TW201802114A - 抗－ige抗體 - Google Patents

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湯瑪斯艾倫 賽斯康
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劉曉峰
詹姆士麥可 麥克唐納
布萊恩瓊 賽頓
馬它卡塔雅娜 威斯特伍
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Abstract

本發明係關於靶向IgE之經改良抗-IgE抗體及抗原結合劑及其組合物之領域，例如：用於治療由IgE引起之病症(諸如過敏反應，或某些自體免疫性反應)；以及特別是由IgE與FcɛRI受體相互作用引起的病症。詳言之，本發明係關於與奧馬珠單抗(Xolair®)之新穎突變體有關的經改良抗-IgE抗體及抗原結合劑。本發明之經改良抗-IgE抗體及抗原結合劑具有對IgE經改良的親和力及/或與IgE之Cɛ2結構域具有經改良的相互作用及/或在IgE上具有經改良之經修飾抗原決定基(例如進一步涉及IgE之Cɛ2結構域)及/或具有在例如醫藥學相關濃度下使IgE自該FcɛRI受體解離之能力。在一個態樣中係揭示用於IgE介導之病症的經改良或新穎治療，其中IgE係作為靶(例如游離IgE及/或IgE與該FcɛRI受體之複合物)。

Description

抗－IGE抗體
本發明係靶向IgE之經改良抗-IgE抗體及抗原結合劑及其組合物之領域，例如用於治療由IgE引起之病症(諸如過敏反應，或某些自體免疫性反應)，且特別是由IgE與FcɛRI受體相互作用引起的病症。詳言之，本發明係關於與奧馬珠單抗(Xolair®)之新穎突變體有關的經改良抗-IgE抗體及抗原結合劑。本發明之經改良抗-IgE抗體及抗原結合劑具有針對IgE之經改良的親和力及/或與IgE之Cɛ2結構域具有經改良的相互作用及/或在IgE上具有經改良之經修飾抗原決定基(例如進一步涉及該IgE之Cɛ2結構域)及/或具有在醫藥學相關濃度下使IgE自該FcɛRI受體解離的能力。在一個態樣中係揭示用於IgE介導之病症的經改良或新穎治療，其中IgE係作為靶(例如游離IgE及/或IgE與該FcɛRI受體之複合物)。
IgE係介導諸如哮喘、食物過敏、1型過敏反應及由眾多原因引起之常見鼻竇炎的免疫球蛋白家族成員。IgE係由B細胞分泌且在B細胞之表面上表現。B細胞合成之IgE藉由經短膜結合區連接至成熟IgE序列的跨膜結構域錨定於B細胞膜中。IgE亦經由其Fc區連接至低親和力IgE受體(FcɛRII)而結合至B細胞(以及單核細胞、嗜酸性細胞及血小板)。當哺乳動物暴露於過敏原時，B細胞以無性方式擴增，由此合成結合該過敏原之IgE。此IgE又經由B細胞釋放至循環中，在循環中其被B細胞所結合(經由FcɛRII)且經由在肥大細胞及嗜鹼性球表面上發現的所謂高親和力受體(FcɛRI)而被肥大細胞及嗜鹼性球所結合。因此，該等肥大細胞及嗜鹼性球針對過敏原敏化。接下來暴露於過敏原將交聯此等細胞上之FcɛRI且因此活化其組胺及負責過敏反應及全身性過敏反應之其他因素的釋放。 奧馬珠單抗(Xolair®)係選擇性結合至人類免疫球蛋白E(IgE)[Cɛ3結構域]的一種重組DNA源性人類化IgG1κ單株抗體。抗體之分子量係約149 kD。Xolair®係由中國倉鼠卵巢細胞懸浮液培養物在含有抗生素慶大黴素(gentamicin)之培養基中產生。Xolair®係包含在一次性使用小瓶中的用USP無菌注射用水(SWFI)復原之不含防腐劑的無菌、白色凍乾粉末(或替代地，呈於無菌注射器中之液體配製物形式)且以皮下(SC)注射液形式投與[參見EP602126 (及基於其之SPC/GB06/005)；WO93/04173；US6267958 (及基於此專利之Xolair® PTE)；WO97/04807；WO97/04801；Presta等人(1993) J. Immunol. 151:2623-2632]。 奧馬珠單抗目前適用於治療皮膚測試呈陽性或在活體外對長期氣源性致敏原具有反應性且具有吸入性皮質類固醇不充分控制之症狀的患者之中度至重度持久性哮喘(來自來自Xolair®處方信息)。 利用奧馬珠單抗之問題在於：1)其在醫藥學相關劑量下靶向游離IgE但不能靶向(或不能高效靶向)致病性物種IgE/FcɛRI複合物；2)可能由於致病性物種IgE/FcɛRI複合物不作為靶，「Xolair治療花費至少12-16週才顯示有效性」(Xolair® 150 mg溶液-Summary of Product Characteristics 2014)-或實際上確定Xolair®是否會對特定患者起作用或是否需要不同治療；3)其不應當用於具有高IgE含量之患者(例如，因為致病性物種IgE/FcɛRI複合物不作為靶且鑒於患者體內之高游離IgE含量而不會隨時間耗散)；4)「當服用奧馬珠單抗時可能發生I型局部或全身反應，包括全身性過敏反應及過敏性休克」(Xolair® 150 mg溶液-Summary of Product Characteristics 2014)；5)其對IgE之親和力並不是特別好(約2 nM)。 本發明之一目的係鑑別改善一或多個此等問題之新穎抗體。 另一目的係鑑別針對新穎抗原決定基之抗體(相較於奧馬珠單抗，具有增加之IgE Cɛ2相互作用)，及/或具有改良之親和力及/或改良的解離IgE/FcɛRI複合物之能力的基於新穎奧馬珠單抗突變體之抗體。 本發明之又一目的係鑑別用於治療與IgE有關之病症，特別是與IgE/FcɛRI複合物有關之病症，例如過敏性病症的新化合物、方法及組合物。
在本發明之一個態樣中提供一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，其接觸包含人類IgE Cɛ3結構域之殘基T373、W374、S375、R376、A377、S378、G379、P381、Q417、C418、R419、T421、P426、R427、A428以及Cɛ2結構域之殘基D278及T281的抗原決定基。在其他實施例中，該抗原決定基可以進一步包含人類IgE Cɛ3結構域之殘基K380及/或M430中的一或多個及/或人類IgE Cɛ2結構域之殘基D276、V277、L279、S280、A282及/或T298中的一或多個。 本發明係基於實例1之晶體結構的觀察結果，該晶體結構首次顯示改良之抗體(基於奧馬珠單抗)與IgE-Fc之相互作用，其中在IgE Cɛ2結構域之突變區域中觀察到顯著相互作用。此可能引起抗-IgE抗體或抗原結合劑之功能特徵相對於奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab有所改良。舉例而言，該抗-IgE抗體或抗原結合劑在小於7、3、1、0.66、0.5或0.3 μM濃度(或峰值血清濃度)下能夠將人類IgE自FcɛRI解離(例如，如實例2中描述之方法所進行)。舉例而言，該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有相對於奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab有所改良/增強的針對人類IgE(例如使用IgE-Fc)之親和力(降低KD )(例如，如藉由實例6中描述之方法所進行)；及/或相對於奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab有所改良的解離IgE/FcɛRI複合物之能力(例如，如藉由實例2中所描述之方法測定)；及/或在低於奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab之濃度(或峰值血清濃度)下將人類IgE自FcɛRI解離之性能(例如，如藉由實例2中所描述之方法測定)。改良之KD 意指比奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab之KD 要低至少5%、10%、20%、30%、40%或50%。本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑的KD 可以小於2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4或0.3 nM。改良的將人類IgE自FcɛRI解離之能力或性能意指相對於奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%或100%改良(例如，當如實例2及7中所描述量測IgE/FcɛRI複合物之%解離及/或表觀解離速率時)，及/或在奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab不能實現解離的濃度下實現解離。 為避免疑問，本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑並非奧馬珠單抗或奧馬珠單抗Fab。 在一個實施例中，藉由在IgE-Fc/抗-IgE抗體或抗原結合劑複合物之晶體結構中測定該抗-IgE抗體或抗原結合劑之4Å或5Å內的IgE殘基，以結晶學測定抗原決定基(例如，如實例1中所描述。所用IgE-Fc可以為SEQ ID NO: 108之IgE-Fc(具有額外N265Q及N371Q突變)。 在一個實施例中，該抗-IgE抗體或抗原結合劑在特定結合位點接觸該抗原決定基，其中該抗原決定基之Cɛ3結構域及Cɛ2結構域部分係在人類IgE之不同鏈上。IgE在Fc結構域中具有兩條鏈，各自具有Cɛ3結構域及Cɛ2結構域。 在一個實施例中，該抗-IgE抗體或抗原結合劑在特定結合位點接觸該抗原決定基，其中該抗原決定基之Cɛ3結構域及Cɛ2結構域部分係在人類IgE之同一條鏈上。 為避免疑問，本發明之兩種抗-IgE抗體或抗原結合劑可以結合至人類IgE，但僅需要其中之一與包含Cɛ3及Cɛ2結構域的本發明之抗原決定基相互作用(另一個可以例如僅與另一Cɛ3結構域相互作用)。 在一個實施例(視情況進一步採用本發明第一態樣之特徵)中，該抗-IgE抗體或抗原結合劑對該包含人類IgE Cɛ3結構域之殘基T373、W374、S375、R376、A377、S378、G379、P381、Q417、C418、R419、T421、P426、R427、A428及Cɛ2結構域之殘基D278及T281的抗原決定基具有特異性。視情況，該抗原決定基可以進一步包含人類IgE Cɛ3結構域之殘基K380及/或M430中的一或多個及/或人類IgE Cɛ2結構域之殘基D276、V277、L279、S280、A282及/或T298中的一或多個。為避免疑問，若該抗-IgE抗體或抗原結合劑識別且結合至包含該抗原決定基之特定人類IgE結構而非整個人類IgE，則其對該抗原決定基具有特異性。 在另一態樣(視情況進一步採用本發明第一態樣之特徵)中，提供一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，其包括含胺基酸序列為SEQ ID NO: 18之互補決定區CDR-H3的重鏈可變區，及含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29之互補決定區CDR-L1的輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區另外包含具有選自SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的構架區FR-L3，該胺基酸序列具有一、二、三、四、五、六、七個或更多個胺基酸取代以加強該抗-IgE抗體或抗原結合劑與人類IgE Cɛ2結構域之相互作用。 在另一態樣(視情況進一步採用本發明先前態樣之特徵)中，提供一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，其包括含胺基酸序列為SEQ ID NO: 18之互補決定區CDR-H3的重鏈可變區，及含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29之互補決定區CDR-L1的輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 28之構架區FR-L1，該胺基酸序列具有一、二、三、四、五、六、七個或更多個胺基酸取代以加強該抗-IgE抗體或抗原結合劑與人類IgE Cɛ2結構域之相互作用。 在CDR-H3及CDR-L1區將抗-IgE抗體或抗原結合劑錨定及定向於IgE Cɛ3區域(按照奧馬珠單抗)上時，FR-L3及/或FR-L1序列之變化允許與人類IgE Cɛ2結構域較強相互作用。該突變體相對於奧馬珠單抗或奧馬珠單抗Fab之較強相互作用可以經由親和力量測[較低KD ](例如，如藉由實例6中所描述之方法進行)及/或改良之IgE/FcɛRI複合物解離特徵(例如，如藉由實例2中所描述之方法測定)進行評估。 抗-IgE抗體或抗原結合劑與人類IgE Cɛ2結構域之較強相互作用可以藉由抗-IgE抗體或抗原結合劑之功能特徵相對於奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab之改良來表徵。舉例而言，抗-IgE抗體或抗原結合劑能夠在小於7、3、1、0.66、0.5或0.3 μM之濃度(或峰值血清濃度)下將人類IgE自FcɛRI解離(例如，如藉由實例2中所描述之方法進行)。舉例而言，該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有相對於奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab有所改良/增強的針對人類IgE(例如使用IgE-Fc)之親和力(降低KD )(例如，如藉由實例6中所描述之方法進行)；及/或相對於奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab有所改良的解離IgE/FcɛRI複合物之能力(例如，如藉由實例2中所描述之方法測定)；及/或在低於奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab之濃度(或峰值血清濃度)下將人類IgE自FcɛRI解離之性能(例如，如藉由實例2中所描述之方法測定)。改良之KD 意指比奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab之KD 要低至少5%、10%、20%、30%、40%或50%。本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑的KD 可以小於2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4或0.3 nM。改良的將人類IgE自FcɛRI解離之能力或性能意指相對於奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%或100%改良(例如，當如實例2及7中所描述量測IgE/FcɛRI複合物之%解離及/或表觀解離速率時)，及/或在奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab不能實現解離之濃度下實現解離。 為避免疑問，本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑並非奧馬珠單抗或奧馬珠單抗Fab。 在一個實施例中，參照SEQ ID NO;129，FR-L3區在S60、S63、S76、S77及/或Q79(Kabat)中之一或多個位置突變成其他天然胺基酸之一。 舉例而言，FR-L3區可以在S60位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一，例如，突變成M、R、K、N、Q或T，特別是M。 舉例而言，FR-L3區可以在S63位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一，例如突變成W或Y，特別是Y。 舉例而言，FR-L3區可以在S76位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一，特別是N。 舉例而言，FR-L3區可以在S77位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一，例如R或K，特別是R。 舉例而言，FR-L3區可以在Q79位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一，例如R或K，特別是R。 舉例而言，參照SEQ ID NO: 20，FR-L1區可以在G16及/或R18(Kabat)上突變成其他天然胺基酸之一。 在某些實施例中，該抗-IgE抗體或抗原結合劑之突變之FR-L3區的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 43-49、60-83、131或138。 在另一實施例中，參照SEQ ID NO:129，FR-L3區進一步在S67位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一以改善其對人類IgE之親和力(降低KD )。在此情況下，該突變可以加強抗-IgE抗體或抗原結合劑與IgE Cɛ3結構域之相互作用。舉例而言，FR-L3區可以在S67位(Kabat)突變成M(特定言之)、E或D。在某些實施例中該抗-IgE抗體或抗原結合劑之突變之FR-L3區的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 53-59、84-107、131或138。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 31之互補決定區CDR-L2的輕鏈可變區。 在一個實施例中，CDR-L2區域在S52位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一以改善其對人類IgE之親和力(降低KD )。在此情況下，該突變可以加強抗-IgE抗體或抗原結合劑與IgE Cɛ3結構域之相互作用。舉例而言，參照SEQ ID NO:129，CDR-L2區域可以在S52位(Kabat)突變成D(特定言之)、E、Q或R。在某些實施例中，突變之CDR-L2區域的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 51。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 14之互補決定區CDR-H1的重鏈可變區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 16之互補決定區CDR-H2的重鏈可變區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 33之互補決定區CDR-L3的輕鏈可變區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 13之構架區FR-H1的重鏈可變區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 15之構架區FR-H2的重鏈可變區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 17之構架區FR-H3的重鏈可變區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 19之構架區FR-H4的重鏈可變區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 30之構架區FR-L2的輕鏈可變區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 34之構架區FR-L4的輕鏈可變區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有輕鏈可變區VL，其具有選自SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 132或SEQ ID NO: 134或SEQ ID NO: 141或SEQ ID NO: 144，或SEQ ID NO: 145或SEQ ID NO: 158或SEQ ID NO: 159的胺基酸序列。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有含胺基酸序列SEQ ID NO: 1之重鏈可變區VH。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可進一步包含輕鏈恆定區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有輕鏈恆定區，即κ恆定區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有含突變L154P(Kabat)之輕鏈恆定區。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有輕鏈可變區及輕鏈恆定區VL-CL，其具有選自SEQ ID NO: 39，或SEQ ID NO: 41，或SEQ ID NO: 117，或SEQ ID NO: 119，或SEQ ID NO: 125，或SEQ ID NO: 127，或SEQ ID NO: 136，或SEQ ID NO: 143的胺基酸序列，視情況包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 160之信號序列。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可進一步包含重鏈恆定區CH1。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有重鏈可變區及重鏈恆定區VH-CH1，其具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可進一步包含重鏈Fc區Fc。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有來自人類IgG1或人類IgG4之Fc。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有重鏈可變區、重鏈恆定區及重鏈Fc區VH-CH1-Fc，其具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9。 在本發明之另一態樣中，提供一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，其包括含胺基酸序列為SEQ ID NO: 18之互補決定區CDR-H3的重鏈可變區，及含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29之互補決定區CDR-L1的輕鏈可變區，其中： a. 該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32之構架區FR-L3，其中參照SEQ ID NO:129，該FR-L3區在S67位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一以改善該抗-IgE抗體或抗原結合劑對人類IgE之親和力(降低KD )；及/或 b.該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 31之互補決定區CDR-L2，其中參照SEQ ID NO:129，該CDR-L2區在S52位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一以改善該抗-IgE抗體或抗原結合劑對人類IgE之親和力(降低KD )。 本發明人在此發現，此等突變中之任一個或兩個可以意外地相對於奧馬珠單抗或奧馬珠單抗Fab改善抗-IgE抗體或抗原結合劑對人類IgE(例如使用IgE-Fc)之親和力(改善或降低KD )(例如，如藉由實例6中所描述之方法進行)。詳言之，該親和力之改良係相對於奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab而言。該等突變可以改善與IgE Cɛ3結構域之相互作用。改善或降低KD 意指比奧馬珠單抗及/或奧馬珠單抗Fab之KD 要低至少5%、10%、20%、30%、40%或50%。本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑的KD 可以小於2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4或0.3 nM。 舉例而言，參照SEQ ID NO:129，FR-L3區可以在S67位(Kabat)突變成M(特定言之)、E或D。 在某些實施例中，抗-IgE抗體或抗原結合劑之突變之FR-L3區的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 52-59、84-107、131或138。 舉例而言，參照SEQ ID NO:129，CDR-L2區可以在S52位(Kabat)突變成D(特定言之)、E、Q或R。 在某些實施例中，抗-IgE抗體或抗原結合劑之突變之CDR-L2區的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 50(特定言之)或SEQ ID NO: 51。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 14之互補決定區CDR-H1的重鏈可變區。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 16之互補決定區CDR-H2的重鏈可變區。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 33之互補決定區CDR-L3的輕鏈可變區。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 13之構架區FR-H1的重鏈可變區。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 15之構架區FR-H2的重鏈可變區。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 17之構架區FR-H3的重鏈可變區。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 19之構架區FR-H4的重鏈可變區。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 30之構架區FR-L2的輕鏈可變區。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 34之構架區FR-L4的輕鏈可變區。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有輕鏈可變區VL，其包含連續FR-L1、CDR-L1、FR-L2、CDR-L2、FR-L3、CDR-L3及FR-L4區，且具有胺基酸序列SEQ ID NO: 20，不過該CDR-L2區具有選自SEQ ID NO: 50(特定言之)或SEQ ID NO: 51之胺基酸序列。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有輕鏈可變區VL，其包含連續FR-L1、CDR-L1、FR-L2、CDR-L2、FR-L3、CDR-L3及FR-L4區，且具有胺基酸序列SEQ ID NO: 20，不過該FR-L3區具有胺基酸序列SEQ ID NO: 52。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有輕鏈可變區VL，其包含連續FR-L1、CDR-L1、FR-L2、CDR-L2、FR-L3、CDR-L3及FR-L4區，且具有胺基酸序列SEQ ID NO: 20，不過該CDR-L2區具有選自SEQ ID NO: 50(特定言之)或SEQ ID NO: 51之胺基酸序列，且該FR-L3區具有選自SEQ ID NO: 52、131或138之胺基酸序列。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有含胺基酸序列SEQ ID NO: 1之重鏈可變區VH。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可進一步包含輕鏈恆定區。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有輕鏈恆定區，即κ恆定區。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有輕鏈可變區及輕鏈恆定區VL-CL，其具有胺基酸序列SEQ ID NO: 24，不過該CDR-L2區具有選自SEQ ID NO: 50(特定言之)或SEQ ID NO: 51之胺基酸序列。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有輕鏈可變區及輕鏈恆定區VL-CL，其具有胺基酸序列SEQ ID NO: 24，不過該FR-L3區具有胺基酸序列SEQ ID NO: 52。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有輕鏈可變區及輕鏈恆定區VL-CL，其具有胺基酸序列SEQ ID NO: 24，不過該CDR-L2區具有選自SEQ ID NO: 50(特定言之)或SEQ ID NO: 51之胺基酸序列，且該FR-L3區具有選自SEQ ID NO: 52、131或138之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明提供一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中： a. 該重鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 14之CDR-H1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 16之CDR-H2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 18之CDR-H3，且該輕鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29之CDR-L1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 50之CDR-L2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 33之CDR-L3及胺基酸序列為SEQ ID NO: 131或138之構架區FW-L3；或 b. 重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO. 1且該輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO: 132或139之胺基酸序列。 在一個實施例中，該抗-IgE抗體或抗原結合劑可進一步包含輕鏈恆定區，其中輕鏈可變區及輕鏈恆定區VL-CL具有選自SEQ ID NO: 136或143之胺基酸序列，視情況包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 160之信號序列。 在如本文中所描述的所有實施例中，該抗-IgE抗體或抗原結合劑可進一步包含重鏈恆定區CH1。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有重鏈可變區及重鏈恆定區VH-CH1，其具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可進一步包含重鏈Fc區Fc。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有來自人類IgG1或人類IgG4之Fc。 該抗-IgE抗體或抗原結合劑可以具有重鏈可變區、重鏈恆定區及重鏈Fc區VH-CH1-Fc，其具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9。 本發明之所有態樣的抗-IgE抗體或抗原結合劑可選自由以下組成之群：具有全長重鏈及輕鏈之完整抗體分子，或其片段。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以選自由以下組成之群：Fab片段、修飾之Fab'片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv、scFv、scab、雙功能抗體、雙特異性抗體、三鏈抗體、FabFv、Fab-Fv-Fv、三功能抗體或(Fab-Fv)2 -Fc。不受理論束縛，若本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑僅具有一個而非多個抗-IgE抗原結合位點，則其可以具有較低的與其相關之全身性過敏反應。 在一個實施例中，該抗-IgE抗體係直接或經由連接子連接至scFv的Fab片段，該scFv結合至血清載體蛋白，諸如人類血清白蛋白。 在一個實施例中，該scFv可以包含較佳經由具有SEQ ID NO: 151之連接子連接的重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 152之CDR-H1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 153之CDR-H2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 154之CDR-H3，且該輕鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 155之CDR-L1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 156之CDR-L2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 157之CDR-L3。 在一個實施例中，該scFv具有胺基酸序列SEQ ID NO: 150。在一個較佳實施例中，Fab片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中： a. 該重鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 14之CDR-H1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 16之CDR-H2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 18之CDR-H3，且該輕鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29之CDR-L1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 50之CDR-L2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 33之CDR-L3及胺基酸序列為SEQ ID NO: 131或138之構架區FW-L3；或 b. 重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO. 1且輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO: 132或139之胺基酸序列。 在另一個實施例中，Fab片段另外包含重鏈恆定區及輕鏈恆定區，其中重鏈可變區及重鏈恆定區VL-CH1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5並且其中輕鏈可變區及輕鏈恆定區VL-CL具有選自SEQ ID NO: 136或143之胺基酸序列，視情況包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 160之信號序列。 在另一實施例中，scFv經由具有胺基酸序列SEQ ID NO: 149之連接子連接至Fab片段之CH1。 在一個實施例中，重鏈可變區及重鏈恆定區、連接子及scFv具有胺基酸序列SEQ ID NO: 147，視情況包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 160之信號序列。 在另一實施例中，連接至具有SEQ ID NO: 147之scFv的Fab片段之重鏈與具有SEQ ID NO: 136或143之輕鏈可變區及恆定區配對。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以連接有效應子或報告子分子。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以經糖基化(例如在Fc結構域內)及/或可以偶聯至選自澱粉、白蛋白及聚乙二醇(PEG)之聚合物。在一個實施例中，偶聯之PEG的分子量可以在5至50 kDa範圍內。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑可以經人類化。 本發明之另一態樣係關於一種分離之DNA序列，其編碼本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑之重鏈及/或輕鏈。進一步提供包含本發明之一或多個DNA序列之選殖或表現載體。舉例而言選殖或表現載體可以包含一或多個選自以下之DNA序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40或SEQ ID NO: 42，或SEQ ID NO: 133，或SEQ ID NO: 135，或SEQ ID NO: 137，或SEQ ID NO: 140，或SEQ ID NO: 142，或SEQ ID NO: 144，且視情況可進一步包含一或多個選自以下之DNA序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12，或SEQ ID NO: 148。 本發明之另一態樣係包含一或多個本發明之選殖或表現載體的宿主細胞。本發明之宿主細胞可視情況進一步包含一或多個選殖或表現載體，該一或多個選殖或表現載體包含一或多個選自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 148之DNA序列。 亦提供一種用於製造本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑的方法，其包含培養本發明之宿主細胞及分離該抗-IgE抗體或抗原結合劑。 另一態樣係關於一種醫藥組合物，其包含本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑，以及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑中之一或多種。適合地，本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑的存在劑量係每毫升稀釋劑50至200，較佳約或剛好150 mg。在某些實施例中，賦形劑包含L-精胺酸、L-組胺酸中之一種或兩種。該賦形劑可以獨立地或組合地包含聚山梨醇酯20。稀釋劑可以為水或水性等滲溶液。 本發明之醫藥組合物可以呈在皮下投與之前復原的粉末形式裝載於無菌小瓶內，或裝載於無菌注射器內供即時皮下投與。 本發明之醫藥組合物可以含有75至600 mg，例如約或剛好100或150 mg之抗-IgE抗體或抗原結合劑總劑量。 本發明之醫藥組合物可以另外包含與抗-IgE抗體或抗原結合劑一起包含或與抗-IgE抗體或抗原結合劑分開共投與的其他活性成分。舉例而言，本發明之醫藥組合物可以用於基於過敏之特異性免疫療法情形中，其中本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑係與過敏原分開共投與(但可以共包裝)。因此，本發明之醫藥組合物可以用於基於過敏之特異性免疫療法中，其中患者在接受治療性過敏原之前7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天(或同一天)接受本發明之醫藥組合物。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或組合物可以用作藥物。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或組合物可以用於治療或預防疾病。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或組合物可以用於治療或預防與人類IgE及FcɛRI之複合物有關的病症。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或組合物可以經由解離人類IgE及FcɛRI之複合物及該抗-IgE抗體或抗原結合劑結合人類IgE而用於治療或預防病症。 本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或組合物可以用於治療或預防以下一或多種：過敏；過敏性哮喘；重度哮喘；中度哮喘；慢性自發性風疹；慢性特發性風疹；常年性過敏性鼻炎；季節性過敏性鼻炎；急性哮喘惡化；急性支氣管痙攣；哮喘持續狀態；高IgE症候群；過敏性支氣管肺麯黴病；全身過敏性反應之預防；食物過敏；異位性皮炎；過敏性鼻炎；蜂毒過敏；特發性全身性過敏反應；花生過敏；乳膠過敏；炎性皮膚病；風疹(日光、冷誘發、局部熱誘發及/或長期壓力誘發)；皮膚肥大細胞增多症；全身肥大細胞增多症；嗜伊紅血球相關胃腸病症；大皰性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻息肉；特發性血管性水腫；或非過敏性哮喘。 進一步提供一種用於治療或預防人類個體之疾病的方法，該方法包含向該個體投與有效量的本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑或組合物。該方法可以用於治療或預防與人類IgE及FcɛRI之複合物有關的病症。本發明之方法可以經由解離人類IgE及FcɛRI之複合物及本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑結合人類IgE來治療或預防疾病。 本發明之方法可以用於治療或預防以下一或多種：過敏；過敏性哮喘；重度哮喘；中度哮喘；慢性自發性風疹；慢性特發性風疹；常年性過敏性鼻炎；季節性過敏性鼻炎；急性哮喘惡化；急性支氣管痙攣；哮喘持續狀態；高IgE症候群；過敏性支氣管肺麯黴病；全身過敏性反應之預防；食物過敏；異位性皮炎；過敏性鼻炎；蜂毒過敏；特發性全身性過敏反應；花生過敏；乳膠過敏；炎性皮膚病；風疹(日光、冷誘發、局部熱誘發及/或長期壓力誘發)；皮膚肥大細胞增多症；全身肥大細胞增多症；嗜伊紅血球相關胃腸病症；大皰性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻息肉；特發性血管性水腫；或非過敏性哮喘。 在本發明中，已闡明針對第一多肽之抗體或抗原結合劑能夠結合至游離及經結合第一多肽兩種，使此類第一多肽之構形穩定，該多肽藉助於結合至第二多肽(諸如受體)來引起其生理反應。該穩定之構形對第二多肽之結合親和力比在無該抗體或抗原結合劑存在下要弱，因此，使第一多肽更快自第二多肽解離。 就此而言，本發明提供另一態樣，該態樣係關於一種能夠結合游離及FcɛRI結合之IgE且使IgE構形穩定的抗體或抗原結合劑。當該IgE係呈此類構形時，其對FcɛRI之結合親和力比在無該抗體或抗原結合劑存在下之情形要弱並且其中FcɛRI結合之人類IgE自FcɛRI解離。視情況，當IgE係呈此類構形時，IgE對奧馬珠單抗或其片段之結合親和力低於本發明之抗體或抗原結合劑。舉例而言，該抗體或抗原結合劑係如本文中所描述之抗體。 在另一態樣中，本發明係關於一種用於選擇如本文中所描述之此類抗體或抗原結合劑的方法。該方法包含： a. 使測試抗體或抗原結合劑與包含結合至人類FcɛRI之人類IgE的樣品接觸； b. 量測該測試抗體或抗原結合劑將人類IgE自人類FcɛRI解離的解離常數； c. 將如步驟b)中量測的解離常數與奧馬珠單抗或其片段將該人類IgE自人類FcɛRI解離之解離常數相比較； d. 若抗體或抗原結合劑將該IgE自FcɛRI解離比奧馬珠單抗或其片段要快，則選擇該抗體或抗原結合劑。 或者，根據本發明的用於選擇抗體或抗原結合劑之方法包含： a. 使測試抗體或抗原結合劑與包含結合至人類FcɛRI之人類IgE的樣品接觸； b. 量測該測試抗體或抗原結合劑對來自人類FcɛRI之人類IgE的結合親和力； c.將如步驟b)中量測之結合親和力與人類IgE對FcɛRI的結合親和力相比較； d. 若抗體或抗原結合劑對IgE之結合親和力高於IgE對FcɛRI之結合親和力，則選擇該抗體或抗原結合劑。 視情況，所選抗體或抗原結合劑使仍結合至FcɛRI之IgE呈現這樣一種構形，其中該穩定構形之IgE可以比在奧馬珠單抗或其片段存在下結合至FcɛRI之IgE更快自FcɛRI解離；及/或對該抗體或抗原結合劑之結合親和力可以高於對FcɛRI之結合親和力。 在最後一個態樣中，本發明係關於特定抗體或抗原結合劑，其包含： a. 含SEQ ID NO: 1之重鏈可變區及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含： i. SEQ ID NO: 109；或 ii. SEQ ID NO: 113；或 iii. SEQ ID NO: 121；或 iv. SEQ ID NO: 132；或 v. SEQ ID NO: 139；或 b. SEQ ID NO: 5，及 i. SEQ ID NO: 24，其中S77及S79經Q置換； ii. SEQ ID NO: 117或 iii. SEQ ID NO: 125；或 iv. SEQ ID NO:136；或 v. SEQ ID NO: 143。 在本發明此最後一個態樣的一個實施例中，該抗-IgE抗體或抗原結合劑接觸參照SEQ ID NO:108包含人類IgE Cε3結構域之殘基T373、W374、S375、R376、A377、S378、G379、P381、Q417、C418、R419、T421、P426、R427、A428及Cε2結構域之殘基D278及T281的抗原決定基，或接觸該抗原決定基且對其具有特異性。
本文中之抗體胺基酸編號將係根據抗體之連續胺基酸序列(例如，奧馬珠單抗包含SEQ ID NO: 1之VH序列及SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO:129之VL序列)，即所謂的「pdb」編號，或者可以利用常用的Kabat編號方案。在描述常見VH或VL序列之免疫球蛋白部分(CDR-互補決定區，或FR-構架區)時，其係按標準次序連接(VH=FR-H1.CDR-H1.FR-H2.CDR-H2.FR-H3.CDR-H3.FR-H4；VL=FR-L1.CDR-L1.FR-L2.CDR-L2.FR-L3.CDR-L3.FR-L4)。對於奧馬珠單抗，VH(SEQ ID NO: 1)各部分之「pdb」編號係FR-H1(胺基酸1-25)、CDR-H1(26-36)、FR-H2(37-50)、CDR-H2(51-66)、FR-H3(67-98)、CDR-H3(99-110)、FR-H4(111-121)；而Kabat編號係：FR-H1(胺基酸1-25)、CDR-H1(26-35)、FR-H2(36-49)、CDR-H2(50-65)、FR-H3(66-94)、CDR-H3(95-102)、FR-H4(103-113)。對於奧馬珠單抗，VL(SEQ ID NO: 20)各部分之「pdb」編號係：FR-L1(胺基酸1-23)、CDR-L1(24-38)、FR-L2(39-53)、CDR-L2(54-60)、FR-L3(61-92)、CDR-L3(93-101)、FR-L4(102-111)；而Kabat編號係：FR-L1(胺基酸1-23)、CDR-L1(24-34)、FR-L2(35-49)、CDR-L2(50-56)、FR-L3(57-88)、CDR-L3(89-97)、FR-L4(98-107)。 IgE抗體編號係如Dorrington及Bennich(1978)Immunol. Rev. 41:3-25報導。因此，本發明中使用之IgE-Fc多肽(參見SEQ ID NO: 108)係自V224至K547(包括C225A突變)。如圖16中所示，所遵循之編號係根據Dorrington及Bennich (1978) Immunol. Rev. 41:3-25其中在253位之後的L(Leu，白胺酸)係編號為L253a且其餘殘基係自L253a連續編號為C254等。在結晶學實驗中，亦將以下突變插入IgE-Fc中以簡化糖基化模式：N265Q及N371Q。一般公認IgE-Fc之Cɛ2區佔據序列S226至D330。本文中提及之IgE可以參照人類IgE(且反之亦然)，且在本文所描述之分析及方法的上下文中，亦可構成對IgE-Fc之參考。全長人類IgE抗體之Fab臂序列不包括在本說明書中，因為其不存在於晶體結構中。 本文中提及之「奧馬珠單抗」係參照商業上出售之Xolair®產品；或包括含VH胺基酸序列SEQ ID NO: 1之重鏈及含VL胺基酸序列SEQ ID NO: 20之輕鏈的IgG全長抗體；或包括含VH-CH1胺基酸序列SEQ ID NO: 5之重鏈及含VL-CL胺基酸序列SEQ ID NO: 24之輕鏈的IgG全長抗體；或包括含VH-CH1-Fc胺基酸序列SEQ ID NO: 9之重鏈及含VL-CL胺基酸序列SEQ ID NO: 24之輕鏈的IgG全長抗體。提及之「奧馬珠單抗Fab」係參照包括含VH胺基酸序列SEQ ID NO: 1之重鏈及含VL胺基酸序列SEQ ID NO: 20之輕鏈的Fab片段；或(特別是)包括含VH-CH1胺基酸序列SEQ ID NO: 5之重鏈及含VL-CL胺基酸序列SEQ ID NO: 24之輕鏈的Fab片段。 通用定義 除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。儘管與本文所述之方法及材料類似或等效的方法及材料均可以用於實踐或測試本發明，但本文描述適合的方法及材料。所有出版物、專利申請案、專利及本文提及之其他參考文獻均以全文引用之方式併入本文中。此外，材料、方法以及實例僅為說明性的且並不欲作限制。 除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在本申請案中，除非另外陳述，否則使用「或」意謂「及/或」。此外，使用術語「包括(including)」以及其他形式，諸如「包括(includes)」及「包括(included)」，不具限制性。此外，除非另外具體陳述，否則諸如「元件」或「組件」之類術語涵蓋包含一個單元之元件及組件以及包含一個以上子單元之元件及組件兩者。 一般而言，本文所描述的結合細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質與核酸化學及雜交使用的命名法及其技術係此項技術中熟知且常用的命名法及技術。除非另外指明，否則本發明之方法及技術一般係根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及論述之各種一般及更特定參考文獻中所描述來進行。酶反應及純化技術可以根據製造商之說明書、如通常在此項技術中所實現或如本文所描述來進行。本文中所描述的與分析化學、合成有機化學及藥物與醫藥化學結合使用的命名法以及其實驗室程序及技術係在此項技術中熟知且常用者。使用化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送以及患者治療之標準技術。 為更容易地理解本發明，下文定義所選術語。 如本文所使用，術語「宿主」通常係指人類個體，且特別是在使用人類或人類化構架作為接受體結構之情況下。在治療另一宿主之情況下，熟習此項技術者應瞭解，抗體或抗原結合劑可能需要針對該宿主加以調整以避免排斥反應或增加相容性。已知針對一系列宿主所需之遞送及功能，如何在本發明中使用CDR且將其工程改造至適當構架或肽序列中。其他宿主可以包括其他哺乳動物或脊椎動物物種。因此，術語「宿主」可以替代地指諸如小鼠、猴、狗、豬、兔、家養豬(豬及肉豬)、反芻動物、馬類動物、家禽、貓科動物、鼠類動物、牛類動物、犬科動物及其類似動物之動物，其中必要時，對於抗體或抗原結合劑進行適當設計以與宿主相容。 如本文所使用，術語「多肽」係指胺基酸構成之任何聚合物鏈。術語「肽」及「蛋白質」可以與術語多肽互換使用且亦指胺基酸構成之聚合物鏈。術語「多肽」涵蓋天然或人工蛋白質、蛋白質片段，及蛋白質序列之多肽類似物。多肽可以為單體或聚合物。 如本文所使用，術語「回收」係指藉由例如使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術進行分離，使得諸如多肽之化學物種基本上不含天然相關聯之組分的工序。 如本文所使用，在提及抗體、蛋白質或肽與第二化學物種之相互作用時，術語「特異性結合(specific binding)」或「特異性地結合(specifically binding)」意謂相互作用取決於化學物種上特定結構(例如，如下所定義之「抗原決定子」或「抗原決定基」)之存在；例如，抗體識別且結合至特定蛋白質結構而非一般蛋白質。若抗體對抗原決定基「A」具有特異性，則在含有經標記「A」及該抗體之反應中，含抗原決定基A (或未經標記之游離A)之分子的存在將減少結合至該抗體之經標記A的量。在本文中提到本發明之抗原決定基時，本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑對該抗原決定基具有特異性。 如本文所使用，術語「抗體」廣泛地指由四條多肽鏈，即兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈構成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子之抗原決定基結合特徵之至少某一部分以使其特異性結合至IgE的任何功能片段、突變體、變異體或衍生物。此類突變體、變異體或衍生物抗體形式係此項技術中已知的且描述於下。其非限制性實施例論述於下。若抗體能夠與一個分子(或抗原決定基)特異性反應，由此使該分子(或抗原決定基)結合至該抗體，則稱該抗體「能夠結合」該分子(或抗原決定基)。 如本文所使用，「單株抗體」意欲指相比於含有不同抗體之混合物的「多株」抗體製劑，共有共同重鏈及共同輕鏈胺基酸序列之抗體分子製劑，或其至少保留Ig分子之輕鏈抗原決定基結合特徵的任何功能片段、突變體、變異體或衍生物。單株抗體可以藉由若干已知技術產生，該等技術如噬菌體、細菌、酵母或核糖體展示，以及經典方法，例如融合瘤來源之抗體(例如藉由融合瘤技術，諸如標準Kohler及Milstein融合瘤方法((1975) Nature 256:495-497)製備之融合瘤所分泌的抗體)。 在全長抗體中，每一重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區(CH)構成。重鏈恆定區由四個結構域，即CH1、鉸鏈、CH2及CH3 (重鏈γ、α及δ)或CH1、CH2、CH3及CH4 (重鏈μ及ε)構成。每一輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區(CL)構成。輕鏈恆定區由一個結構域CL構成。VH及VL區可以進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，間雜有稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL係由自胺基末端至羧基末端按以下順序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以屬於任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。 如本文所使用，術語「抗原結合劑」係指保持特異性結合至抗原(例如IgE)之能力的一或多個抗體片段或部分，或保持所需的與抗原之結合能力的抗體片段之合成修飾。經顯示，抗體之抗原結合功能可以由全長抗體之片段或某些部分或其修飾執行。實施例包括可以特異性結合至兩種或兩種以上不同抗原或者抗原之若干抗原決定基或不連續抗原決定基區域的雙特異性、雙重特異性及多特異性形式。抗原結合劑之非限制性實例包括(i) Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，一種包含在鉸鏈區藉由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv) 由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人, (1989) Nature 341:544-546；Winter等人, PCT公開案WO 90/05144 A1，以引用之方式併入本文中)，其包含單一可變結構域；(vi)分離之互補決定區(CDR)，(vii)抗體片段(諸如呈免疫球蛋白性質之抗體片段)之融合物，例如雙功能抗體、scab、雙特異性抗體、三鏈抗體、Fab-Fv、Fab-Fv-Fv、三功能抗體、(Fab-Fv)2-Fc；及(viii)移植至非免疫球蛋白構架，如纖維結合蛋白或白胺酸拉鏈上的抗體部分，諸如CDR或抗體環(參見Binz等人(2005) Nat. Biotech. 23:1257-1268，併入本文中)。另外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH係由獨立基因編碼，但其可以使用重組方法或其他方法，藉由能夠將其製備為單一蛋白質鏈之合成或天然存在之連接子接合，在該蛋白質鏈中，VL與VH區配對形成單價分子稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等人(1988) Science 242:423-426；及Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。預期此類單鏈抗體亦涵蓋於術語抗原結合劑內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。雙功能抗體係二價雙特異性抗體，其中VH及VL結構域係在單一多肽鏈上表現，但使用太短而不允許同一鏈上之兩個結構域之間配對的連接子，由此迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如，Holliger, P.等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J.等人, (1994) Structure 2:1121-1123)。此類抗體結合部分係此項技術中已知的(Kontermann及Dubel編, Antibody Engineering (2001) Springer- Verlag. New York. 第790頁(ISBN 3-540-41354-5)。 如本文所使用，術語「抗體構建體」係指包含連接至連接子多肽或免疫球蛋白恆定結構域的一或多個本發明之抗原結合部分的多肽。連接子多肽包含兩個或兩個以上由肽鍵接合之胺基酸殘基，且用於連接一或多個抗原結合部分。此類連接子多肽係此項技術中熟知的(參見例如，Holliger, P.等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J.等人(1994) Structure 2:1121-1123)。免疫球蛋白恆定結構域係指重鏈或輕鏈恆定結構域，例如人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM恆定結構域。重鏈及輕鏈恆定結構域胺基酸序列係此項技術中已知的。Ig重鏈γ1恆定區及Ig輕鏈λ及κ鏈之非限制性實例分別提供於表8及中6。 又另外，抗體或其抗原結合部分可以作為藉由抗體或抗體部分與一或多種其他蛋白質或肽共價或非共價締合而形成的較大免疫黏附分子之一部分。此類免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區製備四聚scFv分子(Kipriyanov, S. M.等人(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C末端聚組胺酸標籤製備生物素化二價scFv分子(Kipriyanov, S. M.等人(1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)。抗體部分，諸如Fab和F(ab')2片段可以使用習知技術由完整抗體製備，諸如對完整抗體分別進行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化來製備。此外，抗體、抗體部分及免疫黏附分子可以使用如本文中所述之標準重組DNA技術獲得。 如本文所使用，「分離之抗體」意欲指基本上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合IgE的分離之抗體基本上不含特異性結合除IgE以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合例如人類IgE的分離之抗體可以與其他抗原，諸如來自其他物種之IgE分子具有交叉反應性。另外，分離之抗體可以大體上不含其他細胞材料及/或化學物質。 術語「CDR移植抗體」係指包含來自一種物種之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中VH及/或VL之一或多個CDR區之序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有人類重鏈及輕鏈可變區但其中一或多個人類CDR(例如CDR3)已經鼠類CDR序列置換的抗體。 術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在本文中可互換使用。此項技術中認可的此等術語係指抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中比其他胺基酸殘基更易變(亦即，高變)之胺基酸殘基的編號系統(Kabat等人(1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391；及Kabat, E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication NO: 91-3242)。對於重鏈可變區，根據Kabat編號系統，高變區在胺基酸位置31-35 (CDR-H1)、殘基50-65 (CDR-H2)及殘基95-102 (CDR-H3)範圍內。然而，根據Chothia (Chothia等人(1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))，相當於CDR-H1之環自殘基26延伸至殘基32。因此，除非另外指明，否則如Kabat編號系統與Chothia拓樸環定義之組合所描述，如本文所採用之「CDR-H1」意欲指殘基26至35。對於輕鏈可變區，高變區範圍對於CDRL1係自胺基酸位置24至34，對於CDRL2係自胺基酸位置50至56，且對於CDRL3係自胺基酸位置89至97。 如本文所使用，術語「接受體」及「接受體抗體」係指提供或編碼一或多個構架區之至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%之胺基酸序列的抗體或核酸序列。在一些實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼恆定區之抗體胺基酸或核酸序列。在另一實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼構架區及恆定區中之一或多者的抗體胺基酸或核酸序列。在一特定實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼一或多個構架區之至少80%、較佳至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%之胺基酸序列的人類抗體胺基酸或核酸序列。根據此實施例，接受體可以含有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少10個不存在於人類抗體之一或多個特定位置的胺基酸殘基。接受體構架區及/或一或多個接受體恆定區可以例如源自或獲自生殖系抗體基因、成熟抗體基因、功能性抗體(例如此項技術中熟知之抗體、處於研發中之抗體或市售抗體)。 如本文所使用，術語「CDR」係指在抗體可變序列內之互補決定區。重鏈及輕鏈之可變區中分別存在三個CDR，對於重鏈CDR，其稱為CDRH1、CDRH2及CDRH3，且對於輕鏈CDR，其稱為CDRL1、CDRL2及CDRL3。如本文所使用，術語「CDR組」係指存在於能夠結合抗原之單一可變區中之一組三個CDR。此等CDR之準確邊界已根據不同系統不同地定義。藉由Kabat (Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)及(1991))描述之系統不僅提供適用於抗體之任何可變區的明確殘基編號系統，而且亦提供界定該三個CDR之精確殘基邊界。此等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及同事(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；及Chothia等人, Nature 342:877-883 (1989))發現，Kabat CDR內之某些子部分儘管在胺基酸序列層面上具有極大多樣性，但呈現幾乎一致的肽主鏈構形。此等子部分稱為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別表示輕鏈區及重鏈區。此等區可以稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR的其他邊界已由Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995))及MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996))描述。又其他CDR邊界定義可以不嚴格遵循以上系統之一，但仍然將與Kabat CDR重疊，不過其可以根據特定殘基或殘基組或者甚至全部CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗結果而縮短或延長。本文中使用之方法可以利用根據此等系統中之任一個所界定之CDR，不過較佳實施例使用Kabat或Chothia或其組合界定之CDR。 如本文所使用，術語「經典」殘基係指如Chothia等人(J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987)；Chothia等人, J. Mol. Biol. 227:799 (1992)，均以引用的方式併入本文中)所定義，CDR或構架中界定特定的經典CDR結構之殘基。根據Chothia等人，許多抗體之CDR之重要部分儘管在胺基酸序列層面上具有極大多樣性，但具有幾乎相同的肽主鏈構形。各經典結構主要為形成環之一段相鄰胺基酸殘基指定一組肽主鏈扭轉角。 如本文所使用，術語「供體」及「供體抗體」係指提供一或多個CDR之抗體。在一個較佳實施例中，供體抗體係來自與獲得或得到構架區之抗體不同之物種的抗體。在人類化抗體之情況下，術語「供體抗體」係指提供一或多個CDR之非人類抗體。 如本文所使用，術語「構架」或「構架序列」係指可變區減去CDR之剩餘序列。因為CDR序列之精確界定可藉由不同系統確定，所以構架序列之含義相對應地需要不同解釋。六個CDR (輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，及重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架區分成各鏈上之四個子區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於FR3與FR4之間。在不將特定子區指定為FR1、FR2、FR3或FR4的情況下，如由其他方式提及之構架區代表單一、天然存在之免疫球蛋白鏈之可變區內的組合FR。如本文所使用，FR表示四個子區之一，且FRs表示構成構架區之四個子區中的兩個或更多個。 如本文所使用，術語「生殖系抗體基因」或「基因片段」係指由未經歷導致基因重排及突變以表現特定免疫球蛋白之成熟過程的非淋巴細胞編碼的免疫球蛋白序列。參見例如，Shapiro等人, Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002)；Marchalonis等人, Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)。本發明各種實施例所提供的優點之一利用以下認識：生殖系抗體基因比成熟抗體基因更可能保持物種中各個體特有的基本胺基酸序列結構，因此當在治療上用於該物種中時不大可能被識別為來自外來來源。 如本文所使用，術語「關鍵」殘基係指可變區內對於抗體、尤其是人類化抗體之結合特異性及/或親和力影響較大的某些殘基。關鍵殘基包括(但不限於)以下一或多個：與CDR相鄰之殘基、潛在糖基化位點(可以為N或O糖基化位點)、稀有殘基、能夠與抗原相互作用之殘基、能夠與CDR相互作用之殘基、經典殘基、介於重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基、在維尼爾區(Vernier zone)內之殘基及在Chothia定義之可變重鏈CDR1與Kabat定義之第一重鏈構架之間重疊的區域中之殘基。 術語「人類化抗體」一般係指包含來自非人類物種(例如兔、小鼠等)之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中VH及/或VL序列之至少一部分已改變成更「像人類」，亦即，更類似於人類生殖系可變序列的抗體。一種類型之人類化抗體係將人類CDR序列引入非人類VH及VL序列中以替代相應非人類CDR序列的CDR移植抗體。另一類型之人類化抗體為將至少一個非人類CDR插入人類構架中之CDR移植抗體。後者通常係本發明之焦點。 詳言之，如本文所使用，術語「人類化抗體」係免疫特異性結合至相關抗原且包含具有實質上人類抗體之胺基酸序列之構架(FR)區及具有實質上非人類抗體之胺基酸序列之互補決定區(CDR)的抗體或其變異體、衍生物、類似物或片段。如本文所使用，在CDR之情況下，術語「實質上」係指CDR具有的胺基酸序列與非人類抗體CDR之胺基酸序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%，較佳至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致。在一個實施例中，相較於非人類抗體CDR，人類化抗體之CDR區具有一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加及/或缺失。此外，非人類CDR可以使用已知技術工程改造成更「像人類」或與人體相容。人類化抗體包含至少一個且通常兩個可變結構域(Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')c、Fv)之基本上全部，其中所有或基本上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白(亦即，供體抗體)之CDR區且所有或基本上所有構架區係具有人類免疫球蛋白共同序列之構架區。較佳地，人類化抗體亦包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常至少一部分人類免疫球蛋白之恆定區。在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及至少重鏈之可變結構域。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2及CH3，或CH1、CH2、CH3及CH4。在一些實施例中，人類化抗體僅含人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含人類化重鏈。在特定實施例中，人類化抗體僅含輕鏈之人類化可變結構域及/或人類化重鏈。雖然本文所論述之突變中有一些可能通常不為「人類」的，但此等突變不足以使本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑不為「人類化」的。 人類化抗體可以選自任何類別免疫球蛋白，包括IgY、IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何同型，包括(但不限於) IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。人類化抗體可以包含來自超過一種類別或同型的序列，且可以使用此項技術中熟知之技術選擇特定恆定結構域以優化所需效應功能。 人類化抗體之構架區及CDR區不必精確對應於親本序列，例如，供體抗體CDR或共同構架可以藉由至少一個胺基酸殘基之取代、插入及/或缺失來進行突變誘發，以使得該位點處之CDR或構架殘基無法剛好對應於供體抗體或共同構架。然而，在一個較佳實施例中，該等突變不多。通常，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%，較佳至少85%，更佳至少90%，且最佳至少95%、98%或99%的人類化抗體殘基將對應於親本FR及CDR序列之殘基。在一個實施例中，相較於親本FR及序列(例如，相較於奧馬珠單抗或奧馬珠單抗Fab序列)，人類化抗體中可以存在一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸取代、添加及/或缺失。如本文所使用，術語「共同構架」係指共同免疫球蛋白序列中之構架區。如本文所使用，術語「共同免疫球蛋白序列」係指由一組相關免疫球蛋白序列中最頻繁出現之胺基酸(或核苷酸)形成的序列(參見例如，Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)。在一組免疫球蛋白中，共同序列中之每個位置均由該組中最頻繁出現於該位置之胺基酸佔據。若兩個胺基酸同等頻繁地出現，則共同序列中可以包括任一個。 如本文所使用，「維尼爾」區係指如Foote及Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499，以引用的方式併入本文中)所描述，可以調整CDR結構且微調與抗原之配合度的一小組構架殘基。維尼爾區殘基在CDR下面形成一層且可能影響抗體之CDR結構及親和力。 如本文所使用，術語「中和」係指當本文所描述的本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑特異性結合IgE蛋白質時，中和IgE之生物活性。中和可以為該抗體與IgE以不同方式結合的結果。較佳地，中和抗體係結合至IgE導致中和IgE之生物活性的抗體。較佳地，中和性結合蛋白結合IgE並使IgE之生物活性降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、80%、85%或更多。中和抗體對IgE生物活性之中和可以藉由量測本文所描述之IgE生物活性之一或多個指標來評估。 如本文所使用，「中和性單株抗體」意圖指當結合至IgE時能夠部分或完全抑制或降低IgE生物活性的抗體分子製劑。 如本文所使用，術語「減弱(attenuation)」、「減弱(attenuate)」及其類似表述係指由血清IgE含量升高所引起之症狀或病狀之嚴重程度的減輕或降低。 術語「抗原決定基」或「抗原決定子」包括能夠特異性結合至免疫球蛋白或T細胞受體之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面群組，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且在某些實施例中，其可以具有特定三維結構特徵及/或特定荷質比特徵。抗原決定基係抗體所結合之抗原區域。在某些實施例中，在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中，當抗體優先識別其靶抗原時，稱該抗體特異性結合抗原。 如本文所使用，術語「kon 」意欲指抗體與抗原締合形成如此項技術中已知之抗體/抗原複合物的締合速率常數。 如本文所使用，術語「koff 」意欲指抗體自如此項技術中已知之抗體/抗原複合物解離的解離速率常數。 如本文所使用，術語「kd 」或「kD 」意欲指如此項技術中已知的特定抗體-抗原相互作用之解離常數。 免疫結合相互作用之強度或親和力可以根據相互作用之解離常數(kD 或kd )表示，其中kd 愈小，表示親和力愈大或愈高。所選多肽之免疫結合特性可以使用此項技術中熟知之方法定量。一種此類方法涉及量測抗原結合位點/抗原複合物形成及解離之速率，其中該等速率取決於複合物搭配物之濃度、相互作用之親和力及在兩個方向上同等地影響速率之幾何結構參數。因此，「締合速率常數」(「kon 」)及「解離速率常數」(「koff 」)可以藉由計算濃度及締合與解離之實際速率來確定。(Nature 361:186-87 (1993))。koff /kon 之比率能夠抵消與親和力不相關之所有參數，且等於解離常數kd 。Davies等人(1990) Annual Rev Biochem 59:439-473。 術語「抗體偶聯物」係指以化學方式連接至諸如治療劑或細胞毒性劑之第二化學部分的結合蛋白，諸如抗體或抗體片段或其結合部分。術語「試劑」在本文中用以表示化合物、化合物之混合物、生物大分子或由生物材料製成之提取物。 如本文所使用，術語「晶體」及「結晶」係指以晶體形式存在之抗體或其抗原結合部分。晶體係物質固態之一種形式，其不同於諸如非晶形固態或液晶態之其他形式。晶體係由原子、離子、分子(例如蛋白質，諸如抗體)或分子集合體(例如，抗原/抗體複合物)之規則、重複、三維陣列構成。此等三維陣列係根據本領域中充分瞭解之特定數學關係排列。在晶體中重複之基本單元或構建嵌段稱為不對稱單元。以符合明確確定之給定晶體學對稱性之排列重複不對稱單元將提供晶體之「單位晶胞」。所有三個維度上單位晶胞藉由規則變換進行重複將提供晶體。參見Giege, R.及Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 第2版, 第201-16頁, Oxford University Press, New York, N.Y., (1999)。 如本文中所提及，術語「聚核苷酸」意謂兩個或兩個以上核苷酸，即核糖核苷酸或脫氧核苷酸，或任一核苷酸類型之修飾形式的聚合物形式。該術語包括單股及雙股形式之DNA，但較佳為雙股DNA。 如本文所使用，術語「分離之聚核苷酸」意謂這樣一種聚核苷酸(例如基因組、cDNA或合成來源的聚核苷酸，或其某一組合)，根據來源，該「分離之聚核苷酸」與在自然界中與該「分離之聚核苷酸」一起發現的聚核苷酸之全部或一部分不相關；可操作地連接至在自然界中不與之連接的聚核苷酸；或在自然界中不會發生成為較大序列之一部分。 如本文所使用，術語「載體」意欲指能夠運輸其所連接之另一核酸的核酸分子。一種載體類型係「質體」，指可以連接其他DNA區段的環形雙股DNA環。另一載體類型係病毒載體，其中其他DNA區段可以接合至病毒基因組。某些載體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時可以整合至宿主細胞之基因組中，且由此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導與其可操作地連接之基因的表現。此類載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常常呈質體形式。由於質體係載體之最常用形式，故在本發明書中，「質體」與「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括提供等效功能之該等其他形式之表現載體，諸如病毒載體(例如，複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒以及腺相關病毒)。 術語「可操作地連接」係指所描述之組分處於准許其以其預定方式起作用的關係中的並接。「可操作地連接」至編碼序列的控制序列係以使得該編碼序列在與該等控制序列相容之條件下表現的方式接合。「可操作地連接」的序列包括與相關基因相鄰之表現控制序列及以反式作用或在一定距離處作用以控制相關基因之表現控制序列兩種。如本文所使用，術語「表現控制序列」係指這樣一類聚核苷酸序列，該等聚核苷酸序列係實現其所接合之編碼序列的表現及加工所需的。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；增大轉譯效率之序列(亦即，科紮克共同序列(Kozak consensus sequence))；增強蛋白質穩定性之序列；及必要時，增強蛋白質分泌之序列。此類控制序列之性質取決於宿主生物體而不同；在原核生物中，此類控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列；在真核生物中，此類控制序列一般包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲包括表現及加工必不可少之組件，且亦可包括有利地存在之其他組件，例如前導序列及融合搭配物序列。 如本文所定義，「轉型」係指使外源DNA進入宿主細胞之任何方法。轉型可以在天然或人工條件下使用此項技術中熟知之各種方法進行。轉型可以依賴於將外來核酸序列插入原核或真核宿主細胞中之任何已知方法。該方法係基於轉型之宿主細胞選擇且可以包括(但不限於)病毒感染、電穿孔、脂質體轉染及粒子轟擊。此類「轉型」之細胞包括穩定轉型細胞，其中插入之DNA能夠作為自主複製質體或作為宿主染色體之一部分進行複製。其亦包括在有限時間段內短暫表現所插入之DNA或RNA的細胞。 如本文所使用，術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)意欲指已引入外源性DNA之細胞。應瞭解，此類術語不僅意欲指特定個體細胞，而且亦指此類細胞之後代。因為某些修飾可能因突變或環境影響而出現在隨後數代中，所以此類後代可能實際上與親本細胞不相同，但仍包括在如本文中所使用之術語「宿主細胞」的範圍內。較佳地，宿主細胞包括選自生物界中任一種的原核及真核細胞。較佳真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。最佳地，宿主細胞包括(但不限於)原核細胞株大腸桿菌；哺乳動物細胞株CHO、HEK 293及COS；昆蟲細胞株Sf9；以及真菌細胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。 可以使用重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉型的標準技術(例如電穿孔、脂質體轉染)。酶反應及純化技術可以根據製造商之說明書，或如通常在此項技術中所實現，或如本文所描述來進行。前述技術及程序一般可以根據此項技術中熟知的且如在本說明書通篇所引用及論述之各種一般及更特定之參考文獻中所描述的習知方法進行。參見例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，以引用的方式併入本文中用於任何目的。 如本文所使用，術語「有效量」係指足以降低或改善病症或其一或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間；阻止病症進展；引起病症消退；防止與病症相關之一或多種症狀復發、發生、發作或進展；偵測病症；或者增強或提高另一療法(例如預防劑或治療劑)之預防或治療效果的療法量。 本文中提供之人類IgE蛋白質的特定區域或抗原決定基定位可以藉由此項技術中已知之任何適合的抗原決定基定位方法結合本發明提供之抗體中的任一種來鑑別。此類方法之實例包括針對結合至本發明抗體來篩選衍生自IgE的具有不同長度之肽，其中可以特異性結合至該抗體之最小片段含有該抗體所識別之抗原決定基序列。IgE肽可以用合成方式或藉由蛋白質水解消化IgE蛋白質產生。結合抗體之肽可以藉由例如質譜分析來鑑別。在另一實例中，可以使用NMR波譜分析或X射線結晶學鑑別本發明抗體所結合之抗原決定基。對於測定IgE之結構及IgE上本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑所結合之抗原決定基，結晶及X射線結晶學技術較佳。 用於本發明之抗體可以使用單一淋巴細胞抗體方法，藉由選殖及表現免疫球蛋白可變區cDNA產生，該等免疫球蛋白可變區cDNA係由選擇用於產生特異性抗體之單一淋巴細胞，藉由例如Babcook, J.等人, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268及國際專利申請案第WO2004/106377號描述之方法產生。可以使用量測與人類IgE之結合的分析及/或量測阻斷IgE與其天然受體結合之能力的分析來篩選抗體。結合分析之實例係ELISA。 人類化抗體(包括CDR移植抗體)係具有來自非人類物種(例如兔或小鼠)之一或多個互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之構架區的抗體分子(參見例如，US 5,585,089; WO91/09967)。應瞭解，可能僅僅需要轉變CDR之特異性決定殘基而非整個CDR (參見例如，Kashmiri等人, 2005, Methods, 36, 25-34)。人類化抗體可視情況進一步包含一或多個來源於得到CDR之非人類物種的構架殘基。後者常常稱為供體殘基。本發明之抗體分子適合地具有小於2 nM之結合親和力(KD )。親和力可以使用此項技術中已知之任何適合方法(包括如本文中實例中所描述之BIAcore(參見實例6))，使用分離之天然或重組IgE或適合的融合蛋白/多肽量測。 本發明之抗體或抗原結合劑之親和力以及結合劑(諸如抗體)抑制結合之程度可以由一般熟習此項技術者使用習知技術，例如Scatchard等人(Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949))描述之技術或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用諸如BIAcore之系統測定。對於表面電漿子共振，將靶分子係固定於固相上且暴露於沿流槽行進之移動相中之配位體。若發生配位體結合至固定靶，則局部折射率改變，導致SPR角變化，其可藉由偵測反射光強度之變化來進行即時監測。可以分析SPR信號之變化速率以得到該結合反應之締合相及解離相之表觀速率常數。此等值之比率得到表觀平衡常數(親和力)(參見例如，Wolff等人, Cancer Res. 53:2560-65 (1993))。 應瞭解，本發明提供之抗體的親和力可以使用此項技術中已知之任何適合方法改變。因此，本發明亦關於本發明之抗體分子之變異體，其對IgE具有改善之親和力。此類變異體可以藉由多種親和力成熟方案獲得，包括使CDR突變(Yang等人, J. Mol. Biol.,254, 392-403, 1995)、鏈改組(Marks等人, Bio/Technology, 10, 779-783, 1992)、使用大腸桿菌之突變株(Low等人, J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996)、DNA改組(Patten等人, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997)、噬菌體展示(Thompson等人, J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996)及性PCR(Crameri等人, Nature, 391, 288-291, 1998)。Vaughan等人(前述)論述了此等親和力成熟方法。 人類化抗體及抗原結合劑 在本發明之一個態樣中，本文提供人類化抗-IgE單株抗體及抗原結合劑。人類化抗體係這樣一類抗體，其中重鏈及/或輕鏈含有移植至接受體抗體(例如人類抗體)之重鏈及/或輕鏈可變區構架中的一或多個來自供體抗體(例如非人類抗體，諸如鼠類或兔單株抗體)之CDR (必要時，包括一或多個經修飾CDR)。有關評述，參見Vaughan等人, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998。 在一個實施例中，僅將來自上文所描述之CDR中之任一個的一或多個特異性決定殘基轉移至人類抗體構架中，而非轉移整個CDR(參見例如，Kashmiri等人, 2005, Methods, 36, 25-34)。在一個實施例中，僅將來自本文所描述之CDR中之一或多個的特異性決定殘基轉移至人類抗體構架中。在另一個實施例中，僅將來自本文所描述之CDR中每一個的特異性決定殘基轉移至人類抗體構架中。 當移植CDR或特異性決定殘基時，考慮到得到CDR之供體抗體的類別/類型，可以使用任何適當的接受體可變區構架序列，包括小鼠、兔、靈長類動物及人類構架區。 適當地，根據本發明之人類化抗體具有包含人類接受體構架區以及一或多個本文中特別提供之CDR的可變結構域。因此，在一個實施例中提供一種結合人類IgE之人類化單株抗體，其中可變結構域包含人類接受體構架區(如本文中所描述，具有可選突變)及非人類供體CDR。 CDR移植抗體之構建大體上描述於歐洲專利申請案EP-A-0239400中，該案揭示一種方法，其中藉由定點突變誘發，使用長寡核苷酸將小鼠單株抗體之CDR移植至人類免疫球蛋白可變結構域的構架區上，且併入其中。CDR決定抗體之抗原結合特異性且為可變結構域之構架區上所攜帶的相對較短之肽序列。 關於藉由CDR移植得到人類化單株抗體之最早工作係在識別合成抗原之單株抗體，諸如NP上進行。然而，Verhoeyen等人(Science, 239, 1534-1536, 1988)及Riechmann等人(Nature, 332, 323-324, 1988)已分別描述藉由CDR移植對識別溶菌酶之小鼠單株抗體及識別人類T細胞上之抗原的大鼠單株抗體進行人類化的實例。抗體人類化係藉由將非人類抗體，諸如小鼠、大鼠、山羊或兔抗體之CDR移植至「類似」人類構架(接受體)上且選擇最少數目之關鍵構架殘基(回復突變)來實現，該等關鍵構架殘基係手動地選自供體單株抗體且併入人類接受體構架中以維持原始CDR構形。此類方法係此項技術中已知的，且包括併入本文中之以下中描述之方法：Jones等人, Nature 321:522 (1986)；Verhoeyen等人, Science 239:1534 (1988))；Sims等人, J. Immunol. 151: 2296 (1993)；Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)；Carter等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992)；Presta等人, J. Immunol. 151:2623 (1993)；Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)；Studnicka等人, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)；Roguska.等人, PNAS 91:969-973 (1994)；PCT公開案WO 91/09967、PCT/: US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246、EP 592,106；EP 519,596、EP 239,400；美國專利號5,565,332、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567。 人類可變重鏈及輕鏈生殖系子家族分類可以來源於Kabat生殖系亞群名稱：特定VH序列為VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6或VH7，以及構架4之特定可變重鏈接合組為JH1、JH2、JH3、JH4、JH5及JH6；構架1、2及3之特定VLκ序列為VK1、VK2、VK3、VK4、VK5或VK6，以及構架4之特定κ接合組為JK1、JK2、JK3、JK4或JK5；或構架1、2及3之特定VLλ序列為VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9或VL10，以及構架4之特定λ接合組為JL1、JL2、JL3或JL7。 本發明之抗體分子之恆定區結構域若存在，則可根據所提出的抗體分子之功能且尤其是可能需要之效應功能進行選擇。舉例而言，恆定區結構域可以為人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM結構域。在特定實施例中，當抗體分子意欲用於治療性用途且需要抗體效應功能時，可以使用人類IgG恆定區結構域，尤其是IgG1及IgG3同型之恆定區結構域。或者，當抗體分子意欲用於治療目的且不需要抗體效應功能時，可以使用IgG2及IgG4同型。應瞭解，亦可使用此等恆定區結構域之序列變異體。舉例而言，可以如Angal等人, Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108中所述，使用241位之絲胺酸已變成脯胺酸的IgG4分子。熟習此項技術者亦應瞭解，抗體可以經歷多種轉譯後修飾。此等修飾之類型及程度常常取決於用於表現抗體之宿主細胞株以及培養條件。此類修飾可以包括糖基化變化、甲硫胺酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬胺酸鹽異構化及天冬醯胺去醯胺化。常見的修飾係由於羧基肽酶作用引起的羧基末端鹼性殘基(諸如離胺酸或精胺酸)之喪失(如Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995中所描述)。因此，可能缺乏抗體重鏈之C末端離胺酸。CDR 及人類構架修飾 Riechmann等人發現，僅僅轉移CDR(如Kabat (Kabat等人(前述))及Wu等人, J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)所定義)不足以在CDR移植產物中提供令人滿意之抗原結合活性。已發現，許多構架殘基必須作出改變，以使得其對應於供體構架區之殘基。所提出的有關選擇需要作出改變之構架殘基的標準描述於國際專利申請案WO 90/07861中，該案併入本文中。 若人類可變結構域構架呈現與得到CDR之非人類可變構架相同或類似的構形，則將非人類CDR取代至人類可變結構域構架中最有可能保留CDR之正確空間取向。此係藉由自構架序列與得到CDR之非人類可變構架結構域展現高度序列一致性的人類抗體獲得人類可變結構域來實現。如上所述，重鏈及輕鏈可變構架區可以來源於相同或不同的人類抗體序列。人類抗體序列可以為天然存在之人類抗體之序列或可以為若干人類抗體之共同序列。參見Kettleborough等人, Protein Engineering 4:773 (1991)；Kolbinger等人, Protein Engineering 6:971 (1993)及Carter等人, WO 92/22653。 鑑別了非人類供體免疫球蛋白及適當人類接受體免疫球蛋白之互補決定區，下一步係確定來自此等組件之哪些殘基(若存在)應經取代以優化所得人類化抗體之特性。一般而言，用非人類胺基酸殘基取代人類胺基酸殘基應減到最少，因為非人類殘基之引入會增加抗體在人體中引發人類抗-供體抗體(HADA)反應之風險。可以進行此項技術中認可的確定免疫反應之方法以監測特定宿主中或臨床試驗期間之HADA反應。在投與該療法開始及整個過程中，可以對投與人類化抗體之宿主進行免疫原性評估。使用熟習此項技術者已知之方法，包括表面電漿子共振技術(BIACORE)及/或固相ELISA分析，例如藉由偵測來自宿主之血清樣品中針對人類化治療試劑之抗體來量測HADA反應 供取代(本文中亦為「突變」)之胺基酸殘基的選擇係部分藉由計算機建模確定。在本文中描述用於產生免疫球蛋白分子之三維影像之電腦硬體及軟體。一般而言，分子模型係自解析的免疫球蛋白鏈或其結構域之結構開始來產生。比較待建模之鏈與具有解析之三維結構之鏈或結構域的胺基酸序列相似性，且選擇顯示最大序列相似性之鏈或結構域作為構建分子模型之起點。選擇共有至少50%序列一致性之鏈或結構域進行建模，且較佳選擇共有至少60%、70%、80%、90%或更大序列一致性的鏈或結構域進行建模。對解析之起始結構進行修改以允許建模之免疫球蛋白鏈或結構域中之實際胺基酸與起始結構中之胺基酸之間的差異。接著，將經修改之結構組裝成複合免疫球蛋白。最終，藉由能量最小化及藉由驗證所有原子均在彼此適當距離內且鍵長及鍵角在化學上可接受之界限內來精化模型。 供取代之胺基酸殘基的選擇亦可部分藉由檢查特定位置處胺基酸之特徵，或取代或突變誘發特定胺基酸之影響的經驗觀測結果來確定。舉例而言，當供體可變區構架殘基與所選人類可變區構架殘基之間的胺基酸不同時，人類構架胺基酸通常應藉由來自供體抗體之等效構架胺基酸取代，此時合理地預期該胺基酸： (1)直接非共價結合抗原， (2) 與CDR區相鄰， (3)以其他方式與CDR區(例如，如藉由計算機建模所測定，在約3-6埃內)相互作用，或 (4) 參與VL-VH界面。 「直接非共價結合抗原」之殘基包括構架區中根據確定之化學力，例如藉由氫鍵、凡得瓦爾力、疏水相互作用及其類似作用，很可能直接與抗原上之胺基酸相互作用之位置中的胺基酸。CDR及構架區係如Kabat等人或Chothia等人(前述)所定義。當如Kabat等人(前述)所定義之構架殘基構成如Chothia等人(前述)所定義之結構環殘基時，可以選擇存在於供體抗體中之胺基酸用於取代至人類化抗體中。「與CDR區相鄰」之殘基包括在緊鄰人類化免疫球蛋白鏈一級序列中之一或多個CDR的位置，例如緊鄰如Kabat所定義之CDR或如Chothia(參見例如，Chothia及Lesk 1MB 196:901(1987))所定義之CDR的位置中的胺基酸殘基。此等胺基酸很可能與CDR中之胺基酸相互作用，且若選自接受體，則會使供體CDR變形且降低親和力。此外，相鄰胺基酸可以直接與抗原相互作用(Amit等人, Science, 233:747 (1986)，以引用的方式併入本文中)且可能希望自供體選擇此等胺基酸以保持提供原始抗體之親和力的所有抗原接觸。如本文中所描述，FR序列亦可經取代/突變以改善本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑對IgE之親和力(及/或擴展其相互作用或至IgE Cɛ2上之抗原決定基)。 「以其他方式與CDR區相互作用」之殘基包括藉由二級結構分析確定呈足以實現CDR區之空間取向的殘基。在一個實施例中，「以其他方式與CDR區相互作用」的殘基係藉由分析供體免疫球蛋白之三維模型(例如，計算機生成之模型)來鑑別。原始供體抗體之典型三維模型顯示，在CDR範圍外之某些胺基酸接近CDR且很可能藉由氫鍵、凡得瓦爾力、疏水相互作用等與CDR中之胺基酸相互作用。在該等胺基酸位置處，可以選擇供體免疫球蛋白胺基酸而非接受體免疫球蛋白胺基酸。遵照此標準之胺基酸一般會在CDR中之一些原子約3埃單位(A)內具有側鏈原子，且必須含有可以根據確定之化學力，諸如以上所列之化學力與CDR原子相互作用的原子。在可以形成氫鍵之原子之情況下，在其核之間量測3Å，但對於不形成鍵之原子，在其凡得瓦爾表面之間量測3Å。因此，在後一情況下，對於認為能夠相互作用之原子，核必須在約6Å內(3Å加凡得瓦爾半徑總和)。在多數情況下，核將相隔4或5至6Å。在確定胺基酸是否能與CDR相互作用時，較佳不考慮重鏈CDR 2之最後8個胺基酸作為CDR之一部分，因為自結構之角度看，此8個胺基酸更多行為更像構架之一部分。 能夠與CDR(或FR)中之胺基酸相互作用之胺基酸可以用又一種方式鑑別。每一構架胺基酸之溶劑可及表面積係以兩種方式計算：(1)在完整抗體中，及(2)在由移除了CDR之抗體組成的假設分子中。此等數量之間約10平方埃或更大之顯著差異顯示，溶劑對構架胺基酸之接近至少部分由CDR阻斷，且因此使胺基酸與CDR接觸。胺基酸之溶劑可及表面積可以基於抗體之三維模型，使用此項技術中已知之演算法計算(例如Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983)；以及Lee及Richards, J. Mol. Biol. 55:379 (1971)，二者以引用的方式併入本文中)。構架胺基酸偶爾亦可藉由影響另一構架胺基酸之構形，由此接觸CDR而與CDR間接相互作用。 已知在許多抗體中，在構架中若干位置處之特定胺基酸能夠與CDR相互作用(Chothia及Lesk, 前述；Chothia等人, 前述；及Tramontano等人, J. Mol. Biol. 215:175 (1990)，皆以引用的方式併入本文中)。值得注意的是，已知在許多抗體中，在輕鏈之位置2、48、64及71處之胺基酸及重鏈之位置71及94處之胺基酸(根據Kabat編號)能夠與CDR相互作用。在輕鏈中位置35處及重鏈中位置93及103處之胺基酸亦可能與CDR相互作用。在所有此等編號位置處，選擇供體胺基酸而非接受體胺基酸(當其不同時)至人類化免疫球蛋白中較佳。另一方面，在人類化免疫球蛋白中，能夠與CDR區相互作用之某些殘基，諸如輕鏈之頭5個胺基酸有時可以選自接受體免疫球蛋白，而不喪失親和力。 「參與VL-VH界面」之殘基或「填充殘基」包括在如Novotny及Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985)或Chothia等人, 前述所定義之VL與VH之間之界面處的殘基。一般而言，若不常見的填充殘基不同於人類構架中之填充殘基，則其應保留在人類化抗體中。 一般而言，滿足以上標準之一或多個胺基酸經取代。在一些實施例中，滿足以上標準之所有或大部分胺基酸經取代。有時，關於特定胺基酸是否符合以上標準，及是否產生替代性變異免疫球蛋白，其中之一具有該特定取代，而其他不具有存在一些不確定性。可以在任一本文所描述之分析中針對所需活性測試由此產生之替代性變異免疫球蛋白，且選擇較佳免疫球蛋白。 通常，人類化抗體中之CDR區與供體抗體之相應CDR區實質上一致，且更通常一致。雖然通常不希望，但有時可在不明顯影響所得人類化免疫球蛋白之結合親和力情況下對CDR殘基進行一或多個保守胺基酸取代。保守或類似取代係預定組合，諸如白胺酸取代異白胺酸或纈胺酸。通常可以彼此取代的其他胺基酸包括(但不限於)： 苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳族側鏈之胺基酸)； 離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼性側鏈之胺基酸)； 天冬胺酸及麩胺酸(具有酸性側鏈之胺基酸)； 天冬醯胺及麩醯胺酸(具有醯胺側鏈之胺基酸)；以及 半胱胺酸及甲硫胺酸(具有含硫側鏈之胺基酸)。 供取代之其他候選胺基酸係人類免疫球蛋白在該位置不常見或「稀少」之接受體人類構架胺基酸。此等胺基酸可以經來自供體抗體之同等位置之胺基酸或來自更典型人類免疫球蛋白之同等位置之胺基酸取代。舉例而言，當接受體免疫球蛋白之人類構架區中的胺基酸在該位置稀少且供體免疫球蛋白中的相應胺基酸係人類免疫球蛋白序列中該位置常用時；或當相對於其他人類序列，接受體免疫球蛋白中之胺基酸在該位置稀少且供體免疫球蛋白中的相應胺基酸亦稀少時，可能希望取代。此等標準幫助確保人類構架中之非典型胺基酸不會破壞抗體結構。此外，藉由用來自供體抗體之人類抗體特有胺基酸替代不常見人類接受體胺基酸，可以使人類化抗體免疫原性降低。 如本文所使用，術語「稀少」指示胺基酸在代表性序列樣品中小於約20%，但通常小於約10%之序列中該位置處存在，且如本文所使用，術語「常用」指示胺基酸在代表性樣品中超過約25%，但通常超過約50%之序列中存在。舉例而言，所有人類輕鏈及重鏈可變區序列分別分組成尤其彼此同源且在某些關鍵位置具有相同胺基酸之序列「子組」(Kabat等人, 前述)。當確定人類接受體序列中之胺基酸在人類序列間「稀少」還是「常用」時，僅僅考慮與接受體序列相同之子組中之人類序列通常係較佳的。 供取代之其他候選殘基係對應於稀少或不常見供體構架殘基之受體構架殘基。稀少或不常見供體構架殘基係供體抗體在該位置處稀少或不常見(如本文所定義)的殘基。對於供體抗體，可以根據Kabat確定子組且鑑別不同於共同序列之殘基位置。此等供體特有差異可以指出供體序列中增強活性之體細胞突變。保留預測會影響結合之不常見殘基，而預測對於結合不重要的殘基可以經取代。 供取代之其他候選殘基係在接受體構架區中存在之非生殖系殘基。舉例而言，當接受體抗體鏈(亦即，與供體抗體鏈共有相當大序列一致性之人類抗體鏈)與生殖系抗體鏈(同樣與供體鏈共有相當大序列一致性)對準時，接受體鏈構架與生殖繫鏈構架之間不匹配的殘基可以經來自生殖系序列之相應殘基取代。 除上文所論述之特定胺基酸取代外，人類化免疫球蛋白之構架區通常大體上一致，且更通常地，與得到其之人類抗體之構架區一致(例外為如本文出於本發明之目的所描述的情形)。當然，構架區中許多胺基酸對於抗體之特異性或親和力具有極小或無直接作用。因此，可以容許構架殘基之許多個別保守取代而不明顯改變所得人類化免疫球蛋白之特異性或親和力。因此，在一個實施例中，人類化免疫球蛋白之可變構架區與此類序列之人類可變構架區序列或共同序列共有至少65%、75%或85%序列類似性或一致性。在另一個實施例中，人類化免疫球蛋白之可變構架區與此類序列之人類可變構架區序列或共同序列共有至少90%、較佳95%、更佳96%、97%、98%或99%序列類似性或一致性。然而，一般而言，此類取代係不合需要的(本文所描述之取代除外)。 如本文所使用，一致性及類似性程度容易例如以下中所述計算：Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編, Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, 第1部分, Griffin, A.M., 及Griffin, H.G.編, Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編, M Stockton Press, New York, 1991，購自NCBI之BLAST™軟體(Altschul, S.F.等人, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410；Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272；Madden, T.L.等人, 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141；Altschul, S.F.等人, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402；Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656，其以引用的方式併入本文中。 已公開論述CDR移植抗體之許多評述，包括Vaughan等人(Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998)，其以引用的方式併入本文中。 本發明之抗-IgE抗體可以進一步包括額外的結合結構域，例如按照如WO 2007/024715中所揭示之分子DVD-Ig，或WO2011/030107中描述的所謂(FabFv)2Fc。因此，如本文所使用之抗體包括二價、三價或四價全長抗體。 抗原結合劑 抗原結合劑包括單鏈抗體(亦即，全長重鏈及輕鏈)；Fab、經修飾Fab、Fab'、經修飾Fab'、F(ab')2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、單結構域抗體(例如VH或VL或VHH，例如WO 2001090190中所描述)、scFv、二價抗體、三價抗體或四價抗體、雙scFv、雙功能抗體、三鏈抗體、三功能抗體、四功能抗體及以上任一種的抗原決定基-抗原結合劑(參見例如，Holliger及Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136；Adair及Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217)。用於產生及製造此等抗體片段之方法係此項技術中熟知的(參見例如，Verma等人, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181)。Fab-Fv形式最先在WO2009/040562中揭示且其二硫化物穩定型式Fab-dsFv最先在WO2010/035012中揭示。用於本發明中之其他抗體片段包括國際專利申請案WO2005/003169、WO2005/003170及WO2005/003171中所述的Fab及Fab'片段。多價抗體可以包含多種特異性，例如雙特異性，或可以具單特異性(參見例如WO 92/22583及WO05/113605)。後者之一種此類實例為如WO92/22583中所述之Tri-Fab (或TFM)。 典型Fab'分子包含重鏈及輕鏈對，其中重鏈包含可變區VH、恆定結構域CH1及天然或經修飾之鉸鏈區，且輕鏈包含可變區VL及恆定結構域CL。 在一個實施例中，提供根據本發明之Fab'之二聚體，產生F(ab')2，例如二聚合可以經由本文所描述之天然鉸鏈序列或其衍生物或合成鉸鏈序列進行。 抗體結合結構域一般將包含6個CDR，三個來自重鏈且三個來自輕鏈。在一個實施例中，CDR係在構架中且一起形成可變區。因此，在一個實施例中，抗原結合劑包括對包含輕鏈可變區及重鏈可變區之IgE具有特異性之結合結構域。 應瞭解，可以如上文或下文所描述，對本發明提供之CDR或其他序列(例如可變結構域)進行一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸之取代、添加及/或缺失，而不顯著改變抗體結合至IgE之能力。熟習此項技術者，例如藉由使用本文所描述之方法，特別是實例中所描述之方法可以容易地測試任何胺基酸取代、添加及/或缺失之影響。 在一個實施例中，可以對本發明提供之抗體或片段中採用的CDR或構架區進行一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸之取代、添加及/或缺失以使得本發明之抗-IgE抗體或抗原結合劑對IgE之結合親和力(KD )小於2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4或0.3 nM。在一個實施例中，提供一種經修飾人類化抗體，其中已對CDR、構架區或這兩者進行修飾以便將KD 降低至小於2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4或0.3 nM。 本發明之抗體片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、雙功能抗體、scFAb、dFv、單結構域輕鏈抗體、dsFv、包含CDR之肽及其類似物。 Fab係具有約50,000之分子量及抗原結合活性之抗體片段，其中在藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶處理IgG (在H鏈224位之胺基酸殘基處切割)獲得的片段間，H鏈N末端側約一半與整個L鏈經由二硫鍵結合在一起。 本發明之Fab可以藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶處理與IgE特異性反應的本發明之人類化CDR移植抗體來獲得。此外，Fab亦可藉由將編碼抗體Fab之DNA插入原核生物表現載體或真核生物表現載體中且將載體引入原核生物或真核生物中以表現Fab來產生。 F(ab')2係具有約100,000之分子量及抗原結合活性之抗體片段，在藉由用蛋白酶胃蛋白酶處理IgG獲得的片段間，其略大於經由鉸鏈區二硫鍵結合的Fab。 本發明之F(ab')2可以藉由用蛋白酶胃蛋白酶處理與IgE特異性反應之人類CDR移植抗體來獲得。此外，F(ab')2亦可藉由經由硫醚鍵或二硫鍵結合下文所述之Fab'產生。 Fab'係具有約50 000之分子量及抗原結合活性之抗體片段，其係藉由切割F(ab')2鉸鏈區之二硫鍵獲得。 本發明之Fab'可以藉由用還原劑二硫蘇糖醇處理與IgE特異性反應之F(ab')2獲得。此外，本發明之Fab'亦可藉由將編碼與IgE特異性反應的本發明之人類CDR移植抗體之Fab'的DNA插入原核生物表現載體或真核生物表現載體中且將載體引入原核生物或真核生物中以表現Fab'來產生。 scFv係一種VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其中一條鏈VH及一條鏈VL使用具有12個或更多個殘基之適當肽連接子(P)連接且具有抗原結合活性。 本發明之scFv可以藉由獲得編碼與IgE特異性反應的本發明之人類CDR移植抗體之VH及VL的cDNA，構建編碼scFv之DNA，將該DNA插入原核生物表現載體或真核生物表現載體中且接著將表現載體引入原核生物或真核生物中以表現scFv來產生。 本發明之Fab片段可以直接或經由連接子連接至scFv。如本文所採用，「單鏈可變片段」或「scFv」係指藉由VH與VL可變結構域之間的肽連接子，例如具有胺基酸序列SEQ ID NO: 151之肽連接子穩定的單鏈可變片段。與Fab片段之鍵聯可以為化學偶聯但最佳為轉譯融合，亦即基因融合，其中各自之序列係由表現載體按順序編碼。因此，連接子通常係如本文中所描述的胺基酸連接子。連接至Fab片段的本發明之scFv可以結合至血清載體蛋白以便延長抗體融合蛋白在活體內之半衰期。以此方式延長半衰期與IgE結合無關且可能係有利的。 如本文所採用，「血清載體蛋白」係指可以結合至scFv的任何適合血漿載體蛋白，在一個實例中，血清載體蛋白係選自甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、α1-酸糖蛋白、轉鐵蛋白、血纖維蛋白原及白蛋白，或其中任一種之片段。通常，該scFv結合至白蛋白，較佳人類血清白蛋白。 任何適合白蛋白結合scFv均可以併入本發明之抗體融合蛋白中。此項技術中先前已描述適合的白蛋白結合結構域。 雙功能抗體係這樣一種抗體片段，其中具有相同或不同抗原結合特異性之scFv形成二聚體，且對相同抗原具有二價抗原結合活性或對不同抗原具有兩種特異性抗原結合活性。 本發明之雙功能抗體，例如與IgE特異性反應之二價雙功能抗體，可以藉由獲得編碼與IgE特異性反應的抗體之VH及VL的cDNA，構建編碼具有含3至10個殘基之多肽連接子之scFv的DNA，將該DNA插入原核生物表現載體或真核生物表現載體中且接著將表現載體引入原核生物或真核生物中以表現該雙功能抗體來產生。 dsFv係藉由經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵結合多肽來獲得，在該等多肽中，VH及VL各自的一個胺基酸殘基經半胱胺酸殘基取代。經半胱胺酸殘基取代之胺基酸殘基可以根據Reiter等人(Protein Engineering, 7, 697 (1994))所示的方法。基於抗體之三維結構估計選擇。 本發明之dsFv可以藉由獲得編碼與IgE特異性反應的本發明之人類CDR移植抗體之VH及VL的cDNA，構建編碼dsFv之DNA，將該DNA插入原核生物表現載體或真核生物表現載體中且接著將表現載體引入原核生物或真核生物以表現dsFv中來產生。 包含CDR之肽係由包括H鏈之至少一個區及L鏈CDRs構成。複數個CDRs可以直接或經由適當肽連接子結合。 本發明之包含CDR之肽可以藉由獲得編碼與IgE特異性反應的人類CDR移植抗體之VH及VL之CDR的cDNA，構建編碼CDR之DNA，將該DNA插入原核生物表現載體或真核生物表現載體中且接著將表現載體引入原核生物或真核生物中以表現該肽來產生。此外，包含CDR之肽亦可藉由化學合成方法，諸如Fmoc方法(茀基甲氧羰基法)、tBoc方法(第三丁氧基羰基法)或其類似方法來產生。 本發明之抗體包括放射性同位素、蛋白質、試劑或其類似物以化學方式或基因方式偶聯至本發明抗體的抗體衍生物。 本發明之抗體衍生物可以藉由將放射性同位素、蛋白質或試劑以化學方式偶聯至與IgE特異性反應的抗體或抗體片段之H鏈或L鏈之N末端側或C端末側、抗體或抗體片段之適當取代基或側鏈或抗體或抗體片段中之糖鏈來產生(Antibody Engineering Handbook, Osamu Kanemitsu編輯, Chijin Shokan出版 (1994))。 此外，其可以藉由將編碼與IgE特異性反應的本發明之抗體或抗體片段的DNA連接至編碼待結合之蛋白質的其他DNA，將該DNA插入表現載體中且將表現載體引入宿主細胞中而以基因方式產生。 放射性同位素包括131I、125I及其類似物，且其可以藉由例如氯胺T方法偶聯至抗體。 該試劑較佳為低分子量化合物。實例包括抗癌劑，諸如烷基化劑(例如氮芥(nitrogen mustard)、環磷醯胺)、代謝拮抗劑(例如5-氟尿嘧啶、甲胺喋呤)、抗生素(例如柔紅黴素(daunomycin)、博萊黴素(bleomycin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、道諾黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin))、植物鹼(例如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine))、激素藥物(例如他莫昔芬(tamoxifen)、地塞米松(dexamethasone))及類似物(Clinical Oncology, Japanese Society of Clinical Oncology編輯, Cancer and Chemotherapy出版(1996))；消炎藥，諸如類固醇藥(例如羥皮質酮(hydrocortisone)、潑尼松(prednisone))、非類固醇藥(例如阿司匹林(aspirin)、吲哚美辛(indometacin))、免疫調節劑(例如硫金蘋果酸鹽(aurothiomalate)、青黴胺(penicillamine))、免疫抑制劑(例如環磷醯胺、硫唑嘌呤)及抗組胺劑(例如順丁烯二酸氯芬尼拉明(chlorpheniramine maleate)、氯馬斯汀(clemastine))(Inflammation and Anti-inflammatory Therapy, Ishiyaku Shuppan (1982))；及其類似物。用於將道諾黴素偶聯至抗體之方法包括經由戊二醛偶聯道諾黴素與抗體之胺基的方法、經由水溶性碳化二亞胺偶聯道諾黴素之胺基與抗體之羧基的方法，及其類似方法。 此外，為直接抑制癌細胞，可以使用諸如蓖麻毒素、白喉毒素之毒素及其類似物。舉例而言，與蛋白質融合之融合抗體可以藉由將編碼抗體或抗體片段之cDNA連接至編碼該蛋白質之其他cDNA，構建編碼該融合抗體之DNA，將該DNA插入原核生物表現載體或真核生物表現載體中且接著將其引入原核生物或真核生物中以表現融合抗體來產生。 本文中進一步涵蓋抗體片段或抗原結合劑，包括結合劑之融合物，例如免疫球蛋白樣片段及試劑，諸如雙功能抗體、scAb、雙特異性片段、三功能抗體、Fab-Fv-Fv、Fab-Fv、三鏈抗體、(Fab-Fv)2-Fc及抗體片段或部分，諸如CDR或包括CDR之抗體環，其移植至諸如纖維結合蛋白或白胺酸拉鏈之非Ig構架上，如以全文併入本文中的Binz等人, (2005) Nat. Biotech. 23:1257-1268中所述。偶聯之抗 - IgE 單株抗體及抗原結合劑 必要時，用於本發明中之抗體或抗原結合劑可以偶聯至一或多個效應分子。應理解，效應分子可以包含單個效應分子或者兩個或兩個以上經連接以形成可以附接至本發明抗體之單一部分的此類分子。在希望獲得連接至效應分子之抗體片段的情況下，此可以藉由將抗體片段直接或經由偶合劑連接至效應分子之標準化學或重組DNA程序來製備。用於將此類效應分子偶聯至抗體之技術係此項技術中熟知的(參見Hellstrom等人, Controlled Drug Delivery, 第2版, Robinson等人編, 1987, 第623-53頁；Thorpe等人, 1982, Immunol. Rev., 62:119-58；及Dubowchik等人, 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123)。特定化學程序包括例如WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476及WO 03/031581中所述之程序。或者，在效應分子係蛋白質或多肽之情況下，可以使用重組DNA程序，例如WO 86/01533及EP0392745中所述的程序來實現連接。 如本文所使用，術語效應分子包括例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白質(例如酶)、其他抗體或抗體片段、抗原結合劑、合成(包括PEG)或天然存在之聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素(尤其是放射性碘化物)、放射性同位素、螯合金屬、奈米粒子及報告子基團，諸如螢光化合物或可以藉由NMR或ESR光譜法偵測之化合物。 效應分子之實例可以包括細胞毒素或細胞毒性劑，包括對細胞有害(例如殺滅細胞)之任何試劑。實例包括康普瑞汀(combrestatin)、海兔毒素(dolastatin)、埃博黴素(epothilone)、星形孢菌素(staurosporin)、類美登素(maytansinoid)、海綿素(spongistatin)、根瘤菌素(rhizoxin)、軟海綿素(halichondrin)、桿孢菌素(roridin)、海米斯林(hemiasterlin)、紫杉醇(taxol)、細胞遲緩素B (cytochalasin B)、短桿菌素D (gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼(colchicin)、多柔比星、道諾黴素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D (actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)，及其類似物或同源物。 效應分子亦包括(但不限於)抗代謝物(例如甲胺喋呤、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine))、烷基化劑(例如甲氮芥(mechlorethamine)、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)及洛莫司汀(lomustine，CCNU)、環硫磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順-二氯二胺鉑(II)(DDP)、順鉑(cisplatin))、蒽環黴素(anthracycline)(例如道諾黴素(以前為柔紅黴素)及多柔比星)、抗生素(例如放線菌素d (以前為放射菌素)、博萊黴素、光神黴素、安麯黴素(anthramycin，AMC)、卡奇黴素(calicheamicin)或倍癌黴素(duocarmycin))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。 其他效應分子可以包括螯合放射性核素，諸如111In及90Y、Lu177、鉍213、鐦252、銥192及鎢188/錸188；或藥物，諸如(但不限於)烷基磷酸膽鹼、拓樸異構酶I抑制劑、類紫杉醇及蘇拉明(suramin)。 其他效應分子包括蛋白質、肽及酶。相關酶包括(但不限於)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。相關蛋白質、多肽及肽包括(但不限於)免疫球蛋白、毒素(諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素或白喉毒素)、蛋白質(諸如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板源性生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子)、血栓劑或抗血管生成劑(例如血管生長抑素或內皮生長抑素)或生物反應調節劑(諸如淋巴激素、介白素-1 (IL-1)、介白素-2 (IL-2)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、神經生長因子(NGF)或其他生長因子及免疫球蛋白。 其他效應分子可以包括可用於例如診斷中之可偵測物質、 可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性核素、正電子發射金屬(用於正電子發射斷層攝影法)及非放射性順磁性金屬離子。關於可以偶聯至抗體用作診斷劑的金屬離子，一般參見美國專利第4,741,900號。適合酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基包括抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白及生物素；適合螢光物質包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯及藻紅素；適合發光物質包括魯米諾(luminol)；適合生物發光物質包括螢光素酶、螢光素及水母素；且適合放射性核素包括125I、131I、111In及99Tc。 在另一實例中，效應分子可以增加抗體在活體內之半衰期，及/或降低抗體之免疫原性及/或增進抗體跨上皮障壁至免疫系統之遞送。此類型之適合效應分子之實例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物，諸如WO05/117984中描述之化合物。 在一個實施例中，由與IgE或抗-人類IgE抗體無關的效應分子提供之半衰期係有利的。 在效應分子係聚合物之情況下，其一般可以為合成或天然存在之聚合物，例如視情況經取代之直鏈或分支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧化烯聚合物，或者分支或未分支多醣，例如同多醣或雜多醣。 可存在於以上提及之合成聚合物上的特定可選取代基包括一或多個羥基、甲基或甲氧基。 合成聚合物之具體實例包括視情況經取代之直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是視情況經取代之聚(乙二醇)，諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。 特定天然存在之聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、聚葡萄糖、肝糖或其衍生物。 在一個實施例中，聚合物係白蛋白或其片段，諸如人類血清白蛋白或其片段。在一個實施例中，聚合物係PEG分子。 如本文關於偶聯物所使用，「衍生物」意欲包括反應性衍生物，例如硫醇選擇性反應基團，諸如順丁烯二醯亞胺及其類似物。反應性基團可以直接或經由連接子區段連接至聚合物。應理解，此類基團之殘基在一些情況下將作為抗體片段與聚合物之間的鍵聯基團而形成產物之一部分。 天然或合成聚合物之大小可按需要變化，但一般將在500Da至50000Da、例如5000至40000Da，諸如20000至40000Da之平均分子量範圍內。特定言之，聚合物大小可以基於產物之預定用途，例如定位至某些組織，諸如腫瘤，或延長循環半衰期之能力進行選擇(有關評述，參見Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545)。因此，舉例而言，在產物意欲離開循環且滲透組織，例如用於治療腫瘤之情況下，宜使用例如分子量為大約5000Da之小分子量聚合物。對於產物保留在循環中之應用，宜使用例如分子量在20000Da至40000Da範圍內的較高分子量聚合物。 適合聚合物包括聚伸烷基聚合物，諸如聚(乙二醇)或尤其是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其分子量在約15000 Da至約40000 Da範圍內的聚合物。 在一個實例中，用於本發明中之抗體連接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一個特定實例中，抗體係抗體片段且PEG分子可以經由位於抗體片段中的任何可用胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基，例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇、羥基或羧基附接。此類胺基酸可以天然存在於抗體片段中或可以使用重組DNA方法工程改造至片段中(參見例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、WO2008/038024)。在一個實例中，本發明之抗體分子係經修飾之Fab片段，其中該修飾係將一或多個胺基酸添加至其重鏈之C末端以允許附接效應分子。適當地，附加之胺基酸形成含有一或多個可以供效應分子附接之半胱胺酸殘基的經修飾鉸鏈區。多個位點可以用於附接兩個或兩個以上PEG分子。 適當地，PEG分子經由位於抗體片段中的至少一個半胱胺酸殘基之硫醇基共價連接。附接至經修飾抗體片段的每個聚合物分子可以共價連接至位於該片段中之半胱胺酸殘基之硫原子。共價鍵一般為二硫鍵或尤其是硫-碳鍵。在使用硫醇基作為附接點之情況下，可以使用適當活化之效應分子，例如硫醇選擇性衍生物，諸如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸衍生物。可以使用活化聚合物作為製備如上所述的聚合物修飾之抗體片段中的起始物質。 活化聚合物可為含有硫醇反應性基團之任何聚合物，該硫醇反應性基團諸如α-鹵基羧酸或酯，例如碘乙醯胺、醯亞胺(例如順丁烯二醯亞胺)、乙烯基碸或二硫化物。此類起始物質可以商購得到(例如購自Nektar，以前為Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA)或可以使用習知化學程序由市售起始物質製備。特定PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可獲自Nektar，以前為Shearwater；Rapp Polymere；以及SunBio)及M-PEG-SPA (可獲自Nektar，以前為Shearwater)。 在一個實施例中，抗體係經修飾之Fab片段、Fab'片段或diFab，其例如根據EP 0948544或EP1090037中揭示之方法聚乙二醇化，亦即，共價附接PEG (聚(乙二醇))[亦參見「Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications」, 1992, J. Milton Harris (編), Plenum Press, New York, 「Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications」, 1997, J. Milton Harris及S. Zalipsky (編), American Chemical Society, Washington DC, 以及「Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」, 1998, M. Aslam及A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]。在一個實例中，PEG附接至鉸鏈區中之半胱胺酸。在一個實例中，經PEG修飾之Fab片段具有共價連接至經修飾鉸鏈區中之單一硫醇基的順丁烯二醯亞胺基團。離胺酸殘基可以共價連接至順丁烯二醯亞胺基且離胺酸殘基上之胺基分別可以附接分子量為大約20,000Da之甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，附接至Fab片段之PEG的總分子量可為大約40,000Da。 特定PEG分子包括經N,N'-雙(甲氧基聚(乙二醇) MW 20,000)修飾之離胺酸之2-[3-(N-順丁烯二醯亞胺基)丙醯胺基]乙基醯胺，亦稱為PEG2MAL40K (可獲自Nektar，先前為Shearwater)。 PEG連接子之替代來源包括NOF，其供應GL2-400MA3 (其中以下結構中之m係5)及GL2-400MA (其中m係2)且n係大約450：
Figure TW201802114AD00001
m係2或5 換言之，各PEG係約20,000Da。 因此，在一個實施例中，PEG係2,3-雙(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-{[3-(6-順丁烯二醯亞胺基-1-側氧基己基)胺基]丙氧基}己烷(帶2臂分支之PEG,-CH2)3NHCO(CH2)5-MAL，Mw 40,000，稱為SUNBRIGHT GL2-400MA3。 以下類型之其他替代PEG效應分子：
Figure TW201802114AD00002
係獲自Dr Reddy、NOF及Jenkem。 在一個實施例中，提供聚乙二醇化(例如含本文所描述之PEG)之本發明抗體，該PEG係經由在該鏈中胺基酸226處或附近，例如在重鏈之胺基酸226(根據依序編號)處或附近的半胱胺酸胺基酸殘基附接。 在一個實施例中，本發明提供一種Fab'PEG分子，其包含一或多個PEG聚合物，例如1或2個聚合物，諸如一或多個40kDa聚合物。 根據本發明之Fab'-PEG分子尤其有利，因為其具有與Fc片段無關之半衰期。在一個實例中，本發明提供一種治療藉由調節人類IgE生物活性改善之疾病的方法，該方法包含投與治療有效量之抗-IgE抗體或其抗原結合劑，其中該抗體或其抗原結合劑之半衰期與Fc結合至IgE無關。 在一個實施例中，提供偶聯至諸如PEG分子、澱粉分子或白蛋白分子之聚合物的Fab'。 在一個實施例中，提供偶聯至諸如PEG分子、澱粉分子或白蛋白分子之聚合物的scFv。 在一個實施例中，抗體或片段偶聯至澱粉分子，例如以增加半衰期。將澱粉偶聯至蛋白質之方法如US 8,017,739中所述，其以引用的方式併入本文中。聚核苷酸 本發明亦提供一種分離之DNA序列，其編碼本發明抗體分子之重鏈及/或輕鏈。適合地，DNA序列編碼本發明抗體分子之重鏈或輕鏈。本發明之DNA序列可以包含合成DNA(例如藉由化學加工產生的DNA)、cDNA、基因組DNA或其任何組合。 編碼本發明抗體分子之DNA序列可以藉由熟習此項技術者熟知的方法獲得。舉例而言，編碼抗體重鏈及輕鏈之一部分或全部的DNA序列可以按需要自確定之DNA序列或基於相應胺基酸序列合成。 編碼接受體構架序列之DNA係熟習此項技術者廣泛可得的且容易基於其已知之胺基酸序列合成。 可以使用分子生物學之標準技術製備編碼本發明抗體分子之DNA序列。所需DNA序列可以完全或部分使用寡核苷酸合成技術合成。適當時，可以使用定點突變誘發及聚合酶鏈反應(PCR)技術。 本發明亦關於一種選殖或表現載體，其包含一或多個本發明之DNA序列。因此，提供一種選殖或表現載體，其包含一或多個編碼本發明抗體之DNA序列。適當地，選殖或表現載體包含分別編碼本發明抗體分子之輕鏈及重鏈的兩個DNA序列，及適合信號序列。在一個實例中，該載體在重鏈與輕鏈之間包含基因間序列(參見WO03/048208)。 可以用於構建載體之通用方法、轉染方法及培養方法係熟習此項技術者熟知的。就此而言，參看「Current Protocols in Molecular Biology」, 1999, F. M. Ausubel (編), Wiley Interscience, New York及由Cold Spring Harbour Publishing出版的Maniatis Manual。表現抗 - IgE 抗體或其片段之宿主細胞 亦提供一種宿主細胞，其包含一或多個選殖或表現載體，該一或多個選殖或表現載體包含一或多個編碼本發明抗體之DNA序列。任何適合的宿主細胞/載體系統均可以用於表現編碼本發明抗體分子之DNA序列。可以使用細菌，例如大腸桿菌，及其他微生物系統，或者亦可使用真核宿主細胞表現系統，例如哺乳動物宿主細胞表現系統。適合的哺乳動物宿主細胞包括CHO、骨髓瘤或融合瘤細胞。 用於本發明中之中國倉鼠卵巢(CHO細胞)的適合類型可以包括CHO及CHO-K1細胞，包括dhfr- CHO，諸如可以與DHFR選擇性標記物結合使用之CHO-DG44細胞及CHO-DXB11細胞，或者可以與麩醯胺酸合成酶選擇性標記物結合使用之CHOK1-SV細胞。用於表現抗體之其他細胞類型包括淋巴細胞株，例如NSO骨髓瘤細胞及SP2細胞、COS細胞。其他適合細胞可以包括此項技術中已知之人胚腎(hek)纖維母細胞，例如hek293F及ExpiHek細胞。 對於本發明之全長Ab，CHO較佳，因為其係產生奧馬珠單抗之標準宿主(在一個實施例中，賦予本發明抗體奧馬珠單抗之標準糖基化模式)[亦參見WO 2013/181577]。產生抗 - IgE 抗體或其片段 本發明亦提供一種用於產生根據本發明之抗體分子的方法，其包含在適於自編碼本發明之抗體分子的DNA表現蛋白質之條件下培養含有本發明之載體的宿主細胞，及分離該抗體分子。 該抗體分子可以僅包含重鏈或輕鏈多肽，在此情況下僅需要使用重鏈或輕鏈多肽編碼序列轉染宿主細胞。為產生包含重鏈與輕鏈之產物，細胞株可以用兩個載體轉染，第一載體編碼輕鏈多肽且第二載體編碼重鏈多肽。或者，可以使用單一載體，該載體包括編碼輕鏈及重鏈多肽之序列。 提供一種用於培養宿主細胞且表現抗體或其片段，分離該抗體或其片段且視情況對其進行純化以提供分離之抗體或片段的方法。在一個實施例中，該方法進一步包含將效應分子偶聯至該分離之抗體或片段，例如特定言之，如本文所描述偶聯至PEG聚合物的步驟。 在一個實施例中，提供一種用於純化抗體(尤其是根據本發明之抗體或片段)的方法，其包含以下步驟：以非結合模式進行陰離子交換層析，使得雜質保留在管柱上且抗體溶離。 在一個實施例中，純化採用在蛋白質A管柱上進行親和捕捉且接著滴定。在一個實施例中，純化採用在蛋白質G管柱上進行親和捕捉，且接著HPLC滴定。在一個實施例中，純化採用在IgE管柱上進行親和捕捉，且接著滴定。 在一個實施例中，純化採用汽巴藍或類似物來純化白蛋白融合物或偶聯物分子。 用於該方法的適合離子交換樹脂包括Q.FF樹脂(由GE-Healthcare供應)。該步驟可以例如在約pH 8下進行。 該方法可以進一步包含採用陽離子交換層析之初始捕捉步驟，該步驟例如在約pH 4至5，諸如4.5下進行。陽離子交換層析可以例如採用樹脂，諸如CaptoS樹脂或SP瓊脂糖凝膠FF (GE-Healthcare供應)。接著，可以採用離子鹽溶液，諸如濃度例如為200 mM氯化鈉自樹脂溶離抗體或片段。 因此，適當時，層析步驟可以包括一或多個洗滌步驟。 純化方法亦可包含一或多個過濾步驟，諸如透濾步驟或HPLC過濾步驟。 因此，在一個實施例中，提供一種純化之抗-IgE抗體或片段，例如人類化抗體或片段，尤其是根據本發明之抗體或片段，其呈實質上純化之形式，特定言之，不含或實質上不含內毒素及/或宿主細胞蛋白質或DNA。 如上文使用之純化意圖指至少90%純度，諸如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% w/w或更純。 實質上不含內毒素一般意圖指每毫克抗體產物1 EU或更低之內毒素含量，諸如每毫克產物0.5或0.1 EU。 實質上不含宿主細胞蛋白質或DNA一般意圖指每毫克抗體產物400 μg或更低宿主細胞蛋白質及/或DNA含量，諸如每毫克100 μg或更低，尤其是適當時每毫克20 μg。醫藥組合物 因為本發明之抗體可用於治療及/或預防病理性病狀，所以本發明亦提供一種醫藥或診斷組合物，其包含本發明之抗體或抗原結合劑，及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。因此，提供本發明之抗體或抗原結合劑用於製造藥物之用途。該組合物通常將作為通常包括醫藥學上可接受之載劑的無菌醫藥組合物之一部分供應。本發明之醫藥組合物可以另外包含醫藥學上可接受之賦形劑。 本發明亦提供一種用於製備醫藥或診斷組合物之方法，其包含添加及混合本發明之抗體或抗原結合劑與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。 抗體或抗原結合劑可以為該醫藥或診斷組合物中之唯一活性成分，或者可以伴隨有其他活性成分，包括其他抗體成分或非抗體成分，諸如類固醇或其他藥物分子，尤其是半衰期與IgE結合無關的藥物分子。 醫藥組合物宜包含治療有效量的本發明之抗體或抗原結合劑。如本文所使用，術語「治療有效量」係指治療、改善或預防靶疾病或病狀，或展現可偵測之治療或預防效果所需要的治療劑之量 對於任何所揭示之抗體或抗原結合劑，可以最初在細胞培養分析中或在動物模型中，通常在嚙齒動物、兔、狗、豬或靈長類動物中估計治療有效量。亦可使用動物模型確定投藥的適當濃度範圍及途徑。該資訊可以隨後用於確定可用於投與人類之劑量及途徑。 用於人類個體之精確治療有效量將取決於疾病狀態之嚴重程度、個體之整體健康狀況、個體之年齡、體重及性別、飲食、投與之時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法之耐受性/反應。此量可以藉由常規實驗確定且在臨床醫師之判斷內。一般而言，治療有效量將為0.01 mg/kg至500 mg/kg，例如0.1 mg/kg至200 mg/kg，諸如100 mg/Kg。醫藥組合物宜以每劑含有預定量之本發明活性劑的單位劑型呈現。 根據本發明之抗體或抗原結合劑之治療劑量在活體內不顯示明顯毒理學作用。 有利地，藉由投與連續劑量的根據本發明之抗體或結合劑，在活體內之IgE活性水準可以維持在適當降低之程度。 組合物可以個別投與患者，或可以與其他藥劑、藥物或激素組合投與(例如同時、依序或分開)。 醫藥組合物亦可含有供投與抗體或抗原結合劑用的醫藥學上可接受之載劑。載劑本身不應誘導產生對接收組合物之個體有害的抗體且不應具有毒性。適合載劑可以為緩慢代謝的較大巨分子，諸如蛋白質、多肽、脂質體、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚胺基酸、胺基酸共聚物及非活性病毒粒子。 可以使用醫藥學上可接受之鹽，例如無機酸鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽及硫酸鹽；或有機酸之鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽及苯甲酸鹽。 治療組合物中之醫藥學上可接受之載劑可以另外含有液體，諸如水、生理食鹽水、甘油及乙醇。另外，在此類組合物中亦可存在輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝物質。此等載劑使得醫藥組合物能夠調配成錠劑、丸劑、糖衣藥丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液及懸浮液，以便患者攝入。 較佳的投與形式包括適於非經腸投與之形式，例如藉由注射或輸注，例如藉由快速注射或連續輸注投與之形式。在產物用於注射或輸注之情況下，其可以呈於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式且其可以含有調配劑，諸如懸浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑。或者，抗體分子可以呈乾燥形式，在使用之前用適當無菌液體復原。 一旦調配好，本發明之組合物即可直接投與個體。待治療之個體可以係動物。然而，組合物較佳適於投與人類個體。 本發明之醫藥組合物可以藉由多種途徑投與，包括(但不限於)經口、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、室內、透皮、經皮(例如參見WO98/20734)、皮下、腹膜內、鼻內、經腸、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。亦可使用無針注射器投與本發明之醫藥組合物。 通常，治療組合物可以製備成呈液體溶液或懸浮液形式之可注射劑形式。亦可製備適於在注射前溶解或懸浮於液體媒劑中之固體形式。 組合物之直接遞送一般係藉由皮下(特定言之)、腹膜內、靜脈內或肌肉內注射實現，或遞送至組織間隙。組合物亦可投至病變中。劑量治療可以為單劑量方案或多劑量方案。 應理解，組合物中之活性成分將為抗體分子。由此其將易於在胃腸道中降解。因此，若打算藉由利用胃腸道之途徑投與組合物，則組合物將需要含有這樣一類試劑，該等試劑保護抗體免於降解，但在其自胃腸道吸收後，即釋放抗體。 有關醫藥學上可接受之載劑的完整論述可見於雷明頓氏藥學大全(Remington's Pharmaceutical Sciences) (Mack Publishing Company, N.J. 1991)。結構 - 功能特性 在本發明之一個態樣中，該抗體或抗原結合劑結合至游離及FcɛRI結合之人類IgE。當本發明之抗體(或抗原結合劑)結合至FcɛRI結合之人類IgE時，其使IgE之構形穩定。在此類穩定構形中，IgE對FcɛRI或奧馬珠單抗(或其片段)之結合親和力比無本發明之抗體或抗原結合劑存在下之情形要弱且其中FcɛRI結合之人類IgE自FcɛRI解離。較佳地，IgE在自FcɛRI解離時仍結合至如本文中所描述之抗體或抗原結合劑。如下文(例如實例1及圖2中)所示，本發明之抗體或抗原結合劑結合至構形不同於當結合至奧馬珠單抗IgE所具有之構形的IgE。 不希望受理論束縛，本發明抗體使IgE呈現部分彎曲之構形(圖2C以及5C及5D)，因此自游離或FcɛRI結合之IgE結構伸直。此類伸直損害了IgE結合FcɛRI或保持結合FcɛRI之能力。如實例部分中所示，由於本發明抗體與IgE上之結合位點競爭結合至FcɛRI，故咸信該抗體能夠與結合至FcɛRI之IgE形成複合物，從而改變IgE在結合至FcɛRI時之結構且將其自FcɛRI解離。具有此等特性的根據本發明之抗體係本文所描述之抗體，諸如包含以下之抗體或抗原結合劑： a.含SEQ ID NO: 1之重鏈可變區及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含： i. SEQ ID NO: 109；或 ii. SEQ ID NO: 113；或 iii. SEQ ID NO: 121；或 iv. SEQ ID NO: 132；或 v. SEQ ID NO: 139；或 b. SEQ ID NO: 5及 i. SEQ ID NO: 24，其中S77及S79經Q置換； ii. SEQ ID NO: 117；或 iii. SEQ ID NO: 125；或 iv. SEQ ID NO: 136；或 v. SEQ ID NO: 143。 具有此類特性之抗-IgE抗體或抗原結合劑接觸參照SEQ ID NO:108包含人類IgE Cε3結構域之殘基T373、W374、S375、R376、A377、S378、G379、P381、Q417、C418、R419、P426、R427、A428及Cε2結構域之殘基D278及T281的抗原決定基，或接觸該抗原決定基且對其具有特異性。 本發明之抗體在若干位置處具有甲硫胺酸殘基。氧化甲硫胺酸殘基係最常見之蛋白質降解路徑。參照SEQ ID NO: 20，在S64位及S71位引入了甲硫胺酸殘基的本發明之抗體可以在不影響該抗體加速IgE-Fc:sFcRIα複合物解離之能力的情況下，經歷完整氧化。 因此，本發明亦提供一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1之重鏈可變區及包含CDR-L2及FW-L3之輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO: 20，不過該CDR-L2具有胺基酸序列SEQ ID NO: 50且該FW-L3具有胺基酸序列SEQ ID NO: 131或138，其中參照SEQ ID NO: 20，在64及/或71位之甲硫胺酸殘基經氧化。 本發明亦提供一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1之重鏈可變區及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 132或139之輕鏈可變區，其中參照SEQ ID NO: 132或139，在64及/或71位之甲硫胺酸殘基經氧化。 本發明之抗體中的其他甲硫胺酸殘基可以在不影響該抗體加速IgE-Fc:sFcRIα複合物解離之能力的情況下經氧化。現將參照附圖中示出的實施例，藉助於實例進一步描述本發明。實例 實例 1 ： 結合至 IgE - Fc 之 治療性抗 - IgE 抗體奧馬珠單抗突變體的結構揭露其作用機制 摘要 免疫球蛋白E及其與受體FcɛRI及CD23的相互作用在過敏性疾病起到關鍵作用。奧馬珠單抗，一種臨床上批准之治療性抗體，抑制IgE與FcɛRI之間的相互作用，防止肥大細胞及嗜鹼性球活化，且阻止IgE結合至CD23。已解析出奧馬珠單抗源性Fab與IgE-Fc之間之2:1複合物的晶體結構，其中一個Fab結合至各Cɛ3結構域(且僅一個Fab結合至Cɛ2結構域)。儘管游離IgE-Fc在溶液中主要呈尖銳地彎曲，但在複合物中，其僅部分彎曲，由此妨礙與FcɛRI之相互作用；CD23之結合由於在各Cɛ3結構域上之結合位點重疊而在空間上受抑制。溶液態相互作用分析展示出抑制兩種受體相互作用之正構及變構基礎，並結合該結構一起揭露出奧馬珠單抗(且尤其是所描述之奧馬珠單抗突變體)如何利用IgE之固有動力學及變構潛能加速受體結合之IgE自FcɛRI之解離。引言 免疫球蛋白E(IgE)抗體經由其Fab臂結合至過敏原且藉由結合至Fc區之受體表現其效應功能，由此在過敏性疾病中起到重要作用1 。兩種主要的IgE受體係FcɛRI及CD23/FcɛRII，通常分別稱為高親和力受體及低親和力受體。在肥大細胞及嗜鹼性球上，IgE緊密地結合至FcɛRI (KD ≈10- 10 M- 1 )以致此類細胞僅需要存在過敏原交聯IgE/FcɛRI複合物即經預先結合之IgE敏化，且引起即時反應。CD23係同三聚體且因此可以藉由在結合至免疫複合物中聚集之IgE時的親合力效應來增強每個IgE結合之C型類凝集素「頭部」結構域固有地較低親和力(KD ≈10- 7 M- 1 )，近似地匹配FcɛRI對IgE之親和力2 。B細胞上表現之CD23參與IgE調控，且在氣管及腸上皮細胞上之表現將介導IgE/過敏原複合物之穿胞運輸1 , 2 。FcɛRI及CD23亦均在一系列抗原呈遞細胞上表現。因此，過敏性反應之多個方面牽涉到IgE-受體相互作用且長期以來，IgE係治療干預之靶3 。 IgE之Fc區包含二硫化物連接的以下三個結構域之二聚體：Cɛ2、Cɛ3及Cɛ4。針對嵌合IgE之早期FRET研究4 , 5 及針對IgE-Fc之X射線溶液散射研究6 指示一種緊湊的彎曲結構，且後來的IgE-Fc之晶體結構揭露一種尖銳且不對稱的彎曲構形，其中(Cɛ2)2 結構域對向後摺疊至Cɛ3及Cɛ4結構域上7 。該彎曲定義為(Cɛ2)2 結構域對之局部雙重軸與Fcɛ3-4(僅包含Cɛ3及Cɛ4結構域之區域)之局部雙重軸之間的角度，已發現在結合至sFcɛRIα(受體之IgE結合α鏈之可溶細胞外結構域)之IgE-Fc之晶體結構中，該彎曲變得甚至更尖銳(62°至54°)8 。近期利用N末端及C末端標記之IgE-Fc進行的FRET研究確定此種在sFcɛRIα結合時增大之彎曲9 。 FcɛRI結合位點跨越Cɛ2鄰近區域中之兩個Cɛ3結構域8 , 10 ，但不直接涉及Cɛ2結構域；兩條鏈之接合說明1:1之結合化學計算量。相比之下，兩個CD23分子結合至IgE-Fc，一個在各鏈中，且另一個在Cɛ3結構域之Cɛ4近端11,12,13 。CD23結合亦使IgE-Fc之構形變化14 ，但並非顯著影響彎曲之構形9 。然而，相較於游離IgE-Fc，在與CD23之可溶頭部結構域(sCD23)之複合物中Cɛ3結構域相對「封閉」之安置與FcɛRI結合所需的此等結構域之較「開放」佈置不相容。此部分解釋了FcɛRI及CD23結合之相互排斥11 , 12 ，不過諸如局部構形變化及構形動力學改變15 之類其他因素亦可能促進該兩個受體結合位點之間的變構通信2 。 近來經由研究IgE-Fc與抗-IgE-Fc Fab (稱為aɛFab)之複合物發現IgE-Fc具有極大的柔性程度16 。兩個aεFab分子以對稱方式結合至IgE-Fc，一個在各Cɛ3結構域上，俘獲完全伸展之構形，其中(Cɛ2)2 結構域與Fcɛ3-4區域之局部雙重軸幾乎一致。有關在溶液中形成複合物之分析，以及對游離IgE-Fc之分子動力學模擬表明，(Cɛ2)2 結構域對可以自Fcɛ3-4區域之一側「翻轉」至另一側16 。利用此抗-IgE抗體穩定的IgE-Fc構形與FcɛRI結合不相容，由此解釋其抑制活性。 奧馬珠單抗係批准用於治療應用之抗-IgE單株IgG1抗體(Xolair®, Novartis)17 。其結合至游離IgE且抑制FcɛRI及CD23結合兩者；結合位點已藉由肽抑制及分子建模而定位至Cɛ3結構域18 , 19 ，但其作用機制仍未知。然而，結合至FRET標記之IgE-Fc指示微小的伸直程度9 且因此有變構而非直接抑制之可能。 近來發現有效地破壞預先形成之IgE/FcɛRI複合物的一類抑制劑：發現經設計錨蛋白重複蛋白(D esignedA nkyrinR epeatP rotein ，DARPin)結合至受體結合之IgE的Cɛ3結構域且加速其自FcɛRI解離20 。受工程改造之二硫鍵限制的DARPin E2_79與Fcɛ3-4分子之2:1複合物的晶體結構揭露結合位點之性質及位置，但其作用機制仍不清楚。隨後報導，奧馬珠單抗可以類似方式促進FcɛRI結合之IgE解離，不過僅僅在大體上大於治療應用中所實現之濃度的極高濃度下實現21,22 。 此處報導了IgE-Fc與新抗體片段，即來源於奧馬珠單抗之Fab(奧馬珠單抗Fab3)之間之複合物的晶體結構，該Fab在抗原(IgE-Fc)結合互補決定區(CDR)之遠端含有三個點突變。參照SEQ ID NO: 125，該等突變係S81R、Q83R及L158P(或參照SEQ ID NO: 129，S77R、Q79R及L154P)。該複合物之結構揭露奧馬珠單抗之作用機制，且溶液研究展示此機制利用IgE之固有動力學。結果 儘管付出大量努力，但有關IgE-Fc與奧馬珠單抗Fab之複合物之結晶試驗僅引起Fab片段之選擇性結晶。其他試驗已類似地報導無法使此複合物結晶23 。因此，設計出一種新抗體，即來源於奧馬珠單抗之Fab，其具有三個點突變，兩個在VL 結構域構架區中(Ser81Arg、Gln83Arg)且一個在Cκ結構域中(Leu158Pro)(SEQ ID NO: 125，PDB編號)(圖1)，旨在破壞在奧馬珠單抗Fab晶體結構中所觀察到的有利晶體接觸(結果於別處報導)。此奧馬珠單抗源性Fab稱為「奧馬珠單抗Fab3」。IgE - Fc / 奧馬珠單抗 Fab3 複合物之整體結構 以3.7Å解析度測定IgE-Fc與奧馬珠單抗Fab3之間之複合物的晶體結構(圖2A)。兩個奧馬珠單抗Fab3分子(Fab1 及Fab2 )結合至部分彎曲之不對稱IgE-Fc分子，每個Fab接合一個Cɛ3結構域(圖2B及2C)。Fab1 接合IgE-Fc之B鏈之Cɛ3結構域，而Fab2 接合IgE-Fc之A鏈之Cɛ3結構域。由於呈複合物形式的IgE-Fc之部分彎曲的構形，故Fab2 之輕鏈亦與來自IgE-Fc之B鏈之Cɛ2結構域形成微小相互作用(關於此相互作用之詳情，參見此實例下文)。IgE - Fc 與 奧馬珠單抗 Fab3 之間之界面 每個奧馬珠單抗Fab3分子接合Cɛ3結構域暴露面之一個邊緣(FcɛRI受體結合之FG環之C、C'、F及G股，以及鹼基)。涉及奧馬珠單抗Fab3之重鏈及輕鏈，該重鏈構成約715Å2 之界面面積之約60%(圖2及3)。 在兩個界面之間略有不同的奧馬珠單抗Fab3重鏈(SEQ ID NO: 5)接觸可以概括如下：Gly32及Tyr33(CDRH1)與Ala377及Ser378(Cɛ3)(IgE-Fc序列如SEQ ID NO: 108及圖16中所示)形成凡得瓦爾相互作用，而Tyr54(CDRH2)接觸Gly379-Pro381(Cɛ3)。當與未結合之Fab結構相比較時，CDRH3殘基貢獻最大接觸面積，且在形成複合物時經歷相當大的構形變化(未公開之結果，19 , 23 )。CDRH3殘基Ser100、His101、Tyr102及Trp 106均與Cɛ3結構域殘基形成凡得瓦爾相互作用，該等Cɛ3結構域殘基包括Ser375-Gly379、Gln417及Arg419(Cɛ3)。然而，此界面部分的最顯著特徵係與Phe103(CDRH3)相互作用。Phe103大部分埋於由Thr373、Trp374主鏈、Ser375、Gln417及Arg419(Cɛ3)產生之袋中，並與Arg419形成陽離子/π堆疊相互作用(圖3)。 Arg419(Cɛ3)亦在與奧馬珠單抗Fab3輕鏈(SEQ ID NO: 125)之相互作用中起關鍵作用(圖3)。Arg419(Cɛ3)除接觸Asp32、Asp34及Tyr36側鏈(與Tyr36羥基形成氫鍵)外，還在Tyr31(CDRL1)及Asp32(CDRL1)主鏈羰基氧原子之氫鍵結距離內。Asp32亦與Thr373及Thr421(Cɛ3)形成凡得瓦爾相互作用。相比之下，僅兩個CDRL2殘基構成界面：Tyr53(CDRL2)接觸Gln417(Cɛ3)，且Tyr53及Tyr57兩者與Met430(Cɛ3)形成凡得瓦爾相互作用；Tyr57亦與Met430主鏈形成氫鍵。對於重鏈相互作用，Fab1 與Fab2 之輕鏈接觸存在微小差異。奧馬珠單抗 Fab3 上 CDR 接觸殘基編號 - 呈 ( pdb / Kabat / Chothia ) 形式 。 重鏈序列 ： SEQ ID NO: 5 ； 輕鏈序列 : SEQ ID NO: 125 CDRH1：Ser (31/31/31)、Gly (32/32/31a)、Tyr (33/33/32) CDRH2：Tyr (54/53/53) CDRH3：Ser (100/96/96)、His (101/97/97)、Tyr (102/98/98)、Phe (103/99/99)、Trp (106/101B/101B) CDRL1：Asp (30/27C/30)、Tyr (31/27D/30A)、Asp (32/28/30B)、Gly (33/29/30C)、Asp (34/30/30D)、Tyr (36/32/32) CDRL2：Tyr (53/49/49)、Ser (56/52/52)、Tyr (57/53/53)、Ser (60/56/56) CDRL1及CDRH3具有相互作用中所涉及之大部分殘基，且因此表徵奧馬珠單抗如何結合IgE-Fc及其自身相對於IgE-Fc如何定向。CDRL3不涉及與IgE-Fc之結合。奧馬珠單抗 Fab3 界面與其他抗 - IgE 複合物之比較 Cε3結構域上用於奧馬珠單抗Fab與近來描述之DARPin E2_7920 的結合位點重疊(圖4)，且具有類似大小，分別為約715Å2 及約753Å2 。兩個界面之間共有的Cɛ3結構域殘基包括Ser375-Gly379、Gln417、Arg419、Arg427及Met430，但奧馬珠單抗Fab3與受體結合之Cɛ3 FG環形成較緊密的接觸，而DARPin E2_79界面在相反方向上延伸以包括Cɛ3-4結構域連接子。 奧馬珠單抗Fab3與DARPin E2_79之重疊結合位點明顯不同於近來關於奧馬珠單抗Fab3所描述之界面，其捕捉呈完全伸展之構形的IgE-Fc16 (圖5)。不僅奧馬珠單抗Fab3界面面積係奧馬珠單抗Fab3與DARPin E2_79之界面面積的約兩倍，為約1400Å2 ，而且奧馬珠單抗Fab3在Cɛ3中以Arg393為中心之位點處接合IgE-Fc，並且亦接觸Cɛ2結構域中之殘基及Cɛ2-Cɛ3連接子16 。另一抗-IgE抗體Fab，即MEDI4212與Fcɛ3-4之2:1複合物的晶體結構揭露Cɛ3結構域內供抗體接合之又一位點，此涉及N-鍵聯之寡醣部分之位點在Asn394處24 。IgE - Fc 當結合至奧馬珠單抗 Fab3 時呈現 部分彎曲之構形 IgE-Fc在溶液中主要係彎曲的5 , 6 , 9 , 25 ,26, 27 , 28 ，且游離IgE-Fc之晶體結構揭露一種尖銳地彎曲(62°)、不對稱構形，其中(Cɛ2)2 結構域對向後摺疊至Cɛ3及Cɛ4結構域上(圖5A及B)，一條鏈(B鏈)之Cɛ2結構域接觸另一條鏈(A鏈)之Cɛ4結構域7 , 8 。IgE-Fc在接合FcɛRIα時變成甚至更尖銳地彎曲(54°)8 , 9 ，且相關構形變化涉及A鏈之Cɛ3結構域與(Cɛ2)2 結構域對一起作為一個剛性單元遠離B鏈之Cɛ3結構域旋轉8 。 相對於IgE-Fc呈現完全伸展之線性構形的奧馬珠單抗Fab3複合物16 ，IgE-Fc在奧馬珠單抗Fab3複合物中呈現部分彎曲之構形(圖2C及5C&D)，與先前揭露奧馬珠單抗使IgE-Fc伸直的FRET研究相符9 。Fab1 所結合之位點在游離、尖銳彎曲之IgE-Fc中暴露出來，但使Fab2 佔據之位點可及需要將IgE-Fc進一步伸直至剛好超過90°。此在奧馬珠單抗Fab3複合物中IgE-Fc之伸直與兩個Cɛ3結構域之打開相關聯，由此產生幾乎對稱之Fcɛ3-4區域(圖2B)。(Cɛ2)2 結構域對係位於來自每條鏈的Cɛ3與Cɛ4結構域之間且不再與來自A鏈之Cɛ3結構域緊密地相關聯。 在近期探究IgE-Fc伸直成伸展結構之分子動力學模擬中，已發現在游離IgE-Fc之晶體結構中觀察到的尖銳彎曲之構形佔據最低能量池，同時亦觀察到對應於部分彎曲之IgE-Fc構形的另一不同且明確界定之能量池16 。奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物中IgE-Fc所呈現的部分彎曲之構形佔據此特殊能量池(圖6)。C ɛ 3 結構域在奧馬珠單抗 Fab3 / IgE - Fc 複合物中呈現明顯地開放構形 在IgE-Fc及Fcɛ3-4子片段之晶體結構中，Cɛ3結構域呈現一系列不同的取向7 , 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 16 , 24 , 29 ，一種與IgE結合至其兩種主要受體FcɛRI及CD23之變構調控有關的特性8 , 11 , 12 , 14 。已使用各Cɛ3結構域之間的距離以及其相對於Cɛ4結構域之位置描述所觀察的Fcɛ3-4區域之構形的種類29 (關於此等量測之完整說明在本實例中稍後提供)。在奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物中，Cɛ3結構域彼此間及與Cɛ4結構域係比含有IgE-Fc或Fcɛ3-4之任何其他晶體結構中相隔更遠地安置，且因此呈現迄今為止所觀察的最開放構形(圖5)；此構形的開放程度明顯大於FcɛRI結合之IgE-Fc的構形(圖7)。奧馬珠單抗 Fab3 對 Fc ɛ RI 及 CD23 受體結合之影響 奧馬珠單抗不僅抑制IgE-Fc與FcɛRI之間的相互作用，而且亦抑制IgE-Fc與CD23之間之相互作用30 。與後一情形相符，奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc及CD23/Fcɛ3-4複合物之比較11 揭露在Fcɛ3-4上的兩個CD23接合位點處奧馬珠單抗Fab3與CD23之間的碰撞。另外，Cɛ3結構域殘基Arg376、Ser378及Lys380參與奧馬珠單抗Fab3及CD23結合11,31 。 相對於CD23結合至IgE，FcɛRIα結合跨過兩個Cɛ3結構域。然而，在奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物中，Cɛ3結構域呈現的構形太開放而不允許同時接合兩條鏈(圖8)。另外，若又將奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc及sFcɛRIα/IgE-Fc複合物疊加於各Cɛ3結構域上，則可能在每種情況下發生空間碰撞。若疊加於A鏈之Cɛ3結構域上，則奧馬珠單抗Fab3 Fab2 將與FcɛRIα複合物中之(Cɛ2)2 結構域對碰撞，且奧馬珠單抗Fab3複合物中之Cɛ2-Cɛ3連接子將可能與FcɛRIα碰撞。若疊加於B鏈之Cɛ3結構域上，則奧馬珠單抗Fab3 Fab1 及Cɛ2-Cɛ3連接子(奧馬珠單抗Fab3複合物之連接子)均可能與FcɛRIα之間碰撞，不過Fab1 及FcɛRIα之結合位點實際上不重疊。 然而，奧馬珠單抗Fab3 CDRL1殘基係緊鄰FcɛRIα結合之Cɛ3結構域FG環安置。該環在B鏈中促進疏水性「脯胺酸夾心」相互作用，其中Cɛ3中之Pro426填充在FcɛRIα之兩個色胺酸殘基之間。Asp32(CDRL1)接觸Thr421，Gly33(CDRL1)接觸Pro426、Arg427及Ala428，且Asp34(CDRL1)接觸Arg427及Ala428。此等相互作用改變Cɛ3結構域FG環之位置且將進一步損害IgE與FcɛRI之結合。 近來，已報導奧馬珠單抗與FcɛRIα結合之IgE的結合21 , 32 ，不過基於IgE-Fc與sFcɛRIα8 及奧馬珠單抗Fab3之複合物之靜態晶體結構，很難看出奧馬珠單抗如何能接合FcɛRI結合之IgE。因此，研究了奧馬珠單抗Fab3與IgE-Fc之結合，且表徵奧馬珠單抗Fab3與IgE-Fc/FcɛRI複合物之間的相互作用。結果提供了對於奧馬珠單抗作用機制之瞭解。奧馬珠單抗 Fab3 與 IgE - Fc 在 溶液中之相互作用 以兩種不同方式，即藉由將奧馬珠單抗Fab3直接固定於表面上且結合IgE-Fc，或使奧馬珠單抗Fab3結合至SPR感測器表面上捕捉的His標記之IgE-Fc，來表徵IgE-Fc/奧馬珠單抗Fab3相互作用。使用抗-His標籤抗體(GE Healthcare)捕捉C末端經His標記之IgE-Fc構建體，且比較奧馬珠單抗Fab3、完整奧馬珠單抗及奧馬珠單抗Fab之結合特徵。不出意料的是，在競爭結合實驗中，全部三個分子均競爭相同結合位點且顯示大致類似的結合親和力(資料未示出)。奧馬珠單抗Fab3構建體展現的親和力略高於奧馬珠單抗Fab3及完整奧馬珠單抗(圖8A-C)。與晶體結構相符，兩個奧馬珠單抗Fab3分子結合至IgE-Fc：該結合明顯呈兩階段，即在低配位體濃度下觀察到的高親和力(約1 nM)相互作用，及在更高濃度下觀察到的第二(較弱)結合位點(約30 nM)(圖9A)。 夾心SPR實驗允許分別表徵該兩個IgE-Fc/奧馬珠單抗Fab3結合位點。使用此方法，將奧馬珠單抗Fab3共價固定於感測器表面上，且使IgE-Fc流動越過此表面。在低濃度下，在此等條件下，高親和力位點主導該相互作用，且結合曲線可以由單相相互作用動力學描述(KD 為約1 nM，kon 為約1.2×106 M- 1 s- 1 ，koff 為約8×10- 4 s- 1 )。接著可以使用此捕捉於SPR生物感測器表面上的1:1 IgE-Fc/奧馬珠單抗Fab3複合物量測第二奧馬珠單抗Fab3分子之結合，其結合明顯比第一個分子弱(KD 為約30 nM，kon 為約2×105 M- 1 s- 1 ，koff 為約6×10- 3 s- 1 )(圖9B)。奧馬珠單抗 Fab3 與 Fc ɛ RIα 結合位點之間之競爭及奧馬珠單抗 Fab3 / IgE - Fc / Fc ɛ RI α 複合物之形成 接下來研究奧馬珠單抗Fab3影響IgE-Fc與FcɛRIα之間之相互作用的能力。在溶液競爭結合實驗中，遞增濃度之奧馬珠單抗Fab3抑制IgE-Fc與FcɛRIα之結合(圖8D)。在機理上，奧馬珠單抗Fab3影響可用結合位點之數量(Bmax )及IgE-Fc/FcɛRIα相互作用之表觀KD 兩者；此係混合抑制機制特有的33 。Bmax 值減小指示變構抑制過程，且該相互作用之表觀親和力降低最常與直接競爭共有結合位點有關(亦即，正構抑制)，但亦可見於一些變構抑制劑。考慮到在晶體結構中觀察到的結合位點，奧馬珠單抗Fab3可能使用正構及變構兩種機制抑制IgE-Fc與FcɛRI之結合。 在許多出版物中已描述奧馬珠單抗與FcɛRIα結合位點之間之競爭，但始終將其解釋為關於相同(或重疊)結合位點之直接競爭。此解釋通常用於闡明奧馬珠單抗為何不能結合至細胞上之IgE-FcɛRI複合物。然而，據觀察，奧馬珠單抗Fab3可以高親和力與預先結合至FcɛRIα之IgE-Fc結合(圖9C，插圖)。其他研究已暗示奧馬珠單抗/IgE-Fc/FcɛRI複合物之存在21 , 32 ，但之前尚未以實驗方式表徵此複合物。資料顯示，儘管IgE-Fc與FcɛRIα之結合沒有顯著改變奧馬珠單抗Fab3對IgE-Fc之親和力，但其明顯地改變FcɛRIα結合之IgE-Fc分子群中奧馬珠單抗Fab3可用結合位點之數量。比較經由抗-His標籤抗體捕捉之IgE-Fc分子與由sFcɛRIα捕捉之IgE-Fc分子的KD 及Bmax 結合值，且發現相較於His標籤捕捉之IgE-Fc，FcɛRIα結合之IgE-Fc具有小於10%之奧馬珠單抗Fab3結合位點，正如預期，此顯示與2:1化學計算量相符之結合量(圖9C)。因此，與一般假設的不同，由於FcɛRIα與奧馬珠單抗結合位點重疊，故奧馬珠單抗不結合至經肥大細胞結合之IgE。實際上，FcɛRIα變構地作用於IgE-Fc，改變不同IgE-Fc構形之動態平衡16 ，使得FcɛRIα結合之IgE-Fc分子群中奧馬珠單抗結合位點之數量大體上減少。奧馬珠單抗 Fab3 介導 IgE - Fc / Fc ɛ RI α 複合物加速解離的機制 Kim等人20 報導，DARPin E2_79可以加速預先形成的IgE-FcɛRI複合物之分解。遵循著此觀察結果，Eggel等人21 隨後顯示，奧馬珠單抗亦可促進IgE自FcɛRI解離。與此等觀察結果類似，發現當奧馬珠單抗Fab3結合至IgE-Fc/FcɛRIα複合物時，其可以加速IgE-Fc自FcɛRIα解離(圖9D)，且奧馬珠單抗Fab3在此方面比奧馬珠單抗Fab高效，且要比完整奧馬珠單抗高效得多(圖10E)。一個Fab接合IgE-Fc/FcɛRIα複合物，但不加速IgE-Fc自FcɛRIα解離。引人注目的是，看來加速解離僅在佔據第二結合位點(亦即，低親和力位點)之後發生。(奧馬珠單抗Fab3)2 /IgE-Fc/FcɛRIα四分子複合物必須以此方式改變IgE-Fc之能量圖譜以明顯地降低IgE-Fc/FcɛRIα解離之能量障壁，從而快速解離此另外極穩定之複合物。奧馬珠單抗 Fab3 輕鏈與 C ɛ 2 結構域之間相互作用之詳情 在奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物中，一個Cɛ2結構域兩個突變殘基(Ser81Arg及Gln83Arg)形成約260Å2 之微小相互作用(相較於奧馬珠單抗Fab3與Cɛ3結構域之間約715Å2 之平均相互作用面積)。Pro158與IgE-Fc之間不存在接觸。 Fab2 輕鏈中之Arg81側鏈(奧馬珠單抗Fab3中之突變殘基之一；(SEQ ID NO: 125，PDB編號))抵靠B鏈Cɛ2結構域(SEQ ID NO: 108)中之Val277及Asp278填充。Ser80(奧馬珠單抗Fab3)抵靠Asp278、Leu279及Thr281(Cɛ2結構域)填充，而Ser64(奧馬珠單抗Fab3)抵靠Asp276及Asp278填充。Ser64及Ser80在奧馬珠單抗與奧馬珠單抗Fab3中相同。 在奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物中，由於Asp278(Cɛ2結構域)側鏈之無序，Arg83(奧馬珠單抗Fab3中之突變殘基之一)不明顯接觸Cɛ2結構域。然而，若Asp278側鏈係有序的，則可能在Arg83與Asp278之間形成氫鍵或鹽橋。結晶學確定的奧馬珠單抗 Fab3 / IgE - Fc 複合物之間之接觸 在晶體結構中在4Å內抗體與抗原之間之接觸通常指示抗原決定基/互補位界面。 在奧馬珠單抗Fab3重鏈和輕鏈CDR之4Å內的IgE-Fc殘基確定以下抗原決定基： T 373、W 374、S 375、R 376、A 377、S 378、G 379、P 381、Q 417、C 418、R 419、P 426、R 427、A 428 (在A鏈上)。 另外，在奧馬珠單抗Fab3輕鏈FR1及FR3殘基之4Å內的IgE-Fc殘基將抗原決定基延伸至： D 278、T 281(在B鏈-Cɛ2結構域上)[且在如實例5中所描述之分子動力學模擬期間揭露，與抗體之R18、S64、S80及R81接觸-及進一步與R83接觸]。 在晶體結構中5Å內抗體與抗原之間的接觸亦提供界定抗體/抗原界面之資訊。 在奧馬珠單抗Fab3重鏈及輕鏈CDR之5Å內的額外IgE-Fc殘基係：K380、M430(在A鏈上)。 另外，在奧馬珠單抗Fab3輕鏈FR1及FR3殘基之5Å內的額外IgE-Fc殘基係：D276、V277、L279、S280、A282(在B鏈-Cɛ2結構域上)[且進一步接觸FR1之G16及FR3之R65]。有關奧馬珠單抗 Fab3 / IgE - Fc 複合物中 C ɛ 3 結構域取向之分析 在分析Cɛ3結構域關於Cɛ4結構域之位置的一種方法中，使用了來自一條鏈之Cɛ3結構域中Asn394 Cα原子與來自另一條鏈之Cɛ4結構域中Lys497 Cα原子之間的原子間距離來描述Cɛ3結構域之「開放度」29 。Val336 Cα之間之原子間距離用於描述「擺動」，或Cɛ3結構域彼此之接近程度29 。 對於Cɛ3結構域呈現開放構形的FcɛRI結合之IgE-Fc及FcɛRI結合之Fcɛ3-4，「開放度」值在23.5-28.4Å範圍內，而「擺動」值係平均23.3Å8 , 10 。奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物之相應值對於「開放度」為平均29.5 Å，且對於「擺動」為平均29.4 Å。在奧馬珠單抗Fab3複合物中，Cɛ3結構域呈現迄今為止所描述的最開放構形(彼此相距最遠)。論述 已報導在3.7 Å解析度下IgE-Fc與來源於治療性抗-IgE抗體奧馬珠單抗之Fab片段之間之複合物的結構；此在構架區中遠離抗原結合位點處含有三個點突變的Fab片段稱為奧馬珠單抗Fab3。結構揭露兩個奧馬珠單抗Fab3分子與IgE-Fc形成複合物，一個結合至兩個Cɛ3結構域中之每一個(但僅一個Fab結合至Cɛ2結構域)，並闡明奧馬珠單抗抑制IgE與FcɛRI及CD23兩者之結合的能力。亦發現在奧馬珠單抗Fab3複合物中IgE-Fc呈現部分彎曲之構形，與先前使用FRET標記之IgE-Fc進行之研究相符，該研究指出相對於游離IgE-Fc略微伸直9 。 IgE-Fc在溶液中主要呈彎曲形式5 , 6 , 9 , 25 , 26 , 27 , 28 ，且在游離IgE-Fc之晶體結構中，(Cɛ2)2 結構域對抵靠Cɛ3及Cɛ4結構域向後摺疊7 , 8 。近來，當解析在IgE-Fc與抗-IgE-Fc Fab(aɛFab)之複合物中捕捉的完全伸展構形之結構時，明顯增進了對IgE-Fc之構形柔性的瞭解16 。探究IgE-Fc自尖銳地彎曲伸直成伸展構形的分子動力學模擬揭露對應於部分彎曲之構形的能量池(圖6)。此處報導的(Cɛ2)2 結構域對與Fcɛ3-4結構域之間之彎曲呈約90°的奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物對應於此模擬中之不同能量池16 。值得關注的是，奧馬珠單抗Fab3結合位點之位置將不妨礙進一步伸直成完全伸展之構形且因此IgE-Fc可能經歷相當大的構形變化，甚至是在與奧馬珠單抗形成複合物時。 除(Cɛ2)2 結構域對相對於Cɛ3及Cɛ4結構域彎曲外，各種IgE-Fc、Fcɛ3-4及受體複合物結構展示，Cɛ3結構域亦可以自封閉至開放呈現一系列相對取向7 , 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 16 , 24 , 29 。Cɛ3結構域之打開及閉合促進IgE-Fc中受體結合之變構調控11 , 12 ：在CD23複合物中，其係相對封閉的11 , 13 , 14 ，而在FcɛRI複合物中，其開放度較高8 , 10 。比較CD23/Fcɛ3-4與奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物之結構顯示，CD23與奧馬珠單抗位點重疊，且競爭結合實驗指示，奧馬珠單抗直接以正構方式抑制IgE與CD23之結合。 然而，FcɛRI結合之抑制要複雜得多。在奧馬珠單抗Fab3複合物中，Cɛ3結構域呈現的構形比在任何先前結構中所發現的構形要開放，開放度如此高以致IgE-Fc與FcɛRI之間相互作用的兩個子位點(一個涉及各Cɛ3結構域)不能同時接合。引起此抑制之另一原因可歸於奧馬珠單抗Fab3(Fab1 )分子與Cɛ3中受體結合之FG環之鄰近位置，該位置可以直接影響FcɛRIα之接觸殘基的構形。最後，即使在IgE-Fc上的奧馬珠單抗Fab3及FcɛRIα結合抗原決定基不嚴格地重疊，但若兩者同時結合，則可能存在空間碰撞。因此，晶體結構表明，奧馬珠單抗之抑制機制主要係變構抑制，但亦可能存在正構成分。 SPR研究能夠評估該兩個奧馬珠單抗Fab3結合位點之動力學及親和力。兩者親和力明顯地不同，其中KD 值為約1 nM及約30 nM，前者涉及較快締合速率常數(kon 為約2×106 M- 1 s- 1 ，與約2×105 M- 1 s- 1 形成對比)及略微較慢的解離速率常數(koff 為約2×10- 3 s- 1 ，與約6×10- 3 s- 1 形成對比)。由此可能推斷，較高的親和力相互作用對應於Fab1 之結合，其將不受阻礙地接近彎曲之IgE-Fc分子，而較低的親和力及較慢締合速率對應於Fab2 ，但對此並不確定。 研究奧馬珠單抗Fab3抑制IgE-Fc結合至FcɛRIα之機制的進一步SPR實驗揭露當與FcɛRIα形成複合物時IgE-Fc上奧馬珠單抗Fab3可利用之位點的數量減少(Bmax 降低)。奧馬珠單抗抑制IgE結合至FcɛRI常常以關於重疊位點之直接競爭來解釋，但據報導，奧馬珠單抗可以結合至受體結合之IgE21 , 32 。此處直接展示當IgE-Fc結合至FcɛRα時奧馬珠單抗Fab3能夠結合至IgE-Fc，形成三分子複合物。IgE-Fc預先結合至FcɛRIα之影響係將IgE-Fc上奧馬珠單抗Fab3結合位點之數量減少至小於游離IgE-Fc中可用結合位點數量之10%；此影響只能由變構調節引起。 奧馬珠單抗Fab3與IgE-Fc/FcɛRI複合物相互作用的性質提供了有關加速解離之機制的瞭解。此現象最先係關於DARPin報導且隨後關於奧馬珠單抗報導20 , 21 ，後者之濃度大體上高於在治療上使用之濃度22 ，且此處現針對奧馬珠單抗Fab片段顯示此現象。進一步展示解離僅在先結合第二(較低親和力)奧馬珠單抗Fab3分子之後發生。換言之，必須形成四分子複合物，即(奧馬珠單抗Fab3)2 /IgE-Fc/FcɛRIα，才會發生顯著加速解離。 基於用奧馬珠單抗Fab3、IgE-Fc及sFcɛRIα得到之觀察結果，設想出奧馬珠單抗、IgE及FcɛRI發生以下機制：IgE結合至FcɛRI，且在此等條件下，一小群此等結合之IgE分子呈現可以結合奧馬珠單抗分子之構形；當第二奧馬珠單抗分子結合以形成四聚體複合物時，IgE之能量圖譜改變，使得與FcɛRI之相互作用不穩定，且IgE迅速自FcɛRI解離。理解此機制之關鍵在於瞭解IgE能量圖譜之複雜性，及動態平衡中存在之不同構形狀態。 奧馬珠單抗之抑制活性看來利用了IgE之固有柔性，及至少對於加速解離過程而言，IgE/FcɛRI複合物之動力學。相較於其他抗體同型，IgE具有多種不常見的結構特徵，包括Cɛ2結構域之存在及獨特的構形動力學，即Cɛ3結構域之類熔球體特性34 。總體而言，此等特性建立一種變構通信路徑，該路徑防止CD23及FcɛRI之同時接合；此係避免藉由三聚體CD23分子交聯FcɛRI結合之IgE進行的不依賴於過敏原之肥大細胞活化必不可少的12 。對於膜結合之IgE B細胞受體，已提出與IgE之動力學有關的其他功能益處16 。有關奧馬珠單抗不利用預期之正構機制抑制IgE/FcɛRI相互作用的觀察結果指示，其亦利用IgE之不常見動力學特性，即其作為阻斷抗體之性能及其避免肥大細胞結合之IgE交聯的能力。最後，奧馬珠單抗可以藉由利用IgE即使在與其受體形成複合物時亦存在的變構形及固有柔性有效地將IgE自FcɛRI解離，即使在高於治療上使用之濃度下21 。方法 選殖、蛋白質表現及純化 . 如16 中所描述選殖、表現及純化奧馬珠單抗人類IgG1 Fab及奧馬珠單抗Fab3。如先前所描述35 產生IgE-Fc。IgE-Fc係根據SEQ ID NO: 108(根據Dorrington & Bennich(1978)Immunol. Rev. 41:3-25，V224-K547，但在IgE-Fc中插入以下突變以簡化糖基化模式：N265Q及N371Q)。奧馬珠單抗係購自Novartis Europharm Limited。藉由尺寸排阻層析純化2:1奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物，將其溶離至25 mM Tris-HCl pH7.5、20 mM NaCl及0.05% (w/v) NaN3 中，並濃縮至23 mg/mL。表面電漿子共振 . 在Biacore T200儀器(GE Healthcare)上進行SPR實驗。藉由使用胺偶合方案(GE Healthcare)，以＜300個共振單位之偶合密度共價偶合蛋白質，或使用抗-His感測器表面捕捉His標記之蛋白質，來製備特定表面。對於捕捉His標記之配位體，採用抗-His標籤單株抗體且根據製造商的說明書(Biacore His捕捉套組，GE Healthcare)固定。在結合實驗中，通常使用180-240秒之締合時間，且監測解離組分至少500秒。用20 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl及0.005%(v/v)界面活性劑P-20(GE Healthcare)構成之操作緩衝液以25μL min- 1 之流動速率進行注射。大部分實驗量測係在25℃下進行；部分夾心結合實驗係在5℃進行以便使加速解離現象減到最少。使用標準雙參照資料差分法(Standard double referencing data subtraction methods)36 且動力學擬合係使用Origin軟體(OriginLab)進行。 TR-FRET. IgE-Fc係藉由使含4 mg/mL蛋白質之100 mM碳酸氫鈉、50mM NaCl(pH 9.3)與5倍莫耳過量之鋱螯合劑異硫氰酸鹽(Invitrogen)反應來用供體螢光團標記。在攪動下，在室溫下培育3小時之後，藉由透析至PBS(20mM磷酸鹽緩衝生理食鹽水、150mM NaCl，pH 7.4)中來去除過量未反應之螢光團。sFcεRIα-IgG4 -Fc融合蛋白(α-γ)37 係藉由使3 mg/mL蛋白質與2.5倍莫耳過量之Alexa Fluor 647琥珀醯亞胺基酯(Invitrogen)在室溫下反應1小時來用接受體螢光團標記。藉由透析至PBS中來去除過量螢光團。 藉由使1nM鋱標記之IgE-Fc及0-20nM Alexa Fluor 647標記之sFcɛRα-IgG4 -Fc與一系列濃度之奧馬珠單抗Fab3競爭來進行TR-FRET抑制分析。在384孔hi-base白色盤(Greiner BioOne)中，使用Lanthascreen緩衝液(Invitrogen)作為稀釋劑進行分析。將該盤在室溫下培育隔夜且利用Artemis盤讀取器(Berthold Technologies)讀取。接著以在620 nm下供體之發射除在665 nm下接受體之發射並乘以10,000來計算每個孔的TR-FRET比率。 結晶. 使用沉滴式蒸氣擴散法，在18℃下生長呈矩形形態之晶體，其長度為至多400μm。儲集層含有50 μL 4%(w/v)PEG 8000及0.03M氟化鈉，且液滴含有100nL蛋白質及300nL儲集層。儘管在優化方面付出大量努力，但晶體之繞射品質無法進一步改良超出本研究使用之品質。晶體通常在數天之後開始生長，並且通常溶解於其液滴中，但可以在4M TMAO(三甲胺N-氧化物)中穩定，該TMAO成功地用作低溫保護劑。資料收集及處理 . 在金剛石光源(Harwell, UK)處，在光束線I02及I03下收集資料。如xia2套裝中所實施，使用XDS38 進行積分39 。該等晶體各向異性地繞射，且合併來自多個晶體之資料。用來自CCP4套件之AIMLESS將資料按比例調整至3.7Å解析度40 , 41 ，且接著使用UCLA繞射各向異性伺服器截斷至3.7Å(a*)、3.9Å(b*)及4.2Å(c*)之解析度界限值42 。對於呈不對稱單元的單一2:1奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物(分子質量係約170kDa)，Matthews係數之計算指示溶劑含量係約62%。結構測定、模型構建及精化 . 藉由使用來自PDB條目2wqr8 之蛋白質原子且以1.9Å解析度奧馬珠單抗Fab結構(未公開之結果)作為搜索模型，用來自CCP4套件40 之PHASER43 及MOLREP44 進行分子替代來解析結構。起初用REFMAC45 且隨後用PHENIX46 進行精化，且與在Coot 47 中手動模型構建交替進行。用MolProbity48 、POLYGON49 ，及PHENIX圖形介面50 內的其他驗證工具評估模型之品質。資料處理及精化統計學呈現於表1中。電子密度圖之區域顯示於圖11中。用PISA51 分析界面，且用PyMOL52 製圖。表 1 .資料處理及精化統計學
Figure TW201802114AD00003
 a 圓括號中之值係針對最高解析度殼層b 藉由資料截斷至3.7Å(a* )、3.9Å(b* )及4.2Å(c* )之解析度界限值來進行精化c Rfree 集合包含5%反射參考文獻 1. Gould, H.J., Sutton, B.J. IgE in allergy and asthma today. Nat. Rev. Immunol. 8,205-217 (2008). 2. Sutton, B.J., Davies, A.M. Structure and dynamics of IgE-receptor interactions: FcɛRI and CD23/FcɛRII. Immunol. Rev. 268,222-235 (2015). 3. Holgate, S.T. New strategies with anti-IgE in allergic diseases. World Allergy Organ. J. 7,17 (2014). 4. Holowka, D., Baird, B. Structural studies on the membrane-bound immunoglobulin E (IgE)-receptor complex. 2. Mapping of distances between sites on IgE and the membrane surface. Biochemistry 22,3475-3484 (1983). 5. Zheng, Y., Shopes, B., Holowka, D., Baird, B. Conformations of IgE bound to its receptor Fc epsilon RI and in solution. Biochemistry 30,9125-9132 (1991). 6. Beavil, A.J., Young, R.J., Sutton, B.J., Perkins, S.J. 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The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.1r1 Schrödinger, LLC.實例 2 ： 藉由 Biacore 量測 IgE - Fc 自固定之 sFcεRIα 的 加速解離 Biacore技術量測生物分子之間的相互作用，不需要標記。將相互作用物之一，稱為配位體，直接固定於或捕捉至感測器表面上，而另一相互作用物，稱為分析物，以溶液形式流動越過捕捉之表面。感測器偵測當分析物結合至配位體時及當分析物自配位體解離時在感測器表面處之質量變化。此等變化對應於締合及解離過程。在加速解離分析中，sFcɛRIα係配位體且經固定至感測器表面上。IgE-Fc係分析物且由sFcɛRIα捕捉。藉由緩衝液流動越過感測器表面或藉由IgE結合搭配物溶液流動越過感測器表面來監測IgE-Fc自sFcɛRIα之解離。該方法之詳情如下： 儀器：Biacore 3000, GE Healthcare AB, Uppsala, Sweden 感測器晶片：CM5。目錄號BR100399 BIA標準化溶液：70% (w/w)甘油。BIA維持套組之一部分。目錄號BR100651。該BIA維持套組係在4℃下儲存。 胺偶合套組：目錄號BR100633。將乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)於蒸餾水中製成75 mg/mL且以200 μl等分試樣在-70℃下儲存。將N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)於蒸餾水中製成11.5 mg/mL且以200 μl等分試樣在-70℃下儲存。乙醇胺鹽酸鹽-NaOH (pH 8.5)在4℃下儲存。 用於氧化sFcɛRIα之試劑. 碳醯肼(SigmaAldrich, 目錄號C11006)在蒸餾水中製成5 mM。氰基硼氫化鈉(SigmaAldrich, 目錄號156159)於乙酸鈉(BDH, 目錄號S1104-500GM)中製成100 mM，100 mM，pH=4。偏高碘酸鈉(SigmaAldrich, 目錄號S-1878)於乙酸鈉(BDH, 目錄號S1104-500GM)製成50 mM，100 mM，pH=5.5。 在pH 5.5之0.1M乙酸鈉中將sFcɛRIα稀釋至1 mg/ml。接著，將4 μl高碘酸鈉(50mM)1/50稀釋)添加至200 μl之1mg/ml sFcɛRIα溶液中。使混合物在冰上保持20分鐘，在固定之前，用pH=4.0之10 mM乙酸鈉(GE Healthcare, 目錄號BR100669)將sFcɛRIα溶液稀釋至7 μg/ml。 緩衝液：操作緩衝液係HBS-EP(即，10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20，自10×儲備溶液復原)：目錄號BR100669。固定緩衝液係乙酸鹽4.0(即10 mM乙酸鈉pH 4.0)。目錄號BR100349。緩衝液在4℃下儲存。 配位體： sFcɛRIα，即人類高親和力IgE受體α鏈之細胞外部分。在CHO細胞中表現為重組蛋白形式且純化。 分析物： IgE-Fc，即人類IgE之Fc部分，在CHO細胞中表現為重組蛋白形式且純化。使用帶有C225A突變之野生型人類IgE-Fc(根據Dorrington & Bennich(1978)Immunol. Rev. 41:3-25，編號V224-K547之Cɛ2-Cɛ4結構域)(SEQ ID NO: 108)。 突變體之命名： • 奧馬珠單抗Fab 1：S81R、Q83R[根據Kabat編號，S77R、Q79R](可變區輕鏈+κ恆定區以SEQ ID NO: 24顯示，其中S77及S79經Q置換；可變區重鏈+CH1恆定區以SEQ ID NO: 5顯示) • 奧馬珠單抗Fab 2：L158P[根據Kabat編號，L154P](可變區輕鏈+κ恆定區以SEQ ID NO: 113顯示；可變區重鏈+CH1恆定區以SEQ ID NO: 5顯示) • 奧馬珠單抗Fab 3：S81R、Q83R、L158P[根據Kabat編號，S77R、Q79R、L154P](可變區輕鏈SEQ ID NO: 121；可變區重鏈+CH1恆定區以SEQ ID NO: 5顯示) IgE結合搭配物(1)：全長奧馬珠單抗(Novartis)；在CHO細胞中表現奧馬珠單抗之重組Fab片段並純化。 IgE結合搭配物(2)：奧馬珠單抗之重組Fab片段，及其突變，在HEK-293細胞中表現且分析培養物上清液。在分析之前對培養物上清液十倍濃縮。 分析方法(1)：藉由醛偶合將sFcɛRIα偶合至感測器表面，達到約500個反應單位(RU)的程度。使用HBS-EP緩衝液作為操作緩衝液，流動速率為30 μL/min。在HBS-EP中將IgE-Fc稀釋至10 nM且注射至固定之sFcɛRIα上，持續290秒，隨後操作緩衝液或在操作緩衝液中稀釋之IgE結合搭配物注射3次，各自持續690秒。IgE-Fc之捕捉量係約90 RU。藉由兩次60秒之10 mM鹽酸甘胺酸pH 2.5注射使表面再生。計算IgE-Fc自固定之sFcɛRIα解離之量隨初始結合量的變化且以IgE-Fc自固定之sFcɛRIα損失之量計算解離速率，針對初始結合量隨經過時間之變化標準化。 分析方法(2)：藉由醛偶合將sFcɛRIα偶合至感測器表面，達到約2000個反應單位(RU)的程度。使用HBS-EP緩衝液作為操作緩衝液，流動速率為30 μL/min。在HBS-EP中將IgE-Fc稀釋至10 nM且注射至固定之sFcɛRIα上，持續180秒，隨後操作緩衝液或在操作緩衝液中稀釋之IgE結合搭配物注射1次，持續180秒。IgE-Fc之捕捉量係約275 RU。藉由兩次60秒之10 mM鹽酸甘胺酸pH 2.5注射使表面再生。計算IgE-Fc自固定之sFcɛRIα解離之量隨初始結合量的變化且以IgE-Fc自固定之sFcɛRIα損失之量計算解離速率，針對初始結合量隨經過時間之變化標準化。
Figure TW201802114AD00004
 表 2 ：IgE-Fc自固定之sFcɛRIα解離之量的計算。IgE與sFcɛRIα之初始結合標準化為100%且解離相對於其計算。表觀解離速率係基於假定之單一速率方法。 進行額外突變誘發以確定是否能鑑別出超出Fab3中所描述之突變範圍的加速IgE-Fc自sFcɛRIα解離之進一步突變。此產生突變S64M(參照SEQ ID NO: 20)，在Fab3之情形中，該突變能夠進一步增進IgE自sFcɛRIα之解離。此等資料描述於圖13及表3中。
Figure TW201802114AD00005
 表 3 ：IgE-Fc自固定之sFcɛRIα解離之量的計算. IgE與sFcɛRIα之初始結合標準化為100%且解離相對於其計算。表觀解離速率係基於假定之單一速率方法。突變體S64M：輕鏈SEQ ID No 39；奧馬珠單抗Fab WT：輕鏈SEQ ID NO: 20；奧馬珠單抗Fab3：輕鏈SEQ ID NO: 125。對於全部三種突變體，重鏈SEQ ID NO: 5。 結論： 綜合而言，此等資料展示，奧馬珠單抗Fab之突變形式可以加速IgE自高親和力IgE受體FcɛRI之固定形式解離。實現此目的之輕鏈突變包括(但不必限於)參照SEQ ID NO:24，S64M、S81R、Q83R及L158P，且得到SEQ ID NO: 39。 實例3：藉由流式細胞測量術量測IgE-Fc自FcɛRI之加速解離. 儀器：FACSCanto II流式細胞儀(Becton Dickinson) 細胞株：在補充有10%胎牛血清、2 mM GlutaMAX及500 μg/mL遺傳黴素(Life Technologies)之最低必需培養基中培養表現人類FcɛRI之RBL-SX38細胞。在分析時，在PBS中洗滌細胞且於Accutase中培育直至剝離，接著將其以1×106 個細胞/毫升再懸浮於培養基中。所有子序列培育步驟均在培養基中進行。 分析方法：在37℃下，將1×106 個細胞/毫升RBL-SX38與5 nM Alexa-488標記之IgE-Fc一起培育1小時。在培養基中洗滌細胞兩次以移除未結合之IgE-488，接著將其以1×106 個細胞/毫升懸浮於培養基中或在培養基中稀釋之100 μg/mL IgE-結合劑中。接著在37℃下，在恆定旋轉下培育細胞。在每一時間點，取出0.5×105 個細胞，在冰冷的PBS中洗滌且接著在4℃下，藉由再懸浮於含1%三聚甲醛之PBS中固定，保持16小時。使用FACSCanto II流式細胞儀測定細胞結合之Alexa-488螢光之量。 流式細胞測量術：在FACS緩衝液(0.1% w/v BSA、0.01%w/v NaN3 於PBS中，pH 7.4)中洗滌固定之細胞兩次，且將其再懸浮於200 μL FACS緩衝液中。在FACSCanto II細胞計數器上使用標準方法執行流式細胞測量術，且使用FlowJo軟體計算結合至完整細胞之Alexa-488的幾何平均螢光強度。以過量未經標記之IgE-Fc或在IgE結合劑存在下在培養基中培育細胞引起的幾何平均螢光強度之變化隨時間變化來計算Alexa-488標記之IgE-Fc的解離速率。 突變體之命名： • 奧馬珠單抗Fab 1：S81R、Q83R[根據Kabat編號，S77R、Q79R](可變區輕鏈+κ恆定區以SEQ ID NO: 24顯示，其中S77及S79經Q置換；可變區重鏈+CH1恆定區以SEQ ID NO: 5顯示) • 奧馬珠單抗Fab 2：L158P[根據Kabat編號，L154P](可變區輕鏈+κ恆定區以SEQ ID NO: 113顯示；可變區重鏈+CH1恆定區以SEQ ID NO: 5顯示) • 奧馬珠單抗Fab 3：S81R、Q83R、L158P[根據Kabat編號，S77R、Q79R、L154P](可變區輕鏈+κ恆定區以SEQ ID NO: 121顯示；可變區重鏈+CH1恆定區以SEQ ID NO: 5顯示)。
Figure TW201802114AD00006
 表 4 ：Alexa488標記之IgE-Fc自RBL-SX38細胞之表面解離之解離速率計算值。對於所有可用時間點，由-ln(R1/R0)隨時間變化之曲線的線性回歸擬合測定表觀解離速率。 結論： 綜合而言，此等資料展示，奧馬珠單抗Fab之突變形式可以加速IgE自細胞表面上表現之高親和力IgE受體FcɛRI解離。實現此目的之輕鏈突變包括(但不必限於)S81R、Q83R及L158P。 實例4：展示當在72小時PCA模型中治療性給與時奧馬珠單抗Fab3具有優於野生型奧馬珠單抗Fab之功效。 藉由將7.5 μL 6.68 mg/mL儲備液添加至1992.5 μL PBS中來製備25 μg/mL人類抗DNP-IgE溶液。20 μL此溶液之注射液將得到500 ng劑量之IgE。刮去動物(hIgER Tg小鼠)側腹上的毛且接著在第0天對每一側腹皮內注射2 pm。將20 μL PBS注射至每隻動物之左側腹中作為陰性對照。將抗DNP-IgE(20 μL)注射至右側腹中。對總計40隻小鼠進行注射。在IgE後18小時(8 am)開始用野生型奧馬珠單抗Fab或奧馬珠單抗Fab3(含S81R、Q83R、L158P突變[根據Kabat編號，S77R、Q79R、L154P])治療。兩組小鼠(n=8隻/組)皮下接受100 mg/kg 野生型奧馬珠單抗Fab或奧馬珠單抗Fab3。另一組8隻小鼠s.c.接受PBS。10小時後(6 pm)，如上再次對小鼠給藥。此時，在IgE後28小時，亦皮下給與另外兩組(n=8隻/組)100 mg/kg野生型奧馬珠單抗Fab或奧馬珠單抗Fab3。所有組均在8 am、6 pm及又在實驗最後一天的8 am再給藥。皮內給藥後72小時(2 pm)，對所有動物靜脈內注射100 μL在100 IU/ml肝素中製造的1 mg/mL DNP-HSA、2.5% w/v伊凡氏藍(Evans blue)。1小時後，根據方案1方法殺死動物。移除側腹中皮內注射部位周圍的皮膚並取得穿孔活檢體。將皮膚樣品置放於700 μL甲醯胺中且在55℃下消化隔夜。在消化之後，自各樣品取出100 μL×2流體且置放於96孔ELISA盤中。接著在620 nm下量測吸光度。 結論： 此等資料展示，當與野生型奧馬珠單抗Fab相比較時，可以加速IgE自高親和力IgE受體FcɛRI解離的奧馬珠單抗Fab之突變形式亦能夠以統計學顯著方式減少被動皮膚全身性過敏反應(如藉由伊凡氏藍染料自反應部位滲漏之抑制所示)。實現此目的之輕鏈突變包括(但不必限於)參照SEQ ID NO:24，S81R、Q83R及L158P，且得到SEQ ID NO: 39。實例 5 ： 奧馬珠單抗 Fab3 與 IgE Fc 之 複合物的分子動力學模擬 方法： 在Molecular Operating Environment(MOE)2014.0901(1)中，藉由在使用Amber 14(2)進行分子動力學(MD)模擬之前，使Cɛ2與Cɛ3結構域之間的一些殘基之缺失側鏈及缺失環完整來製備奧馬珠單抗Fab3與IgE Fc區之複合物的晶體結構(參見實例1)。對該複合物結構加氫且在自箱之任何邊緣延伸10Å至蛋白質原子的截斷之八面體箱中，使用TIP3P明確水模型，用0.15M NaCl鹽溶質溶劑化。該系統係使用Amber ff12SB及寡醣GLYCAM_06j-1(3)力場設立且在針對庫侖及凡得瓦爾相互作用以及基於柵格之鄰區列表設定的10.0Å截止值下，藉由進行偶聯物梯度演算法50,000步來最小化。隨後，在對所有溶質重原子具有限制(諧和力約束係5.0)之NPT整體中，在恆定體積下，在125 ps內將該系統自0 K逐漸加熱至300 K，隨後平衡2.25 ns。對於靜電，在8.0 Å之庫侖相互作用截止值以及默認傅里葉間距及容差設置下，使用第四級PME。藉由分別對蛋白質及溶劑應用弱偶合演算法來控制溫度且時間常數為1.0 ps，且藉應用於完整系統之各向同性Berenson氣壓調節器控制壓力，且時間常數為1.0 ps及壓縮性為4.46×10- 5 巴- 1 。最後，在無任何限制下，使用與平衡相同之參數進行1000 ns製造模擬。為了在GPU基礎結構上實現4 fs時間步長，使用ParmEd(4)將蛋白質及糖之氫質量再分配至3.024道爾頓，同時將其所鍵結之原子的質量調整使總質量保持不變所需之量。藉由使抗體輕鏈中之R81及R83分別虛擬突變成野生型絲胺酸及天冬醯胺，由奧馬珠單抗-突變體3與IgE Fc之複合物的晶體結構建立野生型奧馬珠單抗Fab與IgE Fc區之複合物之結構的模型。使用與突變體3相同之設置方案進行MD模擬。 對於呈與IgE Fc之複合物形式的奧馬珠單抗Fab3及奧馬珠單抗Fab，使用AmberTools cpptraj模組(7)對MD軌跡進行叢集分析。採用分層聚合式演算法(Hierarchical agglomerative algorithm)且各叢集之間之平均鍵聯距離在2.0Å以下。經由抗體輕鏈V區殘基中各Cα-原子之間的最佳擬合座標RMSD計算各框之間的距離。僅對每10個框進行叢集分析且基於在叢集後其與叢集質心之接近性，將所有其他框添加至叢集中。 參考文獻 1. Molecular Operating Environment (MOE), 2014.09; Chemical Computing Group Inc., 1010 Sherbooke St. West, Suite #910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2015. 2. Case, D.A., et al. AMBER 2014, 2014, University of California, San Francisco. 3. Kirschner, K. et al. GLYCAM06: A generalizable biomolecular force field. Carbohydrates. J. Comput. Chem., 2008, 29, 622-655. 4. http: // parmed.github .io/ParmEd/html/index.html 結果： 為了研究奧馬珠單抗Fab3之輕鏈中的S81R及Q83R突變如何影響與IgE之相互作用，分別對奧馬珠單抗Fab及奧馬珠單抗Fab3與IgE Fc結構之複合物進行一微秒分子動力學模擬。將軌跡快照叢集起來且分析前2個填入之叢集中心結構，由此明顯展示，在該兩個叢集中，突變體3中之兩個精胺酸突變分別與相鄰IgE Cɛ2結構域中之殘基D278及S280形成強氫鍵網路。目測檢查該軌跡確定，相對於如晶體結構中所揭示的較接近之Cɛ3結構域，R81-S280及R83-D278成對相互作用在模擬期間要保守及穩定得多，因此經由抗體橋連凍結伸直之Cɛ2構形。有趣的是，儘管雙精胺酸突變在空間上鄰近於奧馬珠單抗Fab3之晶體結構中之Cɛ2 D278及S280，但如MD模擬中所示，不存在直接氫鍵結。對於奧馬珠單抗Fab，正如預期，如在突變體3中所見的氫鍵網路在該前2個叢集中心結構中缺失。目測軌跡檢查顯示，Cɛ2結構域變得較少繫栓至抗體輕鏈構架且因此其與較接近之Cɛ3結構域的相對位置變化要比奧馬珠單抗Fab3之相對位置變化大。除此之外，亦對複合物中奧馬珠單抗Fab3與IgE-Fc之間之界面進行IOTA分析(IOTA係用於測定在蛋白質界面或結合位點處給定接觸原子之概率的統計潛勢工具)，以預測奧馬珠單抗Fab3(參照SEQ ID NO: 113)中之輕鏈位置S56、S64及S71可以經突變以增加奧馬珠單抗對IgE-Fc之親和力且因此增強預測會在以上詳述之S81R及Q38R突變所見的影響。 結論： 總體而言，MD模擬提出以下假設：S81R及Q38R突變藉由與Cɛ2中之相鄰D278及S280直接靜電相互作用及氫鍵相互作用來促進IgE Cɛ2結構域定位至抗體，且藉由將Cɛ2鎖定在伸直構形來影響IgE可塑性。此結合統計方法以預測S64M突變及S56(變成D、E、Q或R)及S71(變成D、E或M)將具有類似影響。 實例6：藉由Biacore量測抗-IgE Fab對IgE-Fc之親和力. Biacore技術量測生物分子之間的相互作用，不需要標記。將相互作用物之一，稱為配位體，直接固定於或捕捉至感測器表面上，而另一相互作用物，稱為分析物，以溶液形式流動越過捕捉之表面。感測器偵測當分析物結合至配位體時及當分析物自配位體解離時在感測器表面處之質量變化。此等變化對應於締合及解離過程。在動力學分析中，抗-IgE Fab係配位體且經捕捉至感測器表面上。IgE-Fc係分析物且由抗-IgE Fab捕捉。藉由使IgE-Fc流動越過感測器表面(締合)或緩衝液流動越過感測器表面(解離相)來監測IgE-Fc與捕捉之抗-IgE Fab的締合及解離。該方法之詳情如下： 儀器：Biacore 3000, GE Healthcare AB, Uppsala, Sweden 感測器晶片：CM5。目錄號BR100399 BIA標準化溶液：70% (w/w)甘油。BIA維持套組之一部分。目錄號BR100651。BIA維持套組在4℃下儲存。 胺偶合套組：目錄號BR100633。將乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)於蒸餾水中製成75 mg/mL且以200 μl等分試樣在-70℃下儲存。將N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)於蒸餾水中製成11.5 mg/mL且以200 μL等分試樣在-70℃下儲存。乙醇胺鹽酸鹽-NaOH pH 8.5在4℃下儲存。 緩衝液：操作緩衝液係HBS-EP(即，10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20，自10×儲備溶液復原)：目錄號BR100669。固定緩衝液係乙酸鹽4.0(即10 mM乙酸鈉pH 4.0)。目錄號BR100349。緩衝液在4℃下儲存。 配位體：抗-IgE Fab係該配位體。此等配位體在HEK-293細胞中暫時表現為重組蛋白形式且不經進一步純化即使用。 分析物： IgE-Fc，即人類IgE之Fc部分，在CHO細胞中表現為重組蛋白形式且純化。使用帶有C225A突變之野生型人類IgE-Fc(根據Dorrington & Bennich(1978)Immunol. Rev. 41:3-25，編號V224-K547之Cɛ2-Cɛ4結構域)(SEQ ID NO: 108)。 使用標準方法，藉由胺偶合將山羊抗人類IgG1(Fab2 片段特異性)(Jackson Immunolabs,目錄號109-006-097)之Fab2 片段固定至感測器表面上。在操作緩衝液(HBS-EP)中稀釋抗-IgE Fab且將約200個共振單位捕捉至該表面。在操作緩衝液中稀釋IgE-Fc且使2 nM至125 pM之連續稀釋系列通過捕捉之抗-IgE Fab。締合相持續180秒且解離相持續300秒。藉由暴露於40 mM HCl達60秒，隨後暴露於10 mM NaOH達60秒且接著再暴露於40 mM HCl達60秒，使感測器表面再生。使用BiaEvaluation軟體，遵循標準程序用雙參照處理所有結合資料。
Figure TW201802114AD00007
 表 5 ：如在Biacore動力學分析中量測的奧馬珠單抗Fab及突變體對IgE-Fc之親和力。解離常數(KD)以kd/ka計算。
Figure TW201802114AD00008
 表 6 ：如在Biacore動力學分析中量測的奧馬珠單抗Fab(WT)及突變體對IgE-Fc之親和力。解離常數(KD)以kd/ka計算。該四個突變體係在野生型序列背景中(輕鏈SEQ ID NO: 20)。
Figure TW201802114AD00009
 表 7a ：如在Biacore動力學分析中量測的奧馬珠單抗Fab(WT)及突變體對IgE-Fc之親和力。解離常數(KD)以kd/ka計算。該等突變係參照輕鏈SEQ ID NO: 20。
Figure TW201802114AD00010
 表 7b ：如在Biacore動力學分析中所量測的奧馬珠單抗Fab對IgE-Fc之親和力。解離常數(KD)以kd/ka計算。該等突變係在輕鏈中(參照SEQ ID NO: 20)。Fab突變體之輕鏈可變區序列示於左邊一欄(VL SEQ ID NO: )中。
Figure TW201802114AD00011
 表 7c ：如在Biacore動力學分析中所量測的奧馬珠單抗Fab突變體對IgE-Fc之親和力。解離常數(KD)以kd/ka計算。該等突變係在輕鏈中(參照SEQ ID NO: 20)。樣品已經歷強制氧化研究且藉由質譜法測定在每個時間點時甲硫胺酸氧化之程度。 結論： 此等資料展示，奧馬珠單抗Fab之突變形式增加奧馬珠單抗Fab對IgE-Fc之親和力。就改良親和力而言，最佳突變組合係S71M與S56D之組合。此親和力增加主要係由Fab自IgE-Fc解離之速率降低引起。鑒於相較於未突變之奧馬珠單抗Fab，抗體與IgE-Fc Cɛ2之相互作用改良，使得奧馬珠單抗Fab1(含S81R、Q83R突變[根據Kabat編號，S77R、Q79R])及Fab3(含S81R、Q83R、L158P突變[根據Kabat編號，S77R、Q79R、L154P]參照SEQ ID NO;125)之親和力亦改良。 實例7：藉由Biacore量測IgE-Fc自固定之sFcɛRIα的加速解離 使用實例2中所概述之方法(分析方法2)量測抗-IgE Fab對IgE-Fc自sFcɛRIα解離之影響。所有抗-IgE Fab係在HEK-29s Fab中表現，藉由標準方法純化且使用莫耳消光係數計算值，藉由在280 nm下之吸光度進行定量。在此分析中，IgE-Fc之濃度係2 nM且解離時間係200秒。計算IgE-Fc自固定之sFcɛRIα解離之量隨初始結合量的變化且以IgE-Fc自固定之sFcɛRIα損失之量計算解離速率，針對初始結合量隨經過時間之變化標準化。 S80N(pdb編號)被認為與Cɛ2 IgE之D278相互作用，且S67W/Y(pdb編號)被認為與Cɛ2 IgE之T298相互作用。
Figure TW201802114AD00012
 表 8 ：IgE-Fc自固定之sFcɛRIα解離之量的計算。IgE與sFcɛRIα之初始結合標準化為100%且解離相對於其計算。表觀解離速率係基於假定之單一速率方法。 結論： 此等資料展示，奧馬珠單抗Fab之突變形式可以加速IgE自高親和力IgE受體FcɛRI之固定形式解離。實現此目的之輕鏈(SEQ ID NO: 20)中之突變包括(但不必限於)在位置S56、S64、S67、S71、S80、S81、Q83及L158(根據Kabat編號，分別為S52、S60、S63、S67、S76、S77、Q79及L154)處之突變。 實例8：突變奧馬珠單抗Fab之強制氧化 使抗-IgE Fab樣品經歷強制氧化方案以確定氧化輕鏈可變區中之甲硫胺酸對於Fab對IgE-Fc之親和力的影響及加速IgE-Fc:sFcɛRIα複合物解離之能力。在室溫下，將突變奧馬珠單抗Fab與0.1%及1%(v/v)過氧化氫一起培育長達14天。培育之後，將樣品重新緩衝液交換成PBS pH 7.4且使用消光係數計算值，藉由在280 nm下之吸光度測定濃度。藉由在變性條件下還原及烷基化材料，隨後胰蛋白酶消化(在37℃下50 μg/mL胰蛋白酶消化180分鐘，隨後TFA淬滅)且接著使用Thermo Orbitrap Q Exactive Plus質譜儀，藉由LC-MS分析，來進行質譜分析以測定輕鏈可變區甲硫胺酸之氧化之量。相對於假設在合成時不存在甲硫胺酸氧化來計算氧化之甲硫胺酸的百分含量且與保持在4℃之參考材料相比較。
Figure TW201802114AD00013
 表 9 ：突變奧馬珠單抗Fab之輕鏈可變區中氧化之甲硫胺酸的百分含量。此奧馬珠單抗Fab突變體含有以下突變：S64M_S81R_Q83R_S56D_S71M(參照SEQ ID NO: 20)。 結論： 此等資料指示，有可能產生關鍵輕鏈甲硫胺酸(M64及M71)基本上完全氧化的突變奧馬珠單抗Fab。基於此等資料，將來自第1天、第3天及第7天樣品之材料合併且用於確定甲硫胺酸氧化對於突變奧馬珠單抗Fab對IgE-Fc之親和力的影響及加速IgE-Fc:sFcεRIα複合物解離之能力。 實例9：藉由FRET量測IgE-Fc自sFcɛRIα之加速解離 在均質FRET分析中量測抗-IgE Fab對IgE-Fc自sFcɛRIα解離之影響。所有抗-IgE Fab係在HEK-293細胞中表現，且藉由標準方法純化且使用計算之莫耳消光法，藉由在280 nm下之吸光度進行定量。FRET分析使用Tb標記之IgE-Fc作為供體且使用Alexa488標記之sFcɛRIα作為接受體。混合兩種試劑且在室溫下平衡60分鐘，最終分析濃度為1 nM。將抗-IgE Fab添加至混合物中，最終分析濃度為500 nM，且每20分鐘讀取螢光度(在330 nm下激發，在495及520 nm下發射)，800分鐘。將螢光發射隨時間變化作圖且以複合物之半衰期計算IgE-Fc自sFcɛRIα解離之解離速率。此等資料報導於表10及11中。
Figure TW201802114AD00014
 表 10 ：在均質FRET分析中抗-IgE Fab(WT及突變體)對IgE-Fc自sFcɛRIα解離之影響。IgE-Fc:sFcɛRIα複合物之解離係一種兩階段衰減。較快的初始階段係大部分IgE-Fc:sFcɛRIα複合物解離之階段且由此測定該複合物之半衰期。該等突變係在輕鏈中(參照SEQ ID NO: 20)。Fab突變體之輕鏈可變區序列示於左邊一欄(VL SEQ ID NO: )中。
Figure TW201802114AD00015
 表 11 ：在均質FRET分析中甲硫胺酸氧化對於抗-IgE Fab使IgE-Fc自sFcɛRIα解離之能力的影響。IgE-Fc:sFcɛRIα複合物之解離係一種兩階段衰減。較快的初始階段係大部分IgE-Fc:sFcɛRIα複合物解離之階段且由此測定該複合物之半衰期。 結論： 此等資料展示，奧馬珠單抗之突變形式能夠以比野生型序列快的速率使IgE-Fc自sFcɛRIα解離。詳言之，實現此目的的輕鏈(參照SEQ ID NO: 20)中之突變包括(但不必限於)在位置S64及S67處之突變。另外，氧化甲硫胺酸(M64及M71，SEQ ID NO: 20)對Fab加速IgE-Fc:sFcɛRIα複合物解離之能力無顯著影響。 已參考本發明之實施例描述本說明書。然而，一般熟習此項技術者瞭解，可在不脫離以下申請專利範圍中所闡述之本發明範疇的情況下進行各種修改及變化。因此，本說明書應以說明性而非限制性意義來看待，且所有此類修改意欲包括在本發明範疇內。 序列 重鏈 SEQ ID NO: 1 v區
Figure TW201802114AD00016
SEQ ID NO: 2 v區
Figure TW201802114AD00017
SEQ ID NO: 3v 區，其中 信號序列加下劃線且呈斜體 SEQ ID NO: 4v 區，其中 信號序列加下劃線且呈斜體 SEQ ID NO: 5v 區 + γ 1 CH1 恆定區 SEQ ID NO: 6v 區 + γ 1 CH1 恆定區 SEQ ID NO: 7 v 區 + γ 1 CH1 恆定區 ， 其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00018
SEQ ID NO: 8 v 區 + γ 1 CH1 恆定區 ， 其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00019
SEQ ID NO: 9 v 區 + γ 1 全長恆定區
Figure TW201802114AD00020
SEQ ID NO: 10 v區 + γ 1 全長恆定區 SEQ ID NO: 11 v區 + γ 1 全長恆定區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00021
SEQ ID NO: 12 v區 + γ 1 全長恆定區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00022
SEQ ID NO: 13 FR H1
Figure TW201802114AD00023
SEQ ID NO: 14 CDRH1 SEQ ID NO: 15 FR H2
Figure TW201802114AD00024
SEQ ID NO: 16 CDRH2
Figure TW201802114AD00025
SEQ ID NO: 17 FR H3
Figure TW201802114AD00026
SEQ ID NO: 18 CDRH3
Figure TW201802114AD00027
SEQ ID NO: 19 FR H4
Figure TW201802114AD00028
輕鏈 SEQ ID NO: 20奧馬珠單抗 _v 區
Figure TW201802114AD00029
SEQ ID NO: 21奧馬珠單抗 _v 區
Figure TW201802114AD00030
SEQ ID NO: 22奧馬珠單抗 _v 區 ，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00031
SEQ ID NO: 23奧馬珠單抗 _v 區 ，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00032
SEQ ID NO: 24 奧馬珠單抗 _v 區 + κ 恆定區 SEQ ID NO: 25 奧馬珠單抗 _v 區 + κ 恆定區 SEQ ID NO: 26 奧馬珠單抗 _v 區 + κ 恆定區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00033
SEQ ID NO: 27 奧馬珠單抗 _v 區 + κ 恆定區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00034
Figure TW201802114AD00035
SEQ ID NO: 28 FR L1 SEQ ID NO: 29 CDRL1 SEQ ID NO: 30 FR L2 SEQ ID NO: 31 CDRL2 SEQ ID NO: 32 FR L3 SEQ ID NO: 33 CDRL3 SEQ ID NO: 34 FR L4
Figure TW201802114AD00036
突變輕鏈 SEQ ID NO: 35 S60M_S77R_Q79R_v區(Kabat)SEQ ID NO: 36 S60M_S77R_Q79R_v 區(Kabat)
Figure TW201802114AD00037
SEQ ID NO: 37 S60M_S77R_Q79R_v 區，其中信號序列加下劃線且呈斜體 (Kabat)
Figure TW201802114AD00038
SEQ ID NO: 38 S60M_S77R_Q79R_v 區，其中信號序列加下劃線且呈斜體 (Kabat)
Figure TW201802114AD00039
SEQ ID NO: 39 S60M_S77R_Q79R_v 區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區 (Kabat)
Figure TW201802114AD00040
SEQ ID NO: 40 S60M_S77R_Q79R_v 區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區 (Kabat)
Figure TW201802114AD00041
SEQ ID NO: 41 S60M_S77R_Q79R_v 區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區，其中信號序列加下劃線且呈斜體 (Kabat)
Figure TW201802114AD00042
SEQ ID NO: 42 S60M_S77R_Q79R_v 區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區，其中信號序列加下劃線且呈斜體 (Kabat)
Figure TW201802114AD00043
SEQ ID NO: 43 FR L3 S64M (PDB) S60M (Kabat)
Figure TW201802114AD00044
SEQ ID NO: 44 FR L3 S81R(PDB) S77R (Kabat)
Figure TW201802114AD00045
SEQ ID NO: 45 FR L3 Q83R(PDB) Q79R (Kabat) SEQ ID NO: 46 FR L3 S64M S81R(PDB) S60M S77R (Kabat)
Figure TW201802114AD00046
SEQ ID NO: 47 FR L3 S64M Q83R(PDB) S60M Q79R (Kabat)
Figure TW201802114AD00047
SEQ ID NO: 48 FR L3 S81R Q83R(PDB) S77R Q79R (Kabat)
Figure TW201802114AD00048
SEQ ID NO: 49 FR L3 S64M S81R Q83R(PDB) S60M S77R Q79R (Kabat) SEQ ID NO: 50 CDRL2 S56D(PDB) S52D (Kabat)
Figure TW201802114AD00049
SEQ ID NO: 51 CDRL2 S56E(PDB) S52E (Kabat)
Figure TW201802114AD00050
SEQ ID NO: 52 FR L3 S71M(PDB) S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00051
SEQ ID NO: 53 FR L3 S64M S71M (PDB) S60M S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00052
SEQ ID NO: 54 FR L3 S81R S71M (PDB) S77R S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00053
SEQ ID NO: 55 FR L3 Q83R S71M (PDB) Q79R S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00054
SEQ ID NO: 56 FR L3 S64M S81R S71M (PDB) S60M S77R S67M (Kabat) SEQ ID NO: 57 FR L3 S64M Q83R S71M (PDB) S60M Q79R S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00055
SEQ ID NO: 58 FR L3 S81R Q83R S71M (PDB) S77R Q79R S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00056
SEQ ID NO: 59 FR L3 S64M S81R Q83R S71M (PDB) S60M S77R Q79R S67M (Kabat) SEQ ID NO: 60 FR L3 S67Y (PDB) S63Y (Kabat)
Figure TW201802114AD00057
SEQ ID NO: 61 FR L3 S64M S67Y (PDB) S60M S63Y (Kabat)
Figure TW201802114AD00058
SEQ ID NO: 62 FR L3 S81R S67Y (PDB) S77R S63Y (Kabat)
Figure TW201802114AD00059
SEQ ID NO: 63 FR L3 Q83R S67Y (PDB) Q79R S63Y (Kabat)
Figure TW201802114AD00060
SEQ ID NO: 64 FR L3 S64M S81R S67Y (PDB) S60M S77R S63Y (Kabat)
Figure TW201802114AD00061
SEQ ID NO: 65 FR L3 S64M Q83R S67Y (PDB) S60M Q79R S63Y (Kabat)
Figure TW201802114AD00062
SEQ ID NO: 66 FR L3 S81R Q83R S67Y (PDB) S77R Q79R S63Y (Kabat)
Figure TW201802114AD00063
SEQ ID NO: 67 FR L3 S64M S81R Q83R S67Y (PDB) S60M S77R Q79R S63Y (Kabat) SEQ ID NO: 68 FR L3 S80N (PDB) S76N (Kabat)
Figure TW201802114AD00064
SEQ ID NO: 69 FR L3 S64M S80N (PDB) S60M S76N (Kabat)
Figure TW201802114AD00065
SEQ ID NO: 70 FR L3 S81R S80N (PDB) S77R S76N (Kabat)
Figure TW201802114AD00066
SEQ ID NO: 71 FR L3 Q83R S80N (PDB) Q79R S76N (Kabat)
Figure TW201802114AD00067
SEQ ID NO: 72 FR L3 S64M S81R S80N (PDB) S60M S77R S76N (Kabat)
Figure TW201802114AD00068
SEQ ID NO: 73 FR L3 S64M Q83R S80N (PDB) S60M Q79R S76N (Kabat)
Figure TW201802114AD00069
SEQ ID NO: 74 FR L3 S81R Q83R S80N (PDB) S77R Q79R S76N (Kabat)
Figure TW201802114AD00070
SEQ ID NO: 75 FR L3 S64M S81R Q83R S80N (PDB) S60M S77R Q79R S76N (Kabat) SEQ ID NO: 76 FR L3 S80N S67Y (PDB) S76N S63Y(Kabat)
Figure TW201802114AD00071
SEQ ID NO: 77 FR L3 S64M S80N S67Y (PDB) S60M S76N S63Y (Kabat)
Figure TW201802114AD00072
SEQ ID NO: 78 FR L3 S81R S80N S67Y (PDB) S77R S76N S63Y (Kabat)
Figure TW201802114AD00073
SEQ ID NO: 79 FR L3 Q83R S80N S67Y (PDB) Q79R S76N S63Y (Kabat)
Figure TW201802114AD00074
SEQ ID NO: 80 FR L3 S64M S81R S80N S67Y (PDB) S60M S77R S76N S63Y (Kabat)SEQ ID NO: 81 FR L3 S64M Q83R S80N S67Y (PDB) S60M Q79R S76N S63Y (Kabat) SEQ ID NO: 82 FR L3 S81R Q83R S80N S67Y (PDB) S77R Q79R S76N S63Y (Kabat) SEQ ID NO: 83 FR L3 S64M S81R Q83R S80N S67Y (PDB) S60M S77R Q79R S76N S63Y (Kabat)
Figure TW201802114AD00075
SEQ ID NO: 84 FR L3 S67Y S71M(PDB) S63Y S67M(Kabat)
Figure TW201802114AD00076
SEQ ID NO: 85 FR L3 S64M S67Y S71M (PDB) S60M S63Y S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00077
SEQ ID NO: 86 FR L3 S81R S67Y S71M (PDB) S77R S63Y S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00078
SEQ ID NO: 87 FR L3 Q83R S67Y S71M (PDB) Q79R S63Y S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00079
SEQ ID NO: 88 FR L3 S64M S81R S67Y S71M (PDB) S60M S77R S63Y S67M (Kabat) SEQ ID NO: 89 FR L3 S64M Q83R S67Y S71M (PDB) S60M Q79R S63Y S67M (Kabat) SEQ ID NO: 90 FR L3 S81R Q83R S67Y S71M (PDB) S77R Q79R S63Y S67M (Kabat) SEQ ID NO: 91 FR L3 S64M S81R Q83R S67Y S71M (PDB) S60M S77R Q79R S63Y S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00080
SEQ ID NO: 92 FR L3 S80N S71M (PDB) S76N S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00081
SEQ ID NO: 93 FR L3 S64M S80N S71M (PDB) S60M S76N S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00082
SEQ ID NO: 94 FR L3 S81R S80N S71M (PDB) S77R S76N S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00083
SEQ ID NO: 95 FR L3 Q83R S80N S71M (PDB) Q79R S76N S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00084
SEQ ID NO: 96 FR L3 S64M S81R S80N S71M (PDB) S60M S77R S76N S67M (Kabat) SEQ ID NO: 97 FR L3 S64M Q83R S80N S71M (PDB) S60M Q79R S76N S67M (Kabat) SEQ ID NO: 98 FR L3 S81R Q83R S80N S71M (PDB) S77R Q79R S76N S67M (Kabat) SEQ ID NO: 99 FR L3 S64M S81R Q83R S80N S71M (PDB) S60M S77R Q79R S76N S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00085
SEQ ID NO: 100 FR L3 S80N S67Y S71M (PDB) S76N S63Y S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00086
SEQ ID NO: 101 FR L3 S64M S80N S67Y S71M (PDB) S60M S76N S63Y S67M (Kabat) SEQ ID NO: 102 FR L3 S81R S80N S67Y S71M (PDB) S77R S76N S63Y S67M (Kabat) SEQ ID NO: 103 FR L3 Q83R S80N S67Y S71M (PDB) Q79R S76N S63Y S67M (Kabat) SEQ ID NO: 104 FR L3 S64M S81R S80N S67Y S71M (PDB) S60M S77R S76N S63Y S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00087
SEQ ID NO: 105 FR L3 S64M Q83R S80N S67Y S71M (PDB) S60M Q79R S76N S63Y S67M (Kabat)
Figure TW201802114AD00088
SEQ ID NO: 106 FR L3 S81R Q83R S80N S67Y S71M (PDB) S77R Q79R S76N S63Y S67M (Kabat) SEQ ID NO: 107 FR L3 S64M S81R Q83R S80N S67Y S71M (PDB) S60M S77R Q79R S76N S63Y S67M (Kabat) SEQ ID NO: 108 C225A突變之帶有野生型人類IgE-Fc (具有編號V224-K547之Cɛ2-Cɛ4結構域，遵循Dorrington & Bennich (1978) Immunol. Rev. 41:3-25)；NB，在結晶學實驗中，亦將以下突變插入IgE-Fc中以簡化糖基化模式：N265Q及N371Q (亦遵循Dorrington & Bennich編號)
Figure TW201802114AD00089
輕鏈 Fab1 SEQ ID NO: 109 S77R_Q79R_v區(Fab1)
Figure TW201802114AD00090
SEQ ID NO: 110 S77R_Q79R_v區(Fab1)
Figure TW201802114AD00091
SEQ ID NO: 111 S77R_Q79R_v 區 (Fab1) ，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00092
SEQ ID NO: 112 S77R_Q79R_v 區 (Fab1) ，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00093
Fab2奧馬珠單抗 v 區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區 SEQ ID NO: 113 Fab2_v 區
Figure TW201802114AD00094
SEQ ID NO: 114 Fab2_v 區
Figure TW201802114AD00095
SEQ ID NO: 115 Fab2_v 區，其中信號序列加下劃線且呈斜體 SEQ ID NO: 116 Fab2_v 區，其中信號序列加下劃線且呈斜體 SEQ ID NO: 117 Fab2_v 區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區 SEQ ID NO: 118 Fab2_v 區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區 SEQ ID NO: 119 Fab2_v 區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00096
SEQ ID NO: 120 Fab2_v 區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00097
Fab3S77R_Q79R_v 區 ( 來自 Fab1) + 包括 L154P 之 κ 恆定區 ( 來自 Fab2) SEQ ID NO: 121 S77R_Q79R_v 區
Figure TW201802114AD00098
SEQ ID NO: 122 S77R_Q79R_v 區
Figure TW201802114AD00099
SEQ ID NO: 123 S77R_Q79R_v 區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00100
SEQ ID NO: 124 S77R_Q79R_v 區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00101
SEQ ID NO: 125 S77R_Q79R_v區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區 SEQ ID NO: 126 S77R_Q79R_v區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區 SEQ ID NO: 127 S77R_Q79R_v區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00102
SEQ ID NO: 128 S77R_Q79R_v區 + 包括 L154P 之 κ 恆定區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00103
SEQ ID NO: 129 奧馬珠單抗 _v 區
Figure TW201802114AD00104
SEQ ID NO: 130 奧馬珠單抗 _v 區
Figure TW201802114AD00105
SEQ ID NO: 131 FR3
Figure TW201802114AD00106
SEQ ID NO: 132 S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v 區 SEQ ID NO: 133 S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v 區 SEQ ID NO: 134 S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00107
SEQ ID NO: 135 S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00108
SEQ ID NO: 136 S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v區 + κ 恆定區 SEQ ID NO: 137 S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v區 + κ 恆定區
Figure TW201802114AD00109
SEQ ID NO: 138 FR3
Figure TW201802114AD00110
SEQ ID NO: 139 S60R_S52D_S67M_S 77R_Q7 9R_v區
Figure TW201802114AD00111
SEQ ID NO: 140 S60R_S52D_S67M_S77R_Q79R_v 區SEQ ID NO: 141 S60R_S52D_S67M_S77R_Q79R_v 區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00112
SEQ ID NO: 142 S60R_S52D_S67M_S77R_Q79R_v 區，其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00113
SEQ ID NO: 143 S60R_S52D_S67M_S77R_Q79R_v 區 + κ 恆定區 SEQ ID NO: 144 S60R_S52D_S67M_S77R_Q79R_v 區 + κ 恆定區
Figure TW201802114AD00114
SEQ ID NO: 145 S60K_S52D_S67M_S77R_Q79R_v 區 (Kabat)
Figure TW201802114AD00115
SEQ ID NO: 146 S60Q_S52D_S67M_S77R_Q79R_v 區 (Kabat)
Figure TW201802114AD00116
SEQ ID NO: 147 v 區 + γ 1 CH1 恆定區加 連接子加 CA645 gL4gH5 scFv ， 其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00117
SEQ ID NO: 148 v 區 + γ 1 CH1 恆定區加 連接子加 CA645 gL4gH5 scFv ， 其中信號序列加下劃線且呈斜體
Figure TW201802114AD00118
SEQ ID NO: 149 連接子在 CH1 與 CA645 gL4gH5 scFv 之間
Figure TW201802114AD00119
SEQ ID NO: 150 CA645 gL4gH5 scFv
Figure TW201802114AD00120
SEQ ID NO: 151 連接子在 scFv 內 CA645 gH5 與 CA645 gL4 之間
Figure TW201802114AD00121
SEQ ID NO: 152 CA645 CDRH1
Figure TW201802114AD00122
SEQ ID NO: 153 CA645 CDRH2
Figure TW201802114AD00123
SEQ ID NO: 154 CA645 CDRH3
Figure TW201802114AD00124
SEQ ID NO: 155 CA645 CDRL1
Figure TW201802114AD00125
SEQ ID NO: 156 CA645 CDRL2
Figure TW201802114AD00126
SEQ ID NO: 157 CA645 CDRL3
Figure TW201802114AD00127
SEQ ID NO: 158 S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_S63W_S76N_v區(Kabat) SEQ ID NO: 159 S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_S63Y_S76N_v區(Kabat)
Figure TW201802114AD00128
SEQ ID NO: 160 信號序列
參照物及SEQ ID見於參照附圖的實例中。圖 1 .奧馬珠單抗 Fab3 含有三個點突變 。奧馬珠單抗Fab3係衍生自奧馬珠單抗，且在抗原結合CDR之遠端含有三個點突變，兩個在VL 結構域構架區中(Ser81Arg、Gln83Arg)及一個在Cκ結構域中(Leu158Pro)。重鏈及輕鏈分別呈白色及藍色。突變之殘基呈紅色，且CRDL1呈綠色，以指示Fab之取向。圖 2 . IgE - Fc 與 奧馬珠單抗 Fab3 之 複合物的整體結構 。(A) 奧馬珠單抗Fab3以2:1化學計算量結合至IgE-Fc。Fab1 (綠色)僅僅經由Cɛ3結構域接合IgE-Fc鏈B(粉紅色)。Fab2 (藍色)經由Cɛ3結構域與IgE-Fc鏈A(黃色)相互作用並與來自IgE-Fc鏈B(粉紅色)的Cɛ2結構域形成微小相互作用。(B) 兩個Fab關於Fcɛ3-4區的二重軸形成偽對稱複合物。為清楚起見，未顯示Cɛ2結構域。(C) IgE-Fc在奧馬珠單抗Fab3複合物中不對稱地彎曲。來自鏈B(粉紅色)之Cɛ2結構域接觸Fab2 (藍色)。圖 3 .奧馬珠單抗 Fab3 與 IgE - Fc 之間之界面 。顯示奧馬珠單抗Fab3 Fab2 (重鏈及輕鏈分別呈綠色及黃色)與來自IgE-Fc(粉紅色)之Cɛ3之間的界面。奧馬珠單抗Fab3及Cɛ3結構域殘基標記分別呈藍色及黑色。該界面包含氫鍵及凡得瓦爾相互作用(van der Waals interaction)。該界面的一個值得注意之特徵係Arg419(Cɛ3結構域)與Phe103(奧馬珠單抗Fab3 CDRH3)之間的陽離子π相互作用。Phe103側鏈大部分埋於由Thr373、Trp374、Ser375、Gln417及Arg419(Cɛ3結構域)產生的袋中。 圖4. 奧馬珠單抗Fab3及DARPin E2_79結合至重疊界面。奧馬珠單抗Fab3及DARPin E2_7920 皆結合至Cɛ3結構域。僅形成奧馬珠單抗Fab3界面之一部分的IgE-Fc殘基呈橙色，而僅形成DARPin E2_79界面之一部分且包括Cɛ3-Cɛ4連接子之一部分的殘基呈藍色。呈粉紅色的IgE-Fc殘基，包括Arg419及Met430在內，係奧馬珠單抗Fab3及DARPin E2_79界面共有的。圖 5 .IgE - Fc 之 構形柔性 。(A) 游離IgE-Fc8 之側視圖，顯示其尖銳的不對稱彎曲部分。(B)游離IgE-Fc之正視圖(由(A)中顯示之圖逆時針旋轉90°)。(C) 奧馬珠單抗Fab3複合物中IgE-Fc之側視圖，揭露部分彎曲之構形。(D) 奧馬珠單抗Fab3複合物中IgE-Fc之正視圖(由(C)中顯示之圖逆時針旋轉90°)。(E) 由抗-IgE-Fc Fab(奧馬珠單抗Fab3)16 捕捉的完全伸展之IgE-Fc的側視圖。(F) 伸展之IgE-Fc之正視圖(由(E)中顯示之圖逆時針旋轉90°)。圖 6 . IgE - Fc 之 構形柔性 。先前已藉由分子動力學16 研究IgE-Fc之柔性，且自彎曲形式伸直成完全伸展之構形。如先前所描述16 ，IgE-Fc伸直係表示為自由能表面。(A) IgE-Fc之伸展構形捕捉於奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物之晶體結構中16 。(B) 在奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物之晶體結構中觀察到部分彎曲之IgE-Fc構形。(C) 游離IgE-Fc之彎曲構形7 , 8 。IgE-Fc之彎曲構形佔據最低能量池，而在奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物中觀察到的部分彎曲之構形佔據明顯不同之能量池(B)。圖 7 . 破壞 IgE - Fc 與 Fc ɛ RI 之間之相互作用 。在奧馬珠單抗Fab3複合物中，Cɛ3結構域呈現迄今為止關於IgE-Fc所報導的最開放構形，妨礙了與FcɛRIα之接合。在與FcɛRIα8 之複合物中IgE-Fc之結構呈黃色，且指出受體接合之兩個子位點。在與IgE-Fc之複合物中奧馬珠單抗Fab3之結構重疊於Cɛ4結構域上，且Cɛ3結構域呈藍色。指出該兩個結構中His424及Pro426之位置，以突出顯示Cɛ3結構域所呈現的不同位置。圖 8 . 破壞 IgE - Fc 與 CD23 之間之相互作用 。(A) 奧馬珠單抗Fab3及CD23界面共有之Cɛ3結構域殘基呈粉紅色。(B) 來自奧馬珠單抗Fab3/IgE-Fc複合物及CD23/Fcɛ3-4複合物11 之Cɛ3結構域(呈深灰色)的疊加揭示CD23(黃色)與奧馬珠單抗Fab3(粉紅色)之間的碰撞。圖 9 . 奧馬珠單抗Fab3與IgE-Fc之相互作用研究。(A) 經由C末端His標籤捕捉的奧馬珠單抗Fab3與IgE-Fc之結合；奧馬珠單抗Fab3在以下濃度下流動越過IgE-Fc：100 nM(黑色)、50 nM(紅色)、25 nM(綠色)、12.5 nM(藍色)、6.2 nM(青色)、3.1 nM(紫色)、1.6 nM(洋紅色)及0.8 nM(深紅色)。採用標準雙參照法36 ；每種濃度均一式兩份操作。(B) 第二奧馬珠單抗Fab3結合位點之結合係使用SPR夾心結合實驗表徵。將IgE-Fc捕捉於奧馬珠單抗Fab3表面上，且接著將以下濃度之第二奧馬珠單抗Fab3分子添加至IgE-Fc/奧馬珠單抗Fab3複合物：1000 nM(黑色)、500 nM(紅色)、250 nM(綠色)、125 nM(藍色)、62.5 nM(青色)、31.2 nM(紫色)、15.6 nM(洋紅色)、7.8 nM(深紅色)及0 nM(藏青色)。(C) 由C末端His標籤(紅色)捕捉之奧馬珠單抗Fab3結合至IgE-Fc的能力及藉由結合至FcɛRIα(藍色)捕捉之IgE-Fc的比較；測試其各自的兩倍連續稀釋液，其中最高濃度係1000 nM。插圖顯示奧馬珠單抗Fab3仍可以結合至IgE-Fc/FcɛRIα複合物，但具有較低Bmax 值。(D) 藉由增加奧馬珠單抗Fab3之濃度介導的IgE-Fc/FcɛRIα複合物之加速解離。首先藉由捕捉在固定之FcɛRIα上的IgE-Fc且接著結合以下濃度之奧馬珠單抗Fab3來確定1:1 IgE-Fc/FcɛRIα複合物：5000 nM(洋紅色)、1000 nM(紫色)、200 nM(青色)、40 nM(藍色)、8 nM(綠色)、1.6 nM(紅色)及0 nM(黑色)。插圖顯示加速解離過程之放大圖。所有濃度均一式兩份操作。所有結合實驗均在25℃下進行，不過表徵第二奧馬珠單抗Fab3結合位點之實驗(圖4B)除外，該等實驗係在5℃下進行以使兩個位點之間的變構通信減到最少。 圖10.直接結合、競爭實驗及加速解離之分析。量測IgE-Fc與固定之奧馬珠單抗Fab3(A)、奧馬珠單抗Fab(B)及完整奧馬珠單抗(C)之直接結合。使用胺偶合套組(GE Healthcare)將Fab或完整抗體以低密度共價固定；使用兩倍連續稀釋液且最高濃度為100 nM，使多種濃度之IgE-Fc流動越過此等表面。所有濃度均一式兩份操作。(D) 奧馬珠單抗Fab3與αγ-融合蛋白之間關於IgE-Fc之TR-FRET競爭結合實驗。用遞增濃度的未標記奧馬珠單抗Fab3作為抑制劑量測鋱標記之αγ-融合蛋白與Alexa Fluor 647標記之IgE-Fc之間的結合：0 μM(黑色 )、2.5 nM(藍色 )、5 nM(綠色 )、10 nM(洋紅色 )、20 nM(紅色 )。作為抑制劑，奧馬珠單抗Fab同時影響IgE-Fc與αγ-融合蛋白之間之表觀KD 及Bmax ，指示一些變構抑制特性。(E) 由濃度各為5 μM之完整奧馬珠單抗(黑色)、奧馬珠單抗Fab(紅色)或奧馬珠單抗Fab3(藍色)介導的IgE-Fc/sFcɛRIα複合物之加速解離的比較。圖 11 . 代表性電子密度圖。顯示鏈A Cɛ3結構域之一部分及在Asn394處共價N鍵聯之寡醣部分在1.1σ處形成輪廓的2Fo -Fc 電子密度圖之立體觀察圖。 圖12. IgE-Fc自固定之sFcɛRIα解離的Biacore感測器圖譜。監測在操作緩衝液(實踐)或IgE結合搭配物(所有其他感測器圖譜)存在下之解離情況。如分析方法(1)實例2中所描述進行分析。 圖13. IgE-Fc自固定之sFcɛRIα解離的Biacore感測器圖譜。監測在對照上清液(實踐)或IgE結合搭配物(所有其他感測器圖譜)存在下之解離情況。如分析方法(2)實例2中所描述進行分析。 圖14. 有關Alexa488標記之IgE-Fc自RBL-SX38細胞之表面解離的分析。量測之結合資料針對在t=0時之100%標準化且解離資料繪製為殘留之經結合IgE-Fc之比例變化隨時間的變化。 圖15. 有關野生型奧馬珠單抗Fab及奧馬珠單抗Fab3之治療劑量對72小時PCA模型之影響的分析。 圖16. 野生型人類IgE-Fc序列(如SEQ ID NO:108中所示)之殘基224至547且殘基224及547以粗體顯示。編號係遵照Dorrington及Bennich(1978)Immunol. Rev. 41:3-25，其中在L253之後的L(Leu；白胺酸)係編號為L235a(加框)且隨後之殘基係C254。其餘殘基連續編號且無另外的添加。抗原決定基殘基以星號(*)顯示。
Figure TW201802114AD00129
Figure TW201802114AD00130
Figure TW201802114AD00131
Figure TW201802114AD00132
Figure TW201802114AD00133
Figure TW201802114AD00134
Figure TW201802114AD00135
Figure TW201802114AD00136
Figure TW201802114AD00137
Figure TW201802114AD00138
Figure TW201802114AD00139
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Figure TW201802114AD00144
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Figure TW201802114AD00150
Figure TW201802114AD00151
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Figure TW201802114AD00154
Figure TW201802114AD00155
Figure TW201802114AD00156
Figure TW201802114AD00157
Figure TW201802114AD00158
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Figure TW201802114AD00160
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Figure TW201802114AD00170
Figure TW201802114AD00171
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Figure TW201802114AD00175
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Figure TW201802114AD00177
Figure TW201802114AD00178
Figure TW201802114AD00179
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Figure TW201802114AD00181
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Figure TW201802114AD00184
Figure TW201802114AD00185
Figure TW201802114AD00186
Figure TW201802114AD00187
Figure TW201802114AD00188
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Figure TW201802114AD00190
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Figure TW201802114AD00199
Figure TW201802114AD00200
Figure TW201802114AD00201
Figure TW201802114AD00202
Figure TW201802114AD00203
Figure TW201802114AD00204
Figure TW201802114AD00205
Figure TW201802114AD00206
Figure TW201802114AD00207
Figure TW201802114AD00208
Figure TW201802114AD00209
Figure TW201802114AD00210
Figure TW201802114AD00211
Figure TW201802114AD00212
Figure TW201802114AD00213
Figure TW201802114AD00214
Figure TW201802114AD00215

Claims (152)

  1. 一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，其接觸包括下列之抗原決定基：參照SEQ ID NO:108，人類IgE Cɛ3結構域之殘基T373、W374、S375、R376、A377、S378、G379、P381、Q417、C418、R419、T421、P426、R427、A428以及Cɛ2結構域之殘基D278及T281。
  2. 如請求項1之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其接觸另外包含該人類IgE Cɛ3結構域之殘基K380的抗原決定基。
  3. 如請求項1或2之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其接觸另外包含該人類IgE Cɛ3結構域之殘基M430的抗原決定基。
  4. 如請求項1至3之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其接觸另外包含該人類IgE Cɛ2結構域之殘基D276的抗原決定基。
  5. 如請求項1至4之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其接觸另外包含該人類IgE Cɛ2結構域之殘基V277的抗原決定基。
  6. 如請求項1至5之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其接觸另外包含該人類IgE Cɛ2結構域之殘基L279的抗原決定基。
  7. 如請求項1至6之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其接觸另外包含該人類IgE Cɛ2結構域之殘基S280的抗原決定基。
  8. 如請求項1至7之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其接觸另外包含該人類IgE Cɛ2結構域之殘基A282(及/或T298)的抗原決定基。
  9. 如請求項1至8之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該Cɛ3結構域及該Cɛ2結構域係在該人類IgE之不同鏈上。
  10. 如請求項1至9之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其對該抗原決定基具有特異性。
  11. 一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，視情況如請求項1至10，其包括含胺基酸序列為SEQ ID NO: 18之互補決定區CDR-H3的重鏈可變區，及含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29之互補決定區CDR-L1的輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區另外包含具有選自SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的構架區FR-L3，該胺基酸序列具有一、二、三、四、五、六、七個或更多個胺基酸取代以加強該抗-IgE抗體或抗原結合劑與該人類IgE Cɛ2結構域之相互作用。
  12. 如請求項11之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中參照SEQ ID NO:129，該FR-L3區在S60、S63、S76、S77及/或Q79位置(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一。
  13. 如請求項11或12之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S60位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一。
  14. 如請求項11至13之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S60位(Kabat)突變成M、R、K、N、Q或T。
  15. 如請求項11至14之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S60位(Kabat)突變成M。
  16. 如請求項11至15之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S63位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一。
  17. 如請求項11至16之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S63位(Kabat)突變成W或Y。
  18. 如請求項11至17之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S63位(Kabat)突變成Y。
  19. 如請求項11至18之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S76位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一。
  20. 如請求項11至19之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S76位(Kabat)突變成N。
  21. 如請求項11至20之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S77位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一。
  22. 如請求項11至21之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S77位(Kabat)突變成R或K。
  23. 如請求項11至22之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S77位(Kabat)突變成R。
  24. 如請求項11至23之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在Q79位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一。
  25. 如請求項11至24之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在Q79位(Kabat)突變成R或K。
  26. 如請求項11至25之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在Q79位(Kabat)突變成R。
  27. 如請求項11至26之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該突變之FR-L3區的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 43-49、60-83、131或138。
  28. 如請求項11至26之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區進一步在S67位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一以改善其對人類IgE之親和力(降低KD )。
  29. 如請求項28之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S67位(Kabat)突變成M、E或D。
  30. 如請求項29之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該突變之FR-L3區的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 53-59、84-107、131或138。
  31. 如請求項1至30之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其視情況地包括含胺基酸序列為SEQ ID NO: 18之互補決定區CDR-H3的重鏈可變區，及含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29之互補決定區CDR-L1的輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 28之構架區FR-L1，該胺基酸序列具有一、二、三、四、五、六、七個或更多個胺基酸取代以加強該抗-IgE抗體或抗原結合劑與該人類IgE Cɛ2結構域的相互作用。
  32. 如請求項31之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中參照SEQ ID NO: 20，該FR-L1區在G16及/或R18位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一。
  33. 如請求項11至32之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 31之互補決定區CDR-L2。
  34. 如請求項33之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中參照SEQ ID NO:129，該CDR-L2區在S52位(Kabat)突變成其他天然胺基酸之一以改善其對人類IgE之親和力(降低KD )。
  35. 如請求項34之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L2區在S52位(Kabat)突變成E、D、Q或R。
  36. 如請求項35之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L2區在S52位(Kabat)突變成D(較佳)或E。
  37. 如請求項34至36之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該突變之CDR-L2區的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 51。
  38. 如請求項11至37之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 14之互補決定區CDR-H1。
  39. 如請求項11至38之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 16之互補決定區CDR-H2。
  40. 如請求項11至39之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 33之互補決定區CDR-L3。
  41. 如請求項11至40之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 13之構架區FR-H1。
  42. 如請求項11至41之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 15之構架區FR-H2。
  43. 如請求項11至42之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 17之構架區FR-H3。
  44. 如請求項11至43之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 19之構架區FR-H4。
  45. 如請求項11至44之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 30之構架區FR-L2。
  46. 如請求項11至45之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 34之構架區FR-L4。
  47. 如請求項11至46之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區VL具有選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 132或SEQ ID NO: 134，或SEQ ID NO: 139或SEQ ID NO: 141，或SEQ ID NO: 145-146，或SEQ ID NO: 158-159，視情況包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 160之信號序列。
  48. 如請求項11至47之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區VH具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1。
  49. 如請求項11至48之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其另外包含輕鏈恆定區。
  50. 如請求項49之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈恆定區係κ恆定區。
  51. 如請求項49或50之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈恆定區具有突變L154P(Kabat)。
  52. 如請求項49至51之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區及該輕鏈恆定區VL-CL具有選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 39，或SEQ ID NO: 41，或SEQ ID NO: 117，或SEQ ID NO: 119，或SEQ ID NO: 125，或SEQ ID NO: 127，或SEQ ID NO: 136，或SEQ ID NO: 143，視情況包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 160之信號序列。
  53. 如請求項11至52之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其另外包含重鏈恆定區CH1。
  54. 如請求項53之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區及該重鏈恆定區VH-CH1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5。
  55. 如請求項11至54之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其另外包含重鏈Fc區Fc。
  56. 如請求項55之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該Fc係來自人類IgG1或人類IgG4。
  57. 如請求項55或56之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區、該重鏈恆定區及該重鏈Fc區VH-CH1-Fc具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9。
  58. 一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，其包括含胺基酸序列為SEQ ID NO: 18之互補決定區CDR-H3的重鏈可變區，及含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29之互補決定區CDR-L1的輕鏈可變區，其中： a. 該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32之構架區FR-L3，其中該FR-L3區在S67位(Kabat，參照SEQ ID NO:129)突變成其他天然胺基酸之一以改善該抗-IgE抗體或抗原結合劑對人類IgE之親和力(降低KD )；及/或 b. 該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 31之互補決定區CDR-L2，其中該CDR-L2區在S52位(Kabat，參照SEQ ID NO: 129)突變成其他天然胺基酸之一以改善該抗-IgE抗體或抗原結合劑對人類IgE之親和力(降低KD )。
  59. 如請求項58之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S67位突變成M、E或D。
  60. 如請求項59之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該FR-L3區在S67位(Kabat)突變成M。
  61. 如請求項60之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該突變之FR-L3區的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 52-59、84-107、131或138。
  62. 如請求項58至61之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L2區在S52位(Kabat)突變成E、D、Q或R。
  63. 如請求項62之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L2區在S52位(Kabat)突變成D或E。
  64. 如請求項63之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L2區在S52位(Kabat)突變成D。
  65. 如請求項63或64之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該突變之CDR-L2區的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 50(較佳)或SEQ ID NO: 51。
  66. 如請求項58至65之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 14之互補決定區CDR-H1。
  67. 如請求項58至66之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 16之互補決定區CDR-H2。
  68. 如請求項58至67之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 33之互補決定區CDR-L3。
  69. 如請求項58至68之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 13之構架區FR-H1。
  70. 如請求項58至69之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 15之構架區FR-H2。
  71. 如請求項58至70之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 17之構架區FR-H3。
  72. 如請求項58至71之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 19之構架區FR-H4。
  73. 如請求項58至72之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 30之構架區FR-L2。
  74. 如請求項58至73之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區另外包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 34之構架區FR-L4。
  75. 如請求項58至74之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區VL包含連續FR-L1、CDR-L1、FR-L2、CDR-L2、FR-L3、CDR-L3及FR-L4區，且具有胺基酸序列SEQ ID NO: 20，不過該CDR-L2區具有選自SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 51之胺基酸序列。
  76. 如請求項58至74之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區VL包含連續FR-L1、CDR-L1、FR-L2、CDR-L2、FR-L3、CDR-L3及FR-L4區，且具有胺基酸序列SEQ ID NO: 20，不過該FR-L3區具有胺基酸序列SEQ ID NO: 52。
  77. 如請求項58至74之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區VL包含連續FR-L1、CDR-L1、FR-L2、CDR-L2、FR-L3、CDR-L3及FR-L4區，且具有胺基酸序列SEQ ID NO: 20，不過該CDR-L2區具有選自SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 51之胺基酸序列，且該FR-L3區具有選自SEQ ID NO: 52、131或138之胺基酸序列。
  78. 如請求項58至77之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區VH具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
  79. 如請求項58至78之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其另外包含輕鏈恆定區。
  80. 如請求項79之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈恆定區係κ恆定區。
  81. 如請求項79或80之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區及該輕鏈恆定區VL-CL具有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列，不過該CDR-L2區具有選自SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 51之胺基酸序列。
  82. 如請求項79或80之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區及該輕鏈恆定區VL-CL具有胺基酸序列SEQ ID NO: 24，不過該FR-L3區具有胺基酸序列SEQ ID NO: 52。
  83. 如請求項79或80之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區及該輕鏈恆定區VL-CL具有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列，不過該CDR-L2區具有選自SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 51之胺基酸序列，且該FR-L3區具有選自SEQ ID NO: 52、131或138之胺基酸序列。
  84. 一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中： a. 該重鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 14之CDR-H1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 16之CDR-H2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 18之CDR-H3，且該輕鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29之CDR-L1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 50之CDR-L2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 33之CDR-L3及胺基酸序列為SEQ ID NO: 131或138之構架區FW-L3；或 b. 該重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1且該輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO: 132或139之胺基酸序列。
  85. 如請求項84之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其另外包含輕鏈恆定區，其中該輕鏈可變區及該輕鏈恆定區VL-CL具有選自SEQ ID NO: 137或145之胺基酸序列，視情況包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 160之信號序列。
  86. 如請求項58至85之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其另外包含重鏈恆定區CH1。
  87. 如請求項86之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區及該重鏈恆定區VH-CH1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5。
  88. 如請求項58至87之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其另外包含重鏈Fc區，Fc。
  89. 如請求項88之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該Fc係來自人類IgG1或人類IgG4。
  90. 如請求項88或89之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區、該重鏈恆定區及該重鏈Fc區VH-CH1-Fc具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
  91. 如請求項1至90之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其係選自由以下組成之群：具有全長重鏈及輕鏈之完整抗體分子，或其片段。
  92. 如請求項1至91之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其係選自由以下組成之群：Fab片段、修飾之Fab'片段、Fab'片段、F(ab')2 片段、Fv、scFv、scab、雙功能抗體、雙特異性抗體、三功能抗體、FabFv、Fab-Fv-Fv、三鏈抗體或(Fab-Fv)2 -Fc。
  93. 如請求項92之抗-IgE抗體，其係直接或經由連接子連接至scFv之Fab片段，該scFv結合至血清載體蛋白，諸如人類血清白蛋白。
  94. 如請求項93之抗-IgE抗體，其中該scFv包含較佳經由具有SEQ ID NO: 151之連接子連接的重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 152之CDR-H1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 153之CDR-H2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 154之CDR-H3，且該輕鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 155之CDR-L1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 156之CDR-L2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 157之CDR-L3。
  95. 如請求項93或94之抗-IgE抗體，其中該scFv具有胺基酸序列SEQ ID NO: 150。
  96. 如請求項93或94之抗-IgE抗體，其中該Fab片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中： a. 該重鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 14之CDR-H1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 16之CDR-H2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 18之CDR-H3，且該輕鏈可變區包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29之CDR-L1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 50之CDR-L2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 33之CDR-L3及胺基酸序列為SEQ ID NO: 131或138之構架區FW-L3；或 b. 該重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1且該輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO: 132或139之胺基酸序列。
  97. 如請求項96之抗-IgE抗體，其中該Fab片段另外包含重鏈恆定區及輕鏈恆定區，其中該重鏈可變區及該重鏈恆定區VL-CH1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5並且其中該輕鏈可變區及該輕鏈恆定區VL-CL具有選自SEQ ID NO: 136或143之胺基酸序列，視情況包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 160之信號序列。
  98. 如請求項93或97之抗-IgE抗體，其中該scFv係經由具有胺基酸序列SEQ ID NO: 149之連接子連接至該Fab片段之CH1。
  99. 如請求項93或98之抗-IgE抗體，其中該重鏈可變區及該重鏈恆定區、該連接子及該scFv具有胺基酸序列SEQ ID NO: 147，視情況包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 160之信號序列。
  100. 如請求項1至99之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其連接有效應子或報告子分子。
  101. 如請求項1至100之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該抗-IgE抗體或抗原結合劑經糖基化及/或偶聯至選自澱粉、白蛋白及聚乙二醇(PEG)之聚合物。
  102. 如請求項101之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該聚合物係分子量在5至50 kDa範圍內之PEG。
  103. 如請求項1至102之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其經人類化。
  104. 一種分離之DNA序列，其編碼如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑之重鏈及/或輕鏈。
  105. 一種選殖或表現載體，其包含一或多個如請求項104之DNA序列。
  106. 一種選殖或表現載體，其包含一或多個選自以下之DNA序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40或SEQ ID NO: 42，或SEQ ID NO: 133，或SEQ ID NO: 135，或SEQ ID NO: 137，或SEQ ID NO: 140，或SEQ ID NO: 142，或SEQ ID NO: 144。
  107. 如請求項106之選殖或表現載體，其另外包含一或多個選自以下之DNA序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 148。
  108. 一種宿主細胞，其包含一或多個如請求項105至107之選殖或表現載體。
  109. 如請求項108之宿主細胞，其另外包含一或多個選殖或表現載體，該一或多個選殖或表現載體包含一或多個選自以下之DNA序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 148。
  110. 一種用於製造如請求項1至94之抗-IgE抗體或抗原結合劑的方法，其包含培養如請求項108或109之宿主細胞及分離該抗-IgE抗體或抗原結合劑。
  111. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
  112. 如請求項111之醫藥組合物，其中該抗-IgE抗體或抗原結合劑係每毫升稀釋劑存在劑量50至200 mg，較佳150 mg。
  113. 如請求項111或112之醫藥組合物，其中該賦形劑包含L-精胺酸。
  114. 如請求項111至113之醫藥組合物，其中該賦形劑包含L-組胺酸。
  115. 如請求項111至114之醫藥組合物，其中該賦形劑包含聚山梨醇酯20。
  116. 如請求項111至115之醫藥組合物，其中該稀釋劑係水。
  117. 如請求項111至116之醫藥組合物，其中該組合物係裝載於無菌注射器內以供其皮下投與。
  118. 如請求項111至117之醫藥組合物，其中該組合物含有75至600 mg總劑量之抗-IgE抗體或抗原結合劑。
  119. 如請求項111至118之醫藥組合物，其另外包含與該抗-IgE抗體或抗原結合劑一起或用於與該抗-IgE抗體或抗原結合劑分開共投與的其他活性成分。
  120. 如請求項119之醫藥組合物，其中該抗-IgE抗體或抗原結合劑係與基於過敏之特定免疫療法分開共投與。
  121. 如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項102至111之組合物，其係用作藥物。
  122. 如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項102至111之組合物，其係用於治療或預防疾病。
  123. 如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項102至111之組合物，其係用於治療或預防與人類IgE及FcɛRI之複合物有關的病症。
  124. 如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項102至111之組合物，其係經由解離該人類IgE及FcɛRI之複合物及該抗-IgE抗體或抗原結合劑結合人類IgE而用於治療或預防病症。
  125. 如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項111至120之組合物，其係用於治療或預防以下一或多種：過敏；過敏性哮喘；重度哮喘；中度哮喘；慢性自發性風疹；慢性特發性風疹；常年性過敏性鼻炎；季節性過敏性鼻炎；急性哮喘惡化；急性支氣管痙攣；哮喘持續狀態；高IgE症候群；過敏性支氣管肺麯黴病；全身過敏性反應之預防；食物過敏；異位性皮炎；過敏性鼻炎；蜂毒過敏；特發性全身性過敏反應；花生過敏；乳膠過敏；炎性皮膚病；風疹(日光、冷誘發、局部熱誘發及/或長期壓力誘發)；皮膚肥大細胞增多症；全身肥大細胞增多症；嗜伊紅血球相關胃腸病症；大皰性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻息肉；特發性血管性水腫；或非過敏性哮喘。
  126. 一種用於治療或預防人類個體之疾病的方法，該方法包含向該個體投與有效量的如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項111至120之組合物。
  127. 如請求項126之方法，其係用於治療或預防與人類IgE及FcɛRI之複合物有關的病症。
  128. 如請求項126或127之方法，其中該治療或預防係經由解離該人類IgE及FcɛRI之複合物及該抗-IgE抗體或抗原結合劑結合人類IgE實現。
  129. 如請求項126至128之方法，其用於治療或預防以下一或多種：過敏；過敏性哮喘；重度哮喘；中度哮喘；慢性自發性風疹；慢性特發性風疹；常年性過敏性鼻炎；季節性過敏性鼻炎；急性哮喘惡化；急性支氣管痙攣；哮喘持續狀態；高IgE症候群；過敏性支氣管肺麯黴病；全身過敏性反應之預防；食物過敏；異位性皮炎；過敏性鼻炎；蜂毒過敏；特發性全身性過敏反應；花生過敏；乳膠過敏；炎性皮膚病；風疹(日光、冷誘發、局部熱誘發及/或長期壓力誘發)；皮膚肥大細胞增多症；全身肥大細胞增多症；嗜伊紅血球相關胃腸病症；大皰性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻息肉；特發性血管性水腫；或非過敏性哮喘。
  130. 如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項111至120之組合物，或如請求項121至125之抗-IgE抗體或抗原結合劑或組合物，或如請求項126至129之方法，其中該抗-IgE抗體或抗原結合劑能夠在小於7、3、1、0.66、0.5或0.3 μM濃度(或峰值血清濃度)下將人類IgE自FcɛRI解離。
  131. 如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項111至120之組合物，或如請求項121至125之抗-IgE抗體或抗原結合劑或組合物，或如請求項126至129之方法，其中該抗-IgE抗體或抗原結合劑能夠在小於奧馬珠單抗(omalizumab)(或替代地，奧馬珠單抗Fab)之濃度(或峰值血清濃度)下將人類IgE自FcɛRI解離。
  132. 如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項111至120之組合物，或如請求項121至125之抗-IgE抗體或抗原結合劑或組合物，或如請求項126至129之方法，其中該抗-IgE抗體或抗原結合劑能夠以高於奧馬珠單抗(或替代地，奧馬珠單抗Fab)之%解離將人類IgE自FcɛRI解離。
  133. 如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項111至120之組合物，或如請求項121至125之抗-IgE抗體或抗原結合劑或組合物，或如請求項126至129之方法，其中該抗-IgE抗體或抗原結合劑能夠以高於奧馬珠單抗(或替代地，奧馬珠單抗Fab)之表觀解離速率將人類IgE自FcɛRI解離。
  134. 如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項111至120之組合物，或如請求項121至125之抗-IgE抗體或抗原結合劑或組合物，或如請求項126至129之方法，其中該抗-IgE抗體或抗原結合劑具有比奧馬珠單抗(或替代地，奧馬珠單抗Fab)低至少10%的改良之對於人類IgE(例如使用IgE-Fc)的親和力(KD )。
  135. 如請求項1至103之抗-IgE抗體或抗原結合劑，或如請求項111至120之組合物，或如請求項121至125之抗-IgE抗體或抗原結合劑或組合物，或如請求項126至129之方法，其中該抗-IgE抗體或抗原結合劑不為奧馬珠單抗或奧馬珠單抗Fab。
  136. 一種結合至游離及FcɛRI結合之人類IgE的抗體或抗原結合劑，其中該抗體或抗原結合劑結合至該FcɛRI結合之人類IgE且使該IgE改變構形，其中呈該構形的該FcɛRI結合之人類IgE對於FcɛRI之結合親和力比在無該抗體或抗原結合劑存在下要弱且其中該FcɛRI結合之人類IgE自FcɛRI解離。
  137. 如請求項136之抗體或抗原結合劑，其中呈該構形的該FcɛRI結合之人類IgE對於奧馬珠單抗或其片段的結合親和力低於對於該抗體或抗原結合劑的結合親和力。
  138. 如請求項136至137之抗體或抗原結合劑，其係如請求項1至103、130至135中任一項之抗體。
  139. 如請求項136至138之抗體或抗原結合劑，其係用作藥物。
  140. 如請求項136至138之抗體或抗原結合劑，其係用於治療或預防與人類IgE及FcɛRI之複合物有關的病症。
  141. 如請求項136至138之抗體或抗原結合劑，其係經由解離該人類IgE及FcɛRI之複合物及由該抗體或抗原結合劑結合人類IgE而用於治療或預防病症。
  142. 如請求項136至138之抗體或抗原結合劑，其係用於治療或預防以下一或多種：過敏；過敏性哮喘；重度哮喘；中度哮喘；慢性自發性風疹；慢性特發性風疹；常年性過敏性鼻炎；季節性過敏性鼻炎；急性哮喘惡化；急性支氣管痙攣；哮喘持續狀態；高IgE症候群；過敏性支氣管肺麯黴病；全身過敏性反應之預防；食物過敏；異位性皮炎；過敏性鼻炎；蜂毒過敏；特發性全身性過敏反應；花生過敏；乳膠過敏；炎性皮膚病；風疹(日光、冷誘發、局部熱誘發及/或長期壓力誘發)；皮膚肥大細胞增多症；全身肥大細胞增多症；嗜伊紅血球相關胃腸病症；大皰性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻息肉；特發性血管性水腫；或非過敏性哮喘。
  143. 一種用於治療或預防人類個體之疾病的方法，該方法包含向該個體投與有效量的如請求項136至138之抗體或抗原結合劑。
  144. 如請求項143之方法，其係用於治療或預防與人類IgE及FcɛRI之複合物有關的病症。
  145. 如請求項143或144之方法，其中該治療或預防係經由解離該人類IgE及FcɛRI之複合物及由該抗體或抗原結合劑結合人類IgE實現。
  146. 如請求項143至145之方法，其用於治療或預防以下一或多種：過敏；過敏性哮喘；重度哮喘；中度哮喘；慢性自發性風疹；慢性特發性風疹；常年性過敏性鼻炎；季節性過敏性鼻炎；急性哮喘惡化；急性支氣管痙攣；哮喘持續狀態；高IgE症候群；過敏性支氣管肺麯黴病；全身過敏性反應之預防；食物過敏；異位性皮炎；過敏性鼻炎；蜂毒過敏；特發性全身性過敏反應；花生過敏；乳膠過敏；炎性皮膚病；風疹(日光、冷誘發、局部熱誘發及/或長期壓力誘發)；皮膚肥大細胞增多症；全身肥大細胞增多症；嗜伊紅血球相關胃腸病症；大皰性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻息肉；特發性血管性水腫；或非過敏性哮喘。
  147. 一種用於選擇如請求項1至103或130至138之抗體或抗原結合劑的方法，其中該方法包含： a. 使測試抗體或抗原結合劑與包含結合至人類FcɛRI之人類IgE的樣品接觸； b. 量測該測試抗體或抗原結合劑將該人類IgE自人類FcɛRI解離的解離常數； c.將如步驟b)中量測的解離常數與奧馬珠單抗或其片段將該人類IgE自人類FcɛRI解離之解離常數相比較； d. 若該抗體或抗原結合劑將該IgE自FcɛRI解離比奧馬珠單抗或其片段要快，則選擇該抗體或抗原結合劑。
  148. 一種用於選擇如請求項1至103或130至138之抗體或抗原結合劑的方法，其中該方法包含： a. 使測試抗體或抗原結合劑與包含結合至人類FcɛRI之人類IgE的樣品接觸； b. 量測該測試抗體或抗原結合劑對來自人類FcɛRI之人類IgE的結合親和力； c. 將如步驟b)中量測之結合親和力與人類IgE對FcɛRI的結合親和力相比較； d. 若該抗體或抗原結合劑對IgE之結合親和力高於該IgE對FcɛRI之結合親和力，則選擇該抗體或抗原結合劑。
  149. 如請求項147或148之方法，其中該選擇的抗體或抗原結合劑使該IgE儘管仍結合至FcɛRI，但呈現一構形，其中呈該穩定構形之該IgE a.在奧馬珠單抗或其片段存在下，自FcɛRI解離比結合至FcɛRI之IgE快；及/或 b. 對該抗體或抗原結合劑之結合親和力高於對該FcɛRI之結合親和力。
  150. 一種抗-IgE抗體或抗原結合劑，其包含： a. 含SEQ ID NO:1之重鏈可變區，及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含： i. SEQ ID NO: 109；或 ii. SEQ ID NO: 113；或 iii. SEQ ID NO: 121；或 iv. SEQ ID NO: 132；或 v. SEQ ID NO: 139；或 b. SEQ ID NO: 5；及 i. SEQ ID NO: 24，其中S77及S79經Q置換； ii. SEQ ID NO: 117；或 iii. SEQ ID NO: 125；或 iv. SEQ ID NO: 136；或 v. SEQ ID NO: 143。
  151. 如請求項150之抗-IgE抗體或抗原結合劑，其中該抗體或抗原結合劑接觸下列抗原決定基，或接觸下列抗原決定基且對其等具有特異性：參照SEQ ID NO:108，包含人類IgE Cɛ3結構域之殘基T373、W374、S375、R376、A377、S378、G379、P381、Q417、C418、R419、T421、P426、R427、A428以及Cɛ2結構域之殘基D278及T281。
  152. 一種結合第一多肽之抗體或抗原結合劑，該第一多肽藉由結合至第二多肽(諸如受體)而引起其生理反應，其中該抗體或抗原結合劑能夠結合至游離及經結合第一多肽兩者，使該第一多肽之構形穩定且其中呈該穩定構形之該第一多肽在該抗體或抗原結合劑存在下與無該抗體或抗原結合劑存在下相比對該第二多肽具有較低結合親和力，且其中該抗體或抗原結合劑觸發該第一多肽更快自該第二多肽解離。
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