JPH06506696A - 凝固因子５および８に相同な細胞表面レセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新しい種類の細胞レセプター分子に関する。レセプター分子は幾つか の凝固補因子たとえばヒト凝固因子ＶおよびＶ［［Ｉと相同である。機能的には レセプター分子は例えば循環性タンパク質因子Ｘａ、因子ＩＸ／ＩＸａおよびプ ラスミン（プロスミノーゲン）のようなセリンプロテアーゼリガンドに結合する 。

ここでＥＰＲ−１と呼ばれる好ましいレセプター分子はヒト因子■と相同である が異なっており因子Ｘａに結合する。ＦＰＲ−１に相同なアミノ酸残基配列を含 むポリペプチドもまた企図されている。

本発明の好ましい実施態様は、分子量約７８ＫＤａでかつ下記のアミノ酸残基配 列 （１１Ｔｈｒ−Ｌａｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａ ｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−工１ｅｉ（２１Ｐｒｏ−Ｘａａ−工１ｅ−Ｘａａ　−Ｇ ｉｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌａｕ−Ｌｅ東（３）　Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅ ｕ　Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−）１ｉｓ−Ｌｙｓ；（４１Ｖａｌ−八ｓ ｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌ ａ；（５）　Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ；（６ １Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−人１ａ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ −Ｘａａ−Ｖａｌ　；および（７１Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ− Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ−Ｈｉ ｓ−Ｖａｌ−に１ｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ　。

（Ｘａａは自然に存在するアミノ酸残基のようにタンパク質中にあり、修飾され たか、または普通でない（例えばグリコジル化した）残基を含む、不特定のアミ ノ酸である））を含むアミノ酸残基配列を有する精製されたタンパク質である。

Ｘａａ残基は分子中において別のＸａａ残基と同一であるかそれ以外の物である 。

本発明のさらに好ましい態様においてタンパク質は１２ＨＩ　（ＡＴＣＣ受託番 号　ＨＢ　Ｉ　ＯＳ　３７）と命名されたハイブリドーマにより産生される抗体 と免疫反応をする。本発明のさらに好ましい態様において、タンパク質はＭＯＬ Ｔ１３＃３　（ＡＴＣＣ受託番号　ＣＲＬ　１０６３８）と命名された細胞系か ら単離されたＥＰＲ−１タンパク質である。

本発明の他の好ましい実施態様は、上記の配列の群（１）−（７）から選択され たアミノ酸残基配列を含む約６００までのアミノ酸残基から成るポリペプチドで ある。

また、本発明において、上記のようなタンパク質またはポリペプチドをコードす るＤＮＡセグメントおよびベクター（すなわちＤＮＡセグメントを含む自己複製 ＤＮＡ分子）も企図されている。

本発明の好ましい態様において、本タンパク質またはポリペプチドと免疫反応す る抗体組成物が企図されている。特に好ましい抗体組成物は１２Ｈ１ハイブリド ーマから産生されるモノクローナル抗体である。他の好ましい抗体組成物は分子 量約７８ＫＤａを有し上記のアミノ酸残基配列を含むＭＯＬＴ１３＃３細胞系よ り単離されたタンパク質と免疫反応する。

細胞表面の本レセプター分子の存在をアッセイする方法もまた考慮されている。

方法は （ａ）ハイブリドーマ１２Ｈ１のような、上記抗体組成物とレセプター分子を発 現すると推測される細胞または細胞溶解物を混合し、（ｂ）免疫反応産生物を形 成するのに十分な時間混合物を維持し、（Ｃ）免疫反応産生物の存在を測定し、 それによってレセプター分子の存在を検出する、工程を含む。

また、疾病状態のマーカーとして用いられる患者から採取された体内サンプル中 の細胞に局在化した上記のタンパク質と関連する疾病を有する患者の治療にたい する応答を監視する方法も考慮されている。方法は上記の抗体組成物を用いてマ ーカーについてアッセイし、一連の治療の後アッセイを繰り返し、治療の後、存 在するその細胞表面タンパク質の量の関数として治療に対する患者の応答を測定 する。監視される例示的な疾患は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。

アミノ酸残記配列：隣接した残基間のペプチド結合により結合された２またはそ れ以上のアミノ酸残基の連続はペプチドまたはポリペプチドを形成する。アミノ 酸残基配列は、その構成アミノ酸の１または３文字の略号により便利に表される 。ここでアミノ酸のために用いられる略号は３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，９１，８２２（ｂ ）（２）で提供されているものであり、次の対応表に再現されている。

対応表 Ｆ　Ｐｈｅ　フェニルアラニン Ｓ　Ｓｅｒ　セリン エ　エ１ｅ　イソロイシン ＨＨユＳ　ヒスチジン Ｑ　Ｇｉｎ　グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ｚ　Ｇｌｘ　Ｇｌｕお！Ｕ／まｒ；はＧｌｎｗ　Ｔｒｐ　）リブトファン ＲＡｒｇ　アルギニン Ｄ　Ａｓｐ　アスノくラギン酸 Ｎ　Ａｓｎ　アスパラギン Ｂ　Ａｓｘ　Ａｓｎおよび／またはＡｓｐｃ　Ｃｙｓ　システィン Ｊ　Ｘａａ　未特定 ここでアミノ酸残基配列を含む個々の残基は、所望の機能的性質がアミノ酸残基 配列を組み込んでいる分子により保持されている限り、ＤまたはＬ異性体である 。

また、アミノ酸残基配列は翻訳後修飾アミノ酸を含み、例えばヒドロキシルイヒ グリコキシル化アミノ酸残基または、ジスルフィド結合により結合した残基であ る。更に、アミノ酸残基配列は、ここで参照欄に編入されている、例えば３７Ｃ ・Ｆ、Ｒ，ａｌ、８２２　（ｂ）（４）中に記載されているような１またはそれ 以上の修飾された、または普通でないアミノ酸を含む。アミノ酸残基配列はその 構成するアミノ酸に対応する略号により代表さね、そこにおいて２つの隣接する 略号間のハイフンは対応する残基間のペプチド結合を示す。

抗体・ハブテン群、すなわちリガンドに化学的に結合するポリペプチド。ここで 用いられている抗体は免疫グロブリン分子および免疫学的に活性な免疫グロブリ ン分子のフラグメントである。当業上知られているＦａｂ、Ｆａｂ”、Ｆ（ａｂ ′）２およびＦｖのような部分を含む。通常、抗体は約１０’　−１０”Ｍ−’ でカリ１００Ｍ−１まで高い範囲の会合定数を有する約６−約３４人大きさの範 囲のリガンドに結合する。抗体はステロイドおよびプロスタグランジンのような 小さな分子、核酸、タンパク質および多糖のようなバイオポリマー、そしてポリ プロピレンのような合成ポリマーを含む広い範囲のリガンドに結合できる。“抗 体結合部位”は抗原に特異的に結合する（免疫反応する）ＨおよびＬ鎖可変領域 および高度可変領域を含む抗体分子の構造部分である。その種々の形態で用語“ 免疫反応″はここで用いられ、抗原決定基含有分子（抗原）と全抗体分子または その部分のような抗体結合部位を含む分子との結合を意味する。“抗原決定基″ は、抗体結合部位により免疫学的に結合される抗原の構造部分である。用語はま た“エピトープと相互交換的に用いられる。抗体は抗原の単一のエピトープ（モ ノクローナル）または複数のエピトープ（ポリクローナル）に結合できる。

リガンド：通常、静電力および／または水素結合により特定のレセプター分子に 特異的に結合する構造領域を有する分子。

ペプチド／ポリペプチド：隣接する残基がｌ残基のα−アミノ基と隣接する残基 のカルボニル基とのペプチド結合により結合している、少なくとも２つのアミノ 酸残基を含むポリマー。ポリペプチドの第一次構造はポリマーの１末端に第一ア ミン基そして他の末端にカルボン酸基を有する。したがって、ポリペプチドは式 ： により表され、ここでＲは所定のアミノ酸残基に特徴的な側鎖であり、そして１ は数か２かそれ以上であるポリマーを含むアミノ酸残基の数を示す。ポリペプチ ドは１またはそれ以上のアミノ酸残基配列を含む。また、水溶液中のポリペプチ ドは溶液のｐＨにより通常ｌまたはそれ以上の両性イオン型である。

タンパク質　単一のポリペプチドまたは約５０アミノ酸残基以上からなる交差結 合したポリペプチド。タンパク質は、同じポリペプチド鎖または隣接するポリペ プチド間での化学的交差結合、すなわちジスルフィド結合を有し得る。タンパク 質はグリコジル化し、その場合それらは糖タンパク質と呼ばれる。

造領域を存する生物的に活性なタンパク性分子。

Ｂ　ポリペプチド 本発明のポリペプチドはエフェクター細胞プロテアーゼレセプター（ＥＰＲ）と 呼ばれる、新しい種類の細胞表面レセプターから得られる。なぜならその種類の 構成員はプロテアーゼリガントと結合し、また、多くの型の炎症性エフェクター 細胞に見い出される。このクラス（ＥＰＲ−１）の第一の構成員は、ヒトファク ターＸａか反量であるプロテアーゼリガンドと結合することが示されている。

本発明のポリペプチドはアミノ酸残基配列においてＥＰＲ−１の１またはそれ以 上のアミノ酸残基配列に対応する。さらに、本発明のポリペプチドはヒト凝固因 子Ｖのアミノ酸残基配列と頚著な相同性を有することが示されておりこれは因子 ＶとＥＰＲ−１との共通の進化上の起源を示唆している。因子Ｖが因子Ｖａの残 基配列を含むように、本ポリペプチドもまた因子Ｖａと相同性を有する。本発明 のポリペプチドはまた配列において因子ＶＩ［Ｉのポリペプチド部分ならびにＭ ＦＧ　Ｅ−８と呼ばれるマウスタンパク質のポリペプチドと相同性を示す。［５ ｔｕｂｂｓ　ｅｔ　ａ！、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８７：８４１７　（１９９０）］、それにもかかわらず、本発明のポ リペプチドは因子Ｖ、因子Ｖ［ＩＩ　、またはマウス　ＭＦＧ　Ｅ−８とは異な る。

本発明の好ましい態様において、ポリペプチドは下記のアミノ酸残基配列＝（１ ）　Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ａｌ ａ−Ｖａｌ”Ｍａｔ−工１ｅ；（２）　Ｐｒｏ−Ｘａａ−工１ｅ−Ｘａａ−Ｇｉ ｎ−Ｍａｔ−Ａｓｐ−Ｌａｕ−Ｌｅｕ　；（コ）　Ａｈａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌ ｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ；（４）Ｖａｌ−Ａｓ ｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−人１ ａ；（５）　Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ；（６ ）　Ｇｌｙ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ａｓｐ−人１ａ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｖａ　１−Ｌ ｙｓ−Ｘａａ−Ｖａ　ｌ　；および（７）　Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ− 人１ａ−Ｇ１．ｕ−人５ｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ −Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ　。

（Ｘａａは不特定アミノ酸残基として分子で存在する）を含む分子量約７８ＫＤ ａを存するタンパク質である。Ｘａａ残基は修飾されたか、または普通でない残 基（ｃｆ、３７　Ｃ，Ｆ、　Ｒ，ｆｉｌ、８２２　（ｂ）　（４））を含む任意 の自然に発生するアミノ酸残基である。また、Ｘａａ残基は特定のアミノ酸残基 配列またはＸａａ残基を有する分子の他の配列において、他のＸａａ残基と同じ である必要はない。特徴的には、タンパク質はポリアクリルアミドゲル電気泳動 で測定されたように分子量７８±４ＫＤａを有する。（各アミノ酸残基配列に関 わる数字は３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，９１，８２１（Ｃ）の必須要件に応じてここに提供 される配列リストに示されている配列番号を示す） さらに好ましい実施態様において、タンパク質はＭＯＬＴ１３＃３と命名された 細胞系より単離され、分子量約７８ＫＤａを有する。ＭＯＬＴ１３＃３細胞系は アメリカ合衆国　２０８５２　メリーランド州ロツクヴイル、バークローンドラ イブ１２３０１のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託 された。この細胞系は１９９１年１月１１日こ寄託され受託番号ＣＲＬ　１０６ ３８を受けた。

本寄託はブタペスト条約の必須要件に従ってなされ、寄託の期間は寄託の日付か ら３０年間または寄託期間での寄託物に対する最後の請求後５年間またはこの出 願から満期となる米国特許の有効期間、これらのうちのいずれかより長いもので ある。細胞系は寄託期間において生存しえないものとなった場合は補充される。

本発明の他の態様において、タンパク質はヒト因子Ｖにだいする幾つかの抗血清 、ならびに（例えば固定され精製されたヒト因子Ｖの免疫吸着により）抗血清か ら精製されたポリクローナル抗体と免疫反応する。本発明のさらに別の態様にお いて、タンパク質はヒト因子ＶＩＩＩに対する抗体と免疫反応する。従って、本 ＥＰＲタンパク質は、それ自体ヒト因子ＶまたはＶＩ［［タンパク質ではないが 、因子■およびＶＩＩ［の幾つかのエピトープに対するリガンドと交差反応する エピトープを保有する。

本発明のさらに別の好ましい態様において、単離されたタンノくり質は、上記の ようにブタペスト条約に従いＡＴＣＣに１９９１年１月１１日に寄託された１２ Ｈ１と命名されたハイブリドーマにより産生される、より少ない組の抗体と免疫 反応する。そのハイブリトーマはＡＴＣＣＨＢ＋０６３７と命名された。

別の態様において、この発明のポリペプチドは下記の式により表されるアミノ酸 残基配列を存し Ｈ−Ｘ、−Ｙ−Ｘ、−ＯＨ ここてＹはＥＰＲ−１に存在する上記のアミノ酸残基配列（１）−（７）の群か ら選ばれたアミノ酸残基配列；Ｘｎはｎ＝０の場合存在せずｎ＝１の場合、約５ ５０残基までを含むＮ−末端（リーダーセグメントおよび成熟タンノ（り質）ア ミノ酸残基配列である。そしてＸｍはｍ＝ｏの場合存在しなく、ｍ＝１の場合、 約５５０残基までを含むＣ−末端（テールセグメント）アミノ酸残基配列である 。

ポリペプチドは約６００までのアミノ酸を含む。

好ましくは、ＸｎまたはＸｍのどちらかがアミノ酸残基配列の場合、Ｘｎまたは Ｘｍは約２００残基までを含み、さらに好ましくは、約５０残基まで、そして最 も好ましくは約２０アミノ酸残基までを含む。通常ＸｎおよびＸｍはそれぞれｌ またはそれ以上の上記のアミノ酸残基配列を含む。

本発明のさらに別の好ましい態様において、ＸｎおよびＸｍはポリペプチドがヒ ト因子■にたいして産生された抗体を含む血清と免疫反応をするように選択され る。さらに好ましくはＸｎおよびＸｍは、ポリペプチドが分子量約７８ＫＤａを 有するタンパク質であるように選択される。最も好ましくは、単離されたタンパ ク質はまたヒト因子Ｘａと結合する。さらに別の好ましい実施態様において本発 明のポリペプチドは式・ −Ｙ−ＯＨ （ここにおいてＹは上記に定義されているものである）を有する。

本発明のポリペプチドはここに記載されている方法により、種々の有用な抗体を 産生ずるために用いることかできる。ポリペプチドの有用性は下記に提供される 考察から明らかとなろう。

通常本ポリペプチドはグリコツル化しているものでなく、すなわちそれは標準的 ペプチド合成技術により直接、または、本発明の組み換えＤＮＡ分子の原核宿主 発現により合成される。本発明の真核生物により産生されたポリペプチドは、通 常グリコジル化している。

本ブリペプチドは、得られるポリペプチド分子が所望の性質を示す限り保存的ま たは非保存的なアミノ酸残基の挿入、欠失、および、置換のような種々の変化を 組み込むことかできる。ここで意味する“所望の性質′はポリペプチドが好適な 宿主において免疫原性であり、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて見られるような少 なくとも変性状態においてしかし多くの場合、細胞に発現されるような自然な状 態においてもＥＰＲ−１分子、または、ＥＰＲ−１に相同なポリペプチドに対す る抗体を産生できることを含む。さらに、ポリペプチドは細胞で発現された場合 、または、その変性状態において抗原性なのでＥＰＲ−１分子と免疫反応する抗 体はまた本ポリペプチドと免疫反応する。

本ポリペプチドが上記ＥＰＲ−１に対応する配列の保存性置換を含む場合、置換 されるアミノ酸残基は、生じるポリペプチドが因子Ｖ、因子Ｖ［Ｉ［の配列、ま たは配列ＭＦＧ　Ｅ−８と異なる（以外の）アミノ酸残基配列を有するように別 の生物的に同様なアミノ酸残基により置換される。保存性置換のいくつかの例は 他の疎水性残基の代わりに、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、またはメ チオニンのような疎水性残基の置換を含む。また、例えばアルギニン、グリシン 、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン等のような極性残 基はこの群の他の構成員と保存的に置換され得る。置換アミノ酸残基が未置換親 アミノ酸残基を置換する場合、保存性置換を含むポリペプチドのさらに別の状態 が発生する。置換アミノ酸の例は、３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，６１，８２２（ｂ）（４） に見られ、その種は、ここの参照として導入する。ポリペプチドがＥＰＲ−１の 配列に対応するアミノ酸残基配列を育するがｌまたはそれ以上の保存性置換を有 する場合、天然タンパク質のアミノ酸残基の、好ましくは、約４０％のみ、さら に好ましくは約２０％のみが置換される。

本発明のポリペプチドは当業者に知られている任意のペプチド合成法により合成 される。利用可能な技術のいくつかの要約は、その記載がここの参照欄に編入さ れているＪ、Ｍ、　５ｔｕａｒｄ　ａｎｄ　Ｊ、Ｄ、　Ｙｏｕｎｇ、”５ｏｌｉ ｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ”AＷ。

Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　（１９６９） 、　Ｊ、　Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ、　”Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐ窒盾狽■奄獅■ ａｎｄＰｅｐｔｉｄｅｓ”　ｖｏｌ、　２．　ｐｐ、４６．　Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒ’ｋ）　１９８３、そしてA米 国特許第４，６３１，２１１号に見られる。本発明において用いられる所望のポ リペプチドが比較的短い場合（約５０アミノ酸残基未溝の長さ）、例えば、Ｍｅ ｒｒｉｆｉｅｌｄ［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　ＪＡＣＳ、８５：２１４９　（１９ ６３）］の固相法を通常使用する直接ペプチド合成法が通常適している。

本ポリペプチドは組み換えＤＮＡ法により合成することもできる。このような組 み換え法は、所望のポリペプチドが比較的長い場合、（約５０アミノ酸残基以上 の長さ）特に適している。組み換えＤＮＡ法を用いて本ポリペプチドを調製する 場合、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントを事前に選択したベク ターに組み込み、その後好適な宿主において発現する。上記のＥＰＲ−１に対応 するアミノ酸残基配列（１）−（７）の少なくとも１つを含む、発現されたポリ ペプチドは例えばゲル電気泳動、免疫吸着、クロマトグラフィーなどのような通 常の方法により生成されることが好ましい。

Ｃ，ＤＮＡセグメント 組み換えＤＮＡ法を用いて本発明のポリペプチドを調製する場合、ポリペプチド をコードするＤＮＡセグメントを用いる。本発明で考慮されるＤＮＡセグメント は好適な宿主中においてその後発現されるベクターに結合される。よく知られて いるように、セグメントがベクターに（共有結合で）結合（ｌｉｇａｔｅ）して いる場合、セグメントは、ここで用いられているベクターに“機能的に結合″し ている。

また、本ＤＮＡセグメントに同等のＲＮＡセグメントも考慮されている。

本ＤＮＡセグメントは化学的方法、例えば、良く知られているホスホトリニスタ ー法［Ｍａｔｔｅｕｃｉ　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＡＣＳ、　１０３：３１８５　（ １９８１月により容易に合成され得る分子である。ＤＮＡセグメントを化学的に 合成することにより、鋳壓ポリペプチド、例えば、天然タンパク質からのアミノ 酸残基または配列の、望ましい置換、挿入、または欠失は、単にＤＮＡセグメン トのヌクレオチド配列において対応する変化を作ることにより容易に提供される 。

本ポリペプチドをコードするＲＮＡセグメントが用いられる場合は常に、ポリペ プチドコードセグメントを含むＲＮＡ分子は逆転写酵素により相補性ＤＮＡ（ｃ ＤＮＡ）に転写される。続いて、ｃＤＮＡ分子を、ここで記載されているように 転写し、翻訳し、所望のポリペプチドを産生ずる。本発明の好ましい態様におい て、上記のＥＰＲ−１のアミノ酸残基配列（＋）−（７）の少なくとも１つをコ ードするＤＮＡヌクレオチド配列（セグメント）は、より大きなりＮＡ分子と機 能的に結合している。続いて、得られたＤＮＡ分子を好適な宿主を用いて形質転 換しそこで発現する。

上記のアミノ酸残基配列（１）−（７）をコードするＤＮＡセグメントは、開始 および終了コドンと共に与えられ、開始および終了コドンの１つまたは両方はよ り大きなりＮＡ分子、例えばＤＮＡと機能的に結合したベクターにより提供さね 、その結果、対応するポリペプチドが生成される。また、さらに別のアミノ酸残 基をコードするヌクレオチド配列はＤＮＡセグメントの３′およびまたは５′末 端に提供され、その結果大きなポリペプチドはＥＰＲ−１分子の上記のアミノ酸 残基配列（＋）−（７）に加えてそのＮ−末端およびＣ−末端のどちらかまたは 両方にアミノ酸残基配列を有して発現される。本発明のＤＮＡ分子は式。

Ｈ−４−Ｙ−Ｘ、−ＯＨ で表されるアミノ酸残基配列を有するポリペプチドをコードしここでＸｎ５Ｙ、 およびＸｍは前記の通りである。好ましくはＤＮＡセグメントは約６００アミノ 酸残基までの長さのポリペプチドをコードする。ＤＮＡセグメントが、アミノ酸 残基配列としてＸｎまたはＸｍを有するポリペプチドをコードする場合、Ｘｎま たはＸｍは約２００残基まで、さらに好ましくは５０残基まで、最も好ましくは 約２０アミノ酸残基まで含有する。通常ポリペプチドのＹ配列をコードするＤＮ Ａセグメントのフランキング領域の１つまたは両方は上記の１またはそれ以上の アミノ酸残基配列（１）−（７）をコードする。

本ＤＮＡ分子は酵素法により生成することもできる。従って、あらかしめ決めら れた認識配列でＤＮＡ分子を切断する制限酵素を用いてＥＰＲ−１タンパク質を コードするＤＮＡ　（またはＲＮＡ）のような所望のＤＮＡセグメントを含む大 きなりＮＡ配列からＤＮＡセグメントを単離する。通常、この様な方法で生成さ れるＤＮＡフラグメントは、−重鎮ヌクレオチド配列が分子の二本鎖部分を越え る、粘着“突き出し′末端を有する。そのような粘着末端の存在は一般に平滑末 端ＤＮＡ分子よりも好ましい。続いて所望のコード配列を含む単離されたフラグ メントを増殖および発現のために好適なベクターに結合（クローン化）する。

さらに、本ＤＮＡセグメントは鋳型核酸の標的ＤＮＡセグメントを増幅するポリ メラーゼチェーンリアクンヨン（ＰＣＲ）法により生成される。ＰＣＨにおいて 、特定のヌクレオチド標的を反応により転写し、ここにおいて核酸鋳型の特定の 部分に相補性のプライマー分子を用いて標的に相補性の核酸領域を含むプライマ ーの伸長生成物を作る。鋳型と伸長したプライマーの分離後、各プライマー伸長 生成物は、鋳型として役割を果たし相補性プライマー分子と特異的にアニーリン グする。得られるプライマーの付いた鋳型はさらに別の伸長反応の基質として働 く。これらの工程を、好ましくは自動サイクリング方法を用いて繰り返し、それ によりプライマーがハイブリッド形成する最初のポリヌクレオチドの指数増幅を 行う。ＰＣＲを行う方法はその記載がここの参照として編入されている、例えば 、米国特許第４，６８３，１９５号および第４．６８３，２０２号に詳しく記載 されている。

ここでのＰＣＲ法使用において、前記に列挙したアミノ酸残基配列（１）−（７ ）の１またはそれ以上をコードするＤＮＡプライマーを使用することが好ましい 。しかしながら、さらに別のヌクレオチド配列はＥＰＲ−１およびそのアミノ酸 残基の少ない配列をコードする、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをクローニングす ることにより明らかになる。標的ＥＰＲ−１アミノ酸残基配列をコードするＤＮ ＡまたはＲＮＡとのハイブリッド形成の特異性を最大にし、因子ｖ１因子Ｖ［１ １または相同な非標的分子をコードするＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリッド形 成を最小にするために、因子ＶまたはＶ［ＩＩに最小の相同性を育するＥＰＲ− １アミノ酸残基配列をコードするＤＮＡプローブ分子を通常用いる。しかしなが らプローブ分子の相同性に関するそのような“経験に基づく方法”は好適なプロ ーブを同定するのに重要でなく、事実、細胞が因子ＶまたはＶＩ＋＋を発現しな いと調べられた場合、全く適切でない。同じアミノ酸残基にたいして異なるコド ンを用いて標的アミノ酸残基配列をコードする、混合した余分なプライマーを用 いることももちろん企図されている。

Ｄ、ベクタ一 本発明は、本ＤＮＡセグメントと機能的に結合し、好ましくは、ＥＰＲ−１タン パク質自体を発現する本ポリペプチドをコードする自己複製組み換えＤＮＡ分子 を提供することができるベクターを企図している。組み換え分子を用いて好適な 宿主細胞を形質転換し、その結果、宿主細胞は所望のポリペプチドを発現する。

従って、ＤＮＡ分子は自己複製と考えられる。

本発明のＤＮＡセグメントが機能的に結合されるベクターの選択候補は、当業上 良く知られているように所望の機能的特徴、例えば、発現効率、宿主細胞の形質 転換等に依存する。しかしながら、本発明のベクターは、本ポリペプチドをコー ドするＤＮＡセグメントの複製、そして、好ましくは、発現も導くことが少なく ともできる。

好ましくは選択されたベクターは原核生物レプリコン、すなわち、それにより形 質転換された原核生物宿主細胞中の染色体外で組み換えＤＮＡ分子の直接的自己 複製と維持を導くことができるＤＮＡ配列を含む。そのようなレブリフンは当業 上良（知られている。さらに原核生物レプリコンを含むベクターは、薬剤耐性遺 伝子も含むことがさらに好ましく、その結果、ベクターで形質転換された宿主は 容易にスクリーニングされ得る。典型的なバクテリアの薬剤耐性遺伝子はアンピ シリンまたはテトラサイクリンへの耐性を与えるものである。

原核生物レプリコンを含むベクターは本ポリペプチド遺伝子の転写を導くことが できる原核生物プロモーターを含むことが好ましい。プロモーターはＲＮＡポリ メラーゼの結合および単一鎖ＤＮＡをメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）分子 への転写を促進するＤＮＡ配列により形成された発現制御要素である。ｔａｃプ ロモーターのようにバクテリア宿主と適合するプロモーター配列は本発明のＤＮ Ａセグメントの挿入のために便秤な制限部位を有するプラスミドベクターに通常 提供されている。そのようなベクタープラスミツドの典型はＢｉｏｒａｄ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎ、　ＣＡ）から入手できるｐＵＣ８，ｐ ＵＣ９，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２９およびＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔ ａｗａｙ、ＮＪ）から入手できるｐＰＬとｐＫＫ２２３である。

真核生物細胞と適合する発現ベクターは、好ましくは、を椎動物細胞と適合する ものを用いて上記の組み換えＤＮＡ分子を作ることもできる。真核生物細胞発現 ベクターは当業上良く知られ、いくつかの市販のものが入手可能である。通常、 そのようなベクターは所望のＤＮＡセグメントの挿入のために便利な制限部位と ともに提供される。そのようなベクターの典型はｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　、ｐ　Ｂ　ＰＶ−１ｐＭＬ　２　ｄ　（Ｉｎｔｅｒｎ ａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　ＩｎメA　） およびｐＴＤＴｌ　（ＡＴＣＣ，＃３１２５５）である。真核生物細胞に適合す るベクター中で用いる好ましい薬剤耐性マーカーは、ネオマイシンホスホトラン スフェラーゼ（ｎ　ｅ　ｏ）遺伝子である［５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｅｔ　ａｔ、、 　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１：３２７−３４１（１９８ ２）］。

本発明の組み換えＤＮＡを生成することができるレトロウィルス発現ベクターも また企図されている。所望のＤＮＡ分子を生成するためのレトロウィルスベクタ ーの構築および使用はＳｏｒｇｅ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ ｉｏｌ、、４：１７３０−３７（１９８４）に記載されている。

相補性粘着末端によりＤＮＡを機能するようにベクターに結合するために多くの 方法が可能である。例えば相補性ホモポリマーは挿入されるＤＮＡセグメントお よびベクターＤＮＡに加える。続いてベクターおよびＤＮＡセグメントは相補性 ポリマーチイル間の水素結合によりハイブリッド形成し組み換え二本鎖ＤＮＡ分 子を形成する。

または１またはそれ以上の制限部位を含む合成リンカ−を用いてＤＮＡセグメン トをベクターに結合する。上記のようにＤＮＡセグメントをエンドヌクレアーゼ 制限消化により生成した場合、突出する３′一本鎖末端を取り除き、へこんだ３ ′末端を充填するＥ、Ｃｏ１１　ＤＮＡポリメラーゼ■のバクテリオファージＴ ４ＤＮＡポリマラーゼで処理する。その結果平滑末端ＤＮＡセグメントが生成さ れる。

平滑末端ＤＮＡセグメントを、例えばバクテリオファージＴ４ＤＮＡライゲーズ のような平滑末端ＤＮＡ分子の結合を触媒することができる酵素の存在下におい て過剰モルのリンカ−分子とインキュベートする。したがって、反応の生成物は その中に制限部位を育するリンカ−配列とその末端で結合しているＤＮＡセグメ ントである。続いて、これらＤＮＡセグメント制限部位を適切な制限酵素で切断 し、切断ＤＮＡセグメントとそれと適合する末端を有する発現ベクターに結合す る。種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ−はＩｎｔｅｒｎａｔ 　ｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　（Ｎｅｗ　Ｈａｖ ａｎ、　ＣＴ）を含む多くの供給源から市販されている。

Ｅ、宿主の形質転換 本発明はまた、本発明の組み換えＤＮＡ分子で形質転換される宿主細胞に関する 。宿主細胞は原核生物であるかまたは真核生物である。好ましい原核生物宿主細 胞はＥ、ｃｏｌｉ、株、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍc。

から入手可能なＥ！、Ｃｏ１１株ＤＨ５である。好ましい真核生物宿主細胞は酵 母および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、モンキー、またはヒト繊維 芽細胞系のようなを椎動物細胞を含む。好ましい真核宿主細胞はＡＴＣＣからＣ ＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＡ ＴＣＣからＣＲＬ　１６５８として入手可能なＨＩＨスイスマウス胎児細胞を含 む。本発明の組み換えＤＮＡ分子との適切な細胞宿主の形質転換は、使用される ベクターの型に通常依存する良く知られた方法により達成される。原核生物宿主 細胞の形質転換については例え１よ１！ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｒ＋ｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｌｔ≠獅■ ａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２jを参乳 本ポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウィルスベクターでのを椎動物 細胞の形質転換については例えばＳｏｒｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ １１．　Ｂｉｏｌ、、４：１７３０−３７（＋９８４）を参照。

形質転換に成功した細胞、すなわち本発明の組み換えＤＮＡ分子を含むものは良 く知られている方法で同定できる。例えば形質転換細胞をクローン化し、モノク ローナルコロニーを生成する。これらのコロニーからの細胞を収穫し、溶解しそ して５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８：５０３　（１ ９７５）により記載されている方法を用いて所望のＤＮＡセグメントの存在につ いてそれらのＤＮＡ含有物を調べる。

所望のＤＮＡセグメントの存在を直接アッセイするのに加わえて、ＤＮＡが本発 明のポリペプチドの発現を導く場合、形質転換の成功は良く知られている免疫学 的方法によって確認される。形質転換されていると推測される細胞を収穫し本ポ リペプチドに特異的に結合する抗体により抗原性をアッセイする。

形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明はこれら細胞の培養も考慮してい る。形質転換宿主細胞を培養をするために有用な栄養培地は当業上良く知られて おり、いくつかの市販の供給源より入手できる。宿主細胞が哺乳動物である実施 態様において、″血清を含まない′培地を用いることが好ましい。

培養物から発現されたタンパク質を回収する方法は当業上良く知られている。

例えばゲルろ過、ゲルクロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、イオン交換、 親和性クロマトグラフィー、および関連した方法を用いて培養物中に見い出され る発現されるタンパク質を単離する。さらに、免疫化学的方法、例えば、免疫親 和、免疫吸着など、ここに記載された方法により例示されているような良く知ら れた方法を用いて行う事ができる。

Ｆ、抗体組成物 また、本発明は、本ポリペプチドと免疫反応する抗体組成物も企図されている。

抗体組成物は、細胞表面と結合しているか、または、細胞構造から遊離している ポリペプチドと免疫反応する。従って、抗体組成物は、細胞の外部表面のポリペ プチドによって提示されるｌまたはそれ以上のエピトープまたは、細胞から遊離 したポリペプチドのエピトープに結合する。

本発明の好ましい抗体組成物は細胞表面に提示されるか、またはＥＰＲ−１分子 がその分子を単離する細胞の溶解後に単離される場合のように細胞成分から遊離 している、ＥＰＲ−１タンパク質分子と免疫反応する。この点で特に好ましい抗 体組成物は、７Ｇ１２．９Ｄ４．および１２Ｈ１と命名されたモノクローナル抗 体（ｍＡｂ）である。そのようなｍＡｂはこここでおよびＡｌｔｉｅｒｉ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６４（５）：２９６９　（１９８９）、ＡＩｔｉ ｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　１４５：２S６　（１９９０） に記載されているように入手される。もちろんポリクローナル抗体も考慮されて いる。

簡単にのべると、好ましい抗体組成物は、ヒト因子Ｖ、因子ＶＩｌ［または本発 明のポリペプチドでマウスを免疫化することにより産生される。産生された抗体 はＥＰＲ−１のような本発明のポリペプチドにたいする結合親和性についてスク リーニングされる。単離されたＥＰＲ−１または因子Ｖ、または因子ＶＩ［Ｉを 含まない洗浄されたリンパ球のＥＰＲ−１を用いて抗体をスクリーニングするこ とができる。

通常、本ｍＡｂは因子Ｖおよび因子Ｖと相同性を有するこの発明の標的ポリペプ チドの両者と免疫反応する。しかしながら、因子Ｖに相同であるが同一でないポ リペプチドを用いて本ｍＡｂを入手した場合、ｍＡｂは、選択的に標的ポリペプ チドと免疫反応するが血液凝固因子とは免疫反応しない。ｍＡｂは、また、因子 Ｖとの反応と同じように因子ＶＩｌ［タンパク質と免疫反応する。

本発明の抗体は、凝固因子Ｘａのレセプターに結合することができるので、それ らを用いて因子Ｘａが細胞表面の部位に結合するのを競争的に阻害することがで きる。したがって細胞表面の領域の因子Ｘａのプロテアーゼ活性は低減される。

そのような結合を阻害する方法は当業者に良く知られている。

ここで考慮されている好ましい抗体組成物は、ヒト因子■または本発明ポリペプ チドを含む接種物で哺乳動物を免疫化し、それによって免疫原性ポリペプチドに たいして適切な免疫特異性を有する哺乳動物抗体分子を誘発することにより、通 常産生される。続いて抗体分子を哺乳動物から集めスクリーニングし、良く知ら れている方法、例えば、固体支持体に固定された免疫原にたいする免疫親和性に より所望の程度に生成する。この様に産生された抗体組成物は、とりわけ本発明 の診断方法およびシステムにおいて用いられ、細胞表面（例えば、慢性リンパ性 白血病（ＣＬＬ）の患者の白血球）の本ポリペプチドの発現を検出する。

上記のように、モノクローナル抗体組成物（ｍＡｂ）もまた、本発明において企 図される。種々の文法的形態における用語“モノクローナル抗体組成物′は、特 定の抗原と免疫反応することができる単一種の抗体結合部位を有する抗体分子の 群をいう。したがって本ｍＡｂ混合物は任意の抗原（それと免疫反応する）にた いして単一の結合親和性を通常示す。しかしながら、所定のモノクローナル抗体 組成物は２つの異なる抗体結合部位を有する抗体分子を含みそれぞれが異なる抗 原決定基に免疫特異的である。（すなわち、二特異的モノクローナル抗体）本ｍ Ａｂは、通常、一種類の抗体分子だけをを分泌（産生）する、ハイブリドーマと 呼ばれる単一細胞のクローンにより産生される抗体からなる。ハイブリドーマ細 胞は抗体産生細胞とミエローマまたは、他の永続性細胞系と融合することにより 形成される。そのような抗体はＫｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎ ａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７　（１９７５）によりはじめて記載された 。とくに好ましいハイブリドーマは、１２Ｈ１（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ　１０６ ３７）と命名されている。

モノクローナル抗体は当業者に良く知られているキメラ抗体を産生ずる方法によ り産生できる。これらの方法は、免疫グロブリンＬ鎮の可変領域を含む可変領域 の部分および免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を含む可変領域の部分の両方を含む 、免疫グロブリン可変領域の全部か、または一部をコードする核酸を単離、操作 、そして、発現させることを含む。原核生物および真核生物宿主において、可変 領域をコードする核酸を単離、操作、および、発現する方法はＲｏｂｉｎｓｏｎ 　ｅｔ　ａｌ、。

ＰＣＴ公開第ＷＯ８９１００９９号；　Ｗｉｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ヨーロッ パ特許公開第０２３９４００号；Ｒｅａｄｉｎｇ、米国特許第４．７１４．６８ １号；　Ｃａｂｉｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ、、ヨーロッパ特許公開第０１２５０２３ 号：　Ｓｏｒｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　！Ｊｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　４ ：１７３０−１７３７　（１９８４）；　Ｂｅｈｅ秩@ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２４０：１０４１−１０４３　（１９８８）：　５ｋｅｒｒ ａ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｄｉｅｎｃｅ、　２４０：１０３０|１０４１ （１９８Ｂ）；　ａｎｄ　０ｒｌａｎｄｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８６：３８３３−３W３７ （１９８９）に開示されている。通常、核酸は事前に選択された抗原（リガンド ）に結合する免疫グロブリン可変領域の全部か、または一部をコードする。その ような核酸の供給源は当業者に良く知られており、例えば事前に選択された抗原 に結合するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマから入手できるか、ま たは事前に選択された抗原を用いて複数の免疫グロブリン可変領域をコードする 発現ライブラリーをスクリーニングし、その結果、核酸を単離する。

本発明は、本発明のポリペプチドと免疫反応するモノクローナル抗体分子を形成 する方法、そして選択的には、哺乳動物から得られる因子Ｖまたは因子Ｖｌ１１ タンパク質を考慮している。方法は、 （ａ）この発明のポリペプチドと相同なタンパク質、例えば因子Ｖまたは、　Ｖ ｔｔＩタンパク質で動物を免疫化する工程を含む。好都合なことに、免疫原は、 被験体動物種から直接取れるタンパク質である。しかしながら、抗原は、キーホ ールリンペットヘモシアニンのような（例えば、上記のアミノ酸残基配列（１） −（７）から基本的にはなるポリペプチドのように抗原が小さい場合）キャリア タンパク質に結合する事もできる。免疫化は、通常、試料を免疫学的にコンピテ ントな哺乳動物に免疫学的に作用のある量（すなわち、免疫応答を生成するのに 十分な量）を投与することにより、行われる。好ましくは、哺乳動物は、ウサギ 、ラット、マウスのような、げっ線類である。続いて、動物が免疫原と免疫反応 する抗体分子を分泌する細胞を産生するのに十分な時間動物を維持する。

（ｂ）続いて、免疫（ｔＪ乳動物から回収された抗体産生細胞の懸濁物を続いて 調製する。これは当業上良く知られている方法を用いて、通常、哺乳動物の牌臓 を取り出し、生理学的に許容される培地中で個々の牌臘細胞を機械的に分離する ことにより達せられる。

（Ｃ）懸濁された抗体産生細胞を、形質転換（“不死性”）細胞系を産生ずるこ とができる形質転換剤で処理する。不死化細胞系を産生ずるための形質転換剤お よびその使用は当業上良く知ら托例えば、エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ） 、シミアンウィルス　４０　（ＳＶ４０）　、ボリオマウイルス等のＤＮＡウィ ルス、例えばモロニームリン白血病ウィルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）　、ラウス内積 ウィルス等のＲＮＡウィルス、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓ　ｐ　２１０− Ａｇ　１４のようなミエローマ細胞を含む。　好ましい実施態様において、形質 転換剤での処理は、懸濁された牌臓細胞と好適な細胞系（例えば、５Ｐ−２）お よび好適な融合促進物を用いることにより、不死化ハイブリドーマの産生を生じ る。

好ましい割合は、約１０”の牌臓細胞を含む懸濁液において１ミエローマ細胞あ たり約５牌臓細胞である。好ましい融合促進剤は約１０００−約４０００の平均 分子量を有するポリエチレングリコールである（市販されているＰＥＧ１０００ 等）、シかし当業上知られている他の融合促進剤も使用することができる。

用いられる細胞系は、いわゆる“薬剤耐性型であることが好ましく、その結果、 未融合ミエローマ細胞は選択培地において生存しないが、ノゾブリツドは生存す る。最も普通の種類は、エンザイムヒボキサンチングアニンホスホリボシルトラ ンスフェラーゼを欠き、したがって、ＨＡＴ　（ヒボキサンチン、アミノプテリ ン、およびチミジン）により維持されない８アザグアニン耐性細胞系である。

また、一般に用いられるミエローマ細胞系が任意の抗体をそれ自体生成しない、 いわゆる“非分泌堅であることが好ましい。しかしながらいくつかの場合におい て、分泌ミエローマ系が好ましい。

（ｄ）続いて、形質転換細胞をクローン化し、好ましくは、モノクローン化する 。

クローニングは、非形質転換細胞を持続（維持）させない組織培地において行う ことが望ましい。形質転換細胞力かイブリドーマである場合、通常、未融合ミエ ローマ細胞を維持しない選択培地中の未融合牌臓細胞、未融合ミエローマ細胞、 および融合細胞（ハイブリドーマ）の混合物を別々の容器中で希釈し、培養する ことにより行われる。細胞を未融合細胞の死が可能になる十分な期間（約１週間 ）この培地で培養する。希釈は限界希釈であり、ここにおいて希釈液の容量は統 計学的に計算され、それぞれ別々の容器（例えば、マイクロタイタープレートの 各ウェル）中のある細胞数（例えば０．３−０．５）を単離する。培地は薬剤耐 性（８アザグアニン耐性）未融合ミエローマ細胞系を維持しないもの（例えば、 ＨＡＴ培地）である。

（ｅ）クローン化した形質転換体の組織培養培地を分析しく免疫学的にアッセイ し）本ポリペプチドまたはＥＰＲ−ルセブター分子を担持する細胞と優先的に反 応する抗体分子の存在を検出する。これは、よく知られている免疫学的な方法を 用いて達成される。

（ｆ）続いて、所望の形質転換体を選択し適切な長さの時間、適切な組織培地に おいて培養し、よく知られた方法により、培養上清から所望の抗体を回収（収穫 ）する。適切な培地および培養時間の長さもよく知られており、容易に決定され る。

因子Ｖとの免疫化により誘発されるＥＰＲ−１に対するモノクローナル抗体は比 較的希であることが注目される。事実、上記方法により誘発されたモノクローナ ル抗体の約１％だけがＥＰＲ−１と免疫反応する。

さらに高い濃度の、多少純粋性の少ないモノクローナル抗体を産生ずるために、 所望のハイブリドーマをマウス、好ましくは同系または半間系マウスに注射によ り移入する。ハイブリドーマは適切なインキュベーション期間の後、抗体産生腫 瘍の形成を生じ宿主マウスの血流および腹腔滲出液（腹水）において高い濃度の 所望の抗体（約５−２０ｍｇ／ｍｌ）を生じる。

これら組成物の調製のために有用な培地および動物は両方とも当業上良く知られ ており市販され、そして合成培地、近文マウス等も含む。例示される合成培地は グルコース４．５ｇｍ／Ｌ　２０ｍＭグルタミンおよび２０％ウシ胎児血清を補 充したダルベツコ最小必須培地［ＤＭＥＭ；　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ｅｔ　ａｔ、 、　Ｖｉｒｏｌ、　８：３９６　（＋９５９）］である。好ましい近交マウスは Ｂａ１ｂ／ｃである。

本発明の抗体分子を産生（分泌）する本ハイブリドーマを産生ずる方法は当業上 よく知られておりここでさらに記載される。関連するハイブリドーマ法の特別に 適用される記載はＮｉｍａｎｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０：４９４９−４９５３（１９８３）、およびＧ ａ１ｆｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　７３：３−４６ 　（１９８１）により示され、その記載はここの参照欄に編入されている。

本抗体組成物を産生ずるためのさらに別の好ましい方法はＨｕｓｅ　ｅｔ　ａｔ 、。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２４６：１２７５（１９８９）の方法を用いて、Ｆａｂ分子 のライブラリーをつくる必要がある。この方法において、ＨおよびＬ抗体鎖のｍ ＲＮＡ分子は免疫化動物から単離される。ｍＲＮＡをポリメラーゼチェーンリア クション（ＰＣＲ）法を用いて増幅する。続いて、核酸を無作為にラムダファー ジにクローン化し、組み換え体ファージ粒子のライブラリーを作る。ファージを 用いてＥ、ｃｏｌｉのような発現宿主に感染させる。Ｅ、ｃｏｌｉコロニーおよ び対応するファージ組み換え体を、続いて、所望のＦａｂフラグメントを産生す るものに関してスクリーニングする。好ましいラムダファージベクターはｇｔｌ ｌおよびｚａｐ２である。

本発明において使用される抗体分子含有組成物は、溶液または懸濁液の形態をと る。活性成分として抗体分子を含有する組成物調製は当業上よく理解されている 。通常、そのような組成物は液体溶液または懸濁液として調製されるが、しかし 液体中で、溶液または懸濁液に好適な固体形態もまた調製される。調製物は乳化 することもできる。活性な治療成分はアッセイを妨げず活性成分と適合する賦形 剤としばしば混合される。例えば、好適な賦形剤は水、食塩水、デキストローズ 、グリセロール、エタノール等、および、その組み合わせである。さらに、所望 により組成物は活性成分の効果を強化する少量の補助剤、例えば、湿潤剤、乳化 剤、ｐＨ緩衝剤などを含む。

抗体分子組成物は中和された許容される塩形懇に配合される。許容される塩は例 えば、塩酸、またはリン酸のような無機酸、または、例えば酢酸酒石酸マンデル 酸などのような有機酸と形成される酸付加塩（抗体分子の遊離アミノ基と形成す る）を含む。遊離カルボキシル基と形成される塩は例えばナトリウム、カリウム 、アンモニウム、カルシウム、または、水酸化第二鉄のような無機塩基、および イソプロピルアミン、トリメチルアミン２エチルアミノメタノール、ヒスチジン 、プロ力インなどのような有機塩基から得られるＧ１診断アッセイ方法 本発明はＥＰＲ−１分子またはそのポリペプチド部分を検出する方法を企図して いる。アッセイはＥＰＲ−１そのものを含むＥＰＲ−１と相同な細胞表面レセプ ターのためのものである。アッセイは抗体特異性の適切な選択によりＥＰＲ−１ そのものに特異的である。また本発明のアッセイはＥＰＲ−１の部分に相同なポ リペプチドレセプターならびに、遊離している（特定の細胞構造と結合していな い）ＥＰＲ−１に相同なポリペプチドまたは、そのポリペプチド部分のためであ る。通常、アッセイ方法は細胞表面にさらされているＥＰＲ−１（例えばＣＬＬ 細胞）を検出することを含む。

その探的種の試薬分子の相対的結合親和性はフローミクロ蛍光定量法（ＦＭＦ） を用いて、ここで記載されているように便利に決定される。したがって、細胞表 面抗原にたいする本蛍光標識抗体の結合による細胞に関連した蛍光強度が予定さ れた、しきい値レベルを越える場合、標的抗原、例えば、ＥＰＲ−１を発現する 細胞の存在を示す。標識された抗体は通常、イソチオシアン酸塩結合のフルオレ セインであるが他に良く知られたフルオレセイン標識を用いることができる。

本発明の抗原性ポリペプチドを検出する方法は、ここで開示されているように、 ポリペプチドと抗ポリペプチド抗体分子との間の免疫反応産生物の産生を含むこ とが望ましい。検出される抗原は、血管の体液試料または体内の組織試料中に存 在する。免疫反応産生物は当業者に良く知られている方法により検出される。多 くの臨床上の診断化学方法を用いて検出可能な免疫複合体を形成する。

または、ポリペプチドのポリペプチドリガンド（非抗体組成物）をアッセイ法に 用いることができる。本発明のこの態様における例示的なリガンドは、標識され た因子Ｘａ酵素である。したがって、例示的なアッセイ方法はここに記載される が本発明はそれにより限定されるものではない。

本発明の好ましいアッセイ方法はＥＰＲ−１細胞表面レセプターの存在の測定を 必要とする。体内試料、好ましくは、細胞含有試料における細胞表面レセプター の存在および、好ましくは、その量を検出するために種々の異種および同種のア ッセイ方法を競合的にまたは非競合的に用いる。レセプター分子はヒト凝固因子 ＶおよびＶｌｌｌおよび、その実質的なポリペプチド部分にたいして相同なので ＥＰＲ−１分子または、因子ＶおよびＶＩＩ［からのそのポリペプチド部分を区 別するには注意が必要である。アッセイのために特に好ましいレセプターはＣＬ Ｌ細胞に発現されるＥＰＲ−１細胞である。方法は分析される細胞を含む体内試 料、好ましくはヒトのものとレセプター分子と免疫反応する前記の抗体組成物と を混合することを含む。好ましくは、細胞試料を混合の工程の前に洗浄して凝固 因子ＶおよびＶ［Ｉ＋を含まないようにする。その結果生じた免疫反応混合物を 、細胞が抗原を発現するために十分な時間、生物学的アッセイ状況下で維持し、 抗体組成物中の抗体と免疫反応させ、抗体レセプター免疫複合体を形成させる。

続いて、免疫反応生成物（免疫複合体）を混合物中に存在する未反応抗体から分 離する。

生じた免疫反応物の存在、および必要ならば、その量を続いて測定する。続いて 、生じた産生物の量を細胞により発現させたレセプターの量と相関させる。

生じた免疫反応生成物の存在または量の測定は、生成物を同定するために選択さ れた方法に依存する。例えば、標識された抗体を用いて、本発明のレセプター分 子を有する標識された免疫複合体を形成する。標識された免疫複合体は、それぞ れのラベル（例えば、下記のような蛍光標識、放射標識、ビオチン標識など）を 検出するために適切な方法により定量化される。または、未標識抗体を用いて、 未標識免疫複合体（続いて、未標識免疫複合体を有する未標識抗体を認識する標 識された抗体を免疫反応させることによって検出される）を形成する。それによ り免疫複合体は標識され、上記のように検出される。

本アッセイにおいて用いられる生物的条件は、本発明の抗体ＥＰＲ−１細胞表面 分子およびポリペプチド分子の生物活性を維持するものである。これらの条件は 、約４”Ｃ−約４５°Ｃの温度範囲、好ましくは、約３７°Ｃ１約５−約９のｐ Ｈ値の範囲、好ましくは約７、そしてイオン強度は蒸留水から約１モルの塩化ナ トリウムのイオン強度、好ましくは、生理食塩水のイオン強度程度を含む。その 様な条件を最適化する方法は画業上よく知られている。

好ましい実施態様において、分析される体内試料は、患者から取り出されアリコ ートに配分される。本発明の抗体組成物を用いて少なくとも１つのアリコートを 抗原発現の決定のために用いる。必要な場合、第二のアリコートを対照抗体の試 料との反応性を決定するために使用する。分析は同時に行うこともあるが通常、 順次行う。

本発明のさらにべつの態様において、本アッセイにおいて入手できるデータは有 形の手段（例えば、コンピューター保存、またはハードコピー版）により記録さ れる。データは市販の標準的アナログデジタル（Ａ／Ｄ）機器により自動的に入 力さね、かつ保存される。また、データの本相関関係の最善の提示を所望する場 合、データを呼び出し、記録し、表示することができる。したがって、本方法の 使用に好適な機器およびソフトウェアは本発明の範囲内で考慮されている。

本発明の抗体組成物および方法は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および他の疾 患（因子ＶおよびＶＩＩ［に相同なレセプターの発現は疾患状態と相関している ）に苦しむ患者の治療を監視する方法を提供する。例えば、ＥＰＲ−１マーカー を発現する細胞の頻度はＣＬＬで苦しむ患者の治療に対する応答と逆の関係があ ることが見い出だされている。また、ＥＰＲ−１”型のヘアリー・セル白血病（ ＨＣＬ）で苦しむ患者は本抗体組成物によって検出されるマーカーを発現し、そ れにより治療の監視が可能になる。

その結果、疾患のマーカーを検出する治療に対する患者の応答を監視する方法が 考慮される。方法はＥＰＲ−１マーカーに関してアッセイされる細胞を含む体内 サンプルと本抗体組成物とを上記のアッセイ方法にしたがって、混合することか らなる。混合物は、事前に決められた反応条件下で、免疫反応産生物を形成する のに十分な時間維持される。生じた免疫反応産生物の量は最初の疾患状態と関連 している。これらの工程を治療養生期間中の後の方で繰り返しそれにより治療に 対する患者の応答の測定が可能になり、細胞表面に発現されるＥＰＲ−１分子の 数が減少する場合は、疾病状態の改善を意味する。

Ｈ９診断システム 本発明においては、記載されたアッセイを行うための診断システムもまた企図さ れている。本発明のキット形態の診断システムは別々に包装された試薬として、 少なくとも１回のアッセイに十分な量の本発明の抗体分子を含む組成物またはそ のフラグメントおよび、好ましくは免疫反応産生物を示すことができるラベル等 を含む。包装された試薬の使用指示書もまた通常含まれる。“使用指示”は試薬 濃度、または、例えば、混合される試薬と試料の相対的な量のような少なくとも １回のアッセイ法のパラメーター試薬／試料混合物の維持時間、温度、緩衝液条 件などを記載した立体的な説明を通常含む。１つの実施態様において、診断シス テムは細胞含有試料における細胞に発現されたＥＰＲ−ルセブターの存在をアッ セイするために考慮されている。

好ましいキットは細胞試料において、細胞のレセプター分子と免疫反応する抗Ｅ ＰＲ−１抗体の容器を含む封入物（包装物）として提供される。通常、キットは 抗ＥＰＲ−１抗体およびＥＰＲ−ルセプターの免疫複合体と免疫反応する標識さ れた抗体プローブも含む。

標識は通常入手可能な任意のものであり、例えばフルオレセイン、フィコエリス ン、ローダミン、　１１１１などである。他の例示的な標識は”’Ｉｎｑ　”Ｔ ｃ。

ＩＴに、、そしてＩｌｌ　ｌおよび非放射性ラベル、例えばビオチン、酵素結合 抗体などを含む。抗体分子に結合するかまたは組み込まれる標識または存在を示 す手段は、本発明の抗体の一部またはモノクローナル抗体組成物として考えられ る。考慮されている標識はまた別々に用いることができ、これらの原子または分 子は単独で、またはさらにべつの試薬とともに用いることができる。そのような 標識は臨床的診断化学ではそれら自体よ（知られており、それらが新規な方法お よび／またはシステムで用いられない限り、この発明の一部を構成する。

標識のポリペプチドおよびタンパク質との結合はよく知られている。例えばハイ ブリドーマにより生成される抗体分子は、培地における成分として提供される放 射性同位体含有アミノ酸の代謝性組み込みにより標識される。例えば、Ｇａ１ｆ ｒｅｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　７３：３−４６（＋９８ １）を参照。活性化官能基によるタンパク質結合またはカップリングの方法は、 特に適用される。例えば、Ａｕｒａｍｅａｓ、　ｅｔａｌ、、　５ｃａｎｄ、　 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　Ｖｏｌ、８．５ｕｐｐ１．７：７−２３　（１９７８ ）、　Ｒｏｄｗｅｌｌ　ｅｔ　ａ戟A。

Ｂｉｏｔｅｃｈ、、　３：８８９−８９４　（１９８４）、および米国特許第４ ．４９３．７９５号を参乱本診断システムはまた特異的な結合剤を含む。“特異 的な結合剤“は本発明の試薬種に選択的に結合することができる化学種であるが 、それ自体本発明の抗体分子ではない。抗体が上記のような免疫複合体の一部と して存在する場合、例示的な特異的な結合剤は、本発明の抗体分子と反応する抗 体分子補体タンパク質またはそのフラグメント、タンパク質Ａなどである。

好ましい実施態様において特異的な結合剤を標識する。しかしながら、診断シス テムが標識されていない特異的な結合剤を含む場合、剤は増幅の手段または試薬 として通常用いられる。これらの実施態様において、増幅手段が本試薬の１つを 含む複合体に結合する場合、標識された特異的な結合剤は、増幅手段と特異的に 結合することができる。

例えば本発明の診断キットを“ＥＬＩＳＡ”形式に用い、体内試料または、例え ば、血清、血漿、または細胞の界面活性剤溶解物（例えば、１０ｍＭ　ＣＨＰＳ 溶解物）のような体液試料中のＥＰＲ−１ポリペプチドの存在または量を検出す る。“ＥＬＩＳＡ法は固相に結合した抗体または抗原および酵素抗原または酵素 抗体接合物を使用する酵素結合免疫吸着アッセイを意味し試料中に存在する抗体 または抗原の量を検出および定量化する。ＥＬＩＳＡ法の記載は、１９８２年に Ｌａｎｇｅｍｅｄｉｃａｌ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｌｏｓ　Ａｌｔ ｏｓ、　ＣＡ　により出版されたり、Ｐ、　５ｉｔｅｓｅｔａ１．、による　４ ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎｏｆ　Ｂａ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　［ｍｍｕ ｎｏｌｏｇｙの２２章　および米国特許第３．６５４．０９０号；第３．８５０ ．７５２号；および第４．０１６．０４３号（その特許はここの参照欄に編入さ れている）に見られる。

好ましい態様において、抗体または抗原試薬成分は、固体マトリックスに固定し 患者診断系において別個に梱包される固体支持体を作る。試薬は水性培地から吸 着により固体マトリックスに通常固定されるが、当業者に良く知られている他の 様式の固定を使用することができる。例えば、本杭ＥＰＲ−１抗体を表面に固定 しＥＰＲ−１分子を含む溶液または、ＥＰＲ−ルセブターを発現する細胞をアッ セイするために用いる。または、ＥＰＲ−１、そのポリペプチドフラグメントお よびＥＰＲ−１を発現する全部または部分的に溶解した細胞を表面に固定し、固 定された種と免疫反応する抗体組成物の溶液をスクリーニングするために用いる 。

この点において有用な、固体マトリックス材料はＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｉｎｅ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から商標５ＥＰＨＡＤＥ Ｘとして入手可能な誘導化交差結合デキストラン、誘導化および／または交差結 合型のアガローズ、Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ。

１ＬのＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な約１ミクロン− 約５ミリメーターのポリスチレンビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、交差 結合ポリアクリルアミド、シート、ストリップ、またはパドル（Ｐａｄｄｌｅ） のようなニトロセルローズ、またはナイロンを主成分とするウェブ、チューブ、 プレート、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルから作られるマイクロタイタープ レートのウェルなどを含む。

ここに記載されている診断システムの試薬種、標識された特異的結合剤または、 増幅剤は、液体分散液または実質的乾燥粉末（例えば、冷凍乾燥形Ｕ）として溶 液で提供される。示す媒体が酵素である場合、酵素の基質も系の別の包装物で提 供される。通常試薬は不活性状態で包装されている。前記のマイクロタイタープ レートおよびｌまたはそれ以上の緩衝物のような固相支持体は、この診断アッセ イ系の別に梱包された要素として含めることもできる。

診断システムは従来の梱包に入る。そのような包装はガラスおよびプラスチック （例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリカーボネート）、ボトル 、バイラル、プラスチックおよびプラスチック箔でラミネートした包装体などを 含む。

実施例 下記の実施例を示すが本発明を限定するものではない。

Ｉ、細胞および細胞培養 ＰＭＮ　（多形核白血球）を酸−シトレード　デキストローズ抗凝固血液からデ キストラン沈殿により単離した。血小板高濃度血漿をフィコールーハイペイク（ Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｏ、）（密 度＝１．０７７　ｇ／ｍ　ｌ）を用い４００Ｘｇ　で１８分間、２２°Ｃで、低 速度分画遠心により取り除いた後、ＰＢＭＣ（抹消血単核細胞）を分離した。Ｐ ＢＭＣを５ｍＭ　ＥＤＴＡ−ＰＢＳ、ｐＨ７，２中で充分に洗浄し、５ｍＭ　Ｅ ＤＴＡを含む自己由来血清中で３０分間、３７°Ｃで２度インキュベートし血小 板−単球のロゼツト形成を防いだ。自己由来血清で事前筒布したプラスチックベ トリデイッシュへ１時間３７°Ｃで付着させて、単球をＰＢＭＣから単離した。

検出用の内毒素を含まないＲＰＭＩＩ６４０培地（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ、　５ａｎｔａ　Ａｎａ、ＣＡ）および１０％熱不活性化ＦＣ８（ウシ 胎児血清；Ｇｅｍ１ｎｉ　Ｂｉｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｃ、、　Ｃａ１ａｂ ａｓａｓ、　ＣＡ）、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ）、２５ｍＭ　Ｈ ＥＰＥＳ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅａ＋　Ｂｏｈｒｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ 、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ。

ＣＡ）、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ゲラマイシン、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　 Ｃｏｒｐ、。

Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、　ＮＪ）中で細胞を１−１．５Ｘ１０”／ｍｌで懸濁し た。

単球細胞系ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ）を、さらに１０　ｕＭ　２−ＭＥ　（Ｅａｓ ｔｍｎＫｏｄａｋ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）を補充した上記培地中で継 代培地で維持した。推奨されているように、形質転換ヒト白血病−リンバＩＩＴ 細胞系ＨｕＴ７８、ＭＯＬＴ４、ＣＣＲＦ−ＣＥＮ、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２、お よびＤａｕｄｉ　（ＡＴＣＣ）を培養して維持した。ヒト白血病−リンパ腫Ｔ細 胞系Ｊｕｒｋａｔ、ＭＬＴ、ＰＥＥＲ，およびＭＯＬＴはＲｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　５ｃｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ、　Ｌａ、　Ｊｏｌｌ ａ。

ＣＡ、のＤｒ、Ｄ、Ｐ、　Ｄｉａｌｙｎａｓからの寛大な贈呈品であった。

混合リンパ球応答に関して、新たに単離したＰＢＭＣ２０Ｘ１０＠を照射された （１０．０００ラド）ＲａｊｉまたはＤａｕｄｉ細胞２０ＸＩＯ’の存在下でＴ −２５通気フラス：Ｉ　（Ｃｏｓｔｅｒ　Ｃｏｒｐ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、 　ＩＪＡ）中で培養した。培養物を５％ＣＯを給温インキュベーター中のＲＰＭ １１６４０、ｌＯ％ＦＣ３，２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１０μＭ−２ＭＥ（混合リ ンパ球培地（ＭＬＣ））中で、７日間３７°Ｃで維持した。応答細胞を収穫し、 フィコールーハイベイクで、４００Ｘｇで１８分間、２２℃の遠心分離により単 離し、完全ＭＬＣ培地中で洗浄し、続いて、照射したＤａｕｄｉまたはＲａｊｉ 細胞２Ｘ１０“の存在下で、２ＸＩＯ’／ウエルにて２４−ウェルプレート（Ｃ ｏｓｔａｒ）で培養した。

照射されたＤａｕｄｉまたはＲａｊｉにより刺激された同種反応性細胞の長期培 養のために、応答Ｔ細胞を上記のプロトコルに従い６日毎に移し、１０％Ｔ細胞 成長因子（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｉｎｃ、、　Ｂｕｆｆａｌｏ、 ＮＹ）を含むＭＬＣ培地中で再培養した。いくつかの研究においては、ｌＸｌ０ ’／ｍｌで新たに単離されたＰＢＭＣの懸濁物は、ｌμｇ／ｍｌのＣｏｎＡ　（ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または１μｇ／ｍｌのＰＨＡ　（フィトヘマグルチニン ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて、７日間、５％ＣＯ２中で３７°Ｃで処理し た。これらの培養物からの細胞の了りコートを種々の時間間隔で収穫し、洗浄し 、ＦＭＦ　（フローミクロ蛍光定量法）により分析した。

２、　ｍＡｂ。

ヒトＶの精製および特徴決定の実験方法は、以前Ａｌｔｉｅｒｉ、Ｄ、　ｅｔ　 ａｌ、ｊ、Ｂｉｏｌ。

ＣｈｅｒＬ、　２６４：２９６９（１９８９）中に報告されている。簡単に述べ ると、ＢＡＬＢ／ｃｖウスをＣＦＡ　（完全フロインドアジュバント；Ｃａ　ｌ ｂ　ｉｏｃｈｅｍ）　中の７５０８ｇを用いて腹腔免疫し、前記（Ａｌｔｉｅｒ ｉ、　Ｄ、ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６４：２９６９（１９ ８９））のようにハイブリドーマを産生じた。抗体選択のスクリーニング方法は 、ＴＨＰ−１細胞（Ａｌｔｉｅｒｉ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅ＋ｕ、、２６４：２９６９（１９８９））を有するハイブリドーマ培養液 の反応性をＦＭＦにより分析することであった。ＴＨＰ−１細胞の〉９８％と反 応する６つのハイブリドーマを、固定化した■を用いて固相ＲＩＡおよびイムノ プロティング中で抗体生成について選択し、限界希釈による２−４回の連続サブ クローニングにより最終的に確立した。精製したＶで複数の免疫処置により産生 したウサギポリクローナル抗血清もまたＦＭＦにより、スクリーニングし上記の 方法により特徴決定した。さらにＶでの免疫処置により誘発され、ウスタンプロ ットによるＶとは反応性であるが、ＦＭＦによるＴＨＰ−１細胞とは反応性でな い第２の一団のｍＡｂを選択し確立した。

ｍＡｂ　７Ｇ１２（ＩｇＧ２ａ）、９Ｄ４　（ＩｇＧ１）、および１２Ｈ１（１ ｇＭ）（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ　１０６３７）の精製１ｇフラクションをＡｆｆ 　ｉ　−Ｇｅ　Ｉ　ＭＡＰＳ　ＩＩまたはヒドロキシアパタイト　カラム（Ｂｉ ｏ−Ｒａｄ、　Ｒ４ｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を用いるクロマトグラフィーにより 調製した。抗Ｖウサギポリクローナル抗血清８７８．９の精製された１ｇフラク ションを硫酸アンモニウム分画およびＤＥＡＥ　セファデックスを用いるクロマ トグラフィーにより調製した。免疫精製８７８．９抗体を、製造業者の指示書に 従い、Ａｆ　ｆ　ｉｇｅ　１　１５　（Ｂｉｏｒａｄ。

Ｒｉｃｔｕｎｏｎｄ、　ＣＡ）に固定した精製因子Ｖから単離した。

抗ＣＤＩ　６ｍＡｂはＬ　ｅ　ｕ　Ｉ　ｌ　ｂ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎ ｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡ）。

ｔｈｅ　Ｗｉｓｔａｒｌｎｓｔｉｔｕｔｅ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｐ ＡのＤｒ、　Ｇ、Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉの親切な贈呈品であるδ７３．１および ３０８である。抗ＣＤ５６ｍＡｂＮＫＨ−１（Ｌｅｕ１９）をＣｏｕｌ　ｔｅｒ 　Ｉａｎｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｈｉａｌｅａｈ、　ＰＬ、から購入した。抗ＣＤ１ １ｂおよび抗ＣＤ１８ｍＡｂはそれぞれＯＫＭＩおよび６０．３テあった。ＣＤ ５７　（ＨＮＫ−１）、ＣＤ３　（ＯＫＴ３）、ＣＤ４　（ＯＫＴ４）、ＣＤ８ 　（ＯＫＴ８）、ＣＤ２　（○ＫＴＩ　１）、ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２）に 対するｍＡｂをＡＴＣＣから取得した。抗α／β　Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ） ｍＡｂ　ＷＴ３１をＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎより購入し、抗／δＴＣ ＲｍＡｂ　δ１はＤｒ、　Ｍ、　Ｂ、　Ｂｒｅｎｎｅｒ。

Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡより 親切に提供された。

３、結合反応 種々のｍＡｂの異なる細胞型との相互作用をＦＭＦにより評価した。簡単に述べ ると、細胞ｌＸｌ０’を各々ｍＡｂの飽和濃度で３０分間４°Ｃで■底マイクロ タイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中にインキュベートした。ＭＬＣ培地中での 洗浄後、フルオレセイン結合ヤギ（Ｆ（ａｂ＝）、抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｔ ａｇｏ　Ｉｎｃ、　、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）の１／２０希釈了りコ ートを加えて、さらに３０分間４℃でインキュベートした。細胞を洗浄し、Ｂｅ ｃｔｏｎ　ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＩＶ／４０　ＦＡＣ３を用いてすぐに分析した。

ビオチン（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ビオチン、Ｓｉｇｍａ）と前もって 結合したｍＡｂ　７Ｇ１２または９Ｄ４を用いて、同時２色ＦＭＦ分析を以前に 記載（Ａｌｔｉｅｒｉ、　Ｄ、　ｅｔａｌ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６４：２９６９　（１９８９））されてい るように行い、そしてフィコエリスリン結合、ストレプトアビジン試薬（Ｔａｇ ｏ）のｌ／２０希釈により明らかにされた。

種々の細胞群に行われた２色ＦＭＦ分析の正確性を確認するために、さらに別の ２組の研究も行った。第１に、ビオチン化ｍＡｂとの第２のＦＩＴＣ結合抗マウ ス試薬の、交差反応の可能性を避けるために、種々の抗Ｔ細胞または抗ＮＫ（ナ チュラルキラー）細胞関連マーカーｍＡｂと共にウサギポリクローナル抗体Ｂ７ ８．９のビオチン結合アリコートを用いることにより、これらの研究を繰り返し た。

さらに別の一連の研究において、直接にＦＩＴＣ結合ｍＡｂ、７Ｇ１２または９ Ｄ４　（Ｃｈｒｏｍａｐｒｏｂｅ、　Ｉｎｃ、、　Ｒｅｄｗｏｏｄ　Ｃ１ｔｙ、 　ＣＡ）もビオチン結合ｍＡｂ、０ＫＴ３、○ＫＴ４．０ＫＴ８と共に用いた。

細胞選別研究のために、ＨｕＴ７８細胞（１５Ｘｌ　０７／ｍ１）を抗Ｖポリク ローナル抗血清８７８．９と、続いてフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ　 （Ｔａｇｏ）とインキュベートした。Ｂ２Ｏ，９”ＨｕＴ７８細胞（Ｈｕｔ７８ ”米画分群の３４％）を掃引率（Ｓｗｅ　ｅ　ｐ　ｒ　ａｔｅ）２０００細胞／ Ｓの負の圧力下でＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｆａｃｓ　ｔａｒ　を用 いて単離し、完全ＭＬＣ培地中で洗浄し、９６ウエル丸底プレート（Ｃｏｓｔａ ｒ）を用い、２０％ＦＣ３で補充されたＨｕＴ７ｇならし培地中で０．３．１． ３細胞／ウエルの限界希釈によりクローン化した。３週間後、ポアソン分布に基 づき、単一細胞をクローン起源とする増殖細胞をサブクローンし、確立し、さら にＦＭＦにより表現型の特徴決定した。

因子Ｘａの単離、特徴決定、■ｌ標謙の方法はＡｌｔｉｅｒｉ、Ｄ、　ｅｔ　ａ ｌ、、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

ＣｈｅｒＬ、　２６４：２９６９（１９８９）により以前記載された。ＨｕＴ７ ８°細胞との…ＩＸａの相互作用を、２．５ｍＭ　ＣａＣ１ｚの存在化で１．５ −２　ＸＩＯ’／ｍｌの細胞懸濁物と漸増濃度の”Ｊ／Ｘａ　（０，４５−３６ ｎＭ）を２０分間室温でインキュベートすることにより分析した。インキュベー ション終了時に、細胞結合放射活性から分離するためにシリコーン油の混合物を 用い、細胞懸濁物のアリコートを１２．０００　Ｘ　ｇで２分間遠心することに より反応を終了させた。インキュベーション反応の出発時に加えた、５０倍過剰 モルの未標識因子Ｘａの存在下で非特異的結合を定量化し、合計から引き算し、 実質特異的結合を得た。いくつかの研究において、”’Ｉ−Ｘａの連続濃度を加 える前に、ＨｕＴ７８”細胞のアリコートを５０μｇ／ｍｌのｍＡｂ９Ｄ４とと もに３０分間室温で事前インキュベートした。

４、細胞表面潔識および免疫沈降 ｌＸｌ０’／ｍｌのＰＭＮ懸濁物をイオドゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）法により、（ Ｆｒａｋｅｒ、　Ｐ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ、　Ｂｉｏｐ ｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ：ｏｍｍｕｎ、、　８０：８４９　（１X７８））によ り、５ｍＣ１”’ｌ−Ｎａで表面ヨウ素化を行った。ＨＥＰＥＳ食塩緩衝液ｐＨ ７，３５中で充分に洗浄した後、細胞を０．５％トリトン　Ｘ−Ｉ　ＯＯまたは １０ｍＭ　ＣＨＡＰＳ、０．０５　Ｍ　）リス　ＭＣＩ、１ｍＭペンスアミジン 、０．１ｍＭ　（ＰＰＡＣＫ＝Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　クロｔ＝＋メチル ケトン、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、２５μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ　ＰＭ ＳＦ　（フェニルメチルスルフォニルフルオリド：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含 む緩衝液、ｐＨ８，３（溶解緩衝液）中で、３０分間４°Ｃで溶解した。ヨウ素 化溶解物から、１４．０００　Ｘ　ｇで３０分間４°Ｃの遠心分離により細胞核 および他の細胞残片を取り除き、セファローズＣＬ４Ｂ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ ｍ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭのアリコートとともに長く事前吸着 させた。ＩＩＩ　ｌ−標識ＰＭＮ溶解物の了りコートをｍＡｂ１２Ｈ１または６ ０．３と攪拌しながら１４時間４°Ｃで別々にインキュベートした。免疫複合体 は、セファローズＣＬ４Ｂと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭを添加しさら に６時間４℃でインキュベートすることにより沈殿させ、上記溶解緩衝液中で、 よく洗浄し、最終的に還元剤として５０ｍＭ　２−ジチオスレイトールを含む２ ％ＳＤＳサンプル緩衝液、ｐＨ６，８中に懸濁した。試料をすぐに５分間煮沸し 、１４．ＯＯＯＸｇで５分間の遠心分離で不純物を除去し、最終的に０．１％Ｓ ＤＳ中で７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドスラブ　ゲル　にて電気泳動した。

ゲルをラーマシープルーＲ２５０中で染色し、５％酢酸中で脱染色し、乾燥させ 、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍａｔ　ＡＲＸ−線フィルム　および増感スクリーン（Ｃ ｒｏｎｅｘε、　１．　、　Ｄｕｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ。

Ｗｊｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ）を用いて一７０°Ｃでオートラジオグラフィー のためにさらした。

５、ＥＰＲ−１分子の単離 ＥＰＲ−１分子の単離から相同性はこの表面抗原を高レベルで構成的に発現する 細胞型の同定および／または確定を必要とした。これらの研究は主に抹消血多形 核白血球（ＰＭＮ）および親Ｔ細胞系ＭＯＬＴ　＋　３　＃　３　（Ａｌｔｉｅ ｒｉ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｉｍｃｎｕｎ、　１４５：２４６　（＋９９０）から特異的に選択されたＴ細胞 クローン誘導体に関して行われた。

サブ系ＭＯＬＴ１３＃３を抗ＥＰＲ−１ｍＡｂ１２Ｈ１を用いて親糸ＭＯＬＴ１ ３の２回の連続サイクルのフルオレセイン選別により確定し、フルオレセイン分 析によりｍＡｂ１２ＨＩと高レベルの反応性を示すＭＯＬＴｌ　３細胞だけを単 離し、ｌまたは３細胞／ウエルの限界希釈によりクローン化し、集密まで増殖さ せ、最終的に、ｍＡｂ１２Ｈ１および種々のＴ細胞関連マーカーに対して導かれ る一団のｍＡｂとの反応性についてフローサイトメトリーにより再び、再スクリ ーニングした。上記のように確定されたサブ系ＭＯＬＴ１３＃３は親ラインと比 較した場合、７−１０倍高いレベルのＥＰＲ−１を発現した。

ＭＯＬＴＴｌ　３＃３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１０６３８）をＴ１５０ 組織培養フラスコ中で５％Ｃｏｔ、３７°Ｃで懸濁して継代培養した。細胞を収 穫し、５ｍＭ　ＥＤＴＡを補充した水冷のリン酸緩衝溶液、ｐＨ７，２中で２回 洗浄し、継続的攪拌下の溶解緩衝液中で１時間、４°Ｃで溶解した。

溶解緩衝液の組成は、単離されたＥＰＲ−１分子の満足される回収を得るために 重要であることが見い出だされた。用いられた界面活性剤は１ｍＭのＣａＣ］２ 存在下の０．３％ＣＨＡＰＳ　（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルア ミン］−１−プロパンスルホネート：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）および、ＰＭＳ　 Ｆ（１ｍＭ）　、ｐ−ＡＰＭＳＦ　（アミシリフェノールメチル　スルホニル　 フルオリド；Ｃａｋｂｕｉｃｈｅｍ）（１ｍＭ）、ＰＰＡＣＫ　（０，２５ｍｇ ／ｍｌ）、大豆トリプシン阻害剤　（０，１ｍｇ／ｍｌ）　、ベンズアミジン　 （ｌ　ｍＭ）、ロイペブンン　（０，２５ｍｇ／ｍｌ）、アプロチニン　（１０ ，０００Ｕ／ｍ１）を含むプロテアーゼ阻害剤のカクテルである。溶解緩衝液の 容量と溶解を受ける細胞数との間の割合は分析に選ばれる細胞型に依存する。Ｍ ＯＬＴ＋３＃３細胞のためには、緩衝液約１２０ｍ１が１０＠細胞を効果的に溶 解させるために必要となった。同じ条件下で、４Ｘ１０’ＰＭＮはＥＰＲ−１溶 解緩衝液２００ｍ１を用いて効果的に溶解された。続いて、溶解細胞抽出物から ６．００Ｏｒｐｍで３０分間、４°Ｃで遠心により細胞核および他の不溶解性物 質を取り除き、使用に供されるまで一７０°Ｃで保存した。

上記のように調製された界面活性剤溶解細胞抽出物からのＥＰＲ−１分子の免疫 親和性単離は、抗ＥＰＲ−１ｍＡｂ　１２Ｈ１（１ｇＭアイソタイプ）の使用に 基づいている。記載されているように溶解された約４ＸＩ　Ｏ”細胞をｍＡｂと 共に１６時間４°Ｃで攪拌しながらインキュベートした。用いられたｍＡｂ１２ Ｈ１の割合は、腹水１ｍｌ／ＥＰＲ−１溶解物１００ｍ１であった。

インキュベート終了時に、セファローズＣＬ４Ｂ（固相免疫吸着）に共育結合し たヤギ抗マウスＩｇＭの２ｍｌアリコート（５ｍｇ）を添付し、さらに６時間４ °Ｃで攪拌しながらインキュベートすることによりｍＡｂ　１２Ｈ１に結合した ＥＰＲ−１分子を単離した。その時間の終了時に、免疫沈殿物を３．００Ｏｒｐ ｍ、２０分間、４°Ｃで遠心分離することにより、ＥＰＲ−１溶解緩衝液中で５ 回洗浄した。

洗浄後、種々のチューブからのペレットをプールし、０．４ｍｌの非還元性ＳＤ Ｓサンプル緩衝液、ｐＨ６，８で懸濁液し、５分間煮沸し、抗体複合体より抗原 を分離し、そして最終的に、２５ｍＡｐｓ／ゲルの定電流をかけて、７．５％Ｕ ＩＩＭ用ＳＤポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離した。電気泳動に よる移動の後、ゲルをメタノール中で固定し、０．０８％クーマシーブルーで染 色し、１０％メタノールおよび５％酢酸中で、−晩、脱染色した。

この単離方法により、クーマシーブルーにより染色された顕著な７８ＫＤａバン ドおよび、６６−６８ＫＤａ分子の大きさとともに移動し、そして６６／６８Ｋ Ｄａのダブレットとしてしばしば現れる第２の特別な成分の視覚化が可能となっ た。６６／６８ＫＤａ種は制約されたタンパク質分解または不完全グリコジル化 （ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）によると考えられる。７８ＫＤａ染 色バンドをレーザーブレードを用いて調製用ゲルから切断し、へらで小さなフラ グメントに解離し、２０％グリセロール、０．１％ブロモフェノールブルー、１ ２５ｍＭ）リスＨＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳを含む消イ罎衝液、 ｐＨ６，８と混合した。解離したバンドを１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル の６ウエルに充填し、それぞれの試料を配列決定グレード（Ｖ８）のエンドプロ テイナーゼＧ４０μｍとともに１００μｇ／ｍｌの最終濃度で積層した。

試料が分離ゲルに入るまで、それらを５０ｍＡｍｐｓで先に泳動し、３０分のイ ンキュベーション時間で消化し、精製したフラグメントを、最終的に、残りの電 気泳動操作で分離した。移動の後、ゲルを素早く水、続いて１０ｍＭ　ＣＡＰＳ と２０％メタノールを含むＣＡＰＳ　（［３−（シクロへキシルアミノ）−プロ パンスルトン酸］　；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）移動緩衝液に浸しそして最終的に 、ゲル移動装置中でイモピロン（Ｉｍｍｏｂ　ｉ　１　ｏｎ）膜に取り付けた。

タンパク質移動は４５０ｍＡｍｐｓで数時間、室温で行った。続いて、イモピロ ン膜を取り出し、水に浸し、ラーマシープルー５０％メタノール中で３０−６０ 分間染色し、水ですすぎ、１０％酢酸と４０％メタノール中で脱染色した。この 方法により、７８ＫＤａバンド　ＥＰＲ−１分子の内部切断による多くの強く染 色されたバンドの直接同定および対応するフラグメントの、その後に続ぐ電気泳 動による分離が可能になった。

関心のあるバンドをそれらの相対的分子量に基づき、染色移動物から切断し、Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　５ｃｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃの Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ部（ｃ　ｏ　ｒ　ｅ）において、利用可能なオン ラインＨＰＬＣとともにＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＶａｐｏｒＰ ｈａｓｅ　シクエンサーを用いてＮＨｔマイクロシクエンス分析にかけた。ＰＭ ＮおよびＭＯＬＴ１３＃３Ｔ細胞両者に関して、上記のように行われた多くの研 究から得られたペプチド配列をＳＵＮコンピュータープログラム（Ｉｎｔｅｌｌ ｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ、）により、モしてＶＡＸ７５０コンピューターを 用いＷＯＲＤＳＥＡＲＣＨプログラム（Ｕｎｉｖ、ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ）により分析した。表に示す ように、ＥＰＲ−１分子より得られたすべての推定ペプチド配列は、もっばら、 凝固タンパク質、因子Ｖ、およびＶＩ［Ｉ　と、そして、これら２つの凝固タン パク質、およびＥＰＲ−１分子と顕著な相同性を共育するＭＦＧ　Ｅ−８［５ｔ ｕｂｂｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、 Ａ　８７：８４１７　（１９９０）］　と命名された■ 近記載されたマウス細胞表面分子と有意な程度の相同性を示した。

表Ｉ ＥＰＲ−１配列整合 ＥＰＲ−１配列　１１ ＥＰＲ−１配列　、ｆ２ ＥＰＲ（配列　Ｉコ ＥＰＲ−１配列　／４ ＥＰＲ−１配列　ｌ５ ＥＰＲ−１配列　ｌ６ ＥＰＲ−１配列　Ｉ７ ＊ヒト因子Ｖおよび因子Ｖ［Ｉ［の番号名称はＮＢＲＦ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａ ｔａ　Ｂａｎｋ　からのものであり、配列中のリーダーペプチドを含む（因子Ｖ については２９残基、因子Ｖ［ｌＩについては１９残基）。ＭＦＧ　Ｅ−８の番 号付けは５ｔｕｂｂｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、、　８７：８４１７−８４２１　（１９９０）からのものであるが、２２残基 リーダーペプチドを含む。５ｔｕｂｂｓ　ｅｔ　ａｌ、における因子Ｖおよび因 子Ｖｅｉｌ配列番号付けは、因子ＶについてはＮＢＲＦ体系マイナス２９、そし て因子ＶＩ［［についてはＮＢＲＦ体系マイナス１９である。１−同一：　＝保 存的置換：、二半保存的置換。Ｘは可変性アミノ酸残基。配列中に存在する空間 は配列の整合を改善するために導入された間隙である。因子Ｖおよび因子Ｖｌ１ １は２つの繰り返しの高い相同性Ｃドメインおよび配列を育し、したがって、二 重の相同適合性があることに注目。ドメインはＣＩまたはＣ２と適合し、好まし い相同性は両者が考慮されなければならない場合示されている。

６、ＥＰＲ−１発現はＣＬＬ治療に対する応答と相関する。

造血性悪性疾患の患者から単離された末梢血細胞との抗ＥＰＲ−１ｍＡの反応性 はフローサイトメトリーで調査された。正常な対照（正常なドナーのＥＰＲ−ビ 細胞：１６．５±３．２％、ｎ−１２に対しＣＬＬ中のＥＰＲ−１細胞二８９． １±２．５％、ｎ−２８）と比較した場合、３７ＣＬＬ患者のうち２８人（７５ ％）において、ＥＰＲ−１”細胞の数は５−６倍増加し、したがって、循環群の ほとんどを含むことが見い出された。ＣＬＬ細胞に発現されたＥＰＲ−１分子の 数はまた正常の対照と比較した場合、平均２．５倍の増大を示した（ＥＰＲ−ビ 正常細胞の平均蛍光：８５．６±１６．１に対しＥＰＲ−１”　ＣＬＬ　：２１ ５．６±５０．３）。ＰＭＣ細胞の約９８％がこのマーカーに対して陽性であっ た。２色サイトメトリー研究によりＣＬＬ患者において、ＣＤ５およびＥＰＲ− １両者は同し細胞群中に同時に共発現することが確認された。最後に、４ケ月間 （０日より開始）にわたっておこなわれたＣＬＬ患者一群の連続分析は治療に対 する陽性の生物的応答が検出されるＥＰＲ−１＋細胞の数における顕著な減少（ ６７−９０％減少）としばしば関連していることが示された。代表的な患者デー タは下の表２に示されており、この傾向を示す。

したがって、ＥＰＲ−１はＣＬＬにおける新規細胞マーカーを示し、そしてその 表面発現は、治療に対する患者の生物的応答と逆相関する。データは、選択され た造血性悪性疾患の進展および／または確立におけるプロテアーゼ媒介メカニズ ムの参加可能性をさらに強調する。

表２ 白血病細胞での発現　ＥＰＲ−１ ＊上記のように１２Ｈ１およびＢ７８．９は、それぞれモノクローナルおよびポ リクローナル抗体である。示されたデータは超しきい値量のＥＰＲ−１を発現す る、調査された細胞の百分率である。

？、ＥＰＲ−ＩＤＮＡのＰＣＲ産生 産生表示すＥＰＲ−１について得られたアミノ酸残基配列を用いて、ＥＰＲ−１ それ自体を含む、ＥＰＲ−１ポリペプチドをコードする核酸のＰＣＲ増幅のため にプライマー分子を固定した。例えば、ＤＮＡの（−）鎖とアニーリングし、力 りＥＰＲ−１＃Ｉおよび＃３アミノ酸残基配列をコードするオリコ゛ヌクレオチ ドは。

である。

上記のものと相補性のプローブを用いてＲＮＡまたはＤＮＡの（＋）鎖とハイブ リッド形成する。一般に、上記のプライマーのひとつを上記の他のプライマーと 相補のプライマーと共に用いるべきであり、その結果、（＋）および（−）鎮両 者の伸長生成物を同時に生成する。また、プライマーを伸長し、必要に応じて便 利な制限部位およびクローニング部位を含める。＃ｌプライマー：よ＃３プライ マーの５″および／または３′とアニーリングするので、通常、プライマーおよ びプライマー相補体の両方の組をＰＣＲプロトコルに用いる。ＰＣＲの反応条件 および周期プロトコルはよく知られており、上に記載されてしする。これらのヌ クレオチド　プローブにおいて、八はアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、 ＴはチミジンそしてＩはイノシシである。

１５０、０００）として機能することが示されている。この研究（こおし）て、 ｍＡｂＩ団を利用し、推定膜セリンプロテアーゼ　レセプター（ＥＰＲ−１）の 細胞分布および同定を特徴決定した。

図１に示すように、Ｉ団の抗ＶｍＡｂの反応性は、形質転換された１ｎｖｉｔｒ ｏ細胞系に特有な常軌を逸したものではな（１゜ｍＡｂ　７Ｇ１２ラン単離ＰＭ Ｎと反応するが後者の群において顕著な不均一性を有する（図１）。

ＰＢＭＣの懸濁物をＦＭＦにより分析した場合、ｍＡｂ　７Ｇ１２．９Ｄ４およ び１２Ｈ１は、リンパ系細胞特有の前方光散乱を有する細胞群（５−２０％）と −貫して反応した。同時２色ＦＭＦ分析をおこない、このリンパ球群の表現型を さらに詳細に分析した。これらの研究のために、ＰＢＭＣの懸濁物から、プラス チックへの吸着により、またはナイロン　ウール分画により吸着細胞を減少させ る調製をしＰＢＬ　（末梢血リンパ系細胞）中に濃度の高い群を得た。それぞれ ｍＡｂ　Ｌｅｕｌｌｂ、３０８．Ｂ７３．１およびＮＫＨ−１の同時結合により 明らかにされたように、ｍＡｂ　７Ｇ１２．９Ｄ４　または１２Ｈ１により同定 されたリンパ球サブセットの約５０％は０ＫＴ３−であり、ＮＫ関連マーカーＣ Ｄ１６およびＣＤ５６を発現した。さらに、ナイロンウール分画、５ＲＢＣ（ヒ ツジ赤血球）ロゼツト形成、およびｍＡｂＯＫＴ３を用いた負の淘汰によりＰＢ ＭＣから調製された、濃度の高いＮＫ細胞群（く３％ＣＤ３”、＞８５％ＣＤ１ ６”″）をＦＭＦにより分析した場合、ｍＡｂ　７Ｇ１２および９Ｄ４はこれら の細胞の６８および７２％と反応した。

残りのＥＰＲ−１’　ＰＢＬを表現型によりＣＤ３’″リンパ系細胞として確定 した。以後表３はこのＥＰＲ−ビサブセットの２色ＦＭＦ特徴決定の代表的研究 を示す。ＣＤ４またはＣＤ８を発現する二重陽性細胞を同定したが、後者のフラ クションはＥＰＲ−１マ一カーｍＡｂとの高い頻度と非常に大きな強度の反応を 一貫して示した。

それぞれｍＡｂＯＫＭｌおよびＨＮＫ−１により示されたように、はとんどすべ てのＥＰＲ−１”　Ｔ細胞はＣＤ１１ｂおよびＣＤ５７　（Ｌｅｕ７）も共発現 し、約７０−８０％はＣＤ２”　（ＯＫＴＩ　１）であった（表３）。ＥＰＲ− １”サブセットはＷＴ３１＋が優勢であったが、ＥＰＲ−１＋細胞（未分画ＰＢ Ｌの２％、ｎ＝３）の約ｌＯ％はＵδＴＣＲｍＡｂδ１と反応することが見い出 された。

種々の抗Ｔ細胞または抗ＮＫ細胞関連マーカーｍＡｂとともにウサギポリクロー ナル抗体８７８．９のビオチン結合アリコートまたは直接ＦＩＴＣ結合ｍＡｂ７ Ｇ１２．　または９Ｄ４を用いてＰＢＬの２色ＦＭＦ分析を行なった場合、定量 的に比較可能な結果も得られた。

表３ Ｔ細胞のＥＰＲ−１＋サブセツトの ２色ＦＭＦ特徴決定 ＊粘着細胞減少ＰＢＬの２色ＦＭＦ分析を次のように行った：　ＰＢＬの懸濁物 から粘着細胞を減少させ、抗ＣＤＩ　６ｍＡｂＬｅｕ　Ｉ　Ｉｂ５Ｂ７３．１ま たは３０８のアリコートとまたは、抗ＣＤ５６ｍＡｂＮＫＨ−］　（Ｌｅｕ　１ ９）と３０分間４°Ｃで別々に染色した。細胞を洗浄し、フルオレセイン結合ヤ ギ（Ｆ　（ａｂ　−）＊抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭと共にさらに３０分間４゜Ｃで インキュベートした。十分洗浄した後、細胞を１０μｇ／ｍ］のビオチン化ｍＡ ｂ　７ＣＩ２と平衡化し、１／２０希釈のフィコエリスリン　ストレプト　アビ ノン結合試薬とインキュベートした。代表的研究の二重陽性細胞は末分画化ＰＢ Ｌ群を示し、ＥＰＲ−１’サブセツトと関連（１３，１％）している。

ＥＰＲ−１はＣＤｌ１ｂ／ＣＤｌ８と異なる星球、ＰＭＮ、ＮＫ細胞およびＣＤ ８”も優勢であるＴ細胞フラクションのＥＰＲ−１の発現は、白血球インテグリ ンＣＤＩ　ｌ　ｂ／ＣＤＩ　８　（Ｍａｃ−１）（Ｓａｎｃｈｅｚ　Ｍａｄｒｉ ｄ、　Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、λｌｅｄ、、　１５８：１７８５ 　（１９８３））の細胞分布■ よく似ているように見える。したがって、さらに別の研究を計画し、ＣＤ１１ｂ ／ＣＤ１８およびＥＰＲ−１の相互的構造および機能的性質を確定した。これら の研究のために、大量レベルのＣＤ１１／ＣＤ１８分子［５ａｎｃｈｅｚ　ＩＪ ａｄｒｉｄ、　Ｆ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１５８：１７８５（１９８３月を 発現するＰＭＮの懸濁物を＋ｔｓ　１で表面標識し、界面活性剤可溶化し、そし て抗ＥＰＲ−１ｍＡｂ１２Ｈ１を用いて免疫沈降にかけた。

以前の観察と一致して［５ａｎｃｈｅｚ　Ｍａｄｒｉｄ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１５８：１７８５（１９８３月、　■Ｉ標識 ＰＭＮ溶解物から、ｍＡｂ６０．３は通常のβ−サブユニッ）ＣＤ１８と共に白 血球インテグリンＣＤ１１ａ、ＣＤ１１１ｂ、　そしてＣＤ１１ｃのαサブユニ ットに対応するポリペプチドを沈殿させた。これとは対照的に、同じ条件下で、 ｍＡｂ１２Ｈ１は分子量約７８±４ＫＤａを有する、主要表面成分を沈殿させた 。機能的には、ＣＤｌ１ｂ／ＣＤ１８およびＥＰＲ−１は異なるリガンド認識特 異性を育する。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８はＣ３ｂ１、フィブリノゲン、そして因子 Ｘ　［５ａｎｃｈｅｚ　Ｍａｄｒｉｄ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、ＥＸＩ ｌ、　Ｍｅｄ、、　１５８：１７８５（１９８３）；　八１ｔｉｅｒｉ、Ｄ、ｅ ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１０７：１８９３　（１９８８）＋　 Ｗｒｉｇ■煤B Ｓ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８５ニア７３３　（１９８８）：　Ａｌｔｉｅｒ堰A　Ｄ、　ｅｔ ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６３ニア００７　（１９８８） ］、のオリゴ特異的レセプターとして認識されているが、ＥＰＲ−１は活性化セ リンプロテアーゼＸａ　［Ａｌｔｉｅｒｉ、　Ｄ、　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６４：２９６９　（１９８９月に結合する。

抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤｌ８　ｍＡｂはＥＰＲ−ルセブター機能を阻害せず、その逆 もまたＣＤｌ１ｂ／Ｃｄ１８　リガンド認識についてのＥＰＲ−１にも適用され る。同様に、可溶性のＤＣ１ｌｂ／ＣＤ１８　リガンド、たとえばフィブリノゲ ン［Ａｌｔｉｅｒｉ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　 １０７：＋８９３　（１９８８）　；　Ｗｒｉｇｈｔ、@Ｓ。

Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ　８５ニア７３３　（１９８８）　］および因子Ｘ［Ａｌｔｉｅｒｉ、　Ｄ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＯｌ、、　２６３ニア０（７７ （１９８８）］はＸａのＥＰＲ−ルセプター認識と競合または阻害しない。

ＰＢＬに関するＥＰＲ−１の強力に調節された発現さらに別の研究を計画し、抗 原特異的またはマイトジェン駆動Ｔ細胞活性化の条件下で、ＥＰＲ−１発現の強 力な調節の可能性を調査した。新鮮に単離されたＰＢＭＣを照射同種Ｂ細胞すな わち（ＭＨＣクラス■およびＩＩに駆動された）Ｒａｊｉまたは（ＭＨＣクラス ＩＩに駆動された）Ｄａｕｄｉに対して単一方向性混合リンパ球培養（ＭＬＣ） 中に供給した。７日間培養後、応答Ｔ細胞を収穫し、洗浄し、そしてｍＡｂ　７ Ｇ１２．９Ｄ４および１２Ｈ１を用いてＦＭＦにより表現型の特徴決定した。

他の一連の研究において、ＰＢＭＣを１μｇ／ｍｌのポリクローナル活性化因子 （ＰＨＡ）またはＣｏｎＡの存在下で７日間別々に培養し、続いてＦＭＦ分析に かけた。図２に示すように、正常ＰＢＭＣまたはレクチン活性化の両方の同種性 増加は、ｍＡｂ１２Ｈ１で認識されたように、ＥＰＲ−ビＴ細胞において一貫し た３倍−４倍増を生じた。

＋２８１”細胞の観察された増加が、活性化の後起きるＴ細胞サブセットの選択 的再分布の結果であるという可能性を除外するために、種々の時間間隔で培養後 ＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣを順次分析した。ＥＰＲ−ビサブセットのＣｏｎＡ媒介定 量化増加は、増殖する活性化芽球に特有の前方光散乱を有する細胞に起こった。

これらの細胞の数は培養第６日と７日との間に約４倍に増加し、これらの細胞を ２色ＦＭＦにより表現型の特徴決定した場合、それらはＣＤ３”、ＣＤ４”、Ｃ Ｄ８’″、ＣＤ２”であった。

さらに別の研究を行い、ＥＰＲ−１発現に及ぼす長期同種反応刺激の作用を調査 した。照射Ｄａｕｄｉ細胞に対して単一方向性ＭＬＣを１０％Ｔ細胞成長因子（ ＴＣＧＦ）の存在下で毎週移し換えを行い継代培養で維持した。種々の時間間隔 で、応答Ｔ細胞の了りコートを収穫し、フィフールハイパックを用い、遠心によ り回収し、そして最終的に、ｍＡｂ１２ＨＩまたはポリクローナル抗血清８７８ ．９を用いＦＭＦによりＥＰＲ−１マーカーの発現を分析した。これらのデータ は図３に要約されている。ｍＡｂ１２ＨＩにより検出されたＥＰＲ−１１細胞の 数は、１ケ月の培養後、抗原培養活性中に約９倍増加した。類似の結果は、この 試薬により検出される、より多くの数のＥＰＲ−１エピトープと一致するより高 い反応性を示す、ポリクローナル抗血清８７８．９を用いて得られた。

ＥＰＲ−ビ細胞の選択的増加かまたはポリクローナルまたは抗原刺激から生じる このマーカーの新たな発現かを見分けるために、さらに別の組の研究を行つた。

新鮮に単離されたＰＢＬの懸濁物をｍＡｂ１２ＨＩを用いＦＭＦ選別により、Ｅ ＰＲ−１”とＥＰＲ−１−サブセットに分画して調製した。続いて、ＥＰＲ−１ 発現のＦＭＦ分析の前に、これら得られた群をｌμｇ／ｍ］のＣｏｎＡ、５μｇ ／ｍｌのＰＨＡとともに１０日間別々に培養するが、または１ｏ％ＴＣＧＦの存 在下で照射されたＤａｕｄｉを用い混合リンパ系細胞応答を刺激した。これらの 実験の結果を以後表４に示す。ポリクローナルまたは負の淘汰をしたＥＰＲ−１ −サブセットの抗原刺激の両方はｍＡｂ１２ＨＩの結合により検出されたように ＥＰＲ−１の新たな発現と関連していた。

表４ 短期培養後に活性化された負の淘汰を受けたＥＰＲ−１−サブセットでの新たな ＥＰＲ−１発現 ＊新しく単離されたＰＢＬをｍＡｂ１２ＨＩを用いてＦＭＦによりＥＰＲ−１− およびＥＰＲ−ビサプセットに分画化した。抗ＥＰＲ−１ｍＡｂ１２８１でのＦ ＭＦ分析の前に、得られた群をＩμｇ／ｍｌのＣｏｎＡ、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ の存在下で培養するかまたはＤａｕｄｉ細胞により同種ＭＨＣを１０日間刺激さ れた。Ｕ＝任意の単位 Ｔ細胞に発現されたＥＰＲ−１は機能的に活性なプロテアーゼレセプターである 。

別個のリンパ球群でのＥＰＲ−１の発現をさらに実証するために、多くの形質転 換されたｉｎ　ｖｉｔｒｏのＴ細胞系を上記のｍＡｂの一団を用いてＦＭＰによ りスクリーニングした。図４に示すように、アッセイされた種々のＴ細胞系のう ち、ＨｕＴ７８細胞のサブ群だけがｍＡｂ７Ｇ１２と反応した。これらの細胞を ポリクローナル抗血清Ｂ　７８．９を用い蛍光選別により〉９０％純度にまで単 離しＨｕＴ７８＊サブ群を得て、続いて、これを限界希釈によりクローン化した 。

これらのクローンを確立し、サブクローン化し、０ＫＴ３”　、０ＫＴ４”、０ ＫＴ８−１１２Ｈ１”、Ｂ７８．９”としてＦＭＦにより表現型を特徴決定し、 それらの１つをさらに調査するために選択した。

Ｈｕｔ７８°の懸濁物を２．５ｍＭ　ＣａＣ］ｔの存在下で漸増濃度のＩｎ３− Ｘａで平衡化した場合、これらの細胞は特定の濃度依存反応中の供給されたリガ ンドに結合し、３３０−３６ｎの添加”Ｊ−Ｘａで安定した飽和に近づいた（表 ５）　。ＴＨＰ−１細胞［Ａｌｔｉｅｒｉ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６４：２９６９（１９８９）］、で以前得られた結 果と定量的に同様に、この反応は、はぼ１１０−２０ｎの見かけ上のＫｄにより 調節されており、”Ｊ−Ｘａの１９４．０００±２６．０００分子がＨｕＴ７８ °細胞の表面と特異的に結合している場合、飽和となった。最後に、飽和量のｍ Ａｂ９Ｄ４とのＨｕＴ７８’細胞の事前インキュベーションは、これらの細胞に 対する”’Ｉ−Ｘａの特異的結合を阻害した。

表５ ＊ＨｕＴ７８°細胞に結合するＩＩＩ　ｌ−因子Ｘａ、ウサギポリクローナル抗 血清８７８、９と反応するＨｕＴ７８”細胞をフルオレセイン選別により９４． ２％純度に単離し限界希釈によりクローン化した。３つのクローンを確定し、表 現型を特徴決定し、そしてひとつ（ＨｕＴ７８°−３）をさらに調査するために 選択した。

ｌＸ１０’／ｍ１のＨｕＴ７８”　−３細胞の懸濁物を漸増濃度のＩＩＩ　１− 因子Ｘａ（０，４５−３６ｎＭ）および２．５　ｍＭ　Ｃａ　Ｃｌ　ｇを添加し 、さらに２０分間室温でインキュベートする前に対照抗体または５０ｎｇ／ｍｌ の抗ＥＰＲ−１ｍＡｂ９Ｄ４と３０分間、室温で別々にインキュベートした。反 応はシリコーン油の混合物と遠心することにより終了させ、ＨｕＴ７８°細胞に 特異的結合する”’Ｉ−Ｘａを抗ＥＰＲ−１ｍＡｂ９Ｄ４の存在下または非存在 下で計算した。

竺険 いくつかの白血球に発現される細胞表面プロテアーゼレセプターとの一団のｍＡ ｂの反応性を特徴決定した。以前の研究において、血漿凝固タンパク質■（７Ｇ １２）に対して初めに産生されたｍＡｂは、特定の飽和反応において、単球−骨 ａ細胞系、ＴＨＰ−１、Ｖ９３７．およびＨＬ　−６０［Ａｌｔｉｅｒｉ、Ｄ、 　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ、　２６４：２９６９　（１９８９）］　と結合す ることが示された。さらに血漿タンパク質Ｖａ　［Ｎｅ５ｈｅｉａ　Ｍ、　Ｅ、 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ［ＩＬ、　２５４：１０９５２ 　（１９７９j］ の既知の受容体／補因子機能から類推して、これらの細胞にｍＡｂ７Ｇ２２によ り認識される分子はセリンプロテアーゼＸａの特異的レセプター機能に関係して いるように見えた。

抗ＶｍＡｂの一団も現在産生されている。これらｍＡｂを分泌するハイブリドー マをＴＨＰ−１細胞のＦＭＦ分析により選択し、ｍＡｂをプローブとして用い、 末梢血細胞のＶ細胞表面交差反応分子の発現を探求した。

これらの研究から導かれる第一の結論は、ＥＰＲ−１として機能的に定義される これらｍＡｂにより認識される分子が培養中の形質転換細胞系だけにより不適切 に発現されるものではないことである。むしろ、それは広い細胞分布およびリン パ球系統の細胞と顕著な関連を有している。調査された種々の群中には著しい異 種性を育しているが、これらｍＡｂの定義するＥＰＲ−］は末梢血単球、ＰＭＮ およびＣＤ３−　ＣＤ］６”　ＣＤ５６”　ＮＫ細胞と反応することが見い出さ れた。

興味深いことに、循環Ｔ細胞の少ないフラクションもＥＰＲ−ビとして同定され た。ＦＭＦによるこのサブセットの表現型特徴決定はＥＰＲ−１の発現か、Ｔ細 胞の現在既知のマーカーにより定義される独自のサブ群に区別されないようであ ることを示唆した。種々のドナーから単離された大部分のＥＰＲ−１”Ｔ細胞は またＣＤ８’″またはα／βＴＣＲ＋であったが、ＣＤ４または／δＴＣＲを共 発現する細胞も同定した。この所見と一致して、ＭＯＬＴ１３細胞のＥＰＲ−１ マーカーの明示された発現は、以前の観察［Ｌｅｆｒａｎｃ、　Ｍ、　Ｐ、、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ。

３１６：４６４　（１９８５）；　Ｂｒｅｎｎｅｒ、　Ｍ、Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、 、　Ｎａｔｕｒｅ、３２５：６８９　（１９８７）］と一致■■ ＣＤ４”およびＴＣＲ／δ“とじて、さらに表現型を確定した。

正常ＰＢＬのＣＤ８”フラクションの中で、ＥＰＲ−１発現は、ｍＡｂＯＫＭｌ およびＨＮＫ−１により固定されたように、ＣＤ１１ｂ　（Ｌｅｕ１５）および ＣＤ５７　（Ｌｅｕ７）の共発現と一貫して関連していた。初期の研究において 、この種類のマーカーはサプレッサー機能［Ｃｌｅｍｅｎｔ、　Ｌ、　Ｔ、、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｎｎｕｎｏｌ、。

＋３３：２４６１　（１９８４）；　Ｆｏｘ、　Ｅ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６６：４０４　（１９８V）：　Ｔａｋｅｕ ｃｈｉ、　Ｔ、、　ｅｔａｌ、、　Ｃｅ１１．　Ｉｎｎｕｎｏｌ、、　１１１： ３９８　（１９８８月およびＬＡＫ活性［Ｄｉａｎｚａｎｉ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｎｎｕｎｏｌ、、　＋９：１０３７　（＋９８９）］と関 連していた。しかしながら、このＴ細胞サブセットの以前に報告された弱い増殖 性応答［Ｆｏｘ、　Ｅ、　Ｊ、、　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、 　１６６：４０４　（１９８７）］と矛盾して、ＥＰＲ−１発現は、マイトジェ ンおよび抗原刺激により強く増大するのが観察された。

この所見は、こうＥＰＲ−１ウサギポリクロ一ナル抗体８７８．９が、１ケ月の 培養後、はとんどすべての応答細胞と反応する、長期の同種反応−刺激Ｔ細胞を 用いた研究で特に強調されているように見えた。同様に、新たなＥＰＲ−１発現 もまた、調製により選択されたＥＰＲ−１一群の短期のポリクローナルまたは抗 原刺激の後、観察された。これらのデータは、ＥＰＲ−１が真実のＴ細胞活性化 応答性分子であるという仮定と一致するようであるが、単一のクローン細胞レベ ルでのさらに別の調査が、この可能性を重点的に取り上げて決定することが必要 である。最後に、ＣＤ４またはＣＤ８両方の発現と一致して、ＥＰＲ−ビ細胞の 選択的増加はクラスＩまたはクラス［ＩＭＭＣ同種刺激によって観察されなかっ た。

ＥＰＲ−１の細胞分布は白血球インテグリンＣＤ　１　ｌ　ｂ／ＣＤ　ｌ　８　 ［ＳａｎｃｈｅｚＭａｄｒｉｄ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ、、　１５８：１７８５　（１９８３）］のそれと密接に類似しているが 、免疫沈降研究および１１１１７標識リガンド結合アッセイにより明示された構 造／機能分析は、これらが別々の異なるレセプター認識機能［Ａｌｔｉｅｒｉ、 　Ｄ、　ｅｔ、、Ｊ、Ｂ１０Ｌ、Ｃｈｅｍ、、２６４：２９６９　（１９８９） ；５ａｎｃｈｅｚ　Ｍａｄｒｉｄ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、ＭｅｄA 。

１５８：１７８５　（１９８３）；　Ａｌｔｉｅｒｉ、　Ｄ、　Ｃ，、ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１０７＋１８９３@（１９８８）； Ｗｒｉｔｅ、　Ｓ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５：ｍ３４（１９８８）；　`ｌｔｉｅｒｉ。

Ｄ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅｌＬ、　２６３ニア０ ０７　（１９８８月と関係した２つの異なる分子であることを明らかに示してい る。

この研究は、使用される抗ＥＰＲ−１ｍＡｂを産生ずるために初めに免疫原とし ての役目をする細胞ＥＰＲ−１と血漿タンパク質との間の相互関係に重点をおい て計画されたものではない。しかしながら、記載された抗ＥＰＲ−１ｍＡｂ団（ Ｉ団）は、因子Ｖで免疫処理により誘発された抗Ｖハイブリドーマの少数フラク ションだけを構成することに注目することが重要である。事実、同じプロトフル で産生じ、確立し、そして因子Ｖと免疫反応するｍＡｂの産主により選択された 第三回の抗ＶｍＡｂはＴＨＰ−１細胞との交差反応性を示さなかった。さらに、 免疫沈降研究において解明されたＥＰＲ−１の大きさく７８±４ＫＤａ）と構造 的構成は血漿タンパク質因子Ｖａ　［ＮｅｓｈｅｉＩＩＬＭ、　Ｅ、、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２５４：１０９５２　（１９７９）ｌのＬ＠と顕著な大きさの類似性を示してい る。これらの考慮に基づいて、ＥＰＲ−１がリガンド認識と機能的に関連した、 いくつかの保存された免疫反応性エピトープを維持している血漿凝固タンパク質 Ｖと相同な細胞表面分子を示すと考えられる。

種々の白血球群でのＥＰＲ−１の発現が特定の免疫エフェクター機能におけるそ の関係を意味するものかどうか現在知られていない。しかしながら、ＮＫ細胞お よびＣＤ８”　Ｔ細胞が高親和性セリンプロテアーゼレセプターを発現するとい う観察がヒトおよびマウスＮＫおよびＣＴＬクローン［Ｍａｓｓｏｎ　Ｄ、、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ。

４９：６７９　（１９８７）］の顆粒中に含まれる、密接に関連したセリンプロ テアーゼ（グランザイ幻のファミリーの同定を考慮した場合、刺激的である。こ れらの酵素は多くのセリンプロテアーゼと、特に凝固プロテアーゼ因子ＩＸａ、 Ｘａ、およびプラスミン［Ｊｅｎｎｅ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５：４８１４（１９W８） ： Ｇｅｒｓｈｅｎｆｅｌｄ、　）ｔ、　Ｋ、、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ 、　２３２：８５４　（１９８６）；　Ｊｅｎｎｅ、　Ｄ、A　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　１ｗＩｕｎｏ１．、１４０：３１８　（１９８ｇ）；　Ｌｏｂｅ、　Ｃ， Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２：８５W（１９８６）； Ｇｅｒｓｈｅｎｆｅｌｄ、　Ｈ，に、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳん８５：１１８４　（１X８８）］と 顕著な相同性を共有する。遺伝子発現の強力な調節およびグランザイムの分泌が ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＥＰＲ−１の発現の増大（すなわち抗原およびＩＬ−２に 対する長期応答）と関連する同じ刺激により増大する［Ｍａｎｙａｋ、　Ｃ，Ｌ 、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　［［１ｕｎｏ１．、１４２：３７０７　（１９８９）＋　Ｍａｓｓｏｎ、 　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＩＪＢＯＪ、、　４：２５３R（１９８５）］ ことも注目に値する。ＮＫまたはＣＴＬキリング（Ｋｉｌｌｉｎｇ）における細 胞グランザイムの役割は解明されねばならないが［Ｄｅｎｎｅｒｔ、　Ｇ、、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

階比Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８４：５００４　（１９８７月溶解工程に おけるセリンプロテアーゼの推定的役割はセリンプロテアーゼ阻害剤を用いた実 験［Ｒｅｄｅｌｓａｎ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　ＩＩＩｕｕｎｏｌ、、　１２４：８７０　（１９８０）＋　Ｃｈａｎｇ、 　Ｔ、　Ｗ、、ｅｔａｌ、、　Ｊ、　ＩＩＩＩＩＩｕｎｏｌA、　１２４：１０ ２８ （１９８０）；　５ｕｆｆｙｓ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　 Ｂｉｏｃｈｅａ、　１７８：２５７（１９８８）；　５ｃｕр■窒堰A　Ｐ、。

Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．、１４３：１６８　（１９８９月により示唆されている 。

タンパク質分解活性のレセプター媒介増幅［Ｍｉｌｅｓ、　Ｌ、＾、、　ｅｔ　 ａｌ、。

Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、２二６１（１９８８）：　Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、ｅ ｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１．　５０：１２９（１９８７）；　Ｎ■Tｈｅｊｕ ｋＬ　Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ、　２５４：１０ ９５２　（１９７９月、の一般的概念から類推して、局部的に放出されたグラン ザイムはエフェクター細胞の膜成分と相互作用し、循環プロテアーゼ阻害剤によ る中和から保護された最適の触媒効率を産出する。

これに関連して、ＥＰＲ−１は、因子Ｘａのように原形の、高度に保存されたセ リンプロテアーゼのリガンド認識を示しかつ抗原刺激により強力にアップレギュ レートされた、免疫エフェクター細胞により発現される表面レセプターの必須要 件を具体化しているであろう。

結論として、ｍＡｂ選択の通常でない方法を用いることにより、新規な白血球マ ーカー、セリンプロテアーゼレセプター、および血漿凝固タンパク質Ｖの明らか な細胞表面相同性体を同定した。免疫エフェクター細胞でのその顛著な分布のた めに、名称“ＥＰＲ−１″を提唱し、一時的にこの分子を識別する。フィブリン の細胞媒介形成のメカニズムにおいてＥＰＲ−１の役割はＸａに対する、その認 識［Ｎｅ５ｈｅｉａ、　Ｍ、　Ｅ、、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅａ、　２５４：１０９５２　Ｑ９７９）］により強調されているが、セリン プロテアーゼにより媒介される広い範囲の生物的活性は、さらに別のリガンド認 識および細胞媒介機能におけるＥＰＲ−１の関係を示していると考えられる。

本発明は明瞭性の目的で例示および実施例によりいくらか詳細に記載されている が、いくつかの明白な改変は本クレームの範囲内で行われ得る。

図面の簡単な説明 図１は抗−ＥＰＲ−１ｍＡｂ　９Ｄ４との単球またはＰＭＮ（多形核白血球）の ＦＭＦ　（フローミクロ蛍光定量法）分析を示す。単球の懸濁物は自己白米血清 で事前筒布されたプラスチックに３７°Ｃで１時間付着させることによりＰＭＢ 　Ｃ（末梢血単核細胞）から調製された。ＰＭＮはデキストラン沈降により単離 された。ｌＸｌ０’細胞をｍＡｂ　９Ｄ４　１０日ｇ／ｍｌと氷上で３０分間染 色し、洗浄し、そして更にフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧのｌ／２０希 釈液とインキュベートした。細胞を洗浄し、ただちにＦＭＦにより分析した。対 照ｍＡｂはＶ８２Ａ６と関係かなく１点線で示されている。横軸は４対数目盛り での蛍光強度を示す。縦軸は細胞数を示す。

図２はＴ細胞活性中のＥＰＲ−１発現の調節を示す。新しく単離されたＰＢＭＣ （１０ＸＩ　Ｏ“）のアリコートを１ｕｇ／ｍｌのＰＨＡ、または、ＣｏｎＡの 存在下で３７°Ｃで７日間培養することにより、ポリクローナル活性化した。抗 原特異的増加のために、１０Ｘ１０６でＰＢＭＣの懸濁物を、照射（１０，００ ０ラド）したＤａｕｄｉまたはＲａｊｉ細胞（ＩＯＸＩＯ’）と共に５％ＣＯ！ 中で３７°Ｃで７日間単一方向性混合リンパ球培養中（ＭＬＣ）で別々に培養し た。

インキュベーションで終了時に、応答Ｔ細胞を収穫し、フィコールーハイペイク で遠心分離により回収し、洗浄し、ｍＡｂ１２Ｈｔとフルオレセイン結合ヤギ抗 マウスＩｇＧ＋ＩｇＭのアリコートで染色し、ＦＭＦで分析した。点線は関係の ないｍＡｂ　Ｖ８２Ａ６で染色されるバックグランドを示す。それぞれのインキ ュベーション混合前に分析された１２Ｈ１”細胞の割合は６．７±１．　４％で あった。

図３はＥＰＲ−１発現に及ぼす長期の同種反応刺激の作用を示す。単一方向性Ｍ ＬＣを照射した（１０．０００ラド）Ｄａｕｄｉ細胞に対して調製し、毎週の移 し換えとｌＯ％Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）により維持した。応答Ｔ細胞のアリ コートを種々の時間間隔（０日、７日、１５日、３２日）で収穫し、フィコール ーハイペイクで遠心分離することにより回収し、抗−ＦＰＲ−１ｍＡｂ１２Ｈ１ ，またはポリクロナール抗血清Ｂ　７８．９を用いてＦＭＦにより分析した。

図４は形質転換Ｔ細胞系に関するＥＰＲ−１の発現を示す。抗−ＥＰＲ−１ｍＡ ｂ７Ｇ１２と共に培養中の継体Ｔ細胞系の一団のＦＭＦ分析を図１に記載された ように行った。関係のないｍＡｂ　Ｖ８２Ａ６を対照として用い、点線で示す。

ＦＬＩ 図、３Ａ ＦＬＩ 図３Ｂ 図、４Ａ 図４Ｂ 図４Ｃ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｐ　２１１０８　 ８２１４−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｌ　８３１０−２Ｊ／／　Ｃ１２Ｎ　５ ／２０ （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） ｌ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．下記のアミノ酸残基配列： 【配列があります】および【配列があります】（Ｘａａは、未特定のアミノ酸残 基である）を含む、分子量約７８ｋＤを有する精製タンパク質。
2. ２．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０６３７を有するハイブリドーマ１２ＨＩにより分 泌されるモノクローナル抗体と更に免疫反応する、請求項１記載の精製タンパク 質。
3. ３．分子量約７８ｋＤａを有し、下記のアミノ酸残基配列：【配列があります】 および 【配列があります】 （Ｘａａは、未特定のアミノ酸残基である）を含むタンパク質をコードする、単 離されたＤＮＡセグメント。
4. ４．分子量約７８ｋＤａを有し、下記のアミノ酸残基配列：【配列があります】 および【配列があります】（Ｘａａは、未特定のアミノ酸残基である）を含むタ ンパク質をコードする、単離されたＤＮＡセグメントを含む、自己複製ＤＮＡ分 子。
5. ５． 【配列があります】および【配列があります】（Ｘａａは、未特定のアミノ酸残 基である）から成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を有する、約６００までの アミノ酸残基を含むポリペプチド。
6. ６． 【配列があります】および【配列があります】（Ｘａａは、未特定のアミノ酸残 基である）から成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を有する、約６００までの アミノ酸残基を含む、ポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡセグメント。
7. ７． 【配列があります】および【配列があります】（Ｘａａは、未特定のアミノ酸残 基である）から成る群から選ばれる、アミノ酸残基配列を有する約６００までの アミノ酸残基を含むポリペプチドをコードする、ＤＮＡセグメントを含む自己複 製ＤＮＡ分子。
8. ８．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０６３７を有する１２Ｈ１ハイブリドーマにより産 生される抗体と免疫反応し、 【配列があります】および【配列があります】（Ｘａａは、未特定のアミノ酸残 基である）から成る群から選ばれる、アミノ酸残基配列を含むポリペプチド。
9. ９．前記ポリペプチドがヒト因子Ｘａと結合する、請求項８記載のポリペプチド 。
10. １０．前記ポリペプチドが分子量約７８±４ｋＤａを有する、請求項８記載のポ リペプチド。
11. １１．前記ポリペプチドがＴＨＰ−１、好中球、ＮＫ細胞、および，ＡＴＣＣ受 託番号ＣＲＬ１０６３８を有するＭＯＬＴ１３＃３から成る群から選ばれる細胞 系から単離される、請求項８記載のポリペプチド。
12. １２．ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０６３８を有するＭＯＬＴ１３＃３から単離さ れ、分子量約７８ｋＤａを有し、下記のアミノ酸残基配列：【配列があります】 および【配列があります】（Ｘａａは、未特定のアミノ酸残基である）を含むタ ンパク質と免疫反応する抗体結合部位を有する抗体組成物。
13. １３．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０６３７を有する１２Ｈ１ハイブリドーマにより 産生される、請求項１２記載の抗体組成物。
14. １４．（ａ）細胞表面レセプターについてアッセイされる細胞を含みかっ因子Ｖ およびＶＩＩＩを実質的に含まない、体内試料と下記のアミノ酸残基配例：【配 列があります】および【配列があります】（Ｘａａは、未特定のアミノ酸残基で ある）を含むタンパク質と免疫反応する抗体結合部位を含む抗体組成物とを混合 し、（ｂ）免疫反応産生物の形成に十分な時間該混合物を椎持し、そして（ｃ） 該産生物の存在を測定し、それにより該体内試料におけるレセプターの存在を測 定する、工程を含む体内試料中の細胞表面レセプターの存在のアッセイ方法。
15. １５．該体内試料の一部を固体支持体に固定し、該免疫反応混合物が固相および 液相を含み、前記免疫反応産生物が前記固相に生じる、請求項１４記載の方法。
16. １６．前記タンパク質がＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０６３８を有するＭＯＬＴ１ ３＃３細胞系から単離される、請求項１４記載の方法。
17. １７．前記抗体組成物がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０６３７を有する１２Ｈ１ハイ ブリドーマにより産生される抗体から成る、請求項１４記載の方法。
18. １８．（ａ）患者からの体内試料と下記のアミノ酸残基配列：【配列があります 】および【配列があります】（Ｘａａは、未特定のアミノ酸残基である）を含む タンパク質と免疫反応する抗体結合部位を含む抗体組成物とを混合し、（ｂ）第 一免疫反応産生物の形成に十分な時間、該混合物を維持し、（ｃ）生じた第一の 免疫反応産生物の量を測定し、（ｄ）治療期間後、患者からの第二体内試料に関 して工程（ａ）−（ｂ）を繰り返し、 （ｅ）生じた第二の免疫反応産生物の量を測定し、（ｆ）生じた第一と第二の免 疫反応産生物の量の差異を測定し、それにより治療プロトコルに対する患者の応 答を測定する、ことを含む治療プロトコルに対する、ＥＰＲ−１発現腫瘍細胞に 相関関係のある疾病状態に苦しむ患者の応答を監視する方法。
19. １９．前記抗体組成物がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０６３７を有する１２ＨＩハイ ブリドーマにより産生される抗体を含み、請求項１８記載の方法。
20. ２０．前記抗体組成物がＴＨＰ−１、単球、好中球、ＮＫ細胞、および，ＡＴＣ Ｃ受託番号ＣＲＬ１０６３８を有するＭＯＬＴ１３＃３から成る群から選ばれる 細胞系から単離されるタンパク質と免疫反応する、請求項１８記載の方法。