes til at klone genet i en ekspressions-20 vektor, som bevirker transskription og oversættelse af gen-sekvensen i en passende værtscelle.
Afhængigt af den påtænkte anvendelse kan liganden eller passende fragmenter af liganden modificeres kemisk ved at fastgøre en vilkårlig blandt en række forbindelser til liganden under anvendelse af i og for 25 sig kendte koblingsteknikker. Sådanne teknikker kan omfatte, men er ikke begrænset til, anvendelsen af carbodiimld, cyanogen bromid, bifunktionelle reagenser, såsom glutaraldehyd, N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP), Schiff base-reaktioner, fastgørelse til sulfhydryl-dele, anvendelse af natri umisothiocyanat eller enzymatisk binding for 30 blot at nævnte nogle få. Når en radioisotop skal fastgøres til liganden, kan dette også ske ved hjælp af enzymatiske midler, oxidativ substituering, chelatdannelse etc. For en gennemgang af de kemiske reagenser som kan anvendes til proteinmodifikation henvises til Lundblad og Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, Volume II, CRC Press, Inc., 35 Boca Raton, Florida, kap. 5, p. 123-139, 1984.
Den kemiske binding eller kobling af en forbindelse til liganden vil kunne styres til et sted på liganden, som ikke deltager i binding til Bp50. Dette vil kunne ske ved at beskytte ligandens bindingssted før 11 DK 173940 B1 foretagelse af koblingsreaktionen. F.eks. kan liganden først bindes til Bp50 for at beskytte Bp50-b1nd1ngsstedet, hvorefter koblingsreaktionen kan udføres til binding af den ønskede forbindelse til tilgængelige reaktive steder på I1gand-Bp50-komplekset. Når først koblingsreaktionen er 5 komplet, kan komplekset ryddes, og herved danne en modificeret ligand, hvortil den ønskede forbindelse er fastgjort, således at Bp50-bindings-stedet for molekylet påvirkes minimalt. Når liganden omfatter et monoklonalt antistof, såsom G28-5, hvori Fc-området for molekylet ikke kræves, for at liganden kan udøve sin virkning (se afsnit 3.3 nedenfor) 10 kan det være fordelagtigt at styre koblingen af ønskede forbindelser til molekylets Fc-område.
I de følgende underafsnit beskrives den nye 50-kDa B-celle overflademarkør, Bp50, der tilsyneladende virker ved B-celle proliferation, samt ligander der binder til den nye 50kDa receptor og anvendelser 15 deraf. Som et eksempel på liganderne ifølge den foreliggende opfindelse beskrives også et monoklonalt antistof, som definerer Bp50 og dets Fiab'Jg-fragmenter, og som, ligesom BCGF, forøger B-celle proliferation.
I modsætning til anti-Bp35 mAb, der kan inducere hvilende B-celler i G0 til at Indtræde i Gj, aktiverer anti-Bp50 mAb ikke hvilende B-celler.
20 Anti~Bp35 og anti-Bp50 mAb inducerer tilsammen, uden nogen yderligere exogene signaler, stærk aktivering og proliferation af rensede B-celler.
De nedenfor beskrevne forsøg viser også, at ant1-Bp50-akt1vitet ligner BCGF-aktivitet, men at anti-bp50 askiller sig fra én BCGF, eftersom anti-Bp50 og lavmolekylvægt BCGF er klart additive og virker for-25 skelligt på forskellige B-celle-undergrupper eller maligniteter. Bp50 kan være en receptor for en særskilt BCGF eller for et transmembran-signal, der modulerer BCGF-produkt1on eller BCGF-receptor ekspression.
1. ANVENDTE METODER TIL KARAKTERISERING AF Bp50-RECEPT0REN
Cellepræparater. Nononucleære celler i soleredes fra normalt eller 30 leukæmisk heparaniseret perifert blod ved hjælp af Ficoll-Hypague gradienter (Pharmacia, Piscataway, NJ). Hononucleære celler opnåedes fra tonsillært væv som beskrevet (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 82:1766-1770). T-celler fortyndedes med AET-behandlet fåre-erythro-cyt-rosetterlng og Ficoll-Hypague gradient-separering. I nogle forsøg 35 berlgedes B-celler fra blod ved Isolering af nylonuld-adhærente celler. Monocytter fjernedes ved inkubation på plastic petri-skåle en eller to gange ved 37°C i 45 minutter med mindre andet er anført. Flydende eller tætte tonsillære B-celle fraktioner isoleredes ved hjælp af Percoll 12 DK 173940 B1 step-gradienter som beskrevet (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 82:1766-1770). Tætte tonsillære B-celle præparater havde til stadighed mere end 95% slg+ Bp35+ celler. Blod-B-celle berigede præparater havde 60 til 85% slg+ celler. B-celle lymphomaceller Isoleredes ved 5 mild påvirkning af lymphomaceller i medium efterfulgt af Ficoll-Hypague gradient-centrifugering.
Monoklonale antistoffer. G28-5 antistoffet mod Bp50 udvikledes ved at immunisere BALB/c mus med human E- tonsillære lymphocytter og fusionering af immune miltceller med en NS-1-myeloma (Kohler, et al., 1975, 10 Nature 256:495-497; Ledbetter, et al., 1979, Immunol. Rev. 47:63-82). Hybride cellekulturer, som udskilte antistof, der var reaktivt med tonsillære B-celler og ikke med T-celler, identificeredes ved anvendelse af Indirekte immunofluorescens (IF) og analyse med et FACS IV cellesorteringsapparat. Kulturer med antistof, som gav histogrammønstre svarende 15 til kendt mAb mod pan B-celle-markører (f.eks. Bp35) klonedes og udvalgtes til yderligere studium. G28-5 klonen dannede et IgGj-mAb, som kun reagerede med normale eller maligne B-celler eller B-celle-1inier. Andet mAb, som blev anvendt i dette studium, er blevet detaljeret beskrevet (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sc1. USA 82:1766-1770; Clark et 20 al., 1986, Human Immunol. 16:100; Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15:30-44; Ledbetter, et al., 1985, 1n Perspectives in Immunooene-tics and Histocompatibility. ASHI, New York, 6, p. 325-340). Disse omfatter 1F5 (IgG2a) anti-Bp35, HBlOa (IgG2a), anti-HLA-DR, 2C3 (IgGj) anti-u-kæde, G19-4 (IgGj) anti-CD3, FC-2 (IgG2a) anti-Fc receptor CD16 25 og 9,6 (IgG2a) anti-CD2 (E-receptor) leveret af Dr. Paul Martin (Martin, et al., 1983, J. Immunol. 131:180). IgGj-mAb'erne rensedes ved fældning under anvendelse af 45% eller 50% mættet ammoniumsulfat og DEAE sepha-cryl-søjlechromotografi, og IgG2a-mAb'erne rensedes ved anvendelse af protein A sepharose-kolonner. F(ab'^-fragmenterne af G28-5 fremstille-30 des ved hjælp af Parhams metode (Parham, et al., 1983, J. Immunol. 131:2895) rensedes på en 2 meter lang sephacryl S200 kolonne og undersøgtes for renhed ved hjælp af SDS-PAGE (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135:1819). 2C3-mAb mod u-kæder konjugeredes til sepharose 4B perler (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) under anvendelse af cy-35 anogenbromid-kobling.
Fluorescin oo phvcoervthrln-kon.luQerinqer. Renset mAb konjugeredes enten direkte med fluorescin under anvendelse af fluorescin-1sothiocyan at (FITC, Molekylære Prober) (grøn) ved hjælp af Godings metode 13 DK 173940 B1 (Goding etc al., 1976, J. Immunol. Meth. 13:215-226) eller konjugeredes til R-phycoerythrin (PE) (rød) ved anvendelse af SPDP (Pharmacia) med en metode, der er detaljeret beskrevet 1 Ledbetter, et al., 1985, Perspectives in Immunogenetics and .Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-5 129. Lymphoide celler inkuberedes i rundbundede microtiter-plader 1 30 minutter med en passende fortynding af grøn og/eller rød mAb, vaskedes to gange, og analyseredes dernæst på et FACS IV cellesorteringsapparat.
To-farve immunofluorescens. To-farve studier foretoges med et fluorescens-aktiveret celle-sorterlngsapparat (FACS IV: Becton-Dickinson, 10 Mountain View, CA) under anvendelse af et 560-nm dikroisk spejl til spaltning af strålen og et 580 lang-pass filter og et 540 kort-pass filter (Ditric Optics, Hudson, MA) foran henholdsvis det røde og grønne fo-tomultiplier-rør. Endvidere anvendtes en to-farve kompensator (T. Noza-ki, Stanford University) til at korrigere for små fejl spredninger af 15 grønne og røde signaler. For hver to-farve pletning opsamledes data fra 40.000 celler, og de opbevaredes på floppy disks. Resultaterne præsenteres som celleantal (lodret) versus log grøn fluorescens versus log rød fluorescens på et 64 x 64 plet-gitter. Omkring 4,5 pletter repræsenterer en fluorescens fordobling. Uplettede celler befinder sig i det bageste 20 hjørne af gitteret, rød fluorescens er til højre, og grøn fluorescens er til venstre. Det anvendte cytometrlsystem til to-farve IF med fluoresdn og phycoerythrin er beskrevet mere detaljeret (Ledbetter, et al., 1985, i Perspectives In Immunogenetics and Histocompatibility. ASHI, New York, 6, 119-129 og 325-340).
25 Cellekultur. Blod- eller tonsillære lymphoide celler dyrkedes i en c mængde på 5-10 x 10 ml i kvadroplicat i 96-brønde microtiter-plader indeholdende 200 μΐ RPM1-1640 medium tilsat 15% fetalt okse-serum, antibiotika, glutamin og pyruvat (R15). Efter 1 til 7 dage pulseredes celler med 0,5 pCi af H-thymidin pr. brønd (New England Nuclear, 6,7 Ci/mmol; 30 1 Cl=37) i 18 timer. Dernæst høstedes celler på glasfiberfiltre med en cellehøster, og radioaktivitet måltes i en scinti 11ationstæller. I nogle forsøg tilsattes antistoffer eller faktorer til forskellige tidspunkter efter start af kulturerne, og proliferation i disse forsøg måltes på dag 3.
35 Kostimulerende faktorer. Renset BCGF indkøbtes fra Cytokine Techno logy (Buffalo, New York) og indeholdt ingen påviselig IL-1, IL-2 eller interferon aktivitet. Denne BCGF fremstilledes ved hjælp af fremgangsmåden ifølge Maizel og medarbejdere (Maizel, et al., 1982, Proc. Nat.
DK 173940 B1 14
Acad. Sc1. USA 79:5998), som har vist, at hovedparten af BCGF-aktivite-ten 1 dette materiale beror i en 12-kDa forbindelse, der herefter omtales som "BCGF (lav)" (Mehta, et al., 1985, J. Immunol. 135:3298). Rensningstrinene omfattede DEAE-affinitetschromatografi i præparativ skala 5 efterfulgt af hydroxylapatit-søjlechromatografi. IL-1, som var renset til homogenitet, var en generøs gave fra Dr. Steven Dower (Dower, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:501). Rekombinant IL-2 var venligst leveret af Cetus Corporation. TPA (12-0-tetradeconyl phorbol 13-acetat) var indkøbt fra Sigma.
10 Påvisning af celleaktivering. Ændringer i cellevolumen induceret med mAb og/eller faktorer måltes ved anvendelse af et cellesorteringsapparat og en lys-spreder med lysindfald forfra. Cellecyklus-ændrlnger i cellulært RNA- og DNA-indhold måltes ved pletning af aktiverede celler med acridin orange og måling af relativt cellulært RNA- (rød) og DNA-15 indhold (grøn) med et cellesorteringsapparat ved hjælp af fremgangsmåden ifølge Darzynkiewicz et al. (Darzynkiewicz, et al., 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:6697-6702). Ændringer i relative Indhold af celleoverflade-antigener måltes ved anvendelse af et mAb direkte konjugeret med fluoresdn og kvantificeredes dernæst ved direkte IF fluorescens-20 mængder ved hjælp af et Epics V cellesorterlngsapparat.
Biokemisk karakterisering af Bp50. Immunofældning af Bp50 fra 1 25 overflade I-mærkede tonsillære celler foretoges som beskrevet (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 134:4250-4254). Isolerede antigener elektroforeseredes på 10% SDS polyacrylamid pladegeler uden reduktion.
25 Geler visualiseredes under anvendelse af autoradiografi ved -70°C og Cronex belysning plus intensiverende skærme (Dupont).
2. KARAKTERISERING AF Bp50 RECEPTOREN
I de følgende underafsnit beskrives resultaterne af de under anvendelse af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder udførte forsøg.
30 2.1. IDENTIFIKATION AF EN B-CELLE SPECIFIK 50 kDa CELLE
OVERFLADEMARKØR, Bp50
Et mAb mod Bp50 frembragtes ved at immunisere BALB/c mus med humane tonsillære lymphocytter og fusion af immune miltceller med NS-1 myelomet. Én klon, G28-5, dannede et IgGj mAb, som ikke Indeholdt den 35 lette kæde af NS-1. Efter nærmere undersøgelse ved IF-analyse fandtes G28-5 kun at reagere med normale eller maligne B-celler eller B-celle linier. En omfattende screening af normalt væv ved hjælp af etablerede metoder (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770; 15 DK 173940 B1
Ledbetter et al-, 1986, Human Immunol. 15:30-44; Ledbetter, 1985, in Perspectives In Immunooenetics and Histocompatibility. ASHI, New York, 6, p. 325-340) viste, at G28-5 antistoffet reagerer med E-roset negative (Er-) celler fra blod eller toniler, men ikke med nylonuld-nonadhærente 5 T-celler, PHAinducerede T-celle-blaster eller med blod-granulocytter, monocytter, røde blodlegemer eller blodplader. Det reagerede stærkt med alle 7 undersøgte B-lymphoblastoide celle linier og med 3 Burkitt's lymphoma linier (Raji, Daudi, Namalwa), men ikke med 4 T-celle linier (CEM, HSB-2, JURKAT, og HPB-ALL). Alle undersøgte kroniske lymphocytiske 10 leukæmier (3/3) og 90% (9/10) af undersøgte B-lymphomer udtrykte Bp50-markøren, mens kun 28% (2/7) af non-T, non-B CALLA+ akutte lymphocytiske leukæmi er udtrykte Bp50.
Den begrænsede fordeling af Bp50 på normalt væv bekræftedes yderligere af kvantitative to-farve immunofluorescens (to-farve IF) analyser.
15 Under anvendelse af et R-phycoerythr1n (PE)-konjugeret antistof (rødt) mod pan B-celle-antigenet Bp35 (Bl, CD20) samt fluoresdn-konjugeret anti-Bp50 antistof (grønt) viste det sig, at Bp50 kun blev udtrykt på Bp35+ B-celler (Fig. 1) i blod eller tonsiler. Blod B-celler udtrykte konsistent noget lavere niveauer af Bp50 end tonslllære B-celler, hvil -20 ket svarer til HLA-DR ekspression (Ledbetter et al., 1986, Human Immunol .15:30-44) samt gp54 ekspression (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) der også er lavere på blod B-celler. Bp50 udtryktes ved lignende niveauer på tonsillære B-celle subpopulationer, der var adskilt på Percoll gradienter 1 flydende og tætte fraktioner. Under anvendelse 25 af det foreliggende PE-konjugerede mAb mod T-celle markøren, CD3(T3), og NK-celle-associeret markør, CD16 (Fc receptor) (Ledbetter, et al., 1979, Immunol. Rev. 47:63-82), viste det sig, at Bp50 ikke udtrykkes på T-celler eller NK-celler. Under anvendelse af to-farve IF viste det sig endvidere, at CD3+ PHA-blaster, der udtrykte høje niveauer af IL-2 recepto-30 rer, ikke udtrykte Bp50.
G28-5 antistoffet reagerede med et enkelt polypeptid på tonsillære lymphocytter, der migrerede ved ca. 50 Kd under ikke-reducerende betingelser (Fig. 2A). Dette molekyle er større end de tidligere rapporterede B-celle markører 1 samme molekylvægtsinterval, såsom Bp39 eller Bp45 35 (Zipf, et al., 1983, 0. Immunol. 131:3064-3072; Kitner, et al., 1981, Nature 294, 458-460; Clark, et al., 1986, i Leukocyte Typing II. eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, kap. 12 bind 2, 155-167; SI ovin, et al., 1982, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79:2649-2653; Thorley- 16 DK 173940 B1
Lawson, et al., 1985, J. Immunol. 134:3007-3012, og Fig. 2B). Eksponeringstiden for denne gel valgtes således, at molekylvægtene af de andre B-celle markører let kunne sammenlignes med Bp50. Bp39 markøren udtrykkes i modsætning til Bp50 på granulocytter, og Bp45 er, i modsætning til 5 Bp50, begrænset til B-celle-blaster. Antistoffer mod Bp39 (41-H16) og Bp45 (MNM6, Blast-1, Blast-2), der var stillet til rådighed fra et international arbejdsmøde (Clark, et al., 1986, 1 Leukocyte Typing II. eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, kap. 12, bind 2, 155-167) blokerede ikke bindingen af fluorescinerede anti-Bp50 antistoffer 10 mod B-celler. Baseret på vævsfordeling, biokemisk analyse og blocking-studier genkender G28-5 monoklonal antistoffet således en 50-Kd struktur, der er forskellig fra andre kendte B-celle-antigener.
2.2 EKSPRESSION AF Bp50 ER BEGRÆNSET TIL B-CELLER Både hæmatopoietiske vævs- og cellelinie distributionsstudier samt 15 detaljeret to-farve flow cytometisk analyse viste, at Bp50 kun udtrykkes på B lymphocytter. Som vist i figur 3 udtrykkes Bp50 på en lille undergruppe af blod lymphocytter og på en stor population af tonsillære lymphocytter. Praktist taget alle Bp50+ celler i både blod og tonsiler udtrykte også Bp35 og HLA-DR, men udtrykte ikke CD2 (Fig. 1) eller CD3, T-20 celle molekyler eller IgG Fc-receptorerne, der findes på NK-celler, Endvidere udtrykte ConA-aktiverede CD3+ T-celle-blaster IL-2-receptorer, men udtrykte ikke Bp50.
To-farve flow cytometrisk analyse muliggør kvantitativ måling af densitetsrelationen mellem to overflade-antigener. Det er tidligere på-25 vist, at de tætte, hvilende B-celler i kappe-zonen for sekundære follikler udtrykker IgM og lave niveauer af Bp35, mens flydende, aktiverede B-celler i germinal centret er IgM-negative og udtrykker forhøjede niveauer af Bp35 (Ledbetter, et al., Human Immunol. 15:30). Figur 3 viser, at både IgM-po$it1ve og IgM-negative B-celle undergrupper ud-30 trykte Bp50 1 samme mængder, hvilket Indikerer, at Bp50 udtrykkes på både hvilende B-celler og in vivo aktiverede B-celler.
3. FORØGELSE AF B-CELLE PROLIFERATION NED ANTI-Bp50 ANTISTOF Som tidligere forklaret, kan B-celler aktiveres med lave doser af anti-u-kæde specifikke antistoffer. Det har fornylig vist sig, at den B-35 celle specifikke markør Bp35 (Bl), et 35-kDa polypeptid, også kan fungere 1 tidlig B-celle aktivering, idet 1F5 mAb mod Bp35, ligesom lave doser af anti-u-antistof, aktiverer B-celler til at vokse 1 cellevolumen og RNA-indhold og blive reaktionsdygtige på BCGF (Clark, et al., 1985, 17 DK 173940 B1
Proc. Nat. Acad. ScI. USA 82:1766-1770; Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Det var derfor af interesse at sammenligne virkningen af anti-Bp50 mAb ved proli ferationen af ubehandlede B-celler eller B-celler, der var aktiveret med enten anti-Bp35 eller anti-u-antistoffer 5 (tabel I). Anti-Bp35 1 opløsning eller anti-u-antistoffer fastgjort til Sepharose-perler, alene under passende betingelser, kunne stimulere nogen B-celle proliferation (tabel I, linie 1). I modsætning hertil stimulerede anti-Bp50 antistoffer alene Ikke proliferation (tabel I, linie 2). Anti-Bp50 mAb forøgede imidlertid proliferation væsentligt, når det 10 dyrkedes med anti-u-perler eller med anti-Bp35. I denne henseende lignede anti-Bp50 BCGF (tabel I, linie 3). Det var derfor vigtigt at bestemme, hvorvidt anti-Bp50 og BCGF tilsammen kunne inducere B-celle proliferation. Som vist i tabel I, linie 4 inducerede anti-Bp50 og BCGF tilsammen ingen proliferation, men forøgede proliferation af enten anti-15 u eller anti-Bp35 aktiverede celler noget mere end hver stimulant alene.
BCGF havde over et tre-log interval, ved anvendelse med anti-Bp50 uden andre signaler, ingen virkning på proliferation af tætte B-celler, selv når anti-Bp50 anvendtes 1 doser varierende fra 0,1 til 10 pg/ml.
20 TABEL I
Forøgelse af anti-Ig eller anti-Bp35 induceret B-celle proliferation med anti-Bp50 antistoffer
Middel proliferation ± standard S.A. af B-celle kulturer med: 25
Linie Ko-stimulant Medium_Anti-u-perler Anti-bp35_ 1 Ingen 1.212+547 10.2191462 5.5391308 2 anti-Bp50 7191718 38.79211,329 25.4651616 3 BCGF 4561217 14.2171445 9.4431343 30 4 anti-Bp50 _+ BCGF 1.456+126 54.39312,537 46.488+3,387
Proliferation af tætte Er-tonsillære B-celler (95% overflade IgM+ celler) måltes på dag 3, som beskrevet, I korte træk dyrkedes 2 X 10^ cel-ler/200 μΐ brønd i kvadroplicat 1 48 timer med RPMI 1640 medium indehol-35 dende 15% føtalt okseserum plus additiver uden antistof eller med enten 2C3 monoklonalt antistof mod u-kæder koblet til Sepharose-perler ("anti-u-perler", 50 øg/ml) eller fri 1F5 anti-Bp35 antistof (5 /tg/ml). Kulturer indeholdende medium, "anti-u-perler" eller anti-Bp35 dyrkedes alene 18 DK 173940 B1 eller med BCGF (5% slutkoncentratlon, Cytokine Technology, Buffalo, New York; har ingen påviselig IL-1 - eller IL-2-aktivltet) med anti-Bp50 (1:1000 fortynding af asciter) som ko-stimulanter. Efter 40 timer 1m- 3 pulsbehandledes celler med H-thymidin, og inkorporerede tælnlnger mål-5 tes efter 18 timer.
3.1 ANTI-Bp-50 mAb FORØGER KUN PROLIFERATION EFTER AT B-CELLER ER AKTIVERET MED ANTI-Bp35- eller ANTI-U-ANTISTOFFER
10 Resultaterne i tabel I lader formode, at anti-Bp50 mAb ikke i sig selv kunne inducere proliferation. Som vist i figur 4 havde doser af 3 anti-Bp50, varierende fra 0,05 /ig til 2,0 /tg/ml ingen virkning på H-thymldin optagelse. I nærværelse af optimale mængder anti-Bp35 mAb forøgede så lidt som 0,1 til 0,5 pg/ml anti-Bp50 antistoffer imidlertid 15 væsentligt proliferation. Så meget som 50.000 til 70.000 cpm var påviselig på det optimale tidspunkt for proliferation, når stærkt rensede B-celler dyrkedes alene med anti-Bp35 plus anti-Bp50. En konsistent Iagttagelse var, at højere doser af anti-Bp50 (mere end 2 til 5 pg/ml) var mindre effektive end doser i intervallet 100 til 200 ng.
20 Disse resultatet antyder, at anti-Bp50 kun kan fungere, efter at B- celler er aktiveret ved hjælp af andre signaler. Resultater vist 1 figur 5 lader formode, at dette rent faktisk er tilfældet. Så fremt B-celler først blev aktiveret med anti-Bp35, kunne anti-Bp50 blive tilsat så sent som 24 til 48 timer senere og stadig forøge proliferation på dag 4. I 25 modsætning hertil var anti-Bp35, når celler først behandledes med anti-Bp50, alene effektivt, såfremt det tilsattes Inden for nogle få timer efter kulturernes påbegyndelse. Tilsvarende resultater blev fundet, når anti-u anvendtes i stedet for anti-Bp35.
3.2 ANTI-Bp50 mAb AKTIVITERER IKKE B-CELLER UD AF GQ HEN INDUCERER
30 AKTIVEREDE B-CELLER TIL AT GENNEMLØBE CELLE-CYKLUS
Det er tidligere fundet, at anti-Bp35, ligesom lave doser af anti-u-antistoffer, inducerer hvilende tonsillære B-celler 1 GQ til at vokse (Clark, et al., 1986, Leukocyte Typing II. eds., Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, Bind 2, 455-462) og til at indtræde i Gj fasen 35 af celle-cyklus (Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Det var defor af interesse at sammenligne evnen hos anti-Bp50 mAb med anti-Bp35 mAb for deres virkninger på B-celle aktivering. Som vist 1 figur 6A havde ustimulerede tætte tonsillære B-celler, selv efter 3 til 4 dage 1 19 DK 173940 B1 kultur, en ensartet RNA-profil, der er karakteristisk for celler i GQ {Darzynkiewicz, 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:6697-6702). Ca. 15-30% af celler stimuleret med anti-Bp35 eller anti-u havde imidlertid forøget RNA-indhold, som indikerer indtræden i Gp I modsætning hertil 5 inducerede hverken anti-Bp50 (fig. 6B) eller BCGF (fig. 6C) alene signi-ficante antal B-celler til at indtræde i Gp For eksempel 2 dage efter aktivering inducerede anti-Bp35 og anti-Ig mAb henholdsvis 13,5% og 20,9% tonsillære celler til at indtræde i Gp hvorimod celler, der alene var behandlet med anti-Bp50, (2,7%) eller BCGF (3,2%) forblev på medium 10 kontrol-niveauer (2,2%). Når imidlertid hverken anti-Bp50 eller BCGF tilsattes sammen med anti-Bp35 eller anti-u antistoffer, voksede mængden af celler, der indtrådte i Gp dramatisk. Tilsvarende inducerede anti-Bp50 og BCGF alene ikke B-celler til at indtræde i S-fase (tabel II), men sammen med enten anti-Bp35 eller anti-u vokser antallet af S-fase 15 celler to- eller tre-dobbelt.
TABEL II
Virkningen af anti-Bp50 og BCGF på progressionen af celle-cyklus i ton- $ i Hære lymphocytter 20 __
Kompetence- Gennemløbnings- Gq % celler S/G^/M
signal signal Gj medium ingen 89,9 7,1 2,5 25 anti-Bp35 ingen 80,4 14,5 3,7 anti-Ig ingen 65,6 27,6 5,7 medium anti-Bp50 83,6 12,0 3,3 ant1-Bp35 anti-Bp50 54,1 35,5 9,7 30 anti-Ig anti-Bp50 43,6 36,2 16,2 medium BCGF 85,4 11,7 2,2 anti-Bp35 BCGF 56,6 32,6 11,6 anti-ία BCGF 48,4 36,1 14,1 35 Celler i procent i GQ, Gj eller S og G2 bestemt ved acridine-orange pletningsmetoden (Darzynkiewicz, et al., 1980 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:6697-6702); 1 X 10® tætte tonsillære lymphocytter med anti-Bp35 (5 j /ig/ml), anti-u på perler (50 pg/ml), anti-Bp50 (0,4 øg/ml), BCGF (5%) 20 DK 173940 B1 eller kombinationer, som vist.
3.3 OPTIMALE FORHOLD FOR FORØGELSE AF B-CELLE PROLIFERATION NED ANTI-Bp50 ANTISTOFFER
I sig selv har anti-Bp50 antistoffer kun ringe eller Ingen påvise-5 lig virkning på tætte hvilende B-celler (tabel III). I nærværelse af midler, der kan aktivere B-celler, såsom anti-Ig, anti-Bp35 og TPA, forøgede anti-Bp50 mAb Imidlertid klart proliferation. Anti-Bp50 ko-stimulerede ikke med adskillige interleukiner, herunder renset IL-1, rekombi-nant IL-2 og BCGF (lav). En sammenligning af virkningen af ant1-Bp50 med 10 virkningen af BCGF (lav) viste, at de stoffer som var ko-stimulatoriske med anti-Bp50 også var ko-stimulatoriske med BCGF (lav) (tabel III). Af særlig interesse fandtes, at BCGF og anti-Bp50 tilsammen stadig ikke var ko-stimulatoriske for hvilende celler.
15 TABEL III
Forøgelse af B-celle proliferation med anti-Bp50 antistoffer eller B-celle vækstfaktor
Middel proliferation ± standard S.A. af B-celle 20 dyrkedes med:
Anti-Bp50 BCGF
fa.·; stimulant_ttedlum_(ZOjL.nq/mi)_(5¾_ ingen 96 ±1 267 ± 15 285 ± 74 25 anti-Ig 5.833 ± 391 41.634 ± 2,103 25.094 ± 61 anti-Bp35 (5 /ig/ml) 457 ± 45 8.143 ± 280 1.733 ± 32 TPA (2 ng/ml) 7.361 ± 871 21.163 ± 871 13.064 ± 1,030 IL-1 (10 U/ml) 264 ±2 308 ± 23 221 ± 8 30 IL-2 (100 U/ml) 204 ± 34 350 ±7 220 ± 11 BCGF 15%) 220 ±7 851 ± 28 270 ± 18 Tætte Er- tonsillære B-celler (større end 95¾ sIgM+ celler) dyrkedes i c 48 timer ved 2 X 10 celler/brønd efterfulgt af 24 timers Impulsbehand- 3 ling med H-thymidin før tælning.
35 _
Kinetiken fra forøget proliferation med anti-Bp50 er vist i figur I
7. Proli ferationshøjdepunktet nåedes på dag 4, hvorefter det dalede J
uanset om celler aktiveredes med anti-Bp35 eller andre aktivatorer, 21 DK 173940 B1 såsom anti-Ig eller TPA, eller ej. Den kinetiken fra forøget proliferation med BCGF eller Bp50 var den samme.
Så lidt som 0,05 /xg af anti-Bp50 antistoffer forøgede proliferation. En optimal dosis på 0,3 μς/ηιΐ anvendtes i efterfølgende studier.
5 En konsistent observation var det, at højere doser af anti-Bp50 (større end 2-5 /ig/ml) var mindre effektive end doser på 0,1-0,5 Mg/ml, når der anvendtes hele antistof-molekyler.
Humane B-celler er stærkt sensitive over for de i nhi bi tori ske virkninger formidlet af Fc-receptorerne, der binder til overflade-Ig 10 (Parker, 1980, Immunol. Rev. 52:115; B1jsterbosch, et al., 1985, J. Exp.
Hed. 162:1825). Det var således vigtigt at sammenligne hele anti-Bp50 mAb's virkningsfuldhed med anti-Bp50 Fiab'^-fragmenternes. Over et hundred-fold doseringsinterval var F(ab')2~fragmenterne klart lige så effektive som, hvis ikke mere effektive end, hele antistoffer til for-15 øgelse af B-celle proliferation (tabel 1111). Anti-Bp50 mAb's Fc-domæne er således ikke nødvendigt for at anti-Bp50 kan udøve sin virkning og kan, om noget, have inhibitoriske egenskaber. Med andre ord kan anti-Bp50, ligesom BCGF, tilsyneladende fungere som et opløseligt mellemprodukt uden hjælp fra FC-receptor-formidlet accesorisk cellefunktion.
20 22 DK 173940 B1
TABEL IIII
Fc-domænet for anti-Bp50 antistoffer 5 er ikke nødvendig til forøgelse af B-celle proliferation
Middel proliferation af B-celler 10 dyrket med:
Dosis
Anti -Bd50_(gg/ml)_Medium_Anti-Bp35
Ingen -- 295 ± 16 269 ± 27
Hele Ab 0,125 278 ± 32 5.140 ± 20 15 1,25 275 ± 24 4.686 ± 342 12.5 163 ± 15 3.852 ± 203 F (ab')2 0,125 594 ± 21 10.635 ± 449 20 1,25 531 ± 3 10.893 ± 575 12.5 279 ± 8 9.411 ± 870
Cellekulturforhold var som beskrevet i tabel III.
25 _ 3.4 FORSKELLE MELLEM ANTI-Bp50- og BCGF- (lav) aktivitet Anti-Bp50 og BCGF (lav) havde en lignende virkning på B-celler og var kostimulatorlske med de samme stoffer (tabel III). Adskillige bevls-raekker indicerer dog, at anti-Bp50 og det i dette studium anvendte BCGF 30 tilsyneladende virker gennem forskellige signaler. For det første udtrykkes Bp50-molekyler, i modsætning til BCGF- (lav) receptorer (Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1825), på hvilende blod B-celler (fig. 3). For det andet, selv om både anti-Bp5Q og BCGF (lav) fungerer mest effektivt, når de tilsættes anti-Bp35 eller anti-Ig, var 35 anti-Bp50 klart mest effektivt, når det blev tilsat 12 timer efter dyrkningens begyndelse (fig. 8A). I modsætning hertil kunne BCGF (lav) tilsættes så sent som 24 timer efter dyrkningens begyndelse og stadig være 1 stand til optimalt at forøge proliferation (fig. 8B). Disse kinetiske DK 173940 B1 23 eksperimenter, som er udformet efter fremgangsmåden beskrevet af Howard and Paul (1983, Ann. Rev. Immunol. 1:307) antyder at et Bp50-afhængigt signal generelt kan udøve sin virkning før BCGF.
Både anti-Bp50 og BCGF (lav) forøgede proliferation af B-celler, 5 der var aktiveret med anti-Bp35 eller anti-Ig (tabel III). Virkningen af anti-Bp50 og BCGF (lav) var imidlertid additiv i mange forsøg (fig. 7).
Fig. 9 viser en titrering af BCGF (lav) i et forsøg, hvor anti-Bp50 blev anvendt i dets optimale koncentration (0,2 Mg/ml). BCGF (lav) kunne yderligere forøge proliferation af hvilende B-celler i nærværelse af 10 anti-Bp50 efter aktivering med enten anti-Ig eller med anti-Bp35. Optimale koncentrationer af BCGF (lav) var 5-10%, medens 25% var inhibito-risk. Når derfor anti-Bp50 og BCGF (lav) begge anvendtes i deres optimale koncentrationer, udviste de fortsat additive virkninger på B-celle proliferation. Endelig afveg både normale og maligne B-celle undergrup-15 per i deres reaktioner på anti-Bp50 og BCGF (lav). For eksempel reagerede nogle blod B-celler på BCGF (lav), men reagerede ikke på anti-Bp50 (tabel IV). Et yderligere aktiveringssignal såsom anti-Bp35 (tabel IV) eller TPA (fig. 10) var til stadighed nødvendigt, for at blod B-celler kunne reagere på anti-Bp50. Medens tætte tonsillære B-celler i alminde-20 lighed ikke reagerede på hverken BCGF eller anti-Bp50, reagerede flydende B-celler (tabel IV). B-celle maligniteter varierede også i deres reaktionsevne på anti-Bp50 i forhold til BCGF. For eksempel reagerede nogle B-celle lymphomaer på TPA plus BCGF (lav), men ikke på TPA plus G28-5 anti-Bp50 (fig. 10B og D). I modsætning hertil reagerede tætte 25 tonsillære B-celler og perifere blod B-celler på TPA plus enten BCGF (lav) eller anti-Bp50 (fig. 10A og C).
30 35 24 DK 173940 B1 LO S-
cm r-- o OD ro --1 s- σ> <D
r~< LO CM LO r—i 05 O) ^5 i— φ 4-5 (/> I i- Ό +1 +1 -Η -H 44 +1 *> t 3 0)
c: >-> O E
Φ r-. i—i ro 05 ro CTi o U- —· Ό OD LO »i- CM -<0- 05 O 4-5 4->
>, ro "J- LO Γ-l CO CO C OM QJ
r ' · * o o
Ll_ r-T r-H r—I CM £ L Γ—
ri Q (D
<u LO 4—0.
r— 3 O
r— r- Ϊ1 O)
-r- CIM E D
LO LO 5----4-1 CO C ro S- O 4-5 4-5
s_ o ro «'i- fW
li_ t*— i— roro o · σ» i— ·—·—< 4-> CD3 «0- CO CO 00 ·—i —i r— os- cd o»··- τ- οο a> 44 -Η -Η -Η -Η Ή O c: 4-> i -Γ- Φ S- 5- 4-5 4-» LO CM CM LO 05 CM CO S- i— Φ tu >, fy od co r·- ih co m- *—o-nJ p i— cj i— ro co m- lo ro ·— c r— O · · · S- 3 ΙΛ 05 CD _CI CM LO ·—< 05 E <J -·- CL ΓΟ 4-> -i- -r- Ό o E +5 45 +5 fl LO >-» >1 W Μ Ια i— υ ιί o t
m O S- r— I
I (4— -C O 0.1— j— Γ0 O- ^4— r~~ +-} E *c0 o
C -—V >,X3 O. O
ro r— 3 5-
2: LO M- LO ΓΟ LO 5- C CD
•ro - ro o Γ-- OD ·—I ro ·—1 CD O O O- Π UJ —( —( CM ( CO ·—1 4-5 4— *r- • r— C 4-> «♦- CD LO 0) -Η -Η -H +1 -H +1 05 S- <0 <0
C CL S- Φ jO
> 4-i t= lo f < lo c— ro fy > 33 cd CD ·—- 0) 0*J-LO LO LO 43- Γ O 5C l/l <52 <0 <33 ro —i ID LD CT5 Ό C3 1— C C DaC . · β C’r 41 o o llj ro·—' lo ro 1 0) Ό
i— T— »—4 Ό 4-5 "O C
4- 5 4-1 r— 4-5 CD CD
>. .* CO 3 « > >
CO S- C C C
_j 01 0> O s- ro UJ S- 4- I— 0) 0» cq ··- ro >v— 4-> S-
<C </) i— CM C -CL} 4-5 CD
>— οι o ro o 10 1 -*Γ >,-σ s- t- ro · ·-< σ» **· 3 m u c 03 O. CM r-4 CM CO 0D LO 0 0 0 3
Ό r— ··— C
r- c— 4-1 +1 +1 -Η -H 1 CO 4-> O M
•r- (D CD V) E <D
Ό "O O- 05 to Lf) **- · re ~Ό
5- Ό O E LO (35 —i -L>- C- —4 <— S- CD
05 -r-l— CD LO LO O LO CM α O i-
05 JE CD LO · · · r— 4- <D
r— jr hs ·—c CM 4) -ro c > uj ro ·—4 c o. l o I*— Γ0 05 — CO 4-5 C 4-5 4-5 · 04J —
L_ -r- -r- >1 <e CM
aj 4-5 υ S- ro CL D « 0 4"—
CL tM <D JD -C
0 03 > 33 CL 1- S-
i- O 05 J* E 4> CD
05 O · 00 o S- C >1 4-5 CL
i- r—ir--—I CM 05 -5C -Γ- r— 4-5 Q- φ </> 1 >l 33 T3 r— 44 -H 44 44 1 1 05 T3 UJ U 5- C CD 1 1 JD 01 O 02 3 CL Γ-" CO 05 <*· > (Λ -C S- E cm <—1 i—1 m EcdO-cd CD 01 LO 05 LO LO O S- XI E Ό
1— lo · 1/5 0> CD >1 C
r- -4T CO 4-5 T3 ·— 32
05 LU —I S- 4-> C I
L5 05 >-i >5 S-·—- 1 LO O 4-> LU —l CO r— O T3 CD C 3 05 C 05 O S- O u- c E ro fy τ- οο -I- 1—4-5 O 4-1 S- I— r— J* CO φ o ΟΙ -Γ Π Ό4- a« l 05 —- LO + S- E C 4- c i— ro 3 w c •r- —. O E LO .— O CL O +5 (D ΙΛΙ- S- a? lo ro 1— lo m m r-Tjjc o 05 LO O. 05 CL E CL 1 CL 3 «I 05 ·Ό *— — co a. eo æ -·- co j«i td wc 3 C I 10514-5 1 05 C ·—· C Ol E Φ U_ -I- in -i- a. -Γ- C v- r- >> -I- X) •r— 0504-5-4-5 4-5 (0 4-5 r— 4-5 - S- >, 4-5 CO CO cm C C CD T3 Φ ΓΟΟ >—· CQ ro re>-r- ro 4- nJ U 3Ni-4- 25 DK 173940 B1 4 ANVENDELSER AF ANTI-Bp50 LIGANDER OG Bp50
Liganderne Ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes 1n vivo eller in vitro, 1 deres umodificerede eller modificerede former, til modulering af immunoreaktioner. For eksempel kan selve liganderne anven-5 des som en "adjuvant" til forøgelse af en immunoreaktion på en vaccine eller til at forøge immunoreaktionen for et immunosuppressivt individ. Alternativt kan disse modificerede ligander, såfremt cytotoxiner eller ant1-proliferative midler kobles til liganderne, anvendes til at formindske en immunoreaktion, f.eks. i tilfælde af en autoimmun sygdom 10 eller hos transplantationspatienter for at undgå transplantat-afstødning. Disse modificerede ligander vil også kunne anvendes til at behandle maligniteter, som omfatter celler eller tumorer, der udtrykker Bp50-ant1genet, uanset om maligniteten oprindeligt er B-celle.
Både liganderne ifølge den foreliggende opfindelse og/eller Bp50 i 15 sig selv kan anvendes in vitro. Sådanne anvendelser omfatter in vitro undersøgelser såsom immunoundersøgelser til påvisning af celler, der udtrykker Bp50-antigenet og/eller til påvisning af eventuelt "shed" Bp50-ant1gen i legemsvæsker. I dette tilfælde kan liganden eller Bp50 mærkes med en radiomærkning, fluor, enzym, enzymsubstrat, farvestof, 20 etc. Endvidere kan liganderne anvendes til separering og/eller Identificering af celler, der udtrykker Bp5G-antigenet, 1 hvilket tilfælde liganden kan kobles til en immobil bærer eller til et fluorstof, der kan anvendes i en FACS (fluorescens-aktiveret cellesorteringsapparat).
De forskellige anvendelser af liganderne og Bp50 ifølge den fore-25 liggende opfindelse diskuteres nærmere nedenfor.
4.1 Bp50 RECEPTOR OG ANVENDELSER AF LIGANDER SÅSOM ANTI-Bp50 TIL FORØGELSE AF B-CELLE PROLIFERATION
Tidligere studier har ladet forstå, at de faktorer, som er Involveret i induktionen af B-celler fra Gq- til Gj-fasen 1 cellecyklus, er 30 forskellige fra de faktorer eller krav, som bevirker overføring i S-fasen. Denne model er primært baseret på studier, som viser, at midler såsom lave doser af ant1-Ig B-celle aktiveringsfaktorer, eller anti-Bp35 alene, har ringe eller ingen virkning på B-celle proliferation. Alligevel kan de selvsamme midler drive B-celler til et punkt i celleaktive-35 ring, hvor de er modtagelige for vækstfaktorer. I modsætning hertil har vækstfaktorer såsom BCGF eller IL-2 alene ingen virkning på hvilende B-celler, men forøger vækst af aktiverede B-celler.
26 DK 173940 B1
Uanset at den foreliggende opfindelse ikke skal være begrænset til en bestemt teori eller forklaring, giver de her viste resultater yderligere grundlag for en model til distinkt regulering af B-celle aktivering og væksttrin. Det er her blevet påvist, at aktiverings- og prolifera-5 tionssignaler i humane B-celler kan overføres gennem distinkte celle-overfladestrukturer. Selv om anti-Bp35 mAb aktiverede B-celler til at indtræde i cellecyklus' Gj-fase, alene, inducerede det ringe eller ingen proliferation. Anti-Bp50 mAb havde den modsatte virkning, idet det ikke kunne aktivere B-celler, men ved tilsætning så sent om 12-24 timer efter 10 aktivering kunne det inducere B-celle vækst.
Bp50-molekylet vil formentlig normalt kunne fungere som enten en receptor for en ligand såsom en opløselig vækstfaktor eller for et signal medieret gennem celle-celle kontakt (dvs. en ligand, der findes på overfladen af en anden celle). Tidligere studier har identificeret ad-15 skillige T-celle-afledte BCGF'er, der, lige som anti-Bp50, forøger B-celle proliferation. Både høj- og lavmolekylvægtformer af B-celle vækstfaktorer er blevet identificeret, og forskellige typer er blevet påvist at have additive virkninger (Kehrl, et al., 1984, Immunol. Rev. 18:75-96; Kishlmoto, 1985, Ann. Rev. Immunol. 3:133-157; Swain, et al. 1983, 20 J. Exp. Med. 158:822-835; Howard et al., 1984, Immunol. Rev. 78:185-210; Ambrus, et al., J. Cl in. Invest. 75:732-739; Ambrus, 1985, J. Exp. Med. 162:1319-1335). Bp50 kunne derfor være en receptor for én af disse faktorer.
Med undtagelse af IL-2-receptorer og C3d-receptoren er receptorerne 25 på B-celler for vækstsignaler endnu ikke blevet identificeret. mAb-AB-1 reagerer med en B-celle markør, som kun udtrykkes på aktiverede B-celler og blokerer BCGF-afhængig proliferation, og kunne derfor eventuelt genkende BCGF-receptoren eller en beslægtet struktur. Bp50 synes at være forskellig fra AB-1-markøren, eftersom AB-1 mAb ikke blokerer bindingen 30 af G28-5-anti-Bp50-antistoffet, og, 1 modsætning til G28-5 mAb, kun reagerer med aktiverede B-celler (Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924). Bp50 findes på alle B-celler, hvilket, baseret på absorptionsanalyse og direkte bindings-undersøgelser, ikke synes at være tilfældet for BCGF-receptorer. De foreliggende data Indikerer, at Bp50 35 og receptoren for lavmolekylvægt BCGF er forskellige strukturer. Under anvendelse af et kanin-heteroantiserum beskrev Wang og medarbejdere (Wang, 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) tidligere et 54-kDa-glyco-protein, gp54, der, lige som Bp50, udtrykkes på alle B-celler, men ved 27 DK 173940 B1 lavere niveauer på blod B-celler end tonsillære B-celler. Det er muligt, men usandsynligt, at kanin-heteroantiserummet og anti-Bp50 genkender de samme eller beslægtede strukturer, men i modsætning til anti-Bp50 mAb var kanln-antiserummet mod gp54 alene tilstrækkeligt til at stimulere B-5 celle proliferation.
Anti-Bp35 kan alene, i modsætning til anti-Bp50, aktivere B-celler fra Gq til Gj og kan således omtales som et naktiverings"-s1gnal. Hvorvidt Bp35 fungerer alene 1 tidlig B-celle aktivering er endnu ikke klarlagt, eftersom anti-Bp35-antistoffer kan stimulere nogle B-celler til 10 deling (Clark et al., 1985, Proc. Nast. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). Tilsvarende kan Bp50 ikke rigtigt fungere alene som et "vækst"-signal, idet anti-Bp50-antistoffer sammen med aktiveringssignaler (anti-Bp35 eller anti-u) ikke blot forøger proliferation, men også forøger det totale antal B-celler, som indtræder i Gj (tabel II). Med andre ord v1r-15 ker anti-Bp50 som kostimulant til at fremme progressionen af både aktiverings- (Gq til Gj) og vækst- (G til S) faser af cellecyklus. Den i disse studier anvendte BCGF havde også lignende aktivitet (fi g. 6C). Ant1-Bp35 og anti-Bp50 (eller BCGF) synes derfor at være mest analoge med "kompetance"- og "progressions"-faktorer, der er beskrevet i studier 20 vedrørende fibroblast-vækst-regulering. Hvordan B-celler reagerer på anti-Bp35 eller anti-Bp50 kan helt klart afhænge af deres differentierings- eller aktiveringstilstand.
Det er her påvist, at to mAb, anti-Bp35 (et "kompetance"-s1gnal) og anti-Bp50 (et "progressions"-signal) tilsammen kan inducere væsentlig 25 proliferation af stærkt rensede B-celler i fravær af antigen eller andre kendte faktorer. De naturlige ligander for disse strukturer kendes endnu ikke. Da mAb mod passende epitoper imidlertid kan ligne både opløselige faktorer og signaler, som medieres af celle-celle Interaktioner, kan det være muligt at anvende passende kombinationer af mAb til at styre og 30 regulere human B-celle proliferation eller differentiering. Dette vil Igen hjælpe med til at anvise strategier in vivo til bekæmpelse af humane sygdomme såsom B-celle maligniteter, immuno-mangelsygdomme og visse autoimmune sygdomme.
Det hidtil ukendte monoklonale antistof, G-28-5, som reagerer med 35 et enkeltkædet polypeptid på ca. 50 Kd udtrykt på overfladen af humane B-celler, er kun en bestemt udførelsesform af liganderne ifølge den foreliggende opfindelse, som kan forøge proli ferationen af aktiverede B-celler. Da human B-celle proliferation kan forøges tilsvarende ved hjælp 28 DK 173940 B1 af T-celle-afledte BCGF'er, herunder lav- og højmolekylvægt BCGF, sammenlignedes aktiviteten af anti-Bp50 G28-5 med aktiviteten af et BCGF præparat indeholdende overvejende lavmolekylvægt-BCGF. Anti-Bp50 G28-5 og BCGF (lav) var meget ens, Idet de var kostimulatoriske med de samme 5 aktiveringsmidler (anti-Ig, anti-Bp35 og TPA), men var ikke kostimulatoriske med hinanden eller med IL-1 eller IL-2. Endvidere var aktiviteten af anti-Bp50 G28-5 ikke afhængig af Fc-domænet, idet F(ab')2 fragmenter af G28-5 var funktionelt aktive. Dette lader formode, at opløselig anti-Bp50, lige som opløseligt BCGF, ikke kræver Fc-receptor-bærende accesso-10 riske celler for at udøve en virkning. Endvidere er både anti-Bp50 og BCGF effektive alene i nærværelse af en aktiveringsstimulering. Med andre ord er anti-Bp50 og BCGF ikke "kompetance"-faktorer, men de fremmer snarere "progressionen" af B-celler gennem cellecyklus.
Selv om det er muligt, at Bp50 kan fungere som receptor for en 15 ligand såsom en B-celle vækstfaktor, lader adskillige resultater formode, at Bp50 ikke er receptoren i det mindste for den i dette studium anvendte BCGF (lav), idet den udtrykkes på blod B-celler, medens BCGF (lav) receptorer ikke gør dette. Mulige strukturer for BCGF (lav) receptoren udtrykkes, i modsætning til Bp50, også kun på aktiverede B-celler.
20 Endvidere afviger både normale og maligne B-celle populationer i deres reaktion på anti-Bp50 i forhold til BCGF (lav) (tabel IV og fig. 10).
For eksempel formerer B-lymphomaer sig som reaktion på BCGF (lav), men ikke som reaktion på anti-Bp50. Endelig, 1 en række forsøg, inducerede optimale koncentrationer af anti-Bp50 og BCGF tilsammen mere prolifera-25 tion end hver af dem alene. Anti-Bp50 ligner aktiviteten af andet BCGF såsom BCGF (høj), der er kostimulatorisk med anti-IgM (Ambrus, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1319; Ambrus, et al., 1985, J. Cl 1n. Invest. 75:732). Dette lader formode, at Bp50 kunne fungere som receptoren for BCGF (høj).
30 Selv om Bp50 kan være en receptor for en opløselig ligand, kan Bp50 alternativt fungere som en receptor for et cel le-cel le-medieret signal, der regulerer BCGF receptor-niveauer og/eller autoerin produktion. Fortrin for differentierings-antigener, der tjener som forstærkere af en autocrln-receptor-vej, kommer fra studier med T-celler. MAb mod Lp220 35 alment leukocyt-antigen forøger proliferation ved at hæve IL-2-receptor-ekspression på aktiverede T-celler (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 1935:1819). En analog mekanisme kan virke med anti-Bp50 og ekspression af visse BCGF-receptorer. Bp50 og BCGF (lav) er tilsyneladende under en 29 DK 173940 B1 vis koordinat-kontrol, eftersom BCGF, lige som IL-1 og IL-2 receptorer, forøger ekspression af Bp50 på visse leukæmi ske celler. Bp50-molekylet har også ligheder med Tp44-molekylet, der virker ved at influere på IL-2 produktion. De foreliggende opfindere og andre har påvist, at 9.3 anti-5 Tp44 antistoffet forøger proliferation af T-celler, der er aktiveret med anti-CD3 eller TPA (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135:2331; Hara, et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1513). Tilsvarende forøger anti-Bp50 pro-liferationen af B-celler, der er aktiveret med anti-Bp35 eller TPA. Tp44 signalet virker ved at stimulere IL-2 produktion snarere end ved at sti-10 mulere T-celle vækst. Bp50 signalet kan formentlig virke på analog måde ved at stimulere B-celle autocrln produktion (Gordon, et al., 1984, Nature, Lond. 310:145).
4.2 MODIFICEREDE LIGANDER ANVENDT TIL IMMUNOSUPPRESSION ELLER BEHANDLING AF MALIGNE SYGDOMME
15 Ifølge denne udførelsesform kan liganden ifølge den foreliggende opfindelse modificeres ved at fastgøre et antiproliferativt middel, således at det resulterende molekyle kan anvendes til at dræbe celler, der udtrykker Bp50-antigenet. Sådanne modificerede ligander kan anvendes til behandling af autoimmune sygdomme for at undertrykke proli ferat Ionen af 20 B-celler og herved undertrykke autoimmunreaktionen. Disse modificerede ligander kan også anvendes til at immunoundertrykke en transplantationspatient for at hindre afstødning af et transplantat. Cytotoxiske midler, som anvendes til suppression af immunoreaktioner, kan derfor fastgøres til liganderne ifølge opfindelsen. Når der anvendes ligander, som for-25 øger proli ferationen af B-celler, bør en forøget virkning blive resultatet, fordi lægemidlet vil blive rettet mod formerende B-celler.
I en anden udførelsesform kan liganderne ifølge den foreliggende opfindelse, som er modificeret ved fastgørelse af et antiproliferativt middel, anvendes til at behandle maligne sygdomme, hvor tumorer eller 30 celler udtrykker Bp50-antigenet. Fastgørelse af disse chemoterapeutiske midler til liganderne Ifølge opfindelsen bør resultere 1 en større specificitet af lægemidlet mod de maligne celler. Endvidere bør en særlig fordel kunne opnås ved behandling af en B-celle malignitet med en ligand koblet til et cytotoxin, som er mere effektivt ved at dræbe prolifere-35 rende celler end non-proli fererende celler, idet behandling med en sådan ligand bør resultere i en forstærkning af cytotoxinets virkning.
De chemoterapeutiske midler eller antiproliferative midler, som kan kobles til liganderne ifølge den foreliggende opfindelse, omfatter 30 DK 173940 B1 derfor, men er ikke begrænsede til de i tabel VI nedenfor opremsede midler, hvilken tabel er udledt fra Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6. udgave, MacMillan Publishing Co., Inc, New York, pp. 1249-1313, 1980, der herved inkorporeres i den foreliggende 5 beskrivelse.
TABEL VI
Chemoterapeutiske midler, der kan kobles 10 til anti-Bp50 ligander
Kl asse IMiddel 15 Alkylerlngsmiddel Nitrogensennep Mechlorethamin
Cyklophosphamld Melphalan Uracilsennep Chlorambucil 20
Ethylenimin- Thiotepa derivater
Alkylsulfonater Busul fan 25
Nitrosoureatyper Carmustin
Lomustln
Semustin
Streptozocin 30
Triazener Dacarbazin
Antimetabolitter Folinsyre-analoge Methotrexat 35 Pyrimidin-analoge Fluoruracil
Cytarabin
Azaribin 31 DK 173940 B1
Purin-analoge Mercaptopurin
Thioguanin
Naturlige produkter Vinca-alkaloider Vinblastin 5 Vineristin
Antibiotika Dactinomycin
Daunorubicin
Doxorubicin 10 Bleomycin
Mithramycin
Mitomycin
Enzymer L-Asparaginase 15
Forskel!ige midler Platin-koordinerede Cisplatin komplekser
Substitueret urinstof Hydroxyurinstof 20
Methyl hydrazin- Procarbazin derivat
Adrenocortikal Mitotan 25 suppressant
Hormoner og Adrenocortico- Prednison antagonister steroider 30 Progestiner Hydroxyprogesteron- caproat
Medroprogesteron- acetat
Megestrolacetat 35 Østrogener Diethylstilbestrol
Ethinyløstradiol 32 DK 173940 B1
Anti østrogen Tamoxifen
Androgener Testosteron- propionat 5 Fluoxymesteron
Radioaktive Phosphor Natriumphosphat
isotoper 32P
10 lod Natriumlod 131 j
Enhver kendt metode kan anvendes til at koble liganden til det 15 chemoterapeutiske eller antiproliferative middel. Eksempler på sådanne metoder er forud gennemgået (se ovenfor).
4.3 ANDRE ANVENDELSER AF LIGANDER OG Bp50
Foruden de terapeutiske anvendelser har liganderne og Bp50 i sig selv andre anvendelser ved både in vitro og 1n vivo diagnostiske prøver, 20 separationsskemaer, etc.
Bp50-receptoren kan anvendes til fremstilling og/eller udformning af liganderne ifølge opfindelsen. Bp50 kan også anvendes med liganderne ifølge opfindelsen i undersøgelser in vitro, der kræver en standard for at kvantificere mængden af påviseligt Bp50 1 en prøve. Ultimativt kan 25 Bp50 i sig selv være nyttigt som en opløselig faktor, der medierer immunitet, f.eks. en lymphokin.
Foruden til terapeutisk behandling og diagnostiske undersøgelser bør liganderne ifølge den foreliggende opfindelse kunne anvendes til at identificere eller separere celler, der udtrykker Bp50-antigenet. End-30 videre bør, såfremt en passende radiomærkning eller radioopak forbindelse bindes til liganden, denne kunne anvendes til in vivo sporing af tumorer, der udtrykker Bp50-antigenet. Andre anvendelser skulle være indlysende for fagmanden på baggrund af den foregående beskrivelse.
DEPONERING AF CELLELINIER
35 Den følgende hybridoma er blevet deponeret hos American Type Cul ture Collection, Rockville, MD, og har fået tildelt følgende accessionsnummer: 33 DK 173940 B1
Hybrldoma ATCC Accessionsnummer G28-5 HB9110
Den foreliggende opfindelse skal ikke i sit omfang være begrænset af den deponerede hybridoma, eftersom den deponerede udførelsesform er 5 beregnet som en enkelt illustration af et aspekt af opfindelsen og enhver cellelinie, der er funktionelt ækvivalent hermed, falder Inden for opfindelsens rammer. Forskellige modifikationer af opfindelsen foruden de viste og i de foregående beskrevne vil naturligvis være indlysende for fagmanden på baggrund af den foreliggende beskrivelse og de vedhæf-10 tede tegninger. Sådanne modifikationer skal anses for at falde inden for opfindelsens rammer.

Claims (16)

1. I det væsentlige ren ligand, KENDETEGNET ved, AT den binder til Bp50, et 50 kilodalton B-celle overfladeantigen defineret af monoklonalt 5 antistof G28-5 fremstillet af hybridomcel1 elinien HB9110 deponeret hos ATCC, eller en mutant, en rekombinant eller et generisk fremstillet derivat deraf, hvilken ligand er valgt fra gruppen bestående af et antistof, eller et fragment deraf, og en lymphokin.
2. Ligand ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT den ved binding til en 10 aktiveret B-celle stimulerer den aktiverede B-celle til at gennemgå cellecyklus, således at proliteration af B-cellen forøges.
3. Ligand ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, AT den omfatter et antistofmolekyle eller en Fv-, Fab-, F(ab')^- eller Fab'-del af antistofmolekylet.
4. Ligand ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, AT antistofmolekylet om fatter et monoklonalt antistofmolekyle eller en Fv-, Fab-, Ftab'^-eller Fab'-del af det monoklonale antistofmolekyle.
5. Ligand ifølge krav 1 til 2, KENDETEGNET ved, AT den omfatter en lymphokin.
6. Ligand ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, AT lymphokinen omfatter en B-celle vækstfaktor.
7. Ligand ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, AT lymphokinen er på overfladen af en celle.
8. Ligand ifølge krav 1 til 3 eller 5, KENDETEGNET ved, AT den 25 yderligere omfatter en til liganden koblet forbindelse, hvilken forbindelse fortrinsvis er et antiproliterativt middel, især et alkyleringsmiddel, en antimetabolit, et antibiotikum, et vinca-alkaloid, et enzym, et platin-koordineret kompleks, en radioisotop eller en fluorescerende forbindelse.
9. Ligand ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, AT antistofmolekylet omfatter G28-5 eller en hvilken som helst Fv-, Fab-, F(ab')2- eller Fab'-del deraf.
10. Ligand ifølge et hvilket som helst af de foregående krav til medicinsk anvendelse.
11. Ligand ifølge et hvilket som helst af de foregående krav til anvendelse i en fremgangsmåde til forøgelse af proli ferationen af B-celler.
12. Ligand ifølge krav 1 til 10 til anvendelse i en fremgangsmåde DK 173940 B1 til undertrykkelse af proliferationen af celler, der udtrykker Bp50.
13. Anvendelse af en ligand ifølge krav 1 til 10 ved fremstillingen af et lægemiddel til forøgelse af proliferationen af B-celler.
14. Anvendelse af en ligand ifølge krav 1 til 10 ved fremstillingen 5 af et lægemiddel til undertrykkelse af proliferationen af celler, der udtrykker Bp50.
15. I det væsentlige rent 50 kilodalton B-celle overfladeantigen (Bp50), KENDETEGNET ved, AT det er defineret af monoklonalt antistof G28-5 fremstillet af hybridomcel 1 el inien HB9110 deponeret hos ATCC, 10 eller en mutant, en rekombinant eller et generisk fremstillet derivat deraf.
16. I det væsentlige rent 50 kilodalton antigen ifølge krav 15, KENDETEGNET ved, AT det omfatter et polypeptid. 15
DK198703022A 1986-06-13 1987-06-12 Ligander og fremgangsmåder til forøgelse af B-celle-proliferation samt B-celle-overfladeantigen Bp50 DK173940B1 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87388486A 1986-06-13 1986-06-13
US87388486 1986-06-13

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK302287D0 DK302287D0 (da) 1987-06-12
DK302287A DK302287A (da) 1987-12-14
DK173940B1 true DK173940B1 (da) 2002-03-04

Family

ID=25362524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198703022A DK173940B1 (da) 1986-06-13 1987-06-12 Ligander og fremgangsmåder til forøgelse af B-celle-proliferation samt B-celle-overfladeantigen Bp50

Country Status (22)

Country Link
JP (1) JPH0762040B2 (da)
KR (1) KR910004100B1 (da)
AT (1) AT398437B (da)
AU (1) AU617087B2 (da)
BE (1) BE1000587A4 (da)
CA (1) CA1338781C (da)
CH (1) CH676600A5 (da)
CY (1) CY1681A (da)
DE (1) DE3719398C2 (da)
DK (1) DK173940B1 (da)
FR (1) FR2607136B1 (da)
GB (1) GB2191494B (da)
GR (1) GR870930B (da)
HK (1) HK10293A (da)
IE (1) IE60486B1 (da)
IL (1) IL82841A (da)
IT (1) IT1208649B (da)
LU (1) LU86919A1 (da)
NL (1) NL195022C (da)
PT (1) PT85073B (da)
SE (1) SE504675C2 (da)
SG (1) SG118992G (da)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506126A (en) * 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
CO4600681A1 (es) 1996-02-24 1998-05-08 Boehringer Ingelheim Pharma Composicion farmaceutica para la modulacion inmunitaria

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4443427A (en) * 1982-06-21 1984-04-17 Sidney Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibody
EP0117705A3 (en) * 1983-02-24 1985-09-25 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibody specific for monocytes and blast cells
FR2547731A1 (fr) * 1983-06-27 1984-12-28 Centre Nat Rech Scient Immunotoxine antitumorale, preparations pharmaceutiques la contenant et son utilisation in vitro
US4585742A (en) * 1983-12-14 1986-04-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibody with specificity to human small cell carcinoma and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PT85073B (pt) 1990-07-31
GR870930B (en) 1987-12-16
SE504675C2 (sv) 1997-04-07
SG118992G (en) 1993-01-29
DK302287A (da) 1987-12-14
HK10293A (en) 1993-02-19
NL8701371A (nl) 1988-01-04
NL195022C (nl) 2003-06-18
IE60486B1 (en) 1994-07-27
CH676600A5 (da) 1991-02-15
KR880000582A (ko) 1988-03-28
GB2191494B (en) 1990-08-22
AU7421487A (en) 1987-12-17
BE1000587A4 (fr) 1989-02-14
CY1681A (en) 1993-10-10
DK302287D0 (da) 1987-06-12
IT1208649B (it) 1989-07-10
KR910004100B1 (ko) 1991-06-22
FR2607136B1 (fr) 1989-09-15
FR2607136A1 (fr) 1988-05-27
DE3719398A1 (de) 1988-01-28
IL82841A (en) 1992-11-15
ATA151387A (de) 1994-04-15
IT8720899A0 (it) 1987-06-12
JPS6480299A (en) 1989-03-27
GB8713650D0 (en) 1987-07-15
DE3719398C2 (de) 1996-03-28
AU617087B2 (en) 1991-11-21
PT85073A (en) 1987-07-01
GB2191494A (en) 1987-12-16
IL82841A0 (en) 1987-12-20
SE8702463L (sv) 1987-12-14
CA1338781C (en) 1996-12-10
AT398437B (de) 1994-12-27
IE871563L (en) 1987-12-13
SE8702463D0 (sv) 1987-06-12
LU86919A1 (fr) 1989-03-08
JPH0762040B2 (ja) 1995-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5182368A (en) Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US5786456A (en) Bp 50-specific antibodies and fragments thereof
Clark et al. Activation of human B cells mediated through two distinct cell surface differentiation antigens, Bp35 and Bp50.
Fleischer A novel pathway of human T cell activation via a 103 kD T cell activation antigen.
Burns et al. TLiSA1, a human T lineage-specific activation antigen involved in the differentiation of cytotoxic T lymphocytes and anomalous killer cells from their precursors.
US6641809B1 (en) Method of regulating cellular processes mediated by B7 and CD28
Lanzavecchia et al. Antibodies as antigens. The use of mouse monoclonal antibodies to focus human T cells against selected targets.
CA2086325C (en) Ligand for cd28 receptor on b cells and methods
Gollob et al. CD2 regulates responsiveness of activated T cells to interleukin 12.
US6569997B1 (en) Antibody specific for H4-1BB
US7445781B2 (en) Anti-CD40CR MR1 antibody
Baroja et al. The anti-T cell monoclonal antibody 9.3 (anti-CD28) provides a helper signal and bypasses the need for accessory cells in T cell activation with immobilized anti-CD3 and mitogens
ES2249759T3 (es) Anticuerpos monoclonales y fv especificos para antigeno cd2.
Funakoshi et al. Differential in vitro and in vivo antitumor effects mediated by anti-CD40 and anti-CD20 monoclonal antibodies against human B-cell lymphomas
Gangemi et al. Anti-T12, an anti-CD6 monoclonal antibody, can activate human T lymphocytes.
KR20170134331A (ko) 조작된 면역 세포들의 분류/소모를 위한 mAb-주도의 키메라 항원 수용체 시스템들
US6830937B1 (en) Method for generating and identifying antibodies directed against a B7
US20030219446A1 (en) Ligand for CD28 receptor on B cells and methods
Klingbeil et al. Pharmacology and safety assessment of humanized monoclonal antibodies for therapeutic use
DK173940B1 (da) Ligander og fremgangsmåder til forøgelse af B-celle-proliferation samt B-celle-overfladeantigen Bp50
EP0325489B1 (en) Leu 23: Monoclonal antibody for monitoring leukocyte activation
Hansson et al. MHC nonrestricted cytotoxic T cell clones with selective specificity from patients with transitional cell carcinoma (TCC) of the urinary bladder
AT400956B (de) Verfahren zur gewinnung eines liganden und verfahren zur unterdrückung der proliferation von bp50 exprimierenden zellen
Lwin et al. Down-regulation of T-cell proliferation in response to soluble anti-CD3 antibodies through development of redirected cytolytic activity eliminating costimulatory cells
Ritz CD2 Regulates Responsiveness of Activated T Cells to Interleukin 12 By Jared A. Gollob,* Jing Li,* Ellis L. Reinherz, r

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PUP Patent expired