WO1991000921A1 - Fragments d'anticorps monoclonaux specifiques de la presence de leucocytes actives - leur procede d'obtention et leur application dans le cas de rejet de greffe - Google Patents

Fragments d'anticorps monoclonaux specifiques de la presence de leucocytes actives - leur procede d'obtention et leur application dans le cas de rejet de greffe Download PDF

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WO1991000921A1
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receptor
antibody fragments
transplant
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Jean-Paul Soulillou
Jean-François CHATAL
Philippe Thedrez
Yannick Jacques
Jacques Paineau
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A61K51/1033—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines or interferons
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo

Definitions

  • the invention relates to fragments of monoclonal antibodies specific for the presence of activated leukocytes.
  • the invention also relates to a process for obtaining these antibody fragments as well as their clinical application as markers for the presence of activated leukocytes, in particular in the case of graft rejection.
  • Organ transplants are now used for certain shortcomings.
  • Heart transplantation for example, has become a well-regulated treatment for end-stage heart failure.
  • the high patient survival rate is linked to the use of cyclosporine in combination with prednisone and azathioprine.
  • the rejection "of allografts is often silent and its diagnosis difficult.
  • the clinical signs appear late: they can result in asthenia, fever, weight gain, oliguria.
  • the examination is not significant (muffling of the sounds of the heart, gallop, rhythm disturbance. With cyclosporine the examination is usually normal. At too late a stage, signs of heart failure appear.
  • the right ventricular endomyocardial biopsy remains the element used in immunological monitoring for the diagnosis of heart transplant rejection, but it is an invasive and restrictive examination for the patient.
  • the inventors have sought and developed new means capable of being used in the search for a transplant rejection crisis or a possible transplant rejection and capable of at least partially remedying the above problems mentioned.
  • mAb monoclonal antibodies
  • interleukin-2 will sometimes be designated by “11-2” and "the interleukin-2 receptor” by "I1-2-R”.
  • Monoclonal antibodies described in the prior art interact with a particular domain of the Il-2 receptor (the expression of which is under the control of the antigenic activation, due for example to a grafted organ) of certain lymphocytes.
  • This particular domain corresponds to one of the epitopes constituting a site of high affinity of the receptor of IL-2, constituted by a complex formed of chains (or TAC) of 55 kDa and ⁇ of 75 kDa.
  • TAC complex formed of chains
  • the inventors envisaged a new approach for monoclonal antibodies, in particular antibodies directed against receptors specifically present on leukocytes, in particular lymphocytes and / or monocytes, when these are activated and more particularly against a specific epitope of '' a site different from the high affinity site of the Il-2 receptor, in transplantation situations, in particular heterologous.
  • the inventors have demonstrated that specific fragments of determined monoclonal antibodies can bind to an epitope 4 specifically present in a leukocyte activation situation in the recipient of a transplant.
  • the invention therefore provides new means which can be used to reveal the presence of activated leukocytes.
  • the detection of activated leukocytes can be particularly advantageous following an organ transplant, in particular a heart or kidney transplant, or a bone marrow transplant (graft versus host reaction) or other fabric.
  • These new means constitute a particularly interesting exploration tool, capable of being integrated into a process for clinical diagnosis of transplant rejection, in particular in humans.
  • the invention relates to fragments of monoclonal antibodies directed against receptors present on leukocyte cells infiltrating a graft, characterized by:
  • the binding of the antibody fragments of the invention to the epitope defined above takes place in vivo.
  • graft should be understood to mean both the grafted organs and any other tissue substance or not (such as bone marrow).
  • the inventors have found that the specific binding of the antibody fragments of the invention on a particular epitope of an antigenic site of a leukocyte cell receptor is a particularly advantageous characteristic in the context of the detection of a leukocyte activation.
  • the use of whole antibodies known hitherto for their action on leukocytes to block transplant rejection does not make it possible to obtain the specificity of fixation sought.
  • fragments meeting the criteria defined above are idiotypic fragments of an antibody, said idiotypic fragments having an antibody site specific for an epitope of an antigenic site of a determined human receptor , accessible at the graft level, in a patient with a transplant rejection crisis.
  • Antibody fragments suitable for carrying out the invention are idiotypic fragments of antibodies directed against receptors, specifically induced in the host having undergone the transplant, following the activation of leukocytes, in particular lymphocytes and in particular T lymphocytes by a graft antigen.
  • fragments can be the fragments of monoclonal antibodies directed against antigen sites and in particular antigenic sites of receptors, advantageously of lymphokine receptors in particular of different interleukins, in particular IL-2, 11-4, 11-5 or transferin receptors, as soon as they have the desired specificity, that is to say when they are present on leukocytes having undergone activation, for example in the event of a transplant rejection crisis. 6
  • the antibody fragments comprise at least one antibody site exhibiting affinity with an epitope of the TAC chain of the human Il-2 receptor.
  • a leukocyte activation determinant which is particularly advantageous for carrying out the invention is the Il-2 receptor.
  • the TAC chain (a or P55) of the Il-2 receptor is the chain with a molecular weight
  • TAC chain is expressed on the surface of leukocytes, only when these leukocytes and in particular the lymphocytes are activated.
  • This modulation corresponds to the reaction of the antigen when an antibody is attached to it, the antigen tending to reject this antibody.
  • the fragments of selected monoclonal antibodies capable of recognizing the TAC chain of the human Il-2 receptor are the F (ab ') 2 fragments.
  • the fragments of monoclonal antibodies are Fab fragments, capable of recognizing the TAC chain of the human receptor 1 * 11-2.
  • the fragments of monoclonal antibodies are fragments Fa ', capable of recognizing the TAC chain of the human receptor 1 * 11-2.
  • the antibody fragments corresponding to the preceding definitions are obtained from whole antibodies, directed against Il-2-R, for example from monoclonal antibodies from animals, for example from rats or mice; an example of a process for preparing them is described below.
  • They can also be prepared from human monoclonal antibodies.
  • the fragments can also be obtained from humanized monoclonal antibodies (or chimeric antibodies) having an animal part corresponding to the antibody site characteristic of the targeted antigen and a human part corresponding to the other parts of the antibody, namely the constant fraction and possibly part of the variable fraction, except that which corresponds to the antibody site recognizing the antigen.
  • fragments may also consist of synthetic fragments, having specific interaction properties with the targeted receptors and which can be used to respond to the above problem.
  • the invention also relates to antibody fragments corresponding to the above definitions, characterized in that they are labeled with a physiologically acceptable substance, compatible with administration in humans or animals, capable of giving a measurable signal. outside the human body, in particular by means of a radioactivity counting device.
  • Particular satisfactory markers are, for example, radioactive markers.
  • the other qualities required for a substance to be able to be used as a marker within the framework of the invention, possibly after chemical modification, are for example, the stability of the bond between the marker and the antibody fragment used. , the speed of the kinetics in the case where the graft (constituting the target) must be reached quickly, the weakness of the background noise during the test at the level of the grafted subject.
  • These qualities must naturally be modulated according to the nature of the organ or of the grafted substance. All the parameters mentioned above will therefore not necessarily be considered, all the more so since corrections can be made by external systems.
  • a marker particularly suitable for carrying out the invention is technetium, in particular technetium 99, preferably its metastable form.
  • F (ab ') fragments can be used in direct labeling by coupling on the F (ab ') fragments or by indirect labeling, depending on the desired stability, for example on F (ab') 2 fragments.
  • a reagent capable of being used is used. to complex technetium and capable of being easily coupled to the F (ab ') 2 fragments.
  • radioactive markers satisfactory for carrying out the invention are for example indium and in particular indiumlll or iodine and in particular iodel31 ( 131 I), l * iodel25 ( 15 I) and iodine 123 ( 123 I).
  • radioactive markers are useful in the case where the radioactivity measurements made following exploration at the level of the patient, in the case of the diagnosis of a possible graft rejection, are carried out by means of a gamma-scintigraphy.
  • the invention therefore relates to a method for labeling antibody fragments determined by a selected radioactive substance, comprising the following steps:
  • the step of complexing the reagent with the marker precedes the step of coupling with the antibody fragments.
  • This variant can for example be advantageously used when it is desired to carry out labeling with technetium.
  • a purification step for example by gel filtration, can precede the recovery of the antibody fragments.
  • An advantageous embodiment of technetium marking uses reduced technetium (for example example by reaction of the stannous ion on the pertechnetate form Tc0 4 ′) then complexed with a weak chelating agent for example an agent of the pyrophosphate di-, tri- or tetraphosphonate type (A Bardy, patent FR 7427249) or IDA compounds ( iminodiacetic).
  • a weak chelating agent for example an agent of the pyrophosphate di-, tri- or tetraphosphonate type (A Bardy, patent FR 7427249) or IDA compounds ( iminodiacetic).
  • the chelating agent is then exchanged by the antibody, a stronger ligand.
  • the reduced Te atoms bind directly to the donor groups of the antibody by sites of low affinity, high capacity (amino groups, carboxylate, etc.), and by sites of high affinity, low capacity (sulfhydrile groups).
  • second form of the complexes is very stable in-vivo and constitutes a preferred embodiment.
  • a method of labeling Fab 'fragments of antibodies with technetium can be carried out as follows:
  • a buffer for example a phosphate-EDTA buffer
  • a physiological solution of sodium salt at a pH belonging to an interval 5 to 8, preferably at pH 6.0 and at room temperature
  • the above contacting step can be carried out using a reagent capable of strongly complexing technetium and capable of to be easily coupled to antibody fragments.
  • Polyaminocharboxylic acids for example diethylenetriaminepentaacetic acid, can be used as reagents (DTPA), analogs of ethylenetriaminatetraacetic acid (EDTA), diaminodithiol compounds, triaminothiols (ex: (thioacetamide / pentanoil) polycyclic amines of dithiosis icarbozones and etallothionines or anhydrides of these acids, in particular cyclic anhydrides.
  • chelating agents are prepared by known methods, for labeling with technetium, for example, reference may be made to the publication Eckelman et al Nucl, Med. Bid. Voll ⁇ n "2, pp 171-176, 1989.
  • a bifunctional chelating agent coupled to the antibody fragments can be used, which will then strongly complex the indium.
  • Fab 'or F (ab') 2 fragments with 1 " indium can be carried out as follows:
  • a determined chelating agent for example bicyclic anhydride of DTPA dissolved in a chelating agent / fragment 2 to 10 molar ratio, preferably 5.0,
  • compositions characterized in that they have the capacity to induce the formation of complexes of the antigen-antibody type in a patient with activated leukocytes which may mark a risk of transplant rejection, in particular that they lack this capacity in a patient having undergone a transplant and not undergoing rejection at the time of the examination and, in that they comprise fragments of antibody as described above.
  • a preferred composition corresponding to the preceding definition is capable of inducing the formation of complexes of the antigen-antibody type in the presence of activated leukocytes of the graft recipient, these leukocytes carrying TAC chains of the human receptor 1 * 11-2.
  • the previously defined fragments as well as the compositions described can enter into the composition of a reagent devoid of toxicity for humans, for the demonstration of the presence of activated leukocytes, in a patient likely to present transplant rejection, these fragments being marked with a marker compatible with administration in humans and meeting the above criteria.
  • This reagent can be used in the case of different transplants such as heart, kidney, marrow transplants.
  • the safety of the reagent is determined according to the criteria conventionally used: it must in particular be apyretic, non-carcinogenic, contain less than 10% of foreign DNA, be non-pyrogenic, sterile, free of microorganisms and other foreign agents.
  • the above reagent can be applied to detect in humans or animals the presence of activated leukocytes, in particular activated lymphocytes, by various measurement methods by gamma scintigraphy.
  • a first preferred method for the detection of activated lymphocytes is munoscintigraphy, in particular gamma-immunoscintigraphy.
  • the invention relates to a non-bloody exploration method applicable in humans who have undergone a transplant, to search for the presence of activated leukocytes, this presence being capable of being subsequently correlated with rejection of a graft, comprising the presence of activated leukocytes in a subject grafted by means of a support external to the subject's body, the subject having previously received the above-described antibody fragments, previously marked if necessary, or the composition whose fragments have have been previously labeled or the reagent described above, characterized in that the antibody fragments, this composition or this reagent are administered in an amount sufficient to allow a reaction with the TAC chain of the Il-2 receptor, said fragments being marked with a physiologically acceptable substance capable of giving a measurable signal outside the human body, in particular by means of a radioactivity counting device.
  • the application of the above method makes it possible to obtain scintigraphy images representing the quantity of antibody fragments linked to the receptor chains targeted on the leukocytes infiltrating the graft.
  • the above exploration method has the advantage that it can be applied to clinical situations at an early stage.
  • This method also has the advantage of being non-traumatic for the patient.
  • the invention also relates to a process for obtaining fragments of monoclonal antibodies meeting the above definitions, comprising the following steps: purification of monoclonal antibodies from which it is desired to obtain said fragments, digestion with one or more determined proteolytic enzymes, chosen in depending on the nature of the antibody fragments sought, under conditions allowing the cleavage of said fragments from the rest of the antibodies. - isolation and recovery of the antibody fragments obtained.
  • a process for the preparation of F (ab ′) 2 can be carried out as follows: purification of monoclonal antibodies from which it is desired to obtain said fragments, digestion with one or more determined proteolytic enzymes, for example pepsin, in conditions authorizing the cleavage of said fragments from the rest of the antibodies, in particular at a temperature of 37 ° C. ⁇ 10 in the presence of 0.5 to 10%, preferably 1 to 5% of pepsin at acid pH, in particular between 3.4 and 5, advantageously between 3.2 and 4.5,
  • proteolytic enzymes for example pepsin
  • Lamoyi J. Imminol Meth, 1983 vol. 56, p 235-243.
  • the digestion is for example carried out using papain and it leads to Fab fragments.
  • the pH of the reaction is preferably basic (preferably 7.8), it is advantageously carried out in the presence of NaCl and a reducing agent , for example 0.1 M cysteine.
  • the reaction can be carried out for 2 to 4 h.
  • the invention also relates to a kit for exploring, in a patient who has undergone a transplant, the presence of activated leukocytes, characterized in that it comprises: antibody fragments as defined above, - a physiologically acceptable marker capable of giving a measurable signal outside the human body, in particular by means of a radioactivity counting device,
  • a reagent authorizing the bond between the antibody fragment and the marker, or stabilizing this bond If necessary, a reagent authorizing the bond between the antibody fragment and the marker, or stabilizing this bond.
  • FIG. 1 biodistribution of intact 125 I 0x39 and 131 I B1G6 monoclonal antibodies in animals having received an allogeneic transplant. The measurements were made 5 days after the transplant and 24 hours after the intravenous injection of antibodies.
  • Figure 2 Biodistribution of fragments F (ab ') 2 of the antibody 0X39 directed against the I12 receptor and of an antibody B1G6 used as a control, 24 hours after the injection. The radioactivity of the transplanted heart and the original heart was measured 5 days after an allogeneic and heterotopic heart transplant (LEW / BN) in LE type animals, or a syngeneic heart transplant in first generation animals (FI ) of type (LEW / BN).
  • LEO allogeneic and heterotopic heart transplant
  • FIG. 4 Immunoscintigraphy in rats of the LEW species, 4 days after a transplant either syngeneic or allogenic heterotopic of an organ of a first generation animal (F-,) resulting from a LEW / BN ((LEW / BN) F,) crossing and 24 hours after an intravenous injection of F fragments (ab ') 2 131 I 0X39.
  • F- first generation animal
  • the data acquisition time was 10 minutes for each image in recipients previously anesthetized. All the animals were then sacrificed for the biodistribution studies. The imaging studies and the biodistribution studies were done on different recipients.
  • FIG. 5 Table 1: The reports of the radioactivity of an allogeneic heart grafted compared to the tissue of the recipient are given for fragments F (ab ') 2 of the antibody 131 I 0x39 or of the antibody B1G6, 7 hours and 24 hours after the injection of the radioactive substance in 4 different animals. Fragments
  • Eterotopic heart allografts were performed according to the Ono et al method (J. Thorac-cardiovasc-Surg 1987; 57: 225) in rats of LEWIS species and (LEW / BN) F species ", (Soulillou JP et al. Transplantation 1988; 38:63). LEW-LEW type syngeneic control grafts were also used as controls. The heartbeats of the transplanted heart were monitored daily and only recipients with good graft function at different times of an injection with a monoclonal antibody were used. 2 / Monoclonal antibodies
  • 0x39 is a mouse monoclonal antibody of the IgGl class directed against the TAC chain (55Kd) of the receptor of 1 • Interleukin-2 of the rat and which recognizes this chain with an affinity of 2nM. It has been described in the article "Transplant. International” (1988, 1: 58-63). It does not interact with the ⁇ chain and does not modify the immune response of the recipient on the graft because in this particular case, it does not block the interaction of IL2 on the receptor in the so-called "high affinity" conformation ( ⁇ association
  • a mouse monoclonal antibody specific for human microglobulin B 2 (B, G 6 ), obtained from Immunotech, Luminy France was used as a non-specific control monoclonal antibody, IgG 1 from mouse.
  • Monononal antibodies were obtained from ascites induced by hybridomas, the hybridomas themselves being obtained from PHLS Center for Applied Microbiology and Research (Division of Biology) Porton Down, Falisbury (UK), for 0x39. These antibodies were purified on an Affigel Protein A column. The respective F (ab ') 2 fragments of these two monoclonal antibodies were prepared by digestion with pepsin.
  • the monoclonal antibodies were dialyzed overnight against a 0.05M acetate buffer, at pH 3.8, then were digested with pepsin (Cooper Biomedical) 1% (w /) for 5 hours at 37 ⁇ C. The reaction was stopped by adding 2.5M Tris buffer to obtain a pH 8.
  • the F (ab ' ) 2 fragments were isolated on Sephadex G150 (Pharmacia) and on Protein A Sepharose (Pharmacia).
  • the F (ab ') 2 fractions had a degree of purity of 95 to 98% after electrophoresis on SDS polyacrylamide gel. 3 / Marking
  • the intact antibodies and the F (ab ') 2 fragments were labeled with 13 I or 125 I. Iodization was carried out using the iodogenic method described by Fraker (PJ et al. Biochem Biophis Res Commun 1978; 80: 849 leading to a specific activity of 5 ⁇ Ci / ⁇ g of antibody.
  • Fraker PJ et al. Biochem Biophis Res Commun 1978; 80: 849 leading to a specific activity of 5 ⁇ Ci / ⁇ g of antibody.
  • an aliquot part (50 ⁇ l) of methylene chloride solution containing 10 ⁇ g of iodogen (Pierce) was completely evaporated in a test tube. The iodine, mixed with different amounts of antibody was added to the tube and the reaction was carried out for 10 minutes at 0-2 "C.
  • the labeled protein was then immediately purified by chromatography on a Biogel 2 glass column (Biorad) and eluted with a phosphate buffered saline (PBS) containing 0.3% bovine serum albumin. 4 / Biodistribution of monoclonal antibodies labeled with a radioactive marker in rats carrying a graft.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the results are expressed as a percentage of doses injected per gram of tissue. For each point, an average of the values obtained from 3 rats was taken into account and the results are given by value ⁇ SD (Standard Deviation) for each group of animals.
  • ⁇ SD Standard Deviation
  • the specific ratio of monoclonal antibody 0x39 to monoclonal antibody B »jG 6 was estimated by measuring the localization index (tissue 131 I / 125 I: blood 131 I / 125 I) such as have described Moshakis et al (Br J. Cancer 1981; 43: 475).
  • Figure 1 shows the biodistribution of lOO ⁇ g of monoclonal antibody 125 I-0x39 (5 ⁇ Ci / ⁇ g) measured in the blood and in several tissues of the recipient 24 hours after the intravenous injection of monoclonal antibodies and 5 days after transplantation.
  • the percentage of 125 I-OX39 antibodies concentrated in the allograft constituted approximately 0.6% of the total radioactivity injected.
  • the activity is higher in the graft than in the others tissue and heart specific to the recipient, the distribution of values was not significantly different from that obtained with the nonspecific antibody 131 i- B "
  • the radioactivity of the lungs was comparable to that of the rejected graft while the liver, spleen and intestines had intermediate values.
  • FIG. 2 shows the distribution of 125 I-OX39 and 131 I B1G6 fragments in the graft and in the heart of recipients having undergone an allogenic or syngeneic transplant 24 hours after the injection.
  • lOO ⁇ g (5 ⁇ Ci / ⁇ g) of F (ab ') 2 fragments were injected into separate rats and the biodistribution was studied 7 and 24 hours after injection of the marked products.
  • Figure 1 the 0x39 F (ab ') 2 fragments have accumulated significantly in the rejected graft of allograft recipients, while the radioactivity found in syngeneic transplant was no different from that of the recipient's own heart.
  • the F (ab ') 2 fragments of B1G6 exhibited roughly the same binding in the case of hearts from orthotopic and heterotopic (allogenic) transplant recipients ( Figure 2).
  • Figure 3 shows that tissue specific activity levels, measured in animals injected with F (ab ') 2 fragments, were much lower than those obtained with intact monoclonal antibodies.
  • the ratio of graft radioactivity to that of the lung of the liver or spleen increased markedly for the F (ab ') 2 fragments of 0x39, which probably indicates uptake via the receptors of the Fc fragments.
  • Table 1 ( Figure 5) gives the radioactivity levels of the allografted heart compared to the heart of the recipient or other tissues of the recipient, obtained 7 and 24 hours after the injection of the F (ab ') 2 fragments, preferably indicating the localization of anti I12-R products in the rejected organ compared to the recipient's own heart.
  • Figure 4 shows that 24 hours after the injection of F (ab ') 2 fragments of 131 I-OX39, a clear signal can be obtained in the recipient of an allograft (from the 4th day after transplantation) while only a very weak signal can be seen in recipients of syngeneic transplants or in recipients of allogenic transplants receiving non-specific F (ab ') 2 fragments.
  • Circulating activated cells can also account for a fraction of the location of F (ab ') fragments in other organs such as the spleen, liver and lungs.
  • the soluble form of the receptor 1 * I1 2 is also capable of binding to monoclonal antibody anti I12-R. Its increase during rejection may increase the complexed fraction of the F (ab ') 2 fragments of 0x39 outside the plugin.
  • An immunoscintigraphy analysis showed that after the injection of F (ab ') 2 fragments of 0x39 labeled with 131 I, the fraction of antibodies binding to cells having receptors of 1 * 112 and infiltrating the graft, could be measured and visualized by this method.
  • the image obtained by gamma-scintigraphy was only positive in the case of allogenic combination and not in the case of syngeneic combination.
  • the image obtained in the case of an allogeneic transplant was easily detectable from the 4th day after transplantation, which represents an early stage of rejection and corresponds to a time when probably less than 20% of cells infiltrating the graft have IL2 receptors.
  • the antibody used in this study is the antibody 33B3.1 marketed by Immunotech under the reference 317 and described by Mauff et al (Hum.
  • Fab fragments are labeled by adding a sterile, pyrogen-free solution of radioactive label.
  • a chromatography on paper of the labeled product is carried out before the injection to determine the radiochemical purity. The percentage obtained must be greater than 90% for the product to be injected.
  • the patients are heart transplant recipients who underwent a transplant at least 10 days previously and therefore left the sterile sector.
  • the positivity criteria are defined by the myocardial location and the intensity of fixation using a count against a sample.
  • hematological parameters hemoglobin, hematochritis, red blood cells, white blood cells (PN, PEo, B, Ly), platelets.
  • - blood ionogram sodium, potassium, chlorine, proteins, calcium, glucose, creatinine, urea.
  • the irradiation received by each patient is approximately 250mRad for each injection.
  • Bicyclic anhydride is added to 20 mg of fragments F (ab ') 2 or F (ab') of antibody 33-B-3.1 in solution in 0.1 M sodium bicarbonate at the concentration of 5.10 mg / ml.
  • DTPA solubilized in anhydrous DMSO in a DTPA anhydride / Antibody molar ratio of 5.0; the solution is stirred for 15 minutes at room temperature.
  • the DTPA not coupled to the antibodies is removed by gel filtration using a column of sephacryl HR200 (1 cm x 30 cm) eluted in 0.15 M NaCl.
  • the average number of DTPA coupled by antibodies is 2.0.
  • the antibodies coupled to DTPA are buffered to pH 5.0 using a 0.1 M acetate buffer, pH 5.0. To this solution is added the desired amount of indium 111 chloride. After stirring for 30 minutes at room temperature, the labeling yield is greater than 90%.

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Abstract

L'invention concerne des fragments d'anticorps capables de se fixer à un site antigènique d'un récepteur présent sur les leucocytes activés. Elle vise en particulier des fragments d'anticorps reconnaissant un site antigènique spécifique du récepteur de l'IL-2. L'invention concerne également l'utilisation de ces fragments d'anticorps pour la détection d'une crise de rejet de greffe, ainsi que leur application dans des kits.

Description

FRAGMENTS D'ANTICORPS MONOCLONAUX SPECIFIQUES DE LA PRESENCE DE LEUCOCYTES ACTIVES - LEUR PROCEDE D'OBTENTION ET LEUR APPLICATION DANS LE CAS DE REJET DE GREFFE.
L'invention concerne des fragments d'anticorps monoclonaux, spécifiques de la présence de leucocytes activés.
L'invention vise également un procédé d'obtention de ces fragments d'anticorps ainsi que leur application clinique en tant que marqueurs de la présence de leucocytes activés notamment dans le cas de rejet de greffe.
Les transplantations d'organes sont maintenant utilisées dans le cas de certaines insuffisances. La transplantation cardiaque est par exemple devenue un traitement bien réglé de 1'insuffisance cardiaque terminale. Le taux élevé de survie des patients est lié à l'utilisation de la cyclosporine associée à la prednisone et l'azathioprine. Cependant le rejet"des allogreffes est souvent silencieux et son diagnostic difficile. Les signes cliniques apparaissent tardivement: ils peuvent se traduire par une asthénie, un fébricule, une prise de poids, une oligurie. L'examen est peu significatif (assourdissement des bruits du coeur, galop, trouble du rythme) . Avec la cyclosporine l'examen est le plus souvent normal. A un stade trop tardif apparaissent les signes d'insuffisance cardiaque.
Les autres méthodes utilisables pour la surveillance des greffés posent de façon générale le problème de leur significativité, de leur sensibilité, de leur spécificité, de leur accessibilité technique et de leur coût (échographie, monitorage cytoimmunologique, détermination du rapport OKT4/OKT8, scintigraphies aux lymphocytes marqués à l'indium, etc...) .
La biopsie endomyocardique ventriculaire droite reste l'élément utilisé dans la surveillance immunologique pour le diagnostic du rejet de greffe cardiaque mais il s'agit d'un examen invasif et contraignant pour le patient.
Les inventeurs ont recherché et mis au point de nouveaux moyens susceptibles d'être utilisés dans la recherche d'une crise de rejet de greffe ou d'un éventuel • rejet de greffe et capables de remédier du moins en partie, aux problèmes ci-dessus mentionnés.
Dans le cadre de ces recherches, les inventeurs se sont intéressés à la biodistribution d'anticorps monoclonaux (AcM) en particulier d'anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur de 1'interleu ine 2 ou certains de ses sites spécifiques (épitopes) , lors d'une greffe d'organe. Ils ont également déterminé chez l'animal les quantités d'anticorps monoclonaux présents quand ils sont injectés après une greffe, dans les différents organes du sujet receveur, y compris dans l'organe greffé.
Jusqu'à présent on connaissait la propriété de certains anticorps monoclonaux particuliers, de reconnaître le récepteur de 1'interleukine-2 et de former avec ce récepteur un complexe immunologique.
Pour simplifier l'écriture dans la suite du texte "l'interleukine-2" sera parfois désignée par "11-2" et "le récepteur de l'interleukine-2" par "I1-2-R".
Des anticorps monoclonaux décrits dans 1'art antérieur interagissent avec un domaine particulier du récepteur de l'Il-2 (dont l'expression est sous le contrôle de l'activation antigènique, due par exemple à un organe greffé) de certains lymphocytes. Ce domaine particulier correspond à l'un des épitopes constitutifs d'un site de haute affinité du récepteur de l'IL-2, constitué par un complexe formé des chaînes (ou TAC) de 55 kDa et β de 75 kDa. De la réaction d'interaction des anticorps avec le domaine antigènique du récepteur de 1•11-2, peut résulter une inhibition de la croissance des clones de lymphocytes dirigés contre les antigènes du donneur lors d'une greffe hétérologue. In vivo, il devrait en résulter une inhibition du rejet de greffe.
Dans leur démarche les inventeurs ont envisagé une nouvelle approche des anticorps monoclonaux, notamment des anticorps dirigés contre des récepteurs spécifiquement présents sur les leucocytes, notamment les lymphocytes et/ou les monocytes, lorsque ceux-ci sont activés et plus particulièrement contre un épitope spécifique d'un site différent du site de haute affinité du récepteur de l'Il-2, dans les situations de greffe notamment hétérologue.
En poursuivant leurs travaux les inventeurs se sont intéressés plus particulièrement à des fragments spécifiques de ces anticorps monoclonaux. Ils ont mis en évidence la propriété particulière de fragments déterminés d'anticorps monoclonaux, de se fixer de façon spécifique et précoce, éventuellement quelques jours après la greffe, sur les cellules leucocytaires par exemple du type des monocytes ou des macrophages et en particulier de type lymphocytaires infiltrant un greffon d'un sujet susceptible de présenter une crise de rejet de greffe et donc susceptible de rejeter une greffe en particulier une greffe de type hétérologue.
En d'autres termes, les inventeurs ont mis en évidence que des fragments spécifiques d'anticorps monoclonaux déterminés peuvent se fixer sur un épitope 4 spécifiquement présent dans une situation d'activation des leucocytes chez le receveur d'une greffe.
Par contraste, les inventeurs ont montré que cette propriété des fragments d'anticorps n'apparaît pas lorsque la greffe réalisée n'est pas susceptible de rejet par exemple dans le cas de greffe de type syngénique.
L'invention fournit donc de nouveaux moyens utilisables pour révéler la présence de leucocytes activés. La détection des leucocytes activés peut s'avérer particulièrement intéressante à la suite d'une greffe d'organe, notamment d'une greffe de coeur ou de rein, ou d'une greffe de moelle osseuse (réaction du greffon contre l'hôte) ou autre tissu. Ces nouveaux moyens constituent un outil d'exploration particulièrement intéressant, susceptible d'être intégré dans un processus de diagnostic clinique d'un rejet de greffe en particulier chez l'homme.
L'invention concerne à cet effet des fragments d'anticorps monoclonaux, dirigés contre des récepteurs présents sur des cellules leucocytaires infiltrant un greffon, caractérisés par:
- l'absence de fraction constante (Fc) ,
- leur capacité à se fixer spécifiquement à l'épitope d'un site antigènique d'un récepteur des cellules leucocytaires infiltrant le greffon lors d'une crise de rejet de greffe.
La fixation des fragments d'anticorps de l'invention à l'épitope défini ci-dessus, a lieu in vivo.
Par greffon, on doit entendre à la fois les organes greffés ainsi que toute autre substance tissulaire ou non (telle que la moelle osseuse) .
Les inventeurs ont constaté que la fixation spécifique des fragments d'anticorps de l'invention sur un épitope particulier d'un site antigènique d'un récepteur des cellules leucocytaires est une caractéristique particulièrement avantageuse dans le cadre de la détection d'une activation leucocytaire. L'utilisation d'anticorps entiers connus jusqu'à présent pour leur action sur les leucocytes pour bloquer des rejets de greffe ne permet pas d'obtenir la spécificité de fixation recherchée.
Selon un premier aspect de l'invention, des fragments répondant aux critères ci-dessus définis sont des fragments idiotypiques d'un anticorps, lesdits fragments idiotypiques possédant un site anticorps spécifique d'un épitope d'un site antigènique d'un récepteur humain déterminé, accessible au niveau d'un greffon, chez un patient présentant une crise de rejet de greffe.
Des fragments d'anticorps adaptés à la réalisation de l'invention sont des fragments idiotypiques, d'anticorps dirigés contre des récepteur, spécifiquement induits chez l'hôte ayant subi la greffe, à la suite de l'activation des leucocytes en particulier des lymphocytes et notamment des lymphocytes T par un antigène du greffon.
Ces fragments peuvent être les fragments d'anticorps monoclonaux dirigés contre des sites d'antigènes et notamment des sites antigéniques de récepteurs, avantageusement de récepteurs de lymphokines en particulier de différentes interleukines, notamment IL-2, 11-4, 11-5 ou de récepteurs de la transférine, dès lors qu'ils présentent la spécificité voulue, c'est-à-dire lorsqu'ils sont présents sur des leucocytes ayant subi une activation par exemple en cas de crise de rejet de greffe. 6
Selon un aspect particulièrement préféré de l'invention, les fragments d'anticorps comprennent au moins un site anticorps présentant une affinité avec un épitope de la chaîne TAC du récepteur humain de l'Il-2. En effet on a noté qu'un déterminant d'activation leucocytaire particulièrement avantageux pour réaliser l'invention est le récepteur de l'Il-2.
La chaîne TAC (a ou P55) du récepteur de l'Il-2 est la chaîne présentant un poids moléculaire
10 d'environ 55kDa. Seule, elle forme le site de faible affinité du récepteur de 1*11-2. Associée avec la chaîne β du récepteur, elle contribue à former le site de forte affinité.
Les inventeurs ont tiré profit du fait que la
15 chaîne TAC est exprimée à la surface des leucocytes, uniquement lorsque ces leucocytes et en particulier les lymphocytes sont activés.
Elle se trouve alors en excès par rapport à la chaîne β avec laquelle elle contribue à la formation
20 du site de haute affinité du récepteur de 1*11-2. L'excès de chaîne TAC reste alors disponible et constitue un site de faible affinité du récepteur de 1*11-2. Les inventeurs ont donc constaté que la chaîne TAC est suffisamment abondante et qu'elle ne possède
25 pas une modulation trop rapide pour être utilisée dans le cadre de l'invention.
Cette modulation correspond à la réaction de l'antigène lorsqu'on lui accroche un anticorps, l'antigène tendant de rejeter cet anticorps.
30 Dans un premier mode de réalisation de l'invention, les fragments d'anticorps monoclonaux choisis, capables de reconnaître la chaîne TAC du récepteur humain de l'Il-2 sont les fragments F(ab')2.
Ces fragments possèdent avantageusement
35 l'ensemble des sites idiotypiques spécifiques de la chaîne TAC, ce qui leur confère une affinité apparente importante vis-à-vis des récepteurs de 1*11-2 et permet d'obtenir des liaisons stables entre le fragment et le site du récepteur.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les fragments d'anticorps monoclonaux sont des fragments Fab, capables de reconnaître la chaîne TAC du récepteur humain de 1*11-2.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les fragments d'anticorps monoclonaux sont des fragments Fa ' , capables de reconnaître la chaîne TAC du récepteur humain de 1*11-2.
Les fragments d'anticorps répondant aux définitions précédentes sont obtenus à partir d'anticorps entiers, dirigés contre l'Il-2-R par exemple d'anticorps monoclonaux d'animaux par exemple de rat ou de souris; un exemple de procédé pour les préparer est décrit dans la suite.
Ils peuvent également être préparés à partir d'anticorps monoclonaux humains.
Les fragments peuvent aussi être obtenus à partir d'anticorps monoclonaux humanisés (ou anticorps chimères) possédant une partie animale correspondant au site anticorps caractéristique de l'antigène visé et une partie humaine correspondant aux autres parties de l'anticorps à savoir la fraction constante et éventuellement une partie de la fraction variable, excepté celle qui correspond au site anticorps reconnaissant 1'antigène.
Ces fragments pourront également être constitués par des fragments synthétiques, présentant des propriétés d'interaction spécifiques avec les récepteurs visés et pouvant être mis en oeuvre pour répondre au problème ci-dessus. L'invention vise également des fragments d'anticorps répondant aux définitions ci-dessus caractérisés en ce qu'ils sont marqués avec une substance physiologiquement acceptable, compatible avec l'administration chez l'homme ou l'animal, capable de donner un signal mesurable à l'extérieur du corps humain, notamment au moyen d'un appareil de comptage de la radioactivité. Des marqueurs particuliers satisfaisants sont par exemple des marqueurs radioactifs.
Les autres qualités requises pour qu'une substance puisse être utilisée en tant que marqueur dans le cadre de l'invention, éventuellement après modification chimique, sont par exemple, la stabilité de la liaison entre le marqueur et le fragment d'anticorps mis en oeuvre, la rapidité de la cinétique dans le cas où le greffon (constituant la cible) doit être atteint rapidement, la faiblesse du bruit de fond lors du test au niveau du sujet greffé. Ces qualités doivent naturellement être modulées selon la nature de l'organe ou de la substance greffée. Tous les paramètres cités ci-dessus ne seront donc pas nécessairement considérés, et ce d'autant plus que des corrections peuvent être apportées par des systèmes externes.
Un marqueur particulièrement adapté à la réalisation de l'invention est le technetium notamment le technetium 99, de préférence sa forme métastable.
Il peut être utilisé en marquage direct par couplage sur les fragments F(ab') ou par marquage indirect, selon la stabilité désirée, par exemple sur des fragments F(ab')2. Dans ce cas, pour pallier l'absence de groupements sulfhydrile libres sur le fragment F(ab')2 on met en oeuvre un réactif capable de complexer le technetium et susceptible d'être facilement couplé aux fragments F(ab')2.
D'autres marqueurs radioactifs satisfaisants pour la réalisation de l'invention sont par exemple l'indium et notamment l'indiumlll ou l'iode et en particulier l'iodel31 (131I) , l*iodel25 (15I) et l'iode 123 (123I) .
Ces marqueurs radioactifs sont intéressants dans le cas où les mesures de radioactivité faites à la suite de l'exploration au niveau du malade, dans le cas du diagnostic d'un éventuel rejet de greffe, sont réalisées au moyen d'une gamma-scintigraphie.
L'invention concerne donc un procédé pour le marquage de fragments d'anticorps déterminés par une substance radioactive choisie, comprenant les étapes suivantes :
- mise en contact des fragments d'anticorps que l'on veut marquer, avec un réactif capable de former un complexe stable avec le marqueur et susceptible d'être couplé aux fragments d'anticorps, dans des conditions permettant ce couplage et,
- complexation des fragments ainsi couplés avec le marqueur.
Selon une variante de ce procédé de marquage, l'étape de complexation du réactif avec le marqueur, précède l'étape de couplage avec les fragments d'anticorps. Cette variante peut par exemple être avantageusement utilisée lorsque l'on souhaite effectuer un marquage avec le technetium.
Selon une autre variante du procédé de marquage, une étape de purification, par exemple par filtration sur gel, peut précéder la récupération des fragments d'anticorps.
Un mode de réalisation avantageux du marquage au technetium met en oeuvre du technetium réduit (par exemple par réaction de l'ion stanneux sur la forme pertechnétate Tc04') puis complexé avec un agent chélatant faible par exemple un agent de type pyrophosphate di-, tri- ou tétraphosphonate (A Bardy, brevet FR 7427249) ou des composés IDA (iminodiacétique) .
L'agent chélatant est ensuite échangé par l'anticorps, ligand plus fort. Les atomes "Te réduits se lient directement aux groupements donneurs de l'anticorps par des sites de faible affinité, forte capacité (groupements amino, carboxylate...) , et par des sites de forte affinité, faible capacité (groupements sulfhydrile) . Cette deuxième forme des complexes est très stable in-vivo et constitue un mode de réalisation préféré.
A titre d'exemple, un procédé de marquage de fragments Fab' d'anticorps avec le technetium peut être réalisé comme suit:
- mise en contact de fragments Fab' d'anticorps avec un agent chélatant faible du type évoqué ci-dessus, dans un tampon, par exemple un tampon phosphate-EDTA, dans une solution physiologique de sel de sodium à un pH appartenant à un intervalle 5 à 8, de préférence à un pH 6,0 et à température ambiante,
- addition de Tc0" dans des proportions de 1 à 30 mCi dams des conditions autorisant le marquage.
Lorsque les fragments d'anticorps ne peuvent être directement liés au technetium, par exemple en l'absence de groupements sulfhydrile libres, l'étape de mise en contact ci-dessus peut être réalisée en utilisant un réactif capable de complexer fortement le technetium et susceptible d'être facilement couplé aux fragments d'anticorps. Peuvent être utilisés comme réactifs, des acides polyaminocharboxyliques, par exemple 1'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DTPA) , des analogues de l'acide éthylenetriaminatetraacétique (EDTA) , des composés diaminodithiols, triaminothiols (ex : les (thioacétamide/ pentanoile) des aminés polycycliques des dithiose icarbozones et des étallothionines ou des anhydrides de ces acides, notamment des anhydrides cycliques. Ces agents chélatants sont préparés par des méthodes connues. Pour le marquage au technetium, on pourra par exemple se référer à la publication Eckelman et al Nucl, Med. Bid. vollβ n" 2, pp 171-176, 1989.
Pour effectuer le marquage à 1•indium 111 on peut utiliser un agent chélatant bifonctionnel couplé aux fragments d'anticorps, qui va ensuite complexer fortement 1*indium.
Pour le couplage à l'anticorps, le DTPA peut être activé sans la forme d'anhydride bicyclique, d'anhydride mixte (DTPA-isobutylchloroformate) de chlorure d'acide ou, les formes suivantes peuvent être synthétisées SCN-benzyl DTPA, B^CHg)., benzyl DTPA (avec n=2, 3, 4) N2 - benzyl DTPA.
A titre d'exemple, un procédé de marquage de fragments Fab' ou F(ab')2 avec 1»indium peut être réalisé comme suit :
- mise en contact des fragments d'anticorps en solution avec un agent chélatant déterminé, par exemple l'anhydride bicyclique de DTPA solubilisé dans un rapport molaire agent chélatant/fragment 2 à 10, de préférence de 5,0 ,
- puis l'élimination de l'agent chélatant n'ayant pas complexé les fragments d'anticorps, mise en contact des fragments complexés avec 1'indium dans une solution tamponnée à pH 4 à 6, de préférence à pH 5,0 dans des conditions autorisant le marquage., 12
Pour les techniques de marquage on pourra, de façon générale, se référer aux pubications suivantes : Childs et al (J Nucl Med 26 : 293-299, 1985), Hosotani et al (Nucl Med Biol vol 13 n* 6 pp 603-609, 1986), Fritzbetg et al (PNAC USA vol 85 pp 4025-4029, Juin 88), Brbwn et al (Analytical Biochemistry 172, 22-28, 1988) . On pourra également se référer à la demande de brevet EP 0263046 du 16 septembre 1987 (priorité' FR 8613146) .
Entrent également dans le cadre de l'invention, des compositions caractérisées en ce qu'elles ont la capacité d'induire la formation de complexes du type antigène-anticorps chez un patient présentant des leucocytes activés pouvant marquer un risque de rejet de greffe, en ce qu'elles sont dépourvues de cette capacité chez un patient ayant subi une greffe et ne subissant pas de rejet au moment de l'examen et, en ce qu'elles comprennent des fragments d'anticorps tels que décrit ci-dessus.
Une composition préférée répondant à la définition précédente est capable d*induire la formation de complexes du type antigène-anticorps en présence de leucocytes activés du receveur de la greffe, ces leucocytes étant porteurs de chaînes TAC du récepteur humain de 1*11-2.
Etant donné leurs propriétés caractéristiques, les fragments précédemment définis ainsi que les compositions décrites peuvent entrer dans la composition d'un réactif dépourvu de toxicité pour l'homme, pour la mise en évidence de la présence de leucocytes activés, chez un patient susceptible de présenter un rejet de greffe, ces fragments étant marqués par un marqueur compatible avec l'administration chez l'homme et répondant aux critères ci-dessus. Ce réactif peut être utilisé dans le cas de différentes greffes telles que des greffes de coeur, de rein, de moelle.
L'inocuité du réactif est déterminée en fonction des critères classiquement utilisés: il doit notamment être apyretique, non cancérigène, contenir moins de 10% d'ADN étranger, être non pyrogène, stérile, dépourvu de micro-organismes et autres agents étrangers.
Le réactif ci-dessus peut être appliqué pour détecter chez l'homme ou l'animal la présence de leucocytes activés en particulier de lymphocytes activés, par différentes méthodes de mesure par gamma scintigraphie.
Une première méthode préférée pour la détection de lymphocytes activés est 1'i munoscintigraphie en particulier la gamma-immunoscintigraphie.
A cet égard l'invention concerne une méthode d'exploration non sanglante applicable chez l'homme ayant subi une greffe, pour rechercher la présence de leucocytes activés, cette présence étant susceptible d'être ultérieurement corrélée avec un rejet de greffe, comprenant la détermination de la présence de leucocytes activés chez un sujet greffé au moyen d'un support extérieur au corps du sujet, le sujet ayant reçu au préalable des fragments d'anticorps ci-dessus décrits, préalablement marqués si besoin, ou la composition dont les fragments ont été préalablement marqués ou le réactif décrit ci-dessus, caractérisé en ce que les fragments d'anticorps, cette composition ou ce réactif sont administrés en quantité suffisante pour permettre une réaction avec la chaîne TAC du récepteur de l'Il-2, lesdits fragments étant marqués avec une substance physiologiquement acceptable, capable de donner un signal mesurable à 1'extérieur du corps humain, notamment au moyen d'un appareil de comptage de la radioactivité.
L'application du procédé précédent permet d'obtenir des images en scintigraphie représentant la quantité de fragments d'anticorps liés aux chaînes des récepteurs visés sur les leucocytes infiltrant le greffon.
D'autres étapes consistant dans la mesure de la radioactivité du marqueur obtenue ainsi que la comparaison de cette mesure, avec des données caractéristiques d'un état d'absence de rejet de greffe, peuvent permettre de détecter un niveau anormal d'activation des leucocytes notamment des lymphocytes et conduire au diagnostic d'une éventualité de rejet de greffe.
La méthode d'exploration ci-dessus présente l'avantage tout à fait intéressant de pouvoir être appliquée à des situations cliniques, de façon précoce.
Elle est notamment utile pour la surveillance de patients ayant subi une greffe hétérologue.
Cette méthode présente également l'avantage d'être non traumatisante pour le patient.
L'invention concerne également un procédé d'obtention de fragments d'anticorps monoclonaux répondant aux définitions ci-dessus comprenant les étapes suivantes : purification d'anticorps monoclonaux dont on souhaite obtenir lesdits fragments, digestion par une ou plusieurs enzymes protéolytiques déterminées, choisies en fonction de la nature des fragments anticorps recherchés, dans des conditions autorisant la coupure desdits fragments du reste des anticorps. - isolement et récupération des fragments d'anticorps obtenus.
A titre d'exemple un procédé de préparation de F(ab')2 peut être réalisé comme suit : purification d'anticorps monoclonaux dont on souhaite obtenir lesdits fragments, digestion par une ou plusieurs enzymes protéolytiques déterminées, par exemple la pepsine, dans des conditions autorisant la coupure desdits fragments du reste des anticorps, notamment à une température de 37*C ± 10 en présence de 0,5 à 10%, de préférence 1 à 5% de pepsine à pH acide notamment entre 3,4 et 5, avantageusement entre 3,2 et 4,5,
- isolement et récupération des fragments d'anticorps obtenus.
Pour le marquage avec la pepsine, on pourra se référer à la publication Lamoyi (J. Imminol Meth, 1983 vol. 56, p 235-243) .
Dans un autre mode de réalisation du procédé de l'invention, la digestion est par exemple réalisée à l'aide de papaîne et elle conduit à des fragments Fab.
Pour préparer les fragments Fab, on peut par exemple suivre le protocole précédent en modificant les conditions opératoires : le pH de la réaction est de préférence basique (de préférence 7,8), on opère avantageusement en présence de NaCl et d'un agent réducteur, par exemple la cystéine 0,1 M. La réaction peut être faite pendant 2 à 4 h.
L'invention concerne également un kit pour l'exploration chez un patient ayant subi une greffe, de la présence de leucocytes activés, caractérisé en ce qu'il comprend: des fragments d'anticorps tels que définis précédemment, - un marqueur physiologiquement acceptable, capable de donner un signal mesurable à l'extérieur du corps humain, notamment au moyen d'un appareil de comptage de la radioactivité,
- le cas échéant un réactif autorisant la liaison entre le fragment d'anticorps et le marqueur, ou stabilisant cette liaison.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples et les figures qui suivent.
Figure 1: biodistribution d'anticorps monoclonaux intacts 125I 0X39 et 131I B1G6 chez des animaux ayant reçu une greffe allogénique. Les mesures ont été faites 5 jours après la transplantation et 24 heures après l'injection intraveineuse d'anticorps. Figure 2: Biodistribution de fragments F(ab')2 de l'anticorps 0X39 dirigé contre le récepteur de l'I12 et d'un anticorps B1G6 utilisé en tant que contrôle, 24 heures après l'injection. La radioactivité du coeur greffé et du coeur d'origine a été mesurée 5 jours après une greffe de coeur allogénique et hétérotopique (LEW/BN) chez des animaux de type LE , ou une greffe de coeur syngénique chez des animaux de première génération (FI) de type (LEW/BN) . Les résultats sont exprimés en pourcentage de doses injectées par gramme. Figure 3: Résultats des études de la biodistribution de fragments F(ab*)2 de l'anticorps monoclonal 0X39 et de fragments F(ab')2 de l'anticorps B1G6 chez des receveurs de greffes hétérotopiques du type allogénique ou syngénique. La radioactivité a été mesurée de 7 à 24 heures après l'injection intraveineuse des fragments d'anticorps. Figure 4: Immunσscintigraphie chez des rats de l'espèce LEW, 4 jours après une transplantation hétérotopique soit syngénique ou allogénique d'un organe d'un animal de première génération (F-,) résultant d'un croisement LEW/BN ((LEW/BN)F,) et 24 heures après une injection intraveineuse de fragments F(ab')2 131I 0X39. Le temps d'acquisition des données était de 10 minutes pour chaque image chez des receveurs préalablement anesthésiés. Tous les animaux ont ensuite été sacrifiés pour les études de biodistribution. Les études en imagerie et les études de biodistribution ont été faites sur des receveurs différents.
A/ Chez des receveurs de type LEW, de transplantation hétérotopique d'organe obtenu chez un animal du type LEW/BN)F»j, le coeur rejeté a pu clairement être visualisé (voir la flèche) . Les deux autres taches correspondent à la thyroïde (tache supérieure) et aux voies urinaires.
B/ Dans le cas d'une transplantation orthotopique de type syngénique (LEW/LEW) le coeur transplanté n'était pas visualisé alors que la radioactivité au niveau de la thyroïde subsistait. Aucune radioactivité de la vessie n'a été notée, ce qui correspond probablement à une miction.
C/ Dans des combinaisons de type (LEW/BN)F-j, LEW, ayant reçu une injection de fragments 131I-B1G6 F(ab*)2, la radioactivité de la thyroïde avait diminué de façon inexplicable par rapport au texte réalisé dans les cas A et B, bien qu'il n'y ait aucune visualisation de l'allogreffe hétérotipique.
Figure 5: Tableau 1: Les rapports de la radioactivité d'un coeur allogène greffé par rapport au tissu du receveur sont donnés pour des fragments F(ab')2 de l'anticorps 131I 0X39 ou de l'anticorps B1G6, 7 heures et 24 heures après l'injection de la substance radioactive chez 4 animaux différents. Des fragments
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18 F(ab')2 dirigés contre le récepteur de l'Il2 se sont accumulés de façon spécifique dans le greffon rejeté alors que ce n'est pas le cas dans le propre coeur du receveur.
EXEMPLE 1
MATERIEL ET METHODE
1/ Transplantation
Des allogreffes de coeur étérotopiques ont été réalisées selon la méthode Ono et al (J.Thorac- cardiovasc-Surg 1987; 57:225) dans des rats d'espèce LEWIS et d'espèce (LEW/BN)F», (Soulillou JP et al. Transplantation 1988; 38:63). Des greffes syngéniques de contrôle de type LEW-LEW ont également été utilisées comme témoins. Les battements du coeur greffé ont été suivis chaque jour et seuls les receveurs présentant une bonne fonction du greffon à différents moments d'une injection avec un anticorps monoclonal ont été utilisés. 2/ Anticorps monoclonaux
0X39 est un anticorps monoclonal de souris de la classe des IgGl dirigé contre la chaîne TAC (55Kd) du récepteur de 1•Interleukine-2 du rat et qui reconnaît cette chaîne avec une affinité de 2nM. Il a été décrit dans l'article "Transplant. International" (1988, 1:58-63). Il n'interagit pas avec la chaîne β et ne modifie pas la réponse immune du receveur sur le greffon car dans ce cas particulier, il ne bloque pas l'interaction de l'IL2 sur le récepteur en conformation dite de "haute affinité" (association α
Un anticorps monoclonal de souris spécifique de la microglobuline B2 humaine (B,G6) , obtenu auprès de Immunotech, Luminy France a été utilisé comme anticorps monoclonal témoin non spécifique, IgG1 de souris. Les anticorps mono lonaux ont été obtenus à partir d'ascites induits par des hybridomes, les hybridomes étant eux-mêmes obtenus de PHLS Center for Applied Microbiology and Research (Division de Biology) Porton Down, Falisbury (UK) , pour 0X39. Ces anticorps ont été purifiés sur une colonne Affigel Protéine A. Les fragments respectifs F(ab')2 de ces deux anticorps monoclonaux ont été préparés par digestion avec la pepsine. Les anticorps monoclonaux ont été dialyses pendant une nuit contre un tampon d'acétate 0,05M, à pH3,8 puis ont été digérés avec la pepsine (Cooper Biomédical) 1% (w/ ) pendant 5 heures à 37βC. La réaction a été stopée par addition de tampon Tris 2,5M pour obtenir un pH 8. Les fragments F(ab»)2 ont été isolés sur Sephadex G150 (Pharmacia) et sur Protéine A Sépharose (Pharmacia) . Les fractions F(ab')2 présentaient un degré de pureté de 95 à 98% après électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS. 3/ Marquage
Les anticorps intacts et les fragments F(ab')2 ont été marqués avec 13I ou 125I. L'iodation a été réalisée en utilisant la méthode iodogène décrite par Fraker (PJ et al.Biochem Biophis Res Commun 1978 ; 80:849 conduisant à une activité spécifique de 5 μCi/μg d'anticorps. En résumé, une partie aliquote (50μl) de solution de chlorure de méthylène contenant lOμg de iodogène (Pierce) a été évaporée totalement dans un tube test. L'iode, mélangée avec différentes quantités d'anticorps a été ajoutée au tube et la réaction a été conduite pendant 10 minutes à 0-2"C. La protéine marquée a ensuite immédiatement été purifiée par chromatographie sur colonne de verre Biogel 2 (Biorad) et éluée avec un tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,3% de sérum albumine bovine. 20 4/ Biodistribution des anticorps monoclonaux marqués à l'aide d'un marqueur radioactif chez les rats porteurs de greffe.
Les rats ont reçu différentes quantités d'anticorps monoclonal marqué (20-100-300μg/rat) d'activité spécifique déterminée, 4 ou 5 jours après la transplantation cardiaque hétérotopique. Une injection intraveineuse de 125I-OX39 et l31l-B»jG6 a été faite avec une solution de 0,2ml d'anticorps monoclonal dans le PBS. Les rats ont été sacrifiés par dislocation cervicale à différents intervalles de temps après l'injection intraveineuse. Tous les organes et le coeur greffé du récepteur ont été prélevés immédiatement, lavés et pesés. La radioactivité (CPM/gramme) de chaque isotope a été déterminée en utilisant un compteur gamma à plusieurs canaux permettant l'enregistrement simultané de l'émission 131I et 125I. Les résultats sont exprimés en pourcentage de doses injectées par gramme de tissu. Pour chaque point, une moyenne des valeurs obtenues à partir de 3 rats a été prise en considération et les résultats sont donnés par valeur ±SD (Standard Déviation) pour chaque groupe d'animaux. Le rapport spécifique d'anticorps monoclonal 0X39 par rapport à l'anticorps monoclonal B»jG6 a été estimé par la mesure de l'index de localisation (tissu 131I/125I : sang 131I/125I) tel que l'ont décrit Moshakis et al (Br J.Cancer 1981 ; 43:475).
Lorsque des fragments F(ab')2 ont été utilisés l'index de localisation a été calculé en utilisant les rapports allogreffe/coeur et allogreffe/autre organes pour chaque rat ayant reçu des fragments F(ab'). 5/ Gamma-scintigraphie
Pour les études de l'image, lOOμg de fragments
131IF(ab*)2 d'anticorps monoclonaux (activité spécifique 5μCi/μg) ont été injectés aux receveurs d'allogreffe. La fonction thyroïdienne n'a pas été bloquée par l'iode froide. Les rats ont été anesthésiés et placés sous un colimateur. Les images ont ensuite été obtenues (10 minutes de scanner) en utilisant une caméra à scintillation à large champ (Searle Siemens, LFOV) avec un colimateur à trou d'énergie parallèle, avec un interface avec un ordinateur (SIMIS III, SOPHA MEDICAL).
RESULTATS
1/ Biodistribution d'anticorps 0X39 marqués, intacts Au cours d'expériences préliminaires, on a déterminé quelle était la dose la plus favorable en utilisant différentes doses d'anticorps marqués (30-100-300 μg/rat) testées pendant 24 heures après injection intraveineuse d'anticorps monoclonal. On a ensuite choisi d'utiliser une dose de lOOμg/rat avec une activité spécifique de 5μCi/μg. De plus les schémas de biodistribution des anticorps monoclonaux mis en évidence lorsque les tissus étaient étudiés pendant 24 à 48 heures après l'injection d'anticorps monoclonaux étaient relativement similaires. Les analyses faites 72 heures après injection des F(ab')2 apportaient moins d'information.
La figure 1 montre la biodistribution de lOOμg d'anticorps monoclonal 125I-0X39 (5μCi/μg) mesurée dans le sang et dans plusieurs tissus du receveur 24 heures après l'injection intraveineuse d'anticorps monoclonaux et 5 jours après la transplantation. Le pourcentage d'anticorps 125I-OX39 concentrés dans l'allogreffe constituait environ 0,6% de la radioactivité totale injectée. Bien que l'activité soit plus haute dans le greffon que dans les autres tissus et le coeur propre au receveur, la distribution des valeurs n'était pas significativement différente de celle obtenue avec l'anticorps non spécifique 131i- B»|G6. La radioactivité des poumons était comparable à celle du greffon rejeté alors que le foie, la rate et les intestins présentaient des valeurs intermédiaires.
Une dose faible a été trouvée dans les muscles, le cerveau et les os. La radioactivité des reins résultait probablement d'une concentration au niveau du tissu et d'une filtration des anticorps 125I-OX39 dégradée. Exprimés sous forme d'index de localisation de spécificité (LI comme indiqué dans Matériel et Méthode) qui ont pris la radioactivité du sang en compte, les résultats montrent une faible discrimination de 125I-0X39 comparés aux anticorps non spécifiques pour l'organe rejeté (LI:1,25 ± 0,2). Ces données suggèrent que la majorité des anticorps monoclonaux anti IL2 a été captée par les tissus riches en macrophages et/ou complexée par la forme soluble des récepteurs de l'IL2. Le taux de radioactivité du coeur (coeur allogreffé/coeur du receveur) (figure 1) déterminé avec à la fois 0X39 et B1G6 (respectivement 1,95 et 1,12) suggère qu'il y a eu une forte affluence des cellules portant le récepteur pour la partie Fc de l'anticorps et le récepteur pour le complément dans le greffon dès le quatrième jour après la transplantation. 2/ Biodistribution des fragments F(ab')9
La figure 2 montre la distribution de fragments 125I-OX39 et 131I B1G6 dans le greffon et dans le coeur de receveurs ayant subi une greffe allogénique ou une greffe syngénique 24 heures après l'injection. Dans ces expériences, lOOμg (5μCi/μg) de fragments F(ab')2 ont été injectés dans des rats séparés et la biodistribution a été étudiée 7 et 24 heures après l'injection des produits marqués. Par contraste avec ce qui a pu être observé en utilisant des molécules intactes (figure 1), les fragments 0X39 F(ab')2 se sont accumulés de façon significative dans le greffon rejeté des receveurs d'allogreffes, alors que la radioactivité trouvée en cas de greffe syngénique n'était pas différente de celle du coeur propre au receveur. Les fragments F(ab')2 de B1G6 ont présenté à peu près la même liaison dans le cas des coeurs de receveurs de greffes orthotopiques et hétérotopiques (allogéniques) (figure 2) .
La figure 3 montre que les niveaux d'activité spécifique des tissus, mesurés chez les animaux ayant reçu une injection de fragments F(ab')2 étaient beaucoup plus faibles que ceux obtenus avec des anticorps monoclonaux intacts. De plus, le rapport de la radioactivité greffon sur celle du poumon du foie ou de la rate augmentait de façon marquée pour les fragments F(ab')2 de 0X39, ce qui indique probablement une captation par l'intermédiaire des récepteurs des fragments Fc. Le tableau 1 (Figure 5) donne les taux de radioactivité du coeur allogreffé par rapport au coeur du receveur ou d'autres tissus du receveur, obtenus 7 et 24 heures après l'injection des fragments F(ab')2, indiquant préférentiellement la localisation des produits anti I12-R dans l'organe rejeté comparé au propre coeur du receveur.
3/ Gamma immuno-scintigraphie: Compte tenu des différentes quantités de radioactivité accumulées dans le propre coeur de 1*animal et dans 1•organe greffé allogénique rejeté, on a cherché à visualiser par immunoscintigraphie l'accumulation des cellules dans le greffon présentant des récepteurs pour 1•IL2. Pour ces expériences, les fragments F(ab')2 de 0X39 et B»jG6 ont été marqués avec 131I et injectés dans des animaux différents indépendamment des expériences de biodistribution. La scintigraphie a été réalisée sur des rats anesthésiés 3, 4 et 5 jours après la transplantation de receveur de type LEW avec soit un coeur allogénique (LEW/BN)F1 ou syngénique (LEW). La figure 4 montre que 24 heures après l'injection de fragments F(ab')2 de 131I-OX39, un signal net peut être obtenu chez le receveur d'une allogreffe (dès le 4ème jour après la transplantation) alors que seul un très faible signal peut être visualisé chez les receveurs de greffes syngéniques ou chez les receveurs de greffes allogéniques recevant des fragments F(ab')2 non spécifiques. DISCUSSION
Ces résultats mettent en évidence que de faibles quantités de 0X39 marqués sont localisées dans le greffon lorsque l'anticorps est injecté 5 jours après la transplantation, au moment où le rejet d'une greffe allogénique est susceptible de se produire, lorsqu'il n'y a pas de lésions vasculaires endommageant la vascularisation du greffon. Etant donné que 0X39 est faiblement efficace dans l'inhibition de la croissance des lymphocytes T, il n'interfère probablement pas avec la localisation et les quantités de cellules positives pour les récepteurs d'IL2 chez le receveur pendant la période de 24 heures suivant l'injection. De façon tout à fait intéressante dans cette série d'expériences, la biodistribution d'anticorps monoclonaux de contrôle (IgG^ était pratiquement similaire pour ce qui concerne la distribution à celui de 0X39, même au niveau du greffon. En revanche le propre coeur du receveur montrait une radioactivité beaucoup plus faible.
Ceci suggère que la majorité des anticorps monoclonaux intacts se lie au greffon rejeté par leurs segments monomorphiques Fc. Cette liaison était probablement due aux macrophages qui infiltraient le greffon pendant le rejet. Les profils de distribution n'ont pas subi de variations en fonction de la dose d'anticorps monoclonaux marqués mais la radioactivité spécifique du greffon était maximale 24 heures après l'injection et déclinait après. Par contraste, les fragments F(ab') 0X39 ont été liés spécifiquement uniquement sur le coeur allogénique alors que les fragments F(ab')2 contrôles présentaient un schéma de distribution similaire dans les greffons allogéniques et syngéniques.
On a donc mis en évidence que dans la situation d'une greffe allogénique, la majorité des fragments marqués est liée aux cellules circulantes présentant des récepteurs à l'IL2 dans la mesure où seule une faible fraction des fragments radioactifs sont retrouvés dans le rein. Ces lymphocytes activés hors de greffon représentent seulement une petite fraction de l'ensemble des lymphocytes mais qui correspond néanmoins à un grand nombre de lymphocytes cibles. Cette liaison hors du greffon cardiaque peut jouer un rôle dans l'effet biologique des anticorps anti¬ récepteurs de 1*112. Ils peuvent en particulier interférer avec les cellules activées dirigées contre le donneur, cellules recirculantes du greffon vers les ganglions lymphathiques, la rate et vice-versa. Les cellules activées circulantes peuvent également compter pour une fraction de la localisation des fragments F(ab') dans d'autres organes tels que la rate, le foie et les poumons. De plus, la forme soluble des récepteurs de 1*I12 est également capable de se lier aux anticorps monoclonaux anti I12-R. Il est possible que son augmentation pendant le rejet augmente la fraction complexée des fragments F(ab')2 de 0X39 à l'extérieur du greffon. Une analyse en immunoscintigraphie a montré qu'après l'injection de fragments F(ab')2 de 0X39 marqués avec 131I, la fraction d'anticorps se liant aux cellules présentant des récepteurs de 1*112 et infiltrant la greffe, pouvait être mesurée et visualisée par cette méthode. Conformément au résultat de la biodistribution obtenus avec des fragments F(ab')2 anti IL2-R, l'image obtenue en gamma-scintigraphie était uniquement positive dans le cas de combinaison allogénique et non dans le cas de combinaison syngénique. De façon tout à fait intéressante, l'image obtenue dans le cas d'une greffe allogénique était facilement détectable dès le 4ème jour après la transplantation, ce qui représente un stade précoce de rejet et correspond à un moment où probablement moins de 20% des cellules infiltrant la greffe présentent des récepteurs d'IL2.
Lorsque cette méthode est appliquée à l'homme, l'interférence possible d'autres paramètres liés à la situation clinique tel qu'un traitement à la cyclosporine (CyA) qui peut diminuer la transcription des gènes du récepteur de l'IL2 ainsi que la concentration de lymphocytes dans l'organe rejeté doit être pris en compte. Le volume de tissus environnants peut également jouer un rôle dans la facilité de 1'enregistrement. EXEMPLE 2
PROTOCOLE APPLICABLE CHEZ UN PATIENT AYANT SUBI UNE GREFFE POUR RECHERCHER LA PRESENCE DE LEUCOCYTES ACTIVES
L'anticorps utilisé dans cette étude est l'anticorps 33B3.1 commercialisé par Immunotech sous la référence 317 et décrit par le Mauff et al (Hum.
Immunology, 1987, 3), 53-68) et par Olive et al, 1986 (Eur Journal of Immunology n* 10 p. 611-616) . Les fragments Fab de cet anticorps est marqué au technetium 99m.
Ces fragments Fab sont marqués par addition d'une solution stérile apyrogene de marqueur radioactif. Une chromatographie sur papier du produit marqué est effectuée avant l'injection pour déterminer la pureté radiochimique. Le pourcentage obtenu doit être supérieur à 90% pour que le produit soit injecté.
1/ Population
Les patients sont des greffés cardiaques ayant subi une greffe au moins 10 jours auparavant et donc sortis du secteur stérile.
2/ Imagerie
Il est prévu 4 scintigraphies, (et éventuellement d'autres) couplées à des biopsies dans les périodes de haut risque de rejet: 15, 30, 45 et 60 jours après la transplantation. A la seconde injection, ces scintigraphies sont faites systématiquement après contrôle de l'absence d'anticorps anti-Fab'-33B3.1. L'interprétation est effectuée par des observateurs.
Les critères de positivité sont définis par la localisation myocardique et l'intensité de fixation à l'aide d'un comptage par rapport à un échantillon.
3/ Toxicité
Des réactions anaphylactiques sont toujours possibles quand des anticorps sont injectés. Elles impliquent la disponibilité de mesures de réanimation.
Les examens de laboratoires sont effectués avant et 24 heures après l'injection: paramètres hématologiques: hémoglobine, hématochrite, globules rouges, globules blancs (PN,PEo,B,Ly) , plaquettes.
- ionogramme sanguin: sodium, potassium, chlore, protides, calcium, glucose, creatinine, urée. L'irradiation reçue par chaque patient est d'environ 250mRad pour chaque injection.
4/ Paramètres à considérer
Les mesures obtenues devront prendre en compte de l'importance de la population lymphocytaire au sein du greffon. En effet chez le rat non traité à J+4 de la greffe, 10% à 25% des cellules infiltrant le greffon sont R-IL2+. Chez l'homme ce taux serait de 7% (+/- 8) en sachant que la cyclosporine A diminuerait de 50% l'expression du récepteur. EXEMPLE 3
MARQUAGE DE FRAGMENTS Fab' DE L'ANTICORPS 3BB3.1 AVEC LE TECHNETIUM99m
Dans un flacon contenant le lyophylisat d'étain- pyrophosphate (Sn: 0,048mg- Pyrophosphate l,16mg) on ajoute lmg de fragments d'anticorps 33B3.1Fab* à l,2mg/ml (en tampon phosphate 0,1 M pH 6,0 - EDTA 5 mM) . Le volume est complété à 1ml avec NaCl 9%.. Le flacon est agité, puis le Tc04" est ajouté (1 à 2 mCi) . On laisse en contact 1 heure à température ambiante. EXEMPLE 4
MARQUAGE DE FRAGMENTS Fab' et F(ab'), de l'anticorps 33B3.1 avec l'INDIUMlll
A 20mg de fragments F(ab')2 ou F(ab') d'anticorps 33-B-3.1 en solution dans du bicarbonate de sodium 0,1 M à la concentration de 5.10 mg/ml est additionné de l'anhydre bicyclique de DTPA solubilisé dans du DMSO anhydride dans un rapport molaire anhydride DTPA/Anticorps de 5,0 ; la solution est agitée 15 minutes à température ambiante.
Le DTPA non couplé aux anticorps est éliminé par filtration sur gel en utilisant une colonne de séphacryl HR200 (1cm x 30cm) éluée en NaCl 0,15 M. Le nombre moyen de DTPA couplé par anticorps est de 2,0. Pour le radiomarquage au chlorure d'indium, les ar icorps couplés au DTPA sont tamponnés à pH 5,0 en utilisant un tampon acétate 0,1 M pH 5,0. A cette solution est ajoutée la quantité d'indium111 chlorure désirée. Après agitation 30 minutes à température ambiante le rendement de marquage est supérieur à 90%.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Fragments d'anticorps monoclonaux, dirigés contre des récepteurs présents sur les cellules de type leucocytaire infiltrant un greffon, caractérisés par:
- l'absence de fraction constante (Fc) ,
- leur capacité à se fixer spécifiquement à l'épitope d'un site antigènique d'un récepteur des cellules leucocytaires infiltrant le greffon lors d'un rejet de greffe.
2/ Fragments d'anticorps selon la revendication 1, constitués par le fragment idiotypique d'un anticorps, ledit fragment idiotypique possédant un site anticorps spécifique d'un épitope d'un site antigènique d'un récepteur humain déterminé, accessible au niveau d'un greffon chez un patient présentant un rejet de greffe. 3/ Fragments d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un site anticorps présentant une affinité avec la chaîne TAC du récepteur humain de l'Il-2.
4/ Fragments d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'il s'agit de fragments F(ab')2 capables de reconnaître la chaîne TAC du récepteur humain de l'Il-2.
5/ Fragments d'anticorps, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'il s'agit de fragments F(ab') capables de reconnaître la chaîne TAC du récepteur de 1*11-2.
6/ Fragments d'anticorps, selon l'une quelconque des revendicati.ons 1 à 3, caractérisés en ce qu'il s'agit de fragments F(ab) capables de reconnaître la chaîne
TAC du récepteur de l'Il-2.
7/ Fragments d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'ils sont marqués avec une substance physiologiquement acceptable, capable de donner un signal mesurable à l'extérieur du corps humain, notamment au moyen d'un appareil RMN ou d'un appareil de comptage de la radioactivité.
8/ Fragments d'anticorps selon la revendication 7, caractérisés en ce qu'ils sont marqués avec une substance physiologiquement acceptable, radioactive telle que le technetium99m.
9/ Fragments d'anticorps selon la revendication 7, caractérisés en ce qu'ils sont marqués avec une substance physiologiquement acceptable radioactive telle que l'iodel31, l'iodel25 ou l'indiumlll. 10/ Fragments d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisés en ce qu'il s'agit des fragments de l'anticorps 33B3.1.
11/ Composition caractérisée en ce qu'elle a la capacité d'induire la formation de complexes du type antigène-anticorps, chez un patient présentant des leucocytes activés pouvant marquer un risque de rejet de greffe en ce qu'elle est dépourvue de cette capacité chez un patient ayant subi une greffe non rejetée et, en ce qu'elle comprend des fragments d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pris isolément ou en mélange. 12/ Composition selon la revendication 11, capable d'induire la formation de complexes du type antigène- anticorps en présence de leucocytes activés du receveur, porteurs de chaînes TAC du récepteur humain de l»Il-2.
13/ Réactif dépourvu de toxicité pour l'homme pour la mise en évidence de la présence de leucocytes activés, chez un patient susceptible de présenter un rejet de greffe, caractérisé en ce qu'il comprend des fragments d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 ou une composition selon la revendication 12, dont les fragments sont marqués par une substance compatible avec l'administration chez l'homme, capable de donner un signal mesurable à l'extérieur du corps humain, notamment au moyen d'un appareil de comptage de la radioactivité.
14/ Méthode d'exploration non sanglante, applicable chez l'homme ayant subi une greffe, pour rechercher la présence de leucocytes activés, cette présence étant susceptible d'être ultérieurement corrélée avec un rejet de greffe, comprenant la détermination de la présence de leucocytes activés chez un sujet greffé au moyen d'un support extérieur au corps du sujet, le sujet ayant reçu au préalable des fragments d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 préalablement marqués si besoin, ou de la composition selon la revendication 10 ou 11, dont les fragments ont préalablement été marqués, ou un réactif selon la revendication 13, caractérisé en ce que les fragments d'anticorps, cette composition ou ce réactif sont administrés en quantité suffisante pour permettre une réaction avec la chaîne TAC du récepteur de l'Il-2, lesdits fragments étant marqués avec une substance physiologiquement acceptable, capable de donner un signal mesurable à l'extérieur du corps humain, notamment au moyen d'un appareil de comptage de la radioactivité,
15/ Procédé d'obtention de fragments d'anticorps monoclonaux selon 1'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 10, comprenant les étapes suivantes : purification d'anticorps monoclonaux dont on souhaite obtenir lesdits fragments,
- digestion par une ou plusieurs enzymes protéolytiques déterminées, choisies en fonction de la nature des fragments d'anticorps recherchés, dans des conditions autorisant la coupure desdits fragments du reste des anticorps,
- isolement et récupération des fragments d'anticorps obtenus.
16/ Procédé d'obtention de fragments d'anticorps monoclonaux selon la revendication 15, caractérisé en ce que la digestion est effectuée en présence de pepsine pour préparer des fragments d'anticorps F(ab')2, en présence de papaïne pour préparer des fragments F(ab) .
17/ Kit pour l'exploration chez un patient ayant subi une greffe, de la présence de leucocytes activés, caractérisé en ce qu'il comprend:
- des fragments d'anticorps selon l'une quelconque des' revendications 1 à 6 ou 10,
- un marqueur physiologiquement acceptable, capable de donner un signal mesurable à 1•extérieur du corps humain, notamment au moyen d'un appareil de comptage de la radioactivité,
- le cas échéant un réactif autorisant la liaison entre le fragment d'anticorps et le marqueur, ou stabilisant cette liaison.
18/ Procédé pour le marquage de fragments d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, par une substance radioactive choisie, comprenant les étapes suivantes :
- mise en contact des fragments d'anticorps que l'on veut marquer, avec un réactif capable de former un complexe stable avec le marqueur et susceptible d'être couplé aux fragments d'anticorps, dans des conditions permet tant ce couplage et,
- complexation des fragments ainsi couplés avec le marqueur, ou en variante. 34 - complexation dudit réactif avec le marqueur puis couplage dudit réactif complexé avec les fragments d*anticorps.
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