PT100235B - Proteinas receptores da superficie celular analogos polipeptidicos dos factores de coagulacao v e viii, anticorpos para os mesmos, moleculas de adn, processo para analise da presenca de um receptor da superficie celular e processo para controlar a resposta de um paciente - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo Técnico

O presente invento refere-se a uma nova classe de moléculas receptoras extracelulares homólogas aos factores de coagulação V e VIII humanos e às suas formas activadas. Descrevem-se as sequências de resíduos de aminoácidos dos receptores, bem como anticorpos imunorreactivos com as moléculas receptoras e conjuntos de diagnóstico associados.

Antecedentes

A reunião das actividades proteolíticas nas superfícies celulares inicia uma variedade de respostas biológicas essenciais. Os receptores de elevada actividade específicos coordenam tais interacções, protegem a protease da inactivação por inibidores extracelulares ubíquos e proporcionam o alinhamento espacial óptimo para a eficácia catalítica da enzima. A associação regulada das proteínas de coagulação e fibrinolíticas com uma variedade de células pode exemplificar bem estes mecanismos de interacções protease-célula especializadas [Miles, L. A., et al., Fibrinolvsis, 2:61 (1988); Morrissey, et al. , Cell, 50:129 (1987); Nesheim, Μ. E. , et al. , J. Biol. Chem., 254:10952 (1979)].

Contudo, tem sido cada vez mais claro gue as mesmas enzimas que participam na fibrinólise e na coagulação sanguínea também mediam funções biológicas adicionais e díspares. A trombina exerce um potente efeito mitogénico em vários tipos de células numa reacção especialmente coordenada por receptores celulares específicos, com surpreendentes analogias com os mecanismos de actividade de factor de crescimento mediada por hormona [Chen, L. Β., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72:131 (1975); Glenn,

K. C., et al., Nature, 278:711 (1979); Baker, J. Β., et al., Nature 278:743 (1979)]. Similarmente, o equilíbrio delicado entre a mitogénese, a transformação maligna, a expressão protoncogénica e a diferenciação celular tem mostrado ser profundamente influenciado pela actividade da protease [Unkeless, J. C., et al., J. Exp. Med., 137:85 (1973); Sullivan,

L. Μ., et al.. Cell, 45:905 (1986); e Fenner, F. et al. em The

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Orthopoxviruses, Academic Press

(San Diego) (1989)].

As várias reacções imuno-inflamatórias não são excepção. A ligação da uroquinase assim como da trombina aos seus receptores celulares complementares produz uma reacção quimiotáctica potente com acumulação local de neutrófilos e monócitos in vivo [Bovie, M.D.P., et al.. J. Immunol.. 139:169 (1987); Bar-Shavit, R., et al., Science, 220:728 (1983)]. Além disso, os inibidores sintéticos da protease têm mostrado diminuir ou abolir a lise de células alvo mediada por NK e CTL, assim como a síntese de monócitos e a libertação de TNF-α [Redelman, D., et al., J. Immunol.. 124:870 (1980); Chang, T. W., et al.. J. Immunol., 124:1028 (1980); Suffys, P., et al.. Eur. J. Biochem.. 178:257 (1988); Scuderi, P., J. Immunol., 143:168 (1989)].

Este conceito de uma participação mais directa das proteases nas funções celulares imuno-efectoras, específicas, tem sido recentemente mais reforçado pela identificação de uma família de serina-proteases relacionadas em clones NK e CTL citotóxicos [Masson, D., et al. . Cell. 49:679 (1987)]. Estas serina-proteases, denominadas granzimas [Jenne, D., et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:4814 (1988)] são compartimentadas em grânulos subcelulares juntamente com a proteína formadora de poro perforina e são localmente libertadas durante a exoeitose polarizada associada à formação de conjugados de endotélio:célula T [Masson, D., et al., J. Biol. Chem., 260:9069 (1985); Pasternack, M. S., et al., Nature. 322:740.12 (1986); Podack, E. R., et al., J. Exp. Med., 160:695 (1984)].

As várias granzimas partilham um grau notável de homologia com outras serina-proteases envolvidas na coagulação e fibrinólise, e particularmente com os factores de proteases de coagulação plasmática IXa e Xa, como revelado por clonagem molecular [Jenne, D., et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:4814 (1988); Gershenfeld, Η. K., et al., Science, 232:854 (1986); Jenne, D., et al., J. Immunol., 140:318 (1988); Lobe, C.

G., et al., Science, 232:858 (1986); Gershenfeld, Η. K., et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:1184 (1988)]. Embora se tenham

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233.0 (POR) -4- eF acumulado fortes evidências para um papel directo da perforina na lesão da célula alvo [Masson, D., et al.. J. Biol. Chem.. 260:9069 (1985); Duke, R. C., et al.. J. Exp. Med.. 170:1451 (1989)], a participação e o papel mecanístico das granzimas ou de outras serina-proteases no processo lítico permanece ainda pouco claro [Dennert, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:5004 (1987)].

A elucidação das estruturas e propriedades reactivas das granzimas e de outras serina-proteases irá provavelmente conduzir a uma melhor compreensão dos papéis biológicos desempenhados por estas entidades. Tal conhecimento podia proporcionar sondas de diagnóstico melhoradas para condições celulares anormais e novas ferramentas terapêuticas que invertem as doenças associadas.

Breve Sumário do Invento presente invento refere-se a uma nova classe de moléculas receptoras celulares. As moléculas receptoras são homologas a certos cofactores de coagulação, tais como os factores de coagulação V e VIII humanos. Funcionalmente, as moléculas receptoras ligam-se a ligandos serina-protease, tais como as proteínas circulantes factor Xa, factor IX/IXa e plasmina(plasminogénio). Uma molécula receptora preferida, referida aqui como EPR-1, é homóloga, mas diferente, do factor V humano e liga o factor Xa. São também contemplados os polipéptidos contendo uma sequência de resíduos de aminoácidos homóloga a EPR-1.

Uma concretização preferida do invento, é uma proteína purificada que possui um peso molecular de cerca de 78 kDa e uma sequência de resíduos de aminoácidos que compreende as seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:

(1) Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile;

(2) Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu;

(3) Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys;

(4) Val-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala;

(5) Gly-Val-Pro-Pro-Val-Val-Thr;

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233.0 (POR) -5- i (6) Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e (7) Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-Lys-

-Lys-His-Val-Glu—Pro—His-Ala—Thr, onde Xaa é um aminoácido não especificado, que pode estar na proteína como um qualquer resíduo de aminoácidos que ocorre naturalmente, incluindo um resíduo modificado ou pouco usual, por exemplo, glicosado. 0 resíduo Xaa pode ser idêntico, ou pode ser diferente do resíduo Xaa na molécula. Num outro aspecto preferido do invento, a proteína imunorreage com o anticorpo produzido pelo hibridoma designado por 12H1 (número de acesso ao ATCC HB 10637). Ainda num outro aspecto preferido do invento, a proteína é a proteína EPR-1 isolada da linha de células designada por MOLT13 #3 (número de acesso ao ATCC CRL 10638).

Uma outra concretização preferida do invento é um polipéptido compreendendo até cerca de 600 resíduos de aminoácidos que inclui uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada a partir do grupo de sequências (1)-(7) acima apresentado.

São também contemplados no invento um segmento de ADN que codifica uma proteína ou polipéptido como previamente definido e um vector, i.e., uma molécula de ADN auto-replicante, que inclui o segmento de ADN.

Num aspecto preferido do invento, é contemplada uma composição de anticorpos que imunorreage com uma proteína ou polipéptido do presente invento. Uma composição de anticorpos particularmente preferida é o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma 12H1. Uma outra composição de anticorpos preferida imunorreage com uma proteína isolada da linha de células MOLT13 #3, que possui um peso molecular de cerca de 78 kDa e inclui uma sequência de resíduos de aminoácidos anteriormente apresentada.

É também contemplado um processo para análise da presença de uma presente molécula receptora na superfície da célula. 0 processo compreende os passos de:

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(a) mistura de uma célula ou lisado	de células	que se sus-

peita expressar a molécula receptora com uma composição de anticorpos anteriormente descrita, tal como o hibridoma 12H1;

(b) manutenção da mistura durante um período de tempo suficiente para que se forme um produto de imunorreacção; e (c) determinação da presença de produto de imunorreacção e, assim, detecção da presença da molécula receptora.

É também contemplado um processo para controlar a resposta ao tratamento de um paciente que possui uma doença associada a uma proteína anteriormente descrita localizada nas células, numa amostra corporal retirada do paciente que é utilizada como marcador para o estado de doença. O processo compreende a análise do marcador utilizando uma composição de anticorpos anteriormente descrita, a repetição do ensaio depois de um período de tratamento e a determinação da resposta do paciente ao tratamento como função da quantidade daquela proteína da superfície da célula presente depois do tratamento. Um estado de doença exemplificativo controlado é a leucemia linfocítica crónica (CLL).

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 representa a análise por FMF (microfluorometria de fluxo) de monócitos ou PMN (leucócitos polimorfonucleares) com mAb 9D4 anti-EPR-1. As suspensões de monócitos foram preparadas a partir de PBMC (células mononucleares sanguíneas periféricas) por aderência a plástico pré-revestido com soro autólogo durante 1 hora a 37°C. Os PMN foram isolados por sedimentação com dextrano. As 1 x 10⁶ células foram coradas com 10 Mg/ml de mAb 9D4 durante 30 minutos em gelo, lavadas e depois incubadas com diluições a 1/20 de IgG anti-ratinho de cabra, conjugada com fluoresceína. As células foram lavadas e imediatamente analisadas por FMF. 0 mAb de controlo era o V82A6 irrelevante e é mostrado com uma linha a ponteado. A abcissa indica a intensidade de fluorescência numa escala 4 log. A ordenada indica o número de células.

A Figura 2 representa a modulação da expressão da EPR-1 ;·

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durante a activação das células T. As alíquotas de PBMC recentemente isoladas (10 x 10⁶) foram policlonalmente activadas por cultura na presença de 1 ^g/ml de PHA ou Con A durante 7 dias a 37°C. Para a expansão específica de antigénio, as suspensões de PBMC a 10 x 10⁶ foram separadamente cultivadas em culturas de linfócitos misturados (MLC) unidireccional com células Daudi ou Raji (10 x 10⁶) irradiadas (10 000 rad) durante 7 dias em CO₂ a 5% a 37°C. No fim da incubação, as células T responsivas foram colhidas, recuperadas por centrifugação sobre Ficoll-Hypaque, lavadas, coradas com alíquotas de mAb 12H1 mais IgG + IgM antiratinho de cabra, conjugadas com fluoresceína, e analisadas por FMF. A linha a ponteado indica a coloração de fundo com o mAb V82A6 irrelevante. A percentagem de células 12H1⁺ analisadas antes de cada mistura de incubação era de 6,7 ± 1,4%.

A Figura 3 representa o efeito da estimulação alorreactiva a longo termo na expressão de EPR-1. A MLC unidireccional foi colocada contra células Daudi irradiadas (10 000 rad) e mantida com transferências semanais e factor de crescimento de células T (TCGF) a 10%. As alíquotas de células T responsivas foram colhidas após vários intervalos de tempo (Dias = 0, 7, 15 e 32), recuperadas por centrifugação em Ficoll-Hypaque e analisadas por FMF utilizando mAb 12H1 anti-EPR-1 ou o anti-soro policlonal B78.9.

A Figura 4 representa a expressão da EPR-1 em linhas de células T transformadas, onde a análise por FMF de um conjunto de linhas de células T contínuas em cultura com mAb 7G12 antiEPR-1 foi realizada como acima descrito para a Figura 1. O mAb V82A6 irrelevante foi utilizado como controlo e é mostrado como uma linha a ponteado.

Descrição detalhada do invento

A. Definições

Sequência de resíduos de aminoácidos: uma série de dois ou mais resíduos de aminoácidos unidos através de ligações peptídicas entre os resíduos adjacentes para formar um péptido ou polipéptido. Uma sequência de resíduos de aminoácidos é

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SCR 0734P/SCRF

233.0 (POR) -8adequadamente representada pelas abreviaturas de uma ou três letras para os seus aminoácidos constituintes. As abreviaturas aqui utilizadas para os aminoácidos são aquelas fornecidas em 37 C.F.R. §1.822(b)(2) e estão reproduzidas na seguinte Tabela de Correspondência í

TABELA DE CORRESPONDÊNCIA

ABREVIATURA	AMINOÁCIDO
1 Letra	3 Letras
Y	Tyr	tirosina
G	Gly	glicina
F	Phe	fenilalanina
M	Met	metionina
A	Ala	alanina
S	Ser	serina
I	Ile	isoleucina
L	Leu	leucina
T	Thr	treonina
V	Vai	valina
P	Pro	prolina
K	Lys	lisina
H	His	histidina
Q	Gin	glutamina
E	Glu	ácido glutâmico
Z	Glx	Glu e/ou Gin
W	Trp	triptofano
R	Arg	arginina
D	Asp	ácido aspártico
N	Asn	asparagina
B	Asx	Asn e/ou Asp
C	Cys	cisteína
J	Xaa	Não especificado

Os resíduos individuais que compreendem uma sequência de resíduos de aminoácidos do presente invento podem estar na forma isomérica D ou L desde que seja mantida a propriedade funcional desejada, pela(s) molécula(s) que incorpora(m) a sequência de resíduos de aminoácidos. A sequência de resíduos de aminoácidos

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233.0 (POR) -9pode também incluir aminoácidos modificados póstraducionalmente, por exemplo, resíduos de aminoácidos hidroxilados, glicosados ou resíduos ligados através de ligações dissulfureto. Adicionalmente, uma sequência de resíduos de aminoácidos pode incluir um ou mais aminoácidos modificados ou não usuais, tais como aqueles apresentados em 37 C.F.R. §1.822(b)(4), os quais são aqui incorporados para referência. Uma sequência de resíduos de aminoácidos pode ser representada pelas abreviaturas correspondentes aos seus aminoácidos constituintes, em que um hífen entre duas abreviaturas adjacentes indica uma ligação peptídica entre os resíduos correspondentes.

J

Anticorpo: um polipéptido que se liga guimicamente a um grupo hapténico, i.e., um ligando. Os anticorpos, como aqui utilizado, são moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente activos de moléculas de imunoglobulina. Estão incluídas tais porções conhecidas na arte como Fab, Fab^z; F(ab')₂ ® F_v. Os anticorpos ligam tipicamente ligandos que variam em tamanho de cerca de 6 a cerca de 34 Â com constantes de associação no intervalo de cerca de 10⁴ a 10¹⁰ M”¹ e no máximo 10¹³ M¹. Os anticorpos podem ligar uma grande variedade de ligandos, incluindo pequenas moléculas tais como os esteróides e as prostaglandinas, biopolímeros tais como ácidos nucleicos, proteínas e polissacáridos, e polímeros sintéticos tal como o polipropileno. Um local de combinação de anticorpo é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo compreendida por regiões variáveis e hipervariáveis de uma cadeia pesada e leve gue liga especificamente (imunorreagem com) o antigénio. 0 termo imunorreagir nas suas várias formas é aqui utilizado para referir a ligação entre uma molécula contendo determinante antigénico (antigénio) e uma molécula contendo um local de combinação de anticorpo tal como uma molécula de anticorpo completa ou uma sua porção. Um determinante antigénico é a porção estrutural do antigénio que é imunologicamente ligada por um local de combinação de anticorpo. 0 termo é também utilizado alternativamente com epítopo. Os anticorpos podem ligar um único epítopo de um antigénio (mono73 761

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-10clonal) ou múltiplos epítopos (policlonal).

Licrando: uma molécula que tem uma região estrutural que se liga especificamente a uma molécula receptora particular, normalmente através de forças electrostáticas e/ou ligações de hidrogénio.

Péptido/Polipéptido: um polímero que compreende, pelo menos, dois resíduos de aminoácidos nos quais os resíduos adjacentes estão ligados por uma ligação peptídica entre o grupo amino alfa de um resíduo e o grupo carbonilo alfa de um resíduo adjacente. A estrutura primária de um polipéptido possui um grupo amina primária num terminal e um grupo ácido carboxilico no outro terminal do polímero. Assim, um polipéptido pode ser representado pela fórmula:

H-[NH-CH-C(0)]£-0H

I

R

onde R é uma cadeia lateral característica de um dado resíduo de aminoácido e i indica o número de resíduos de aminoácidos que constituem o polímero, cujo número é de dois ou mais. Um polipéptido pode compreender uma ou mais sequências de resíduos de aminoácidos. Um polipéptido em solução aquosa está também normalmente numa ou mais formas zwitteriónicas dependendo do pH da solução.

Proteína: um único polipéptido ou conjunto de polipéptidos reticulados compreendendo mais do que cerca de 50 resíduos de aminoácidos. As proteínas podem ter reticulação química, i.e., através de pontes dissulfureto, na mesma cadeia polipeptídica ou entre polipéptidos adjacentes. As proteínas podem estar glicosadas caso no qual são denominadas glicoproteínas.

Receptor: uma molécula proteica biologicamente activa tendo uma região estrutural que se liga especificamente a (ou com) uma outra molécula (ligando).

Ζ /

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Β. Os Polipéotidos

Um polipéptido do presente invento é derivado de uma nova classe de receptores da superfície celular, denominados receptores da protease da célula efectora (EPR) porque são membros da classe que se liga a ligandos protease e são também encontrados em muitos tipos de células efectoras inflamatórias. 0 primeiro membro desta classe (EPR-1) mostrou ligar-se a ligandos protease dos quais o factor Xa humano é um protótipo.

Um polipéptido do presente invento corresponde na sequência de resíduos de aminoácidos a uma ou mais sequências de resíduos de aminoácidos de EPR-1. Além disso, um polipéptido do presente invento mostrou possuir homologias pronunciadas com a sequência de resíduos de aminoácidos do factor de coagulação V humano, sugerindo uma origem evolucionária comum do factor V e de EPR-1. Como o factor V inclui a sequência de resíduos do factor Va, um presente polipéptido pode possuir também homologias com o factor Va. Um polipéptido do invento pode exibir também homologia de sequência com uma porção de polipéptido do factor VIII, assim como com um polipéptido da proteína de murino denominado MFG E-8 [Stubbs et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8417 (1990)]. Contudo, um polipéptido deste invento é diferente do factor V, do factor VIII ou de MFG E-8 de murino.

Numa concretização preferida do invento, o polipéptido é uma proteína possuindo um peso molecular de cerca de 78 kDa que inclui as seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:

(1) Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile;

(2) Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu;

(3) Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys;

(4) Val-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala;

(5) Gly-Val-Pro-Pro-Val-Val-Thr;

(6) Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e (7) Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-Lys-Lys-His-Val-Glu-Pro-His-Ala-Thr, onde Xaa está presente na molécula como um resíduo de aminoácido não especificado. 0 resíduo Xaa pode ser um qualquer resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente, incluindo um resíduo

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modificado ou pouco usual (cf. 37 C.F.R. §1.822(b)(4)). O resíduo Xaa não necessita também de ser o mesmo que um outro resíduo Xaa numa sequência de resíduos de aminoácidos particular ou numa outra sequência da molécula que possui um resíduo Xaa. Caracteristicamente, a proteína possui um peso molecular de 78+4 kDa, como determinado por electrof orese em gel de poliacrilamida. (0 número associado a cada sequência de resíduos de aminoácidos refere-se à sua Sequência I.D. N^s como apresentado no registo de sequências aqui fornecido de acordo com os requisitos de 37 C.F.R. §1.821(c)).

Numa outra concretização preferida, a proteína é isolada da linha de células designada por MOLT13 #3 e possui um peso molecular de cerca de 78 kDa. A linha de células MOLT13 #3 foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20852. Esta linha de células foi depositada a 11 de Janeiro de 1991 e recebeu o número de acesso CRL 10638.

depósito em questão foi feito de acordo com os requisitos do Tratado de Budapeste de que a duração do depósito devia ser de 30 anos a partir da data de depósito ou de 5 anos a partir do último pedido para o depósito no depositário ou para a vigência de uma patente U.S. que tem origem neste pedido de patente, o que for mais longo. A linha de células será recompletada à medida que se tornar inviável no depositário.

Numa outra concretização do invento, a proteína é imunorreactiva com certos anti-soros para o factor V humano assim como com anticorpos policlonais purificados a partir dos antis-soros, por exemplo, por imunoadsorção em factor V humano purificado, imobilizado. Num outro aspecto do invento, a proteína imunorreage com anticorpos para o factor VIII humano. Por isso, embora a presente proteína EPR não seja uma proteína de factor V ou VIII humano per se, ela possui epítopos que são cruzadamente reactivos com ligandos para certos epítopos dos factores V e VIII.

Λ/·

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Numa outra concretização preferida do invento, a proteína isolada imunorreage com um pequeno conjunto de anticorpos tais como aqueles produzidos pelo hibridoma designado por 12H1, que foi depositado a 11 de Janeiro de 1991 na ATCC de acordo com o Tratado de Budapeste, como acima descrito. Ao hibridoma foi dada a designação ATCC HB 10637.

Numa outra concretização, um polipéptido deste invento possui uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela seguinte fórmula:

H-X_n-Y-X_m-OH onde Y é uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada a partir do grupo de sequências de resíduos de aminoácidos (1)-(7), acima apresentado, que estão presentes em EPR-1; X_n está ausente quando n=0 e é uma sequência de resíduos de aminoácidos de terminal N (segmento de comando e proteína madura) contendo até cerca de 550 resíduos quando n=l; e X_m está ausente quando m=0 e é uma sequência de resíduos de aminoácidos de terminal C (segmento de cauda) contendo até cerca de 550 resíduos quando m=l. 0 polipéptido compreende até cerca de 600 resíduos de aminoácidos.

Preferivelmente, quando ou X_n ou X_m são uma sequência de resíduos de aminoácidos, X_n ou X_m contêm até cerca de 200 resíduos, mais preferivelmente, até cerca de 50 resíduos, e ainda mais preferivelmente, até cerca de 20 resíduos de aminoácidos. Tipicamente, X_n e X_m contêm cada um deles uma ou mais das sequências de resíduos de aminoácidos anteriormente apresentadas.

Num outro aspecto preferido do invento, X_n e X_m são seleccionados de modo a que o polipéptido imunorreaja com soros contendo anticorpos criados para o factor V humano. Mais preferivelmente, X_n e X_m são seleccionados de modo a que o polipéptido seja uma proteína possuindo um peso molecular de cerca de 78 kDa. Ainda mais preferivelmente, a proteína isolada liga-se também ao factor Xa humano.

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-14Ainda numa outra concretização preferida, um polipéptido do invento possui a fórmula:

H-Y-OH onde Y é como previamente definido.

Um polipéptido do presente invento pode ser utilizado para produzir uma variedade de anticorpos úteis pelos meios aqui descritos. A utilidade dos polipéptidos será evidente a partir da explicação fornecida abaixo.

O polipéptido em questão não é tipicamente glicosado, i.e., é sintetisado quer directamente pelas técnicas padrão de síntese de péptidos quer por expressão em hospedeiro procariótico de uma molécula de ADN recombinante do presente invento. Um polipéptido do presente invento eucarioticamente produzido é tipicamente glicosado.

O polipéptido em questão pode incorporar uma variedade de alterações, tais como inserções, delecções e substituições de resíduos de aminoácidos que são ou conservativas ou não conservativas, desde que a molécula de polipéptido resultante exiba as propriedades desejadas. As propriedades desejadas como aqui referido incluem o facto de o polipéptido ser imunogénico num hospedeiro adequado e capaz de gerar anticorpos para a molécula EPR-1 ou para um polipéptido homólogo a EPR-1, pelo menos, no estado desnaturado como se verifica num gel de SDS-PAGE, mas também, frequentemente, no estado natural como expresso em células. Adicionalmente, o polipéptido é antigénico quando expresso em células ou no seu estado desnaturado de forma a que os anticorpos imunorreactivos com a molécula EPR-1 também imunorreagem com o polipéptido em questão.

Quando o presente polipéptido em questão incorpora substituições conservativas das sequências correspondentes à EPR-1 representada acima, os resíduos de aminoácidos substituídos são substituídos por um outro resíduo de aminoácido biologicamente similar, de forma a que o polipéptido resultante possua uma sequência de resíduos de aminoácidos, que seja diferente de (em

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233.0 (POR) -15vez de) uma sequência do factor V, do factor VIII ou da sequência MFG E-8. Alguns exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por um outro resíduo hidrofóbico. Igualmente, um resíduo polar tal como arginina, glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico, glutamina, asparagina e semelhantes, pode ser conservativamente substituído por um outro membro deste grupo. Ainda um outro aspecto de um polipéptido que incorpora substituições conservativas ocorre quando um resíduo de aminoácido substituído substitui um resíduo de aminoácido porgenitor não substituído. Os exemplos de aminoácidos substituídos podem ser encontrados em 37 C.F.R. §1.822(b)(4), cujas espécies são aqui incorporadas por referência. Quando o polipéptido tem uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde à sequência de EPR-1, mas possui uma ou mais substituições conservativas, preferivelmente não são substituídos mais do que cerca de 40%, e mais preferivelmente não mais do que cerca de 20%, dos resíduos de aminoácidos da proteína nativa.

Um polipéptido do presente invento pode ser sintetisado por qualquer uma das técnicas sintéticas de péptidos conhecidas pelos peritos na arte. Um sumário de algumas das técnicas disponíveis pode ser encontrado em J.M. Stuard e J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman, Co., San Francisco (1969), J. Meinhofer, Hormonal Proteins and Peptides Vol. 2, pgs 46, Academic Press (New York) 1983 e Patente U.S. N^s 4631211, cujas descrições são aqui incorporadas por referência. Quando um polipéptido desejado para utilização no presente invento é relativamente curto (menos do que cerca de 50 resíduos de aminoácidos de comprimento) estão geralmente favorecidas as técnicas sintéticas directas de péptidos, normalmente por utilização de uma técnica em fase sólida tal como a de Merrifield [Merrifield JACS. 85:2149 (1963)].

polipéptido em questão pode também ser sintetisado por técnicas de ADN recombinante. Tais técnicas recombinantes estão favorecidas especialmente quando o polipéptido desejado é

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233.0 (POR) -16relativamente longo (mais do que cerca de 50 resíduos de aminoácidos de comprimento). Quando se empregam as técnicas de ADN recombinante para preparar o polipéptido em questão, é incorporado um segmento de ADN que codifica o polipéptido desejado num vector pré-seleccionado que é subsequentemente expresso num hospedeiro adequado. 0 polipéptido expresso, contendo, pelo menos, uma das sequências de resíduos de aminoácidos (1)-(7) correspondente à EPR-1 acima identificada, é preferivelmente purificado por um processo de rotina tal como electroforese em gel, cromatografia imunossorvente e semelhantes.

C. Segmentos de ADN

Quando se empregam as técnicas de ADN recombinante para preparar um polipéptido do presente invento, é utilizado um segmento de ADN que codifica o polipéptido. Um segmento de ADN contemplado no invento é operativamente ligado a um vector que é subsequentemente expresso num hospedeiro adequado. 0 segmento é operativamente ligado ao vector como aqui utilizado quando é ligado (covalentemente ligado) a ele, como é bem conhecido. É também contemplado um segmento de ARN equivalente ao segmento de ADN em questão.

segmento de ADN em questão é uma molécula que pode ser facilmente sintetisada por técnicas químicas, por exemplo, pelo processo de fosfotriéster bem conhecido [Matteuci et al., JACS, 103:3185 (1981)]. Por síntese química dos segmentos de ADN, pode ser facilmente fornecida uma qualquer substituição, inserção ou delecção desejada de um resíduo ou sequência de aminoácidos a partir de um polipéptido molde, por exemplo, a proteína nativa, fazendo simplesmente as alterações correspondentes na sequência de nucleótidos do segmento de ADN.

Sempre que for utilizado um segmento de ARN que codifique o polipéptido em questão, a molécula de ARN que inclui o segmento que codifica o polipéptido é transcrita em ADN complementar (ADNc) através de uma transcriptase inversa. A molécula de ADNc

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-17pode então ser transcrita e traduzida como aqui descrito para produzir um polipéptido desejado.

Num aspecto preferido do invento, uma sequência (segmento) de nucleótidos de ADN que codifica, pelo menos, uma das sequências de resíduos de aminoácidos (1)-(7) da EPR-1 acima identificada é operativamente ligada a uma molécula de ADN maior. A molécula de ADN resultante é então transformada num hospedeiro adequado e nele expressa.

segmento de ADN que codifica uma sequência de resíduos de aminoácidos (1)-(7) acima apresentada pode ser fornecido com codões de início e paragem ou podem ser fornecidos um ou mais dos codões de início e paragem pela molécula de ADN maior, por exemplo, vector, operativamente ligada ao segmento de ADN de forma a que só seja produzido o polipéptido correspondente. Alternativamente, pode ser fornecida uma sequência de nucleótidos que codifica resíduos de aminoácidos adicionais nas extremidades 3' e/ou 5' do segmento de ADN de modo a que seja expresso um polipéptido maior possuindo uma sequência de resíduos de aminoácidos quer numa quer nas duas extremidades de terminal N e terminal C, adicionalmente a uma sequência de resíduos de aminoácidos (1)-(7) acima apresentada da molécula EPR-1.

Uma molécula de ADN do presente invento pode codificar um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula:

H-X_n-Y-X_m-OH onde X_n, Y e X_m são como previamente definidos. 0 segmento de ADN codifica preferivelmente um polipéptido até cerca de 600 resíduos de aminoácidos de comprimento. Quando o segmento de ADN codifica um polipéptido possuindo ou X_n ou X_m como sequência de resíduos de aminoácidos, X_n ou X_m contêm até cerca de 200 resíduos, mais preferivelmente até cerca de 50 resíduos e ainda mais preferivelmente até cerca de 20 resíduos de aminoácidos. Tipicamente, uma ou as duas regiões de flanqueamento do segmento de ADN que codifica a sequência Y do polipéptido codifica uma ou

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233.0 (POR) mais das sequências de resíduos de aminoácidos (1)-(7) acima apresentadas.

A molécula de ADN em questão pode também ser produzida por técnicas enzimáticas. Assim, as enzimas de restrição que clivam moléculas de ADN em sequências de reconhecimento pré-definidas podem ser utilizadas para isolar fragmentos de ADN a partir de moléculas de ADN maiores, contendo os segmentos de ADN desejados tal como o ADN (ou ARN) que codifica a proteína EPR-1. Tipicamente, os fragmentos de ADN produzidos desta maneira vão ter terminais pendentes, coesivos, nos quais as sequências de nucleótidos de cadeia simples se estendem para além da porção de cadeia dupla da molécula. A presença de tais terminais coesivos é geralmente preferida às moléculas de ADN de extremidades rombas. Os fragmentos isolados contendo a sequência de codificação desejada podem ser então ligados (clonados) num vector adequado para amplificação e expressão.

Adicionalmente, um presente segmento de ADN pode ser produzido por técnicas de reacção em cadeia de polimerase (PCR), as quais amplificam os segmentos de ADN de alvo de um ácido nucleico molde. Em PCR, é transcrito um alvo de ácido polinucleico específico por uma reacção na qual é utilizada uma molécula iniciadora complementar de uma secção particular de um molde de ácido nucleico para formar um produto de extensão do iniciador que inclui uma região de ácido nucleico complementar ao alvo. Após separação do molde e iniciador prolongado, cada produto de extensão de iniciador actua como um molde e tempera-se (anneals) especificamente com uma molécula de iniciador complementar. 0 molde iniciado resultante actua como um substrato para as reacções de extensão seguintes. Repetem-se estes passos utilizando preferivelmente um procedimento cíclico automático, amplificando assim exponencialmente o alvo de ácido polinucleico inicial com o qual o iniciador hibrida. Os procedimentos para a realização da PCR têm sido extensivamente descritos, ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4 683 195 e 4 683 202, cujas descrições são aqui incorporadas por referência.

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Utilizando esta tecnologia de PCR, é preferivelmente usada uma molécula de iniciador de ADN que codifica uma ou mais das sequências de resíduos de aminoácidos anteriormente enumeradas (1)-(7). Contudo, podem ser reveladas sequências de nucleótidos adicionais por clonagem do ADNc ou do ADN genómico que codifica EPR-1 e suas sequências de resíduos de aminoácidos mais pequenas. É normalmente empregue uma molécula sonda de ADN que codifica uma sequência de resíduos de aminoácidos EPR-1 possuindo homologia mínima quer com o factor V quer com o factor VIII, de forma a maximizar a especificidade da hibridação com o ADN ou ARN que codifica a sequência de resíduos de aminoácidos EPR-1 alvo e a minimizar a hibridação com o ADN ou ARN que codifica quer o factor V, quer o factor VIII quer moléculas não alvo, homólogas. Contudo, tal regra do polegar relativamente à homologia de uma molécula sonda não é crítica na identificação de uma sonda adequada, e pode na verdade não ser de todo apropriada, como quando as células examinadas não expressam os factores V ou VIII. Evidentemente que é contemplada a utilização de iniciadores redundantes, misturados, que codificam uma sequência de resíduos de aminoácidos alvo utilizando diferentes codões para o mesmo resíduo de aminoácido.

D. Vectores

É também contemplado no presente invento um vector que pode ser operativamente ligado ao segmento de ADN em questão para proporcionar uma molécula de ADN recombinante auto-replicante, que codifica o polipéptido em questão, que expressa preferivelmente a própria proteína EPR-1. A molécula recombinante pode ser utilizada para transformar células hospedeiras adequadas, de forma a que as células hospedeiras expressem o polipéptido desejado. Portanto, a molécula de ADN pode ser vista como auto-replicante.

A escolha do vector ao qual um segmento de ADN do presente invento é operativamente ligado depende, como é bem conhecido na arte, das propriedades funcionais desejadas, por exemplo, eficácia de expressão, da célula hospedeira de transformação e semelhantes. Contudo, um vector do presente invento é, pelo

761 / ..^—33,

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233.0 (POR) -20menos, capaz de dirigir a replicação, e preferivelmente também a expressão, de um segmento de ADN que codifica o polipéptido em questão.

Um vector escolhido inclui, preferivelmente, um replicão procariótico, i.e., uma sequência de ADN, que possua a capacidade de dirigir a replicação autónoma e a manutenção, extracromossomicamente, da molécula de ADN recombinante numa célula hospedeira procariótica transformada com ela. Tais replicões são bem conhecidos na arte. Adicionalmente, um vector que inclui um replicão procariótico inclui também preferivelmente, um gene de resistência à droga, de forma a que possam ser rapidamente analisados os hospedeiros transformados com um vector. Os genes bacterianos de resistência à droga, típicos, são aqueles que conferem resistência à ampicilina ou tetraciclina.

Os vectores, que incluem um replicão procariótico, incluem preferivelmente um promotor procariótico capaz de dirigir a transcrição dos genes de polipéptido em questão. Um promotor é um elemento de controlo da expressão formado por uma sequência de ADN, que promove a ligação da ARN-polimerase e a transcrição do ADN de cadeia simples em moléculas de ARN mensageiro (ARNm). As sequências promotoras compatíveis com hospedeiros bacterianos, tal como um promotor tac, são tipicamente fornecidas em vectores plasmídicos posuindo locais de restrição adequados para a inserção de um segmento de ADN do presente invento. São típicos de tais plasmídeos vectores o pUC8, pUC9, pBR322 e pBR329 disponíveis em Biorad Laboratories, (Richmond, CA) e o pPL e pKK223 disponíveis em Pharmacia (Piscataway, NJ).

Os vectores de expressão compatíveis com células eucarióticas, preferivelmente aqueles compatíveis com células de vertebrados, podem também ser utilizados para formar uma molécula de ADN recombinante anteriormente descrita. Os vectores de expressão em células eucarióticas são bem conhecidos na arte e estão disponíveis em várias fontes comerciais. Tipicamente, tais vectores são fornecidos com locais de restrição adequados

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-21para inserção do segmento de ADN desejado. São típicos de tais vectores o pSVL e o pKSV-10 (Pharmacia)_t o pBPV-lpML2d (International Biotechnologies, Inc.) e o pTDTl (ATCC, #31255). Um marcador de resistência à droga preferido para utilização em vectores compatíveis com células eucarióticas é o gene neomicina-fosfotransferase (neo). [Southern et al. , J. Mol. Appl. Genet.. 1:327-341 (1982)].

São também contemplados os vectores de expressão retroviral capazes de produzir o ADN recombinante do presente invento. A construção e utilização dos vectores retrovirais na produção das moléculas de ADN desejadas tem sido descrita por Sorge, et al., ) Mol. Cell. Biol., 4:1730-37 (1984).

Está disponível um certo número de processos de ligação operativa do ADN aos vectores, através de terminais coesivos complementares. Por exemplo, os tractos de homopolímero complementares podem ser adicionados ao segmento de ADN a ser inserido e ao ADN vector. O vector e o segmento de ADN são então deixados hibridar por ligação hidrogénio entre as caudas de homopolímero complementar para formar moléculas de ADN duplas recombinantes.

Alternativamente, podem ser utilizados ligantes sintéticos contendo um ou mais locais de restrição para ligar o segmento de ADN aos vectores. Quando o segmento de ADN é produzido por digestão com endonuclease de restrição, como anteriormente descrito, é tratado com ADN-polimerase de bacteriófago T4 da ADN-polimerase I de E. coli, o que remove os terminais de cadeia simples 3 * protuberantes e preenche as extremidades 3' com reentrâncias. São assim produzidos os segmentos de ADN de extermidades rombas.

Os segmentos de ADN de extremidades rombas são incubados com um grande excesso molar de moléculas ligantes na presença de uma enzima que é capaz de catalisar a ligação das moléculas de

ADN de extremidades rombas, tal como ADN-ligase de bacteriófago

T4. Assim, os produtos da reacção são segmentos de ADN ligados nas suas extremidades a sequências ligantes possuindo locais de

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233.0 (POR) -22restrição. Os locais de restrição destes segmentos de ADN são então clivados com a enzima de restrição apropriada e os segmentos ligados a um vector de expressão possuindo terminais compatíveis com aqueles do segmento de ADN clivado. Os ligantes sintéticos contendo uma variedade de locais de endonuclease de restrição estão comercialmente disponíveis num certo número de fontes incluindo a International Biotechnologies, Inc. (New Haven, CT).

E. Transformação de hospedeiros

O presente invento refere-se também a células hospedeiras transformadas com uma molécula de ADN recombinante do presente invento. A célula hospedeira pode ser ou procariótica ou eucariótica. As células hospedeiras procarióticas preferidas são as estirpes de E. coli. por exemplo, a estirpe de E. coli DH5 disponível em Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD. As células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem as células de leveduras e de mamíferos, preferivelmente as células de vertebrados tais como as da linha de células fibroblásticas

de ratinho, ratazana, macaco ou humano. As células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem as células de ovário de criceto Chmes (CHO) disponíveis ATCC como CCL61 e as células de embrião de ratinho Suiço NIH NIH/3T3 disponíveis em ATCC como CRL 1658. A transformação dos hospedeiros de células apropriados com uma molécula de ADN recombinante do presente invento é realizada por processos bem conhecidos que dependem tipicamente do tipo de vector utilizado. Relativamente à transformação de células hospedeiras procarióticas, ver, por exemplo, Maniatis et al. . Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Relativamente à transformação de células de vertebrados com vectores retrovirais contendo ARN que codifica os polipéptidos em questão e uma transcriptase inversa, ver, por exemplo, Sorqe et al., Mol. Cell. Biol.. 4:1730-37 (1984).

As células bem transformadas, i.e., aquelas contendo uma molécula de ADN recombinante do presente invento, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as

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233.0 (POR) -23células transformadas podem ser clonadas para produzir colónias monoclonais. As células daquelas colónias podem ser colhidas, lisadas e o seu teor em ADN examinado quanto à presença do segmento de ADN desejado utilizando um processo tal como aquele descrito por Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975).

Adicionalmente à análise directa quanto à presença do segmento de ADN desejado, a transformação bem sucedida pode ser confirmada por processos imunológicos bem conhecidos, quando o ADN dirige a expressão dos polipéptidos do presente invento. As amostras de células que se suspeitam serem transformadas são colhidas e analisadas quanto à antigenicidade por anticorpos que se ligam especificamente aos polipéptidos em questão.

Adicionalmente às próprias células hospedeiras transformadas, são também contempladas pelo presente invento as culturas destas células. Os meios nutrientes úteis para a cultura de células hospedeiras transformadas são bem conhecidos na arte e podem ser obtidos em várias fontes comerciais. Nas concretizações em que a célula hospedeira é de mamífero é preferivelmente utilizado um meio isento de soro.

Os processos de recuperação de uma proteína expressa a partir de uma cultura são bem conhecidos na arte. Por exemplo, a filtração em gel, a cromatografia em gel, a ultrafiltração, a electroforese, a permuta iónica, a cromatografia de afinidade e técnicas relacionadas podem ser utilizadas para isolar as proteinas expressas encontradas na cultura. Adicionalmente, podem ser utilizados processos imunoquímicos, tal como a imunoafinidade, imunoadsorção e semelhantes, utilizando processos bem conhecidos, como exemplificado pelos processos aqui descritos.

F. Composições de anticorpos

É também contemplada no presente invento uma composição de anticorpos que imunorreage com o polipéptido em questão. Uma composição de anticorpos imunorreage com o polipéptido quer associado às superfícies celulares quer livre das estruturas

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celulares. Assim, uma composição de anticorpos liga-se a um ou mais epítopos apresentados pelo polipéptido na superfície exterior das células ou aos epítopos de polipéptidos livres de células.

Uma composição de anticorpos do invento, preferida, imunorreage com uma molécula de proteína EPR-1 apresentada na superfície da célula ou livre de componentes celulares como quando a molécula EPR-1 é isolada após lise das células transportadoras da molécula. Assim, as composições de anticorpos particularmente preferidas são os anticorpos monoclonais (mAb) designados por 7G12, 9D4 e 12H1. Tais mAb são obtidos como aqui ) descrito e em Altieri et al.. J. Biol. Chem.. 264(5):2969 (1989) e Altieri et al.. J. Immun. 145:246 (1990). Evidentemente que são também contemplados os anticorpos policlonais.

Em resumo, uma composição de anticorpos preferida é produzida por imunização de ratinhos com o factor V, o factor VIII humanos ou um polipéptido deste invento. Os anticorpos produzidos são analisados quanto à afinidade de ligação para um polipéptido do presente invento, tal como EPR-1. A EPR-1 isolada ou a EPR-1 em linfócitos lavados livres de factor V ou factor VIII podem ser utilizadas para analisar os anticorpos.

Os mAb em questão imunorreagem tipicamente quer com o factor V quer com o polipéptido alvo deste invento que possui homologia com o factor V. Contudo, quando é utilizado um polipéptido homólogo mas não idêntico ao factor V para se obter os mAb em questão, os mAb imunorreagem preferivelmente com o polipéptido alvo mas não com o factor de coagulação sanguínea. Os mAb podem também imunorreagir com proteínas de factor VIII similares à reacção com o factor V.

Uma vez que os anticorpos do presente invento se podem ligar a receptores para o factor de coagulação Xa, eles podem ser utilizados para inibir competitivamente o factor Xa da ligação aos locais nas superfícies celulares. Assim, pode-se reduzir a actividade de protease do factor Xa na região das

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-25superfícies das células. Os processos de inibição de tal ligação são bem conhecidos pelos peritos na arte.

Uma composição de anticorpos preferida, como aqui contemplada, é tipicamente produzida por imunização de um mamífero com um inoculo contendo o factor V humano ou um polipéptido do presente invento, induzindo assim no mamífero moléculas de anticorpo que possuem a imunoespecificidade apropriada para o polipéptido imunogénico. As moléculas de anticorpos são então recolhidas do mamífero, crivadas e purificadas até ao grau desejado por técnicas bem conhecidas tal como, por exemplo, por imunoafinidade para o imunogénio imobilizado num suporte sólido. A composição de anticorpos assim produzida pode ser utilizada inter alia, nos processos e sistemas de diagnóstico do presente invento para detectar a expressão dos polipéptidos em questão na superfície de células, por exemplo, leucócitos de pacientes com leucemia linfocítica crónica (CLL).

É também contemplada pelo presente invento uma composição de anticorpos monoclonais (mAb), como anteriormente observado. A frase composição de anticorpos monoclonais nas suas várias formas gramaticais refere-se a uma população de moléculas de anticorpos que só contém uma espécie de local de combinação de anticorpos capaz de imunorreagir com um antigénio particular. A composição de mAb em questão apresenta assim, tipicamente, uma afinidade de ligação simples para um qualquer antigénio com o qual imunorreage. Contudo, uma dada composição de anticorpos monoclonais pode conter moléculas de anticorpos possuindo dois

I locais de combinação de anticorpos diferentes, cada um imunoespecífico para um determinante antigénico diferente, i.e., um anticorpo monoclonal biespecífico.

mAb em questão é tipicamente composto por anticorpos produzidos por clones de uma única célula denominada um hibridoma que segrega (produz) apenas um tipo de molécula de anticorpo. A célula hibridoma é formada pela fusão de uma célula produtora de anticorpos e de um mieloma ou outra linha de

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células auto-perpetuante. Tais anticorpos foram primeiro descritos por Kohler e Milstein, Nature 256:495-497 (1975). Um hibridoma particularmente preferido é designado por 12H1 (n^a de acesso ao ATCC HB 10637).

Um anticorpo monoclonal pode também ser produzido por processos bem conhecidos pelos peritos na arte de produção de anticorpos quiméricos. Aqueles processos incluem o isolamento, manipulação e expressão do ácido nucleico que codifica toda ou parte de uma região variável da imunoglobulina incluindo quer a porção da região variável que compreende a região variável da cadeia leve da imunoglobulina quer a porção da região variável que compreende a região variável da cadeia pesada da imunoglobulina. Os processos de isolamento, manipulação e expressão do ácido nucleico que codifica a região variável em hospedeiros procarióticos e eucarióticos são descritos em Robinson et al., PCT Publication N^e WO 89/0099; Winter et al.. Publicação de Patente Europeia N^a 0239400; Reading, Patente U.S. n^a 4 714 681; Cabilly et al.. Publicação de Patente Europeia N^a 0125023; Sorge et al.. Mol. Cell. Biol., 4:1730-1737 (1984); Beher et al.. Science. 240:1041-1043 (1988); Skerra et al.. Science. 240:10301041 (1988); e Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.. 86:3833-3837 (1989). 0 ácido nucleico codifica tipicamente toda ou parte de uma região variável de imunoglobulina que liga um antigénio pré-seleccionado (ligando). As fontes de tal ácido nucleico são bem conhecidas pelos peritos na arte e, por exemplo, podem ser obtidas a partir de um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que liga o antigénio pré-seleccionado, ou o antigénio pré-seleccionado pode ser utilizado para analisar uma biblioteca de expressão que codifica uma pluralidade de regiões variáveis de imunoglobulina, isolando-se assim o ácido nucleico.

presente invento contempla um processo de formação de uma molécula de anticorpo monoclonal que imunorreage com um polipéptido do presente invento e, opcionalmente, uma proteína de factor V ou VIII obtida a partir de um mamífero. 0 processo compreende os passos de:

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233.0 (POR) (a) Imunização de um animal com um polipéptido deste invento ou um seu homólogo proteico, tal como uma proteína de factor V ou VIII. 0 imunogénio é, convenientemente, uma proteína retirada directamente de uma espécie animal sujeita. Contudo, o antigénio pode ser também ligado a uma proteína portadora tal como hemocianina de lapa (Fissurella), particularmente quando o antigénio é pequeno, tal como um polipéptido que consiste essencialmente numa sequência de resíduos de aminoácidos (1)-(7) acima apresentada. A imunização é tipicamente realizada por administração da amostra a um mamífero imunologicamente competente numa quantidade imunologicamente eficaz, i.e., numa quantidade suficiente para produzir uma resposta imune. 0 mamífero é, preferivelmente, um roedor tal como um coelho, ratazana ou ratinho. O mamífero é então mantido durante um período de tempo suficiente para produzir células que segregam moléculas de anticorpos que imunorreagem com o imunogénio.

(b) É então preparada uma suspensão de células produtoras de anticorpos, removidas do mamífero imunizado. Isto é tipicamente realizado por remoção do baço do mamífero e separação mecânica das células individuais do baço num meio fisiologicamente tolerável utilizando processos bem conhecidos na arte.

(c) As células produtoras de anticorpos suspensas são tratadas com um agente de transformação capaz de produzir uma linha de células transformadas (imortalizadas). Os agentes de transformação e a sua utilização para produzir linhas de células imortalizadas são bem conhecidos na arte e incluem vírus ADN tal como o vírus Epstein-Barr (EBV), o vírus de símio 40 (SV40), o vírus polioma e semelhantes, os vírus ARN tal como o vírus da leucemia de murino Moloney (MoMuLV), o vírus de sarcoma de Rous e semelhantes, as células de mieloma tais como P3X63-Ag8.653, Sp2/O-Agl4 e semelhantes.

Nas concretizações preferidas, o tratamento com o agente de transformação resulta na produção de um hibridoma imortalizado por fusão das células de baço suspensas com células de mieloma β

™ 761 β.ββ*^

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233.0 (POR) -28- -¾ ' < ' de ratinho de uma linha de células adequada, por exemplo, SP-2, pela utilização de um promotor de fusão adequado. A relação preferida é de cerca de 5 células de baço por célula de mieloma numa suspensão contendo cerca de 10⁸ esplenócitos. Um promotor de fusão preferido é o polietilenoglicol possuindo um peso molecular médio de cerca de 1000 a cerca de 4000 (comercialmente disponível como PEG 1000, etc.); contudo, podem ser empregues outros promotores de fusão conhecidos na arte.

A linha de células utilizada devia ser preferivelmente do tipo denominado resistente a drogas”, de forma a que as células de mieloma não fundidas não sobrevivam num meio selectivo, enquanto que os híbridos sobrevivem. A classe mais comum é a das linhas de células resistentes à 8-azaguanina, que carecem da enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase e por isso não são suportadas por meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina). Também se prefere, geralmente, que a linha de células de mieloma utilizada seja do tipo denominado não secretor, que não produz ele próprio qualquer anticorpo. Contudo, em certos casos, pode-se preferir as linhas de mieloma secretoras.

(d) As células transformadas são então clonadas, preferivelmente até à monoclonalidade. A clonagem é preferivelmente realizada num meio de cultura de tecidos que não mantém (suporta) células não transformadas. Quando as células transformadas são hibridomas isto é tipicamente realizado por diluição e cultura em recipientes separados da mistura de células de baço não fundidas, células de mieloma não fundidas e células fundidas (hibridomas) num meio selectivo que não vai manter as células de mieloma não fundidas. As células são cultivadas neste meio durante um período de tempo suficiente para permitir a morte das células não fundidas (aproximadamente uma semana). A diluição pode ser uma diluição limitante, na qual o volume de diluente é estatisticamente calculado para isolar um certo número de células (por exemplo, 0,3-0,5) em cada recipiente separado (por exemplo, em cada cavidade de uma placa de microtitulação). 0 meio é aquele (por exemplo, meio HAT) que não mantém a linha de células de mieloma não fundidas,

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resistentes a drogas (por exemplo, resistentes à 8-azaguanina).

(e) 0 meio de cultura de tecidos dos transformantes clonados é analisado (imunologicamente ensaiado) para detectar a presença de moléculas de anticorpos que reagem preferivelmente com os polipéptidos em questão ou células de suporte da molécula receptora de EPR-1. Isto é realizado utilizando técnicas imunológicas bem conhecidas.

(f) É então seleccionado um transformante desejado e deixado crescer num meio de cultura de tecidos apropriado durante um período de tempo adequado, seguido por recuperação (colheita) do anticorpo desejado a partir do sobrenadante de cultura, por técnicas bem conhecidas. É também bem conhecido ou facilmente determinado um meio ou período de tempo de cultura, adequados.

Deve-se observar que os anticorpos monoclonais para EPR-1 induzidos por imunização com o factor V são relativamente raros. De facto, só cerca de um por cento dos anticorpos monoclonais induzidos pelo processo acima imunorreagem com EPR-1.

Para produzir uma concentração muito maior de anticorpo monoclonal ligeiramente menos puro, pode-se transferir o hibridoma desejado por injecção em ratinhos, preferivelmente ratinhos singénicos ou semi-singénicos. 0 hibridoma causa a formação de tumores produtores de anticorpos após um tempo de incubação adequado, o que resulta numa alta concentração do anticorpo desejado (aproximadamente 5-20 mg/ml) na corrente sanguínea e no exsudado peritoneal (ascites) do ratinho hospedeiro.

Virol. 8:396 (1959)] suplementado com 4,5 g/1 de glucose, 20 mM

Os meios e animais úteis para a preparação destas composições são ambos bem conhecidos na arte e comercialmente disponíveis e incluem meios de cultura sintéticos, ratinhos consanguíneos e semelhantes. Um meio sintético exemplificativo é o meio essencial mínimo de Dulbecco [DMEM; Dulbecco et al.,

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i.

-30Uma estirpe de glutamina e soro preferida de ratinhos é a Balb/c.

Os processos de produção dos hibridomas em questão que produzem (segregam) as moléculas de anticorpos do presente invento, são bem conhecidos na arte e são aqui adicionalmente descritos. As descrições particularmente aplicáveis da tecnologia de hibridoma relevantes são apresentadas por Niman et al., Pro. Natl. Acad. Sei. USA. 80:4949-4953 (1983) e por Galfre et al._f Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981), cujas descrições são aqui incorporadas por referência.

Um outro processo preferido para a formação das composições de anticorpos em questão envolve a produção de bibliotecas de moléculas Fab utilizando o processo de Huse et al. , Science. 246:1275 (1989). Neste processo, as moléculas de ARNm para as cadeias pesadas e leves dos anticorpos são isoladas a partir do animal imunizado. Os ARNm são amplificados utilizando-se as técnicas de reacção em cadeia com polimerase (PCR). Os ácidos nucleicos são então clonados aleatoriamente em fagos lambda para produzir uma biblioteca de partículas de fago recombinadas. Os fagos são utilizados para infectar um hospedeiro de expressão tal como E. coli. As colónias de E. coli e os correspondentes recombinantes de fago podem então ser analisados para aqueles que produzem os fragmentos Fab desejados. Os vectores de fago lambda preferidos são o gtll e o zap 2.

A composição contendo moléculas de anticorpo empregue no presente invento pode tomar a forma de uma solução ou suspensão. É bem entendida na arte a preparação de uma composição que contém moléculas de anticorpos como ingredientes activos. Tais composições são tipicamente preparadas como soluções ou suspensões líquidas, contudo, podem também ser preparadas formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em líquido. A preparação pode ser também emulsionada. 0 ingrediente terapêutico activo é muitas vezes misturado com excipientes que não interferem com o ensaio e são compatíveis com o ingrediente activo. São excipientes adequados, por exemplo, a água, solução

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-31salína, dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes e suas combinações. Adicionalmente, se desejado, a composição pode conter menores guantidades de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes de pH e semelhantes que aumentam a eficácia do ingrediente activo.

Uma composição de moléculas de anticorpos pode ser formulada numa forma salina aceitável, neutralizada. Os sais aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da molécula de anticorpo) que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como o acético, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, os hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico, e de bases orgânicas tais como a isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína e semelhantes.

G. Processos de ensaio de diagnóstico presente invento contempla um processo de detecção de uma molécula EPR-1 ou de uma sua porção polipeptídica. 0 ensaio pode ser para os receptores da superfície da célula homólogos a EPR1, incluindo a própria EPR-1. 0 ensaio pode ser específico para a própria EPR-1 por selecção adequada da especificidade de anticorpo. Um ensaio do invento pode ser também para os receptores de polipéptido homólogos a porções da EPR-1 assim como para polipéptidos homólogos à EPR-1, livres, i.e., não associados a qualquer estrutura celular particular, ou suas porções polipeptídicas. Os processos de ensaio envolvem, tipicamente, a detecção da EPR-1 exposta nas superfícies das células, por exemplo, de células CLL.

A afinidade de ligação relativa de uma molécula reagente para a sua espécie alvo é adequadamente determinada como aqui descrito, utilizando o processo de microfluorimetria de fluxo (FMF). Assim, as células que expressam o antigénio alvo, por exemplo, EPR-1, são indicadas sempre que a intensidade de

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233.0 (POR) fluorescência associada às células, devido à ligação dos anticorpos marcados por fluorescência aos antigénios das superfícies das células em questão, exceder um nível limiar prédefinido. Os anticorpos marcados estão tipicamente conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC), embora possam ser utilizados outros marcadores fluorescentes bem conhecidos.

processo de detecção de um polipéptido antigénico do presente invento compreende preferivelmente a formação de um produto de imunorreacção entre o polipéptido e uma molécula de anticorpo anti-polipéptido, como aqui descrito. O antigénio a ser detectado pode estar presente numa amostra de fluído vascular ou numa amostra de tecido corporal. 0 produto de imunorreacção é detectado por processos bem conhecidos pelos peritos na arte. Podem ser utilizados numerosos procedimentos químicos de diagnóstico clínico para formar os imunocomplexos detectáveis.

Alternativamente, pode ser utilizado no processo de ensaio um ligando de polipéptido (composição não-anticorpo) para o receptor de EPR-1 ou polipéptido em questão. Um ligando exemplificativo neste aspecto do invento é uma enzima de factor Xa marcada. Assim, embora sejam aqui descritos os processos de ensaio exemplificativos, o invento não é por isso limitado.

Um processo de ensaio preferido do presente invento envolve a determinação da presença de receptores da superfície da célula EPR-1. Podem ser empregues vários protocolos de análise heterogéneos e homogéneos, quer competitivos quer não competitivos, para a detecção da presença e, preferivelmente, da quantidade de receptores da superfície da célula numa amostra corporal, preferivelmente numa amostra contendo células. As moléculas receptoras são homólogas aos factores de coagulação V e VIII humanos ou a uma sua porção polipeptídica substancial, de forma a que seja requerido algum cuidado na distinção de uma molécula EPR-1, ou da sua porção polipeptídica, dos factores V e VIII. Um receptor particularmente preferido para ensaio é a EPR-1, como expresso em células CLL.

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O processo compreende a mistura de uma amostra corporal, preferivelmente humana, contendo células a ser analisadas com uma composição de anticorpos anteriormente descrita, que imunorreage com as moléculas receptoras. A amostra de células é, preferivelmente lavada, ficando livre dos factores de coagulação V e VIII antes do passo de mistura. A mistura de imunorreacção assim formada é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para que quaisquer das células que expressam o antigénio imunorreajam com anticorpos na composição de anticorpos para formar um imunocomplexo anticorporeceptor. O produto de imunorreacção (imunocomplexo) é então separado de quaisquer anticorpos que não reagiram presentes na mistura. É então determinada a presença, e se desejado, a quantidade de produto de imunorreacção formado. A quantidade de produto formado pode então ser correlacionada com a quantidade de receptores expressos pelas células.

A determinação da presença ou da quantidade de produto de imunorreacção formado depende do processo seleccionado para identificar o produto. Por exemplo, pode-se utilizar um anticorpo marcado para formar um imunocomplexo marcado com uma molécula receptora do presente invento. 0 imunocomplexo marcado pode ser quantificado por processos apropriados de detecção do respectivo marcador, por exemplo, marcadores de biotina, radioactivos, fluorescentes e semelhantes como explicado a seguir. Alternativamente, pode-se utilizar um anticorpo não marcado para formar um imunocomplexo não marcado, que é subsequentemente detectado por imunorreacção de um anticorpo marcado que reconhece o anticorpo não marcado com o imunocomplexo não marcado. Assim, o imunocomplexo torna-se marcado e pode ser detectado como acima descrito.

As condições biológicas utilizadas nos presentes ensaios são aquelas que mantêm a actividade biológica do anticorpo, da molécula da superfície da célula EPR-1 e das moléculas de polipéptido deste invento. Aquelas condições incluem um intervalo de temperaturas de cerca de 4°C a cerca de 45°C, preferivelmente cerca de 37°C, a um intervalo de valores de pH

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233.0 (POR) -34- ^: de cerca de 5 a cerca de 9, preferivelmente cerca de 7, e a uma força iónica que varia da da água destilada à do cloreto de sódio aproximadamente um molar, preferivelmente próxima à da solução salina fisiológica. Os processos para optimizar tais condições são bem conhecidos na arte.

Numa concretização preferida, retira-se de um paciente uma amostra corporal a ser analisada e divide-se em alíquotas. Utiliza-se pelo menos uma alíquota para determinar a expressão antigénica que utiliza uma composição de anticorpos do presente invento. Se desejado, pode-se utilizar uma segunda alíquota para determinar a reactividade de um anticorpo de controlo com a amostra. A análise pode ser realizada concorrentemente mas é normalmente realizada sequencialmente.

Num outro aspecto do invento, os dados obtidos nas presentes análises são apresentados através de um meio evidente, por exemplo, versões de armazenamento em computador ou cópia dura. Os dados podem ser automaticamente introduzidos e armazenados por instrumentação analógica/digital (A/D) padrão que está comercialmente disponível. Os dados podem ser também revistos e transcritos ou visionados, como desejado para melhor apresentação das correlações de dados em questão. Por consequência, a instrumentação e o suporte lógico adequados para utilização com os presentes processos são contemplados no âmbito do presente invento.

As composições de anticorpos e os processos do invento fornecem um processo para controlar o tratamento de pacientes atingidos por leucemia linfocítica crónica (CLL) e outras doenças nas quais a expressão dos receptores homólogos aos factores V e VIII está correlacionada com o estado de doença. Por exemplo, verifica-se que a frequência das células que expressam um marcador EPR-1 está inversamente relaccionada com a resposta ao tratamento de pacientes que sofrem de CLL. Adicionalmente, os pacientes atingidos pela leucemia de células filamentosas (HCL) do tipo EPR-1⁺ expressam marcadores detectados pela composição de anticorpos em questão, permitindo

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-35assim o controlo do tratamento.

Por consequência, é contemplado um processo de controlo de uma resposta do paciente ao tratamento no qual se detecta um marcador para a doença. O processo compreende a mistura de uma amostra corporal contendo células a ser ensaiadas para o marcador EPR-1 com a composição de anticorpos em questão de acordo com um processo de ensaio acima descrito. A mistura é mantida durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imunorreacção sob condições de reacção pré-definidas. A quantidade de produto de imunorreacção formado está correlacionada com um estado de doença inicial. Repetem-se estes passos mais tarde durante o regime de tratamento, permitindo assim a determinação da resposta do paciente ao tratamento, com uma diminuição no número de moléculas EPR-1 expressas nas superfícies das células indicando um melhoramento no estado de doença.

H. Sistemas de diagnóstico

É também contemplado no presente invento um sistema de diagnóstico para realização dos ensaios descritos. Um sistema de diagnóstico na forma de conjunto, do presente invento, inclui, numa quantidade suficiente para pelo menos um ensaio, uma composição contendo moléculas de anticorpo do presente invento, ou seus fragmentos, como um reagente separadamente embalado, e preferivelmente com um marcador capaz de indicar a presença de um produto de imunorreacção. As instruções para utilização do reagente embalado são também tipicamente incluídas. As instruções para utilização incluem tipicamente uma expressão evidente que descreve a concentração de reagente ou, pelo menos, um parâmetro do processo de ensaio tal como as quantidades relativas de reagente e amostra a serem misturadas, períodos de tempo de manutenção para as misturas de reagente/amostra, temperatura, condições de tamponamento e semelhantes. Numa concretização, é contemplado um sistema de diagnóstico para ensaio da presença de receptores EPR-1 expressos em células numa amostra contendo células.

Fornece-se um conjunto preferido como um envólucro

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(embalagem) que compreende um recipiente para anticorpos antiEPR-1 que imunorreagem com as moléculas receptoras nas células da amostra de células. O conjunto contém tipicamente uma sonda de anticorpo marcada que imunorreage com o imunocomplexo do anticorpo anti-EPR-1 e com o receptor EPR-1.

marcador pode ser qualquer um daqueles geralmente disponíveis, por exemplo, fluoresceína, ficoeritrina, rodamina, ¹²⁵I e semelhantes. Outros marcadores exemplificativos incluem ¹¹³·ΐη, ⁹⁹Tc, ⁶⁷Ga e ¹³²I e marcadores não radioactivos tal como a biotina e anticorpos ligados a enzima. Qualquer marcador ou meio de indicação que pode ser ligado ou incorporado numa molécula de anticorpo é contemplado como parte de um anticorpo ou composição de anticorpos monoclonais do presente invento. Um marcador contemplado pode ser também utilizado separadamente e aqueles átomos ou moléculas podem ser utilizados só ou em conjunção com reagentes adicionais. Tais marcadores são eles próprios bem conhecidos na química de diagnóstico clínico e constituem uma parte deste invento só até ao ponto de serem utilizados com outros processos e/ou sistemas novos.

Conhece-se bem a ligação de marcadores a polipéptidos e proteínas. Por exemplo, as moléculas de anticorpos produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo rádio-isótopos fornecidos como um componente no meio de cultura. Ver, por exemplo, Galfre et al., Meth. Enzymol.. 73:3-46 (1981). São particularmente aplicáveis as técnicas de conjugação ou acoplamento de proteínas através de grupos funcionais activados. Ver, por exemplo, Aurameas et al., Scand. J. Immunol.. Vol. 8, Supl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al.. Biotech., 3:889-894 (1984) e Pat. U.S. N² 4 493 795.

sistema de diagnóstico em questão pode também incluir um agente de ligação específica. Um agente de ligação especifica'’ é uma espécie química capaz de ligar selectivamente uma espécie de reagente do presente invento mas não é ele próprio uma molécula de anticorpo do presente invento. Os agentes de ligação específica exemplificativos são moléculas de anticorpos,

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proteínas do complemento ou seus fragmentos, proteína A e semelhantes que reagem com uma molécula de anticorpo deste invento, quando o anticorpo está presente como parte do imunocomplexo acima descrito.

Nas concretizações preferidas, o agente de ligação específica está marcado. Contudo, quando o sistema de diagnóstico inclui um agente de ligação específica que não está marcado, o agente é tipicamente utilizado como um meio ou

reagente de amplificação. Nestas concretizações, um agente de ligação específica marcado é capaz de ligar especificamente o meio de amplificação guando o meio de amplificação está ligado a um complexo contendo um dos presentes reagentes.

Por exemplo, pode-se utilizar um conjunto de diagnóstico do presente invento num formato ELISA para detectar a presença ou a quantidade de um polipéptido EPR-1 numa amostra corporal ou amostra de fluído corporal tal como soro, plasma ou urina ou um lisado de células detergente, por exemplo, um lisado CHAPS 10 mM. ELISA refere-se a um ensaio imunossorvente com enzima ligada que emprega um anticorpo ou antigénio ligado a uma fase sólida e um conjugado enzima-antigénio ou enzima-anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de anticorpo ou antigénio presente numa amostra. Encontra-se uma descrição da técnica ELISA no Capítulo 22 da 4^a Edição de Basic and Clinicai Immunology de D.P. Sites et al.. publicado por Lange Medicai Publications of Los Altos, CA em 1982 e nas Patentes U.S. N^a 3 654 090; N² 3 850 752; e N² 4 016 043, patentes que São aqui incorporadas por referência.

Nas concretizações preferidas, o componente reagente anticorpo ou antigénio pode ser fixado a um molde sólido para formar um suporte sólido que é separadamente embalado nos sistemas de diagnóstico em apreço. 0 reagente é tipicamente fixado ao molde sólido por adsorção a partir de um meio aquoso, embora possam ser utilizados outros modos de fixação bem conhecidos pelos peritos na arte. Por exemplo, um presente anticorpo antiEPR-1 pode ser fixado a uma superfície e utilizado para ensaiar

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-38uma solução contendo moléculas EPR-1 ou células que expressam receptores EPR-1. Alternativamente, a EPR-1, seus fragmentos polipeptídicos e as células total ou parcialmente lisadas que expressam EPR-1 podem ser fixadas na superfície e utilizadas para analisar uma solução quanto às composições de anticorpos que imunorreagem com a espécie fixada.

Em relação a isto, os materiais de molde sólido úteis incluem o dextrano reticulado, derivado, disponível, sob a marca comercial SEPHADEX em Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ), agarose na sua forma derivada e/ou reticulada, pérolas de poliestireno de cerca de 1 micron a cerca de 5 milímetros de diâmetro disponíveis em Abbott Laboratories of North Chicago, IL, poli(cloreto de vinilo), poliestireno, poliacrilamida reticulada, telas à base de nitrocelulose ou nilão tais como folhas, faixas ou almofadas, tubos, placas, as cavidades de uma placa de microtitulação tais como as feitas de poliestireno ou poli(cloreto de vinilo) e semelhantes.

A espécie reagente, o agente de ligação específica marcado ou o reagente de amplificação de um qualquer sistema de diagnóstico aqui descrito podem ser fornecidos em solução, como uma dispersão em líquido ou como um pó substancialmente seco, por exemplo, na forma liofilizada. Quando o meio de indicação for uma enzima, o substrato da enzima pode também ser fornecido numa embalagem separada de um sistema. Normalmente, os reagentes são embalados sob uma atmosfera inerte. Pode também ser incluído neste sistema de ensaio de diagnóstico um suporte sólido tal como a placa de microtitulação anteriormente descrita e um ou mais tampões, como elementos separadamente embalados.

sistema de diagnóstico está contido numa embalagem convencional. Tais embalagens incluem garrafas de vidro e plástico (por exemplo, de polietileno, polipropileno e policarbonato), frascos, envólucros de plástico e folha de plástico laminada, e semelhantes.

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-39.7

Exemplos

Os exemplos seguintes ilustram mas não limitam o invento.

1. Células e cultura de células. Os PMN (leucócitos polimorfonucleares) foram isolados por sedimentação com dextrano do sangue anticoagulado com dextrose citrada ácida. As PBMC (células mononucleares sanguíneas periféricas) foram separadas depois de se remover o plasma rico em plaquetas por centrifugação diferencial a baixa velocidade sobre FicollHypaque (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (densidade = 1,077 g/ml) a 400 x g durante 18 minutos, a 22 °C. As PBMC foram extensivamente lavadas em 5 mM de EDTA-PBS, pH 7,2, e incubadas duas vezes em soro autólogo contendo 5 mM de EDTA durante 30 minutos a 37°C para impedir a formação de rosetas de plaquetasmonócitos. Os monócitos foram isolados das PBMC por aderência a discos de petri de plástico pré-revestidos com soro autólogo, durante 1 hora a 37°C. As células foram suspensas em 1 até 1,5 x 10⁷/ml em meio RPMI 1640 isento de endotoxina detectável (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) e FCS inactivado por calor a 10% (soro de feto de vitelo; Gemini Bioproducts Inc., Calabasas, CA), 2 mM de L-glutamina (Irvine), 25 mM de HEPES (Calbiochem Boehring Diagnostic, La Jolla, CA), 100 /xg/ml de gentamicina (Geramycin, Schering Corp., Kenilworth, NJ).

A linha de células monocítica THP-1 (ATCC) foi mantida em cultura contínua nos meios acima suplementados adicionalmente com 10 μΜ de 2-ME (Eastman Kodak, Rochester, NY). As linhas de células T de linfoma leucémico humano, transformadas, HuT 78, MOLT 4, CCRF-CEM, CCRF-HSB-2 e as linhas de células B de linfoma humano Raji e Daudi (ATCC) foram mantidas em cultura como recomendado. As linhas de células T de linfoma-leucemia humano Jurkat, MLT, PEER e MOLT 13 foram uma oferta generosa do Dr. D. P. Dialynas, Research Institute os Scripps Clinic, La Jolla, CA.

Para a resposta de linfócitos misturados, foram cultivadas χ 10⁶ PBMC recentemente isoladas em balões com respiradores

T-25 (Costar Corp., Cambridge, MA) na presença de 20 χ 10⁶ células Raji ou Daudi irradiadas (10 000 rad). As culturas foram

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mantidas em RPMI 1640, FCS a 10%, 25 mM de HEPES, 10 μΜ de 2-ME (meio de cultura de linfócitos misturados (MLC)) numa incubadora humidificada com CO₂ a 5%, durante 7 dias a 37 °C. As células responsivas foram colhidas, isoladas por centrifugação em Ficoll-Hypaque a 400 x g durante 18 minutos a 22°C, lavadas em meio de MLC completo, depois cultivadas em placas de 24 cavidades (Costar) a 2 x 10⁵/cavidade na presença de 2 x io⁶ células Daudi ou Raji irradiadas.

Para a cultura a longo termo de células alorreactivas estimuladas por células Daudi ou Raji irradiadas, as células T responsivas foram transferidas de 6 em 6 dias de acordo com o protocolo acima descrito e recultivadas em meio MLC contendo factor de crescimento de células T a 10% (Cellular Product Inc., Buffalo, NY) . Nalguns estudos, as suspensões de PBMC recentemente isoladas a 1 x 10⁶/ml foram tratadas com 1 /xg/ml de Con A (Calbiochem) ou 1 ^g/ml de PHA (Fito-hemaglutinina; Calbiochem) durante 7 dias em C0₂ a 5%, a 37°C. As aliquotas de células destas culturas foram colhidas após vários intervalos de tempo, lavadas e analisadas por FMF (microfluorometria de fluxo).

2. mAb. Os procedimentos experimentais para a purificação e caracterização do V humano foram previamente descritos em Altieri, D. et al.. J. Biol. Chem.. 264:2969 (1989). Em resumo, os ratinhos BALB/c foram intraperitonealmente imunizados com 50 μg de V em CFA (adjuvante de Freund completo; Calbiochem) e os hibridomas produzidos como previamente descrito [Altieri, D. et al.. J. Biol. Chem.. 264:2969 (1989)]. A estratégia de análise para a selecção de anticorpos serviu para analisar por FMF a reactividade dos fluídos da cultura de hibridoma com células THP-1 [Altieri, D. et al.. J. Biol. Chem.. 264:2969 (1989)]. Seis hibridomas que reagem com >98% das células THP-1 foram seleccionados para a produção de anticorpos em RIA de fase sólida e imunomancha utilizando V imobilizado e finalmente estabelecidos por duas a quatro subclonagens sequenciais com diluição limitante. Foi também analisado por FMF um antissoro policlonal de coelho criado por imunizações múltiplas com V

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233.0 (POR) -41- <.·//· purificado e caracterizado de acordo com a estratégia acima descrita. Adicionalmente, foi seleccionado e estabelecido um segundo painel de mAb eliciado por imunização com V, reactivo com V por mancha Western mas não reactivo com células THP-1 por FMF.

As fracções de Ig purificadas dos mAb 7G12 (IgG2a), 9D4 (IgGl) e 12H1 (IgM) (n² de acesso ao ATCC HB 10637) foram preparadas por cromatografia em colunas Affi-Gel MAPS II ou de hidroxilapatite (Bio-Rad, Richmond, CA). As fracções de Ig purificadas do antissoro policlonal de coelho anti-V B78.9 foram preparadas por fraccionamento com sulfato de amónio e cromatografia em DEAE Sephadex. Os anticorpos B78.9 imunopurifiçados foram isolados a partir do factor V purificado imobilizado em Affigel 15 (Biorad, Richmond, CA) de acordo com as directivas do fabricante.

Os mAb anti-CD16 eram o Leu 11b (Becton Dickinson, Mountain View, CA), B73.1 e 3G8, uma oferta generosa do Dr. G. Trinchieri, Wistar Institute, Philadelphia PA. O mAb anti-CD56 NKH-1 (Leu 19) foi adquirido em Coulter Immunology, Hialeah, FL. Os mAb anti-CDllb e anti-CD18 eram ο OKM1 e 60.3, respectivamente. Os mAb para CD57 (HNK-1), CD3 (OKT3), CD4 (OKT4), CD8 (OKT8), CD2 (0KT11), classe I de HLA (W6/32) foram adquiridos em ATCC. O mAb de receptor de células T (TCR) anti-α/β WT31 foi adquirido em Becton Dickinson, o mAb anti- /6 TCR 61 foi generosamente fornecido pelo Dr. M.B. Brenner, Harvard Medicai School, Boston, MA.

3. ReacçÕes de ligação. Foi avaliada por FMF a interacção de vários mAb com diferentes tipos de células. Em resumo, 1 x

10^{3 * * 6} células foram incubadas em placas de microtitulação de fundo em V (Costar) com concentrações saturadas de cada mAb, durante minutos a 4°C. Após lavagens em meios MLC, foram adicionadas aliquotas da diluição a 1/20 de IgG + IgM anti-ratinho de F(ab')₂ de cabra conjugadas com fluoresceína (Tago Inc., Burlingame, CA) durante 30 minutos adicionais a 4°C. As células foram lavadas e imediatamente analisadas num Becton Dickinson

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IV/40 FACS. Foram realizadas análises FMF de duas cores, simultâneas, como previamente descrito [Altieri, D. et al.. J. Biol. Chem., 264:2969 (1989)] utilizando o mAb 7G12 ou 9D4 previamente conjugado com biotina (N-hidroxissuccinimidobiotina, Sigma) e reveladas por diluições a 1/20 de reagente de estreptavidina conjugada com ficoeritrina (Tago).

Para confirmar a precisão da análise FMF de duas cores realizada em várias populações de células, foram também realizados dois conjuntos de estudos adicionais. Primeiro, para evitar possíveis reacções cruzadas do segundo reagente anti-ratinho conjugado com FITC com o mAb biotinilado, repetiram-se estes estudos utilizando alíquotas conjugadas com biotina do anticorpo policlonal de coelho B78.9 em associação com os vários mAb marcadores relacionados com anti-células T ou anti-células NK (assassinos naturais).

Numa outra série de estudos, foram também utilizados mAb directamente conjugados com FITC 7G12 ou 9D4 (Chromaprobe, Inc., Redwood City, CA) em combinação com mAb conjugados com biotina OKT3, OKT4, OKT8. Para estudos seleccionadores de células, as células HuT 78 (1,5 x 10⁷/ml) foram incubadas com o anti-soro policlonal anti-V B78.9 seguido por IgG anti-coelho de cabra conjugada com fluoresceína (Tago). As células B78.9⁺ HuT 78 (Hut 78*, 34% da população não fraccionada) foram isoladas num Becton Dickinson Facstar sob pressão negativa com uma velocidade de passagem de 2000 células/s, lavadas em meio MLC completo e clonadas por diluição limitante em placas de fundo redondo de 96 cavidades (Costar) a 0,3, 1, 3 células/cavidade em meio condicionado por HuT 78 suplementado com FCS a 20%. Passadas 3 semanas, as células proliferantes de uma única origem clonal de células com base na distribuição de Poisson foram subclonadas, estabelecidas e em seguida fenotipicamente caracterízadas por FMF.

Os procedimentos para o isolamento, caracterização e marcação com ¹²⁵I do factor Xa foram como previamente descritos por Altieri, D. et al., J. Biol. Chem., 264:2969 (1989). A

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interacção de ¹²⁵I-Xa com células HuT 78* foi analisada por incubação de concentrações aumentadas de ¹²⁵I-Xa (0,45 a 36 nM) com uma suspensão de células a 1,5 até 2 x 10⁷/ml na presença de

2,5 mM de CaCl₂, durante 20 minutos à temperatura ambiente. No fim da incubação, parou-se a reacção por centrifugação das alíquotas da suspensão de células a 12 000 x g durante 2 minutos, através de uma mistura de óleo de silicone para a libertar de reactividade associada a células. A ligação não específica foi quantificada na presença de um excesso molar de 50 vezes de factor Xa não marcado adicionado no início da reacção de incubação e foi subtraída do total para render a ligação específica líquida. Nalguns estudos, as alíquotas de células HuT 78* foram pré-incubadas com 50 μg/ml de mAb 9D4 durante 30 minutos à temperatura ambiente antes da adição de séries de concentrações de ¹²⁵I-Xa.

4. Marcação da superfície da célula e imunoprecipitacão. As suspensões de PMN a 1 x 10⁸/ml foram iodadas à superfície com 5 mCi de ¹²⁵I-Na pelo processo de Iodogénio [Fraker, P. J., et al. . Biochem. Biophvs. Res. Commun. . 80:849 (1978)]. Após extensas lavagens em tampão de solução salina de HEPES, pH 7,35, as células foram lisadas em tampão contendo Triton X-100 a 0,5% OU 10 mM de CHAPS, 0,05 M de Tris HC1, 0,15 M de NaCl, 1 mM de benzamidina, 0,1 mM de (PPACK = D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona; Calbiochem), 25 μ g/ml de leupeptina, 1 mM de PMSF (Fluoreto de fenilmetilsulfonilo; Calbiochem), pH 8,3 (tampão de lise), durante 30 minutos a 4°C. 0 lisado iodado foi limpo de núcleos e outros detritos celulares por centrifugação a 14 000 x g durante 30 minutos a 4°C e extensivamente pré-absorvido com alíquotas de IgG + IgM anti-ratinho de cabra conjugadas com sepharose CL4B (Calbiochem). As alíquotas do lisado de PMN marcado com foram separadamente incubadas com mAb 12H1 ou 60.3 durante 14 horas a 4°C, sob agitação. Os complexos imunes foram precipitados por adição de IgG + IgM anti-ratinho de cabra conjugadas com sepharose CL4B durante 6 horas adicionais a 4°C, extensivamente lavados no tampão de lise acima e finalmente ressuspensos em tampão de amostra de SDS a 2%, pH 6,8, contendo 50 mM de 2-ditiotreitol como um agente redutor. As amostras

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233.0 (POR) -44- -¾ foram imediatamente fervidas durante 5 minutos, clarificadas por centrifugação a 14 000 x g durante 5 minutos e finalmente sofreram electroforese em geles slab de SDS-poliacrilamida a 7,5% em SDS a 0,1%. Os geles foram corados em Coomassie azul R 250, descorados em ácido acético a 5%, secos e expostos a autorradiografia a -70 °C utilizando película de Raio X Kodak XOmat AR e filtros intensificadores (Cronex E.I., DuPont de Nemours, Wilmington, DE).

5. Isolamento da molécula EPR-1. O isolamento para a homogeneidade da molécula EPR-1 necessitou da identificação e/ou estabelecimento dos tipos de células que expressam constitutivamente níveis elevados deste antigénio de superfície. Estes estudos foram realizados principalmente em leucócitos polimorfonucleares sanguíneos, periféricos (PMN) e num clone de células T especificamente seleccionado derivado da linha de células T progenitoras MOLT13 #3 [Altieri, et al. . J. Immun. 145:246 (1990)].

A sublinha MOLT13 #3 foi estabelecida por dois ciclos sequenciais de selecção por fluorescência da linha progenitora MOLT 13 utilizando o mAb anti-EPR-1 12H1. Só as células MOLT 13 que expressam os níveis mais elevados de reactividade com o mAb 12H1 por análise com fluorescência é que foram isoladas, clonadas por diluições limitantes a 1 ou 3 células/cavidade, deixadas crescer até à confluência e finalmente reanalisadas de novo por citometria de fluxo quanto à reactividade com o mAb 12H1 assim como com um painel de mAb dirigidos contra vários marcadores relacionados com células T. A sublinha MOLT13 #3, estabelecida como acima descrito, expressou níveis 7-10 vezes maiores de EPR-1 quando comparada com a linha proqenitora.

As células MOLT13 #3 (número de acesso ao ATCC CRL 10638) foram deixadas crescer, continuamente, em suspensão a 37°C em balões de cultura de tecidos T150, CO₂ a 5%. As células foram colhidas, lavadas duas vezes em solução salina tamponada com fosfato, gelada, suplementada com 5 mM de EDTA, pH 7,2, e lisadas em tampão de lise durante 1 hora a 4°C, com agitação

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contínua.

A composição do tampão de lise mostrou ser crítica para obter a recuperação satisfatória da molécula EPR-1 isolada. O detergente utilizado era o CHAPS a 0,3% (1-propanossulfonato de

3-[(3-colamidopropil)dimetilamónio]; Calbiochem) na presença de 1 mM de CaCl₂ e de uma mistura de inibidores da protease, incluindo PMSF (1 mM) , p-APMSF (fluoreto de amidinofenilmetilsulfonilo; Calbiochem) (1 mM), PPACK (0,25 mg/ml), inibidor da tripsina de soja (0,1 mg/ml), benzamidina (1 mM), leupeptina (0,25 mg/ml), aprotinina (10 000 U/ml). A relação entre o volume de tampão de lise e o número de células | submetidas a lise depende do tipo de células seleccionadas para a análise. Para as células MOLT13 #3 foram necessários aproximadamente 120 ml de tampão de lise para solubilizar eficazmente 10⁹ células. Sob as mesmas condições, 4 χ 10⁹ PMN foram eficazmente solubilizados utilizando 200 ml de tampão de lise de EPR-1. O extracto de células solubilizadas foi então limpo de núcleos e de outros materiais insolúveis por centrifugação a 6 000 rpm durante 30 minutos a 4°C, e armazenado a -70°C até estar pronto para utilização.

isolamento por imunoafinidade da molécula EPR-1 a partir dos extractos de células solubilizadas com detergente preparados como anteriormente descrito, foi baseado na utilização de mAb | anti-EPR-1 12H1 (isotipo IgM). Aproximadamente 4 χ 10⁹ células solubilizadas como descrito foram incubadas com mAb 12H1 durante 16 horas a 4°C com agitação. A relação de mAb 12H1 utilizada foi de 1 ml de ascites/100 ml de lisado de EPR-1.

No fim da incubação, a molécula EPR-1 ligada ao mAb 12H1 foi isolada pela adição de alíquotas de 2 ml (5 mg) de IgM anti-rato de cabra covalentemente conjugada a Sepharose CL4B (imunossorvente de fase sólida) durante 6 horas adicionais a 4°C com agitação. No fim daguele período de tempo, o imunoprecipitado foi lavado cinco vezes em tampão de lise de EPR-1 por centrifugação a 3 000 rpm durante 20 minutos a 4°C.

761 / '

SCR 0734P/SCRF

233.0 (POR) -46Depois das lavagens, as pelotas de vários tubos foram reunidas, ressuspensas em 0,4 ml de tampão de amostra de SDS não reduzido, pH 6,8, fervidas durante 5 minutos para separar o antigénio do complexo de anticorpos, e finalmente separadas por electroforese num gel de SDS-poliacrilamida preparativo a 7,5%, aplicando uma corrente constante de 25 mAmps/gel. Após migração electroforética, os geles foram fixados em metanol, corados em Coomassie azul a 0,08% e descorados durante a noite em metanol a 10% e ácido acético a 5%.

Este procedimento de isolamento permitiu a visualização de uma banda de 78 kDa proeminente corada por Coomassie azul e de um segundo componente específico que migrou com um tamanho molecular de 66-68 kDa e que apareceu frequentemente como um dupleto de 66/68 kDa. Pensa-se que as espécies de 66/68 kDa são devidas à proteólise limitada ou à subglicosilação. A banda corada de 78 kDa foi cortada do gel preparativo utilizando-se uma lâmina de barbear, macerada em fragmentos pequenos com uma espátula e misturada com um tampão de digestão contendo glicerol a 20%, bromofenol azul a 0,1%, 125 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, SDS a 0,1%, pH 6,8. As bandas maceradas foram introduzidas em 6 cavidades num gel de SDS-poliacrilamida a 15% e cada amostra foi coberta com 40 μΐ de Endoproteinase G, grau de sequenciação (v8) à concentração final de 100 jug/ml.

As amostras foram pré-operadas a 50 mAmps até entrarem no gel de separação, digeridas durante um período de incubação de 30 minutos, e os fragmentos produzidos foram finalmente separados durante a operação electroforética remanescente. Os geles foram rapidamente embebidos em água após a migração, depois em tampão de transferência CAPS (ácido [3-(ciclo-hexilamino)propanossulfónico]; Calbiochem) contendo 10 mM de CAPS e metanol a 20%, e finalmente reunidos em membrana Immobilon num aparelho de transferência de gel. A transferência da proteína foi realizada a 450 mAmps durante horas à temperatura ambiente. As membranas Immobilon foram então removidas, embebidas em água, coradas durante 30-60 minutos em Coomassie azul, metanol a 50%, lavadas em água e descoradas

761

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233.0 (POR)

em ácido acético a 10% e metanol a 40%. Este procedimento permitiu a identificação directa de um certo número de bandas fortemente coradas por clivagem interna da molécula EPR-1 de banda a 78kDa e a separação electroforética subsequencial dos fragmentos correspondentes.

As bandas com interesse foram cortadas do transferido corado com base no seu peso molecular relativo e submetidas a análise de microssequência com NH₂ utilizando um Sequenciador de Fase de Vapor Applied Biosystems com HPLC em série disponível no núcleo de Microquímica do Research Institute of Scripps Clinic. As sequências peptídicas derivadas de um certo número de estudos conduzidos como acima descrito quer em células PMN quer em células T MOLT13 #3 foram analisadas pelo programa de computador GENALIGN (Intelligenetics, Inc.) num computador SUN e pelos programas WORDSEARCH (Univ. of Wisconsin Genetics Computer Group) num computador VAX 750. Como indicado na Tabela 1, todas as sequências peptídicas deduzidas derivadas da molécula EPR-1 mostraram um grau significativo de homologia exclusivamente com as proteínas de coagulação, factor V e VIII, e com uma molécula da superfície das células de murino recentemente descrita denominada MFG E-8 [Stubbs et al., Proc. Natl. Acad. Sei. u.s.A. 87:8417 (1990)], que compartilha homologias notáveis com estas duas proteínas de coagulação e a molécula EPR-1.

(Segue Tabela I)

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233.0 (POR)

-48TABELA 1

ALINHAMENTOS DA SEQUÊNCIA EPR-1*

RES. #	SEQUÊNCIA	RES. #	FONTE
SEQUÊNCIA EPR-1 #1
1	TLKG.QTQGAVMI • 1 1 1 1 1	12	EPR-1 #1
215	• · 1 llil RVSGYMTQGASRA * 1 1 1 1 1	227	MFG E-8
2099	IIHGIKTQGARQK II II 1 1 1 1 ·	2111	factor VIII (Cl)
1972	11 · 11 · 1111 · · IITGIQTQGAKHY	1984	factor V (Cl)
2033	IM III .·: KITAIITQGKDSI 1*1 * III 1 *	2044	factor V (C2) (Preferido)
2259	Ι·Ι·· III · 1 · KVTGVTTQGVKSL III* III *	2271	factor VIII (C2) (Preferido)
376	•III* III···· QVTGIITQGARDF * 1 1 1 1 1	388	MFG E-8 (Preferido)
1	• · · 1 1 1 1 1 TLKG.QTQGAVMI	12	EPR-1 #1

SEQUÊNCIA EPR-1 #2

1	PXIXQMDLL 1 1 1 * 1 1	9	EPR-1 #2
204	1 1 1 · · 1 1 PWI QVNLL II 1 1 1 1	211	MFG E-8
2089	II *1111 .WI KVDLL II 1 1 1 1	2095	factor VIII (Cl)
1963	II *1111 PWI QVDMQ III *1*11	1967	factor v (Cl)
204	III · 1 · 1 1 PWI QVNLL	211	MFG E-8

SEQUÊNCIA EPR-1 #3

1	ACKLREELHKX . I II II	11	EPR-1 #3
293	·Ι·ΙΙ II GCTLRFELLGC «III II	303	MFG E-8
2178	• 111 · 11 · RSTLRMELMGC 1 III II	2188	factor viu (ci)
2051	1 111*11 RPTLRLELQGC II II*	2061	factor V (Cl)
1	••II II· ACKLREELHKX	11	EPR-1 #3

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-49TABELA 1 (cont.)

ALINHAMENTOS DA SEQUÊNCIA EPR-1*

RES.		RES.
J	SEQUÊNCIA	#	FONTE
SEQUÊNCIA EPR-1 #4 1 VDKLAPRDP.LA	11	EPR-1 #4
173	• 1 ---1 II FMGLQRWQPELA 1 1 1 1	184	MFG E-8
2059	• · 1 1 · 11 SGQYGQWAPKLA	2070	factor VIII (Cl)
1926	1 -l-l Hl SEFLGYWEPRLA * 1 1 II	1937	factor V (Cl)
1	• I · — 1 II VDKLAPRDP.LA	11	EPR-1 #4

SEQUÊNCIA EPR-1 #5

274	FNPTLEAQ I .	281	MFG E-8
1	1 · · GVPPWT 1 1 · 1	7	EPR-1 #5
2032	1 1 · 1 · FDPPIVARY 1 · 1 1 1 · 1 1 1	2040	factor V (Cl)
2159	1 · 111 · 111 FNPPIIARY . I I . . II	2167	factor VIII (Cl)
2316	.. I I ... I I LDPPLLTRY 11**1	2324	factor VIII (C2) (Preferido)
1	1 1 · · 1 GVPPWT 1 1 ...	7	EPR-1 #5
2192	II··· FNPPIISRF 1*1 1 *	2200	factor V (C2) (Preferido)
434	FEKPFMARY	442	MFG E-8 (Preferido)

SEQUÊNCIA EPR-1 #6

262	GNLDNNSLKVN III * 1	272	MFG E-8 (Preferido)
1	III · · 1 GNSDAXYVKXV 1 1 1 1 1 *1	9	EPR-1 #6
2020	1 1 1 1 1 *1 GNSDASTIKEN II 1 1 II 1	2028	factor V (Cl) (Preferido)
2147	II 1 · 1 1 1 · 1 GNVDSSGIKHN II 1 1 II 1	2158	factor VIII (Cl) (Preferido)
2181	II 1 · 1 11 · 1 GNTNTKGHVKN 11·« II	2191	factor V (C2)
2304	II — -1 1 GNQDSFTPWN III -II	2314	factor VIII (C2)
422	III · · 1 1 GNLDNNSHKKN III 1	430	MFG E-8
1	III 1 GNSDAXYVKXV	9	EPR-1 #6

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233.0 (POR) -50TABELA 1

ALINHAMENTOS DA SEQUÊNCIA EPR-1*

RES. RES.

# SEQUÊNCIA_________#______FONTE

SEQUÊNCIA EPR-1 #7

353	INAWTAQSNSAKEWLQVD	370	MFG E-8
1	• · · · 1 II...... VQKLAEDENNAKKHVEPH 1 · : · · · · 11 · 1 · : 1 ·	18	EPR-1 #7
2109	VNAWQAKANNNKQWLEID :||| |||| ||	2126	factor V (C2)
353	INAWTAQSNSAKEWLQVD :|||	370	MFG E-8
2109	VNAWQAKANNNKQWLEID III * II 1 * 1 1 « * 1	2126	factor V (C2)
2235	SNAWRPQVNNPKEWLQVD : . : | | | :::: .	2251	factor VIII
1	VQKLAEDENNAKKHVEPH	18	EPR-1 #7

* A numenclatura de numeração para o factor V e factor VIII humanos é a do Banco de Dados de Proteínas NBRF e inclui os péptidos de comando na sequência (29 resíduos para o factor V e 19 resíduos para o factor VIII). A numeração de MFG E-8 é a de Stubbs et al.. Proc. Nat. Acad. Sei., 87:8417-8421 (1990), mas inclui o péptido de comando de 22 resíduos. A numeração da sequência do factor V e do factor VIII em Stubbs et al. é a do esquema NBRF menos 29 para o factor V e menos 19 para o factor VIII. | = identidade; : = substituição conservativa; . = substituição semi-conservativa. X é um resíduo de aminoácidos variável. Um espaço, quando presente numa sequência, é um intervalo introduzido para melhorar os alinhamentos da sequência. Observar que o factor V e o factor VIII têm dois domínios C e sequências altamente homólogos repetidos, assim há correspondências de homologia duplicadas. 0 domínio corresponde a Cl ou C2 e a homologia preferida está indicada quando devem ser considerados ambos.

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233.0 (POR)

6. A expressão de EPR-1 correlaciona-se com a resposta à terapia de CLL. A reactividade dos mAb anti-EPR-1 com as células sanguíneas periféricas isoladas de pacientes com doenças hematopoiéticas foi explorada com citometria de fluxo. Verificou-se que em 28 de 37 pacientes com CLL (75%), o número de células EPR-1⁺ aumentou 5-6 vezes, incluindo assim a maioria da população circulante, quando comparado com controlos normais (células EPR-1⁺ em dadores normais: 16,5±3,2%, n-12 versus células EPR-1’*' em CLL: 89,1+2,5%, n-28). O número de moléculas EPR-1 expressas em células CLL mostrou também um aumento médio de 2,5 vezes, quando comparado com controlos normais (fluorescência média de células normais EPR-1⁺: 85,6±16,1 versus CLL EPR-1⁺: 215,6±50,3). Aproximadamente 98% das células PMC foram positivas a este marcador. Os estudos de citometria de fluxo de duas cores confirmaram que em pacientes CLL quer o CD5 quer a EPR-1 foram simultaneamente coexpressas na mesma população de células. Finalmente, a análise sequencial de um grupo de pacientes CLL realizada durante um período de 4 meses (começando no dia 0) mostrou que a resposta biológica positiva à terapia estava frequentemente associada à redução drástica (6790% de redução) no número de células EPR-1⁺ detectadas. Os dados representativos dos pacientes são apresentados na Tabela 2, abaixo, e ilustram esta tendência.

Por consequência, a EPR-1 representa um novo marcador celular em CLL e a sua expressão à superfície correlaciona-se inversamente com a resposta biológica do paciente à terapia. Os dados realçam ainda a possibilidade da participação de mecanismos mediados por protease no desenvolvimento e/ou estabelecimento de doenças hematopoiéticas seleccionadas.

(Segue Tabela 2)

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233.0 (POR)

-52TABELA 2

Expressão	da EPR-1 em células	de leucemia*
Paciente #	Dia	% 12H1	% B78.9
1	0	91,5	74,4
	35	95,3	11,4
	70	9,2	49,6
2	0	46,8	52,8
	41	98,7	98,6
	75	5,2	32,8

3	0 36	98,3 66,7	92.6 83.7
4		0	25,4	32
		28	46,3	51,8
		56	2,9	1/4
		84	63	41,2
5		0	99,7	98,9
		55	21	43,8
6		0	94	31,2
		35	9/6	88,9
7		0	97	96,8
		34	75,8	87
8		0	96,7	88,4
		34	92,6	77,2
		69	82,2	12,2
* 0 12H1 e o	B78	.9 são anticorpos monoclonais e policlonais,
respectivamente,	como acima descrito	. Os	dados apresentados são
percentagens	de	células examinadas	que	expressam quantidades

supralimiares de EPR-1.

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233.0 (POR)

7. Produção por PCR de ADN de EPR-1. Utilizando-se as sequências de resíduos de aminoácidos obtidas para EPR-1 e apresentadas na Tabela 1, as moléculas iniciadoras foram identificadas por amplificação com PCR dos ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos EPR-1, incluindo a própria EPR-1. Por exemplo, os oligonucleótidos que se temperam (anneal¹') com a cadeia (-) do ADN e que codificam as sequências de resíduos de aminoácidos EPR-1 #1 e EPR-1 #3 são:

#1 5’-AAAGGICAGACICAGGGIGCIGTIATGAT-3·; #3 5 ^z-TGCAAAITIIGIGAAGAAITICACAAA-3’.

As sondas complementares das acima identificadas podem ser utilizadas para hibridar com uma cadeia ( + ) de ARN ou ADN. Em geral, deve ser utilizado um dos iniciadores acima apresentados com um iniciador complementar ao outro iniciador acima apresentado de forma a serem produzidos simultaneamente produtos de extensão quer nas cadeias (+) quer nas cadeias (-). Os iniciadores podem também ser prolongados para incluir locais de restrição e clonagem convenientes, quando desejado. Uma vez que um iniciador #1 se pode temperar (”anneal^H) em 5' e/ou 3^Z no iniciador #3, serão normalmente utilizados ambos os conjuntos de iniciadores e complementos de iniciadores, num protocolo PCR. As condições de reacção e o protocolo de ciclização para PCR são bem conhecidos e estão descritos acima. Nestas sondas nucleotídicas, A é adenina, G é guanina, C é citosina, T é timina e I é inosina.

8. Explicação dos exemplos 1-7.

Distribuição celular de EPR-1. Prepararam-se os anticorpos monoclonais contra V, a proteína plasmática circulante que se liga à serina-protease Xa da cascata de coagulação Xa [Nesheim,

M. , et al. _f J. Biol. Chem., 254:10952 (1979)]. Num estudo prévio, verificou-se que uma fracção menor deste mAb (painel I de mAb 7G12, 9D4 e 12H1) também reage com uma molécula de superfície expressa em várias linhas de células monocíticas mieloides [Altieri, D. et al.. J. Biol. Chem., 264:2969 (1989)]. Utilizando-se estudos de inibição de mAb e a reticulação química

73 761
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233.0 (POR)	-54-		«Γ

receptor-ligando, demonstrou-se que esta molécula imunorreactiva associada a células funciona como um receptor de elevada afinidade (K_d = 30 nM, n de cerca de 150 000) para Xa [Altieri, D. et al. . J, Biol. Chem., 264:2969 (1989)]. Neste estudo foi explorado o painel I de mAb para se caracterizar a distribuição e a identidade celulares do receptor serina-protease de membrana, putativo (EPR-1).

Como ilustrado na Figura 1, a reactividade do mAb anti-V do painel I não é uma característica excêntrica das linhas de células transformadas in vitro. O mAb 9D4, que reconhece um epítopo diferente do previamente identificado pelo mAb 7G12 [Altieri, D. C., J. Biol. Chem.. 264:2969 (1989)], reagiu com monócitos sanguíneos periféricos e PMN isolados com dextrano, embora com considerável heterogeneidade na última população (Fig. 1).

Quando as suspensões de PBMC foram analisadas por FMF, os mAb 7G12, 9D4 e 12H1 reagiram firmemente com uma população de células (5 a 20%) com a dispersão de luz dianteira dos linfócitos. Foram realizadas análises FMF de duas cores, simultâneas, para dissecar ainda o fenótipo desta população linfóide. Para estes estudos, as suspensões de PBMC foram preparativamente esgotadas de células aderentes quer por aderência ao plástico quer por fraccionamento em lã de nilão para produzir populações enriquecidas em PBL (linfócito sanguíneo periférico). Aproximadamente 50 por cento do subconjunto linfóide identificado pelos mAb 7G12, 9D4 ou 12H1 era 0KT3“ e expressou os marcadores associados a NK CD16 e CD56, como revelado pela ligação simultânea dos mAb Leu 11b, 3G8, B73.1 e NKH-1, respectivamente. Além disso, quando as populações enriquecidas de células NK (<3% de CD3⁺, >85% de CD16⁺) preparadas a partir de PBMC por fraccionamento em lã de nilão, formação de rosetas de SRBC (eritrócitos de ovelha) e selecção negativa com mAb OKT3, foram analisadas por FMF, os mAb 7G12 e 9D4 reagiram com 68 e 72% destas células.

Os PBL EPR-1⁺ remanescentes foram fenotipicamente es73 761...

SCR 0734P/SCRF

233.0 (POR)-55tabelecidos como linfócitos CD3⁺. A Tabela 3, a seguir, mostra um estudo representativo da caracterização por FMF de duas cores deste subconjunto EPR-1⁺. Embora tenham sido identificadas células duplamente positivas que coexpressam quer CD4 quer CD8, a última fracção exibiu fortemente uma maior frequência e uma intensidade de reacção muito maior com o mAb marcador de EPR-1.

Virtualmente, todas as células T EPR-1⁺ coexpressaram

também CDllb e CD57(Leu 7), como revelado pelos mAb OKM1 e HNK1, respectivamente, e aproximadamente 70 a 80 por cento eram CD2⁺(OKT11) (Tabela 3). Embora o subconjunto EPR-1⁺ seja predominantemente WT31⁺, aproximadamente 10% das células EPR-1⁺ (2% dos PBL não fraccionados, n = 3) mostraram ser reactivas com mAb anti- /<STCR <51. Os resultados quantitativamente comparáveis foram também obtidos quando foram realizadas as análises por FMF de duas cores dos PBL utilizando-se alíquotas conjugadas com biotina do anticorpo policlonal de coelho B78.9 ou o mAb 7G12 ou 9D4 directamente conjugado com FITC, em combinação com os vários mAb marcadores relacionados com anti-células T ou anti-células

NK.

TABELA 3

Caracterização por FMF de duas cores do subconjunto EPR-1⁺ de célulasT^a

mAb	Especificidade	Percentagem Relativa
Percentagem de PBL que coexpressam	Células que coexpressam no subconjunto EPR-1+
OKT3	CD3	9/6	73
OKT4	CD4	3,6	27
OKT8	CD8	7,4	56
OKT11	CD2	10,5	79
OKM1	CD11B	10,8	82
HNK-1	CD57	11,5	88
60.3	CD18	10,7	82
WT31	α/β TCR	8,1	61
51	/6 TCR	1,4	10
W6/32	MHC Classe	I 12,0	91

^a A análise por FMF de duas cores de PBL isentos de células

761

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233.0 (POR)

-56Z /

Z Z-j c

aderentes foi realizada como se segue: as suspensões de PBL foram esgotadas de células aderentes e separadamente coradas com alíquotas de mAb anti-CD16 Leu 11b, B73.1 ou 3G8, ou com mAb anti-CD56 NKH-1 (Leu 19) durante 30 minutos a 4°c. As células foram lavadas e incubadas com IgG + IgM anti-ratinho de F(ab')₂ de cabra conjugadas com fluoresceína durante 30 minutos adicionais a 4°C. Após extensas lavagens, as células foram equilibradas com 10 gg/ml de mAb 7G12 biotinilado, lavadas e incubadas com diluição a 1/20 de reagente conjugado com ficoeritrina-estreptavidina. As células duplamente positivas de um estudo representativo são indicadas pela população de PBL não fraccionados e relativas ao subconjunto EPR-1* (13,1%).

A EPR-1 é distinta de CDllb/CD18. A expressão de EPR-1 em monócitos, PMN, células NK e numa fracção de células T que é também predominantemente CD8⁺, parece imitar a distribuição celular da integrina de leucócitos CDllb/CD18 (Mac-1) [Sanchez Madrid, F., et al., J. Exo. Med., 158:1785 (1983)]. Por consequência, os estudos adicionais foram concebidos para estabelecer a estrutura recíproca e as propriedades funcionais de CDllb/CD18 e EPR-1. Para estes estudos, as suspensões de PMN que expressam níveis abundantes das moléculas CD11/CD18 [Sanchez Madrid, F., et al.. J. Exo. Med.. 158:1785 (1983)] foram marcadas à superfície com ¹²⁵I, solubilizado com detergente, e submetidas a imunoprecipitação utilizando ou o mAb anti-CD18

60.3 ou o mAb anti-EPR-1 12H1.

mAb 60.3 imunoprecipitou, a partir do lisado de PMN marcados com ¹²⁵I, os polipéptidos correspondentes às subunidades a das integrinas de leucócito CDlla, CDllb e CDllc em associação com a subunidade β comum de CD18, de acordo com as observações prévias [Sanchez Madrid, F., et al.. J. Exo. Med., 158:1785 (1983)]. Em contraste, sob as mesmas condições, o mAb 12H1 imunoprecipitou um componente de superfície maior possuindo uma massa molecular de cerca de 78±4 kDa. Funcionalmente, a CDllb/CD18 e a EPR-1 têm diferentes especificidades de reconhecimento de ligando. Embora a CDllb/CD18 tenha sido reconhecida como um receptor oligo-específico para C3bi, fibrinogénio e factor X [Sanchez Madrid, F., et al. , J. Exp. Med. . 158:1785 (1983); Altieri, D. et al. . J. Cell Biol., 107:1893 (1988); Wright, S. D., et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:7734 (1988); Altieri, D. et al.. J. Biol. Chem., 263:7007 (1988)], a EPR-1 liga a serina-protease activada Xa [Altieri, D. et al.. J. Biol. Chem., 264:2969 (1989)].

mAb anti-CDllb/CD18 não inibiu a função do receptor EPR-1 ⁷⁶¹ 7 _?

SCR 0734P/SCRF

233.0 (POR) -57- 7'^77 e o inverso também se aplica ao mAb EPR-1 no reconhecimento do ligando CDllb/CD18. Similarmente, os ligandos CDllb/CD18 solúveis, tais como o fibrinogénio [Altieri, D. et al. . J. Cell Biol., 107:1893 (1988); Wright, s. D., et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:7734 (1988)] e o factor X [Altieri, D. C., et al. . J. Biol. Chem., 263:7007 (1988)], não competem ou inibem o reconhecimento de receptor EPR-1 do Xa.

Expressão dinâmica regulada de EPR-1 em PBL. Foram concebidos estudos adicionais para explorar a possibilidade de uma modulação dinâmica da expressão de EPR-1 sob condições de activação de células T específica de antigénio ou conduzida por mitogénios. As PBMC recentemente isoladas foram colocadas em culturas de linfócitos misturados (MLC), unidireccionais, contra células B alogeneicas irradiadas, i.e., Raji (conduzidas por MHC classe I e II) ou Daudi (conduzidas por MHC classe II). Após cultura de 7 dias, as células T responsivas foram colhidas, lavadas e fenotipicamente caracterizadas por FMF utilizando mAb 7G12, 9D4 e 12H1.

Numa outra série de estudos, as PBMC foram separadamente cultivadas durante 7 dias na presença de 1 p.g/ml dos activadores policlonais (PHA) ou de Con A e depois submetidas a análise por FMF. Como mostrado na Figura 2, quer a expansão alogeneica de PBMC normais quer a activação de lectina resultaram num forte aumento de três a quatro vezes em células T EPR-1⁺, como reconhecido pelo mAb 12H1.

Para excluir a possibilidade de que a expansão observada de células 12H1⁺ resultasse de uma redistribuição selectiva de subconjuntos de células T, que ocorre após activação, as PBMC estimuladas por Con A foram sequencialmente analisadas por FMF após vários intervalos de tempo de cultura. A expansão quantitativa mediada por Con A do subconjunto EPR-1⁺ ocorreu em células com a dispersão de luz dianteira característica dos blastos activados em proliferação. O número destas células aumentou aproximadamente quatro vezes entre os dias 6 e 7 da cultura e quando estas células foram fenotipicamente caracterizadas por FMF de duas cores elas eram: CD3⁺, CD4”, CD8⁺, CD2⁺.

Foram realizados estudos adicionais para investigar os efeitos da estimulação alorreactiva a longo prazo na expressão de EPR-1. A MLC unidireccional contra células Daudi irradiadas foi mantida em cultura contínua com transferências semanais na presença de factor de crescimento de células T a 10% (TCGF). Foram colhidas alíquotas de células T responsivas, a vários

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233.0 (POR)

-58intervalos de tempo, recuperadas por centrifugação sobre FicollHypaque e finalmente analisadas para a expressão do marcador EPR-1 por FMF utilizando o mAb 12H1 ou o anti-soro policlonal B78.9. Estes dados estão sumarizados na Figura 3. O número de células EPR-1¹ detectadas pelo mAb 12H1 aumentou aproximadamente nove vezes durante a activação mediada por antigénio, após um mês de cultura. Foram também obtidos resultados similares utilizando-se o anti-soro policlonal B78.9, o que mostra uma maior reactividade compatível com o maior número de epitopos EPR-1 detectados por este reagente.

Foi realizado um conjunto de estudos adicionais, para distinguir entre a expansão selectiva de células EPR-1⁺ ou a expressão de novo deste marcador, que resulta da estimulação policlonal ou de antigénio. As suspensões de PBL recentemente isolados foram preparativamente fraccionadas em subconjuntos EPR-1⁴ e EPR-1^- por selecção por FMF com o mAb 12H1. Estas populações resultantes foram então separadamente cultivadas durante 10 dias com 1 ^g/ml de Con A, 5 gg/ml de PHA, ou estimuladas em resposta a linfócitos misturados com Daudi irradiada na presença de TCGF a 10% antes da análise por FMF da expressão de EPR-1. Os resultados destas experiências são mostrados na Tabela 4, a seguir. Quer a estimulação policlonal quer a estimulação por antigénio do subconjunto EPR-1 negativamente seleccionado estavam associadas à expressão de novo de EPR-1, como detectado por ligação do mAb 12H1.

TABELA 4

Expressão de novo da EPR-1, negativamente seleccionado, activada num após subconjunto EPR-1 cultura a curto termo^a

Subconjunto EPR-1

Estimulação Células Fluorescência

Subconjunto EPR-1⁺ Células Fluorescência

	Positivas (%)	(U)	Positivas (%)	(U)
—		0,2	5,5	77,5	102,1
PHA		6,8	78,3	ND	ND
Con	A	47,2	218,5	ND	ND
MLC	Daudi	45	82	91,8	83,1
a OS PBL	recentemente	isolados	foram fraccionados	em subconjun-
tos	EPR-1-	e EPR-1* por	FMF utilizando o mAb 12H1.	As populações

resultantes foram cultivadas na presença de 1 μ9/πι1 de Con A, 5 gg/ml de PHA ou estimuladas em MHC alogeneicas com células Daudi, durante 10 dias, antes da análise por FMF com o mAb 12H1

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233.0 (POR) anti-EPR-1. U = unidades

-59-	zz' c
arbitrárias.	(S 3

A EPR-1 expressa em células T é um receptor protease funcionalmente activo. Para justificar ainda a expressão de EPR-1 em populações linfóides descontínuas, foi analisado por FMF um certo número de linhas de células T transformadas in vitro utilizando-se o painel de mAb acima descrito. Como mostrado na Figura 4, das várias linhas de células T analisadas só uma subpopulação de células HuT 78 era reactiva com o mAb 7G12. Estas células foram isoladas para uma pureza >90% por selecção por fluorescência utilizando-se o anti-soro policlonal B78.9, para produzir a subpopulação HuT 78*, que foi então clonada por diluição limitante. Foram estabelecidos três clones, subclonados, fenotipicamente caracterizados por FMF como OKT3⁺, 0KT4⁺, 0KT8“, 12H1⁺, B78.9⁺, e um deles foi seleccionado para I investigações adicionais.

Quando as suspensões de HuT 78* foram equilibradas com concentrações aumentadas de ¹²⁵l-Xa, na presença de 2,5 mM de CaCl2, estas células ligaram-se ao ligando oferecido numa reacção específica e dependente da concentração, aproximando-se da saturação constante a 30 até 36 nM de ¹²⁵l-Xa adicionado (Tabela 5). Quantitativamente similar aos resultados previamente obtidos com as células THP-1 [Altieri, D. et al., J. Biol. Chem., 264:2969 (1989)], esta reacção foi regulada por um Kd aparente da ordem dos 10 a 20 nM e foi saturada quando 194 000 ± 26 000 moléculas de ¹²^I-Xa foram especificamente associadas à superfície de cada célula HuT 78*. Finalmente, a pré-incubação de células HuT 78* com quantidades saturantes do mAb 9D4 inibiu a ligação específica de ¹²⁵I-Xa a estas células.

»

TABELA 5 125j_Factor Xa l25i-xa liaado (moléculas/célula X103)
adicionado (nM)*	mAb 9D4	Sem mAb
1,5	1	6
5	8	26
8	20	50
18	33	140
27	58	170
36	76	200
*Ligação do 125I-factor Xa a células HuT que reagem com o anti-soro policlonal	78*. As células HuT 78* de coelho B78.9 foram

isoladas para uma pureza de 94,2% por selecção de fluorescência e clonadas por diluição limitante. Foram estabelecidos três

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233.0 (POR)

-60clones, fenotipicamente caracterizados e um seleccionado (HuT 78*-3) para investigações adicionais. As suspensões de células HuT 78*-3 a 1 X lO^/ml foram separadamente incubadas com o anticorpo de controlo ou com 50 ptg/ml do mAb 9D4 anti-EPR-1, durante 30 minutos à temperatura ambiente, antes da adição de concentrações aumentadas de ¹²⁵I-factor Xa (0,45 para 36 nM) e

2,5 mM de CaCl₂ durante 20 min adicionais à temperatura ambiente. A reacção foi parada por centrifugação através de uma mistura de óleos de silicone e calculou-se, na presença ou ausência de mAb 9D4 anti-EPR-1, a ligação específica de ¹²⁵I-Xa às células HuT 78*.

Conclusão

Caracterizou-se a reactividade de um painel de mAb com um receptor protease da superfície da célula expressa nalguns leucócitos. Em estudos prévios, mostrou-se que um mAb originalmente criado contra a proteína de coagulação plasmática V (7G12) se ligou numa reacção específica e saturável às linhas de células mielóides monocíticas THP-1, U937 e HL-60 [Altieri, D. et al.. J. Biol. Chem., 264:2969 (1989)]. Além disso, por analogia com a função conhecida de aceitador/cofactor da proteína plasmática Va [Nesheim, Μ. E., et al. , J. Biol. Chem., 254:10952 (1979)], a molécula reconhecida nestas células pelo mAb 7G12 pareceu estar implicada numa função de receptor específica para a serina-protease Xa.

Foi agora criado um painel de mAb anti-V. Os hibridomas que segregam aqueles mAb foram seleccionados por análise por FMF das células THP-1 e os mAb foram utilizados como sondas para procurar a expressão da molécula que reage cruzadamente na superfície da célula V em células sanguíneas periféricas.

A primeira conclusão que pode ser retirada destes estudos é a de que a molécula reconhecida por estes mAb, operativamente definida como EPR-1, não é inapropriadamente expressa só pelas linhas de células transformadas, em cultura. Em vez disso, ela tem uma vasta distribuição celular e uma associação notável com células da linhagem mielóide e linfóide. Embora com uma heterogeneidade considerável entre as várias populações examinadas, estes mAb que definem a EPR-1 mostraram ser reactivos com monócitos sanguíneos periféricos, PMN, e células NK CD3“ CD16⁺CD56⁺.

Uma pequena fracção das células T circulantes foi também identificada, de modo interessante, como EPR-1⁺. A caracterização fenotípica deste subconjunto por FMF sugeriu que

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233.0 (POR)

-61a expressão de EPR-1 não parece ser segregada numa única subpopulação definida por marcadores de células T correntemente conhecidos. Embora a maioria das células T EPR-1⁺ isoladas a partir de vários dadores fossem também CD8⁺ ou a/j8TCR⁺, foram também identificadas células que coexpressam CD4 ou /5TCR. De acordo com esta verificação, a análise por FMF de várias linhas de células T transformadas in vitro. revelou a expressão de marcadores EPR-1 em células MOLT 13 que foram, adicionalmente, fenotipicamente estabelecidos como CD4⁺ e TCR /5⁺, respectivamente, de acordo com as observações prévias [Lefranc, Μ. P., et al., Nature, 316:464 (1985); Brenner, Μ. B., et al., Nature. 325:689 (1987)].

Na fracção CD8⁺ de PBL normais, a expressão de EPR-1 foi compativelmente associada à coexpressão de CDllb(Leu 15) e CD57(Leu 7), como identificado pelos mAb OKM1 e HNK-1. Em estudos anteriores, este padrão de marcadores foi associado à função supressora [Clement, L. T. , et al. . J. Immunol.. 133:2461 (1984); Fox, E. J., et al. . J. Exp. Med. . 166:404 (1987); Takeuchi, T., et al., Cell. Immunol., 111:398 (1988)] e à actividade LAK [Dianzani, et al., Eur. J. Immunol., 19:1037 (1989)]. Contudo, em contrário com a fraca resposta proliferativa anteriormente descrita deste subconjunto de células T [Fox, E. J., et al., J. Exp. Med., 166:404 (1987)], observa-se que a expressão da EPR-1 é fortemente aumentada quer por estimulação com mitogénios quer por estimulação com antigênios.

Esta verificação pareceu ser particularmente realçada em estudos que utilizam culturas a longo prazo de células T estimuladas, alorreactivas, onde o anticorpo policlonal de coelho anti-EPR-1 B78.9 reagiu virtualmente com todas as células responsivas após um mês de cultura. Similarmente, observou-se também a expressão de EPR-1 de novo após estimulação policlonal ou por antigénio, a curto prazo, das populações EPR-1 preparativamente seleccionadas. Embora estes dados pareçam ser compatíveis com a hipótese de que a EPR-1 é uma verdadeira molécula responsiva à activação de células T, são necessárias investigações adicionais ao nível da célula clonal simples para subscrever conclusivamente esta possibilidade. Finalmente, de acordo com a expressão quer de CD4 quer de CD8, não foi observada qualquer expansão preferencial das células EPR-1⁺ pela estimulação alogeneica de MHC ou da classe I ou da classe II.

Embora a distribuição celular da EPR-1 se assemelhe muito à da integrina de leucócito CDllb/CD18 [Sanchez Madrid, F., et

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-62al. . J. Exp. Med. , 158:1785 (1983 )], as análises de estrutura/função reveladas por estudos de imunoprecipitação e as análises de ligação de ligandos marcados com ¹²⁵I demonstraram claramente que estas são duas moléculas diferentes implicadas em funções de reconhecimento de receptor distintas e diferentes [Altieri, D. et al., J. Biol. Chem., 264:2969 (1989); Sanchez Madrid, F., et al., J. Exp. Med., 158:1785 (1983); Altieri, D.

C., et al., J. Cell Biol., 107:1893 (1988); Wright, S. D., et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:7734 (1988); Altieri, D. C., et al.. J. Biol. Chem., 263:7007 (1988)].

Este estudo não foi concebido para subscrever a relação recíproca entre a EPR-1 celular e a proteína plasmática V, que serviu originalmente como um imunogénio para criar o mAb antiEPR-1 utilizado. Contudo, é importante observar que o painel de ) mAb anti-EPR-l descrito (painel I), só constitui uma fracção menor dos hibridomas anti-V eliciados por imunização com o factor V. De facto, um segundo painel de mAb anti-V criado e estabelecido sob protocolos idênticos e seleccionado para a produção de mAb imunorreactivos com o factor V não exibiu reactividade cruzada com células THP-1. Além disso, o tamanho (78±4 kDa) e a organização estrutural da EPR-1 resolvidos em estudos de imunoprecipitação exibiu notável similaridade de tamanho para a cadeia leve do factor Va da proteína plasmática [Nesheim, M. E., et al., J. Biol. Chem., 254:10952 (1979)]. Com base nestas considerações, pensa-se que a EPR-1 representa uma molécula da superfície da célula homóloga à proteína de coagulação plasmática V que mantém alguns epítopos imunorreactivos conservados funcionalmente associados ao reconhecimento do ligando.

►

Actualmente, não se sabe se a expressão da EPR-1 em várias populações de leucócitos implica o seu envolvimento em funções imunoefectoras específicas. Contudo, a observação de que as células NK e as células T CD8⁺ expressam um receptor serina-protease de elevada afinidade é estimulante, tendo em vista a identificação de uma família de serina-proteases (granzimas) muito relacionadas, contidas nos grânulos de clones de NK e CTL de humano e ratinho [Masson, D., et al., Cell. 49:679 (1987)]. Estas enzimas partilham de uma homologia significativa com um certo número de serina-proteases, particularmente com o factor IXa, Xa das proteases de coagulação e a plasmina [Jenne, D., et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:4814 (1988); Gershenfeld, H. K., et al., Science, 232:854 (1986); Jenne, D., et al., J. Immunol., 140:318 (1988); Lobe, C. G., et al., Science. 232:858 (1986); Gershenfeld, Η. K., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,

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-6385:1184 (1988)]. È também digno de atenção que a modulação dinâmica da expressão e secreção de genes das granzimas sejam aumentadas pelos mesmos estímulos que estão associados à expressão da EPR-1 aumentada in vitro, i.e., à resposta a longo prazo ao antigénio e à IL-2 [Manyak, C. L., et al., J. Immunol., 142:3707 (1989); Masson, D., et al.. EMBO J.. 4:2533 (1985)]. Embora o papel das granzimas celulares na morte de NK ou CTL permaneça por elucidar [Dennert, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 84:5004 (1987)], tem sido sugerido pelas experiências que utilizam inibidores serina-proteases um papel putativo para as serina-proteases, no processo lítico, [Redelman, D., et al. . J. Immunol., 124:870 (1980); Chang, T. W., et al. . J. Immunol., 124:1028 (1980); Suffys, P., et al.. Eur. J. Biochem., 178:257 (1988); Scuderi, P., J. Immunol.. 143:168 (1989)].

Por analogia com o conceito geral de amplificação mediada por receptor das actividades proteolíticas [Miles, L. A., et al., Fibrinolysis. 2:61 (1988); Morrisey, et al., Cell, 50:129 (1987); Nesheim, Μ. E., et al. . J. Biol. Chem.. 254:10952 (1979)], pensa-se que as granzimas localmente libertadas possam interagir com um componente de membrana na célula efectora para distribuir uma eficácia catalítica óptima, protegida da neutralização pelos inibidores protease circulantes. Neste contexto, a EPR-1 podia incorporar os requisitos para um receptor de superfície expresso pelas células imunoefectoras, que apresentam um reconhecimento de ligando para uma serina-protease prototípica e altamente conservada, tal como o factor Xa, e dinamicamente regulada por estimulação antigénica.

Em conclusão, utilizando uma estratégia não comum para a selecção de mAb, foi identificado um novo marcador de leucócitos, um receptor serina-protease e um homólogo aparente da proteína de coagulação plasmática V da superfície da célula. Por causa da sua distribuição notável em células imunoefectoras, propõem-se o nome ⁿEPR-l para se identificar experimentalmente esta molécula. Embora seja realçado o papel da EPR-1 no mecanismo de formação de fibrina mediado por células, pelo seu reconhecimento de Xa [Nesheim, Μ. E., et al., J. Biol. Chem. , 254:10952 (1979)], pensa-se que o largo espectro de actividades biológicas mediadas por serina-proteases implica o envolvimento da EPR-1 no reconhecimento de ligando(s) adicional(is) e nas funções mediadas por células.

Embora o presente invento seja descrito com algum detalhe por meio de ilustração e exemplo, com a finalidade da clareza, podem ser praticadas certas modificações no âmbito das

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reivindicações anexas.

Claims (20)

1. REIVINDICACÕES

   1 - Proteína purificada, caracterizada por possuir um peso molecular de cerca de 78 kD e incluir as seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:

   Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile;

   Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu; Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys;

   Val-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala;

   Gly-Val-Pro-Pro-Val-Val-Thr;

   Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-LysLys-His-Val-Glu-Pro-His-Ala-Thr, onde Xaa é um resíduo de aminoácido não especificado.
2. 2 - Proteína purificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por imunorreagir ainda com anticorpos monoclonais segregados pelo hibridoma 12H1 possuindo o n^fi de acesso ao ATCC HB 10637.
3. 3 - Segmento de ADN isolado, caracterizado por codificar uma proteína que possui um peso molecular de cerca de 78 kDa e que inclui as seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:

   Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile;

   Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu;

   Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys;

   Val-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala; Gly-Val-Pro-Pro-Val-Val-Thr;

   Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e

   Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-LysLys-His-Val-Glu-Pro-His-Ala-Thr, onde Xaa é um resíduo de aminoácido não especificado.
4. 4 - Molécula de ADN auto-replicante, caracterizada por incluir um segmento de ADN que codifica uma proteína que possui um peso molecular de cerca de 78 kDa e que inclui a seguinte sequência de resíduos de aminoácidos:

   Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile;

   Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu; Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys;

   Val-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala;

   Gly-Val-Pro-Pro-Val-Vai-Thr;

   Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-LysLys-His-Val-Glu-Pro-His-Ala-Thr, onde Xaa é um resíduo de aminoácido não especificado.

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   233.0 (POR)
5. 5 - Polipéptido, caracterizado por compreender até cerca de 600 resíduos de aminoácidos possuindo uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada de entre o grupo consistindo em: Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile; Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu;

   Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys; Val-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala; Gly-Val-Pro-Pro-Val-Val-Thr;

   Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-LysLys-His-Val-Glu-Pro-His-Ala-Thr, onde Xaa é um resíduo de aminoácido não especificado.
6. 6 - Segmento de ADN isolado, caracterizado por codificar um polipéptido que compreende até cerca de 600 resíduos de aminoácidos possuindo uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada de entre o grupo consistindo em:

   Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile;

   Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu;

   Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys;

   Val-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala;

   Gly-Val-Pro-Pro-Val-Val-Thr; Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-LysLys-His-Val-Glu-Pro-His-Ala-Thr, onde Xaa é um resíduo de aminoácido não especificado.
7. 7 - Molécula de ADN auto-replicante, caracterizada por incluir um segmento de ADN que codifica um polipéptido que compreende até cerca de 600 resíduos de aminoácidos possuindo uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada de entre o grupo consistindo em:

   Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile;

   Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu;

   Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys;

   Val-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala;

   Gly-Val-Pro-Pro-Val-Val-Thr; Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-LysLys-His-Vai-Glu-Pro-His-Ala-Thr, onde Xaa é um resíduo de aminoácido não especificado.
8. 8 - Polipéptido que imunorreage com um anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma 12H1 possuindo o n² de acesso ao ATCC HB 10637, polipéptido este que inclui uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada de entre o grupo consistindo em:

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   233.0 (POR) —67—

   Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile;

   Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu;

   Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys;

   Vai-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala;

   Gly-Val-Pro-Pro-Val-Val-Thr;

   Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e

   Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-LysLys-His-Vai-Glu-Pro-His-Ala-Thr, onde Xaa é um resíduo de aminoácido não especificado.
9. 9 - Polipéptido de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o polipéptido ligar factor Xa humano.
10. 10 - Polipéptido de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o polipéptido ter um peso molecular de 78±4 kDa.
11. 11 - Polipéptido de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o polipéptido ser isolado de uma linha de células seleccionada de entre o grupo constituído por THP-1, neutrófilos, células NK e MOLT 13 #3 possuindo o n^a de acesso ao ATCC CRL 10638.
12. 12 - Composição de anticorpos, caracterizada por possuir um local de combinação de anticorpo, que imunorreage com uma proteína isolada da linha de células MOLT 13 #3 possuindo o n^a de acesso ao ATCC CRL 10638, proteína esta que possui um peso molecular de cerca de 78 kDa e que inclui as seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:

    Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile;

    Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu;

    Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys;

    Val-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala;

    Gly-Val-Pro-Pro-Val-Val-Thr; Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-LysLys-His-Val-Glu-Pro-His-Ala-Thr, onde Xaa é um resíduo de aminoácido não especificado.
13. 13 - Composição de anticorpos de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por ser produzida pelo hibridoma 12H1 possuindo o n^a de acesso ao ATCC HB 10637.
14. 14 - Processo para análise da presença de um receptor da superfície celular numa amostra corporal, caracterizado por compreender os passos de:

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    233.0 (POR) (a) misturar uma amostra corporal, contendo células a ser analisadas relativamente ao referido receptor da superfície celular e sendo substancialmente desprovida de factores V e VIII, com uma composição de anticorpos que inclui um local de combinação de anticorpo que imunorreage com uma proteína que inclui as seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:

    Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile; Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu; Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys; Val-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala;

    Gly-Val-Pro-Pro-Val-Val-Thr; Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-LysLys-His-Val-Glu-Pro-His-Ala-Thr, onde Xaa é um resíduo de aminoácido não especificado;

    (b) manter a referida mistura durante um período de tempo suficiente para que se forme um produto de imunorreacção; e (c) determinar a presença do referido produto e, assim, a presença do receptor na referida amostra corporal.
15. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por se fixar uma porção da referida amostra corporal a um suporte sólido, a referida mistura de imunorreacção compreender uma fase sólida e uma fase líquida, e o referido produto de imunorreacção se formar na fase sólida.
16. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por se isolar a proteína da linha de células MOLT 13 #3 possuindo o n^H de acesso ao ATCC CRL 10638.
17. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a composição de anticorpos compreender anticorpos produzidos pelo hibridoma 12H1 possuindo o n^a de acesso ao ATCC HB 10637.
18. 18 - Processo para controlar a resposta de um paciente atingido por uma condição de doença correlacionada com células de tumor que expressam EPR-1 a um protocolo de tratamento, caracterizado por compreender:

    (a) misturar uma amostra corporal do paciente com uma composição de anticorpos que inclui um local de combinação de anticorpo que imunorreage com uma proteína que inclui as seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:

    Thr-Leu-Lys-Gly-Gln-Thr-Gln-Gly-Ala-Val-Met-Ile;

    Pro-Xaa-Ile-Xaa-Gln-Met-Asp-Leu-Leu;

    Ala-Cys-Lys-Leu-Arg-Glu-Glu-Leu-His-Lys;

    73 761

    SCR 0734P/SCRF

    233.0 (POR) —69—

    Val-Asp-Lys-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Leu-Ala;

    Gly-Val-Pro-Pro-Val-Val-Thr;

    Gly-Asn-Ser-Asp-Ala-Xaa-Tyr-Val-Lys-Xaa-Val; e Val-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn-Asn-Ala-LysLys-His-Val-Glu-Pro-His-Ala-Thr , onde Xaa é um resíduo de aminoácido não especificado;

    (b) manter a referida mistura durante um período de tempo suficiente para que se forme um primeiro produto de imunorreacção;

    (c) determinar uma primeira quantidade de produto de imunorreacção formado;

    (d) repetir os passos (a)-(b) numa segunda amostra corporal do paciente, depois de um período de tratamento;

    (e) determinar uma segunda quantidade de produto de imunorreacção formado; e (f) determinar a diferença entre as referidas primeira e a segunda quantidades de produtos de imunorreacção formados e assim a resposta do paciente ao protocolo de tratamento.
19. 19 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a composição de anticorpos compreender anticorpos produzidos pelo hibridoma 12H1 possuindo o n^a de acesso ao ATCC HB 10637.
20. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a composição de anticorpos imunorreagir com uma proteína isolada de uma linha de células seleccionada de entre o grupo constituído por THP-1, monócitos, neutrófilos, células NK e MOLT 13 #3 possuindo o n² de acesso ao ATCC CRL 10638.