NL8701371A - LIGANDS AND METHODS FOR STRENGTHENING B-CELL EXPANSION. - Google Patents

LIGANDS AND METHODS FOR STRENGTHENING B-CELL EXPANSION. Download PDF

Info

Publication number
NL8701371A
NL8701371A NL8701371A NL8701371A NL8701371A NL 8701371 A NL8701371 A NL 8701371A NL 8701371 A NL8701371 A NL 8701371A NL 8701371 A NL8701371 A NL 8701371A NL 8701371 A NL8701371 A NL 8701371A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
ligand
cell
cells
fab
monoclonal antibody
Prior art date
Application number
NL8701371A
Other languages
Dutch (nl)
Other versions
NL195022C (en
Original Assignee
Oncogen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncogen filed Critical Oncogen
Publication of NL8701371A publication Critical patent/NL8701371A/en
Application granted granted Critical
Publication of NL195022C publication Critical patent/NL195022C/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54Interleukins [IL]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0634Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635B lymphocytes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74Inducing cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

* ' * VO 9180* '* VO 9180

Liganden en werkwijzen voor het versterken van B-celuitbreiding.Ligands and Methods for Enhancing B Cell Expansion.

Inhoudsopgave.Table of contents.

Blz.P.

1. Inleiding ................................................. 2 2. Achtergrond van de uitvinding . —......................... 2 3. Samenvatting van de uitvinding ............................ 4 3.1. Definities.................................. 8 5 4. Figuurbeschrijving .................................. 8 5. Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding ............. 11 5.1. Methoden gebruikt voor karakterisering van de1 Introduction ............................................... .. 2 2. Background of the invention. —......................... 2 3. Summary of the invention ................. ........... 4 3.1. Definitions .................................. 8 5 4. Figure description .......... ........................ 8 5. Detailed description of the invention ............. 11 5.1. Methods used for characterization of the

Bp5Q receptor................... 14 5.2. Karakterisering van de Bp50 receptor............... 17 10 5.2.1. Identificatie van een B-celBp5Q receptor ................... 14 5.2. Characterization of the Bp50 receptor ............... 17 10 5.2.1. Identification of a B cell

Specifieke 50 kDa celoppervlaktemerkerSpecific 50 kDa cell surface marker

Bp50...................................... 17 5.2.2. Expressie van Bp50 is beperkt tot B-cellen. 19 5.3. Versterking van B-celuitbreiding met 15 Anti-Bp50 antilichamen............................. 20 5.3.1. Anti-Bp50 mAh versterkt uitbreiding alleen nadat B-cellen zijn geactiveerd door anti-Bp35 of anti-u antilichamen .......... 21 5.3.2. Anti-Bp50 mAb geven geen activering van 20 B-cellen uit GQ maar induceren wel geactiveerde B-cellen tot verder doorlopen van de celcyclus .................. 22 5.3.3. Optimale condities voor versterking van B-celuitbreiding met anti-Bp50 antilichamen 23Bp50 ...................................... 17 5.2.2. Bp50 expression is limited to B cells. 19 5.3. Amplification of B cell extension with 15 Anti-Bp50 antibodies ............................. 20 5.3.1. Anti-Bp50 mAh enhances expansion only after B cells are activated by anti-Bp35 or anti-u antibodies .......... 21 5.3.2. Anti-Bp50 mAb do not activate 20 B cells from GQ but do induce activated B cells to continue the cell cycle .................. 22 5.3.3. Optimal conditions for enhancement of B cell extension with anti-Bp50 antibodies 23

25 5.3.4. Verschillen tussen anti-Bp50 en BCGF25 5.3.4. Differences between anti-Bp50 and BCGF

(laag) activiteit ........................ 26 5.4. Toepassing van anti-Bp50 liganden en Bp5Q -------.... 29 5.4.1. Bp50 receptor en toepassing van liganden zoals anti-3p50 voor versterking van 30 B-celuitbreiding.......................... 29 5.4.2. Gemodificeerde liganden, gebruikt voor(low) activity ........................ 26 5.4. Application of anti-Bp50 ligands and Bp5Q -------.... 29 5.4.1. Bp50 receptor and use of ligands such as anti-3p50 to enhance B cell expansion .......................... 29 5.4.2. Modified ligands used for

Immunosuppresie of behandeling van maligniteiten .....................'........ 34 5.4.3. Andere toepassingen van liganden en Bp50 .. 37 35 6. Depots van cellijnen...................................... 37Immunosuppression or treatment of malignancies .....................'........ 34 5.4.3. Other applications of ligands and Bp50 .. 37 35 6. Deposits of cell lines ................................... ... 37

t' '3 ' ·« * - ~Tt '' 3 '«* - ~ T

>. : ? V» ƒ » -2- 1. Inleiding>. :? V »ƒ» -2- 1. Introduction

De onderhavige uitvinding is gericht op liganden, zoals anti-lichaammoleculen of fragmenten van antilichaammoleculen of andere liganden zoals lymfokines die binden aan een 50kBa B-celoppervlaktemerker, 5 verder aangeduid als Bp50, die in B-celuitbreiding een rol vervult maar niet in vroege B-celactivering. De onderhavige uitvinding is ook gericht op het Bp50 B-celantigeen zelf. In een bijzondere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, wordt een monoklonaal antilichaam G28-5 beschreven dat Bp50 definieert en een rol blijkt te spelen in de uitbrei-10 ding van geactiveerde B-cellen maar geen detecteerbaar effect heeft op de uitbreiding van rustende B-cellen.The present invention is directed to ligands such as antibody molecules or fragments of antibody molecules or other ligands such as lymphokines that bind to a 50kBa B cell surface marker, further referred to as Bp50, which plays a role in B cell extension but not in early B- cell activation. The present invention is also directed to the Bp50 B cell antigen itself. In a particular embodiment of the present invention, a G28-5 monoclonal antibody is defined which defines Bp50 and appears to play a role in the expansion of activated B cells but has no detectable effect on resting B cells. .

De liganden zoals antilichamen, lymfokines en fragmenten daarvan volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt voor het richten ên reguleren van humane B-celuitbreiding en/of differentiatie.The ligands such as antibodies, lymphokines and fragments thereof of the present invention can be used to direct and regulate human B cell extension and / or differentiation.

15 Bovendien kunnen de liganden volgens de onderhavige uitvinding worden gemodificeerd door bevestiging daaraan van andere verbindingen die gebruikt kunnen worden in de behandeling en/of detectie van malignecellen die het Bp50 antigeen tot expressie brengen.In addition, the ligands of the present invention can be modified by attachment thereto of other compounds that can be used in the treatment and / or detection of malignant cells expressing the Bp50 antigen.

2. Achtergrond van de uitvinding 20 De activering van rustende B-cellen van naar G^ fase van de celcyclus en de daaropvolgende inductie van geactiveerde B-cellen tot uitbreiding zijn onderscheiden stappen die onderscheiden regelmechanismen vereisen. Sommige middelen, waaronder muize-B-cel stimulerende factor-pl (BSF-pl) (Rabin, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 2935-2939) 25 of lage doses van anti-immunoglobuline (anti-Ig) (DeFranco, et al., 1985, J. Immunol. 135:87-94; Wetzel, et al., 1984, J. Immunol. 133: 2327-2332; DeFranco, et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1523-1536;2. Background of the Invention The activation of resting B cells from to G1 phase of the cell cycle and the subsequent induction of activated B cells to extension are distinct steps that require distinct control mechanisms. Some agents, including mouse B cell stimulating factor-pl (BSF-pl) (Rabin, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 2935-2939) or low doses of anti-immunoglobulin (anti-Ig) (DeFranco, et al., 1985, J. Immunol. 135: 87-94; Wetzel, et al., 1984, J. Immunol. 133: 2327-2332; DeFranco, et al., 1982, J. Exp Med 155: 1523-1536;

Muraguchi, et al., 1984, J. Immunol. 132:176-180), zijn "activatie" of "competentie" factoren. Dit betekent dat ze B-cellen opwekken om groter 30 te worden, meer RNA te synthetiseren, en over te gaan in G^, maar alleen leiden ze niet tot inductie van DNA synthese in B-cellen. Andere "groei"-factoren zoals hymane B-celgroeifactor (BCGF) en interleukine-2 (IL-2) veroorzaken dat geactiveerde B-cellen de celcyclus doorlopen en overgaan in de S fase maar leiden niet tot aanzetten van rustende B-cellen 35 (Kehrl, et al., 1984, Immunol. Rev. 18:75-96; Muraguchi, et al., 1984, J. Immunol. 132:176-180; Zubler·, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1170-1183; Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1597-1604.Muraguchi, et al., 1984, J. Immunol. 132: 176-180), are "activation" or "competence" factors. This means that they induce B cells to grow larger, synthesize more RNA, and pass into G ^, but only do not induce DNA synthesis in B cells. Other "growth" factors such as hymane B cell growth factor (BCGF) and interleukin-2 (IL-2) cause activated B cells to go through the cell cycle and enter S phase but do not induce resting B cells. Kehrl, et al., 1984, Immunol Rev. 18: 75-96; Muraguchi, et al., 1984, J. Immunol. 132: 176-180; Zubler ·, et al., 1984, J. Exp. Med 160: 1170-1183; Jung, et al., 1984, J Exp Med 160: 1597-1604.

^ *r -3-^ * r -3-

Thans is een aantal factoren die de groei van B-cellen bevorderen, beschreven door onderzoekers van zowel muize-als humane systemen.A number of factors that promote B cell growth have now been described by researchers in both mouse and human systems.

Deze omvatten B-celgroeifactoren (BCGF), die afgeleid zijn van verscheidene uiteenlopende bronnen waaronder T-cellijnen of hybridoma's, B-cel-5 lijnen, of dendrietcellen. Hoewel zowel interleukine-1 (11-1} als inter-leukine-2 (IL-2) hebben bewezen om de B-celgroei te versterken, zijn ze kennelijk verschillend van bepaalde BCGFs. Bijvoorbeeld geven monoklo-nale antilichamen (mAb) tegen een muize-BCGF (O'Hara, et al., 1985,These include B cell growth factors (BCGF), which are derived from several diverse sources including T cell lines or hybridomas, B cell 5 lines, or dendrite cells. Although both interleukin-1 (11-1} and inter-leukin-2 (IL-2) have been shown to enhance B cell growth, they are apparently different from certain BCGFs, for example, monoclonal antibodies (mAb) against a mouse-BCGF (O'Hara, et al., 1985,

Nature (Lond.) 315:333) of humane BCGF (Ambrus, et al., 1985, J. Exp.Nature (Lond. 315: 333) or human BCGF (Ambrus, et al., 1985, J. Exp.

10 Med. 162:1319) blokkering van de BCGF activiteit maar niet van de 11-1 of 11-2 activiteit. Hoewel onderscheiden van 11-1 of 11-2, lijken de BCGFs zelf heterogeen te zijn, gebaseerd op biochemische gegevens en . activiteitsverschillen op verschillende B-celsubsets of costimulatie-tests. Bijvoorbeeld is 60-kilodalton (kDa) hoogmoleculairgewicht humaan 15 BCGF, BCGF (hoog) geïdentificeerd dat verschillend is van een 12-kDa laagmoleculairgewichtvorm, BCGF (laag) (Ambrus, et al., 1985, J. Clin. Invest. 75:732). Onlangs is het cDNA, dat codeert voor een 20-kDa muize-BCGF, dat voorlopig is aangeduid als B-celstimuleringsfactor pl (BSF-pl), gekloneerd en gesequenced (Noma et al., 1986, Nature 319:640).10 Med. 162: 1319) blocking of the BCGF activity but not of the 11-1 or 11-2 activity. Although distinguished from 11-1 or 11-2, the BCGFs themselves appear to be heterogeneous, based on biochemical data and. activity differences on different B cell subsets or costimulation assays. For example, 60-kilodaltons (kDa) high molecular weight human 15 BCGF, BCGF (high) has been identified which is different from a 12-kDa low molecular weight form, BCGF (low) (Ambrus, et al., 1985, J. Clin. Invest. 75: 732 ). Recently, the cDNA encoding a 20-kDa mouse BCGF, which has been tentatively referred to as B cell stimulation factor pl (BSF-pl), has been cloned and sequenced (Noma et al., 1986, Nature 319: 640).

20 Het reccmbinante lymfokine heeft niet alleen BCGF activiteit, maar kan ook rustende B-cellen activeren en de differentiatie van IgG^ producerende cellen opwekken; het verschil derhalve van humaan BCGF (hoog) en BCGF (laag) in zowel zijn molecuulgewicht als in zijn activiteitsbereik.The recombinant lymphokine not only has BCGF activity, but can also activate resting B cells and induce the differentiation of IgG producing cells; therefore the difference of human BCGF (high) and BCGF (low) in both its molecular weight and in its activity range.

Deze activering en groeisignalen reguleren vermoedelijk cellen 25 door een interactie met specifieke B-celoppervlaktestructuren. Naast het antigeen-specifieke signaal door middel van oppervlakte Ig, zijn verscheidene andere kandidaat B-celoppervlaktepolypeptiden geïdentificeerd die op enige wijze een rol kunnen spelen in de activering of groei van B-cellen. Zo zijn bijvoorbeeld de celoppervlaktereceptoren voor 11-1 30 (Dower, et al., 1985, J. Exp. Med. 160:501) en IL-2 (Robb et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1126) gekarakteriseerd, en onlangs zijn functionele 11-2 receptoren op B-cellen geïdentificeerd (Zubler, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1170; Jung, et al., 1984, J, Exp. Med. 160:1597,These activation and growth signals presumably regulate cells by interacting with specific B cell surface structures. In addition to the surface Ig antigen-specific signal, several other candidate B cell surface polypeptides have been identified that may play some role in the activation or growth of B cells. For example, the cell surface receptors for 11-130 (Dower, et al., 1985, J. Exp. Med. 160: 501) and IL-2 (Robb et al., 1984, J. Exp. Med. 160: 1126 ), and recently functional 11-2 receptors on B cells have been identified (Zubler, et al., 1984, J. Exp. Med. 160: 1170; Jung, et al., 1984, J, Exp. Med. 160 : 1597,

Muraguchi, et al., 1985, J. Exp. Med. 161:181). Receptors voor B-celgroei 35 en activatiefactoren moeten echter nog volledig worden gekarakteriseerd.Muraguchi, et al., 1985, J. Exp. Med. 161: 181). However, receptors for B cell growth and activation factors have yet to be fully characterized.

-4- *-4- *

Verscheidene kandidaat B-celoppervlaktepolypeptiden zijn geïdentificeerd die op enige wijze een rol kunnen spelen in de activering of groei van B-cellen. Bijvoorbeeld is door Subbarao en Mosier (Subbarao, et al., 1983, Immunol. Rev. 69:81-97) gevonden dat monoklonale antilichamen 5 (mAb) tegen het muize-B-cel antigeen Lyb2 activering van B-cellen geven, en onlangs is bewijsmateriaal verschenen dat erop wijst dat Lyb2 de receptor voor BSF-pl kan zijn (Yakura, 1985, Fed. Proc. 44:1532). Evenzo is door ons gevonden dat geschikt mAb (1F5) tegen een 35 kDa polypeptide, Bp35, humane B-cellen activeert van GQ tot G (Clark, et al., 1985, 10': Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770; Gollay, et al., J. Immunol.Several candidate B cell surface polypeptides have been identified that may play some role in the activation or growth of B cells. For example, Subbarao and Mosier (Subbarao, et al., 1983, Immunol. Rev. 69: 81-97) have found that monoclonal antibodies 5 (mAb) against mouse B cell antigen produce Lyb2 activation, and Recently evidence has emerged that Lyb2 may be the receptor for BSF-pl (Yakura, 1985, Fed. Proc. 44: 1532). Likewise, we have found that suitable mAb (1F5) against a 35 kDa polypeptide, Bp35, activates human B cells from GQ to G (Clark, et al., 1985, 10 ': Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 : 1766-1770; Gollay, et al., J. Immunol.

135:3795-3801). Geaggregeerde C3d of antilichamen tegen de 140 kDa C3d receptor, Bpl40, veroorzaken uitbreiding van B-cellen die T-cel afhankelijk zijn (Melchers, et al., 1985, Nature 317:264-267; Nemerow, et al., 1985, J. Immunol. 135:3068-3073; Frade, et al., 1985, Eur. J. Immunol.135: 3795-3801). Aggregated C3d or antibodies to the 140 kDa C3d receptor, Bpl40, cause extension of T cell-dependent B cells (Melchers, et al., 1985, Nature 317: 264-267; Nemerow, et al., 1985, J Immunol 135: 3068-3073 Frade, et al., 1985, Eur J. Immunol.

15 15:73-76). Hoewel BCGFs in zowel de muis als de mens zijn geïdentificeerd, zijn de receptors voor deze factoren nog niet geïsoleerd. Door Wang en medewerkers (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) is een poly-klonaal antiserum bereid dat een 54 kDa polypeptide (gp54) op humane B-cellen identificeerde en is aangetoond dat het konijne-antiserum tegen 20 gp54 tonsillaire B-cellen aanzette tot deling. Onlangs werd door Jung en Fu (Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924) een mAb (AB-1) tegen een 55-kDa, tot geactiveerde B-cellen beperkt antigeen geïsoleerd dat BCGF-afhankelijke uitbreiding blokkeert. Of anti-gp54 of AB-1 al dan niet een BCGF receptor herkennen, is echter nog niet bekend.15 15: 73-76). Although BCGFs have been identified in both mouse and human, the receptors for these factors have not yet been isolated. A polyclonal antiserum which identified a 54 kDa polypeptide (gp54) on human B cells and has been shown to be produced by Wang et al. (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149: 1424-1433). the rabbit antiserum against 20 gp54 tonsillary B cells spurred division. Recently, an mAb (AB-1) against a 55-kDa, restricted B-activated antigen containing BCGF was isolated by Jung and Fu (Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160: 1919-1924). -dependent extension blocks. However, whether or not anti-gp54 or AB-1 recognize a BCGF receptor is not yet known.

25 3. Samenvatting van de uitvinding3. Summary of the invention

De onderhavige uitvinding is gericht op liganden die (a) binden aan Bp50, een 50kDa B-cel-specifiek oppervlaktepolypeptide dat hierin is beschreven, en (b) de uitbreiding van geactiveerde B-cellen versterken. De uitvinding is ook gericht op het Bp50 antigeen zelf, dat gede-30 finieerd wordt door monoklonaal antilichaam G28-5 en in de uitbreiding van geactiveerde B-cellen een rol speelt. Bovendien is de uitvinding gericht op liganden die aan Bp50 binden, maar geen biologisch effect of functie laten zien zoals versterking van de uitbreiding van geactiveerde B-cellen.The present invention is directed to ligands that (a) bind to Bp50, a 50kDa B cell specific surface polypeptide described herein, and (b) enhance the extension of activated B cells. The invention is also directed to the Bp50 antigen itself, which is defined by monoclonal antibody G28-5 and plays a role in the extension of activated B cells. In addition, the invention is directed to ligands that bind to Bp50, but show no biological effect or function such as enhancement of the extension of activated B cells.

- _ - - ., . t -5- > r.- _ - -.,. t -5-> r.

De liganden volgens de onderhavige uitvinding omvatten anti-lichaammoleculen, monoklonale antilichaaxnmoleculen en fragmenten van deze antilichaammcleculen die de met het antigeen combinerende plaats bevatten/ of chemisch gemodificeerde antilichamen en fragmenten; dergelijke 5 fragmenten omvatten, zonder daartoe beperkt te zijn, Fv, Fab, F(ab')2,The ligands of the present invention include antibody molecules, monoclonal antibody molecules, and fragments of these antibody molecules containing the antigen-combining site / or chemically modified antibodies and fragments; such 5 fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, F (ab ') 2,

Fab1 en dergelijke. Bovendien omvatten de liganden volgens de onderhavige uitvinding lymfokines, die, zonder daartoe beperkt te zijn, humane B-celgroeifactoren evenals chemisch gemodificeerde lymfokines kunnen omvatten. De liganden volgens de onderhavige uitvinding kunnen chemisch 10 worden gemodificeerd, bijvoorbeeld door een verbinding aan het ligand te binden of koppelen. Dergelijke verbindingen omvatten, zonder daartoe beperkt te zijn, cytotoxische middelen, therapeutische middelen, cherno-therapeutische middelen, labels zoals radiolabels, kleurstoffen, enzymen, radicöpake verbindingen, en dergelijke. De liganden volgens de onderis havige uitvinding kunnen in hun gemodificeerde of ongemodificeerde vorm worden gebruikt voor het richten, reguleren en modificeren van humane 3-celuitbreiding en/of differentiatie.Fab1 and the like. In addition, the ligands of the present invention include lymphokines, which may include, but are not limited to, human B cell growth factors as well as chemically modified lymphokines. The ligands of the present invention can be chemically modified, for example, by binding or coupling a compound to the ligand. Such compounds include, but are not limited to, cytotoxic agents, therapeutic agents, chernotherapeutic agents, labels such as radiolabels, dyes, enzymes, radicopaque compounds, and the like. The ligands of the present invention can be used in their modified or unmodified form for targeting, regulating and modifying human 3 cell extension and / or differentiation.

De onderhavige uitvinding is gebaseerd op de vondst dat twee humane B-celdifferentiatieantigenen, Bp35 en het hierin beschreven B-cel-20 antigeen, Bp50, kennelijk onderscheiden functies hebben als signaal- receptors in B-celactivering. Monoklonale antilichamen (mAb) tegen Bp35 en Pb50 geven allebei positieve signalen aan B-cellen die hun doorlopen van de celcyclus stimuleren. Monoklonale antilichamen tegen 3p35, evenals anti-Ig antilichamen, functioneren in principe door activering van 25 rustende B-cellen tot competentie voor het betreden van de fase van de celcyclus. Daarentegen functioneert een hierin beschreven monoklonaal antilichaam of zijn F(ab')2 fragment tegen Bp5Q, een 50 kDa polypeptide dat op alle B-cellen tot expressie komt, door stimulering van geactiveerde B-cellen tot doorlopen van de cellcyclus en versterkt het de uit-30 breiding van geactiveerde B-cellen. Monoklonale antilichamen tegenThe present invention is based on the discovery that two human B cell differentiation antigens, Bp35 and the B cell-20 antigen, Bp50 described herein, have apparently distinct functions as signal receptors in B cell activation. Monoclonal antibodies (mAb) to Bp35 and Pb50 both give positive signals to B cells that stimulate their cycle cycle. Monoclonal antibodies to 3p35, as well as anti-Ig antibodies, basically function by activating resting B cells to become competent to enter the cell cycle phase. In contrast, a monoclonal antibody or its F (ab ') 2 fragment described herein functions against Bp5Q, a 50 kDa polypeptide expressed on all B cells, by stimulating activated B cells to progress through the cell cycle and enhancing the -30 extension of activated B cells. Monoclonal antibodies against

Bp35, evenals anti-Ig antilichamen, activeren tonsillaire B-cellen en wekken lage niveaus van B-celuitbreiding op. Daarentegen leidt anti-Bp50 monoklonaal antilichaam alleen noch tot activering van B-cellen, noch tot het opwekken van uitbreiding van B-cellen, maar samen met anti-35 Bp35 of anti-Ig antilichamen, versterkt het B-celuitbreiding. In dit opzicht lijkt de werking van anti-Bp50 antilichaam op de activiteit van f ' * .:* * -6- B-celgroeifactoren (BCGF). Slechts een geringe hoeveelheid van 0,05 ug/ml van anti-Bp50 is nodig om uitbreiding te versterken en evenals BCGF is anti-Bp50 zelfs effectief wanneer het 12-24 uur nadat B-cellen zijn geactiveerd met anti-Ig of anti-Bp35 is toegevoegd. Zonder bijkomende 5 exogene signalen, wekken anti-Bp35 en anti-Bp50 antilichamen samen een sterke uitbreiding van gezuiverde rustende B-cellen op. Deze resultaten wijzen in de richting dat de Bp35 en Bp50 oppervlaktemoleculen een rol spelen in de regulering van B-celactivering en voortgang door de cel-cyclus. Vanwege de betekenis die anti-Bp35 en soortgelijke moleculen 10' hebben op het effect en de werking van de liganden volgens de onderhavige uitvinding, dient de publikatie van Clark et al., 1985, Proc.Bp35, as well as anti-Ig antibodies, activate tonsillar B cells and elicit low levels of B cell expansion. In contrast, anti-Bp50 monoclonal antibody alone does not lead to B cell activation or to induce B cell expansion, but together with anti-Bp35 or anti-Ig antibodies, enhances B cell extension. In this regard, the action of anti-Bp50 antibody resembles the activity of f '*: * * -6- B cell growth factors (BCGF). Only a small amount of 0.05 µg / ml of anti-Bp50 is needed to enhance extension, and like BCGF, anti-Bp50 is effective even 12 to 12 hours after B cells are activated with anti-Ig or anti-Bp35 is added. Without additional exogenous signals, anti-Bp35 and anti-Bp50 antibodies together elicit a strong expansion of purified resting B cells. These results indicate that the Bp35 and Bp50 surface molecules play a role in the regulation of B cell activation and cell cycle progression. Because of the significance of anti-Bp35 and like molecules 10 'on the effect and action of the ligands of the present invention, the publication of Clark et al., 1985, Proc.

Natl. Acad. Sci. (USA) 82:1766-1770 hier door verwijzing opgenomen te worden geacht.Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 1766-1770 incorporated herein by reference.

Hoewel de activiteit van anti-Bp50 lijkt op die van BCGF (laag) 15 omdat zowel anti-Bp50 als BCGF (laag) met dezelfde middelen maar 'niet met elkaar costimulerend werken en zowel anti-Bp50 als BCGF (laag) alleen invloed uitoefenen op geactiveerde B-cellen en in een oplosbare vorm werken, kan de activiteit van anti-Bp50 worden onderscheiden van de activiteit van BCGF (laag), doordat de uitbreiding van B-cellen die met op-20 timale hoeveelheden van anti-Bp50 en anti-Bp35 (of anti-Ig) is gestimuleerd, verder kan worden versterkt met BCGF (laag) en zowel B-cellen in het bloed als bepaalde B-cellymfoma's op een verschillende wijze reageren op anti-Bp50 versus BCGF. Voor optimale activiteit dient anti-Bp50 binnen 12 uur na B-celactivering te worden toegevoegd, terwijl BCGF (laag) 25 een. optimale activiteit behoudt, zelfs wanneer het 24 uur na activering wordt toegevoegd. Bovendien wordt Bp50 op alle B-cellen tot expressie gebracht, terwijl receptors of BCGF (laag) beperkt zijn tot geactiveerde B-cellen. Derhalve kunnen anti-Bp50 en BCGF (laag) op gecoördineerde wijze B-celgroei reguleren, maar kennelijk doen ze dat via onderscheiden 30 signalen.Although the activity of anti-Bp50 is similar to that of BCGF (low) because both anti-Bp50 and BCGF (low) do not have a costimulating effect with the same agents but both anti-Bp50 and BCGF (low) only affect activated B cells and act in a soluble form, the activity of anti-Bp50 can be distinguished from the activity of BCGF (low), in that the extension of B cells containing optimal amounts of anti-Bp50 and anti- Bp35 (or anti-Ig) is stimulated, can be further enhanced with BCGF (low) and both blood B cells and certain B cell lymphomas respond differently to anti-Bp50 versus BCGF. For optimal activity, anti-Bp50 should be added within 12 hours of B cell activation, while BCGF (low) 25 a. maintains optimal activity even when added 24 hours after activation. In addition, Bp50 is expressed on all B cells, while receptors or BCGF (low) are limited to activated B cells. Therefore, anti-Bp50 and BCGF (layer) can coordinate B cell growth in a coordinated manner, but apparently they do so via distinct signals.

In één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, kunnen de liganden die aan Bp50 binden en de uitbreiding van geactiveerde B-cellen versterken, worden gebruikt voor het vergroten van een immuunrespons. Bijvoorbeeld kunnen deze liganden die Bp50 binden worden gebruikt als 35 "adjuvans" om een immuunrespons op een vaccin te vergroten. Anderzijds kunnen deze liganden worden gebruikt om de immuunrespons van een in een toestand van immunosuppressie verkerend individu te vergroten.In one embodiment of the present invention, the ligands that bind to Bp50 and enhance the extension of activated B cells can be used to enhance an immune response. For example, these ligands that bind Bp50 can be used as an "adjuvant" to enhance an immune response to a vaccine. On the other hand, these ligands can be used to enhance the immune response of an immunosuppressed individual.

-.- V $ '·} Λ . 4 ' Γ.-.- V $ '·} Λ. 4 'Γ.

-7- Ιη een andere uitvoeringsvorm kunnen de liganden volgens de uitvinding chemische worden gemodificeerd op een zodanige wijze dat.de cellen waaraan de liganden binden, worden gedood- Omdat alle B-cellen hef Bp50 antigeen tot expressie brengen, zou deze benadering resulteren 5 in een suppressie van de immuunrespons. Bijvoorbeeld kan een aan een ligand volgens de onderhavige uitvinding gebonden cytotoxisch geneesmiddel worden gebruikt in vivo om immunosuppressie te veroorzaken teneinde grenzen van histccompatibiliteit in transplantatiepatiënten te overschrijden? anderzijds kunnen deze gemodificeerde liganden worden gê-10 bruikt voor het beheersen van autoimmuunziekten.In another embodiment, the ligands of the invention can be chemically modified in such a way that the cells to which the ligands bind are killed. Because all B cells express the Bp50 antigen, this approach would result in a suppression of the immune response. For example, a cytotoxic drug bound to a ligand of the present invention can be used in vivo to cause immunosuppression in order to exceed limits of hist compatibility in transplant patients? on the other hand, these modified ligands can be used to control autoimmune diseases.

In een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, kunnen maligniteiten zoals tumorcellen die Bp50 tot expressie brengen, worden behandeld onder toepassing van een ligand volgens de uitvinding, gekoppeld aan een chemotherapeutisch middel dat bruikbaar is voor de 15 behandeling van dergelijke neoplastische ziekten. Deze gemodificeerde liganden kunnen in vivo worden gebruikt om het chemotherapeutische middel te sturen naar elk type malignecel die het Bp50 antigeen tot expressie brengt, met inbegrip van cellen die geen B-cellen zijn maar wel Bp50 tot expressie brengen. Wanneer de liganden volgens de uitvinding worden 20 gebruikt die B-celuitbreiding versterken, zou een bijzonder voordeel worden bereikt wanneer B-celmaligniteiten worden behandeld waarbij het chemotherapeutische middel dat aan het ligand is gebonden een stof omvat die effectiever is in het doden van zich uitbreidende cellen; in dit geval zou een versterking van de geneesmiddelwerking worden verkregen.In another embodiment of the present invention, malignancies such as tumor cells expressing Bp50 can be treated using a ligand of the invention coupled to a chemotherapeutic agent useful for the treatment of such neoplastic diseases. These modified ligands can be used in vivo to direct the chemotherapeutic agent to any type of malignant cell expressing the Bp50 antigen, including cells that are not B cells but do express Bp50. When using the ligands of the invention that enhance B cell proliferation, a particular advantage would be achieved when treating B cell malignancies where the chemotherapeutic agent bound to the ligand comprises a substance more effective in killing expanding cells ; in this case an enhancement of the drug action would be obtained.

25 Anderzijds kunnen de liganden volgens de uitvinding in vitro worden gebruikt voor het identificeren of scheiden van cellen die het Bp50 antigeen tot expressie brengen en/of voor het onderzoeken van lichaamsvloeistoffen op de aanwezigheid van het Bp50 antigeen dat al dan niet afgeworpen kan zijn. Bovendien kunnen de liganden volgens de uit-30 vinding in vivo worden gebruikt voor het verkrijgen van een beeld "imaging" van cellen of tumoren die het Bp50 antigeen tot expressie brengen.On the other hand, the ligands of the invention can be used in vitro to identify or separate cells expressing the Bp50 antigen and / or to test body fluids for the presence of the Bp50 antigen which may or may not have been shed. In addition, the ligands of the invention can be used in vivo to image imaging cells or tumors expressing the Bp50 antigen.

Het gezuiverde Bp50 antigeen volgens de onderhavige uitvinding kan worden toegepast voor het bereiden van antilichamen en voor het be-35 reiden of ontwerpen van andere liganden volgens de uitvinding. Bovendien zou het Bp50 antigeen kunnen worden toegepast in tests zoals diagnostische * c -8- immunoassays. Bovendien kan Bp50 zelf worden gebruikt als een middel voor het bevorderen van celimmuniteit in vivo of in vitro.The purified Bp50 antigen of the present invention can be used to prepare antibodies and to prepare or design other ligands of the invention. In addition, the Bp50 antigen could be used in assays such as diagnostic * c -8 immunoassays. In addition, Bp50 itself can be used as an agent for promoting cell immunity in vivo or in vitro.

3,1« Definities3.1 «Definitions

Zoals hierin gebruikt zullen de volgende afkortingen de aange-5 geven betekenissen hebben: AO = acridine oranje BCGF = B-celgroeifactorAs used herein, the following abbreviations will have the indicated meanings: AO = acridine orange BCGF = B cell growth factor

BCGF (hoog) = een 60 kDa humaan BCGFBCGF (high) = a 60 kDa human BCGF

BCGF (laag) = een 12 kDa humaan BCGFBCGF (low) = a 12 kDa human BCGF

10 Bp35 = een 35 kDa B-cel- specifiek oppervlakte- polypeptide (CD20) gedefinieerd door mAb 1F5 Bp50 = een 50 kDa B-cel~specifiek oppervlakte polypeptide gedefinieerd door mAb G28-5 Fv = het variabele gebied of de antigeen-combinerende 15 plaats van een antilichaammolecuul. Dit kan elk fragment zijn dat het idiotype van het mol‘ecuul bevat, waaronder (zonder beperking daartoe)Bp35 = a 35 kDa B cell specific surface polypeptide (CD20) defined by mAb 1F5 Bp50 = a 50 kDa B cell specific surface polypeptide defined by mAb G28-5 Fv = the variable region or the antigen-combining 15 site of an antibody molecule. This can be any fragment that contains the idiotype of the molecule, including (without limitation)

Fab, F(ab') , Fab', en dergelijke IF = immunofluorescentie t 20 Ig = immunoglobuline IL-1 - interleukine 1 IL-2 = interleukine 2 kDa = kilodalton mAb = monoklonaal antilichaam 25- SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese TPA = 12-0-tetradecanoylforbol-13-acetaat 4. FiguurbeschrijvingFab, F (ab '), Fab', and the like IF = immunofluorescence t Ig = immunoglobulin IL-1 - interleukin 1 IL-2 = interleukin 2 kDa = kilodaltons mAb = monoclonal antibody 25-SDS-PAGE = sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TPA = 12-0-tetradecanoylforbol-13-acetate 4. Figure description

Fig. 1. Expressie van Bp50 is beperkt tot Bp35± B-cellen. Een 30 twee-kleuren stroom cytometrische analyse van 50.000 cellen werd uitgevoerd op de wijze als beschreven door Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770. De gegevens zijn uitgezet als aantal cellen versus de logaritme van groene fluorescentie en de logaritme van rode fluorescentie waarbij 4-5 stippen ongeveer een verdubbeling van -9- * fluorescentie vertegenwoordigen. De gegevens worden verstrekt om auto-fluorescente negatieve cellen te tonen. PE (rood) -anti-Bp35 (1F5) versus FITC (groen) -anti-Bp5Q (G28-5) kleuring toont dat alle Bp50+ cellen ook Bp35+ zijn.Fig. 1. Expression of Bp50 is limited to Bp35 ± B cells. A two-color flow cytometric analysis of 50,000 cells was performed in the manner described by Clark, et al., 1985, Proc. Wet. Acad. Sci. USA 82: 1766-1770. The data are plotted as cell number versus the green fluorescence logarithm and the red fluorescence logarithm where 4-5 dots represent approximately a doubling of -9- * fluorescence. The data is provided to show auto-fluorescent negative cells. PE (red) -anti-Bp35 (1F5) versus FITC (green) -anti-Bp5Q (G28-5) staining shows that all Bp50 + cells are also Bp35 +.

5 Fig. 2. Biochemische vergelijking van Bp50 polypeptide met andere 3-celoppervlakteantigenen. Immunoprecipitatie van Bp50 van aan het opper-125 vlak met I-gelabelde tonsillaire cellen werd uitgevoerd op de beschreven wijze. Geïsoleerde antigenen werden elektroforetisch behandeld op 10% SDS polyacrylamide slab-gels zonder reductie. De gels werden zicht-10 baar gemaakt met autoradicgrafie en versterkingsschermen.FIG. 2. Biochemical comparison of Bp50 polypeptide with other 3-cell surface antigens. Immunoprecipitation of Bp50 from the 125 surface with I-labeled tonsillary cells was performed as described. Isolated antigens were treated electrophoretically on 10% SDS polyacrylamide slab gels without reduction. The gels were visualized with auto-radiography and reinforcement screens.

Paneel Aï laan 1, anti-Bp50 (G28-5); laan 2, anti-Bp95 (G28-8); laan 3, sefarose-geit anti-muis Ig alleen.Panel Ailane 1, anti-Bp50 (G28-5); lane 2, anti-Bp95 (G28-8); lane 3, sepharose-goat anti-mouse Ig alone.

Belichtingstijd: 4 dagen. Paneel B: laan 1, anti-Bp50 (G28-5); laan 2, anti-Bp45 (3LAST-2); laan 3, anti-Bp39 (G28-1); laan 4, anti-Bp39 15 (41-H16); laan 5, sefarose-geit anti-muis Ig alleen.Exposure time: 4 days. Panel B: lane 1, anti-Bp50 (G28-5); lane 2, anti-Bp45 (3LAST-2); lane 3, anti-Bp39 (G28-1); lane 4, anti-Bp39 (41-H16); lane 5, sepharose-goat anti-mouse Ig alone.

Een belichtingstijd van 2 dagen werd gekozen zodat de banden in -de lanen 2-4 niet overbelicht werden en met betrekking tot Bp50 duidelijk konden worden onderscheiden. Eén van drie experimenten.An exposure time of 2 days was chosen so that the bands in lanes 2-4 were not overexposed and could be clearly distinguished with respect to Bp50. One of three experiments.

Fig. 3. Twee-kleuren immunofluorescentie-analyse van Bp50 expres-20 sie. Periferaal bloed of tonsillaire mononucleaire cellen werden door centrifugering op Ficoll geïsoleerd en gekleurd met PE (rood)-geconjugeerd G28-5 (anti-3p50) in combinatie met fluoresceïne (groen)-geconjugeerde referentie-antilichamen, omvattende 2C3 (anti-IgM); 1F5 (anti-Bp35); HBlOa (anti-DR); en 9.6 (anti-CD2), E receptor). Cellen werden ge-25 analyseerd met een FACS IV, uitgerust met vier decade logversterkers in zowel rode als groene dimensies. Voorwaartse en onder een rechte hoek lichtverstrooiing werd gebruikt om monocyten uit te sluiten. Ongekleurde cellen bevinden zich aan de achterkant van het rooster; rode fluorescentie aan de rechter zijde en groene fluorescentie aan de linker zijde.Fig. 3. Two-color immunofluorescence analysis of Bp50 express-20 sion. Peripheral blood or tonsillar mononuclear cells were isolated by centrifugation on Ficoll and stained with PE (red) conjugated G28-5 (anti-3p50) in combination with fluorescein (green) conjugated reference antibodies, including 2C3 (anti-IgM); 1F5 (anti-Bp35); HB10a (anti-DR); and 9.6 (anti-CD2), E receptor). Cells were analyzed with a FACS IV equipped with four decade log amplifiers in both red and green dimensions. Forward and right angle light scattering was used to exclude monocytes. Unstained cells are located on the back of the grid; red fluorescence on the right side and green fluorescence on the left.

30 Fig. 4. Dosisresponskrommen voor versterking van uitbreiding van dichte tonsillaire Er- B-cellen door anti-Bp50 antilichamen zoals aangegeven: Media alleen; anti-Bp50 alleen; anti-Bp35 (5 ug/ml) alleen; BCGF alleen; anti-Bp35 plus BCGF; anti-Bp35 plus getrapte doses van anti-Bp50. Gemiddelde uitbreiding ± standaardfout van monsters in viervoud 35 werd gemeten op dag 3.FIG. 4. Dose response curves for enhancing expansion of dense tonsillary ErB cells by anti-Bp50 antibodies as indicated: Media only; anti-Bp50 only; anti-Bp35 (5 µg / ml) only; BCGF only; anti-Bp35 plus BCGF; anti-Bp35 plus staged doses of anti-Bp50. Mean extension ± standard error of quadruplicate samples was measured on day 3.

-10- *-10- *

Fig. 5. Anti-Bp50 mAh zijn zeer effectief in versterking van uitbreiding indien toegevoegd na een B-celactiveringssignaal. Dichte tonsillaire Er- B-cellen werden gedurende 4 dagen gelncubeerd met media alleen, anti-Bp50 (0,5 ug/ml) toegevoegd op verschillende tijdstippen 5 na incubatie, anti-Bp35 (5 ug/ml) toegevoegd op verschillende tijdstippen na incubatie; anti-Bp50 constant gehouden waaraan later op verschillende tijdstippen anti-Bp35 werd toegevoegd; anti-Bp35 constant gehouden waaraan anti-Bp50 werd toegevoegd aan culturen op verschillende tijd- 3 stippen. Gedurende de laatste 10 uur werd H-thymidine toegevoegd en 10. zijn opname gemeten.Fig. 5. Anti-Bp50 mAh are very effective in enhancement enhancement when added after a B cell activation signal. Dense tonsillar Er-B cells were incubated for 4 days with media alone, anti-Bp50 (0.5 µg / ml) added at different times after incubation, anti-Bp35 (5 µg / ml) added at different times after incubation ; anti-Bp50 kept constant to which anti-Bp35 was added later at different times; anti-Bp35 kept constant to which anti-Bp50 was added to cultures at different times. During the last 10 hours, H-thymidine was added and 10. its uptake measured.

Fig. 6. Vergelijking van het vermogen van anti-Bp35 en anti-Bp50 om rustende tonsillaire B-cellen aan te zetten tot verlaten van het Gq stadium van de celcyclus. Dag 3 na behandeling media alleen (-), anti-Bp35 alleen (-----); en Ig alleen (.....), A, geen extra toevoegin- 15 gen; B, anti-Bp50 (0,5 ug/ml) toegevoegd aan elke groep; C, 5% BCGF toegevoegd aan elke groep. De gegevens zijn uitgezet als relatief aantal cellen versus de logaritme van AO rode fluorescentie (RNA).Fig. 6. Comparison of the ability of anti-Bp35 and anti-Bp50 to induce resting tonsillary B cells to exit the Gq stage of the cell cycle. Day 3 after treatment media only (-), anti-Bp35 only (-----); and Ig alone (.....), A, no additional additives; B, anti-Bp50 (0.5 µg / ml) added to each group; C, 5% BCGF added to each group. The data are plotted as a relative cell number versus the logarithm of AO red fluorescence (RNA).

Fig. 7. Kinetiek van B-celuitbreiding na stimulering met anti-Bp50 versus BCGF. Dichte tonsillaire E- B-cellen werden gestimuleerd 20 met media alleen; 10% BCGF alleen? anti-Bp35 alleen? anti-Bp50 alleen? anti-Bp35 + 10% BCGF? anti-Bp35 + anti-Bp50? en anti-Bp35 + anti-Bp50 + 10% BCGF. Uitbreiding werd gemeten op de aangegeven dagen door een 3 stoot gedurende 18 uur H-thymidine. Uitbreiding werd gemeten m viervoud en standaardfouten zijn aangegeven. Eén van drie experimenten.Fig. 7. Kinetics of B cell extension after stimulation with anti-Bp50 versus BCGF. Dense tonsillar E-B cells were stimulated with media alone; 10% BCGF alone? anti-Bp35 only? anti-Bp50 only? anti-Bp35 + 10% BCGF? anti-Bp35 + anti-Bp50? and anti-Bp35 + anti-Bp50 + 10% BCGF. Extension was measured on the indicated days by a 3 shot H-thymidine for 18 hours. Extension was measured in quadruplicate and standard errors are indicated. One of three experiments.

25 Fig. 8. Tijden na stimulering met anti-Bp35 waarop anti-Bp50 (A) of BCGF (B) de uitbreiding optimaal versterken. Dichte tonsillaire E-B-cellen werden op de getoonde wijze gestimuleerd en de uitbreiding werd 3 gemeten door een stoot gedurende 18 uur van H-thymidine op dag 3.FIG. 8. Times after stimulation with anti-Bp35 at which anti-Bp50 (A) or BCGF (B) optimally enhance the extension. Dense tonsillary E-B cells were stimulated in the manner shown and the extension was measured by an 18-hour burst of H-thymidine on day 3.

Media? anti-Bp35 alleen toegevoegd op de aangegeven tijdstippen; anti-30 Bp50 of BCGF alleen; anti-Bp35 toegevoegd bij het begin van de kweek gevolgd door toevoeging van anti-Bp50 of BCGF op de aangegeven tijdstippen? anti-Bp50 of BCGF toegevoegd bij het begin van de kweek gevolgd door anti-Bp35. Eén van twee experimenten. De uitbreiding werd gemeten in viervoud en standaardfouten zijn aangegeven. De gebruikte doses: 35 anti-Bp35, 5 ug/ml; anti-Bp50, 0,2 ug/ml? BCGF (laag) 5%. De gebruikte concentraties waren als volgt: anti-Bp35, 5 ug/ml; anti-Bp50, 0,2 ug/ml; BCGF, 5%.Media? anti-Bp35 added only at the indicated times; anti-30 Bp50 or BCGF alone; anti-Bp35 added at the start of the culture followed by addition of anti-Bp50 or BCGF at the indicated times? anti-Bp50 or BCGF added at the start of the culture followed by anti-Bp35. One of two experiments. The extension was measured in quadruplicate and standard errors are indicated. The doses used: 35 anti-Bp35, 5 µg / ml; anti-Bp50, 0.2 µg / ml? BCGF (low) 5%. The concentrations used were as follows: anti-Bp35.5 µg / ml; anti-Bp50, 0.2 µg / ml; BCGF, 5%.

* , ’ '*·ν |Λ» ,,/ ; s ♦ 7 -.J ·: „ ƒ ^ -11-*, ’'* · Ν | Λ» ,, /; s ♦ 7 -.J ·: „ƒ ^ -11-

Fig- 9. Anti-Bp50 en BCGF hebben additieve effecten op de B-cel-uitbreiding. Dichte tonsillaire E- B-cellen werden gestimuleerd met getrapte doses van BCGF (laag) samen met anti-Bp50 alleen; anti-Bp35 alleen? anti-Ig-korrels alleen; anti-3p35 + anti-Bp50; of anti-Bp50 + 5 anti-Ig. De uitbreiding werd gemeten op dag 3 na stimulering met een 3 stoot gedurende 18 uur van H-thymidine. De uitbreiding werd gemeten in viervoud en standaardfouten zijn aangegeven. Eén van vier experi- 6 menten. De gebruikte doses voor 10 cellen: anti-Bp35, 5 ug/ml? anti-3p50, 0,2 ug/ml; anti-Ig-korrels, 50 ug/ml.Fig. 9. Anti-Bp50 and BCGF have additive effects on B cell extension. Dense tonsillar E-B cells were stimulated with staged doses of BCGF (low) together with anti-Bp50 alone; anti-Bp35 only? anti-Ig beads only; anti-3p35 + anti-Bp50; or anti-Bp50 + 5 anti-Ig. The extension was measured on day 3 after stimulation with a 3-hour pulse of H-thymidine for 18 hours. The extension was measured in quadruplicate and standard errors are indicated. One of four experiments. The doses used for 10 cells: anti-Bp35, 5 µg / ml? anti-3p50, 0.2 µg / ml; anti-Ig beads, 50 µg / ml.

10 Fig. 10. Vergelijkende effecten van anti-Bp50 en BCGF op normale en maligne B-cellen. Periferale bloed E- B-cellen (A) of dichte tonsillaire E- B-cellen (C) werden gestimuleerd met of zonder TPA (75 ng/ml) in tegenwoordigheid van 10% BCGF of 1.ug/ml anti-Bp50. Twee aparte 3-cellymfoma1s (panelen B en D) werden op dezelfde wijze gestimuleerd.FIG. 10. Comparative effects of anti-Bp50 and BCGF on normal and malignant B cells. Peripheral blood E-B cells (A) or dense tonsillary E-B cells (C) were stimulated with or without TPA (75 ng / ml) in the presence of 10% BCGF or 1.ug/ml anti-Bp50. Two separate 3-cell lymphomas (panels B and D) were stimulated in the same manner.

3 15 De uitbreiding werd gemeten op dag 3 door opname van H-thymidine gedurende een stoot van 12 uur. De uitbreiding werd gemeten in viervoud en standaardfouten zijn aangegeven.The extension was measured on day 3 by incorporation of H-thymidine over a 12 hour burst. The extension was measured in quadruplicate and standard errors are indicated.

BB

5. Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding De onderhavige uitvinding is gericht op liganden die (a) binden 20 aan Bp50, een 50 kDA B-cel-specifiek oppervlaktepolypeptide, en (b) de uitbreiding van geactiveerde B-cellen versterken. De uitvinding is ook gericht op het Bp50 ahtigeen zelf, dat gedefinieerd wordt door mAb G28-5 en in B-celuitbreiding een rol speelt. Bovendien is de uitvinding gericht op liganden die binden aan Bp50 maar geen biologisch effect of 25 functie vertonen zoals versterking van uitbreiding van geactiveerde B-cellen.5. Detailed Description of the Invention The present invention is directed to ligands that (a) bind to Bp50, a 50 kDA B cell-specific surface polypeptide, and (b) enhance the extension of activated B cells. The invention is also directed to the Bp50 ahtigen itself, which is defined by mAb G28-5 and plays a role in B cell extension. In addition, the invention is directed to ligands that bind to Bp50 but show no biological effect or function such as enhancement of extension of activated B cells.

De liganden volgens de onderhavige uitvinding omvatten antilichaam-moleculen, monoklonale antilichaammoleculen en fragmenten van deze anti-lichaammoleculen die 'de antigeen-combinerende plaats bevatten die aan de 30 Bp5Q receptor binden met inbegrip van chemisch gemodificeerde antilicha-men en fragmenten; dergelijke fragmenten omvatten, zonder daartoe beperkt te zijn, Fv, Fab, F(ab')Fab' en dergelijke. Bovendien omvatten de : liganden volgens de onderhavige uitvinding lymfokines, die aan de Bp50 receptor binden. Deze kunnen, zonder daartoe beperkt te zijn, 35 BCGFs omvatten evenals chemisch gemodificeerde lymfokines en dergelijke.The ligands of the present invention include antibody molecules, monoclonal antibody molecules, and fragments of these antibody molecules containing the antigen-combining site that bind to the Bp5Q receptor including chemically modified antibodies and fragments; such fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, F (ab ') Fab' and the like. In addition, the ligands of the present invention include lymphokines that bind to the Bp50 receptor. These can include, but are not limited to, 35 BCGFs as well as chemically modified lymphokines and the like.

-12--12-

De liganden volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt in hun gemodificeerde of ongemodificeerde vormen voor het moduleren en reguleren van immuunreacties en. in de therapie van maligniteiten die het Bp50 antigeen tot expressie brengen. Deze toepassingen worden in groter detail bespro-5 ken in hoofdstuk 5.4.The ligands of the invention can be used in their modified or unmodified forms to modulate and regulate immune responses and. in the therapy of malignancies expressing the Bp50 antigen. These applications are discussed in more detail in chapter 5.4.

Wanneer het ligand een monoklonaal antilichaam of een fragment daarvan is, kan het monoklonale antilichaam tegen Bp50 worden bereid volgens elke techniek die leidt tot de produktie van antilichaammole-culen door een cultuur van continue cellijnen. Bijvoorbeeld behoren de 10 hybr.idomatechniek die oorspronkelijk ontwikkeld is door Kohier enWhen the ligand is a monoclonal antibody or a fragment thereof, the anti-Bp50 monoclonal antibody may be prepared by any technique that leads to the production of antibody molecules through a culture of continuous cell lines. For example, the 10 hybrid ida technique originally developed by Kohier and

Milstein (1975, Nature 256:495-497) evenals andere technieken die meer recent beschikbaar zijn gekomen zoals de humane B-celhybridomatechniek (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) en de EBV-hybridomatechniek voor het bereiden van humane monoklonale antilichamen (Cole et al., 1985, 15 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pag. 77-96) en dergelijke tot de omvang van de onderhavige uitvinding.Milstein (1975, Nature 256: 495-497) as well as other techniques that have become more recently available such as the human B cell hybridoma technique (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) and the EBV hybridoma technique for preparing human monoclonal antibodies (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) and the like to the scope of the present invention.

Antilichaamfragmenten die het idiotype van het molecuul bevatten, kunnen volgens bekende technieken worden gegenereerd. Bijvoorbeeld omvatten dergelijke fragmenten, zonder daartoe beperkt te zijn: het 20 F(ah')2 fragment dat gegenereerd kan worden door het antilichaammolecuul te behandelen met pepsine; de Fab' fragmenten die gegenereerd kunnen worden door de disulfidebruggen van het F(ab')2 fragment te reduceren; het F(ab')2 fragment dat gegenereerd kan worden door het antilichaammolecuul te behandelen met papaïne; en de 2Fab of Fab fragmenten die gegenereerd 25 kunnen worden door het antilichaammolecuul te behandelen met papaïne en een reductiemiddel om de disulfidebruggen te reduceren.Antibody fragments containing the idiotype of the molecule can be generated according to known techniques. For example, such fragments include, but are not limited to: the 20 F (ah ') 2 fragment that can be generated by treating the antibody molecule with pepsin; the Fab 'fragments that can be generated by reducing the disulfide bridges of the F (ab') 2 fragment; the F (ab ') 2 fragment that can be generated by treating the antibody molecule with papain; and the 2Fab or Fab fragments that can be generated by treating the antibody molecule with papain and a reducing agent to reduce the disulfide bridges.

Wanneer het ligand dat Bp50 bindt een lymfokine is, kan het lymfo-kine worden verkregen uit natuurlijke bronnen of, wanneer zijn aminozuur-sequentie bekend of afgeleid is, kan het lymfokine via chemische synthe-30 tische methoden worden bereid. Anderzijds kunnen, wanneer de gensequentie van het lymfokine bekend is, recombinant DNA technieken worden gebruikt om het gen te kloneren in een expressievector die voor transcriptie en translatie van de gensequentie in een geschikte gastheercel zorgt.When the ligand that binds Bp50 is a lymphokine, the lymphokine can be obtained from natural sources or, when its amino acid sequence is known or derived, the lymphokine can be prepared by chemical synthetic methods. On the other hand, when the gene sequence of the lymphokine is known, recombinant DNA techniques can be used to clone the gene into an expression vector that transcribes and translates the gene sequence into a suitable host cell.

Afhankelijk van het beoogde gebruik, kunnen het ligand of geschikte 35 fragmenten van het ligand chemisch worden gemodificeerd door bevestiging aan het ligand van één van verscheidene verbindingen waarbij op zichzelf ·. i ♦ Λ fj -13- •r * bekende koppelingstechnieken worden gebruikt. Dergelijke technieken kunnen/ zonder daartoe beperkt te zijn, het gebruik omvatten van carbodi-imide, cyanogeenbromide, bifunctionele reagentia zoals glutaaraldehyde, N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionaat (SPDP), Schiff basereacties, 5 bevestiging aan sulfhydrylgroepen, het gebruik van natriumisothiocyanaat, of enzymatische aanhechting, om slechts een paar mogelijkheden te noemen. Wanneer een radioisotoop aan het ligand moet worden gebonden, kan dit eveneens worden uitgevoerd via enzymatische middelen, oxydatieve substitutie, chelaatvorming enz. Voor een overzicht van de chemische reagentia 10 die voor modificatie van eiwitten kunnen worden gebruikt, wordt verwezen naar Lundblad en Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification,Depending on the intended use, the ligand or suitable fragments of the ligand can be chemically modified by attachment to the ligand of one of several compounds by itself. i ♦ Λ fj -13- • r * known coupling techniques are used. Such techniques may include, but are not limited to, the use of carbodiimide, cyanogen bromide, bifunctional reagents such as glutaraldehyde, N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), Schiff base reactions, attachment to sulfhydryl groups, use of sodium isothiocyanate, or enzymatic attachment, to name just a few possibilities. When a radioisotope is to be bound to the ligand, it can also be performed via enzymatic means, oxidative substitution, chelation, etc. For an overview of the chemical reagents that can be used for protein modification, see Lundblad and Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification,

Volume II, CSC press, Inc., Boca Raton, Florida, hoofdstuk 5, pag. 123-139, 1984.Volume II, CSC press, Inc., Boca Raton, Florida, Chapter 5, p. 123-139, 1984.

De chemische binding of koppeling van een verbinding aan het li-15 gand zou kunnen worden gestuurd naar een plaats op het ligand dat geen deel heeft aan de binding aan Bp50. Dit zou kunnen worden gereduceerd door de bindingsplaats van het ligand te beschermen voordat de koppe-lingsreactie' wordt uitgevoerd. Het ligand kan bijvoorbeeld eerst aan Bp50 worden gebonden om de 3p50 bindingsplaats te beschermen, waarna 20 de koppelingsreactie kan worden uitgevoerd om de gewenste verbinding te verbinden aan beschikbare reactieve plaatsen op het Iigand-Bp50 complex. Wanneer de koppelingsreactie eenmaal voltooid is, kan het complex worden verbroken onder vorming van een gemodificeerd ligand waaraan de gewenste verbinding is gebonden zodat de Bp50 bindingsplaats van het molecuul 25 zo weinig mogelijk is beïnvloed. Wanneer het ligand een monoklonaal antilichaam zoals G28-5 omvat, waarin het Fc domein van het molecuul niet vereist is voor het ligand om zijn effect uit te oefenen (zie hoofdstuk 5.3.3.) kan het voordelig zijn om de koppeling van gewenste verbindingen te sturen naar het Fc domein van het molecuul.The chemical binding or coupling of a compound to the ligand could be directed to a site on the ligand that does not participate in the binding to Bp50. This could be reduced by protecting the binding site of the ligand before performing the coupling reaction. For example, the ligand can first be bound to Bp50 to protect the 3p50 binding site, after which the coupling reaction can be performed to attach the desired compound to available reactive sites on the Igand-Bp50 complex. Once the coupling reaction is complete, the complex can be broken to form a modified ligand to which the desired compound is bound so that the Bp50 binding site of the molecule is minimized. When the ligand comprises a monoclonal antibody such as G28-5, in which the Fc domain of the molecule is not required for the ligand to exert its effect (see chapter 5.3.3.), It may be advantageous to couple desired compounds. send to the Fc domain of the molecule.

30 De onderstaande subsecties beschrijven de nieuwe, 50-kDa B-cel-30 The subsections below describe the new, 50-kDa B cell

oppervlaktemerker, Bp50, die kennelijk in B-celuitbreiding een rol speelt evenals liganden die aan de nieuwe 50-kDa receptor binden, en hun toe-. passingen. Als een voorbeeld van de liganden volgens de onderhavige uitvinding worden ook een monoklonaal antilichaam dat Bp5Q definieert 35 alsmede zijn F (ab1) 2 fragmenten beschreven die evenals BCGF B-celuitbreiding versterken. Anders dan anti-Bp35 mAb, dat rustende B-cellen in GQsurface marker, Bp50, which apparently plays a role in B cell extension, as well as ligands that bind to the new 50-kDa receptor, and their gene. fits. As an example of the ligands of the present invention, a monoclonal antibody that defines Bp5Q as well as its F (ab1) 2 fragments which, as well as BCGF B cell extension, are described. Other than anti-Bp35 mAb, which is resting B cells in GQ

,Ji * -14- kan opwekken tot overgang naar G^ geeft anti-Bp50 mAb geen activering ' van rustende B-cellen. Anti-Bp35 en anti-Bp50 mAb samen, zonder enige additionele exogene signalen, induceren een sterke activering en uitbreiding van gezuiverde B-cellen.Ji * -14- can induce transition to G ^ does not give anti-Bp50 mAb activation of resting B cells. Anti-Bp35 and anti-Bp50 mAb together, without any additional exogenous signals, induce strong activation and expansion of purified B cells.

5 De onderstaand beschreven experimenten laten ook zien dat anti-5 The experiments described below also show that anti-

Bp50 activiteit lijkt op BCGF activiteit maar dat anti-Bp50 verschilt van één BCGF omdat anti-Bp50 en laagmoleculair gewicht BCGF duidelijk additief zijn en verschillend werken op verscheidene B-celsubsets of maligniteiten. BpSO kan een receptor zijn voor een onderscheiden BCGF 1D' of voor een transmembraansignaal dat BCGF produktie of BCGF receptor-express ie moduleert.Bp50 activity is similar to BCGF activity but that anti-Bp50 differs from one BCGF because anti-Bp50 and low molecular weight BCGF are clearly additive and act differently on various B cell subsets or malignancies. BpSO can be a receptor for a distinct BCGF 1D 'or for a transmembrane signal that modulates BCGF production or BCGF receptor expression.

5.1. Methoden, gebruikt voor karakterisering van de Bp50 receptor Celpreparaten. Mononucleaire cellen werden geïsoleerd van normaal of leukemisch, geheparaniseerd periferaal bloed door Ficoll-Hypaque 15 gradiënten (Pharmacia, Piscataway, NJ). Mononucleaire cellen werden verkregen van tonsillaire weefsels zoals beschreven door (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). Een verarming aan T-cellen werd gerealiseerd met AET-behandelde schapeërythrocytrozetvorming en Ficoll-Hypaque gradiëntscheiding. In sommige experimenten werd een ver-20 rijking aan bloed B-cellen gerealiseerd door aan nylonwol hechtende cellen te isoleren. Monocyten werden verwijderd door incubatie op kunststof petrischalen, één of twee keer gedurende 45 minuten bij 37°C, tenzij anders is aangegeven. Opdrijvende of dichte tonsillaire B-cel fracties werden geïsoleerd door Percoll stapgradiënten zoals beschreven door 25 (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770). Dichte tonsillaire B-celpreparaten bevatten consistent meer dan 95% slg+5.1. Methods Used for Characterization of the Bp50 Receptor Cell Preparations. Mononuclear cells were isolated from normal or leukemic heparanized peripheral blood by Ficoll-Hypaque gradients (Pharmacia, Piscataway, NJ). Mononuclear cells were obtained from tonsillary tissues as described by (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 1766-1770). Depletion of T cells was accomplished with AET-treated sheep erythrocyte rosetting and Ficoll-Hypaque gradient separation. In some experiments, enrichment of blood B cells was accomplished by isolating cells attached to nylon wool. Monocytes were removed by incubation on plastic Petri dishes once or twice for 45 minutes at 37 ° C unless otherwise indicated. Floating or dense tonsillar B cell fractions were isolated by Percoll step gradients as described by 25 (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 1766-1770). Dense tonsillar B cell preparations consistently contain more than 95% slg +

Bp35+ cellen. Preparaten die verrijkt waren aan B-cellen van het bloed bevatten 60-85% slg+ cellen. B-cellymfomacellen werden geïsoleerd door voorzichtig lymfomacellen in het medium te pesten gevolgd door Ficoll-30 Hypaque gradiëntcentrifugatie.Bp35 + cells. Preparations enriched for blood B cells contained 60-85% slg + cells. B cell lymphoma cells were isolated by gently pesting lymphoma cells in the medium followed by Ficoll-30 Hypaque gradient centrifugation.

Monoklonale antilichamen. Het G28-5 antilichaam tegen Bp50 werd verkregen door BALB/c muizen te immuniseren met humane E- tonsillaire lymfocyten en immuunmiitcellen te fuseren met het NS-1 myeloma (Kohier, et al., 1975, Nature 256:495-497; Ledbetter, et al., 1979, Immunol.Monoclonal antibodies. The G28-5 anti-Bp50 antibody was obtained by immunizing BALB / c mice with human E-tonsillar lymphocytes and fusing immune cells with the NS-1 myeloma (Kohier, et al., 1975, Nature 256: 495-497; Ledbetter, et al., 1979, Immunol.

35 Rev. 47:63-82). Hybridecelculturen die antilichaam uitscheiden dat reac- = · . *ij -·- Λ -15- tief is ten opzichte van tonsillaire B-cellen en niet ten opzichte van T-cellen werden geïdentificeerd met behulp van indirekte immunofluores-centie (I?) en analyse met een FACS IV celsorteerder? culturen met anti-lichaam dat soortgelijke histogrampatronen geeft als bekende mAb tegen 5 pan 3-celmerkers (b.v. Bp35) werd gekloneerd en voor verder onderzoek geselecteerd. De G28-5 kloon produceerde een IgG^ mAb dat alleen met normale of maligne B-cellen of B-cellijnen reageerde. Andere mAb, die in dit onderzoek werden gebruikt, zijn in detail beschreven (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770? Clark, et al., 19S6, Human 10 Immunol. 16:100? Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15:30-44; Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, pag. 325-340). Deze omvatten 1F5 (IgG ) anti-Bp35, HBlOa (IgG ), anti-HLA-DR, 2C3 (IgG.) anti-u keten,35 Rev. 47: 63-82). Hybrid cell cultures that secrete antibody that reac- = ·. * ij - · - Λ -15- is active towards tonsillar B cells and not towards T cells were identified by indirect immunofluorescence (I?) and analysis with a FACS IV cell sorter? cultures with antibody showing similar histogram patterns as known mAb against 5 pan 3 cell markers (e.g. Bp35) were cloned and selected for further study. The G28-5 clone produced an IgG ^ mAb that reacted only with normal or malignant B cells or B cell lines. Other mAb used in this study have been described in detail (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 1766-1770? Clark, et al., 19S6, Human Immunol. 16: 100? Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15: 30-44; Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 325-340). These include 1F5 (IgG) anti-Bp35, HB10a (IgG), anti-HLA-DR, 2C3 (IgG.) Anti-u chain,

Zd Zd XZd Zd X.

G19-4 (IgG ) anti-CD3, FC-2 (IgG. ) anti-Fc receptor CD16, en 9.6 (IgG ) X £ci 15 anti-CD2 (E receptor) geleverd door Dr. Paul Martin (Martin, et al., 1983, J. Immunol. 131:180). De IgG^ mAbs werden gezuiverd door precipi-tatie gebruikmakend van 45% of 50% verzadigd ammoniumsulfaat en DEAE Sephacryl kolomchromatografie, en de IgG mAbs werden gezuiverd met be- 4» 3.G19-4 (IgG) anti-CD3, FC-2 (IgG.) Anti-Fc receptor CD16, and 9.6 (IgG) X £ ci anti-CD2 (E receptor) supplied by Dr. Paul Martin (Martin, et al., 1983, J. Immunol. 131: 180). The IgG ^ mAbs were purified by precipitation using 45% or 50% saturated ammonium sulfate and DEAE Sephacryl column chromatography, and the IgG mAbs were purified with 4 »3.

hulp van proteïne A Sepharose kolommen. De F(ab*)^ fragmenten van G28-5 20 werden bereid met de methode van Parham (Parham, et al., 1983, J. Immunol. 131:2895), gezuiverd op een 2-meter lange Sephacryl S200-kolom, en getest op zuiverheid door SDS-PAGE (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135: 1819). Het 2C3 mAb tegen u-ketens werd geconjugeerd aan Sepharose 4B-korrels (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) waarbij cyanogeen-25 bromidekoppeling werd gebruikt.help from protein A Sepharose columns. The F (ab *) ^ fragments of G28-520 were prepared by the method of Parham (Parham, et al., 1983, J. Immunol. 131: 2895), purified on a 2-meter Sephacryl S200 column, and tested for purity by SDS-PAGE (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135: 1819). The 2C3 mAb against u chains was conjugated to Sepharose 4B beads (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) using cyanogen-bromide coupling.

Fluorescelne en fycoërythrineconjugaties. Gezuiverde mAb werden hetzij direkt geconjugeerd met fluorescelne gebruikmakend van fluores-celne-isothiocyanaat (FITC; Molecular Probes) (groen) volgende methode van Goding (Goding, et al., 1976, J. Immunol. Meth. 13:215-226), hetzij 30 geconjugeerd aan R-phycoërythrine (PE) (rood) met behulp van SPDPFluorescelne and Phycoerythrin Conjugations. Purified mAb were either conjugated directly with fluorescence using fluorescence isothiocyanate (FITC; Molecular Probes) (green) following method from Goding (Goding, et al., 1976, J. Immunol. Meth. 13: 215-226), or conjugated to R-phycoerythrine (PE) (red) using SPDP

(Pharmacia) met een methode welke gedetailleerd door ons is beschreven in Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-129. Lymfoldecellen werden geincubeerd in rond-bodem microtiterplaten gedurende 30 minuten met een 35 geschikte verdunning van groen en/of rood mAb, tweemaal gewassen, en daarna geanalyseerd op een FACS IV celsorteerder.(Pharmacia) by a method detailed by us in Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-129. Lymphoid cells were incubated in round-bottom microtiter plates for 30 minutes with an appropriate dilution of green and / or red mAb, washed twice, and then analyzed on a FACS IV cell sorter.

X * -16-X * -16-

Twee-kleuren immunofluorescentie. Twee-kleuren onderzoeken werden uitgevoerd met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS IV: Becton-Dickinson, Mountain View, CA) waarbij gebruik werd gemaakt van een 560-nm dichrolsche spiegel om de bundel te splitsen en een 580 lang-5 doorlaatfilter en 540 kort-doorlaatfilter (Ditric Opties, Hudson, MA) opgsteld voor respectievelijk de rode en de groene fotomultiplicator-buizen. Bovendien werd een twee-kleuren compensator (T. Nozaki, Stanford University) gebruikt om te corrigeren voor ondergeschikt overlopen van groene en rode signalen. Voor elke twee-kleuren kleuring, werden gege-10 vens van. 40.00 cellen verzameld en opgeslagen op floppy disks. Gegevens worden weergegeven als aantal cellen (verticaal) versus de logaritme van de groene fluorescentie versus de logaritme van de rode fluorescentie op een 64 x 64 stippenrooster. Ongeveer 4.5 stippen vertegenwoordigen een verdubbeling van de fluorescentie. Ongekleurde cellen bevinden zich aan 15 de achterste hoek van het rooster; rode fluorescentie is aan de rechter kant en groene fluorescentie aan de linker kant. Ons stroomcytometrie-systeem voor twee-kleuren IF met fluorescelne en fycoërythrine is in groter detail beschreven door (Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-129 en 20 325-340).Two-color immunofluorescence. Two-color studies were performed with a fluorescence-activated cell sorter (FACS IV: Becton-Dickinson, Mountain View, CA) using a 560-nm dichroic mirror to split the beam and a 580 long-5 pass filter and 540 short-pass filter (Ditric Options, Hudson, MA) arranged for the red and green photomultiplier tubes, respectively. In addition, a two-color compensator (T. Nozaki, Stanford University) was used to correct for minor overflow of green and red signals. For each two-color staining, data from. 40.00 cells collected and stored on floppy disks. Data are presented as cell number (vertical) versus the green fluorescence logarithm versus the red fluorescence logarithm on a 64 x 64 dot grid. About 4.5 dots represent doubling of the fluorescence. Unstained cells are located at the rear corner of the grid; red fluorescence is on the right side and green fluorescence on the left. Our flow cytometry system for two-color IF with fluorescence and phycoerythrine is described in more detail by (Ledbetter, et al., 1985, in Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, 119-129 and 20 325-340 ).

Celcultuur. Bloed of tonsillaire lymfoïdecellen werden gekweekt bij 5-10 x 105 ml in viervoud in microtiterplaten met 96 putjes, bevattend 200 ul KPMI-1640 medium aangevuld met 15% feutaal runderserum, antibiotica, glutamine, en pyruvaat (R15). Na 1-7 dager werd aan de cel-25 len een stoot van H-thymidine toegediend van 0.5 uCi/putje (New England Nuclear, 6.7 Ci/mmol; 1 Ci=37) gedurende 18 uur. De cellen werden daarna geoogst op glas-vezelfliters met een celoogster, en de radioactiviteit werd gemeten in een scintillatieteller. In sommige experimenten werden antilichamen of factoren op verschillende tijdstippen na het begin van 30 de kweek toegévoegd; uitbreiding in deze experimenten werd gemeten op dag 3.Cell culture. Blood or tonsillar lymphoid cells were grown at 5-10 x 105 ml in quadruplicate in 96-well microtiter plates containing 200 µl KPMI-1640 medium supplemented with 15% fetal bovine serum, antibiotics, glutamine, and pyruvate (R15). After 1-7 days, the cells were administered a burst of H-thymidine of 0.5 µCi / well (New England Nuclear, 6.7 Ci / mmol; 1 Ci = 37) for 18 hours. The cells were then harvested on glass fiber flashes with a cell harvester, and the radioactivity was measured in a scintillation counter. In some experiments, antibodies or factors were added at different times after the start of the culture; extension in these experiments was measured on day 3.

Costimulerende factoren. Gezuiverd BCGF werd gekocht bij Cytokine Technology (Buffalo, New York) en bevatte geen detecteerbare IL-1, 11-2 of interferonactiviteit. Dit BCGF werd bereid met de methode 35 volgens Maizel en medewerkers (Maizel, et al., 1982, Proc. Nat. Acad.Cost-stimulating factors. Purified BCGF was purchased from Cytokine Technology (Buffalo, New York) and contained no detectable IL-1, 11-2 or interferon activity. This BCGF was prepared by the method according to Maizel et al. (Maizel, et al., 1982, Proc. Nat. Acad.

Sci. USA 79:5998), die hebben aangetoond dat de belangrijkste BCGF acti-Sci. USA 79: 5998), which have demonstrated that the major BCGF active

τ·* Xτ · * X

-17- viteit in dit materiaal schuilt in een 12-kDa species dat verder wordt aangeduid als nBCGF (laag)" (Mehta, et al., 1985, J. Immunol. 135:3298).In this material, there is a 12-kDa species further referred to as nBCGF (layer) "(Mehta, et al., 1985, J. Immunol. 135: 3298).

De zuiveringsstappen omvatten preparatieve schaal DEAE affiniteitschro-matografie gevolgd door hydroxylapatietkolomchromatografie. IL-1 gezui- 5. verd tct homogeniteit was een genereuze gift van Dr. Steven Dower (Dower, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:501). De Cetus Corporation was zo vriendelijk om recombinant IL-2 te leveren. TPA (12-0-tetradeconoyl-forbol 13-acetaat) werd gekocht bij Sigma.The purification steps included preparative scale DEAE affinity chromatography followed by hydroxylapatite column chromatography. IL-1 purified 5. homogeneity was a generous gift from Dr. Steven Dower (Dower, et al., 1985, J. Exp. Med. 162: 501). The Cetus Corporation was kind enough to provide recombinant IL-2. TPA (12-0-tetradeconoyl phorbol 13 acetate) was purchased from Sigma.

Detectie van celactivering. Veranderingen in celvolume, cpge-10 roepen door mAb en/of factoren, werden gemeten met een celsorteerder en een voorwaartse hoeklichtverstrooier. Celcyclusveranderingen in cellulaire RNA en DNA niveaus werden gemeten door geactiveerde cellen te kleuren met acridine oranje en het relatieve cellulaire RNA (rood) en DNA (groen) gehalte te meten met een celsorteerder volgens de methode 15 van Darzynkiewicz et al. (Darzynkiewicz, et al., 1980, Proc. Nat. Acad.Detection of cell activation. Changes in cell volume, cpge-10 calls by mAb and / or factors, were measured with a cell sorter and a forward angular light scatterer. Cell cycle changes in cellular RNA and DNA levels were measured by staining activated cells with acridine orange and measuring the relative cellular RNA (red) and DNA (green) content with a cell sorter according to the method of Darzynkiewicz et al. (Darzynkiewicz, et al ., 1980, Proc Nat Acad.

Sci. USA 77:6697-6702). Veranderingen in relatieve gehaltes van cel-oppervlakte-antigenen werden gevolgd door gebruik te maken van mAb, direkt geconjugeerd met fluoresceine, en daarna kwantitatief bepaald door direkte IP fluorescentieniveaus met een Epics V celsorteerder.Sci. USA 77: 6697-6702). Changes in relative levels of cell surface antigens were monitored using mAb, conjugated directly with fluorescein, and then quantitated by direct IP fluorescence levels with an Epics V cell sorter.

20 Biochemische karakterisering van Bp50. Immunoprecipitatie van 12520 Biochemical characterization of Bp50. Immunoprecipitation of 125

Bp50 van aan het oppervlak met I-gelabelde tonsillaire cellen werd uitgevoerd op de beschreven wijze (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 134:4250-4254). Geïsoleerde antigenen werden aan elektroforese onderworpen op 10% SDS polyacrylamide slabgels zonder reductie. De gels 25 werden zichtbaar gemaakt met behulp van autoradiografie bij -70°C en Cronex belichting plus versterkingsschermen (Dupont).Bp50 of surface I-labeled tonsillar cells was performed as described (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 134: 4250-4254). Isolated antigens were electrophoresed on 10% SDS polyacrylamide bibs without reduction. The gels 25 were visualized by autoradiography at -70 ° C and Cronex illumination plus enhancement screens (Dupont).

5.2. Karakterisering van de Bp50 receptor De onderstaande subsecties beschrijven de resultaten van de experimenten die met de bovenstaand beschreven methoden werden uitgevoerd.5.2. Characterization of the Bp50 receptor The subsections below describe the results of the experiments performed with the methods described above.

30 5.2.1. Identificatie van een B-cel-specifieke _50 kDa celoppervlaktemerker, Bp50_30 5.2.1. Identification of a B cell specific _50 kDa cell surface marker, Bp50_

Een mAb tegen Bp50 werd opgewekt door BALB/c muizen te immuniseren met humane tonsillaire lymfocyten en immuunmiltcellen te fuseren met de NS-1 myeloma. Eén kloon, G28-5, produceerde een IgG^ mAb dat niet de 35 NS-1 lichte keten bevatte. Na onderzoek met IF analyse, bleek G28-5An mAb against Bp50 was generated by immunizing BALB / c mice with human tonsillar lymphocytes and fusing immune spleen cells with the NS-1 myeloma. One clone, G28-5, produced an IgG ^ mAb that did not contain the NS-1 light chain. After examination with IF analysis, G28-5 was found

#*- *·· 'V# * - * ·· 'V

' l ’ > ; _* *· -18- alleen te reageren met normale of maligne B-cellen of B-cellijnen. Een uitgebreid onderzoek van normale weefsels volgens bekende methoden (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:1766-1770; Ledbetter et al,, 1986, Human Immunol. 15:30-44; Ledbetter, 1985, in Perspectives 5 in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, pag. 325-340) openbaarde dat het G28-5 antilichaam reageert met E rozet-negatieve (Er-) cellen uit bloed of tonsillen maar niet met niet aan nylonwol hechtende T-cellen, PHA-geïnduceerde T-celblasts, of met bloedgranulo-cyten, monocyten, rode cellen, of plaatjes. Het reageerde sterk met 10. alle. zeven geteste B lymfoblastoïdecellijnen en met drie Burkitt's lymfomalijnen (Raji, Daudi, Namalwa), maar niet vier T-cellijnen (CEM, HSB-2, JURKAT, en HPB-ALL). Alle geteste chronische lymfocytische leukemieën (3/3) en 90% (9/10) van geteste B lymfoma's brachten de Bp50 merker tot expressie terwijl slechts 28% (2/7) van non T, non B CALLA+ 15 acute lymfocytische leukemieên Bp50 tot expressie brachten.'l'>; _ * * · -18- to react only with normal or malignant B cells or B cell lines. A comprehensive study of normal tissues by known methods (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 1766-1770; Ledbetter et al ,, 1986, Human Immunol. 15: 30-44; Ledbetter , 1985, in Perspectives 5 in Immunogenetics and Histocompatibility, ASHI, New York, 6, pp. 325-340) revealed that the G28-5 antibody reacts with E rosette negative (Er) cells from blood or tonsils but not with no nylon wool adhering T cells, PHA-induced T cell blasts, or with blood granulocytes, monocytes, red cells, or platelets. It responded strongly with 10. all. seven B lymphoblastoid cell lines tested and three Burkitt's lymphoma lines (Raji, Daudi, Namalwa), but not four T cell lines (CEM, HSB-2, JURKAT, and HPB-ALL). All tested chronic lymphocytic leukemias (3/3) and 90% (9/10) of tested B lymphomas expressed the Bp50 marker while only 28% (2/7) of non T, non B CALLA + 15 acute lymphocytic leukemias Bp50 expressed.

De beperkte distributie van Bp50 op normale weefsels werd verder bevestigd door kwantitatieve twee-kleuren immunofluorescentie (twee-kleuren IF) analyses.The limited distribution of Bp50 on normal tissues was further confirmed by quantitative two-color immunofluorescence (two-color IF) analyzes.

Onder toepassing van een R-fycoërythrine (PE)-geconjugeerd anti-20 lichaam (rood) tegen het pan B-celantigeen Bp35 (Bl, CD20) en fluores-ceïne-geconjugeerd anti-Bp50 antilichaam (groen), vonden wij dat Bp50 slechts tot expressie werd gebracht op Bp35+ B-cellen (fig. 1) in bloed of tonsillen. B-cellen van bloed brachten consistent iets lagere niveaus van Bp50 tot expressie dan tonsillaire B-cellen; dit vertoont overeen-25 stemming met HLA-DR expressie, (Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15-30-44) en met gp54 expressie (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) die eveneens lager zijn aan bloed B-cellen. Bp50 werd in overeenkomstige niveaus tot expressie gebracht op tonsillaire B-cel-subpopulaties die gescheiden waren op Percoll gradiënten tot opdrijvende 30 en dichte fracties. Gebruikmakend van ons PE-geconjugeerd mAb tegen de T-celmerker, CD3(T3), en NK cel-gebonden merker, CD16(Fc receptor) (Ledbetter, et al., 1979, Immunol. Rev. 47:63-82), vonden wij dat Bp50 niet tot expressie kwam op T-cellen of NK cellen. Gebruikmakend van twee-kleuren IF, vonden wij ook dat CD3+ PHA blasts die hoge niveaus 35 van IL-2 receptoren tot expressie brachten, Bp50 niet tot expressie brachten.Using an R-phycoerythrine (PE) -conjugated anti-20 body (red) against the pan B cell antigen Bp35 (B1, CD20) and fluorescein-conjugated anti-Bp50 antibody (green), we found that Bp50 only was expressed on Bp35 + B cells (Fig. 1) in blood or tonsils. Blood B cells consistently expressed slightly lower levels of Bp50 than tonsillar B cells; this is consistent with HLA-DR expression, (Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15-30-44) and with gp54 expression (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149 : 1424-1433) which are also lower in blood B cells. Bp50 was expressed at corresponding levels on tonsillar B cell subpopulations separated on Percoll gradients into buoyant and dense fractions. Using our PE-conjugated mAb against the T cell marker, CD3 (T3), and NK cell bound marker, CD16 (Fc receptor) (Ledbetter, et al., 1979, Immunol. Rev. 47: 63-82), we found that Bp50 was not expressed on T cells or NK cells. Using two-color IF, we also found that CD3 + PHA blasts expressing high levels of IL-2 receptors did not express Bp50.

jW1 -Λϊ .i # ^ i1 f ‘ ' ·1 -19-jW1 -Λϊ .i # ^ i1 f ‘'· 1 -19-

Eet G28-5 antilichaam reageerde met één enkel polypeptide op tonsillaire lymf ocyten, dat bij ongeveer 50 Kd migreerde onder niet-reducerende omstandigheden (Fig. 2A). Dit molecuul is groter dan eerder beschreven B-celmerkers in hetzelfde molecuulgewichtsfcereik zoals Bp39 5 of Bp45 (Zipf, et al., 1983, J. Immunol. 131:3064-3072; Kitner, et al., 1981, Nature 294, 458-460; Clark, et al., 1986, in Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, et al... Springer Verlag, Berlijn, hoofdstuk 12 Vol. 2, 155-167; Slovin, et al., 1982, Proc. Nat- Acad. Sci. üSA 79:2649-2653; Thorley-Lawson, et al., 1985, J. Immunol. 134:3007-3012 en Fig. 2B).The G28-5 antibody reacted with a single polypeptide on tonsillary lymph ocytes, which migrated at approximately 50 Kd under non-reducing conditions (Fig. 2A). This molecule is larger than previously described B cell markers in the same molecular weight range as Bp39 or Bp45 (Zipf, et al., 1983, J. Immunol. 131: 3064-3072; Kitner, et al., 1981, Nature 294, 458- 460; Clark, et al., 1986, in Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, et al. Springer Verlag, Berlin, Chapter 12 Vol. 2, 155-167; Slovin, et al., 1982, Proc. Nat Acad Sci US 79: 2649-2653; Thorley-Lawson, et al., 1985, J. Immunol. 134: 3007-3012 and Fig. 2B).

10 De belichtingstijd werd voor deze gel zo gekozen dat de molecuulgewich-ten van de andere B-celmerkers gemakkelijk kon vergeleken met Bp50.The exposure time for this gel was chosen so that the molecular weights of the other B cell markers could easily be compared to Bp50.

De Bp39 merker, wordt in tegenstelling tot Bp5Q tot expressie gebracht op granulocyten en Bp45 is in tegenstelling tot Bp50 beperkt tot B-cel-blasts. Antilichamen tegen Bp39 (41-H16) en Bp45 (MNM6, Blast-1, Blast-2) 15 die ter beschikking waren gekomen via een internationale workshop (Clark, et al., 1986, in Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlijn, hoofdstuk 12 Vol. 2, 155-167) gaven geen blokkering van de binding van gefluorescelneerde anti-3p50 antilichamen tegen B-cellen. Gebaseerd op weefselverdeling, biochemische analyse, 20 en blokkeringsonderzoeken, herkent derhalve het G28-5 monoklonaal antilichaam een 50-Kd structuur die verschilt van andere bekende B-cel anti-genen.The Bp39 marker, unlike Bp5Q, is expressed on granulocytes and Bp45, unlike Bp50, is limited to B cell blasts. Antibodies to Bp39 (41-H16) and Bp45 (MNM6, Blast-1, Blast-2) 15 made available through an international workshop (Clark, et al., 1986, in Leukocyte Typing II, eds. Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, Chapter 12 Vol. 2, 155-167) did not block the binding of fluorescent anti-3p50 antibodies to B cells. Therefore, based on tissue distribution, biochemical analysis, and blocking studies, the G28-5 monoclonal antibody recognizes a 50-Kd structure different from other known B cell anti-genes.

5.2.2. Expressie van Bp50 is beperkt tot B-cellen Zowel verdelingsonderzoeken aan hematopoietisch weefsel en cel-25 lijnen als gedetailleerde twee-kleuren stroomcytometrische analyses openbaarden dat Bp50 alleen op B lymfocyten tot expressie komt. Zoals weergegeven in fig. 3, komt Bp50 tot expressie op een kleine subset van bloedlymfocyten en op een grote populatie van tonsillaire lymfocyten. Nagenoeg alle Bp5Q+ cellen in zowel bloed als tonsillen brachten ook 30 3p35 en HLA-DR tot expressie, maar brachten niet het CD2 (fig. 1) of CD3, T-celmoleculen of de IgG Fc receptoren die op NK cellen worden aangetroffen, tot expressie. Verder vertoonden ConA-geactiveerde CD3+ T-celblasts IL-2 receptoren tot expressie, maar brachten geen Bp50 tot expressie.5.2.2. Bp50 expression is limited to B cells. Both hematopoietic tissue and cell line distribution studies and detailed two-color flow cytometric analyzes revealed that Bp50 is expressed only on B lymphocytes. As shown in Figure 3, Bp50 is expressed on a small subset of blood lymphocytes and on a large population of tonsillar lymphocytes. Virtually all Bp5Q + cells in both blood and tonsils also expressed 3p35 and HLA-DR, but did not express the CD2 (Figure 1) or CD3, T cell molecules or the IgG Fc receptors found on NK cells. . Furthermore, ConA-activated CD3 + T cell blasts expressed IL-2 receptors, but did not express Bp50.

35 Twee-kleuren stroomcytometrische analyses maken een kwantitatieve meting mogelijk van het dichtheidsverband tussen twee oppervlakte- 1 · . > « 1 ** ‘ v ft *~ -20- antigenen. Eerder is door ons aangetoond dat de dichte, rustende B-cellen in de mantelzone van secundaire follikels IgM en geringe niveaus van Bp35 tot expressie brengen, terwijl de opdrijvende, geactiveerde B-cellen in het germinale centrum IgM-negatief zijn en verhoogde niveaus van 5 Bp35 tot expressie brengen (Ledbetter, et al., Human Immunol. 15:30).35 Two-color flow cytometric analyzes allow a quantitative measurement of the density relationship between two surface 1 ·. > «1 **" v ft * ~ -20 antigens. We have previously been shown that the dense resting B cells in the mantle zone of secondary follicles express IgM and low levels of Bp35, while the floating, activated B cells in the germinal center are IgM negative and elevated levels of 5 Expressing Bp35 (Ledbetter, et al., Human Immunol. 15:30).

Fig. 3 laat zien dat zowel IgM-positieve als IgM-negatieve B-celsubsets Bp50 in gelijke hoeveelheden tot expressie brachten, hetgeen erop wijst dat Bp50 zowel op rustende B-cellen als op B-cellen die in vivo geactiveerd zijn tot expressie komt.Fig. 3 shows that both IgM positive and IgM negative B cell subsets expressed Bp50 in equal amounts, indicating that Bp50 expresses both resting B cells and B cells activated in vivo.

10 5.3, Versterking van B-celuitbreiding _met anti-Bp50 antilichaam_10 5.3, Enhancement of B cell extension _with anti-Bp50 antibody_

Zoals eerder uitgelegd kunnen B-cellen worden geactiveerd met lage doses van anti-u keten-specieke antilichamen. Onlangs werd door ons gevonden dat de B-cel-specifieke merker Bp35 (Bl), een 35-kDa polypep-15 tide, eveneens in vroege B-celactivering een rol kan spelen: het 1F5 m£b tegen Bp35 activeert evenals lage doses van anti-u antilichaam, B-cellen "tot een vergroting van celvolume en RNA gehalte en tot respon-siviteit op BCGF (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 1766-1770; Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Het was 20 daarom interessant om het effect van anti-Bp50 mAb in de uitbreiding van onbehandelde B-cellen of B-cellen, geactiveerd met hetzij anti-Bp35 hetzij anti-u antilichamen te vergelijken (tabel A). Anti-Bp35 in oplossing of aan Sepharose-korrels gebonden anti-u antilichamen konden onder gepaste omstandigheden alleen enige B-celuitbreiding stimuleren (tabel A 25.' regel 1); daarentegen stimuleerden anti-Bp50 antilichamen alleen geen uitbreiding (tabel A, regel 2). Anti-Bp50 mAb versterkte echter de uitbreiding aanzienlijk bij kweken met anti-u korrels of met anti-Bp35.As previously explained, B cells can be activated with low doses of anti-u chain-specific antibodies. We recently found that the B cell-specific marker Bp35 (Bl), a 35-kDa polypeptide, may also play a role in early B cell activation: it activates 1F5 mb against Bp35 as well as low doses of anti-u antibody, B cells "to increase cell volume and RNA content and to responsiveness to BCGF (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 1766-1770; Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135: 3795-3801) It was therefore interesting to note the effect of anti-Bp50 mAb in the extension of untreated B cells or B cells activated with either anti-Bp35 or Compare anti-u antibodies (Table A) Anti-Bp35 in solution or Sepharose beads bound anti-u antibodies could only stimulate some B cell extension under appropriate conditions (Table A 25, line 1); Bp50 antibodies alone do not extend (Table A, line 2) However, anti-Bp50 mAb significantly enhanced the extension when cultured with anti-u beads or with anti-Bp35.

In dit opzichte leek. anti-Bp50 op BCGF (tabel A, regel 3). Het was derhalve belangrijk om te bepalen of anti-Bp50 en BCGF samen B-celuitbrei-30 ding konden opwekken. Zoals geïllustreerd in tabel A, regel 4, werd door anti-Bp50 en BCGF samen geen uitbreiding opgewekt, maar werd uitbreiding van hetzij anti-u hetzij anti-Bp35 geactiveerde cellen iets meer versterkt dan door elk stimuleringsmiddel alleen. BCGF had over een drie-logbereik, indien toegepast met anti-Bp50 zonder andere signalen, geen 35 effect op de uitbreiding van dichte B-cellen, zelfs niet wanneer anti-Bp50 werd gebruikt in doses variërend van 0,1 tot 10 ug/ml.In this respect it seemed. anti-Bp50 on BCGF (Table A, line 3). It was therefore important to determine whether anti-Bp50 and BCGF together could elicit B cell extension. As illustrated in Table A, line 4, anti-Bp50 and BCGF together did not elicit extension, but extension of either anti-u or anti-Bp35 activated cells was slightly more enhanced than by any stimulant alone. BCGF over a three log range, when used with anti-Bp50 without other signals, had no effect on the expansion of dense B cells, even when anti-Bp50 was used at doses ranging from 0.1 to 10 µg / ml .

.. i . j --vs -4 " ‘ ''> * f • W 5 * Δ * » -21-.. i. j --vs -4 "" ""> * f • W 5 * Δ * »-21-

TABEL ATABLE A

Versterking van anti-Ig of anti-Bp35 geïnduceerde B-celuitbreiding met anti-Bp50 antilichamenAmplification of anti-Ig or anti-Bp35 induced B cell extension with anti-Bp50 antibodies

Gemiddelde uitbreiding ± S.E. van B-cellen, gekweekt met: 5 regel Co-stimulans_media_anti-u-korrels_anti-Bp35 1 geen 1.2121547 10.219±462 5.539+308 2 anti-Bp50 719±718 38.792+1.329 25.465+616 3 BCGF 456±217 14.217±445 9.443+343 4 1.456Ü26 54.393+2.537 46.488+3.387Mean extension ± S.E. of B cells, cultured with: 5 line Co-stimulant_media_anti-u-granules_anti-Bp35 1 none 1,2121547 10,219 ± 462 5,539 + 308 2 anti-Bp50 719 ± 718 38,792 + 1,329 25,465 + 616 3 BCGF 456 ± 217 14,217 ± 445 9,443 +343 4 1.456Ü26 54.393 + 2.537 46.488 + 3.387

10 + BCGF10 + BCGF

•4-• 4-

Uitbreiding van dichte Er- tonsillaire B-cellen (95% oppervlak IgM cellen) werd op de beschreven wijze op dag 3 gemeten. In het kort werden 2 x IQ5 cellen/200 ul putje gekweekt in viervoud gedurende 48 uur met RPMI 1640 medium dat 15% feutaal runderserum plus additieven bevatte 15 zonder antilichaam of met hetzij 2C3 monaklonaal antilichaam tegen u-ketens gekoppeld aan sefarosekorrels ("anti-u korrels", 50 ug/ml) het-• zij vrij 1F5 anti-Bp35 antilichaam (5 ug/ml). Cultures die media, "anti-u korrels", of anti-Bp35 bevatten, werden alleen of mat BCGF (5% eindConcentratie, Cytokine Technology, Buffalo, New York; zonder detec-20 teerbare IL-1 of IL-2 activiteit), met anti-BpSO (1:1000 verdunning van ascites) als co-stimuleringsmiddelen gekweekt. Na 40 uur werd aan de 3 cellen een stoot H-thymidine gegeven, en opgenomen aantallen werden na 18 uur gemeten.Expansion of dense Ertonsillar B cells (95% surface IgM cells) was measured on day 3 as described. Briefly, 2 x IQ5 cells / 200 µl well were grown in quadruplicate for 48 hours with RPMI 1640 medium containing 15% fetal bovine serum plus additives without antibody or with either 2C3 monoclonal anti-u chain antibody coupled to sepharose beads ("anti- u beads, 50 µg / ml) either • free 1F5 anti-Bp35 antibody (5 µg / ml). Cultures containing media, "anti-u beads", or anti-Bp35, were alone or measured BCGF (5% final Concentration, Cytokine Technology, Buffalo, New York; without detectable IL-1 or IL-2 activity), cultured with anti-BpSO (1: 1000 dilution of ascites) as costimulants. After 40 hours, the 3 cells were boosted with H-thymidine, and recorded numbers were measured after 18 hours.

5.3.1. Anti-Bp5Q mAb versterkt uitbreiding alleen 25 nadat B-cellen zijn geactiveerd door _anti-Bp35 of anti-u antilichamen_5.3.1. Anti-Bp5Q mAb enhances extension only after B cells have been activated by anti-Bp35 or anti-u antibodies

De resultaten in tabel A wijzen erop dat anti-Bp50 mAb op zichzelf niet in staat zouden zijn om uitbreiding te induceren. Zoals getoond in fig. 4 hadden doses van anti-3p50 variërend van 0,05 ug tot 2,0 ug/ml 3 30 geen effect op de opname van H-thymidine. In tegenwoordigheid van optimale niveaus van anti-Bp35 mAb echter versterkten geringe hoeveelheden anti-Bp50 antilichamen van slechts 0,1 tot 0,5 ug/ml de uitbreiding aanzienlijk. Grote hoeveelheden van wel 50.000 tot 70.000 cpm waren detecteerbaar bij het optimale tijdstip van uitbreiding wanneer sterk gezui-35 verde B-cellen alleen met anti-Bp35 plus anti-Bp50 werden gekweekt.The results in Table A indicate that anti-Bp50 mAb alone would not be able to induce extension. As shown in Figure 4, doses of anti-3p50 ranging from 0.05 µg to 2.0 µg / ml 3 had no effect on the uptake of H-thymidine. However, in the presence of optimal levels of anti-Bp35 mAb, small amounts of anti-Bp50 antibodies of only 0.1 to 0.5 µg / ml significantly enhanced the extension. Large amounts as high as 50,000 to 70,000 cpm were detectable at the optimal time of expansion when highly purified B cells were grown only with anti-Bp35 plus anti-Bp50.

v ·* -22-v · * -22-

Ccnsistent werd waargenomen dat hogere doses van anti-Bp50 (groter dan 2-5 ug/ml) minder effektief waren dan doses in het gebied van 100-200 ng.Consistently, higher doses of anti-Bp50 (greater than 2-5 µg / ml) were observed to be less effective than doses in the range of 100-200 ng.

Deze resultaten wezen erop dat anti-Bp50 alleen kunnen functioneren nadat B-cellen door andere signalen zijn geactiveerd. De in fig. 5 5 getoonde gegevens wijzen erop dat dit inderdaad het geval is. Wanneer B-cellen eerst geactiveerd werden met anti-Bp35, kon anti-Bp50 zo laat als 24-48 uur later worden toegevoegd en toch uitbreiding op dag 4 versterken. Daarentegen was anti-Bp35, in het geval dat de cellen eerst met anti-Bp50 werden behandeld, alleen effectief wanneer het binnen een 10; paar uur. na het begin van de kweek werd toegevoegd. Soortgelijke resultaten werden gevonden wanneer anti-u in plaats van anti-Bp35 werd gebruikt.These results indicated that anti-Bp50 can only function after B cells have been activated by other signals. The data shown in Fig. 5 indicate that this is indeed the case. When B cells were first activated with anti-Bp35, anti-Bp50 could be added as late as 24-48 hours later and still enhance extension on day 4. In contrast, in the case that the cells were first treated with anti-Bp50, anti-Bp35 was effective only when within a 10; couple of hours. was added after the start of the culture. Similar results were found when anti-u was used instead of anti-Bp35.

5.3.2. Anti-Bp50 mAb geven geen activering van B-cellen uit maar induceren wel 15 geactiveerde B-cellen tot verder door- _lopen van de celcyclus__5.3.2. Anti-Bp50 mAb do not release B cell activation but do induce 15 activated B cells to continue through the cell cycle.

Eerder werd door ons gevonden dat anti-Bp35, evenals geringe doses van anti-u antilichamen, rustende tonsillaire B-cellen in GQ tot vergroting opwekken (Clark, et al., 1986, Leukocyte Typing II, eds., 20 Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlijn, Vol. 2, 455-462} en tot over-gang naar de G^ fase van de celcyclus (Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Het was daarom belangwekkend om het vermogen van anti-Bp50 mAb te vergelijken met dat van anti-Bp35 mAb voor wat betreft hun effekten op de B-celactivering. Zoals getoond in fig. 6A, hadden niet 25 gestimuleerde dichte tonsillaire B-cellen zelfs na 3-4 dagen in cultuur een uniform RNA profiel dat karakteristiek is voor cellen in G^ (Darzynkiewicz, 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:6697-6702). Ongeveer 15-30% van met anti-Bp35 of anti-u gestimuleerde cellen had echter een verhoogd RNA gehalte dat duidt op overgang naar G^. In tegenstellen 30 daarmee induceerden noch anti-Bp50 (fig. 6B) noch BCGF (fig. 60 alleen een overgang van significante aantallen van B-cellen naar G^. Bijvoorbeeld induceerden 2 dagen na de activering anti-Bp35 en anti-Ig mAb respectievelijk 13,5% en 20,9% van tonsillaire cellen tot overgang naar G^, terwijl cellen die alleen met anti-Bp50 (2,7%) of BCGF (3,2%) waren 35 behandeld, op mediacontroleniveaus bleven (2,2%). Wanneer echter hetzij anti-Bp50 hetzij BCGF samen met anti-Bp35 of anti-u antilichamen werden C -7 n -r , v / V j J ƒ 1 1 *.It was previously found by us that anti-Bp35, as well as small doses of anti-u antibodies, elicit quiescent tonsillary B cells in GQ (Clark, et al., 1986, Leukocyte Typing II, eds., 20 Reinherz, et al Springer Verlag, Berlin, Vol. 2, 455-462} and transition to the G phase of the cell cycle (Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135: 3795-3801). therefore, interesting to compare the ability of anti-Bp50 mAb to that of anti-Bp35 mAb in their effects on B cell activation As shown in Figure 6A, unstimulated dense tonsillary B cells even after 3- 4 days in culture a uniform RNA profile characteristic of cells in G ^ (Darzynkiewicz, 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77: 6697-6702). About 15-30% of with anti-Bp35 or anti- u stimulated cells, however, had an increased RNA content indicating transition to G ^. In contrast, neither anti-Bp50 (Fig. 6B) nor BCGF (Fig. 60) induced only a transition of G ^. n significant numbers of B cells to G ^. For example, 2 days after activation, anti-Bp35 and anti-Ig mAb induced 13.5% and 20.9% of tonsillar cells to transition to G ^, respectively, while cells containing only anti-Bp50 (2.7%) or BCGF (3.2%) were treated 35, remained at media control levels (2.2%). However, when either anti-Bp50 or BCGF together with anti-Bp35 or anti-u antibodies, C-7 n -r, v / V j J ƒ 1 1 *.

-23- toegevoegd, steeg de hoeveelheid cellen die overgingen naar G^ dramatisch. Evenzo gaven anti-Bp50 en BCGF alleen geen inductie van B-cellen tot overgang naar de S fase (tabel B), maar samen met hetzij anti-B35 hetzij anti-u leidden zij tot een twee- tot drievoudige verhoging van 5 het aantal cellen in de S fase.-23- added, the amount of cells that switched to G ^ increased dramatically. Similarly, anti-Bp50 and BCGF alone did not induce B cells to transition to the S phase (Table B), but together with either anti-B35 or anti-u they led to a two to three fold increase in the number of cells in the S phase.

TABEL BTABLE B

Effekt van anti-Bp50 en BCGF op voortgang van de celcyclus in tonsülaire lymfocytenEffect of anti-Bp50 and BCGF on cell cycle progression in tonsillar lymphocytes

Competentie- Progressie- GQ % Cellen S/G^/MCompetency- Progression- GQ% Cells S / G ^ / M

IQ signaal signaal G^ media geen 89,9 7,1 2,5 anti-Bp35 * 80,4 14,5 3,7 anti-Ig " 65,6 27,6 5,7 media anti-Bp50 83,6 . 12,0 3,3 15 anti-Bp35 ” 54,1 35,5 9,7 anti-Ig " 43,6 36,2 16,2 media BCGF 85,4 11,7 2,2 anti-Bp35 n 56,6 32,6 11,6 anti-Ig " 48,4 36,1 14,1 20 Percentage van cellen in G^, G^, of S en G^ bepaald met behulp van de acridine oranje-kleuringsprocedure (Darzynkiewicz, et al., 1980, Proc.IQ signal signal G ^ media none 89.9 7.1 2.5 anti-Bp35 * 80.4 14.5 3.7 anti-Ig "65.6 27.6 5.7 media anti-Bp50 83.6. 12.0 3.3 15 anti-Bp35 ”54.1 35.5 9.7 anti-Ig" 43.6 36.2 16.2 media BCGF 85.4 11.7 2.2 anti-Bp35 n 56, 6 32.6 11.6 anti-Ig "48.4 36.1 14.1 20 Percentage of cells in G ^, G ^, or S and G ^ determined using the acridine orange staining procedure (Darzynkiewicz, et al ., 1980, Proc.

gg

Nat. Acad. Sci. USA 77:6697-6702); 1 x 10 dichte tonsillaire lymfo-cyten met anti-Bp35 (5 ug/ml), anti-u op korrels (50 ug/ml), anti-Bp50 (0,4 ug/ml), BCGF (5%) of combinaties zoals getoond.Wet. Acad. Sci. USA 77: 6697-6702); 1 x 10 dense tonsillary lymphocytes with anti-Bp35 (5 µg / ml), anti-u on beads (50 µg / ml), anti-Bp50 (0.4 µg / ml), BCGF (5%) or combinations as shown.

25 5.3,3. Optimale condities voor versterking van B-celuitbreiding met anti-Bp50 _antilichamen_5.3.3. Optimal conditions for enhancement of B cell extension with anti-Bp50 antibodies

Antilichamen tegen Bp50 hebben op zichzelf weinig of geen detecteerbaar effekt op dichte rustende B-cellen (tabel C). In tegenwoordig-30 heid van middelen die B-cellen kunnen activeren zoals anti-Ig, anti-Bp35 en TPA, versterkte anti-Bp50 mAb echter de uitbreiding duidelijk'.Antibodies to Bp50 alone have little or no detectable effect on dense resting B cells (Table C). However, in the present age of agents that can activate B cells such as anti-Ig, anti-Bp35 and TPA, anti-Bp50 mAb markedly enhanced extension.

-24--24-

Anti-Bp50 vertoonde geen costimulatie met verscheidene interleukines, ' met inbegrip van gezuiverd IL-1, recombinant IL-2 en BCGF (laag). Een vergelijking van de effekten van anti-Bp50 met die van BCGF (laag) liet zien dat dezelfde middelen die costimulatie met anti-Bp50 gaven, ook 5 costimulatie gaven met BCGF (laag) (tabel C). Van bijzonder belang was de vondst dat BCGF en anti-Bp50 tezamen nog geen costimulatie van rustende cellen gaven.Anti-Bp50 showed no costimulation with various interleukins, including purified IL-1, recombinant IL-2 and BCGF (low). A comparison of the effects of anti-Bp50 with those of BCGF (low) showed that the same agents that co-stimulated with anti-Bp50 also co-stimulated with BCGF (low) (Table C). Of particular interest was the finding that BCGF and anti-Bp50 together did not yet yield resting cell costimulation.

TABEL· CTABLE · C

Versterking van B-celuitbreiding met anti-Bp50 10' antilichamen of B-celgroeifactorEnhancement of B cell extension with anti-Bp50 10 'antibodies or B cell growth factor

Gemiddelde uitbreiding ± S.E. van B-cellen, gekenmerkt met:Mean extension ± S.E. of B cells, characterized by:

Co-stimulans media anti-Bp50 BCGFCo-stimulant media anti-Bp50 BCGF

(200 ng/ml) (5%) 15 geen 96 ± 1 267 ± 15 285 ± 74' anti-Ig 5.833 ± 391 41.634 ± 2.103 25.094 ± 61 anti-Bp35 457+45 8.143 ± 280 1,733 ± 32 (5 ug/ml) TPA (2 ng/ml) 7.361 ± 537 21.163 ± 871 13.064 ± 1.030 20 IL-1 ( 10 U/ml) 264 ±2 308 ± 23 221 ± 8 11-2 (100 U/ml) 204 ±‘34 350 ± 7 220 ±11 BCGF (5%) 220 ±7 851 ± 28 270 ± 18(200 ng / ml) (5%) 15 none 96 ± 1 267 ± 15 285 ± 74 'anti-Ig 5,833 ± 391 41,634 ± 2,103 25,094 ± 61 anti-Bp35 457 + 45 8,143 ± 280 1,733 ± 32 (5 µg / ml) TPA (2 ng / ml) 7,361 ± 537 21,163 ± 871 13,064 ± 1,030 20 IL-1 (10 U / ml) 264 ± 2 308 ± 23 221 ± 8 11-2 (100 U / ml) 204 ± '34 350 ± 7 220 ± 11 BCGF (5%) 220 ± 7 851 ± 28 270 ± 18

Dichte Er- tonsillaire B-cellen (meer dan 95% slgM cellen) gekweekt gedurende 48 uur bij 2 x 105 cellen/putje, gevolgd door een 24 uur 3 25 stoot van H-thymidine voordat geteld werd.Dense Ertonsillar B cells (more than 95% slgM cells) cultured for 48 hours at 2 x 105 cells / well, followed by a 24 hour burst of H-thymidine before counting.

De kinetiek van de door anti~Bp50 versterkte uitbreiding is in fig. 7 getoond. De uitbreidingspiek vondplaats op dag 4 en nam daarna af ongeacht of de cellen met anti-Bp35 of andere activatoren zoals anti-Ig of TPA waren geactiveerd. De kinetiek van de door BCGF of door anti-30 Bp50 versterkte uitbreiding was hetzelfde.The kinetics of the anti-Bp50 amplified extension are shown in Figure 7. The extension peak occurred on day 4 and then declined regardless of whether the cells were activated with anti-Bp35 or other activators such as anti-Ig or TPA. The kinetics of the enhancement enhanced by BCGF or anti-30 Bp50 were the same.

Een geringe hoeveelheid anti-Bp50 antilichamen van slechts 0,05 ug versterkte de uitbreiding. Een optimale dosis van 0,3 ug/ml werd in daaropvolgende onderzoeken gebruikt. Een consistente waarneming was -·.* ' <ί ' -.v * -· ? * -25- dat wanneer hele antilichaammoleculen werden gebruikt, hogere doses van anti-PB50 (groter dan 2-5 ug/ml) minder effektief waren dan doses in het bereik van 0,1-0,5 ug/ml.A small amount of anti-Bp50 antibodies as low as 0.05 µg enhanced the extension. An optimal dose of 0.3 µg / ml was used in subsequent studies. A consistent observation was - ·. * '<Ί' -.v * - ·? * -25- that when whole antibody molecules were used, higher doses of anti-PB50 (greater than 2-5 µg / ml) were less effective than doses in the range 0.1-0.5 µg / ml.

Humane B-cellen zijn fcuigengewoon gevoelig voor inhibitoire effek-5 ten die via de Fc receptoren van aan oppervlakte Ig bindende antilichamen worden uitgeoefend (Parker, 1980, Immunol. Rev. 52:115; Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1825). Het was derhalve belangrijk om de werkzaamheid van volledig anti-Bp50 mAb te vergelijken met die van anti-3p50 F(ab'>2 fragmenten. Over een 100-voudig dosisbereik waren 10 F(ab1)2 fragmenten duidelijk even effektief als of effektiever dan volledig antilichaam voor wat betreft de versterking van B-celuitbreiding (tabel D). Derhalve is het Fc domein van anti-Bp50 mAb niet nodig voor anti-Bp50 om zijn effekt uit te oefenen en kan het hoogstens inhibitoir werken. Met andere woorden kan anti-Bp50 evenals BCGF kennelijk werken 15 als een oplosbare mediator zonder assistentie van Fc receptor-gemedi-eerde accessoire celfunctie.Human B cells are highly sensitive to inhibitory effects exerted via the Fc receptors of surface Ig binding antibodies (Parker, 1980, Immunol. Rev. 52: 115; Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med 162: 1825). It was therefore important to compare the efficacy of complete anti-Bp50 mAb with that of anti-3p50 F (ab '> 2 fragments. Over a 100-fold dose range, 10 F (ab1) 2 fragments were clearly as effective as or more effective than complete antibody in terms of B cell extension enhancement (Table D). Therefore, the Fc domain of anti-Bp50 mAb is not necessary for anti-Bp50 to exert its effect and may act at most inhibitory. -Bp50 as well as BCGF apparently act as a soluble mediator without assistance of Fc receptor mediated accessory cell function.

TABEL DTABLE D

Het Fc domein van anti-Bp50 antilichamen is niet vereist voor versterking van B-celuitbreiding 20 Gemiddelde uitbreiding van B-cellen, gekweekt met:___The Fc domain of anti-Bp50 antibodies is not required to enhance B cell extension. 20 Average B cell extension grown with: ___

DosisDose

Anti-Bp50 (ug/ml) media anti-Bp35 geen - 295 ± 16 269 ± 27 25 volledig Ab 0,125 278 ±32 5.140 ± 20 1.25 275 ± 24 4.686 ± 342 12,5 163 ±15 3.852 ± 203 F(ab2)2 0,125 594 ± 21 10.635 ± 449 1.25 531 ± 3 10.893 ± 575 30 12,5 279 ± 8 9.411 ± 870Anti-Bp50 (µg / ml) media anti-Bp35 none - 295 ± 16 269 ± 27 25 complete Ab 0.125 278 ± 32 5.140 ± 20 1.25 275 ± 24 4.686 ± 342 12.5 163 ± 15 3.852 ± 203 F (ab2) 2 0.125 594 ± 21 10.635 ± 449 1.25 531 ± 3 10.893 ± 575 30 12.5 279 ± 8 9.411 ± 870

De celcultuurcondities waren zoals beschreven in tabel C.The cell culture conditions were as described in Table C.

' ·*** 2 y Λ -26- 5.3.4. Verschillen tussen anti-Bp50 _en BCGF (laag) activiteit*** 2 y Λ -26- 5.3.4. Differences between anti-Bp50 and BCGF (low) activity

Anti-Bp50 en BCGF (laag) hadden een vergelijkbaar effekt op B-cellen en waren costimulatoir met dezelfde middelen (tabel C). Ver-5 schillende soorten bewijs wijzen echter in de richting dat anti-Bp50 en het in dit onderzoek gebruikte BCGF kennelijk via verschillende signalen werken. Op de eerste plaats worden Bp50 moleculen, anders dan BCGFAnti-Bp50 and BCGF (low) had a similar effect on B cells and were costimulatory with the same agents (Table C). However, different types of evidence indicate that anti-Bp50 and the BCGF used in this study apparently act via different signals. Firstly, Bp50 becomes molecules other than BCGF

(laag) receptoren (Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1825) tot expressie gebracht op rustende bloed B-cellen (fig. 3). Op de tweede 10' plaats, hoewel zowel anti-Bp50 als BCGF (laag) het meest effektief functioneren wanneer ze worden toegevoegd na anti-Bp35 of anti-Ig, was anti-Bp50 duidelijk het effektiefst wanneer het 12 uur na het begin van de ksreek werd toegevoegd'(fig. 8A). Daarentegen kon BCGF (laag) zelfs 24 uur na de start van de cultures worden toegevoegd en toch een optimale verster-15 king van de uitbreiding geven (fig. 8B). Deze kinetiekexperimenten, die de benadering van Howard en Paul (1983, Ann. Rev. Immunol. 1:307), als model gebruikten, wijzen erop dat een Bp50-afhankelijk signaal normaal zijn effekt kan uitoefenen voor BCGF.(low) receptors (Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med. 162: 1825) expressed on resting blood B cells (Fig. 3). Second, although both anti-Bp50 and BCGF (low) function most effectively when added after anti-Bp35 or anti-Ig, anti-Bp50 was clearly most effective when applied 12 hours after the start of ksreek was added '(fig. 8A). In contrast, BCGF (low) could be added even 24 hours after the start of the cultures and still give an optimal enhancement of the extension (Fig. 8B). These kinetics experiments, using the approach of Howard and Paul (1983, Ann. Rev. Immunol. 1: 307) as a model, indicate that a Bp50 dependent signal can normally exert its effect on BCGF.

Zowel anti-Bp50 als BCGF (laag) versterkte uitbreiding van B-20 cellen die geactiveerd waren met anti-Bp35 of anti-Ig (tabel C). Het effekt van anti-Bp50 en BCGF (laag) was echter in veel experimenten additief (fig. 7). Fig. 9 toont een titratie van BCGF (laag) in een experiment waarin anti-Bp50 werd gebruikt in zijn optimale concentratie (0,2 ug/ml). BCGF (laag) kon verder de uitbreiding van rustende B-cellen 25: versterken in tegenwoordigheid van anti-Bp50 na activering met anti-Ig of met anti-Bp35. Optimale concentraties van BCGF (laag) waren 5-10%, terwijl 25% inhibitoir was. Wanneer derhalve anti-Bp50 en BCGF (laag) allebij in hun optimale concentraties werden toegepast, vertoonden ze nog steeds additieve effekten op de B-celuitbreiding.Both anti-Bp50 and BCGF (low) enhanced extension of B-20 cells activated with anti-Bp35 or anti-Ig (Table C). However, the effect of anti-Bp50 and BCGF (low) was additive in many experiments (Fig. 7). Fig. 9 shows a titration of BCGF (low) in an experiment using anti-Bp50 at its optimal concentration (0.2 µg / ml). BCGF (low) could further enhance the extension of resting B cells in the presence of anti-Bp50 upon activation with anti-Ig or with anti-Bp35. Optimal concentrations of BCGF (low) were 5-10%, while 25% were inhibitor. Thus, when anti-Bp50 and BCGF (layer) were both used at their optimal concentrations, they still showed additive effects on B cell extension.

30 Tenslotte verschilden zowel normale als maligne B-celsubsets in hun reacties op anti-Bp50 en op BCGF (laag). Bijvoorbeeld reageerden sommige bloed B-cellen op BCGF (laag) maar niet op anti-Bp50 (tabel E).Finally, both normal and malignant B cell subsets differed in their responses to anti-Bp50 and to BCGF (low). For example, some blood B cells responded to BCGF (low) but not anti-Bp50 (Table E).

Een extra activeringssignaal zoals anti-Bp35 (tabel E) of TPA (fig. 10) was consistent nodig om mogelijk te maken dat bloed B-cellen reageerden 35 op anti-Bp50, Terwijl dichte tonsillaire B-cellen in het algemeen niet reageerden op BCGF of anti-Bp50, reageerden opdrijvende B-cellen wel - ctAn additional activation signal such as anti-Bp35 (Table E) or TPA (Fig. 10) was consistently needed to allow blood B cells to respond to anti-Bp50, while dense tonsillar B cells generally did not respond to BCGF or anti-Bp50, floating B cells did respond - ct

ƒ 'J i O / Iƒ 'J i O / I

-27- y » (tabel E). B-celmaligniteiten verschilden ook in hun respons op anti-Bp50 versus BCGF. Bijvoorbeeld reageerden sommige B-cellymfoma's op TPA plus BCGF (laag), maar niet op TPA plus G28-5 anti-BpSO (fig. 10B en D). Daarentegen reageerden dichte tonsillaire B-cellen en periferale bloed 5 B-cellen op TPA plus hetzij BCGF (laag) hetzij anti-Pb50 (fig. 10A en C).-27- y (Table E). B cell malignancies also differed in their response to anti-Bp50 versus BCGF. For example, some B cell lymphomas responded to TPA plus BCGF (low), but not to TPA plus G28-5 anti-BpSO (Fig. 10B and D). In contrast, dense tonsillar B cells and peripheral blood 5 B cells responded to TPA plus either BCGF (low) or anti-Pb50 (Figures 10A and C).

’·»'?·» ·. , t i"?"? , t i

Aa

-28- Ό VO 3 3 CN Γ~ O CO PO H d-28- Ό VO 3 3 CN Γ ~ O CO PO H d

a) h in cn η σι —t Ia) h in cn η σι —t I

> td ο I> td ο I

•n +1 +1 +1 +1 +1 +1 T3 A 3 3• n +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 T3 A 3 3

•H (U ϋ Ο H• H (U ϋ Ο H

M t'- η po σι ro σι o tn SM t'- η po σι ro σι o tn S

'O CO m ^ CN N1 01 a Ή d) a ro ^ in a co co ,30330 0 · . · . · JJ Λ Ή Ό a a a Ν’ CN +1 01 cd cd 3 3 ¢)-)-1 a d <u A ω ’d h > H 3 S ·Η ·η H 3 3 3 ω ·Η H cd Ai Ο 3 3 .. οι m > M o 'd jj s ro a <D Ê-1 O,O CO m ^ CN N1 01 a Ή d) a ro ^ in a co co, 30 330 0 ·. ·. JJ Λ Ή Ό aaa Ν 'CN +1 01 cd cd 3 3 ¢) -) - 1 ad <u A ω' dh> H 3 S · Η · η H 3 3 3 ω · Η H cd Ai Ο 3 3 .. οι m> M o 'd yy s ro a <D Ê-1 O,

•H O PO 3 O > O• H O PO 3 O> O

3 £-1 co co o · σι ¢) +1 'd'rOCOOOHH +) +1 C O' +43 £ -1 co co o · σι ¢) +1 'd'rOCOOOHH +) +1 C O' +4

3 A >1 Λ ¢) 3 O3 A> 1 Λ ¢) 3 O

0) O +1 +1 +1 +1+1+1 ü O -P -H0) O +1 +1 +1 + 1 + 1 + 1 ü O -P -H

jj *H O O +1 - a cd m (N· cn in σι cn +4 s u o +>yy * H O O +1 - a cd m (N · cn in σι cn +4 s u o +>

rjn CO O t' H (D <J S O a Orjn CO O t 'H (D <J S O a O

no co co Ν’ Ν' m ro >i s +4 3 a cqiu . . . h ai ε e hno co co Ν ’m m ro> i s +4 3 a cqiu. . . h ai ε e h

£ CNVOH O >1 ‘3 O£ CNVOHO> 1 "3 O

a >1 to m H +j a n rJ ^2 <υ i co —' 0 H 'g -d w λ e? - £ c o) φ S § $ 2 « « -ya> 1 to m H + j a n rJ ^ 2 <υ i co - '0 H' g -d w λ e? - £ c o) φ S § $ 2 «« -y

Pi ^ j-t M Ci Λ ff vo^· inrow "dOCüPi ^ j-t M Ci Λ ff vo ^ · inrow "dOCü

1 Λ ro OP'COr-lrOH M cd a cd -H1 Λ ro OP'COr-lrOH M cd a cd -H

a . HHCNHPO H ΪΦΛΓΰΤ) +i2 · ” O1 3 . a +i +i +i +i +i +i fi j +! id m x ai <u 'd o . H vOr'H ldr-fO H-rlidS+l a w o vf m co ίο vf o +) 3 o _ o σι ro a m 10 σι 3 cd o its 3 υ +| . · 3 Λ !5 CD 0) οι vj> ro a in co 0 3 +4 4-1 A Η H ü ro cd 3 0 Dl ^ S n '2 as s ·Η · o -η m -H a O T3 ïï ra 3 3 * > 3 H ft -3 5 o W u ¢) ro rij O *· O' o 3 3 cn Φ 3 3a . HHCNHPO H ΪΦΛΓΰΤ) + i2 · ”O1 3. a + i + i + i + i + i + i fi j +! id m x ai <u 'd o. H vOr'H ldr-fO H-rlidS + l a w o vf m co ίο vf o +) 3 o _ o σι ro a m 10 σι 3 cd o its 3 υ + | . 3 Λ! 5 CD 0) οι vj> ro a in co 0 3 +4 4-1 A Η H ü ro cd 3 0 Dl ^ S n '2 as s · Η · o -η m -H a O T3 ïï ra 3 3 *> 3 H ft -3 5 o W u ¢) ro row O * · O 'o 3 3 cn Φ 3 3

Mpn POO vo · K O HMpn POO for K O H

CQ r* +1 CN PO · a CTi Ν’ << 3 HHCQ r * +1 CN PO · a CTi Ν ’<< 3 HH

C -η T3 a pn co co in 0*30C -η T3 a pn co co in 0 * 30

Fh 3 3 o · γ-I +J —. Λ ü -i-j O a +1 +1 +1 +1 +1 1 dl CN Cl 3 0) HO? -Q O 01 01Fh 3 3 o · γ-I + J -. Λ ü -i-j O a +1 +1 +1 +1 +1 +1 1 dl CN Cl 3 0) HO? -Q O 01 01

3 ό W η σι Ν' ro m Ν' cd o · +4 A3 ό W η σι Ν 'ro m Ν' cd o +4 A

(UH w σι a n· r* +13040 H o 13 in O ΙΟ PN _ Q * +i g H T3 ... Ö g W öï (y .,-j frt Γ- H (N *ri *P > 3 .η η η £ G ω Λ OS G <Ö <U G & 01 § g ό g ^ urn > H Ai d S <u *ΰ Λ > u ε · a o CN A 3 a O Λ οι co o cd x jj o 01 Μ Μ M +1 01 HO-COO 0)01^-30 οι η-Ηηισι Λ>^38 ”§ a +1 +1 +1 +1 I 1 01 3 C H 'd(UH w σι an · r * +13040 H o 13 in O ΙΟ PN _ Q * + ig H T3 ... Ö g W öï (y., - j frt Γ- H (N * ri * P> 3. η η η £ G ω Λ OS G <Ö <UG & 01 § g ό g ^ urn> H Ai d S <u * ΰ Λ> u εao CN A 3 a O Λ οι co o cd x yy o 01 +1 Μ M +1 01 HO-COO 0) 01 ^ -30 οι η-Ηηισι Λ> ^ 38 ”§ a +1 +1 +1 +1 I 1 01 3 CH 'd

01 i—1 0) O M01 i-1 0) O M

r-1 (jar'cn^'d' 3τ3>αιοι m CN a H in O +1 01 T3 0) 0 ιησιηιη noj+iccr-1 (jar'cn ^ 'd' 3τ3> αιοι m CN a H in O +1 01 T3 0) 0 ιησιηιη noj + icc

1 . 3 cd ai O1. 3 cd ai O

ffl PO 3 tö Μ ·Η Η Φ — H 3 +> μ oi a 'd o <-»ffl PO 3 tö Μ · Η Η Φ - H 3 +> μ oi a 'd o <- »

fö <D CU 3 CNfö <D CU 3 CN

3 +i &i Cn M po — m ^3+4^ H po 0! O -H <0 <11 g —» a cuoM-naoi \Hffl ·Η3ω+1 +13 + i & i Cn M po - m ^ 3 + 4 ^ H po 0! O -H <0 <11 g - »a cuoM-naoi \ Hffl · Η3ω + 1 +1

Dl ε I +) O H cd 3 <DDl ε I +) O H cd 3 <D

3\-na -Hgdxidoi D1+1C5 <d ε3Τ!Χ1 in 3 3 Ο 3W-HOM3 - cdcq 03+JCdioi 0 m ϋ h 01 a 3 -^++ Ai a -—·3 \ -na -Hgdxidoi D1 + 1C5 <d ε3Τ! Χ1 in 3 3 Ο 3W-HOM3 - cdcq 03 + JCdioi 0 m ϋ h 01 a 3 - ^ ++ Ai a -— ·

¢) .0 !-l 3 H¢) .0! -L 3 H

01 οιηοο.<υ3τ30<υ 3 tnroinin 3<u O+icu td aac^a ai ri υ ώ >ι ·η01 οιηοο. <Υ3τ30 <υ 3 tnroinin 3 <u O + icu td aac ^ a ai ri υ ώ> ι · η

η mcnram HH3 O +Jη mcnram HH3 O + J

3 1111 CD ¢) Cd 3 o o g fi h -ri ·4 ·Η ·Η υ Ο 3 ¢1 a Cd •H (DU +) +)+1+1 1 O +1 ε Μ +) 003333 d) ff) O >1 >i a3 1111 CD ¢) Cd 3 eye fi h -ri · 4 · Η · Η υ Ο 3 ¢ 1 a Cd • H (DU +) +) + 1 + 1 1 O +1 ε Μ +) 003333 d) ff) O> 1> ia

Ui O! ffl nj <Ö cd' <0 _ Q w O <—) ' .Onion O! ffl nj <Ö cd '<0 _ Q w O <-)'.

?; I '< / 1 + f -vi j ~-J& ( ·+ t Λ -29- 5.4. Toepassingen vaa anti-Bp50 liganden en Bp50 De liganden volgens de onderhavige uitvinding kunnen in vivo of in vitro in hun ongemodificeerde of gemodificeerde vorm worden gebruikt voor het moduleren van de immuunrespons. De liganden zelf kunnen 5 bijvoorbeeld worden gebruikt als "adjuvans" voor het vergroten van een immuunrespons op een vaccin of voor het vergroten van de immuunrespons van een individu dat in een toestand van immunosuppressie verkeert.?; I '</ 1 + f -vi j ~ -J & (· + t Λ -29-) 5.4 Uses of anti-Bp50 ligands and Bp50 The ligands of the present invention can be used in vivo or in vitro in their unmodified or modified form. used to modulate the immune response For example, the ligands themselves can be used as an "adjuvant" to enhance an immune response to a vaccine or to enhance the immune response of an individual in an immunosuppressive state.

Ook kunnen wanneer cytotoxinen of anti-uitbreidingsmiddelen aan de liganden gekoppeld zijn, deze gemodificeerde liganden worden gebruikt 10 voor het verlagen een immuunrespons, bijvoorbeeld in auto-immuunziekten of in transplantatiepatiënten om afstoting van het geënte materiaal te vermijden. Deze gemodificeerde liganden zouden ook kunnen worden gebruikt voor het behandelen van maligniteiten die cellen of tumoren omvatten welke het 3p50 antigeen tot expressie brengen, ongeacht of de maligni-15 text oorspronkelijk een B-cel is.Also, when cytotoxins or anti-extenders are coupled to the ligands, these modified ligands can be used to lower an immune response, for example, in autoimmune diseases or in transplant patients to avoid rejection of the grafted material. These modified ligands could also be used to treat malignancies comprising cells or tumors expressing the 3p50 antigen, regardless of whether the malignant text is originally a B cell.

Zowel de liganden volgens de onderhavige uitvinding en/of Bp5Q zelf kunnen in vitro worden gebruikt. Dergelijke toepassingen omvatten in vitro assays, zoals immunoassays voor de bepaling van cellen die het Bp50 antigeen tot expressie brengen en/of voor de detectie van eventueel 20 afgeworpen Bp5Q in lichaamsvloeistoffen. In dit geval zou het ligand of Bp50 gelabeld kunnen worden met een radiolabel, fluor, enzym, enzym-substraat, kleurstof, enz. Bovendien kunnen de liganden worden gebruikt voor het scheiden en/of identificeren van cellen die het 3p50 antigeen tot expressie brengen, in welk geval het ligand gekoppeld kan zijn aan 25 een onbeweeglijke drager, of aan eèn fluor dat gebruikt kan worden in een FACS (fluorescentie-geactiveerde celsorteerder).Both the ligands of the present invention and / or Bp5Q itself can be used in vitro. Such uses include in vitro assays, such as immunoassays for the determination of cells expressing the Bp50 antigen and / or for the detection of any shed Bp5Q in body fluids. In this case, the ligand or Bp50 could be labeled with a radiolabel, fluorine, enzyme, enzyme substrate, dye, etc. In addition, the ligands can be used to separate and / or identify cells expressing the 3p50 antigen, in which case the ligand may be linked to an immobile support, or to a fluorine which can be used in a FACS (fluorescence activated cell sorter).

De verschillende toepassingen en gebruiken van de liganden en Bp50 volgens de onderhavige uitvinding worden onderstaand in groter detail besproken.The various uses and uses of the ligands and Bp50 of the present invention are discussed in greater detail below.

30 5.4.1. Bp50 receptor en toepassingen van liganden zoals anti-Bp50 voor _versterking van B-celuitbreiding30 5.4.1. Bp50 receptor and applications of ligands such as anti-Bp50 for enhancement of B cell extension

Voorgaande onderzoeken wezen in de richting dat de bij de inductie van.B-cellen van GQ naar de fase van de celcyclus betrokken fac-35 toren verschillen van de factoren of vereisten voor overgang in de S fase.Previous studies indicated that the factors involved in the induction of B cells from GQ to the cell cycle phase differ from the factors or requirements for transition in the S phase.

. , i -30-. , i -30-

Dit model is in essentie gebaseerd op onderzoeken waarmee werd aangetoond dat middelen zoals lage doses van anti-Ig B-celactiveringsfactoren of anti-Bp35 alleen weinig of geen effekt op B-celuitbreiding hebben.This model is essentially based on studies demonstrating that agents such as low doses of anti-Ig B cell activation factors or anti-Bp35 alone have little or no effect on B cell proliferation.

Toch kunnen deze zelfde middelen B-cellen brengen tot een punt in de 5 celactivering waar ze gevoelig zijn voor groeifactoren. In tegenstelling daarmee hebben groeifactoren zoals BCGF of IL-2 alleen geen effekt op rustende B-cellen maar versterken de groei van geactiveerde B-cellen.However, these same agents can bring B cells to a point in cell activation where they are sensitive to growth factors. In contrast, growth factors such as BCGF or IL-2 alone do not affect resting B cells but enhance the growth of activated B cells.

Hoewel de onderhavige uitvinding niet beperkt is tot enige theorie of verklaring, verschaffen de hierin gepresenteerde resultaten een 10 verdere steun voor een model van onderscheiden regulering van B-celacti-vering en groeistappen. Hierin is aangetoond dat activering en uitbrei-dingssignalen in humane B-cellen kunnen worden doorgegeven via onderscheiden celoppervlaktestructuren. Hoewel anti-Bp35 mAb B-cellen activeerde tot het overgaan naar de fase van de celcyclus induceerde het 15 alleen weinig of geen uitbreiding. Anti-Bp50 mAb had het tegengestelde effekt. Het kon B-cellen niet activeren, maar indien het zelfs pas 12-24 uur na de activering werd toegevoegd, kon het B-celgroei induceren.Although the present invention is not limited to any theory or explanation, the results presented herein provide further support for a model of distinct regulation of B cell activation and growth steps. It has been shown herein that activation and extension signals in human B cells can be passed through distinct cell surface structures. Although anti-Bp35 mAb activated B cells to transition to the cell cycle phase, it alone induced little or no extension. Anti-Bp50 mAb had the opposite effect. It could not activate B cells, but if added even 12-24 hours after activation, it could induce B cell growth.

Het Bp50 molecuul zou waarschijnlijk normaal kunnen functioneren als hetzij een receptor voor een ligand zoals een oplosbare groeifactor 20 hetzij voor een via cel-celcontact tot stand gebracht signaal (d.w.z.The Bp50 molecule would likely function normally as either a receptor for a ligand such as a soluble growth factor 20 or for a cell-to-cell-mediated signal (i.e.

een op het oppervlak van een andere cel aangetroffen ligand). Voorgaande onderzoeken hebben verschillende T-cel-afgeleide BCGFs geïdentificeerd die evenals anti-BP50 de uitbreiding van B-cellen versterken. Zowel hoge als lage molecuulgewichtsvormen van B-celgroeifactoren zijn geïdentificeerd 25 en voor verschillende typen is aangetoond dat ze additieve effekten hebben (Kehrl, et al., 1984, Immunol. Rev. 18:75-96; Kishimoto, 1985,a ligand found on the surface of another cell). Previous studies have identified several T cell-derived BCGFs which, like anti-BP50, enhance B cell expansion. Both high and low molecular weight forms of B cell growth factors have been identified and have been shown to have additive effects for different types (Kehrl, et al., 1984, Immunol. Rev. 18: 75-96; Kishimoto, 1985,

Ann. Rev. Immunol. 3:133-157; Swain, et al., 1983, J. Exp. Med. 158: 822-835; Howard, et al., 1984, Immunol. Rev. 78:185-210; Ambrus, et al., J. Clin. Invest. 75:732-739; Ambrus, 1985, J. Exp. Med. 162:1319-1335).Ann. Rev. Immunol. 3: 133-157; Swain, et al., 1983, J. Exp. Med. 158: 822-835; Howard, et al., 1984, Immunol. Rev. 78: 185-210; Ambrus, et al., J. Clin. Invest. 75: 732-739; Ambrus, 1985, J. Exp. Med. 162: 1319-1335).

30 Bp50 zou derhalve een receptor voor één van deze factoren kunnen zijn.Bp50 could therefore be a receptor for one of these factors.

Met de uitzondering van IL-2 receptoren en de C3d receptor, zijn de receptoren op B-cellen voor groeisignalen nog niet geïdentificeerd. Het mAb AB-1 reageert met een B-celmerker die alleen tot expressie komt op geactiveerde B-cellen en BCGF-afhankelijke uitbreiding blokkeert, 35.' en derhalve de BCGF receptor of een verwante structuur zou kunnen herkennen. Bp50 blijkt van de AB-1 merker te verschillen omdat het AB-1 mAb ^ i g i 3 / f ' * * -31- niet de binding van het G28-5 anti-Bp50 antilichaam blokkeert, en anders dan het G28-5 mSb alleen reageert met geactiveerde B-cellen (Jung, et al, 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924). Bp50 bevindt zich op alle B-cellen, hetgeen op basis van absorptie-analyse en direkte bindingstests niet 5 het geval blijkt te zijn voor BCGF receptoren. Onze huidige gegevens wijzen erop dat Bp50 en de receptor voor laagmoleculairgewicht BCGF onderscheiden structuren zijn. Gebruikmakend van een konijneheteroanti-serum, is door Wang en medewerkers (Wang, 1979, J. Exp. Med. 149:1424-1433) eerder een 54-kDa glycoproteine beschreven, gp54, dat evenals Bp50 tot expressie 10 komt op alle B-cellen maar in lagere niveaus op bloed B-cellen dan op tonsillaire B-cellen. Het is mogelijk, maar onwaarschijnlijk, dat het konijneheteroantiserum en anti-Bp50 dezelfde of verwante structuren herkennen: anders dan anti-BpSO mAb, was het konijneantiserum tegen gp54 alleen voldoende om de uitbreiding van B-cellen te stimuleren.With the exception of IL-2 receptors and the C3d receptor, the receptors on B cells for growth signals have not yet been identified. The AB-1 mAb reacts with a B cell marker that is only expressed on activated B cells and blocks BCGF-dependent extension, 35. ' and therefore could recognize the BCGF receptor or a related structure. Bp50 appears to differ from the AB-1 marker because the AB-1 mAb ^ igi 3 / f '* * -31- does not block the binding of the G28-5 anti-Bp50 antibody, and unlike the G28-5 mSb alone reacts with activated B cells (Jung, et al, 1984, J. Exp. Med. 160: 1919-1924). Bp50 is present on all B cells, which does not appear to be the case for BCGF receptors based on absorption analysis and direct binding assays. Our current data indicate that Bp50 and the low molecular weight BCGF receptor are distinct structures. Using a rabbit heteroanti serum, Wang and co-workers (Wang, 1979, J. Exp. Med. 149: 1424-1433) previously described a 54-kDa glycoprotein, gp54, which, like Bp50, is expressed on all B- cells but at lower levels on blood B cells than on tonsillar B cells. It is possible, but unlikely, that the rabbit heteroantiserum and anti-Bp50 recognize the same or related structures: other than anti-BpSO mAb, the rabbit antiserum to gp54 alone was sufficient to stimulate B cell expansion.

15 Anti-Bp35 alleen kan anders dan anti-Bp50 B-cellen activeren vanAnti-Bp35 alone can activate B cells other than anti-Bp50

Gq naar G1 en kan derhalve worden aangeduid als een "activerings" signaal. Of Bp35 al dan niet alleen in vroege B-celactivering functioneert is nog niet duidelijk omdat anti-Bp35 antilichamen sommige B-cellen kunnen stimuleren tot deling (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci.Gq to G1 and can therefore be referred to as an "activation" signal. Whether or not Bp35 functions alone in early B cell activation is not yet clear because anti-Bp35 antibodies can stimulate some B cells to divide (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci.

20 USA 82:1766-1770). Evenzo is mogelijk dat Bp50 niet uitsluitend functioneert als een "groei" signaal: anti-Bp50 antilichamen samen met active-ringssignalen (anti-Bp35 of anti-u) leidt niet alleen tot versterking van de uitbreiding maar ook tot vergroting van het totaal aantal B-cellen dat in G^ overgaat (tabel B). Met andere woorden leidt anti-3p50 als 25 costimulans tot bevordering van de progressie van zowel de activering (Gq naar G^) als de groei (G naar S) fasen van de celcyclus. Het in deze onderzoeken toegepaste BCGF had eveneens een soortgelijke activiteit (fig. 6C). Anti-Bp35 en anti-Pb50 (of BCGF) blijken derhalve zeer analoog te zijn aan de "competentie" en "progressie" factoren die in onder-30 zoeken van fibroblast groeiregulering zijn bechreven. Hoe B-cellen reageren op anti-Bp35 of anti-Bp50 kan duidelijk afhangen van hun toestand van differentiatie of activering.20 USA 82: 1766-1770). Likewise, it is possible that Bp50 does not function solely as a "growth" signal: anti-Bp50 antibodies together with activation signals (anti-Bp35 or anti-u) not only enhance extension but also increase total B cells that transition to G ^ (Table B). In other words, anti-3p50 as a costimulant promotes the progression of both the activation (Gq to G ^) and the growth (G to S) phases of the cell cycle. The BCGF used in these studies also had a similar activity (Fig. 6C). Thus, anti-Bp35 and anti-Pb50 (or BCGF) appear to be very analogous to the "competence" and "progression" factors described in studies of fibroblast growth regulation. How B cells respond to anti-Bp35 or anti-Bp50 can clearly depend on their state of differentiation or activation.

Hierin hebben wij aangetoond dat twee mAb, anti-3p35 (een "competentie" signaal) en anti-Bp50 (een "progressie" signaal), samen een 35 aanzienlijke uitbreiding van sterk gezuiverde B-cellen in afwezigheid van antigeen of andere bekende factoren kunnen induceren. De natuurlijke 2 ^ » r -32- liganden voor deze structuren zijn nog niet bekend. Aangezien mAb tegen geschikte epitopen echter zowel oplosbare factoren als door cel-cel-interacties gemedieerde signalen kan imiteren, kunnen wellicht geschikte combinaties van mAb worden gebruikt om humane B-celuitbreiding of diffe-5 rentiatie te sturen en reguleren. Dit zal op zijn beurt bijdragen aan het ontwerpen van strategieën in vivo voor de beheersen van humane ziekten zoals B-celmaligniteiten, immunodeficiënties en bepaalde auto-immuun-ziekten.Herein, we demonstrated that two mAb, anti-3p35 (a "competence" signal) and anti-Bp50 (a "progression" signal), together can significantly expand highly purified B cells in the absence of antigen or other known factors. induce. The natural 2 -32 ligands for these structures are not yet known. However, since mAb against suitable epitopes can mimic both soluble factors and cell-cell interaction-mediated signals, appropriate combinations of mAb may be used to direct and regulate human B cell expansion or differentiation. This, in turn, will contribute to designing strategies in vivo for the control of human diseases such as B cell malignancies, immunodeficiencies and certain autoimmune diseases.

Het nieuwe monoklonale antilichaam G28-5, dat reageert met een 10) enkele ketenpolypeptide van ongeveer 50 Kd dat op het oppervlak van humane B-cellen tot expressie komt, is slechts één bijzondere uitvoeringsvorm van de liganden volgens de onderhavige uitvinding die de uitbreiding van geactiveerde B-cellen kunnen versterken. Omdat humane B-celuitbreiding eveneens kan worden versterkt door T-cel-afgeleide BCGFs 15 waaronder laag- en hoogmoleculairgewicht BCGF, is door ons de activiteit van anti-Bp50 G28-5 vergeleken met die van een BCGF preparaat dat overwegend laagmoleculairgewicht BCGF bevat. Anti-Bp50 G28-5 en BCGF (laag) vertoonden grote gelijkenis doordat ze met dezelfde activeringsmiddelen costimulatie gaven (anti-Ig, anti-Bp35 en TPA), maar geen costimulatie 20 gaven met elkaar of met IL-1 of IL-2. Verder was de activiteit van anti-Bp50 G28-5 niet afhankelijk van zijn Fc domein omdat F(ab')2 fragmenten van G28-5 functioneel actief waren. Dit wijst erop dat oplosbaar anti-Bp50 evenals oplosbaar BCGF geen Fc-receptor-dragende accessoire cellen nodig heeft om een effekt uit te oefenen. Verder zijn zowel anti-Bp50 25. als. BCGF alleen effektief in tegenwoordigheid van een activeringsprikkel. Met. andere woorden zijn anti-Bp50 en BCGF geen "competentie" factoren, maar bevorderen eerder de "progressie" van B-cellen door de celcyclus.The novel G28-5 monoclonal antibody, which reacts with a 10) approximately 50 Kd single chain polypeptide expressed on the surface of human B cells, is only one particular embodiment of the ligands of the present invention that extend activated B cells can strengthen. Because human B cell extension can also be enhanced by T cell-derived BCGFs including low and high molecular weight BCGF, we compared the activity of anti-Bp50 G28-5 with that of a BCGF preparation containing predominantly low molecular weight BCGF. Anti-Bp50 G28-5 and BCGF (low) showed great similarity in that they gave costimulation with the same activators (anti-Ig, anti-Bp35 and TPA), but did not cost stimulation with each other or with IL-1 or IL-2. Furthermore, the activity of anti-Bp50 G28-5 did not depend on its Fc domain because F (ab ') 2 fragments of G28-5 were functionally active. This indicates that soluble anti-Bp50 as well as soluble BCGF does not require an Fc receptor-carrying accessory cells to exert an effect. Furthermore, both anti-Bp50 are 25. and. BCGF effective only in the presence of an activation stimulus. With. in other words, anti-Bp50 and BCGF are not "competence" factors, but rather promote the "progression" of B cells through the cell cycle.

Hoewel het mogelijk is dat Bp50 functioneert als receptor voor een ligand zoals een B-celgroeifactor, wijzen verscheidene resultaten 30 erop dat Bp50 althans niet de receptor voor het in dit onderzoek toegepaste BCGF (laag) is: het komt tot expressie op bloed B-cellen terwijl BCGF (laag) receptoren daarop kennelijk niet tot expressie komen. Kandidaatstructuren voor de PCGF (laag) receptor komen anders dan Bp50 alleen tot expressie op geactiveerde B-cellen. Verder verschillen zowel 35 normale als maligne B-celpopulaties in hun respons op anti-Bp50 versus BCGF (laag) (tabel E en fig. 10). Bijvoorbeeld vertonen sommige B lym- \ ·" :---}¾ >- -33- foma's uitbreiding in respons op BCGF (laag), maar niet in respons op anti-Bp50. Tenslotte riepen in een aantal experimenten optimale concentraties van anti-Bp50 en BCGF samen meer uitbreiding op dan elk van beide alleen. Anti-Bp50 imiteert de activiteit van ander BCGF, zoals 5 BCGF (hoog) die costimulatie geven met anti-IgM (Ambrus, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1319? Ambrus, et al..# 1985, J. Clin. Invest. 75:732).Although it is possible that Bp50 functions as a receptor for a ligand such as a B cell growth factor, several results indicate that Bp50 is at least not the receptor for the BCGF (low) used in this study: it is expressed on blood B cells while BCGF (low) receptors apparently are not expressed thereon. Candidate structures for the PCGF (low) receptor other than Bp50 are expressed only on activated B cells. Furthermore, both normal and malignant B cell populations differ in their response to anti-Bp50 versus BCGF (low) (Table E and Figure 10). For example, some B lymphomas show extension in response to BCGF (low), but not in response to anti-Bp50. Finally, in a number of experiments, optimal concentrations of anti- Bp50 and BCGF taken together are more extensive than either, anti-Bp50 mimics the activity of other BCGF, such as 5 BCGF (high), which costimulate with anti-IgM (Ambrus, et al., 1985, J. Exp. Med 162: 1319 Ambrus, et al. # 1985, J. Clin Invest 75: 732).

Dit wijst erop dat Bp50 zou kunnen functioneren als de receptor voor BCGF (hoog).This indicates that Bp50 could function as the receptor for BCGF (high).

Hoewel Bp50 een receptor kan zijn voor een oplosbaar ligand, kan 10 Bp50 anderzijds functioneren als een receptor voor een cel-cel-gemedieerd signaal dat BCGF receptor-gehaltes en/of autocrine-produktie reguleert. Aanwijzingen voor het dienst doen van differentiatie-antigenen zoals versterkers van een autocrine-receptorroute komen uit onderzoeken met T cellen. Monoklonaal antilichaam tegen het Lp220 algemene leukocyt-15 antigeen versterkt de uitbreiding door verhoging van de IL-2 receptor-expressie op geactiveerd T cellen (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135:1819). Een analoog mechanisme zou kunnen werken met anti-Bp50 en expressie van bepaalde BCGF receptoren. Bp50 en BCGF (laag) staan kennelijk onder enige gecoördineerde controle omdat BCGF, evenals IL-1 en 20 IL-2 receptoren, de expressie van Bp50 op bepaalde leukemische cellen versterkt. Het Bp50 molecuul vertoont ook overeenkomsten met het Tp44 molecuul dat een invloed uitoefent op de IL-2 produktie. Door ons en anderen is aangetoond dat het 9.3 anti-Tp44 antilichaam de uitbreiding van T cellen, geactiveerd door anti-CD3 of TPA versterkt (Ledbetter et al., 25 1985, J. Immunol. 135:2331? Hara, et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1513).On the other hand, although Bp50 may be a receptor for a soluble ligand, Bp50 may function as a receptor for a cell-cell-mediated signal that regulates BCGF receptor levels and / or autocrine production. Evidence for the service of differentiation antigens such as enhancers of an autocrine receptor pathway comes from T cell studies. Monoclonal antibody to the Lp220 general leukocyte-15 antigen enhances extension by increasing IL-2 receptor expression on activated T cells (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135: 1819). An analogous mechanism may work with anti-Bp50 and expression of certain BCGF receptors. Bp50 and BCGF (low) are apparently under some coordinated control because BCGF, like IL-1 and IL-2 receptors, enhances expression of Bp50 on certain leukemic cells. The Bp50 molecule also has similarities to the Tp44 molecule that influences IL-2 production. It has been shown by us and others that the 9.3 anti-Tp44 antibody enhances the extension of T cells activated by anti-CD3 or TPA (Ledbetter et al., 1985, J. Immunol. 135: 2331? Hara, et al., 1985, J Exp Med 161: 1513).

Evenzo versterkt anti-Bp50 de uitbreiding van B-cellen, die geactiveerd zijn door anti-Bp35 of TPA. Het Tp44 signaal functioneert eerder door stimulering van de IL-2 produktie dan door stimulering van de T celgroei. Het Bp50 signaal zou verffloedelijk op een analoge wijze kunnen functione-30 ren door stimulering van B-cel autocrine produktie (Gordon, et al., 1984, Nature, Lond. 310:145).Likewise, anti-Bp50 enhances the expansion of B cells activated by anti-Bp35 or TPA. The Tp44 signal functions by stimulating IL-2 production rather than by stimulating T cell growth. The Bp50 signal could function in an analogous fashion by stimulating B-cell autocrine production (Gordon, et al., 1984, Nature, Lond. 310: 145).

Λ —: **·! . > t ‘C ' -34- 5.4.2. Gemodificeerde liganden, gebruikt voor immuno-_suppressie of behandeling van maligniteitenΛ -: ** ·! . > t "C" -34- 5.4.2. Modified ligands, used for immunosuppression or treatment of malignancies

Volgens deze uitvoeringsvorm kan het ligand volgens de onderhavige uitvinding worden gemodificeerd door de aanhechting van een anti- 5. uitbreidingsmiddel zodat het resulterende molecuul kan worden gebruikt voor het doden van cellen die het Bp50 antigeen tot expressie brengen. Dergelijke gemodificeerde liganden kunnen worden gebruikt in de behandeling van autoïmmuunziekten om de uitbreiding van B-cellen te onderdrukken en daardoor de autoimmuunrespons te onderdrukken. Deze gemodifi-10 ceerde liganden kunnen ook worden gebruikt voor immunosuppressie van een transplantatiepatiënt om afstoting van een geënt materiaal te voorkomen. Dienovereenkomstig kunnen cytotoxische middelen die gebruikt worden voor het onderdrukken van de immuunrespons, aan de liganden volgens de uitvinding worden gebonden. Wanneer liganden worden gebruikt 15 die de uitbreiding van B-cellen versterken, zou een vergroot effekt het gevolg moeten zijn omdat het geneesmiddel gestuurd zal worden naar uitbreidende B-cellen.According to this embodiment, the ligand of the present invention can be modified by the attachment of an anti-extension agent so that the resulting molecule can be used to kill cells expressing the Bp50 antigen. Such modified ligands can be used in the treatment of autoimmune diseases to suppress B cell proliferation and thereby suppress the autoimmune response. These modified ligands can also be used for immunosuppression of a transplant patient to prevent rejection of a grafted material. Accordingly, cytotoxic agents used to suppress the immune response can be bound to the ligands of the invention. When using ligands that enhance B cell expansion, an enhanced effect should result because the drug will be directed to B cell expansion.

In een andere uitvoeringsvorm kunnen de liganden volgens de onderhavige uitvinding die gemodificeerd zijn door de aanhechting van een 20 anti-uitbreidingsmiddel worden gebruikt voor het behandelen van maligniteiten waarin tumoren of cellen het Bp50 antigeen tot expressie brengen. Bevestiging van deze chemotherapeutische middelen aan de liganden volgens de uitvinding zou moeten leiden tot een grotere specificiteit van het geneesmiddel voor de malignecellen. Bovendien zou een bijzonder voor-25 deel worden verkregen wanneer een B-celmaligniteit wordt behandeld met een ligand dat gekoppeld is aan een cytotoxine dat effektiever is in het doden van uitbreidende cellen dan niet-uitbreidende cellen; behandeling met een dergelijk ligand zou moeten leiden tot een versterking van de werking van het cytotoxine.In another embodiment, the ligands of the present invention that have been modified by the attachment of an anti-proliferative agent can be used to treat malignancies in which tumors or cells express the Bp50 antigen. Attachment of these chemotherapeutic agents to the ligands of the invention should lead to greater drug specificity for the malignant cells. In addition, a particular advantage would be obtained if a B cell malignancy is treated with a ligand linked to a cytotoxin that is more effective in killing expanding cells than non-expanding cells; treatment with such a ligand should enhance the action of the cytotoxin.

30 Dienovereenkomstig omvatten de chemotherapeutische middelen of anti-uitbreidingsmiddelen die aan de liganden volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gekoppeld, zonder daartoe beperkt te zijn, de in tabel F vermelde middelen, welke tabel afgeleid is van Goodman en Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, zesde editie, 35 MacMillan Publishing Co., Inc. New York, pag. 1249-1313, 1980 die door verwijzing hierin opgenomen moet worden geacht.Accordingly, the chemotherapeutic or anti-extension agents which can be coupled to, but are not limited to, the ligands of the present invention include those listed in Table F, which table is derived from Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, sixth edition, 35 MacMillan Publishing Co., Inc. New York, p. 1249-1313, 1980 to be incorporated by reference herein.

**" -Λ Vf Mf ·/ >* i 1.) J .1 ï -35-** "-Λ Vf Mf · /> * i 1.) J .1 ï -35-

TABEL FTABLE F

Chemotherapeutische middelen die gekoppeld kunnen _worden aan anti-3p5Q liganden__Chemotherapeutic Agents That Can Be Linked to Anti-3p5Q Ligands

Klasse Type Middel 5 alkyleringsmiddel stikstofmosterd MechlorethamineClass Type Medium 5 alkylating agent nitrogen mustard Mechlorethamine

Cyclophosphamide Melphalan Uracil Mustard Chlorambucil 10 ethyleenimine Thiotepa derivaten alkylsulfonaten Busulfan nitrosourea's CarmustineCyclophosphamide Melphalan Uracil Mustard Chlorambucil 10 ethyleneimine Thiotepa derivatives alkyl sulfonates Busulfan nitrosoureas Carmustine

Lomustine 15 SemustineLomustine 15 Semustine

Streptozocin triazenen Dacarbazine antimetabolieten folinezuur Methotrexaat analoga 20 pyrimidine Fluorouracil analoga _ , , .Streptozocin Tririazenes Dacarbazine Antimetabolites Folinic Acid Methotrexate Analogs 20 Pyrimidine Fluorouracil Analogs.

CytarabmeCytarabme

Azaribine purine Mercaptopurine analoga .Azaribine purine Mercaptopurine analogues.

Thioguamne 25 natuurlijke Vinca Vinblastine produkten alkaloïden . . .Thioguamne 25 natural Vinca Vinblastine products alkaloids. . .

c Vxncristxne I S- -36- antibiotica Dactinomycinec Vxncristxne I S -36 antibiotics Dactinomycin

DaunorubicineDaunorubicin

DoxorubicineDoxorubicin

BleomycineBleomycin

MithramycineMithramycin

Mitomycine enzymen L-Asparaginase diverse middelen platina Cisplatin coördinatie- complexen gesubstitueerd Hydroxyureum ureum methylhydrazine- Procarbazine derivaat adrenocorticaal Mitotane suppressant hormonen en adrenocorti- Prednisone antagonisten costeroiden progestinen Hydroxyprogesterone caproaatMitomycin enzymes L-Asparaginase various agents platinum Cisplatin coordination complexes substituted Hydroxyurea urea methylhydrazine- Procarbazine derivative adrenocortical Mitotane suppressant hormones and adrenocorti- Prednisone antagonists costeroids progestins Hydroxyprogesterone caproate

Medroprogesterone acetaatMedroprogesterone Acetate

Megestrol acetaat estrogenen DiethylstilbestrolMegestrol acetate estrogens Diethylstilbestrol

Ethinyl estradiol antiestrogeen . Tamoxifen androgenen Testosterone propionaatEthinyl estradiol antiestrogen. Tamoxifen Androgens Testosterone Propionate

Fluoxymesterone -ΛΚ - «·«» , ·' 'V' " » ' 5- -37- radioactieve fosfor Natriumfosfaat, 32Fluoxymesterone -ΛΚ - «·« », · '' V '" »' 5- -37- radioactive phosphorus Sodium phosphate, 32

. „ - P. "- P

isotopen jodium Natriumjodide, 131^isotope iodine Sodium iodide, 131 ^

Elke op zichzelf bekende methode kan worden gebruikt voor het koppelen van het ligand aan het chemotherapeutische of anti-uitbreidings-5 middel. Voorbeelden van dergelijke methoden zijn bovenstaand opgesomd (zie hoofdstuk 5.).Any method known per se can be used to couple the ligand to the chemotherapeutic or anti-extension agent. Examples of such methods are listed above (see chapter 5.).

5.4.3. Andere toepassingen van liganden en 3p505.4.3. Other applications of ligands and 3p50

Naast de therapeutische toepassingen hebben de liganden en Bp50 zelf andere toepassingen in zowel in vitro als in vivo diagnostische 10 assays, scheidingsschema's, enz.In addition to the therapeutic applications, the ligands and Bp50 themselves have other applications in both in vitro and in vivo diagnostic assays, separation schemes, etc.

De Bp50 receptor kan worden gebruikt voor het bereiden en/of ontwerpen van de liganden volgens de uitvinding. Bp50 kan ook worden gebruikt met de liganden volgens de uitvinding in in vitro assays die een standaard vereisen voor het kwantificeren van de hoeveelheid Bp50 die 15 in een monster is gedetecteerd, üiteindelijk kan Bp50 zelf bruikbaar zijn als een oplosbare factor die immuniteit bevordert, bijvoorbeeld een lymfokine.The Bp50 receptor can be used to prepare and / or design the ligands of the invention. Bp50 can also be used with the ligands of the invention in in vitro assays that require a standard for quantifying the amount of Bp50 detected in a sample, ultimately Bp50 itself can be useful as a soluble factor that promotes immunity, for example a lymphokine.

Naast therapeutische behandeling en diagnostische assays, zouden de liganden volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt 20 voor het identificeren of scheiden van cellen die het Bp50 antigeen tot expressie brengen. Bovendien zou, wanneer een geschikt radiolabel of radio-opake verbinding aan het ligand is gebonden, het ligand kunnen worden gebruikt voor in vivo imaging van tumoren die het Bp5Q antigeen tot expressie brengen. Andere toepassingen zullen aan de deskundigen 25 uit de hiervoorgaande beschrijving duidelijk worden.In addition to therapeutic treatment and diagnostic assays, the ligands of the present invention could be used to identify or separate cells expressing the Bp50 antigen. In addition, when an appropriate radiolabel or radiopaque compound is bound to the ligand, the ligand could be used for in vivo imaging of tumors expressing the Bp5Q antigen. Other applications will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description.

6. Depots van cellijnen6. Deposits of cell lines

De volgende hybridoma is gedeponeerd bij de American Type Culture Collection, Hockville, MD, en heeft het vermelde inschrijvingsnummer toegekend gekregen: 30 Hybridoma ATCC inschrijvingsnummer G28-5 HB9110 **** .4 * ' tf 4 ^ -38-The following hybridoma has been deposited with the American Type Culture Collection, Hockville, MD, and has been assigned the indicated registration number: 30 Hybridoma ATCC registration number G28-5 HB9110 ****. 4 * 'tf 4 ^ -38-

De onderhavige uitvinding is niet beperkt in omvang door de gedeponeerde hybridoma omdat de gedeponeerde uitvoeringsvorm bedoeld is als een enkele illustratie van één aspect van de uitvinding en alle cellijnen die functioneel equivalent zijn tot de omvang van de uitvinding 5 ’ behoren. Inderdaad zullen verscheidene modificaties van de uitvinding naast de hierin getoonde en beschreven varianten aan de deskundigen duidelijk worden op basis van de voorgaande beschrijving en de bijbehorende tekeningen. Beoogd wordt dat dergelijke modificaties binnen de omvang van de bijbehorende conclusies vallen.The present invention is not limited in scope by the deposited hybridoma because the deposited embodiment is intended as a single illustration of one aspect of the invention and all cell lines that are functionally equivalent to the scope of the invention 5. Indeed, various modifications of the invention in addition to the variants shown and described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and the accompanying drawings. It is intended that such modifications fall within the scope of the accompanying claims.

10 . v' ··«? ft} ^ v / 'i10. v '·· «? ft} ^ v / 'i

Claims (67)

1. In essentie zuiver ligand dat (a) bindt aan Bp50, een 50 kilo-dalton B-celoppervlakteantigeen dat gedefinieerd wordt door monoklonaal antilichaam G28-5 en (b) na binding aan een geactiveerde B-cel de geactiveerde B-cel stimuleert tot doorlopen van de celcyclus zodat uit- 5 breiding van de B-cel wordt versterkt.1. Essentially pure ligand which (a) binds to Bp50, a 50 kilo-dalton B cell surface antigen defined by monoclonal antibody G28-5 and (b) upon binding to an activated B cell stimulates the activated B cell to go through the cell cycle so that expansion of the B cell is enhanced. 2. Ligand volgens conclusie 1, omvattende een antilichaammolecuul of een Fv, Fab, F(ab’)2 of Fab' gedeelte van het antilichaammolecuul.The ligand of claim 1, comprising an antibody molecule or an Fv, Fab, F (ab ') 2 or Fab' portion of the antibody molecule. 3. Ligand volgens conclusie 2, waarin het antilichaammolecuul een monoklonaal antilichaammolecuul of een Fv, Fab, Fiab1)^ of Fab' gedeelte 10 van het monoklonale antilichaammolecuul omvat.Ligand according to claim 2, wherein the antibody molecule comprises a monoclonal antibody molecule or an Fv, Fab, Fiab1) or Fab 'portion 10 of the monoclonal antibody molecule. 4. Monoklonaal antilichaammolecuul volgens conclusie 3, omvattende G28-5, of een Fv, Fab, F(ab')2 of Fabr gedeelte daarvan.The monoclonal antibody molecule of claim 3, comprising G28-5, or an Fv, Fab, F (ab ') 2 or Fabr portion thereof. 5. Monoklonaal antilichaammolecuul volgens conclusie 3, geproduceerd door een hybridomacellijn zoals gedeponeerd bij het ATCC met inschrij- 15 vingsnummer HB9110, of een mutant,recombinant of genetisch gemanipuleerd derivaat daarvan.Monoclonal antibody molecule according to claim 3, produced by a hybridoma cell line as deposited with the ATCC with accession number HB9110, or a mutant, recombinant or genetically engineered derivative thereof. 6. Ligand volgens conclusie 1, omvattende een lymfokine.Ligand according to claim 1, comprising a lymphokine. 7. Lymfokine volgens conclusie 6, omvattende een B-celgroeifactor.Lymphokine according to claim 6, comprising a B cell growth factor. 8. Ligand volgens conclusie 6, waarin het lymfokine zich op het 20 oppervlak van een cel bevindt.8. Ligand according to claim 6, wherein the lymphokine is on the surface of a cell. 9. Ligand volgens conclusie 1, 2 of 6, dat verder een aan het ligand gekoppelde verbinding omvat.The ligand according to claim 1, 2 or 6, further comprising a compound linked to the ligand. 10. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een anti-uitbreidingsmiddel omvat.The ligand according to claim 9, wherein the compound coupled to the ligand comprises an anti-propagating agent. 11. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een alkyleringsmiddel omvat.The ligand according to claim 9, wherein the compound coupled to the ligand comprises an alkylating agent. 12. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een antimetaboliet omvat.The ligand according to claim 9, wherein the compound coupled to the ligand comprises an anti-metabolite. 13. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde 30 verbinding een antibioticum omvat.Ligand according to claim 9, wherein the compound coupled to the ligand comprises an antibiotic. 14. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een vinca alkaloïde omvat.The ligand according to claim 9, wherein the compound coupled to the ligand comprises a vinca alkaloid. 15. Ligand volgens conlcusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een enzym omvat. . - ' 5 > -i j * > t -40-Ligand according to claim 9, wherein the compound coupled to the ligand comprises an enzyme. . - '5> -i j *> t -40- 16. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een platina coördinatiecomplex omvat.The ligand of claim 9, wherein the compound coupled to the ligand comprises a platinum coordination complex. 17. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een radioïsotoop omvat.The ligand of claim 9, wherein the compound coupled to the ligand comprises a radioisotope. 18. Ligand volgens conclusie 9, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een fluorescente verbinding omvat.The ligand of claim 9, wherein the compound coupled to the ligand comprises a fluorescent compound. 19. In essentie zuiver ligand dat bindt aan Bp50, een 50 kilodalton B-celoppervlakteantigeen dat gedefinieerd wordt door monoklonaal anti-lichaam G28-5.19. Essentially pure ligand that binds to Bp50, a 50 kilodalton B cell surface antigen defined by monoclonal antibody G28-5. 20. Ligand volgens conclusie 19, omvattende een antilichaammolecuul of een Fv, Fab, Fiab')^ of Fab' gedeelte van het antilichaammolecuul.Ligand according to claim 19, comprising an antibody molecule or an Fv, Fab, Fiab ') or Fab' portion of the antibody molecule. 21. Ligand volgens conlcusie 20, waarin het antilichaammolecuul een monoklonaal antilichaammolecuul of een Fv, Fab, F(ab')2 of Fab' gedeelte van het monoklonale antilichaammolecuul omvat.A ligand according to claim 20, wherein the antibody molecule comprises a monoclonal antibody molecule or an Fv, Fab, F (ab ') 2 or Fab' portion of the monoclonal antibody molecule. 22. Ligand volgens conclusie 19, dat een lymfokine omvat.The ligand of claim 19, which comprises a lymphokine. 23. Lymfokine volgens conclusie 22, omvattende een B-celgroeifactor.Lymphokine according to claim 22, comprising a B cell growth factor. 24. Ligand volgens conclusie 19, 20 of 22 dat verder een aan het ligand gekoppelde verbinding omvat.The ligand according to claim 19, 20 or 22, further comprising a compound linked to the ligand. 25 Fab;' gedeelte van het monoklonale antilichaammolecuul.25 Fab; portion of the monoclonal antibody molecule. 25. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde 20 verbinding een anti-uitbreidingsmiddel omvat.The ligand according to claim 24, wherein the compound coupled to the ligand comprises an anti-propagating agent. 26. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een alkyleringsmiddel omvat.The ligand of claim 24, wherein the compound coupled to the ligand comprises an alkylating agent. 27. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een antimetaboliet omvat.The ligand of claim 24, wherein the ligand-linked compound comprises an anti-metabolite. 28. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een antibioticum omvat.The ligand of claim 24, wherein the compound coupled to the ligand comprises an antibiotic. 29. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een vinca alkaloïde omvat.The ligand of claim 24, wherein the compound coupled to the ligand comprises a vinca alkaloid. 30 ATCC met inschrijvingsnummer Hb9110, of een mutant, recombinant of genetisch gemanipuleerd derivaat daarvan.ATCC with accession number Hb9110, or a mutant, recombinant or genetically engineered derivative thereof. 30. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde 30 verbinding een enzym omvat.30. The ligand of claim 24, wherein the compound coupled to the ligand comprises an enzyme. 31. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een platina coördinatiecomplex omvat.The ligand of claim 24, wherein the ligand linked compound comprises a platinum coordination complex. 32. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een radioïsotoop omvat.The ligand of claim 24, wherein the compound coupled to the ligand comprises a radioisotope. 33. Ligand volgens conclusie 24, waarin de aan het ligand gekoppelde verbinding een fluorescente verbinding omvat. ' ·· · ' - 7 *4 , , .·· 'J · ï *ί ' *. -41-The ligand of claim 24, wherein the compound coupled to the ligand comprises a fluorescent compound. "·· ·" - 7 * 4,. ·· "J · ï * ί" *. -41- 34. In essentie zuiver 50 kilodalton B-celoppervlakteantigeen dat gedefinieerd wordt door monoklonaal antilichaam G28-5.34. Essentially pure 50 kilodalton B cell surface antigen defined by monoclonal antibody G28-5. 35. In essentie zuiver 50 kilodalton antigeen volgens conclusie 34, dat een polypeptide omvat.Essentially pure 50 kilodaltone antigen according to claim 34 comprising a polypeptide. 36. Werkwijze voor het versterken van de uitbreiding van B-cellen, omvattende de behandeling van geactiveerde B-cellen met een effektieve dosis van een ligand dat aan Bp50, een 50 kilodalton B-celoppervlakteantigeen gedefinieerd door monoklonaal antilichaam G28-5, bindt, zodat de geactiveerde B-cellen de celcyclus doorlopen en uitbreiding wordt 10 versterkt.A method for enhancing B cell expansion, comprising treating activated B cells with an effective dose of a ligand that binds to Bp50, a 50 kilodalton B cell surface antigen defined by monoclonal antibody G28-5, so that the activated B cells go through the cell cycle and extension is enhanced. 37. Werkwijze volgens conclusie 36, waarin de B-cellen geactiveerd werden door behandeling met een effectieve dosis van een tweede ligand, dat aan 3p35, een 35 kilodalton B-celoppervlakteantigeen, bindt zodat de B-cel van het GQ naar het stadium van de celcyclus overgaat.The method of claim 36, wherein the B cells are activated by treatment with an effective dose of a second ligand, which binds to 3p35, a 35 kilodaltons of B cell surface antigen, such that the B cell moves from the GQ to the stage of the cell cycle rings. 38. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, die in vivo wordt uitgevoerd.The method of claim 36 or 37, which is performed in vivo. 39. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, die in vitro wordt uitgevoerd.The method according to claim 36 or 37, which is performed in vitro. 40. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, waarin het ligand een anti-lichaammolecuul omvat dat bindt aan Bp50 of een Fv, Fab, F(ab')^ of Fab' 20 gedeelte van het antilichaammolecuul dat aan Bp50 bindt.The method of claim 36 or 37, wherein the ligand comprises an antibody molecule that binds to Bp50 or an Fv, Fab, F (ab ') ^ or Fab' 20 portion of the antibody molecule that binds to Bp50. 41. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, waarin het ligand een monoklonaal antilichaammolecuul omvat dat aan Bp50 bindt of een Fv, Fab, F(ah'of Fab* gedeelte van een monoklonaal antilichaammolecuul dat aan 3p50 bindt.The method of claim 36 or 37, wherein the ligand comprises a monoclonal antibody molecule that binds to Bp50 or an Fv, Fab, F (ah 'or Fab * portion of a monoclonal antibody molecule that binds to 3p50. 42. Werkwijze volgens conclusie 41, waarin het monoklonale antilichaam molecuul G28-5 omvat, of een Fv, Fab, F(ab')2 of Fab1 gedeelte daarvan.The method of claim 41, wherein the monoclonal antibody comprises molecule G28-5, or an Fv, Fab, F (ab ') 2 or Fab1 portion thereof. 43. Werkwijze volgens conclusie 41, waarin het monoklonale antilichaam geproduceerd is door een hybridomacellijn als gedeponeerd bij het ATCC met inschrijvingsnummer HB9110, of een mutant, recombinant of genetisch 30 gemanipuleerd derivaat daarvan.43. The method of claim 41, wherein the monoclonal antibody is produced by a hybridoma cell line as deposited with the ATCC with accession number HB9110, or a mutant, recombinant or genetically engineered derivative thereof. 44. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, waarin het ligand een lymfokine omvat.The method of claim 36 or 37, wherein the ligand comprises a lymphokine. 45. Werkwijze volgens conclusie 44, waarin het lymfokine een B-cel-groeifactor omvat.The method of claim 44, wherein the lymphokine comprises a B cell growth factor. 46. Werkwijze volgens conclusie 44, waarin het lymfokine zich op het oppervlak van een cel bevindt. .- ' *· -42-The method of claim 44, wherein the lymphokine is on the surface of a cell. .- '* -42- 47. Werkwijze volgens conclusie 37, waarin het tweede ligand een antilichaammolecuul omvat dat aan Bp35 bindt.The method of claim 37, wherein the second ligand comprises an antibody molecule that binds to Bp35. 48. Werkwijze volgens conclusie 47, waarin het antilichaam dat aan Bp35 bindt, verder een monoklonaal antilichaam omvat.The method of claim 47, wherein the antibody that binds to Bp35 further comprises a monoclonal antibody. 49. Werkwijze volgens conclusie 37, waarin de geactiveerde B-cellen behandeld worden met het ligand dat aan Bp50 bindt binnen ongeveer 12 uur na activering door het tweede ligand dat aan Bp35 bindt.The method of claim 37, wherein the activated B cells are treated with the ligand that binds to Bp50 within about 12 hours of activation by the second ligand that binds to Bp35. 50. Werkwijze voor het onderdrukken van de uitbreiding van cellen die Bp5Q tot expressie brengen, een 50 kilodalton B-celoppervlakte- 1.0., antigeen dat door monoklonaal antilichaam G28-5 wordt gedefinieerd, omvattende de behandeling van de cellen die Bp50 tot expressie brengen met een effektieve dosis van een ligand dat aan 3p50 bindt, welk ligand gekoppeld is aan een anti-uitbreidingsmiddel.50. A method of suppressing the extension of cells expressing Bp5Q, a 50 kilodalton B cell surface 1.0, antigen defined by monoclonal antibody G28-5 comprising treating the cells expressing Bp50 with an effective dose of a ligand that binds to 3p50, which ligand is linked to an anti-extension agent. 51. Werkwijze volgens conclusie 50, waarin de cellen die Bp50 tot 15 expressie brengen, B-cellen omvatten.51. The method of claim 50, wherein the cells expressing Bp50 comprise B cells. 52. Werkwijze volgens conclusie 50, waarin de cellen die Bp50 tot expressie brengen, malignecellen omvatten. aThe method of claim 50, wherein the cells expressing Bp50 comprise malignant cells. a 53. Werkwijze volgens conclusie 50, die in vivo wordt uitgevoerd.The method of claim 50, which is performed in vivo. 54. Werkwijze volgens conclusie 50, die in vitro wordt uitgevoerd.The method of claim 50, which is performed in vitro. 55. Werkwijze volgens conclusie 50, waarin het ligand een antilichaam molecuul of een Fv, Fab, F(ab’)2 of Fab' gedeelte van het antilichaammolecuul omvat.The method of claim 50, wherein the ligand comprises an antibody molecule or an Fv, Fab, F (ab ') 2 or Fab' portion of the antibody molecule. 56. Werkwijze volgens conclusie 55, waarin het antilichaammolecuul een monoklonaal antilichaammolecuul omvat of een Fv, Fab, FCab'^ ofThe method of claim 55, wherein the antibody molecule comprises a monoclonal antibody molecule or an Fv, Fab, FCab 'or 57. Werkwijze volgens conclusie 56, waarin het monoklonale antilichaam G28-5 omvat, of een Fv, Fab, Fiab'^ of Fab' gedeelte daarvan.The method of claim 56, wherein the monoclonal antibody comprises G28-5, or an Fv, Fab, Fiab '^ or Fab' portion thereof. 58. Werkwijze volgens conclusie 56, waarin het monoklonale antilichaam geproduceerd wordt door een hybridomacellijn als gedeponeerd bij hetThe method of claim 56, wherein the monoclonal antibody is produced by a hybridoma cell line as deposited in the 59. Werkwijze volgens conclusie 50, waarin het ligand een lymfokine . omvat.The method of claim 50, wherein the ligand is a lymphokine. includes. 60. Werkwijze volgens conclusie 59, waarin het lymfokine een B-cel-35 groeifactor omvat. * -* . -43-The method of claim 59, wherein the lymphokine comprises a B cell 35 growth factor. * - *. -43- 61. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-uitbreidingsmiddel een alkyleringsmiddel omvat.A method according to claim 50, 55 or 59, wherein the anti-extension agent comprises an alkylating agent. 62. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-uithreidingsmiddel een antimetaboliet omvat.The method of claim 50, 55 or 59, wherein the anti-spreading agent comprises an anti-metabolite. 63. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti- uitbreidingsmiddel een antibioticum omvat.A method according to claim 50, 55 or 59, wherein the anti-spreading agent comprises an antibiotic. 64. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-uitbreidingsmiddel een vinca alkaloïde omvat.The method of claim 50, 55 or 59, wherein the anti-propagating agent comprises a vinca alkaloid. 65. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-101 uitbreidingsmiddel een enzym omvat.The method of claim 50, 55 or 59, wherein the anti-101 extension agent comprises an enzyme. 66. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-uitbreidingsmiddel een platina coördinatiecomplex omvat.A method according to claim 50, 55 or 59, wherein the anti-extension agent comprises a platinum coordination complex. 67. Werkwijze volgens conclusie 50, 55 of 59, waarin het anti-uitbreidingsmiddel een radiclsotoop omvat. 15 tThe method of claim 50, 55 or 59, wherein the anti-propagating agent comprises a radicototope. 15 t
NL8701371A 1986-06-13 1987-06-12 Antibodies and active fragments thereof that serve to enhance B cell expansion. NL195022C (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87388486A 1986-06-13 1986-06-13
US87388486 1986-06-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NL8701371A true NL8701371A (en) 1988-01-04
NL195022C NL195022C (en) 2003-06-18

Family

ID=25362524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8701371A NL195022C (en) 1986-06-13 1987-06-12 Antibodies and active fragments thereof that serve to enhance B cell expansion.

Country Status (22)

Country Link
JP (1) JPH0762040B2 (en)
KR (1) KR910004100B1 (en)
AT (1) AT398437B (en)
AU (1) AU617087B2 (en)
BE (1) BE1000587A4 (en)
CA (1) CA1338781C (en)
CH (1) CH676600A5 (en)
CY (1) CY1681A (en)
DE (1) DE3719398C2 (en)
DK (1) DK173940B1 (en)
FR (1) FR2607136B1 (en)
GB (1) GB2191494B (en)
GR (1) GR870930B (en)
HK (1) HK10293A (en)
IE (1) IE60486B1 (en)
IL (1) IL82841A (en)
IT (1) IT1208649B (en)
LU (1) LU86919A1 (en)
NL (1) NL195022C (en)
PT (1) PT85073B (en)
SE (1) SE504675C2 (en)
SG (1) SG118992G (en)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506126A (en) * 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
RS50101B (en) 1996-02-24 2009-01-22 Boehringer Ingelheim International Gmbh., Pharmaceutical compositions for immunomodulation

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4443427A (en) * 1982-06-21 1984-04-17 Sidney Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibody
EP0117705A3 (en) * 1983-02-24 1985-09-25 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibody specific for monocytes and blast cells
FR2547731A1 (en) * 1983-06-27 1984-12-28 Centre Nat Rech Scient ANTITUMOR IMMUNOTOXIN, PHARMACEUTICAL PREPARATIONS CONTAINING IT AND ITS USE IN VITRO
US4585742A (en) * 1983-12-14 1986-04-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibody with specificity to human small cell carcinoma and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
ATA151387A (en) 1994-04-15
IL82841A0 (en) 1987-12-20
IE60486B1 (en) 1994-07-27
DE3719398C2 (en) 1996-03-28
NL195022C (en) 2003-06-18
GB2191494B (en) 1990-08-22
BE1000587A4 (en) 1989-02-14
HK10293A (en) 1993-02-19
SE8702463D0 (en) 1987-06-12
JPH0762040B2 (en) 1995-07-05
FR2607136A1 (en) 1988-05-27
AU617087B2 (en) 1991-11-21
GR870930B (en) 1987-12-16
IE871563L (en) 1987-12-13
IT1208649B (en) 1989-07-10
GB8713650D0 (en) 1987-07-15
JPS6480299A (en) 1989-03-27
DK173940B1 (en) 2002-03-04
DE3719398A1 (en) 1988-01-28
IL82841A (en) 1992-11-15
GB2191494A (en) 1987-12-16
LU86919A1 (en) 1989-03-08
CH676600A5 (en) 1991-02-15
CY1681A (en) 1993-10-10
DK302287D0 (en) 1987-06-12
AU7421487A (en) 1987-12-17
KR910004100B1 (en) 1991-06-22
SE8702463L (en) 1987-12-14
IT8720899A0 (en) 1987-06-12
SG118992G (en) 1993-01-29
FR2607136B1 (en) 1989-09-15
AT398437B (en) 1994-12-27
CA1338781C (en) 1996-12-10
SE504675C2 (en) 1997-04-07
DK302287A (en) 1987-12-14
PT85073A (en) 1987-07-01
PT85073B (en) 1990-07-31
KR880000582A (en) 1988-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5182368A (en) Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US5786456A (en) Bp 50-specific antibodies and fragments thereof
Clark et al. Activation of human B cells mediated through two distinct cell surface differentiation antigens, Bp35 and Bp50.
Ledbetter et al. Antibodies to common leukocyte antigen p220 influence human T cell proliferation by modifying IL 2 receptor expression.
Gollob et al. CD2 regulates responsiveness of activated T cells to interleukin 12.
Yodoi et al. TCGF (IL 2)-receptor inducing factor (s). I. Regulation of IL 2 receptor on a natural killer-like cell line (YT cells).
Fleischer A novel pathway of human T cell activation via a 103 kD T cell activation antigen.
Kamoun et al. A novel human T cell antigen preferentially expressed on mature T cells and shared by both well and poorly differentiated B cell leukemias and lymphomas.
Leo et al. Identification of a monoclonal antibody specific for a murine T3 polypeptide.
US6641809B1 (en) Method of regulating cellular processes mediated by B7 and CD28
EP0537293A1 (en) Ligand for cd28 receptor on b cells and methods
JPH013128A (en) Bifunctional antibody constructs and methods for selectively destroying cell populations
Chouaib et al. Differential effect of anti-beta 2-microglobulin on IL 2 production and IL 2 receptor expression in the primary mixed lymphocyte culture reaction.
US7070776B1 (en) Methods for blocking binding of CD28 receptor to B7
EP0203403B1 (en) A cloned t cell capable of recognizing tumors and a t cell antigen receptor
JPH0638789A (en) Hybridoma and monoclonal antibody for inhibiting growth of anti-cd 3 stimulating t-cell
Seiler et al. Monoclonal antibodies: their chemistry, functions, and possible uses
Kirsch et al. The pattern of expression of CD147/neurothelin during human T‐cell ontogeny as defined by the monoclonal antibody 8D6
NL8701371A (en) LIGANDS AND METHODS FOR STRENGTHENING B-CELL EXPANSION.
US5028424A (en) Antibodies to receptor and antigen for natural killer and non-specific cytotoxic cells
EP0325489B1 (en) Leu 23: Monoclonal antibody for monitoring leukocyte activation
US5229494A (en) Receptor for natural killer and non-specific cytotoxic cells
US5185430A (en) Antigen recognized by natural killer and non-specific cytotoxic cells
Colamonici et al. IL-2-dependent expansion of CD3+ large granular lymphocytes expressing T cell receptor-gamma delta. Evidence for a functional receptor by anti-CD3 activation of cytolysis.
AT400956B (en) Method for obtaining a ligand and method for suppressing the proliferation of BP50-expressing cells

Legal Events

Date Code Title Description
BA A request for search or an international-type search has been filed
BB A search report has been drawn up
BC A request for examination has been filed
NP1 Patent granted (not automatically)
V4 Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent

Effective date: 20070612