KR20190017949A - 항-IgE 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 예를 들면 IgE에 의해 유발된 장애(예컨대, 알레르기성 반응 또는 일부 자가면역 반응); 특히 IgE와 FcεRI 수용체의 상호작용에 의해 유발된 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 개선된 항-IgE 항체 및 항원 결합 물질, 및 이의 조성물의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 오말리주맙(omalizumab)(Xolair®)의 신규 돌연변이체와 관련된 개선된 항-IgE 항체 및 항원 결합 물질에 관한 것이다. 본 발명의 개선된 항-IgE 항체 및 항원 결합 물질은, 예를 들면, 약학적으로 적절한 농도에서 IgE에 대한 개선된 친화성 및/또는 IgE의 Cε2 도메인 및/또는 (예를 들면, IgE의 Cε2 도메인을 추가로 포함하는) IgE의 개선된 변형된 에피토프와의 개선된 상호작용, 및/또는 FcεRI 수용체로부터 IgE를 해리시키는 능력을 가질 수 있다. 한 양태에서, IgE(예를 들면, 유리 IgE 및/또는 FcεRI 수용체와 복합체를 형성한 IgE)가 표적화되는, IgE 매개 장애의 개선된 또는 신규 치료가 개시된다.
Description
본 발명은, 예를 들면, IgE에 의해 유발된 장애(예컨대, 알레르기성 반응 또는 일부 자가면역 반응); 특히 IgE와 FcεRI 수용체의 상호작용에 의해 유발된 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 개선된 항-IgE 항체 및 항원 결합 물질, 및 이의 조성물의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 오말리주맙(omalizumab)(Xolair®)의 신규 돌연변이체와 관련된 개선된 항-IgE 항체 및 항원 결합 물질에 관한 것이다. 본 발명의 개선된 항-IgE 항체 및 항원 결합 물질은 약학적으로 적절한 농도에서 IgE에 대한 개선된 친화성 및/또는 IgE의 Cε2 도메인 및/또는 (예를 들면, IgE의 Cε2 도메인을 추가로 포함하는) IgE의 개선된 변형된 에피토프와의 개선된 상호작용, 및/또는 FcεRI 수용체로부터 IgE를 해리시키는 능력을 가질 수 있다. 한 양태에서, IgE(예를 들면, 유리 IgE 및/또는 FcεRI 수용체와 복합체를 형성한 IgE)가 표적화되는, IgE 매개 장애의 개선된 또는 신규 치료가 개시된다.
IgE는 광범위하게 고통받는 알레르기성 반응, 예컨대, 천식, 음식물 알레르기, 1형 과민성 및 가족성 부비강 염증을 매개하는 면역글로불린 패밀리의 구성원이다. IgE는 B 세포에 의해 분비되고 B 세포의 표면에서 발현된다. B 세포에 의해 합성된 IgE는 짧은 막 결합 영역에 의해 성숙 IgE 서열에 연결된 막횡단 도메인에 의해 B 세포 막에 고착된다. IgE는 저친화성 IgE 수용체(FcεRII)에 대한 그의 Fc 영역을 통해 B 세포(및 단핵구, 호산구 및 혈소판)에 결합된다. 포유동물이 알레르겐에 노출되었을 때, 알레르겐에 결합하는 IgE를 합성하는 B 세포가 클론 증폭된다. 이어서, 이 IgE는 B 세포에 의해 순환계 내로 방출되는데, 이때 IgE는 (FcεRII를 통해) B 세포에 의해 결합되고, 비만 세포 및 호염기구의 표면에서 발견되는 소위 고친화성 수용체(FcεRI)를 통해 비만 세포 및 호염기구에 의해 결합된다. 이로써, 이러한 비만 세포 및 호염기구는 알레르겐에 대해 감작된다. 알레르겐에의 다음 노출은 이 세포들에서 FcεRI을 가교결합시킴으로써, 이들이 임상적 과민성 및 아나필락시스의 원인이 되는 히스타민 및 다른 인자를 방출하도록 활성화시킨다.
오말리주맙(Xolair®)은 인간 면역글로불린 E(IgE)[Cε3 도메인]에 선택적으로 결합하는 재조합 DNA 유래의 인간화된 IgG1κ 단일클론 항체이다. 이 항체는 대략 149 kD의 분자량을 갖는다. Xolair®는 항생제 젠타미신을 함유하는 영양분 배지에서의 중국 햄스터 난소 세포 현탁 배양에 의해 생성된다. Xolair®는 주사용 멸균수(SWFI)(USP)에 의해 (또는 대안적으로 멸균 주사기 내의 액체 제형으로서) 재구성되고 피하(SC) 주사로서 투여되는, 1회용 바이알 내의 멸균 백색 보존제 무함유 동결건조된 분말이다[유럽 특허 제602126호(및 이에 기반을 둔 SPC/GB06/005); 국제 특허출원 공보 제WO93/04173호; 미국 특허 제6267958호(및 이 특허에 기반을 둔 Xolair® PTE); 국제 특허출원 공보 제WO97/04807호; 국제 특허출원 공보 제WO97/04801호; 문헌(Presta et al. (1993) J. Immunol. 151:2623-2632) 참조].
오말리주맙은 사계절 공기알레르겐에 대한 양성 피부 테스트 또는 시험관내 반응성을 갖는 환자의 중등증 내지 중증 지속성 천식, 및 흡입된 코르티코스테로이드에 의해 부적절하게 조절되는 증상을 치료하기 위한 것으로서 현재 표시되어 있다(Xolair® 처방 정보).
오말리주맙의 문제점은 1) 오말리주맙이 약학적으로 적절한 용량에서 유리 IgE를 표적화하나, IgE/FcεRI 복합체인 병원성 종을 표적화하지 않는(또는 효율적으로 표적화하지 않는)다는 점; 2) 가능하게는 표적화되지 않는 IgE/FcεRI 복합체인 병원성 종으로 인해, "Xolair 치료가 효과를 보이는 데 적어도 12주 내지 16주"가 소요되거나(Xolair® 150 mg 용액 - 제품 특성의 요약 2014 - 사실상 Xolair®가 특정 환자를 위해 작동할 지 또는 상이한 치료가 필요한 지를 확립하는 데 적어도 12주 내지 16주가 소요된다는 점; 3) (예를 들면, IgE/FcεRI 복합체라는 병원성 종이 표적화되지 않고 환자에서 고수준의 유리 IgE의 제공 시 소멸되지 않기 때문에) 환자가 고수준의 IgE를 가질 필요가 없다는 점; 4) "아나필락시스 및 아나필락시스성 쇼크를 포함하는 I형 국소 또는 전신 반응이 오말리주맙을 복용할 때 일어날 수 있다"는 점(Xolair® 150 mg 용액 - 제품 특성의 요약 2014); 5) IgE에 대한 친화성(대략 2 nM)이 특별히 우수하지 않다는 점에 있다.
본 발명의 목적은 이 문제점들 중 하나 이상의 문제점을 개선하는 신규 항체를 확인하는 것이다.
추가 목적은 (오말리주맙에 비해 증가된 IgE Cε2 상호작용을 가진) 신규 에피토프에 대한 항체, 및/또는 개선된 친화성 및/또는 IgE/FcεRI 복합체를 해리시키는 개선된 능력을 갖는 오말리주맙의 신규 돌연변이체에 기반을 둔 항체를 확인하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 IgE와 관련된 장애, 특히 IgE/FcεRI의 복합체와 관련된 장애, 예를 들면, 알레르기성 장애를 치료하는 신규 화합물, 방법 및 조성물을 확인하는 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 인간 IgE의 Cε3 도메인의 잔기 T373, W374, S375, R376, A377, S378, G379, P381, Q417, C418, R419, T421, P426, R427, A428, 및 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 D278 및 T281을 포함하는 에피토프와 접촉하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질을 제공한다. 추가 실시형태에서, 상기 에피토프는 인간 IgE의 Cε3 도메인의 잔기 K380 및/또는 M430 중 하나 이상의 잔기, 및/또는 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 D276, V277, L279, S280, A282 및/또는 T298 중 하나 이상의 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 (오말리주맙에 기반을 둔) 개선된 항체와 IgE-Fc의 상호작용을 처음으로 보여준 실시예 1의 결정 구조의 관찰에 기반을 두는데, 이때 유의미한 상호작용은 돌연변이의 영역 내의 IgE Cε2 도메인에서 관찰되었다. 이것은 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab에 비해 상기 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 기능적 특성을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 (예를 들면, 실시예 2에 기재된 방법에 의해 수행될 때) 7, 3, 1, 0.66, 0.5 또는 0.3 μM 미만의 농도(또는 피크 혈청 농도)에서 FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시킬 수 있다. 예를 들면, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 (예를 들면, 실시예 6에 기재된 방법에 의해 수행될 때) 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab에 비해 인간 IgE(예를 들면, IgE-Fc를 사용함)에 대한 개선된/더 강한 친화성(더 낮은 KD); (예를 들면, 실시예 2에 기재된 방법에 의해 측정될 때) 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab에 비해 IgE/FcεRI 복합체를 해리시키는 개선된 능력; 및/또는 (예를 들면, 실시예 2에 기재된 방법에 의해 측정될 때) 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab보다 더 낮은 농도(또는 피크 혈청 농도)에서 FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시키는 성능을 가질 수 있다. 개선된 KD는 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab의 KD보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 더 낮은 KD를 의미한다. 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 KD는 2, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4 또는 0.3 nM 미만일 수 있다. FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시키는 개선된 능력 또는 성능은 (예를 들면, 실시예 2 및 7에 기재된 바와 같이 IgE/FcεRI 복합체의 % 해리 및/또는 겉보기 해리 속도를 측정할 때) 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab에 비해 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 100% 개선된 능력 또는 성능, 및/또는 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab가 해리를 달성하지 않는 농도에서의 해리의 달성을 의미한다.
의심을 피하기 위해, 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 오말리주맙 또는 오말리주맙 Fab가 아니다.
한 실시형태에서, 에피토프는 복합체를 형성한 IgE-Fc/항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 결정 구조에서 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 4 또는 5 Å 이내에서 IgE 잔기를 확인함으로써 (예를 들면, 실시예 1에 기재된 바와 같이) 결정학적으로 확인된다. 사용된 IgE-Fc는 (추가 N265Q & N371Q 돌연변이를 가진) 서열번호 108의 IgE-Fc일 수 있다.
한 실시형태에서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 특정 결합 부위에서 에피토프와 접촉하고, 이때 상기 에피토프의 Cε3 도메인 및 Cε2 도메인 부분은 인간 IgE의 서로 다른 쇄에 존재한다. IgE는 Cε3 도메인 및 Cε2 도메인을 각각 갖는 Fc 도메인에서 2개의 쇄를 갖는다.
한 실시형태에서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 특정 결합 부위에서 에피토프와 접촉하고, 이때 상기 에피토프의 Cε3 도메인 및 Cε2 도메인 부분은 인간 IgE의 동일한 쇄에 존재한다.
의심을 피하기 위해, 본 발명의 2종의 항-IgE 항체들 또는 항원 결합 물질들은 인간 IgE에 결합할 수 있으나, 이들 중 하나만이 Cε3 및 Cε2 도메인을 포함하는 본 발명의 에피토프와 상호작용할 필요가 있다(나머지 하나는 예를 들면, 다른 Cε3 도메인과만 상호작용할 수 있다).
(경우에 따라 본 발명의 제1 양태의 특징을 더 채택하는) 한 실시형태에서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 인간 IgE의 Cε3 도메인의 잔기 T373, W374, S375, R376, A377, S378, G379, P381, Q417, C418, R419, T421, P426, R427, A428, 및 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 D278 및 T281을 포함하는 상기 에피토프에 특이적이다. 경우에 따라, 상기 에피토프는 인간 IgE의 Cε3 도메인의 잔기 K380 및/또는 M430 중 하나 이상의 잔기, 및/또는 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 D276, V277, L279, S280, A282 및/또는 T298 중 하나 이상의 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 의심을 피하기 위해, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 일반적으로 인간 IgE보다 오히려 상기 에피토프를 포함하는 특정 인간 IgE 구조를 인식하고 이에 결합하는 경우 상기 에피토프에 특이적이다.
(경우에 따라 본 발명의 제1 양태의 특징을 추가로 채택하는) 추가 양태에서, 서열번호 18인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 29인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 제공되고, 이때 상기 경쇄 가변 영역은, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질과 인간 IgE의 Cε2 도메인의 상호작용을 강화시키기 위해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그보다 많은 아미노산 치환을 갖는, 서열번호 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 프레임워크(framework) 영역 FR-L3을 추가로 포함한다.
(경우에 따라 본 발명의 이전 양태들의의 특징을 추가로 채택하는) 추가 양태에서, 서열번호 18인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 29인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 제공되고, 이때 경쇄 가변 영역은, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질과 인간 IgE의 Cε2 도메인의 상호작용을 강화시키기 위해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그보다 많은 아미노산 치환을 갖는, 서열번호 28인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L1을 추가로 포함한다.
CDR-H3 및 CDR-L1 영역이 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질을 (오말리주맙과 같이) IgE Cε3 영역에 고착시키고 배향시키는 경우, FR-L3 및/또는 FR-L1 서열의 변화(들)는 인간 IgE의 Cε2 도메인과의 보다 더 강한 상호작용을 가능하게 한다. 오말리주맙 또는 오말리주맙 Fab에 비해 돌연변이체의 보다 더 강한 상호작용은 (예를 들면, 실시예 6에 기재된 방법에 의해 수행된 바와 같은) 친화성 측정[보다 더 낮은 KD] 및/또는 (예를 들면, 실시예 2에 기재된 방법에 의해 확인된 바와 같은) IgE/FcεRI 복합체의 개선된 해리라는 특성을 통해 추정될 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질과 인간 IgE의 Cε2 도메인의 보다 더 강한 상호작용은 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab에 비해 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 개선된 기능적 특성을 특징으로 할 수 있다. 예를 들면, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 (예를 들면, 실시예 2에 기재된 방법에 의해 수행될 때) 7, 3, 1, 0.66, 0.5 또는 0.3 μM 미만의 농도(또는 피크 혈청 농도)에서 FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시킬 수 있다. 예를 들면, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 (예를 들면, 실시예 6에 기재된 방법에 의해 수행될 때) 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab에 비해 인간 IgE(예를 들면, IgE-Fc를 사용함)에 대한 개선된/더 강한 친화성(보다 더 낮은 KD); 및/또는 (예를 들면, 실시예 2에 기재된 방법에 의해 측정될 때) 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab에 비해 IgE/FcεRI 복합체를 해리시키는 개선된 능력; 및/또는 (예를 들면, 실시예 2에 기재된 방법에 의해 측정될 때) 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab보다 더 낮은 농도(또는 피크 혈청 농도)에서 FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시키는 성능을 가질 수 있다. 개선된 KD는 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab의 KD보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 더 낮은 KD를 의미한다. 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 KD는 2, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4 또는 0.3 nM 미만일 수 있다. FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시키는 개선된 능력 또는 성능은 (예를 들면, 실시예 2 및 7에 기재된 바와 같이 IgE/FcεRI 복합체의 % 해리 및/또는 겉보기 해리 속도를 측정할 때) 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab에 비해 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 100% 개선된 능력 또는 성능, 및/또는 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab가 해리를 달성하지 못하는 농도에서 해리의 달성을 의미한다.
의심을 피하기 위해, 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 오말리주맙 또는 오말리주맙 Fab가 아니다.
한 실시형태에서, FR-L3 영역은 서열번호 129와 관련하여 위치 S60, S63, S76, S77 및/또는 Q79(카바트(Kabat)) 중 하나 이상의 위치에서 다른 천연 아미노산들 중 한 아미노산으로 돌연변이된다.
예를 들면, FR-L3 영역은 위치 S60(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 한 아미노산, 예를 들면, M, R, K, N, Q 또는 T, 특히 M으로 돌연변이될 수 있다.
예를 들면, FR-L3 영역은 위치 S63(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 한 아미노산, 예를 들면, W 또는 Y, 특히 Y로 돌연변이될 수 있다.
예를 들면, FR-L3 영역은 위치 S76(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 한 아미노산, 특히 N으로 돌연변이될 수 있다.
예를 들면, FR-L3 영역은 위치 S77(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 한 아미노산, 예를 들면, R 또는 K, 특히 R로 돌연변이될 수 있다.
예를 들면, FR-L3 영역은 위치 Q79(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 한 아미노산, 예를 들면, R 또는 K, 특히 R로 돌연변이될 수 있다.
예를 들면, FR-L1 영역은 서열번호 20과 관련하여 G16 및/또는 R18(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 한 아미노산으로 돌연변이될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 돌연변이된 FR-L3 영역의 아미노산 서열은 서열번호 43 내지 49, 60 내지 83, 131 또는 138로부터 선택된다.
추가 실시형태에서, FR-L3 영역은 인간 IgE에 대한 친화성을 개선하기 위해(KD를 낮추기 위해) 서열번호 129와 관련하여 위치 S67(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 한 아미노산으로 돌연변이되어 있다. 이 경우, 돌연변이는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질과 IgE의 Cε3 도메인의 상호작용을 강화시킬 수 있다. 예를 들면, FR-L3 영역은 위치 S67(카바트)에서 M(특히), E 또는 D로 돌연변이될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 돌연변이된 FR-L3 영역의 아미노산 서열은 서열번호 53 내지 59, 84 내지 107, 131 또는 138로부터 선택된다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 31인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L2를 추가로 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
한 실시형태에서, CDR-L2 영역은 인간 IgE에 대한 친화성을 개선하기 위해(KD를 낮추기 위해) 위치 S52(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 한 아미노산으로 돌연변이되어 있다. 이 경우, 돌연변이는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질과 IgE의 Cε3 도메인의 상호작용을 강화시킬 수 있다. 예를 들면, CDR-L2 영역은 서열번호 129와 관련하여 위치 S52(카바트)에서 D(특히), E, Q 또는 R로 돌연변이될 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 CDR-L2 영역의 아미노산 서열은 서열번호 50 또는 서열번호 51로부터 선택된다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 14인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H1을 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 16인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H2를 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 33인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L3을 추가로 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 13인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H1을 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 15인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H2를 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 17인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H3을 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 19인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H4를 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 30인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L2를 추가로 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 34인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L4를 추가로 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 35, 서열번호 132 또는 서열번호 134 또는 서열번호 141 또는 서열번호 144, 또는 서열번호 145 또는 서열번호 158 또는 서열번호 159로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 VL을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 1인 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 VH를 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 카파 불변 영역인 경쇄 불변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 돌연변이 L154P(카바트)를 갖는 경쇄 불변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은, 서열번호 160인 아미노산 서열을 갖는 신호 서열을 경우에 따라 포함하는, 서열번호 39, 또는 서열번호 41, 또는 서열번호 117, 또는 서열번호 119, 또는 서열번호 125, 또는 서열번호 127, 또는 서열번호 136 또는 서열번호 143으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 중쇄 불변 영역 CH1을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 5인 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역 VH-CH1을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 중쇄 Fc 영역 Fc를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4로부터 유래한 Fc를 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 9인 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역 및 중쇄 Fc 영역 VH-CH1-Fc를 가질 수 있다.
본 발명의 추가 양태에서, 서열번호 18인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 29인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 제공되고, 이때
a. 경쇄 가변 영역은 서열번호 32인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L3을 추가로 포함하고, 이때 FR-L3 영역은 인간 IgE에 대한 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 친화성을 개선하기 위해(KD를 낮추기 위해) 서열번호 129와 관련하여 위치 S67(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 한 아미노산으로 돌연변이되어 있고/있거나;
b. 경쇄 가변 영역은 서열번호 31인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L2를 추가로 포함하고, 이때 CDR-L2 영역은 인간 IgE에 대한 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 친화성을 개선하기 위해(KD를 낮추기 위해) 서열번호 129와 관련하여 위치 S52(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 한 아미노산으로 돌연변이되어 있다.
본 발명자들은 (예를 들면, 실시예 6에 기재된 방법에 의해 수행될 때) 이 돌연변이들 중 어느 하나 또는 둘 다가 인간 IgE(예를 들면, IgE-Fc를 사용함)에 대한, 오말리주맙 또는 오말리주맙 Fab에 기반을 둔 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 친화성을 놀라울 정도로 개선할 수 있다(개선된 또는 보다 더 낮은 KD)는 것을 본원에서 발견하였다. 특히, 친화성의 개선은 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab에 비해 상대적인 것이다. 돌연변이는 IgE의 Cε3 도메인과의 상호작용을 개선할 수 있다. 개선된 또는 보다 더 낮은 KD는 오말리주맙 및/또는 오말리주맙 Fab의 KD보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 더 낮은 KD를 의미한다. 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 KD는 2, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4 또는 0.3 nM 미만일 수 있다.
예를 들면, FR-L3 영역은 서열번호 129와 관련하여 위치 S67(카바트)에서 M(특히), E 또는 D로 돌연변이될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 돌연변이된 FR-L3 영역의 아미노산 서열은 서열번호 52 내지 59, 84 내지 107, 131 또는 138로부터 선택된다.
예를 들면, CDR-L2 영역은 서열번호 129와 관련하여 위치 S52(카바트)에서 D(특히), E, Q 또는 R로 돌연변이될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 돌연변이된 CDR-L2 영역의 아미노산 서열은 서열번호 50(특히) 또는 서열번호 51로부터 선택된다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 14인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H1을 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 16인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H2를 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 33인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L3을 추가로 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 13인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H1을 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 15인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H2를 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 17인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H3을 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 19인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H4를 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 30인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L2를 추가로 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 34인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L4를 추가로 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 연속하는 FR-L1, CDR-L1, FR-L2, CDR-L2, FR-L3, CDR-L3 및 FR-L4 영역을 포함하고 서열번호 20인 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 VL을 가질 수 있으며, 단, 상기 CDR-L2 영역은 서열번호 50(특히) 또는 서열번호 51로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 연속하는 FR-L1, CDR-L1, FR-L2, CDR-L2, FR-L3, CDR-L3 및 FR-L4 영역을 포함하고 서열번호 20인 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 VL을 가질 수 있으며, 단, 상기 FR-L3 영역은 서열번호 52인 아미노산 서열을 갖는다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 연속하는 FR-L1, CDR-L1, FR-L2, CDR-L2, FR-L3, CDR-L3 및 FR-L4 영역을 포함하고 서열번호 20인 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 VL을 가질 수 있으며, 단, 상기 CDR-L2 영역은 서열번호 50(특히) 또는 서열번호 51로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고, 상기 FR-L3 영역은 서열번호 52, 131 또는 138로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 1인 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 VH를 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 카파 불변 영역인 경쇄 불변 영역을 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 24인 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL을 가질 수 있으며, 단, CDR-L2 영역은 서열번호 50(특히) 또는 서열번호 51로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 24인 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL을 가질 수 있으며, 단, FR-L3 영역은 서열번호 52인 아미노산 서열을 갖는다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 24인 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL을 가질 수 있으며, 단, CDR-L2 영역은 서열번호 50(특히) 또는 서열번호 51로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고, FR-L3 영역은 서열번호 52, 131 또는 138로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
추가 양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질을 제공하고, 이때
a. 중쇄 가변 영역은 서열번호 14인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 16인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 18인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 29인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 50인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 서열번호 33인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3, 및 서열번호 131 또는 138인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FW-L3을 포함하거나;
b. 중쇄 가변 영역은 서열번호 1인 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 132 또는 139로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있고, 이때 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL은, 서열번호 160인 아미노산 서열을 갖는 신호 서열을 경우에 따라 포함하는, 서열번호 136 또는 143으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 기재된 모든 실시형태에서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 중쇄 불변 영역 CH1을 추가로 포함할 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 5인 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역 VH-CH1을 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 중쇄 Fc 영역 Fc를 추가로 포함할 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4로부터의 Fc를 가질 수 있다.
항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 9인 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역 및 중쇄 Fc 영역 VH-CH1-Fc를 가질 수 있다.
본 발명의 모든 양태의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 전체 길이 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 Fab 단편, 변형된 Fab' 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv, scFv, scab, 디아바디(diabody), 이중특이적 항체, 트리아바디(triabody), FabFv, Fab-Fv-Fv, 트리바디(tribody) 또는 (Fab-Fv)2-Fc로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 이론에 의해 구속받지 않지만, 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 다수의 항-IgE 항원 결합 부위들보다는 오히려 단지 1개의 항-IgE 항원 결합 부위를 갖는 경우 그와 관련된 더 적은 아나필락시스 위험을 가질 수 있다.
한 실시형태에서, 항-IgE 항체는 혈청 캐리어 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민에 결합하는 scFv에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된 Fab 단편이다.
한 실시형태에서, scFv는 바람직하게는 서열번호 151을 갖는 링커를 통해 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 이때 중쇄 가변 영역은 서열번호 152인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 153인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 154인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 155인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 156인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 157인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함한다.
한 실시형태에서, scFv는 서열번호 150인 아미노산 서열을 갖는다. 한 바람직한 실시형태에서, Fab 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때
a. 중쇄 가변 영역은 서열번호 14인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 16인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 18인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 29인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 50인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 서열번호 33인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3, 및 서열번호 131 또는 138인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FW-L3을 포함하거나;
b. 중쇄 가변 영역은 서열번호 1인 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 132 또는 139로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, Fab 단편은 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역 VL-CH1은 서열번호 5인 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL은, 서열번호 160인 아미노산 서열을 갖는 신호 서열을 경우에 따라 포함하는, 서열번호 136 또는 143으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, scFv는 서열번호 149인 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 Fab 단편의 CH1에 연결된다.
한 실시형태에서, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역, 링커 및 scFv는, 서열번호 160인 아미노산 서열을 갖는 신호 서열을 경우에 따라 포함하는, 서열번호 147인 아미노산 서열을 갖는다.
한 다른 실시형태에서, 서열번호 147을 갖는 scFv에 연결된 Fab 단편의 중쇄는 서열번호 136 또는 143을 갖는 경쇄 가변 및 불변 영역과 쌍을 이룬다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 그에 부착된 이펙터 또는 리포터 분자를 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 (예를 들면, Fc 도메인 내에서) 글리코실화될 수 있고/있거나, 전분, 알부민 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로부터 선택되는 중합체에 접합될 수 있다. 한 실시형태에서, 접합된 PEG는 5 내지 50 kDa 범위 내의 분자량을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 인간화될 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)를 코딩하는 단리된 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터도 제공된다. 예를 들면, 클로닝 또는 발현 벡터는 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 또는 서열번호 42, 또는 서열번호 133, 또는 서열번호 135, 또는 서열번호 137, 또는 서열번호 140, 또는 서열번호 142, 또는 서열번호 144로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 서열을 포함할 수 있고, 경우에 따라 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 또는 서열번호 12 또는 서열번호 148로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 하나 이상의 본 발명의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 본 발명의 숙주 세포는 경우에 따라 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 또는 서열번호 12 또는 서열번호 148로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질을 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 제조 방법도 제공된다.
추가 양태는 1종 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 적합하게는, 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 희석제 ㎖당 50 내지 200, 바람직하게는 대략 또는 정확히 150 mg의 용량으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 부형제는 L-아르기닌 및 L-히스티딘 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 부형제는 별도로 또는 조합으로 폴리소르베이트 20을 포함할 수 있다. 희석제는 물 또는 수성 등장성 용액일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 피하 투여 전 재구성을 위한 분말로서 멸균 바이알 내에 담지될 수 있거나, 그의 즉석 피하 투여를 위해 멸균 주사기 내에 담지될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 75 내지 600 mg, 예를 들면, 약 또는 정확히 100 또는 150 mg의 총 용량으로 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질과 함께 함유된 다른 활성 성분, 또는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질과 별도로 공투여하기 위한 다른 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학 조성물은 알레르기에 기초한 특이적 면역요법과 관련하여 사용될 수 있고, 이때 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 알레르겐과 별도로 공투여된다(그러나 함께 포장될 수 있다). 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 알레르기에 기초한 특이적 면역요법에서 사용될 수 있고, 이때 환자는 치료 알레르겐 투여 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일 전(또는 치료 알레르겐 투여일과 동일한 날)에 본 발명의 약학 조성물을 제공받는다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 조성물은 의약으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 조성물은 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 조성물은 인간 IgE와 FcεRI의 복합체와 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 조성물은 인간 IgE와 FcεRI의 복합체의 해리, 및 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질에 의한 인간 IgE의 결합을 통해 장애의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 조성물은 알레르기; 알레르기성 천식; 중증 천식; 중등증 천식; 만성 자발성 두드러기; 만성 특발성 두드러기; 통년성 알레르기성 비염; 계절성 알레르기성 비염; 급성 천식 악화; 급성 기관지 연축; 천식 지속 상태; 고 IgE 증후군; 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증; 아나필락시스성 반응의 예방; 음식물 알레르기; 아토피 피부염; 알레르기성 비염; 봉독 민감성; 특발성 아나필락시스; 땅콩 알레르기; 라텍스 알레르기; 염증성 피부 질환; 두드러기(일광성, 한랭성, 국소적 열성 및/또는 지연형 압박성); 피부 비만세포증; 전신 비만세포증; 호산구 관련 위장 장애; 수포성 유사천포창; 간질성 방광염; 비용종; 특발성 혈관부종; 또는 비알레르기성 천식 중 하나 이상의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
인간 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공된다. 이 방법은 인간 IgE와 FcεRI의 복합체와 관련된 장애를 치료 또는 예방하는 방법일 수 있다. 본 발명의 방법은 인간 IgE와 FcεRI의 복합체의 해리, 및 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질에 의한 인간 IgE의 결합을 통해 질환을 치료할 수 있거나 예방할 수 있다.
본 발명의 방법은 알레르기; 알레르기성 천식; 중증 천식; 중등증 천식; 만성 자발성 두드러기; 만성 특발성 두드러기; 통년성 알레르기성 비염; 계절성 알레르기성 비염; 급성 천식 악화; 급성 기관지 연축; 천식 지속 상태; 고 IgE 증후군; 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증; 아나필락시스성 반응의 예방; 음식물 알레르기; 아토피 피부염; 알레르기성 비염; 봉독 민감성; 특발성 아나필락시스; 땅콩 알레르기; 라텍스 알레르기; 염증성 피부 질환; 두드러기(일광성, 한랭성, 국소적 열성 및/또는 지연형 압박성); 피부 비만세포증; 전신 비만세포증; 호산구 관련 위장 장애; 수포성 유사천포창; 간질성 방광염; 비용종; 특발성 혈관부종; 또는 비알레르기성 천식 중 하나 이상을 치료 또는 예방하는 방법일 수 있다.
본 발명에서, 제2 폴리펩타이드(예컨대, 수용체)에 결합함으로써 그의 생리학적 반응을 이끌어내는 제1 폴리펩타이드에 대한 항체 또는 항원 결합 물질은 유리형 제1 폴리펩타이드 및 결합형 제1 폴리펩타이드 둘 다에 결합하여, 이러한 제1 폴리펩타이드의 입체구조(conformation)를 안정화시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 안정화된 입체구조는 상기 항체 또는 항원 결합 물질의 부재 하에서의 결합 친화성보다 더 약한 제2 폴리펩타이드에 대한 결합 친화성을 가짐으로써, 제2 폴리펩타이드로부터의 제1 폴리펩타이드의 보다 더 빠른 해리를 유발한다.
이와 관련하여, 본 발명은 유리 인간 IgE 및 FcεRI에 결합된 인간 IgE에 결합하여, IgE의 입체구조를 안정화시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 물질에 관한 추가 양태를 제공한다. IgE가 이러한 입체구조로 존재할 때, IgE는 항체 또는 항원 결합 물질의 부재 하에서의 결합 친화성보다 더 약한 FcεRI에 대한 결합 친화성을 가지고, 이때 FcεRI에 결합된 인간 IgE는 FcεRI로부터 해리한다. 경우에 따라, IgE가 이러한 입체구조로 존재할 때, IgE는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 물질보다 오말리주맙 또는 이의 단편에 대한 더 낮은 결합 친화성을 갖는다. 예를 들면, 항체 또는 항원 결합 물질은 본원에 기재된 항체이다.
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 이러한 항체 또는 항원 결합 물질을 선택하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은
a. 테스트 항체 또는 항원 결합 물질을, 인간 FcεRI에 결합된 인간 IgE를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계;
b. 인간 FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시키기 위한 테스트 항체 또는 항원 결합 물질의 해리 상수를 측정하는 단계;
c. 단계 b)에서 측정된 해리 상수를, 인간 FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시키기 위한 오말리주맙 또는 이의 단편의 해리 상수와 비교하는 단계; 및
d. 항체 또는 항원 결합 물질이 오말리주맙 또는 이의 단편보다 더 빨리 FcεRI로부터 IgE를 해리시키는 경우 상기 항체 또는 항원 결합 물질을 선택하는 단계
를 포함한다.
대안적으로, 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 물질을 선택하는 방법은
a. 테스트 항체 또는 항원 결합 물질을, 인간 FcεRI에 결합된 인간 IgE를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계;
b. 인간 FcεRI로부터의 인간 IgE에 대한 테스트 항체 또는 항원 결합 물질의 결합 친화성을 측정하는 단계;
c. 단계 b)에서 측정된 결합 친화성을 FcεRI에 대한 인간 IgE의 결합 친화성과 비교하는 단계; 및
d. 항체 또는 항원 결합 물질이 FcεRI에 대한 IgE의 결합 친화성보다 더 높은 IgE에 대한 결합 친화성을 갖는 경우 상기 항체 또는 항원 결합 물질을 선택하는 단계
를 포함한다.
경우에 따라, 선택되는 항체 또는 항원 결합 물질은 FcεRI에 여전히 결합되어 있으면서 IgE가 입체구조를 채택하게 하고, 이때 상기 안정화된 입체구조의 IgE는 오말리주맙 또는 이의 단편의 존재 하에서 FcεRI에 결합된 IgE보다 더 빨리 FcεRI로부터 해리할 수 있고/있거나; FcεRI에 대한 결합 친화성보다 더 높은 상기 항체 또는 항원 결합 물질에 대한 결합 친화성을 가질 수 있다.
마지막 양태에서, 본 발명은
a. 서열번호 1을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 i. 서열번호 109; 또는 ii. 서열번호 113; 또는 iii. 서열번호 121; 또는 iv. 서열번호 132; 또는 v. 서열번호 139를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호 5, 및 i. S77 및 S79가 Q로 대체되어 있는 서열번호 24; ii. 서열번호 117; 또는 iii. 서열번호 125; 또는 iv. 서열번호 136; 또는 v. 서열번호 143
을 포함하는 특정 항체 또는 항원 결합 물질에 관한 것이다.
본 발명의 이 마지막 양태의 한 실시형태에서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 108과 관련하여 인간 IgE의 Cε3 도메인의 잔기 T373, W374, S375, R376, A377, S378, G379, P381, Q417, C418, R419, T421, P426, R427, A428, 및 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 D278 및 T281을 포함하는 에피토프와 접촉하거나, 접촉하고 그에 특이적이다.
참고문헌 및 서열번호는 도면을 참조하는 실시예에서 확인된다.
도 1. 오말리주맙 Fab3은 3개의 점 돌연변이들을 함유한다. 오말리주맙 Fab3은 오말리주맙으로부터 유래하고, 항원 결합 CDR로부터 멀리 떨어진 3개의 점 돌연변이들, 즉 VL 도메인 프레임워크 영역 내의 2개의 점 돌연변이들(Ser81Arg, Gln83Arg) 및 Cκ 도메인 내의 1개의 점 돌연변이(Leu158Pro)를 함유한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 백색 및 청색으로 채색되어 있다. Fab의 배향을 표시하기 위해, 돌연변이된 잔기는 적색으로 채색되어 있고 CRDL1은 녹색으로 채색되어 있다.
도 2. 오말리주맙 Fab3과 복합체를 형성한 IgE-Fc의 전체 구조. (a) 오말리주맙 Fab3은 2:1 화학양론으로 IgE-Fc에 결합한다. Fab1(녹색)은 Cε3 도메인을 통해서만 IgE-Fc 쇄 B(분홍색)와 맞물린다. Fab2(청색)는 Cε3 도메인을 통해 IgE-Fc 쇄 A(황색)와 상호작용하고 IgE-Fc 쇄 B(분홍색)로부터의 Cε2 도메인과 경미한 상호작용을 형성한다. (b) 2개의 Fab들은 Fcε3-4 영역의 2배 축 주위에서 슈도-대칭적인 복합체를 형성한다. 명료성을 위해, Cε2 도메인은 표시되어 있지 않다. (c) IgE-Fc는 오말리주맙 Fab3 복합체에서 비대칭적으로 굽어져 있다. 쇄 B(분홍색)로부터의 Cε2 도메인은 Fab2(청색)와 접촉한다.
도 3. 오말리주맙 Fab3과 IgE-Fc 사이의 계면. 오말리주맙 Fab3 Fab2(각각 녹색 및 황색으로 채색된 중쇄 및 경쇄)와 IgE-Fc(분홍색)로부터의 Cε3 도메인 사이의 계면이 표시되어 있다. 오말리주맙 Fab3 및 Cε3 도메인 잔기 표지는 각각 청색 및 흑색으로 채색되어 있다. 상기 계면은 수소결합 및 반데르발스 상호작용을 포함한다. 상기 계면의 주목할 만한 특징은 Arg419(Cε3 도메인)과 Phe103(오말리주맙 Fab3 CDRH3) 사이의 양이온-π 상호작용이다. Phe103 측쇄는 Thr373, Trp374, Ser375, Gln417 및 Arg419에 의해 생성된 포켓(Cε3 도메인) 내에 주로 묻혀 있다.
도 4. 오말리주맙 Fab3 및 DARPin E2_79는 중첩되는 계면에 결합한다. 오말리주맙 Fab3 및 DARPin E2_7920 둘 다가 Cε3 도메인에 결합한다. 오말리주맙 Fab3 계면의 일부만을 형성하는 IgE-Fc 잔기는 주황색으로 채색되어 있는 반면, Cε3-Cε4 링커의 일부를 포함하는, DARPin E2_79 계면의 일부만을 형성하는 IgE-Fc 잔기는 청색으로 채색되어 있다. Arg419 및 Met430을 포함하는, 분홍색으로 채색된 IgE-Fc 잔기는 오말리주맙 Fab3 및 DARPin E2_79 계면 둘 다에 공통된다.
도 5. IgE-Fc의 입체구조적 유연성. (a) 그의 심한 비대칭적인 굽힘을 보이는 유리 IgE-Fc8의 측면도. (b) 유리 IgE-Fc의 전면도((a)에 나타낸 측면도로부터의 90o 반시계방향 회전). (c) 부분적으로 굽혀진 입체구조를 보이는, 오말리주맙 Fab3 복합체로부터의 IgE-Fc의 측면도. (d) 오말리주맙 Fab3 복합체에서 IgE-Fc의 전면도((c)에 나타낸 측면도로부터의 90o 반시계방향 회전). (e) 항-IgE-Fc Fab(오말리주맙 Fab3)16에 의해 포획된, 전체적으로 펼쳐진 IgE-Fc의 측면도. (f) 펼쳐진 IgE-Fc의 전면도((e)에 나타낸 측면도로부터의 90o 반시계방향 회전).
도 6. IgE-Fc의 입체구조적 유연성. IgE-Fc의 유연성, 및 굽혀진 입체구조로부터 전체적으로 펼쳐진 입체구조로 펴짐은 분자 동역학에 의해 이미 조사되었다16. IgE-Fc 펴짐은 이미 기재된 바와 같이16 자유 에너지 표면으로서 표시된다. (A) 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체의 결정 구조에서 포획된 IgE-Fc의 펼쳐진 입체구조16. (B) 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체의 결정 구조에서 관찰된 부분적으로 굽혀진 IgE-Fc 입체구조. (C) 유리 IgE-Fc의 굽혀진 입체구조7,8. IgE-Fc의 굽혀진 입체구조는 가장 낮은 에너지 대역을 점유하는 반면, 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체에서 관찰된 부분적으로 굽혀진 입체구조는 명확히 상이한 에너지 대역을 점유한다(B).
도 7. IgE-Fc와 FcεRI 사이의 상호작용의 파괴. 오말리주맙 Fab3 복합체에서, Cε3 도메인은 FcεRIα와의 맞물림을 방해하는, IgE-Fc에 대해 지금까지 보고된 가장 많이 개방된 입체구조를 채택한다. FcεRIα8과 복합체를 형성한 IgE-Fc의 구조는 황색으로 채색되어 있고, 수용체 맞물림의 2개 하위부위들은 표시되어 있다. IgE-Fc와 복합체를 형성한 오말리주맙 Fab3의 구조는 Cε4 도메인 위에 겹쳐졌고, Cε3 도메인은 청색으로 채색되어 있다. 두 구조에서 His424 및 Pro426의 위치는 Cε3 도메인에 의해 채택된 상이한 위치를 강조하기 위해 표시되어 있다.
도 8. IgE-Fc와 CD23 사이의 상호작용의 파괴. (A) 오말리주맙 Fab3 및 CD23 계면 둘 다에 공통된 Cε3 도메인 잔기들은 분홍색으로 채색되어 있다. (B) 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체 및 CD23/Fcε3-4 복합체11로부터의 Cε3 도메인(어두운 회색)의 중첩은 CD23(황색)과 오말리주맙 Fab3(분홍색) 사이의 충돌을 보여준다.
도 9. 오말리주맙 Fab3과 IgE-Fc의 상호작용 연구. (a) C-말단 His-태그를 통해 포획된 IgE-Fc에의 오말리주맙 Fab3의 결합; 오말리주맙 Fab3을 하기 농도로 IgE-Fc 위에 유동시켰다: 100 nM(흑색), 50 nM(적색), 25 nM(녹색), 12.5 nM(청색), 6.2 nM(청록색), 3.1 nM(자주색), 1.6 nM(자홍색) 및 0.8 nM(어두운 적색). 표준 이중 기준화 방법을 이용하였다36; 각각의 농도를 이중으로 실행하였다. (b) SPR 샌드위치 결합 실험을 이용하여 제2 오말리주맙 Fab3 결합 부위의 결합을 특징규명하였다. IgE-Fc를 오말리주맙 Fab3 표면에 포획한 후, 제2 오말리주맙 Fab3 분자를 1000 nM(흑색), 500 nM(적색), 250 nM(녹색), 125 nM(청색), 62.5 nM(청록색), 31.2 nM(자주색), 15.6 nM(자홍색), 7.8 nM(어두운 적색) 및 0 nM(감청색)의 농도로 IgE-Fc/오말리주맙 Fab3 복합체에 첨가하였다. (c) C-말단 His-태그에 의해 포획된 IgE-Fc에 결합하는 오말리주맙 Fab3의 능력(적색)과, FcεRIα에 결합함으로써 포획된 IgE-Fc에 결합하는 오말리주맙 Fab3의 능력(청색)의 비교; 각각에 대해 일련의 2배 희석물들을 테스트하였고, 이때 최고 농도는 1000 nM이었다. 삽도는 오말리주맙 Fab3이 낮은 Bmax 값으로 IgE-Fc/FcεRIα 복합체에 여전히 결합할 수 있다는 것을 보여준다. (d) 오말리주맙 Fab3의 농도를 증가시킴으로써 매개된 IgE-Fc/FcεRIα 복합체의 가속화된 해리. 고정된 FcεRIα에 IgE-Fc를 포획한 후 하기 농도로 오말리주맙 Fab3을 결합시킴으로써 1:1 IgE-Fc/FcεRIα 복합체를 먼저 확립하였다: 5000 nM(자홍색), 1000 nM(자주색), 200 nM(청록색), 40 nM(청색), 8 nM(녹색), 1.6 nM(적색) 및 0 nM(흑색). 삽도는 가속화된 해리 과정의 확대를 보여준다. 모든 농도를 이중으로 실행하였다. 2개의 부위들 사이의 알로스테릭(allosteric) 소통을 최소화하기 위해 5℃에서 수행된, 제2 오말리주맙 Fab3 결합 부위의 특징규명 실험(도 4B)을 제외하고 모든 결합 실험들을 25℃에서 수행하였다.
도 10. 직접적인 결합, 경쟁 실험 및 가속화된 해리의 분석. 고정된 오말리주맙 Fab3(a), 오말리주맙 Fab(b) 및 온전한 오말리주맙(c)에의 IgE-Fc의 직접적인 결합을 측정하였다. 아민 커플링 키트(GE Healthcare)를 사용하여 Fab 또는 온전한 항체를 낮은 밀도로 공유고정시켰고; 100 nM의 최고 농도로 일련의 2배 희석물들을 사용하여 다양한 농도에서 IgE-Fc를 이 표면들 위에 유동시켰다. 모든 농도를 이중으로 실행하였다. (d) IgE-Fc에 대한 오말리주맙 Fab3과 αγ-융합 단백질 사이의 TR-FRET 경쟁 결합 실험. 증가하는 농도의 비표지된 오말리주맙 Fab3을 억제제로서 사용하여 터븀으로 표지된 αγ-융합 단백질과 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647로 표지된 IgE-Fc 사이의 결합을 측정하였다: 0 μM(흑색), 2.5 nM(청색), 5 nM(녹색), 10 nM(자홍색), 20 nM(적색). 억제제로서, 오말리주맙 Fab는 IgE-Fc와 αγ-융합 단백질 사이의 상호작용의 겉보기 KD 및 Bmax 둘 다에 영향을 미치는데, 이것은 일부 알로스테릭 억제 성질을 시사한다. (e) 각각 5 μM의 농도에서 온전한 오말리주맙(흑색), 오말리주맙 Fab(적색) 또는 오말리주맙 Fab3(청색)에 의해 매개된 IgE-Fc/sFcεRIα 복합체의 가속화된 해리의 비교.
도 11. 대표적인 전자 밀도 맵. 1.1σ에서 등고선으로 표시된 2Fo-Fc 전자 밀도 맵의 입체도가 쇄 A Cε3 도메인의 일부, 및 Asn394의 N-공유결합된 올리고사카라이드 모이어티에 대해 제시되어 있다.
도 12. 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리의 비아코어(Biacore) 센서그램. 런닝 완충제(직선) 또는 IgE 결합 파트너(모든 다른 센서그램들)의 존재 하에서 해리를 모니터링하였다. 실시예 2의 어세이 방법 (1)에 기재된 바와 같이 어세이를 수행하였다.
도 13. 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리의 비아코어 센서그램. 대조군 상청액(직선) 또는 IgE 결합 파트너(모든 다른 센서그램들)의 존재 하에서 해리를 모니터링하였다. 실시예 2의 어세이 방법 (2)에 기재된 바와 같이 어세이를 수행하였다.
도 14. RBL-SX38 세포의 표면으로부터의 알렉사488로 표지된 IgE-Fc의 해리의 분석. 측정된 결합 데이터는 t=0에서 100%로 표준화되었고, 해리 데이터는 시간의 함수로서 결합된 남은 IgE-Fc의 비율의 변화로서 작도되었다.
도 15. 72시간 PCA 모델에 대한 야생형 오말리주맙 Fab 및 오말리주맙 Fab3의 치료 투약의 효과의 분석.
도 16. 굵은 글자체로 표시된 잔기 224 및 547을 갖는 야생형 인간 IgE-Fc 서열(서열번호 108로 표시됨)의 잔기 224 내지 547. 넘버링은 문헌(Dorrington and Bennich (1978) Immunol. Rev. 41:3-25)에 따른 것이고, 이때 L253 다음의 L(Leu; 류신)은 L235a(상자로 표시됨)로서 넘버링되고, 후속 잔기는 C254이다. 남은 잔기는 더 추가 없이 연속적으로 넘버링된다. 에피토프 잔기는 별표시(*)로 표시된다.
도 1. 오말리주맙 Fab3은 3개의 점 돌연변이들을 함유한다. 오말리주맙 Fab3은 오말리주맙으로부터 유래하고, 항원 결합 CDR로부터 멀리 떨어진 3개의 점 돌연변이들, 즉 VL 도메인 프레임워크 영역 내의 2개의 점 돌연변이들(Ser81Arg, Gln83Arg) 및 Cκ 도메인 내의 1개의 점 돌연변이(Leu158Pro)를 함유한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 백색 및 청색으로 채색되어 있다. Fab의 배향을 표시하기 위해, 돌연변이된 잔기는 적색으로 채색되어 있고 CRDL1은 녹색으로 채색되어 있다.
도 2. 오말리주맙 Fab3과 복합체를 형성한 IgE-Fc의 전체 구조. (a) 오말리주맙 Fab3은 2:1 화학양론으로 IgE-Fc에 결합한다. Fab1(녹색)은 Cε3 도메인을 통해서만 IgE-Fc 쇄 B(분홍색)와 맞물린다. Fab2(청색)는 Cε3 도메인을 통해 IgE-Fc 쇄 A(황색)와 상호작용하고 IgE-Fc 쇄 B(분홍색)로부터의 Cε2 도메인과 경미한 상호작용을 형성한다. (b) 2개의 Fab들은 Fcε3-4 영역의 2배 축 주위에서 슈도-대칭적인 복합체를 형성한다. 명료성을 위해, Cε2 도메인은 표시되어 있지 않다. (c) IgE-Fc는 오말리주맙 Fab3 복합체에서 비대칭적으로 굽어져 있다. 쇄 B(분홍색)로부터의 Cε2 도메인은 Fab2(청색)와 접촉한다.
도 3. 오말리주맙 Fab3과 IgE-Fc 사이의 계면. 오말리주맙 Fab3 Fab2(각각 녹색 및 황색으로 채색된 중쇄 및 경쇄)와 IgE-Fc(분홍색)로부터의 Cε3 도메인 사이의 계면이 표시되어 있다. 오말리주맙 Fab3 및 Cε3 도메인 잔기 표지는 각각 청색 및 흑색으로 채색되어 있다. 상기 계면은 수소결합 및 반데르발스 상호작용을 포함한다. 상기 계면의 주목할 만한 특징은 Arg419(Cε3 도메인)과 Phe103(오말리주맙 Fab3 CDRH3) 사이의 양이온-π 상호작용이다. Phe103 측쇄는 Thr373, Trp374, Ser375, Gln417 및 Arg419에 의해 생성된 포켓(Cε3 도메인) 내에 주로 묻혀 있다.
도 4. 오말리주맙 Fab3 및 DARPin E2_79는 중첩되는 계면에 결합한다. 오말리주맙 Fab3 및 DARPin E2_7920 둘 다가 Cε3 도메인에 결합한다. 오말리주맙 Fab3 계면의 일부만을 형성하는 IgE-Fc 잔기는 주황색으로 채색되어 있는 반면, Cε3-Cε4 링커의 일부를 포함하는, DARPin E2_79 계면의 일부만을 형성하는 IgE-Fc 잔기는 청색으로 채색되어 있다. Arg419 및 Met430을 포함하는, 분홍색으로 채색된 IgE-Fc 잔기는 오말리주맙 Fab3 및 DARPin E2_79 계면 둘 다에 공통된다.
도 5. IgE-Fc의 입체구조적 유연성. (a) 그의 심한 비대칭적인 굽힘을 보이는 유리 IgE-Fc8의 측면도. (b) 유리 IgE-Fc의 전면도((a)에 나타낸 측면도로부터의 90o 반시계방향 회전). (c) 부분적으로 굽혀진 입체구조를 보이는, 오말리주맙 Fab3 복합체로부터의 IgE-Fc의 측면도. (d) 오말리주맙 Fab3 복합체에서 IgE-Fc의 전면도((c)에 나타낸 측면도로부터의 90o 반시계방향 회전). (e) 항-IgE-Fc Fab(오말리주맙 Fab3)16에 의해 포획된, 전체적으로 펼쳐진 IgE-Fc의 측면도. (f) 펼쳐진 IgE-Fc의 전면도((e)에 나타낸 측면도로부터의 90o 반시계방향 회전).
도 6. IgE-Fc의 입체구조적 유연성. IgE-Fc의 유연성, 및 굽혀진 입체구조로부터 전체적으로 펼쳐진 입체구조로 펴짐은 분자 동역학에 의해 이미 조사되었다16. IgE-Fc 펴짐은 이미 기재된 바와 같이16 자유 에너지 표면으로서 표시된다. (A) 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체의 결정 구조에서 포획된 IgE-Fc의 펼쳐진 입체구조16. (B) 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체의 결정 구조에서 관찰된 부분적으로 굽혀진 IgE-Fc 입체구조. (C) 유리 IgE-Fc의 굽혀진 입체구조7,8. IgE-Fc의 굽혀진 입체구조는 가장 낮은 에너지 대역을 점유하는 반면, 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체에서 관찰된 부분적으로 굽혀진 입체구조는 명확히 상이한 에너지 대역을 점유한다(B).
도 7. IgE-Fc와 FcεRI 사이의 상호작용의 파괴. 오말리주맙 Fab3 복합체에서, Cε3 도메인은 FcεRIα와의 맞물림을 방해하는, IgE-Fc에 대해 지금까지 보고된 가장 많이 개방된 입체구조를 채택한다. FcεRIα8과 복합체를 형성한 IgE-Fc의 구조는 황색으로 채색되어 있고, 수용체 맞물림의 2개 하위부위들은 표시되어 있다. IgE-Fc와 복합체를 형성한 오말리주맙 Fab3의 구조는 Cε4 도메인 위에 겹쳐졌고, Cε3 도메인은 청색으로 채색되어 있다. 두 구조에서 His424 및 Pro426의 위치는 Cε3 도메인에 의해 채택된 상이한 위치를 강조하기 위해 표시되어 있다.
도 8. IgE-Fc와 CD23 사이의 상호작용의 파괴. (A) 오말리주맙 Fab3 및 CD23 계면 둘 다에 공통된 Cε3 도메인 잔기들은 분홍색으로 채색되어 있다. (B) 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체 및 CD23/Fcε3-4 복합체11로부터의 Cε3 도메인(어두운 회색)의 중첩은 CD23(황색)과 오말리주맙 Fab3(분홍색) 사이의 충돌을 보여준다.
도 9. 오말리주맙 Fab3과 IgE-Fc의 상호작용 연구. (a) C-말단 His-태그를 통해 포획된 IgE-Fc에의 오말리주맙 Fab3의 결합; 오말리주맙 Fab3을 하기 농도로 IgE-Fc 위에 유동시켰다: 100 nM(흑색), 50 nM(적색), 25 nM(녹색), 12.5 nM(청색), 6.2 nM(청록색), 3.1 nM(자주색), 1.6 nM(자홍색) 및 0.8 nM(어두운 적색). 표준 이중 기준화 방법을 이용하였다36; 각각의 농도를 이중으로 실행하였다. (b) SPR 샌드위치 결합 실험을 이용하여 제2 오말리주맙 Fab3 결합 부위의 결합을 특징규명하였다. IgE-Fc를 오말리주맙 Fab3 표면에 포획한 후, 제2 오말리주맙 Fab3 분자를 1000 nM(흑색), 500 nM(적색), 250 nM(녹색), 125 nM(청색), 62.5 nM(청록색), 31.2 nM(자주색), 15.6 nM(자홍색), 7.8 nM(어두운 적색) 및 0 nM(감청색)의 농도로 IgE-Fc/오말리주맙 Fab3 복합체에 첨가하였다. (c) C-말단 His-태그에 의해 포획된 IgE-Fc에 결합하는 오말리주맙 Fab3의 능력(적색)과, FcεRIα에 결합함으로써 포획된 IgE-Fc에 결합하는 오말리주맙 Fab3의 능력(청색)의 비교; 각각에 대해 일련의 2배 희석물들을 테스트하였고, 이때 최고 농도는 1000 nM이었다. 삽도는 오말리주맙 Fab3이 낮은 Bmax 값으로 IgE-Fc/FcεRIα 복합체에 여전히 결합할 수 있다는 것을 보여준다. (d) 오말리주맙 Fab3의 농도를 증가시킴으로써 매개된 IgE-Fc/FcεRIα 복합체의 가속화된 해리. 고정된 FcεRIα에 IgE-Fc를 포획한 후 하기 농도로 오말리주맙 Fab3을 결합시킴으로써 1:1 IgE-Fc/FcεRIα 복합체를 먼저 확립하였다: 5000 nM(자홍색), 1000 nM(자주색), 200 nM(청록색), 40 nM(청색), 8 nM(녹색), 1.6 nM(적색) 및 0 nM(흑색). 삽도는 가속화된 해리 과정의 확대를 보여준다. 모든 농도를 이중으로 실행하였다. 2개의 부위들 사이의 알로스테릭(allosteric) 소통을 최소화하기 위해 5℃에서 수행된, 제2 오말리주맙 Fab3 결합 부위의 특징규명 실험(도 4B)을 제외하고 모든 결합 실험들을 25℃에서 수행하였다.
도 10. 직접적인 결합, 경쟁 실험 및 가속화된 해리의 분석. 고정된 오말리주맙 Fab3(a), 오말리주맙 Fab(b) 및 온전한 오말리주맙(c)에의 IgE-Fc의 직접적인 결합을 측정하였다. 아민 커플링 키트(GE Healthcare)를 사용하여 Fab 또는 온전한 항체를 낮은 밀도로 공유고정시켰고; 100 nM의 최고 농도로 일련의 2배 희석물들을 사용하여 다양한 농도에서 IgE-Fc를 이 표면들 위에 유동시켰다. 모든 농도를 이중으로 실행하였다. (d) IgE-Fc에 대한 오말리주맙 Fab3과 αγ-융합 단백질 사이의 TR-FRET 경쟁 결합 실험. 증가하는 농도의 비표지된 오말리주맙 Fab3을 억제제로서 사용하여 터븀으로 표지된 αγ-융합 단백질과 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647로 표지된 IgE-Fc 사이의 결합을 측정하였다: 0 μM(흑색), 2.5 nM(청색), 5 nM(녹색), 10 nM(자홍색), 20 nM(적색). 억제제로서, 오말리주맙 Fab는 IgE-Fc와 αγ-융합 단백질 사이의 상호작용의 겉보기 KD 및 Bmax 둘 다에 영향을 미치는데, 이것은 일부 알로스테릭 억제 성질을 시사한다. (e) 각각 5 μM의 농도에서 온전한 오말리주맙(흑색), 오말리주맙 Fab(적색) 또는 오말리주맙 Fab3(청색)에 의해 매개된 IgE-Fc/sFcεRIα 복합체의 가속화된 해리의 비교.
도 11. 대표적인 전자 밀도 맵. 1.1σ에서 등고선으로 표시된 2Fo-Fc 전자 밀도 맵의 입체도가 쇄 A Cε3 도메인의 일부, 및 Asn394의 N-공유결합된 올리고사카라이드 모이어티에 대해 제시되어 있다.
도 12. 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리의 비아코어(Biacore) 센서그램. 런닝 완충제(직선) 또는 IgE 결합 파트너(모든 다른 센서그램들)의 존재 하에서 해리를 모니터링하였다. 실시예 2의 어세이 방법 (1)에 기재된 바와 같이 어세이를 수행하였다.
도 13. 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리의 비아코어 센서그램. 대조군 상청액(직선) 또는 IgE 결합 파트너(모든 다른 센서그램들)의 존재 하에서 해리를 모니터링하였다. 실시예 2의 어세이 방법 (2)에 기재된 바와 같이 어세이를 수행하였다.
도 14. RBL-SX38 세포의 표면으로부터의 알렉사488로 표지된 IgE-Fc의 해리의 분석. 측정된 결합 데이터는 t=0에서 100%로 표준화되었고, 해리 데이터는 시간의 함수로서 결합된 남은 IgE-Fc의 비율의 변화로서 작도되었다.
도 15. 72시간 PCA 모델에 대한 야생형 오말리주맙 Fab 및 오말리주맙 Fab3의 치료 투약의 효과의 분석.
도 16. 굵은 글자체로 표시된 잔기 224 및 547을 갖는 야생형 인간 IgE-Fc 서열(서열번호 108로 표시됨)의 잔기 224 내지 547. 넘버링은 문헌(Dorrington and Bennich (1978) Immunol. Rev. 41:3-25)에 따른 것이고, 이때 L253 다음의 L(Leu; 류신)은 L235a(상자로 표시됨)로서 넘버링되고, 후속 잔기는 C254이다. 남은 잔기는 더 추가 없이 연속적으로 넘버링된다. 에피토프 잔기는 별표시(*)로 표시된다.
본원에서 항체 아미노산 넘버링은 항체(예를 들면, 서열번호 1의 VH 서열 및 서열번호 20 또는 서열번호 129의 VL 서열을 포함하는 오말리주맙)의 연속 아미노산 서열로부터의 넘버링(소위 "pdb" 넘버링)일 것이나, 통상의 카바트 넘버링 체계를 이용할 수 있다. VH 또는 VL 서열의 공통된 면역글로불린 부분들(CDR - 상보성 결정 영역, 또는 FR - 프레임워크 영역)이 기재되어 있는 경우, 이들은 표준 순서로 연결되어 있다(VH = FR-H1.CDR-H1.FR-H2.CDR-H2.FR-H3.CDR-H3.FR-H4; VL = FR-L1.CDR-L1.FR-L2.CDR-L2.FR-L3.CDR-L3.FR-L4). 오말리주맙의 경우, VH(서열번호 1) 부분의 "pdb" 넘버링은 FR-H1(아미노산 1-25), CDR-H1(26-36), FR-H2(37-50), CDR-H2(51-66), FR-H3(67-98), CDR-H3(99-110), FR-H4(111-121)인 반면; 카바트 넘버링은 FR-H1(아미노산 1-25), CDR-H1(26-35), FR-H2(36-49), CDR-H2(50-65), FR-H3(66-94), CDR-H3(95-102), FR-H4(103-113)이다. 오말리주맙의 경우, VL(서열번호 20) 부분의 "pdb" 넘버링은 FR-L1(아미노산 1-23), CDR-L1(24-38), FR-L2(39-53), CDR-L2(54-60), FR-L3(61-92), CDR-L3(93-101), FR-L4(102-111)인 반면; 카바트 넘버링은 FR-L1(아미노산 1-23), CDR-L1(24-34), FR-L2(35-49), CDR-L2(50-56), FR-L3(57-88), CDR-L3(89-97), FR-L4(98-107)이다.
IgE 항체 넘버링은 문헌(Dorrington & Bennich (1978) Immunol. Rev. 41:3-25)에 의해 보고된 바와 같다. 따라서, 본 발명에서 사용된 IgE-Fc 폴리펩타이드(서열번호 108 참조)는 (C225A 돌연변이를 포함하는) V224-K547로부터 유래한다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 뒤따르는 넘버링은 문헌(Dorrington and Bennich (1978) Immunol. Rev. 41:3-25)에 따른 것이고, 이때 위치 253 다음의 L(Leu, 류신)은 L253a로서 넘버링되고, 남은 잔기들은 C254 등으로서 L253a부터 연속적으로 넘버링된다. 결정학 실험에서, 글리코실화 패턴을 단순화하기 위해 하기 돌연변이도 IgE-Fc 내에 삽입하였다: N265Q & N371Q. IgE-Fc의 Cε2 영역은 일반적으로 서열 S226-D330을 점유하도록 허용된다. 본원에서 IgE의 언급은 인간 IgE의 언급일 수 있고(반대 경우도 가능함), 본원에 기재된 어세이 및 방법과 관련하여 IgE-Fc의 언급을 구성할 수도 있다. 전체 길이 인간 IgE 항체의 Fab 아암(arm)의 서열은 결정 구조에 존재하지 않기 때문에 이 설명에 포함되지 않는다.
본원에서 "오말리주맙"의 언급은 시판되는 Xolair® 제품; 또는 서열번호 1인 VH 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 20인 VL 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IgG 전체 길이 항체; 또는 서열번호 5인 VH-CH1 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 24인 VL-CL 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IgG 전체 길이 항체; 또는 서열번호 9인 VH-CH1-Fc 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 24인 VL-CL 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IgG 전체 길이 항체의 언급이다. "오말리주맙 Fab"의 언급은 서열번호 1인 VH 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 20인 VL 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab 단편; 또는 (특히) 서열번호 5인 VH-CH1 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 24인 VL-CL 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab 단편의 언급이다.
일반적인 정의
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 갖는 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 본원에 기재되어 있다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌들, 특허출원들, 특허들 및 다른 참조문헌들은 전체로서 참고로 도입된다. 추가로, 재료, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이고 한정하기 위한 것이 아니다.
문맥에 의해 달리 요구되지 않은 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 본원에서, 달리 언급되어 있지 않은 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. 나아가, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대, "포함한다" 및 "포함된"의 사용은 한정하기 위한 것이 아니다. 또한, 달리 구체적으로 언급되어 있지 않은 한, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어는 한 유닛을 포함하는 요소 및 성분, 및 하나 초과의 서브유닛을 포함하는 요소 및 성분 둘 다를 포괄한다.
일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 기법은 당분야에서 잘 공지되어 있고 통상적으로 이용된다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 본 발명의 방법 및 기법은 일반적으로 당분야에서 잘 공지되어 있고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 고찰된 다양한 일반적인 참고문헌들 및 보다 더 구체적인 참고문헌들에 기재된 통상의 방법에 따라 일반적으로 수행된다. 효소 반응 및 정제 기법은 당분야에서 통상적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 제조자의 설명서에 따라 수행될 수 있다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약품 화학과 관련하여 사용된 명명법, 및 이들의 실험 절차 및 기법은 당분야에서 잘 공지되어 있고 통상적으로 이용된다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약학적 제조, 제제화 및 전달, 및 환자의 치료를 위해 표준 기법이 이용된다.
본 발명이 더 용이하게 이해될 수 있도록, 선택되는 용어들은 이하에 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "숙주"는 전형적으로 인간 대상체를 지칭하고, 특히 이때 인간 또는 인간화된 프레임워크가 수용자 구조로서 사용된다. 또 다른 숙주가 치료되는 경우, 당분야에서 숙련된 자는 항체 또는 항원 결합 물질이 거부를 피하기 위해 또는 보다 더 적합해지기 위해 그 숙주에 맞게 조정될 필요가 있을 수 있다는 것을 이해한다. 다양한 숙주들을 위한 원하는 전달 및 기능을 위해 본 발명에서 CDR을 어떻게 사용하고 적절한 프레임워크 또는 펩타이드 서열 내로 조작하는 지는 공지되어 있다. 다른 숙주는 다른 포유동물 또는 척추동물 종을 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "숙주"는 대안적으로 동물, 예컨대, 마우스, 원숭이, 개, 돼지, 토끼, 사육된 돼지과 동물(돼지 및 수퇘지), 반추동물, 말과 동물, 가금류, 고양잇과 동물, 뮤린, 솟과 동물, 갯과 동물 등을 지칭할 수 있고, 이때 필요하다면 항체 또는 항원 결합 물질은 숙주에 적합하도록 적절하게 디자인된다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩타이드"는 아미노산의 임의의 중합체성 쇄를 지칭한다. 용어 "펩타이드" 및 "단백질"은 용어 폴리펩타이드와 상호교환 가능하게 사용되고, 아미노산의 중합체성 쇄도 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 단백질 서열의 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 폴리펩타이드 유사체를 포괄한다. 폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "회수하는"은 예를 들면, 당분야에서 잘 공지되어 있는 단백질 정제 기법을 이용하는 단리를 통해 화학적 종, 예컨대, 폴리펩타이드가 천연적으로 회합된 성분을 실질적으로 갖지 않게 만드는 과정을 지칭한다.
항체, 단백질 또는 펩타이드와 제2 화학적 종의 상호작용과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 상호작용이 화학적 종의 특정 구조(예를 들면, 하기 정의된 "항원성 결정인자" 또는 "에피토프")의 존재에 의존한다는 것을 의미하는데; 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질보다는 오히려 특정 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서의 에피토프 A 함유 분자(또는 유리 비표지된 A)의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다. 본 발명의 에피토프가 본원에서 언급되어 있는 경우, 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 상기 에피토프에 특이적이다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 넓게는 IgE에 특이적으로 결합할 수 있도록 면역글로불린(Ig) 분자의 에피토프 결합 특징의 적어도 일부를 보유하는, 4개의 폴리펩타이드 쇄들(2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)), 또는 이들의 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체로 구성된 임의의 Ig 분자를 지칭한다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체 포맷은 당분야에서 공지되어 있고 이하에 기재되어 있다. 이들의 비한정적 실시형태는 이하에 고찰되어 있다. 항체는 분자(또는 에피토프)와 특이적으로 반응함으로써, 상기 분자(또는 에피토프)를 항체에 결합시킬 수 있는 경우 상기 분자(또는 에피토프)에 "결합할 수 있다"고 주장된다.
본원에서 사용된 "단일클론 항체"는 상이한 항체들의 혼합물을 함유하는 "다중클론" 항체 제제와 대조적으로, Ig 분자의 적어도 경쇄 에피토프 결합 특징을 보유하는, 공통된 중쇄 및 공통된 경쇄 아미노산 서열을 공유하는 항체 분자, 또는 이의 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체의 제제를 지칭하기 위한 것이다. 단일클론 항체는 파지, 세균, 효모 또는 리보좀 디스플레이와 같은 여러 공지된 기술에 의해 생성될 수 있을 뿐만 아니라, 하이브리도마 유래의 항체(예를 들면, 하이브리도마 기술, 예컨대, 표준 콜러(Kohler) 및 밀스테인(Milstein) 하이브리도마 방법((1975) Nature 256:495-497)에 의해 제조된 하이브리도마에 의해 분비된 항체)로 예시된 고전적인 방법에 의해서도 생성될 수 있다.
전체 길이 항체에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 4개의 도메인들, 즉 CH1, 힌지, CH2 및 CH3(중쇄 γ, α 및 δ), 또는 CH1, CH2, CH3 및 CH4(중쇄 μ 및 ε)로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인인 CL로 구성된다. VH 영역 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로서 지칭되는, 보다 더 보존된 영역에 의해 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로서 지칭된 초가변 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노 말단부터 카복시 말단까지 정렬된 3개의 CDR들 및 4개의 FR들로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 물질"은 항원(예를 들면, IgE)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 부분, 또는 항원에 대한 원하는 결합 능력을 보유하는 항체 단편의 합성 변형체를 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전체 길이 항체의 단편 또는 특정 부분, 또는 이들의 변형체에 의해 수행될 수 있다는 것이 확인되었다. 실시형태는 2종 이상의 상이한 항원들, 또는 항원의 여러 에피토프들 또는 불연속 에피토프 영역들에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 포맷, 이중 특이적 포맷 및 다중특이적 포맷을 포함한다. 항원 결합 물질의 비한정적 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편(본원에 참고로 도입된 문헌(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) 및 PCT 공보 제WO 90/05144 A1호(Winter et al.)); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR), (vii) 항체 단편의 융합체, 예컨대, 성질 면에서 면역글로불린인 융합체, 예를 들면, 디아바디, scab, 이중특이적, 트리아바디, Fab-Fv, Fab-Fv-Fv, 트리바디, (Fab-Fv)2-Fc, 및 비면역글로불린 프레임워크, 예컨대, 피브로넥틴 또는 류신 지퍼에 이식된 항체 부분, 예컨대, CDR 또는 항체 루프(본원에 도입된 문헌(Binz et al. (2005) Nat. Biotech. 23:1257-1268) 참조)가 있다. 더욱이, Fv 단편의 두 도메인들인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩될지라도, 재조합 또는 다른 방법을 이용하여, 이들로 하여금 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단일쇄 Fv(scFv)로서 공지됨; 예를 들면, 문헌(Bird et al. (1988) Science 242:423-426); 및 문헌(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) 참조)로서 만들어질 수 있게 하는 합성 또는 천연 생성 링커로 이들을 연결할 수 있다. 이러한 단일쇄 항체도 용어 항원 결합 물질에 포함된다. 다른 형태의 단일쇄 항체, 예컨대, 디아바디도 포함된다. 디아바디는 동일한 쇄에서 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧아, 상기 도메인들이 또 다른 쇄의 상보적 도메인들과 강제로 쌍을 이루게 하고 2개의 항원 결합 부위들을 생성하게 하는 링커를 사용함으로써, VH 도메인 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄에서 발현되는 2가 이중특이적 항체이다(예를 들면, 문헌(Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448); 및 문헌(Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123) 참조). 이러한 항체 결합 부분은 당분야에서 공지되어 있다(Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)).
본원에서 사용된 용어 "항체 구축물"은 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인에 연결된 본 발명의 항원 결합 부분들 중 하나 이상의 항원 결합 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 링커 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기들을 포함하고, 하나 이상의 항원 결합 부위를 연결하는 데 사용된다. 이러한 링커 폴리펩타이드는 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448); 및 문헌(Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123) 참조). 면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인, 예를 들면, 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 불변 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 당분야에서 공지되어 있다. Ig 중쇄 γ1 불변 영역 및 Ig 경쇄 λ 및 κ 쇄의 비한정적 예는 각각 표 8 및 6에 제공되어 있다.
추가로, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드의 공유결합 또는 비공유결합에 의해 형성된, 보다 더 큰 면역부착 분자의 부분일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예로는 사량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101), 및 2가 및 바이오티닐화된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용(Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)이 있다. 항체 부분, 예컨대, Fab 및 F(ab')2 단편은 통상의 기법, 예컨대, 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해를 이용함으로써 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 뿐만 아니라, 항체, 항체 부분 및 면역부착 분자는 본원에 기재된 바와 같이 표준 재조합 DNA 기법을 이용함으로써 수득될 수 있다.
본원에서 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 갖지 않는 항체를 지칭하기 위한 것이다(예를 들면, IgE에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 IgE 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 갖지 않는다). 그러나, 예를 들면, 인간 IgE에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대, 다른 종으로부터의 IgE 분자에 대한 교차반응성을 가질 수 있다. 나아가, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 갖지 않을 수 있다.
용어 "CDR-이식된 항체"는 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되, VH 및/또는 VL의 CDR 영역들 중 하나 이상의 CDR 영역의 서열이 또 다른 종의 CDR 서열로 대체되어 있는 항체, 예컨대, 인간 CDR들 중 하나 이상의 CDR(예를 들면, CDR3)이 뮤린 CDR 서열로 대체되어 있는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "카바트 넘버링", "카바트 정의" 및 "카바트 표지부착"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 당분야에서 인식되어 있는 이 용어들은 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기보다 더 가변적인(즉, 초가변적인) 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 지칭한다(Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 and, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 중쇄 가변 영역의 경우, 초가변 영역은 카바트 넘버링 시스템에 따른 아미노산 위치 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 이른다. 그러나, 초티아(Chothia)(Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따르면, CDR-H1에 해당하는 루프는 잔기 26부터 잔기 32까지 걸쳐 있다. 따라서, 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 "CDR-H1"은 카바트 넘버링 시스템과 초티아 위상 루프 정의의 조합에 의해 기재될 때 잔기 26 내지 35를 지칭하기 위한 것이다. 경쇄 가변 영역의 경우, 초가변 영역은 CDRL1의 경우 아미노산 위치 24부터 34까지 이르고, CDRL2의 경우 아미노산 위치 50부터 56까지 이르고, CDRL3의 경우 아미노산 위치 89부터 97까지 이른다.
본원에서 사용된 용어 "수용자" 및 "수용자 항체"는 프레임워크 영역들 중 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%를 제공하거나 코딩하는 항체 또는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "수용자"는 불변 영역(들)을 제공하거나 코딩하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, 용어 "수용자"는 프레임워크 영역들 및 불변 영역(들) 중 하나 이상을 코딩하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어 "수용자"는 프레임워크 영역들 중 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%를 제공하거나 코딩하는 인간 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 이 실시형태에 따르면, 수용자는 인간 항체의 하나 이상의 특정 위치에서 발견되지 않는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 10개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 수용자 프레임워크 영역 및/또는 수용자 불변 영역(들)은 예를 들면, 생식세포계 항체 유전자, 성숙 항체 유전자, 기능성 항체(예를 들면, 당분야에서 잘 공지되어 있는 항체, 개발 중인 항체, 또는 상업적으로 입수될 수 있는 항체)로부터 유래할 수 있거나 수득될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 중쇄 CDR의 경우 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서 명명되고 경쇄 CDR의 경우 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서 명명된 3개의 CDR들이 중쇄 및 경쇄의 각각의 가변 영역에 존재한다. 본원에서 사용된 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 발견되는 3개의 CDR들의 군을 지칭한다. 이 CDR들의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되어 있다. 카바트에 의해 기재된 시스템(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))은 항체의 임의의 가변 영역에 적용될 수 있는 분명한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 3개의 CDR들을 정의하는 정확한 잔기 경계도 제공한다. 이 CDR들은 카바트 CDR들로서 지칭될 수 있다. 초티아와 동료들(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) and Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989))은 카바트 CDR들 내의 특정 하위부분들이 아미노산 서열의 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고 거의 동일한 펩타이드 골격 입체구조를 채택한다는 것을 발견하였다. 이 하위부분들은 L1, L2 및 L3, 또는 H1, H2 및 H3으로서 명명되었고, 이때 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 영역 및 중쇄 영역을 표시한다. 이 영역들은 카바트 CDR들과 중첩되는 경계를 갖는 초티아 CDR들로서 지칭될 수 있다. 카바트 CDR들과 중첩되는 CDR들을 정의하는 다른 경계는 문헌(Padlan, FASEB J. 9:133-139 (1995)) 및 문헌(MacCallum, J Mol Biol 262(5):732-45 (1996))에 기재되어 있다. 특정 잔기 또는 잔기들의 군 또는 심지어 전체 CDR들이 항원 결합에 유의미하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 볼 때, 다른 CDR 경계 정의들은 단축될 수 있거나 늘어날 수 있을지라도, 이들은 상기 시스템들 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있으나, 그럼에도 불구하고 카바트 CDR들과 중첩될 것이다. 바람직한 실시형태가 카바트 또는 초티아, 또는 이들의 병용에 의해 정의된 CDR을 사용할지라도, 본원에서 이용된 방법은 이 시스템들 중 임의의 시스템에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "정규(canonical)" 잔기는 문헌(Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992); 이들 둘 다가 본원에 참고로 도입됨)에서 정의된 특정 정규 CDR 구조를 규정하는, CDR 또는 프레임워크 내의 잔기를 지칭한다. 상기 문헌(Chothia et al.)에 따르면, 많은 항체들의 CDR의 임계 부분은 아미노산 서열 수준에서의 큰 다양성에도 불구하고 거의 동일한 펩타이드 골격 입체구조를 갖는다. 각각의 정규 구조는 루프를 형성하는 아미노산 잔기들의 연속 분절에 대한 한 세트의 펩타이드 골격 비틀림 각도를 일차적으로 특정한다.
본원에서 사용된 용어 "공여자" 및 "공여자 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 항체를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 공여자 항체는 프레임워크 영역이 수득되거나 유래한 항체와 상이한 종으로부터의 항체이다. 인간화된 항체와 관련하여, 용어 "공여자 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비인간 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 CDR을 뺀 가변 영역의 남은 서열을 지칭한다. CDR 서열의 정확한 정의가 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있기 때문에, 프레임워크 서열의 의미는 상응하게 상이하게 해석된다. 6개의 CDR들(경쇄의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 및 중쇄의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)도 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 영역을 각각의 쇄에서 4개의 하위영역들(FR1, FR2, FR3 및 FR4)로 나누고, 이때 CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치하고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치하고, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. 특정 하위영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 특정하지 않으면서, 다른 사람들에 의해 지칭될 때, 프레임워크 영역은 단일 천연 생성 면역글로불린 쇄의 가변 영역 내의 조합된 FR들을 나타낸다. 본원에서 사용된 FR은 4개의 하위영역들 중 하나를 나타내고, FR들은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 하위영역들 중 2개 이상의 하위영역들을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "생식세포계 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 면역글로불린의 발현을 위해 유전적 재배열 및 돌연변이를 유발하는 성숙 과정을 겪지 않은 비림프계 세포에 의해 코딩된 면역글로불린 서열을 지칭한다. 예를 들면, 문헌(Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002)); 및 문헌(Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001))을 참조한다. 본 발명의 다양한 실시형태들에 의해 제공된 장점들 중 하나는 생식세포계 항체 유전자가 종에서 개체의 필수 아미노산 서열 구조 특성을 보존할 가능성이 성숙 항체 유전자보다 더 높으므로, 그 종에서 치료적으로 사용될 때 외부 공급원으로부터 유래하는 것으로서 인식될 가능성이 더 적다는 인식을 이용한다.
본원에서 사용된 용어 "핵심"은 항체, 특히 인간화된 항체의 결합 특이성 및/또는 친화성에 더 많이 영향을 미치는, 가변 영역 내의 특정 잔기를 지칭한다. 핵심 잔기는 CDR에 인접한 잔기, 잠재적인 글리코실화 부위(N-글리코실화 또는 O-글리코실화 부위일 수 있음), 희귀 잔기, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, 정규 잔기, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기, 버니어 대역(Vernier zone) 내의 잔기, 및 가변 중쇄 CDR1의 초티아 정의와 제1 중쇄 프레임워크의 카바트 정의 사이에 중첩되는 영역 내의 잔기들 중 하나 이상을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
용어 "인간화된 항체"는 일반적으로 인간이 아닌 종(예를 들면, 토끼, 마우스 등)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되, VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 "인간과 더 유사"하도록, 즉 인간 생식세포계 가변 서열과 더 유사하도록 변경되어 있는 항체를 지칭한다. 인간화된 항체의 한 유형은 인간 CDR 서열이 비인간 VH 및 VL 서열 내로 도입되어 상응하는 비인간 CDR 서열을 대체하는 CDR-이식된 항체이다. 인간화된 항체의 또 다른 유형은 적어도 하나의 비인간 CDR이 인간 프레임워크 내로 삽입되어 있는 CDR-이식된 항체이다. 후자가 전형적으로 본 발명의 초점이다.
특히, 본원에서 사용된 용어 "인간화된 항체"는 관심 있는 항원에 면역특이적으로 결합하고 인간 항체의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 프레임워크(FR) 영역 및 비인간 항체의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체, 또는 이의 변이체, 유도체, 유사체 또는 단편이다. CDR과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "실질적으로"는 비인간 항체 CDR의 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 지칭한다. 한 실시형태에서, 인간화된 항체는 비인간 항체 CDR에 비해 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 갖는 CDR 영역을 갖는다. 추가로, 비인간 CDR은 공지된 기법을 이용함으로써 "인간과 더 유사"하거나 인체에 더 적합하도록 조작될 수 있다. 인간화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, F(ab')c, Fv)을 포함하고, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역들은 비인간 면역글로불린(즉, 공여자 항체)의 CDR 영역들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역들은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 프레임워크 영역이다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부도 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간화된 항체는 두 경쇄뿐만 아니라 적어도 중쇄의 가변 도메인도 함유한다. 항체는 중쇄의 CH1, 힌지, CH2 및 CH3, 또는 CH1, CH2, CH3 및 CH4도 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간화된 항체는 인간화된 경쇄만을 함유한다. 일부 실시형태에서, 인간화된 항체는 인간화된 중쇄만을 함유한다. 특정 실시형태에서, 인간화된 항체는 경쇄의 인간화된 가변 도메인 및/또는 인간화된 중쇄만을 함유한다. 본원에서 언급된 돌연변이들 중 일부 돌연변이들이 통상적으로 "인간"이 아닐 수 있지만, 이들은 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 "인간화"되지 않기에 불충분하다.
인간화된 항체는 IgY, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 클래스의 면역글로불린, 및 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 인간화된 항체는 하나 초과의 클래스 또는 이소타입으로부터의 서열을 포함할 수 있고, 특정 불변 도메인은 당분야에서 잘 공지되어 있는 기법을 이용함으로써 원하는 이펙터 기능을 최적화하도록 선택될 수 있다.
인간화된 항체의 프레임워크 및 CDR 영역은 모 서열에 정확히 상응할 필요가 없고, 예를 들면, 공여자 항체 CDR 또는 컨센서스 프레임워크는 그 부위에서 CDR 또는 프레임워크 잔기가 공여자 항체 또는 컨센서스 프레임워크에 정확히 상응하지 않도록 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않을 것이다. 통상적으로, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 인간화된 항체 잔기들이 모 FR 및 CDR 서열의 잔기들에 상응할 것이다. 한 실시형태에서, 모 FR 및 CDR 서열에 비해(예를 들면, 오말리주맙 또는 오말리주맙 Fab 서열에 비해) 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개)의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실이 인간화된 항체에 존재할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열 내의 프레임워크 영역을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련 면역글로불린 서열들의 패밀리에서 가장 흔히 발견되는 아미노산들(또는 뉴클레오타이드들)로부터 형성된 서열을 지칭한다(예를 들면, 문헌(Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)) 참조). 면역글로불린의 패밀리에서, 컨센서스 서열 내의 각각의 위치는 상기 패밀리에서 그 위치에서 가장 흔히 발견되는 아미노산에 의해 점유된다. 2개의 아미노산들이 동등하게 빈번히 발견되는 경우, 이들 중 어느 하나가 컨센서스 서열에 포함될 수 있다.
본원에서 사용된 "버니어" 대역은 문헌(Foote and Winter, 1992, J. Mol. Biol. 224:487-499, 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 바와 같이 CDR 구조를 조절할 수 있고 항원에 대한 피트(fit)를 미세조정할 수 있는 프레임워크 잔기의 서브세트를 지칭한다. 버니어 대역 잔기들은 CDR 기저 층을 형성하고 CDR의 구조 및 항체의 친화성에 영향을 미칠 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "중화"는 본원에 기재된 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 IgE 단백질에 특이적으로 결합할 때 IgE의 생물학적 활성의 중화를 지칭한다. 중화는 상기 항체와 IgE의 상이한 결합 방식의 결과일 수 있다. 바람직하게는, 중화 항체는 그와 IgE의 결합이 IgE의 생물학적 활성의 중화를 야기하는 항체이다. 바람직하게는, 중화 결합 단백질은 IgE에 결합하고 IgE의 생물학적 활성을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 80% 또는 85% 이상 감소시킨다. 중화 항체에 의한 IgE의 생물학적 활성의 중화는 본원에 기재된 IgE 생물학적 활성의 하나 이상의 표시자를 측정함으로써 평가될 수 있다.
본원에서 사용된 "중화 단일클론 항체"는 IgE에 결합할 때 IgE의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 억제할 수 있거나 감소시킬 수 있는 항체 분자의 제제를 지칭하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "약화", "약화시킨다" 등은 상승된 혈청 IgE 수준에 의해 유발된 증상 또는 상태의 중증도를 경감시키거나 감소시키는 것을 지칭한다.
용어 "에피토프" 또는 "항원성 결정인자"는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 결정인자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 에피토프 결정인자는 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐을 포함하고, 일부 실시형태에서, 특정 3차원적 구조 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 주장된다.
본원에서 사용된 용어 "kon"은 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 항체/항원 복합체를 형성하기 위한 항체와 항원의 회합에 대한 결합 속도 상수를 지칭하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "koff"는 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 해리 속도 상수를 지칭하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "kd" 또는 "kD"는 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하기 위한 것이다.
면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화성은 이 상호작용의 해리 상수(kD 또는 kd)의 관점에서 표현될 수 있고, 이때 보다 더 작은 kd는 보다 더 크거나 보다 더 높은 친화성을 나타낸다. 선택되는 폴리펩타이드의 면역학적 결합 성질은 당분야에서 잘 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 정량될 수 있다. 한 이러한 방법은 항원 결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 상기 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화성, 및 양 방향에서 상기 속도에 동등하게 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 의존한다. 따라서, "결합 속도 상수"("kon") 및 "해리 속도 상수"("koff") 둘 다가 결합 및 해리의 농도 및 실제 속도의 계산에 의해 결정될 수 있다(Nature 361:186-87 (1993)). koff/kon의 비는 친화성과 관련되지 않은 모든 파라미터들의 무효화를 가능하게 하고, 해리 상수 kd와 동등하다(Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473).
용어 "항체 접합체"는 제2 화학적 모이어티, 예컨대, 치료 또는 세포독성 작용제에 화학적으로 연결된 결합 단백질, 예컨대, 항체 또는 항체 단편 또는 이의 결합 부분을 지칭한다. 용어 "작용제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물들의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터 만들어진 추출물을 의미하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "결정" 및 "결정화된"은 결정의 형태로 존재하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 결정은 다른 형태, 예컨대, 비결정성 고체 상태 또는 액체 결정성 상태와 상이한 고체 상태의 물질의 한 형태이다. 결정은 원자, 이온, 분자(예를 들면, 단백질, 예컨대, 항체) 또는 분자 조립체(예를 들면, 항원/항체 복합체)의 규칙적인 반복되는 3차원적 어레이로 구성된다. 이 3차원적 어레이는 당분야에서 잘 이해되는 특정 수학적 관계에 따라 정렬된다. 결정에서 반복되는 기본적인 유닛 또는 구축 블록은 비대칭적인 유닛으로서 지칭된다. 소정의 잘 정의된 결정학적 대칭에 일치하는 정렬에서 비대칭적인 유닛의 반복은 결정의 "유닛 셀"을 제공한다. 모든 3차원에서 규칙적인 번역에 의한 유닛 셀의 반복은 결정을 제공한다. 문헌(Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, N.Y., (1999))을 참조한다.
본원에서 지칭된 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 이들 중 어느 한 유형의 변형된 형태의 뉴클레오타이드인 2종 이상의 뉴클레오타이드들의 중합체 형태를 의미한다. 상기 용어는 단일 가닥 형태 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함하나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
본원에서 사용된 용어 "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 "단리된 폴리뉴클레오타이드"가 자연에서 "단리된 폴리뉴클레오타이드"와 함께 발견되는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 회합되어 있지 않거나; 자연에서 그 자신에 연결되어 있지 않은 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있거나; 보다 더 큰 서열의 일부로서 자연에서 발견되지 않는다는 점에서 그의 기원에 의해 (예를 들면, 게놈, cDNA 또는 합성 유래, 또는 이들의 일부 조합의) 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 그 자신에 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위한 것이다. 한 유형의 벡터는 추가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 이때 추가 DNA 분절은 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 일부 벡터들은 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들면, 세균 복제기점을 갖는 세균 벡터 및 에피좀성 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들면, 비에피좀성 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 삽입됨으로써, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 뿐만 아니라, 일부 벡터들은 이들에 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히, "발현 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 형태의 벡터이기 때문에,"플라스미드"와 "벡터"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능에 기여하는 이러한 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터(예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)를 포함하기 위한 것이다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 기재된 성분들이 그들의 의도된 방식으로 작용하게 하는 관계로 존재하는 병치를 의미한다. 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열에 적합한 조건 하에서 달성되는 방식으로 결찰된다. "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심 있는 유전자와 인접한 발현 조절 서열, 및 트랜스로 또는 멀리서 작용하여 관심 있는 유전자를 조절하는 발현 조절 서열 둘 다를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "발현 조절 서열"은 그 자신에 결찰된 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미치는 데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 시작, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호, 예컨대, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 요구될 때 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 상이하고; 원핵생물에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵생물에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 그의 존재가 발현 및 프로세싱을 위해 필수적인 성분을 포함하기 위한 것이고, 그의 존재가 유리한 추가 성분, 예를 들면, 리더 서열 및 융합 파트너 서열도 포함할 수 있다.
본원에서 정의된 "형질전환"은 외생성 DNA가 숙주 세포로 들어가는 임의의 과정을 지칭한다. 형질전환은 당분야에서 잘 공지되어 있는 다양한 방법들을 이용함으로써 천연 또는 인공 조건 하에서 일어날 수 있다. 형질전환은 외부 핵산 서열을 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 삽입하는 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다. 상기 방법은 형질전환되는 숙주 세포를 기반으로 선택되고, 바이러스 감염, 전기천공, 지질감염 및 입자 폭격(bombardment)을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 "형질전환된" 세포는 삽입된 DNA가 자율 복제 플라스미드로서, 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있는 안정하게 형질전환된 세포를 포함한다. 이들은 한정된 시간 동안 삽입된 DNA 또는 RNA를 일시적으로 발현하는 세포도 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히, "숙주 세포")는 외생성 DNA가 도입된 세포를 지칭하기 위한 것이다. 이러한 용어들은 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손세포도 지칭하기 위한 것임을 이해해야 한다. 일부 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손세포는 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다. 바람직하게는, 숙주 세포는 임의의 생명계로부터 선택되는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 바람직한 진핵 세포는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 가장 바람직하게는, 숙주 세포는 원핵 세포주 이. 콜라이(E. coli); 포유동물 세포주 CHO, HEK 293 및 COS; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들면, 전기천공, 지질감염)을 위해 표준 기법이 이용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기법은 제조자의 설명서에 따라 수행될 수 있거나, 당분야에서 통상적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 상기 기법들 및 절차들은 일반적으로 당분야에서 잘 공지되어 있고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 고찰된 다양한 일반적인 참고문헌들 및 보다 더 구체적인 참고문헌들에 기재된 통상의 방법에 따라 일반적으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 임의의 목적으로 본원에 참고로 도입된 문헌(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)))을 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "유효량"은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 지속을 감소시키거나 완화시키거나, 장애의 발달을 예방하거나, 장애의 퇴행을 야기하거나, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발생, 발병 또는 진행을 예방하거나, 장애를 검출하거나, 또 다른 요법(예를 들면, 예방제 또는 치료제)의 예방 또는 치료 효과(들)를 향상시키거나 개선시키기에 충분한 요법의 양을 지칭한다.
본원에서 제공된 인간 IgE 단백질의 특정 영역 또는 에피토프 맵핑은 본 발명에 의해 제공된 항체들 중 어느 한 항체와 조합되는, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 에피토프 맵핑 방법에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법의 예로는 항체에 의해 인식되는 에피토프의 서열을 함유하는, 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 가장 작은 단편을 사용하여 본 발명의 항체에의 결합에 대해 IgE로부터 유래한 다양한 길이의 펩타이드를 스크리닝하는 것이 있다. IgE 펩타이드는 합성에 의해 생성될 수 있거나 IgE 단백질의 단백질용해성 분해에 의해 생성될 수 있다. 항체에 결합하는 펩타이드는 예를 들면, 질량 분광측정 분석에 의해 확인될 수 있다. 또 다른 예에서, NMR 분광법 또는 X-선 결정학을 이용하여 본 발명의 항체에 의해 결합되는 에피토프를 확인할 수 있다. IgE의 구조, 및 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질에 결합되는 IgE의 에피토프를 확인함에 있어서 결정화 및 X-선 결정학 기법이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 항체는 예를 들면, 문헌(Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l); 국제 특허출원 공보 제WO92/02551호; 국제 특허출원 공보 제WO2004/051268호; 및 국제 특허출원 공보 제WO2004/106377호에 기재된 방법으로 특정 항체의 생성에 대해 선택되는 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시킴으로써 단일 림프구 항체 방법의 이용을 통해 생성될 수 있다. 항체에 대한 스크리닝은 인간 IgE에의 결합을 측정하는 어세이, 및/또는 IgE와 그의 천연 수용체의 결합을 차단하는 능력을 측정하는 어세이를 이용함으로써 수행될 수 있다. 결합 어세이의 한 예는 ELISA이다.
(CDR-이식된 항체를 포함하는) 인간화된 항체는 비인간 종(예를 들면, 토끼 또는 마우스)으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 항체 분자이다(예를 들면, 미국 특허 제5,585,089호; 및 국제 특허출원 공보 제WO91/09967호 참조). 전체 CDR보다는 오히려 CDR의 특이성 결정 잔기만을 옮길 필요가 있을 수 있다는 것이 인식될 것이다(예를 들면, 문헌(Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34) 참조). 인간화된 항체는 경우에 따라 CDR이 유래한 비인간 종으로부터 유래한 하나 이상의 프레임워크 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 후자는 종종 공여자 잔기로서 지칭된다. 본 발명의 항체 분자는 적절하게는 2 nM 미만의 결합 친화성(KD)을 갖는다. 친화성은 단리된 천연 또는 재조합 IgE 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩타이드를 사용하여, 본원의 실시예(실시예 6 참조)에 기재된 바와 같이, 비아코어를 포함하는, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 방법을 이용함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 물질의 친화성뿐만 아니라, 결합제(예컨대, 항체)가 결합을 억제하는 정도도 통상의 기법, 예를 들면, 문헌(Scatchard et al., Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949))에 기재된 기법, 또는 비아코어와 같은 시스템을 이용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)을 이용함으로써 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자에 의해 측정될 수 있다. 표면 플라스몬 공명의 경우, 표적 분자는 고체 상에 고정되고 유동 셀을 따라 흐르는 이동 상에 있는 리간드에 노출된다. 리간드와 고정된 표적의 결합이 일어나는 경우, 국소 굴절 지수가 변화하여, 반사된 광의 강도의 변화를 검출함으로써 실시간으로 모니터링될 수 있는 SPR 각도의 변화를 유발한다. SPR 신호의 변화 속도를 분석하여, 결합 반응의 회합기 및 해리기에 대한 겉보기 속도 상수를 산출할 수 있다. 이 값들의 비는 겉보기 평형 상수(친화성)를 제공한다(예를 들면, 문헌(Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)) 참조).
당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 방법을 이용하여 본 발명에 의해 제공된 항체의 친화성을 변경할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 IgE에 대한 개선된 친화성을 가진, 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이기도 하다. 이러한 변이체는 CDR을 돌연변이시키는 것(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 쇄 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 이. 콜라이의 돌연변이유발자 균주의 사용(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링(Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 성적 PCR(Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 포함하는 다수의 친화성 성숙 프로토콜들에 의해 수득될 수 있다. (상기) 문헌(Vaughan et al.)은 이 친화성 성숙 방법들을 논의한다.
인간화된 항체 및 항원 결합 물질
본 발명의 한 양태에서, 본원은 인간화된 항-IgE 단일클론 항체 및 항원 결합 물질을 제공한다. 인간화된 항체는 중쇄 및/또는 경쇄가 수용자 항체(예를 들면, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 이식된, 공여자 항체(예를 들면, 비인간 항체, 예컨대, 뮤린 또는 토끼 단일클론 항체)로부터의 하나 이상의 CDR(요구된 경우, 하나 이상의 변형된 CDR을 포함함)을 함유한다. 검토를 위해서는 문헌(Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998)을 참조한다.
한 실시형태에서, 전체 CDR이 옮겨지기 보다는 오히려, 본원에서 앞서 기재된 CDR들 중 어느 한 CDR로부터의 특이성 결정 잔기들 중 하나 이상의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 옮겨진다(예를 들면, 문헌(Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34) 참조). 한 실시형태에서, 본원에 기재된 CDR들 중 하나 이상의 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 옮겨진다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 CDR들 각각으로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 옮겨진다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 이식될 때, 마우스, 토끼, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 포함하는, CDR이 유래한 공여자 항체의 클래스/유형을 유념하면서 임의의 적절한 수용자 가변 영역 프레임워크 서열을 사용할 수 있다.
적절하게는, 본 발명에 따른 인간화된 항체는 인간 수용자 프레임워크 영역을 포함하는 가변 도메인뿐만 아니라 본원에서 구체적으로 제공된 CDR들 중 하나 이상의 CDR도 갖는다. 따라서, 한 실시형태에서, 인간 IgE에 결합하는 인간화된 단일클론 항체가 제공되고, 이때 가변 도메인은 (본원에 기재된 임의적 돌연변이를 가진) 인간 수용자 프레임워크 영역 및 비인간 공여자 CDR을 포함한다.
CDR-이식된 항체의 구축은 긴 올리고뉴클레오타이드를 사용한 부위 지정된 돌연변이유발로 마우스 단일클론 항체의 CDR을 인간 면역글로불린의 가변 도메인의 프레임워크 영역에 이식하는 방법을 개시하고 본원에 도입된 유럽 특허출원 제EP-A-0239400호에 일반적으로 기재되어 있다. CDR은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고 가변 도메인의 프레임워크 영역에 탑재된 상대적으로 짧은 펩타이드 서열이다.
CDR 이식으로 단일클론 항체를 인간화하는 것에 대한 최초의 작업은 합성 항원, 예컨대, NP를 인식하는 단일클론 항체에 대해 수행되었다. 그러나, 라이소자임을 인식하는 마우스 단일클론 항체 및 인간 T 세포의 항원을 인식하는 래트 단일클론 항체가 CDR 이식에 의해 인간화된 예는 각각 문헌(Verhoeyen et al., Science, 239, 1534-1536, 1988) 및 문헌(Riechmann et al., Nature, 332, 323-324, 1988)에 기재되어 있다. 항체 인간화는 비인간 항체, 예컨대, 마우스, 래트, 염소 또는 토끼 항체의 CDR을 "유사한" 인간 프레임워크(수용자)에 이식하고, 원래의 CDR 입체구조를 유지하기 위해 공여자 단일클론 항체로부터 수동으로 선택되고 인간 수용자 프레임워크 내로 도입되는 최소한의 수의 핵심 프레임워크 잔기(역-돌연변이)를 선택함으로써 달성된다. 이러한 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 본원에 도입된 문헌(Jones et al., Nature 321:522 (1986)); 문헌(Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)); 문헌(Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)); 문헌(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)); 문헌(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992)); 문헌(Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)); 문헌(Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)); 문헌(Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)); 문헌(Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)); PCT 공보 제WO 91/09967호; PCT 특허출원 제US98/16280호, 제US96/18978호, 제US91/09630호, 제US91/05939호 및 제US94/01234호, 영국 특허 제89/01334호, 제91/01134호 및 제92/01755호; PCT 공보 제WO90/14443호, 제WO90/14424호 및 제WO90/14430호; 유럽 특허 제229246호, 제592,106호, 제519,596호 및 제239,400호; 및 미국 특허 제5,565,332호, 제5,723,323호, 제5,976,862호, 제5,824,514호, 제5,817,483호, 제5,814,476호, 제5,763,192호, 제5,723,323호, 제5,766,886호, 제5,714,352호, 제6,204,023호, 제6,180,370호, 제5,693,762호, 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,225,539호 및 제4,816,567호에 기재된 방법들을 포함한다
인간 가변 중쇄 및 경쇄 생식세포계 서브패밀리 분류는 카바트 생식세포계 하위군 명칭으로부터 유래할 수 있다: 특정 VH 서열의 경우 VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6 또는 VH7, 및 프레임워크 4에 대한 특정 가변 중쇄 연결 기의 경우 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 및 JH6; 프레임워크 1, 2 및 3에 대한 특정 VL 카파 서열의 경우 VK1, VK2, VK3, VK4, VK5 또는 VK6, 및 프레임워크 4에 대한 특정 카파 연결 기의 경우 JK1, JK2, JK3, JK4 또는 JK5; 또는 프레임워크 1, 2 및 3에 대한 특정 VL 람다 서열의 경우 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9 또는 VL10, 및 프레임워크 4에 대한 특정 람다 연결 기의 경우 JL1, JL2, JL3 또는 JL7.
존재하는 경우, 항체 분자의 제안된 기능, 특히 요구될 수 있는 이펙터 기능을 유념하면서 본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인을 선택할 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체 분자가 치료 용도를 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구될 때, 특히 IgG1 및 IgG3 이소타입의 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료 목적을 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않을 때, IgG2 및 IgG4 이소타입이 사용될 수 있다. 이 불변 영역 도메인들의 서열 변이체도 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들면, 문헌(Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108)에 기재된 바와 같이 위치 241에서 세린이 프롤린으로 바뀌어 있는 IgG4 분자가 사용될 수 있다. 항체가 다양한 번역후 변형을 겪을 수 있다는 것도 당분야에서 숙련된 자에 의해 이해될 것이다. 이 변형의 유형 및 정도는 항체를 발현시키는 데 사용된 숙주 세포주 및 배양 조건에 종종 의존한다. 이러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화의 변경을 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 (문헌(Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995)에 기재된 바와 같은) 카복시펩티다제의 작용으로 인한 카복시 말단 염기성 잔기(예컨대, 라이신 또는 아르기닌)의 상실이다. 따라서, 항체 중쇄의 C-말단 라이신은 부재할 수 있다.
CDR 및 인간 프레임워크 변형
리히만(Riechmann et al.)은 (카바트(Kabat et al. (상기) and Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970))에 의해 정의된 바와 같은) CDR 단독의 전달이 CDR-이식된 생성물의 만족스러운 항원 결합 활성을 제공하기에 충분하지 않다는 것을 발견하였다. 다수의 프레임워크 잔기들이 공여자 프레임워크 영역의 잔기들에 상응하기 위해 변경되어야 한다는 것이 확인되었다. 어느 프레임워크 잔기가 변경될 필요가 있는 지를 선택하기 위한 제안된 기준은 본원에 도입된 국제 특허출원 공보 제WO 90/07861호에 기재되어 있다.
인간 가변 도메인 프레임워크가 CDR이 유래한 비인간 가변 프레임워크와 동일하거나 유사한 입체구조를 채택하는 경우, 인간 가변 도메인 프레임워크 내로의 비인간 CDR의 치환은 CDR의 정확한 공간적 배향의 유지를 야기할 가능성이 가장 높다. 이것은 CDR이 유래한 비인간 가변 프레임워크 도메인과 고도의 서열 동일성을 나타내는 프레임워크 서열을 갖는 인간 항체로부터 인간 가변 도메인을 수득함으로써 달성된다. 전술된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유래할 수 있다. 인간 항체 서열은 천연 생성 인간 항체의 서열일 수 있거나, 여러 인간 항체들의 컨센서스 서열일 수 있다. 문헌(Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991)); 문헌(Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993)); 및 국제 특허출원 공보 제WO 92/22653호(Carter et al.)를 참조한다.
비인간 공여자 면역글로불린 및 적절한 인간 수용자 면역글로불린의 상보성 결정 영역이 확인되면, 다음 단계는 만약에 있다면 이 성분들로부터의 어느 잔기가 생성된 인간화된 항체의 성질을 최적화하기 위해 치환되어야 하는 지를 확인하는 것이다. 일반적으로, 비인간 잔기의 도입이 인간에서 인간-항-공여자-항체(HADA) 반응을 이끌어내는 항체의 위험을 증가시키기 때문에, 비인간 아미노산 잔기에 의한 인간 아미노산 잔기의 치환은 최소화되어야 한다. 당분야에서 인정된 면역 반응 확인 방법을 수행하여, 특정 숙주에서 또는 임상 시험 동안 HADA 반응을 모니터링할 수 있다. 인간화된 항체를 투여 받은 숙주는 상기 요법의 투여 초기 및 전체에서 면역원성 평가를 제공받을 수 있다. 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 기술(비아코어) 및/또는 고체 상 ELISA 분석을 포함하는, 당업자에게 공지되어 있는 방법을 이용하여 숙주로부터의 혈청 샘플에서 인간화된 치료 시약에 대한 항체를 검출함으로써 HADA 반응을 측정한다.
치환(또한 본원에서 "돌연변이")될 아미노산 잔기의 선택은 부분적으로 컴퓨터 모델링에 의해 결정된다. 면역글로불린 분자의 3차원 영상을 생성하는 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어는 본원에 기재되어 있다. 일반적으로, 면역글로불린 쇄 또는 이의 도메인의 해상된 구조로부터 출발하여 분자 모델을 생성한다. 모델링되는 쇄를 해상된 3차원 구조의 쇄 또는 도메인과 아미노산 서열 유사성에 대해 비교하고, 가장 큰 서열 유사성을 보이는 쇄 또는 도메인을 분자 모델의 구축을 위한 출발점으로서 선택한다. 모델링을 위해 적어도 50% 서열 동일성을 공유하는 쇄 또는 도메인을 선택하고, 바람직하게는 모델링을 위해 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쇄 또는 도메인을 선택한다. 모델링되는 면역글로불린 쇄 또는 도메인의 실제 아미노산들 사이의 차이, 및 출발 구조의 차이를 허용하도록 해상된 출발 구조를 변형시킨다. 그 다음, 변형된 구조를 합성 면역글로불린으로 조립한다. 최종적으로, 에너지를 최소화하고, 모든 원자들이 서로로부터 적절한 거리 이내에 있고 결합 길이 및 각도가 화학적으로 허용 가능한 한계 이내에 있다는 것을 입증함으로써 모델을 개량한다.
치환될 아미노산 잔기의 선택은 부분적으로 특정 위치에서 아미노산의 특성을 조사하거나, 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발의 영향을 실험적으로 관찰함으로써 결정될 수도 있다. 예를 들면, 공여자 가변 영역 프레임워크 잔기와 선택되는 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 사이에 아미노산이 상이한 경우, 아미노산이 (1) 항원에 직접적으로 비공유결합하거나, (2) CDR 영역에 인접하거나, (3) CDR 영역과 다른 방식으로 상호작용하거나(예를 들면, 컴퓨터 모델링에 의해 측정될 때 CDR 영역의 약 3 내지 6 옹스트롬 이내에 있거나), (4) VL-VH 계면에 참여한다는 것이 합리적으로 예상될 때, 인간 프레임워크 아미노산은 통상적으로 공여자 항체로부터의 동등한 프레임워크 아미노산으로 치환될 것이다.
"항원에 직접적으로 비공유결합하는" 잔기는 확립된 화학적 힘에 따라, 예를 들면, 수소결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 등에 의해 항원의 아미노산과 직접적으로 상호작용할 높은 확률을 가진, 프레임워크 영역 내의 위치에 있는 아미노산을 포함한다. CDR 및 프레임워크 영역은 상기 문헌(Kabat et al.) 또는 문헌(Chothia et al.)에 의해 정의된 바와 같다. 상기 문헌(Kabat et al.)에 의해 정의된 프레임워크 잔기가 상기 문헌(Chothia et al.)에 의해 정의된 구조적 루프 잔기를 구성할 때, 공여자 항체에 존재하는 아미노산이 인간화된 항체 내로의 치환을 위해 선택될 수 있다. "CDR 영역에 인접한" 잔기는 인간화된 면역글로불린 쇄의 일차 서열에서 하나 이상의 CDR에 바로 인접한 위치, 예를 들면, 카바트에 의해 정의된 CDR 또는 초티아에 의해 정의된 CDR에 바로 인접한 위치에 있는 아미노산 잔기를 포함한다(예를 들면, 문헌(Chothia and Lesk 1MB 196:901 (1987)) 참조). 이 아미노산들은 특히 CDR 내의 아미노산과 상호작용할 가능성이 높고, 수용자로부터 선택되는 경우, 공여자 CDR을 비틀고 친화성을 감소시킬 가능성이 높다. 더욱이, 인접 아미노산들은 항원과 직접적으로 상호작용할 수 있고(Amit et al., Science, 233:747 (1986), 본원에 참고로 도입됨), 공여자로부터의 이 아미노산들의 선택은 원래의 항체에서 친화성을 제공하는 모든 항원 접촉을 유지하는 데 바람직할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, IgE에 대한 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 친화성을 개선하기 위해(및/또는 IgE의 Cε2에서 그의 상호작용 또는 에피토프를 연장시키기 위해) FR 서열도 치환/돌연변이시킬 수 있다.
"CDR 영역과 다른 방식으로 상호작용하는" 잔기는 CDR 영역에 영향을 미치기에 충분한 공간적 배향으로 존재하는 것으로 이차 구조 분석에 의해 확인된 잔기를 포함한다. 한 실시형태에서, "CDR 영역과 다른 방식으로 상호작용하는" 잔기는 공여자 면역글로불린의 3차원 모델(예를 들면, 컴퓨터에 의해 생성된 모델)을 분석함으로써 확인된다. 전형적으로 원래의 공여자 항체의 3차원 모델은 CDR의 외부에 있는 일부 아미노산들이 CDR과 유사하고 수소결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 등에 의해 CDR 내의 아미노산과 상호작용할 높은 확률을 갖는다는 것을 보여준다. 이러한 아미노산 위치에서, 수용자 면역글로불린 아미노산보다는 오히려 공여자 면역글로불린 아미노산이 선택될 수 있다. 이 기준에 따른 아미노산은 일반적으로 CDR에서 일부 원자의 약 3 옹스트롬 유닛(A) 이내에 측쇄 원자를 가질 것이고, 확립된 화학적 힘, 예컨대, 상기 나열된 힘에 따라 CDR 원자와 상호작용할 수 있는 원자를 함유해야 한다. 수소결합을 형성할 수 있는 원자들의 경우, 이들의 핵 사이에 3 Å이 측정되나, 결합을 형성하지 않는 원자들의 경우, 이들의 반데르발스 표면 사이에 3 Å이 측정된다. 따라서, 후자의 경우, 원자들이 상호작용할 수 있는 것으로 간주되기 위해 핵은 약 6 Å(3 Å 플러스 반데르발스 반경의 합계) 이내에 있어야 한다. 많은 경우들에서 핵은 4 Å 또는 5 Å 내지 6 Å 떨어져 있을 것이다. 아미노산이 CDR과 상호작용할 수 있는 지를 확인하는 데 있어서, 중쇄 CDR2의 마지막 8개 아미노산들을 CDR의 일부로서 간주하지 않는 것이 바람직한데, 이는 구조의 관점에서 볼 때, 이 8개의 아미노산들이 프레임워크의 일부로서 더 잘 행동하기 때문이다.
CDR(또는 FR) 내의 아미노산과 상호작용할 수 있는 아미노산은 또 다른 방식으로 확인될 수 있다. 각각의 프레임워크 아미노산의 용매 접근 가능한 표면적은 2종의 방식으로 계산된다: (1) 온전한 항체, 및 (2) 그의 CDR이 제거되어 있는 항체로 구성된 가상 분자. 약 10 평방 옹스트롬 이상의 이 수치들 사이의 유의미한 차이는 용매에의 프레임워크 아미노산의 접근이 CDR에 의해 적어도 부분적으로 차단되므로, 상기 아미노산이 CDR과 접촉한다는 것을 보여준다. 아미노산의 용매 접근 가능한 표면적은 당분야에서 공지되어 있는 알고리즘을 이용함으로써 항체의 3차원 모델을 기반으로 계산될 수 있다(예를 들면, 문헌(Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983)) 및 문헌(Lee and Richards, J. Mol. Biol. 55:379 (1971)), 이들 둘 다가 본원에 참고로 도입됨). 프레임워크 아미노산은 종종 CDR과 접촉하는 또 다른 프레임워크 아미노산의 입체구조에 영향을 미침으로써 CDR과 간접적으로 상호작용할 수도 있다.
프레임워크 내의 여러 위치들에 있는 특정 아미노산들이 많은 항체들에서 CDR과 상호작용할 수 있는 것으로 공지되어 있다(상기 문헌(Chothia and Lesk), 상기 문헌(Chothia et al.) 및 문헌(Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215:175 (1990)), 이들 모두 본원에 참고로 도입됨). 특히, 경쇄의 위치 2, 48, 64 및 71에 있는 아미노산, 및 중쇄의 위치 71 및 94에 있는 아미노산(카바트에 따른 넘버링)은 많은 항체들에서 CDR과 상호작용할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 경쇄의 위치 35에 있는 아미노산, 및 중쇄의 위치 93 및 103에 있는 아미노산도 CDR과 상호작용할 가능성이 있다. 모든 이 넘버링된 위치들에서, 수용자 아미노산보다는 오히려 공여자 아미노산(이들이 상이할 때)을 인간화된 면역글로불린에 존재하도록 선택하는 것이 바람직하다. 다른 한편으로, CDR 영역, 예컨대, 경쇄의 처음 5개 아미노산과 상호작용할 수 있는 일부 잔기들은 종종 인간화된 면역글로불린에서 친화성을 상실하지 않으면서 수용자 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다.
"VL-VH 계면에 참여하는" 잔기 또는 "팩킹 잔기"는 예를 들면, 문헌(Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985)) 또는 상기 문헌(Chothia et al.)에 의해 정의된 바와 같이 VL과 VH 사이의 계면에 있는 잔기를 포함한다. 일반적으로, 드문 팩킹 잔기들은 이들이 인간 프레임워크 내의 잔기들과 상이한 경우 인간화된 항체에 보유되어야 한다.
일반적으로, 상기 기준을 충족시키는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산이 치환된다. 일부 실시형태에서, 상기 기준을 충족시키는 아미노산들 전부 또는 대다수가 치환된다. 종종, 특정 아미노산이 상기 기준을 충족시키는 지에 대한 약간의 모호함이 있고, 대안적 변이체 면역글로불린들이 생성되고, 이들 중 하나는 그 특정 치환을 가지고, 이들 중 나머지 하나는 그 특정 치환을 갖지 않는다. 이렇게 생성된 대안적 변이체 면역글로불린은 원하는 활성에 대해 본원에 기재된 어세이들 중 임의의 어세이에서 테스트될 수 있고, 바람직한 면역글로불린이 선택될 수 있다.
통상적으로, 인간화된 항체에서 CDR 영역은 공여자 항체의 상응하는 CDR 영역과 실질적으로 동일하고, 보다 더 통상적으로 동일하다. 통상적으로 바람직하지는 않지만, 생성된 인간화된 면역글로불린의 결합 친화성에 인지 가능하게 영향을 미치지 않으면서 CDR 잔기의 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 만드는 것이 종종 가능하다. 보존적 또는 유사한 치환은 조합을 의미하고, 예를 들면, 이소류신 또는 발린이 류신으로 치환된다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산들은 하기 아미노산들을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다:
페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산);
라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산);
아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산);
아스파라긴 및 글루타민(아마이드 측쇄를 갖는 아미노산); 및
시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산).
치환을 위한 추가 후보는 그 위치에서 인간 면역글로불린에 드물거나 "희귀한" 수용자 인간 프레임워크 아미노산이다. 이 아미노산은 공여자 항체의 동등한 위치, 또는 보다 더 전형적인 인간 면역글로불린의 동등한 위치로부터의 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들면, 다른 인간 서열에 비해, 수용자 면역글로불린의 인간 프레임워크 영역 내의 아미노산이 그 위치에서 희귀하고 공여자 면역글로불린의 상응하는 아미노산이 인간 면역글로불린 서열의 그 위치에서 흔할 때; 또는 수용자 면역글로불린의 아미노산이 그 위치에서 희귀하고 공여자 면역글로불린의 상응하는 아미노산도 희귀할 때, 치환이 바람직할 수 있다. 이 기준은 인간 프레임워크 내의 비정형적 아미노산이 항체 구조를 파괴하지 않는다는 것을 보장하는 데 도움을 준다. 더욱이, 인간 항체에 전형적으로 존재하는, 공여자 항체로부터의 아미노산으로 드문 인간 수용자 아미노산을 대체함으로써, 보다 더 낮은 면역원성을 갖는 인간화된 항체를 만들 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "희귀한"은 대표적인 서열 샘플 중의 약 20% 미만, 통상적으로 약 10% 미만의 서열에서 그 위치에서 발견되는 아미노산을 표시하고, 본원에서 사용된 용어 "흔한"은 대표적인 샘플 중의 약 25% 초과, 통상적으로 약 50% 초과의 서열에서 발견되는 아미노산을 표시한다. 예를 들면, 모든 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열들은 특히 서로 상동하고 특정 임계 위치들에서 동일한 아미노산을 갖는 서열들의 "하위군"으로 각각 분류된다(상기 문헌(Kabat et al.)). 인간 수용자 서열의 아미노산이 인간 서열들 사이에 "희귀한" 지 아니면 "흔한" 지를 결정할 때, 동일한 하위군 내의 인간 서열들만을 수용자 서열로서 간주하는 것이 종종 바람직할 것이다.
치환을 위한 추가 후보는 희귀한 또는 드문 공여자 프레임워크 잔기에 상응하는 수용자 프레임워크 잔기이다. 희귀한 또는 드문 공여자 프레임워크 잔기는 그 위치에서 공여자 항체에 희귀한 또는 드문(본원에서 정의됨) 프레임워크 잔기이다. 공여자 항체의 경우, 하위군은 카바트에 따라 결정될 수 있고, 컨센서스와 상이한 잔기 위치가 확인될 수 있다. 이 공여자 특이적 차이는 활성을 향상시키는, 공여자 서열 내의 체세포 돌연변이를 암시할 수 있다. 결합에 영향을 미칠 것으로 예상된 드문 잔기는 보유되는 반면, 결합에 중요하지 않을 것으로 예상된 잔기는 치환될 수 있다.
치환을 위한 추가 후보는 수용자 프레임워크 영역에서 발견되는 비생식세포계 잔기이다. 예를 들면, 수용자 항체 쇄(즉, 공여자 항체 쇄와 유의미한 서열 동일성을 공유하는 인간 항체 쇄)가 생식세포계 항체 쇄(마찬가지로 공여자 쇄와 유의미한 서열 동일성을 공유함)에 정렬될 때, 수용자 쇄 프레임워크와 생식세포계 쇄 프레임워크 사이에 일치하지 않는 잔기는 생식세포계 서열로부터의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다.
상기 논의된 특정 아미노산 치환 이외에, 인간화된 면역글로불린의 프레임워크 영역들은 (본 발명의 목적을 위해 본원에 기재된 경우를 제외하고) 그들이 유래한 인간 항체의 프레임워크 영역들과 통상적으로 실질적으로 동일하고, 보다 더 통상적으로 동일하다. 물론, 프레임워크 영역 내의 대다수의 아미노산들은 항체의 특이성 또는 친화성에 거의 또는 전혀 직접적으로 기여하지 않는다. 따라서, 프레임워크 잔기의 많은 개별 보존적 치환들은 생성된 인간화된 면역글로불린의 특이성 또는 친화성의 인식 가능한 변화 없이 용인될 수 있다. 따라서, 한 실시형태에서, 인간화된 면역글로불린의 가변 프레임워크 영역은 인간 가변 프레임워크 영역 서열 또는 이러한 서열의 컨센서스와 적어도 65%, 75% 또는 85%의 서열 유사성 또는 동일성을 공유한다. 또 다른 실시형태에서, 인간화된 면역글로불린의 가변 프레임워크 영역은 인간 가변 프레임워크 영역 서열 또는 이러한 서열의 컨센서스와 적어도 90%, 바람직하게는 95%, 보다 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 유사성 또는 동일성을 공유한다. 그러나, 일반적으로, 이러한 치환은 (본원에 기재된 경우를 제외하고) 바람직하지 않다.
본원에서 사용된 바와 같이, 동일성 및 유사성의 정도는 예를 들면, 본원에 참고로 도입된 문헌(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988); 문헌(Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993); 문헌(Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994); 문헌(Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987); 문헌(Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991), NCBI로부터 입수될 수 있는 BLAST™ 소프트웨어(Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410); 문헌(Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272); 문헌(Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141); 문헌(Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402); 및 문헌(Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656)에 기재된 바와 같이 용이하게 계산될 수 있다.
본원에 참고로 도입된 문헌(Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998)을 포함하는, CDR-이식된 항체를 고찰하는 다수의 보고서들이 공개되었다.
본 발명의 항-IgE 항체는 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2007/024715호에 개시된 분자 DVD-Ig 또는 국제 특허출원 공보 제WO2011/030107호에 기재된 소위 (FabFv)2Fc에 따라 추가 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 항체는 2가, 3가 또는 4가 전체 길이 항체를 포함한다.
항원 결합 물질
항원 결합 물질은 단일쇄 항체(즉, 전체 길이 중쇄 및 경쇄); Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2001/090190호에 기재된 단일 도메인 항체(예를 들면, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 디아바디, 트리바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 이들 중 임의의 항원 결합 물질의 에피토프 항원 결합 물질을 포함한다(예를 들면, 문헌(Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136); 문헌(Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217) 참조). 이 항체 단편을 생성하고 제조하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181) 참조). Fab-Fv 포맷은 국제 특허출원 공보 제WO2009/040562호에 처음 개시되었고, 이의 디설파이드 안정화된 버전인 Fab-dsFv는 국제 특허출원 공보 제WO2010/035012호에 처음 개시되었다. 본 발명에서 사용될 다른 항체 단편은 국제 특허출원 공보 제WO2005/003169호, 국제 특허출원 공보 제WO2005/003170호 및 국제 특허출원 공보 제WO2005/003171호에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중특이성, 예를 들면, 이중특이성을 포함할 수 있거나, 단일특이적일 수 있다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO92/22583호 및 국제 특허출원 공보 제WO05/113605호 참조). 후자의 이러한 한 예는 국제 특허출원 공보 제WO92/22583호에 기재된 트리-Fab(또는 TFM)이다.
전형적인 Fab' 분자는 중쇄 및 경쇄 쌍을 포함하고, 이때 중쇄는 가변 영역 VH, 불변 도메인 CH1 및 천연 또는 변형된 힌지 영역을 포함하고, 경쇄는 가변 영역 VL 및 불변 도메인 CL을 포함한다.
한 실시형태에서, F(ab')2를 생성하기 위한 본 개시에 따른 Fab'의 이량체가 제공되고, 예를 들면, 이량체화는 본원에 기재된 천연 힌지 서열 또는 이의 유도체, 또는 합성 힌지 서열을 통해 달성될 수 있다.
항체 결합 도메인은 일반적으로 6개의 CDR들, 즉 중쇄로부터의 3개의 CDR들 및 경쇄로부터의 3개의 CDR들을 포함할 것이다. 한 실시형태에서, CDR들은 프레임워크 내에 있고 함께 가변 영역을 형성한다. 따라서, 한 실시형태에서, 항원 결합 물질은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 IgE에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
앞서 또는 다음에 기재된 바와 같이, IgE에 결합하는 항체의 능력을 유의미하게 변경시키지 않으면서 본 발명에 의해 제공된 CDR 또는 다른 서열(예를 들면, 가변 도메인)에 대한 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 만들 수 있다는 것이 인식될 것이다. 임의의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실의 효과는 예를 들면, 본원, 특히 실시예에 기재된 방법을 이용함으로써 당분야에서 숙련된 자에 의해 용이하게 테스트될 수 있다.
한 실시형태에서, IgE에 대한 본 발명의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 결합 친화성(KD)이 2, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4 또는 0.3 nM 미만이도록 본 발명에 의해 제공된 항체 또는 단편에서 사용된 CDR 또는 프레임워크 영역에 대한 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 만들 수 있다. 한 실시형태에서, 변형된 인간화된 항체가 제공되고, 이때 변형은 KD를 예를 들면, 2, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4 또는 0.3 nM 미만까지 감소시키기 위해 CDR, 프레임워크 영역 또는 이들 둘 다에 대해 만들어진다.
본 발명의 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 디아바디, scFAb, dFv, 단일 도메인 경쇄 항체, dsFv, CDR을 포함하는 펩타이드 등을 포함한다.
Fab는 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이고, 이때 (H 쇄의 위치 224에 있는 아미노산 잔기에서 절단하는) 프로테아제인 파파인으로 IgG를 처리함으로써 수득된 단편들 중에서 H 쇄의 N-말단 쪽의 약 절반 및 전체 L 쇄는 디설파이드 결합을 통해 함께 결합된다.
본 발명의 Fab는 IgE와 특이적으로 반응하는 본 발명의 인간화된 CDR-이식된 항체를 프로테아제인 파파인으로 처리함으로써 수득될 수 있다. 또한, Fab는 항체의 Fab를 코딩하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터 내로 삽입하고 상기 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 Fab를 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
F(ab')2는 IgG를 프로테아제인 펩신으로 처리함으로써 수득된 단편들 중에서 힌지 영역의 디설파이드 결합을 통해 결합된 Fab보다 약간 더 큰, 약 100,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 F(ab')2는 IgE와 특이적으로 반응하는 인간 CDR-이식된 항체를 프로테아제인 펩신으로 처리함으로써 수득될 수 있다. 또한, F(ab')2는 티오에테르 결합 또는 디설파이드 결합을 통해 이하에 기재된 Fab'를 결합시킴으로써 생성될 수 있다.
Fab'는 F(ab')2의 힌지 영역의 디설파이드 결합을 절단함으로써 수득된, 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 Fab'는 IgE와 특이적으로 반응하는 F(ab')2를 환원제인 디티오쓰레이톨로 처리함으로써 수득될 수 있다. 또한, 본 발명의 Fab'는 IgE와 특이적으로 반응하는 본 발명의 인간 CDR-이식된 항체의 Fab'를 코딩하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터 내로 삽입하고 상기 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 Fab'를 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
scFv는 한 쇄 VH 및 한 쇄 VL이 12개 이상의 잔기들의 적절한 펩타이드 링커(P)의 사용을 통해 연결되어 있고 항원 결합 활성을 갖는 VH-P-VL 또는 VL-P-VH 폴리펩타이드이다.
본 발명의 scFv는 본 발명의 IgE와 특이적으로 반응하는 인간 CDR-이식된 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 수득하고, scFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터 내로 삽입한 후, 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 scFv를 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
본 발명의 Fab 단편은 직접적으로 또는 링커를 통해 scFv에 연결될 수 있다. 본원에서 사용된 "단일쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 VH 가변 도메인과 VL 가변 도메인 사이의 펩타이드 링커, 예를 들면, 서열번호 151인 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커에 의해 안정화된 단일쇄 가변 단편을 지칭한다. Fab 단편에의 연결은 화학적 접합일 수 있으나, 가장 바람직하게는 번역 융합, 즉 유전적 융합이고, 이때 각각의 서열은 발현 벡터에 의해 순서대로 코딩된다. 따라서, 링커는 전형적으로 본원에 기재된 아미노산 링커이다. Fab 단편에 연결된 본 발명의 scFv는 생체 내에서 항체 융합 단백질의 반감기를 연장시키기 위해 혈청 캐리어 단백질에 결합할 수 있다. 이러한 방식으로 반감기를 연장시키는 것은 IgE 결합과 무관하고 유리할 수 있다.
본원에서 사용된 "혈청 캐리어 단백질"은 scFv에 결합할 수 있는 임의의 적합한 혈장 캐리어 단백질을 지칭하고, 한 예에서, 혈청 캐리어 단백질은 티록신 결합 단백질, 트랜스티레틴(transthyretin), α1-산 당단백질, 트랜스페린, 피브리노겐 및 알부민, 또는 이들의 임의의 단편으로부터 선택된다. 전형적으로, scFv는 알부민, 바람직하게는 인간 혈청 알부민에 결합한다.
임의의 적합한 알부민 결합 scFv는 본 발명의 항체 융합 단백질 내로 도입될 수 있다. 적합한 알부민 결합 도메인은 당분야에서 이미 기재되어 있다.
디아바디는 동일하거나 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 scFv가 이량체를 형성하고 동일한 항원에 대한 2가 항원 결합 활성 또는 상이한 항원에 대한 2종의 특이적 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
IgE와 특이적으로 반응하는 본 발명의 디아바디, 예를 들면, 2가 디아바디는 IgE와 특이적으로 반응하는 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 수득하고, 3개 내지 10개의 잔기들의 폴리펩타이드 링커를 갖는 scFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터 내로 삽입한 후, 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 디아바디를 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
dsFv는 VH 및 VL 각각의 한 아미노산 잔기가 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합을 통해 시스테인 잔기로 치환되어 있는 폴리펩타이드를 결합시킴으로써 수득된다. 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 문헌(Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697 (1994))에 의해 제시된 방법에 따라 항체의 3차원 구조 평가를 기반으로 선택될 수 있다.
본 발명의 dsFv는 본 발명의 IgE와 특이적으로 반응하는 인간 CDR-이식된 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 수득하고, dsFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터 내로 삽입한 후, 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 dsFv를 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
CDR을 포함하는 펩타이드는 H 쇄 및 L 쇄 CDR들의 적어도 하나의 영역을 포함시킴으로써 구성된다. 복수의 CDR들이 직접적으로 또는 적절한 펩타이드 링커를 통해 결합될 수 있다.
본 발명의 CDR을 포함하는 펩타이드는 IgE와 특이적으로 반응하는 인간 CDR-이식된 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코딩하는 cDNA를 수득하고, CDR을 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터 내로 삽입한 후, 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 상기 펩타이드를 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 또한, CDR을 포함하는 펩타이드는 화학적 합성 방법, 예컨대, Fmoc 방법(플루오레닐메톡시카보닐 방법), tBoc 방법(t-부틸옥시카보닐 방법) 등에 의해 생성될 수도 있다.
본 발명의 항체는 방사성 동위원소, 단백질, 작용제 등이 본 발명의 항체에 화학적으로 또는 유전적으로 접합되어 있는 항체 유도체를 포함한다.
본 발명의 항체 유도체는 방사성 동위원소, 단백질 또는 작용제를, IgE와 특이적으로 반응하는 항체 또는 항체 단편의 H 쇄 또는 L 쇄의 N-말단 쪽 또는 C-말단 쪽, 상기 항체 또는 항체 단편의 적절한 치환기 또는 측쇄, 또는 상기 항체 또는 항체 단편의 당 쇄에 화학적으로 접합시킴으로써 생성될 수 있다(Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)).
또한, 상기 항체 유도체는 IgE와 특이적으로 반응하는 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 DNA를, 결합될 단백질을 코딩하는 다른 DNA에 연결하고, 상기 DNA를 발현 벡터 내로 삽입하고, 상기 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입함으로써 유전적으로 생성될 수 있다.
방사성 동위원소는 131I, 125I 등을 포함하고, 예를 들면, 클로라민 T 방법에 의해 항체에 접합될 수 있다.
작용제는 바람직하게는 저분자량 화합물이다. 예로는 항암제, 예컨대, 알킬화제(예를 들면, 질소 머스타드, 사이클로포스프아마이드), 대사 길항제(예를 들면, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트), 항생제(예를 들면, 다우노마이신, 블레오마이신, 미토마이신 C, 다우노루비신, 독소루비신), 식물 알칼로이드(예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신), 호르몬 약물(예를 들면, 타목시펜, 덱사메타손) 등(Clinical Oncology, edited by Japanese Society of Clinical Oncology, published by Cancer and Chemotherapy (1996)); 소염제, 예컨대, 스테로이드 작용제(예를 들면, 하이드로코르티손, 프레드니손), 비스테로이드성 약물(예를 들면, 아스피린, 인도메타신), 면역조절제(예를 들면, 아우로티오말레이트, 페니실라민), 면역억제제(예를 들면, 사이클로포스프아마이드, 아자티오프린) 및 항히스타민성 작용제(예를 들면, 클로르페니라민 말레에이트, 클레마스틴)(Inflammation and Anti-inflammatory Therapy, Ishiyaku Shuppan (1982)) 등이 있다. 다우노마이신을 항체에 접합시키는 방법은 다우노마이신과 항체의 아미노 기가 글루타르알데하이드를 통해 접합되는 방법, 다우노마이신의 아미노 기와 항체의 카복실 기가 수용성 카보디이미드를 통해 접합되는 방법 등을 포함한다.
또한, 암세포를 직접적으로 억제하기 위해, 독소, 예컨대, 리신, 디프테리아 독소 등을 사용할 수 있다. 예를 들면, 단백질을 갖는 융합 항체는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 cDNA를, 단백질을 코딩하는 다른 cDNA에 연결하고, 융합 항체를 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터 내로 삽입한 후, 상기 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 융합 항체를 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
본원에 전체로서 도입된 문헌(Binz et al., (2005) Nat. Biotech. 23:1257-1268)에 기재된 바와 같이, 결합제들, 예를 들면, 면역글로불린 유사 단편과 작용제의 융합체, 예컨대, 디아바디, scAb, 이중특이적 단편, 트리아바디, Fab-Fv-Fv, Fab-Fv, 트리바디, (Fab-Fv)2-Fc, 및 비Ig 프레임워크, 예컨대, 피브로넥틴 또는 류신 지퍼에 이식된 항체 단편 또는 부분, 예컨대, CDR 또는 CDR을 포함하는 항체 루프를 포함하는 항체 단편 또는 항원 결합 물질도 본원에서 고려된다.
접합된 항-IgE 단일클론 항체 및 항원 결합 물질
원하는 경우, 본 발명에서 사용될 항체 또는 항원 결합 물질은 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 접합될 수 있다. 이펙터 분자는 단일 이펙터 분자를 포함할 수 있거나, 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 연결된 2개 이상의 이러한 분자들을 포함할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 이펙터 분자에 연결된 항체 단편을 수득하고자 하는 경우, 이것은 직접적으로 또는 커플링제를 통해 항체 단편을 이펙터 분자에 연결하는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있다. 이러한 이펙터 분자를 항체에 접합시키는 기법은 당분야에서 잘 공지되어 있다(문헌(Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53); 문헌(Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58); 및 문헌(Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123) 참조). 구체적인 화학적 절차는 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 93/06231호, 국제 특허출원 공보 제WO 92/22583호, 국제 특허출원 공보 제WO 89/00195호, 국제 특허출원 공보 제WO 89/01476호 및 국제 특허출원 공보 제WO 03/031581호에 기재된 화학적 절차들을 포함한다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩타이드인 경우, 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 86/01533호 및 유럽 특허 제0392745호에 기재된 재조합 DNA 절차를 이용하여 연결을 달성할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 이펙터 분자는 예를 들면, 항신생물성 작용제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들면, 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 항원 결합 물질, 합성(PEG를 포함함) 또는 천연 생성 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들면, DNA, RNA 및 이들의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성요오다이드, 방사성 동위원소, 킬레이팅된 금속, 나노입자 및 리포터 기, 예컨대, 형광 화합물, 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.
이펙터 분자의 예로는 세포에 해로운(예를 들면, 세포를 사멸시키는) 임의의 작용제를 포함하는 세포독소 또는 세포독성 작용제가 있을 수 있다. 예로는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탄시노이드, 스폰기스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스털린, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안쓰라신 디온, 미톡산트론, 미쓰라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신, 및 이들의 유사체 또는 동족체가 있다.
이펙터 분자는 항대사물질(예를 들면, 메토트렉세이트, 6-머캡토푸린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들면, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU),사이클로토스프아마이드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안쓰라사이클린(예를 들면, 다우노루비신(이전 명칭: 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들면, 닥티노마이신(이전 명칭: 악티노마이신), 블레오마이신, 미쓰라마이신, 안쓰라마이신(AMC), 칼리케아미신 또는 듀오카마이신), 및 항-유사분열 작용제(예를 들면, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)도 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
다른 이펙터 분자는 킬레이팅된 방사성핵종, 예컨대, 111In 및 90Y, Lu177, 비스무트213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188; 또는 약물, 예컨대, 알킬포스포콜린, 토포이소머라제(topoisomerase) I 억제제, 탁소이드 및 수라민(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 포함할 수 있다.
다른 이펙터 분자는 단백질, 펩타이드 및 효소를 포함한다. 관심 있는 효소는 단백질용해성 효소, 하이드롤라제(hydrolase), 리아제(lyase), 이소머라제(isomerase), 트랜스퍼라제(transferase)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 관심 있는 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드는 면역글로불린, 독소, 예컨대, 애브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예컨대, 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래의 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화제, 혈전 작용제 또는 항-혈관신생 작용제, 예를 들면, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 생물학적 반응 변형제, 예컨대, 림포카인, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
다른 이펙터 분자는 예를 들면, 진단에 유용한 검출 가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출 가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사성 핵종, (양전자 방사 단층촬영에서 사용되는) 양전자 방사 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온이 있다. 진단제로서 사용될 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 일반적으로 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소는 호스라디쉬 퍼록시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하고; 적합한 보결분자단은 스트렙타비딘, 아비딘 및 바이오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질은 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 파이코에리쓰린을 포함하고; 적합한 발광 물질은 루미놀을 포함하고; 적합한 생체발광 물질은 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사성 핵종은 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
또 다른 예에서, 이펙터 분자는 생체 내에서 항체의 반감기를 증가시킬 수 있고/있거나, 항체의 면역원성을 감소시킬 수 있고/있거나, 항체가 상피 장벽을 가로질러 면역 시스템으로 전달되는 것을 향상시킬 수 있다. 이 유형의 적합한 이펙터 분자의 예로는 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예컨대, 국제 특허출원 공보 제WO05/117984호에 기재된 이펙터 분자들이 있다.
한 실시형태에서, IgE 또는 항-인간 IgE 항체와 무관한 이펙터 분자에 의해 제공된 반감기는 유리하다.
이펙터 분자가 중합체인 경우, 일반적으로, 이펙터 분자는 합성 또는 천연 생성 중합체, 예를 들면, 경우에 따라 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체, 또는 분지된 또는 비분지된 폴리사카라이드, 예를 들면, 동종폴리사카라이드 또는 이종폴리사카라이드일 수 있다.
상기 언급된 합성 중합체에 존재할 수 있는 구체적인 임의적 치환기는 하나 이상의 하이드록시, 메틸 또는 메톡시 기를 포함한다.
합성 중합체의 구체적인 예로는 경우에 따라 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알코올) 또는 이의 유도체, 특히 경우에 따라 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예컨대, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체가 있다.
구체적인 천연 생성 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체를 포함한다.
한 실시형태에서, 중합체는 알부민 또는 이의 단편, 예컨대, 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편이다. 한 실시형태에서, 중합체는 PEG 분자이다.
접합체와 관련하여 본원에서 사용된 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들면, 티올 선택적 반응성 기, 예컨대, 말레이미드 등을 포함하기 위한 것이다. 반응성 기는 직접적으로 또는 링커 분절을 통해 중합체에 연결될 수 있다. 일부 경우에서 이러한 기의 잔기가 항체 단편과 중합체 사이의 연결 기로서 생성물의 일부를 형성할 것임이 인식될 것이다.
천연 또는 합성 중합체의 크기는 요구된 바와 같이 변경될 수 있으나, 일반적으로 500 Da 내지 50000 Da, 예를 들면, 5000 내지 40000 Da, 예컨대, 20000 내지 40000 Da의 평균 분자량 범위 내에 있을 것이다. 특히, 중합체 크기는 생성물의 의도된 용도, 예를 들면, 특정 조직, 예컨대, 종양에 위치하거나 순환 반감기를 연장시키는 능력을 기반으로 선택될 수 있다(검토를 위해서는 문헌(Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545) 참조. 따라서, 예를 들면, 생성물이 순환계를 떠나고 조직을 침투하기 위한 것인 경우, 예를 들면, 종양의 치료에 사용하기 위한 것인 경우, 예를 들면, 약 5000 Da의 분자량을 갖는 저분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환계에 남아 있는 적용의 경우, 예를 들면, 20000 Da 내지 40000 Da의 범위 내의 분자량을 갖는 고분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
적합한 중합체는 특히 약 15000 Da 내지 약 40000 Da의 범위 내의 분자량을 갖는 폴리알킬렌 중합체, 예컨대, 폴리(에틸렌글리콜) 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체를 포함한다.
한 예에서, 본 발명에서 사용될 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 한 구체적인 예에서, 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 항체 단편에 위치한 임의의 이용 가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들면, 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카복실 기를 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에 천연적으로 존재할 수 있거나, 재조합 DNA 방법을 이용함으로써 단편 내로 조작될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,219,996호; 미국 특허 제5,667,425호; 국제 특허출원 공보 제WO98/25971호; 국제 특허출원 공보 제WO2008/038024호 참조). 한 예에서, 본 발명의 항체 분자는 변형된 Fab 단편이고, 이때 변형은 이펙터 분자의 부착을 가능하게 하기 위해 하나 이상의 아미노산을 그의 중쇄의 C-말단에 추가하는 것이다. 적합하게는, 추가 아미노산은 이펙터 분자에 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 다수의 부위들을 사용하여 2개 이상의 PEG 분자들을 부착시킬 수 있다.
적합하게는, PEG 분자는 항체 단편에 위치한 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 공유결합된다. 변형된 항체 단편에 부착된 각각의 중합체 분자는 단편에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유결합될 수 있다. 공유결합은 일반적으로 디설파이드 결합 또는 특히 황-탄소 결합일 것이다. 티올 기가 부착 점으로서 사용되는 경우, 적절하게 활성화된 이펙터 분자, 예를 들면, 티올 선택적 유도체, 예컨대, 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 전술된 바와 같이 중합체-변형된 항체 단편의 제조에 있어서 출발 물질로서 사용될 수 있다.
활성화된 중합체는 티올 반응 기, 예컨대, α-할로카복실산 또는 에스테르, 예를 들면, 요오도아세트아마이드, 이미드, 예를 들면, 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설파이드를 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 물질은 (예를 들면, 넥타(Nektar)(이전 명칭: 쉐어워터 폴리머스 인코포레이티드(Shearwater Polymers Inc.))(미국 앨라바마주 헌츠빌 소재)로부터) 상업적으로 입수될 수 있거나, 통상의 화학적 절차를 이용함으로써 상업적으로 입수될 수 있는 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 구체적인 PEG 분자는 20K 메톡시-PEG-아민(넥타(이전 명칭: 쉐어워터); 랩 폴리미어(Rapp Polymere); 및 선바이오(SunBio)로부터 입수될 수 있음) 및 M-PEG-SPA(넥타(이전 명칭: 쉐어워터)로부터 입수될 수 있음)를 포함한다.
한 실시형태에서, 항체는 예를 들면, 유럽 특허 제0948544호 또는 유럽 특허 제1090037호에 개시된 방법에 따라 PEG화되어 있는, 즉 그에 공유부착된 PEG(폴리(에틸렌글리콜))를 갖는 변형된 Fab 단편, Fab' 단편 또는 diFab이다[문헌("Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545) 또한 참조]. 한 예에서, PEG는 힌지 영역 내의 시스테인에 부착된다. 한 예에서, PEG에 의해 변형된 Fab 단편은 변형된 힌지 영역 내의 단일 티올 기에 공유결합된 말레이미드 기를 갖는다. 라이신 잔기는 말레이미드 기에 공유결합될 수 있고, 대략 20,000 Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체는 라이신 잔기의 아민 기들 각각에 부착될 수 있다. 따라서, Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da일 수 있다.
구체적인 PEG 분자는 PEG2MAL40K(넥타(이전 명칭: 쉐어워터)로부터 입수될 수 있음)로서도 공지되어 있는, N,N'-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 20,000)에 의해 변형된 라이신의 2-[3-(N-말레이미도)프로피온아마이도]에틸 아마이드를 포함한다.
PEG 링커의 대안적 공급원은 GL2-400MA3(이때, 하기 구조에서 m은 5임) 및 GL2-400MA(이때, m은 2임)를 공급하는 NOF를 포함하고, n은 대략 450이다:
다시 말해, 각각의 PEG는 약 20,000 Da이다.
따라서, 한 실시형태에서, PEG는 SUNBRIGHT GL2-400MA3으로서도 공지되어 있는 2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-{[3-(6-말레이미도-1-옥소헥실)아미노]프로필옥시}헥산(2 아암 분지된 PEG, -CH2）3NHCO(CH2)5-MAL, Mw 40,000이다.
하기 유형의 추가 대안적 PEG 이펙터 분자는 레디 박사(Dr Reddy), NOF 및 젠켐(Jenkem)으로부터 입수될 수 있다:
한 실시형태에서, (순차적 넘버링에 의한) 쇄의 아미노산 226, 예를 들면, 중쇄의 아미노산 226에서 또는 이 근처에서 시스테인 아미노산 잔기를 통해 부착된, PEG화된(예를 들면, 본원에 기재된 PEG를 가진) 본 발명의 항체가 제공된다.
한 실시형태에서, 본 개시는 하나 이상의 PEG 중합체, 예를 들면, 1개 또는 2개의 중합체, 예컨대, 40 kDa 중합체 또는 중합체들을 포함하는 Fab'PEG 분자를 제공한다.
본 개시에 따른 Fab'-PEG 분자는 Fc 단편과 무관한 반감기를 갖는다는 점에서 특히 유리할 수 있다. 한 예에서, 본 발명은 치료 유효량의 항-IgE 항체 또는 이의 항원 결합 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 IgE 생물학적 활성을 조절함으로써 완화되는 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 물질이 IgE에 결합하는 Fc와 무관한 반감기를 갖는 것인 방법을 제공한다.
한 실시형태에서, 중합체, 예컨대, PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자에 접합된 Fab'가 제공된다.
한 실시형태에서, 중합체, 예컨대, PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자에 접합된 scFv가 제공된다.
한 실시형태에서, 상기 항체 또는 단편은 예를 들면, 반감기를 증가시키기 위해 전분 분자에 접합된다. 전분을 단백질에 접합시키는 방법은 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제8,017,739호에 기재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드
본 발명은 본 발명의 항체 분자의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)을 코딩하는 단리된 DNA 서열도 제공한다. 적합하게는, 상기 DNA 서열은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩한다. 본 발명의 DNA 서열은 예를 들면, 화학적 프로세싱에 의해 생성된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열은 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있는 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 항체 중쇄 및 경쇄의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열은 원할 때 확인된 DNA 서열로부터 합성될 수 있거나 상응하는 아미노산 서열을 기반으로 합성될 수 있다.
수용자 프레임워크 서열을 코딩하는 DNA는 당분야에서 숙련된 자에 의해 널리 이용될 수 있고, 그의 공지된 아미노산 서열을 기반으로 용이하게 합성될 수 있다.
분자생물학의 표준 기법을 이용하여, 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성 기법을 이용하여 원하는 DNA 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 적절한 경우 부위 지정된 돌연변이유발 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터가 제공된다. 적합하게는, 상기 클로닝 또는 발현 벡터는 각각 본 발명의 항체 분자의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 2개의 DNA 서열들, 및 적합한 신호 서열을 포함한다. 한 예에서, 상기 벡터는 중쇄와 경쇄 사이의 유전자간 서열을 포함한다(국제 특허출원 공보 제WO03/048208호 참조).
벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있다. 이와 관련하여, 문헌("Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbour Publishing)을 참조한다.
항-IgE 항체 또는 이의 단편을 발현하는 숙주 세포
본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템은 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. 세균, 예를 들면, 이. 콜라이, 및 다른 미생물 시스템이 사용될 수 있거나, 진핵생물포, 예를 들면, 포유동물 숙주 세포 발현 시스템도 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 유형의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 DHFR 선택 마커와 함께 사용될 수 있는 dhfr- CHO 세포, 예컨대, CHO-DG44 세포 및 CHO-DXB11 세포, 또는 글루타민 합성효소 선택 마커와 함께 사용될 수 있는 CHOK1-SV 세포를 포함하는 CHO 및 CHO-K1 세포를 포함할 수 있다. 항체를 발현하는 데 사용될 다른 유형의 세포는 림프구 세포주, 예를 들면, NSO 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포를 포함한다. 다른 적합한 세포는 당분야에서 공지되어 있는 인간 배아 신장(hek) 섬유모세포, 예를 들면, hek293F 및 ExpiHek 세포를 포함할 수 있다.
CHO가 오말리주맙의 생성을 위한 표준 숙주라는 점(한 실시형태에서 오말리주맙의 표준 글리코실화 패턴을 본 발명의 항체에게 제공한다는 점)을 고려할 때, CHO가 본 발명의 전체 길이 항체를 위해 바람직하다[국제 특허출원 공보 제WO 2013/181577호 또한 참조].
항-IgE 항체 또는 이의 단편의 생성
본 발명은 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터의 단백질의 발현을 유발하기에 적합한 조건 하에서 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 분자를 제조하는 방법도 제공한다.
항체 분자는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드만을 포함할 수 있고, 이 경우 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드 코딩 서열만이 숙주 세포를 형질감염시키는 데 사용될 필요가 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함하는 생성물의 제조를 위해, 세포주를 2종의 벡터들, 즉 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 대안적으로, 경쇄 폴리펩타이드 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 단일 벡터를 사용할 수 있다.
숙주 세포를 배양하고 항체 또는 이의 단편을 발현시키고, 상기 항체 또는 이의 단편을 단리하고 경우에 따라 이를 정제하여 단리된 항체 또는 단편을 제공하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 이펙터 분자를 단리된 항체 또는 단편에 접합시키는, 예를 들면, 특히 본원에 기재된 PEG 중합체에 접합시키는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, 불순물이 컬럼에 보유되고 항체가 용출되도록 비결합 모드로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 항체(특히 본 발명에 따른 항체 또는 단편)를 정제하는 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 정제는 단백질 A 컬럼에서의 친화성 포획에 이어 적정을 이용한다. 한 실시형태에서, 정제는 단백질 G 컬럼에서의 친화성 포획에 이어 HPLC 적정을 이용한다. 한 실시형태에서, 정제는 IgE 컬럼에서의 친화성 포획에 이어 적정을 이용한다.
한 실시형태에서, 정제는 시바크론 블루(cibacron blue)를 사용하거나 알부민 융합 또는 접합체 분자의 정제와 유사하다.
상기 방법에서 사용되기에 적합한 이온 교환 수지는 Q.FF 수지(지이-헬쓰케어(GE-Healthcare)에 의해 공급됨)를 포함한다. 이 단계는 예를 들면, 약 8의 pH에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 예를 들면, 약 4 내지 5, 예컨대, 4.5의 pH에서 수행되는, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 초기 포획 단계를 추가로 포함할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피는 예를 들면, 수지, 예컨대, CaptoS 수지 또는 SP 세파로스 FF(지이-헬쓰케어에 의해 공급됨)를 사용할 수 있다. 그 다음, 예를 들면, 200 mM의 농도로 이온성 염 용액, 예컨대, 염화나트륨을 사용하여 수지로부터 항체 또는 단편을 용출할 수 있다.
따라서, 적절한 경우, 크로마토그래피 단계 또는 단계들은 하나 이상의 세척 단계를 포함할 수 있다.
정제 방법은 하나 이상의 여과 단계, 예컨대, 정용여과 단계 또는 HPLC 여과 단계도 포함할 수 있다.
따라서, 한 실시형태에서, 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA로부터 실질적으로 정제된, 특히 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA를 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않는 정제된 항-IgE 항체 또는 단편, 예를 들면, 인간화된 항체 또는 단편, 특히 본 발명에 따른 항체 또는 단편이 제공된다.
상기 사용된 "로부터 정제된"은 적어도 90%의 순도, 예컨대, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% w/w 이상의 순도를 지칭하기 위한 것이다.
"내독소를 실질적으로 갖지 않는"은 일반적으로 항체 생성물 mg당 1 EU 이하, 예컨대, 생성물 mg당 0.5 또는 0.1 EU의 내독소 함량을 지칭하기 위한 것이다.
"숙주 세포 단백질 또는 DNA를 실질적으로 갖지 않는"은 적절한 경우 일반적으로 항체 생성물 mg당 400 ㎍ 이하, 예컨대, mg당 100 ㎍ 이하, 특히 mg당 20 ㎍의 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량을 지칭하기 위한 것이다.
약학 조성물
본 발명의 항체가 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방에 유용하기 때문에, 본 발명은 1종 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 본 발명의 항체 또는 항원 결합 물질을 포함하는 약학 또는 진단 조성물도 제공한다. 따라서, 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체 또는 항원 결합 물질의 용도가 제공된다. 상기 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 일반적으로 포함할 멸균 약학 조성물의 일부로서 공급될 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 1종 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체 또는 항원 결합 물질을 추가하고 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 또는 진단 조성물을 제조하는 방법도 제공한다.
항체 또는 항원 결합 물질은 약학 또는 진단 조성물에서 단독 활성 성분일 수 있거나, 다른 항체 성분 또는 비항체 성분, 예컨대, 스테로이드 또는 다른 약물 분자, 특히 IgE 결합과 무관한 반감기를 갖는 약물 분자를 포함하는 다른 활성 성분을 동반할 수 있다.
약학 조성물은 적절하게는 치료 유효량의 본 발명의 항체 또는 항원 결합 물질을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "치료 유효량"은 표적화된 질환 또는 상태를 치료하거나, 완화시키거나 예방하거나, 검출 가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내기 위해 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 개시된 항체 또는 항원 결합 물질의 경우, 치료 유효량은 처음에 세포 배양 어세이 또는 동물 모델, 통상적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 추정될 수 있다. 동물 모델은 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는 데에도 이용될 수 있다. 그 다음, 이러한 정보는 인간에게 투여하기에 유용한 용량 및 경로를 결정하는 데 이용될 수 있다.
인간 대상체를 위한 정확한 치료 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식습관, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성 및 요법에 대한 내성/반응에 의존할 것이다. 이 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의의 판단 내에 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg, 예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 예컨대, 100 mg/kg일 것이다. 약학 조성물은 용량당 소정의 양의 본 발명의 활성제를 함유하는 유닛 제형으로 편리하게 제공될 수 있다.
치료 용량의 본 개시에 따른 항체 또는 항원 결합 물질은 생체 내에서 분명한 독성학 효과를 보이지 않는다.
유리하게는, 생체 내에서의 IgE 활성의 수준은 순차적 용량의 본 개시에 따른 항체 또는 결합제를 투여함으로써 적절하게 감소된 수준에서 유지될 수 있다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나, 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합되어(예를 들면, 동시에, 순차적으로 또는 별도로) 투여될 수 있다.
약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 물질의 투여를 위해 약학적으로 허용 가능한 담체도 함유할 수 있다. 상기 담체는 상기 조성물을 제공받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 그 자체가 유도하지 않아야 하고 독성을 나타내지 않아야 한다. 적합한 담체는 큰 느리게 대사되는 거대분자, 예컨대, 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리젖산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들면, 무기산 염, 예컨대, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염, 또는 유기산 염, 예컨대, 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염이 사용될 수 있다.
치료 조성물 중의 약학적으로 허용 가능한 담체는 액체, 예컨대, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대, 습윤화제, 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물이 환자에 의해 섭취될 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로서 제제화될 수 있게 한다.
투여를 위한 바람직한 형태는 예를 들면, 주사 또는 주입, 예를 들면, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입을 위한 것인 경우, 생성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유화액의 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예컨대, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 사용 전에 적절한 멸균 액체에 의해 재구성될 건조된 형태로 존재할 수 있다.
일단 제제화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있다. 치료되는 대상체는 동물일 수 있다. 그러나, 조성물은 인간 대상체에게 투여되도록 맞추어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 척추강내, 심실내, 경진피, 경피(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO98/20734호 참조), 피하, 복강내, 비강내, 장, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 수의 경로들에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이도 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액 중 어느 한 주사제로서 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다.
상기 조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 피하(특히), 복강내, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 달성될 것이거나, 조직의 간질 공간에 전달될 것이다. 상기 조성물은 병변 내로 투여될 수도 있다. 투약 치료는 단회 용량 일정 또는 다회 용량 일정일 수 있다.
상기 조성물 중의 활성 성분이 항체 분자라는 것은 인식될 것이다. 따라서, 상기 활성 성분은 위장관에서의 분해에 민감할 것이다. 따라서, 상기 조성물이 위장관을 이용하는 경로에 의해 투여되어야 하는 경우, 상기 조성물은 항체를 분해로부터 보호하되, 일단 위장관으로부터 흡수되면 항체를 방출하는 작용제를 함유할 필요가 있을 것이다.
약학적으로 허용 가능한 담체의 철저한 고찰은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, N.J. 1991)에서 이용될 수 있다.
구조-기능 성질
본 발명의 한 양태에서, 항체 또는 항원 결합 물질은 유리 인간 IgE 및 FcεRI에 결합된 인간 IgE에 결합한다. 본 발명의 항체(또는 항원 결합 물질)가 FcεRI에 결합된 인간 IgE에 결합할 때, 이 항체는 IgE의 입체구조를 안정화시킨다. 이러한 안정화된 입체구조에서, IgE는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 물질의 부재 하에서의 결합 친화성보다 더 약한 FcεRI 또는 오말리주맙(또는 이의 단편)에 대한 결합 친화성을 가지고, 이때 FcεRI에 결합된 인간 IgE는 FcεRI로부터 해리한다. 바람직하게는, IgE는 FcεRI로부터 해리하였을 때 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 물질에 결합된 상태로 남아 있다. 이하(예를 들면, 실시예 1 및 도 2)에서 확인될 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 물질은 IgE가 오말리주맙에 결합되었을 때 갖는 입체구조와 상이한 입체구조의 IgE에 결합한다.
이론에 의해 구속받고자 하지는 않지만, 본 발명의 항체는 IgE가 부분적으로 굽혀진 입체구조(도 2c 및 5c&d)를 채택하게 함으로써, 유리 IgE 구조 또는 FcεRI에 결합된 IgE 구조로부터의 펴짐을 야기한다. 이러한 펴짐은 FcεRI에 결합하거나 결합을 유지하는 IgE의 능력을 손상시킨다. 실시예 단락에서 확인될 바와 같이, 본 발명의 항체는 FcεRI에의 결합에 대해 IgE의 결합 부위와 경쟁하기 때문에, 상기 항체는 FcεRI에 결합되는 IgE와 복합체를 형성하여, FcεRI에 결합될 때 IgE의 구조를 변경시킬 수 있고 FcεRI로부터 IgE를 해리시킬 수 있다. 이 성질들을 갖는 본 발명에 따른 항체는 본원에 기재된 항체, 예컨대,
a. 서열번호 1을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 i. 서열번호 109; 또는 ii. 서열번호 113; 또는 iii. 서열번호 121; 또는 iv. 서열번호 132; 또는 v. 서열번호 139를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호 5, 및 i. S77 및 S79가 Q로 대체되어 있는 서열번호; ii. 서열번호 117; 또는 iii. 서열번호 125; 또는 iv. 서열번호 136; 또는 v. 서열번호 143을 포함하는 항체 또는 항원 결합 물질이다.
이러한 성질을 갖는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질은 서열번호 108과 관련하여 인간 IgE의 Cε3 도메인의 잔기 T373, W374, S375, R376, A377, S378, G379, P381, Q417, C418, R419, P426, R427, A428, 및 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 D278 및 T281을 포함하는 에피토프와 접촉하거나, 접촉하고 그에 특이적이다.
본 발명의 항체는 여러 위치에서 메티오닌 잔기를 갖는다. 메티오닌 잔기의 산화는 가장 흔한 단백질 분해 경로에 속한다. 메티오닌 잔기가 서열번호 20과 관련하여 위치 S64 및 S71에서 도입되어 있는 본 발명의 항체는 IgE-Fc:sFcRIα 복합체의 해리를 가속화하는 항체의 능력에 영향을 미치지 않으면서 완전한 산화를 겪을 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1인 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 CDR-L2 및 FW-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질도 제공하고, 이때 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 20인 아미노산 서열을 가지고, 단, CDR-L2는 서열번호 50인 아미노산 서열을 가지고 FW-L3은 서열번호 131 또는 138인 아미노산 서열을 가지며, 여기서 서열번호 20과 관련하여 위치 64 및/또는 71에 있는 메티오닌 잔기는 산화된다.
본 발명은 서열번호 1인 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 132 또는 139인 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질도 제공하고, 이때 서열번호 132 또는 139를 참고할 때 위치 64 및/또는 71에 있는 메티오닌 잔기는 산화된다.
본 발명의 항체에서 추가 메티오닌 잔기는 IgE-Fc:sFcRIα 복합체의 해리를 가속화하는 항체의 능력에 영향을 미치지 않으면서 산화될 수 있다.
지금부터 본 발명은 첨부된 도면에 예시된 실시형태를 참조하면서 예로써 더 기재될 것이다.
실시예
실시예 1: IgE-Fc에 결합된 치료 항-IgE 항체 오말리주맙의 돌연변이체의 구조는 작용 메카니즘을 보여준다 .
개요
면역글로불린 E, 및 이와 수용체 FcεRI 및 CD23의 상호작용은 알레르기성 질환에서 중추적인 역할을 한다. 임상적으로 승인된 치료 항체인 오말리주맙은 IgE와 FcεRI 사이의 상호작용을 억제하여, 비만 세포 및 호중구 활성화를 방지하고, IgE와 CD23의 결합을 차단한다. 본 발명자들은 각각의 Cε3 도메인에 결합된 1개의 Fab(그러나, Cε2 도메인에 결합된 Fab들 중 단지 하나)를 가진, 오말리주맙 유래의 Fab와 IgE-Fc 사이의 2:1 복합체의 결정 구조를 해상하였다. 유리 IgE-Fc는 용액에서 대부분 심하게 굽혀지지만, 복합체 형태의 IgE-Fc는 단지 부분적으로 굽혀져, FcεRI과의 상호작용을 방해하고; CD23 결합은 각각의 Cε3 도메인의 중첩되는 결합 부위로 인해 입체적으로 억제된다. 용액 상태 상호작용 분석은 두 수용체 상호작용의 억제에 대한 오르토스테릭(orthosteric) 및 알로스테릭(allosteric) 근거를 입증하고, 구조와 함께, 오말리주맙(및 구체적으로 기재된 오말리주맙 돌연변이체)가 어떻게 IgE의 고유 동역학 및 알로스테릭 잠재력을 활용하여 FcεRI로부터의 수용체-결합된 IgE의 해리를 가속화할 수 있는 지를 보여준다.
도입
면역글로불린 E(IgE) 항체는 그의 Fab 아암을 통해 알레르겐에 결합하고 Fc 영역에 대한 수용체에 결합하여 그의 이펙터 기능을 발현함으로써 알레르기성 질환에 있어서 중대한 역할을 한다1. 2종의 주요 IgE 수용체들은 통상적으로 각각 고친화성 수용체 및 저친화성 수용체로서 지칭되는 FcεRI 및 CD23/FcεRII이다. 비만 세포 및 호중구에서, IgE는 이러한 세포들이 미리 결합된 IgE에 의해 감작될 정도로 단단히(KD 
10-10 M-1) FcεRI에 결합하여, IgE/FcεRI 복합체를 가교결합시키고 즉시 반응을 이끌어내기 위해 알레르겐의 존재만을 요구한다. CD23은 동종삼량체이므로, 각각의 IgE 결합 C형 렉틴 유사 "헤드" 도메인의 본질적으로 더 낮은 친화성(KD 
10-7 M-1)은 면역 복합체에서 응집된 IgE에 결합할 때 결합력(avidity) 효과에 의해 향상되어, IgE에 대한 FcεRI의 친화성과 거의 일치할 수 있다2. B 세포에서 발현된 CD23은 IgE 조절에 관여하고, 기도 및 장 상피 세포에서의 발현은 IgE/알레르겐 복합체의 트랜스사이토시스를 매개한다1,2. FcεRI 및 CD23도 둘 다 다양한 항원 제시 세포들에서 발현된다. 따라서, IgE-수용체 상호작용은 알레르기성 반응의 다수의 양태들에 관여하고, IgE는 치료적 중재를 위한 오래된 표적이다3.
IgE의 Fc 영역은 3개의 도메인들, 즉 Cε2, Cε3 및 Cε4의 디설파이드-결합된 이량체를 포함한다. 키메라 IgE의 초기 FRET 연구4,5 및 IgE-Fc의 X-선 용액 산란 연구6는 조밀한 굽혀진 구조를 시사하였고, 나중에 IgE-Fc의 결정 구조는 Cε3 및 Cε4 도메인 위로 되접어 꺾인 (Cε2)2 도메인 쌍을 가진, 심하게 비대칭적으로 굽혀진 입체구조를 보여주었다7. (Cε2)2 도메인 쌍의 국소 2배 축과 Fcε3-4(Cε3 및 Cε4 도메인만을 포함하는 영역)의 국소 2배 축 사이의 각도로서 정의된 굽힘은 수용체의 IgE 결합 α 쇄의 가용성 세포외 도메인인 sFcεRIα에 결합된 IgE-Fc의 결정 구조에서 훨씬 더 심해지는 것(62o 내지 54o)으로 발견되었다8. N-말단 및 C-말단에서 표지된 IgE-Fc를 사용한 최근의 FRET 연구는 sFcεRIα 결합 시 이의 향상된 굽힘을 확인시켜주었다9.
Cε2 도메인은 직접적으로 관여하지 않지만, FcεRI 결합 부위는 Cε2와 가까운 영역에서 두 Cε3 도메인들에 걸쳐 있고8,10; 두 쇄들의 맞물림은 1:1 결합 화학양론을 설명한다. 대조적으로, 2개의 CD23 분자들은 각각의 쇄에서 1개씩 IgE-Fc에 결합하고, 다른 부위에서 Cε4에 가까운 Cε3 도메인 말단에 결합한다11,12,13. CD23 결합도 IgE-Fc의 입체구조적 변화를 야기하나14, 굽힘에 유의미하게 영향을 미치는 입체구조적 변화를 야기하지는 않는다9. 그러나, 유리 IgE-Fc에 비해, CD23의 가용성 헤드 도메인(sCD23)을 갖는 복합체에서 Cε3 도메인의 상대적으로 "폐쇄된" 배치는 FcεRI 결합을 위해 요구되는 이 도메인들의 보다 더 "개방된" 정렬에 적합하지 않다. 다른 요인, 예컨대, 국소 입체구조적 변화 및 입체구조적 동역학의 변형15도 2개의 수용체 결합 부위들 사이의 알로스테릭 소통에 기여할 가능성이 있지만2, 이것은 FcεRI 및 CD23 결합의 상호 배제를 부분적으로 설명한다11,12.
aεFab로서 지칭되는, 항-IgE-Fc Fab를 갖는 복합체의 연구를 통해 IgE-Fc의 보다 더 극단적인 정도의 유연성을 최근에 발견하였다16. 2개의 aεFab 분자들은 각각의 Cε3 도메인에서 1개씩 대칭적인 방식으로 IgE-Fc에 결합하여, (Cε2)2 도메인 및 Fcε3-4 영역의 국소 2배 축이 사실상 일치하는 전체적으로 펼쳐진 입체구조를 포획하였다. 유리 IgE-Fc의 분자 동역학 시뮬레이션과 함께 용액에서의 복합체 형성의 분석은 (Cε2)2 도메인 쌍이 Fcε3-4 영역의 한 쪽부터 다른 한 쪽까지 "뒤집을" 수 있다는 것을 암시하였다16. 이 항-IgE 항체에 의해 안정화된 IgE-Fc 입체구조는 FcεRI 결합에 적합하지 않으므로, 그의 억제 활성을 설명한다.
오말리주맙은 치료 용도로 승인받은 항-IgE 단일클론 IgG1 항체(Xolair®, Novartis)이다17. 이 항체는 유리 IgE에 결합하고 FcεRI 및 CD23 결합 둘 다를 억제하고; 결합 부위는 펩타이드 억제 및 분자 모델링에 의해 Cε3 도메인에 맵핑되었으나18,19, 그의 작용 메카니즘은 공지되어 있지 않다. 그러나, FRET로 표지된 IgE-Fc에의 결합은 약간의 정도의 펴짐9을 시사함으로써, 직접적인 억제보다는 오히려 알로스테릭 억제에 대한 잠재력을 시사하였다.
최근에, 미리 형성된 IgE/FcεRI 복합체를 능동적으로 파괴한 억제제의 일종이 발견되었다: 디자인된 안키린(Ankyrin) 반복부 단백질(DARPin)은 수용체에 결합된 IgE의 Cε3 도메인에 결합하고 FcεRI로부터의 그의 해리를 가속화하는 것으로 확인되었다20. 조작된 디설파이드 결합에 의해 구속된, DARPin E2_79와 Fcε3-4 분자의 2:1 복합체의 결정 구조는 결합 부위의 성질 및 위치를 보여주었으나, 그의 작용 메카니즘을 불명확한 상태로 남겨두었다. 오말리주맙은 치료 용도에서 달성된 농도보다 실질적으로 더 큰 매우 높은 농도에서만 FcεRI에 결합된 IgE의 해리를 유사하게 촉진할 수 있다는 것이 나중에 보고되었다21,22.
본 발명자들은 여기서 IgE-Fc와 신규 항체 단편, 즉 항원(IgE-Fc) 결합 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 멀리 떨어져 있는 3개의 점 돌연변이들을 함유하는, 오말리주맙으로부터 유래한 Fab(오말리주맙 Fab3) 사이의 복합체의 결정 구조를 보고한다. 상기 돌연변이들은 서열번호 125를 참고할 때 S81R, Q83R 및 L158P(또는 서열번호 129와 관련하여 S77R, Q79R 및 L154P)이다. 상기 복합체의 구조는 오말리주맙의 작용 메카니즘을 보여주고, 용액 연구는 이 메카니즘이 IgE의 고유 동역학을 활용한다는 것을 입증한다.
결과
광범위한 노력에도 불구하고, 오말리주맙 Fab를 갖는 복합체에서 IgE-Fc에 대한 결정화 테스트는 Fab 단편만의 선택적 결정화를 초래하였다. 다른 연구자들은 이 복합체의 결정화에 대한 유사한 실패를 보고하였다23. 따라서, 본 발명자들은 오말리주맙 Fab 결정 구조에서 관찰된 선호되는 결정 접촉을 파괴할 목적(다른 부분에서 보고될 결과)으로 3개의 점 돌연변이들, 즉 VL 도메인 프레임워크 영역 내의 2개의 점 돌연변이들(Ser81Arg, Gln83Arg) 및 Cκ 도메인 내의 1개의 점 돌연변이(Leu158Pro)(서열번호 125, PDB 넘버링)를 갖는 신규 항체인 오말리주맙 유래의 Fab를 디자인하였다. 본 발명자들은 이 오말리주맙 유래의 Fab를 "오말리주맙 Fab3"으로서 명명한다.
IgE-Fc/오말리주맙 Fab3 복합체의 전체 구조
본 발명자들은 IgE-Fc와 오말리주맙 Fab3 사이의 복합체의 결정 구조를 3.7Å 해상도까지 확인하였다(도 2a). 각각의 Fab가 1개의 Cε3 도메인과 맞물림으로써, 2개의 오말리주맙 Fab3 분자들(Fab1 및 Fab2)이 비대칭적인 부분적으로 굽혀진 IgE-Fc 분자에 결합한다(도 2b&c). Fab1은 IgE-Fc 쇄 B의 Cε3 도메인과 맞물리는 반면, Fab2는 IgE-Fc 쇄 A의 Cε3 도메인과 맞물린다. 상기 복합체에서 IgE-Fc의 부분적으로 굽혀진 입체구조로 인해, Fab2의 경쇄도 IgE-Fc 쇄 B로부터의 Cε2 도메인과 약간의 상호작용을 형성한다(이 상호작용의 상세한 내용에 대해서는 이 실시예의 이하 내용 참조).
IgE-Fc와 오말리주맙 Fab3 사이의 계면
각각의 오말리주맙 Fab3 분자는 Cε3 도메인의 노출된 면의 한 가장자리(C, C', F 및 G 가닥, 및 FcεRI 수용체 결합 FG 루프의 기부)와 맞물린다. 오말리주맙 Fab3의 중쇄 및 경쇄 둘 다가 관여하고, 전자는 약 715 Å2의 계면 면적까지 약 60% 기여한다(도 2&3).
2개의 계면들 사이에 약간 상이한 오말리주맙 Fab3 중쇄(서열번호 5) 접촉은 다음과 같이 요약될 수 있다: Gly32 및 Tyr33(CDRH1)은 Ala377 및 Ser378(Cε3)과 반데르발스 상호작용을 형성하는 반면(서열번호 108 및 도 16에 나타낸 IgE-Fc 서열), Tyr54(CDRH2)는 Gly379 - Pro381(Cε3)과 접촉한다. CDRH3 잔기는 가장 큰 접촉 면적에 기여하고, 비결합된 Fab 구조와 비교될 때 복합체 형성 시 유의미한 입체구조적 변화를 겪는다(비공개된 결과, 19,23). CDRH3 잔기 Ser100, His101, Tyr102 및 Trp106 모두가 Ser375 - Gly379, Gln417 및 Arg419(Cε3)를 포함하는 Cε3 도메인 잔기와 반데르발스 상호작용을 형성한다. 그러나, 계면의 이 부분의 가장 놀라운 특징은 Phe103(CDRH3)과의 상호작용이다. Phe103은 Thr373, Trp374 주쇄, Ser375, Gln417 및 Arg419(Cε3)에 의해 생성된 포켓 내에 대부분 묻혀 있고, Arg419와 양이온/π 적층 상호작용을 형성한다(도 3).
Arg419(Cε3)도 오말리주맙 Fab3 경쇄(서열번호 125)와의 상호작용에 있어서 핵심 역할을 한다(도 3). Arg419(Cε3)는 Asp32, Asp34 및 Tyr36 측쇄와 접촉하는 것(Tyr36 하이드록실 기와 수소결합을 형성함) 이외에 Tyr31(CDRL1) 및 Asp32(CDRL1) 주쇄 카보닐 산소 원자들의 수소결합 거리 이내에 있다. Asp32도 Thr373 및 Thr421(Cε3)과 반데르발스 상호작용을 형성한다. 대조적으로, 2개의 CDRL2 잔기들만이 계면에 기여한다: Tyr53(CDRL2)이 Gln417(Cε3)과 접촉하고, Tyr53 및 Tyr57 둘 다가 Met430(Cε3)과 반데르발스 상호작용을 형성하고; Tyr57도 Met430 골격과 수소결합을 형성한다. 중쇄 상호작용의 경우, Fab1 및 Fab2에 대한 경쇄 접촉에 있어서 약간의 차이가 있다.
오말리주맙 Fab3 넘버링 시 CDR 접촉 잔기 - 포맷(pdb/카바트/초티아).
중쇄 서열: 서열번호 5; 경쇄 서열: 서열번호 125
CDRH1: Ser(31/31/31), Gly(32/32/31a), Tyr(33/33/32)
CDRH2: Tyr(54/53/53)
CDRH3: Ser(100/96/96), His(101/97/97), Tyr(102/98/98), Phe(103/99/99), Trp(106/101B/101B)
CDRL1: Asp(30/27C/30), Tyr(31/27D/30A), Asp(32/28/30B), Gly(33/29/30C), Asp(34/30/30D), Tyr(36/32/32)
CDRL2: Tyr(53/49/49), Ser(56/52/52), Tyr(57/53/53), Ser(60/56/56)
CDRL1 및 CDRH3은 상호작용에 관여하는 가장 많은 잔기들을 가지므로, 오말리주맙이 어떻게 결합하고 IgE-Fc에 비해 그 자신을 배향시키는지를 특징짓는다. CDRL3은 IgE-Fc에의 결합에 관여하지 않는다.
오말리주맙 Fab3 계면과 다른 항-IgE 복합체의 비교
오말리주맙 Fab3 및 최근에 기재된 DARPin E2_7920에 대한 Cε3 도메인의 결합 부위는 중첩되고(도 4), 각각 약 715 Å2 및 약 753 Å2의 유사한 크기를 갖는다. 2개의 계면들 사이에 공유된 Cε3 도메인 잔기는 Ser375-Gly379, Gln417, Arg419, Arg427 및 Met430을 포함하나, 오말리주맙 Fab3은 수용체 결합 Cε3 FG 루프와 보다 더 친밀한 접촉을 형성하는 반면, DARPin E2_79 계면은 Cε3-4 도메인 링커를 포함하도록 반대 방향으로 연장된다.
오말리주맙 Fab3과 DARPin E2_79의 중첩되는 결합 부위는 전체적으로 펼쳐진 입체구조의 IgE-Fc를 포획하는 오말리주맙 Fab3에 대해 최근에 기재된 계면과 현저히 상이하다16(도 5). 오말리주맙 Fab3 계면 면적은 약 1400 Å2로 오말리주맙 Fab3 및 DARPin E2_79의 계면 면적의 대략 2배일뿐만 아니라, 오말리주맙 Fab3은 Cε3 내의 Arg393을 중심으로 하는 부위에서 IgE-Fc와 맞물리고, Cε2 도메인 및 Cε2-Cε3 링커 내의 잔기와도 접촉한다16. Fcε3-4를 갖는 2:1 복합체에서 또 다른 항-IgE 항체 Fab인 MEDI4212의 결정 구조는 Cε3 도메인 내의 또 다른 항체 맞물림 부위를 보여주는데, 이 부위는 Asn394에서 N-결합된 올리고사카라이드 모이어티를 포함한다24.
IgE-Fc는 오말리주맙 Fab3에 결합될 때 부분적으로 굽혀진 입체구조를 채택한다.
IgE-Fc는 용액에서 대체로 굽혀져 있고5,6,9,25,26,27,28, 유리 IgE-Fc에 대한 결정 구조는 심하게 굽혀진(62o) 비대칭적인 입체구조를 보여주었는데, 이때 (Cε2)2 도메인 쌍은 Cε3 및 Cε4 도메인 위로 되접어 꺾여 있고, 한 쇄(쇄 B)의 Cε2 도메인은 다른 쇄(쇄 A)의 Cε4 도메인과 접촉한다7,8. IgE-Fc는 FcεRIα 맞물림 시 훨씬 더 심하게 굽혀지게 되고(54o)8,9, 관련된 입체구조적 변화는 강성 유닛으로서 쇄 A의 Cε3 도메인이 (Cε2)2 도메인 쌍과 함께 쇄 B의 Cε3 도메인으로부터 떨어져 회전하는 것을 수반한다8.
IgE-Fc가 전체적으로 펼쳐진 선형 입체구조를 채택하는 오말리주맙 Fab3 복합체와 대조적으로16, IgE-Fc는 오말리주맙 Fab3 복합체에서 부분적으로 굽혀진 입체구조를 채택하는데(도 2c 및 5c&d), 이 결과는 오말리주맙이 IgE-Fc로 하여금 펴지게 한다는 것을 보여준 초기 FRET 연구와 일치한다9. Fab1이 결합하는 부위는 심하게 굽혀진 유리 IgE-Fc에 노출되나, 90o 이상까지 IgE-Fc의 더 펴짐은 Fab2에 의해 점유된 부위가 접근 가능할 수 있게 만드는 데 요구된다. 오말리주맙 Fab3 복합체에서 IgE-Fc의 이 펴짐은 거의 대칭적인 Fcε3-4 영역을 생성하기 위한 두 Cε3 도메인들의 개방과 관련되어 있다(도 2b). (Cε2)2 도메인 쌍은 각각의 쇄로부터의 Cε3 도메인과 Cε4 도메인 사이에 위치하고, 쇄 A로부터의 Cε3 도메인과 더 이상 그렇게 밀접하게 관련되어 있지 않다.
펼쳐진 구조로의 IgE-Fc의 펴짐을 조사하는 최근 분자 동역학 시뮬레이션에서, 유리 IgE-Fc의 결정 구조에서 관찰된 심하게 굽혀진 입체구조는 가장 낮은 에너지 대역을 점유하였다는 것이 확인된 반면, 부분적으로 굽혀진 IgE-Fc 입체구조에 상응하는 또 다른 상이한 잘 정의된 에너지 대역이 관찰되었다16. 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체에서 IgE-Fc에 의해 채택된 부분적으로 굽혀진 입체구조는 이 특정 에너지 대역을 점유한다(도 6).
Cε3 도메인은 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체에서 현저히 개방된 입체구조를 채택한다.
IgE-Fc 및 Fcε3-4 하위단편의 결정 구조에서, Cε3 도메인은 다양한 상이한 배향을 채택하는데7,8,10,11,13,14,16,24,29, 이것은 그의 두 주요 수용체들인 FcεRI 및 CD23에 결합하는 IgE의 알로스테릭 조절과 관련된 성질이다8,11,12,14. Cε3 도메인들 사이의 거리 및 Cε4 도메인에 대한 그들의 위치 둘 다가 Fcε3-4 영역에 대해 관찰된 다양한 입체구조들을 기술하는 데 사용되었다29(이 측정에 대한 전체 설명은 이하 이 실시예에서 제공됨). 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체에서, Cε3 도메인들은 IgE-Fc 또는 Fcε3-4를 함유하는 임의의 다른 결정 구조의 Cε3 도메인들보다 서로로부터 및 Cε4 도메인으로부터 더 떨어져 위치하므로, 지금까지 관찰된 가장 개방된 입체구조를 채택하고(도 5); 이 입체구조는 FcεRI에 결합된 IgE-Fc에 대한 입체구조보다 유의미하게 더 개방되어 있다(도 7).
FcεRI 및 CD23 수용체 결합에 대한 오말리주맙 Fab3의 효과
오말리주맙은 IgE-Fc와 FcεRI 사이의 상호작용뿐만 아니라, IgE-Fc와 CD23 사이의 상호작용도 억제한다30. 후자와 일치하여, 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc와 CD23/Fcε3-4 복합체의 비교11는 Fcε3-4의 두 CD23 맞물림 부위들에서 오말리주맙 Fab3과 CD23 사이의 충돌을 보여준다. 나아가, Cε3 도메인 잔기 Arg376, Ser378 및 Lys380은 오말리주맙 Fab3 및 CD23 결합 둘 다에 관여한다11,31.
IgE에 결합하는 CD23과 대조적으로, FcεRIα는 두 Cε3 도메인들에 걸쳐 결합한다. 그러나, 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체에서, Cε3 도메인은 두 쇄들의 동시적인 맞물림을 허용하기에는 너무 개방된 입체구조를 채택한다(도 8). 더욱이, 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 및 sFcεRIα/IgE-Fc 복합체가 차례차례 각각의 Cε3 도메인에 겹쳐 놓이는 경우, 잠재적인 입체적 충돌이 각각의 경우에서 일어난다. 쇄 A의 Cε3 도메인에 겹쳐 놓이는 경우, 오말리주맙 Fab3 Fab2는 FcεRIα 복합체에서 (Cε2)2 도메인 쌍과 충돌할 것이고, 오말리주맙 Fab3 복합체로부터의 Cε2-Cε3 링커는 FcεRIα와 잠재적으로 충돌할 것이다. 쇄 B의 Cε3 도메인에 겹쳐 놓이는 경우, Fab1 및 FcεRIα에 대한 결합 부위들이 실제로 중첩되지 않을지라도, (오말리주맙 Fab3 복합체의) 오말리주맙 Fab3 Fab1 및 Cε2-Cε3 링커 둘 다와 FcεRIα 사이의 잠재적인 충돌이 있을 것이다.
그러나, 오말리주맙 Fab3 CDRL1 잔기는 FcεRIα 결합 Cε3 도메인 FG 루프에 바로 인접하여 위치한다. 쇄 B에서 이 루프는 소수성 "프롤린 샌드위치" 상호작용에 기여하고, 이때 Cε3 내의 Pro426은 FcεRIα의 2개의 트립토판 잔기들 사이에 팩킹된다. Asp32(CDRL1)는 Thr421과 접촉하고, Gly33(CDRL1)은 Pro426, Arg427 및 Ala428과 접촉하고, Asp34(CDRL1)는 Arg427 및 Ala428과 접촉한다. 이 상호작용은 Cε3 도메인 FG 루프의 위치를 변경시키고, IgE와 FcεRI의 결합을 더 손상시킬 것이다.
sFcεRIα8 및 오말리주맙 Fab3을 갖는 복합체에서 IgE-Fc의 정적 결정 구조를 기반으로 오말리주맙이 어떻게 FcεRI에 결합된 IgE와 맞물릴 수 있는 지를 알아보는 것은 어렵지만, 최근에 오말리주맙과 FcεRIα에 결합된 IgE의 결합이 보고되었다21,32. 따라서, 본 발명자들은 오말리주맙 Fab3과 IgE-Fc의 결합을 연구하였고, 오말리주맙 Fab3과 IgE-Fc/FcεRI 복합체 사이의 상호작용을 특징규명하였다. 본 발명자들의 결과는 오말리주맙의 작용 메카니즘에 대한 통찰력을 제공한다.
용액 중에서의 오말리주맙 Fab3과 IgE-Fc의 상호작용
본 발명자들은 오말리주맙 Fab3을 표면에 직접적으로 고정시키고 IgE-Fc를 결합시키거나, 오말리주맙 Fab3을 SPR 센서 표면에 포획된, His-태그가 부착된 IgE-Fc에 결합시킴으로써 2종의 상이한 방식으로 IgE-Fc/오말리주맙 Fab3 상호작용을 특징규명하였다. 항-His-태그 항체(GE Healthcare)를 사용하여 C-말단에서 His-태그가 부착된 IgE-Fc 구축물을 포획하였고, 오말리주맙 Fab3, 온전한 오말리주맙 및 오말리주맙 Fab의 결합 특성을 비교하였다. 놀랄 것 없이, 경쟁 결합 실험에서, 모든 3개의 분자들은 동일한 결합 부위에 대해 경쟁하였고 넓게 유사한 결합 친화성을 보였다(데이터는 제시되지 않음). 오말리주맙 Fab3 구축물은 오말리주맙 Fab3 및 온전한 오말리주맙에 비해 약간 더 높은 친화성을 나타내었다(도 8A-C). 결정 구조와 일치하게, 2개의 오말리주맙 Fab3 분자들은 IgE-Fc에 결합한다: 결합은 명확히 2상 결합이고, 이때 고친화성(약 1 nM) 상호작용은 낮은 리간드 농도에서 관찰되고, 제2 (보다 더 약한) 결합 부위(약 30 nM)는 보다 더 높은 농도에서 관찰된다(도 9a).
샌드위치 SPR 실험은 2개의 IgE-Fc/오말리주맙 Fab3 결합 부위들이 별도로 특징규명될 수 있게 하였다. 이 방법을 이용하여, 오말리주맙 Fab3을 센서 표면에 공유고정시켰고, IgE-Fc를 이 표면 위에 유동시켰다. 낮은 농도에서, 이 조건들 하에서, 고친화성 부위는 상호작용을 지배하고, 결합 곡선은 1상 상호작용 반응역학(KD 약 1 nM, kon 약 1.2x106 M-1 s-1, koff 약 8x10-4 s-1)에 의해 기재될 수 있다(도 9b). SPR 바이오센서 표면에 포획된 이 1:1 IgE-Fc/오말리주맙 Fab3 복합체는 제1 오말리주맙 Fab3 분자보다 유의미하게 더 약한(KD 약 30 nM, kon 약 2x105 M-1 s-1, koff 약 6x10-3 s-1) 제2 오말리주맙 Fab3 분자의 결합을 측정하는 데 사용될 수 있다.
오말리주맙 Fab3 결합 부위와 FcεRIα 결합 부위 사이의 경쟁 및 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc/FcεRIα 복합체의 형성
다음으로, 본 발명자들은 IgE-Fc와 FcεRIα 사이의 상호작용에 영향을 미치는 오말리주맙 Fab3의 능력을 조사하였다. 용액 경쟁 결합 실험에서, 증가하는 농도의 오말리주맙 Fab3은 IgE-Fc와 FcεRIα의 결합을 억제하였다(도 8D). 메카니즘적으로, 오말리주맙 Fab3은 이용 가능한 결합 부위의 수(Bmax) 및 IgE-Fc/FcεRIα 상호작용의 겉보기 KD 둘 다에 영향을 미치고; 이것은 혼합된 억제 메카니즘의 특성이다33. Bmax 값의 감소는 알로스테릭 억제 과정을 시사하고, 상기 상호작용의 겉보기 친화성의 감소는 공유된 결합 부위에 대한 직접적인 경쟁(즉, 오르토스테릭 억제)와 가장 흔히 관련되어 있으나, 일부 알로스테릭 억제제들에 대해서도 확인될 수 있다. 결정 구조에서 관찰된 결합 부위를 고려할 때, 오말리주맙 Fab3은 오르토스테릭 메카니즘 및 알로스테릭 메카니즘 둘 다를 이용하여 IgE-Fc와 FcεRI의 결합을 억제할 가능성이 있다.
오말리주맙 결합 부위와 FcεRIα 결합 부위 사이의 경쟁은 많은 공개문헌들에 기재되어 있으나, 항상 동일한(또는 중첩되는) 결합 부위에 대한 직접적인 경쟁으로서 해석되었다. 이 해석은 종종 오말리주맙이 왜 세포의 IgE-FcεRI 복합체에 결합할 수 없는 지를 설명하는 데 사용되었다. 그러나, 본 발명자들은 오말리주맙 Fab3이 FcεRIα에 미리 결합된 IgE-Fc에 고친화성으로 결합할 수 있다는 것을 관찰하였다(도 9c, 삽도). 오말리주맙/IgE-Fc/FcεRI 복합체의 존재는 다른 연구에 의해 암시되었으나21,32, 이 복합체는 이전에 실험적으로 특징규명되지 않았다. 데이터는 IgE-Fc와 FcεRIα의 결합이 IgE-Fc에 대한 오말리주맙 Fab3의 친화성을 유의미하게 변화시키지 않았지만, 이 결합이 FcεRIα에 결합된 IgE-Fc 분자의 집단에서 오말리주맙 Fab3에 대한 이용 가능한 결합 부위의 수를 현저히 변화시켰다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 항-His-태그 항체를 통해 포획된 IgE-Fc 분자에 대한 KD 및 Bmax 결합 값을 sFcεRIα에 의해 포획된 IgE-Fc 분자에 대한 KD 및 Bmax 결합 값과 비교하였고, FcεRIα에 결합된 IgE-Fc가 His-태그에 의해 포획된 IgE-Fc에 비해 10% 미만의 오말리주맙 Fab3 결합 부위를 가졌다는 것을 발견하였는데, 이것은 예상된 바와 같이 2:1 화학양론과 일치하는 결합 수준을 보여주었다(도 9c). 그러므로, 일반적으로 추정된 바와 같이, FcεRIα 결합 부위와 오말리주맙 결합 부위가 중첩되기 때문에 오말리주맙이 비만 세포에 결합된 IgE에 결합하지 않는다는 것은 아니다. 그 대신에, FcεRIα는 IgE-Fc에 알로스테릭하게 작용하여, 상이한 IgE-Fc 입체구조의 동역학적 평형을 변화시킴으로써16, FcεRIα에 결합된 IgE-Fc 분자의 집단에서 오말리주맙 결합 부위의 수를 실질적으로 감소시킨다.
IgE-Fc/FcεRIα 복합체의 오말리주맙 Fab3 매개 가속화된 해리의 메카니즘
문헌(Kim et al.)20은 DARPin E2_79가 IgE-FcεRI의 미리 형성된 복합체의 해체를 가속화할 수 있다고 보고하였다. 이 관찰 이후, 문헌(Eggel et al.)21은 오말리주맙이 FcεRI로부터의 IgE의 해리도 촉진할 수 있다는 것을 나중에 보여주었다. 이 관찰과 유사하게, 본 발명자들은 오말리주맙 Fab3이 IgE-Fc/FcεRIα 복합체에 결합되었을 때 FcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리를 가속화할 수 있고(도 9d), 그 오말리주맙 Fab3이 오말리주맙 Fab3보다 더 효율적으로, 그리고 온전한 오말리주맙보다 훨씬 더 효율적으로 이것을 수행하였다는 것(도 10e)을 발견하였다. 1개의 Fab는 IgE-Fc/FcεRIα 복합체와 맞물리나, FcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리를 가속화하지 않는다. 놀랍게도, 가속화된 해리가 제2 결합 부위(즉, 저친화성 부위)의 점유 후에만 일어나는 듯하다. (오말리주맙 Fab3)2/IgE-Fc/FcεRIα 사량체분자 복합체는 IgE-Fc/FcεRIα 해리에 대한 에너지 장벽을 현저히 감소시켜, 이 달리 매우 안정한 복합체의 신속한 해리를 야기하는 방식으로 IgE-Fc의 에너지 지형(landscape)을 변경시켜야 한다.
오말리주맙 Fab3 경쇄와 Cε2 도메인 사이의 상호작용의 상세한 설명
오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체에서, 1개의 Cε2 도메인은 2개의 돌연변이된 잔기들(Ser81Arg 및 Gln83Arg)과 대략 260 Å2의 약한 상호작용을 형성한다(오말리주맙 Fab3과 Cε3 도메인 사이의 약 715 Å2의 평균 상호작용 면적과 비교됨). Pro158과 IgE-Fc 사이의 접촉은 없다.
Fab2 경쇄로부터의 Arg81 측쇄(오말리주맙 Fab3에서 돌연변이된 잔기들 중 하나; (서열번호 125, PDB 넘버링))는 쇄 B(서열번호 108)로부터의 Cε2 도메인으로부터의 Val277 및 Asp278 가까이에 팩킹된다. Ser80(오말리주맙 Fab3)은 Asp278, Leu279 및 Thr281(Cε2 도메인) 가까이에 팩킹되는 반면, Ser64(오말리주맙 Fab3)는 Asp276 및 Asp278 가까이에 팩킹된다. Ser64 및 Ser80은 오말리주맙 및 오말리주맙 Fab3에서 동일하다.
오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체에서, Arg83(오말리주맙 Fab3에서 돌연변이된 잔기들 중 하나)은 Asp278(Cε2 도메인) 측쇄에서의 장애로 인해 외관상으로는 Cε2 도메인과 명확히 접촉하지 않는다. 그러나, Asp278 측쇄가 정돈되면, 수소결합 또는 염 가교가 Arg83과 Asp278 사이에 잠재적으로 형성될 수 있다
오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체 사이의 결정학적으로 확인된 접촉
결정 구조에서 4 Å 이내에서의 항체와 항원 사이의 접촉은 전형적으로 에피토프/파라토프 계면을 표시한다.
오말리주맙 Fab3 중쇄 및 경쇄 CDR들의 4 Å 이내의 IgE-Fc 잔기는 하기 에피토프를 규정한다:
T 373, W 374, S 375, R 376, A 377, 3 S 78, G 379, P 381, Q 417, C 418, R 419, P 426, R 427, A 428(쇄 A).
나아가, 오말리주맙 Fab3 경쇄 FR1 및 FR3 잔기들의 4 Å 이내의 IgE-Fc 잔기는 에피토프를 D 278, T 281(쇄 B - Cε2 도메인)[항체의 R18, S64, S80, R81, 및 실시예 5에 기재된 분자 동역학 시뮬레이션 동안 밝혀진 추가 R83과 접촉됨]까지 연장시킨다.
결정 구조에서 5 Å 이내에서의 항체와 항원의 접촉도 항체/항원 계면을 규정하는 데 있어서 정보를 제공한다.
오말리주맙 Fab3 중쇄 및 경쇄 CDR들의 5 Å 이내의 추가 IgE-Fc 잔기는 K380, M430(쇄 A)이다.
뿐만 아니라, 오말리주맙 Fab3 경쇄 FR1 및 FR3 잔기의 5 Å 이내의 추가 IgE-Fc 잔기는 D276, V277, L279, S280, A282(쇄 B - Cε2 도메인)[FR1의 G16 및 FR3의 R65와 추가로 접촉됨]이다.
오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체에서 Cε3 도메인 배향의 분석
Cε4 도메인과 관련하여 Cε3 도메인의 위치를 분석하는 한 방법에서, 한 쇄로부터의 Cε3 도메인으로부터의 Asn394 Cα 원자와 다른 쇄의 Cε4 도메인으로부터의 Lys497 Cα 원자 사이의 원자간 거리를 이용하여 Cε3 도메인의 "개방도"를 기술하였다29. Val336 Cα 사이의 원자간 거리를 이용하여 "스윙(swing)", 또는 Cε3 도메인들이 서로 얼마나 가까운 지를 기술하였다29.
Cε3 도메인이 개방된 입체구조를 채택하는, FcεRI에 결합된 IgE-Fc 및 FcεRI에 결합된 Fcε3-4의 경우, "개방도" 값은 23.5 내지 28.4 Å인 반면, "스윙" 값은 평균 23.3 Å이다8,10. 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체에 대한 상응하는 값은 "개방도"의 경우 평균 29.5 Å이고 "스윙"의 경우 평균 29.4 Å이다. 오말리주맙 Fab3 복합체에서, Cε3 도메인은 지금까지 기재된 가장 개방된 입체구조(서로로부터 가장 멀리 떨어져 있음)를 채택한다.
고찰
본 발명자들은 IgE-Fc와, 치료 항-IgE 항체 오말리주맙으로부터 유래한 Fab 단편 사이의 복합체의 구조를 3.7 Å 해상도로 보고하고; 본 발명자들은 항원 결합 부위로부터 멀리 떨어진 프레임워크 영역 내에 3개의 점 돌연변이들을 함유하는 이 Fab 단편을 오말리주맙 Fab3으로서 지칭한다. 상기 구조는 2개의 Cε3 도메인들 각각에 1개씩 결합된(그러나, Fab들 중 하나만이 Cε2 도메인에 결합됨), IgE-Fc와 복합체를 형성한 2개의 오말리주맙 Fab3 분자들을 보여주고, IgE와 FcεRI 및 CD23 둘 다의 결합을 억제하는 오말리주맙의 능력에 대한 설명을 제공한다. IgE-Fc가 오말리주맙 Fab3 복합체에서 부분적으로 굽혀진 입체구조를 채택한다는 것도 확인되는데, 이것은 유리 IgE-Fc에 비해 약간의 펴짐을 시사하는, FRET로 표지된 IgE-Fc를 사용한 본 발명자들의 초기 연구와 일치한다9.
IgE-Fc는 용액에서 대체로 굽혀져 있고5,6,9,25,26,27,28, 유리 IgE-Fc의 결정 구조에서 (Cε2)2 도메인 쌍은 Cε3 및 Cε4 도메인에 기대어 되접어 꺾여 있다7,8. 최근에, IgE-Fc의 입체구조적 유연성에 대한 본 발명자들의 이해는 본 발명자들이 항-IgE-Fc Fab를 갖는 복합체(aεFab)에서 포착된, 전체적으로 펼쳐진 입체구조의 구조를 해상하였을 때 상당히 향상되었다16. 심하게 굽혀진 입체구조부터 펼쳐진 입체구조까지의 IgE-Fc 펴짐을 조사하는 분자 동역학 시뮬레이션은 부분적으로 굽혀진 입체구조에 상응하는 에너지 대역을 보여주었다(도 6). (Cε2)2 도메인 쌍과 Fcε3-4 도메인 사이의 굽힘이 약 90o인, 여기서 보고된 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체는 이 시뮬레이션에서 상이한 에너지 대역에 상응한다16. 흥미롭게도, 오말리주맙 Fab3 결합 부위의 위치는 전체적으로 펼쳐진 입체구조로의 추가 펴짐을 방해하지 않을 것이므로, IgE-Fc가 오말리주맙과 복합체를 형성할 때조차도 입체구조의 실질적인 변화를 겪을 수 있다는 것이 가능하다.
다양한 IgE-Fc, Fcε3-4 및 수용체 복합체 구조는 Cε3 및 Cε4 도메인에 비해 (Cε2)2 도메인 쌍의 굽힘 이외에 Cε3 도메인이 폐쇄된 배향부터 개방된 배향까지 다양한 상대적 배향을 채택할 수 있다는 것을 입증하였다7,8,10,11,13,14,16,24,29. Cε3 도메인의 개방 및 폐쇄는 IgE-Fc에서 수용체 결합의 알로스테릭 조절에 기여한다11,12: CD23 복합체에서 이들은 상대적으로 폐쇄되어 있는 반면11,13,14, FcεRI 복합체에서 이들은 더 개방되어 있다8,10. CD23/Fcε3-4 복합체의 구조와 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체의 구조의 비교는 CD23 부위와 오말리주맙 부위가 중첩된다는 것을 보여주고, 경쟁 결합 실험은 오말리주맙에 의한 IgE와 CD23의 결합의 억제가 단순하게 오르토스테릭하다는 것을 시사한다.
그러나, FcεRI 결합의 억제는 더 복잡하다. 오말리주맙 Fab3 복합체에서, Cε3 도메인은 Cε3 도메인을 각각 포함하는, IgE-Fc와 FcεRI 사이의 2개의 상호작용 하위부위들이 동시에 맞물릴 수 없을 정도로 많이 임의의 이전 구조에서 확인된 입체구조보다 더 개방된 입체구조를 채택한다. 이 억제에의 또 다른 기여는 오말리주맙 Fab3(Fab1) 분자가 FcεRIα에 대한 접촉 잔기의 입체구조에 직접적으로 영향을 미칠 수 있는, Cε3 내의 수용체 결합 FG 루프에 가깝게 위치하는 것으로부터 비롯될 수 있다. 마지막으로, IgE-Fc의 오말리주맙 Fab3 및 FcεRIα 결합 에피토프들이 엄격히 중첩되지 않을지라도, 이들 둘 다가 동시에 결합된 경우 입체적 충돌의 가능성이 있다. 따라서, 결정 구조는 오말리주맙의 억제 메카니즘이 원칙적으로 알로스테릭하나 잠재적인 오르토스테릭 성분을 사용한다는 것을 암시한다.
SPR 연구는 본 발명자들로 하여금 2개의 오말리주맙 Fab3 결합 부위들에 대한 반응역학 및 친화성을 평가할 수 있게 하였다. 두 친화성은 약 1 nM 및 약 30 nM의 KD 값으로 현저히 상이한데, 이때 전자는 보다 더 빠른 결합 속도 상수(약 2x105 M-1 s-1에 비해 약 2x106 M-1 s-1의 kon) 및 약간 더 느린 해리 속도 상수(약 6x10-3 s-1에 비해 약 2x10-3 s-1의 koff)와 관련되어 있다. 보다 더 높은 친화성 상호작용은 굽혀진 IgE-Fc 분자에 방해받지 않고 접근할 Fab1의 결합에 상응하는 반면, 보다 더 낮은 친화성 및 보다 더 느린 결합 속도는 Fab2에 상응할 것으로 추측되나, 본 발명자들은 이것을 단정할 수 없다.
오말리주맙 Fab3에 의한 IgE-Fc와 FcεRIα의 결합 억제의 메카니즘을 조사하기 위한 추가 SPR 실험은 FcεRIα와 복합체를 형성할 때 IgE-Fc에서 오말리주맙 Fab3에 대한 이용 가능한 부위의 수의 감소(감소된 Bmax)를 보여주었다. 오말리주맙에 의한 IgE와 FcεRI의 결합 억제는 중첩되는 부위들에 대한 직접적인 경쟁의 관점에서 종종 해석되었으나, 오말리주맙이 수용체에 결합된 IgE에 결합할 수 있다는 것을 시사하는 보고가 있다21,32. 본 발명자들은 IgE-Fc가 이미 FcεRIα에 결합되었을 때 오말리주맙 Fab3이 IgE-Fc에 결합하여 삼량체분자 복합체를 형성하는 능력을 여기서 직접적으로 입증하였다. IgE-Fc와 FcεRIα의 예비결합의 효과는 IgE-Fc의 오말리주맙 Fab3 결합 부위의 수를 유리 IgE-Fc에서 이용될 수 있는 결합 부위의 수의 10% 미만까지 감소시키는 것이고; 이 효과는 단지 알로스테릭 조절에 기인할 수 있다.
오말리주맙 Fab3과 IgE-Fc/FcεRI 복합체의 상호작용의 성질은 가속화된 해리의 메카니즘에 대한 통찰력을 제공한다. 이 현상은 DARPin에 대해 먼저 보고되었고 그 후에 치료적으로 사용된 농도보다 실질적으로 더 큰 농도의 오말리주맙에 대해 보고되었고20,21, 여기서 오말리주맙 Fab 단편에 대해 제시되어 있다. 본 발명자들은 해리가 제2(저친화성) 오말리주맙 Fab3 분자의 제1 결합 후에만 일어난다는 것도 입증한다. 또 다른 방식으로 말하면, 유의미한 가속화된 해리가 일어나기 위해 사량체분자 복합체, 즉 (오말리주맙 Fab3)2/IgE-Fc/FcεRIα가 형성되어야 한다.
오말리주맙 Fab3, IgE-Fc 및 sFcεRIα를 사용한 본 발명자들의 관찰을 기반으로, 본 발명자들은 오말리주맙, IgE 및 FcεRI에 대해 하기 메카니즘이 일어날 것을 예상한다: IgE는 FcεRI에 결합하고, 이 조건 하에서 이 결합된 IgE 분자의 작은 집단은 오말리주맙 분자가 결합할 수 있는 입체구조를 채택하고; 제2 오말리주맙 분자가 결합하여 사량체 복합체를 형성할 때, FcεRI과의 상호작용이 불안정화되도록 IgE의 에너지 지형이 변화되고, FcεRI로부터의 IgE의 신속한 해리가 일어난다. 이 메카니즘을 이해하는 데 있어서 핵심은 IgE에 대한 에너지 지형의 복잡성의 인식, 및 동역학적 평형으로 존재하는 상이한 입체구조적 상태이다.
오말리주맙의 억제 활성은 IgE의 고유 유연성을 이용하고 적어도 가속화된 해리의 과정을 위해 IgE/FcεRI 복합체의 동역학을 이용하는 듯하다. IgE는 Cε2 도메인의 존재 및 Cε3 도메인의 독특한 입체구조적으로 동역학적 용융된 구 유사 특성을 포함하는, 다른 항체 이소타입에 비해 다수의 특이한 구조적 특성을 갖는다. 종합하건대, 이 성질들은 CD23과 FcεRI의 동시적인 맞물림을 방해하는 알로스테릭 소통 경로를 생성하고; 이것은 FcεRI에 결합된 IgE를 삼량체 CD23 분자로 가교결합시킴으로써 알레르겐 독립적 비만 세포 활성화를 피하는 데 필수적이다12. IgE의 동역학과 관련된 다른 기능적 장점은 막에 결합된 IgE B 세포 수용체에 대해 제안되었다16. 오말리주맙이 IgE/FcεRI 상호작용의 억제에 대한 예상된 오르토스테릭 메카니즘을 이용하지 않는다는 관찰은 오말리주맙이 차단 항체로서의 그의 성능 및 비만 세포에 결합된 IgE의 가교결합을 피하는 그의 능력 둘 다에서 IgE의 특이한 동역학적 성질도 활용한다는 것을 시사한다. 마지막으로, 오말리주맙은 IgE가 그의 수용체와 복합체를 형성할 때조차도 존재하는, IgE의 알로스테리(allostery) 및 고유 유연성을 이용함으로써 비록 치료적으로 사용되는 농도보다 더 높은 농도로 사용될지라도 FcεRI로부터 IgE를 능동적으로 해리시킬 수 있다.
방법
클로닝, 단백질 발현 및 정제. 오말리주맙 인간 IgG1 Fab 및 오말리주맙 Fab3을 문헌16에 기재된 바와 같이 클로닝하고 발현시키고 정제하였다. IgE-Fc는 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다35. IgE-Fc는 서열번호 108에 따른 것이었다(문헌(Dorrington & Bennich (1978) Immunol. Rev. 41:3-25)에 따라 V224-K547, 그러나, 하기 돌연변이들이 글리코실화 패턴을 단순화하기 위해 IgE-Fc 내로 삽입됨: N265Q & N371Q). 오말리주맙을 노바티스 유로팜 리미티드(Novartis Europharm Limited)로부터 구입하였다. 2:1 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체를 크기 배제 크로마토그래피로 정제하고 25 mM Tris-HCl(pH 7.5), 20 mM NaCl 및 0.05%(w/v) NaN3 내로 용출하고 23 mg/㎖까지 농축하였다.
표면 플라스몬 공명. SPR 실험을 비아코어 T200 기계(GE Healthcare)에서 수행하였다. 아민 커플링 프로토콜(GE Healthcare)을 이용하여 300 공명 단위 미만의 커플링 밀도로 단백질을 공유커플링시키거나, 항-His 센서 표면을 사용하여 His-태그가 부착된 단백질을 포획함으로써 특이적 표면을 제조하였다. His-태그가 부착된 리간드를 포획하기 위해, 항-His-태그 단일클론 항체를 사용하였고 제조자의 설명서(비아코어 His 포획 키트, GE Healthcare)에 따라 고정시켰다. 결합 실험에서, 180초 내지 240초의 결합 시간을 전형적으로 사용하였고, 적어도 500초 동안 해리 성분을 모니터링하였다. 20 mM HEPES(pH 7.4), 150 mM NaCl 및 0.005%(v/v) 계면활성제 P-20(GE Healthcare)의 런닝 완충제를 사용하여 25 ㎕ 분-1의 유속으로 주사를 수행하였다. 대다수의 실험적 측정을 25℃에서 수행하였고; 가속화된 해리 현상을 최소화하기 위해 샌드위치 결합 실험들 중 일부를 5℃에서 수행하였다. 표준 이중 기준화 데이터 차감 방법을 이용하였고36, 오리진(Origin) 소프트웨어(OriginLab)를 이용하여 반응역학적 피트를 수행하였다.
TR-FRET. 100 mM 중탄산나트륨 및 50 mM NaCl(pH 9.3) 중의 4 mg/㎖ 단백질을 5배 몰 과량의 터븀 킬레이트 이소티오시아네이트(Invitrogen)와 반응시켜 IgE-Fc를 공여자 형광단으로 표지하였다. 교반하면서 실온에서 3시간 동안 항온처리한 후, PBS(20 mM 인산염 완충제 식염수, 150 mM NaCl, pH 7.4) 내로 투석함으로써 여분의 미반응된 형광단을 제거하였다. 실온에서 1시간 동안 3 mg/㎖ 단백질을 2.5배 몰 과량의 알렉사 플루오르 647 석신이미딜 에스테르(Invitrogen)와 반응시켜 sFcεRIα-IgG4-Fc 융합 단백질(α-γ)37을 수용자 형광단으로 표지하였다. 여분의 형광단을 PBS 내로 투석하여 제거하였다.
터븀으로 표지된 1 nM의 IgE-Fc 및 알렉사 플루오르 647로 표지된 0 내지 20 nM의 sFcεRIα-IgG4-Fc를 다양한 농도의 오말리주맙 Fab3과 경쟁시킴으로써 TR-FRET 억제 어세이를 수행하였다. 란타스크린(Lanthascreen) 완충제(Invitrogen)를 희석제로서 사용하여 어세이를 384웰 하이-베이스(hi-base) 백색 플레이트(Greiner BioOne)에서 수행하였다. 플레이트를 실온에서 하룻밤 동안 항온처리하고 아르테미스(Artemis) 플레이트 판독기(Berthold Technologies)로 판독하였다. 그 다음, 665 nm에서의 수용자의 방출을 620 nm에서의 공여자의 방출로 나누고 10,000을 곱하여 각각의 웰에 대한 TR-FRET 비를 계산하였다.
결정화. 길이가 최대 400 ㎛인 직사각형 형태를 갖는 결정을, 시팅 소적(sitting drop) 증기 확산 방법을 이용하여 18℃에서 성장시켰다. 저장소는 50 ㎕ 4%(w/v) PEG 8000 및 0.03 M 불화나트륨을 함유하였고, 소적은 100 nl 단백질 및 300 nl 저장소를 함유하였다. 최적화를 위한 광범위한 노력에도 불구하고, 결정의 회절 질은 이 연구를 위해 사용된 회절 질을 넘는 수준까지 더 개선될 수 없었다. 결정은 전형적으로 수일 후에 성장하기 시작하였고, 종종 그들의 소적에 용해되었으나, 냉동보호제로서 성공적으로 사용된 4 M TMAO(트리메틸아민 N-옥사이드)에서 안정화될 수 있었다.
데이터 수집 및 프로세싱. 데이터를 다이아몬드 라이트 소스(Diamond Light Source)(영국 하웰 소재)의 빔라인(102 및 103)에서 수집하였다. xia2 팩키지39에서 실행된 XDS38를 사용하여 적분을 수행하였다. 결정은 이방성으로 회절하였고, 다수의 결정들로부터의 데이터를 병합하였다. CCP4 스위트40,41로부터의 AIMLESS를 이용하여 데이터를 3.7 Å 해상도까지 크기 조정한 후, UCLA 회절 이방성 서버42를 이용하여 3.7 Å(a*), 3.9 Å(b*) 및 4.2 Å(c*)의 해상도 한계까지 줄였다. 매튜(Matthews) 계수의 계산은 비대칭적인 유닛에서 단일 2:1 오말리주맙 Fab3/IgE-Fc 복합체(약 170 kDa의 분자 질량)에 대한 약 62%의 용매 함량을 표시하였다.
구조 확인, 모델 구축 및 개량. PDB 엔트리 2wqr8로부터의 단백질 원자 및 1.9 Å 해상도 오말리주맙 Fab 구조(비공개된 결과)를 검색 모델로서 사용하여 CCP4 스위트40로부터의 PHASER43 및 MOLREP44로 분자를 대체함으로써 구조를 해상하였다. 먼저 REFMAC45를 사용하고 나중에 PHENIX46를 사용하여 개량을 수행하였고, Coot 47의 매뉴얼 모델 구축으로 교대시켰다. 상기 모델의 질을 MolProbity48, POLYGON49, 및 PHENIX 그래픽 계면50 내의 다른 검증 수단으로 평가하였다. 데이터 프로세싱 및 개량 통계자료는 표 1에 제공되어 있다. 전자 밀도 맵의 영역은 도 11에 제시되어 있다. 계면을 PISA51로 분석하였고, 도면을 PyMOL52로 준비하였다.
참고문헌
실시예 2: 비아코어에 의한 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 가속화된 해리의 측정
비아코어 기술은 표지 부착에 대한 요구 없이 생체분자들 사이의 상호작용을 측정한다. 리간드로서 지칭되는, 상호작용제들 중 하나는 센서 표면에 직접적으로 고정되거나 포획되는 반면, 분석물로서 지칭되는 다른 상호작용제는 포획된 표면 위에 용액으로 유동한다. 센서는 분석물이 리간드에 결합할 때 및 분석물이 리간드로부터 해리할 때 센서 표면에서 질량의 변화를 검출한다. 이들은 결합 과정 및 해리 과정 둘 다에 상응한다. 가속화된 해리 어세이에서, sFcεRIα는 리간드이고 센서 표면에 고정된다. IgE-Fc는 분석물이고 sFcεRIα에 의해 포획된다. sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리는 센서 표면 위를 유동하는 완충제, 또는 센서 표면 위를 유동하는 IgE 결합 파트너의 용액에 의해 모니터링된다. 방법의 상세한 내용은 다음과 같다:
기계: 비아코어 3000, 지이 헬쓰케어 아베(GE Healthcare AB), 스웨덴 업살라 소재
센서 칩: CM5. 카탈로그 번호 BR100399
비아표준화(BIAnormalising) 용액: 70%(w/w) 글리세롤. 비아유지(BIAmaintenance) 키트의 일부. 카탈로그 번호 BR100651. 비아유지 키트를 4℃에서 저장하였다.
아민 커플링 키트: 카탈로그 번호 BR100633. 증류수에서 최대 75 mg/㎖로 제조되고 -70℃에서 200 ㎕ 분취물로 저장된 에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC). 증류수에서 최대 11.5 mg/㎖로 제조되고 -70℃에서 200 ㎕ 분취물로 저장된 N-하이드록시석신이미드(NHS). 4℃에서 저장된 에탄올아민 하이드로클로라이드-NaOH(pH 8.5).
sFcεRIα의 산화를 위한 시약. 증류수에서 최대 5 mM로 제조된 카보하이드라자이드(SigmaAldrich, 카탈로그 번호 C11006). 아세트산나트륨에서 최대 100 mM로 제조된 수소화시아노붕소나트륨(SigmaAldrich, 카탈로그 번호 156159), (BDH, 카탈로그 번호 S1104-500GM) 100 mM pH=4. 아세트산나트륨에서 최대 50 mM로 제조된 m-과요오드산나트륨(SigmaAldrich, 카탈로그 번호 S-1878)(BDH, 카탈로그 번호 S1104-500GM) 100 mM, pH=5.5.
sFcεRIα를 pH 5.5의 0.1 M 아세트산나트륨에 1 mg/㎖까지 희석하였다. 그 다음, 4 ㎕의 과요오드산나트륨(50 mM, 희석 1/50)을 200 ㎕의 1 mg/㎖ sFcεRIα 용액에 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 얼음 위에 놓아두었다. 고정 전에, sFcεRIα의 용액을 10 mM 아세트산나트륨(GE Healthcare, 카탈로그 번호 BR100669)(pH=4.0)으로 7 ㎍/㎖까지 희석하였다.
완충제: 런닝 완충제는 HBS-EP(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, 10배 원액 용액으로부터 재구성됨)이다: 카탈로그 번호 BR100669. 고정 완충제는 아세트산염 4.0(10 mM 아세트산나트륨 pH 4.0)이다. 카탈로그 번호 BR100349. 완충제를 4℃에서 저장하였다.
리간드: 인간 고친화성 IgE 수용체의 알파 쇄의 세포외 부분인 sFcεRIα. CHO 세포에서 재조합 단백질로서 발현되고 정제된다.
분석물: CHO 세포에서 재조합 단백질로서 발현되고 정제된, 인간 IgE의 Fc 부분인 IgE-Fc. C225A 돌연변이를 보유하는 야생형 인간 IgE-Fc(문헌(Dorrington & Bennich (1978) Immunol. Rev. 41:3-25)에 따라 넘버링 V224-K547을 갖는 Cε2-Cε4 도메인)를 사용하였다(서열번호 108).
돌연변이체의 명명법:
IgE 결합 파트너 (1): 전체 길이 오말리주맙(Novartis); CHO 세포에서 발현되고 정제된 오말리주맙의 재조합 Fab 단편.
IgE 결합 파트너 (2): HEK-293 세포에서 발현되고 배양 상청액으로서 분석된 오말리주맙의 재조합 Fab 단편 및 이의 돌연변이. 배양 상청액을 분석 전에 10배 농축하였다.
어세이 방법 (1): sFcεRIα를 약 500 반응 유닛(RU)의 수준까지 알데하이드 커플링으로 센서 표면에 커플링시켰다. HBS-EP 완충제를 30 ㎕/분의 유속으로 런닝 완충제로서 사용하였다. IgE-Fc를 HBS-EP로 10 nM까지 희석하였고 290초 동안 고정된 sFcεRIα에 주사한 후, 런닝 완충제 또는 런닝 완충제에 의해 희석된 IgE 결합 파트너를 매회 690초 동안 3회 주사하였다. IgE-Fc의 포획 수준은 약 90 RU이었다. 표면을 10 mM 글리신-HCl(pH 2.5)의 2회 60초 주사로 재생시켰다. 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리의 양을 초기 결합 양의 함수로서 계산하였고, 해리의 속도를 경과된 시간의 함수로서 초기 결합 양에 대해 표준화된, 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 상실의 양으로서 계산하였다.
어세이 방법 (2): sFcεRIα를 약 2000 반응 유닛(RU)의 수준까지 알데하이드 커플링으로 센서 표면에 커플링시켰다. HBS-EP 완충제를 30 ㎕/분의 유속으로 런닝 완충제로서 사용하였다. IgE-Fc를 HBS-EP로 10 nM까지 희석하고 180초 동안 고정된 sFcεRIα에 주사한 후, 런닝 완충제 또는 런닝 완충제에 의해 희석된 IgE 결합 파트너를 180초 동안 1회 주사하였다. IgE-Fc의 포획 수준은 약 275 RU이었다. 표면을 10 mM 글리신-HCl(pH 2.5)의 2회 60초 주사로 재생시켰다. 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리의 양을 초기 결합 양의 함수로서 계산하였고, 해리의 속도를 경과된 시간의 함수로서 초기 결합 양에 대해 표준화된, 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 상실의 양으로서 계산하였다.
sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리를 가속화하는 추가 돌연변이가 Fab3으로 기재된 부위의 외부에서 확인될 수 있는 지를 확인하기 위해 추가 돌연변이유발을 수행하였다. 이것은 Fab3의 환경에서 sFcεRIα로부터의 IgE의 해리를 더 증가시킬 수 있는 (서열번호 20과 관련하여) 돌연변이 S64M으로 이어졌다. 이 데이터는 도 13 및 표 3에 기재되어 있다.
결론:
종합하건대, 이들 데이터는 돌연변이된 형태의 오말리주맙 Fab가 고정된 형태의 고친화성 IgE 수용체인 FcεRI로부터의 IgE의 해리를 가속화할 수 있다는 것을 입증한다. 이것을 가능하게 하는 경쇄 내의 돌연변이는 서열번호 24를 참고할 때 S64M, S81R, Q83R 및 L158P를 포함하고 서열번호 39를 생성하나, 반드시 이들로 한정되지는 않는다.
실시예 3: 유세포분석에 의한 FcεRI로부터의 IgE-Fc의 가속화된 해리의 측정
기계: FACSCanto II 유세포분석기(Becton Dickinson)
세포주: 인간 FcεRI을 발현하는 RBL-SX38 세포를 10% 태아 소 혈청, 2 mM 글루타맥스(GlutaMAX) 및 500 ㎍/㎖ 젠네티신(Geneticin)으로 보충된 최소 필수 배지(Life Technologies)에서 배양하였다. 어세이할 때, 세포를 PBS로 세척하고 탈착될 때까지 아큐타제(Accutase)와 함께 항온처리한 후, 배양 배지에 1x106개 세포/㎖로 재현탁하였다. 모든 하위순서 항온처리 단계들을 배양 배지에서 수행하였다.
어세이 방법: 1x106개 세포/㎖의 RBL-SX38 세포를 37℃에서 1시간 동안 알렉사-488로 표지된 5 nM IgE-Fc와 함께 항온처리하였다. 세포를 배양 배지로 2회 세척하여 비결합된 IgE-488을 제거한 후, 배양 배지 또는 배양 배지에 의해 희석된 100 ㎍/㎖ IgE 결합제에 1x106개 세포/㎖로 현탁하였다. 그 다음, 세포를 일정하게 회전시키면서 37℃에서 항온처리하였다. 각각의 시점에서, 0.5x105개의 세포를 제거하고 빙냉 PBS로 세척한 후, 4℃에서 16시간 동안 PBS 중의 1% 파라포름알데하이드에 재현탁하여 고정시켰다. FACSCanto II 유세포분석기를 이용하여 세포에 결합된 알렉사-488 형광의 양을 측정하였다.
유세포분석: 고정된 세포를 FACS 완충제(PBS 중의 0.1% w/v BSA 및 0.01% w/v NaN3, pH 7.4)로 2회 세척하고 200 ㎕ FACS 완충제에 재현탁하였다. 표준 방법을 이용하여 FACSCanto II 세포분석기에서 유세포분석을 수행하였고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 이용하여 온전한 세포에 결합된 알렉사-488의 기하 평균 형광 강도를 계산하였다. 세포를 배양 배지, 과량의 비표지된 IgE-Fc 또는 IgE 결합제의 존재 하에서 항온처리한 결과로서, 알렉사-488로 표지된 IgE-Fc의 해리 속도를 시간의 함수로서의 기하 평균 형광 강도의 변화로서 계산하였다.
돌연변이체의 명명법:
결론:
종합하건대, 이들 데이터는 돌연변이된 형태의 오말리주맙 Fab가 세포 표면에서 발현된 고친화성 IgE 수용체인 FcεRI로부터의 IgE의 해리를 가속화할 수 있다는 것을 입증한다. 이것을 가능하게 하는 경쇄 내의 돌연변이는 S81R, Q83R 및 L158P를 포함하나, 반드시 이들로 한정되지는 않는다.
실시예 4: 오말리주맙 Fab3이 72시간 PCA 모델에서 치료적으로 투약되었을 때 야생형 오말리주맙 Fab보다 더 우수한 효능을 갖는다는 것을 입증한다 .
7.5 ㎕의 6.68 mg/㎖ 원액을 1992.5 ㎕의 PBS에 첨가함으로써 25 ㎍/㎖의 인간 항-DNP-IgE 용액을 제조하였다. 이 용액의 20 ㎕ 주사는 500 ng 용량의 IgE를 제공할 것이다. 동물(hIgER Tg 마우스)의 옆구리를 면도한 후, 0일째 날 오후 2시에 각각의 옆구리에서 진피내로 주사하였다. 20 ㎕의 PBS를 음성 대조군으로서 각각의 동물의 좌측 옆구리 내로 주사하였다. 항-DNP-IgE(20 ㎕)를 우측 옆구리 내로 주사하였다. 총 40마리의 마우스들을 전부 주사하였다. 야생형 오말리주맙 Fab 또는 오말리주맙 Fab3(S81R, Q83R, L158P 돌연변이[카바트 넘버링에 따라 S77R, Q79R, L154P]를 가짐)을 사용한 치료는 IgE 후 18시간(오전 8시)에 시작하였다. 2개의 마우스 군들(n=8/군)은 100 mg/kg의 야생형 오말리주맙 Fab 또는 오말리주맙 Fab3을 피하로 제공받았다. 8마리 마우스들의 추가 군은 PBS를 피하로 제공받았다. 10시간 후(오후 6시) 전술한 바와 같이 마우스들에게 다시 투약하였다. 이 시점, 즉 IgE 후 28시간에서 100 mg/kg의 야생형 오말리주맙 Fab 또는 오말리주맙 Fab3을 추가 2개의 군들(n=8/군)에게도 피하로 투약하였다. 실험 마지막 날 오전 8시, 오후 6시 및 다시 오전 8시에 모든 군들에게 재투약하였다. 진피내 투약 후 72시간(오후 2시)에, 100 ㎕의 1 mg/㎖ DNP-HSA, 및 100 IU/㎖의 헤파린에서 제조된 2.5% w/v 에반스 블루(Evans blue)를 모든 동물들에게 정맥내로 주사하였다. 1시간 후, 동물들을 일정 1 방법으로 사멸시켰다. 진피내 주사 부위 주변의 옆구리로부터 피부를 떼어내고 펀치 생검을 수행하였다. 피부 샘플을 700 ㎕의 포름아마이드에 넣고 55℃에서 하룻밤 동안 분해하였다. 분해 후, 100 ㎕ x 2 유체를 각각의 샘플로부터 제거하고 96웰 ELISA 플레이트에 넣었다. 그 다음, 흡광도를 620 nm에서 측정하였다.
결론:
이들 데이터는 고친화성 IgE 수용체인 FcεRI로부터의 IgE의 해리를 가속화할 수 있는 돌연변이된 형태의 오말리주맙 Fab가 야생형 오말리주맙 Fab와 비교할 때 (반응 부위로부터의 에반스 블루 염료의 누출의 억제에 의해 확인된) 수동 피부 아나필락시스를 통계학적으로 유의미한 방식으로 감소시킬 수도 있다는 것을 입증한다. 이것을 가능하게 하는 경쇄 내의 돌연변이는 서열번호 24를 참고할 때 S81R, Q83R 및 L158P를 포함하고 서열번호 39를 생성하나, 반드시 이들로 한정되지는 않는다.
실시예 5: IgE-Fc와 복합체를 형성한 오말리주맙 Fab3의 분자 동역학 시뮬레이션
방법:
앰버(Amber) 14(2)를 이용하여 분자 동역학(MD) 시뮬레이션 전에 일부 잔기들에서 누락된 측쇄를 완성시키고 Cε2 도메인과 Cε3 도메인 사이의 루프를 누락시킴으로써 분자 작동 환경(MOE) 2014.0901(1)에서 IgE-Fc 영역과 복합체를 형성한 오말리주맙 Fab3의 결정 구조(실시예 1 참조)를 제조하였다. 상자의 임의의 가장자리부터 단백질 원자까지 10 Å 펼쳐진 절두된 8면체 상자에서 0.15 M NaCl 염 용질과 함께 TIP3P 명시적 물 모델을 사용하여 복합체 구조를 수소-첨가하고 용매화하였다. 앰버 ff12SB 및 올리고사카라이드 GLYCAM_06j-1(3) 힘장(forcefields)을 이용하여 시스템을 설정하고 쿨롬(Coulombic) 및 반데르발스 상호작용에 대해 설정된 10.0 Å 컷오프 및 격자 기반 이웃 목록(grid-based neighbour list)을 사용하여 50,000개 단계에 대한 접합체 구배 알고리즘으로 최소화하였다. 그 후, 시스템을 일정한 부피로 125 ps에서 0 K부터 300 K까지 점진적으로 가열한 후, 모든 용질 중원자들에 대한 제약을 갖는 NPT 앙상블(ensemble)에서 2.25 ns 평형에 도달하게 하였다(조화 힘 제약은 5.0이다). 정전기학을 위해, 본 발명자들은 디폴트 푸리에 간격 및 공차 설정과 함께 쿨롬 상호작용에 대한 8.0 Å의 컷오프를 갖는 4차 PME를 사용하였다. 각각 1.0 ps의 시간 상수를 갖는 단백질 및 용매에 적용된 약한 커플링 알고리즘으로 온도를 조절하였고, 1.0 ps의 시간 상수 및 4.46 X 10-5 bar-1의 압축률을 갖는 전체 시스템에 적용된 등방성 베렌슨(Berenson) 압력조절기를 이용하여 압력을 조절하였다. 마지막으로, 임의의 제한 없이 수행된 1000 ns 생성 시뮬레이션은 평형에 대한 파라미터와 동일한 파라미터를 이용하였다. GPU 기반시설에서 4 fs 시간 단계를 가능하게 하기 위해, ParmEd(4)를 이용하여 단백질 및 당의 수소 질량을 3.024 달톤까지 재분획화한 반면, 이들이 결합된 원자의 질량을, 총 질량을 변하지 않은 상태로 남겨두기 위해 요구된 양으로 조절하였다. 항체 경쇄에서 R81 및 R83을 각각 야생형 세린 및 아스파라긴으로 사실상 돌연변이시킴으로써, IgE-Fc 영역과 복합체를 형성한 야생형 오말리주맙 Fab의 구조를 IgE-Fc를 갖는 오말리주맙-돌연변이체3의 결정 복합체 구조로부터 모델링하였다. 돌연변이체3에 대한 설정 프로토콜과 동일한 설정 프로토콜을 이용하여 MD 시뮬레이션을 수행하였다.
오말리주맙 Fab3, 및 IgE-Fc와 복합체를 형성한 오말리주맙 Fab 둘 다에 대한 MD 궤도의 클러스터링 분석을 위해 앰버툴스(AmberTools) cpptraj 모듈(7)을 사용하였다. 각각의 클러스터 사이의 평균 연결 거리가 2.0 Å 미만이도록 계층 응집형(Hierarchical agglomerative) 알고리즘을 채택하였다. 항체 경쇄 V-영역 잔기에서 Cα 원자들 사이의 최적합 좌표 RMSD를 통해 프레임들 사이의 거리를 계산하였다. 단지 10개의 프레임마다 클러스터링을 수행하였고, 모든 다른 프레임들이 클러스터링 후 클러스터 중심에 얼마나 가까운 지를 기반으로 이들을 클러스터에 추가하였다.
참고문헌
결과:
오말리주맙 Fab3의 경쇄 내의 S81R 및 Q83R 돌연변이가 어떻게 IgE와의 상호작용에 영향을 미치는 지를 연구하기 위해, 각각 오말리주맙 Fab, 및 IgE-Fc 구조물과 복합체를 형성한 오말리주맙 Fab3에 대해 1-마이크로초 분자 동역학 시뮬레이션을 수행하였다. 궤도 스냅사진을 모았고, 상위 2개의 밀집된 클러스터 중심 구조물들을 분석하였는데, 이 분석은 두 클러스터들에서 돌연변이체3 내의 2개 아르기닌 돌연변이들이 각각 인접한 IgE Cε2 도메인 내의 잔기 D278 및 S280과 강한 수소결합 네트워크를 형성한다는 것을 명확히 입증한다. 궤도의 시각적 검사는 R81-S280 및 R83-D278 쌍별 상호작용이 시뮬레이션 동안 훨씬 더 보존되고 안정하므로, 결정 구조에서 개시된 바와 같이 보다 더 가까운 Cε3 도메인에 비해 펴진 Cε2 입체구조가 항체 가교를 통해 굳어진다는 것을 확인시켜준다. 흥미롭게도, 이중 아르기닌 돌연변이가 오말리주맙 Fab3의 결정 구조에서 Cε2 D278 및 S280에 공간적으로 인접해 있을지라도, MD 시뮬레이션에서 암시된 바와 같이 직접적으로 수소결합되지 않는다. 오말리주맙 Fab의 경우, 예상된 바와 같이, 돌연변이체3에서 확인된 수소결합 네트워크는 상위 2개의 클러스터 중심 구조물들에서 누락되어 있다. 시각적 궤도 검사는 Cε2 도메인이 항체 경쇄 프레임워크에 덜 묶이게 되므로, 보다 더 가까운 Cε3 도메인에 대한 그의 상대적 위치가 오말리주맙 Fab3의 상대적 위치보다 더 가변적이라는 것을 보여준다. 이것 이외에, 오말리주맙 Fab3과 이의 복합체 내의 IgE-Fc 사이의 계면에 대해 IOTA 분석을 수행하였는데(IOTA는 단백질 계면 또는 결합 부위에서 소정의 접촉 원자 유형의 확률을 측정하기 위한 통계학적 잠재적인 수단임), 이 분석은 (서열번호 113을 참고할 때) 오말리주맙 Fab3에서 경쇄 위치 S56, S64 및 S71이 IgE-Fc에 대한 오말리주맙의 친화성을 증가시키도록 돌연변이될 수 있고, 이로써 상기 상세히 기재된 S81R 및 Q38R 돌연변이에 대해 확인될 것으로 예상된 효과를 향상시킬 것이라고 예상하였다.
결론:
요약하건대, MD 시뮬레이션은 S81R 및 Q38R 돌연변이가 Cε2 내의 인접 D278 및 S280과의 직접적인 정전기 및 수소결합 상호작용을 통해 IgE Cε2 도메인이 상기 항체에 위치하는 것을 용이하게 하고, Cε2 펴진 입체구조를 고정시킴으로써 IgE 가소성 Fc에 영향을 미친다는 가설을 제안한다. 이것은 S64M 돌연변이 및 S56(D, E, Q 또는 R로 교체됨) 및 S71(D, E 또는 M으로 교체됨)이 유사한 효과를 가질 것이라고 예상하는 통계학적 방법론과 커플링된다.
실시예 6: 비아코어에 의한 IgE-Fc에 대한 항-IgE Fab의 친화성 측정
비아코어 기술은 표지 부착에 대한 요구 없이 생체분자들 사이의 상호작용을 측정한다. 리간드로서 지칭되는, 상호작용제들 중 하나는 센서 표면에 직접적으로 고정되거나 포획되는 반면, 분석물로서 지칭되는 다른 상호작용제는 포획된 표면 위에 용액으로 유동한다. 센서는 분석물이 리간드에 결합할 때 및 분석물이 리간드로부터 해리할 때 센서 표면에서 질량의 변화를 검출한다. 이들은 결합 과정 및 해리 과정 둘 다에 상응한다. 반응역학 어세이에서, 항-IgE Fab는 리간드이고 센서 표면에 포획된다. IgE-Fc는 분석물이고 항-IgE Fab에 의해 포획된다. 센서 표면 위에서 유동하는 IgE-Fc(결합기) 또는 센서 표면 위에서 유동하는 완충제(해리기)를 사용하여 포획된 항-IgE Fab로부터의 IgE-Fc의 결합 및 해리를 모니터링한다. 방법의 상세한 내용은 다음과 같다:
기계: 비아코어 3000, 지이 헬쓰케어 아베, 스웨덴 업살라 소재
센서 칩: CM5. 카탈로그 번호 BR100399
비아표준화 용액: 70%(w/w) 글리세롤. 비아유지 키트의 일부. 카탈로그 번호 BR100651. 비아유지 키트를 4℃에서 저장하였다.
아민 커플링 키트: 카탈로그 번호 BR100633. 증류수에서 최대 75 mg/㎖로 제조되고 -70℃에서 200 ㎕ 분취물로 저장된 에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC). 증류수에서 최대 11.5 mg/㎖로 제조되고 -70℃에서 200 ㎕ 분취물로 저장된 N-하이드록시석신이미드(NHS). 4℃에서 저장된 에탄올아민 하이드로클로라이드-NaOH(pH 8.5).
완충제: 런닝 완충제는 HBS-EP(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, 10배 원액 용액으로부터 재구성됨)이다: 카탈로그 번호 BR100669. 고정 완충제는 아세트산염 4.0(10 mM 아세트산나트륨 pH 4.0)이다. 카탈로그 번호 BR100349. 4℃에서 저장된 완충제.
리간드: 항-IgE Fab는 리간드이었다. 이것은 HEK-293 세포에서 재조합 단백질로서 일시적으로 발현되었고 추가 정제 없이 사용되었다.
분석물: CHO 세포에서 재조합 단백질로서 발현되고 정제된, 인간 IgE의 Fc 부분인 IgE-Fc. C225A 돌연변이를 보유하는 야생형 인간 IgE-Fc(문헌(Dorrington & Bennich (1978) Immunol. Rev. 41:3-25)에 따라 넘버링 V224-K547을 갖는 Cε2-Cε4 도메인)를 사용하였다(서열번호 108).
표준 방법을 이용하여 아민 커플링으로 염소 항-인간 IgG1의 Fab2 단편(Fab2 단편 특이적)(Jackson Immunolabs, 카탈로그 번호 109-006-097)을 센서 표면에 고정시켰다. 항-IgE Fab를 런닝 완충제(HBS-EP)로 희석하였고 대략 200 공명 단위 표면에 포획하였다. IgE-Fc를 런닝 완충제로 희석하였고 2 nM부터 125 pM까지 일련의 희석물들을 포획된 항-IgE Fab에 통과시켰다. 결합기는 180초이었고 해리기는 300초이었다. 센서 표면을 40 mM HCl에의 60초 노출에 이은 10 mM NaOH에의 60초 노출 및 그 다음 40 mM HCl에의 추가 60초 노출로 재생시켰다. 표준 절차에 따라 비아에발루션 소프트웨어를 이용하여 모든 결합 데이터를 이중 기준화로 프로세싱하였다.
결론:
이들 데이터는 돌연변이된 형태의 오말리주맙 Fab가 IgE-Fc에 대한 오말리주맙 Fab의 친화성을 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다. 개선된 친화성의 관점에서 돌연변이들의 최상의 조합은 S56D와 조합된 S71M이다. 이 친화성 증가는 주로 IgE-Fc로부터의 Fab의 해리 속도의 감소에 의해 야기된다. 돌연변이되지 않은 오말리주맙 Fab에 비해 항체와 IgE-Fc Cε2의 개선된 상호작용을 고려할 때, 오말리주맙 Fab1(S81R, Q83R 돌연변이[카바트 넘버링에 따라 S77R, Q79R]를 가짐) 및 Fab3(서열번호 125를 참고로 할 때 S81R, Q83R, L158P 돌연변이[카바트 넘버링에 따라 S77R, Q79R, L154P]를 가짐)의 친화성도 개선된다.
실시예 7: 비아코어에 의한 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 가속화된 해리의 측정
실시예 2에 요약된 방법(어세이 방법 2)을 이용하여 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리에 대한 항-IgE Fab의 효과를 측정하였다. 모든 항-IgE Fab들을 HEK-29s Fab에서 발현시키고 표준 방법으로 정제하였고, 계산된 몰 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 흡광도로 정량하였다. 이 어세이에서, IgE-Fc의 농도는 2 nM이었고 해리 시간은 200초이었다. 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리의 양을 초기 결합 양의 함수로서 계산하였고, 해리의 속도를 경과된 시간의 함수로서 초기 결합 양에 대해 표준화된, 고정된 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 상실의 양으로서 계산하였다.
S80N(pdb 넘버링)은 Cε2 IgE의 D278과 상호작용하는 것으로 생각되고, S67W/Y(pdb 넘버링)는 Cε2 IgE의 T298과 상호작용하는 것으로 생각된다.
결론:
이들 데이터는 돌연변이된 형태의 오말리주맙 Fab가 고정된 형태의 고친화성 IgE 수용체인 FcεRI로부터의 IgE의 해리를 가속화할 수 있다는 것을 입증한다. 이것을 가능하게 하는 경쇄(서열번호 20) 내의 돌연변이는 위치 S56, S64, S67, S71, S80, S81, Q83 & L158(카바트 넘버링에 따라 각각 S52, S60, S63, S67, S76, S77, Q79 & L154)에서의 돌연변이들을 포함하나, 반드시 이들로 한정되지는 않는다.
실시예 8: 돌연변이된 오말리주맙 Fab의 강제된 산화
IgE-Fc에 대한 Fab의 친화성에 대한 경쇄 가변 영역 내의 메티오닌의 산화 효과, 및 IgE-Fc:sFcεRIα 복합체의 해리를 가속화하는 능력을 확인하기 위해 항-IgE Fab 샘플에 대해 강제된 산화법을 수행하였다. 돌연변이된 오말리주맙 Fab를 실온에서 최대 14일 동안 0.1% 및 1%(v/v) 과산화수소와 함께 항온처리하였다. 항온처리 후, 샘플을 PBS(pH 7.4) 내로 완충제 역교환하였고, 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도로 농도를 측정하였다. 변성 조건 하에서의 물질의 환원 및 알킬화에 이은 트립신 분해(37℃에서 180분 동안 50 ㎍/㎖ 트립신에 이은 TFA 켄치(quench)) 및 그 다음 써모 오비트랩(Thermo Orbitrap) Q 이그잭티브 플러스(Exactive Plus) 질량 분광계를 이용한 LC-MS에 의한 분석으로 경쇄 가변 영역 메티오닌의 산화의 양을 측정하기 위한 질량 분광 분석을 수행하였다. 합성 시 메티오닌 산화가 없다는 가정 하에, 산화된 메티오닌의 퍼센트를 계산하고, 4℃에서 유지된 기준 물질과 비교한다.
결론:
이들 데이터는 본질적으로 임계 경쇄 메티오닌(M64 및 M71)의 완전한 산화를 갖는 돌연변이된 오말리주맙 Fab를 생성할 수 있다는 것을 시사한다. 이들 데이터를 기반으로, 1일째 날, 3일째 날 및 7일째 날 샘플로부터의 물질을 모았고 IgE-Fc에 대한 돌연변이된 오말리주맙 Fab의 친화성 및 IgE-Fc:sFcεRIα 복합체의 해리를 가속화하는 능력에 대한 메티오닌 산화의 영향을 확인하는 데 사용하였다.
실시예 9: FRET에 의한 sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 가속화된 해리의 측정
sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리에 대한 항-IgE Fab의 효과를 균질한 FRET 어세이에서 측정하였다. 모든 항-IgE Fab들을 HEK-293 세포에서 발현시키고 표준 방법으로 정제하였고, 계산된 몰 흡광 방법을 이용하여 280 nm에서 흡광도로 정량하였다. FRET 어세이는 Tb로 표지된 IgE-Fc를 공여자로서 사용하였고 알렉사488로 표지된 sFcεRIα를 수용자로서 사용하였다. 상기 두 시약들을 혼합하였고 1 nM의 최종 어세이 농도에서 60분 동안 실온에서 평형화시켰다. 항-IgE Fab를 500 nM의 최종 어세이 농도로 혼합물에 첨가하였고, 형광을 800분 동안 20분마다 판독하였다(330 nm에서 여기, 495 및 520 nm에서 방사). 형광 방사를 시간의 함수로서 작도하였고, sFcεRIα로부터의 IgE-Fc의 해리 속도를 복합체의 반감기로서 계산하였다. 이들 데이터는 표 10 및 11에 보고되어 있다.
결론:
이들 데이터는 돌연변이된 형태의 오말리주맙이 야생형 서열보다 더 빠른 속도로 sFcεRIα로부터 IgE-Fc를 해리시킬 수 있다는 것을 입증한다. 구체적으로, 이것을 가능하게 하는 경쇄 내의 돌연변이는 (서열번호 20과 관련하여) 위치 S64 및 S67에서의 돌연변이들을 포함하나, 반드시 이들로 한정되지는 않는다. 더욱이, 메티오닌(M64 및 M71, 서열번호 20)의 산화는 IgE-Fc:sFcεRIα 복합체의 해리를 가속화하는 Fab의 능력에 유의미한 효과를 갖지 않는다.
본 명세서는 본 발명의 실시형태들에 대하여 기재되어 있다. 그러나, 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자는 하기 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변형들 및 변화들을 만들 수 있다는 것을 인식한다. 따라서, 본 명세서는 제한 의미보다는 오히려 예시 의미로 간주되어야 하고, 모든 이러한 변형들은 본 발명의 범위 내에 포함되기 위한 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> UCB Biopharma sprl
<120> ANTI-IGE ANTIBODIES
<130> PF0087-WO
<150> GB1610198.2
<151> 2016-06-10
<160> 160
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region
<400> 2
gaagtgcagt tggtggagtc gggtggaggg ctggtgcagc ctggcggtag cctgaggctg 60
tcctgtgccg tgtccggata ctccattacc tccggctact cgtggaactg gatcagacag 120
gctcccggaa agggacttga gtgggtggcg tccatcacct acgacggctc aaccaactat 180
aacccgtccg tgaagggccg catcaccatt tcgcgcgacg acagcaagaa tactttttac 240
ctccaaatga acagcctgcg ggccgaagat actgccgtgt actactgcgc gcggggatca 300
cattacttcg ggcactggca cttcgccgtc tggggacagg gcaccctcgt cactgtctcg 360
agc 363
<210> 3
<211> 139
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region with signal sequence
<400> 3
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
35 40 45
Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 4
<211> 417
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region with signal sequence
<400> 4
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct ccagcgccta ctccgaagtg 60
cagttggtgg agtcgggtgg agggctggtg cagcctggcg gtagcctgag gctgtcctgt 120
gccgtgtccg gatactccat tacctccggc tactcgtgga actggatcag acaggctccc 180
ggaaagggac ttgagtgggt ggcgtccatc acctacgacg gctcaaccaa ctataacccg 240
tccgtgaagg gccgcatcac catttcgcgc gacgacagca agaatacttt ttacctccaa 300
atgaacagcc tgcgggccga agatactgcc gtgtactact gcgcgcgggg atcacattac 360
ttcgggcact ggcacttcgc cgtctgggga cagggcaccc tcgtcactgt ctcgagc 417
<210> 5
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v-region + gamma 1 CH1 constant region
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 6
<211> 672
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v-region + gamma 1 CH1 constant region
<400> 6
gaagtgcagt tggtggagtc gggtggaggg ctggtgcagc ctggcggtag cctgaggctg 60
tcctgtgccg tgtccggata ctccattacc tccggctact cgtggaactg gatcagacag 120
gctcccggaa agggacttga gtgggtggcg tccatcacct acgacggctc aaccaactat 180
aacccgtccg tgaagggccg catcaccatt tcgcgcgacg acagcaagaa tactttttac 240
ctccaaatga acagcctgcg ggccgaagat actgccgtgt actactgcgc gcggggatca 300
cattacttcg ggcactggca cttcgccgtc tggggacagg gcaccctcgt cactgtctcg 360
agcgcttcta caaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gt 672
<210> 7
<211> 242
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v-region + gamma 1 CH1 constant region with signal sequence
<400> 7
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
35 40 45
Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys
<210> 8
<211> 726
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v-region + gamma 1 CH1 constant region with signal sequence
<400> 8
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct ccagcgccta ctccgaagtg 60
cagttggtgg agtcgggtgg agggctggtg cagcctggcg gtagcctgag gctgtcctgt 120
gccgtgtccg gatactccat tacctccggc tactcgtgga actggatcag acaggctccc 180
ggaaagggac ttgagtgggt ggcgtccatc acctacgacg gctcaaccaa ctataacccg 240
tccgtgaagg gccgcatcac catttcgcgc gacgacagca agaatacttt ttacctccaa 300
atgaacagcc tgcgggccga agatactgcc gtgtactact gcgcgcgggg atcacattac 360
ttcgggcact ggcacttcgc cgtctgggga cagggcaccc tcgtcactgt ctcgagcgct 420
tctacaaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720
tcttgt 726
<210> 9
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v-region + gamma 1 full length constant region
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 10
<211> 1353
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v-region + gamma 1 full length constant region
<400> 10
gaagtgcagt tggtggagtc gggtggaggg ctggtgcagc ctggcggtag cctgaggctg 60
tcctgtgccg tgtccggata ctccattacc tccggctact cgtggaactg gatcagacag 120
gctcccggaa agggacttga gtgggtggcg tccatcacct acgacggctc aaccaactat 180
aacccgtccg tgaagggccg catcaccatt tcgcgcgacg acagcaagaa tactttttac 240
ctccaaatga acagcctgcg ggccgaagat actgccgtgt actactgcgc gcggggatca 300
cattacttcg ggcactggca cttcgccgtc tggggacagg gcaccctcgt cactgtctcg 360
agcgcttcta caaagggccc ctccgtgttc ccgctcgctc catcatcgaa gtctaccagc 420
ggaggcactg cggctctcgg ttgcctcgtg aaggactact tcccggagcc ggtgaccgtg 480
tcgtggaaca gcggagccct gaccagcggg gtgcacacct ttccggccgt cttgcagtca 540
agcggccttt actccctgtc atcagtggtg actgtcccgt ccagctcatt gggaacccaa 600
acctacatct gcaatgtgaa tcacaaacct agcaacacca aggttgacaa gaaagtcgag 660
cccaaatcgt gtgacaagac tcacacttgt ccgccgtgcc cggcacccga actgctggga 720
ggtcccagcg tctttctgtt ccctccaaag ccgaaagaca cgctgatgat ctcccgcacc 780
ccggaggtca cttgcgtggt cgtggacgtg tcacatgagg acccagaggt gaagttcaat 840
tggtacgtgg atggcgtcga agtccacaat gccaaaacta agcccagaga agaacagtac 900
aattcgacct accgcgtcgt gtccgtgctc acggtgttgc atcaggattg gctgaacggg 960
aaggaataca agtgcaaagt gtccaacaag gcgctgccgg caccgatcga gaaaactatc 1020
tccaaagcga agggacagcc tagggaacct caagtctaca cgctgccacc atcacgggaa 1080
gaaatgacta agaatcaagt ctcactgact tgtctggtga aggggtttta ccctagcgac 1140
attgccgtgg agtgggaatc caacggccag ccagagaaca actacaagac tacccctcca 1200
gtgctcgact cggatggatc gttcttcctt tactcgaagc tcaccgtgga taagtcccgg 1260
tggcagcagg gaaacgtgtt ctcctgctcg gtgatgcatg aagccctcca taaccactat 1320
acccaaaagt cgctgtccct gtcgccggga aag 1353
<210> 11
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v-region + gamma 1 full length constant region with signal
sequence
<400> 11
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
35 40 45
Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210> 12
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v-region + gamma 1 full length constant region with signal
sequence
<400> 12
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct ccagcgccta ctccgaagtg 60
cagttggtgg agtcgggtgg agggctggtg cagcctggcg gtagcctgag gctgtcctgt 120
gccgtgtccg gatactccat tacctccggc tactcgtgga actggatcag acaggctccc 180
ggaaagggac ttgagtgggt ggcgtccatc acctacgacg gctcaaccaa ctataacccg 240
tccgtgaagg gccgcatcac catttcgcgc gacgacagca agaatacttt ttacctccaa 300
atgaacagcc tgcgggccga agatactgcc gtgtactact gcgcgcgggg atcacattac 360
ttcgggcact ggcacttcgc cgtctgggga cagggcaccc tcgtcactgt ctcgagcgct 420
tctacaaagg gcccctccgt gttcccgctc gctccatcat cgaagtctac cagcggaggc 480
actgcggctc tcggttgcct cgtgaaggac tacttcccgg agccggtgac cgtgtcgtgg 540
aacagcggag ccctgaccag cggggtgcac acctttccgg ccgtcttgca gtcaagcggc 600
ctttactccc tgtcatcagt ggtgactgtc ccgtccagct cattgggaac ccaaacctac 660
atctgcaatg tgaatcacaa acctagcaac accaaggttg acaagaaagt cgagcccaaa 720
tcgtgtgaca agactcacac ttgtccgccg tgcccggcac ccgaactgct gggaggtccc 780
agcgtctttc tgttccctcc aaagccgaaa gacacgctga tgatctcccg caccccggag 840
gtcacttgcg tggtcgtgga cgtgtcacat gaggacccag aggtgaagtt caattggtac 900
gtggatggcg tcgaagtcca caatgccaaa actaagccca gagaagaaca gtacaattcg 960
acctaccgcg tcgtgtccgt gctcacggtg ttgcatcagg attggctgaa cgggaaggaa 1020
tacaagtgca aagtgtccaa caaggcgctg ccggcaccga tcgagaaaac tatctccaaa 1080
gcgaagggac agcctaggga acctcaagtc tacacgctgc caccatcacg ggaagaaatg 1140
actaagaatc aagtctcact gacttgtctg gtgaaggggt tttaccctag cgacattgcc 1200
gtggagtggg aatccaacgg ccagccagag aacaactaca agactacccc tccagtgctc 1260
gactcggatg gatcgttctt cctttactcg aagctcaccg tggataagtc ccggtggcag 1320
cagggaaacg tgttctcctg ctcggtgatg catgaagccc tccataacca ctatacccaa 1380
aagtcgctgt ccctgtcgcc gggaaag 1407
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR H1
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser
20 25
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDRH1
<400> 14
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser Trp Asn
1 5 10
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR H2
<400> 15
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDRH2
<400> 16
Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR H3
<400> 17
Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDRH3
<400> 18
Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR H4
<400> 19
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 20
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region light
<400> 20
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 21
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region light
<400> 21
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtat 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgcctcata ccttgaaagc 180
ggcgtgcctt cgcgcttctc gggaagcggg tcgggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
tcgctgcagc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggaaccaa ggtcgaaatc aag 333
<210> 22
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region light with signal sequence
<400> 22
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
35 40 45
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys
<210> 23
<211> 387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region light with signal sequence
<400> 23
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctccgccta ctccgatatt 60
cagctgactc agagcccgag ctcactctcc gcttccgtgg gggatagagt gaccatcact 120
tgccgggcat cccagtcggt ggactacgac ggagactcct acatgaactg gtatcagcag 180
aagcccggaa aagccccaaa gttgctgatc tacgccgcct cataccttga aagcggcgtg 240
ccttcgcgct tctcgggaag cgggtcgggc accgatttca ccctgaccat ttcgtcgctg 300
cagccggagg acttcgcgac ttactactgc caacagtccc acgaggaccc ctatacgttt 360
ggccagggaa ccaaggtcga aatcaag 387
<210> 24
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region light + kappa constant region
<400> 24
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 25
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region + kappa constant region
<400> 25
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtat 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgcctcata ccttgaaagc 180
ggcgtgcctt cgcgcttctc gggaagcggg tcgggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
tcgctgcagc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggaaccaa ggtcgaaatc aagcgtacgg tagcggcccc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 26
<211> 236
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region + kappa constant region with signal sequence
<400> 26
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
35 40 45
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 27
<211> 708
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V-region + kappa constant region with signal seque
<400> 27
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctccgccta ctccgatatt 60
cagctgactc agagcccgag ctcactctcc gcttccgtgg gggatagagt gaccatcact 120
tgccgggcat cccagtcggt ggactacgac ggagactcct acatgaactg gtatcagcag 180
aagcccggaa aagccccaaa gttgctgatc tacgccgcct cataccttga aagcggcgtg 240
ccttcgcgct tctcgggaag cgggtcgggc accgatttca ccctgaccat ttcgtcgctg 300
cagccggagg acttcgcgac ttactactgc caacagtccc acgaggaccc ctatacgttt 360
ggccagggaa ccaaggtcga aatcaagcgt acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc 420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 708
<210> 28
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L1
<400> 28
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDRL1
<400> 29
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L2
<400> 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDRL2
<400> 31
Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
1 5
<210> 32
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3
<400> 32
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDRL3
<400> 33
Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L4
<400> 34
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 35
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S77R_Q79R_v-region
<400> 35
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Met
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 36
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S77R_Q79R_v-region
<400> 36
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtat 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgcctcata ccttgaaagc 180
ggcgtgccta tgcgcttctc gggaagcggg tcgggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
agactgaggc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggaaccaa ggtcgaaatc aag 333
<210> 37
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S77R_Q79R_v-region with signal sequence
<400> 37
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
35 40 45
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys
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<211> 387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S77R_Q79R_v-region with signal sequence
<400> 38
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tgccgggcat cccagtcggt ggactacgac ggagactcct acatgaactg gtatcagcag 180
aagcccggaa aagccccaaa gttgctgatc tacgccgcct cataccttga aagcggcgtg 240
cctatgcgct tctcgggaag cgggtcgggc accgatttca ccctgaccat ttcgagactg 300
aggccggagg acttcgcgac ttactactgc caacagtccc acgaggaccc ctatacgttt 360
ggccagggaa ccaaggtcga aatcaag 387
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S77R_Q79R_v-region + kappa constant region including L154P
<400> 39
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Met
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Pro Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> S60M_S77R_Q79R_v-region + kappa constant region including L154P
<400> 40
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cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgcctcata ccttgaaagc 180
ggcgtgccta tgcgcttctc gggaagcggg tcgggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
agactgaggc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggaaccaa ggtcgaaatc aagcgtacgg tagcggcccc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cccgcaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
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<223> S60M_S77R_Q79R_v-region + kappa constant region including L154P
with signal sequence
<400> 41
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
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Tyr Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
35 40 45
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Pro
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
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Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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with signal sequence
<400> 42
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctccgccta ctccgatatt 60
cagctgactc agagcccgag ctcactctcc gcttccgtgg gggatagagt gaccatcact 120
tgccgggcat cccagtcggt ggactacgac ggagactcct acatgaactg gtatcagcag 180
aagcccggaa aagccccaaa gttgctgatc tacgccgcct cataccttga aagcggcgtg 240
cctatgcgct tctcgggaag cgggtcgggc accgatttca ccctgaccat ttcgagactg 300
aggccggagg acttcgcgac ttactactgc caacagtccc acgaggaccc ctatacgttt 360
ggccagggaa ccaaggtcga aatcaagcgt acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc 420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccccgca atcgggtaac 540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 708
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<211> 32
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<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Gly Val Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
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<212> PRT
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Gly Val Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<211> 7
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<213> Artificial Sequence
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Ala Ala Glu Tyr Leu Glu Ser
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<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Gly Val Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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<211> 32
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Gly Val Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S81R Q83R S80N S77R Q79R S76N
<400> 74
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 75
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S81R Q83R S80N S60M S77R Q79R S76N
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<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S80N S67Y S60M S76N S63Y
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S81R S80N S67Y S77R S76N S63Y
<400> 78
Gly Val Pro Ser Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S81R S80N S67Y S60M S77R S76N S63Y
<400> 80
Gly Val Pro Met Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 81
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M Q83R S80N S67Y S60M Q79R S76N S63Y
<400> 81
Gly Val Pro Met Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 82
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S81R Q83R S80N S67Y S77R Q79R S76N S63Y
<400> 82
Gly Val Pro Ser Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 83
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S81R Q83R S80N S67Y S60M S77R Q79R S76N S63Y
<400> 83
Gly Val Pro Met Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 84
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S67Y S71M S63Y S67M
<400> 84
Gly Val Pro Ser Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 85
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S67Y S71M S60M S63Y S67M
<400> 85
Gly Val Pro Met Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S81R S67Y S71M S77R S63Y S67M
<400> 86
Gly Val Pro Ser Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 Q83R S67Y S71M Q79R S63Y S67M
<400> 87
Gly Val Pro Ser Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S81R S67Y S71M S60M S77R S63Y S67M
<400> 88
Gly Val Pro Met Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M Q83R S67Y S71M S60M Q79R S63Y S67M
<400> 89
Gly Val Pro Met Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 90
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S81R Q83R S67Y S71M S77R Q79R S63Y S67M
<400> 90
Gly Val Pro Ser Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 91
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S81R Q83R S67Y S71M S60M S77R Q79R S63Y S67M
<400> 91
Gly Val Pro Met Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 92
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 92
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 93
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S80N S71M S60M S76N S67M (
<400> 93
Gly Val Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 94
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S81R S80N S71M S77R S76N S67M
<400> 94
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 95
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 Q83R S80N S71M Q79R S76N S67M
<400> 95
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 96
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S81R S80N S71M S60M S77R S76N S67M
<400> 96
Gly Val Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 97
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M Q83R S80N S71M S60M Q79R S76N S67M
<400> 97
Gly Val Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 98
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S81R Q83R S80N S71M S77R Q79R S76N S67M
<400> 98
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 99
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S81R Q83R S80N S71M S60M S77R Q79R S76N S67M
<400> 99
Gly Val Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 100
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S80N S67Y S71M S76N S63Y S67M
<400> 100
Gly Val Pro Ser Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 101
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S80N S67Y S71M S60M S76N S63Y S67M
<400> 101
Gly Val Pro Met Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 102
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S81R S80N S67Y S71M S77R S76N S63Y S67M
<400> 102
Gly Val Pro Ser Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 103
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 Q83R S80N S67Y S71M Q79R S76N S63Y S67M
<400> 103
Gly Val Pro Ser Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 104
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S81R S80N S67Y S71M S60M S77R S76N S63Y S67M
<400> 104
Gly Val Pro Met Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 105
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M Q83R S80N S67Y S71M S60M Q79R S76N S63Y S67M
<400> 105
Gly Val Pro Met Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 106
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S81R Q83R S80N S67Y S71M S77R Q79R S76N S63Y S67M
<400> 106
Gly Val Pro Ser Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 107
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR L3 S64M S81R Q83R S80N S67Y S71M S60M S77R Q79R S76N S63Y
S67M
<400> 107
Pro Met Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
1 5 10 15
Ile Asn Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 108
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wild-type human IgE-Fc (CE2-CE4 domains with numbering V224-K547
according to Dorrington & Bennich (1978)
<400> 108
Val Ala Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser
1 5 10 15
Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys
20 25 30
Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu
35 40 45
Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln
50 55 60
Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys
65 70 75 80
His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly
85 90 95
His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg
100 105 110
Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile
115 120 125
Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser
130 135 140
Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val
145 150 155 160
Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr
165 170 175
Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu
180 185 190
Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met
195 200 205
Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr
210 215 220
Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu
225 230 235 240
Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp
245 250 255
Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln
260 265 270
Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu
275 280 285
Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala
290 295 300
Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser
305 310 315 320
Val Asn Pro Gly Lys
325
<210> 109
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S77R_Q79R_v-region (Fab1)
<400> 109
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 110
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 77R_Q79R_v-region (Fab1)
<400> 110
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtac 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgcctccta ccttgaaagc 180
ggcgtgcctt cacgcttctc gggaagcggg tctggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
agactgaggc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggtaccaa ggtcgaaatc aag 333
<210> 111
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S77R_Q79R_v-region (Fab1) with signal sequence
<400> 111
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
35 40 45
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys
<210> 112
<211> 387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S77R_Q79R_v-region (Fab1) with signal sequence
<400> 112
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctccgccta ctccgatatt 60
cagctgactc agagcccgag ctcactctcc gcttccgtgg gggatagagt gaccatcact 120
tgccgggcat cccagtcggt ggactacgac ggagactcct acatgaactg gtaccagcag 180
aagcccggaa aagccccaaa gttgctgatc tacgccgcct cctaccttga aagcggcgtg 240
ccttcacgct tctcgggaag cgggtctggc accgatttca ccctgaccat ttcgagactg 300
aggccggagg acttcgcgac ttactactgc caacagtccc acgaggaccc ctatacgttt 360
ggccagggta ccaaggtcga aatcaag 387
<210> 113
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab2_v-region
<400> 113
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 114
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab2_v-region
<400> 114
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtat 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgcctcata ccttgaaagc 180
ggcgtgcctt cgcgcttctc gggaagcggg tcgggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
tcgctgcagc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggaaccaa ggtcgaaatc aag 333
<210> 115
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab2_v-region with signal sequence
<400> 115
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
35 40 45
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys
<210> 116
<211> 387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab2_v-region with signal sequence
<400> 116
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctccgccta ctccgatatt 60
cagctgactc agagcccgag ctcactctcc gcttccgtgg gggatagagt gaccatcact 120
tgccgggcat cccagtcggt ggactacgac ggagactcct acatgaactg gtatcagcag 180
aagcccggaa aagccccaaa gttgctgatc tacgccgcct cataccttga aagcggcgtg 240
ccttcgcgct tctcgggaag cgggtcgggc accgatttca ccctgaccat ttcgtcgctg 300
cagccggagg acttcgcgac ttactactgc caacagtccc acgaggaccc ctatacgttt 360
ggccagggaa ccaaggtcga aatcaag 387
<210> 117
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab2_v-region + kappa constant region including L154P
<400> 117
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Pro Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 118
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab2_v-region + kappa constant region including L154P
<400> 118
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtat 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgcctcata ccttgaaagc 180
ggcgtgcctt cgcgcttctc gggaagcggg tcgggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
tcgctgcagc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggaaccaa ggtcgaaatc aagcgtacgg tagcggcccc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cccgcaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 119
<211> 236
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab2_v-region + kappa constant region including L154P with signal
sequence
<400> 119
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
35 40 45
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Pro
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 120
<211> 708
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab2_v-region + kappa constant region including L154P with signal
sequence
<400> 120
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctccgccta ctccgatatt 60
cagctgactc agagcccgag ctcactctcc gcttccgtgg gggatagagt gaccatcact 120
tgccgggcat cccagtcggt ggactacgac ggagactcct acatgaactg gtatcagcag 180
aagcccggaa aagccccaaa gttgctgatc tacgccgcct cataccttga aagcggcgtg 240
ccttcgcgct tctcgggaag cgggtcgggc accgatttca ccctgaccat ttcgtcgctg 300
cagccggagg acttcgcgac ttactactgc caacagtccc acgaggaccc ctatacgttt 360
ggccagggaa ccaaggtcga aatcaagcgt acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc 420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccccgca atcgggtaac 540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 708
<210> 121
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab3_S77R_Q79R_v-region
<400> 121
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 122
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab3_S77R_Q79R_v-region
<400> 122
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtac 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgcctccta ccttgaaagc 180
ggcgtgcctt cacgcttctc gggaagcggg tctggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
agactgaggc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggtaccaa ggtcgaaatc aag 333
<210> 123
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab3_S77R_Q79R_v-region with signal sequence
<400> 123
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
35 40 45
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys
<210> 124
<211> 387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab3_S77R_Q79R_v-region with signal sequence
<400> 124
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctccgccta ctccgatatt 60
cagctgactc agagcccgag ctcactctcc gcttccgtgg gggatagagt gaccatcact 120
tgccgggcat cccagtcggt ggactacgac ggagactcct acatgaactg gtaccagcag 180
aagcccggaa aagccccaaa gttgctgatc tacgccgcct cctaccttga aagcggcgtg 240
ccttcacgct tctcgggaag cgggtctggc accgatttca ccctgaccat ttcgagactg 300
aggccggagg acttcgcgac ttactactgc caacagtccc acgaggaccc ctatacgttt 360
ggccagggta ccaaggtcga aatcaag 387
<210> 125
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab3_S77R_Q79R_v-region + kappa constant region including L154P
<400> 125
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Pro Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 126
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab3_S77R_Q79R_v-region + kappa constant region including L154P
<400> 126
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtac 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgcctccta ccttgaaagc 180
ggcgtgcctt cacgcttctc gggaagcggg tctggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
agactgaggc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggtaccaa ggtcgaaatc aagcgtacgg tagcggcccc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cccgcaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 127
<211> 236
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab3_S77R_Q79R_v-region + kappa constant region including L154P
with signal sequence
<400> 127
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
35 40 45
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Pro
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 128
<211> 708
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fab3_S77R_Q79R_v-region + kappa constant region including L154P
with signal sequence
<400> 128
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctccgccta ctccgatatt 60
cagctgactc agagcccgag ctcactctcc gcttccgtgg gggatagagt gaccatcact 120
tgccgggcat cccagtcggt ggactacgac ggagactcct acatgaactg gtaccagcag 180
aagcccggaa aagccccaaa gttgctgatc tacgccgcct cctaccttga aagcggcgtg 240
ccttcacgct tctcgggaag cgggtctggc accgatttca ccctgaccat ttcgagactg 300
aggccggagg acttcgcgac ttactactgc caacagtccc acgaggaccc ctatacgttt 360
ggccagggta ccaaggtcga aatcaagcgt acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc 420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccccgca atcgggtaac 540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 708
<210> 129
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Omalizumab_v-region
<400> 129
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
1 5 10 15
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 130
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Omalizumab_v-region
<400> 130
actcagagcc cgagctcact ctccgcttcc gtgggggata gagtgaccat cacttgccgg 60
gcatcccagt cggtggacta cgacggagac tcctacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggaaaagccc caaagttgct gatctacgcc gcctcatacc ttgaaagcgg cgtgccttcg 180
cgcttctcgg gaagcgggtc gggcaccgat ttcaccctga ccatttcgtc gctgcagccg 240
gaggacttcg cgacttacta ctgccaacag tcccacgagg acccctatac gtttggccag 300
ggaaccaagg tcgaaatcaa g 321
<210> 131
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR3
<400> 131
Gly Val Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 132
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region
<400> 132
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Met
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 133
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region
<400> 133
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtat 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgccgacta ccttgaaagc 180
ggcgtgccta tgcgcttctc gggaagcggg atgggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
agactgaggc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggaaccaa ggtcgaaatc aag 333
<210> 134
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region with signal sequence
<400> 134
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
35 40 45
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Met Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys
<210> 135
<211> 387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region with signal sequence
<400> 135
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctccgccta ctccgatatt 60
cagctgactc agagcccgag ctcactctcc gcttccgtgg gggatagagt gaccatcact 120
tgccgggcat cccagtcggt ggactacgac ggagactcct acatgaactg gtatcagcag 180
aagcccggaa aagccccaaa gttgctgatc tacgccgccg actaccttga aagcggcgtg 240
cctatgcgct tctcgggaag cgggatgggc accgatttca ccctgaccat ttcgagactg 300
aggccggagg acttcgcgac ttactactgc caacagtccc acgaggaccc ctatacgttt 360
ggccagggaa ccaaggtcga aatcaag 387
<210> 136
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region + kappa constant region
<400> 136
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Met
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 137
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region + kappa constant region
<400> 137
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtat 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgccgacta ccttgaaagc 180
ggcgtgccta tgcgcttctc gggaagcggg atgggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
agactgaggc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggaaccaa ggtcgaaatc aagcgtacgg tagcggcccc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 138
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR3
<400> 138
Gly Val Pro Arg Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 139
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60R_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region
<400> 139
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Arg
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 140
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60R_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region
<400> 140
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtat 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgccgatta ccttgaaagc 180
ggcgtgcctc gtcgcttctc gggaagcggg atgggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
agactgaggc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggaaccaa ggtcgaaatc aag 333
<210> 141
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60R_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region with signal sequence
<400> 141
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
35 40 45
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Arg Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys
<210> 142
<211> 387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60R_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region with signal sequence
<400> 142
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctccgccta ctccgatatt 60
cagctgactc agagcccgag ctcactctcc gcttccgtgg gggatagagt gaccatcact 120
tgccgggcat cccagtcggt ggactacgac ggagactcct acatgaactg gtatcagcag 180
aagcccggaa aagccccaaa gttgctgatc tacgccgccg attaccttga aagcggcgtg 240
cctcgtcgct tctcgggaag cgggatgggc accgatttca ccctgaccat ttcgagactg 300
aggccggagg acttcgcgac ttactactgc caacagtccc acgaggaccc ctatacgttt 360
ggccagggaa ccaaggtcga aatcaag 387
<210> 143
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60R_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region + kappa constant region
<400> 143
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Arg
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 144
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60R_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region + kappa constant region
<400> 144
gatattcagc tgactcagag cccgagctca ctctccgctt ccgtggggga tagagtgacc 60
atcacttgcc gggcatccca gtcggtggac tacgacggag actcctacat gaactggtat 120
cagcagaagc ccggaaaagc cccaaagttg ctgatctacg ccgccgatta ccttgaaagc 180
ggcgtgcctc gtcgcttctc gggaagcggg atgggcaccg atttcaccct gaccatttcg 240
agactgaggc cggaggactt cgcgacttac tactgccaac agtcccacga ggacccctat 300
acgtttggcc agggaaccaa ggtcgaaatc aagcgtacgg tagcggcccc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 145
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60K_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region
<400> 145
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Lys
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 146
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60Q_S52D_S67M_S77R_Q79R_v-region
<400> 146
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Gln
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 147
<211> 506
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v-region + gamma 1 CH1 constant region plus linker plus CA645
gL4gH5 scFv with signal sequence
<400> 147
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
35 40 45
Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
245 250 255
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn
275 280 285
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile
290 295 300
Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe
305 310 315 320
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
325 330 335
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val
340 345 350
Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
385 390 395 400
Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
405 410 415
Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln
420 425 430
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys
435 440 445
Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
450 455 460
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
465 470 475 480
Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr Phe Gly
485 490 495
Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
500 505
<210> 148
<211> 1518
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v-region + gamma 1 CH1 constant region plus linker plus CA645
gL4gH5 scFv with signal sequence
<400> 148
atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct ccagcgccta ctccgaagtg 60
cagttggtgg agtcgggtgg agggctggtg cagcctggcg gtagcctgag gctgtcctgt 120
gccgtgtccg gatactccat tacctccggc tactcgtgga actggatcag acaggctccc 180
ggaaagggac ttgagtgggt ggcgtccatc acctacgacg gctcaaccaa ctataacccg 240
tccgtgaagg gccgcatcac catttcgcgc gacgacagca agaatacttt ttacctccaa 300
atgaacagcc tgcgggccga agatactgcc gtgtactact gcgcgcgggg atcacattac 360
ttcgggcact ggcacttcgc cgtctgggga cagggcaccc tcgtcactgt ctcgagcgct 420
tctacaaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccagtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggtg ccctgaccag cggcgttcac accttcccgg ctgtcctaca gtcttcagga 600
ctctactccc tgagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtcg ataagaaagt tgagcccaaa 720
tcttgtagtg gaggtggggg caccggtgga ggtggcagcg aggttcaact gcttgagtct 780
ggaggaggcc tagtccagcc tggagggagc ctgcgtctct cttgtgcagt aagcggcatc 840
gacctgagca attacgccat caactgggtg agacaagctc cggggaagtg tttagaatgg 900
atcggtataa tatgggccag tgggacgacc ttttatgcta catgggcgaa aggaaggttt 960
acaattagcc gggacaatag caaaaacacc gtgtatctcc aaatgaactc cttgcgagca 1020
gaggacacgg cggtgtacta ttgtgctcgc actgtcccag gttatagcac tgcaccctac 1080
ttcgatctgt ggggacaagg gaccctggtg actgtttcaa gtggcggagg gggtagtgga 1140
gggggtggct ctgggggtgg cggaagcggt ggcgggggtt ctgacataca aatgactcag 1200
tctccttcat cggtatccgc gtccgttggc gatagggtga ctattacatg tcaaagctct 1260
cctagcgtct ggagcaattt tctatcctgg tatcaacaga aaccggggaa ggctccaaaa 1320
cttctgattt atgaagcctc gaaactcacc agtggagttc cgtcaagatt cagtggctct 1380
ggatcaggga cagacttcac gttgacaatc agttcgctgc aaccagagga ctttgcgacc 1440
tactattgtg gtggaggtta cagtagcata agtgatacga catttgggtg cggtactaag 1500
gtggaaatca aacgtacc 1518
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker between CH1 and CA645 gL4gH5 scFv
<400> 149
Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 150
<211> 253
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 gL4gH5 scFv
<400> 150
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu
180 185 190
Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
245 250
<210> 151
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker between CA645 gH5 and CA645 gL4 within scFv
<400> 151
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 CDRH1
<400> 152
Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 153
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 CDRH2
<400> 153
Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 154
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 CDRH3
<400> 154
Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 155
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 CDRL1
<400> 155
Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
1 5 10
<210> 156
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 CDRL2
<400> 156
Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser
1 5
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 CDRL3
<400> 157
Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr
1 5 10
<210> 158
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_S63W_S76N_v-region
<400> 158
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Met
50 55 60
Arg Phe Trp Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 159
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S60M_S52D_S67M_S77R_Q79R_S63Y_S76N_v-region
<400> 159
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Met
50 55 60
Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Met Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Arg Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 160
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Signal sequence
<400> 160
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser
Claims (152)
- 서열번호 108과 관련하여 인간 IgE의 Cε3 도메인의 잔기 T373, W374, S375, R376, A377, S378, G379, P381, Q417, C418, R419, T421, P426, R427, A428, 및 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 D278 및 T281을 포함하는 에피토프와 접촉하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항에 있어서, 인간 IgE의 Cε3 도메인의 잔기 K380을 추가로 포함하는 에피토프와 접촉하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 IgE의 Cε3 도메인의 잔기 M430을 추가로 포함하는 에피토프와 접촉하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 D276을 추가로 포함하는 에피토프와 접촉하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 V277을 추가로 포함하는 에피토프와 접촉하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 L279를 추가로 포함하는 에피토프와 접촉하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 S280을 추가로 포함하는 에피토프와 접촉하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 A282(및/또는 T298)를 추가로 포함하는 에피토프와 접촉하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Cε3 도메인 및 Cε2 도메인이 인간 IgE의 서로 다른 쇄에 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에피토프에 특이적인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 경우에 따라 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 18인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 29인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질과 인간 IgE의 Cε2 도메인의 상호작용을 강화시키기 위해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그보다 많은 아미노산 치환을 갖는, 서열번호 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L3을 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항에 있어서, FR-L3 영역이 서열번호 129와 관련하여 위치 S60, S63, S76, S77 및/또는 Q79(카바트(Kabat))에서 다른 천연 아미노산들 중 하나로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S60(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 하나로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S60(카바트)에서 M, R, K, N, Q 또는 T로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S60(카바트)에서 M으로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S63(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 하나로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S63(카바트)에서 W 또는 Y로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S63(카바트)에서 Y로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S76(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 하나로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S76(카바트)에서 N으로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S77(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 하나로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S77(카바트)에서 R 또는 K로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S77(카바트)에서 R로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 Q79(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 하나로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 Q79(카바트)에서 R 또는 K로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 Q79(카바트)에서 R로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 FR-L3 영역의 아미노산 서열이 서열번호 43 내지 49, 60 내지 83, 131 또는 138로부터 선택되는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, FR-L3 영역이 인간 IgE에 대한 친화성을 개선하기 위해(KD를 낮추기 위해) 위치 S67(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 하나로 더 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제28항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S67(카바트)에서 M, E 또는 D로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제29항에 있어서, 돌연변이된 FR-L3 영역의 아미노산 서열이 서열번호 53 내지 59, 84 내지 107, 131 또는 138로부터 선택되는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 경우에 따라 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 18인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 29인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질과 인간 IgE의 Cε2 도메인의 상호작용을 강화시키기 위해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그보다 많은 아미노산 치환을 갖는, 서열번호 28인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L1을 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제31항에 있어서, FR-L1 영역이 서열번호 20과 관련하여 위치 G16 및/또는 R18(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 하나로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호 31인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L2를 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제33항에 있어서, CDR-L2 영역이 인간 IgE에 대한 친화성을 개선하기 위해(KD를 낮추기 위해) 서열번호 129와 관련하여 위치 S52(카바트)에서 다른 천연 아미노산들 중 하나로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제34항에 있어서, CDR-L2 영역이 위치 S52(카바트)에서 E, D, Q 또는 R로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제35항에 있어서, CDR-L2 영역이 위치 S52(카바트)에서 D(바람직하게는) 또는 E로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 CDR-L2 영역의 아미노산 서열이 서열번호 50 또는 서열번호 51로부터 선택되는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 14인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H1을 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 16인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H2를 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호 33인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L3을 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 13인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H1을 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 15인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H2를 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 17인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H3을 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 19인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H4를 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호 30인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L2를 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호 34인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L4를 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역 VL이, 서열번호 160인 아미노산 서열을 갖는 신호 서열을 경우에 따라 포함하는, 서열번호 35, 서열번호 132, 또는 서열번호 134, 또는 서열번호 139 또는 서열번호 141, 또는 서열번호 145 및 146, 또는 서열번호 158 및 159로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역 VH가 서열번호 1인 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제49항에 있어서, 경쇄 불변 영역이 카파 불변 영역인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 경쇄 불변 영역이 돌연변이 L154P(카바트)를 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL이, 서열번호 160인 아미노산 서열을 갖는 신호 서열을 경우에 따라 포함하는, 서열번호 39, 또는 서열번호 41, 또는 서열번호 117, 또는 서열번호 119, 또는 서열번호 125, 또는 서열번호 127 또는 서열번호 136, 또는 서열번호 143으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역 CH1을 추가로 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제53항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역 VH-CH1이 서열번호 5인 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제11항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 Fc 영역 Fc를 추가로 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제55항에 있어서, Fc가 인간 IgG1 또는 인간 IgG4로부터 유래하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제55항 또는 제56항에 있어서, 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역 및 중쇄 Fc 영역 VH-CH1-Fc가 서열번호 9인 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 서열번호 18인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 29인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질로서,
a. 경쇄 가변 영역이 서열번호 32인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L3을 추가로 포함하고, FR-L3 영역이 인간 IgE에 대한 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 친화성을 개선하기 위해(KD를 낮추기 위해) 위치 S67(카바트, 서열번호 129와 관련하여)에서 다른 천연 아미노산들 중 하나로 돌연변이되어 있고/있거나;
b. 경쇄 가변 영역이 서열번호 31인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L2를 추가로 포함하고, CDR-L2 영역이 인간 IgE에 대한 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 친화성을 개선하기 위해(KD를 낮추기 위해) 위치 S52(카바트, 서열번호 129와 관련하여)에서 다른 천연 아미노산들 중 하나로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질. - 제58항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S67에서 M, E 또는 D로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제59항에 있어서, FR-L3 영역이 위치 S67(카바트)에서 M으로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제60항에 있어서, 돌연변이된 FR-L3 영역의 아미노산 서열이 서열번호 52 내지 59, 84 내지 107, 131 또는 138로부터 선택되는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, CDR-L2 영역이 위치 S52(카바트)에서 E, D, Q 또는 R로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제62항에 있어서, CDR-L2 영역이 위치 S52(카바트)에서 D 또는 E로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제63항에 있어서, CDR-L2 영역이 위치 S52(카바트)에서 D로 돌연변이되어 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제63항 또는 제64항에 있어서, 돌연변이된 CDR-L2 영역의 아미노산 서열이 서열번호 50(바람직하게는) 또는 서열번호 51로부터 선택되는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 14인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H1을 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 16인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H2를 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호 33인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L3을 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 13인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H1을 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 15인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H2를 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 17인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H3을 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 19인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-H4를 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호 30인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L2를 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호 34인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FR-L4를 추가로 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역 VL이 연속하는 FR-L1, CDR-L1, FR-L2, CDR-L2, FR-L3, CDR-L3 및 FR-L4 영역을 포함하고, 서열번호 20인 아미노산 서열을 가지며, 단, 상기 CDR-L2 영역은 서열번호 50 또는 서열번호 51로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역 VL이 연속하는 FR-L1, CDR-L1, FR-L2, CDR-L2, FR-L3, CDR-L3 및 FR-L4 영역을 포함하고, 서열번호 20인 아미노산 서열을 가지며, 단, 상기 FR-L3 영역은 서열번호 52인 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역 VL이 연속하는 FR-L1, CDR-L1, FR-L2, CDR-L2, FR-L3, CDR-L3 및 FR-L4 영역을 포함하고, 서열번호 20인 아미노산 서열을 가지며, 단, 상기 CDR-L2 영역은 서열번호 50 또는 서열번호 51로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고, 상기 FR-L3 영역은 서열번호 52, 131 또는 138로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역 VH가 서열번호 1인 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제79항에 있어서, 경쇄 불변 영역이 카파 불변 영역인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제79항 또는 제80항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL이 서열번호 24인 아미노산 서열을 가지며, 단, CDR-L2 영역은 서열번호 50 또는 서열번호 51로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제79항 또는 제80항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL이 서열번호 24인 아미노산 서열을 가지며, 단, FR-L3 영역은 서열번호 52인 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제79항 또는 제80항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL이 서열번호 24인 아미노산 서열을 가지며, 단, CDR-L2 영역은 서열번호 50 또는 서열번호 51로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고, FR-L3 영역은 서열번호 52, 131 또는 138로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질로서,
a. 중쇄 가변 영역이 서열번호 14인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 16인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 18인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 29인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 50인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 서열번호 33인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3, 및 서열번호 131 또는 138인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FW-L3을 포함하거나;
b. 중쇄 가변 영역이 서열번호 1인 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 132 또는 139로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질. - 제84항에 있어서, 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질로서, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL이, 서열번호 160인 아미노산 서열을 갖는 신호 서열을 경우에 따라 포함하는, 서열번호 137 또는 145로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역 CH1을 추가로 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제86항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역 VH-CH1이 서열번호 5인 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제58항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 Fc 영역 Fc를 추가로 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제88항에 있어서, Fc가 인간 IgG1 또는 인간 IgG4로부터 유래하는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제88항 또는 제89항에 있어서, 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역 및 중쇄 Fc 영역 VH-CH1-Fc가 서열번호 9인 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 길이 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 단편, 변형된 Fab' 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv, scFv, scab, 디아바디(diabody), 이중특이적 항체, 트리아바디(triabody), FabFv, Fab-Fv-Fv, 트리바디(tribody) 또는 (Fab-Fv)2-Fc로 구성된 군으로부터 선택되는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제92항에 있어서, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 캐리어 단백질에 결합하는 scFv에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된 Fab 단편인 항-IgE 항체.
- 제93항에 있어서, scFv가, 바람직하게는 서열번호 151을 갖는 링커를 통해 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열번호 152인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 153인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열번호 154인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 155인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 156인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 157인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함하는 것인 항-IgE 항체.
- 제93항 또는 제94항에 있어서, scFv가 서열번호 150인 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체.
- 제93항 또는 제94항에 있어서, Fab 단편이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고,
a. 중쇄 가변 영역이 서열번호 14인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 16인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 18인 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 29인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 50인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 서열번호 33인 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3, 및 서열번호 131 또는 138인 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 FW-L3을 포함하거나;
b. 중쇄 가변 영역이 서열번호 1인 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 132 또는 139로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-IgE 항체. - 제96항에 있어서, Fab 단편이 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역 VL-CH1이 서열번호 5인 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 VL-CL이, 서열번호 160인 아미노산 서열을 갖는 신호 서열을 경우에 따라 포함하는, 서열번호 136 또는 143으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체.
- 제93항 또는 제97항에 있어서, scFv가 서열번호 149인 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 Fab 단편의 CH1에 연결되는 것인 항-IgE 항체.
- 제93항 또는 제98항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역, 링커 및 scFv가, 서열번호 160인 아미노산 서열을 갖는 신호 서열을 경우에 따라 포함하는, 서열번호 147인 아미노산 서열을 갖는 것인 항-IgE 항체.
- 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 또는 리포터 분자가 부착되어 있는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실화되어 있고/있거나, 전분, 알부민 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로부터 선택되는 중합체에 접합된 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제101항에 있어서, 중합체가 5 내지 50 kDa 범위 내의 분자량을 갖는 PEG인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)을 코딩하는 단리된 DNA 서열.
- 제104항에 따른 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
- 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 또는 서열번호 42, 또는 서열번호 133, 또는 서열번호 135, 또는 서열번호 137, 또는 서열번호 140, 또는 서열번호 142, 또는 서열번호 144로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
- 제106항에 있어서, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 또는 서열번호 12 또는 서열번호 148로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 서열을 추가로 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
- 제105항 내지 제107항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제108항에 있어서, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 또는 서열번호 12 또는 서열번호 148로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질을 제조하는 방법으로서, 제108항 또는 제109항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질을 단리하는 단계를 포함하는 방법.
- 1종 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여, 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질을 포함하는 약학 조성물.
- 제111항에 있어서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 희석제 ㎖당 50 내지 200 mg, 바람직하게는 150 mg의 용량으로 존재하는 것인 약학 조성물.
- 제111항 또는 제112항에 있어서, 부형제가 L-아르기닌을 포함하는 것인 약학 조성물.
- 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 부형제가 L-히스티딘을 포함하는 것인 약학 조성물.
- 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 부형제가 폴리소르베이트 20을 포함하는 것인 약학 조성물.
- 제111항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 희석제가 물인 약학 조성물.
- 제111항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 피하 투여를 위해 멸균 주사기 내에 담지된 약학 조성물.
- 제111항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 75 내지 600 mg의 총 용량으로 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질을 함유하는 약학 조성물.
- 제111항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질과 함께, 또는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질과 별도로 공투여하기 위한 다른 활성 성분을 추가로 포함하는 약학 조성물.
- 제119항에 있어서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 알레르기에 기초한 특이적 면역요법과 별도로 공투여되는 것인 약학 조성물.
- 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 약학 조성물.
- 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 약학 조성물.
- 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgE와 FcεRI의 복합체와 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 약학 조성물.
- 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgE와 FcεRI의 복합체의 해리, 및 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질에 의한 인간 IgE의 결합을 통해 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 약학 조성물.
- 제1항 내지 제103항 및 제111항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 알레르기; 알레르기성 천식; 중증 천식; 중등증 천식; 만성 자발성 두드러기; 만성 특발성 두드러기; 통년성 알레르기성 비염; 계절성 알레르기성 비염; 급성 천식 악화; 급성 기관지 연축; 천식 지속 상태; 고 IgE 증후군; 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증; 아나필락시스성 반응의 예방; 음식물 알레르기; 아토피 피부염; 알레르기성 비염; 봉독 민감성; 특발성 아나필락시스; 땅콩 알레르기; 라텍스 알레르기; 염증성 피부 질환; 두드러기(일광성, 한랭성, 국소적 열성 및/또는 지연형 압박성); 피부 비만세포증; 전신 비만세포증; 호산구 관련 위장 장애; 수포성 유사천포창; 간질성 방광염; 비용종; 특발성 혈관부종; 또는 비알레르기성 천식 중 하나 이상을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 약학 조성물.
- 인간 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항의 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 또는 제111항 내지 제120항 중 어느 한 항의 약학 조성물의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제126항에 있어서, 인간 IgE와 FcεRI의 복합체와 관련된 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
- 제126항 또는 제127항에 있어서, 치료 또는 예방이 인간 IgE와 FcεRI의 복합체의 해리, 및 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질에 의한 인간 IgE의 결합을 통해 달성되는 것인 방법.
- 제126항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 알레르기; 알레르기성 천식; 중증 천식; 중등증 천식; 만성 자발성 두드러기; 만성 특발성 두드러기; 통년성 알레르기성 비염; 계절성 알레르기성 비염; 급성 천식 악화; 급성 기관지 연축; 천식 지속 상태; 고 IgE 증후군; 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증; 아나필락시스성 반응의 예방; 음식물 알레르기; 아토피 피부염; 알레르기성 비염; 봉독 민감성; 특발성 아나필락시스; 땅콩 알레르기; 라텍스 알레르기; 염증성 피부 질환; 두드러기(일광성, 한랭성, 국소적 열성 및/또는 지연형 압박성); 피부 비만세포증; 전신 비만세포증; 호산구 관련 위장 장애; 수포성 유사천포창; 간질성 방광염; 비용종; 특발성 혈관부종; 또는 비알레르기성 천식 중 하나 이상을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제1항 내지 제103항 및 제111항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 7, 3, 1, 0.66, 0.5 또는 0.3 μM 미만의 농도(또는 피크 혈청 농도)에서 FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시킬 수 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 약학 조성물, 또는 방법.
- 제1항 내지 제103항 및 제111항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 오말리주맙(또는 대안적으로 오말리주맙 Fab)보다 더 낮은 농도(또는 피크 혈청 농도)에서 FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시킬 수 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 약학 조성물, 또는 방법.
- 제1항 내지 제103항 및 제111항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 오말리주맙(또는 대안적으로 오말리주맙 Fab)보다 더 높은 %로 FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시킬 수 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 약학 조성물, 또는 방법.
- 제1항 내지 제103항 및 제111항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 오말리주맙(또는 대안적으로 오말리주맙 Fab)보다 더 높은, FcεRI로부터의 인간 IgE의 겉보기 해리 속도를 달성할 수 있는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 약학 조성물, 또는 방법.
- 제1항 내지 제103항 및 제111항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 오말리주맙(또는 대안적으로 오말리주맙 Fab)의 친화성보다 적어도 10% 더 낮은 인간 IgE(예를 들면, IgE-Fc를 사용함)에 대한 개선된 친화성(KD)을 갖는 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 약학 조성물, 또는 방법.
- 제1항 내지 제103항 및 제111항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질이 오말리주맙 또는 오말리주맙 Fab가 아닌 것인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질, 약학 조성물, 또는 방법.
- 유리 인간 IgE 및 FcεRI에 결합된 인간 IgE에 결합하고 FcεRI에 결합된 인간 IgE에 결합하여 IgE가 입체구조를 변화시키게 하는 항체 또는 항원 결합 물질로서, 상기 입체구조에서 FcεRI에 결합된 인간 IgE는 상기 항체 또는 항원 결합 물질의 부재 하에서의 결합 친화성보다 더 약한 FcεRI에 대한 결합 친화성을 가지고, FcεRI에 결합된 인간 IgE는 FcεRI로부터 해리하는 것인 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제136항에 있어서, 상기 입체구조에서 FcεRI에 결합된 인간 IgE가 상기 항체 또는 항원 결합 물질에 대한 결합 친화성보다 더 낮은 오말리주맙 또는 이의 단편에 대한 결합 친화성을 갖는 것인 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제136항 또는 제137항에 있어서, 제1항 내지 제103항 및 제130항 내지 제135항 중 어느 한 항에 따른 항체인 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgE와 FcεRI의 복합체와 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgE와 FcεRI의 복합체의 해리, 및 상기 항체 또는 항원 결합 물질에 의한 인간 IgE의 결합을 통해 상기 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 알레르기; 알레르기성 천식; 중증 천식; 중등증 천식; 만성 자발성 두드러기; 만성 특발성 두드러기; 통년성 알레르기성 비염; 계절성 알레르기성 비염; 급성 천식 악화; 급성 기관지 연축; 천식 지속 상태; 고 IgE 증후군; 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증; 아나필락시스성 반응의 예방; 음식물 알레르기; 아토피 피부염; 알레르기성 비염; 봉독 민감성; 특발성 아나필락시스; 땅콩 알레르기; 라텍스 알레르기; 염증성 피부 질환; 두드러기(일광성, 한랭성, 국소적 열성 및/또는 지연형 압박성); 피부 비만세포증; 전신 비만세포증; 호산구 관련 위장 장애; 수포성 유사천포창; 간질성 방광염; 비용종; 특발성 혈관부종; 또는 비알레르기성 천식 중 하나 이상을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 항체 또는 항원 결합 물질.
- 인간 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 물질의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제143항에 있어서, 인간 IgE와 FcεRI의 복합체와 관련된 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
- 제143항 또는 제144항에 있어서, 치료 또는 예방이 인간 IgE와 FcεRI의 복합체의 해리, 및 상기 항체 또는 항원 결합 물질에 의한 인간 IgE의 결합을 통해 달성되는 것인 방법.
- 제143항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 알레르기; 알레르기성 천식; 중증 천식; 중등증 천식; 만성 자발성 두드러기; 만성 특발성 두드러기; 통년성 알레르기성 비염; 계절성 알레르기성 비염; 급성 천식 악화; 급성 기관지 연축; 천식 지속 상태; 고 IgE 증후군; 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증; 아나필락시스성 반응의 예방; 음식물 알레르기; 아토피 피부염; 알레르기성 비염; 봉독 민감성; 특발성 아나필락시스; 땅콩 알레르기; 라텍스 알레르기; 염증성 피부 질환; 두드러기(일광성, 한랭성, 국소적 열성 및/또는 지연형 압박성); 피부 비만세포증; 전신 비만세포증; 호산구 관련 위장 장애; 수포성 유사천포창; 간질성 방광염; 비용종; 특발성 혈관부종; 또는 비알레르기성 천식 중 하나 이상을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제1항 내지 제103항 및 제130항 내지 제138항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 물질을 선택하는 방법으로서,
a. 테스트 항체 또는 항원 결합 물질을, 인간 FcεRI에 결합된 인간 IgE를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계;
b. 인간 FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시키는 것에 대한 상기 테스트 항체 또는 항원 결합 물질의 해리 상수를 측정하는 단계;
c. 단계 b)에서 측정된 해리 상수를, 인간 FcεRI로부터 인간 IgE를 해리시키는 것에 대한 오말리주맙 또는 이의 단편의 해리 상수와 비교하는 단계; 및
d. 항체 또는 항원 결합 물질이 오말리주맙 또는 이의 단편보다 더 빨리 FcεRI로부터 IgE를 해리시키는 경우 상기 항체 또는 항원 결합 물질을 선택하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제103항 및 제130항 내지 제138항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 물질을 선택하는 방법으로서,
a. 테스트 항체 또는 항원 결합 물질을, 인간 FcεRI에 결합된 인간 IgE를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계;
b. 인간 FcεRI로부터의 인간 IgE에 대한 상기 테스트 항체 또는 항원 결합 물질의 결합 친화성을 측정하는 단계;
c. 단계 b)에서 측정된 결합 친화성을, FcεRI에 대한 인간 IgE의 결합 친화성과 비교하는 단계; 및
d. 항체 또는 항원 결합 물질이 FcεRI에 대한 IgE의 결합 친화성보다 더 높은 IgE에 대한 결합 친화성을 갖는 경우 상기 항체 또는 항원 결합 물질을 선택하는 단계
를 포함하는 방법. - 제147항 또는 제148항에 있어서, 선택되는 항체 또는 항원 결합 물질이 IgE로 하여금 FcεRI에 여전히 결합되어 있으면서 입체구조를 채택하게 하고, 상기 안정화된 입체구조의 IgE가
a. 오말리주맙 또는 이의 단편의 존재 하에서 FcεRI에 결합된 IgE보다 더 빨리 FcεRI로부터 해리하고/하거나;
b. FcεRI에 대한 결합 친화성보다 더 높은 상기 항체 또는 항원 결합 물질에 대한 결합 친화성을 갖는 것인 방법. - a. 서열번호 1을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 i. 서열번호 109; 또는 ii. 서열번호 113; 또는 iii. 서열번호 121; 또는 iv. 서열번호 132; 또는 v. 서열번호 139를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
b. 서열번호 5, 및 i. S77 및 S79가 Q로 대체되어 있는 서열번호 24; ii. 서열번호 117; 또는 iii. 서열번호 125; 또는 iv. 서열번호 136; 또는 v. 서열번호 143
을 포함하는 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질. - 제150항에 있어서, 서열번호 108과 관련하여 인간 IgE의 Cε3 도메인의 잔기 T373, W374, S375, R376, A377, S378, G379, P381, Q417, C418, R419, T421, P426, R427, A428, 및 인간 IgE의 Cε2 도메인의 잔기 D278 및 T281을 포함하는 에피토프와 접촉하거나, 접촉하고 그에 특이적인 항-IgE 항체 또는 항원 결합 물질.
- 제1 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 항원 결합 물질로서, 상기 제1 폴리펩타이드는 제2 폴리펩타이드(예컨대, 수용체)에 결합함으로써 그 자신의 생리학적 반응을 이끌어내고, 상기 항체 또는 항원 결합 물질은 유리형 제1 폴리펩타이드 및 결합형 제1 폴리펩타이드 둘 다에 결합하여, 제1 폴리펩타이드의 입체구조를 안정화시키며, 상기 안정화된 입체구조의 제1 폴리펩타이드는 상기 항체 또는 항원 결합 물질의 부재 하에서보다 상기 항체 또는 항원 결합 물질의 존재 하에서 제2 폴리펩타이드에 대한 더 낮은 결합 친화성을 가지고, 상기 항체 또는 항원 결합 물질이 제2 폴리펩타이드로부터의 제1 폴리펩타이드의 보다 더 빠른 해리를 유발하는 것인 항체 또는 항원 결합 물질.
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