ES2596254T3

ES2596254T3 - Novedosos anticuerpos antagonistas y sus fragmentos Fab contra GPVI y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2596254T3
Application number: ES10813028.7T
Authority: ES
Inventors: Nicolas Baurin; Francis Blanche; Béatrice Cameron; Carsten Corvey; Tarik Dabdoubi; Christian Engel; Peter Florian; Ingo Focken; Katja Kroll; Jochen Kruip; Christian Lange; Thomas Langer; Martin Lorenz; Vincent Mikol; Ercole Rao; Peter Wonerow
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2017-01-05
Anticipated expiration: 2030-12-17
Also published as: EP2513147A2; SG10201405259PA; TW201132759A; WO2011073954A3; EP2933269A1; ZA201204421B; MA33930B1; UY33115A; LT2513147T; SI2513147T1; AU2010331807A1; EA201290525A1; PL2513147T3; JP2013514077A; CA2784498A1; CN102725309B; BR112012014975A2; IL220447A0; PT2513147T; KR20120102125A

Abstract

Un método para preparar un fragmento Fab modificado que alberga una molécula en el extremo C-terminal de su cadena pesada que comprende las etapas de: (a) Adición de una molécula que consiste en GlyGlyGlyGlySer o (GlyGlyGlyGlySer)2 al extremo C-terminal de la cadena pesada del fragmento Fab; (b) Producción del fragmento Fab modificado en un sistema apropiado; y (c) Purificación del fragmento Fab modificado, en el que la adición evitar el reconocimiento del fragmento Fab modificado por anticuerpos anti-Fab preexistentes en un paciente.

Description

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permanecen ausentes o no disponibles durante toda la vida de la plaqueta. Eso corresponde a una ampliación de la duración de la acción hasta varios días, dependiendo de la semivida de las plaquetas (10 días para plaquetas humanas).

Todas estas propiedades demuestran que los Fab de la presente descripción son candidatos adecuados para el tratamiento de enfermedades trombóticas y vasculares.

Las clases importantes de dianas para agentes biológicos basados en anticuerpos son receptores de membrana que pueden bloquearse con alta especificidad por anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos de longitud completa en el formato IgG se unen y también bloquean su diana a través de su parte Fv. La parte Fc añade funcionalidad adicional a estas moléculas que conduce a citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad mediada por el complemento (CDC). Estas actividades a menudo son una parte importante del modo de acción del mAb (MoA) especialmente para aplicaciones de oncología. Sin embargo, en otras áreas de aplicación las actividades ADCC/CDC tienen me minimizarse o no son necesarias. Por lo tanto, son deseables varios fragmentos de anticuerpo que carecen de la parte Fc, tales como moléculas Fab. Otra razón para desarrollar fragmentos de anticuerpo monovalentes deriva de la biología de la diana. Muchos receptores de membrana inician la señalización después de la agrupación de receptores (por ejemplo, GPVI). Si dicho receptor debe bloquearse, un fragmento de anticuerpo monovalente es el formato natural de elección.

Los fragmentos de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab son formatos mucho más adecuados que los anticuerpos completos para muchas aplicaciones clínicas. Esta ventaja depende de varias características únicas de los fragmentos Fab que los diferencian de los anticuerpos completos, en particular:

-monovalencia: necesaria si debe evitarse el entrecruzamiento de moléculas -ausencia del dominio Fc: necesario si no se necesitan o son indeseables las funciones Fc -menor peso molecular: determina el comportamiento farmacocinético y farmacodinámico, así como la distribución tisular

Para mantener estas propiedades deseadas de los fragmentos Fab de anticuerpo después de su administración a un paciente, debe evitarse la interacción de los fragmentos Fab con moléculas no diana.

Como se ha mencionado previamente, los fragmentos Fab se obtienen por deleción del dominio constante de la cadena pesada (parte Fc) de la molécula IgG. Desafortunadamente, la retirada del Fc expone un novedoso péptido C-terminal (o extremo C-terminal), es decir un neoepítopo. Se ha informado de una clase específica de proteínas, capaces de interaccionar específicamente con la extremidad C-terminal de los fragmentos Fab en seres humanos y se han identificado como anticuerpos preexistentes contra fragmentos de anticuerpo tales como Fab (Kormeier et al. (1968) J. Immunol. 100(3);612-21; Persselin y Stevens (1985) J. Clin. Invest. 76; 723-30). Estos anticuerpos preexistentes se forman de manera prematura en la vida y dependen del paciente. Con el desarrollo de anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo como novedosos agentes terapéuticos, la existencia de anticuerpos preexistentes anti-Fab restringe y complica el uso de moléculas Fab terapéuticas por las razones mencionadas anteriormente.

Además, la extremidad C-terminal del Fab es un epítopo preferido para la generación de anticuerpos como se ha descrito previamente (Christopoulos C., et al. 1994). Sin embargo, incluso en casos donde el paciente no tiene o tiene cantidades bajas de anticuerpos preexistentes contra el extremo C-terminal, puede aparecer la generación de nuevos anticuerpos dirigidos contra este epítopo después de la administración de Fab terapéutico, lo que conduce a estas mismas limitaciones descritas con los anticuerpos preexistentes.

De hecho, la unión de la molécula Fab terapéutica por anticuerpos preexistentes o nuevos contra el epítopo Cterminal del Fab puede cambiar el comportamiento farmacocinético y farmacodinámico de las moléculas (por ejemplo, activación de receptores en lugar de inhibición, basándose en el cambio de moléculas monovalentes a bivalentes), crear nuevos complejos y funciones (por ejemplo, añadir una parte Fc de anticuerpo con todas sus funciones efectoras) y cambiar el tamaño del complejo, que también puede tener consecuencias para la distribución tisular. Por lo tanto, este fenómeno representa un riesgo de seguridad y eficacia significativo que tiene que evitarse.

Para evitar dichas limitaciones, el neoepítopo que se reconoce por anticuerpos anti-Fab puede enmascararse mediante la adición de una molécula en el extremo C-terminal del Fab como se describe actualmente para moléculas Fab anti-GPVI. Este principio es esencial para el desarrollo de todos los fragmentos de anticuerpo terapéuticos en que la biología de la diana evita el uso de moléculas bivalentes (por ejemplo, en el caso de activación del receptor a través de agrupación) y donde se requiere de forma estricta, por lo tanto, el empleo de moléculas monovalentes.

Por lo tanto, para posibilitar el tratamiento más seguro de todos los pacientes, así como para evitar la variabilidad de la farmacocinética y farmacodinámica específica del paciente, las moléculas Fab deben modificarse para enmascarar los neoepítopos específicos de Fab creados en la extremidad C-terminal que podría reconocerse por anticuerpos preexistentes o recién generados contra fragmentos Fab.

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Para la purificación de la proteína GPVI marcada con His, se capturaron directamente las variantes del sobrenadante en matriz IMAC (HisTrap, GE Healthcare) y se eluyó por un gradiente de imidazol. Después de pulir la proteína por SEC usando Superdex 75 (GE Healthcare) y ultrafiltración, la proteína se usó en los experimentos indicados.

Ejemplo 2: Generación y selección de mAb anti-GPVI funcionales

A -Generación de mAb anti-GPVI

Se generaron anticuerpos específicos para GPVI usando el método RIMMS como se describe por Kilpatrick et al. (1997, Hybridoma 16: 381389).

Ratones BALB/c hebra de 6-8 semanas de edad (S082342; Charles River Labs, Bar Harbor, ME) recibieron cada una cuatro rondas de inmunización con proteína GPVI marcada con his soluble purificada (preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1) sobre un curso de 14 días a intervalos de 3-4 días.

Para la primera inmunización en el día cero, se administraron 5 µg de antígeno emulsionado en adyuvante de Titermax (TierMax Gold Adjuvant; Sigma n.º T2684) por vía subcutánea en seis sitios proximales a ganglios linfáticos de drenaje, a lo largo del lomo de los ratones. Se administraron otros 5 µg de antígeno emulsionado en adyuvante de RIBI (Sigma Adjuvant system; Sigma n.º S6322) a seis sitios yuxtapuestos a lo largo del abdomen. Se dieron inmunizaciones de refuerzo en los días 4, 7 y 11 de un modo similar.

Cuatro días después de la última inyección, se sacrificaron los ratones. Se aislaron los ganglios linfáticos bilaterales poplíteos, superficiales inguinales, axilares y branquiales de forma aséptica y se lavaron con medio RPMI fresco. Se liberaron los linfocitos de los ganglios linfáticos y la suspensión resultante de células individuales se lavó dos veces con medio RPMI antes de fusionarse con células de mieloma P3X63-AG8.653 usando polietilenglicol. Después de la fusión, la mezcla celular se incubó en una incubadora a 37ºC durante 16-24 horas. La preparación resultante de células se transfirió a medio semisólido selectivo y se sembró de forma aséptica en placas Petri de 100 mm y se incubó a 37ºC.

Diez días después del inicio de la selección, las placas se examinaron para el crecimiento de hibridoma, y se recogieron las colonias visibles y se colocaron en placas de 96 pocillos que contenían 200 µl de medio de crecimiento. Las placas de 96 pocillos se mantuvieron en una incubadora a 37ºC durante 2 a 4 días.

B -Selección de mAb que reconocen la proteína GPVI humana

La selección primaria para la producción de IgG anti-GPVI se realizó por ELISA usando la proteína de fusión GPVI-Fc (preparada como se describe en el Ejemplo 1) como antígeno de captura. Las placas se recubrieron con la proteína de fusión GPVI-Fc y se añadieron sobrenadantes de hibridoma a la placa y se detectaron usando anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón, conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (Sigma; n.º A9044). La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo tampón TMB-H2O2 y se leyó a una longitud de onda de 450 nm.

Entre los 367 hibridomas seleccionados de las placas de 96 pocillos, 129 hibridomas eran positivos para la producción de anticuerpo anti-GPVI humana y después se confirmaron 111 tras la amplificación celular.

C -Capacidad de los mAb anti-GPVI de bloquear la unión de colágeno a GPVI humana

Se realizó una selección secundaria para caracterizar las propiedades funcionales de todos los mAb específicos para GPVI humana para su capacidad de bloquear la unión de colágeno a la proteína de fusión GPVI humana-Fc en un ensayo de unión ELISA de competición. Se usaron placas de 96 pocillos personalizadas recubiertas con colágeno (Pierce). Se añadió mezcla preincubada de la proteína de fusión GPVI humana-Fc y los sobrenadantes de hibridoma a la placa y se detectó el complejo colágeno-GPVI humana-Fc usando anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG humana, conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (Sigma; n.º A0170). La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo tampón TMB-H2O2 y se leyó a una longitud de onda de 450 nm. Entre los 100 hibridomas de unión a GPVI, 22 hibridomas bloqueaban la unión de GPVI-Fc al colágeno (umbral: 90% de inhibición). Las propiedades de bloqueo de los mAb preseleccionados contra GPVI humana se confirmaron como dependientes de la dosis usando un ensayo ELISA de competición como se muestra en la Figura 1A.

Todos los mAb antagonistas se isotiparon como IgG1, kappa, determinados usando un kit de isotipado de IgG de ratón (SEROTEC; n.º MMT1) (datos no mostrados).

D -Propiedades de unión de los mAb anti-GPVI

Se realizó una última selección por resonancia de plasmón superficial (BIAcore 2000) para evaluar las propiedades de unión de los anticuerpos de bloqueo de GPVI. En este análisis, se evaluó la interacción de la proteína GPVI

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humana con los mAb anti-GPVI humana fijados a un anticuerpo anti-Fc unido covalentemente a chips CM. La cinética de unión de los mAb individuales se realizó usando el protocolo descrito por Canziani et al. 2004. Anal. Biochem. 325: 301-307.

Todos los mAb de bloqueo presentaban afinidades en el intervalo (sub)nanomolar para GPVI humana (Tabla 1). Basándose en las afinidades diana, se seleccionó el anticuerpo del clon de hibridoma 390 para desarrollo adicional.

Tabla 1: Afinidad y tasas de asociación/disociación de mAb anti-hGPVI seleccionados

Hibridoma: Biacore

ka (1/Ms): kd (1/s) KD (M)

25: 6,05E+04 2,57E-04 4,2E-09

29: 15,4E+04 3,28E-04 2,1E-09

136: 15,2E+04 3,16E-04 2,0E-09

145: 5,87E+04 8,63E-04 14,7E-09

149: 1,27E+04 1,49E-04 11,7E-09

202: 1,33E+04 2,10E-04 15,8E-09

298: 85E+04 18,2E-04 2,1E-09

345: 16,7E+04 3,29E-04 1,9E-09

390: 10,8E+04 0,04E-04 0,04E-09

E -Propiedades de reactividad cruzada de los mAb anti-GPVI con la proteína GPVI de primate

Se evaluaron los mAb específicos de GPVI enumerados en la tabla 1 para su capacidad de unirse a la proteína GPVI de primate-Fc por ELISA. Las placas se recubrieron con la proteína de fusión GPVI de primate-Fc, se añadieron mAb anti-hGPVI a la placa y se detectaron con anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón, conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (Sigma; n.º A9044). La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo tampón TMB-H2O2 y se leyó a una longitud de onda de 450 nm.

Los hibridomas preseleccionados se clonaron por cultivo en medio semisólido. Se sembraron placas Petri a 125 células/ml y se seleccionaron los clones que mostraban crecimiento significativo para la unión a GPVI, la actividad de bloqueo de GPVI y la reactividad cruzada con GPVI de primate. Como se muestra en la Figura 1B y la Figura 2, todos los mAb tenían reactividad cruzada con GPVI de primate.

Las secuencias usadas para el dominio extracelular de GPVI de primate (Macaca fascicularis o cynomolgus) se describen como la SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

F -Determinación de la secuencia de las cadenas pesada y ligera de los mAb anti-GPVI

El ADNc que codifica los dominios variables de los anticuerpos monoclonales se obtuvo del siguiente modo: se extrajo el ARNm de las células de hibridoma con el kit Oligotex de Qiagen. El ADNc correspondiente se amplificó por RT-PCR por el método RACE utilizando el kit Gene Racer (Invitrogen), la transcriptasa SuperScript III a 55ºC (Invitrogen) y los cebadores descrito en la Tabla 2 (RACEMOG1 o CKFOR). Los fragmentos de ADNc se amplificaron por PCR con la polimerasa Phusion a 55ºC (Finnzymes) y cebadores también descritos en la Tabla 2.

Tabla 2: Cebadores usados para RT-PCR y PCR

Cebador: Número de secuencia

Cebador 5'-GeneRacer: SEQ ID NO: 24

RACEMOG1: 3'-cebador interno para la bisagra murina: SEQ ID NO: 25

CKFOR: 3'-cebador interno para Ck murina: SEQ ID NO: 26

Los fragmentos amplificados que codificaban las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) se clonaron en el plásmido pGEM-T Easy de Promega o el plásmido pCR4-Topo de Invitrogen que se amplificaron en

E. coli. Después se secuenció el ADNc clonado en ambas hebras.

Las secuencias proteicas se tradujeron desde las secuencias codificantes de los plásmidos y se calcularon las masas de las cadenas pesada (HC) y ligera (LC) (Tabla 3). Los valores obtenidos estaban en perfecto acuerdo con los datos de espectrometría de masas obtenidos de preparaciones de mAb purificadas de cultivos del hibridoma correspondiente, véase la Tabla 3. En particular, se confirmó la ocupación del sitio de N-glicosilación en la región variable de la cadena pesada (NST) del anticuerpo 390 anti-GPVI. La secuencia de aminoácidos de HC y LC se presenta en la lista de secuencias del siguiente modo: la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6 corresponden a la HC del mAb anti-GPVI del clon 390 y la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8 corresponden a la LC del mAb anti-GPVI del clon

390.

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C -Caracterización biofísica de Fab recombinante

Se usó tecnología de resonancia de plasmón superficial en un Biacore 3000 (GE Healthcare) para la caracterización cinética detallada de los fragmentos purificados de anticuerpo. Se usó un ensayo de unión directa con el Fab anti-GPVI como ligando y GPVI humana como analito. Típicamente, se inmovilizaron 500 RU de Fab anti-GPVI en un chip CM5 de calidad de investigación por acoplamiento reactivo de amina, produciendo una Rmáx de 200 RU para la molécula GPVI unida. La cinética de unión se midió sobre un intervalo de concentración típicamente entre 0,8 a 208 nM en HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005%) a un caudal de 30 µl/min. Las superficies de los chips se regeneraron con glicina 10 mM pH 2,0. Los parámetros cinéticos se analizaron y calcularon en el paquete del programa BIAevaluation (versión 4.1) usando una celda de flujo sin Fab inmovilizado como referencia. Se aplicó un modelo de unión 1:1 con transferencia de masa para un ajuste global de los datos para las curvas.

Para investigar las consecuencias funcionales del motivo adicional de glicosilación presente en la secuencia original derivada del clon clone 390 glicosilado (Fab 390-G), se retiró el motivo conservado de glicosilación por remplazo de aminoácido (Fab 390-nG). Para este propósito, se construyeron dos fragmentos de cadena pesada basados en el clon 390: el primero no tiene ninguna modificación y corresponde a la SEQ ID NO: 9 y el segundo tiene una mutación puntual N→ Q en la posición 60 de la SEQ ID NO: 9.

Se sabe que la glicosilación puede ser muy heterogénea y produce heterogeneidad de glicoproteínas; dicha fuente de heterogeneidad debe evitarse lo máximo posible.

En el presente caso, la retirada del glicano adicional no afecta a la afinidad de unión por GPVI como se muestra en la Tabla 5. Por tanto, la construcción no glicosilada Fab 390-nG se ha elegido para experimentos adicionales.

Tabla 5: Determinación de las características de unión para moléculas Fab recombinantes anti-GPVI por SPR (Biacore)

Fab recombinante

ka (1/Ms): kd (1/s) KD (M)

Construcción: E+04 E-04 E-09

Fab 390-G: 32 0,15 0,05

Fab 390-nG: 34,8 0,22 0,06

D -Determinación del epítopo reconocido por el mAb anti-GPVI por cocristalización de Fab anti-GPVI con GPVI y cristalografía de rayos X

Para la caracterización del epítopo, se ha aplicado una estrategia de cocristalización. Se formó un complejo entre el Fab 390-nG (expresado en células HEK293) y la glicoproteína humana VI (dominio extracelular de GPVI humana (Met1-Thr205), expresado en células de insecto High five) por incubación de ambas proteínas a una relación molar igual. El complejo se digirió con tripsina, se volvió a purificación por filtración en gel, se concentró y se sometió a selección por cristalización. Se obtuvieron cristales de buena difracción mezclando 100 nl de solución proteica (complejo Fab-antígeno a 6,5 mg/ml en Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM) con 100 nl de solución de reserva que contenía BisTris 0,1 M pH 5,5, PEG3350 al 25% y acetato amónico 0,2 M e incubando la gota de proteína frente a 200 µl de solución de reserva a 4ºC en una placa sellada de cristalización por difusión de vapor de gota sedente. Un cristal se congeló rápidamente en nitrógeno líquido usando solución de reserva suplementada con etilenglicol al 25% para la crioprotección. Los datos cristalográficos se recogieron en la European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble, Francia, en la línea de haz ID14-4. La estructura se resolvió por Molecular Replacement usando el fragmento Fab de la entrada pdb 1 FDL como modelo para Fab 390-nG y un monómero de la estructura cristalina de la glicoproteína humana VI de plaquetas, entrada pdb 2GI7, como modelo para GPVI. La resolución y el factor R final de la estructura refinada son 1,72 Å, factor R 17,2% y libre R 19,9%. El epítopo de unión a GPVI es un epítopo conformacional caracterizado por interacciones (definidas como una distancia < 4,5 Å) de Fab 390-nG con los siguientes restos del antígeno hGPVI:

Pro4, Lys7, Glu40, Lys41, Leu42, Ser43, Ser44, Ser45, Arg46, Arg65, Arg67, Trp76, Leu78, Pro79, Ser80, Asp81, Gln82, Ser165, Arg166

Estos restos pertenecen al dominio D1 (hasta el aminoácido 84) o constituyen partes del dominio D2 (aminoácidos 94 a 176) y, por lo tanto, representan un epítopo conformacional. El sistema de numeración para los restos del epítopo de GPVI corresponde a la proteína con la secuencia señal retirada mostrada en la Figura 16 y la SEQ ID NO: 32. La interacción del Fab anti-GPVI del clon 390 con el dominio extracelular D1-D2 de GPVI se ilustra en la Figura 5.

Los restos del anticuerpo que contactan con los restos del epítopo de GPVI se describen en la Tabla 6 a la Tabla 11 a continuación.

Como se usa en este documento, "restos de contacto" se definieron como restos del anticuerpo con una distancia de menos de 4,5 Å a los restos del antígeno GPVI o a la inversa y medida en la estructura cristalina entre el anticuerpo contra GPVI y el antígeno GPVI. Las distancias se determinaron usando el programa de software NCONT del paquete de software CCP4.

5 La estructura de rayos X destaca restos de las CDR que pueden mutarse, que no deben afectar a la unión a GPVI.

En las siguientes descripciones, los restos de las CDR podrían modificarse como se indica, sin alteración de la unión a GPVI. También se entiende que las mutaciones en las CDR no deben afectar a la conformación y orientación de

10 los restos de las CDR para conservar la unión a GPVI. La numeración de los restos es secuencial y no sigue las convenciones de Kabbat usadas en Al-Lazikani ((1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948). "X" representa "cualquier resto", mientras que "-" indica que no debe hacerse modificación en esta posición.

La secuencia de CDRH1 definida en la SEQ ID NO: 18 abarca diez restos. Como se muestra en la Tabla 6, seis de

15 los diez o el 60% de los restos de la CDRH1 no hacen contacto con GPVI. Todos los restos de GPVI en contacto con los restos del anticuerpo son restos de serina.

Tabla 6: Restos de la CDRH1 del anticuerpo en contacto con los restos del antígeno GPVI

H26: H27 H28 H29 H30 H31 H32 H33 H34 H35

Secuencia inicial de CDRH1: G F S L T G Y G V N

Mutaciones sugeridas: - - X - X X Y/F - - -

GPVI: S44 S43 S43 S43

S44
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S44

20 La secuencia de CDRH2 se define en la SEQ ID NO: 19 y abarca dieciséis restos del anticuerpo. Como se muestra en la Tabla 7, nueve de los dieciséis o el 56% de los restos de la CDRH2 no hacen contacto con GPVI. Se descubrió que el triptófano 52 estaba en contacto con siete restos diferentes del antígeno GPVI. La arginina 46 de GPVI se encontró en contacto con cinco restos diferentes de la CDRH2.

25 Tabla 7: Restos de la CDRH2 del anticuerpo en contacto con los restos del antígeno GPVI

50: 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Secuencia inicial de CDRH2: M I W G D G S T D Y Q S T L K S

Mutaciones sugeridas: - I/V/L - - - - S/T X - Y/F - X X L/I X X

GPVI: S43 E40 S43 S44 R46 R46 R46

K41: S44 S45

L42: S45 R46

S43

S44

S45

R46

La secuencia de CDRH3 se define en la SEQ ID NO: 20 y abarca cinco restos del anticuerpo. Basándose en el hecho de que la definición de la secuencia CDR puede variar ligeramente dependiendo del software usado, se ha descubierto que la CDRH3 puede incluir un resto adicional. Por tanto, la CDRH3 puede ser como se define en la

30 SEQ ID NO: 38, abarcando seis restos del anticuerpo. Como se muestra en la Tabla 8, dos de los seis o el 33% de los restos de la CDRH3 no hacen contacto con GPVI. Se descubrió que la arginina 65 estaba en contacto con tres restos diferentes del antígeno GPVI. Existen tres restos diferentes de arginina de GPVI en contacto con restos de la CDRH3.

35 Tabla 8: Restos de la CDRH3 del anticuerpo en contacto con los restos del antígeno GPVI

98: 99 100 101 102 103

Secuencia inicial de CDRH3: D L P M D Y

Mutaciones sugeridas: D/N L/I/V - - D/N X

GPVI: L42 L42 R65 R166

S43
S43

R65
R65

R67

La secuencia de CDRL1 se define en la SEQ ID NO: 21 y abarca once restos del anticuerpo. Como se muestra en la Tabla 9, siete de los once o el 64% de los restos de la CDRL1 no hacen contacto con GPVI. Se descubrió que la tirosina 32 estaba en contacto con cinco restos diferentes de GPVI.

Tabla 9: Restos de la CDRL1 del anticuerpo en contacto con los restos del antígeno GPVI

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24: 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

Secuencia inicial de CDRL1: K A S Q D I N K Y I A

Mutaciones sugeridas: X - X G/E D/N - - X - - -

GPVI: P4 L78 K7 R67

P79
P79

S80
S80

D81
D81

Q82

La secuencia de CDRL2 se define en la SEQ ID NO: 22 y abarca siete restos del anticuerpo. Basándose en el hecho de que la definición de la secuencia CDR puede variar ligeramente dependiendo del software usado, se ha descubierto que la CDRL2 puede incluir un resto adicional. Por tanto, la CDRL2 puede ser como se define en la SEQ ID NO: 39 abarcando ocho restos del anticuerpo. Como se muestra en la Tabla 10, seis de los ocho o el 75% de los restos de la CDRL2 no hacen contacto con GPVI. Esta CDR está en contacto con restos en ambos dominios D1 y D2 de GPVI. La tirosina 50 está en contacto con asp81 y gln82 en D1, mientras que la prolina 56 está en contacto con arg166 y ser165 del dominio D2 de GPVI.

Tabla 10: Restos de la CDRL2 del anticuerpo en contacto con los restos del antígeno GPVI

50: 51 52 53 54 55 56 57

Secuencia inicial de CDRL2: Y T S T L Q P G

Mutaciones sugeridas: - T/S X X X X - X

GPVI: D81 S165

Q82: R166

La secuencia de CDRL3 se define en la SEQ ID NO: 23 y abarca ocho restos del anticuerpo. Como se muestra en la Tabla 11, cinco de los ocho o el 63% de los restos de la CDRL3 no hacen contacto con GPVI.

Tabla 11: Restos de la CDRL3 del anticuerpo en contacto con los restos del antígeno GPVI

89: 90 91 92 93 94 95 96

Secuencia inicial de CDRL3: L Q Y A N L L T

Mutaciones sugeridas: - - - - N/D/Q/E/S/T/R/K X - T/S

GPVI: L42 R67 W76

R67: P79

Un resumen de los contactos entre los restos de GPVI que interaccionan con los restos del anticuerpo reveló que ser43 tiene 8 contactos, ser44 tiene 7 contactos, arg46 tiene 4 contactos, arg67 tiene 4 contactos, arg65 tiene 3 contactos, asp81 tiene 3 contactos y arg166 tiene dos contactos. La mayoría de los restos de GPVI favorecen la cadena ligera o la cadena pesada, pero R67 y R166 hacen contacto con ambas.

E -Humanización del dominio Fv del Fab anti-GPVI

Se usó el protocolo de humanización descrito en la solicitud de patente WO 2009/032661 para humanizar el clon Fab 390-nG. Además, el análisis del complejo cristalográfico entre Fab 390-nG y la GPVI humana condujo a varias mutaciones con el objetivo de mejorar o al menos retener la afinidad del Fab 390-nG por GPVI humana dentro de la operación de humanización.

Las secuencias de VL y VH de Fab 390-nG se lanzaron frente a la versión de agosto de 2007 del Protein Data Bank (PDB). Se usó la estructura PDB 1L7I para construir un modelo de homología de la cadena ligera. Se usaron las estructuras PDB 1YY8 y 1ZA6 para construir un modelo de homología de la cadena pesada. La estructura 1ZA6 se usó específicamente para modelar la subregión CDR3, mientras que la estructura 1YY8 se usó para la parte restante de la cadena pesada. Los modelos VL y VH resultantes se usaron para construir un modelo de homología de los dominios variables que posteriormente fueron sometidos a minimización energética usando el procedimiento convencional implementado en Molecular Operating Environment (MOE). MOE es un software para el diseño de fármacos asistido por ordenador distribuido por el grupo Chemical Computing. El modelo minimizado del Fab 390-nG posteriormente se sometió a simulaciones de Molecular Dynamics para identificar los restos más flexibles que era más probable que interaccionaran con receptores de células T y fueran responsables de la activación de la respuesta inmunitaria. Las simulaciones se ejecutaron con el software AMBER distribuido por la University of California. Finalmente se identifican 57 aminoácidos como flexibles en el Fab 390-nG. El movimiento de la mayoría de los 60 aminoácidos flexibles de Fab 390-nG (excluyendo la región CDR+5A), durante los 20 ns (10 x 2 ns), se compararon después con el movimiento de los correspondientes aminoácidos flexibles de 49 modelos de homología de la línea germinal humana, para cada una de las cuales se ejecutaron las simulaciones MD 10 x 2 ns. Los 49 modelos de la línea germinal humana se construyeron combinando sistemáticamente las 7 cadenas ligeras de la línea germinal humana más comunes (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) y las 7 cadena pesadas de la línea germinal humana más comunes (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6). Las secuencias de la línea germinal humana vk1-vh6 mostraron un 84% de similitud 4D de sus aminoácidos flexibles en comparación con los

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aminoácidos flexibles de las secuencias del Fab 390-nG; las secuencias de la línea germinal vk1-vh6 se usaron, por lo tanto, para humanizar las secuencias Fab 390-nG centrándose en los aminoácidos flexibles. Para la asociación de aminoácidos por pares entre los aminoácidos de Fab 390-nG y vk1-vh6, las 2 secuencias se alinearon basándose en la superposición 3D óptima de los carbonos alfa de 2 los modelos de homología correspondientes. Los siguientes motivos de secuencias potencialmente problemáticas se consideraron en algunos casos: Asp-Pro (enlace inestable en ácido), Asn-X-Ser/Thr (glicosilación, X=cualquier aminoácido salvo Pro), Asp-Gly/Ser/Thr (formación de succinimida/iso-asp en áreas flexibles), Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys (sitios de desamidación expuestos), Met (oxidación en área expuesta). Las secuencias modificadas por ingeniería resultantes se lanzaron para la similitud de secuencia frente a la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot proporcionando confianza de que se había hecho una suposición razonable. Además, ninguna de las secuencias contiene ningún epítopo conocido de células B o T enumerado en la Immune Epitope Database and Analysis Resource (base de datos IEDB).

Se sugirieron cinco versiones para la cadena pesada (VH1, VH2, VH3, VH4, VH5 de Fab 390-nG) y tres versiones para la cadena ligera (VL1, VL2, VL3). Todas las versiones derivan de las secuencias de la construcción Fab 390-nG anti-GPVI. Las secuencias de partida para Fab 390-nG no humanizado se proporcionan en la SEQ ID NO: 33 para VH y la SEQ ID NO: 34 para VL. La versión L1 tiene 4 mutaciones. La versión L2 incluye una mutación adicional (N93H) para mejorar potencialmente la unión a GPVI humana. La versión L3 deriva de L1 e incluye una mutación adicional para mejorar potencialmente la unión a GPVI humana (N93L).

La versión H1 contiene 5 mutaciones humanizantes derivadas de la secuencia más cercana de la línea germinal de cadena pesada humana, VH6, que se encontró después del procedimiento descrito previamente. La versión H2 contiene 4 mutaciones humanizantes y deriva de H1 sin mutar el aminoácido en la posición 73 (Asn73), que se encontró que era importante para una potente afinidad observada en el complejo cristalográfico entre Fab 390-nG y la GPVI humana. La versión H3 contiene 5 mutaciones humanizantes derivadas de la secuencia VH3 de la línea germinal de cadena pesada humana. Se descubrió que VH3 estaba cercana a la cadena VH de Fab 390-nG, después del procedimiento descrito previamente, y que tenía un resto de asparagina (Asn) en la posición 73. La versión H4 deriva de H2 e incluye una mutación adicional (G31Y) para mejorar potencialmente la unión a GPVI humana. La versión H5 deriva de H2 e incluye una mutación adicional (Y103E) para mejorar potencialmente la unión a GPVI humana.

Se recomendaron ocho combinaciones de variantes de VL y VH para la generación de anticuerpos modificados por ingeniería: VL1 con VH1, VL1 con VH2, VL1 con VH3, VL2 con VH2, VL3 con VH2, VL1 con VH4, VL1 con VH5 y VL3 con VH5. Como se muestra en la Tabla 12 y en la Tabla 13, los cambios de aminoácidos se hicieron en las variantes de VL y VH modificadas por ingeniería del Fab 390-nG, usando la metodología expuesta en la sección de descripción detallada de la presente solicitud. La columna de la izquierda indica los aminoácidos originales y sus posiciones en el Fab 390-nG murino.

Además de modificar por ingeniería el dominio variable, los anticuerpos y sus fragmentos pueden modificarse adicionalmente mediante la adición de marcas o extensiones de aminoácidos. Por ejemplo, podría añadirse una secuencia de seis o más restos de histidina, en particular (His)6 o (His)7 o (His)8 en el extremo C-terminal de la cadena pesada o el extremo podría ampliarse en secuencia mediante la adición de aminoácidos tales como unidades GlyGlyGlyGlySer o (GlyGlyGlyGlySer)2. Asimismo, la región flanqueante de los anticuerpos y sus fragmentos podría cambiarse de una estructura IgG1 a otra estructura IgG como IgG4.

Tabla 12: Sumario de las mutaciones introducidas en la SEQ ID NO: 34 para la cadena ligera humanizada de la construcción 390-nG de Fab anti-GPVI

Cadena ligera (numeración secuencial como se muestra en la SEQ ID NO: 34): L1 L2 L3

LEU15: VAL VAL VAL

LYS18: ARG ARG ARG

ILE58: VAL VAL VAL

GLU79: GLN GLN GLN

ASN93: ASN HIS LEU

4 mutaciones: 5 mutaciones 5 mutaciones

Tabla 13: Sumerio de las mutaciones introducidas en la SEQ ID NO: 33 para la cadena pesada humanizada de la construcción 390-nG del Fab anti-GPVI

Cadena pesada (numeración secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 33): H1 H2 H3 H4 H5

GLN1: GLN GLN GLU GLN GLN

LYS5: GLN GLN LEU GLN GLN

GLN16: GLN GLN GLY GLN GLN

GLY31: GLY GLY GLY TYR GLY

GLY42: SER SER GLY SER SER

LYS43: ARG ARG LYS ARG ARG

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*: Note: Esta variante corresponde a una construcción no humanizada basada en el clon original 390 sin la marca His. Por lo tanto, esta construcción está exactamente en el mismo formato que las variantes humanizadas (DKTHT en el extremo C-terminal de HC) mencionadas en la misma tabla.

B.: Inhibición de la agregación plaquetaria inducida por colágeno por fragmentos recombinantes Fab anti-GPVI (plasma humano rico en plaquetas)

Para el plasma rico en plaquetas (PRP), se recogió sangre en jeringas que contenían ACD-A hasta una concentración final del 10%. Después de centrifugación a 200 x g durante 20 min a temperatura ambiente sin interrupción, se separó el sobrenadante (PRP). Se separó el plasma pobre en plaquetas (PPP) de la sangre restante por centrifugación durante 10 min a 1500 x g. El PRP se ajustó a un recuento de plaquetas de 3,0 x 108 células/ml por dilución con PPP. Se usaron fragmentos Fab a una concentración final de 0,15 -20 µg/ml y se incubaron con PRP durante 5 min a 37ºC. Después de ello, se añadió colágeno a una concentración de 1 -1,5 µg/ml y se controló la respuesta de agregación por la medición de la transmisión de luz usando un lector de placa de 96 pocillos (agregación en placa de 96 pocillos) o el agregómetro Born (agregación clásica). La respuesta de agregación se controló durante 20 min. Como se muestra en la Tabla 16, todos los fragmentos Fab investigados eran capaces de inhibir la agregación plaquetaria inducida por colágeno de un modo dependiente de la concentración.

Tabla 16: Valores de CI50 calculados (µg/ml) para la inhibición de la agregación plaquetaria inducida por colágeno de tres experimentos independientes.

Variante: Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3

Basada en el clon 390*: 1,6 6,4 1,3

VL1/VH1: 1,5 2,3 ---

VL1/VH2: 2,3 2,0 1,1

VL1/VH3: 1,7 1,5 1,5

VL1/VH4: 1,6 1,8 1,2

VL1/VH5: 1,9 2,3 1,2

VL2/VH2: 1,4 2,4 2,3

VL3/VH2: 1,9 0,9 2,1

VL3/VH4: 1,0 2,3 2,0

C.: Inhibición de la agregación plaquetaria inducida por colágeno por fragmentos Fab anti-GPVI (sangre completa humana)

Para los experimentos, se anticoaguló sangre con 20 µg/ml de hirudina y se usó inmediatamente. Antes de la medición, la sangre completa se diluyó 1:1 con NaCl. Los fragmentos Fab se usaron a una concentración final de 0,15 -20 µg/ml y se incubaron con sangre durante 5 min a 37ºC. Después de ello, se añadió colágeno a una concentración de 1 µg/ml y se controló la respuesta de agregación por la medición de la impedancia usando analizador Multiplate®. La reacción se controló durante 6 min. La respuesta de agregación se cuantificó por el área bajo la curva de agregación (AUC) como se especifica por el fabricante. Como se muestra en la Figura 6, los fragmentos Fab investigados eran capaces de inhibir la agregación plaquetaria inducida por colágeno de un modo dependiente de la concentración.

D. Inhibición de la formación de trombos bajo una corriente por fragmentos Fab anti-GPVI

Para los experimentos, se anticoaguló sangre con 20 µg/ml de hirudina y se usó inmediatamente. Se recubrieron portaobjetos capilares rectangulares de vidrio microslide con un diámetro interno de 1 x 0,1 mm (Camlab, Cambridge, RU) durante una noche con 100 µg/ml de colágeno Horm y se bloquearon con BSA libre de ácidos grasos al 0,5% inactivado por calor a temperatura ambiente durante 1 h. Las plaquetas sanguíneas se marcaron de forma fluorescente con DiOC6(3) 2 µM y se trataron con fragmentos Fab durante 5 min a 37ºC. Se realizó perfusión a través del cubreobjetos recubierto con colágeno durante 2 minutos a 2000 s-1. Después de la perfusión sanguínea, se perfundió tampón Tyrodes 1 a través de los portaobjetos microslide durante 5 min al mismo índice de corte. La formación de trombos se cuantificó por la determinación de cobertura superficial de plaquetas (trombo). Para este fin, se registraron imágenes finales de fluorescencia desde diferentes áreas en el centro del capilar. Además, se registraron imágenes de contraste de fase y DIC. El registro de imágenes y el análisis se realizaron usando el software de imágenes ImagePro plus (Mediacy, Silver Spring, EE.UU.) conectado a una cámara CCD en blanco y negro (CoolSnap cf, Ropers Scientific GmbH/Photometrics, Ottobrunn). La Figura 7A-E muestra ejemplos de inhibición de la formación de trombos bajo una corriente por fragmentos Fab anti-GPVI.

E. Efecto del fragmento Fab anti-GPVI en un modelo de ratón de trombosis arterial

Para esta investigación in vivo, se han usado ratones humanizados para el receptor GPVI. La oclusión de la arteria

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carótida se indujo de forma fotoquímica produciendo lesión del endotelio vascular en el lado interno del vaso sin afectar a la pared externa del vaso. Mediante esta técnica, se administra de forma sistémica el colorante rojo, rosa de Bengala, y se irradió el endotelio de la arteria carótida por luz láser verde produciendo una lesión "de dentro hacia afuera". El fragmento Fab anti-GPVI se administró a 10 mg/kg como un bolo intravenoso mediante el catéter de la vena yugular. Después de un periodo de incubación de 15 min, la fuente de luz láser se colocó a 12 cm desde la arteria carótida distal a la sonda de flujo y se inició la irradiación láser. Se controló de forma continua el flujo de sangre durante un periodo de observación de 90 min. Los parámetros medidos de trombosis fueron la longitud de tiempo hasta la oclusión arterial completa después de la lesión vascular (tiempo hasta la oclusión, TTO) y el área bajo la curva de flujo de sangre (AUC).

Para la evaluación de la trombosis, se usaron dos parámetros medidos: a) tiempo hasta la oclusión (TTO) y b) el área bajo la curva de flujo de sangre. El tiempo desde la provocación trombótica hasta la oclusión del vaso (TTO) fue de 78 min para el fragmento Fab anti-GPVI frente a 33 min para el grupo de control produciendo un aumento de 2,4 veces (tabla 17). El área bajo la curva de flujo estuvo 2,3 veces aumenta para el grupo tratado con el fragmento Fab anti-GPVI en comparación con el grupo de control (tabla 18). La administración en bolo intravenoso de 10 mg/kg de fragmento Fab anti-GPVI produjo un efecto antitrombótico significativo en el modelo de trombosis arteria inducida de forma fotoquímica en ratones de GPVI humanizada.

Tabla 17: Parámetro de trombosis: tiempo hasta la oclusión (min)

TTO (min)

Grupo de control: Fab 10 mg/kg iv

Media: 32,9 77,9

SEM: 1,4 5,0

CI 95% inferior de la media: 29,5 65,0

CI 95% superior de la media: 36,4 90,8

Número de animales: 6 6

Tabla 18: Parámetro de trombosis: área bajo la curva de flujo de sangre

AUC (au)

Grupo de control: Fab 10 mg/kg iv

Media: 1154 2605

SEM: 189,2 515,2

CI 95% inferior: 667,1 1280

CI 95% superior: 1640 3929

Número de animales: 6 6

F. Reducción de GPVI de la superficie de las plaquetas inducida por fragmentos Fab anti-GPVI

Para los experimentos, se anticoaguló sangre con 20 µg/ml de hirudina y se usó inmediatamente. Se usaron fragmentos Fab anti-GPVI a las concentraciones indicadas. Se incubaron muestras de sangre o de plasma rico en plaquetas (PRP) con los fragmentos Fab durante 5 min, 15 min, 1 h y 2 h, respectivamente. Después de ello, las muestras se fijaron usando paraformaldehído y se determinó la expresión del receptor GPVI. Se midió la densidad de GPVI sobre la superficie de las plaquetas usando un anticuerpo anti-GPVI diferente marcado de forma fluorescente y se determinó en un citómetro de flujo (BD LSR II). Como control, se demostró previamente que este anticuerpo es capaz de unirse a GPVI independientemente (y en presencia) del fragmento Fab investigado.

Como se muestra en la Figura 8, el Fab anti-GPVI causa una reducción de la expresión superficial de GPVI de un modo dependiente de la concentración. Experimentos adicionales muestran que 5 min de exposición al Fab anti-GPVI ya causaban una reducción significativa de GPVI a 10 µg/ml y 2 µg/ml (Figura 9). También concentraciones inferiores del Fab anti-GPVI eran capaces de disminuir la densidad superficial de GPVI, aunque con un curso de tiempo retardado.

Estos resultados apoyan el hecho de que el Fab anti-GPVI induce la reducción de GPVI en la superficie de las plaquetas.

G. Efectos in vitro y ex vivo de un Fab anti-GPVI sobre la agregación de sangre completa inducida por colágeno en mono cynomolgus (Macaca fascicularis) con evaluación concomitante de la hematología.

1. Detalles de los animales y régimen de dosis:

Se realizaron estudios en animales en una instalación acreditada por la AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) de acuerdo con las regulaciones locales de bienestar animal y registrados por las autoridades veterinarias. La especie/cepa usada en el estudio fue monos cynomolgus (Macaca fascicularis). Se usaron solamente monos hembra para el estudio. Se estudiaron dos animales por grupo de dosis. Las dosis estudiadas incluían control de vehículo de solución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,01, 0,1, 1 y 3 mg/kg de

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Claims

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