UA126468C2 - АНТИТІЛА ДО IgE - Google Patents

АНТИТІЛА ДО IgE Download PDF

Info

Publication number
UA126468C2
UA126468C2 UAA201812606A UAA201812606A UA126468C2 UA 126468 C2 UA126468 C2 UA 126468C2 UA A201812606 A UAA201812606 A UA A201812606A UA A201812606 A UAA201812606 A UA A201812606A UA 126468 C2 UA126468 C2 UA 126468C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
ide
antibody
amino acid
acid sequence
omalizumab
Prior art date
Application number
UAA201812606A
Other languages
English (en)
Inventor
Ральф Адамс
Томас Аллен Ческа
Анна Маріе Девіс
Анна Марие Девис
Алістер Джеймс Генрі
Алистер Джеймс Генри
Ксяофен Лю
Джеймс Майкл МакДоннелл
Браян Джон Саттон
Марта Катажина Вествууд
Original Assignee
Юсб Біофарма Срл
Юсб Биофарма Срл
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Юсб Біофарма Срл, Юсб Биофарма Срл filed Critical Юсб Біофарма Срл
Publication of UA126468C2 publication Critical patent/UA126468C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіла до IgE, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить ділянку, що визначає комплементарність, CDR-H1 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою SEQ ID NO: 14, CDR-H2 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою SEQ ID NO: 16, CDR-H3 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою SEQ ID NO: 18, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить ділянку, що визначає комплементарність, CDR-L1 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою SEQ ID NO: 29, CDR-L2 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою SEQ ID NO: 50 або 51, CDR-L3 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою SEQ ID NO: 33; причому варіабельна ділянка легкого ланцюга додатково містить каркасну ділянку, FR-L3 з амінокислотною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO: 32, яка має одну, дві, три, чотири, п’ять, шість, сім або більше амінокислотних замін для посилення взаємодії антитіла до IgE з Cε2-доменом людського IgE.

Description

Галузь техніки, до якої відноситься даний винахід
Даний винахід відноситься до галузі поліпшених антитіл до (ДЕ та антигензв'язувальних засобів, а також їх композицій, які цілеспрямовано впливають на ІдЕ, наприклад, для застосування у лікуванні розладів, викликаних ІДЕ (таких як алергічні реакції або певні аутоїмунні реакції) та, зокрема, розладів, викликаних взаємодією ІДЕ з рецептором ЕсеВІ.
Зокрема, даний винахід відноситься до поліпшених антитіл до ІДЕ та антигензв'язувальних засобів, що пов'язані з новими мутантами омалізумабу (Хоїаіг). Поліпшені антитіла до ЧЕ та антигензв'язувальні засоби за даним винаходом можуть характеризуватися поліпшеною афінністю до ІДЕ, талабо поліпшеною взаємодією з Сє2-доменом ІДЕ, та/або поліпшеним модифікованим епітопом на ІДЕ (наприклад, який додатково включає Св2-домен ЧЕ), та/або здатністю до дисасоціації ІДЕ від рецептора ЕсеВІ при концентраціях, доцільних з точки зору фармацевтики. Згідно з одним аспектом розкритими є поліпшені або нові способи лікування для опосередкованих ІДЕ розладів, у яких цілеспрямованому впливу піддається ІДЕ (наприклад, незв'язаний ІДЕ та/або ІДЕ у комплексі з ЕсєВІ-рецептором).
Рівень техніки даного винаходу
ІДЕ є членом родини імуноглобулінів, який опосередковує алергічні реакції, такі як астма, харчові алергії, гіперчутливість 1 типу та добре відоме запалення носових пазух, на які страждає багато людей. ІДЕ секретується В-клітинами та експресується на їх поверхні. ЧЕ, синтезований В-клітинами, заякорюється на у мембрані В-клітин за допомогою трансмембранного домену, з'єднаного з послідовністю зрілого ЩЕ за допомогою короткої ділянки, що зв'язується з мембраною. ІДЕ також зв'язується з В-клітинами (та моноцитами, еозинофілами та тромбоцитами) через свою Ес-ділянку з низькоафінним рецептором ІДЕ (РсеВІІ). Після того як ссавець піддається впливу алергену, клонально розмножуються В- клітини, які синтезують ІДЕ, що зв'язується з алергеном. Цей ІдЕ, в свою чергу, вивільняється у кровотік В-клітинами, де він зв'язується В-клітинами (через ЕсеВІЇ) і гладкими клітинами та базофілами через так званий високоафінний рецептор (ЕсеєВІ), що знаходиться на поверхні гладких клітин і базофілів. Такі гладкі клітини та базофіли таким чином сенсибілізуються до алергену. Наступний вплив алергену перехресно зв'язує ЕсеВі| на цих клітинах та, отже, активує вивільнення ними гістаміну та інших факторів, які є відповідальними за клінічну гіперчутливість
Зо та анафілаксію.
Омалізумаб (Хоїаін) являє собою одержане за допомогою технології рекомбінантної ДНК гуманізоване моноклональне антитіло ІдСиік, яке селективно зв'язується 3з людським імуноглобуліном Е (І9Е) (СеєЗ-доменомі). Антитіло характеризується молекулярною масою, що становить приблизно 149 кДа. Хоїаійб продукується суспензійною культурою клітин яєчника китайського хом'ячка у поживному середовищі, яке містить антибіотик гентаміцин. Хоїіаік? являє собою стерильний білий ліофілізований порошок без консервантів, який міститься у флаконі для одноразового використання та який відновлюють з використанням стерильної води для ін'єкцій (ЗМУРІ), ОБР (Фармакопея США) (або, в якості альтернативи, який міститься у вигляді рідкого складу у стерильному шприці) та вводять у вигляді підшкірної (50) ін'єкції (див. патентний документ ЕР 602126 (та 5РС/24806/005, заснований на ньому); міжнародну заявку
МО 93/04173; патент США 5 6267958 (та Хоіаїфб РТЕ, заснований на цьому патенті); міжнародні заявки УУХО 97/04807; М/О97/04801; Ргезіа в! аї!. (1993) 9. Іттипої. 151:2623-26321.
Омалізумаб у даний час призначають для лікування персистуючої астми з рівнем тяжкості від помірного до тяжкого у пацієнтів із позитивною шкірною пробою або визначеною іп міто реактивністю на цілорічно діючий аероалерген та симптомами, які недостатньо контролюються інгаляційними кортикостероїдами (з інструкції з застосування Хоїаї"Ф).
Проблеми, що існують при використанні омалізумабу, полягають у наступному: 1) його мішенню є лише незв'язаний ІДЕ, але він не чинить цілеспрямований влив (або не впливає ефективно) на патогенні молекули комплексу ІДЕ/ЕсеВІ у доцільних із точки зору фармацевтики дозах; 2) можливо, внаслідок того що він не чинить цілеспрямований вплив на патогенні молекули комплексу ІДЕ/ЕсеєВІ, необхідно "цонайменше 12-16 тижнів для того, щоб лікування
Хоїаійг показало свою ефективність" (Хоїаікю у розчині в дозі 150 мг - Коротка характеристика властивостей препарату, 2014), або для того, щоб дійсно визначити, чи буде працювати ХоїаїФ для конкретного пацієнта, або буде необхідне інше лікування; 3) його не слід застосовувати у пацієнтів з високими рівнями ІДЕ (наприклад, унаслідок того, що патогенні молекули комплексу
ІДЕ/ЕсеєВІ не піддаються цілеспрямованому впливу, та він не руйнується з часом за наявності високих рівнів незв'язаного ІДЕ у пацієнта); 4) "місцеві або системні реакції І типу, у тому числі анафілаксія та анафілактичний шок. можуть мати місце при прийманні омалізумабу" (Хоїаїк у розчині в дозі 150 мг - Коротка характеристика властивостей препарату, 2014); 5) його афінність до ІЗЕ не є особливо гарною (приблизно 2нМ).
Метою даного винаходу є ідентифікація нових антитіл для розв'язання однієї або декількох із цих проблем.
Додатковою метою є ідентифікація антитіл до нових епітопів (із підвищеною взаємодією з
Св2 ІДЕ у порівнянні з омалізумабом) та/або антитіл на основі нових мутантів омалізумабу з поліпшеною афінністю та/або поліпшеною здатністю до дисасоціації комплексу ІДЕ/ЕсеВІ.
Ще однією додатковою метою даного винаходу є ідентифікація нових сполук, способів і композицій для лікування розладів, асоційованих з ІДЕ, зокрема, розладів, асоційованих із комплексом ІДЕ/ЕсеВІ, наприклад, алергічних розладів.
Коротке розкриття даного винаходу
Відповідно до одного аспекту даного винаходу передбачається антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб, які контактують з епітопом, що містить залишки Т373, М/374, 5375, 8376, АЗ377, 5378, (379, РЗ81, 0417, С418, 8419, Т421, Р426, Н427, А428 у СєЗ-домені та залишки 0278 та 1281 у Сє2-домені людського ІДЕ. Згідно з додатковими варіантами здійснення епітоп може додатково містити один або декілька із залишків КЗ8О та/або М430 у СеєЗ-домені людського ІДЕ та/або один або декілька із залишків 0276, М277, 1279, 5280, А282 та/або 1298 у
Св2-домені людського ІДЕ.
Даний винахід засновується на результатах вивчення кристалічної структури у прикладі 1, які вперше показують взаємодію поліпшеного антитіла (на основі омалізумабу) з ІдБ-Ес, причому спостерігали значні взаємодії з Сє2-доменом ІДЕ у ділянці з мутацією. Це може приводити у результаті до поліпшених функціональних характеристик антитіла до ДЕ або антигензв'язувального засобу в порівнянні з омалізумабом та/або Рар омалізумабу. Наприклад, антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть бути здатними до дисасоціації людського ІДЕ від ЕсеєВІ при концентраціях (або при пікових концентраціях у сироватці крові), менших ніж 7, З, 1, 0,66, 0,5 або 0,3 мкМ (наприклад, як це визначається у способі, описаному у прикладі 2). Наприклад, антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть характеризуватися поліпшеною/сильнішою афінністю (нижчою Ка) до людського ІДЕ (наприклад, при використанні ІДЕ-Ес) (наприклад, як це визначається у способі, описаному у прикладі 6) у
Зо порівнянні з омалізумабом та/або Бар омалізумабу; та/або поліпшеною здатністю до дисасоціації комплексу ІДЕ/ЕсеВІ (наприклад, як визначається у способі, описаному у прикладі 2) у порівнянні з омалізумабом та/або Рар омалізумабу; та/або здатністю до дисасоціації людського ІДЕ від ЕсеєВІ при концентраціях (або при пікових концентраціях у сироватці крові) нижчих, ніж для омалізумабу та/або Рар омалізумабу (наприклад, як визначається у способі, описаному у прикладі 2). Під поліпшеною Ко розуміють щонайменше на 5, 10,20,30,40 або 50 95 нижчу, ніж така в омалізумабу та/або БРабБ омалізумабу. Ка в антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу за даним винаходом може становити менш ніж 2, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 15,14,1,3,12,11,1,0,0,9,0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4 або 0,3 нМ. Під поліпшеною можливістю або здатністю до дисасоціації людського ІДЕ від ЕсеєВІ розуміють поліпшення щонайменше на 5, 10, 20, 30, 40, 50 або 100 95 у порівнянні з омалізумабом та/або Раб омалізумабу (наприклад, при вимірюванні дисасоціації у 95 та/або умовної швидкості дисасоціації комплексу ІДЕ/ЕсеєВІ, як описано у прикладах 2 та 7) та/або досягнення дисасоціації при концентрації, при якій омалізумаб та/або Раб омалізумабу не досягають дисасоціації.
З метою уникнення неправильного трактування слід зазначити, що антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом не являють собою омалізумаб або Рар омалізумабу.
Згідно з одним варіантом здійснення епітоп визначають за допомогою кристалографічних методів (наприклад, як описано у прикладі 1) шляхом визначення залишків ІДЕ, що знаходяться в межах 4 або 5 А від антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу у кристалічній структурі комплексу ІДдЕ-ЕРс/антитіло до ІДЕ або ІдЕ-Ес/антигензв'язувальний засіб. ІдБб-Рс, що використовується, може мати 5ЕО ІО Мо 108 (з додатковими мутаціями М2650 і М3710О)).
Згідно з одним варіантом здійснення антитіло до (ДЕ або антигензв'язувальний засіб у конкретному сайті зв'язування контактують з епітопом, причому частини епітопа у СеєЗ-домені та
Св2-домені знаходяться на різних ланцюгах людського ІДЕ. ІДЕ має два ланцюги у Ес-домені, кожний із них має СеєЗ-домен та Сеє2 домен.
Згідно з одним варіантом здійснення антитіло до (ДЕ або антигензв'язувальний засіб у конкретному сайті зв'язування контактують з епітопом, причому частини епітопа у СеєЗ-домені та
Св2-домені знаходяться на одному й тому ж ланцюзі людського ІДЕ.
З метою уникнення неправильного трактування слід зазначити, що два антитіла до ІДЕ або антигензв'язувальні засоби за даним винаходом можуть зв'язуватися з людським ІЗЕ. проте тільки для одного з них необхідна взаємодія з епітопом за даним винаходом, який містить СеЗ - та Св2 -домени (інший може взаємодіяти тільки з іншим СеєЗ-доменом, наприклад).
Згідно з одним варіантом здійснення (необов'язково, додатково використовуючи ознаки першого аспекту даного винаходу) антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб є специфічними до зазначеного епітопа, що містить залишки Т373, М/374, 5375, 8376, АЗ77, 5378, 1379, РЗ81, 0417, С418, 8419, Т421, Р426, В427, А428 у СеєЗ -домені та залишки 0278 та
Т281 у Сє2-домені людського ІДЕ. Необов'язково, зазначений епітоп може додатково містити один або декілька з залишків КЗ8О та/"або М430 у СєЗ-домені людського ІДЕ та/або один або декілька з залишків 0276, М277, 1279, 5280, А282 та/або 1298 у Св2-домені людського ІЧЗЕ. З метою уникнення неправильного трактування слід зазначити, що антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб є специфічними до зазначеного епітопа, якщо вони розпізнають та зв'язуються з конкретною структурою людського ІДЕ, що містить зазначений епітоп, а не з людським ІДЕ взагалі.
Відповідно до додаткового аспекту (необов'язково, додатково використовуючи ознаки першого аспекту даного винаходу) передбачаються антитіло до ІЩЕ або антигензв'язувальний засіб, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-НЗ, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 18, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить ділянку, що визначає комплементарність.
СОВ-11, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 29, причому варіабельна ділянка легкого ланцюга додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-ІЇ3, з амінокислотною послідовністю, вибраною з 5ЕСО ІО Мо 32, яка має одну, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім або більше амінокислотних замін для посилення взаємодії антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу з Се2 -доменом людського ІДЕ.
Відповідно до додаткового аспекту (необов'язково, додатково використовуючи ознаки попередніх аспектів даного винаходу) передбачаються антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-НЗ, з амінокислотною послідовністю, яка являє
Зо собою 5ЕО ІО Мо 18, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-11, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 29, причому варіабельна ділянка легкого ланцюга додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-11, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 28, яка має одну, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім або більше амінокислотних замін для посилення взаємодії антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу з Сє2-доменом людського ЗЕ.
У випадку, коли ділянки СОВ-НЗ та СОВ-11 заякорюють та орієнтують антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб на СєЗ -ділянці ІДЕ (як у випадку омалізумабу), зміна(зміни) у послідовностях ЕВ-І З та/або ЕВ-11 забезпечує(забезпечують) можливість сильнішої взаємодії з
Св2 -доменом людського ІДЕ. Сильнішу взаємодію мутанта у порівнянні з омалізумабом або Рар омалізумабу можна оцінити за допомогою вимірювань афінності (за нижчою Ко) (наприклад, як це визначається у способі, описаному у прикладі б) та/(або за характеристикою поліпшеної дисасоціації комплексу ІДЕ/ЕсеВІ (наприклад, як визначається у способі описаному у прикладі 2).
Сильнішу взаємодію антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу з Сє2-доменом людського (ДЕ можна охарактеризувати за поліпшеними функціональними характеристиками антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу в порівнянні з омалізумабом та/або Рар омалізумабу. Наприклад, антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть бути здатними до дисасоціації людського ІДЕ від ЕсеєВІ при концентраціях (або при пікових концентраціях у сироватці крові), менших ніж 7, 3, 1, 0,66, 0,5 або 0,3 мкМ (наприклад, як це визначається у способі, описаному у прикладі 2). Наприклад, антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть характеризуватися поліпшеною/сильнішою афінністю (нижчою Ко) до людського ІДЕ (наприклад, при використанні ІДЕ-Ес) (наприклад, як це визначається у способі, описаному у прикладі б) у порівнянні з омалізумабом та/або Рар омалізумабу; та/або поліпшеною здатністю до дисасоціації комплексу ІДЕ/РсеєВІ (наприклад, як визначається у способі, описаному у прикладі 2) у порівнянні з омалізумабом та/або Раб омалізумабу; та/або здатністю до дисасоціації людського ІДЕ від ЕсєВІ при концентраціях (або при пікових концентраціях у сироватці крові) нижчих, ніж для омалізумабу та/або Рар омалізумабу (наприклад, як визначається у способі, описаному у прикладі 2). Під поліпшеною Ко розуміють щонайменше на 5, 10, 20, 30, 40 або 50 95 нижчу, ніж така в омалізумабу та/або Раб омалізумабу. Ка в антитіла 60 до ІЗЕ або антигензв'язувального засобу за даним винаходом може становити менш ніж 2, 1,9,
1,8,1,7,1,6,1,5,1,4,1,3,1,2,1,1,1,0, 009, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4 або 0,3 нМ. Під поліпшеною можливістю або здатністю до дисасоціації людського ІДЕ від ЕсеєВІ розуміють поліпшення щонайменше на 5, 10, 20, 30, 40, 50 або 100 95 у порівнянні з омалізумабом та/або Рар омалізумабу (наприклад, при вимірюванні дисасоціації ую та/або умовної швидкості дисасоціації комплексу ІЯЕ/ЕсеВІ, як описано у прикладах 2 та 7) та/або досягнення дисасоціації при концентрації, при якій омалізумаб та/або Рар омалізумабу не досягають дисасоціації.
З метою уникнення неправильного трактування слід зазначити, що антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом не являють собою омалізумаб або Рар омалізумабу.
Згідно з одним варіантом здійснення ділянку ЕВ-І З піддають мутації, у випадку 5ЕО ІЮ Мо 129, у одному або декількох з положення 560, 563, 576, 577 та/або 279 (за Кабаї) із заміною на одну з інших природних амінокислот.
Наприклад, ділянка ЕВ-І З може бути піддана мутації у положенні 560 (за Кабаї) із заміною на одну з інших природних амінокислот, наприклад, на М, РН, К, М, О або Т, зокрема, на М.
Наприклад, ділянка ЕВ-І З може бути піддана мутації у положенні 563 (за Кабаї) із заміною на одну з інших природних амінокислот, наприклад, на МУ/ або У, зокрема, на У.
Наприклад, ділянка ЕВ-І З може бути піддана мутації у положенні 576 (за Кабаї) із заміною на одну з інших природних амінокислот, зокрема, на М.
Наприклад, ділянка ЕВ-І З може бути піддана мутації у положенні 577 (за Кабаї) із заміною на одну з інших природних амінокислот, наприклад, на КЕ або К, зокрема, на В.
Наприклад, ділянка ЕВ-І З може бути піддана мутації у положенні 279 (за Кабаї) із заміною на одну з інших природних амінокислот, наприклад, на КЕ або К, зокрема, на В.
Наприклад, ділянка ЕВ-11 може бути піддана мутації, у випадку 5ЕО ІО Мо 20, за с16 та/або
В18 (за Кара) із заміною на одну з інших природних амінокислот.
Згідно з певними варіантами здійснення амінокислотна послідовність мутованої ділянки ЕВ-
ЇЗ антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу є вибраною з 5ЕО ІЮ Мо 43-49,60-83, 131 або 138.
Згідно з додатковим варіантом здійснення ділянку ЕВ-І З додатково піддають мутації, у випадку 5ЕО ІЮ Мо 129, у положенні 567 (за Кара) із заміною на одну з інших природних
Зо амінокислот для поліпшення її афінності (нижчої Ко) до людського ІДЕ. У цьому випадку мутація може бути такою, що посилює взаємодію антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу з
СеєЗ-доменом ІДЕ. Наприклад, ділянка ЕВ-Ї3 може бути піддана мутації у положенні 567 (за
Кара) із заміною на М (зокрема), Е або ОО. Згідно з певними варіантами здійснення амінокислотна послідовність мутованої ділянки ЕВ-ІЇЗ антитіла до ІЕ або антигензв'язувального засобу є вибраною з 5ЕО ІЮ Мо 53-59, 84-107, 131 або 138.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка додатково містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-1 2, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО 10 Мо 31.
Згідно з одним варіантом здійснення ділянка СОВ-І 2 піддається мутації у положенні 552 (за
Кабай із заміною на одну з інших природних амінокислот для поліпшення її афінності (нижчої
Ко) до людського (ШЕ. У цьому випадку мутація може бути такою, що посилює взаємодію антитіла до ІЩЕ або антигензв'язувального засобу з СєЗ-доменом ІДЕ. Наприклад, ділянка СОВ-
Ї2 може бути піддана мутації, у випадку 5ЕО ІЮ Мо 129, у положенні 552 (за Кабаї) із заміною на
О (зокрема), Е, О або В. Згідно з певними варіантами здійснення амінокислотна послідовність мутованої ділянки СОВ-12 є вибраною з 5ЕО ІО Мо 50 або БЕОІЮМе51.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-НІ, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 14.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-Н2, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 16.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка додатково містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-Ї 3, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО 10 Мо 33.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-НІ, з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІО Мо 13.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-Н2, з 60 амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІО Мо 15.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-НЗ, з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІО Мо 17.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-НА4, з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІО Мо 19.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-12. з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІО Мо 30.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-14, з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІО Мо 34.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, МІ. яка має амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО
ІО Мо 35, 5ЕО ІО Мо 132, або 5ЕО ІЮ Мо 134, або 5ЕО ІО Мо 141, або 5ЕО ІО Мо 144, або 5ЕО ІЮ
Мо 145, або 5ЕО ІО Мо 158, або 5ЕО ІО Мо 159.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, МН, яка має амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІЮ Мо 1.
Антитіло до ЇДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть додатково містити константну ділянку легкого ланцюга.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати константну ділянку легкого ланцюга, яка являє собою константну ділянку капа-ланцюга.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати константну ділянку легкого ланцюга, що має мутацію І 154Р (за Кара).
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга та константну ділянку легкого ланцюга, МІ-СЇ, що мають амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІО Мо 39, або 5ЕО ІО Мо 41, або 5ЕО ІО Мо 117, або
ЗЕО ІО Ме 119, або 5ЕО ІО Мо 125, або 5ЕО ІЮО Мо 127, або 5ЕО ІО Ме 136, або 5ЕО ІО Мо 143, яка необов'язково містить сигнальну послідовність, що має амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 160.
Антитіло до ЇДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть додатково містити константну ділянку важкого ланцюга, СНІ.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга та константну ділянку важкого ланцюга, МН-СНІ, що мають амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 5.
Антитіло до ЇДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть додатково містити Ес-ділянку важкого ланцюга, Ес.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати Ес, який походить із людського ІЇдСс1 або людського ІдсСа.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, константну ділянку важкого ланцюга та Ес-ділянку важкого ланцюга, МН-СНІ-Ес, які мають амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО І
Мо 9.
Відповідно до додаткового аспекту даного винаходу передбачається антитіло до ДЕ або антигензв'язувальний засіб, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-НЗ, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 18, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-11, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 29, причому: а. варіабельна ділянка легкого ланцюга додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-ІЗ, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 32, при цьому ділянка ЕВ-І З має мутацію, у випадку 5ЕО ІЮ Мо 129, у положенні 567 (за Кара!) із заміною на одну з інших природних амінокислот для поліпшення афінності (нижчої Ко) до людського ІДЕ у антитіла до
ІЯЕ або антигензв'язувального засобу; та/або р. варіабельна ділянка легкого ланцюга додатково містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-12, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 31, при цьому ділянка СОВ-12 має мутацію, у випадку 5ЕО ІЮ Мо 129, у положенні 552 (за Кабай із заміною на одну з інших природних амінокислот для поліпшення афінності (нижчої Ко) до бо людського ІДЕ у антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу.
Автори даного винаходу у даному документі визначили, що будь-яка одна з цих мутацій або обидві ці мутації можуть несподівано поліпшувати афінність (поліпшена або нижча Ко) до людського ІДЕ (наприклад, при застосуванні ІЧЕ-Ес) (наприклад, як це визначається у способі, описаному у прикладі б) у антитіла до ІЩЕ або антигензв'язувального засобу на основі омалізумабу або Бар омалізумабу. Зокрема, афінність є поліпшеною в порівнянні з омалізумабом та/або Раб омалізумабу. Мутації можуть поліпшувати взаємодію з СеЗ-доменом
ІЧЕ. Під поліпшеною або нижчою Ко розуміють щонайменше на 5, 10, 20, 30, 40 або 50 95 нижчу, ніж така в омалізумабу та/або Раб омалізумабу. Ко в антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу за даним винаходом може становити менш ніж 2, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5,1,4,1,3,1,2,11, 1,0,0,9,0,8,0,7,0,6,0,5,0,4 або 0,3 нМ.
Наприклад, ділянка ЕВ-І З може бути піддана мутації, у випадку 5ЕО І Мо 129, у положенні 567 (за Кабаї) із заміною на М (зокрема), Е або 0.
Згідно з певними варіантами здійснення амінокислотна послідовність мутованої ділянки ЕВ-
ЇЗ антитіла до ІЩЕ або антигензв'язувального засобу є вибраною з 5ЕО ІЮ Мо 52-59,84-107, 131 або 138.
Наприклад, ділянка СОВ-12 може бути піддана мутації, у випадку 5ЕО ІО Мо 129, у положенні 552 (Кабаї) із заміною на О (зокрема), Е, О або В.
Згідно з певними варіантами здійснення амінокислотна послідовність мутованої ділянки
СОВ-І2 антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу є вибраною з 5ЕО ІО Мо 50 (зокрема) або 5ЕО ІЮО Мо 51.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-НІ, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 14.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-Н2, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО Ме 16.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка додатково містить ділянку, що визначає комплементарність, СОВ-13, з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 33.
Зо Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-НІ, з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ Мо 13.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-Н2, з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ Мо 15.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-НЗ, з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ Мо 17.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-Н4, з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ Мо 19.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-12, з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ Мо 30.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка додатково містить каркасну ділянку, ЕВ-1І4, з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ Мо 34.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, МІ, що містить послідовні ділянки ЕВ-І1, СОВ-11, ЕВ-І2, СОВ-12, ЕВ-І 3, СОВ-Ї З і ЕВ-
БО І 4 та має амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 20, за винятком того, що ділянка СОВ-12 має амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО 10 Мо 50 (зокрема) або 5ЕО І
Мо 51.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, МІ, що містить послідовні ділянки ЕВ-І1, СОВ-11, ЕВ-І2, СОВ-12, ЕВ-І 3, СОВ-Ї З і ЕВ-
І 4 та має амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 20, за винятком того, що ділянка ЕВ-І З має амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 52.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, МІ, що містить послідовні ділянки ЕВ-І1, СОВ-11, ЕВ-І2, СОВ-12, ЕВ-І 3, СОВ-Ї З і ЕВ-
І 4 та має амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 20, за винятком того, що 60 ділянка СОВ-12 має амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО Мо 50 (зокрема) або 5ЕО І
Мо 51, та ділянка ЕВ-І З має амінокислотну послідовність, яка є вибраною з 5ЕО ІЮО Мо 52, 131 або 138.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, МН, яка має амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо 1.
Антитіло до ІЩЕ або антигензв'язувальний засіб можуть додатково містити константну ділянку легкого ланцюга.
Антитіло до ЇДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати константну ділянку легкого ланцюга, яка являє собою константну ділянку капа-ланцюга.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга та константну ділянку легкого ланцюга, МІ -СЇ, що мають амінокислотну послідовність, яка являє собою 5БЕО ІО Мо 24, за винятком того, що ділянка СОВ-12 має амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІО Мо 50 (зокрема) або 5ЕО ІО Мо 51.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга та константну ділянку легкого ланцюга, МІ -СЇ, що мають амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 24, за винятком того, що ділянка ЕВ-ЇЗ3 має амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 52.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку легкого ланцюга та константну ділянку легкого ланцюга, МІ -СЇ, що мають амінокислотну послідовність, яка являє собою 5БЕО ІО Мо 24, за винятком того, що ділянка СОВ-12 має амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО Мо 50 (зокрема) або 5ЕО ІО Мо 51, та ділянка ЕВ-І З має амінокислотну послідовність, яка є вибраною з 5ЕО ІО Мо 52, 131 або 138.
Відповідно до додаткового аспекту даним винаходом передбачається антитіло до ЩЕ або антигензв'язувальний засіб, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, причому: а. варіабельна ділянка важкого ланцюга містить СОВ-НІ з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо 14, СОВ-Н2 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕС
ІЮ Мо 16, та СОВ-НЗ з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо 18, та варіабельна ділянка легкого ланцюга містить СОВ-11 з амінокислотною послідовністю, що
Ко) являє собою 5ЕО ІЮ Ме 29, СОВ-12 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 50, СОВ-ЇЗ з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІО Мо 33, та каркасну ділянку
ЕМУ-ІЗ з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 131 або 138; або р. варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІО Мо 1, та варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО Мо 132 або 139.
Згідно з одним варіантом здійснення антитіло до ІЩЕ або антигензв'язувальний засіб можуть додатково містити константну ділянку легкого ланцюга, причому варіабельна ділянка легкого ланцюга та константна ділянка легкого ланцюга, МІ -СЇ, мають амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО Мо 136 або 143, що необов'язково містить сигнальну послідовність, яка має амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо 160.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб згідно зі всіма варіантами здійснення, які описані у даному документі, можуть додатково містити константну ділянку важкого ланцюга,
СНІ.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга та константну ділянку важкого ланцюга, МН-СНІ. що мають амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО І Ме 5.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть додатково містити Ес-ділянку важкого ланцюга, Ес.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати Ес з людського ІДС1 або
БО людського ІДС.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, константну ділянку важкого ланцюга та Ес-ділянку важкого ланцюга, МН-СНІ1-Ес, які мають амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІО Мо 9.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб відповідно до всіх аспектів даного винаходу можуть бути вибрані з групи, що складається з повної молекули антитіла, яка має повнорозмірні важкі та легкі ланцюги, або її фрагмента.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть бути вибрані з групи, що складається з: Рар-фрагмента, модифікованого ЕРар'-ррагмента, Рар'-фрагмента,
Р(ар)2-фрагмента, Ем, зсЕм, зсаб, діатіла, біспецифічного антитіла, триатіла, ГабеЕм, Рар-Ем-Ем, 60 тріотіла або (Гар-Ем)--Ес. Не вдаючись у теорію, антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть характеризуватися меншим ризиком анафілаксії, асоційованої з ними, якщо вони мають лише один, а не декілька сайтів зв'язування з антигеном ЧЕ.
Згідно з одним варіантом здійснення антитіло до ІДЕ являє собою Рар-фрагмент, з'єднаний безпосередньо або через лінкер із зсЕм, який зв'язується з сироватковим білком-носієм, таким як людський сироватковий альбумін.
Згідно з одним варіантом здійснення 5сЕм може містити варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, переважно, з'єднані через лінкер, що має 5ЕО
ІО Мо 151, причому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить СОВ-НІ з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮ Мо 152, СОВ-Н2 з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ Мо 153, та СОВ-НЗ з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО
ІС Мо 154, та варіабельна ділянка легкого ланцюга містить СОВ-11 з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо 155, СОВ-12 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕСО ІО Мо 156, СОВ-Ї З з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ
Мо 157.
Згідно з одним варіантом здійснення 5сЕм має амінокислотну послідовність, що являє собою
ЗЕО ІО Мо 150. Згідно з одним переважним варіантом Рар-фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, причому: а. варіабельна ділянка важкого ланцюга містить СОВ-НІ з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо 14, СОВ-Н2 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕС
ІЮ Мо 16, та СОВ-НЗ з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо 18, та варіабельна ділянка легкого ланцюга містить СОВ-11 з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ Ме 29, СОВ-12 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 50, СОВ-ЇЗ з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІО Мо 33, та каркасну ділянку
ЕМУ-ІЗ з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 131 або 138; або р. варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІО Мо 1, та варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО Мо 132 або 139.
Згідно з іншим варіантом здійснення Рар-фрагмент додатково містить константну ділянку важкого ланцюга та константну ділянку легкого ланцюга, причому варіабельна ділянка важкого ланцюга та константна ділянка важкого ланцюга, МІ -СНІ, мають амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо 5, та при цьому варіабельна ділянка легкого ланцюга та константна ділянка легкого ланцюга, МІ -СїЇ, мають амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІЮО Мо 136 або 143, що необов'язково містить сигнальну послідовність, яка має амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІО Мо 160.
Згідно з іншим варіантом здійснення 5сЕм є з'єднаним з СНІ Рар-фрагменту через лінкер, що має амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 149.
Згідно з одним варіантом здійснення варіабельна ділянка важкого ланцюга та константна ділянка важкого ланцюга, лінкер та 5сЕм мають амінокислотну послідовність, яка являє собою
ЗЕБЕО ІО Мо 147, що необов'язково містить сигнальну послідовність, яка має амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІО Мо 160.
Згідно з іншим варіантом здійснення важкий ланцюг РГар-фрагменту, з'єднаний із зсЕм з ФЕО
ІО Мо 147, утворює пару з варіабельною та константною ділянками легкого ланцюга, які мають
ЗЕО ІЮ Ме 136 або 143.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть мати ефекторну або репортерну молекулу, прикріплену до нього.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть бути глікозильованими (наприклад, у Ес-домені) талабо можуть бути кон'югованими з полімером, вибраним із крохмалю, альбуміну та поліетиленгліколю (РЕСї). Згідно з одним варіантом здійснення кон'юЮюгований РЕСї може характеризуватися молекулярною масою у діапазоні від 5 до 50 кДа.
Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом можуть бути гуманізованими.
Додатковий аспект даного винаходу відноситься до виділеної послідовності ДНК, що кодує важкий та/або легкий ланцюг(ланцюги) антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу за даним винаходом. Додатково передбачається вектор клонування або експресії, що містить одну або декілька послідовностей ДНК за даним винаходом. Наприклад, вектор клонування або експресії може містити одну або декілька послідовностей ДНК, вибраних із БЕО ІО Мо 36, 5ЕО
ІО Мо 38, 5ЕО ІО Мо 40, або 5ЕО ІО Мо 42, або 5ЕО ІО Мо 133, або 5ЕО ІО Мо 135, або 5ЕО ІО Мо 137, або 5ЕО ІЮО Мо 140, або 5ЕБЕО ІО Мо 142, або 5ЕО ІЮО Мо 144, та, необов'язково, може додатково містити одну або декілька послідовностей ДНК, вибраних із БЕО І Мо 2, 5ЕО 1О Мо 4,
ЗЕО ІО Мо 6, БЕО ІО Мо 8, 5ЕО ІО Мо 10, або 5ЕО ІО Мо 12, або 5ЕО ІО Мо 148.
Додатковий аспект даного винаходу відноситься до клітини-хазяїна, що містить один або декілька векторів клонування або експресії за даним винаходом. Клітина-хазяїн за даним винаходом, необов'язково, може додатково містити один або декілька векторів клонування або експресії, що містять одну або декілька послідовностей ДНК, вибраних із ЕС ІО Мо 2, БЕО ІЮО Мо 4, 5ЕО ІО Мо 6, 5ЕО ІО Мо 8, 5ЕО 10 Мо 10, або 5ЕО 10 Мо 12, або 5ЕО ІО Мо 148.
Також передбачається спосіб одержання антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу заданим винаходом, що передбачає культивування клітини-хазяїна заданим винаходом та виділення антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу.
Додатковий аспект відноситься до фармацевтичної композиції, що містить антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом у комбінації з одним або декількома з фармацевтично прийнятної допоміжної речовини, розріджувача або носія. Відповідно, антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом присутні у дозі, що становить 50- 200, переважно, приблизно або точно 150 мг на мл розріджувача. Згідно з певними варіантами здійснення допоміжна речовина містить один з І -аргініну, І-гістидину або обидва з них.
Допоміжна речовина може окремо або у комбінації містити полісорбат 20. Розріджувач може являти собою воду або ізотонічний водний розчин.
Фармацевтична композиція за даним винаходом може міститись усередині стерильного флакона у вигляді порошку для відновлення перед підшкірним введенням або всередині стерильного шприця для її безпосереднього підшкірного введення.
Фармацевтична композиція за даним винаходом може містити загальну дозу антитіла до ЩЕ або антигензв'язувального засобу, що становить 75-600 мг, наприклад, приблизно або точно 100 або 150 мг.
Фармацевтична композиція за даним винаходом може додатково містити інші активні інгредієнти, які або містяться разом з антитілом до ІДЕ або антигензв'язувальним засобом, або призначені для окремого спільного введення з антитілом до ІДЕ або антигензв'язувальним засобом. Наприклад, фармацевтичну композицію за даним винаходом можна застосовувати у контексті специфічної імунотерапії алергії, при якій спільне введення антитіла до ІДЕ або
Зо антигензв'язувального засобу за даним винаходом здійснюють окремо (але вони можуть знаходитись у одній упаковці) від алергену. Отже, фармацевтична композиція за даним винаходом може бути призначена для застосування у специфічній імунотерапії алергії, при якій пацієнт одержує фармацевтичну композицію за даним винаходом за 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 добу до терапевтичного алергену (або тієї ж доби).
Антитіло до ІДЕ, або антигензв'язувальний засіб, або композиція за даним винаходом можуть бути призначені для застосування у якості лікарського препарату.
Антитіло до ІДЕ, або антигензв'язувальний засіб, або композиція за даним винаходом можуть бути призначені для застосування у лікуванні або попередженні захворювання.
Антитіло до ІДЕ, або антигензв'язувальний засіб, або композиція за даним винаходом можуть бути призначені для застосування у лікуванні або попередженні розладів, асоційованих із комплексом людського ІДЕ та ЕсеєВіІ.
Антитіло до ІДЕ, або антигензв'язувальний засіб, або композиція за даним винаходом можуть бути призначені для застосування у лікуванні або попередженні розладів за допомогою дисасоціації комплексу людського ІДЕ та ЕсеВІ та зв'язування людського ІДЕ антитілом до ІДЕ або антигензв'язувальним засобом.
Антитіло до ІДЕ, або антигензв'язувальний засіб, або композиція за даним винаходом можуть бути призначені для застосування у лікуванні або попередженні одного або декількох з: алергії; алергічної астми; тяжкої астми; помірної астми; хронічної спонтанної кропив'янки; хронічної ідіопатичної кропив'янки; цілорічного алергічного риніту; сезонного алергічного риніту; гострих нападів астми; гострого бронхоспазму; астматичного стану; гіпер-ІДЕ-синдрому; алергічного бронхолегеневого аспергільозу; попередження анафілактичних реакцій; харчової алергії; атопічного дерматиту; алергічного риніту; чутливості до бджолиної отрути; ідіопатичної анафілаксії; алергії на арахіс; алергії на латекс; запальних захворювань шкіри; кропив'янки (викликаної впливом сонячних променів, викликаної впливом холоду, викликаної локальним тепловим впливом та/або відстроченої, викликаної стисненням); шкірного мастоцитозу; системного мастоцитозу; шлунково-кишкового розладу, асоційованого з еозинофілами; бульозного пемфігоїду; інтерстиційного циститу; носових поліпів; ідіопатичного ангіоневротичного набряку або неалергічної астми.
Додатково передбачається спосіб лікування або попередження захворювання у суб'єкта- 60 людини, причому спосіб передбачає введення суб'єкту ефективної кількості антитіла до ІЧЕ, або антигензв'язувального засобу, або композиції за даним винаходом. Спосіб може бути призначений для лікування або попередження розладів, асоційованих із комплексом людського
ІЕ та ЕГсєВІ. За допомогою способу за даним винаходом можна лікувати або попереджувати захворювання за допомогою дисасоціації комплексу людського ІДЕ та ЕсеєВіІ та зв'язування людського ІДЕ антитілом до ІДЕ або антигензв'язувальним засобом за даним винаходом.
Спосіб за даним винаходом може бути призначений для лікування або попередження одного або декількох з: алергії; алергічної астми; тяжкої астми; помірної астми; хронічної спонтанної кропив'янки; хронічної ідіопатичної кропив'янки; цілорічного алергічного риніту; сезонного алергічного риніту; гострих нападів астми; гострого бронхоспазму; астматичного стану; гіпер-ІДЕ-синдрому; алергічного бронхолегеневого аспергільозу; попередження анафілактичних реакцій; харчової алергії; атопічного дерматиту; алергічного риніту; чутливості до бджолиної отрути; ідіопатичної анафілаксії; алергії на арахіс; алергії на латекс; запальних захворювань шкіри; кропив'янки (викликаної впливом сонячних променів, викликаної впливом холоду, викликаної локальним тепловим впливом та/або відстроченої, викликаної стисненням); шкірного мастоцитозу; системного мастоцитозу; шлунково-кишкового розладу, асоційованого з еозинофілами; бульозного пемфігоїду; інтерстиційного циститу; носових поліпів; ідіопатичного ангіоневротичного набряку або неалергічної астми.
У даному винаході було виявлено, що антитіло або антигензв'язувальний засіб проти першого поліпептиду, причому фізіологічна реакція на даний поліпептид проявляється внаслідок його зв'язування із другим поліпептидом (таким як рецептор), є здатним до зв'язування як із незв'язаним, так і зі зв'язаним першим поліпептидом, стабілізуючи конформацію такого першого поліпептиду. Така стабілізована конформація характеризується афінністю зв'язування з другим поліпептидом, яка є слабшою, ніж за відсутності антитіла або антигензв'язувального засобу, таким чином запускаючи швидшу дисоціацію першого поліпептиду від другого поліпептиду.
У зв'язку з цим даним винаходом передбачається додатковий аспект, який відноситься до антитіла або антигензв'язувального засобу, що є здатними до зв'язування з незв'язаним та зав'язаним з ГсеєВІ людським ІДЕ та стабілізації конформації ЧЕ. Коли ІЩЕ перебуває у такій конформації, він характеризується афінністю зв'язування з ЕсеєВІ, яка є слабшою, ніж за
Зо відсутності антитіла або антигензв'язувального засобу, та при цьому ЕсеВіІ, зв'язаний із людським ІДЕ, дисоціює від ЕсеєВІ. Необов'язково, коли ІДЕ перебуває у такій конформації, ЧЕ характеризується нижчою афінністю зв'язування з омалізумабом або його фрагментом, ніж антитіло або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом. Наприклад, антитіло або антигензв'язувальний засіб являє собою антитіло, яке описане у даному документі.
Відповідно до додаткового аспекту даний винахід відноситься до способу вибору таких антитіл або антигензв'язувальних засобів, які описані у даному документі. Спосіб передбачає: а. забезпечення контакту досліджуваного антитіла або антигензв'язувального засобу зі зразком, що містить людський ІДЕ, зв'язаний із людським ЕсеНІ р. вимірювання константи дисоціації досліджуваного антитіла або антигензв'язувального засобу для дисоціації людського ІДЕ від людського ЕсеВІ; с. порівняння константи дисоціації, виміряної на стадії Б), з константою дисоціації омалізумабу або його фрагмента для дисоціації людського ІДЕ від людського ЕсеВІ; 4. вибір антитіла або антигензв'язувального засобу, якщо зазначені антитіло або антигензв'язувальний засіб дисоціюють ІДЕ від ЕсєВІ швидше, ніж омалізумаб або його фрагмент.
У якості альтернативи, спосіб вибору антитіл або антигензв'язувальних засобів за даним винаходом передбачає: а. забезпечення контакту досліджуваного антитіла або антигензв'язувального засобу зі зразком, що містить людський ІДЕ, зв'язаний із людським ЕсеВІ; р. вимірювання афінності зв'язування досліджуваного антитіла або антигензв'язувального засобу для людського ІДЕ з людського ЕсеВІ; с. порівняння афінності зв'язування, виміряної на стадії б), з афінністю зв'язування людського ІДЕ з ЕсеВІ; 4. вибір антитіла або антигензв'язувального засобу, якщо зазначені антитіло або антигензв'язувальний засіб характеризуються вищою афінністю зв'язування з ІДЕ, ніж ЧЕ з
ЕсеВІ.
Необов'язково, вибрані антитіла або антигензв'язувальні засоби викликають набуття ЩЕ конформації, коли він усе ще залишається зв'язаним із ЕсєВІ, причому ІДЕ у зазначеній стабілізованій конформації може дисоціювати від ЕсєВІ швидше, ніж ІДЕ, зв'язаний з ЕсеВіІ, у присутності омалізумабу або його фрагмента; та/або може характеризуватися афінністю зв'язування, вищою для антитіла або антигензв'язувального засобу, ніж для ЕсеВІ.
Відповідно до заключного аспекту даний винахід відноситься до специфічних антитіл або антигензв'язувального засобу, що містять: а. варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить 5ЕО ІО Мо 1, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить: і. ЗЕО ІО Мо 109; або і. ЗЕО ІО Мо 113; або йї.ЗЕО 10 Мо 121; або їм.2ЕО ОМе 132; або м. ЗЕО ІЮ Ме139; або
Б. 5ЕО ІО Мо 5 та і. 5ЕО ІЮ Мо 24, причому 577 та 579 замінені на СО; і. ЗЕО ІО Мо 117; або ії. «ЕС ІЮО Ме125;або їм.ЗЕО ІО Мо 136; або м. ЗЕО ІО Мо 143.
Згідно з одним варіантом здійснення цього заключного аспекту даного винаходу антитіло до
ІЕ або антигензв'язувальний засіб контактують або контактують і є специфічними до епітопа, що містить, у випадку 5ЕО ІЮ Мо 108, залишки 7373, М/374, 5375, Н376, АЗ377, 5378. 11379, РЗ81, 0417, С418, В419, Т421, Р426, Н427, А428 у СеєЗ -домені та залишки 0278 і Т281 у Свє2-домені людського ЗЕ.
Короткий опис фігур
Літературні джерела та 5ЕО ІО наведені у розділі Приклади з посиланням на фігури.
Фіг. 1. БаБ3 омалізумабу містить три точкові мутації. БГар3 омалізумабу одержують з омалізумабу. та він містить три точкові мутації, віддалені від СОВА, що зв'язуються з антигеном: дві у каркасній ділянці Мі-домену (Зег81Ага, СіпвЗАго) та одну у Ск-домені (І еці58Рго). Важкий та легкий ланцюги позначені білим та синім кольором, відповідно. Мутовані залишки виділені червоним кольором, а САОІ 1 - зеленим для позначення орієнтації Раб.
Зо Фіг. 2. Загальна структура ДЕ-Ес у комплексі з Габ3 омалізумабу. (А) РарЗ3 омалізумабу зв'язується з ІДЕ-Бс у стехіометричному співвідношенні 2:11. Рар' (зелений) взаємодіє з ланцюгом В ІДЕ-Ес (рожевий) виключно через СєЗ-домен. Рар: (синій) взаємодіє з ланцюгом А
ІДБ-Ес (жовтий) через СеєЗ-домен та утворює незначну взаємодію з Сє2 -доменом із ланцюга В
ІДБ-Ес (рожевий). (В) Два Рар утворюють псевдосиметричний комплекс відносно осі подвійного перегину ділянки Есє3-4. Для спрощення Сє2-домени не показані. (С) ІДЕ-Рс є асиметрично зігнутим у комплексі з Гар3 омалізумабу. Сє2-домен із ланцюга В (рожевий) контактує з ЕРар- (синій).
Фіг. 3. Поверхня взаємодії між Гарз омалізумабу та ІДЕ-Ес. Показана поверхня взаємодії між
Еар- у Гар3 омалізумабу (важкий та легкий ланцюги позначені зеленим і жовтим кольором, відповідно) та СеєЗ-доменом з ІДЕ-Ес (рожевий). Позначення залишків ГарзЗ омалізумабу та СеєЗ- домену мають синій та чорний колір, відповідно. Поверхня взаємодії містить водневі зв'язки та ван-дер-ваальсові взаємодії. Характерною ознакою поверхні взаємодії є катіонна-л-взаємодія між Ага419 (СеєЗ-домен) та Рпе103 (СОВНЗ Рар3 омалізумабу). Боковий ланцюг Рпе1оз переважно є зануреним у кишеню, що утворена ТНг373, Ттр374, Зег375, СІп417 та Ага419 (Сеє3- домен).
Фіг. 4. Рар3 омалізумабу та ОАВРіп Е2 79 зв'язуються з поверхнею взаємодії, що перекривається. Обидва з Гар3 омалізумабу та ЮСАВРІіп Е2 7920 зв'язуються з СєЗ-доменом.
Залишки у ІДЕ-ЕРс, які утворюють частину поверхні взаємодії тільки з Раб3 омалізумабу, позначені оранжевим кольором, у той час як залишки, що утворюють частину поверхні взаємодії тільки з ПОАВРІп Е2 79, яка включає у себе частину лінкера Се3-Сє4, позначені синім кольором.
Позначені рожевим кольором залишки у ІДЕ-Ес, які включають у себе Аг9419 і Меї430, є спільними для поверхонь взаємодії як із Гарз омалізумабу, так і з ОАВРІп Е2. 79.
Фіг. 5. Конформаційна гнучкість у ІДЕ-Ес. (А) Вид збоку незв'язаного ІДЕ-Ес8, що показує його асиметричний вигин під гострим кутом. (В) Вид спереду незв'язаного ІДЕ-Ес (поворот на 90" у напрямку проти годинникової стрілки відносно виду, показаного на секції (А). (С) Вид збоку ІДЕ-
Ес зі складу комплексу з ГарЗ омалізумабу, що показує частково вигнуту конформацію. (0) Вид спереду ІДЕ-Рс у складі комплексу з РГарЗ3 омалізумабу (поворот на 907 у напрямку проти годинникової стрілки відносно виду, показаного на секції (С). (ЕЕ) Вид збоку повністю розпрямленого ІДЕ-Рс, захопленого Раб до ІДЕ-ЕРс (Рар3 омалізумабу)б. (Р) Вид спереду розпрямленого ІДЕ-ЕРс (поворот на 907 у напрямку проти годинникової стрілки відносно виду, показаного на секції (Е).
Фіг. 6. Конформаційна гнучкість у ІДЕ-Ес. Гнучкість ІДЕ-Ес та розгинання із зігнутої у повністю розпрямлену конформацію раніше вивчали за допомогою досліджень молекулярної динаміки "5.
Розгинання ІДЕ-Рс представлене у вигляді поверхні вільної енергії, як описано раніше"б. (А)
Розпрямлена конформація ІдЕ-Рс, захопленого у кристалічній структурі комплексу Еарз омалізумабулЛдуБ-Ес'б. (В) Частково зігнута конформація ІдЕ-Бс, що спостерігається у кристалічній структурі комплексу Гарз омалізумабу/Лдєе-Ес. (С) Зігнута конформація незв'язаного
ІЗЕ-ЕРс"8. Зігнута конформація ІДЕ-Рс займає басейн із найнижчою енергією, у той час як частково зігнута конформація, яка спостерігалась у комплексу ГарзЗ омалізумабуЛдєЕ-Ес, займає явно відмінний енергетичний басейн (В).
Фіг. 7. Порушення взаємодії між ІДЕ-Ес та ЕсеєВІ. У комплексі з РарЗ омалізумабу СеєЗ-домени набувають найбільш відкритої конформації з описаних на даний час для ІДдБЕ-Ес, що перешкоджає взаємодії з ЕсеєМВіІс. Структура ІДЕ-Рс у комплексі з ЕсєВІо? позначена жовтим кольором, а також позначені два субсайти взаємодії з рецептором. Структуру РарзЗ омалізумабу у комплексі з ІДЕ-Ес накладали на Сє4-домени, та СеєЗ-домени позначені синім кольором.
Положення Нівзг424 та Рго426 у двох структурах показані для виділення різних положень, яких набувають СеєЗ-домени.
Фіг. 8. Порушення взаємодії між ІЧЕ-Ес та СО23. (А) Залишки у СеЗ-домені, які є спільними для поверхонь взаємодії як з Гар3З омалізумабу, так і з СО23, позначені жовтим кольором. (В)
Накладання СеєЗ-доменів (темно-сірий) із комплексу Рар3 омалізумабу/ЛдЕ-Ес та комплексу
СО23/Есе3-4 " виявило зіткнення між СО23 (жовтий) та Гарз омалізумабу (рожевий).
Фіг. 9. Дослідження взаємодії ГарЗ омалізумабу з ІДЕ-Ес. (А) Зв'язування РарЗ омалізумабу з ЮДЕ-Ес, захопленим через С-кінцеву Нів-мітку; потік Рар3 омалізумабу пропускали над ІДЕ-Ес у наступних концентраціях: 100 нМ (чорний), 50 нМ (червоний), 25 нМ (зелений), 12,5 нМ (синій), 6,2 нМ (блакитний), 3,1 нМ (фіолетовий), 1,6 нМ (пурпурний) та 0,8 нМ (темно-червоний).
Використовували стандартні методи з двома стандартними зразкамизб: кожну концентрацію аналізували у двох повторностях. (В) Зв'язування другого сайту зв'язування Гарз характеризували з застосуванням експерименту з дослідження зв'язування методом 5РА
Зо (поверхневий плазмонний резонанс) у сендвіч-форматі. ІДЕ-Ес захоплювали на поверхні з Гарз омалізумабу, а потім другу молекулу ГарЗ3 омалізумабу додавали до комплексу ІЗЕ-Ес/Рарз омалізумабу у концентраціях, що становлять 1000 нМ (чорний), 500 нМ (червоний), 250 нм (зелений), 125 нМ (синій), 62,5 нМ (блакитний), 31,2 нМ (фіолетовий), 15,6 нМ (пурпурний), 7,8
НМ (темно-червоний) та 0 нМ (темно-синій). (С)
Порівняння здатності Рар3 омалізумабу до зв'язування з ІДЕ-ЕРс, що захоплений за допомогою С-кінцевої Нібз-мітки (червоний), та ІДЕ-Ес, який захоплений шляхом зв'язування з
ЕсеєВіІо (синій); серію двократних розведень досліджували для кожного випадку, причому найвища концентрація становила 1000 нМ. На графіку показано, що ГабЗ омалізумабу все ще може зв'язуватись із комплексом ІДЕ-Ес/ЕсеєВіс, але з низькою величиною Втах. (Ю) Прискорена дисоціація комплексу ІдЕ-Рс/ЕсєНІо, опосередкована підвищенням концентрацій Еарз омалізумабу. Спочатку одержували комплекс ІдЕ-Ес/ЕсєВІсо у співвідношенні 1:11 шляхом захоплення ІдЕ-Ес на іммобілізованому ЕсеєВіс з наступним зв'язуванням Рар3 омалізумабу у наступних концентраціях: 5000 нМ (пурпурний), 1000 нМ (фіолетовий), 200 нМ (блакитний). 40
НМ (синій), 8 нМ (зелений), 1,6 нМ (червоний) та 0 нМ (чорний). На графіку показане посилення процесу прискореної дисоціації. Всі концентрації досліджували у двох повторностях. Усі експерименти зі зв'язування здійснювали при 25 "С, за винятком тих, у яких характеризували другий сайт зв'язування Рар3 омалізумабу (фіг. 4В), які виконували при 5 "С для мінімізації алостеричної комунікації між двома сайтами.
Фіг. 10. Аналіз безпосереднього зв'язування, конкурентні експерименти та прискорена дисоціація. Вимірювали безпосереднє зв'язування для ІДдЕ-ЕРс з іммобілізованим Гарз омалізумабу (А), Раб омалізумабу (В) та інтактним омалізумабом (С). Раб або інтактне антитіло ковалентно іммобілізували з низькою щільністю з використанням набору для зв'язування через аміногрупи (СЕ НеайНсагє); потік ІДЕ-Ес пропускали над цими поверхнями у ряді концентрацій при застосуванні серії двократних розведень, причому найвища концентрація становила 100
НМ. Усі концентрації досліджували у двох повторностях. (0) Експерименти з аналізу методом
ТА-ЕВЕТ (флуоресцентне резонансне перенесення енергії з часовим розрізненням) конкуренції між Рабз омалізумабу та оу-гібридним білком за зв'язування з ІДЕ-Ес. Зв'язування між міченим тербієм су-гібридним білком та міченим Аїеха Рійог 647 ІДЕ-Ес вимірювали з використанням зростаючих концентрацій неміченого РабзЗ омалізумабу в якості інгібітора: 0 мкМ (чорний), 2,5
НМ (синій), 5 НМ (зеленіш), 10 нМ (пурпурний), 20 нМ (червоний). В якості інгібітора Раб омалізумабу впливає як на умовну Ко, так і на Втлах для взаємодії між ІДЕ-Ес та оу-гібридним білком, що вказує на деякі властивості алостеричного інгібування. (Е) Порівняння прискореної дисоціації комплексу ІДЕ-Ес/5ЕсеєВіс, опосередкованої інтактним омалізумабом (чорний), Раб омалізумабу (червоний) або Рарз омалізумабу (синій), кожний з яких присутній у концентрації 5
МКМ.
Фіг. 11. Типова карта електронної щільності. Стереозображення карти електронної щільності 2Ео-Ес, нанесеної у вигляді контуру при 1,1с, показане для частини ланцюга А СеєЗ-домену та ковалентно приєднаного через атом М олігосахаридного фрагменту у Азп394.
Фіг. 12. Одержана методом Віасоге сенсограма дисоціації ІДЕ-Рс від іммобілізованого 5ЕсеВіс. Дисоціацію відстежували у присутності робочого буфера (суцільна лінія) або партнерів
ІДЕ по зв'язуванню (усі інші сенсограми). Аналіз здійснювали, як описано у розділі Метод аналізу (1) у прикладі 2.
Фіг. 13. Одержана методом Віасоге сенсограма дисоціації ІДЕ-Рс від іммобілізованого 5ЕсеВіс. Дисоціацію відстежували у присутності контрольного супернатанту (суцільна лінія) або партнерів ІДЕ по зв'язуванню (всі інші сенсограми). Аналіз здійснювали, як описано у розділі
Метод аналізу (2) у прикладі 2.
Фіг. 14. Аналіз дисоціації міченого АТеха488 ІдЕ-Ес від поверхні клітин ВВІ -5Х38. Виміряні дані зв'язування, нормалізовані до 100 95 у момент часу 1-0, та дані дисоціації, нанесені на графік у вигляді зміни у частці ІДЕ-Ес, що залишився зв'язаним, у залежності від часу.
Фіг. 15. Аналіз впливу введення терапевтичної дози Раб омалізумабу дикого типу та абз омалізумабу у моделі 72-годинної РСА(пасивна шкірна анафілаксія).
Фіг. 16. Залишки 224-547 у послідовності людського ІДЕ-Ес дикого типу (які показані у БЕО ІЮ
Мо 108), причому залишки 224 та 547 виділені жирним шрифтом. Нумерація відповідає
Ботпдюп апа Веппісн (1978) Іттипої. Нем. 41:3-25, де І (І ви; лейцин) після І 253 має номер
І235а (у квадратних дужках), а наступний залишок являє собою С254. Решта залишків пронумеровані послідовно без додаткових доданих елементів. Залишки у епітопах показані з використанням зірочки (7).
Докладне розкриття даного винаходу
Зо Нумерація амінокислот у антитілі у даному документі буде наведена або у формі безперервної амінокислотної послідовності антитіла (наприклад, омалізумабу, що містить послідовність МН з 5ЕО ІЮО Мо 1 та послідовність МІ з 5ЕО ІО Мо 20 або 5ЕО ІО Мо 129), так звана нумерація "рар", або може використовуватись загальноприйнята схема нумерації за
Караї У випадку, коли описані характерні частини імуноглобулінів (СОВА - ділянки, що визначають комплементарність, або ЕВ - каркасні ділянки) у послідовності МН або МІ, вони є з'єднаними у стандартному порядку (МН - ЕВ-НІ.СОВ-НІ.ЕВ-Н2.СОВ-Н2г.ЕВ-НЗ.СОВ-НЗ.ЕВ-НА;
МІ -ЕВ-І1.СОВ-11.ЕВ-12.СО8-12.ЕВ-13.СО8-13.ЕВ-14). У випадку нумерації "рар" для омалізумабу частини МН (5ЕО ІЮ Мо 1) являють собою наступні: ЕВ-НІ1 (амінокислоти 1-25),
СОВ-НІ1 (26-36), ЕВ-Н2 (37-50), СОВ-Н2 (51-66), ЕВ-НЗ (67-98), СОВ-НЗ (99-110), ЕВ-НА (111- 121); тоді як нумерація за Кабаї є наступною: ЕВ-НІ (амінокислоти 1-25), СОВ-НІ (26-35), ЕВ-Н2 (36-49), СОВ-Н2 (50-65), ЕВ-НЗ (66-94), СОВ-НЗ (95-102), ЕВ-НА (103-113). У випадку нумерації "рар" для омалізумабу частини МІ (5ЕО ІО Мо 20) являють собою наступні: ЕВ-І 1 (амінокислоти 1-23), СОВ-І 1 (24-38), ЕВ-І2 (39-53), СОВ-12 (54-60), ЕВ-І З (61-92), СОВ-1 3 (93-101), ЕВ-І 4 (102-111); тоді як нумерація за Кабраї є наступною: ЕВ-І1 (амінокислоти 1-23), СОВ-І 1 (24-34),
ЕВ-12 (35-49), СОВ-1 2 (50-56), ЕВ-І З (57-88), СОВ-І З (89-97), ЕВ-1І 4 (98-107).
Нумерація в антитілі ІДЕ є такою, як описано у Юоітіпдіоп 4 Веппісп (1978) Іттипої. Неу. 41:3-25). Отже, поліпептиди ІДЕ-Ес, які застосовуються у даному винаході (див. ФЕО ІЮ Мо 108), походять із М224-К547 (включаючи мутацію С225А). Як показано на фіг. 16 нумерація, якої дотримуються, відповідає Юоітіпдіоп апа Веппісп (1978) Іттипої. Нем. 41:3-25, де І (І еи, лейцин) після положення 253 має номер І 253а, а решта залишків послідовно пронумеровані від
І253а як 0254 і т.д. У кристалографічних експериментах для спрощення профілю глікозилування у ІДЕ-Ес також уводили наступні мутації: М2650 і М3710) В цілому, прийнято, що ділянка Сє2 у ЩДЕ-Ес займає послідовність 5226-0330. Посилання на ЧЕ у даному документі може являти собою посилання на людський ІДЕ (та навпаки), а також може являти собою посилання на ІДдЕ-Рс у контексті аналізів та способів, описаних у даному документі.
Послідовність плечей Рар повнорозмірного людського антитіла ІДЕ не включена у даний опис, оскільки вони не присутні у кристалічних структурах.
У даному документі посилання на "омалізумаб" являє собою посилання на продукт Хоїаї"Ф, що комерційно реалізується; або на повнорозмірне антитіло Ідс, яке містить важкий ланцюг, що 60 містить амінокислотну послідовність МН, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 1, та легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність МІ, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 20; або на повнорозмірне антитіло ІдСї, яке містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність МН-СНІ, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 5, та легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність МІ -СІ, яка являє собою 5ЕО ІЮ Мо 24; або на повнорозмірне антитіло Ідс, яке містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність МН-СНІ-Бс, яка являє собою 5БЕО ІО Мо 9, та легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність МІ/-СЇ, яка являє собою 5БЕО ІО Мо 24.
Посилання на "Раб омалізумабу" являє собою посилання на Рар-фрагмент, який містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність МН, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 1, та легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність МІ, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 20; або (зокрема) на Рар-фрагмент, який містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність МН-СНІ, яка являє собою 5БЕО ІО Мо 5, та легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність МІ -СІ,, яка являє собою 5ЕО ІЮ Мо 24.
Загальні визначення
Якщо не визначено інше, усі технічні та наукові терміни, які використовуються у даному документі, мають таке ж саме значення, що звичайно зрозуміле середньому спеціалісту у галузі техніки, до якої належить даний винахід. Незважаючи на те що способи та матеріали, подібні або еквівалентні описаним у даному документі, можуть бути застосовані у практичній реалізації або випробуванні даного винаходу, у даному документі описані підходящі способи та матеріали.
Усі публікації, патентні заявки, патенти та інші джерела, які згадуються у даному документі, включені за допомогою посилання у своїй повноті. Окрім того, матеріали, методи та приклади є тільки ілюстративними та не призначені для обмеження.
Якщо контекст не вимагає іншого, терміни в однині будуть включати у себе форми множини, та терміни у множині будуть включати у себе форми однини. У даній заявці використання слова "або" означає "та/або", якщо не зазначено інше. Більш того, використання терміну "що включає у себе", а також інших форм, таких як "включає у себе" та "включений", не є обмежувальним.
Також, такі терміни, як "елемент" або "компонент" охоплюють як елементи та компоненти, що містять одну одиницю, так і елементи та компоненти, які містять більш ніж одну субодиницю, якщо спеціально не зазначено інше.
В цілому, термінологія, яка використовується у зв'язку з методиками культивування клітин та тканин, методиками молекулярної біології, імунології, мікробіології, генетики та хімії та гібридизації білків і нуклеїнових кислот, та самі методики, що описані у даному документі, є такими, що добре відомі та широко застосовуються у рівні техніки. Способи та методики за даним винаходом, в цілому, здійснюють згідно із загальноприйнятими способами, які є добре відомими у рівні техніки та описані у різноманітних загальних та більш конкретних джерелах, що цитуються та обговорюються у даному описі, якщо не зазначено інше. Ферментативні реакції та методики очищення можна здійснювати у відповідності до технічних вимог виробника, як звичайно виконується у даній галузі або як описано у даному документі. Термінологія, що використовується у зв'язку з лабораторними процедурами та методиками аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії та медичної та фармацевтичної хімії, та самі ці процедури та методики, описані у даному документі, є такими, що добре відомі та широко застосовуються у рівні техніки. Стандартні методики застосовують для процедур хімічного синтезу, хімічного аналізу, одержання фармацевтичного препарату, одержання складу та доставки, а також лікування пацієнтів.
Щоб даний винахід було легше зрозуміти, вибрані терміни є визначеними нижче.
Термін "хазяїн" у контексті даного документа, як правило, відноситься до суб'єкта-людини, та, зокрема, до випадку, коли людський або гуманізований каркас використовується в якості акцепторної структури. У випадку, коли лікуванню піддається інший хазяїн, спеціалісту у даній галузі техніки слід розуміти, що антитіло або антигензв'язувальний засіб можуть потребувати адаптації до такого хазяїна для того, щоб уникнути відторгнення, або щоб зробити їх більш сумісними. Відомо, як застосовувати СОВ у даному винаході та вбудовувати їх за допомогою методів генної інженерії у відповідний каркас або пептидну послідовність для бажаної доставки та функціонування у ряді хазяїнів. Інші хазяїни можуть включати у себе інші види ссавців або хребетних. Отже, термін "хазяїн", в якості альтернативи, може відноситись до тварин, таких як миші, мавпи, собаки, свині, кролі, домашні свині (свині та кнури), жуйні тварини, коні, домашня птиця, коти, миші, корови, собаки та подібні, при цьому антитіло або антигензв'язувальний засіб, якщо необхідно, переважно є сконструйованими для сумісності з хазяїном.
Термін "поліпептид" у контексті даного документа відноситься до будь-якого полімерного ланцюга з амінокислот. Терміни "пептид" та "білок" використовуються взаємозамінно з терміном поліпептид, і також відносяться до полімерного ланцюга з амінокислот. Термін "поліпептид"
охоплює нативні або штучні білки, фрагменти білків та поліпептидні аналоги білкової послідовності. Поліпептид може бути мономерним або полімерним.
Термін "виділення" в контексті даного документа відноситься до процесу, під час якого хімічну молекулу, таку як а поліпептид, роблять такою, що, по суті, не містить компонентів, асоційованих з нею у природних умовах, за допомогою виділення, наприклад, із застосуванням методик очищення білків, які є добре відомими у рівні техніки.
Терміни "специфічне зв'язування" або "що специфічно зв'язується", які використовуються у даному документі по відношенню до взаємодії антитіла, білка або пептиду з другою хімічною молекулою, означають, що взаємодія є залежною від присутності на хімічній молекулі конкретної структури (наприклад, "антигенної детермінанти" або "епітопа". які визначені нижче); наприклад, антитіло розпізнає та зв'язується зі специфічною білковою структурою, а не з білками взагалі. Якщо антитіло є специфічним до епітопа "А", присутність молекули, яка містить епітоп А (або незв'язаний, немічений А), у реакційній суміші, що містить мічений "А" та антитіло, буде знижувати кількість міченого А, який зв'язується з антитілом. У випадку, коли епітоп за даним винаходом згадується у даному документі, антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом є специфічними до зазначеного епітопа.
Термін "антитіло" у контексті даного документа у широкому сенсі відноситься до будь-якої молекули імуноглобуліну (Ід), що складається з чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких (Н) ланцюгів і двох легких (І) ланцюгів, або до її будь-якого функціонального фрагмента, мутанта, варіанта або похідної, які зберігають щонайменше деяку частину характеристик зв'язування з епітопом у молекули ДЖ, що дозволяють їм специфічно зв'язуватись з ІДЕ. Такі формати мутанта, варіанта або похідної антитіла є відомими у рівні техніки та описані нижче. їх необмежувальні варіанти здійснення обговорюються нижче. Антитіло вважається "здатним до зв'язування" з молекулою (або епітопом), якщо воно є здатним до специфічної реакції з молекулою (або епітопом), внаслідок якої молекула (або епітоп) зв'язується з антитілом.
Передбачається, що "моноклональне антитіло" у контексті даного документа відноситься до препарату молекул антитіла, які мають однакову амінокислотну послідовність важкого ланцюга та однакову амінокислотну послідовність легкого ланцюга, або до їх будь-якого функціонального фрагмента, мутанта, варіанта або похідної, що зберігають щонайменше
Зо характеристики зв'язування з епітопами у легкого ланцюга молекули Ід, на відміну від препаратів "поліклональних" антитіл, які містять суміш різних антитіл. Моноклональні антитіла можуть бути одержані за допомогою декількох відомих технологій, таких як фаговий, бактеріальний, дріжджовий або рибосомальний дисплей, а також за допомогою класичних способів, прикладом яких є одержання антитіл із гібридоми (наприклад, антитіла, що секретується гібридомою, одержаною за допомогою гібридомної технології, такої як стандартна гіоридомна технологія Келера та Мільштейна ((1975) Майте 256:495-497).
У повнорозмірному антитілі кожний важкий ланцюг складається з варіабельної ділянки важкого ланцюга (яка позначається у даному документі скороченням НСМА або УН) та константної ділянки важкого ланцюга (СН). Константна ділянка важкого ланцюга складається з чотирьох доменів: або СНІ, шарнірний, СН2 та СНЗ (важкі ланцюги у, с: та є), або СНІ, СН2, СНЗ та СН4 (важкі ланцюги нд та є). Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної ділянки легкого ланцюга (яка позначається у даному документі скороченням /СМА або МІ) та константної ділянки легкого ланцюга (СІ). Константна ділянка легкого ланцюга складається з одного домену, СІ. Ділянки МН та Мі. можна додатково поділити на гіперваріабельні ділянки, які називаються ділянками, що визначають комплементарність (СОР), у проміжках між якими знаходяться ділянки, що є більш консервативними, які називаються каркасними ділянками (ЕВ).
Кожна МН та Мі складається з трьох СОВ та чотирьох ЕВ, розташованих у напрямку з аміно- кінця до карбокси-кінця у наступному порядку: ЕІ, СОВІ, ЕВ2, СОВ2г, ЕАЗ, СОВЗ, Ева.
Молекули імуноглобуліну можуть відноситись до будь-якого типу (наприклад, Ідс, ЧЕ. І9М, дО,
БО ІЗА та Іду), класу (наприклад, Ідаі, дае, ІдаЗ, Ід, ІдАЇ та ІДА2) або підкласу.
Термін "антигензв'язувальний засіб" у контексті даного документа відноситься до одного або декількох фрагментів або частин антитіла, що зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном (наприклад, ІДЕ), або до синтетичних модифікацій фрагментів антитіла, які зберігають бажану здатність до зв'язування з антигеном. Було показано, що антигензв'язувальна функція антитіла може виконуватись фрагментами або певними частинами повнорозмірного антитіла або їх модифікаціями. Варіанти здійснення включають у себе біспецифічні формати, формати з подвійною специфічністю та мультиспецифічні формати, які можуть специфічно зв'язуватись із двома або більше різними антигенами або з декількома епітопами або ділянками переривчастого епітопа антигена. Необмежувальні приклади бо антигензв'язувальних засобів включають у себе (ї) Рар-фрагмент, моновалентний фрагмент, що складається з МІ-, МН-, СІ- ії СНІ-доменів; (ії) Е(ар)2-фрагмент, бівалентний фрагмент, який містить два ЕРар-фрагменти, з'єднані дисульфідним містком у шарнірній ділянці; (ії) Ба- фрагмент, що складається з МН- і СНІ1-доменів; (ім) Ем-фрагмент, який складається з МІ- і МН- доменів одного плеча антитіла, (м) даАбБ-фрагмент (Умаго еї а!., (1989) Маїшге 341:544-546, М/іпіег еї аІ., РСТ публікація міжнародної заявки М/О 90/05144 АЇ, включені у даний документ за допомогою посилання), який містить один варіабельний домен; (мі) виділену ділянку, що визначає комплементарність (СОР), (мії) гібридні білки з фрагментами антитіла, як наприклад, такі що за властивостями являють собою імуноглобуліни, наприклад, діатіла, 5саб, біспецифічні антитіла, тріатіло, Рар-Ем, Рар-Емхм-Ем, тріотіло, (Бар-Ем)2-Ес, та (мії) частини антитіла, такі як СОВ або петлі антитіла, прищеплені на каркаси, відмінні від імуноглобулінів, такі як фібронектин або домени "лейцинова застібка" (див. Віп7 еї а). (2005) Маї. Віоїтесн. 23:1257-1268, яка включена у даний документ). Більш того, незважаючи на те що два домени у
Ем-фрагменті, МІ та МН, кодуються окремими генами, вони можуть бути сполучені із застосуванням методик на основі рекомбінантної ДНК або інших способів за допомогою синтетичного лінкера або лінкера, що зустрічається у природних умовах, який дозволяє зробити з них єдиний білковий ланцюг, у якому пара ділянок МІ та МН утворює моновалентні молекули (відомі як одноланцюговий Ем (5сЕм); див., наприклад, Віга еї аї. (1988) Зсієпсе 242:423-426; та
Нивюп еї аї. (1988) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 85:5879-5883). Також передбачається, що такі одноланцюгові антитіла охоплюються терміном антигензв'язувальний засіб. Також охоплюються інші форми одноланцюгових антитіл, такі як діатіла. Діатіла являють собою бівалентні біспецифічні антитіла, у яких МН- та Мі -домени експресуються на одному поліпептидному ланцюзі, але використовується лінкер, який є закоротким для забезпечення можливості спарювання між двома доменами на одному й тому ж самому ланцюзі, що, таким чином, змушує домени спарюватись із комплементарними доменами іншого ланцюга та утворювати два сайти зв'язування антигена (див., наприклад, НоїЇїдег, Р., єї аІ. (1993) Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА 90:6444-6448; РоЦак, В. 9., єї аІ. (1994) Зтисіште 2:1121-1123). Такі зв'язувальні частини антитіл є відомими у рівні техніки (Копівптапп апа Риреї! єдв»., Апіїбоду Епдіпеегіпа (2001) 5рііпдег-
Мепад. Мем Моїк. 790 рр. (ІЗВМ 3-540-41354-5).
Термін "конструкція антитіла" у контексті даного документа відноситься до поліпептиду, що містить одну або декілька з антигензв'язувальних частин за даним винаходом, з'єднані з лінкерним поліпептидом або константним доменом імуноглобуліну. Лінкерні поліпептиди містять два або більше амінокислотних залишків, з'єднані пептидними зв'язками, та їх застосовують для з'єднання однієї або декількох антигензв'язувальних частин. Такі лінкерні поліпептиди є добре відомими у рівні техніки (див., наприклад, Ноїїдег, Р., єї аіІ. (1993) Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА
З5 90:6444-6448; РоЦак, А. У. еї аїЇ. (1994) бігисіше 2:1121-1123). Константний домен імуноглобуліну відноситься до константного домену важкого або легкого ланцюга, наприклад, константних доменів людського ІдА, 40, ІДЕ, дб; або ІДМ. Амінокислотні послідовності константних доменів важкого ланцюга та легкого ланцюга відомі у рівні техніки. Необмежувальні приклади константної ділянки важкого у!-ланцюга Ід та легких 7, - та к-ланцюгів Ід наведені у таблицях 8 та 6, відповідно.
Окрім того, антитіло або його антигензв'язувальна частина можуть бути частиною більшої імуноадгезивної молекули, утвореної шляхом ковалентної або нековалентної асоціації антитіла або частини антитіла з одним або декількома іншими білками або пептидами. Приклади таких імуноадгезивних молекул включають застосування корової ділянки стрептавідину для одержання тетрамерної молекули 5сЕм (Кіргуапом, 5. М, єї аї. (1995) Нитап Апіібодієв апа
Нубгідотаз 6:93-101) та використання цистеїнового залишка, маркерного пептиду та С-кінцевої полігістидинової мітки для одержання бівалентних та біотинільованих молекул 5сЕм (Кіргіуапом,
З. М, еї аї. (1994) Мої. ІттипоїЇ. 31:1047-1058). Частини антитіл, такі як Раб- та Е(ар)2- фрагменти, можуть бути одержані з цілих антитіл із застосуванням традиційних методик, таких як розщеплення цілих антитіл папаїном або пепсином, відповідно. Більш того, антитіла, частини антитіл та імуноадгезивні молекули можна одержувати з застосуванням стандартних методик на основі рекомбінатної ДНК, які описані у даному документі.
Передбачається, що термін "виділене антитіло" у контексті даного документа відноситься до антитіла, яке, по суті, не містить інших антитіл, що характеризуються відмінними антигенними специфічностями (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з ІДЕ, практично не містить антитіл, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від ЇДЕ). Тим не менш, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується, наприклад, із людським ІДЕ, може характеризуватись перехресною реактивністю з іншими антигенами, такими як молекули ІЗЕ з інших видів. Більш того, виділене антитіло може, по суті, не містити інший клітинний матеріал 60 та/або хімічні сполуки.
Термін "антитіло з прищепленими СОВ" відноситься до антитіл, що містять послідовності варіабельної ділянки важкого та легкого ланцюга з одного виду, але в яких послідовності однієї або декількох із ділянок СОВ у МН та/або М замінені на послідовності СОВ з іншого виду, як наприклад, антитіла, що мають людські варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів, в яких один або декілька з людських СОВ (наприклад, СОВЗ) було замінено на послідовності СОВ миші.
Терміни "нумерація за Караї" "визначення за Кара та "маркування за Кабаї" використовуються у даному документі взаємозамінно. Ці терміни, що є відомими у рівні техніки, відносяться до системи нумерації амінокислотних залишків, які Є більш варіабельними (тобто гіперваріабельними), ніж інші амінокислотні залишки у варіабельних ділянках важкого та легкого ланцюгів антитіла або його антигензв'язувальної частини (КаБбаї сї аї!. (1971) Апп. МУАсадй, 5сі. 190:382-391; та Караї, Е. А., єї а. (1991) бБедиепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, ГА
Еайіоп, 0.5. Оераптепі ої Неайй апа Нитап 5егмісев5, МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242). У випадку варіабельної ділянки важкого ланцюга гіперваріабельна ділянка знаходиться в межах положень амінокислот 31-35 (СОВ-НІ), залишків 50-65 (СОВ-Н2) та залишків 95-102 (СОВ-НЗ) у відповідності з системою нумерації за Кабраї. Тим не менш, згідно із Споїніа (Споїніа вї аї., (1987)
У. Мої. Віо!., 196, 901-917 (1987)), петлі, що еквівалентні СОВ-НІ, простягаються від залишка 26 до залишка 32. Отже, якщо не зазначено інше, передбачається, що "СОВ-НІ1" при використанні у даному документі відноситься до залишків 26-35, які описуються комбінацією системи нумерації за Кабаї і топологічним визначенням петель за СПпоїйіа. У випадку варіабельної ділянки легкого ланцюга гіперваріабельна ділянка знаходиться в межах положень амінокислот 24-34 для СОВІ 1, положень амінокислот 50-56 для СОВІ 2 та положень амінокислот 89-97 для
СОВІЗ.
У контексті даного документа терміни "акцептор" та "акцепторне антитіло" відносяться до антитіла або послідовності нуклеїнової кислоти, які забезпечують або кодують щонайменше 80 965, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або 100 95 амінокислотних послідовностей однієї або декількох із каркасних ділянок. Згідно з деякими варіантами здійснення термін "акцептор" відноситься до амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти антитіла, що забезпечує або кодує константну(константні)
Зо ділянку(ділянки). Згідно з ще одним варіантом здійснення термін "акцептор" відноситься до амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти антитіла, що забезпечує або кодує одну або декілька з каркасних ділянок та константних ділянок. Згідно з конкретним варіантом здійснення термін "акцептор" відноситься до амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти людського антитіла, що забезпечує або кодує щонайменше 80 96, переважно, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або 10095 амінокислотних послідовностей однієї або декількох із каркасних ділянок. У відповідності до цього варіанта здійснення акцептор може містити щонайменше 1. щонайменше 2, щонайменше 3. щонайменше 4, щонайменше 5 або щонайменше 10 амінокислотних залишків, які не зустрічаються у одному або декількох конкретних положеннях у людському антитілі. Акцепторна каркасна ділянка та/(або акцепторна(акцепторні) константна(константні) ділянка(ділянки), наприклад, можуть походити або можуть бути одержані з гена антитіла зародкового типу, гена зрілого антитіла, функціонального антитіла (наприклад, з антитіл, які добре відомі у рівні техніки, антитіл, що знаходяться у розробці, або антитіл, які є комерційно доступними).
У контексті даного документа термін "СОН" відноситься до ділянки, що визначає комплементарність. у межах послідовностей варіабельної ділянки антитіла. У кожній з варіабельних ділянок важкого ланцюга та легкого ланцюга присутні три СОВ, які позначені
СОВНІ, СОВН2 та СОВНЗ для СОВ важкого ланцюга та СОВІ1, СОВІ2 та СОВІ З для СОВ легкого ланцюга. Термін "набір СОВ" у контексті даного документа відноситься до групи з трьох
СОВ. які зустрічаються в одній варіабельній ділянці, здатній до зв'язування з антигеном. Точні границі цих СОВА були визначені відмінно у відповідності з різними системами. Система, описана КарБбаї (Кабаї єї аї... Зедпепсез ої Ргоїеїп5 ої Іттипо!одісаї Іпіегеві (Майопаї Іп5ійшев ої
Неацй, Веїпезаа, Ма. (1987) та (1991)), не тільки забезпечує однозначну систему нумерації залишків, застосовну до будь-якої варіабельної ділянки антитіла, але також забезпечує точні границі залишків, які визначають три СОВ. Ці СОВ можуть бути названі СОВ за Кабаї. Споїніа та співробітники (Споїйпіа 5 І евК, у. Мої. Віої. 196:901-917 (1987); та Споїніа єї аї... Майшгеє 342:877-883 (1989)) виявили, що певні субчастини в межах СОВ за Кабраї набувають практично ідентичних конформацій пептидного кістяка, незважаючи на те, що вони характеризуються значним розмаїттям на рівні амінокислотної послідовності. Ці субчастини позначили як І, 12 та 60 ЇЗ або НІ, Н2 та НЗ, де літери "І" та "Н" позначають ділянки легкого ланцюга та важкого ланцюга, відповідно. Ці ділянки можуть бути названі СОВА за Споїпіа, які мають границі, що перекриваються з СОВ за Кабаї. Інші границі, що визначають СОН, які перекриваються з СОВ за Кабраї, було описано Радіап (ЕАБЗЕВ .). 9:133-139 (1995)) та МассСаїїшт (У Мої Віо! 262(5):732- 45 (1996)). Інші визначення СОВА можуть не дотримуватись чітко однієї з вищенаведених систем, але, тим не менш, вони будуть перекриватися з СОВ за Кабаї, хоча вони можуть бути вкорочені або подовжені з урахуванням прогнозування або експериментальних даних про те, що конкретні залишки або групи залишків або навіть цілі СОВ не впливають істотно на зв'язування з антигеном. У способах, які застосовуються у даному документі, можуть використовуватись СОВ, визначені у відповідності з будь-якою з цих систем, хоча у переважних варіантах здійснення використовуються СОН, визначені за Кабаї, або за Спошпіа, або за їх комбінацією.
У контексті даного документа термін "канонічний" залишок відноситься до залишка у СОВ або каркасі, який визначає конкретну канонічну структуру СОВ, яка визначена Споїніа еї аї. (у.
Мої. Віої. 196:901-907 (1987); Споїніа єї аї., 9). Мої. ВіоІ. 227:799 (1992), обидва з цих джерел включені у даний документ за допомогою посилання). Згідно з Споїпіа єї аІ. критично важливі частини СОВА у багатьох антитіл характеризуються практично ідентичними конформаціями пептидного кістяка, незважаючи на велику різноманітність на рівні амінокислотної послідовності.
Кожна канонічна структура визначає у першу чергу набір кутів повороту пептидного кістяка для суміжного сегмента з амінокислотних залишків, що утворюють петлю.
У контексті даного документа терміни "донор" і "донорне антитіло" відносяться до антитіла, що забезпечує одну або декілька СОВ. Згідно з переважним варіантом здійснення донорне антитіло являє собою антитіло з виду, відмінного від антитіла того виду, з якого каркасні ділянки є одержаними або з якого вони походять. У контексті гуманізованого антитіла термін "донорне антитіло" відноситься до антитіла, відмінного від людського, яке забезпечує одну або декілька
Сов.
У контексті даного документа термін "каркас" або "каркасна послідовність" відносяться до решти послідовностей варіабельної ділянки мінус СОВ. Оскільки точне визначення послідовності СОВА може бути дане за допомогою різних систем, значення терміну "каркасна послідовність" визначається, відповідно, різними інтерпретаціями. Шість СОВ (СОВ-11, -І2 і -І З легкого ланцюга та СОВ-НІ, -Н2 ї -НЗ важкого ланцюга) також ділять каркасні ділянки на
Зо легкому ланцюзі та важкому ланцюзі на чотири субділянки (ЕВ, ЕР2, ЕВЗ та ЕН4) на кожному ланцюзі, причому СОВІ1 розташований між ЕВ! і ЕН2, СОВА - між ЕНВ2 і ЕВЗ, та СОВЗ - між ЕВЗі
ЕН4. За відсутності визначення конкретних субділянок як ЕНТ, ЕВ2, ЕВЗ або ЕВА4, каркасна ділянка, на яку посилаються у інших випадках, являє собою об'єднані ЕЕ в межах варіабельної ділянки одного ланцюга імуноглобуліну, що зустрічається у природних умовах. У контексті даного документа ЕВ являє собою одну з чотирьох субділянок, а використання скорочення ЕВ для множини відноситься до двох або більшої кількості з чотирьох субділянок, що складають каркасну ділянку.
У контексті даного документа терміни "ген антитіла зародкового типу" або "фрагмент гена" відносяться до послідовності імуноглобуліну, що кодується нелімфоїдними клітинами, які не піддалися процесу дозрівання, що веде до генетичного перегрупування та мутації для експресії конкретного імуноглобуліну. Див., наприклад, Зпаріго єї аї., Стї. Вему. Іттипої. 22(3): 183-200 (2002); МагспаІопіє еї а), Айм Ехр Мей Віої. 484:13-30 (2001). Однією з переваг, які забезпечуються різними варіантами здійснення даного винаходу, є вигода від знання того, що гени антитіл зародкового типу з більшою вірогідністю, ніж гени зрілих антитіл, зберігають основні структури амінокислотної послідовності, характерні для індивідів виду, отже, вони будуть з меншою вірогідністю розпізнаватись як такі, що походять із чужорідного джерела, при їх терапевтичному застосуванні для цього виду.
У контексті даного документа термін "ключові" залишки відноситься до певних залишків у межах варіабельної ділянки, які мають більший вплив на специфічність та/або афінність зв'язування в антитіла, зокрема, в гуманізованого антитіла. Ключовий залишок включає у себе, без обмеження, один або декілька з наступних: залишок, який є суміжним із СОВ, потенційний сайт глікозилування (може являти собою сайт або М-, або О-глікозилування), рідкісний залишок, залишок, здатний до взаємодії з антигеном, залишок, здатний до взаємодії з СОВ, канонічний залишок, контактний залишок між варіабельною ділянкою важкого ланцюга та варіабельною ділянкою легкого ланцюга, залишок в межах верньєрної зони та залишок у ділянці, яка співпадає у визначенні СОН варіабельної ділянки важкого ланцюга за Споїйіа та у визначенні першої каркасної ділянки важкого ланцюга за Кабаї.
Термін "гуманізоване антитіло", в цілому, відноситься до антитіл, що містять послідовності варіабельних ділянок важкого та легкого ланцюгів із виду, відмінного від людини (наприклад, бо кролика, миші і т.д.), проте, у яких щонайменше частину послідовності МН та/або МІ було змінено, щоб зробити її більш "подібною до людської", тобто, більш подібною до людських послідовностей варіабельної ділянки зародкового типу. Одним типом гуманізованого антитіла є антитіло з прищепленими СОВ, у якому людські послідовності СОВА є введеними у послідовності
МН та МІ, відмінні від людських, із заміною відповідних послідовностей СОВ, відмінних від людських. Інший тип гуманізованого антитіла являє собою антитіло з прищепленими СОВ, у якому щонайменше одна СОВ, відмінна від людської, вставлена у людський каркас. На останньому, як правило, фокусується даний винахід.
Зокрема, термін "туманізоване антитіло" у контексті даного документа являє собою антитіло або його варіант, похідну, аналог або фрагмент, який імуноспецифічно зв'язується з антигеном, що представляє інтерес, та який містить каркасну (ЕВ) ділянку, що, по суті, має амінокислотну послідовність людського антитіла, та ділянку, яка визначає комплементарність (СОР), що, по суті, має амінокислотну послідовність антитіла, відмінного від людського. Термін "по суті", який використовується у даному документі у контексті СОВА, відноситься до СОВА, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50, 55, 60, 65, 70, 75 або 80 95, переважно, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності СОВА антитіла, відмінного від людського. Згідно з одним варіантом здійснення гуманізоване антитіло має ділянку СОВА, яка має одну або декілька (наприклад, 1, 2, З або 4) амінокислотних замін, додавань та/або делецій у порівнянні з СОВ антитіла, відмінного від людського. Окрім того, СОН, відмінна від людської, може бути піддана дії методів генної інженерії, щоб зробити її більш "подібною до людської" або сумісною з людським організмом із застосуванням відомих методик. Гуманізоване антитіло містить, по суті, усі з щонайменше одного та, як правило, двох варіабельних доменів (Раб, Раб",
Каб), Е(іар)с, Ем), у яких усі або, по суті, всі з ділянок СОВА відповідають таким у імуноглобуліну, відмінного від людського (тобто, донорного антитіла), та всі або, по суті, всі з каркасних ділянок є такими з консенсусної послідовності людського імуноглобуліну. Переважно, гуманізоване антитіло також містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну (Ес), як правило, константної ділянки людського імуноглобуліну. Згідно з деякими варіантами здійснення гуманізоване антитіло містить як легкий ланцюг, так і щонайменше варіабельний домен важкого ланцюга. Антитіло також може включати СНІ, шарнір, СН2 та СНЗ або СНІ,
Сн2г, СНЗ та СН4А важкого ланцюга. Згідно з деякими варіантами здійснення гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований легкий ланцюг. Згідно з деякими варіантами здійснення гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований важкий ланцюг. Згідно з конкретними варіантами здійснення гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований варіабельний домен легкого ланцюга та/або гуманізований важкий ланцюг. Незважаючи на те що деякі з мутацій, які обговорюються у даному документі, зазвичай можуть не бути "характерними для людини", вони є недостатніми для того, щоб антитіло до ІЩЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом не були "гуманізованими".
Гуманізоване антитіло може бути вибраним із будь-якого класу імуноглобулінів, у тому числі
Іа, ІМ, да, Ід, ІдА та ІДЕ, та будь-якого ізотипу, в тому числі, без обмеження, ІдАЇ, ІЧАг, Ідаі,
Ідс2, ДОЗ та Ідс4. Гуманізоване антитіло може містити послідовності з більш ніж одного класу або ізотипу, та конкретні константні домени можуть бути вибрані для оптимізації бажаних ефекторних функцій із використанням методик, добре відомих у рівні техніки.
Каркасні ділянки та ділянки СОВА у гуманізованому антитілі не обов'язково мають бути точно відповідними вихідним послідовностям, наприклад, СОВА донорного антитіла або консенсусна каркасна ділянка можуть бути піддані мутагенезу шляхом заміни, вставки та/або делеції щонайменше одного амінокислотного залишка таким чином, що залишок у СОВ або каркасній ділянці у цьому сайті не буде точно відповідним або донорному антитілу, або консенсусній каркасній ділянці. Згідно з переважним варіантом здійснення такі мутації, тим не менш, не будуть значними. Звичайно щонайменше 50, 55, 60, 65, 70, 75 або 8095, переважно, щонайменше 85 95, більш переважно, щонайменше 90 95 та, найбільш переважно, щонайменше 9595, 9895 або 9995 залишків у гуманізованому антитілі будуть відповідати залишкам у вихідних послідовностях ЕВ та СОВ. Згідно з одним варіантом здійснення одна або декілька (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10) амінокислотних замін, додавань а/або делецій можуть бути присутні у гуманізованому антитілі в порівнянні з вихідними послідовностями ЕВ та СОВ (наприклад, в порівнянні з послідовностями омалізумабу або Рар омалізумабу). У контексті даного документа термін "консенсусна каркасна ділянка" відноситься до каркасної ділянки у консенсусній послідовності імуноглобуліну. У контексті даного документа термін "консенсусна послідовність імуноглобуліну" відноситься до послідовності, що утворена з амінокислот (або нуклеотидів), які найчастіше зустрічаються у сімействі споріднених послідовностей (510) імуноглобулінів (див., наприклад, У/іппакег, ГЕгот Сепевз о Сіопез (МепПадздезеївспаїй, М/еіпнеїт,
Септапу 1987). У сімействі імуноглобулінів кожне положення у консенсусній послідовності займає амінокислота, яка найчастіше зустрічається у цьому положенні у сімействі. Якщо дві амінокислоти зустрічаються однаково часто, будь-яка з них може бути включена у консенсусну послідовність.
У контексті даного документа "верньєрна" зона відноситься до групи залишків у каркасній ділянці, які можуть коригувати структуру СОВА та точно налаштовувати відповідність до антигену, як описано Рооїє апа М/іпіег (1992, 9. Мої. ВіоІ. 224:487-499, яка включена у даний документ за допомогою посилання). Залишки у верньєрній зоні утворюють шар, що лежить нижче СОВ та може впливати на структуру СОВ та афінність антитіла.
У контексті даного документа термін "нейтралізуючий" відноситься до нейтралізації біологічної активності ІДЕ, коли антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом, описані у даному документі, специфічно зв'язуються з білком ІЩЕ. Нейтралізація може бути результатом різних процесів зв'язування зазначеного антитіла з (ДЕ. Переважно, нейтралізуюче антитіло являє собою антитіло, чиє зв'язування з І4Е приводить у результаті до нейтралізації біологічної активності ІЧЕ. Переважно нейтралізуючий зв'язувальний білок зв'язує
ІЗЕ та знижує біологічну активність ІДЕ приблизно щонайменше на 5 95, 10 95, 15 о, 20 Фо, 25 95,
ЗО бо, 35 Ус, 40 95, 50 95, 60 У, 80 Фо, 85 95 або більше. Нейтралізація біологічної активності ІДЕ нейтралізуючим антитілом може бути оцінена шляхом вимірювання одного або декількох індикаторів біологічної активності ІДЕ, описаних у даному документі.
Передбачається, що "нейтралізуюче моноклональне антитіло" у контексті даного документа відноситься до препарату молекул антитіл, які при зв'язуванні з ІДЕ є здатними до інгібування або зниження біологічної активності ІДЕ або частково, або повністю.
У контексті даного документа терміни "ослаблення", "ослаблювати" та подібні відносяться до зменшення або зниження тяжкості симптому або стану, викликаних підвищеними рівнями ІДЕ у сироватці крові.
Терміни "епітоп" або "антигенна детермінанта" включають у себе будь-яку поліпептидну детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з імуноглобуліном або Т-клітинним рецептором. Згідно з певними варіантами здійснення епітопні детермінанти включають у себе хімічно активні поверхневі угрупування молекул, таких як амінокислоти, бокові ланцюги цукрів,
Зо фосфорил або сульфоніл, та згідно з певними варіантами здійснення вони можуть мати конкретні характеристики тривимірної структури та/або конкретні характеристики заряду. Епітоп являє собою ділянку антигена, з якою зв'язується антитіло.
Згідно з певними варіантами здійснення вважається, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, коли воно переважно розпізнає свій антиген-мішень у складній суміші білків та/або макромолекул.
Передбачається, що термін "Коп' у контексті даного документа відноситься до константи швидкості реакції асоціації антитіла з антигеном з утворенням комплексу антитіло/антиген, як відомо у рівні техніки.
Передбачається, що термін "Коб у контексті даного документа відноситься до константи швидкості реакції дисоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген, як відомо у рівні техніки.
Передбачається, що терміни "Ка" або "Ко" у контексті даного документа відносяться до константи дисоціації для конкретної взаємодії антитіло-антиген, як відомо у рівні техніки.
Міцність або афінність взаємодій імунного зв'язування можуть бути виражені через константу дисоціації (Ко або Ка) для взаємодії, причому менша Ка відповідає більшій або вищій афінності. Імунологічні властивості зв'язування у вибраних поліпептидів можна кількісно визначити із застосуванням способів, добре відомих у рівні техніки. Один такий спосіб включає вимірювання швидкостей утворення та дисоціації комплексу сайт зв'язування антигена/антиген, причому ці швидкості залежать від концентрацій партнерів, що утворюють комплекс, афінності взаємодії та геометричних параметрів, які однаково впливають на швидкість у обох напрямках.
Отже, як "константа швидкості асоціації" ("Коп"), так і "константа швидкості дисоціації" ("Коє") можуть бути визначені шляхом розрахунку концентрацій та фактичних швидкостей асоціації та дисоціації. (Маїште 361:186-87 (1993)). Співвідношення Кої/Коп дозволяє виключити всі параметри, які не пов'язані з афінністю, та дорівнює константі дисоціації Ка. Оамієв 6вї аї. (1990)
Аппиа! Нем Віоспет 59:439-473.
Термін "кон'югат антитіла" відноситься до зв'язувального білка, такого як антитіло або фрагмент антитіла або їх зв'язувальна частина, хімічно з'єднаного із другим хімічним фрагментом, таким як терапевтичний або цитотоксичний засіб. Термін "засіб" використовується у даному документі для визначення хімічної сполуки, суміші хімічних сполук, біологічної макромолекули або екстракту, одержаного з біологічних матеріалів.
Терміни "кристал" та "кристалізований" у контексті даного документа відносяться до антитіла або його антигензв'язувальної частини, які існують у формі кристала. Кристали являють собою одну форму твердого стану речовини, яка відрізняється від інших форм, таких як аморфний твердий стан або рідкокристалічний стан. Кристали складаються з повторюваних тривимірних масивів правильної форми з атомів, іонів, молекул (наприклад, білків, таких як антитіла) або молекулярних агрегатів (наприклад, комплексів антиген/антитіло). Ці тривимірні масиви розташовані у певному порядку відповідно до конкретних математичних залежностей, які є добре зрозумілими у даній галузі Основна одиниця або будівельний блок, які повторюються у кристалі називаються асиметричною одиницею. Повторення асиметричної одиниці у порядку, який узгоджується з заданою добре визначеною кристалографічною симетрією забезпечує "елементарну комірку" кристала. Повторення елементарної комірки за рахунок регулярних зсувів у всіх трьох вимірах забезпечує кристал. Див., Ссієде, АВ. апа Юистиїх,
А. Ваїтей, СтузіаїІІ:айноп ої Мисівіс Асіа5 апа Ргоївїпв, а Ргасіїса! Арргоасн, 2па єа., рр. 20 1-16,
Охтога Опіметейу Ргезв, Мем Моїк, М.У., (1999)."
Термін "полінуклеотид", який згадується у даному документі, означає полімерну форму двох або більше нуклеотидів, або рибонуклеотидів, або дезоксинуклеотидів, або модифіковану форму будь-якого типу нуклеотиду. Термін включає у себе одно- та дволанцюгові форми ДНК. але, переважно, являє собою дволанцюгову ДНК.
Термін "виділений полінуклеотид" у контексті даного документа означає полінуклеотид (наприклад, який походить з генома, кКДНК або синтетичного походження або деяку їх комбінацію), який за своїм походженням є функціонально зв'язаним із полінуклеотидом, з яким він не зв'язаний у природних умовах; або він не зустрічається у природі у вигляді частини більшої послідовності, причому "виділений полінуклеотид" не є асоційованим з усім полінуклеотидом або частиною полінуклеотиду, з яким "виділений полінуклеотид" виявляється у природних умовах.
Передбачається, що термін "вектор" у контексті даного документа відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що здатна транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою її було зв'язано.
Один тип вектора являє собою "плазміду", що відноситься до кільцевої дволанцюгової петлі
ДНК, у яку можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Інший тип вектора являє собою
Зо вірусний вектор, у якому додаткові сегменти ДНК можуть бути ліговані у вірусний геном. Певні вектори є здатними до автономної реплікації у клітин і-хазяїн і, в яку вони введені (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальну точку початку реплікації, та епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, вектори ссавців, відмінні від епісомних) можуть інтегруватись у геном клітини-хазяїна після введення у клітину-хазяїн та внаслідок цього реплікуються разом із геномом хазяїна. Більш того, певні вектори є здатними керувати експресією генів, з якими вони є функціонально зв'язаними. Такі вектори називаються у даному документі "рекомбінантними векторами експресії" (або просто "векторами експресії"). В цілому, вектори експресії, які знаходять застосування у методиках на основі рекомбінантної ДНК, часто мають форму плазмід. У даному описі терміни "плазміда" та "вектор" можна використовувати взаємозамінно, оскільки плазміда є найчастіше використовуваною формою вектора. Тем не менш, передбачається, що даний винахід включає в себе інші форми векторів експресії, такі як вірусні вектори (наприклад, ретровіруси з дефектною реплікацією, аденовіруси та аденоасоційовані віруси), які виконують еквівалентні функції.
Термін "функціонально зв'язаний" відноситься до суміжного розташування, при якому описані компоненти знаходяться у взаємному розташуванні, яке дозволяє їм функціонувати відповідним чином. Керуючу послідовність, "функціонально зв'язана" з кодуючою послідовністю, лігують таким чином, щоб експресія кодуючої послідовності досягалась в умовах, сумісних з керуючими послідовностями. "Функціонально зв'язані" послідовності включають у себе як послідовності для керування експресією, які є суміжними з геном, що представляє інтерес, так і послідовності для керування експресією, які діють віддалено або на відстані, контролюючи ген, що представляє інтерес. Термін "послідовність для керування експресією" у контексті даного документа відноситься до полінуклеотидних послідовностей, які обов'язково впливають на експресію та процесинг кодуючих послідовностей, з якими вони ліговані. Послідовності для керування експресією включають у себе відповідні послідовності для ініціації, термінації транскрипції, промоторні та енхансерні послідовності; сигнали для ефективного процесингу
РНК, такі як сигнали сплайсингу та поліаденілування; послідовності, які стабілізують цитоплазматичну мРНК; послідовності, які посилюють ефективність трансляції (тобто, консенсусну послідовність Козак); послідовності, які посилюють стабільність білка; та, якщо необхідно, послідовності, які посилюють секрецію білка. Природа таких контрольних бо послідовностей відрізняється в залежності від організму-хазяїна; у прокаріот такі керуючі послідовності, в цілому, включають у себе промотор, сайт зв'язування рибосом та послідовність термінації транскрипції; у еукаріот такі керуючі послідовності, в цілому, включають у себе промотори та послідовність термінації транскрипції. Передбачається, що термін "керуючі послідовності" включає у себе компоненти, присутність яких є необхідною для експресії та процесингу, та він також може включати у себе додаткові компоненти, присутність яких є переважною, наприклад, лідерні послідовності та послідовності партнера для утворення гібридного білка.
Як визначено у даному документі, термін "трансформація" відноситься до будь-якого процесу, за допомогою якого екзогенна ДНК потрапляє до клітини-хазяїна. Трансформація може проходити в природних або штучних умовах із застосуванням різних способів, добре відомих у рівні техніки. В основі трансформації може лежати будь-який відомий спосіб введення чужорідних послідовностей нуклеїнової кислоти у прокаріотичну або еукаріотичну клітину- хазяїн. Спосіб вибирають, виходячи із клітини-хазяїна, що піддається трансформації, та він може включати у себе, без обмеження, вірусну інфекцію, електропорацію, ліпофекцію та бомбардування частинками. Такі "трансформовані" клітини включають у себе стабільно трансформовані клітини, в яких уведена ДНК є здатною до реплікації або у вигляді плазміди, що автономно реплікується, або у вигляді частини хромосоми хазяїна. Вони також включають у себе клітини, які тимчасово експресують уведену ДНК або РНК протягом обмежених періодів часу.
Передбачається, що термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") у контексті даного документа відноситься до клітини, у яку було введено екзогенну ДНК. Слід розуміти, що такі терміни, як передбачається, відносяться не тільки до конкретної клітини, що є об'єктом дослідження, але й до потомства такої клітини. Оскільки певні модифікації можуть виникати у наступних поколіннях внаслідок або мутації, або впливів навколишнього середовища, таке потомство, фактично, може не бути ідентичним батьківській клітині, але при цьому є все ще включеним у обсяг терміну "клітина-хазяїн", який використовується у даному документі. Переважно, клітини-хазяїни включають у себе прокаріотичні й еукаріотичні клітини, вибрані з будь-якого з царств життя. Переважні еукаріотичні клітини включають у себе клітини найпростіших, грибів, рослин та тварин. Найбільш переважно, клітини-хазяїни включають у
Ко) себе, без обмеження, лінію прокаріотичних клітин Е. соїї; лінії клітин ссавців СНО, НЕК 293 та
СО5; лінію клітин комахи 519 та лінію клітин гриба Засспаготусез сегемівзіає.
Стандартні методики можна застосовувати для одержання рекомбінантної ДНК, синтезу олігонуклеотидів і культивування та трансформації тканин (наприклад, електропорацію, ліпофекцію). Ферментативні реакції та методики очищення можна здійснювати у відповідності до технічних вимог виробника, або як звичайно виконується у даній галузі, або як описано у даному документі. Наступні методики та процедури можна, в цілому, здійснювати згідно з традиційними способами, які є добре відомими у рівні техніки та описані у різноманітних загальних та більш конкретних джерелах, що цитуються та обговорюються у даному описі. Див., наприклад, ЗатрьгоокК єї а). МоІесшаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиаї! (2а єд., Соїд брііпуд Наїтбог
І арогаїогу Ргезв, Соїй бргіпа Нагтбог, М.У. (1989)), яка включена у даний документ за допомогою посилання з будь-якою метою.
У контексті даного документа термін "ефективна кількість" відноситься до кількості терапевтичного засобу, що є достатньою для того, щоб зменшити або ослабити тяжкість та/або тривалість розладу або одного або декількох його симптомів, попередити розвиток розладу, викликати регрес розладу, попередити рецидив, прояв, появу або прогресування одного або декількох симптомів, асоційованих із розладом, виявити розлад або посилити або поліпшити профілактичний або терапевтичний ефект(ефекти) іншої терапії (наприклад, профілактичного або терапевтичного засобу).
Конкретна ділянка або положення епітопа на карті білка людського ІДЕ, представленій у даному документі, можуть бути ідентифіковані за допомогою будь-якого підходящого способу одержання карти епітопів, відомого у рівні техніки, у комбінації з будь-яким з антитіл, які передбачаються даним винаходом. Приклади таких способів включають у себе скринінг пептидів змінної довжини, які одержані з ІДЕ, щодо зв'язування з антитілом за даним винаходом, причому найменший фрагмент, який може специфічно зв'язуватись з антитілом, містить послідовність епітопа, що розпізнається антитілом. Пептиди ЇДЕ можна одержати за допомогою синтезу або за допомогою протеолітичного розщеплення білка ІДЕ. Пептиди, які зв'язуються з антитілом, можна ідентифікувати, наприклад, за допомогою мас- спектрометричного аналізу. В іншому прикладі для ідентифікації епітопа, з яким зв'язується антитіло за даним винаходом, можна застосовувати ЯМР-спектроскопію або рентгенівську бо кристалографію. Методики кристалізації та рентгенівської кристалографії є переважними для визначення структури ІДЕ та епітопа на ЧЕ, з яким зв'язується антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом.
Антитіла для застосування у даному винаході можуть бути одержані з використанням способів одержання антитіл з окремих виділених лімфоцитів шляхом клонування та експресії
КДНК варіабельних ділянок імуноглобулінів, одержаної з окремих лімфоцитів, підданих селекції щодо продукування специфічних антитіл, наприклад, за допомогою способів, описаних у
Варсоок, .. еї а!., 1996, Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. ОБА 93(15):7843-78481; міжнародні патентні заявки
МО 92/02551; МО 2004/051268 та МО 2004/106377. Скринінг щодо антитіл можна здійснювати з використанням аналізів для вимірювання зв'язування з людським ІДЕ та/або аналізів для вимірювання здатності до блокування зв'язування ЧЕ з його природним рецептором.
Прикладом аналізу зв'язування є ЕІ ІЗА (імуноферментний аналіз).
Гуманізовані антитіла (які включають у себе антитіла з прищепленими СОВ) являють собою молекули антитіл, які мають одну або декілька ділянок, що визначають комплементарність (СОРЕ), з виду, відмінного від людини (наприклад, кролика або миші), та каркасну ділянку з молекули людського імуноглобуліну (див., наприклад, патент США 05 5585089; міжнародну заявку УМО 91/09967). Буде зрозуміло, що може бути необхідним лише перенесення залишків, що визначають специфічність СОВ, а не повної СОВ (див., наприклад, КазПптіїгі єї аї., 2005,
Меїпоа», 36, 25-34). Гуманізовані антитіла, необов'язково, можуть додатково містити один або декілька каркасних залишків, одержаних із виду, відмінного від людини, з якого було одержано
СОВ. Останні часто називають донорними залишками. Молекули антитіл за даним винаходом, переважно, характеризуються афінністю зв'язування (Ка), меншою ніж 2 нМ. Афінність можна вимірювати з застосуванням будь-якого підходящого способу, відомого у рівні техніки, у тому числі методом ВіАсоге, як описано у розділі Приклади у даному документі (див., приклад 6), із використанням виділеного природного або рекомбінантного ІДЕ або підходящого гібридного білка/поліпептиду.
Афінність антитіла або антигензв'язувального засобу за даним винаходом, а також міра, в якій зв'язувальний засіб (такий як антитіло) інгібує зв'язування, можуть бути визначені середнім спеціалістом у даній галузі техніки з застосуванням традиційних методик, наприклад, описаних зсаїснага еї а!. (Апп. КУ. Асай. 5сі. 51:660-672 (1949)), або за допомогою методу поверхневого
Зо плазмонного резонансу (ЗРА) із використанням систем, таких як ВІАсоге. У випадку методу поверхневого плазмонного резонансу молекули-мішені іммобілізують на твердій фазі та піддають дії лігандів у рухомій фазі, що рухається уздовж проточної кювети. Якщо відбувається зв'язування ліганда з іммобілізованою мішенню, локальний показник заломлення змінюється, що приводить до зміни кута 5РА, який можна відслідковувати у реальному масштабі часу шляхом виявлення змін інтенсивності відбитого світла. Швидкості зміни сигналу 5РА можна аналізувати з одержанням констант умовної швидкості реакції для фаз асоціації та дисоціації у реакції зв'язування. Співвідношення цих значень дає умовну константу рівноваги (афінність) (див., наприклад, Моїй єї аі, Сапсег Нез. 53:2560-65 (1993)).
Буде зрозуміло, що афінність антитіл, які передбачаються даним винаходом, можна змінювати з застосуванням будь-якого підходящого способу, відомого в рівні техніки. Отже, даний винахід також відноситься до варіантів молекул антитіл за даним винаходом, які характеризуються поліпшеною афінністю до ІДЕ. Такі варіанти можуть бути одержані за допомогою ряду протоколів дозрівання афінності, у тому числі за допомогою мутації СОВ (мМапд еї аї., У. Мої. Віої., 254, 392-403, 1995), шафлінгу ланцюгів (Магкз еї а!., Віо/Тесппоіоду. 10, 779- 183, 1992), застосування штамім-мутаторів Е. сої (І ом/ єї аї., у. Мої. Віо!., 250, 359-368, 1996), шафлінгу ДНК (Райеп еї аї., Сит. Оріп. ВіоїесНпої!., 8, 724-733, 1997), фагового дисплею (Тнотрзоп 6ї аї., у). Мої. Віо!., 256, 77-88, 1996) та ПЛР з імітацією рекомбінації при статевому розмноженні (Статеті єї аї!., Майте, 391, 288-291,1998). У Мацднап вї аї. (вище) обговорюються ці способи дозрівання афінності.
Гуманізовані антитіла та антигензв'язувальні засоби
У відповідності до одного аспекту даного винаходу у даному документі представлені гуманізовані моноклональні антитіла до ІДЕ та антигензв'язувальні засоби. Гуманізовані антитіла являють собою антитіла, в яких важкий та/або легкий ланцюг містить одну або декілька
СОВ (у тому числі, якщо необхідно, одну або декілька модифікованих СОР) із донорного антитіла (наприклад, антитіла, відмінного від людського, такого як мишаче або кроляче моноклональне антитіло), прищеплені на каркас варіабельної ділянки важкого та/або легкого ланцюга в акцепторному антитілі (наприклад, людському антитілі). Для огляду див., Машоапап єї а!, Маїшге Віоїесппоіоду, 16, 535-539, 1998.
Згідно з одним варіантом здійснення замість переносу повної СОВ лише один або декілька з бо залишків, що визначають специфічність, із будь-якого з СОВ, описаних вище у даному документі, переносять у каркас людського антитіла (див., наприклад, КазПтігі єї аї., 2005,
Меїпоаз, 36, 25-34). Згідно з одним варіантом здійснення у каркас людського антитіла переносять лише залишки, що визначають специфічність, з однієї або декількох із СОВ, описаних у даному документі. Згідно з іншим варіантом здійснення у каркас людського антитіла переносять лише залишки, що визначають специфічність, із кожної із СОВ, описаних у даному документі.
Якщо прищеплюють СОВ або залишки, що визначають специфічність, можна використовувати будь-яку каркасну послідовність відповідної акцепторної варіабельної ділянки, беручи до уваги клас/тип донорного антитіла, з якого одержані СОВ, у тому числі каркасні ділянки миші, кролика, примата та людини.
Переважно, гуманізоване антитіло за даним винаходом має варіабельний домен, що містить людські акцепторні каркасні ділянки, а також одну або декілька з СОН, спеціально наведених у даному документі. Отже, згідно з одним варіантом здійснення передбачається гуманізоване моноклональне антитіло, яке зв'язується з людським ІДЕ, причому варіабельний домен містить людські акцепторні каркасні ділянки (з необов'язковими мутаціями, які описані у даному документі) та донорні СОВ, відмінні від людських.
Конструювання антитіл із прищепленими СОН, в цілому, описане в європейський патентній заявці ЕР-А-0239400, де розкрито процес, у якому СОВ мишачого моноклонального антитіла прищеплюють на каркасні ділянки варіабельних доменів людського імуноглобуліну за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу з використанням довгих олігонуклеотидів, та включене у даний документ. СОВ визначають у антитіл специфічність зв'язування з антигеном та являють собою відносно короткі пептидні послідовності, які знаходяться на каркасних ділянках варіабельних доменів.
Найбільш ранню роботу з гуманізації моноклональних антитіл за допомогою прищеплення
СОР виконували на моноклональних антитілах, що розпізнають синтетичні антигени, такі як МР.
Тим не менш, приклади, у яких мишаче моноклональне антитіло, що розпізнає лізоцим, та щуряче моноклональне антитіло, що розпізнає антиген на людських Т-клітинах, гуманізували шляхом прищеплення СОВА, було описано Метпоеуеєп еї аї. (Зсієпсе, 239, 1534-1536, 1988) та
Віесптапп єї а! (Маїште, 332, 323-324, 1988), відповідно. Гуманізація антитіла досягається шляхом прищеплення СОВ з антитіла, відмінного від людського, такого як мишаче, щуряче, козяче або кроляче антитіло, на "подібний" людський каркас (акцептор) та вибору мінімальної кількості ключових каркасних залишків (зворотних мутацій), які вручну вибирають з донорного моноклонального антитіла та вводять у людський акцепторний каркас з метою підтримання вихідної конформації СОВ. Такі способи є відомими у рівні техніки та включають у себе описані у допев єї аї., Майшге 321:522 (1986); Мептоеуеп еї аї., Зсіепсе 239:1534 (1988)), бітв5 еї аї., у.
Ітітипої. 151: 2296 (1993); Споїніа апа І! е5К, 9. Мої. Віої. 196:901 (1987), Сапег евї аї., Ргос. Маї!).
Асад. Зсі. 0.5.А. 89:4285 (1992); Ргевіа еї аї., У. Іттипої. 151:2623 (1993), Радіап, Моїесшіаг
Іттипоїоду 28(4/5):489-498 (1991); ЗщапісКа єї аї., Ргоїєїп Епдіпеегіпуд 7(6):805-814 (1994);
ВодизкКа. єї аі., РМАБ5 91:969-973 (1994); у РСТ публікації міжнародної заявки УУО 91/09967, патентних документах РСТ/ ОБО8/16280, 0О596/18978, 00591/09630, 0591/05939, О594/01234, сВв89/01334, 4891/01134, 1892/01755; М/О90/14443, М О90/14424, М О90/14430, ЕР 229246, ЕР 592106; ЕР 519596, ЕР 239400, у патентах США МоМо 5565332, 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, причому кожне з цих джерел включене у даний документ.
Класифікацію підсімейств варіабельних ділянок людського важкого та легкого ланцюгів зародкового типу можна одержати, виходячи з визначень підгруп ділянок зародкового типу за
Кабаї: УНІ, УН2, МНЗ, УНа4, УН5. УНб або УН7 для конкретної послідовності МН, та УНІ, На.
УНЗ, УН4, НО та УНб для конкретної з'єднувальної групи у варіабельній ділянці важкого ланцюга для каркасу 4; УК, МК2, УКЗ, МК4. УК5 або УКб для конкретної послідовності МІ. капа- ланцюга для каркасу 1, 2 та 3, та УК, Укаг, УКЗ, Ука або УОК5 для конкретної з'єднувальної групи капа-ланцюга для каркасу 4; або МІ, МІ2, МІЗ, МІ 4, МІ 5, МІ 6, МІ 7. МІ 8, МІ 9 або МІ10 для конкретної послідовності МІ. лямбда-ланцюга для каркасу 1, 2 та 3, та 211, 212, 913 або ДІ7 для конкретної з'єднувальної групи лямбда-ланцюга для каркасу 4.
Домени константної ділянки молекули антитіла за даним винаходом, якщо вони присутні, можуть бути вибрані з урахуванням запланованої функції молекули антитіла та, зокрема, ефекторних функцій, які можуть бути необхідні. Наприклад, домени константної ділянки можуть являти собою домени людського ІдА, 940, ІЧ9Е, їдс або ДМ. Згідно з конкретними варіантами здійснення домени константної ділянки людського ІдС, особливо, ізотипів ЇДС1 та Ід23, можна застосовувати, коли молекула антитіла призначена для терапевтичних застосувань, та бо необхідними є ефекторні функції антитіла. В якості альтернативи, ізотипи Ід22 та ЗСс4 можна застосовувати, коли молекула антитіла призначена для терапевтичних цілей, а ефекторні функції антитіла не потрібні. Буде зрозуміло, що варіанти послідовностей цих доменів константної ділянки також можна застосовувати. Наприклад, можна застосовувати молекули
Ідс4, у яких серии у положенні 241 був змінений на пролін, як описано у Апааї еї а!., МоїІесшіаг
Іттипоіоаду, 1993, 30 (1), 105-108. Спеціалісту у даній галузі техніки також буде зрозуміло, що антитіла можуть піддаватись ряду посттрансляційних модифікацій. Тип та ступінь цих модифікацій часто залежить від лінії клітин-хазяїнів, яку використовують для експресії антитіла, а також від умов культивування. Такі модифікації можуть включати у себе варіанти глікозилування, окиснення метіоніну, утворення дикетопіперазину, ізомеризації аспартату та дезамідування аспарагіну. Частою модифікацією є втрата карбокси-кінцевого основного залишку (такого як лізин або аргінін) внаслідок дії карбоксипептидаз (як описано в Наїті5, Ву. доитаї ої Спготаїюдгарну 705:129-134, 1995). Відповідно, С-кінцевий лізин у важкому ланцюзі антитіла може бути відсутній.
Модифікації СОВ та людських каркасних ділянок
Віеєсптапп єї а). виявили, що перенесення тільки СОВ (які визначені за Кабаї (КаБбаї є! аї. (вище) та УУи єї аї., у). Ехр. Мед., 132, 211-250, 1970)) не було достатнім для забезпечення задовільної антигензв'язувальної активності у продукту з прищепленими СОВА. Було виявлено, що кількість каркасних залишків має бути змінена для того, щоб вони відповідали залишкам у донорній каркасній ділянці. Запропоновані критерії для вибору тих каркасних залишків, які необхідно змінити, є описаними у міжнародній патентній заявці УМО 90/07861, яка включена у даний документ.
Заміна СОВ, відмінних від людських, у каркасі людського варіабельного домену найбільш вірогідно приводить у результаті до збереження правильної просторової орієнтації СОВА, якщо каркас людського варіабельного домену набуває такої ж або подібної конформації, що й каркас відмінної від людської варіабельної ділянки, з якого походять СОН. Це досягається шляхом одержання людських варіабельних доменів із людських антитіл, чиї каркасні послідовності проявляють високий ступінь ідентичності послідовності з каркасними доменами відмінної від людської варіабельної ділянки, з яких було одержано СОВ. Як описано вище, каркасні ділянки варіабельної ділянки важкого та легкого ланцюгів можуть бути одержані з послідовностей одного людського антитіла або різних людських антитіл. Послідовності людського антитіла можуть являти собою послідовності людських антитіл, що зустрічаються у природних умовах, або можуть являти собою консенсусні послідовності декількох людських антитіл. Див.,
Кешеброгоцоди еї аї, Ргоїєїп Епдіпеегіпд 4:773 (1991); Коїібіпдег єї аї., Ргоївіп Епдіпеегіпу 6:971 (1993); та Сапег єї а), міжнародна заявка У/О 92/22653.
Після ідентифікації ділянок, що визначають комплементарність, у донорному імуноглобуліні, відмінному від людського, та відповідних людських акцепторних імуноглобулінів наступна стадія полягає у визначенні того, які залишки з цих компонентів, якщо такі залишки присутні, слід замінити для оптимізації властивостей одержаного у результаті гуманізованого антитіла. В цілому, заміну людських амінокислотних залишків на амінокислотні залишки, відмінні від людських, слід звести до мінімуму, оскільки введення залишків, відмінних від людських, збільшує ризик того, що антитіло буде викликати у людей реакцію типу "людина проти донорного антитіла" (НАБА). Відомі у рівні техніки способи визначення імунної реакції можна здійснювати для відстеження НАЮА-реакції у конкретного хазяїна або протягом клінічних випробувань. Хазяїнам, яким уводили гуманізовані антитіла, можна давати оцінку імуногенності на початку та впродовж введення зазначеного терапевтичного засобу. НАБА-реакцію вимірюють, наприклад, шляхом виявлення антитіл до гуманізованого терапевтичного реактиву у зразках сироватки від хазяїна з застосуванням способу, відомого у рівні техніки, в тому числі технології поверхневого плазмонного резонансу (ВІАСОНВЕ) та/або твердофазного аналізу
ЕПЗА.
Вибір амінокислотних залишків для заміни (також називається у даному документі "мутацією") визначається, частково, за допомогою комп'ютерного моделювання. Комп'ютерне апаратне та програмне забезпечення для одержання тривимірних зображень молекул імуноглобулінів описане у даному документі. В цілому, молекулярні моделі одержують, виходячи з розшифрованих структур для ланцюгів імуноглобулінів або їх доменів.
Ланцюги, які підлягають моделюванню, порівнюють за подібністю амінокислотної послідовності з ланцюгами або доменами розшифрованих тривимірних структур, та ланцюги або домени, які показують найбільшу подібність послідовності вибирають у якості відправних точок для побудови молекулярної моделі. Для моделювання вибирають ланцюги або домени, які характеризуються щонайменше 50 95 ідентичністю послідовності, та, переважно, такі, що бо характеризуються щонайменше бос, 7095, 8095, 9095 або більшою ідентичністю послідовності. Розшифровані вихідні структури піддають модифікації з урахуванням відмінностей між фактично присутніми амінокислотами у ланцюгах або доменах імуноглобулінів, які моделюють, та амінокислотами у вихідній структурі. Модифіковані структури потім збирають у складений імуноглобулін. Нарешті, модель допрацьовують шляхом мінімізації енергії та підтвердження того, що всі атоми знаходяться в межах відповідних відстаней один від одного, та що довжини та кути зв'язків знаходяться в хімічно прийнятних межах.
Вибір амінокислотних залишків для заміни також може частково визначатись за оцінкою характеристик амінокислот у конкретних місцях або за емпіричним спостереженням ефектів заміни або мутагенезу конкретних амінокислот. Наприклад, якщо амінокислота відрізняється у каркасному залишку донорної варіабельної ділянки та каркасному залишку вибраної людської варіабельної ділянки, людську каркасну амінокислоту звичайно слід замінити на еквівалентну каркасну амінокислоту з донорного антитіла, коли резонно очікується, що амінокислота: (1) безпосередньо нековалентно зв'язується з антигеном, (2) є суміжною з ділянкою СОВ, (3) інакше взаємодіє з діллнкою СОВА (наприклад, знаходиться приблизно в межах 3-6
Ангстрем від ділянки СОВ, яка визначена за допомогою комп'ютерного моделювання) або (4) бере участь у поверхні контакту МІ -МН.
Залишки, які "безпосередньо нековалентно зв'язуються з антигеном" включають у себе амінокислоти у положеннях у каркасних ділянках, які характеризуються хорошою імовірністю безпосередньої взаємодії з амінокислотами на антигені у відповідності зі встановленими хімічними силами, наприклад, за рахунок утворення водневих зв'язків, ван-дер-ваальсових сил, гідрофобних взаємодій та подібного. СОВ та каркасні ділянки є такими, як визначено за Кабаї єї аІ. або Спошціа єї аІЇ, вище. Якщо каркасні залишки, які визначені за Кабаї єї а), вище, являють собою залишки структурної петлі, які визначені Споїйіа єї аіІ, вище, амінокислоти, присутні у донорному антитілі, можуть бути вибрані для введення шляхом заміни у гуманізоване антитіло.
Залишки, які є "суміжними з ділянкою СОН" включають у себе амінокислотні залишки у положеннях, безпосередньо суміжних з однією або декількома з СОЕВ у первинній послідовності ланцюга гуманізованого імуноглобуліна, наприклад, у положеннях, безпосередньо суміжних із
СОВ, визначеною за Кабаї, або з СОВ, визначеною за СНоїйіа (див., наприклад, Споїйніа апа
Зо Гек 1МВ 196:901 (1987)). Досить імовірно, що ці амінокислоти взаємодіють з амінокислотами у
СО та, якщо їх вибрати з акцептора, викривляють донорні СОВ та знижують афінність. Більш того, суміжні амінокислоти можуть безпосередньо взаємодіяти з антигеном (Аптії єї аїЇ, бсієпсе, 233:747 (1986), яка включена у даний документ за допомогою посилання), та вибір цих амінокислот у донорі може бути бажаним для збереження всіх контактів з антигеном, які забезпечують афінність у вихідного антитіла. Як описано у даному документі, послідовності ЕВ також можуть бути замінені/мутовані для поліпшення афінності до ІДЕ у антитіла до ЩЕ або антигензв'язувального засобу за даним винаходом (та/або для поширення взаємодії з ними на епітоп Св2 ІЯЕ).
Залишки, які "інакше взаємодіють із ділянкою СОН", включають у себе залишки, які визначені за допомогою аналізу вторинної структури як такі, що знаходяться у просторовій орієнтації, достатній для впливу на ділянку СОВ. Згідно з одним варіантом здійснення залишки, які "інакше взаємодіють із ділянкою СОВ", ідентифікують шляхом аналізу тривимірної моделі донорного імуноглобуліну (наприклад, моделі, створеної комп'ютером). Тривимірна модель, як правило, модель вихідного донорного антитіла, показує, що певні амінокислоти за межами СОВ є близькими до СОВА та характеризуються хорошою імовірністю взаємодії з амінокислотами у
СО за рахунок утворення водневих зв'язків, ван-дер-ваальсових сил, гідрофобних взаємодій і т.д. У цих амінокислотних положеннях замість амінокислоти акцепторного імуноглобуліну може бути вибрана амінокислота донорного імуноглобуліну. Амінокислоти, що відповідають цьому критерію, в цілому, будуть мати атом бокового ланцюга приблизно в межах 3 одиниць
Ангстрема (А) від певного атома у СОВ та мають містити атом, який може взаємодіяти з атомами СОВ у відповідності зі встановленими хімічними силами, такими як наведені вище. У випадку атомів, які можуть утворювати водневий зв'язок, виміряна відстань між їх ядрами становить З А", але у випадку атомів, які не утворюють зв'язок, відстань З А" вимірюється між їх ван-дер-ваальсовими поверхнями. Отже, в останньому випадку ядра мають знаходитись приблизно в межах 6 А" (3 А плюс сума ван-дер-ваальсових радіусів) для атомів, які вважаються здатними до взаємодії. У багатьох випадках ядра будуть знаходитись на відстані від 4 або 5 до 6 А" одне від одного. При визначенні того, чи може амінокислота взаємодіяти з
СО, переважно не слід розглядати останні 8 амінокислот у СОВ2 важкого ланцюга як частину
СОН, оскільки з точки зору структури ці 8 амінокислот радше поводять себе як частина каркасу.
Амінокислоти, які є здатними до взаємодії з амінокислотами у СОВА (або ЕЕ), можна ідентифікувати ще одним способом. Площу доступної для розчинника поверхні кожної каркасної амінокислоти розраховують двома способами: (1) у інтактного антитіла та (2) у гіпотетичної молекули, що складається з антитіла, СОВ якого видалені. Значна відмінність між цими числами, яка становить приблизно 10 квадратних ангстремів або більше, показує, що доступ каркасних амінокислот до розчинника щонайменше частково блокується СОВА, та, отже, що амінокислота вступає в контакт із СОВА. Площу доступної для розчинника поверхні амінокислоти можна розрахувати на основі тривимірної моделі антитіла з застосуванням алгоритмів, відомих у рівні техніки (наприклад, Соппоїу, У. Аррі. Стуві. 16:548 (1983); та І се апа Віснагав, У. Мої. Віо!. 55:379 (1971), причому обидва з цих джерел включені у даний документ за допомогою посилання). Каркасні амінокислоти також інколи можуть взаємодіяти з СОВА опосередковано за рахунок впливу на конформацію іншої каркасної амінокислоти, яка, у свою чергу, контактує з
Сов.
Відомо, що конкретні амінокислоти у декількох положеннях у каркасі є здатними до взаємодії з СОМ у багатьох антитілах (Споїпіа апа Іев5К, вище, СПоїйіа єї аЇї, вище, та
Тгатопіапо еї аї, ). Мої. Віої. 215:175 (1990), причому всі з цих джерел включені у даний документ за допомогою посилання). Примітно, амінокислоти у положеннях 2, 48, 64 та 71 у легкому ланцюзі та 71 та 94 у важкому ланцюзі (нумерація за Кабаї), як відомо, є здатними до взаємодії з СОВ у багатьох антитілах. Амінокислоти у положеннях 35 у легкому ланцюзі та 93 та 103 у важкому ланцюзі також, імовірно, взаємодіють із СОВ. У всіх цих пронумерованих положеннях переважним є вибір донорної амінокислоти замість акцепторної амінокислоти (Якщо вони відрізняються) для використання у гуманізованому імуноглобуліні. З іншого боку, певні залишки, здатні до взаємодії з ділянкою СОН, такі як перші 5 амінокислот у легкому ланцюзі, іноді можна вибрати з акцепторного імуноглобуліну без втрати афінності у гуманізованого імуноглобуліну.
Залишки, які "Серуть участь у поверхні контакту МІ-МН" або "пакувальні залишки" включать у себе ті залишки на поверхні контакту між МІ та МН, які визначені, наприклад, у Момоїпу апа
Набетг, Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА, 82:4592-66 (1985); або Споїпіа єї аї, вище. В цілому, незвичні пакувальні залишки слід зберігати у гуманізованому антитілі, якщо вони відрізняються від
Зо залишків у людських каркасах.
Звичайно замінюють одну або декілька з амінокислот, які вдовольняють вищезазначеним критеріям. Згідно з деякими варіантами здійснення замінюють усі або більшість з амінокислот, що вдовольняють вищезазначеним критеріям. Інколи існує певна невизначеність щодо того, чи відповідає конкретна амінокислота вищезазначеним критеріям, та одержують альтернативні варіанти імуноглобулінів, один з яких має цю конкретну заміну, а інший з яких - не має.
Одержані таким чином альтернативні варіанти імуноглобулінів можна досліджувати у будь- якому з аналізів, описаних у даному документі, щодо бажаної активності та можна вибрати переважний імуноглобулін.
Звичайно ділянки СОВА у гуманізованих антитілах є, по суті, ідентичними, а частіше ідентичними до відповідних діллнок СОВА донорного антитіла. Незважаючи на те, що це звичайно не є бажаним, інколи можливо зробити одну або декілька консервативних амінокислотних замін залишків СОВ без істотного впливу на афінність зв'язування одержаного в результаті гуманізованого імуноглобуліну. Під консервативними або подібними замінами розуміють комбінації, такі як, наприклад, лейцин, який замінює ізолейцин або валін. Інші амінокислоти, які часто можуть замінювати одна одну, включають у себе, без обмеження: фенілаланін, тирозин і триптофан (амінокислоти, які мають ароматичні бокові ланцюги); лізин, аргінін та гістидин (амінокислоти, які мають основні бокові ланцюги); аспартат і глутамат (амінокислоти, які мають кислотні бокові ланцюги); аспарагін і глутамін (амінокислоти, які мають бічні ланцюги з амідною групою); та, цистеїн і метіонін (амінокислоти, які мають бокові ланцюги, що містять сірку).
Додатковими кандидатами для заміни є амінокислоти акцепторного людського каркасу, які є незвичними або "рідкісними" для людського імуноглобуліну у цьому положенні. Ці амінокислоти можуть бути замінені на амінокислоти з еквівалентного положення у донорному антитілі або з еквівалентних положень у більш типових людських імуноглобулінах. Наприклад, заміна може бути бажаною, коли амінокислота у людській каркасній ділянці акцепторного імуноглобуліну є рідкісною для цього положення, а відповідна амінокислота у донорному імуноглобуліні є типовою для цього положення у послідовностях людського імуноглобуліну; або коли амінокислота у акцепторному імуноглобуліні є рідкісною для цього положення, а відповідна амінокислота у донорному імуноглобуліні також є рідкісною порівняно з іншими людськими бо послідовностями. Ці критерії допомагають упевнитись, що нетипова амінокислота у людському каркасі не порушить структуру антитіла. Більш того, за рахунок заміни незвичної людської акцепторної амінокислоти на амінокислоту з донорного антитіла, яка виявляється типовою для людських антитіл, гуманізоване антитіло можна зробити менш імуногенним.
Термін "рідкісна" у контексті даного документа означає амінокислоту, що зустрічається у цьому положенні у менш ніж приблизно 2095, а звичайно у менш ніж приблизно 10 95 послідовностей у репрезентативній виборці послідовностей, та термін "типова" у контексті даного документа означає амінокислоту, яка зустрічається у більш ніж приблизно 25 95, а звичайно у більш ніж приблизно 50 95 послідовностей у репрезентативній виборці. Наприклад, усі людські послідовності варіабельних ділянок легкого та важкого ланцюга відповідно об'єднують у "підгрупи" послідовностей, які є особливо гомологічними одна одній та мають однакові амінокислоти у певних критично важливих положеннях (Караї еї аі, вище). При прийнятті рішення про те, чи є амінокислота у людській акцепторній послідовності "рідкісною" або "типовою" у людських послідовностях, часто буде переважно розглядати лише ті людські послідовності, що знаходяться у тій же підгрупі, що й акцепторна послідовність.
Додатковими кандидатами для заміни є каркасні залишки акцептора, які відповідають рідкісному або незвичному каркасному залишку донора. Рідкісні або незвичайні каркасні залишки донора являють собою ті, які є рідкісними або незвичними (як визначено у даному документі) для донорних антитіл у цьому положенні. Для донорних антитіл підгрупа може бути визначена за Караї та ідентифікованими положеннями залишків, які відрізняються від консенсусних. Ці специфічні для донора відмінності можуть вказувати на соматичні мутації у донорній послідовності, які посилюють активність. Незвичні залишки, які за прогнозом впливають на зв'язування, зберігають, у той час як залишки, які за прогнозом є неважливими для зв'язування, можуть бути замінені.
Додатковими кандидатами для заміни є залишки, відмінні від залишків імуноглобулінів зародкового типу, які зустрічаються у каркасній ділянці акцептора. Наприклад, коли ланцюг акцепторного антитіла (тобто ланцюг людського антитіла, який характеризується значною ідентичністю послідовності з залишком донорного антитіла) вирівнюють з ланцюгом антитіла зародкового типу (який аналогічно характеризується значною ідентичністю послідовності з донорним ланцюгом), залишки, які не співпадають між каркасом акцепторного ланцюга та
Зо каркасом ланцюга зародкового типу, можуть бути замінені на відповідні залишки з послідовності зародкового типу.
На відміну від специфічних амінокислотних замін, які обговорювались вище, каркасні ділянки гуманізованих імуноглобулінів звичайно є, по суті, ідентичними, а частіше - ідентичними до каркасних ділянок людських антитіл, з яких вони були одержані (за винятком описаних у даному документі в контексті даного винаходу). Звичайно, багато з амінокислот у каркасній ділянці мають невеликий безпосередній вплив або не впливають на специфічність або афінність антитіла. Отже, багато окремих консервативних замін каркасних залишків можуть допускатись без істотної зміни специфічності або афінності одержаного у результаті гуманізованого імуноглобуліну. Отже, згідно з одним варіантом здійснення каркасна ділянка варіабельного домену гуманізованого імуноглобуліну, характеризується щонайменше 65, 75 або 85 95 подібністю або ідентичністю послідовності з людською послідовністю каркасної ділянки варіабельного домену або консенсусним варіантом таких послідовностей. Згідно з іншим варіантом здійснення каркасна ділянка варіабельного домену гуманізованого імуноглобуліну характеризується щонайменше 90 95, переважно, 95 95, більш переважно, 96 95, 97 Ув, 98 95 або 99 95 подібністю або ідентичністю послідовності з людською послідовністю каркасної ділянки варіабельного домену або консенсусним варіантом таких послідовностей. Тим не менш, в цілому, такі заміни є небажаними (за винятком описаних у даному документі).
У контексті даного документа ступені ідентичності та подібності можна легко розрахувати, наприклад, як описано у Сотриїайопа! Моїесшіаг Віоіоду, І е5К, А.М., єд., Охтога Опімегейу Ргевзв,
Мем Моїк, 1988; Віосотриїіпод. Іптоптаїйс5 апа Сепоте Рго|есів, Зтіїй, ОЛМУ., ед., Асадетіс Ргевв,
Мем Моїк, 1993; Сотршиїег Апаїувзів ої Зедиепсе Оаїа, Рай 1, Спініп, А.М., апа Стійіп, Н.С., едв.,
Нитапа Ргевзв, Мем/ Уегзеу, 1994; бЗедиепсе Апаїувів іп Моїіесціаг Віоіоду, моп Неїіпів, а.,
Асадетіс Ргез5, 1987, зедиепсе Апаїувів Ргітег, Сспгір5Ком, М. апа Оеємегеих, «., едв., М БюсКюп
Ргез5, Мем МоїКк, 1991, за допомогою програмного забезпечення ВІ А5Т "М, доступного від МОВІ (АПБСНиї, 5.Р. еї аї!., 1990, 9). Мої. Вісі. 215:403-410; Сзівп, МУ. 5 еїаїе5, 0.). 1993, Маїшге Сепеї. 3:266-272. Мадавеп, Т.І. еї аі., 1996, Меїй. Епгутої. 266:131-141; Айвспиї, 5.Р. єї аї., 1997, Мисієїс
Асіаз Вев. 25:3389-3402; 7Нпапо, у. в Мадаеєп, Т.Г. 1997, Сепоте Вез. 7:649-656, причому всі ці джерела включено в даний документ за допомогою посилань.
Було опубліковано ряд оглядів, у яких обговорюються антитіла з прищепленими СОН, у тому числі Мацапап еї аї. (Маїште Віоїесппоіоду, 16, 535-539, 1998), яка включена у даний документ за допомогою посилання.
Антитіла до ІДЕ за даним винаходом можуть додатково включати у себе додаткові зв'язувальні домени, наприклад, як у молекулі ОМО-І9д, яка розкрита у міжнародній заявці УУО 2007/024715, або у так званому (ГарЕм)2Ес, описаному у міжнародній заявці МО 2011/030107.
Таким чином, антитіло, яке використовується у даному документі, включає у себе бі-, три- або тетравалентні повнорозмірні антитіла.
Антигензв'язувальні засоби
Антигензв'язувальні засоби включають у себе одноланцюгові антитіла (тобто повнорозмірні важкий ланцюг та легкий ланцюг); Раб, модифікований Раб, Рар', модифікований Раб", Е(ар)2,
Ем, Рар-Рм, Рар-а5Ем, однодоменні антитіла (наприклад, МН, або МІ, або УНН), наприклад, як описано у міжнародній заявці М/О 2001090190, в5егм, бі-, три- або тетравалентні антитіла, Вів- 5СЕм, діатіла, тріотіла, триатіла, тетратіла та епітоп/антигензв'язувальні засоби на основі будь- якого з вищезазначених (див., наприклад, Ноїїїдег апа Ниазоп, 2005, Маїшге Віоїесн. 23(9): 1126- 1136; Адаїг апа І ажзоп, 2005, Огид Оевідп Неміємв-Опіїпе 2(3), 209-217). Способи одержання та виробництва цих фрагментів антитіл є добре відомими у рівні техніки (див., наприклад, Мегта єї а!І., 1998, доштаї ої Іттипоіодіса! Меїпоадв, 216, 165-181). Формат Рар-Ем був уперше розкритий у міжнародній заявці УМО 2009/040562, та їх стабілізовані дисульфідними зв'язками варіанти,
Еар-азгм, були уперше розкриті у міжнародній заявці М/О 2010/035012. Інші фрагменти антитіл для застосування у даному винаході включають у себе Рар- та Рар'-фрагменти, описані у міжнародних патентних заявках МО 2005/003169, М/О 2005/003170 та М/О 2005/003171.
Полівалентні антитіла можуть містити декілька ділянок, що визначають специфічність, наприклад, можуть бути біспецифічними, або можуть бути моноспецифічними (див., наприклад, міжнародні заявки МО 92/22583 та МО 05/113605). Одним таким прикладом останніх є Тгі-Рар (або ТЕМ), що описані у міжнародній заявці УУО 92/22583.
Типова молекула Рар' містить пару з важкого та легкого ланцюгів, у якій важкий ланцюг містить варіабельну ділянку МН, константний домен СНІ та природну або модифіковану шарнірну ділянку, а легкий ланцюг містить варіабельну ділянку МІ. та константний домен Сі.
Згідно з одним варіантом здійснення передбачається, що димер ЕРар' за даним розкриттям утворює Е(аб)2, наприклад, димеризація може здійснюватись через описану у даному документі природну шарнірну послідовність або її похідну або через синтетичну шарнірну послідовність.
Зв'язувальний домен антитіла звичайно буде містити 6 СОВ - три з важкого ланцюга та три з легкого ланцюга. Згідно з одним варіантом здійснення СОВ знаходяться у каркасі та разом утворюють варіабельну ділянку. Отже, згідно з одним варіантом здійснення антигензв'язувальний засіб включає у себе зв'язувальний домен, специфічний до ІДЕ, який містить варіабельну ділянку легкого ланцюга та варіабельну ділянку важкого ланцюга.
Буде зрозуміло, що одну або декілька (наприклад, 1, 2, З або 4) амінокислотних замін, додавань та/або делецій, які описано вище або нижче, можна здійснити у СОВА або інших послідовностях (наприклад, варіабельних доменах), що передбачаються даним винаходом, без істотної зміни здатності антитіла до зв'язування з (ЧЕ. Вплив будь-яких амінокислотних замін, додавань та/або делецій може бути легко досліджений спеціалістом у даній галузі техніки, наприклад, за допомогою застосування способів, описаних у даному документі, зокрема, у розділі Приклади.
Згідно з одним варіантом здійснення одну або декілька (наприклад, 1, 2, З або 4) амінокислотних замін, додавань та/або делецій можна здійснити у СОВ або каркасній ділянці, що використовуються у антитілі або фрагменті, які передбачаються даним винаходом, для того, щоб афінність зв'язування (Ко) з ІДЕ у антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу заданим винаходом становила менш ніж 2, 1,9, 1,8,1,7,1,6,1,5,1,4,1,3,1,2,1,1,1,0,0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4 або 0,3 нМ. Згідно з одним варіантом здійснення передбачається модифіковане гуманізоване антитіло, в якому було здійснено модифікації в будь-якій із СОВА, каркасних ділянок або і там, і там з метою зменшення Ко, наприклад, до менш ніж 2, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 12,1,1,1,0,0,9и50,8,0,7,0,6,0,5,0,4 або 0,3 НМ.
Фрагмент антитіла за даним винаходом включає у себе Раб, Раб, К(аб)2, 5егм, діатіло, 5СЕАБ, акм, однодоменні антитіла з легкого ланцюга, азЕм, пептид, що містить СОВ, та подібне.
Бар являє собою фрагмент антитіла, що має молекулярну масу приблизно 50000 та антигензв'язувальну активність, у якому приблизно половина Н ланцюга з боку М-кінця та цілий
Ї ланцюг із фрагментів, одержаних шляхом обробки Ід протеазою-папаїном (розщеплює за амінокислотним залишком у положенні 224 Н ланцюга), зв'язані разом за допомогою дисульфідного зв'язку.
Бар за даним винаходом можна одержувати шляхом обробки протеазою-папаїном гуманізованого антитіла з прищепленими СОВ за даним винаходом, яке специфічно реагує з
ІДЕ. Раб також можна одержувати шляхом вставки ДНК. що кодує Рар антитіла, у вектор експресії для прокаріот або вектор експресії для еукаріот, та введення вектора у прокаріота або еукаріота для експресії Габ.
Кабв)2 являє собою фрагмент антитіла, що має молекулярну масу приблизно 100000 та антигензв'язувальну активність та є трохи більшим, ніж Раб, зв'язані через дисульфідний зв'язок у шарнірній ділянці з фрагментів, одержаних при обробці Ідеї протеазою-пепсином.
Кавф)2 за даним винаходом можна одержувати шляхом обробки протеазою-пепсином людського антитіла з прищепленими СОРВ, яке специфічно реагує з ЧЕ. К(аб)2 також можна одержувати шляхом зв'язування Раб", описаного нижче, тіоефірним зв'язком або дисульфідним зв'язком.
ЕРар' являє собою фрагмент антитіла, що має молекулярну масу приблизно 50000 та антигензв'язувальну активність, який одержують при розщепленні дисульфідного зв'язку у шарнірній ділянці Е(аб)2.
ЕРар' за даним винаходом можна одержувати шляхом обробки К(аб)2, який специфічно реагує з ІЗЕ, відновлювальним засобом-дитіотреїтолом. Раб' за даним винаходом також можна одержувати шляхом вставки ДНК, що кодує Рар' людського антитіла з прищепленими СОВА за даним винаходом, яке специфічно реагує з ІЧЕ, в вектор експресії для прокаріот або вектор експресії для еукаріот та введення вектора у прокарота або еукаріота для експресії Бар". 5сЕм являє собою поліпептид МН-Р-МІ або МІ-Р-МН, у якому МН одного ланцюга та Мі. одного ланцюга з'єднані за допомогою відповідного пептидного лінкера (Р) з 12 або більше залишків, та який має антигензв'язувальну активність. 5сЕм за даним винаходом можна одержувати шляхом одержання кДНК, які кодують МН та МІ. людського антитіла з прищепленими СОВ, що специфічно реагує з ІДЕ за даним винаходом, конструювання ДНК, яка кодує зсЕм, вставки ДНК у вектор експресії для прокаріот або вектор експресії для еукаріот та наступного введення вектора експресії у прокаріота або еукаріота для
Зо експресії всгЕм.
Еар-фрагмент за даним винаходом може бути з'єднаним із зсЕм безпосередньо або через лінкер. Терміни "одноланцюговий варіабельний фрагмент" або "всЕм", що використовуються у даному документі, відносяться до одноланцюгового варіабельного фрагмента, який стабілізований пептидним лінкером між варіабельними доменами МН та Мі, наприклад, пептидним лінкером з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 151. Зв'язок із
Еаб-фрагментом може бути досягнутий за допомогою хімічної кон'югації, але, найбільш переважно, за допомогою трансляційного злиття, тобто генетичного злиття, при якому послідовність кожного закодована у послідовності вектора експресії. Отже, лінкер, як правило, являє собою амінокислотний лінкер. який описаний у даному документі. 5сЕм за даним винаходом. з'єднаний з ЕРарб-фрагментом, можна зв'язати із сироватковим білком-носієм із метою подовження періоду напівжиття гібридного білка на основі антитіла іп мімо. Подовження періоду напівжиття таким чином є незалежним від зв'язування ІДЕ та може бути переважним.
Термін "сироватковий білок-носій", який використовується у даному документі, відноситься до будь-якого підходящого білка-носія з плазми крові, з яким може зв'язуватись 5сЕм, в одному прикладі сироватковий білок-носій є вибраним із тироксинзв'язуючого білка, транстиретину, с1-кислого глікопротеїну, трансферину. фібриногену та альбуміну або фрагмента будь-якого з них. Як правило, 5сЕм зв'язується з альбуміном, переважно, людським сироватковим альбуміном.
Будь-який підходящий 5сЕм, що зв'язується з альбуміном, може бути вбудований у гібридні білки на основі антитіла за даним винаходом. Підходящі домени, що зв'язують альбумін, були описані раніше у рівні техніки.
Діатіло являє собою фрагмент антитіла, в якому 5сЕм, що мають однакову або відмінну антигензв'язувальну специфічність, утворюють димер, та воно характеризується дивалентною антигензв'язувальною активністю щодо одного й того ж антигена або двома специфічними антигензв'язувальними активностями щодо різних антигенів.
Діатіло за даним винаходом, наприклад, дивалентне діатіло, яке специфічно реагує з ІЗЕ, можна одержувати шляхом одержання кКДНК, що кодують МН та Мі антитіла, яке специфічно реагує з ІДЕ, конструювання ДНК, що кодує 5сЕм, який має поліпептидний лінкер з 3-10 залишків, вставки ДНК у вектор експресії для прокаріот або вектор експресії для еукаріот та бо наступного введення вектора експресії у прокаріота або еукаріота для експресії діатіла.
Зо а5Ем одержують шляхом зв'язування поліпептидів, у яких один амінокислотний залишок у кожному з МН та МІ є заміненим на цистеїновий залишок, через дисульфідний зв'язок між цистеїновими залишками. Амінокислотний залишок, який заміщують на цистеїновий залишок, може бути вибраний на основі оцінки тривимірної структури антитіла у відповідності зі способом, показаним Вейег еї аї. (Ргоїєїп Епдіпеегіпод, 7, 697 (1994)). а5Ем за даним винаходом можна одержувати шляхом одержання кДнНК, які кодують МН та МІ. людського антитіла з прищепленими СОВ, що специфічно реагує з ІДЕ за даним винаходом, конструювання ДНК, яка кодує азгЕм, вставки ДНК у вектор експресії для прокаріот або вектор експресії для еукаріот та наступного введення вектора експресії у прокаріота або еукаріота для експресії авгм.
Пептид, що містить СОВ, складають шляхом включення щонайменше однієї ділянки СОВ Н ланцюга та І ланцюга. Декілька СОВ можуть бути зв'язані безпосередньо або через відповідний пептидний лінкер.
Пептид, що містить СОН, за даним винаходом можна одержувати шляхом одержання кДНК, що кодує СОВ МН та МІ. людського антитіла з прищепленими СОР, яке специфічно реагує з ІДЧЗЕ, конструювання ДНК, що кодує СОВ, вставки ДНК у вектор експресії для прокаріот або вектор експресії для еукаріот та наступного введення вектора експресії у прокаріота або еукаріота для експресії пептиду. Також, пептид, що містить СОР, також можна одержати за допомогою способу хімічного синтезу, такого як Етос-спосіб (спосіб із використанням флуоренілметоксикарбонілу), ІВос-спосіб (спосіб із використанням трет-бутилоксикарбонілу) або подібне.
Антитіло за даним винаходом включає у себе похідні антитіл, у яких радіоізотоп, білок, засіб або подібне є хімічно або генетично кон'югованим з антитілом за даним винаходом.
Похідні антитіл за даним винаходом можна одержувати шляхом хімічної кон'югації радіоактивного ізотопу, білка або засобу з боку М-кінця або з боку С-кінця Н ланцюга або ланцюга антитіла або фрагмента антитіла, які специфічно реагують з ІДЕ, з відповідною групою- замісником або бічним ланцюгом антитіла або фрагмента антитіла або з цукровим ланцюгом у антитілі або фрагменті антитіла (Апіїбоду Епдіпеєегіпд НапароокК, едіпеда ру Озати Капетіїви, рибіїзней Бу Спііп ЗпоКап (1994)). їх також можна одержати генетичними методами шляхом з'єднання ДНК, що кодує антитіло або фрагмент антитіла за даним винаходом, які специфічно реагують з ІдЕ, та іншої ДНК, що кодує білок, який має бути зв'язаний, вставки ДНК у вектор експресії та введення вектора експресії у клітину-хазяїна.
Радіоактивний ізотоп включає в себе 1311, 1251 та подібні, та він може бути кон'югований з антитілом, наприклад, за допомогою способу з використанням хлораміну Т.
Засіб переважно являє собою низькомолекулярну сполуку. Приклади включають у себе протиракові засоби, такі як алкілуючі засоби (наприклад, азотистий іприт, циклофосфамід), антиметаболіти (наприклад, 5-фторурацил, метотрексат), антибіотики (наприклад, дауноміцин, блеоміцин, мітоміцин С, даунорубіцин, доксорубіцин), рослинні алкалоїди (наприклад, вінкристин, вінбластин, віндезин), гормональні лікарські засоби (наприклад, тамоксифен, дексаметазон) та подібні (Сіїпісаї Опсоіоду, єдіед Бу дарапе5зе 5босієїу ої Сіїіпіса! Опсоіоаду, рибіїзней ру Сапсег апа СпетоїНегару (1996)); протизапальні лікарські засоби, такі як стероїдні засоби (наприклад, гідрокортизон, преднізон), нестероїдні засоби (наприклад, аспірин, індометацин), імуномодулятори (наприклад, ауротіомалат, пеніциламін), імунодепресивні засоби (наприклад, циклофосфамід, азатіоприн) та антигістамінні засоби (наприклад, хлорфеніраміну малеат, клемастин) (Іпйаттайоп апа Апії-іпПаттаїйюгу ТПегару, ІвпіуакКи зЗпиррап (1982)); та подібні. Спосіб кон'югації дауноміцину з антитілом включає у себе спосіб, у якому дауноміцин та аміногрупу антитіла кон'югують за допомогою глутарового альдегіду, спосіб, у якому аміногрупу дауноміцину та карбоксильну групу антитіла кон'югують за
БО допомогою водорозчинного карбодіїміду, та подібні.
Також, з метою прямого інгібування ракових клітин можна застосовувати токсин, такий як рицин, дифтерійний токсин та подібні. Наприклад, гібридне антитіло з білюом можна одержувати шляхом з'єднання кКДНК, що кодує антитіло або фрагмент антитіла, з іншою кДНК, яка кодує білок, конструювання ДНК, що кодує гібридне антитіло, вставки ДНК у вектор експресії для прокаріот або вектор експресії для еукаріот та його наступного введення у прокаріота або еукаріота для експресії гібридного антитіла.
У даному документі додатково розглядаються фрагменти антитіл або антигензв'язувальні засоби, в тому числі гібридні білки на основі зв'язувальних засобів, наприклад, імуноглобуліноподібні фрагменти та засоби, такі як діатіла, 5сАБ, біспецифічні фрагменти, 60 триатіла, Гар-Ем-Ем, Рар-Рм, тріотіла, (Гар-Ем)2-Ес, та фрагменти або частини антитіл, такі як
СО або петлі антитіла, що включають у себе СОВ, які прищеплені на відмінні від Ід каркаси, такі як фібронектин або білок з доменом "лейцинова застібка", як описано у Віп?о еї аї., (2005)
Маї. Віотесі. 23:1257-1268, яка включена у даний документ у своїй повноті.
Кон'юговані моноклональні антитіла та антигензв'язувальні засоби проти ІДЕ Якщо необхідно, антитіло або антигензв'язувальний засіб для застосування у даному винаході можуть бути кон'юговані з однією або декількома ефекторними молекулами. Буде зрозуміло, що ефекторна молекула може містити одну ефекторну молекулу або дві або більше таких молекул, з'єднаний таким чином, щоб утворювати єдиний фрагмент, який може бути прикріплений до антитіл за даним винаходом. У випадку, коли необхідно одержати фрагмент антитіла, з'єднаний з ефекторною молекулою, його можна одержати за допомогою стандартних хімічних процедур або процедур з використанням рекомбінантної ДНК, при яких фрагмент антитіла з'єднується з ефекторною молекулою або безпосередньо, або через сполучний засіб. Методики для кон'югації таких ефекторних молекул з антитілами є добре відомими у рівні техніки (див.,
Неїївігот еї аї!., Сопігоїєа Ога Оеєїїмегу, 2па Еа., Вобіпзоп еї аї!., єдв., 1987, рр. 623-53; Погре сеї а!., 1982, Іттипої!. Нем., 62:119-58; та биром/спікК еї а!., 1999. Рпагтасоїоду апа ТГнегарешіісв, 83, 67-123). Конкретні хімічні процедури включають у себе, наприклад, такі, що описані у міжнародних заявках УУО 93/06231, МО 92/22583, УМО 89/00195, МО 89/01476 та МО 03/031581.
У якості альтернативи, у випадку, коли ефекторна молекула являє собою білок або поліпептид, зв'язок може бути одержаний за допомогою процедур із використанням рекомбінантної ДНК, наприклад, як описано у міжнародній заявці М/О 86/01533 та у патентному документі
ЕРОЗ392745.
Термін "ефекторна молекула" у контексті даного документа включає в себе, наприклад, протипухлинні засоби, лікарські засоби, токсини, біологічно активні білки, наприклад, ферменти, інше антитіло або фрагменти антитіла, антигензв'язувальні засоби, синтетичні (в тому числі
РЕС) або природні полімери, нуклеїнові кислоти та їх фрагменти, наприклад, ДНК, РНК та їх фрагменти, радіонукліди, особливо, радіоактивний йод, радіоактивні ізотопи, метали у складі хелатних комплексів, наночастинки та репортерці групи, такі як флуоресцентні сполуки або сполуки, які можуть бути виявлені за допомогою ЯМР- або ЕПР-спектроскопії.
Приклади ефекторних молекул можуть включати у себе цитотоксини або цитотоксичні засоби, в тому числі будь-який засіб, який є шкідливим для клітин (наприклад, він їх знищує).
Приклади включають у себе комбрестатини, доластатини, епотилони, стауроспорин, майтансиноїди, спонгістатини, ризоксин, галіхондрини, рорідини, геміастерліни, таксол, цитохалазин В, граміцидин ОО, бромід етідію, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідрокси-антрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин ОО, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол та пуроміцин та їх аналоги або гомологи.
Ефекторні молекули також включають у себе, без обмеження, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, б-меркаптопурин, б-тіогуанін, цитарабін, 5-фторурацил-декарбазин), алкілуючі засоби (наприклад, мехлоретамін, тіоепа-хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (В5МІ) та ломустин (ССМІ)), циклофосфамід, бусульфан, дибромманіт, стрептозотоцин, мітоміцин С та цис-дихлордіамінплатину (І) ((0О0ОР) цисплатин), антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (раніше, дауноміцин) та доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (раніше, актиноміцин), блеоміцин, мітраміцин, антраміцин (АМС), каліхеаміцини або дуокарміцини) та антимітотичні засоби (наприклад, вінкристин та вінбластин).
Інші ефекторні молекули можуть включати у себе радіонукліди у хелатній формі, такі як 1111п та 90У, І и177. Вісмут213, Каліфорній252, Іридій192 та Вольфрам 188/Реній 188; або лікарські засоби, такі як, без обмеження, алкілфосфохоліни, інгібітори топоізомерази І, таксоїди та сурамін.
Інші ефекторні молекули включають у себе білки, пептиди та ферменти. Ферменти, що
БО представляють інтерес, включають у себе, без обмеження, протеолітичні ферменти, гідролази, ліази, ізомерази, трансферази. Білки, поліпептиди та пептиди, що представляють інтерес, включають у себе, без обмеження, імуноглобуліни, токсини, такі як абрин, рицин А. ендотоксин
Реємдотопаз або дифтерійний токсин, білок, такий як інсулін, фактор некрозу пухлин, с- інтерферон, р-інтерферон, фактор росту нервів, фактор росту тромбоцитів або тканинний активатор плазміногену, тромботичний засіб або антиангіогенний засіб, наприклад, ангіостатин або ендостатин, або модифікатор біологічної реакції, такий як лімфокін, інтерлейкін-і (1-1), інтерлейкін-2 (1-2), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (БМ-С5БЕ), гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (0-С51Е), фактор росту нервів (МОРЕ) або інший фактор росту та імуноглобуліни.
Інші ефекторні молекули можуть включати у себе детектовні сполуки, придатні, наприклад, у діагностиці. Приклади детектовних сполук включають у себе різноманітні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали, біолюмінесцентні матеріали, радіонукліди, позитронно-активні метали (для застосування у позитронно-емісійній томографії) та нерадіоактивні іони парамагнітних металів. Див., в цілому, патент США Мо 4741900 для інформації про іони металів, які можуть бути кон'юговані з антитілами для застосування в якості діагностичних засобів. Підходящі ферменти включають у себе пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу; підходящі простетичні групи включають у себе стрептавідин, авідин та біотин; підходящі флуоресцентні матеріали включають у себе умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїн-ізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламін-флуоресцеїн, дансил-хлорид та фікоеритрин; підходящі люмінесцентні матеріали включають у себе люмінол; підходящі біолюмінесцентні матеріали включають у себе люциферазу, люциферин та екворин; та підходящі радіонукліди включають у себе 1251, 1311, 1111п та 996.
В іншому прикладі ефекторна молекула може збільшувати період напівжиття антитіла іп мімо та/або зменшувати імуногенність антитіла та/або поліпшувати доставку антитіла через епітеліальний бар'єр в імунну систему. Приклади підходящих ефекторних молекул цього типу включають у себе полімери, альбумін, білки, що зв'язуються з альбуміном, або сполуки, що зв'язуються з альбуміном, такі як описані у міжнародній заявці М/О 05/117984.
Згідно з одним варіантом здійснення переважним є період напівжиття, що забезпечується ефекторною молекулою, яка є незалежною від ІДЕ або антитіла до людського ІДЕ.
У випадку, коли ефекторна молекула являє собою полімер, вона, в цілому, може являти собою синтетичний або природний полімер, наприклад, необов'язково заміщений лінійний або розгалужений поліалкіленовий, поліалкюеніленовий або поліоксіалкіленовий полімер або розгалужений або нерозгалужений полісахарид, наприклад, гомо- або гетерополісахарид.
Конкретні необов'язкові замісники, які можуть бути присутні на вищезгаданих синтетичних полімерах, включають у себе одну або декілька гідрокси, метильних або метокси груп.
Конкретні приклади синтетичних полімерів включають у себе необов'язково заміщений лінійний або розгалужений полі(етиленгліколь), полі(пропіленгліколь), полі(вініловий спирт) або їх похідні, особливо, необов'язково заміщений полі(етиленгліколь), такий як метоксиполі(етиленгліколь) або його похідні.
Специфічні природні полімери включають у себе лактозу, амілозу, декстран, глікоген або їх похідні.
Згідно з одним варіантом здійснення полімер являє собою альбумін або його фрагмент, такий як людський сироватковий альбумін або його фрагмент. Згідно з одним варіантом здійснення полімер являє собою молекулу РЕ.
У контексті даного документу термін "похідні" стосовно кон'югатів, як передбачається, включає реакційноздатні похідні, наприклад, селективні по відношенню до тіолу реакційноздатні групи, такі як малеїміди та подібне. Реакційноздатна група може бути з'єднана з полімером безпосередньо або через лінкерний сегмент. Буде зрозуміло, що залишок такої групи у деяких випадках буде утворювати частину продукту у вигляді з'єднувальної групи між фрагментом антитіла та полімером.
Розмір натурального або синтетичного полімеру можна змінювати, якщо необхідно, проте, в цілому, він буде знаходитись у діапазоні середньої молекулярної маси від 500 Да до 50000 Да, наприклад, від 5000 до 40000 Да, як наприклад, від 20000 до 40000 Да. Розмір полімеру, зокрема, може бути вибраний, виходячи з передбаченого застосування продукту, наприклад, здатності до локалізації у певних тканинах, таких як пухлини, або продовження періоду напіввиведення з кровотоку (для огляду, див., Спартап, 2002, Адмапседа Опша Овєїїмегу Веміємув, 54, 531-545). Таким чином, наприклад, у випадку, коли передбачається, що продукт залишає кровотік і проникає у тканину, наприклад, для застосування у лікуванні пухлини, переважним може бути застосування полімеру з низькою молекулярною масою, наприклад, із молекулярною масою приблизно 5000 Да. Для застосувань, при яких продукт залишається у кровотоці, переважним може бути застосування полімеру з вищою молекулярною масою, наприклад, який має молекулярну масу в діапазоні від 20000 Да до 40000 Да.
Підходящі полімери включають у себе поліалкіленовий полімер, такий як полі(етиленгліколь) або, зокрема, метоксиполі(етиленгліколь) або їх похідне, та. зокрема, полімер із молекулярною масою у діапазоні від приблизно 15000 Да до приблизно 40000 Да.
В одному прикладі антитіла для застосування у даному винаході прикріплені до полі(етиленгліколевих) (РЕС) фрагментів. В одному конкретному прикладі антитіло являє собою 60 фрагмент антитіла, та молекули РЕСї можуть бути прикріплені через боковий ланцюг будь-якої доступної амінокислоти або функціональну групу кінцевої амінокислоти, що знаходиться у фрагменті антитіла, наприклад, через будь-яку вільну аміно, іміно, тіольну, гідроксильну або карбоксильну групу. Такі амінокислоти можуть зустрічатися у природних умовах у фрагменті антитіла або можуть бути введені за допомогою методів генної інженерії у фрагмент із застосуванням методів на основі рекомбінантної ДНК (див., наприклад, патенти США 05 5219996; 005 5667425; міжнародні заявки УУО 98/25971, МО 2008/038024). В одному прикладі молекула антитіла за даним винаходом являє собою модифікований Рар-фрагмент, причому модифікація являє собою приєднання до С-кінця його важкого ланцюга однієї або декількох амінокислот для забезпечення можливості прикріплення ефекторної молекули. Переважно, додаткові амінокислоти утворюють модифіковану шарнірну ділянку, що містить один або декілька цистеїнових залишків, до яких може бути прикріплена ефекторна молекула. Декілька сайтів можна використовувати для прикріплення двох або більше молекул РЕ.
Переважно, молекули РЕСї ковалентно з'єднані через тіольну групу щонайменше одного цистеїнового залишку, що знаходиться у фрагменті антитіла. Кожна молекула полімеру, прикріплена до модифікованого фрагмента антитіла, може бути ковалентно з'єднана з атомом сірки у цистеїновому залишку, що знаходиться у фрагменті. Ковалентний зв'язок звичайно буде являти собою дисульфідний зв'язок або, зокрема, зв'язок сірка-вуглець. У випадку, коли тіольну групу використовують у якості точки прикріплення активованих відповідним чином ефекторних молекул, можна використовувати, наприклад, селективні по відношенню до тіолу похідні, такі як малеїіміди та похідні цистеїну. Активований полімер можна використовувати в якості вихідного матеріалу в одержанні модифікованих полімером фрагментів антитіла, які описані вище.
Активований полімер може являти собою будь-який полімер, який містить групу, здатну до реакції з тіолом, таку як о-галогенкарбонова кислота або естер, наприклад, йод ацетамід, імід, наприклад, малеїмід, вінілсульфон або дисульфід. Такі вихідні матеріали можуть бути одержані від комерційних постачальників (наприклад, від МекКіаг. раніше ЗНеагмаїєг Роїутегв Іпс.,
Гантсвіл, Алабама, США), або їх можна приготувати з комерційно доступних вихідних матеріалів з використанням загальноприйнятих хімічних процедур. Конкретні молекули РЕСї включають у себе 20К метокси-РЕО-амін (який можна одержати від МеКіаг, раніше 5Неєагмаїег; Варр
Роїутеге та 5!пВіо) та М-РЕС-5РА (який можна одержати від МеКіаг, раніше Зпеагмаїег).
Згідно з одним варіантом здійснення антитіло являє собою модифікований Рар-фрагмент,
Еар'-фрагмент або адігРаб, який є пегілованим, тобто має РЕС (полі(етиленгліколь)). ковалентно прикріплений до нього, наприклад, згідно зі способом, розкритим у патентному документі ЕР 0948544 або ЕР 1090037 |див. також "Роїу(еїйпуіІепедіусої) Спетівігу, ВіоїесНпіса! апа Віотедіса)!
Арріїсайопв", 1992, У. Мійоп Наїтіз (єд), Рієпит Ргев55, Мем Хогк, "Роїу(еїпуІепеаіусої) Спетівігу апа Віоіодіса! Арріїсайопв", 1997, 3. Міоп Наїгтіз апа 5. 7аїїр5Ку (ед5), Атегісап Спетіса! босієїу,
Муазпіпдіоп ОС апа "Віосопійдайоп Ргоївіп Соиріїпд Тесппідие5 Тог Ше Віотеаіса! Зсіепсев", 1998, М. Авіат апа А. Оепі, Стоме Рибіїзпег5, Мем МоїКк; Спартап, А. 2002, Адмапсей Огид
Оеєїїмегу Веміємже 2002, 54:531-545) В одному прикладі РЕСї прикріплений до цистеїну у шарнірній ділянці. В одному прикладі модифікований РЕС: Габ-фрагмент має малеїімідну групу, ковалентно з'єднану з однією тіольною групою в модифікованій шарнірній ділянці. Лізиновий залишок може бути ковалентно з'єднаним з малеімідною групою, та до кожної з аміногруп на лізиновому залишку може бути прикріплений метоксиполі(етиленгліколевий) полімер, що характеризується молекулярною масою приблизно 20000 Да. Отже, сумарна молекулярна маса
РЕС, прикріпленого до Гар-фрагмента, може становити приблизно 40000 Да.
Конкретні молекули РЕС включають у себе лізин, модифікований /-2-І3-(М- малеімідо)пропіонамідо|етиламідом М,М-біс(метоксиполі(етиленгліколю) (ММУУ 20000), також відомий як РЕС2МАЇ 40К (який може бути одержаний від МеКіаг, раніше Зпеагмаїег).
Альтернативні постачальники лінкерів для РЕСї включають у себе МОРЕ, яка поставляє (1 2- 400МАЗ (де т у структурі нижче дорівнює 5) та СІ 2-А0ОМА (де т дорівнює 2), та п дорівнює приблизно 450:
Соч
ЕЕ Я: чи ; вно З н З
От си Сну ча ї ії в 0 ан в хв дерівнин я ба
Інакше кажучи, кожний РЕСї має молекулярну масу приблизно 20000 Да.
Отже, згідно з одним варіантом здійснення РЕСї являє собою 2,3-біс(метилполіоксиетилен- окси)-1-І3-(б-малеїімідо-1-оксогексил)аміно|пропілокси) гексан (розгалужений РЕ з 2 ланцюгами, -«СН2) ЗМНСО(СН2)5-МАЇГ., Муу 40000, відомий як ФБОМВАЇСИНТ СІ 2-400МАЗ.
Додаткові альтернативні ефекторні молекули РЕС наступного типу:
ССС. я і и я і! і! х | Дане: ЯК
Е : шк ї і;
Хресної
СА г є доступними від Ог Ведау, МОЕ та дУепКет.
Згідно з одним варіантом здійснення передбачається антитіло за даним винаходом, яке є пегілованим (наприклад, з використанням РЕС, описаного у даному документі) з прикріпленням через залишок амінокислоти цистеїну у положенні 226 або поблизу амінокислоти 226 у ланцюзі, наприклад, до амінокислоти 226 у важкому ланцюзі (при послідовній нумерації).
Згідно з одним варіантом здійснення даним розкриттям передбачається молекула Гар'РЕС, що містить один або декілька полімерів РЕС, наприклад, 1 або 2 полімери, такі як полімер або полімери з молекулярною масою 40 кДа.
Молекули Рар'-РЕа згідно з даним розкриттям можуть бути особливо переважними тим, що їх період напівжиття не залежить від Ес-фрагмента. В одному прикладі даним винаходом передбачається спосіб лікування захворювання, яке ослаблюється внаслідок модуляції біологічної активності людського ІДЕ, що передбачає введення терапевтично ефективної кількості антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу на його основі, причому антитіло або антигензв'язувальний засіб на його основі характеризуються періодом напівжиття, який є незалежним від зв'язування Ес з ІДЕ.
Згідно з одним варіантом здійснення передбачається Рар', кон'югований із полімером, таким як молекула РЕС, молекула крохмалю або молекула альбуміну.
Згідно з одним варіантом здійснення передбачається 5сгУ, кон'югований із полімером, таким як молекула РЕС, молекула крохмалю або молекула альбуміну.
Зо Згідно з одним варіантом здійснення антитіло або фрагмент є кон'югованими з молекулою крохмалю, наприклад, для збільшення періоду напівжиття. Способи кон'югації крохмалю з білком описані у патенті США 05 8017739, включеному у даний документ за допомогою посилання.
Полінуклеотиди
Даний винахід також відноситься до виділеної послідовності ДНК, що кодує важкий та/або легкий ланцюг(ланцюги) молекули антитіла за даним винаходом. Переважно, послідовність ДНК кодує важкий або легкий ланцюг молекули антитіла за даним винаходом. Послідовність ДНК за даним винаходом може містити синтетичну ДНК, наприклад, одержану за допомогою хімічної обробки, кКДНК, геномну ДНК або будь-яку їх комбінацію.
Послідовності ДНК, які кодують молекулу антитіла за даним винаходом, можна одержати за допомогою способів, добре відомих спеціалістам у даній галузі техніки. Наприклад, послідовності ДНК, які кодують частину важкого та легкого ланцюгів антитіла або всі з них, можуть бути синтезовані, якщо необхідно, з визначених послідовностей ДНК або на основі відповідних амінокислотних послідовностей.
ДНК, що кодує акцепторні каркасні послідовності, є добре доступною для спеціалістів у даній галузі техніки та може бути легко синтезована на основі їх відомих амінокислотних послідовностей.
Стандартні методики молекулярної біології можна використовувати для одержання послідовностей ДНК, які кодують молекулу антитіла за даним винаходом. Бажані послідовності
ДНК можуть бути синтезовані повністю або частково з використанням методик синтезу олігонуклеотидів. За потреби можна використовувати методики сайт-спрямованого мутагенезу та полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Даний винахід також відноситься до вектора клонування або експресії, що містить одну або декілька послідовностей ДНК за даним винаходом. Відповідно, передбачається вектор клонування або експресії, що містить одну або декілька послідовностей ДНК, які кодують антитіло за даним винаходом. Переважно, вектор клонування або експресії містить дві послідовності ДНК, що кодують легкий ланцюг і важкий ланцюг молекули антитіла за даним винаходом, відповідно, та підходящі сигнальні послідовності. В одному прикладі вектор містить міжгенну послідовність між важким та легким ланцюгами (див. міжнародну заявку УМО 03/048208).
Загальні методи, за допомогою яких можуть бути сконструйовані вектори, методи трансфекції та методи культивування є добре відомими спеціалістам у даній галузі техніки. У зв'язку з цим слід зробити посилання на "Ситепі Ргоїосоі5 іп Моїесшіаг Віоіоду", 1999, Р. М.
А!йзибеї! (єд), УМіеу Іпіегесіепсе, Мем/ МогКк; та посібник Мапіаїіз Мапиа!, випущений Соїд бргіпд
Нагбоиг Рибіїпіпа.
Клітини-хазяїни, що експресують антитіла до ІДЕ або їх фрагменти
Також передбачається клітина-хазяїн, що містить один або декілька векторів клонування або експресії, які містять одну або декілька послідовностей ДНК, що кодують антитіло за даним
Зо винаходом. Будь-яку підходящу систему клітина-хазяїн/вектор можна застосовувати для експресії послідовностей ДНК, що кодують молекулу антитіла за даним винаходом. Можна застосовувати бактеріальні системи, наприклад, Е. соїї, та системи на основі інших мікробів, або також можна застосовувати експресійні системи на основі еукаріотичних клітин-хазяїнів, наприклад, на основі клітин ссавців. Підходящі клітини-хазяїни ссавців включають у себе СНО клітини, клітини мієломи або гібридоми.
Підходящі типи клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО клітини) для застосування у даному винаході можуть включати у себе клітини СНО та СНО-КІ, у тому числі ант- сно клітини, такі як СНО-0С144 клітини та СНО-ОХВІ11 клітини, які можна використовувати з селектовним маркером ОНЕНВ, або СНОК1-5М клітини, які можна використовувати з глутамін- синтетазою в якості селектовного маркера. Інші типи клітин для застосування у експресії антитіл включають у себе лімфоцитарні лінії клітин, наприклад, клітини мієломи МБО та 5Р2 клітини,
СО5 клітини. Інші підходящі клітини можуть включати фібробласти ембріональної нирки людини (пек), наприклад, пек293Е та Ехрінек клітини, які є відомими у рівні техніки.
СНО є переважною для повнорозмірного АЬ за даним винаходом, виходячи з того, що вона є стандартним хазяїном для продукування омалізумабу (згідно з одним варіантом здійснення, де для антитіл за даним винаходом забезпечується стандартний профіль глікозилування омалізумабу) (див. також міжнародну заявку МО 2013/181577|.
Одержання антитіл до ІДЕ або їх фрагментів
Даний винахід також відноситься до способу одержання молекули антитіла за даним винаходом, що передбачає культивування клітини-хазяїна, яка містить вектор за даним винаходом, в умовах, підходящих для здійснення експресії білка з ДНК, що кодує молекулу антитіла за даним винаходом, та виділення молекули антитіла.
Молекула антитіла може містити тільки поліпептид важкого або легкого ланцюга, у цьому випадку для трансфекції клітин-хазяїнів необхідно застосовувати тільки кодуючу послідовність поліпептиду важкого ланцюга або легкого ланцюга. Для одержання продуктів, що містять як важкий, так і легсий ланцюги, лінію клітин можна трансфікувати двома векторами: першим вектором, що кодує поліпептид легкого ланцюга, та другим вектором, що кодує поліпептид важкого ланцюга. В якості альтернативи, можна застосовувати один вектор, причому вектор включає в себе послідовності, що кодують поліпептиди легкого ланцюга та важкого ланцюга.
Передбачається процес культивування клітини-хазяїна та експресії антитіла або його фрагмента, виділення останнього та, необов'язково, його очищення для забезпечення виділеного антитіла або фрагмента. Згідно з одним варіантом здійснення спосіб додатково передбачає стадію кон'югації ефекторної молекули з виділеним антитілом або фрагментом, наприклад, кон'югації полімеру РЕС, зокрема, як описано у даному документі.
Згідно з одним варіантом здійснення передбачається процес очищення антитіла (зокрема, антитіла або фрагмента за даним винаходом), що передбачає стадії: проведення аніонообмінної хроматографії у режимі без зв'язування таким чином, що домішки утримуються в колонці, а антитіло єлююється.
Згідно з одним варіантом здійснення в очищенні використовується афінне захоплення на колонці з білком А, а потім титрування. Згідно з одним варіантом здійснення в очищенні використовується афінне захоплення на колонці з білком С, а потім НРІ С з титруванням. Згідно з одним варіантом здійснення в очищенні використовується афінне захоплення на колонці з ІДЕ, а потім титрування.
Згідно з одним варіантом здійснення в очищенні використовується Цібакрон блакитний (сібрасгоп рішє) або подібне для очищення гібридного білка з альбуміном або молекул кон'югатів.
Підходящі іонообмінні смоли для застосування у способі включають у себе смолу О.ЕЕ (постачається СЕ-Неаїйїнсагє). Цю стадію можна здійснювати, наприклад, при рН приблизно 8.
Процес може додатково передбачати початкову стадію захоплення з використанням катіонообмінної хроматографії, яку здійснюють, наприклад, при рН, що становить приблизно 4- 5, як наприклад, 4,5. В катіонообмінній хроматографії може використовуватись, наприклад, смола, така як смола Саріо5 або 5Р сефароза ЕЕ (постачається СЕ-НеайНсагє). Антитіло або фрагмент потім можуть бути елюйовані зі смоли з використанням розчину іоногенної солі, такої як хлорид натрію, наприклад, у концентрації, що становить 200 мМ.
Отже, стадія або стадії хроматографії можуть за необхідності включати у себе одну або декілька стадій промивання.
Процес очищення також може передбачати одну або декілька стадій фільтрування, як наприклад, стадію діафільтрування або стадію фільтрування з НРІ С.
Отже, згідно з одним варіантом здійснення передбачається очищене антитіло до ДЕ або
Зо фрагмент, наприклад, гуманізоване антитіло або фрагмент, зокрема, антитіло або фрагмент за даним винаходом, які є, по суті, очищеними від ендотоксину та/або білка або ДНК клітини- хазяїна, зокрема, які не містять або, по суті, не містять ендотоксин та/або білок або ДНК клітини-хазяїна.
Передбачається, що термін "очищений від", який використовувався вище, відноситься до щонайменше 90 95 чистоти, як наприклад, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 95 чистоти за масою або більшого ступеня чистоти.
Передбачається, що термін "по суті, не містить ендотоксину", в цілому, відноситься до вмісту ендотоксину, що становить 1 ШО (ендотоксинова одиниця) на мг продукту антитіла або менше, як наприклад, 0,5 або 0,1 Є) на мг продукту.
Передбачається, що термін "по суті, не містить білка або ДНК клітини-хазяїна", в цілому, відноситься до вмісту білка та/або ДНК клітини-хазяїна, що становить 400 мкг на мг продукту антитіла або менше, як наприклад 100 мкг на мг або менше, зокрема, 20 мкг на мг, якщо необхідно.
Фармацевтичні композиції
Оскільки антитіла за даним винаходом є придатними в лікуванні та/або профілактиці патологіного стану, даним винаходом також передбачається фармацевтична або діагностична композиція, що містить антитіло або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом у комбінації з одним або декількома з фармацевтично прийнятної допоміжної речовини, розріджувача або носія. Відповідно, передбачається застосування антитіла або антигензв'язувального засобу за даним винаходом для виробництва лікарського препарату.
Композиція звичайно буде поставлятися у складі стерильної фармацевтичної композиції, яка в нормі буде включати у себе фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтична композиція за даним винаходом може додатково містити фармацевтично прийнятну допоміжну речовину.
Даним винаходом також передбачається спосіб одержання фармацевтичної або діагностичної композиції що передбачає додавання та змішування антитіла або антигензв'язувального засобу за даним винаходом з одним або декількома з фармацевтично прийнятної допоміжної речовини, розріджувача або носія.
Антитіло або антигензв'язувальний засіб може являти собою єдиний активний інгредієнт у фармацевтичній або діагностичній композиції, або вони можуть бути доповнені іншими 60 активними інгредієнтами, в тому числі іншими інгредієнтами-антитілами або інгредієнтами,
відмінними від антитіл, такими як стероїди або інші молекули лікарських засобів, зокрема, молекули лікарських засобів, період напівжиття яких є незалежним від зв'язування з ІДЗЕ.
Фармацевтичні композиції переважно містять терапевтично ефективну кількість антитіла або антигензв'язувального засобу за даним винаходом. Термін "терапевтично ефективна кількість" у контексті даного документа відноситься до кількості терапевтичного засобу, необхідної для лікування, ослаблення або попередження цільового захворювання або стану або для того, щоб він проявляв терапевтичний або профілактичний ефект, який може бути виявлений. Для будь-якого розкритого антитіла або антигензв'язувального засобу терапевтично ефективну кількість можна оцінити спочатку або в аналізах на культурі клітин, або в тваринних моделях, звичайно на гризунах, кроликах, собаках, свинях або приматах. Тваринну модель також можна використовувати для визначення відповідного діапазону концентрацій і шляху введення. Таку інформацію потім можна використовувати для визначення придатних доз та шляхів для введення людям.
Точна терапевтично ефективна кількість для суб'єкта-людини буде залежати від тяжкості хворобливого стану, загального стану здоров'я суб'єкта, віку, маси та статі суб'єкта, раціону, часу та частоти введення, комбінації(комбінацій) із лікарським засобом(засобами), чутливості до реакцій та толерантності до терапії/відповіді на терапію. Цю кількість можна визначити шляхом стандартного проведення експериментів, та вона визначається настановами лікаря, що здійснює лікування. В цілому, терапевтично ефективна кількість буде становити від 0,01 мг/кг до 500 мг/кг. наприклад, від 0,1 мг/кг до 200 мг/кг, як наприклад, 100 мг/кг. Фармацевтичні композиції для зручності можуть бути присутні у складі одиничних лікарських форм, які містять попередньо визначену кількість активного засобу за даним винаходом на дозу.
Терапевтичні дози антитіл або антигензв'язувальних засобів за даним винаходом не показують помітних токсичних ефектів іп мімо.
Переважно, рівні активності ІДЕ іп мімо можна підтримувати на відповідним чином зниженому рівні за допомогою введення послідовних доз антитіла або зв'язувального засобу за даним розкриттям.
Композиції можна вводити пацієнту окремо, або їх можна вводити у комбінації (наприклад, одночасно, послідовно або окремо) з іншими засобами, лікарськими засобами або гормонами.
Зо Фармацевтична композиція також може містити фармацевтично прийнятний носій для введення антитіла або антигензв'язувального засобу. Сам носій не має викликати продукування антитіл, шкідливих для індивіда, який одержує композицію, та має не бути токсичним. Підходящі носії можуть являти собою великі макромолекули, що повільно метаболізуються, такі як білки, поліпептиди, ліпосоми, полісахариди, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти, полімерні амінокислоти, співполімери амінокислот та інактивовані вірусні частинки.
Можна застосовувати фармацевтично прийнятні солі, наприклад, солі мінеральних кислот, такі як гідрохлориди, гідроброміди, фосфати та сульфати, або солі органічних кислот, такі як ацетати, пропіонати, малонати та бензоати.
Фармацевтично прийнятні носії у терапевтичних композиціях можуть додатково містити рідини, такі як вода, сольовий розчин, гліцерин та етанол. Окрім того, у таких композиціях можуть бути присутні допоміжні матеріали, такі як змочувальні або емульгувальні засоби або буферні речовини для стабілізації рН. Такі носії забезпечують можливість складання фармацевтичних композицій у вигляді таблеток, пілюль, драже, капсул, рідин, гелів, сиропів, зависей та суспензій для приймання всередину пацієнтом.
Переважні форми для введення включають у себе форми, що є підходящими для парентерального введення, наприклад, за допомогою ін'єкції або інфузії, наприклад, за допомогою струменевої ін'єкції або безперервної інфузії. У випадку, коли продукт призначений для ін'єкції або інфузії, він може приймати форму суспензії, розчину або емульсії у масляному або водному середовищі, та він може містити допоміжні засоби для одержання складу, такі як суспендувальні засоби, консерванти, стабілізатори та/(або диспергувальні засоби. У якості альтернативи, молекула антитіла може знаходитись у сухому вигляді для відновлення перед застосуванням з використанням відповідної стерильної рідини.
Після складання композиції за даним винаходом можна вводити безпосередньо суб'єкту.
Суб'єктами, що підлягають лікуванню, можуть бути тварини. Тим не менш, переважно, щоб композиції були адаптовані для введення суб'єктам-людям.
Фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити будь-якою кількістю шляхів, у тому числі, без обмеження, пероральним, внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, внутрішньоартеріальним, інтрамедулярним, інтратекальним, інтравентрикулярним, трансдермальним, черезшкірним (наприклад, див. міжнародну заявку МО 98/20734), 60 підшкірним, інтраперитонеальним, інтраназальним, ентеральним, місцевим, сублінгвальним,
інтравагінальним або ректальним шляхами. Безголкові ін'єктори також можна застосовувати для введення фармацевтичних композицій за даним винаходом. Як правило, терапевтичні композиції можна приготувати у вигляді ін'єкційних препаратів, що мають вигляд або рідких розчинів, або суспензій. Також можуть бути приготовані тверді форми, підходящі для розчинення або суспендування у рідких середовищах перед ін'єкцією.
Безпосередня доставка композицій звичайно буде здійснюватись шляхом ін'єкції підшкірно (зокрема), інтраперитонеально, внутрішньовенно або внутрішньом'язово, або вони будуть доставлятися у інтерстиційний простір тканини. Композиції також можна вводити у вогнище.
Введення дози при лікуванні можна здійснювати за схемою з введенням однієї дози або за схемою з введенням декількох доз.
Буде зрозуміло, що активним інгредієнтом у композиції буде молекула антитіла. Сама по собі вона буде чутливою до руйнування у шлунково-кишковому тракті. Отже, якщо композицію слід вводити шляхом із використанням шлунково-кишкового тракту, буде необхідно, щоб композиція містила засоби, які захищають антитіло від руйнування, але вивільняють антитіло після того, як воно всмокталося зі шлунково-кишкового тракту.
Всебічне обговорення фармацевтично прийнятних носіїв доступне у Ветіпдіоп'є
Рпагтасеціїса! 5сіепсез (Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, М.У. 1991).
Структурно-функціональні властивості
У відповідності до одного аспекту даного винаходу антитіло або антигензв'язувальний засіб зв'язується з незв'язаним та зв'язаним із ЕсеєВІ людським ІДЕ. Коли антитіло (або антигензв'язувальний засіб) за даним винаходом зв'язується зі зв'язаним із ЕсеєВІ людським ЧЕ, воно стабілізує конформацію ІДЕ. У такій стабілізованій конформації ДЕ характеризується афінністю зв'язування з ЕсеВІ або омалізумабом (або його фрагментами), яка є слабшою, ніж за відсутності антитіла або антигензв'язувального засобу за даним винаходом, і при цьому зв'язаний з ЕсєНІ людський ІДЕ дисоціює від ЕсеНІ. Переважно. ІДЕ після дисоціації від Есе ВІ залишається зв'язаним з антитілом або антигензв'язувальним засобом, які описані у даному документі. Як буде показано нижче у даному документі (наприклад, в прикладі 1 та на фіг. 2), антитіло або антигензв'язувальний засіб за даним винаходом зв'язується з ІДЕ у конформації, що відрізняється від конформації, яку має ІДЕ, коли він зв'язаний з омалізумабом.
Не вдаючись у теорію, антитіло за даним винаходом викликає набуття ІДЕ частково зігнутої конформації (фіг. 2С та фіг. 5С та 0) та, отже, розгинання відносно структур незв'язаного або зв'язаного з ЕсеВІ ІЗЕ. Таке розгинання порушує здатність ІДЕ до зв'язування або збереження зв'язування з ЕсеВІ. Як буде показано у розділі Приклади, внаслідок того що антитіло за даним винаходом конкурує з сайтом зв'язування на ІДЕ за зв'язування з ЕсєНІ, вважається, що антитіло може бути здатним до утворення комплексу з ІДЕ, зв'язаним із ЕсеєВіІ, змінюючи структуру ІДЕ, коли він зв'язаний з ЕсеєВІіЇ, та забезпечуючи його дисоціацію від ЕсеВІ. Антитіла за даним винаходом, які характеризуються цими властивостями, являють собою антитіла, описані у даному документі, такі як антитіла або антигензв'язувальний засіб, що містять: а. варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить бед ІЮО Мо.: 1, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить: і. 564 ІО Мо.: 109; або ії. 5ед ІО Мо.: 113; або ії. Бед ІО Мо.: 121; або їм. БЕЯ ІЮ Мо.: 132; або м. Бед ІЮ МО. 139; або р. 5ед ІО Мо.: 5 та і. 564 ІО Мо., причому 577 та 579 замінені на 0; ії. 5ед ІО Мо.: 117; або ії. Бед ІО Мо.: 125; або їм. Зед ІО Мо.: 136; або м. Зед ІО Мо.: 143.
Антитіла до ДЕ або антигензв'язувальні засоби, що характеризуються такими властивостями, контактують або контактують та є специфічними до епітопа, що містить, у випадку 5ЕО ІО Мо 108, залишки Т373, М/374, 5375, НЗ376, АЗ77, 5378, (379, РЗ81, 0417, СА18. 8419, Рі426, Н4і27, А428 у СеЗ-домені та залишки 0278 та Т281 у Св2-домені людського ІДЕ.
Антитіла за даним винаходом мають у декількох положеннях метіонінові залишки.
Окиснення метіонінових залишків є одним із найпоширеніших шляхів руйнування білка. Антитіла за даним винаходом, в яких метіонінові залишки було введено у положення 564 та 571, відносно 5ЕО ІЮО Мо 20, можуть піддаватися повному окисненню без впливу на здатність антитіл бо до прискорення дисоціації комплексу ІДЕ-Ес:5ЕсВіс..
Таким чином, даним винаходом також передбачається антитіло до дЕ або антигензв'язувальний засіб, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо 1, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить СОВ-12 та ЕМУ/-І3, причому варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО ІЮО Мо 20, за винятком того, що СОВ-12 має амінокислотну послідовність яка являє собою 5БЕСО ІО Мо 50, і того, що ЕМ/-ІЗ має амінокислотну послідовність, яка являє собою 5ЕО ІО Мо 131 або 138, при цьому метіонінові залишки у положеннях 64 та/або 71, у випадку 5ЕО ІЮО Мо 20, є окисненими.
Даним винаходом також передбачається антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІО Мо 1, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, що являє собою 5БЕО ІО Мо 132 або 139, причому метіонінові залишки у положеннях 64 та/або 71, у випадку 5ЕО ІЮО Мо 132 або 139, є окисненими.
Додаткові метіонінові залишки у антитілах за даним винаходом можуть бути окиснені без впливу на здатність антитіл до прискорення дисоціації комплексу ІДЕ-ЕРс:5ЕсВіс.
Даний винахід буде додатково описаний за допомогою прикладів із посиланнями на варіанти здійснення, проілюстровані на фігурах, які супроводжують даний опис.
Приклади
Приклад 1. Структура мутанта терапевтичного антитіла до ІДЕ, омалізумабу, зв'язаного з
ІДЕ-Ес, виявляє механізм його дії
Резюме
Імуноглобулін Е та його взаємодії з рецепторами ЕсеєВіІ та СО23 відіграють центральну роль у алергічному захворюванні. Омалізумаб, схвалене для клінічного застосування терапевтичне антитіло, інгібує взаємодію між ІДЕ та ЕсеВіІ, запобігаючи активації гладких клітин і базофілів, та блокує зв'язування ЧЕ з СО23. Автори даного винаходу розшифрували кристалічну структуру комплексу між одержаним з омалізумабу Раб та ІДЕ-Ес у співвідношенні 2:1, в якому один Баб зв'язаний із кожним СєЗ-доменом (проте лише один із Рар зв'язаний із Свє2-доменом).
Незважаючи на те що незв'язаний ІДЕ-Ес переважно є зігнутим під гострим кутом у розчині, у комплексі він є лише частково зігнутим, що перешкоджає взаємодії з ЕсеєВіІ; зв'язування СО23
Зо інгібується стерично внаслідок перекриття сайтів зв'язування на кожному СєЗ-домені. Аналізи взаємодії в розчині демонструють ортостеричну та алостеричну основу для інгібування взаємодій з обома рецепторами та, разом зі структурою, показують, як омалізумаб (та, особливо, описані мутанти омалізумабу) можуть прискорювати дисоціацію зв'язаного з рецептором ІДЕ від ЕсеєНІ, використовуючи характерні динамічні властивості та алостеричний потенціал ІЧЕ.
Вступ
Антитіла імуноглобуліну Е (І9Е) відіграють важливу роль у алергічних захворюваннях, зв'язуючись з алергенами через свої Рар-плечі та проявляючи свої ефекторні функції при зв'язуванні з рецепторами для Ес-ділянки!. Два основні рецептори ІДЕ являють собою ЕсеВі та
СО23З/ЕсеВІЇ, які звичайно називають високо- та низькоафінними рецепторами, відповідно. На гладких клітинах та базофілах ІДЕ зв'язується з ЕсеєВІ так міцно (Ког1079М7), що такі клітини сенсибілізуються попередньо зв'язаним ІДЕ, потребуючи лише присутності алергену для перехресного зв'язування комплексів ІДЕ/ЕсєВІ та для того, щоб викликати негайну реакцію.
СОр23 являє собою гомотример, і, отже, природно низьку афінність кожного ІДЕ-зв'язувального "головного" домену, подібного до лектину типу С, (Кох10-7М7) можна посилити за рахунок ефекту авідності при зв'язуванні з агрегованим ІДЕ у імунних комплексах, що є приблизно відповідними комплексам із ЕсєВІ для ІДЕ2. СО23, що експресується на В-клітинах, задіяний у регуляції ІДЕ, та експресія на епітеліальних клітинах дихальних шляхів та кишкових епітеліальних клітинах опосередковує трансцитоз комплексів Ід4Е/алерген!2. Обидва з ЕсеВІ та
СО23 також експресуються на ряді антигенпрезентуючих клітин. Отже, взаємодії ІДЕ-рецептор задіяні у багатьох аспектах алергічної реакції, та (ЧЕ є давньою мішенню для терапевтичного втручання.
Ес-ділянка ІДЕ містить з'єднаний дисульфідним зв'язком димер трьох доменів: Сє2, СеєЗ та
Сеє4. Попередні дослідження химерного ІДЕ методом ЕНКЕТ"» та дослідження розсіювання рентгенівських променів у розчині ІДЕ-Рсб вказували на компактну зігнуту структуру, а аналіз кристалічної структури ІЗ4Е-Рс згодом виявив зігнуту під гострим кутом і асиметричну конформацію, у якій пара (Сє2)г доменів є загнутою назад на Сє3- та Сеє4-домени". Було виявлено, що вигин, визначений як кут між локальною віссю подвійного перегину пари (Св2)г- доменів та віссю Есеє3-4 (ділянка, що містить тільки СєЗ- та Се4-домени), став ще більш гострим
(з 627 до 54") у кристалічній структурі ІДЕ-Ес, зв'язаного з 5Ес5НіІа, розчинними позаклітинними доменами с-ланцюга, який зв'язується з ЧЕ, у рецептора8. Нещодавні дослідження методом
ЕВЕТ з використанням міченого на М- та С-кінці ІДЕ-Ес підтвердили цей посилений вигин при зв'язуванні 5ЕсеВІог.
Сайт зв'язування ЕсєВІ поширюється на обидва СеєЗ-домени у близькій до Се2 ділянців"о, хоча Сє2-домен безпосередньо не задіяний у зв'язуванні; взаємодія 3 двома ланцюгами пояснює стехіометричне співвідношення 1:1 при зв'язуванні. На відміну від цього, дві молекули
СО23 зв'язуються з ІДЕ-Ес, одна в кожному ланцюзі, та на іншому, близькому до Св4 кінці СеєЗ- домену! "12и3, Зв'язування з СО23 також викликає зміну конформації у ІДЕ-Ес"", але не таку, яка істотно впливає на вигин. Тим не менш, відносно "закрите" розташування СеєЗ-доменів у комплексі з розчинним головним доменом СО23 (50023) у порівнянні з незв'язаним ІЗ4Е-Ес є несумісним з більш "відкритим" розташуванням цих доменів, яке потрібне для зв'язування з
ЕсеєВІ. Це частково пояснює взаємне виключення зв'язування з Ре5ВІ і СО231172, хоча інші фактори, такі як локальні зміни конформації та модифікації динаміки конформаційних перетворень", також, імовірно, роблять внесок у алостеричну комунікацію між двома сайтами зв'язування рецептора"-.
Ще більший ступінь гнучкості у ІЗЧЕ-Ес було нещодавно відкрито при дослідженнях комплексу з використанням Раб до І4Е-Ес, названого єРар'б. Дві молекули «Раб зв'язуються з ІДБЕ-Ес симетрично, по одному на кожному СєЗ-домені, фіксуючи повністю розпрямлену конформацію, в якій локальні осі подвійного перегину (Се2)2-доменів та ЕсеЗ3-4-ділянки практично співпадали.
Аналіз утворення комплексу в розчині разом із моделюваннями молекулярної динаміки для незв'язаного ІДЕ-Рс говорять про те, що пара (Сє2)2-доменів може "перевертатися" з одного боку ділянки Есеє3-4 на інший'бє. Конформація ІДЕ-Ес, стабілізована цим антитілом до ІДЕ, є несумісною зі зв'язуванням із ЕсеВІ, що пояснює його інгібіторну активність.
Омалізумаб являє собою моноклональне ІдСті антитіло до ІДЕ, яке схвалене для терапевтичного застосування (Хоїаї", Момапів)!". Він зв'язується з незв'язаним ІДЕ та інгібує зв'язування як з ЕсеєВІ, так і з СО23; сайт зв'язування був нанесений на карту СєЗ-домену за допомогою використання інгібування пептидами та молекулярного моделювання "99, але механізм його дії є невідомим. Тим не менш, зв'язування міченого для ЕНЕТ ІдЕ-Ес вказувало
Зо на незначний ступінь розгинання", а, отже, на потенціал для алостеричного, а не прямого інгібування.
Нещодавно було відкрито тип інгібітора, який активно руйнував попередньо утворені комплекси ІДЕ/ЕсєВІ: було виявлено, що сконструйований білок з анкіриновим повтором (Оєзідпед АпКугіп Нереаї Ргоївіп) (САРВРІП) зв'язується з СеєЗ-доменом зв'язаного з рецептором
ІДЕ та прискорює його дисоціацію від ЕсєВІ2о. Дослідження кристалічної структури комплексу
САВРіп Е2 79 з молекулою Есеє3-4 у співвідношенні 2:11, обмеженого сконструйованим дисульфідним зв'язком, виявило природу та місце розташування сайту зв'язування, але лишило неясним механізм його дії. Згодом повідомлялося про те, що омалізумаб може подібним чином сприяти дисоціації ІДЕ, зв'язаного з ЕсеєВіІ, хоча й лише у дуже високих концентраціях, які були, по суті, більшими, ніж концентрації, що досягаються при терапевтичному застосуванні?" 22,
Автори даного винаходу у даному документі описують кристалічну структуру комплексу між
ІДЕ-Ес та новим фрагментом антитіла, Раф, одержаним з омалізумабу (РарЗ омалізумабу), який містить три точкові мутації, віддалені від ділянок, що визначають комплементарність (СОР), які зв'язуються з антигеном (І4Е-Ес). Мутації являють собою 5818, О83Е та І158Р у випадку 5ЕО
ІО Мо 125 (або 5778, 0798 та І1154Р у випадку 5ЕО ІЮО Мо 129). Структура комплексу показує механізм дії омалізумабу, та дослідження у розчині демонструють, що цей механізм використовує характерні динамічні властивості ІДЕ.
Результати
Незважаючи на численні спроби, дослідження кристалізації для ІДЕ-ЕРс у комплексі з Рар омалізумабу, приводило у результаті до селективної кристалізації тільки Рар-фрагмента. У інших джерелах повідомлялося про подібні невдачі кристалізації цього комплексу. Внаслідок цього авторами даного винаходу було сконструйовано нове антитіло. Бар, одержаний з омалізумабу, з трьома точковими мутаціями: двома у каркасній ділянці МІ -Домену (Зег81 Ага,
Ссуіп8ЗАгт) та однією у Ск-домені (І еці58Рго) (5єд. ІЮ Мо 125, нумерація РОВ) (фіг. 1), з метою порушення сприятливих контактів у кристалі, що спостерігаються у кристалічній структурі ар омалізумабу (результати будуть повідомлені в іншому місці). Автори даного винаходу назвали цей одержаний з омалізумабу Рар "РГарз омалізумабу".
Загальна структура комплексу ІДЕ-Ес/Рарз омалізумабу
Автори даного винаходу визначили кристалічну структуру комплексу між ІДЕ-Бс та Рарз омалізумабу з роздільною здатністю 3,7 А (фіг. 2А). Дві молекули Рар3 омалізумабу (Рар' та
Еаб-) зв'язуються з асиметричною, частково зігнутою молекулою ІДЕ-Ес, причому кожний Рар взаємодіє з одним СеєЗ-доменом (фіг. 28 і С). Гар' взаємодіє з СеЗ-доменом ланцюга В ІдЕ-Ес, тоді як Рар? взаємодіє з СєЗ-доменом ланцюга А ІДЕ-Рс. Внаслідок частково зігнутої конформації ІДЕ-Ес у комплексі легкий ланцюг ЕРар- також утворює незначну взаємодію з Сє2- доменом з ланцюга В ІдЕ-Ес (див. нижче у цьому прикладі для подробиць цієї взаємодії).
Поверхня взаємодії між ІДЕ-Ес і ГарЗ омалізумабу
Кожна молекула Рар3З3 омалізумабу взаємодіє з одним краєм зовнішньої поверхні СеєЗ- домену (С-, С-, Е- та Сб-ланцюги та основа ЕС петлі, що зв'язується з рецептором Есз5Ві).
Задіяними є і важкий, і легсий ланцюги Габ3 омалізумабу, причому перший забезпечує -60 95 площі поверхні взаємодії, що складає --715 А? (фіг. 2 і 3).
Контакти важкого ланцюга Рар3 омалізумабу (ЗЕО ІЮО Мо 5), які незначно відрізняються у двох поверхонь взаємодії, можуть бути коротко описані наступним чином: СіуЗ2 та Туг3З3 (СОВНІ) утворюють ван-дер-ваальсові взаємодії з АТа377 та бег378 (Сє3) (послідовність ІДЕ-
Ес, яка показана у 5еа. ІО Мо 108 та на фіг. 16), у той час як Туг54 (СОВН2) контактує з СпПуЗ79 -
Рго381 (Сє3). Залишки у СОВНЗ забезпечують найбільшу поверхню контакту та піддаються значній зміні конформації при утворенні комплексу порівняно зі структурами незв'язаних Рар (неопубліковані результати, 79253. Усі з залишків СОВНЗ 5ег100, Ніб101, Туп102 та Тгтр106 утворюють ван-дер-ваальсові взаємодії з залишками СеєЗ-домену, які включають у себе бег375-
СМІуУЗ79, СІп417 та Аг9419 (Сє3). Тим не менш, примітною ознакою цієї частини поверхні взаємодії є взаємодія з Рпе103 (СОВНЗ). Рипе103 переважно є зануреним у кишеню, що утворена ТНг373, основним ланцюгом Ттр374, бег375, СІп417 та Ага419 (Сє3), та утворює катіонну взаємодію/л-стекінг взаємодію з Аг9419 (фіг. 3).
Ага419 (Сеє3) також відіграє ключову роль у взаємодії з легеим ланцюгом ЕРарЗ омалізумабу (5ЕО ІЮ Мо 125) (фіг. 3). Ага419 (Сеє3) знаходиться в межах відстані, достатньої для утворення водневих зв'язків із ТУїЗ! (СОВІ 1) та атомами кисню карбонільної групи основного ланцюга
Азр32 (СОВІ1), додатково до контакту з бічними ланцюгами Азр32, Азр34 та Туг36б (утворення водневого зв'язку з гідроксильною групою Туг36б). А5р32 також забезпечує ван-дер-ваальсові взаємодії з Тпг373 та ТНг421 (Се3). На відміну від цього, тільки два залишки СОВІ 2 роблять внесок у поверхню взаємодії: Туго3 (СОВІ2) контактує з Сіп417 (Сє3), та і Туг53, і Туг57 забезпечують ван-дер-ваальсові взаємодії з Меї430 (Сє3); Туг57 також утворює водневий зв'язок із кістяком Меї430. Що стосується взаємодії важкого ланцюга, існують незначні відмінності у контактах легкого ланцюга для Раб" і Рар-.
Контактні залишки у СОВ на РарЗ3 омалізумабу нумерація - у форматі (рар/КарбауСнпоїпіа).
Послідовність важкого ланцюга: беад. ІЮ Мо 5; послідовність легкого ланцюга: 5ед. ІЮ Мо 125
СОВНТ: 5ег (31/31/ 31), Спу (32/32/31а), Туг (33/33/32)
СОВНо: Туг (54/53/53)
СОВНЗ: 5ег (100/96/96), Нів (101/97/97), Туг (102/98/98), Рне (103/99/99), Ттр (106/1018/1018)
СОВІ 1: Авр (30/27С/30), Туг (31/270/З0А), Авр (32/28/3008), СпПу (33/29/30С), Авр (34/30/3060),
Тук (36/32/32)
СОНВІ 2: Туг (53/49/49), Зег (56/52/52), Тут (57/59/53), Зег (60/56/56)
Більшість залишків СОНІ 1 Її СОВНЗ задіяні у взаємодії, та, отже, характеризують те, як омалізумаб зв'язується та орієнтує себе відносно ІДЕ-Ес. СОВІ З не задіяний у зв'язуванні з ІЧЕ-
Ес.
Порівняння поверхні взаємодії Гаро5 омалізумабу з іншими комплексами з антитілами до ІДЕ
Сайти зв'язування на СеєЗ-домені для ГарЗ3 омалізумабу та нещодавно описаного ОАВРІпП
Ег 7920 перекриваються (фіг. 4) та мають подібний розмір 715 А? та 753 А 2, відповідно.
Залишки у СеєЗ -домені, які є спільними для двох поверхонь взаємодії, включають у себе бег375-
СпіуЗ79, СсіІп417, Ага419, Агда27 та Меї430, але при цьому ГабЗ3 омалізумабу утворює більш близькі контакти з ЕС»6 петлею СеєЗ-домену, що зв'язується з рецептором, поверхня взаємодії з рАВРІпП Е279 простягається у зворотному напрямі з включенням лінкера для СеєЗ3-4-доменів.
Сайти зв'язування, що перекриваються, для Рар3 омалізумабу та ЮАВРіп Е279 явно відрізняються від поверхні взаємодії, нещодавно описаної для БарЗ3 омалізумабу. який захоплював ІДЕ-Рс у повністю розпрямленій конформації (фіг. 5). Площа поверхні взаємодії для РабБ3 омалізумабу є не тільки вдвічі більшою за таку площу для Рар3 омалізумабу та
ОАВРІп Е279,-1400А2, але й Бар3 омалізумабу взаємодіє з ІДЕ-Ес у сайті, центром якого є
Агд393 у Сеє3, а також контактує з залишками у Свє2-домені та лінкері Свє2-Сеє3!5. Кристалічна структура іншого Бар антитіла до ІДЕ, МЕ0ОІ4212, в комплексі з Рсє3-4 у співвідношенні 2:1 виявляє ще один сайт для взаємодії антитіла у СєЗ-домені, він включає М-з'єднаний олігосахаридний фрагмент на Азп39424,
ІДЕ-Ес набуває частково зігнутої конформації, коли він зв'язаний з ГарзЗ омалізумабу
ІДЕ-Ес переважно є зігнутим у розчині»»б2,25,26,2728. та дослідження кристалічної структури для незв'язаного ІДЕ-Ес виявило зігнуту під гострим кутом (627) асиметричну конформацію, в якій пара (Сєг2)2-доменів загнута назад на СеєЗ - та Св4-домени (фіг. 5А і В), причому Свє2 -домен одного ланцюга (ланцюг В) контактує з Се4-доменом іншого (ланцюг А) 78. ІДЕ-Ес стає зігнутим під ще більш гострим кутом (547) після взаємодії з ЕсєВіо8»е, та асоційовані зміни конформації включають оберт СеєЗ -домену ланцюга А разом із парою (Свєг2)»-доменів у вигляді жорсткого блока у бік від СеЗ-домену ланцюга ВУ.
На відміну від комплексу з РГарз3 омалізумабу, у якому ІДЕ-Ес набуває повністю розпрямленої лінійної конформаціїб, ІдДЕ-Рс набуває частково зігнутої конформації у комплексі з ЕРарз омалізумабу (фіг. 2С та фіг. 5С і 0), що узгоджується з попередніми дослідженнями методом
ЕВЕТ, які виявили, що омалізумаб викликав розгинання ІдБЕ-Ес?. Сайт, з яким зв'язується Раб", є відкритим у незв'язаному, зігнутому під гострим кутом ІДЕ-Ес, але додаткове розгинання ІДБ-Ес до кута трохи більше ніж 90" потрібне для того, щоб зробити доступним сайт, зайнятий Рар-. Це розгинання ІДЕ-Ес у комплексі з Гарз омалізумабу асоційоване з відкриттям обох СеєЗ-доменів з утворенням майже симетричної ділянки Есе3-4 (фіг. 28). Пара (Сє2)2-доменів знаходиться між
СеЗ - та Сеє4-доменами з кожного ланцюга та вже не є так тісно асоційованою з СеЗ-доменом з ланцюга А.
При нещодавньому моделюванні молекулярної динаміки, де вивчалося розгинання ІдБ-Ес у розпрямлену структуру, було виявлено, що, незважаючи на те, що зігнута під гострим кутом конформація, яка спостерігалася у кристалічній структурі незв'язаного ІДЕ-Ес, займала басейн із найнижчою енергією, спостерігали інший відмінний та чітко визначений енергетичний басейн, що відповідає частково зігнутим конформаціям ІдЕ-Ес'б. Частково зігнута конформація, якої набуває ІДЕ-бс у комплексі Гар3 омалізумабу/ЛЯЕ-Рс, займає цей конкретний енергетичний басейн (фіг. 6).
СеєЗ-домени набувають явно відкритої конформації у комплексі Гарз омалізумабуЛдєЕ-Ес
У кристалічних структурах ІЯЕ-Ес та субфрагмента Есе3-4 СєЗ-домени набувають ряд різних орієнтацій7 б1011,13и141625293, властивість, асоційовану з алостеричною регуляцією зв'язування ІДЕ з двома його головними рецепторами, ЕсеВІ та СО2381112и14, Як відстань між СеєЗ-доменами, так і їх положення відносно Сє4-доменів було використано для опису ряду конформацій, які спостерігаються для ЕсеЗ-4-ділянки?? (повний опис для цих вимірювань наведений нижче у цьому прикладі). У комплексі Гар3 омалізумабу/ЛдЕ-Рс СєЗ-домени розташовані ще далі один від одного та від Сє4-доменів, ніж у будь-якій іншій кристалічній структурі, що містить ІДЕ-Ес або
Есеє3-4, та, отже, вони набувають найбільш відкритої конформації, яка спостерігалася до цього часу (фіг. 5); ця конформація є значно більш відкритою, ніж конформація для ІДЕ-Ес, зв'язаного з ЕсеВІ (фіг. 7).
Вплив Рабз омалізумабу на зв'язування з рецепторами ЕсеВІ та СО23
Омалізумаб інгібує не тільки взаємодію між ІДЕ-Ес і ЕсеВІ, але також і взаємодію між ІдЕ-Ес і бО2330, З урахуванням останнього, порівняння комплексів ЕРаБ3 омалізумабуЛудєв-Ес та
СО23/Есе3-4" виявило зіткнення між РарЗ омалізумабу та СО23 у обох сайтах взаємодії з СО23 на ЕсеЗ3-4. Більш того, залишки СеЗ-домену Аг9376, 5ег378 та І уз380 є задіяними у зв'язуванні як з РарЗ омалізумабу, так із СО2317 91,
На відміну від зв'язування СО23 з ІДЕ ЕсеВіс; зв'язується через обидва СеєЗ-домени. Тим не менш, у комплексі Гар3З омалізумабу/ЛЯЕ-Ес СеєЗ-домени набувають конформації, яка є занадто відкритою для того, що забезпечувати можливість одночасної взаємодії з обома ланцюгами (фіг. 8). Більш того, якщо комплекси Рар3 омалізумабуЛоєЕ-Ес та 5ЕсеВіІо/ІДЕ-Ес накласти на кожний із СєЗ-доменів по черзі, у кожному випадку виникають потенційні стеричні зіткнення. При накладанні на СєЗ-домен ланцюга А Рар- Рарз омалізумабу буде стикатись із парою (Сє2)2- доменів у комплексі ЕсеєВіІ, та лінкер Се2-СєЗ з комплексу Гар3З омалізумабу буде потенційно стикатись із ЕсеєМВІс. При накладанні на СєЗ-домен ланцюга В буде існувати потенційне зіткнення між обома з Рар' Рар3 омалізумабу та Св2-Сє3 лінкера (у комплексі з Рарз омалізумабу) з ЕсеВіс., хоча сайти зв'язування для Рар' та ЕсєВіІо; фактично не перекриваються.
Тим не менш, залишки СОВІ 1 РарЗ омалізумабу розташовані безпосередньо суміжно з ЕС петлею СеєЗ-домену, що зв'язується з ЕсеВіс. Ця петля у ланцюзі В робить внесок у гідрофобну взаємодію типу "проліновий сендвіч", у якій Ргто42б6 у СеєЗ є упакованим між двома триптофановими залишками у ЕсеєМіс. Азр32 (СОВІ 1) контактує з ТНг421, СптуЗзЗ (СОВІТ)
контактує з Рго426, Агд427 та АТа428, та Азр34 (СОВІ1) контактує з Аг9427 та Ата428. Ці взаємодії змінюють розташування петлі Би СєЗ-домену та будуть додатково порушувати зв'язування ЧЕ з ЕсеВІ.
Нещодавно повідомлялося про зв'язування омалізумабу з ІДЕ, зв'язаним із ЕсєВіІо2792, хоча важко побачити, як омалізумаб може бути здатним взаємодіяти з ІДЕ, зв'язаним із ЕсеєВІ, на статичних кристалічних структурах ІДЕ-Ес у комплексі з 5ЕсеєВіІо? та Гарз омалізумабу. Таким чином, автори даного винаходу досліджували зв'язування Рар3 омалізумабу з ІДЕ-Ес та характеризували взаємодію між Гар3З омалізумабу та комплексом ІДЕ-Ес/ ЕсеєВІ. Ці результати забезпечують інформацію про механізм дії омалізумабу.
Взаємодія РарзЗ омалізумабу з ІЯЕ-Ес у розчині
Автори даного винаходу характеризували взаємодію ІдЧЕ-Ес/Рар3з омалізумабу двома способами: або шляхом прямої іммобілізації Гарз омалізумабу на поверхні та зв'язування з ІДЕ-
Ес, або шляхом зв'язування Рар3 омалізумабу з міченим Ніз захопленим ІДЕ-Ес на поверхні сенсора для 5РА. Мічену Ніз на С-кінці конструкцію ІДЕ-ЕРс захоплювали з використанням антитіла до Нів-мітки (ЗЕ Неапйсагє) та порівнювали характеристики зв'язування Еарз омалізумабу, інтактного омалізумабу та Бар омалізумабу. Не дивно, що у експериментах з конкуренції за зв'язування усі три молекули конкурували за одні й ті ж сайти зв'язування та проявляли, в цілому, подібні афінності зв'язування (дані не показано). Конструкція Рарз омалізумабу демонструє трохи вищу афінність у порівнянні з Габ3 омалізумабу та інтактним омалізумабом (фіг. 8А-С). У відповідності з кристалічною структурою дві молекули ЕРарз омалізумабу зв'язуються з ІДЕ-Ес: зв'язування явно є двофазним, причому високоафінна (-1
НМ) взаємодія спостерігається при низьких концентраціях ліганду, та другий сайт зв'язування (слабшого) (30 нМ) спостерігається при вищих концентраціях (фіг. 9А).
Експеримент з сендвіч-аналізу методом 5РА дозволяв окремо охарактеризувати два сайти зв'язування ІДЕ-Ес/Баб3 омалізумабу. При використанні цього підходу ЕБабБ3 омалізумабу ковалентно іммобілізували на поверхні сенсора та забезпечували потік ІДЕ-Ес над цією поверхнею. При низьких концентраціях у таких умовах високоафінний сайт має переважний вплив на взаємодію, та криві зв'язування можуть описуватись кінетикою однофазної взаємодії (Ко - 1 НМ, Копо з 1,2х106 МИ с, Кон я 8х109 с7). Цей комплекс ІДЧЕ-Ес/Рар3 омалізумабу у співвідношенні 1:1, захоплений на поверхні біосенсора для 5РВ, можна потім використовувати для вимірювання зв'язування другої молекули РарЗ омалізумабу, зв'язування якої є значно слабшим (Ко -- 30 нМ, Коп, 7 2х105 М" с", Конг» бх103 с"), ніж першої (фіг. 98).
Конкуренція між сайтами зв'язування РарЗ омалізумабу та ЕсеєВіс та утворення комплексу
Еарз омалізумабуЛаєЕ-Ес/ ЕсеВіс;
Далі автори даного винаходу досліджували здатність БГар3 омалізумабу до впливу на взаємодію між ІдБ-Ес і ЕсеєВіс. У експериментах з конкурентного зв'язування у розчині підвищені концентрації Гар3З омалізумабу інгібували зв'язування ІДЕ-Ес з ЕсеєВісо (фіг. 80). З точки зору механізму РарЗ омалізумабу впливає як на кількість доступних сайтів зв'язування (Втах), так і на умовну Ко для взаємодії ІДЕ-Бс/ ЕсєНіс; це є характерним для змішаного механізму інгібуванняз3, Зменшення значень Втах вказує на процес алостеричного інгібування, та зменшення умовної афінності взаємодії найчастіше є асоційованим з прямою конкуренцією за спільний сайт зв'язування (тобто, ортостеричне інгібування), але його також можна спостерігати у випадку деяких алостеричних інгібіторів. Розглядаючи сайти зв'язування, які спостерігають у кристалічній структурі, цілюом імовірно, що РарЗ омалізумабу інгібує зв'язування ІдЕ-Ес із ЕсеВІ за допомогою як ортостеричних, так і алостеричних механізмів.
Конкуренція між омалізумабом та сайтами зв'язування ЕсеВіа була описана у багатьох публікаціях, але її завжди інтерпретували як пряму конкуренцію за ідентичний сайт зв'язування (або сайт зв'язування, що перекривається). Цю інтерпретацію часто використовували для пояснення того, чому омалізумаб не може зв'язуватись із комплексами ІДЕ-ЕсСеВІ на клітинах.
Тим не менш, автори даного винаходу спостерігали, що ГарЗ3 омалізумабу може зв'язуватись із високою афінністю з ІДЕ-ЕРс, який був попередньо зв'язаний із ЕсєНіо (фіг. 9С, вкладка).
Існування комплексу омалізумаб/Ід4Е-Ес/ЕсеВІ передбачалось іншими дослідженнями?" з2, але цей комплекс раніше не був охарактеризований у експериментальних умовах. Дані вказують на те, що, незважаючи на те що зв'язування ІДБ-Ес із ЕсеєВіІсо; не змінювало значно афінність Гарз омалізумабу до ІДЕ-Ес, воно явно змінювало кількість доступних сайтів зв'язування для Рарз омалізумабу у популяції молекул ІДЕ-Ес, зв'язаних із ЕсєМіІс. Автори даного винаходу порівнювали значення Ко та Втах зв'язування для молекули ІДЕ-Ес, захопленої через антитіло до Ніб-мітки, з молекулою, захопленою за допомогою 5ЕсєВіс, та виявили, що ІДБ-Ес, зв'язаний із ЕсеєВіІс, мав менш ніж 10 95 сайтів зв'язування РарЗ омалізумабу порівняно з захопленим через Ніб-мітку ІДЕ-Ес. який, як очікувалось, показував рівні зв'язування, які відповідають стехіометричному співвідношенню 2:1 (фіг. 9С). Це не так, оскільки, в цілому, передбачалося, що омалізумаб не зв'язується зі зв'язаним із гладкими клітинами ІДЕ, тому що сайти зв'язування
ЕсеєВіІс та омалізумабу перекриваються. Замість того ЕсеєВіІсо діє на ІДЕ-Ес алостерично, змінюючи динамічну рівновагу між різними конформаціями ІдЕ-Ес"є, що приводить у результаті до значно зменшеної кількості сайтів зв'язування омалізумабу у популяції молекул ІДдБ-Ес, зв'язаних із Есе Ніс.
Механізм опосередкованої Рар3 омалізумабу прискореної дисоціації комплексу ІдЕ-
Ес/ЕсеВіо;
Кіт єї а? повідомляли про те, що САВРІп Е2 79 може прискорювати розпад попередньо утворених комплексів ІДЕ-ЕсєВІ. Продовжуючи це спостереження, Еддєї еї аїЇ. 2"! пізніше показали, що омалізумаб також може стимулювати дисоціацію ІДЕ від ЕсєВІ. Подібно до цих спостережень, автори даного винаходу виявили, що у випадку, коли ЕРар3 омалізумабу зв'язується з комплексом ІДБ-Ес/ЕсеєВіс, він може прискорювати дисоціацію ІДЕ-Ес від ЕсєНіо; (фіг. 90), та що Рар3 омалізумабу робив це більш ефективно, ніж Габ3 омалізумабу, та ще більш ефективно, ніж інтактний омалізумаб (фіг. 10Е). Один Раб взаємодіє з комплексом ІДЕ-Ес/
ЕсеєНіІо, але не прискорює дисоціацію ІДЕ-Рс від ЕсєНіо. Неочікувано виявляється, що прискорена дисоціація стається тільки після зайняття другого сайту зв'язування (тобто низькоафінного сайту). Тетрамолекулярний комплекс (Рар3 омалізумабу)2/Л9Е-Ес/ ЕсеєВіІос має змінювати енергетичну картину для ІДЕ-Ес таким чином, щоб помітно зменшити енергетичний бар'єр для дисоціації ІДЕ-Ес/ ЕсєВіІс, що приводить у результаті до швидкої дисоціації цього комплексу, який в інших умовах є дуже стабільним.
Подробиці взаємодії між: легким ланцюгом РарЗ омалізумабу та Се2-доменом
У комплексі РГарЗ3 омалізумабуЛдЕ-Рс один Сє2-домен утворює незначну взаємодію на поверхні площею приблизно 260 А? (порівняно з середньою площею поверхні взаємодії 715А2 між РарЗ омалізумабу та СеєЗ-доменом) із двома з мутованих залишків (5ег81 Ага та Сіп8ЗАго).
Немає контакту між Рго 158 та ІДЕ-Ес.
Бічний ланцюг Аг9д8в1 з легкого ланцюга Бар? (один із мутованих залишків у ЕабзЗ омалізумабу; (Зеа. ІЮ Мо 125, нумерація РОВ)) займає простір навпроти МаІ277 та А5зр278 з Св2- домену з ланцюга В (ЗЕО ІЮ Мо 108). Зег80 (Баб3 омалізумабу) займає простір навпроти
А5рг278, І ец279 та ТНг281 (Сє2-домен), у той час як бег64 (РарЗ омалізумабу) займає простір навпроти Азр276 та Азр278. 5ег64 та 5ег80 є ідентичними у омалізумабі та Рарз омалізумабу.
У комплексі ГабЗ омалізумабу/ЛдеЕ-Ес Аг9д83 (один з мутованих залишків у ГарЗ3 омалізумабу) не контактує явно з Сеє2-доменом внаслідок порушення у боковому ланцюзі Азр278 (Свє2-домен).
Тим не менш, якщо боковий ланцюг Авр278 був розміщений у певному порядку, водневий зв'язок або між Ага83 та Азр278 потенційно може утворюватися сольовий місток.
Кристалографічно визначені контакти у комплексі ГарЗ омалізумабуЛаЕ-Ес
Контакти між антитілом та антигеном в межах відстані 4 А у кристалічній структурі, як правило, вказують на поверхню взаємодії епітоп/паратоп.
Залишки ІЗЕ-Рс у межах 4 А від СОМ важкого та легкого ланцюгів Габ3 омалізумабу визначають наступний епітоп:
Т 373, М 374, 5375, В 376, А 377, 3 5 78, Сх 379, Р 381, О 417, С 418, В 419, Р 426, В 427, А 428 (на ланцюзі А).
Більш того, залишки ІдДН-Ес у межах 4 А від залишків 1 НІ та ЕВЗ леї кою ланцюга Рар » омалізумабу продовжують епітоп до:
О 278, Т 281 (на ланцюзі В у Се2-домені) |з контактами з В18, 564, 580 та В81 у антитілі та додатковим Н83, як виявлено при моделюванні молекулярної динаміки, описаному у прикладі
Бі.
Контакти між антитілом та антигеном у межах відстані 5 А у кристалічній структурі також дають інформацію при визначенні поверхні взаємодії антитіло/антиген.
Додаткові залишки ІДЕ-Ес у межах 5 А від СОМ важкого та легкого ланцюгів Рарз омалізумабу являють собою: КЗ80, М430 (на ланцюзі А).
Більш того, додаткові залишки ІДЕ-Ес у межах 5 А від залишків ЕНІ1 та ЕНЗ легкого ланцюга
ЕарзЗ омалізумабу являють собою: 0276, М277, 1279, 5280, А282 (на ланцюзі В у Св2-домені) |з додатковими контактами з (116 у ЕВ1 та Нб5 у ЕВЗ)І.
Аналіз орієнтації СеЗ-домену у комплексі ГарЗ омачізумабу/Л9БЕ-Ес
В одному способі для аналізів положення СеєЗ-доменів відносно Сє4-доменів міжатомна відстань між Со-атомом Авбп394 із СєЗ-домену з одного ланцюга та Со-атомом І уз497 із Сє4- домену з іншого ланцюга була використана для опису "відкритості" СєЗ-доменів??. Міжатомну відстань між Со; Ма1336 використовували для опису "відхилення" або того, як близько СєЗ3- домени знаходяться один від одногог2У.
У випадку ІДЕ-Ес, зв'язаного з ЕсеєВіІ, та ЕсеЗ3-4, зв'язаного з ЕсєВІ, у яких СеЗ-домени набувають відкритої конформації, значення для "відкритості" знаходяться у діапазоні 23,5-28,4
А, в той час як значення для "відхилення" становлять, у середньому, 23,3 Авио, Відповідні значення для комплексу Рар3 омалізумабулЛуЕ-ЕРс становлять, у середньому, 29,5 для "відкритості" та 29,4 А для "відхилення". У комплексі з Гарз омалізумабу СеєЗ-домени набувають найбільш відкритої конформації (є найбільш віддаленими один від одного), описаної у даний час.
Обговорення
Автори даного винаходу описували з роздільною здатністю 3,7 А структуру комплексу між
ІЧЕ-Ес та Рар-фрагментом, одержаним із терапевтичного антитіла до ІДЕ, омалізумабу; цей Рар- фрагмент, який містить три точкові мутації у каркасних ділянках, віддалених від сайту зв'язування антигена, назвали ГабрЗ3 омалізумабу. Аналіз структури виявив дві молекули Бабз омалізумабу у комплексі з ІДЕ-Ес, одна зв'язана з кожним із двох СеєЗ-доменів (але лише один із
Еар зв'язаний із Сє2-доменом), та він дає пояснення здатності омалізумабу до інгібування зв'язування ІДЕ як з ЕсеєВіІ, так і з СО23. Також було виявлено, що ІДЕ-Рс набуває частково зігнутої конформації у комплексі з БРаБ3 омалізумабу, що узгоджується з попереднім дослідженням авторів даного винаходу з використанням ІДдЕ-Ес, міченого для ЕНЕТ, яке вказує на незначне розгинання в порівнянні з незв'язаним ІДЕ-Ес".
ІЗЕ-ЕРс переважно є зігнутим у розчині» 692526?" та у кристалічній структурі незв'язаного
ІДЕ-Ес пара (Сег2)2-доменів загнута назад відносно СеєЗ- та Се4-доменів"8. Нещодавно розуміння конформаційної гнучкості ІДЕ-Ес значно поліпшилося, коли автори даного винаходу розшифрували структуру повністю розпрямленої конформації, захопленої у комплексі з Раб до
ІДЕ-Ес (аєРаб)"5. Моделювання молекулярної динаміки, в якому вивчалося розгинання ІдбБ-Ес із зігнутої під гострим кутом у розпрямлену конформацію, виявило енергетичний басейн, що відповідає частково зігнутим конформаціям (фіг. 6). Описаний у даному документі комплекс
Еар3 омалізумабу/ЛаЕ-Рс, у якому кут вигину між парою (Свг2)»-доменів і Есє3-4-доменами становить «907, відповідає відмінному енергетичному басейну у цьому моделюванні 5. Інтерес
Зо викликає той факт, що розташування сайту зв'язування Гар3 омалізумабу не буде заважати подальшому розгинанню у повністю розпрямлену конформацію, та, отже, можливо, що ІДЕ-Ес може піддаватись значним змінам конформації навіть коли він знаходиться у комплексі з омалізумабом.
Додатково до вигину пари (Сє2)2-доменів відносно СеЗ- та Свє4-доменів дослідження структур різноманітних комплексів ІДЕ-Ес, Рсє3-4 та рецептора продемонстрували, що СвеЗ- домени можуть набувати ряд відносних орієнтацій - від закритої до відкритої"9.1011,и15,145162529,
Відкриття та закриття СєЗ-доменів робить внесок у алостеричну регуляцію зв'язування з рецептором у ІдДЕ-Ес!!712: в комплексі з СО23 вони є відносно наближеними!" "914, в той час як у комплексі з ЕсеВІ вони є більш відкритими?""9. Порівняння структур комплексів СО23/Есеє3-4 та
Еар3 омалізумабуЛЯЕ-Ес показує, що сайти СО23 та омалізумабу перекриваються, та експерименти з конкурентного зв'язування вказують на те, що інгібування зв'язування ІДЕ з
СО23 омалізумабом є явно ортостеричним.
Тим не менш, інгібування зв'язування з ЕсеєВІ є більш складним. У комплексі з Еарз омалізумабу СеєЗ-домени набувають більш відкритої конформації, ніж та, яку спостерігали у будь-якій попередній структурі, до такої міри, що два субсайти взаємодії між ІДЕ-Ес та ЕсеВІ, причому один включає кожний СеєЗ-домен, не можуть взаємодіяти одночасно. Інший внесок у це інгібування може бути результатом близького розташування молекули РарзЗ омалізумабу (Рабр') до петлі С, що зв'язується з рецептором, у СеєЗ3, яка може безпосередньо впливати на конформацію контактних залишків для ЕсеєВіс. Нарешті, навіть якщо епітопи, які зв'язуються з
ЕарЗ омалізумабу та ЕсеВіс, на ІДЕ-Ес не перекриваються точно, існує можливість стеричних зіткнень, якщо зв'язування з ними двома стається одночасно. Отже, кристалічна структура говорить про те, що механізм інгібування в омалізумабу за своїм принципом є алостеричним, але з потенційною ортостеричною складовою.
Дослідження методом 5РЕ дають можливість оцінити кінетичні характеристики та афінності для двох сайтів зв'язування ГарЗ омалізумабу. Дві афінності помітно відрізняються, причому значення Ко становлять «1 нМ та «30 нМ, перше з них є асоційованим з більшою константою швидкості асоціації (Коп х2х106 МИ с" порівняно з я2х105 М" с") та трохи меншою константою швидкості дисоціації (Кох 72х103 с" порівняно з «бх103 с"). Можна припустити, що взаємодія з вищою афінністю відповідає зв'язуванню Рар', який буде мати безперешкодний доступ до зігнутої молекули ІДЕ-Ес, у той час як нижча афінність та менша швидкість асоціації відповідає
Еабр-, але автори даного винаходу не можуть остаточно стверджувати це.
Додаткові 5РА експерименти для вивчення механізму інгібування ЕРаб3 омалізумабу зв'язування ІДЕ-Ес з ЕсеВіс; виявили зниження кількості доступних сайтів для Гарз3 омалізумабу на ІДЕ-Ес (зменшена Вртах), коли він знаходився у комплексі з ЕсеВіс.. Інгібування омалізумабом зв'язування ІДЕ з ЕГсєВІ нещодавно було інтерпретовано з точки зору прямої конкуренції за сайти, що перекриваються, але були повідомлення, які вказують на те, що омалізумаб може зв'язуватись зі зв'язаним із рецептором ІДЕ2!32, У даному документі автори даного винаходу прямо продемонстрували здатність Гар3З омалізумабу до зв'язування з ІДЕ-Ес, коли він вже є зв'язаним із ЕсєНіо, з утворенням тримолекулярного комплексу. Вплив попереднього зв'язування ІДЕ-Ес з ЕсеВіс; полягає в зниженні кількості сайтів зв'язування Рабз омалізумабу на
ІЗЕ-Ес до менш ніж 10 95 від кількості, доступної у незв'язаного ІЯЕ-Ес; цей ефект може бути обумовлений тільки алостеричною модуляцією.
Природа взаємодії Гарз омалізумабу з комплексом ІДЕ-Ес/ЕсеВІ забезпечує інформацію про механізм прискореної дисоціації. Про це явище вперше повідомлялося для ВАРРІП, а потім для омалізумабуго2!, причому останній був присутній у значно більших концентраціях, ніж концентрації, які використовуються з терапевтичною метою??7, а тепер це явище описане у даному документі для Еар-фрагментів омалізумабу. Автори даного винаходу додатково демонструють, що дисоціація стається тільки після зв'язування спершу другої молекули Барз омалізумабу (з нижчою афінністю). Інакше кажучи, тетрамолекулярний комплекс (Рарз омалізумабу)2/дЕ-Ес/ЕсєВІс має утворитися для того, щоб сталася значно прискорена дисоціація.
Виходячи зі спостережень із використанням РабЗ омалізумабу, ІДЕ-Ес та 5ЕсеВіс, автори даного винаходу передбачають існування для омалізумабу, ІДЕ та ЕсеВІ наступного механізму:
ІЗЕ зв'язується з ЕсеВІ, та в цих умовах невелика популяція цих зв'язаних молекул ІДЕ набуває конформації, з якою можуть з'єднатись молекули омалізумабу; коли друга молекула омалізумабу зв'язується з утворенням тетрамерного комплексу, енергетична картина для ІДЕ змінюється таким чином, що взаємодія з ЕсеВІ дестабілізується та стається швидка дисоціація
ІДЕ від ЕсєВІ. Ключем до розуміння цього механізму є уявлення про складність енергетичної
Зо картини для ЧЕ та різні конформаційні стани, які перебувають у динамічній рівновазі.
Інгібіторні активності омалізумабу обумовлені використанням характерної гнучкості ІДЕ та, щонайменше у випадку процесу прискореної дисоціації, динамічних властивостей комплексу
ІДЕ/ЕсєВІ. ІДЕ має ряд незвичних структурних характеристик порівняно з іншими ізотипами антитіл, у тому числі наявність Сє2-доменів та СеєЗ-доменів, що мають унікальні властивості конформаційної динаміки характеристики, подібні до "розплавленої глобули»3ї. Разом ці властивості створюють шлях алостеричної комунікації, яка перешкоджає одночасній взаємодії з
СО23 і Ес5ВіІ; це є необхідним для уникнення незалежної від алергену активації гладких клітин при перехресному зв'язуванні ДЕ, зв'язаного з ЕсеєВІ, тримерною молекулою СО2372. Інші функціональні переваги, пов'язані з динамічними характеристиками ІДЕ, передбачалися для мембранозв'язаного В-клітинного рецептора ІДЕ". Дані про те, що омалізумаб не використовує очікуваний ортостеричний механізм для інгібування взаємодії ІДЧЕ/ЕсСеВІ, вказують на те, що він також використовує незвичайні динамічні властивості ДЕ як у своїй функції блокуючого антитіла, так і в своїй здатності не допускати перехресне зв'язування ІдЕ, зв'язаного з гладкими клітинами. Нарешті, омалізумаб може активно дисоціювати ІЧЕ від ЕсеВІ, хоча і в концентраціях, вищих ніж ті, що застосовуються з терапевтичною метою", за рахунок використання алостеричних властивостей і характерної гнучкості ІДЕ, навіть коли він знаходиться у комплексі зі своїми рецепторами.
Методи
Клонування, експресія та очищення білка. Бар людського да омалізумабу та ЕРарз омалізумабу клонували, експресували та очищували, як описано у 75. ІДЕ-Рс продукували, як описано раніше 95. ІЇДЕ-Ес відповідав 5ЕО ІЮ Мо 108 (М224-К547 згідно з Боітіпдіоп 4 Веппісн (1978) Іттипої. Вем. 41:3-25, але при цьому наступні мутації було введено у ІДЕ-Рс для спрощення профілю глікозилування: М2650 і М3710). Омалізумаб був придбаний у Момапів
Еиторпапт Іітйед. Комплекс Рар3 омалізумабуЗз/ЛуЕ-Рс у співвідношенні 2:1 очищували за допомогою гель-хроматографії з елююванням у 25 мМ Ттгів-НОСЇ з рН 7,5, 20 мМ Масі та 0,05 95 (мас/об.) МамМз та концентрували до досягнення концентрації 23 мг/мл.
Поверхневий плазмонний резонанс. Експерименти з 5РА виконували на інструменті Віасоге
Т200 (СЕ Неайнсаге). Специфічні поверхні готували або шляхом ковалентного зв'язування білків із використанням протоколу зв'язування через аміногрупу (СЕ НеайНсагє) зі значеннями щільності зв'язування «300 резонансних одиниць, або шляхом захоплення мічених Ніб-міткою білків із використанням поверхні сенсора з антитілами до Нів-мітки. Для захоплення мічених Нів- міткою лігандів використовували моноклональне антитіло до Нівз-мітки та його іммобілізували згідно з інструкціями виробника (набір для захоплення мічених Нібз-міткою молекул (Віасоге Нів
Саріцгте Кі), СЕ НеайНнсагє). В експериментах зі зв'язування, як правило, використовували значення часу асоціації, що становили 180-240 с, та компоненти при дисоціації відслідковували протягом щонайменше 500 с Впорскування здійснювали при швидкості потоку 25 мкл хв." у робочому буфері з 20 мМ НЕРЕБ5 з рН 7,4, 150 мМ Масі та 0.005 95 (об./06.) поверхнево- активної речовини Р-20 (СЕ НеайНсаге). Більшість вимірювань у експериментах здійснювали при 25 "С; деякі з експериментів у сендвіч-форматі виконували при 5 "С для того, щоб звести до мінімуму явище прискореної дисоціації. Використовували стандартні методи виключення даних із використанням двох стандартних значень? та підбір кінетичних кривих здійснювали з використанням програмного забезпечення Огідіп (Огідіпі аб).
ТА-ЕВЕТ. ІдБ-Ес мітили донорним флуорофором шляхом здійснення реакції 4 мг/мл білка у 100 мМ бікарбонату натрію, 50 мМ МасСі, рН 9,3, з Б5-кратним молярним надлишком ізотіоціанатного хелатного комплексу тербію (Іпийгодеп). Після З-годинного інкубування при кімнатній температурі з перемішуванням надлишок флуорофору, що не прореагував, видаляли шляхом діалізу у РВ5 (20 мМ фосфатно-буферний сольовий розчин, 150 мМ Масі, рН 7,4).
Гібридний білок (с-у) 5ЕсеєВіІа-ІдСса-Ес3" мітили акцептгорним флуорофором шляхом здійснення реакції білка у концентрації З мг/мл з 2,5-кратним молярним надлишком сукцинімідилового естеру барвника Аіеха Бійог 647 (Іпмйгодеп) протягом 1 години при кімнатній температурі.
Надлишковий флуорофор видаляли шляхом діалізу у РВ5. Аналізи інгібування методом ТВ-
ЕВЕТ здійснювали при конкуренції 1 нМ міченого тербієм ІДЕ-Ес та 0-20 нМ міченого Аіеха Рійог 647 5ЕсеєВіІо-Ід024-Рс з використанням діапазону концентрацій Рар3 омалізумабу. Аналізи проводили у 384-лункових білих планшетах з високою основою (Сиєїпег ВіоОпе) з використанням буферу Іапіпазстеєп (Іпийгтодеп) у якості розріджувача. Планшет залишали інкубувати протягом ночі при кімнатній температурі та здійснювали зчитування за допомогою планшет-ридера Апетів (Вепйпоїй ТесппоіІодієз). Співвідношення ТВ-ЕВЕТ потім розраховували для кожної лунки як випромінення акцептора при довжині хвилі 665 нм, поділене на
Зо випромінення донора при довжині хвилі 620 нм і помножене на 10000.
Кристалізація. Кристали з прямокутною морфологією і довжиною до 400 (їм вирощували при 18 7С з використанням методу дифузії пари з сидячої краплини. Розчин-резервуар містив 50 мкл 4 95 (мас/об.) РЕС: 8000 та 0,03 М фториду натрію, та краплина містила 100 нл білка та 300 нл розчину-резервуара. Незважаючи на численні спроби оптимізації, якість дифракції кристалів не може бути додатково поліпшена більше, ніж у кристалів, які використовували для цього дослідження. Кристали, як правило, починали рости через декілька діб і часто розчинялись у своїх краплинах, але їх можна стабілізувати у 4 М ТМАО (М-оксид триметиламіну), який успішно використовували в якості кріопротектора.
Збір та обробка даних. Дані збирали за каналами 102 та 103 на джерелі випромінення
Обіатопа ГіднЕ боцгсе (Гарвел, Великобританія). Інтеграцію здійснювали з використанням програми ХО598, яка реалізована у пакеті хіа2933, Кристали дифрагували анізотропно, та дані від багатьох кристалів об'єднували. Дані приводили до роздільної здатності 3,7 А з використанням програми АІМІЕ55 з пакету ССРА"О і потім відсікали до границь роздільної здатності 3,7 А (а"), 3,9 А (БУ) та 4,2 А (с) з використанням сервера для аналізу анізотропії дифракції ОСІ А рінкасіоп Апізоїгору бегме!"2. Розрахунок коефіцієнта Метьюза указував на вміст розчинника - 62 95 для одного комплексу РГарЗ омалізумабу/ЛаЕ-Ес у співвідношенні 2:1 (молекулярна маса - 170 кДа) в асиметричній одиниці.
Визначення структури, побудова та уточнення моделі. Структуру розшифровували за допомогою молекулярного заміщення з використанням програм РНАБЕН та МОЇ ВЕР" з пакета ССРА9 з використанням атомів білка з запису 2мдг у базі даних РОВУ та структури Габ омалізумабу з роздільною здатністю 1,9 А (неопубліковані результати) у якості моделей для пошуку. Уточнення спочатку здійснювали з використанням програми ВЕРМАС?, а потім з використанням програми РНЕМІХ?"5 ї використовували в якості альтернативи побудову моделі в ручному режимі у Соої". Якість моделі оцінювали з використанням програм МоіРгобрігу"»,
РОГ УСОМ та інших інструментів для підтвердження якості в складі графічного інтерфейсу
РНЕМІХ»О. Обробка даних та статистика для уточнення наведені у таблиці 1. Ділянка карти електронної щільності показана на фіг. 11. Поверхні взаємодії аналізували з використанням програми РІБЗА"', та фігури одержували з використанням програми РУМОЇ 52.
Таблиця 1
Обробка даних та статистика для уточнення 11111111 Обробкаданих.7/7/7/:////СО|Ї.7ССССССС///////С/:/ 34.11
Роздільна здатність (А): загальна бовнішня 00000 івБезлодиозию оболонка)
Середнє значення (П/о(1))
Уточненнябдо 11111111
Довжини зв'язків (А)
Похибкакоординат(А)..///ССССССС1111111111111111111006011111111111СсСсС
КартаРамачандрана.ї//://(//-К2НССССЇ./ССССС11111111111111111111111111 аЗначення у дужках наведені для оболонки з найвищою роздільною здатністю "Уточнення здійснювали з використанням даних, які відсікали до границь роздільної здатності 3,7 А (ах), 3,9 А (ру) та 4,2 А (су) «Набір Вкеее містить 5 95 відбиттів
Перелік посилань 1. соша, Н.)., ЗиШоп, В... ІДЕ іп аПегду апа азіпта юдау. Маї. Вем. Іттипої. 8,205-217 (2008). 2. ЗШШоп, В.У., Оаміе5, А.М. Біписіцгте апа аупатісв ої ІдЕ-гесеріог іпіегасіпе: Ес5ВІ апа
Сра2г3/ЕсенВІЇ. Іттипої!. Нем. 268,222-235 (2015).
З. Ноідаїє, 5.Т. Мему/ зігагедієв м/п апіі-ІДдЕ іп аїІегдіс дізеазев5. МУопа АйПегду Огдап. 9. 7,17 (2014). 4. Ноїоужа, 0., Ваїга, В. Зтистшта! зішаіез оп Ше тетрбгапе-роипа іттиподіориїйп Е (І9Е)- гесеріогї сотріех. 2. Марріпуд ої адібїапсе5 Бреїмжшеєп 5йеб5 оп ІДЕ апа Ше тетбгапе 5иЇпПасе.
Віоспетівігу 22,3475-3484 (1983). 5. 7пепо, У., ЗПпорев, В., НоіомКка, О., Ваїга, В. Сопіоптаїйопв ої ІДЕ рошпа о її гесеріог Ес ерзіїоп НІ апа іп зоІшіоп. Віоспетівігу 30,9125-9132 (1991). 6. Веамії, А.У., Моипд, В.)., ЗиШЩоп, В.9., РеїКіпв, 5.). Вепі дотаїп в5ігисіиге ої гесотбіпапі
Ппитап ІдБ-Ес іп зоїшіоп Бу Х-гау апа пешгоп 5сайегіпу іп сопішпсіоп мій ап ашотаїєй сигуе
ТЩіпу роосеєдиге. Віоспетівігу 34,1449-1461 (1995). 7. Мап, Т. ет аІ. Тне сгувзіа! вігисіцге ої ІДЕ Ес гемеа!5 ап азуттеїйісайну Бепі сопіоптаїйоп. Маї.
Іттипої. 3,681-686 (2002). 8. Ноідот, М.О. єї а!., Сопіоптаїйопа! снапдез іп ІДЕ сопігірше о йв ипідиеїу віом/ аіввосіайоп гаїе тот гесеріог ЕссеВі. Маї. Бігисі. Мої. Віо!. 18, 571-576 (2011). 9. Нипі, У. еї а). А Пиогебсепі Біозепбзог гемеаіє сопіоптайопа! спапде5 іп Питап іттиподіобийй Е Ес: ітріїсайопе ог теспапізтв5 ої гесеріог бБіпаіпо, іппірйіоп, апа аїЇїегдеп гесодпіоп. У. Вісі. Спет. 287,17459-17470 (2012). 10. Саптап, 5.0., МУиг7биг9, В.А., ТагспеузКауа, 5.5., Кіпеї, У.Р., ЧагдеїКу, Т.5. ЗписішШте ої
Ше Ес падтенпі ої пПитап ІДЕ рошпоа 0 її підп-айіпіу гесеріог ЕсеВіІа. Мате 406,259-266 (2000). 11. ОНаїїймаї!, В. єї аї. Стувіа! вігосійге ої ІДЕ Бройпа юю їз В-сеїЇ гесеріої СО23 гемєаїЇв а теспапівт ої гесіргосаї аїІовієтіс іппірйоп м/йй підн айіпйу гесеріог ЕсеВі. Ргос. Маї). Асай. 5сі
ИБА 109, 12686-12691 (2012). 12. ВопНакитг, 5. еї аі. Марріпу ої ШТте СОг3 Бріпаїпд вйе оп іттиподіобиїп Е (ЧЕ) апа аїовіегіс сопігої ої Ше ІДЕ-ЕсенВІ іпіегасійоп. у. ВіоЇ. Спет. 287,31457-31461 (2012). 13. Мцап, 0. єї аіІ. Са" -дерепаеєпі зігисіига! спапдев іп те В-сеї! гесеріог СО23 іпсгеавзе ії аніпйу тог питап іттиподіориїїп Е. У. ВЬІ. Спет. 288,21667-21677 (2013).
14. Онаїїмаї!, В., Рапо, М.О., Миап, 0., Веагмії, А.)., 5иНоп, В.уУ. А гапде ої Сє3-Сє4 іпіегтдотаїп апдієз іп ЧЕ Ес ассоттодаїе Біпаїпа о їїз гесеріогї СО23. Ада СтузіаПодг. Е70,305-309 (2014). 15. Соорег, А., ЮОгудеп, О.Т. АПозієгу м/ййпоці сопіоптаїййопа! спапде. А ріайзіріє тоаеєї. Єик.
Віорпув. у. 11,103-109 (1984). 16. ОппКжмаїег, М. еї аі. Нитап іттиподіобиїйп Е Пехе5 Беїмеєп асшеїу Бепі апа ехієпаєй сопіоптаїййоп5. Маї. бігисі. Мої. Віої. 21, 397-404 (2014). 17. Ноідаїеє, 5., Сазаїпє, Т., Мепгеї, 5., Воиздиеї, у., Оеєпіг, У., Веізпег, С ТНе апіїі-іпаттайогу енесів ої отаїї2гитаь сопіїнт Ше сепігаї! гоЇе ої І9ЗЕ іп аІегдіс іпїаттаїйоп. .). АІПегау Сіїп. ІттипоЇ. 115,459-465 (2005). 18. 2пепоу, Г. еї а). Ріпе ерпйоре тарріпд ої Питапігейд апіі-ІДЕ топосіопа! апібоду отаїї2гитарб. Віоспет. Віорпуз. Нез. Сотт. 375,619-622 (2008). 19. МУ/пдні, 9.0. еї аї. еігисіига! апа РАузіса! Вавзів ог Апіі-ІДЕ Тнегару. Зсі. Нер. 5,11581 (2015). 20. Кіт, В. єї аїЇ. АссеїЇегаївй аізаззетріу ої ІдЕ-гесеріог сотрієхе5 Бу а дівгиріїме тасгтотоїесшіаг іппірог. Маїиге 491,613-617 (2012). 21. Едавєї, А. єї аї. Ассеїегаїей аїівзосіайоп ої ІДЕ-ЕсеНіІ сотрієхе5 Бу аївгиріїме іппірног5 асіїмеу дезепвіїі2ез аІегодіс епесіог сеїІв. У. АПегду Сіїп. Іттипої. 133,1709-1719 (2014). 22. Гоше, Р.)У., Таппепрацт, 5., Сашієг, А., Утепе, Р. Веїайоп5Нпір Ббеїм/єеп отаїїгитар рпаптасокіпеїйсв5, ЗЕ рпаптасодупатісв апа зутріотв іп раїепібв м/йп земеге регзівієпі аПегдіс (ЧЕ-тедіаїед) азіпта. Вг. 9. Сііп. Рнаптасої. 68,61-76 (2009). 23. депзеп, В.К. еїаї. зігисіиге ої Ше отаїїгитабр Раб. Ада СгувіаПодг. Е71,419-426 (2015). 24. Сопеп, Б.5. єї а). А поме! ІДЕ-пешігаїїгіпу апіїроду ог їйПе ігеаїтепі ої земеге ипсопігоїеа азіпта. тАбрз 6,755-763 (2014). 25. 7пепод, У., Зпоревз, В., Ноіом/Ка, 0., Ваїга, В. ОСупатіс сопіогтаїйоп5 сотрагеай ог ІДЕ апа
Іза іп зоїшіоп апа рошпа юю гесеріог5. Віоспетівігу 31,7446-7456 (1992). 26. Ноіомка, 0., Ваїка, В. 5іписіига! вішаїе5 оп те тетбргапе-боипа іттиподіобиїййй Е-гесеріюог сотріех. 2. Марріпо ої дібтапсе5 реїмеєп 5іїез5 оп ІДЕ апа Ше тетрбгапе- зипасе. Віоспетів гу 22, 3475-3484 (1983). 27. Ноісужа, 0., Сопгад, О.Н., Ваїга, В. Зтмисіига! тарріпд ої тетргапе-бошпа іттиподіориїїп-
Зо Е гесеріог сотріехев: ибве ої топосіопаї! апіі-ІДЕ апіїбодієв то ргоре Ше сопіоптаїййоп ої гесеріог- рошпа ІЧЕ. Віоспетівігу 24, 6260-6267 (1985). 28. Рамів, К.С, СІеппіє, М, Нагаїпо, 5.Е. 5 Випоп, О.В. А тоадвеї! ог їйе зоЇшіоп сопіоптаїйоп ої гай юеЕ. Віоспет. 5ос. Тгапв. 18, 935-936 (1990). 29. М/иг2биг9, В.А., Чагадеї5Ку, Т.5. Сопіоптаїййопа! Ріехірійу іп Іттиподіобиййй БЕ-Ес м 4
Вемеаїєд іп Мийіріе Стувіа! Еоптзв. .). Мої. Віої. 393,176-190 (2009). 30. Зпійпо, Г.С. еї а). Ап апіі-ІДЕ топосіопаї апіїроду ШТаї ріпав юю ІДЕ оп СО23 риї пої оп підн- аніппу ІДЕ. Ес гесеріог5. Іттипобіоіоду 217, 676-683 (2012). 31. Воппакитг, 5., Апагеіїема, С., МеОоппеїї, 9У.М. Вавів ої Ше іпійпвіс Пехірійу ої Ше Сєз дотаїп ої ІДЕ. Віоспетівігу 50,4608-4614 (2011). 32. Зетапо-Сапавіав, Е. єї ам. Сотрагабіеє асійопв ої отаїїгитар оп таві сеї апа Бразорнпіїв.
Сііп. Ехр. АПегоду. 46,92-102(2016). 33. ЕетеПйі, А. Іп Зтисіште апа Меснапівт іп Ргоївіп бсіепсе. МУ. Н. Егеетап, Мем мок, рр. 103-131 (1999). 34. Ріїсе, М.Е., Ргісе, М.С., КеПу, 5.М., Мебоппеї!, У.М. Тне Кеу гоїе ої ргоївїп Пехіріїйу іп тоамшіаїйіпу ІДЕ іпіегасійопв. У. Віої. Спет. 280,2324-2330 (2005). 35. Моипо, В.). єї аі. Зестейоп ої гесотбріпапі питап ІДЕ-Рс Бу таттаїйап сеї апа бБіоіодісаї асімпу ої діусозуїайоп зйе тиїапів. Ргоїєїп Епо. 8,193-199 (1995). 36. Музгука, О.С. Ітргоміпа Біозепзог апаїузіб. доштаї ої МоїІесшаг Ресодпіоп 12, 279-284 (1999). 37. ЗП, у. еї аї. Іпіегасіїп ої (Ше І ом/-Айіпйу Весеріог СО23/РсвВі! ІГесіїп Оотаїп м/йй їТШТе
Ес53-4 Ггадтепі ої Нитап Іттиподіобиїййп Е. Віоспетівгу 36,2112-2122 (1997). 38. Карзсн, МУ. ХО. Асіа СтувіаПодг. 066,125-132 (2010). 39. ММіпівг, сх. хіаг: ап ехреїпї зубвівт ог тасготоїесшціаг сгузіаІІмодгарну даїа гедисііоп../. Аррі.
Стузі. 43, 186-190 (2010). 40. М/іпп, М.О. еї аІ. Омегміежм ої Ше ССРА з5ийе апа ситепі демеюортепів. Асіа СтгувіаїІодг. 067, 235-242 (2011). 41. Емапв, Р.А., Мит5Пидом, С.М. Ном/ доод аге ту даїа апа м/паї іє Ше гезоїшіоп? Асіа
СтузіаїІодг. 069,1204-1214 (2013).
42. Зіопу, М., Замжауа, М.В., МУМапо, 5., Рийіре, М., Сазсіо, О., Еізепрегу, Ю. Томат Ше зіписіига! депотісв ої сотріехев: Стувіа! вігисіцге ої а РЕ/РРЕ ргоївїп сотрієх їот Мусобасіетгійт
Тмбрегсціовів. Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА. 103,8060-8065 (2006). 43. МеСоу, А... єї аї., Рназег сгузіаПодгарніс зоймаге. 9. Аррі. Стуві. 40, 658-674 (2007). 44. Мадіп, А., ТеріуаКом, А. Моїесшіаг геріасетепі м/йпй МОЇ ВЕР. Асіа. Стуві. ОЮ66, 22- 25 (2010). 45. Митепидом, С.М. еї а. ВЕЕМАС5 г Ше геїйпетепі ої тасготоїесшіаг сгузіа! вігисіигев.
Асіа СгузіаПодг. 067, 355-367 (2011). 46. Р. М. Апіпе еї аїЇ., Гомжамк5 ашотаїей сгувзіаПйодгарніс віисіШте гейпетепі мій рНепіх.геїїпе. Асіа СтувіаІодг. О68, 352-367 (2012). 47. Етвівєу, Р., ГонКатр, В., Зсой, М/.., Сомап, К. Реаїшгез апа ОеєемеІортепі ої Соої. Асіа
СтузіаПодг. 066, 486-501 (2010). 48. Спеп, М.В. єї а. МоІРгобігу: аІ-ают вігисіиге маїїдайоп їог тасготоїесшціаг сгузіаІІодгарну.
Аста СтузіайПодг. 066, 12-21 (2010). 49. Огпитвіема, І.., Аюпіпе, Р.М., Адатв, Р.О., Отитвієм, А. СтузіаПодгарніс тодеї! доаійу ага діапсе. Асіа СтувіаПодг. 065, 297-300 (2009). 50. Еспо!5, М. єї а). Старпісаї 10015 Тог тасготоїесціаг сгузіаІмодгарну іп РНЕМІХ. У. Аррі. Стуві. 45, 581-586 (2012). 51. Китїввіпеї, Е., НепіісК, К. Іптегепсе ої тастотоїЇесціаг аззетбіїев їот сгузіайНне в5іаїе. у.
Мої. Віо!. 312,114-797 (2007). 52. Тпе РУМОЇ. Моїіесшаг Старпісв Зувієт, Мегвіоп І.І! 5спгодіпдег, ГІ С.
Приклад 2. Вимірювання прискореної дисоціації ІДЕ-Рс з іммобілізованого 5Ес ЕсеВісо методом Віасоге
За допомогою технології Віасоге вимірюють взаємодію між біологічними молекулами без необхідності мічення. Один з учасників взаємодії, який називають лігандом, або прямо іммобілізують на поверхні біосенсора, або захоплюють на поверхні сенсора, тоді як інший, який називають речовиною, що піддається аналізу, протікає у розчині над поверхнею з захопленим лігандом. Сенсор виявляє зміну в масі на поверхні сенсора, коли речовина, що піддається аналізу, зв'язується з лігандом, і коли речовина, що піддається аналізу, дисоціює від ліганда.
Зо Вони відповідають як процесам асоціації, так і дисоціації. В аналізі прискореної дисоціації 5ЕсСеВіс; є лігандом, та він іммобілізований на поверхні сенсора. ІДЕ-Рс являє собою речовину, що піддається аналізу, та він захоплюється 5ЕсеєВіс. Дисоціацію ІДБ-Ес від 5ЕсеВіс; відстежують або з використанням буфера, що протікає над поверхнею сенсора, або з використанням розчину партнера ІДЕ по зв'язуванню, що протікає над поверхнею сенсора. Деталі методу є наступними:
Інструмент: Віасоге 3000, СЕ Неєаїїйсаге АВ, Уппсала, Швеція
Сенсорний чип: СМ5. Номер за каталогом ВА100399
Нормалізуючий розчин ВіІАпоптаївіпа 5оІшіоп: 70 95 (мас./мас.) гліцерин. Частина набору
ВІАтаїіпієпапсе Кії. Номер за каталогом ВН100651. Набір ВІАтаїіпієпапсе Кії зберігали при 4 "С.
Набір для зв'язування через аміногрупи: Номер за каталогом ВА100633. Етил-3-(3- диметиламінопропіл)карбодіїміду гідрохлорид (ЕЮС) розводили до концентрації 75 мг/мл у дистильованій воді та зберігали у вигляді 200 мкл аліквот при температурі -70 0. М- гідроксисукцинімід (МН) розводили до концентрації 11,5 мг/мл у дистильованій воді та зберігали у вигляді 200 мкл аліквот при температурі -70 "С. Етаноламіну гідрохлорид-Маон, рн 8,5, зберігали при температурі 4 "С.
Реактив для окиснення 5ЕсеВіс. Карбогідразид (бідтайіагісни, номер за каталогом СІ 1006) розводили до концентрації 5 мМ у дистильованій воді. Ціаноборогідрид натрію (бЗідталіагісн, номер за каталогом 156159) розводили до концентрації 100 мМ у ацетаті натрію (ВОН, кат. Мо
З1104-500С2М), 100 мМ, рН-4. Мета-перйодат натрію (бідталіагісн, номер за каталогом 5-1878) розводили до концентрації 50 мМ у ацетаті натрію (ВОН. кат. Мо 51104-500СМ), 100 мМ, рнН.5,5. 5ЕсеВіІс розводили до концентрації 1 мг/мл у рН 5,5, 0,1 М ацетаті натрію. Потім 4 мкл перйодату натрію (50 мМ, розведення у співвідношенні 1/50) додавали до 200 мкл розчину 5ЕсеВіІс у концентрації 1 мг/мл. Суміш залишали на льоду на 20 хв. Перед іммобілізацією розчину 5ЕсеВіІс розводили до концентрації 7 мкг/мл 10 мМ ацетатом натрію (СЕ Неайнсагеє, номер за каталогом ВА100669), рН--4,0.
Буфери: робочий буфер являє собою НВ5О-ЕР (являє собою 10 мМ НЕРЕ5Б, рН 7,4, 150 мМ
Масі, 3 мМ ЕОТА, 0,05 95 поверхнево-активної речовини Р20, відновлений із 10-кратного маточного розчину): Номер за каталогом ВА100669. Буфер для іммобілізації являє собою ацетатний буфер 4,0 (являє собою 10 мМ ацетат натрію, рН 4,0). Номер за каталогом бо ВА100349. Буфер зберігали при 4 "С.
Ліганд: 5ЕсеєМіІсх, який являє собою позаклітинну частину альфа-ланцюга людського високоафінного рецептора ЧЕ. Експресується у вигляді рекомбінантного білка у СНО-клітинах та піддається очищенню.
Речовина, що підлягає аналізу: ІДЕ-Рс, що являє собою Ес-частину людського ІДЕ, яку експресують у вигляді рекомбінантного білка у СНО-клітинах та очищують. Використовували людський ІДЕ-Рс дикого типу (Сє2-Сє4-домени з нумерацією М224-К547 згідно з Юоітіпдіоп 8
Веппісй (1978) Іттипої. Вем. 41:3-25), що несе мутацію С225А (5ЕО ІО Ме 108).
Номенклатура мутантів:
Еабї омалізумабу: 5818, 0838 (5778, О79В відповідно до нумерації за Кабаї) (варіабельна ділянка легкого ланцюга -- константна ділянка капа-ланцюга у вигляді 5ЕО ІЮ Мо 24, у якій 577 та 579 замінені на С; варіабельна ділянка важкого ланцюга -- константна ділянка СНІ у вигляді
ЗЕО ІО Мо 5)
Еар2 омалізумабу: ГІ 58Р (І 54Р відповідно до нумерації за Кабаї| (варіабельна ділянка легкого ланцюга ї константна ділянка капа-ланцюга у вигляді 5ед. ІЮ Мо 113; варіабельна ділянка важкого ланцюга -- константна ділянка СНІ у вигляді ФЕО ІО Мо 5)
Еар3 омалізумабу: 5818, О83В8, І158Р ІЗ77В, 0798, 1154Р відповідно до нумерації за
Кабаї| (варіабельна ділянка легкого ланцюга бед. ІЮ Мо 121; варіабельна ділянка важкого ланцюга -- константна ділянка СНІ у вигляді 5ЕО ІЮО Мо 5)
Партнери ІДЕ по зв'язуванню (1): повнорозмірний омалізумаб (Момапів); рекомбінантний
Еар-фрагмент омалізумабу, який експресують у СНО-клітинах та очищують.
Партнери ІЧЕ по зв'язуванню (2): рекомбінантний РГар-фрагмент омалізумабу та його мутації, що експресуються у клітинах НЕК-293 та досліджуються у вигляді культурального супернатанту.
Культуральний супернатант концентрували десятикратно перед аналізом.
Метод аналізу (1): 5ЕсєВіо; зв'язували з поверхнею сенсора за допомогою зв'язування через альдегідну групу до рівня -500 одиниць відповіді (ВОЮ). Буфер НВ5З-ЕР використовували в якості робочого буфера при швидкості потоку 30 мкл/хв. ІЧЕ-Ес розводили до концентрації 10 нМ у
НВ5О-ЕР і впорскували на іммобілізований 5ЕсеНВіа протягом 290 секунд із наступними З впорскуваннями, кожне тривалістю 690 секунд, робочого буфера або партнера ІДЕ по зв'язуванню, розведеного у робочому буфері. Рівень захоплення ІДЕ-Рс становив -90 ВИ.
Зо Поверхню регенерували з використанням двох 6б0-секундних впорскувань 10 мМ гліцин-НСЇІ, рн 2,5. Величину дисоціації ІЧЕ-Ес від іммобілізованого 5ЕсеВіІа розраховували в залежності від початкової величини зв'язування, та швидкість дисоціації розраховували як величину втрати
ІДЕ-Бс з іммобілізованого 5ЕсеєНіс, нормалізовану до початкової величини зв'язування в залежності від витраченого часу.
Метод аналізу (2): 5ЕсеєВіс; зв'язували з поверхнею сенсора за допомогою зв'язування через альдегідну групу до рівня -2000 одиниць відповіді (ВШ). Буфер НВ5О-ЕР використовували в якості робочого буфера при швидкості потоку 30 мкл/хв. ІДЕ-Ес розводили до концентрації 10
НМ у НВ5-ЕР і впорскували на іммобілізований 5ЕсєВіс протягом 180 секунд із наступним 1 впорскуванням, тривалістю 180 секунд, робочого буфера або партнера ІДЕ по зв'язуванню, розведеного у робочому буфері. Рівень захоплення ІДЕ-Ес становив -275 ВИ. Поверхню регенерували з використанням двох бО-секундних впорскувань 10 мМ гліцин-НСІ, рН 2,5.
Величину дисоціації ІДЕ-Рс від іммобілізованого 5ЕсєНіс розраховували в залежності від початкової величини зв'язування, та швидкість дисоціації розраховували як величину втрати
ІДЕ-Бс з іммобілізованого 5ЕсеєНіс, нормалізовану до початкової величини зв'язування в залежності від витраченого часу.
Таблиця 2
Розрахунок величини дисоціації ІДЕ-Ес від іммобілізованого 5ЕсеєВіс. Початкове зв'язування ІЗЕ з 5ЕсеВіс нормалізували до 100 95 та дисоціацію розраховували відносно цього значення. Умовна швидкість дисоціації засновується на умовній швидкості реакції для процесу першого порядку.
Кількість ІДЕ- | Кількість ІдЕ- | Кількість ІДЕ- Умовна
Ес, що Ес, що Ес, що докт рівень залишається | залишається | залишається |" нові 3
Партнер ІЗЕ по ІВ зв'язаним із | зв'язаним із | зв'язаним із ' захоплення . . . впорскування зв'язуванню ІдЕ-Ес (97) З сеВіо; після|5РсєНіо; після | 5ЕсеНіо: після 9Б-Ес (96) партнераїдєеЕ 1-го 2-го 3-го по впорскування впорскування впорскування зв'язуванню ( о) ( о) ( о) (1/с)
Омалізумаб 300 мк/мл | 7000 | 79593 | 71,5 | 699 | 1,46Е-04 мкг/мл " " " " " мкг/мл мкг/мл
Додатковий мутагенез проводили для визначення того, чи можна ідентифікувати додаткові мутації, які прискорювали дисоціацію ІДЕ-Рс від 5ЕсєНіс, окрім тих, що описані у Гар3. Це привело до мутації 564М (у випадку 5ЕО ІО Мо 20), яка у контексті Гарз була здатна додатково збільшувати дисоціацію ІДЕ від 5ЕсеВіс:. Ці дані описані на фіг. 13 та в таблиці 3.
Таблиця З
Розрахунок величини дисоціації ІДЕ-Ес від іммобілізованого 5ЕсеєВіс; Початкове зв'язування ІЗЕ з 5ЕсеВіс нормалізували до 100 95 та дисоціацію розраховували відносно цього значення. Умовна швидкість дисоціації засновується на умовній швидкості реакції для процесу першого порядку.
Мутант 564М: легкий ланцюг із 5ед. ІЮ Мо 39; Раб омалізумабу М/Т: легкий ланцюг із 5ед. ІЮ Мо 20; Рарз омалізумабу: легкий ланцюг із б5ед. ІЮ Мо 125. Для всіх трьох з них важкий ланцюг із
ЗЕО ІО Мо 5.
З Ідентифікаційна ВО для МО для ІдЕ-Рс о Умовна разок інформація захопленого після Дисоціація, 90 швидкість
І9БЕ-Ес дисоціації дисоціації (1/с)
Комірки тільки| Контрольний
Еаь омалізумабу мутація 564М |(564М, 5818, 278,59 94,66 66,02 4, З0Е-03
О83В, 1 158Р
Шиття жене вон омалізумабу Мт 265,49 205,05 22,17 1.04Е-03
МТ
Пон (ШО | же | же | йе | же. . (5818, 0838, 261,85 163,32 37,63 1.90Е-03 омалізумабу і158Р
Висновок
У своїй сукупності ці дані демонструють, що мутована форма Рар омалізумабу може прискорювати дисоціацію ІДЕ від іммобілізованої форми високоафінного рецептора ІЧЕ, ЕсеВІ.
Мутації у легкому ланцюзі, які забезпечують можливість цього, включають у себе, але не обов'язково обмежуються, 564М, 5818, О83В та ІІ 58Р у випадку 5ЕО ІО Мо 24 та приводять у результаті до 5ЕО ІО Мо 39.
Приклад 3. Вимірювання прискореної дисоціації ІдЕ-Рс від ЕсєНІ методом проточної цитометрії
Інструмент: проточний цитометр ЕАС5ЗСапіо ІІ (Весюп бісКіпзоп)
Лінія клітин: клітини НАВІ-5Х38, що експресують людський ЕсеєВіІ, культивували у мінімальному поживному середовищі, доповненому 10 95 фетальної бичачої сироватки, 2 мМ
СІшШамАХ та 500 мкг/мл генетицину (Гїє Тесппоіодієз). У момент аналізу клітини промивали у
РВ5 та інкубували у розчині Ассціазе до відокремлення, потім їх ресуспендували у кількості 1 х 106 клітин/мл у середовищі культивування. Усі наступні стадії інкубування здійснювали у середовищі культивування.
Спосіб аналізу: клітини ВВІ-5Х38 у кількості 1х105 клітин/мл інкубували з 5 нМ міченого
АІеха-488 ІдДЕ-Рс протягом 1 години при температурі 37 "С. Клітини промивали двічі у середовищі культивування для видалення незв'язаного ІДЕ-488, потім суспендували у кількості 1 х 106 клітин/мл у середовищі культивування або ІдЕ-зв'язувальних засобах у концентрації 100 мкг/мл, розведених у середовищі культивування. Клітини потім інкубували при температурі 37 "С з постійним обертанням. У кожний момент часу 0,5 х 105 клітин видаляли, промивали крижаним РВ5 та потім фіксували шляхом ресуспендування у 1 95 параформальдегіді у РВ5 протягом 16 годин при температурі 4 "С. Величину флуоресценції від зв'язаного з клітинами
АІеха-488 визначали з використанням проточного цитометра ЕАСзЗСапіо ІІ.
Проточна цитометрія: зафіксовані клітини промивали двічі у ЕАСО буфері (0,1 95 мас./об.
ВЗА, 0,01 95 мас/об. Мам3 у РВ5, рН 7,4) та ресуспендували у 200 мкл ЕАС5 буфера. Проточну цитометрію здійснювали на цитометрі ЕАСЗСапіо ІІ з використанням стандартних методів та середнє геометричне значення інтенсивності флуоресценції від АїПІеха-488, зв'язаного з інтактними клітинами розраховували з використанням програмного забезпечення РіІоуліо.
Швидкість дисоціації міченого АІеха-488 ІДЕ-Рс розраховували у вигляді зміни середнього геометричного значення інтенсивності флуоресценції в залежності від часу в результаті або інкубування клітин у середовищі культивування з надлишком ІДЕ-Ес без мітки, або в присутності зв'язувальних засобів для ІДЕ. Номенклатура мутантів:
Зо Еабр11 омалізумабу: 5818, 0838 (5778, О79В відповідно до нумерації за Кабаї) (варіабельна ділянка легкого ланцюга ж константна ділянка капа-ланцюга у вигляді 5ЕО ІЮ Мо 24, у якій 577 та 579 замінені на С); варіабельна ділянка важкого ланцюга ж константна ділянка СНІ у вигляді
ЗЕО ІО Мо 5)
Еар2 омалізумабу: І 158Р (/154Р відповідно до нумерації за Кабаї) (варіабельна ділянка легкого ланцюга ж константна ділянка капа-ланцюга у вигляді 5ед. ІЮ Мо 113; варіабельна ділянка важкого ланцюга «т константна ділянка СНІ у вигляді ФЕО ІО Мо 5)
ЕарЗ омалізумабу: 5818, О83В, І158Р І577В, О79В, І1154Р у випадку нумерації за Кабаї (варіабельна ділянка легкого ланцюга ж константна ділянка капа-ланцюга у вигляді 5ед. ІЮ Мо 121; варіабельна ділянка важкого ланцюга «т константна ділянка СНІ у вигляді 5ЕО ІО Мо 5).
Таблиця 4
Розрахована швидкість дисоціації міченого АіІеха488 ІДЕ-Ес від поверхні клітин ВВІ -5Х38.
Умовну швидкість дисоціації визначали у результаті підбору кривої лінійної регресії на графіку -
Іп(ВІ/АО) в залежності від часу для всіх доступних моментів часу. тв
(ГасіннядєЕ ///7777711111Ї111111111111111111111111111111111111111111241
Таблиця 4.
Висновок
У своїй сукупності ці дані демонструють, що мутована форма Рар омалізумабу може прискорювати дисоціацію ІДЕ від високоафінного рецептора ІДЕ, ЕсеВІ, який експресується на поверхні клітини. Мутації у легкому ланцюзі, які забезпечують можливість цього, включають у себе, але не обов'язково обмежуються, 5818, О83Е та І 158Р.
Приклад 4. Демонстрація того, що РГарЗ омалізумабу мас кращу ефективність порівняно з
Еаб омалізумабу дикої о типу при їх терапевтичному дозуванні у моделі 72-годинної РСА
Розчин людського антитіла ІДЕ до ОМР у концентрації 25 мкг/мл одержували шляхом додавання 7.5 мкл маточного розчину з концентрацією 6.68 мг/мл до 1992,5 мкл РВ5. Ін'єкція 20 мкл цього розчину буде давати дозу 500 нг ІЗЕ. Тварин (ПІЧЕВ Та миші) голили на боках і потім їм вводили ін'єкцією і.4 (інтрадермально) на кожному боці о 2 після полудня у День 0. 20 мкл
РВ5 вводили ін'єкцією у лівий бік кожної тварини в якості негативного контролю. Антитіло ІДЕ до
ОМР (20 мкл) вводили ін'єкцією у правий бік. Ін'єкції одержували в сумі всього 40 мишей.
Обробка або Рар омалізумабу дикого типу, або РарЗ3 омалізумабу (з мутаціями 5818, О83В,
ІТ158Р І577В, 0798, 1154Р у випадку нумерації за КабраїЇ) починали через 18 годин після введення ІДЕ (о 8 до полудня). Дві групи мишей (п-:в/група) отримували 100 мг/кг 5.с. (підшкірно) або Раб омалізумабу дикого типу, або ЕРар3 омалізумабу. Додаткова група з 8 мишей отримувала РВ5 5.с. Мишам знову вводили дозу, яка зазначена вище, 10 годин потому (6 після полудня). У цей момент часу, через 28 годин після введення ІДЕ, додаткові дві групи (п-в/група) також отримували дозу або Рар омалізумабу дикого типу, або РарЗ омалізумабу, що становить 100 мг/кг 5.с. Усі групи отримували повторну дозу о 8 годині до полудня, о 6 годині після полудня та знову о 8 годині до полудня у кінцевий день експерименту. Через 72 години після введення дози і. (0 2 годині після полудня) усім тваринам уводили ін'єкцією ім. (внутрішньовенно) 100 мкл ЮОМР-Н5ЗА у концентрації 1 мг/мл, 2,5 95 мас./об. барвника Еванса, складеного у гепарині у концентрації 100 МО/мл. Через 1 годину після цього тварин умертвляли з використанням методу за схемою 1. Шкіру з боків навколо місця ій. ін'єкції видаляли та забирали зразки для пункційної біопсії. Зразки шкіри поміщали у 700 мкл формаміду та
Зо піддавали розщепленню протягом ночі при температурі 55 "С. Після розщеплення 2 х 100 мкл рідини видаляли з кожного зразка та поміщали у 9б-лунковий планшет для ЕГІБА. Потім вимірювали спектральну поглинальну здатність при довжині хвилі 620 нм.
Висновок
Ці дані демонструють, що мутована форма Рар омалізумабу, яка може прискорювати дисоціацію ІДЕ від високоафінного рецептора ІДЕ, ЕсеєВі, також є здатною до зниження пасивної шкірної анафілаксії (як показано шляхом інгібування витоку барвника Еванса блакитного з ділянки реакції) при статистичній значущості змін порівняно з Рар омалізумабу дикого типу.
Мутації у легкому ланцюзі" які забезпечують можливість цього, включають у себе, але не обов'язково обмежуються, 5818, О83А та І1158Р у випадку 5ЕО ІЮ Мо 24 та приводять у результаті до 5ЕО ІО Мо 39.
Приклад 5. Моделювання молекулярної динаміки РарЗ омалізумабу в комплексі з І4Е-Ес
Метод
Кристалічну структуру ГабЗ3 омалізумабу у комплексі з Ес-ділянкою ІДЕ (див. приклад 1) одержували у середовищі для дослідження молекул Моїієсшіаг Орегаїйпуд Епмігоптепі (МОЕ) 2014.0901 (1) шляхом доповнення пропущених бічних ланцюгів у деяких залишків та пропущених петель між Св2- та Сєз-доменами перед моделюванням молекулярної динаміки
МО) з використанням програми Атрбег 14 (2). У структурі комплексу враховували водневі зв'язки та сольватацію з використанням докладної моделі води ТІРЗР з сольовим розчином 0,15 М масі у блоці в вигляді усіченого октаєдру, який простягається на 10 А від будь-якого краю блоку до атомів білка. Систему налаштовували з використанням силових полів Атрег 258 та силових полів для олігосахаридів СІ МСАМ 06)|-1 (3) та вільну енергію мінімізували за допомогою алгоритму спряжених градієнтів для 50000 етапів з граничним значенням 10,0 А, встановленим для кулонівських та ван-дер-ваальсових взаємодій та переліку сусідніх атомів на основі граток. Після цього систему поетапно нагрівали від 0 до 300 К за 125 пс при константному об'ємі з наступним вирівнюванням протягом 2,25 не у МРТ ансамблі з обмеженнями за всіма важкими атомами у розчині (обмеження гармонічної пружної сили становить 5,0). Для електростатичних взаємодій автори використовували РМЕ четвертого порядку з граничним значенням 8,0 А для кулонівських взаємодій з перетворенням Фур'є у просторі за замовчуванням і налаштуваннями допуску. Температуру контролювали з використанням алгоритму слабкого зв'язування, який застосовують до білка та розчинника, відповідно, з часовою константою 1,0 пс, та тиск контролювали з використанням ізотропного баростату беренсона, який застосовували до повної системи з часовою константою 1,0 пс та стисливістю 4,46 х 105 бар". Нарешті, проводили моделювання продукування тривалістю 1000 не без будь-якого обмеження, використовуючи такі ж самі параметри, що і для вирівнювання.
Для забезпечення можливості часового кроку 4 фс на інфраструктурі РО водневу масу білка та цукрів перерозподіляли до 3,024 дальтон з використанням РагтЕа (4), в той час як масу атомів, з якими вони зв'язані, коригували на величину, потрібну для того, щоб загальна маса
Зо лишалася незмінною. Структуру Гаю омалізумабу дикого типу у комплексі з Рс-ділянкою ЧЕ моделювали на основі структури кристалу комплексу омалізумаб-мутант З з ІДЕ-ЕРс за допомогою віртуальної мутації Н81 та В83 у легкому ланцюзі антитіла із заміною на серин та аспарагін дикого типу, відповідно. Моделювання МО проводили з використанням такого ж протоколу налаштувань, як і для мутанта 3.
Модуль сррігаїжр АтбрегТосоі5 (7) використовували для аналізу формування кластерів траєкторій МО як для Рар3 омалізумабу, так і для Раб омалізумабу у комплексі з ІДЕ-Ес.
Приймали ієрархічний агломеративний алгоритм, в якому середня відстань для зв'язку між кожним кластером становить менш ніж 2,0 А. Відстань між кадрами розраховували за ВМ5О (середньоквадратичне відхилення) оптимально підібраних координат між Са-атомами в залишках М-ділянки легкого ланцюга антитіла. Формування кластерів проводили тільки для кожного 10 кадру та всі інші кадри додавали до кластерів, виходячи з того, як близько вони знаходяться до центрів форми після утворення кластерів.
Перелік посилань 1. МоїІесшіаг Орегаїйпа Епмігоптепі (МОЕ), 2014.09; Спетіса! Сотрийпуд Стоцир Іпс., 1010
З ПпеїтбоокКе 51. М/езі, З!ййе 2910, Мопігеаї, ОС, Сапада, НЗА 287, 2015. 2. Сазе, О.А., єї аї. АМВЕВ 2014, 2014, Опімегойу ої СаїІйотіа, Зап Егапсізсо.
З. Кіухвсппег, К. еї а. СІ УСАМОб: А депегаїїгаріє Біотоїесшаг Тогсе Пед. Сагропуагаїев.../.
Сотриї. Спет., 2008, 29, 622-655. 4. пир/раптеа. діти. іо/РатЕаліті/паех.піті
Результати
Для дослідження того, як мутації 581Щ та О83А у легкому ланцюзі Рар3З3 омалізумабу впливають на взаємодію з ІДЕ, здійснювали моделювання молекулярної динаміки протягом одномікросекундного періоду для Бар омалізумабу та РаБ3 омалізумабу у комплексі з структурами ІДЕ-Рс, відповідно. Моментальні знімки траєкторії групували у кластери та центральні структури 2 верхніх заповнених кластерів аналізували, що явно демонструє, що у обох кластерах дві мутації аргініну у мутанті З утворюють виражені мережі водневих зв'язків з залишками 0278 та 5280 у суміжному Сє2-домені ІДЕ, відповідно. Візуальне дослідження траєкторії підтверджує, що попарні взаємодії Н81-5280 та В83-0278 є значно більш консервативними та стабільними протягом моделювання, внаслідок цього, нерозігнуті бо конформації Св22 відносно ближчого СеєЗ-домену, які розкриті у кристалічній структурі, є замороженими через утворення містків у антитілі. Цікаво, що, незважаючи на те що подвійні мутації аргініну є просторово суміжними з 0278 та 5280 у Сє2 в кристалічній структурі Гарз омалізумабу, вони не зв'язані безпосередньо водневими зв'язками, як можна припустити при моделюванні МО. У випадку Бар омалізумабу. як очікується, мережі водневих зв'язків, які спостерігаються у мутанта 3, є відсутніми у структурах верхніх 2 центральних кластерів.
Візуальне дослідження траєкторії показує, що Сє2-домени стають менш прив'язаними до каркасної ділянки легкого ланцюга антитіла та, отже, їх відносні положення відносно ближчого
СеєЗ-домену є більш змінними, ніж такі в Гар3 омалізумабу. Додатково до цього, поверхню взаємодії між ГарЗ омалізумабу та ІДЕ-Ес у комплексі з ним піддавали ІОТА аналізу (ІОТА являє інструмент статистичного потенціалу для визначення імовірності даного типу атома, що контактує, на поверхні взаємодії білка або у сайті зв'язування), в якому спрогнозували, що положення 556, 564 та 571 у легкому ланцюзі у ГабЗ3 омалізумабу (у випадку 5ЕО ІЮО Мо 113) можуть бути піддані мутації для підвищення афінності омалізумабу до ІДЕ-Ес, та, отже, вони будуть посилювати ефект, який за прогнозом буде спостерігатися для мутацій 5818 та 0388. детально описаних вище.
Висновок
У підсумку моделювання МО пропонує гіпотезу про те, що мутації 5818 і ОЗ8ВА полегшують локалізацію Сев2 -доменів ІДЕ у антитілі за допомогою електростатичних взаємодій та водневих зв'язків із суміжними 0278 і 5280 у Се2 та впливають на пластичність Ес ІДЕ за рахунок закриття розігнутої конформації Сеє2. Це узгоджується зі статистичною методологією, за допомогою якої прогнозують, що мутація 564М та 556 (який змінюється на О, Е, О або ЕВ) та 571 (який змінюється на 0, Е або М) буде мати подібний вплив.
Приклад 6. Вимірювання афінної і і Рай проти ІЗЕ до ІДЕ-Ес методом Віасоге
За допомогою технології Віасоге вимірюють взаємодію між біологічними молекулами без необхідності мічення. Один з учасників взаємодії, який називають лігандом, або прямо іммобілізують на поверхні біосенсора, або захоплюють на поверхні сенсора, тоді як інший, який називають речовиною, що піддається аналізу, протікає у розчині над поверхнею з захопленим лігандом. Сенсор виявляє зміну в масі на поверхні сенсора, коли речовина, що піддається аналізу, зв'язується з лігандом, і коли речовина, що піддається аналізу, дисоціює від ліганда.
Зо Вони відповідають як процесам асоціації, так і дисоціації. В аналізі кінетичних характеристик
Еаб до ІДЕ являє собою ліганд, та він захоплюється на поверхні сенсора. ІДЕ-Рс являє собою речовину, що піддається аналізу, та він захоплюється Раф до ІДЕ. Асоціацію та дисоціацію ІДдЕ-
Ес від захопленого Раб до ІДЕ відслідковують із використанням або ІДЕ-Ес, що протікає над поверхнею сенсора (фаза асоціації), або буфера, що протікає над поверхнею сенсора (фаза дисоціації). Деталі методу є наступними:
Інструмент: Віасоге 3000. СЕ Неайнсаге АВ. Уппсала, Швеція
Сенсорний чип: СМ5. Номер за каталогом ВА100399
Нормалізуючий розчин ВіІАпоптаївіпа воішіоп: 70 95 (мас/мас.) гліцерин. Частина набору
ВІАтаїіпієпапсе Кії. Номер за каталогом ВН100651. Набір ВІАтаїіпієпапсе Кії зберігали при 4 "С.
Набір для зв'язування через аміногрупи: уомер за каталогом ВА100633. Етил-3-(3- диметиламінопропіл)карбодіїміду гідрохлорид (ЕЮС) розводили до концентрації 75 мг/мл у дистильованій воді та зберігали у вигляді 200 мкл аліквот при температурі -70 0. М- гідроксисукцинімід (МН) розводили до концентрації 11,5 мг/мл у дистильованій воді та зберігали у вигляді 200 мкл аліквот при температурі -70 "С. Етаноламіну гідрохлорид-Маон, рн 8,5, зберігали при температурі 4 "С.
Буфери: робочий буфер являє собою НВ5О-ЕР (являє собою 10 мМ НЕРЕ5Б, рН 7,4, 150 мМ
Масі, 3 мМ ЕОТА, 0,05 95 поверхнево-активної речовини Р20, відновлений із 10-кратного маточного розчину): Номер за каталогом ВА100669. Буфер для іммобілізації являє собою ацетатний буфер 4,0 (являє собоюю мМ ацетат натрію, рН 4,0). Номер за каталогом ВА100349.
Буфер зберігали при 4 "С.
Ліганд: Раб до ІДЕ являли собою ліганд. їх тимчасово експресували у вигляді рекомбінантного білка у клітинах НЕК-293 та використовували без додаткового очищення.
Речовина, що підлягає аналізу: ІДЕ-Рс, що являє собою Ес-частину людського ІДЕ, яку експресують у вигляді рекомбінантного білка у СНО-клітинах та очищують. Використовували людський ІДЕ-Рс дикого типу (Сє2-Сє4-домени з нумерацією М224-К547 згідно з Юоітіпдіоп 8
Веппісй (1978) Іттипої. Рем. 41:3-25), що несе мутацію С225А (5ЕО ІО Ме 108).
Еарго-фрагмент козячого антитіла до людського ді (специфічного до Еабго-фрагмента) (Часкбвоп Іттипоїаб5, номер за каталогом 109-006-097) іммобілізували на поверхні сенсора шляхом зв'язування через аміногрупи з використанням стандартних методів. Бар до ІДЗЕ 60 розводили у робочому буфері (НВ5-ЕР) та приблизно 200 резонансних одиниць захоплювали на поверхні. ІЧЕ-Ес розводили у робочому буфері та серію серійних розведень від 2 нМ до 125
ПМ пропускали над захопленим Бар до ІДЕ. Фаза асоціації займала 180 секунд, та фаза дисоціації займала 300 секунд. Поверхню сенсора регенерували з використанням 6бО-секундного впливу 40 мМ НС з наступним 60-секундним впливом 10 мМ Маон, та потім із додатковим 60- секундним впливом 40 мМ НС. Усі дані щодо зв'язування обробляли з використанням двох стандартних значень з використанням програмного забезпечення ВіаЕмаї|майоп. слідуючи стандартним процедурам.
Таблиця 5
Афінність Раб омалізумабу та мутантів до ІДЕ-Ес, яку вимірювали у кінетичному аналізі методом
Віасоге. Константу дисоціації (КО) розраховували як кала. (дикого типу)
Таблиця 6
Афінність Раб омалізумабу (М/Т) та мутантів до ІДЕ-Ес, яку вимірювали у кінетичному аналізі методом Віасоге. Константу дисоціації (КО) розраховували як Ка/ка. Чотири мутанти присутні у контексті послідовності дикого типу (легкий ланцюг із 5ед. ІЮ Мо 20).
Таблиця 7а
Афінність Раб омалізумабу до ІдЕ-Ес, яку вимірювали у кінетичному аналізі методом Віасоге.
Константу дисоціації (КО) розраховують як Ка/ка. Мутації знаходяться у легкому ланцюзі (у випадку 5еа. ІЮ Мо 20).
ЗЛЕ ЗбЕ 777777/17771717171717117л7.94111 71116661
Таблиця 7р
Афінність Раб омалізумабу до ІдЕ-Ес, яку вимірювали у кінетичному аналізі методом Віасоге.
Константу дисоціації (КО) розраховують як Ка/ка. Мутації знаходяться у легкому ланцюзі (у випадку 5еад. ІЮ Мо 20). Послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга для мутантів баб наведені у колонці зліва (МІ 5ЕО 10 Ме)
МІ
Мо.
Таблиця 7с
Афінність мутанта Раб омалізумабу до ІДЕ-Ес, яку вимірювали у кінетичному аналізі методом
Віасоке. Константу дисоціації (КО) розраховують як Ка/Ка. Мутації знаходяться у легкому ланцюзі (у випадку 5еа. ІО Мо 20). Зразки піддавали дослідженню прискореного окиснення та рівні окиснення метіоніну у кожний момент часу визначали за допомогою мас-спектрометрії. . ко перилши юн | злет лвєов| зало зо. 11111111 100096) 4години | 343Е06 | 13803 4,03Е10| 403 11111111 доба |340Е:06 146Е03 4ЗЕЛО | 430 11111111 здоби |3.37Е:06 13803 4,09Е10| 404 11111111 діб |ЗД5ЕМЄ | 136ЕО3 4ИВЕЛОЇ 418 11111111 ладів | 308Е:06| 122Е-03| 397ЕЛО| 397 11111110 | 4години | 3.46ЕО6 | 144Е03 | АЛІ8ЕЛО | 418 11111111 доба |ЗАТЕМОЄ|ТО6ЕО3 | З7ЕЛОЇ 371 11111111 1 Здоби |349Е06| 123Е-03 | 353ЕЛО| 353 11111111 діб | 564Е:06| 136Е03 | 2А41ЕЛО | 241 11111111 ладів | 364Е:06| 120є-03 | 331ЕЛО | 331
Висновок
Ці дані демонструють, що мутовані форми Раб омалізумабу можуть збільшувати афінність
Еаб омалізумабу до ІдЕ-Ес. Найкращою комбінацією мутацій з точки зору поліпшеної афінності є 57/1М у комбінації з 5560. Це підвищення афінності переважно викликане зниженням швидкості дисоціації баб від І4Е-Рс. Афінність Барі! омалізумабу (з мутаціями 5818, О8З3А
ІЗ77В, 079 згідно з нумерацією за РНабаї)) та РГарз (з мутаціями 5818. О8З3В, І 158Р І577В,
О79В, ТІ 54Р згідно з нумерацією за Кабраї| у випадку БЕО ІЮ Мо 125) також є поліпшеною за умови поліпшеної взаємодії антитіла з Сє2 ІДЕ-Ес порівняно з РГар омалізумабу, що не має мутації.
Приклад 7. Вимірювання прискореної дисоціації ІДЕ-Рс від іммобілізованого 5ЕсеєВісо методом Віасоге
Вплив Раб до ІДЕ при дисоціації І(ДЕ-Ес від 5ЕсеєВіІс вимірювали з використанням методів, викладених у прикладі 2 (спосіб аналізу 2). Усі Раб до ІДЕ експресували у вигляді Раб у НЕК-29, очищували за допомогою стандартних методів та кількісно визначали за спектральною поглинальною здатністю при довжині хвилі 280 нм із використанням розрахованих коефіцієнтів молярної екстинкції. У цьому аналізі концентрація ІДЕ-бс становила 2 нМ, а час дисоціації становив 200 секунд. Величину дисоціації ІДЕ-Ес від іммобілізованого 5ЕсеєВіс розраховували в залежності від початкової величини зв'язування, та швидкість дисоціації розраховували як величину втрати ІДЕ-Ес з іммобілізованого 5ЕсєВіІс, нормалізовану до початкової величини зв'язування в залежності від витраченого часу.
Вважають, що 580М (нумерація раб) взаємодіє з 0278 у Св2 ІДЕ, та вважають, що 567М//У (нумерація раб) взаємодіє з 1298 у Св2 І9ЗЕ.
Таблиця 8
Розрахунок величини дисоціації ІДЕ-Ес від іммобілізованого 5ЕсеєВіс. Початкове зв'язування ІЗЕ з 5ЕсеВіс нормалізували до 100 95 та дисоціацію розраховували відносно цього значення. Умовна швидкість дисоціації засновується на умовній швидкості реакції для процесу першого порядку.
ВИ для Умовна ш ВО для ІДБ-Ес | Дисоціація, | швидкість
Зразок Мутації захопленого я о ди
ІЮЕ-Ес після /о дисоціації дисоціації (1/с)
Еарз
З81А О83А І158Р 152,1 125,9 6,25Е-04
ЗАМ ВІВ О8З3вІ158РББОІЕ 87,6 | 621 | 291 |ОБЕ-ОЗ
ЗАМ ВІВ О83АІ158РББА ТЕ! 80,0 | 644 | 195 | 7,24Е-04 зб4М 5818 О8ЗНА 560 71М І.74Е-ОЗ 564М 5818 0838 56Е 71М 101,81 666 | 346 | 1.42Е-О3 564М 5818 0838 560 71М 109,1 1,14Е-О3 564М 5818 0838 560 71Е 107,8 І, ОЗВЕ-ОЗ 564М 5818 0838 568 71Е 102,8 6,64Е-04 5560 564М 571Е 5818 0838 156,7 110,5 ІЗ7Е-ОЗ 560 564М 57/1Е 5818 О83В8 560 564М 57/1Е 5818 О83В8 контроль з Й
Висновок
Ці дані демонструють, що мутована форма Раб омалізумабу може прискорювати дисоціацію
ІЧЕ від іммобілізованої форми високоафінного рецептора ІЧЕ, ЕсеВІ. Мутації у легкому ланцюзі (бБеа. ІЮ Мо 20), які забезпечують можливість цього, включають у себе мутації у положеннях 56, 564, 567, 571, 580, 581, 0831158 (552, 560, 563, 567, 576, 577, 079 і 1154, відповідно, згідно з нумерацією за Кабаї), але не обов'язково обмежуються ними.
Приклад 8. Прискорене окиснення мутованого Раб омалізумабу
Зразки Раб до ІДЕ піддавали дії режиму прискореного окиснення для встановлення впливу окиснення метіонінів у варіабельній ділянці легсого ланцюга на афінність Бар до ІДЕ-Ес та здатності до прискорення дисоціації комплексу ІДЕ-Ес: 5ЕсеВіІс. Мутований Раб омалізумабу інкубували з 0,1 95 та 1 95 (06б./06.) перекису водню протягом періоду до 14 діб при кімнатній температурі. Після інкубування зразки піддавали зворотній заміні буфера на РВ5 з рН 7,4, та концентрацію визначали за спектральною поглинальною здатністю при довжині хвилі 280 нм із використанням розрахованого коефіцієнту екстинкції. Мас-спектральний аналіз для визначення величини окиснення метіонінів варіабельних ділянок легкого ланцюга здійснювали шляхом відновлення та алкілування матеріалу в умовах денатурації з наступним розщепленням трипсином (50 мкг/мл трипсину протягом 180 хвилин при температурі 37 "С з наступним гасінням ТЕА), а потім здійснювали аналіз за допомогою І С-М5 (рідинна хроматографія-мас- спектрометрія) з використанням мас-спектрометра Тпепто Огбітар О Ехасіїме Різ. Відсотковий бо вміст окисненого метіоніну розраховують, виходячи з припущення, що на момент синтезу немає окиснення метіоніну, та порівнюють зі стандартним матеріалом, який витримували при 4 "С.
Таблиця 9
Відсотковий вміст окисненого метіоніну у варіабельній ділянці легкого ланцюга мутованого Бар омалізумабу. Мутант Раф омалізумабу містить наступні мутації: 564М 5818 О83А 5560 571М (у випадку 5ЕО ІО Мо 20). 11111101 Збокисненогометіоніну присутньогоукожниймоментчасуїд -:/ 1 |КонтрользіоЄ| 4години| їдоба | Здоби | 7діб | Ч4діб (Контроль з ює
Висновок
Ці дані вказують на те, що можливо створити мутований Бар омалізумабу, який характеризується фактично повним окисненням критично важливих метіонінів (Мб4 та М'1) легкого ланцюга. Виходячи з цих даних, матеріал зі зразка у День 1. День З та День 7 об'єднували та використовували для визначення впливу окиснення метіоніну на афінність мутованого Раб омалізумабу до ІДЕ-Ес та на здатність до прискорення дисоціації комплексу ІДЕ-
Ес: зЕсєНіо
Приклад 9. Вимірювання прискореної дисоціації ІДБЕ-Ес від 5ЕсеєВіІс методом ЕВЕТ
Вплив Раб до ІДЕ на дисоціацію ІДЕ-Ес від 5ЕсеНіа вимірювали у гомогенному ЕНЕТ аналізі.
Усі Раб до ІДЕ експресували у клітинах НЕК-293, очищували за допомогою стандартних методів і кількісно визначали за спектральною поглинальною здатністю при довжині хвилі 280 нм із використанням розрахованих коефіцієнтів молярної екстинкції. У ЕВЕТ аналізі використовували мічений ТЬ ІЗЕ-Ес в якості донора та мічений АІеха488 5ЕсєВіс в якості акцептора. Обидва реактиви змішували та приводили до кімнатної температури протягом 60 хвилин у кінцевій концентрації для аналізу, що становить 1 нМ. Рар до ІДЕ додавали у суміш у кінцевій концентрації для аналізу 500 нМ і флуоресценцію зчитували (довжина хвилі збудження 330 нм, довжина хвилі випромінення 495 та 520 нм) кожні 20 хвилин протягом 800 хвилин. Інтенсивність флуоресцентного випромінення наносили на графік у залежності від часу, та швидкість дисоціації ІДЕ-Ес від 5ЕсєНіс розраховували як період напівжиття комплексу. Ці дані наведені у таблицях 10 та 11.
Таблиця 10
Вплив Раб до ІДЕ (М/Т та мутанти) на дисоціацію ІДЕ-Ес від 5ЕсеєНіо; у гомогенному ЕНЕТ аналізі.
Дисоціація комплексу ІДЕ-Ес: 5ЕсеєВіс являє собою двофазний розпад. Швидка початкова фаза являє собою фазу, на якій дисоціює більша частина комплексу ІДЕ-Ес: 5ЕсеВіс та на основі якої визначається період напівжиття комплексу. Мутації знаходяться у легкому ланцюзі (у випадку зЗеа. ІЮ Мо 20). Послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга для мутантів Рар наведені у колонці зліва (МІ ЕС ІЮО Ме).
МІ. комплексу (хвилини)
Таблиця 11
Вплив окиснення метіоніну на здатність Раб до ІДЕ до дисоціації ІДЕ-Ес від 5ЕсеВіс; у гомогенному ЕВЕТ аналізі. Дисоціація комплексу ІДЕ-Ес: 5ЕсеВіІс являє собою двофазний розпад. Швидка початкова фаза являє собою фазу, на якій дисоціює більша частина комплексу
ІДБ-Ес: 5ЕсеВіо; та на основі якої визначається період напівжиття комплексу. (хвилини)
Висновки
Ці дані демонструють, що мутовані форми омалізумабу здатні дисоціювати ІДЕ-Ес від 5ЕсеВіс з більшою швидкістю, ніж послідовність дикого типу. Зокрема, мутації у легкому ланцюзі (у випадку бед. ІЮ Мо 20), які забезпечують можливість цього, включають у себе мутації в положеннях 564 та 567, але не обов'язково обмежуються ними. Більш того, окиснення метіоніну (Мб4 та М71, бєед. ІО Мо 20) не мало істотного впливу на здатність Габ до прискорення дисоціації комплексу ІДБ-Ес: 5ЕсеєНіс.
Дана заявка була описана з посиланням на варіанти здійснення даного винаходу. Тим не менш, середній спеціаліст у даній галузі техніки зрозуміє, що різноманітні модифікації та зміни можуть бути здійснені без відступу від обсягу даного винаходу, який викладений у пунктах формули винаходу нижче. Відповідно, даний опис слід розглядати у ілюстративному, а не обмежувальному сенсі, та всі передбачається, що такі модифікації включені у обсяг даного винаходу.
Важкий ланцюг
ЗЕО ІО Мо 1
М-ділянка ко КАМНоНя БУС са щуУЄштт шими ВО ДЕВОБЕНМА БІТУМУ
МецпуУуКЮОВІТІ ШбВООБЕККИЖ ПОМ БВАЄО ТВУЖМОДНОМ БтБСНМНКАМ ЦЕ ПЦУКУВ й
ЗЕО ІО Мо 2
М-ділянка
ОА ТоштТОЗАшТОс сот СТО ІВ ПО ВО СРО АОС
ТОСТО ТО Того САТ ТОН АС СУБ ААЦЮТ АТО АСВ пт АК ВОАС ТОА БІТ ТОСАТСШВОССТ АС АСОСТ С ААССАДСТ КЕ
ВАСШИЖЕ ЛЕ ТЕМ СКС ТТ САС АТАБОВМщЕВА ТАТКО
СПК АСУМОУКИТТОВ У се хавожа в АФРБО СОС СТ АСТМОЮ ПОКИ АК ОА
САКТАСЕРТОЮ СНИ СА СОБІ то А АМКУ САЛА СТЮ
ЗЕО ІО Мо З
У-ділянка, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом плющ кісЬ ЕБЕБШАЄ ЕМ ФООУБНОЦОЬУ розви ос АУШОУЄВІЖНО ЗИМА пАшЬВУМАшЕ удо Ми БУКЕТА СОБКО МИШКУ А УКОСИ танинЕдУК СУК БУВТУВХ
ЗЕО ІО Мо 4
У-ділянка, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом
ЕЕ пн нн по мая м вн п о а о в
ПІМУБТЄНЕТО РОСТ ФфюцостовТОе сАБССТИЗС Тло ОшРОРОСТ
ІК ПИХ ХЕ КТ ОН КАТКИ АЕС АКТИ АЮ ОЮИ
ПЕДА ТО Ж САТ АОС ВО ЗО АССАВ СТГ АВС
КЕТІ Ми СТ ОАТОНМО ЖК БЕ АВ АСВ ОА Ж АДЕАСОТС ТАМ АК
АОС То ОоОсИв ВОАТАСТОСС СТЄТАСТАСТ ОЗОН АГТОСАСАТТАС
ТРОС КАСТ БОСАСТТ Є БТ А ОВО САС ОСА ЛО АС
Коо) ЗЕО ІО Мо 5
МУ-ділянка -- СНІ константна ділянка гама-1-ланцюга фот тІЩйМУнирх ати тт дез ТЛІ ситу Кв т іх ШІ тт р КК мим шила діло ЕчАх ХО ТУМ КИ ЖИ СМ СКМ Б МТК ММ МЕ хІНОКУ шосту ух Мк тю Фу т Вже тир ки ту А Ку и ит жду Іф ЖАЄ уК рю юри уут у жор Х ТИХ
ВІ У НА м Ж у НА МН ЄЕг хх Ух і ее ВО ММС щини ВИДИ, пр кож МАО ТАНК КІМ ЕХ в КН Ма Боня А БУЖ ХК УМХ ФЕМ ТІ МА БОКИ М А М хх бом мем та Ку т Іст ИЗД М ух хху хх фі хе уУАМИ: ж МиМИХ ТУ хУщНИ рУ; п КТю
Поч ОСИ о З З о на оскно о Н КЧа оск ФВ змов ЕУ зимі ЕЕ лу лих пермсрслжуу т мету ІХ У ситу у мити Хм уУ кА БЄмтУ Ум иуУЄХ Кая уд би їх и а о а ТЕЦ КЕ а и иа ока но ее ве и ТАТІ І
АВМдля А ТИЙ інжЙй Ми Уся КОМ пИАХКА ЛВ М АТО ДІ МУКА КОХ ШЕ ТА МОБ У КО КВ
ЗЕО ІО Мо 6 оо і и и о М о о с у НН В о В ОН в в Ом пе ОН А аа ниви а п М ик о а ко Нв кА М Ка па и М в І ок ОН и о во В і М В ЕН о ВН
УтЗиЖтииУУ чІИ и ек боже ми ву спи МЕ ух т кууни м матч кулю ки
Ж А МК ЕК АМ КМ ОЕМ А КМ Мо ем А ЛАМИ ДОМА А ххх САДОМ ЛУСУМИЬ М МІ ЖУуМ Хот А и, прое в Вели ту й У у иут У зу в КА ит дю щит ую Ам ВИ МІЛА ТУ
МИХ КК МК Кл КА Кіа СІ А мо ККУ ОАК Кв Ма ВАК КХ ЛАКИ ВА В
АБУ из гру м УуИт Тур 0 хи уки КУМ МІХ ТИ ому мм м тихих Мих мих в мим МВ М ие моих
У УНН и и Но ут жі хо СИ ЯН НЕСЕ и к7 ж она НК гХ МА КД Ки, ТЕТ хКї Му ай сх
МЕМ АЙ АЙ ле лхи МАЙ КО АКА МАЛУ КІМ І ЕОМ КАСА М КІ ВМО жі и Мичов мовити х м щити УМИМ и о ВЧ ная жом мих их, Мои мух Кир и и й дру ут и ом щі ПЕ пи дім гу гух ще ди хі В
КАМЕНІ КІВ ДЗ Ми А ОМ ЧК ІМ АТ КАМ Ка М АКА с Мане мА КІВ ва о м НЯ
ТИ УМ ВУХ пи уми А хи умру ми зиМиЕМ Ми Ех ОО лю у в ук му час ан ана о ЗК Чо он ОК ко А КН и я КН а о Нео ИНА ак М аа НН НН в В В в в НН
Мт ох Мо ИН ЯН Я З и ЛЕ ЕН ТИЖ ни а Ва ЕВ МНЕ НН
ТУМАН Ж ОАЕ ММ Мети БМК МААМКАЬ ОА Му А У АК очи им МАУ. МИ АЗИ Ми уми м
ІЕМ и т и Пелех учи их ку витер МОВИ И ди дитя рію тити с Тур пит и им мих
ЗАШУЛУЮВ ау хи ми МУЛ и АК КА я ПІКИ КОМ КОМА ІТ ХМ А МЕ Й МУХИ КК ОЙ «т ЕМЕАСНТЕ ХЕ моді АЖ Му у ик. ВМО НК дети ріку шк км ижуМ піки их рих МАУ же ми ких
МАМАЯ ХТУМ Є Ме ЕММА ля МИ ЖАН Ка лук МВА ЕМ ем и КН МКК УМ МОВАХ имя оон о НН ХпШХМЯстЗИММоМоихМ сурми хижих их зи и і Й нн м В ОЗ и и кр нин ника
Кл як Кл з Ех. з ї ХА ї пк т НИКИ ГА Ки Н ї Ам Я НІ ОО ЕН КУ
Ах ВЛюЧ Я Х юне и У ие ИН М МАКИ я Мед ХМ а а КІ МИ НЕ М ЕС ВО З ри и Ту имя М тру юМ ус ж кА мя Ки мила лити иа иа в тк дит тру туК
ПТ тТОотюєттІр ти. р ЕТ М ПА В в ко тт ду МИ ЕД ДА БІК АКТІ й БМВ жду МІ АЖУ САМИМ Му ЖУК мк уко ЖІ Уа УА АК МО МУ МИ
ЕТ Тю М тера ЖІ Мт хикио ВМЖАВМ ОА КОЮ
ЗЕО ІО Ме 7
М-ділянка - СНІ константна ділянка гама-їІ-ланцюга, де сигнальна послідовність де ож м М кох а у и в и НН НН НН
ВОДА КІ ОК и А А ГИ ТО ІК У Км ха МИХ ЩІ о
КАЖУ МАК о охини А КІ КВ ки Ж Ми МКК дамам МК УДК жк УЖ юМИХ Кжмх ПОКЕЖІХ У ОТИКУХ па ов ИН оо и зар уйх сти Ки плиту р ютюю мот ти рили т х дажщлях ст шу тить пити им сю ли
ПІ шого ує пкт хо шутер прути ж ит ех БАК т ВОДТМО ру да падали ХА АЮ КБ М КІЗКО ЛКМБА ОА сах ОІВ хх хо РМК ДИ ЕМ КО ОМ ОБОХ хе КК шу» от Тв щі же ху ЖИ мус Еулу я СТІЙ ЦИ Ти тож м кнсяму ЖВЕАКІ ле чу пихи ХК
МІ М мА: ІВ А А МО АКУИЕТ ДУХ е т ТА аа НІ Я МИ паж Мякий М дм КОМ КИ ж ММК М ХК ДМШ ІЛ Бо ММ ШМАТ 1 ПК МАУ ХИ У км; умер Зм тУ мл б ух ж хм Кт тут ж ЕК ско КН то МІ Птах Кк жуткх з ухтх ав мМ КЕ ОМ Му 0 Мі УСЮ М КА УМ АЖ ОСІ БОБОВІ ХТО ТУ
Ух
ЗЕО ІО Ме 8
М-ділянка - СНІ константна ділянка гама-їІ-ланцюга, де сигнальна послідовність
ХЛ п УТА ТЕКА тот м ит уу им их трупу у М УЖЕ би зримо КИТИ и МО ТКЕИТ, «УДО и КМИН Мк КО дик Ко М ОН док о в и а о М а ВК пз КВІНКЕ ит МЕМ рю ри т Дж кри жи Ух уки ким Ж или мису Ех шихти чи крути кожен со ж о о І он и оон ВК фо с В а и п о м по о В НА й ур т иЖих Ж МС ЖИ и М у Ж т ж УТ Ву Жири М, ок тю Ми ит хом их уми
Не и и В Зо Нео І ОБУМ тк зи Ж ЖИ МН А ВНУ АХ ЛІ ОХ АК МКМ
УМ Тит, В чим и иихи килиму ух дн но за В а а а Ви В І ХИТ пере кв З ЧИ НЕ От ВЗ о М ЧО М ПК ДН З ЕКО В В І В во З ВК В В КОЛ проекти У МИХ МИТІ КИ дих де ІМК ш ЕК МЕТИ В ЖИ КАК У ДІ ОЛОМО длобмуєттіІМ стриб доти хг зи М
МОМУМУМКА ЯМІ МИ Ми их КА Ми пуми КМ А ХОЛ АЦ КАМИ Ми МИ АКУМАЦЯ У Й чих КУЛАМЬ ПУХ ОМ ОЇ ОКолуМАчА от ЕХ
Он ев о нн Но а в МмУЛОодДІМо У жІМиЗ их; мо и муфти и вимо ихмилем мити Вч умо ут кит
ЛУ ЖАТИ Я ми АК МАзмліц ій МКМ УК ха 1 ВУ жа Ми ділу АК МАУ Ку ока и А НН а І ка иа СК о ви ВН Ком ов ВО ОВ ОК ХНН оо она АН
БА ОХ УДУД ЗИМ ХО МВУЙ ОМА УМ ДОА Ми МО Божа МУКИ се НАМ жити ОО МАМИ АЛОЗАЧТУХИ Я ша Мои диких мене о нано ж ен и Нав на а в а На А АВ а Не о А п АК АВ: пд а и М В А и о я З ДЕ ВН ВН В Ванни еВ - НВК НВ
А Олю МУКУ МАМ АН УЙ МИХ АК и мохи ми В МЛ Мей сю ми МА Ми ей У ТМ 0 А ля АЛ МИ я ее о А а НН ве а о Но а ем то уми и У А и ие ит у І и ци о М в в о В В ОО А КЗ В СВ А КО КН Ж
ТОВ вс дме Ер ВІ дих ЗНОВ ДИВ зи зро ді у и тЕтт пемх М
УКУС ЕК ККУ пил ММ у МИХ СИМ М КОМ екю Букски М А Ли ММК Ме АОМУ ХОЛ ММА ПАЮ те У КМТ АТХ
ЖІ Жуижи мих гм ВИ ТЕМ ми им 0 уми сих й ИМІМУ МИ М или ких дим Ву кх меБсА ПУ Зими М ОЕМ МАМОЮ СУМКА Мі миец ЮК МВ Ме. МЕ КА МК За йжтку МА ИКН КА ГИ телиг Мет итеия в итии ОТЖЕ У ТІ КМ Кия ди и у си Ким м Ми у ит нен о но А и Я
КЛІ ОТлух пін та А Є: ФО тя пІЗИМА СМП МУЧТІ ПАСМ ВІ пи АГ ЧІ К іди хи Ай КЕ ЗАМАХ Хр ших ЖИ МА УМ. СКЗ ЗІКА Ки МИ Ак и КАТА ММА Ж уки Кк ватру хт
А МЕККА МЖК А
ЗЕО ІО Ме 9 шу: АМОЖІЕМКІ т оаРпурстн ом ето Фе" доти см мМ ня Демі гу усну ют ни ні м сс ОХ М о Та Я МЕ ВО В п А В МА ВИ МЕ НА А ЗУ КЗ ННЯ ке Ди М ях ла ІТ ІМТ БМ сел ти Ух ух Ву дж М и Ля Ти. о У нн ри НН я І о во нку МІХ же МіКуКІ ух жо хисту вх тех мим
На и она и Кік У КИ и ен ан ня ІІ ННІ М а В аа год нка ЯН чи ТЕЦ КІ КО ОУН Ух
ХА М МІЖ АОС ЗІ К ММА КІ Юу МИ УМ КЕН МІ КМУ о м Ж ав З НН а НН ам и Ав вн и На о кн І и в о ННІ ННЯ о а в а М о на по А и а В и и НН ОК и а В в а и КО КН ОМ юн К АХ ХМАДКОШУ Ж аж ши А ВАЛКИ М ен а в а СВ У Па пр ь ки аж ХК КОЮ Ж лук
ПИ Ж т сх уж Ах Ікс ту МА ХК МІ ТЯ пе УА кА Аа я Но Ви оч ее и М а ни п ен і ЛЕ і и В зд ЕВ ОН нн І А НВ и и МЕТІ ДМ се В Ж Ки АВ ее З МИ ЩЕ МЕ ен мя У ЗВ С о з В В ЗК о и о ОН пот жУг КУЄ ТЮ У ТУ ЮДИ ТУ УжНУ иУЄТЬуєЄТЕХ ЗІ ТІ МІК ІДХАїМ ЕХ ЕКУХ ТІК ему дк ут а М КК МІ у випр Ілл гурт МКМ ил ТМ ВЕУ мама КЯАКЛТАК БОКУ ЛАММ ІА КУМ ем жіг ОЬЬею У Кат же УВУМіх АКІ КЕ хе и ци око тт УК и КА ул ухилу то жу ую Ви ти Тем Би ут М Ах тут кит пт Ітту Ку пт аж мс М я М АЮ МІГ ОО Я БОС жк МІК ВК ЮК. Ка УК М КМ ща ци и ММ жи лу Му Ех Ст т удх ух лит ІТИ ЖИнВ пи сжхєТУу ТЯ Ж ХИТ Ул лемжею М жиє де у о ак а ее ТУ, ТОЖ МИТІ О Ми ІІ ТИ ЦІ І ОТО Ду КІ МИ А ик Уж М А ха ж ХМК КВ ЛО ЖУМ МТУ ка КУА МОЖ ІМ І А ТЕ «аю екДКИМЕВ МО КІ УКХ пит ВИХ Куля хау М ТЕКИ тих кожи Ох
МОВУ годе М Ма Х А ЮДТ ДМ НО
ЗЕО ІО Мо 10 ядухи у сумних Меупир курми вими ХИЖИХ виь 0 пиву ту им я мейл ДАВЛ МУЛУ А З ЯУВ ю АВ К ИА ММА КАЛ ХУА а АВ МОА ЖАХУ Я
ТПОМІШМІМАМТІИХ вжи три мииЕх КОМ ТММ оизЕ ІМ дих рми тю км их их пов ижу м Можу ри и т кни Сн он о о Ко НК о осо В Я А ЕН о о АК Но ОК ке АХ Ед У ЕА З АМКІ их и евро Хутро дев и кими ет уко Щодо вир те
Ма я с а А и ж о пл о В В ПЗ З З п ПИ а З Є З МИ Ки З оо В
Кона ан и АНА ЖАННА а АН а о А на а А о ПАСА Но В ВАН ноя тю мити ен СИ У У ОКУ. СК Мету чи ке а иа вт А ВК а С ВЕ С а В а ПК М В А ня ее ит Ву у ше в НН А ес о и ни в НН ЧНІ
Он вм и І В В НЕ Ка ЧАН ен ДК Ка МІ уу АОС ДІ А А ший мил МАТ МИТ ка Ів п КЕН АТ У КІН и АТОМИ ки и р о ШО МТМ ШТ ОТ
ІДУЧИ ВОМУ ті ал, Ті и пра их им ММ ЕЛІТ КУ ЦІМ ВИМ ШИ Ем хі Му ФУР уки пк и ме ен нт зи о кю и м по п А п п п о В ооо КК в оо а о о я ХИЖАК МО МУ пит ЕК к им зу р АВ и ЕЕ тИМ ЖЕ у АХ их перу у ух КД у вих диких вив в ра м в о в м КО в оп о НИ В а о м КК и ж зон их о не ВК ви жити и мож ЖИМ ИМІУ Ім их усе из мини ж дИихим у им и МуЄ ТМоихумуи их КИМ тих ихусуих ви утекти пи ах, ДЯ гук Я 1 Ка с 1 х Н Зх Я и КУ, КОЖ Я 1 т Ху их ик на махи люде МИ Химхлмиї Її Мих Кам Кн мя Таж Усх Ех ше КИ Мобихо мих я мА МАЦІЮ ХІТИ МИЛЕ ТЯ оо ве ВХ МИ В А КВ В ов м п З в В Ав З я ЗНУ в и С ов Ме хи щу м
АОМукд БЦ ТИТум МО ОМЛОМЖ УЛ и си, Ген ме ово во ки но я о р ПОМ М и. чик свя спо и жу дих иземухиев Ей. др х дурити ДИ и и милих ЕК ми сити Купи В
Енн ва ки и п і о а а м п М с а М о с и М А М о ск і о З М В о ЕК ОВО ВОК хІЗиХиОом Ід хи пути в кА Мод Ота а Я МЕМ И Ж КИ Ту АОС у
ТУДИ А ДУНАЮ их ЛО УМКІо КІС ЕЛУ ЮК ЯМА ЖУЙКУ ЖИМ КІ ЕІКО ЕХ ШУБИ МАС МІ а на в о В в На нав о а а АТ ОНА ИН АНА ши и МЕТ той. Ме жа с а ха у ВИДА НН м м З ен хуй км иХК дя МУМИ А АТМ МАО ЮНА СМАК НІ МЕЧА А лиття уми м муть ит ТЕ КОЖ КИТ МИ суму и ух м сАСМИХ жим мости стАИСТА мл ати світ ТУ Утім итеите или пи и МО КЕТІ Ту ї ї СУП ду АН АТ І у ПТ хшЖідого мети кв шими КОКО АТ МЕМ КА МИ ЗАМ А ЕМ КИ Йь ПІдЮМКВ ЯК МА КУКА ВИ птиют и же М, пет Му у и ж а о п і п с рам им я Ам ИЕ ун Мости сит а ма и чн и и А ІН ОН а и Нм нн и М З а М НН В а МН А М
Ми кВ ДК ейЛЮ же АСК ДАХ МСЕК Ми КК М ОО ЖУК ОЕМ Ж ЖІ МТА, УП ЛУЄТІ 1 ОА на а а п в ин м и п п п о о п и ИН м пе п п м о а п оо п в НН нець над о КМ І А о о В а а о ЗО М М КВ и В ВМ с ВЗА КК МИ С ОН М В ЕЕ
МІЖ І их Думи ит ИМихтИ УМО им их села нива а ан; а АН В АННА кВ а а
ЗА ОМА ЕКО УА и НОЯ он о о КО НН А и ов НН КН и Км и ВН Ки ми скит ту ВЕУ ЖЕ М Ту ДИ же Еми моди ти и жи юри ЕМ УМЕ МИХ ЕІ ІМ или Сер и и и м А Ву ст
ШТ УсТ І гУ УКВ АКТІ Мр Уд ЦИ ОКАЙУЮ мкм М КДМШ ДУМИ ЕІ ИКИ МЕМ ЕХ п ча п аю а кн и п і а і в і п а о и а
ПН чо ННІ Кк БО ї в : В же й ї НК На А З ре и мч ї 1 КИ сю
М МАЕ ЯК Бу ее МЕНА КЕ КУ ВУСА МИ А АЖ Юм Ж НААН КАЛУ тА ОМОАТМИ ТМ ЙО МИХ Ас И КОДУМТ Ку В им ую ду роки В пити им о хи уу ви и ту я АК АК В КМ КАН У тр Аг ком м у о З А С ОА и М ЗВ КН ТА
ІК НА КК КИМ НЕ МТА бек хи УЛ АТХ АКА ха А АЮ ЖИМ Я АБО А Ж си КА у сет Гукитя и дю т, пити жи Ж ЖІ от кит ик юю що ат их им Кт М ро а Не
ПОН а Не Кк І АК СК ге ЕК М ї ОМ не еВ В
Нв во п В и м о З о п в КО М ВЕ В З В а Со с ВЕ ВО КВ В Я з ні ит чи Ко жу их свреті ж. доти З отут ті о ит ТІ АТМ уст м Моя. РИ иИх с ХК жу рив с КУ: ие А арх ки о В М и КК ВК МНН З: ФО НН А фо МВ ЗО пилу те пу
А В око НН Ка о М МЕ ЗА В ДО ДИ А А ИН и в в т п Ли В с М З З А ВН ОК така иа ЗА АННА Чо и НН о ан а а ан ВАВ Юм ПА уит у ж и ТУ ОМ т усите тю или: ВИ м БУ Му М їх м о Я НО А г то НЯ х їх се Не и пеня Ах КК РК КАХ НК
Кулі ей хай МКМ АМЖА МО МД хаме МИХ КА ЮА МА КМ Уд ун ЕМ МИ СУА МихА МАК МА СМ ОКККТО ВУХА ХХ
Моміжм мм САМИМИ су муку и уж ОКУ уча у уми ти М, МОм.
ІТИ ЕТ ІМЦ и а НІ и В пз а я ВН и ДО КУ
ЛИХ іме УК КАТА МАЕ МИ ДО ие шиї УПМ мим ие ноз х КЕ,
ЗЕО ІО Мо 11
М-ділянка ї- повнорозмірна константна ділянка гама-1-ланцюга, де сигнальна послідовність п и ННЯ Фу сслдм их дж у О и у УМІЄ Й Ж сум УТИМ и Ж жу дю АСК ША ДТ я и ХУ ТУ МИ ТУ
ОК ОД ад и оо НИ У ни В М С НК ННЯ ето ІІ КСВ Ве У НК лу м КІ Иа М НІХ БІ СМ ОТОЖ МУК МО ДК АМОНІАКУ И Я МОЖ УЖ МУХИ УЮ М пи жосжжт св ТИКИ МИСКА фу кити ж ми итих Мить вх ВАМИ І ВІВ ОА У Когут
ТКУ ТАК потен ки міх лит пт ох піхви у ут леми шт А еру
МК ШУК а І ХУ ОТАК А, кій ХЛ Ж ЛИ ОКА. МІХ ЕМІМ КСО Ми ХЕ АТМ КМЦІЬ Мк МОХ У МАКИ ГІ Х птТІМміІМ Є АЙ І оту о АН Ин Ан а ПІТ М ЦИ о а ве а КН МЕ Кл кл ІХ
ЕреоЕ спина Ки М З кА З о м ж и с вра а кн МИ М а т В а ДВ С М З і кв В о В В В М ВО вл тлу их тт мілини Ж од п ше жди Суд Де Дт и УТ Итюх сК ож КУА ТІ Я им, Ши Уа
Же Он КА пкт ше м нн и ак нн ОН НН 7 м Ок а НН У З ОКЗЕЗ и КК КЕ МК КУ на М оз ха МОМ МО Штам ВІКОМ АМІАКУ М ШУ У вв ни В НН ВК С КО Ка і ОМ о СВ КВ НО ПК и фо и В Он МАС НК На пОМДАЕОВ ІК М КК МТ КО МАУ МО мкм ШОКОМ ЕМХ ТО БОМ ІЗЕМА КОТУ Ж и М Ж мам ХМ КИ У ТМ
МАХ мое ук шити кл Єпо ух ул жти и ті ОКІИ Й их мит п МЛ. том м фе ци М ик
АНУ М МОм чу 4 и мохів три о А У ЗК АК ПОН Ху сх
ХІМ М БУМ КІНА СКОРО УК АЗС. МАУ МЕКУ ІМ МТ НЕК У Му А ТАКУ І ЯК ВИК ца их ум щи т ж жу ма Ви Ту тлу ку в ут пн новиоа и ІфУЛУ ТЦ МІЖ МИЛИ МАМУ ПІДУ ТЕТУ МУ ТИ і ана в в о п В в ОДНІ ВІ иа тека М нн ЕЕ ВН І шт КИТА
ТАТИ ОМП у У екв а екаае нот ок ко З ж З ки п З о З За а о а о и КЕ В о поль чн А и Я Я ПА ЛЕК гати Жуки 0 дж гір жів и МІХ Ох хи г МА жо КАТА КУТУ пкиж стойки ІЙ рт Ку своп плУксвтУ пунк ММ ому тот гу
МеВ Ми МА МОМ АОКИ ОО УА МІХ МИ МУ Й МК Ж ЕМ ЕЖГК ЛКИ лк МІУ ТУ
ЗЕО ІО Мо 12
М-ділянка ї- повнорозмірна константна ділянка гама-1-ланцюга, де сигнальна послідовність литут М ут ИХ тер и и ДОТИ тЕТ ЛИТВИ сФуУЕКетт ие ХУ РТМ имя ЖИМ и що Ми Ж щити
ЖАБ М АК ЖУ ММ коми АЛЮМи би ож Хоми и МУ А Ми МОХ КО В ШК ож мим вл и МК В А АД ЕМ І У
ОКУ ех УМ ТИ пкиттуя нт мими ють лк етику тек ких и п МИ Миски жиму мими пе Ка Ех жалю ня мона Аню КА ше НИЖ ОК І ВІНТАЖ СНІ ЕНН т ик ую ую АТ С КИ и ТОМ КИ ЖИ ит я ук туз КЕ ми. М хоч и ММ ям мя пи ситу ти дит а о А НИ : прот т ще Ім доп не с с М о с ок у зи я и М ЧО ЗМК В с о М а НК НК НЕ о В КЕ КН ВАК М ОН ЩІ гад ек вижити ІМ их ие им ту утіх ШУ ит ит І 00 МИТ точи о ичмих фу и о хи хи ши Мо или п ЮА ЛАК КІ гук пут Не віче ліц хг АДІЧ І ХР ОДН ЩІ нен о не о ни М т а а зн в нн м м а В В о и кп КЕ ОЦ з КН о МК В З тету чи ем гі ут в ж НІ ге и і Ди ен ДЕ ВИМ. ТО ер А и он и о В у я В В МЕ и о В в о еВ НО о ТЕ А ОМ МАК м чими
КСО МИХ серии Ех ки Ж аа а а м о В На о А АНА сит ую ву у пу вм ДА кишка і КЕКВ АК КІМ КК МО ЕМ шк а ЕМК ОЕНАІ У пивні тр супами ДМ вир иКут птн и ни в ов мн у с в в кп о п в а і В ль вк р в ОО В МИЛИ о М В деку МОЖУ ох А версия ин в в в в В КН ем па тн НН а нн
НЕ по АЦИМИ АТО ТІ ПИТ: НЯ пу М Не ОН НН ЗЕМЛЯ ЦК НІ ще ЛУ ЖК. Мн п ЖАКА СИМ КА МК аж Мо 0 Уа ЕВ ЮНА МУ ДМИ МОМ КІ ИЙ ох щихпУУиМ М ихуХХ окисом бор МСЕ и межу уми 0 ух хр юю УМ мк их их ся оо ось со НА А нь я БО БЕ НО І ТИЛ АЯКС АМОША МУ ДО ОА КИ пив и тих ги гх Уми ми кумири и жи оз ум тихим ЗЕ ех и МИ и у те ит пе воно ан и ОК и ОО НН г АНІ КАН ШІ г о кН перу ду селу У КИ КМУ Ки ЕМ бхулЕМИ узи ди У Ан о о ам В а В
МАЮ Мк ММ АК КН ен и а НН а Я ке Клео еко НН а а "бМ тур КАТ и М МУ и ВМ ТА Мои т цим У ВО СА ЖИМ Муміє и ан У а ан
ППО РО лу щ полу у МІ их; Ой милу ха и й ех мухи М ру ям АСУ ЕМ хе АКА. Як В УА ХАІ ЕК ГОТИКА ЕМАЙУТ Мукж Ум УВІ ТХ скупі» фур кими МИТИ ЕЕ ЕЕ спите ви МИ В ой гр куму Ех мал ілархиймойи Бела ЛУ ОБІТИ л ми М меми пи КАМ А упілМЕ ММА Ми
Форт ТИ УМ ЖИТ ит ут Пул ЖК Сас ДИМ Кит ром по щожт си мисю г ху м єс т яти иу жмут ми щих
НУ ІІ УІТрету пф ут МмОйОІМу Тр КІ І Ку (и НИК ИН : а В КОС еН
Мудаки КА М АОМЕА Очне м чин МТАКІЙМЕ МІЛА ЖАХ АЛ АМУхми Ми МИМО ЗА А до ми муМиКИ МО БУМ мими МИ КК
ТУТ ЕХИ І ЗИМ их ву КУМ УДО Ве уЕ и А АН р а НА
МА ХиСумий АДМ СЛІД А ОМВК ЖАВ МАЛА МК Ми ЖАГА КУМ АВ С ПЛ МБА УМ ТЕХуУЮ А МАТ МАУ пмПТЗИХ фути оспругуто вими гу пив Св у М дим мом щоВУт М юн ИМИи Кв щей сТУете зе в а Н о Е В п В СА а М ИВЕ таж у ит у итих с у у ет Ж отити у их шТАЖТ А УТ утри отит ит ЗМ і АТ ИТЕ ЖИ ю криття Ж ти ОК, що ТОД Базу тт тп у ВИ пи р Два ех м ОН и Моя КОМАХ КК хамам А МКУ М ою д М КВ ОК М ДУМА Колки АЖ КИ Км мтс промиту ту у оо на аа КУ п а а ко лев во и ки их ов о Аа нь ма копа а а НН З ИН А Не НЕ НА ОА На А НЕ В, зн мк м в М В В КК ла а ви вн м п а Ка п р м з м о и В Кс п ПН о
ХХ ОДЕВЕМИМ КД Ехи Мити В Кир дови Уроку аа а на и вв аа АН АН На
Кока ка озна ЗМО о м а ля че а М о я В З о о КК КЕ п З ко Ки и а В В В о о п о В ко п в Ва А щетини ДАТУ ИМИ КВ Ж УЖ им есржи ств ух Ко КИМ НИ ттМ дожити Ж.О Ух М тут у их ке с и и м у пе м м В м п А и ВК м и кв а в І М НН в у а ол а и а
ГЕН ЛеХНИТЕМИИ вич ви ЗИ Кер Ви Ви Дод де вими ДИТИ Вих пу ве де ее В св а а осо нат и а кт Ка м м в п о В о В і п ак а і и о п в п В й и о М В о МНЕ лижі и АТ КТ Ар УК и МУ пут їхр. йЗМ о ходемумучи узи руху дл ВОдиМмуУЄИВ Клум Ех пане ИипМУК М У Е АнЮх хи АНА КК ЖИ НЯ Ж хо АЖ КА ЯКІМ ки КІ леми Уста и ери УЖ жу Хижі си МУХ узи ІМ пеодтІТ ВИ рухи Му А Рує миїх св п имЕю жу зимами злу АОС міш Мк Ми УВА ІКЦ ОЕМ КиМУ мими ОКОМ МУЛ МАКОМ Ку им У хи умі им мим и и Ки А Мвих
Ам ЛІ МИ М ІМК М М Кая МК
ЗЕО ІЮ Мо 13
Тих Кулик иу У охоти о у та ту жТТХ
ВАШ ОВ ки ДА КН и НВ От пи М Клас УМ ха кУ даю ДМА ММА
ЗЕО ІО Мо 14 ци трим их ки жд
КО хі А тах КК КОХ
ЗЕО ІО Ме15 и он НН НА
В Ве ММ ут Ки Мод МА ОО УК МОХ
ЗЕО ІЮ Мо 16 спи ких ХУ ЕТ КМІЙ их
ТІ ЖК КАТ ТЕ Мк
ХА ТАМИ ЕК КИ іх Ех
ЗЕО ІЮ Мо 17
МУ ЖЕСТ СІЧ УВА Іще уУх ФА МАІМОК р; млМгатМ мае у
ОК КЕ В ту ТМ МОГТИ дехто ТІ
БАБАК МІК маш АМПУ ТО А ОХ Ко ЕМ
ЗЕО ІО Мо 18 межи ж утуюі т СК : у КМ ТК
МІК БРА ОКХ ККД ОТУМ
ЗЕО ІО Мо 19 сли ку у хви їх ча ТАЄ в сн я МН Я
ЗЕО ІО Мо 20 с и а М а п а и о а о п о а п а А АНЯ нн я вин нах КОМООМЛ АТТУ Кор Тук ут НІ М ТАКО сла им ке а ЕН ел а и ки Кс М о и М п В А А В о а а ЕД З В В ЛО Я БИиХУЖ УМ ка ЖОВТА ДК МЕ ОК пт у іх Ми ур Мч то дм м готуй ММА юс І хм Халати ут рити трі ух УА їх
ІІТ р Б шИгурУ джрорчег ам мор обу ВА О у дк Вр и ДЖ ех ги ці в МЕ МТК ха РИ КІ «ОІВ ММ АЮ Мох ЇХ КЕ МАЕ А о КН нку
ЗЕО ІО Мо 21
САТАТТЕВОУЄ БОС ОМщО СПОРИ ФСГ ес сни а ПУ М оса в АН НН АН в о НН в
АКА АД АВАКОВА Аа КО КВН пуп сн кет щих В ди сири ДООДЖУИХ рих КА уж у оре Мо зрив гм ими кв вух
ПАВЕЛ У ЕК с ЧАК АДААДО че їх міх Ал ви ї 5 іч г НО но ТК мг о СТАВАЛО її ЗАМ :чи
ПММ КО СААЮТЕ Са ема м КІКНО САЛО ВЕТО АКОТ ТЕСЕХ тестом сила СТ М АСТМИ УТ ЕК А
МЕС ОА ШАХ ФВ АЕС НЕ
ЗЕ ІО Мо 22
М-ділянка омалізумабу, де сигнальна послідовніСТтТь піДКреслена та виділена курсивом
ЕКиУгЕтН: КЕН ВІ О1ЛОсеРОВЕЕ ЗпУСЮВУТІТ СВАНОВУЮТО ООЕУКМИУОЮ
КРОКАВКЬІ ЖАЛБУ ЕВ. КМ ООХя ТЕТІЇВ ОЕМ С СОНЕТ о и и
ХЛ ІА КАСУ ДУХ ХХ
ЗЕО ІО Мо 23
М-ділянка омалізумабу, де сигнальна посліІДдовВніІСТЬ піДКреслена та виділена курсивом дих я Мити у ТІМ гу МУ у М ДІ пути рим МИХ ур уми Мои ЖИМУ КО уки их ТРУ я
МІК Ки АК ВІКА ОВ ей Кв МАО ДО А М мо Мій КІХХКИ Ме М Е Ми М ММА КУХ ГІ ол ШК КИ КК в КАК вт дит и о ки я зок и ЧИ Око о м У МК Ви ПЛ ВИ В НО ЕН оз в ВО ВК ВОК НЕ ВЕ НН В НВ ВЕ ЯМИ
ПУ Ехиу у и с они а а КН А а АН оон А ОО Ла ч сит ри т ут жу дух и ит ит
Кк АК ук уву м МИЛІ ВУСА МО ху ек Ми ТУЛУБ М ЖАХ МУ ЕХ
КВБОСОЕОТАКВ МАСКА ЕТО АКИ ТАНК СЕС А АОС ІДКО
«ОМ БООСЄЮЬ Терен Соя сн ВОЛА ТА СС АСАД СХУТОТЕС мн нн В в в о НН ни НН
Пенн а АТ ТИ А ПТ АЕС СААЛВУТОС ВЗ ОВО ТАКТ АТ УКТ
ПАТО МА САЛО А ОАЕ Ж
ЗЕО ІО Мо 24
М-ділянка омалізумабу т константна ділянка капа-ланцюга сут утмуУуЄтЬСтхю то ве ув тяТь тм тУ косу тери яким пет ть т ОКУ й петлю пилавісокО ВОАС СКАТ ОСНО ММ СОСКІВ КАВКО БЕХ МАМИ пУКОМЕОМЕМИІ ВІВ БОБ АСтУ зом ГОСТ ЕУК КТС Є
ЕВ КБОШЕОВК МАБУТЬ МЕККА У УКУС шо УМ і ЗК Их
ВЕЖІ АСЗУ ЕКНКУХАСЕВУ ТОК КУКА
ЗЕО ІО Мо 25
М-ділянка омалізумабу т константна ділянка капа-ланцюга
КАРТИ ТАТ САА СОС АСТСИА СТОПОЮ СО начню КАША Є
МЕШАСТРОКХ пос сАТССКОВМ сип АЮ СОСНА ВСУ ЗАХО КЕ ш Ж АВ САВА СИ ОАКАЮИ ЧО СТА СТ А КИ АКА С ТАМ
ОД СОТ ОО АЛЮХНМУ РОЮ АТС САД ОЄ
ТОСТИ СО ЕН АСК СПОСО АСТТАЄ БАС ААЄ МСГ СА А из АюЬ АК
СПО: ик курник же мо ем я ОКХ Мом Коти СИ СДМ ТИтИ КІ рчиІУИЬ хи
ДАЛІ ОМВК МОНА АВ пе АМС АФ хи емо АЮ АК КВ І КМ
АТБ ЖОВ ССЗ ВАК БОТОСАдСТО СТОЮ СОС О Сто мокру ск еру КИ МІД СКУ Тих цИ Мих во мА хи м ситу меди иши щиих ЖИ КХИМ МТВ ом ХО жк те КО
АДКТААСТТСТ ДРС ЛАСА СОС АВМУА СВО СА АЦ ССЛОЕК А
ОСС АВТО ДОМОВ АСОМ САВ ЗА СА ВІДО СМИТВ САТ СС хо ги их щ пи жи мих их Х дихихдих ис ям щит ск дм их политі кон Уха ит Ех
У КАС НЕО їх ОСАД че пАдА Од НКУ е АКО ЯМ ВАЛОВА ТМ Ср АКС КАМ ЕК
Кен На и о Не и он поки км же тує имя ФОМИ и Лео
АЕН АТО БІО ШИ А ЧАК ПЕМО КХ УС ТА АКНЕ ККУ
ЗЕО ІО Мо 26
М-ділянка омалізумабу - константна ділянка капа-ланцюга, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом
Еш Кия І това МОМ УТІ В СЕС СУ ММС
Кеди жЖААВЖТВОУ БЕВЗ ТЕР КТЕВЛІ ОКО КАХ КК МЕНЕ КЕ кими ех ММ пи М. Ух ий спі г жи ПУХУ ЦИ А ТОМИ су туф и ТОМ ШО МИ ЗШИТІ КАМ ВИ зи ТЕМУ ЖЕ БУдлрВЕ Вер Ко тАУУСЬВИММ ЕТ БАКУ зі ККУ КІ ГЕМ МИ ЕХ теж фени ниж миру тр юю ств п УМ ун чАа КУ клтууми у ЯМИ і
ПОБУТ К КОТУ Б КТК АІЕК НКУЗ АСЕКО КБ КК БХЮ Мих
ЗЕ ІО Мо 27
М-ділянка омалізумабу - константна ділянка капа-ланцюга, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом діри? щодеМмотеМИх ОХ їз цези му ЩО мети рими МЕ о прмучтеччриимиую мими мину й и в Клея га СКК КИ Кона Кр и МИ х Корея но ФОН Мекш о и д ЕІ семи муч в жу ми и ми и УЮ ИМ КОХ Ки мок Мму пути жи АТМ ДИ Осо ж у АК Ох
ФАКТАМ Ми ж А УА КБ дих Мо мин в МН А я КИ ит тити в ен Анонс кон я пет МВ ут тт х ДІУ: ит ит тю п нн о ко і В В В о ВК ВІ М В КН І В С М З ОК молю М пеюцихтхииих мс лупу я зом ми шу па а о А НН Ан АК ан о ВН п п м Мо М В В М о о о а ОХ СЕ Ма НК КВН на НЕ а нн і В НН НЯ
ОХ ВН В НА З Я м Ки КАХ на ан аа ин ан Кіл а а ЛЕТИ а а вн і п В М и п В З М ВК ОП а КН ВО КО КО А МИ КО М МН ОК М ЗКУ КОЮ м хи й яд тики дути дже и в Те м мою у Кр уче Ким Жовч ЕМ КМ щирим
УА КЕ ЕК ВКМ А КАНА КА Ву М МАКИ КК МАЕ КИ М ВАМ АМ КИХ пн Ан НН А ни и в а А НН
Со а и НК в Но В т КИ В ОА м а З Я МА
ЗЕМ уми ту уми ен та В ВА А а пихи их КО кети ит тихо Де о ен Мотя ЕРЕВАН ЕЕ МЕ и КК АКТ АНА МК ня ХАСКІ КЛЕМ слу» ку ух в СК ую зи и 00 пет ок ВИМИ дови Ту ту зу у ит и В, ТТ В и нич ис м а и о м В В В п в А В МК СВ В В В В В ИН М С УЧИ
ТОЮ ит ЕК аа ри ОА НА о АН А НО ОА І АНУ п а а а А а Нв п и КЕ
ПАМ ММЗ ЕМ Ер Аа А ів МІ ВА ІРЖА МСГ АМКУ КАК Мох йхетх вих и и КА МИХ и жи ре вод Ед у дух и мух ки мих ие зу жсти зими
ХАТКУ А ШЕЕМ СаО ІА КА ЕКНАМЕНХ КОКО ТУ НИ КВ КАЧА ААУ АКА ож МКМ ен Ан а НВК о т в
Мед А КД МК им МИХ еконо сом о а А и М и Чо и оо А ПИ со и ЗИ А ЗУ
ЗЕО ІО Мо 28
ТК Ж хИ те щсетиЗруюятиу. и
МАХОМ МК іх хх ліх км «Ока
ЗЕО ІО Мо 29 вавоплувжінь пажмм
ОА Мих и ме КОМАХИ
ЗЕО ІО Мо 30 он НН ана ТИ С МІГ Н х ще аа ОН Я Кия
ЗЕО ІО Мо 31 чено де МІ
ЗЕО ІО Мо 32 я клоую их мах и МТ порі среди С шМСЄ ТЕТУ ТЮВВТ СКИТИ и
ТМ Тс Ду ЕИ Ер рр и у СОТ УуШе УМ Ал 2
МЕМ КМ аж ХК МОМ КАХ ШМК КОМІ КОХ
ЗЕО ІО Мо 33 пи МТУ ек КВН
ЗЕО ІО Мо 34 га А хи Ж КИ
ЗЕО ІО Мо 35
УЖ У ту ти ж од ех житах У Срок полу юю Ки КА м ня яку ол сщоєнчс у жом
ОНА ик зи В АМІ НЕ ООН Еліт У у ДН ЯН ЗНО ие Ач аа
Мал к ки момиуи деле МКМ МОБ ак м тілі ДСК АК ТЕМ МА ХЕ ММ Я Мк
У хКІВ М З КИ ИХ ЗИМУ ЮТЬ сМмсу. М ШТ ЩО Т МАТИ Де УЗИЧ АІС И ОЗу шОр ит ун щх
МЕ КИ ше АВ КВ МАМУ БЕ а ШІ ШИЮ КО КАВА ІА
ЗЕО ІО Мо 36
ТШТуК ВИиМу КН ИУ су их км т ОТ ше ЕМ СУ их оту кИл МУ и МУ ЕМ Ел ТИ щем Вих
ПЯЛЬМ.ОЙМІ Мом ми СМ УЦИляА МОФПХ кА меМиКИМХц я МшхУ мкі МА Ха пеАЦУхМ ект кличу МимУгі й МІ А пох
Ор ен он он с ев с о На НН ва он В а о АНЕШНАВМ нка А Знав АК
ТАТАМИ НХМИ УА БИКА АКА МЕ МА МАЛИ АВК БОМ Кл ж НА М МІД ДЕ Иу мУп ТХ иа и в в и НН НИ НИ он зи зов ее и ВЕ М С жи Хо ск Я М Ко М а С А ВИТ З МЕ ВИК ОН В В ВО М МИ ВН М ЕК те ен а ж о по с и м м нин а п і с р м п п и м а с і М не я
Н ї і г Ед Сі : пп мМ І : чех пи и ВЕ НО С Ки ПЗ пе ев о Кк НН о о М Чи но У в о ке НН и в КК НА КИ Я ше КК ИН упо кий ЕХ ДИМУ ІМ: Кк жлепих дір щих ПОДИХ Хе І диму й ЕЛ А ГХдИ МИЕЗКтКХИ жих чула КУДИ с МАВ МАЙ ОМА МАЛІ ИМАА ЕК УуМУ СОУ кн Кн МКК А МИМО АНТИ аа АНА Ну А Ан ОНА В МАО. подих
УМА кл ФЕВ АИА КК ВМ КАХ ЯМА К У ЗКУ, 0) ЗЕО ІО Мо 37
М-ділянка з 560М 577А О079АЩ, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена галію ДУ того туда м хо Кур мууєиМ тов моудІхУЄЮ ВІЧІ мч усу юТИЮ ус Мних
ЩПомкжоки КОранЯ: опо МошлеМ ШО МК о З КУ ки МК АК Я БМ міти ВИТ о а ви о А Ки р ЗА а З а І м ОА ІюЖЦУ ЦИ АТІУДУ ТИ МІ ХЕ Іди Гірки о З СК ОКХ; др жи у ТОМІ У ту ТА пли гуЮ п
ПпИЕКИЯМ М іх мх АД ЕМ МЕ КИЕВА КЕ ЕАГУХУ кон ки Я пУКЗЖТУ МИХ ЖІН Ж пами ЛЕТ А Х
ЗЕО ІО Мо 38
М-ділянка з 560М 577А О079АЩ, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена
САТ ВОДИТИ МИМИХ сті дути ут ДТ? убив ту ие ут тм. Же КЖ Тури у ик и и Жиж в Ему у Ж ДІОДИ
Аг и лам поеми М Ме у хи хи МИ и А о А ХМ ДОК Ми Си КУМ Ки Я ки А А КД пови кт ум им их в Ж ит милу У у, ФПЕТЕТ ТМ дим фе жо рити у ит
Уа А МАО хо АД АМИ КиМУ А Те А ХА МІУ МИ МУ АХА АД ХДУ ХМ КМУ А ХАТИ КА КМ А ни их у и тут а дн о Не п а зАО Нв ан АК Ла ХУСТМТ и доми фл дм тА ТИ ТТ пев и М ЧО А кН КО р и З В В о З МЕ о С ЗК В В М С С В ПИ В ЕН пиву их Кк, зи из и у и МИХ Км Жур же им Су рмуМ уми их ЕВ а еАНІ МОДУ ти ти
ЕМ ее М ЛЕМ чи ЕК БАД М ВКМ Ко чех МКК Ми А ВЗ МИМИ УАВ Й
УЖ ху им мим и мух оиух жит им М их ям ух жири и, Мом емемч оК, шити мучи ши хуМо ВИ Же Мотя о а с В о з НМ а п НК і и В а В ко а ВЕ опохІмн й хи их п рю о иитх тю пт ТІ МИ или о пекєг и ІА ут вно я НК ня и ши и НН и
МІД ДІ МІ, паху, в с тХхІОУчиху а а ІВ ХО жити Ки ММЗ Оле ол
ТБ му СО ен но ЕМ но у М М и п и ОК ВО а КА и Ми ЕМ М МК АХА
ДИТ их ут рити и ЯМ кути ит или ус и мук
НЕ В НА я а ТАТА, хиба ее Ек АТАКА ДЯ ЯМА ЛОЖКУ
ЗЕО ІО Мо 39
М-ділянка і 560ОМ 5778 О079В « константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І 154Р том ру УМ УТ. Ж СК Од ХУ МУ М Ж от ид М ит ТУ хижих кю ЖИМ ол оон но ши ком и ти ор р ЦИ ТМ ОК ЛАИ а УМ ін шо у м Фр ГЕ а ЕЛ; НЯ можем мМ М ку ДУ АКИ УКХ ДОА МОДА М БК БАБУ КА І ДІВО ЯМ іа вен нн ик НН в Нв в НН
ГІЛЛЯМ МИТИ: сшрутг УТ МІЯ Ці АУу ХЕ ря кА сизим милу у мчали те
УМ а ЩА М ЦК КІДМАН УА ЖК ХО МКМ ОМ ШО У МАЮ ХМ В
ОДУ хи ши ит АБИ ДИТИНІ пит ук улии У єм шт КІ Кт У мих м Му вУЄХ І МЛМ МІЙ ПУ Ежен яю к х
Божу м щи дит МІР шим Тор ВрА ШІ ФІЛІЮ ІК шу ТАЄ у т
ОКУ ЮА ЗВУ А ЕК ХА ХМІМХ КОКО Я М пі КІСТА: у РЕ м дош БИК МИ ху ХМ
СИтТУтоМ то ще У лтох ФМ и ух ХВ Укл ЗД и ту ху вид пу М вжи шиБтти т цу у ие ен Вик ни не КЕ НИК В шк а
Ан кН а Ока п о З ВД Но я М С ВОК
ЗЕО ІО Мо 40
М-ділянка з 560М 577 О079А ж константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе
ТТ ДИ дути ум Ту я віт В им МИ уми М тюки и жу иичи сі гуму тю минути ж Ми му СВ Ах а а А а М Вч ВК Я а о о и о о о в НН В Я КЕ Не о НІ оС ен а НВ пеки еКУм ЕЛЕМЕНТІ М КУМ м ов у ть пос узи мимо вх суду ин ух режи ен о м ев о а В В В а ни В о Во МО а В ПЕ З І о Ко о Мр м НИ ни А М о и о З ОН Я
ДИ ХЕЗВМ М Вус тих Ж В щи их в В Вих пр х з у ку уник шими в ие м их
ЕЕ КМ У КАЕІ КАЕМНАЕНа М дме та Ми СИ МЕНА УА КАВУ МАСА ЛЕ МАЛА ИМУ
ІП ут м Ех мих ОМ В ВИМ. МАТИ и ви учет сизим. ух вими мульти йти реве на ж мк о пе и п В КВ ее З т ви а ВО В ЗВ ОК я ВИК ОНИ В р а р М М и В ЗВ
КАНА АНА а НА НН
КК и ока сек а о ПО а СИЧ рек и Ов но оно ор ча о Ко АКНЕ КИ иа а а о за о Кан в НА З НИЖ мощет Му роки ри и ки, УУжх пл ту. функ т
ФМ А АХ ха БМВ КУ хх ха Кок ЕХ Мо ВУД ОА УА Ж ГАЛА Мем ЧА М КУ пІбжхрУхухииуух жк их рт х ТІНІ вУ у х рих тих ухеуТИ ВИМИ КМЗ
МСА юю ЖАХ МО и АК А А КрНУ мк КА ААУ КІ КАХ КК
ПОПУ ИМИУМ И фу ЕК и У ХО сф ит о ЕК пф В тити. жи ду оф и УМ су и и СЕТ ти
АТЛАС ТОЮ АГСССМОАМА СЮ ССАВАСТА СПАС ТО АГТАО СОСОБОВАТОВ
СИМ м дж тУхИтих силу ми КВН КК А дим минут ФМ А и В ТИН м МИ АЗК МИ СХ УМ и ее ни ак и ве и а м Во с а В В ВХ М ВО а М дили узи м пи жмут жор тю оре я нь в но Он о ШК Во АН АННИ НН ОВО ро Дн НЕ Б ОКА а о НН А ов КК Нора о Ко о в и о ОА НН о и а А ти ХИи их мух Мих м м моє ум КУ и м хз мити жим М, ум мух з а и а і о м ДК ва М М В С А о ОК ек о ЗК Я М о ль ТК а ВНС МКЯ
ЗЕО ІО Мо 41
М-ділянка з 560М 577 О079А ж константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе 154Р, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом (за Кабаї)
Мвт гу шар ду куут буглпустіуєстяя вілли сво хо Дату у ІБ АХ ДИКЕ У ИТУ
МЖК Ки Ж пою ОБ кЛІМО жк Я В. Кік ака ВМ УКНУЮО УТ АЮ БК МІК МІК ж КР КИ дети ми ву ж Кох МАЛА МУК Ж кибу тити ви схе М ШУ Я вк у жу тА КОМУ и уми уд іму В
МК ТІ А НН НИ ТОК их пу МІРИ ХУ: ар Мі г шум ШЕ З они ЮРЕ КОЗозхмахма ММК Кіз ха м АК НИКА ХХ М. ЗИ А КН МЕ мк в вив щи о ж Ту г У И тУута м ту Ди ю. дю топ Кт ик ДУ. сти мі жу тла тутт тих 0 пи ЕРІ тА ВІ утік
КИ МК що у в ак ач нан пф м КМ: ПУ то АК ККАЛ ОМ УТ КТК
ММ КОМ лика АОЖЕМО КУ КОД КО СХОКІК МИ КІ ОКОМ У У МАК КК ОХ ЕК МЦІУ МОЛІ АТХ ти доти пути шт йхутуМИ ФЖТ шт Ст ІЖЄч У тя ци юри 0 пет цим сих т уми ІМ фидж ет тт и
У ЕІ МИ ТЕ у пола нач еВ ОМ КАМИ шк діти ти т м ит у ЛИТІ хитАйТнХИ М 1ОТМІАИЙ МЕ ЛИШ М ТОД ік кА МКК Тв ІІ МУ ВОЗМОпоМ КМ ул ХО КОТИ КОБИЛАаИ
ЗЕО ІО Мо 42
М-ділянка з 560М 577 О079А ж константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе 154Р, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом (за Кабаї) ти дою сих дими ум ми КжмизАМимуюм черви гумусу ситу ин им ие й тик ІК ДІЙ змо вим Ян Й БК нн а АС АН МА НК КА ЕМ ВМ Х сви м жест азу им ооо нь а нь и схвально и и кт В А о в В І кН Ди а аа
МА БУдкМ Мк ВУЦІ М аж ЕМ ММА ЕМ А КАК ші мих АКАД ОМ у М АК КУА МТМ че РЕЛЕ УЦКХ ит пз ких учи КУ и сід вх мих век ди уд хіІииих приз умпт ИХИТИ росі кеуех при а оз вал я на а и Кк оо а ве В о В І ОК о п я НЯ ках ев а и КН КИНЕ НУ сн а и ОТАК Мови ух ж у Ул сИ жур жим ІК и жу ЕМ ХІМ ТММ СА ЕМО ХМ У ЩИХ атути и или
Яхти ОЕМ УМ МКМ РМ МА хи ши ВК ВУ АХ КАЛ А ТУ пЕху дір еМ емих Ему У ихуИиУІМ и А их умер ги им и де ичуМ Кит УМ сизим уиюр м чт в спр тих ких вити хх ж МЖК АШКМ КК, ее уж ба мити ИНА АТАК КВУ НАША В УК КК КА АНА
МЕТ ие Ти рути и и и у ду и р ву су их о А зо ан АННУ тил: оуамиимми б Ушек АОМИ МИ А ЖІ А ЯМУ МА МІ хи МУК ЕМ М Мом МИ АКА Кухня МРТ ГІСА АХ ОК ги чию ж и п я межу Ен ж пити де мив ПАК ит ж птах ие жу ин твер МАМА ик ІК у ни В о и п но М ПИ КК В о МН в м м а а и п В з В В ПО М пити у у У тугих жит т Кук ил ж в І МУК мязи муимусит жі ре и сит рис ММС ТО не а мн и п а КК в М па и м в во о в и В Ж З В В ВОЗ З Я ВЕ В В ВСЕ стримує у и У я, СТ то у а ця Ус В ІДИ прі КУКИ свт М що ит т, пуху мих ие кв
ОКОМ ОАМК мехемийкх ЗГУСТКИ ЯТЮК А ГАС ВИК ЗАКО А КУМ ММ ЯТЬ МИ мети А ЦЮ МАК А УМ
МЯКІ М ЕМ ми дО плит М ри вих А дих и и и Ему Ки ки и ек кур жд и ит
ЕК ву М АКБ СОЯ ОКО А ВОМ и В З и М В С СО НО В М АК о НУ ую Ся и ім, мих Вподомеи их х у ту т у кт Пе воша нн наново мих и ум учи м пут тити ут АТ
ЛЕ УА гіпо а ве чи нн а КЕ ЕНН дО АН ІІ ді СТУ ду хе ДАК МУ М яЛЬ Ся МАЛЕ АМИ А. Мі муки КИ Ек код НАЕК у КАМ и и АЙ МИМО КК МА УМ у шу и дими. Кум усу жу имя дО КИ и и УМ С М КиМУ ти Ту ис, зей Мк ми АЖ МКМ ЛОВУ ААУ ан ОА МОВУ яка З КО МК
ЗЕО ІО Мо 43
Ух жу мату КИ ши жир ТІ Ж МУ Фо 0 йЖю чех АНУ ух м а і КИ м А У У щу у я
НОМ АТОМИ І МУК БИК ШК М Оки МАМУ КАХ ЛА мя
ЗЕО ІО Мо 44
5ЕО ІО Ме 45
ЕВ ІЗ З 0838 (РОВ) О79В (за Кара) в ЗЕО ІО Ме 46
ЕВ 13 З 564М 5818 (РОВ) 560М 5778 (за Каба)
ЗЕО ІЮ Ме 47
ЕВ ІЗ З 564М 0838 (РОВ) 560М О79А (за Кара) шоувмекзсло сОтТПЕТІІй ЗІДРЕОКАТУ Ж
ЗЕО ІО Ме 48
ЕВ ІЗ З 5818 0838 (РОВ) 5778 О79В (за Кара)
ЗЕО ІЮ Ме 49
ЕВ ІЗ З 564М 5818 О838 (РОВ) 560М 5778 0798 (за Кара) пебмаклспе ВогТОттІтІВ ВІВРЕОБАТУ УС
ЗЕО ІЮ Ме 50
СОВІ 2 З 5560 (РОВ) 5520 (за Кабаї) дАПУТЕВ
ЗЕО І Ме 51
СОВІ 2 З 556Е (РОВ) 552Е (за Кабаї)
ЗЕО І Ме 52
ЕВ ІЗ З 571М (РОВ) 567М (за Кара) пувлвкссії спот ттв «ФрровЕдтуУ то
ЗЕО ІЮ Ме 53
ЕВ ІЗ З 564М 571М (РОВ) 560М 567М (за Кара) пуер МОТИЕТІТІо ЗООВЕОЕАТЖ КО
ЗЕО ІЮ Ме 54
ЕВ 13 З 5818 571М (РОВ) 5778 567М (за Кара) перчвееско МОГО РІВ ВІОСЕОвдтя УЄ
ЗЕО ІЮ Ме 55
ЕВ ІЗ З 0838 571М (РОВ) О798 567М (за Кара)
ЗЕО ІЮ Ме 56
ЕВ ІЗ З 564М 5818 571М (РОВ) 560М 5778 567М (за Кара) пурвевщсви МотОттіття ВІЛРЕПЕЛТУ УС
ЗЕО І Ме 57
ЕВ ІЗ З 564М О838 571М (РОВ) 560М О798 567М (за Кабай пувувтасв МотОЕКгтІттх сІКРЕМЕАТУ УЄ
ЗЕО ІЮ Ме 58
ЕВ ІЗ З 5818 0838 571М (РОВ) 5778 0798 567М (за Кара) порзвЕцило МУРОЄТІВтаЕ ВІБВЕОТАТУ ут
ЗЕО ІО Ме 59
ЕВ ІЗ З 564М 5818 О838 571М (РОВ) 560М 5778 0798 567М (за Каба)
ЗЕО ІЮ Ме 60
ЕВ ІЗ З 567У (РОВ) 563У (ЗА Кара)
БО ЗЕО ІЮ Ме 61
ЕВ ІЗ З 564М 567У (РОВ) 560М 563У (за Кара)
ОсТЕМЩЕУЄСТО ЗОТОЕТІТТІВ ВІОБЕЛЕДТХ У
ЗЕО ІЮ Ме 62
ЕВ ІЗ З 5818 567У (РОВ) 5778 563У (за Кара) вв СУБЗВЕТСЕО ВОТОЕТІТІ: ВІОРЕОКАТУ ХО во
ЗЕО ІЮО Мо 63
ЕВ ІЗ З О8З3А 567 (РОВ) 0798 563 (за Кабраї) шчешвЕЖхсО ТИ КгОгІВ ше АГ У
ЗЕО ІЮ Мо 64
ЕІ з 564М ВІВ 567 (РОВ) 560М 5778 5БЗУ (за Кара!) зУКВщшЕУСЕНІ РОКІ ОБОВ АТУ ХЕ
ЗЕО ІЮ Мо 65
ЕВ ІЗ З 564М О8З3А 567 (РОВ) 56ОМ 0798 563 (за Кабаї)
Пре СТО ЕТЕПІВ БІС ККЕ
ЗЕО ІЮ Мо 66
ЕВ ІЗ З 5818 0838 567 (РОВ) 5778 0798 563 (за Кабаї)
УВО ОРГ ВБЕРЕ Аг К
ЗЕО ІЮ Мо 67
ЕВ ІЗ 3 564М 5818 О83А 567 (РОВ) 56ОМ 5778 0798 563 (за Кабраї) пев Ммекжсв га КгОгІв ЕРА У
ЗЕО ІЮ Мо 68
ЕВ ІЗ З 58ВОМ (РОВ) 576М (за Кабаї) шУКиАЕКОо За ТІМ ОВ ЕОКАТУ У
ЗЕО ІЮ Мо 69
ЕВ ІЗ З 564М 580М (РОВ) 560М 576М (за Кабаї)
ПУ мІ ші М піс АГУ ТО
ЗЕО ІЮ Мо 70
ЕВІЗ З 5818 ВОМ (РОВ) 5778 576М (за Караї) шУувшНЕООс СТОКОМ ВО КАТХ ТЕ
ЗЕО ІЮ Мо 71
ЕВ З З О8З3А ВОМ (РОВ) 0798 576М (за Кабаї) зн ТО СІМ КІВ РЕМНАТУ УС
ЗЕО ІО Мо 72
ЕВ ІЗ З 564М 5818 580М (РОВ) 56ОМ 5778 576М (за Кабаї)
ПУЕ ЇмУ МЕТО ЕМ ВОВК АТУ
ЗЕО ІЮО Мо 73
ЕВ ІЗ З 564М О8З3А ВОМ (РОВ) 560М 0798 576М (за Кабраї)
УМО ПЕТ ТЕМ КОВБАС
ЗЕО ІЮО Мо 74
ЕВ ІЗ З 5818 0838 580М (РОВ) 5778 0798 576М (за Кабаї)
ПУЕ БТІ М БІВ ЕАТУ то
ЗЕО ІО Мо 75
ЕВ ІЗ З 564М 5818 О83А 580М (РОВ) 56ОМ 5778 0798 576М (за Кабаї) шуми БТІ М БАБКИ Ус
ЗЕО ІЮО Мо 76
ЕВ ІЗ З 58ОМ 567 (РОВ) 576М 563 (ЗА Кабаї) шпеУвсЕЕтсво БТІ гІ М іс КАГУ ХО
ЗЕО ІЮ Мо 77
ЕВ ІЗ З 564М 580М 567У (РОВ) 56ОМ 576М 563 (за Вабаї) пика ТЕНТ М БОКОМ Уго
ЗЕО ІО Мо 78
ЕВ ІЗ З 5818 580М 567 (РОВ) 5778 576М 563 (за Кабаї)
ЗЕО ІЮ Мо 79
БО ЕВ ІЗ З О8З3А ЗВОМ 567У (РОВ) 0798 576М 563 (за Кабаї) шУВИМУжЦи ЩО гІМ ТВА о
ЗЕО ІЮ Мо 80
ЕВ ІЗ З 564М 5818 580М 567 (РОВ) 56ОМ 5778 576М 563 (за Кабаї)
ЗЕО ІЮ Мо 81
ЕВІЗ З 564М 0838 580М 567 (РОВ) 56ОМ 0798 576М 563 (за Кабраї) ше лнО ОБІГ ТІМ БОКЕКОТАТУ УС
ЗЕО ІЮ Ме 82
ЕВІЗ З 5818 0838 580М 567 (РОВ) 5778 0798 576М 563 (за Кабраї) чув жс ОТО ЕгОТІК ВІКО
ЗЕО ІЮ Ме 83
ЕВІЗ З 564М 5818 0838 580М 567 (РОВ) 56ОМ 5778 0798 576М 563 (за Кабаї) пУБатьЕ чл БТ ЕТОТІМ ВІЗА ж
ЗЕО ІЮ Ме 84
ЕВІЗ З 567У 571М (РОВ) 563У 567М (ЗА Кабаї)
УКВ МУК БІК КО КАВУ
ЗЕО ІЮ Ме 85
ЕВІЗ З 564М 567У 571М (РОВ) 560М 563У 567М (за Кабаї)
Мем МКК БІС КАВУ ТС
ЗЕО ІЮ Ме 86
ЕВІЗ З 5818 567 571М (РОВ) 5778 563У 567М (за Кабаї)
ШшШУКОЗВЕХСЕ МОГТИ КООБЕСЕАТЖ У
ЗЕО ІЮ Ме 87
ЕВІЗ З 0838 567У 571М (РОВ) 0798 563У 567М (за Кабаї)
УВК МУБОЕГТОСТо швед
ЗЕО ІЮ Ме 88
ЕВІЗ З 564М 5818 567У 571М (РОВ) 560М 5778 563У 567М (за Караї)
ЗУВМКЕУОаЇ МІУГОЕТотТІ ВІОВЕСКАТУ С
ЗЕО ІЮ Ме 89
ЕВІЗ З 564М 0838 567 571М (РОВ) 560М 0798 563У 567М (за Кабаї)
ПУЕ МОГО ЕГИ А БІВ КАКУ ЖИ
ЗЕО ІЮ Ме 90
ЕВІЗ З 5818 0838 567 571М (РОВ) 5778 0798 563У 567М (за Караї) шУукввактса МГ ТОтІМВ ВВЕ СЕДЕХ хо
Ко) ЗЕО ІЮ Ме 91
ЕВІЗ З 564М 5818 О83А 567У 571М (РОВ) 560М 5778 0798 563У 567М (за Кабаї) шчвеЕУЄТИ МОТОР УугЕ МЕРИ ЕдІ У о
ЗЕО ІЮ Ме 92
ЕН ІЗ З 580М 571М (РОВ) 576М 567М (ЗА КарБаї)
ЗБ зУувавЕшОсс МОТО ЗОВ КАГТ УС
ЗЕО ІЮ Ме 93
ЕВІЗ З 564М 580М 571М (РОВ) 560М 576М 567М (за Кабраї) ую МЕ що Маг М Іо Т тТ
ЗЕО ІЮ Ме 94
ЕВ ІЗ З 5818 58ВОМ 571М (РОВ) 5778 576М 567М (за Кабаї)
ЗУ МОТО гІ М ВІСК то
ЗЕО ІЮ Ме 95
ЕВІЗ З 0838 5ВОМ 571М (РОВ) 0798 576М 567М (за Кабраї)
ПУБ МмУгОЕТУгІМ праг ж
ЗЕО ІЮ Ме 96
ЕВІЗ З 564М 5818 580М 571М (РОВ) 560М 5778 576М 567М (за Кабаї) суки МОГ ЕТОУгТІ М БОБЕР С
ЗЕО ІЮ Ме 97
ЕВІЗ З 564М 0838 580М 571М (РОВ) 560М 0798 576М 567М (за Кабаї) 5О шва МЕТО М ИВВЕЛЕАКХ ХУ
ЗЕО ІЮ Ме 98
ЕВІЗ З 5818 ОЮ83А 580М 571М (РОВ) 5778 0798 576М 567М (за Кабаї)
ОУРЕВРОСЯО МОТОВЕТЕТІМ ЕВРО АТУ УС
ЗЕО ІЮ Ме 99
ЕВІЗ З 564М 5818 О83А 580М 571М (РОВ) 560М 5778 0798 576М 567М (за Кабаї)
пУКОвКЕУ МЕ КІИБІМ ВІДЕО АТУ хо
ЗЕО ІО Мо 100
ЕВ ІЗ З 58ОМ 567У 571М (РОВ) 576М 563У 567М (ЗА Кабаї)
ПУЕ МТК ОТЕМ БЕДРЕСКАГТУ С
ЗЕО ІО Мо 101
ЕВ ІЗ З 564М 5ВОМ 567 571М (РОВ) 56ОМ 576М 563 567М (за Кабаї)
ЗЕО ІО Мо 102
ЕВ ІЗ З 5818 580М 567 571М (РОВ) 5778 576М 563У 567М (за Кабаї)
УР К Мами М БІДЮК АГТХ С
ЗЕО ІО Мо 103
ЕВІЗ З О83А ВОМ 567У 571М (РОВ) 0798 576М 563 567М (за Кабаї)
УВУ МОТО ВІДРО КАРУ ХО
ЗЕО ІО Мо 104
ЕВ ІЗ З 564М 5818 580М 567 571М (РОВ) 56ОМ 5778 576М 563 567М (за Кабаї)
УМО МУ М ВОВКА УС
ЗЕО ІО Мо 105
ЕВ ІЗ З 564М О8З3А 5ВОМ 567 571М (РОВ) 560М 0798 576М 563 567М (за Кабаї) шити МУГОЖгОоТІМ БВ КАГУ ХО
ЗЕО ІО Мо 106
ЕВ ІЗ 3 5818 0838 580М 567 571М (РОВ) 5778 0798 576М 563 567М (за Кабраї)
ПпУкШКЕЖНО МЕТО ТІМ ВІКО АТХ
ЗЕО ІО Мо 107
ЕВ ІЗ 3 564М 5818 О83А 58ОМ 567 571М (РОВ) 56ОМ 5778 0798 576М 563 567М (за
Кава!) пак ОО МУК ІТІМ БЕК АТХ те
ЗЕО ІО Мо 108
Використовували людський ІДЕ-Рс дикого типу (Сє2-Сє4-домени з нумерацією М224-К547 згідно з Юотіпаїоп 4 Веппісп (1978) Іттипої!. Нем. 41:3-25), що несуть мутацію С225А; примітка:
Зо у кристалографічних експериментах наступні мутації також були вставлені у ІДЕ-Ес для спрощення профілю глікозилування: М2650) та М3710 (знов-таки, з нумерацією згідно з
Ботпадюп є Веппісп)
УВК тЕеТ КІМ ЕЕ гі ЗУЄ ТЕСТИ ФУ МУ А шани ТОМ НОВЕ сУБТЕУОСНТІКЕ ПУТЕКОеОМ ЕС УЄАХКОВ пет сЕТЖОоСВУТН СНІВ АЦЕВЕ ТІКТІОЗСВВАД ВЕУ АКАТВЕ ВЕОЗБВККО
Во ОаМЕщиЕ пСошусжоиМЕ чо реОАЕНех тореЕТКИВО КУКИ Бо яЄ
ІсвАтУнЕВАВ ВООотТУСКАОУВ УМО
Легкий ланцюг
Еар!т
ЗЕО ІО Мо 109
М-ділянка з 5778. 0798 (Раб) пам виИ ЛАВУ ВХТ ТТБ АТОВМО ЗоПЕеММиХ сИЖеоКАеК СЕРА МКК сУвавЕщОО шОРОЕТІВ вл КАВУ жЖсОСсиНЕВеХ ТЕО КУКТ К
ЗЕО ІЮ Мо 110
М-ділянка з 5778. 0798 (Раб) вро ше соювВ сто А С ТАС АЮ АСВ АХ САМОМУ АС
Пе а АЛ са КОСА СТАРТ АЄС ССО А СОРОМУ педа аю САМЕ Оса ЗОЗ АТТТОАСОСУМ САЛАТУ
МАТОМ СПОСО АС СОС АС ТДСТОССВАЄС ВУСІВ АСИСТ АТ
АПК АОС АЛОАА ЗОБА МАТО АВ
ЗЕО ІО Мо 111
М-ділянка з 5778 0798 (Рар!'), де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом
Вико м М НК а оо НН В В Во АННИ КН КАВОВА В НН а ЕН КВК ЗИ
МАЖУ но ще ши ши ми ДВЕсема ЗМИВУ САМУ ШООУ МИХ крови Киих ла У ВОМЕсрхсМ ТтОЕТОТІшВІ ВЕК СОБКО
ОС Е КУКИ
ЗЕО ІЮ Мо 112
М-ділянка з 5778 О079А (БРар!), де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом думи що миМміучимитих о тує щу мучити ЩІ 0 митр живити мету КМУ еф Уже суттю 0 Жим и ут ВМ МО тру и МУ КИТ
Еш он а НО НН ЗА ПАН В к ИН и А НИ В З НА ВЕН а еф и А ЗНО я В ЯКО ЗІ
ШЕ ШМИ Ж Еш щи М І УК АКАД ХНУ о Удома пок М МІ КІ Кр их мухи сша Мем Крах мих М БА МУ М МІ 1 АК х п: МАМА ХМ ме Мн
ЧО НАС НІ ЗАСТ АТ СІВ СТ БІ А АТ УК ВОАС
МОМ и и ми ан в в во пи а и нн І ВА и НН С аа з ЗАЙВУ и В п и АК Ан А
ЗХ и ІЕМ УК ВІКУ МК АДАЯ МІЛА МАЗКА Ки МА ки М А МЕЖ У АИВЕЧИД КМАКАМ
ОСшШРЕСАЮ С ТОСТІВ АС СОУ НВ АСОТБАРЕА СОЧІ АКСК ВТО АТ дашисиов ВШ Ае Краси СА РОю АС АС СТИКУ
СПОН А СТАЛИХ ДАТ САЛО
ЕРар2
М-ділянка омалізумабу ж константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І 154Р
ЗЕО ІЮ Мо 113
М-ділянка Барг
ПІСТ ОшешВ БАБУ Х ТТСВАВОВУЄ ЖІН ММ осКкеоКАеКе ЦІ ААУ шив ЕВОВМІ ВОСТІ БОБ ЕМТ тоне ФАК КУЮЕ Кк
ЗЕО ІЮ Мо 114
М-ділянка Барг
ПДАА Яд А ССС АЕСТЕА СВК Т ПД А ТУТ АЛІ
САС ТЕН СИ ОСА ТС ГАС АСОМ АРТ ОА ШЕЛЮТКН АТ пт ут ТУ МИ ЄМ В Тут им лу ДОТИ ри мМ М А ав ось МОЛ ОНКО Зичу паси Ви ои САТ АМКУ КПА ЕЕ ОК АКТ Я ПІТ АОС ТЕКА АД
С а Б СН АН ТЛ я КОВО АЛОЕ
ХМ ЕВ сидиш СПО АСТАХОВА
ВОЛЯ ТОНКІ АОС АВ ВА ОГС АЛАТ ВМ
ЗЕО ІЮ Мо 115
МУ-ділянка Рарг, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом мами сколи гост тую ото о пшлнутуінит ст) оту юєЄиі тру ЗД Мудии ем
МОЮ кл Кохан СКАН КЕ КАМ МАРКІіДкІ кА ха БУ УТ УЮ КЛАСНА КІ мАИХАХ МИТА ХО
КкрОсКавКоО МАУ кшВЕновоОВО ПОЕТІВ ОоБЕБЕиЖчс ЕЕ
ОКУ КЕ
ЗЕО ІЮ Мо 116
МУ-ділянка Рарг, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом пІМ мое мхуцттим Три миру и и МУ Муки МУК Ер пит ер р я тер ул жи ХУ хомути АТС ИКМІ
Кк а о Кому и МА а ко и Кк М І З ЗАВ ЗА ААЯ Хе Со ШИ ОН Ста Во До
МУМЖЖШ У ЕМ ЖІ риси МИ пусти ж ижу их ихух мс житує ми мує и их І ло Ух пут С у ум рекет в а о п и НК ВИ о Ви Ка М ВО В М а и НК а АВ Ма а М В о Вик а В
Кн СКМ КН НО СК ДВ а МКУ АСВ СУТ ХК СКМ КУ
АВІА ВШ МАВ ЕКС АКС ТАШНОСТ САКАСКТСЯУ КАСКО КАН мУгЧУУЄТІВ ММ КИМ Мер чуєі Ми им Сх пити ДІ тут ру жит Кучерук тА дих и УТ юю и и уки жк АДЕОІЬХ жоухи МадевкдячйииИ СА иМиа АПВ ж МИ ДИМ Дол ТОД КЕ ЖК М ОО АК МАМІ МИ спаси ММ КІНА АСУ АСИ СВК АФфелюаВеСю СЕКСУ ТЕ
СУД дних о тин ДМ я ходив их тих бут У Ки КЕ АМКУ ху БАК МКК
ЗЕО ІЮ Мо 117
М-ділянка з Рар2 -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І 154Р ле а кана ка ж от и ран о о ВК НН во а ОО ОН ет А А Пе І МИ АК ОА ТА ДЯ т
ПІСОК лук КГБ УЮ. КІНО МОЖ КОВИХ
Во о ка а на а пора ОСЬ а Аа ооо на а рекет рн ов ве они ситет гі
ПУЕ ма ТЕГІВ БІК КАТУ жо НКОХ пЕоКУКЕ КАТ УдАРУЄ тпЕрекИпЕОотК Бога УУЄЬЬ ММК ВЕВКУ СМКУЮТМАРОВ МБО ТЕС ПОКИ щЩтолтт фу пр и у ук тре МАТИ НИ и КІ швИштшиВкаАВХІ ВЕК УХАСЮУ ТНБ МАС
ЗЕО ІЮ Мо 118
М-ділянка з Рар2 -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І 154Р пл зМужм Кти И ИЖ диИ Ху пет ВУ хижих тезу их в ТИ КУ ААУ р а лк о и и а УНН В кН о о о кН о о охо п М ок ов У а
САС поса СшТОССТсАС пАСОДЛОНОВО АСТОС АСК СААСТОКЕ АТ
ПеМЕ и же Ки ВНІ САЛА О СТОК СОВОК СОЛО
ПИ Ле КЕКС п Ом ТОННА ВКА АСВ
ТІ АН КІВ СЕЛ АСТМІ ТАТО ОСА МОМ ОА КУ
ВДТ ЕТОм АСССАВОАА ОТО АВАРС ДВА, тлі МЕТИ
ЖЕЛЕ САЙТІ А ЕЕ ТО АК ОПТОВОЮ ШИ Я СУК НЯ
ЗАГАЛ АВС ОВАОА БОСОДААЩМІТА СЛУ РОІЛЯІ ТОБ АКА
СОТ АВС СОС МУ ПЛАС ЗАПАСАХ СВО ПУСК СОЮ с Не и и ОК ши пу я М од сан оо У лоту тупу отв то она а аа мжуиМ и А
ДЕ Не я Її п їх Я СТ ІА АД ХУ х ПАН АКОТ А МАЛІ ВЕНУ СЕМА а ка и о а нн АН НА ВАН ВКМ том ж вх и мІХУКЄ ІТ СЯ УКВ ВИ КО КИ,
Ко не СІК КК ов Ви НН о КО А о З о М а о о В и З п а Кі й п аа о ЛЬ Я
ЗЕО ІО Мо 119
М-ділянка з Рар2 їж константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе 1154Р, де сигнальна посліДдОвніІСТЬ пІДКреслена та виділена курсивом
МОЖЕ ЖК КМ ОСКІДЖУ дж вл ки джут о гати У землі о те ВИК МТУ ОО ЕМІТИЮ КАК АНЮ ЕТ пижмо Кк им ХМ МА ших схо ШК КУую мі Сепюх МА ую
ВОК ААУ КЕМЕСІНО ТМ ОВО КАТУ Є МОБ ОКЕЕ состТКУЮІХЕ ТУВАРВУКІР РРЕОБОБКОО ТВ5УУСТЬВМ ЕУВВЕВКУСИ КУВМАВОБОВ
Опера Кеш Кто НКУ АСКУТН ОСІ ЛЕВУКИ КМБКОВУ
ЗЕО ІО Мо 120
М-ділянка з Рар2 - константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе 1154Р, де сигнальна посліДдОвВніІСТЬ ПІДКреслена та виділена курсивом муки 6 ут рити І1УЄТТ УКуТ УХЖетІ МИ УЮ Меси ЛИВІ ХУ УК МУ УрекІМИМИЮІ сти и ут ит ЕВ М муж ит І хуя
ЯМИ ки пт Я Ки А МАМО Мо мих ДУ Я я М А ХА и ОО Ми КМУ
ЕК АСК ТРАС ШИ СТО СКЗ А а ВК АСК СИ хи М УДИТ МК Ух межи миті умум и їси ис и вт ди р Ек зими их Ум м ум мих Вих
Ваша КК ее и НН ен и А а З НК МИ ЦЯКІВ ЕЕ А и КА ХА ОГМТ ЯХ хом уми кими М мок лили ВК жу им руси ВТ Шк сус мини и й М зу тих жом смухоих ду з Кв я А В КІН в В НА КН А а а ВИ тихе уми их Ж межу им А 0 у им Му и ЗМЖодут МТМ ит 00 му куки В ему Тр мух еух и их ее и я и МВ М Ж п вк о о В В З Я а М С Ко у ВИ В м М В М В В ВИ я З п ВК С ЛА о ВО
Піна АЕРО АС КТАСТАСТОС ПАСТ ОСА МЕККА пиво А САДОВА ДАРОМ УЮ СМ КАСКО ОАЕ ТК
ПшЕМОАТЛ АОС САТ СТОЮ ВО ССЮСТО ТТБ ОСТ ААГАКО питротродт унизу т и Мити ую пою, мухи КОЖ ух ут и м, ери и ми М
МАСА ЖАХ схе М КА ди Ех КУА КАК КІ У я А УААН Ме МАЯ ЕК АНЯ ІЛ
ТИНУ ВО ЗГАС А БОЖА БАВОВНИ АКОТ СОУСУ
ПАОЛО СИЛА СБАПОМаЛАВ СІВАЛКИ КУТИ
СЕ ІА ПЕКИ НУ Ю ПАСА КРАЮ СИЛ еютіТ
Еарз
М-ділянка з 577А8 0798 (з Рар1!) - константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе
І154Р (з габг)
ЗЕО ІО Мо 121
М-ділянка з 57780798 по аа а п а і р НН
ПІДЕ ОВИВИ БАБУ УТ ДОМА ЗІМОБ МАЕ сок ІА ОО сУувантшШсоо ЗСТОКЕСТІВБ ВМРЕ КАГУ СОСЕН ТЕСОСТКУКІ Кк
ЗЕО ІО Мо 122
М-ділянка з 5778 0798
САГАТТСВОС ТАС СОЦ АВСТОСВ СТЮ КИ Схо ТАКА
МСАТ ТОСТ ОС АС ТОНУС ТАС АССОЮ АЮ ВОГО СТАСЯК САТ АС ро ве о а в о В а ни и, АН птахи І ЕТ М пове за оо З ЧНО оо ха ОА
МЕЖІ ВМ ПІ Ми Ми еАМУ Й УІ и ми МТА МАМ СИ МЛК КА УХА ТУЯ Ми а и М АК АСУ ТУ
ЗЕ ПАСТІ ТС На Ся АК МЕТ ТИС АСОМ 2 АЕН КА АКиасАМ ЮК М ША ПАСІК ВТК МТМО БИ АС ХХ пи о нн и п и и
КАК М таку КА Анни ЇМ А ОКВЕАЙАК МУ ФАХУ
ЗЕО ІО Мо 123
М-ділянка з 5778 О79Н, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом
ПЕВ іде шт тод Х пЖ пе С ШК юТЕ Ек ав он НАННЬЯ Хоб ліІліуУТ ШИ КМ тн До ких ЗІ п Мить
КУА Я ть ие М ша Іа ЕМРЖКНІ МК УГТ ШАЯН МЕ КОХ ВИЧАКО кЕсКАКК о ЗААБ шу шк ОО Торти ЕСЕ АКС ОСНО
Оз
ЗЕО ІО Мо 124
М-ділянка з 5778 О79Н, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом
Ви виЗІМВИИУИХ Зуби ик щУКі меду Мир ем 0 УЖ УМА ІВ Ки ЖУКИ ми ик у т хх ЖІ УК Ту
Думі ті КМ ЛИ В В В В НЕК а А о Ки и а а І В М А «А М ІЙ МИ Мих КОВО Мак мое У ши де таж мил ДО КИ АД АКА А КО ДУ ну ов но в м м о и о в о ЯЗ птвиМихІНУ х УЖЕ оту и тези зи их их ми Мило ІТ хе МТ дум МИТІ. 5 думу ей и НМ хи ЕЛАЦИ КИМ Ех хи хе ХМ С С м и по и М ПО а КН За М ЕЕ ИН на а З в нав АН НН АНЯ на у еп а и в п А Ь В В с АН Ко о з В КО М ВВ ЕЕ ОН В М С о В МИНЕ Я сн НН в нн в о і НН и НН и
СИ МИ и А ИНА Ка НВ МИ ВН ЗО КІМ: ГОД пі ї КМ В ИН А ВИ ОА вна и ев ета ке в и а но нт ЧИ МК Ки НІ С З МІ ММ МЕ я ди о Во В ЗИ В З ОЗ З НИ ОН и КМ
Ку жуЄ им им и по у у их луку ур и ит ит. Оки щулітри т УЗИ Ви ТМ и Ми их нет и це ЗК У ЕОМ М и Ко М т о З я ВК С з МЕ Са В а ке а ФММ ВН З ПО ВК ВВА пожити вик ВЕРХ ди див Втр и А ДІВИ КІВ вини ХМ Ют дет ен и о п зи А ЕН ок ою у КЕ ВДЕ ВИС СК мк о р В о и о у ВН о А м и и о В М Се В
МИТ ит и и В Ду Оу и тю аа Си ик НА Мо З НЕ ОК а Ст о А ДК З Я ЧИ ЯКІ
ЗЕО ІО Мо 125
М-ділянка з 5778 079 -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І 154Р тугухти ші тло три Уч оси ог мг ую мли рчмуромщжші тт в ди цю о нь ММА ХАКІ ОКХ КИ М ОК Я ЯЧКИ Х Ким ММ ККУ У А КК ОТ дз ккухЕ т шити кер и п Ж тів г ОХ лОБуЮТуУ ЕК ДАТАХ мож Ки фД, ВТК УіЗухя рити т аж, дан ДА у и я ша м а ен ча р ПИ Чи сво я Мі х ПТУ ав На гетри «А М
СОМ Епік А сх КАМАЗ Ка МК БК ВУ дод длю МИ ТС. КО ут ки ди рон ока а нн ро Ай А ек око ЕМ о нео
КоКЧлашм Уу т мг д ТУ ЩІ Зо КІНО в МН На и а о р м а НВ нн во
МОХ Ж Ж ХК ХА їх ки ЕМ М Мом ІК КІШКУ ТО Кит УХо МЕ Мк М МО МАИ МИТІ АЮ М КБ
Бела но ен Ек пихи вом н хжиНст є жк ит Ура их
На Тит ММ КК; У мили КІ А ум:
АН о кН т о Во ДК З С В Я о р нив НИ ВО З а
ЗЕО ІО Мо 126
М-ділянка з 5778 079 -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І 154Р
ШОК: КУТІ МУ ми М УКМІ ВХ Х ТОИХ. пемзи ми ж умо МТ и КИ МЕТУ ут ие Ко ЖЖ МІ МИТ тю и ана на о вм А ФВ о М З В СВ В М ОК В В В м я А ЗА В КН со а ВИ ситу Ммо рому и им у у М тими СИРИ Ту ит ри тю СТУС ИХ и А Зутяу ит шум СИ дк Ту ЖИ ит то пов я и о В С Зо о М р о М В ДВ М В а КЕ Во УМ ЕК а и о о а НК В На м сю о В а и м п м и а Во пов мс ВИМИ Си хЕМ КЛ МИ жи умо СМ МІ Му жі са кет ут и уми лит ЗЛ тт на ен в и ВК НН У НН а СЛ В НЕ ВН ЗМ Ве
СІМ ОтМиМЕИ и Ми мА ОЙИМ ИиМмМУ чую Иих тихо Ми жи М тм мтТИИ им ит, ПКТ УКНтТ тих кит пове т ту у РК рт
УА 1 а о МК НЕ Ка о ке ЕОИЯКІ пом Мих УА и ЖККОА Мини нн и а и СИ ки вв і нь І са Ва ин на МЕЖ Вижити и ТИВ ли и МИ им тут им Су, ан нн СКУ
МІ ги щих ПВ лен ви НКУ пЕПтЕУ Юм ПОЕТ еВ в ВИ А о м м С и ВВ жала им МАК ЕМ Ю МА АА АКА ВК А ЯИ А ТЮ МІ УА БИ ХМК ДК КМ ит А ша СНО дизІМмиит м ис им жи и МСА пост у тю и д оти суиут иИу у и и КТ У еМО и о ин пр не о о м С о оо г а НК оо Ко о М В зв і В МК В аа ран чи и я ьо ОК ОВ Я ди між ивиих КУ ВІю чім КТуєтом Ми ВА тиру у МІХ, УМ ухилу их Ку
МСЕ СЕС НІ а АВА СТКАВСЯС АЕ КЕ БІЖРО ЖУК ка УЮ хо пом сА Ту ху У ее неви в льш оо ПІН ЗАВ И ВВ Н НН І о А ОК а НН З в а ВН
ЕК Ам ІЕ М МО ЯХК Ос ВУХ АД КН А ВУ МЛ КУА ДОА ЖАКА Ми МА а оо НК АНА На пл сви ж и ит м у в ТКУ, ФК СД ТИМ УМХ С, мили муси их бак АТУЮІ Ме Ми ОБЕОКВЯКВІ ЕМ МІ Юм КУ ЗЛАКИ МК лют БУМ жахи В ХУ МТА сту жиму умо В пемаимУут утоми ут ТОН т у и и Аа в ни п и А М НА ОН НИ клі ЕУ ІМ ля уки УДК ми йКА БУЛ М КА Я ШУ ЕЕ АТАК. ЖАЄЖАКАЬ МАЮ ДУМІ МО ОК МАСА АЕН М я мой Уц МІМ и Ми ет тм М М М жлІоМи ХК Ж мкм у КК Жим ит иа у ек их ттх о А ов оо ин
ВЕНАХ ОА ПІ А І СИ А ВО І КА. КОКОН жу КА
ЗЕО ІО Мо 127
М-ділянка з 577Щ8 0798 -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І 154Р, де мохом ж мк у у М жа ух УЮ п муж умо у поля доле кур ут ту Іжа УА ж у щи КІШКИ, малим ил Р щЩ: ОКУ МИ З гору у щ БО и Та НУ пошу Ситі їі ЛІМІОК М
ДРУК хо оман дом км КК АХА КІ М ЛІК Бех УДК ЮА ОХ пе ЛИ А НН НО ВЕ З еліті М ЮК лилу хх вих ска те и ЕВ КУ рим х пк атЯУт пу у ІІ Оу ДИ глек УААН КИ У БІЛІ БКІ МКАС СНО мим и м блок Юм ож тку ери ю их оту лом уд мими ю ож КУ и ть Мои и жі Фе МІ МУ И У М
М КК оман а и лови вия р НН а У ОН и НН ОК в и ВВ НН ТІ ВУ сих й ТІМ КОД ТТ ж Ж ТК МО хі КожекУку МОУ Мо мА ДОБА КТ ІМ ТУ МІВ МИТІ ІМ рана ВАС Ним губи у и М КМ ож ЗИ Ми ци ти тут та ВИ сю мом сих КИ КУ ТУ ДМ у шал тло
ТИХ петуму ме ККУ КО ЕМО ТАТ: Упр ММ У Ма хи хаки МОХИ ОБМЯЩ КОЮ КИЛИМА дан ТАМИ Кк МЕТ І Ву А КУ ОК МАХ ЖОМУ МО
ЗЕО ІО Мо 128
М-ділянка з 577Щ8 0798 -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І 154Р, де
ХМ ОМ див УМИТУХ КМ или ЖЖ А улмух рити жити 0 тр ЖК Ми ту т тру ММ МКМ им и хи 0 АМІРТ МИ Ж пер УК
КК И А КУТІ ПОМ АУ и А хи Ай чи ми уче Но КА м АД ОН о, Щи АК Ме в І АН ШО Ми ОМ А р м ав в з п в в п ко п а п а а о и и па у т о ся : м їмо о о БИ Чо о а У ЗНЕ ВИРУ її ОК НЕ МК Мк м А аа и ВИ СНИ ше о АЖ Х ЗІ Фк МВА ко В о ЗОВ ОВ Я и оо ВИ Осло В ек ж НК З о и о и я ЧИЯ аж м хижа и и йти ис пи ЕІ и иК их УЖ моих жи ЕМ ОМ ЕХО Ки жр и их ож В ЖИ МТ ит щити у нка и ОНИ нан М и М о ВАН х ЕК ННЯ аа р ВИН усю КІ М плоті МА ки АЮ А А АК ККУ ЗА ЕК Мих КАКАО МИ и А БУКА МИХ МТМ поудстти ції 0 а Дусі в ОН ди ЛИ у ЕТИКИ Ум Кит У ДИТИ их ит во ма аа в и о п В Как м зо ль ВИ В МК В со а и М В а З а нн ж В ОЯ мех А ЖИМ КОЛОД ЛУ ЯЛТА ІК ІА ММК ІХ
ПЕ Ку: у У УМ п и мух ЗУ КУ ДИ шини Мму куки их прати меч ги жи МІУ фр там Мои жим зими У ТАМИМА МИ ОБОВ Хосюод у жи 0 МАЦиМК КІМ м. МА ЕК А хх п ЕХ ТЕ МЕН вон ке а а піни ри и и чим пихи ТК Ки щи и их мив фу поухучеритутет
БУДХЖ У АПОУЕ СУМ шу А АХ М жу ЖАН КАША СУЄТИ УС и ІА Ен А ВА БУКА МАХ
МІЖ милими Ка а альо НН р аа ее а ше в а НН КН а ни таж т т ит им мит.
Ази ен М а ОО З о м я МН Мов з В Ко КО З З В пи и и С В ВИ С ДН межи Ки А ех, сер ту тую и мА и сутки ДИКІ ит СПІЗУЖЕ УМ ж ТАК мУТ В му ж км мк хи ок КА МАЛИ БА ААУ ЯХМ ЖК МЕ Ми НК М КК КАСІ АК ДУМ титру тести в Дитя лан КИТИ питсгту тут уує их пови АМХОКМ КОсяжиЖ жим и их М ХК Ем и ж ух
АБУ уми ьАХ ага М ЖАТИ ОСИ НН ЕВ В М МИ ЕК КВ ВАН ИН ВКА М ККУ поживи Иихещ емо Ем ЕЕ п Ви мож и А ЕМВ С хр ит пост ут Кути не но он с а и В Я З и а З ка М в і А З Чи с МК сов Ан ЧИ о з о МИ ЗК СОС З Я ХУ МКК
УТ Ву МЕ ЕЕ У А И А УТ лити ми с, ЗТ УА МА ТМІуМХУМУХ ту мм ие т м, соту ШУ у и мих
ВЕ її ї іх та См І КУ. АТІКА шк пі Е МА ШИ АШТЕ ОК
ШАР УЦА КИМ МІХ КАК МЕМ М ВА АВ АВАКОВ МІ АКТУ ВЖК Ко У
Ук их ЖИ Тім ому умивет МІ МС мя но учет Мом Жоржини ня жим мит
ТЕМ кі ок а и ВВЕ Ка А я М А ОА ми о КА Ін вк ее а о о и В и и КК ЕЕ м М Леді АХ ЕЕ А
ЗЕО ІО Мо 129 титр ту ТМ й М Хм жтуУХ ТИ І У СМІХ ХУ У АКТИ хі Кг ую МОСТУ УА СА ЮХЬ ІМ дух ху
ТІЛА КИ ОТ ДІМ ТМ СІМ Заказ НО с за вн ев КН ННЯ р ка А ЗИ
ЗАОТЖИ МАТ КХ Ю А Фе ММА ОК НН шк и Ма Ж Му А КЛІ МИСАК А У КМ Мак УМ пд ЄМ В ла МІ ВХ ее а аа в Не аа на в НН а НН жона нн
Ка НИВА Милі ав чи а и Ж М я КЕ КА КЕ НЕ ї
БоОКзимич ам КОМАХ Хю мод ходу ХК ЛИМ ТАК Кай МА ОБОМ ОКА ХМ
ЗЕО ІО Мо 130 шоижпі вих вох чих ЧА вуз их рум іхиух у тих ЕЕ ур тм вх кити ти ВО у у юи их хи
Ши МОМ ІА захи. Хоми у І МІХ а НН п КН ОН КК т ОК ОСЬ ЗІ чи КН Мей мсю хх В ММА сх уМутих щи дими хитерихих ВИМ Мих Везизух тури суч их куту ит ис мук оч ую их ет Ки фу
АТС КА АСТДА САТАНА ПЕС АСАТОЗВ СТО АТС ОСАД
Хто им ЕМО МОДІ ПЗУЄ М УК СИХІВ ХМ му рми Ку им дими ем М В уми Мухи ом Имя
Б ЕВ ях оф у ї У пики Ах хи МО зх Ку Ек ока мо Ці До
МІМИ МКМ М мети ОЕМ КТ КАК АКТ Мих МІК ЯК Кз АННИ КА А м я пи хвпУуйхи тлу ОМ ОДУС Ми ЕМ пт симтих узи в ро фттИ ких вух рЕх ие уМья в нн он А о и о мо я о В я В ХМ п ВО и а п а по М п В НЕ З М о КИ ОВ о ях ДИЛИ ІМ МЕМ ИУ держ уєтх Кхрих их мив уки МИ море зи Му му пп жНпИхЕ и мих ее ик ие ВА В З М ЗО ко М ЕК М я я ИН ЗВ ОК а а оо ВИ ОО ДЕ МВ и я ро КВ М о НЕ Не
КІТ То Ам тили в у во зам в и ОАЕ ДК дя МА
ЗЕО ІО Мо 131
Кен з Аа ЗВО У Вк т ВК о шУЮМИ ЕОМ Сир СВК АТЖ С
ЗЕО ІО Мо 132 а о и нн НИ р но п і и и си вити ди рути ком о кокруи т вх
І ТИМ М со ум Кт ХІМ КМ МИКИх МОКІЯ М ож ик Ве мА ЕМ луку тіла НМ СМ Кит КМ КО АХ АВ КІ МКУ пили пулу у ух пат уж М рт Ку Б ПУХУ ТИМ смути уяви ую М ул ит и юри їх пи малОо Май КІВ ОКЖКЕх оон Е песни Кк
ЗЕО ІО Ме 133
УМОВ з ую мах Ви Ви и ми и и ж у у уми у и ЕХ ВІ С АИМСВЕХ уИ М ЕХ Ки о и ки В СВ В ВН НО о а я ПО В ЧЕ В и Я Я НН У БУ ЕХ ж Кп и ОКХ шт ЕМ у и й рими ЕМ Ки Ми тири ие ЖИМ оСА см и хи отих МЕЖ Ки Ди ж у и М им им В ких Ем а о Ко а ПЕ о КЛ КН У х НН КАК ВАМИ М и КК КА рн доять ОК ДЯ
ОА А тир и г ДАМУ и КІТ ДИ ЖІ ДИ пуер Ел хи с пу их пом УК МЕ и хірур У ДУ и ЖІ ТЕ
У ВЕН ово ЗЕ о ЕН НО а В в В В В и о В В МН М НМ КИ с В
ГІДА ОМ ЗМИВ ТК ТА СА ут и жі ВІТИ КІ ЕМ МИХ ИН М ру ту
МЛ КУКА МІУ АВМ М МИХ М и КиМУ ВА АМ А В Ми О ЖВІАК МИЖУдоап М М МУА КОМ Пи пи СсВИхиІ т ву пи ВУ дум ихи жч дим чу Ми В КИТИ т В ІК Ку
ТАКІ ВАК дп АТАКИ КУА УИ КМУ М меха ПАСХИ МАО КВ ККУ ВИМИ АЖ КИ КУ АК
ЗЕО ІО Мо 134
М-ділянка з 560М 5520 567М 577А8 0798, де сигнальна послідовність підкреслена та
МмохчимтожодУ УК У сщде и им ж ди ж ум можу мом щи ту ЕК. Умух ДВ му им, КВ ДК ит о А Я БУ г БАНАН КО ПУХ М ОЦК ХИТ Н МІ АЛТУю Ух АИМИМТУ Н
ПК МІ мах Ба ОМ єн ЕК кн НАМ КИМ МАМ Й сій МИ КТ
ФА дис и рИ хе Важ ТОЖ ми ьо я МНН Кн ее ЖИ зр; круки ех куму що
КТ КАВКІІ ЖАЛЮТІВИОМОМ МЕТО Ме ТЕКТИ ВРЕЕБЕЖЕУ о МАК ТУ Х по на а кН
Ск КО БАК
ЗЕО ІО Мо 135
М-ділянка з 560М 5520 567М 577А8 0798, де сигнальна послідовність підкреслена та шипи ум ну ди Угму пІут руси ихпу хом и м у узихр тими ут МИ ДТ Ху и ле их ния и Кон и а а А ЧИ КЕ НЕ С СЕ КН ВЕ Ек ов ДК А МО З М Ноя
Губи мМ Му ху Ки их умов у ку зиму ритм узи ви уУ и ДУ Ту Ки у у жу м и ри Ту их ЖИМУ КТ ре итт у ут
Ма мех Ки о и дм ЕМ КАЖАН А Ж МИ ЕВ ЕК М КАК НА КИ АНА чи вусик УТ у и і Ди пе птн ЖЕ У их пи и Вих ДМ ее их Ту В Ту дих зи о и
МА АВ ЯМУ а КАСА АН МУК ОК ВАК У КІМ ХК В Ва КО ВК У ки я КТК КЕ Кто ких РУК чпиуутежи чими ігумен Келих муху жи ее ШАХТУ А ОТИХ пи оф те ут
АОДУш М МКДЛЬ МАО КУМИ М Мк ми В ЕН А А ЕЕ ТУ А и у ЯТА К мид В Кок Ки д мул КАт лТААдМИ п ри вки и и Ки ОЕМ КЕ МКК ит им, Лу и и у и ит т СА сим МІВ и ИН о рух КИТ СМ жу У ие щити
ПТМ КЕ тА ет; сш ВІ кр и ТК ЕК ДИ у их
АК І КК ну а У КА МА АВ ЕК КК лили М ка МАЛИК А М ВА ЕМО МЕ шим ГАМУ КУ
СВ ут ил зу ит у р жити жу ТТ терті ис ДК МАТИ и ОО КИТ М т,
ЩІК их ЕК и У ЕК ВА КК І КІ КМ КК МАМ МАКИ АХ ААРАХК СМАКИ
ЗЕО ІО Мо 136 п кнІНа На А НУ ДИ ЖИ У пулу ан о нь ж НІ о Со а ки и а у КК НИ
І хи АЛ У ДН А ЧОН и но и А А З ЧИН Бар а о ННЯ чинни крон на Кк м а в КА Село ЖАКА ММК СЕ УЮ ЖАТИ ЖЕК ТІ ХХ ех на м а АН Ом ТИМИ ка Урі ди ориг жу Зк ни а на КОН и соя НН а вок Ки
ВАМ ших КМИН ТОК гТІ БА ВОДУ СООБНЕВТТЕ СУ КУВІ КЕ веж нн о п п п п в і м и п п м і і п р
ЛАК Пл м ше т КТ М ПО Кв На ил а у а НН А В в нн с аа Кк
КВ е ко св кі ВЕ м ЕК а Й а и А Я КНТ и В ОМ ОН КИ НИ ЧІ щури М о М ж АТУ МИ ЦУ ВУ тім КУКИ им Ж кт урух всех муч м р ум ща АЛ ОНеВеем ще ЕЕ Ан сни хе жи щу УЖ п
КІККО Іі УМ ОМА ЕК БРА У УМ аміак ЗЕ М ОМ КК
ЗЕО ІО Ме 137
А Он А В т и та а в в І ма а спо о А а АК МА НИК ОВ НН ен ин не А о а м с в в С п и у мк м в в п нн аа НИ тихими Ех м уми ЕЕ рухи и ТИМИ В иту му и и ж ис иу и В ивИ І МИ пли их о Кн Ки а МИНЕ НА ОБ А В ОВ В В З КЕ НН НИ НО КА о НК код дити мин Ох ВИ у ДИ Ки и вимі у КИ ВІВ В ВЕ их и АКТ у ЕІ уки тя
ВЕК КМИН ЛА Ми ж и ад и А М НК а АН МЕ МІ ТИ Я М шив их тр их ДІМ фри ей А ух Мч Емо жири в КЕ дип м их мусу пи у ЛЕТИ КИТИ и куми п ууєктх ее ки УК оз кове в о КМ За ль а п В А З З о ВВ Ко о ан о м В п ов о НЯ пРЙЖИ АСОМ ТВИХ ТИ ФК В МИ ВД и уд у и Кт УК КЕ Мр и РЕНТИ ит ит ВМ В и ВИ и ИМ Т Т ШЖВОИ иТ
МІ Ваш КАЛ ВАВУИА ВИ ЮК пдв А МАЕ ВУСАХ КОЮ ММА ДАЕ ГАК ВМЖА МАН ЕМ ККХ Мет и неви и и В І а ІІ МН В ак вва и Ви и и а о а І у А В В а о и М В ДК В С В о оо НА МК Ка я М ен о З В он поживи раху хи ТИ М тут ут ЗТ тус ІМТ и Ту ДИ и и ДО ВЕ ВМ Оу
КМ МА м икн і кжкАВ ААІ У І ЕК оку ки ик КІ ТАКТ ЕН А Ко Мак У ЕК сти уи и ТУ и в Ду и у дих ВУ ТИ Ти и и КИ ИХ МИС ЕМ мит ДТ ЕМ и Ему ти ДУМИ
ЛКК АЖ РУ ИЙ ЖАВ А ЕД МЯ ММУХВМИ КИ УС НМУ М ВУ МИ М га мух и я их Ж тезу у м фут ву и и Ж и и ви СК ж до и им у МАМУ МОМ Ж ОА ЖЕ В ин я ЕМ и ит ит и вне оф В ВК ВН вк а ВВ ОК ВЕ в С а У о КИ ФМ КН ОВ КТ М ВЗ ОВ
ТО Ко Ту шу кт и муки и их и ких вв им и му их дис и Мих ут ие 2 5 о и рома пн В а КИ КК В АК М о а ка В В М НО и п Ка о Зо МЕ
ЗЕО ІО Ме 138 се ВЕ мак иих СМ тт лу ду ВО Кг ДНУЄ
ГІ А. ТМ т п гУю ї ї ж ов СИ КЕ и ХВ ЗО НН
ЗЕО ІЮ Ме 139
М-ділянка з 560 5520 567М 5778 0798 шині оБешо але УСОКУТ фТОТКАБОВУВМ УПЮ ЕМт ОКО КАВКІ ЗТ ААВУТИКЕ шви МІТОЕТОугІВ Вів АТтТ жо нКлеУ ТЕО Кк
ЗЕО ІЮ Мо 140
М-ділянка з БбБОН 5520 567М 5778 0798 аАБАГТООГТ АС САВА САС ОСТ ОН НО А В АСКОД СТАТЯМИ п СОТ КН А М А А СЕ НТ СА АВТ АТЛАС ОН НХ
ААЛАКНУ МАН ТТ АТ КТ АС КТ АКТ ТО В АССТОСС СГС Т ТТ пек ВОАС АКТ СОТ АССАТТРОСВОдОТО ДЕПО АС ТС А СТ
КО АС ХСВАСАОТОССБОЗАООВОХОСТ АК АОС СС ВОЮ ВАСПАМИУР ОО КАЖЕ СЛ
ЗЕО ІЮ Ме 141
М-ділянка з 5608 5520 567М 5778 О079А, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом
АБУ КІшА ПЕ шИМ І СТОК АБУ Т СЕАДОМУПУТ СОМ МОМ
КЕшКАВКТ ЖАВ СЕКВОУ ви БОаМОо ПОЕТІВ ВоЕаКАКетС он
УТ ВИ
МИМО АХ М МО
ЗЕО ІЮ Мо 142
М-ділянка з 5608 5520 567М 5778 О079А, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом
КІОТО АСК САТ ОК УК ЕСЕ Т САСТ ОАГ АТОМ Е ВА
СТО АКТ САС С ТОНІ А В А КАТ САС ТЯ КАК СТО с АСТ АОС МН М ВМ ОТ АКАТ А АТ ОСТ АТАК ВО АМУКХК І АААЛНС СТАЛУ
ВТО АГСТАСВСОСОЗАТАЛОСГТ ЗАВОД
ОКА ПАСТА АТ СА АТО ВОК МО АС АСК ОЗ ОА АС АТАТВ
ПТ МА АК ТАС ШО АСАД АТ САМУ
ЗЕО ІЮ Ме 143
М-ділянка з БбОВ 5520 567М 577 079В -- константна ділянка капа-ланцюга п ОНИ шШееиоЦю Ам УТІТ САДКОМ СІК ММ КК хАШЕОКщОМУ БИАЕШСЛОМО ТЕСТІВ ВМО АСУС с НКБВОХТе соки КЕ
ТУАДКБУКОЕ БОМ КО ТАБУСИЬММ КЖКВКАКІЄХ КУТАХ БОБОУТЕСТХ кл тиІБИя пінка пЕУЖАСЕУТИ сю ме УККА ЕМО
ЗЕО ІЮ Мо 144
М-ділянка з БбОВ 5520 567М 577 079В -- константна ділянка капа-ланцюга
АГАТ СОЮЗ АСТ ВОВНИ ОС САСЕ СТУ ТУТ КА АТС АТС
БИКА СА СО ОА АТП НА КАХ КТ ЗМО З АД Е РА СКУ АВК
АКА АО ТО СТО АОС АС ТАК СОТ ДАНЕ ТТ УТОМИ
ВИТИНАНОК Аа в І Ем КП КАК Ка АНУ І
АТАКИ АВСАТ КК ВО АЛЕ АТ АС ПО СІ АВ ЛІ АКА ЛАК
ЕН и кни НИ а Я нн вет УК КН оз Коен ООН
ТОК РЕШ ТА ААСТЕ СТ АТС АК НО ТОВ АСКОЕ АНУ ОС АТ АВС
А ІА АНА ЕМ І СКО КН В АКЖЕ В У ВМК С АЛ Е МЕІ ТЕ пАшШОВИНС МО ШТАМИ ОН ААМО А АМ АА ВО А Л АВ А ТТ П АКХ
ПАГОНІВ С С АПАКААН ГТ АЛСДСН АШІС
ЗЕО ІЮ Мо 145
М-ділянка з ББОК 5520 567М 5778 О79В (за Кабаї)
ПпІшШЕшееВБ МУ МІО УТ фол ЖИ ОошУММеХ се аАвЕВ БАК вчУеЖвЕВОСТО МОТОЕТОГІВ ВоВеКоеКХ хост нЕСвРУ ТЕСТУ Кк
ЗЕО ІЮ Ме 146
М-ділянка з БбОО 5520 567М 5778 О79В (за Кабаї)
ПІВ не САУ НУМЕ ТІТКА ММ ХОЛ ММАЕ Сакс КІ І АЮ КА су МОТО ТІВ ОВО БАТУ ЗК ННКОКУ ТЕСТУ
ЗЕО ІЮ Мо 147
М-ділянка 4 СНІ константна ділянка гама-1-ланцюга, плюс лінкер, плюс зсЕм ді 49Н5 САбА5, де сигнальна послідовність підкреслена та виділена курсивом в У и и М в в І ВВ в в а ни и ве а в а в З и В ОВ «ЕТ У. М М кА ВО ККУ мМ У МАМ ЛУ ЖК МУДАКИ ех М А ВИ. ОМ МИ ОМ ТУ АХ ХХ М ТОЖ МУ ХТО ІІ ХУ ат ТУГО МУ МОСК ВТТТВЕтНУ М У МАКІВ АЕТ У ж АНКЕТ Авц вит рУГНУуг и Крут У мА І МАТ У ШИ Ж я А у іш А ОД БІКеХИ ІІ КЕ СОМ уро КРОМ мМ Би ен о КК ни я КН ИН мили кА Минув ки ттют са пул им ит с и и диму ух ше пух У У ЛИ т ти Ех у пуд А т и КЕ
УМ М М МЛК УТЕК мед и та им гую рим М І ПІЦИ ДІ АЙ КУ
УТОМИ Ту АТ я пд Ми Ки ТіК А Та КМУ міх КОМ КОД МЛН я Оу МАУ КК КА ОА МИ М МКМ КО я М г
ЕСТЕТИКУ С Уж КАТЕ КК АдИ ІІ ВИ и ку КОДІВ У ВИМИ и ри и жу о ДІДИ у ЛИТИХ.
ХО КУКА АХ ОСМУЩИ КИ М КАЛІ МВ КИ км МАН Вир УК
КЕ жух и у кхуо ж ГІ жу ких міру ут МК М у мч тка м Вих цех ШМФХ Ук ха ми у У муки
РОТА ЕТ Я МО АЛІ І и ІК м и Ки ІНН мМ Кг ММК мМ Ти мкс до укм иИю ІКАКК М МУ МАЕ МИУи Ти Му ОК Уа КОС Ер ом Ма ТАК Кок Ія ТАМ КИ
Ж КО жу ФфИТ тус жує т и лрюмтУА К ТИ У ТА ТУПИМИ и ие СЕТ ВИТ МИ МК яти
КИ КД ДТ ААУ шо КІМ С АНА а У НЕОН БАН НИ ВЕН па МОМ Ж х ДСТУ ЕХ М Кох ун МІЖ М МлухУи АЗИ МИ МИ НЕ М НМ АЖ КЕ А о и ВК СМ У
Фе го мим учи и ФК мк АК Ко ци и и Хе ат у жо мл ме уд жу и ж Ж ЖуКІМ МОМ чо Ве В ние в я а в М и КИ ОаНИЧИН ко рожа І ЛІК
М ВМ КК Крха ке МУК и МАЙК КТК СОН У ВОІМУК М пунк Я ОКО Х уиеха У УХУ М ПИВІ и гру т и и У Кук ІПЕЗ ИхИ хи же ВІТ ТМ
Коен не о а и МО Ки м еВ ВК З
КІШКА МИХ Мою ХО МАУ КЛ КІМ Буд КМ МОПДОТАКЯ
ЗЕО ІО Мо 148
М-ділянка 4 СНІ константна ділянка гама-1-ланцюга, плюс лінкер, плюс зсЕм ді 49Н5 САбА5,
МЕТИ ло Му уми у мк и ду и Му мо мих ути мух уми гу музи еВ мер им Му ди у я Их М юки Ж Лу СА Мт и Вис иКИя екю ол р о п пи о вк и п во п В о Ви а п ЕК В а а о в м ЕК в Кк в а о СО А рн в о о ре в в оо о о о о ср п п о и п и о МК
АлЖЕКИ КОМИ ЛУ Ж У МД Ки кн ми М МИ о ОКУ и А М КИ А МК и МК МК А КИ ТУ ми В ні В и В о в п в и В а о В и ко В и А Во и А ОС м АХ
КА Маха ЖК М хи ех МАО МА Б китами В МКУ ІА Код РУКАХ Млин ВИ ФУ МИ
КІМ мі дів ту ВІ дим в и ди ит ух МИ УК и ИН у их
ЕЙ ЮК Ам АСК МА Ми ОМ Ми и УМ ВМІ Л АХ МАЛО МУ КАП АСУ МЕ Ми МИ МИМО ХМ я
ЕМ ЕЕ ги ли що ик о ур и я у АТТТУ З и и у Ті и и У М Ту САТ ДИ юТ и У мт у им у ож ЕХ: оса но М НД ОВ и со ВО І ІВ В КЛ ОО ОВ ЕК ЧАННЯ
МОДУ уми их о иа МУ и М МАТІВ САМУ Ки и ус ЖИТИ т и Ху ие Ки Мр я я мити в ик и я НЯ ІН Ті ром ТАКЕ ПУХ піно ПН АТ
БАЖАВ Ки ММ ЕМ КВК Ат мими Ки и МІ ЮК МИЛІ КН АК ВНЮ Кх пити Имт хр дріт у и вих ве КМ Кути ур хи ик ів ик им
ЗМ ет АК КО А ДАДЕ КТЮ Ю А ек КУни АЙАММ Й ки А и М Мило и ТА ЕМ и А МК І КМИН.
УЖ муху их у Де Ех и у У и ЖЕ Имя пу тую Тут ти ит ухих м МИ Тит Ж тир ит и они ан и в и В В КК ВМ В В а о КВ М ВИ М С В З В С о В СН оо кАНА В ВН а а а кро ни а Кн Ан о ан а и иа в о ЕК ен М во М З я и з о В и пл В Моя МО о ВН Ка М о п о ВК КЕ Ва Ка п и м В А ос ль но ДИ як муху им и ДИ р их ум их духи ди М рю о Ж Ким их В КЕ ТИМИ Ст м Ту у ких
ШОКУ. МехиУо хх ДЕ МК ким У км мо М А МКМ ЛАК Ід ВК АК ВАК ОАЕ лих да ди ТИ І ЕМ хв ди и лу Му сер У МД иМ о мим у М гук т МТК пе дме
ГАШЕМКЮ КИМ Ем п сн М Кл ВАТА, ЛАДИ а в а а В НН ННЯ и а А ж А АН В А А В А А В о А ВК А АН АН В ВН она НЯ
ДМА ЖАХ ТУЮ ТУЮ Ки у у КМУ А КАТЮ М А ОД УКАЗИ ММК М Си ВОК. МОЄМУ Мих З ММ
АН он в на А В о АН АН в в и о АННА но и аа аа есе о ОА о о п и А В В ОВ ВОК кое ев о Ко ВН КК А В НИ о Ко хв их у и Йти тики и и Ку и тру ЖИ ДК МІ Ву мит их я АТ ВИ и ви А МУ ЕТИ у ЕХ ДЯ КУКИ т и : А ОНИ ме нм ни і и СМ ни и о ОВ А ВН и во а ню т п НЕ В ТЬМА А и А В КО С Б ко о в С МО ЗА М КАН с Ір зу ит ОЕМ УК С КАМИ лит учи Ул Ск УА МКМ Во ор ЕМ іІМИЗ КУЄ И МІНИ Мих пи о І КМ ЕМ ГАК КМ КК КВК СТГ МКК
АСИСТ УХ ЗАД ох КУГИЖУ ВК УКХ А ІОВ ФУ хи ну УКХ КЕ МАВКИ МИ МУ ЯК Мо МВ М Ох дому ихимут их чих мих ух их у в ик их и мих аку иЖеМм ж хе Кури му и ру и ум й ЖИМ ЕМ и ККУ Ме МИ рик утри ее а и но нс о Ва о опо оо КО о и о в о М З ПК ЯК Я и МО о А А МК ЧО ке ПОД Я а НЯ
ДОК ИИИКИ КК и ВИТ ЖИ и и Ми Ем о У иТЕ ИУЕИуит ор у ТИЖ КУ И ТЕМИ ЕЕ ЕЕ ЕІ збу А ККД МАУ ЯМ МА МУ КТ КА ТУДИ КИ ких КЛ АВМ Ул КА дж п ил кіл МКУ
МТЗ ТИ УВУ и му и До УТ ЮХИМ и як ж и ВИ их В ЗИ Тут: их т и им сити ую А и Ми у АЗОВ М мо св А МО ВАВ АК КАХ ВК ЕЕ І КУ Мо МА Ми М
УгеуМ ВИ и ут ик КИ и МО МТУ Устим их Ми хЕ КУ И ВЕУ ВДІМУМ М г ХСАУКОКТ М Ку В Ву ЖІ ТИ ЖІВСТ УМ ЕХИС у ЖІУУ ОМ
Тераса му ми ик: Бір руте сум м вмер вісти ДІ во і три п Му Ел
ДОМА УМХ А АТМ хМоиМу ММ ХМ меми КОД КТ КИ КУА АЛ ЬДМАИ НАМ АК ТУ А МК М М ХЕ ЛУ А Мо. Ми АЙ ОК дО АЮ М Й
Кхж ери КИ ст М КК ВИ В М КИ МО имя рю имя тд ик тю аку жив й й ИН тки ит Мухи оси кит В, аа НН в ни а МК о В ук и о УК и а А Ка М ВЗ НИ Я В КА НВ
МАЛА ЮА ВКА АКА У МИ КМ ки АК Ж ИН АН ВАЛ КАНК ХХ ЕЕ М ЕК ДЕ ХК
МПА Дощ УТА В М и МИ жерти Мои ММУУиих Кук МУ СЕМ мо Уу ут м ях ект іх мм й ОМ гук од им их т. оОжтх 1 А она Я Ох ї 7 . чи ї ЕНН ЗЕ 1-х их тА КН я Аж п МН тх
МЕФУКУА У я мохи х уми ВАВ ЙМИ М ин ХЕ ВЖК і КУ Ах Кох напій ки МІ ВИМ еп дин ум Епу р Іди Кен дити ІМ жи хи ру АЙ ВУ ви тих Ко ИиХ
ХОМ ж КОЮ МАТ МА КА АХ У М КУМ М АД КИ АЛ А н М Х МИ МОУД МИ МИ МОМ Й БУ КОП МА МТМ оту утИт и ВТМ и рих и ит А ж А ТИ УМ ДЖ УК Ту ; о о а Ка А В о и А КЕ у У МВ КВН п КМУ ЕВ В чих ак А ЕММА КА ВИХ КАДРАМ А ГМК
ЗЕО ІО Мо 149 ву ит им я ую их «КІ М У
ЗЕО ІО Ме 150 ше їх ше У шт У ФІ ДТ ГІ КИ А МІВ ВЕ ТІ ДИН Ти А ТМ ші Бум мих М ОЕМ ММА Б М МОЖ МЕТ М АОС МО ДОЮ ОХ ВХІ УВК У сем Межі Кр ух рови У плита щита Ку И ху жит ЦИТ му ІКр ХК ЕК и а в ИН КН КН ОК о НО НН В ОК З не о В кети и и Мч ти Ж ЖИТА КВТ Ки ис т цк КІН т ІулУЦ МІК ТИ у т МИ ЕОМ Фе МХ п ав НН в и ВО в а кн ВО и НН М В ОН меси лиха у ЗА иа и ЕМ ІТК МУ АХ сх М ІК В У Нюх ВК АМС В зму У по Мф и дих ж жмут я дж и ми МК КК дим и жи у М І м ами м и со Ку и Тр и ДК т ВИ ГУТИТУ ІІ у м тут Би КИ КИ
ШУМ МккИаю А АК КА мика ЮК В ЕКО Ж ок сш ЗА БА АКУА МОУ МАО КІ
ЗЕО ІО Мо 151
УА рими уми и им их о о ИН мамі евуди скит ми Уа МК
ЗЕО ІО Мо 152
МУ ЖАВ мМ КМУ МОХ хх
ПЕ а ОН
ДОМУ Ук й я
ЗЕО І Ме153 чу СА МИ МмІуєІМ Ти ЦІМ А ІК
ПІ НН В ОН
М.М ІМ ОО ОКА ОТ СУМКА
ЗЕО І Ме154
ЧІ У АТ м А и с а кН
ЗЕО ІО Ме155
СОВІ1 САб45
ЗЕО ІО Мо 156
СОВІ2 САб45
ЕВВКЕІВ
ЗЕО ІО Мо 157
СОВІЗ САб45
ЗЕО ІО Мо 158
М-ділянка з 560М 5520 567М 5778 0798 563МУ 576М (за Набаї)
ПЕТ БОАшУЗОВУК ТИНА Хосе окре БЖ БАМХ ОКО
УМО МОТОЗЕТЬТІМ ВІДЕР ЕАТУ тою Х ТЕСТУ Ю
ЗЕО ІО Мо 159
М-ділянка з 560М 5520 567М 5778 0798 563У 576М (за Кабаї) пл тосвИй їв това УЮ жроплаУмУми свое т АВУ ВИХ пжлІпітовВИЗ бодосреУт фтоевалдекоУю жіно УмМки СОСОК У АВБУ СЕ сУурМеКЖОнОо МОУТОЕГІТІМ ВІВеКОКАКХ ЖТООБНЕНВУ ТЕООСТКУВІ Кк
ЗЕО ІО Ме 160
Сигнальна послідовність
МЕЯУТЕриЦ КБ «110» ЮСІіБі Біофарма ЕсПіЕрЕлЬь «120» АНТИТІЛА ДО ІСЕ «130» РЕ0О087-МО «1505 1481610198.2 «1515» 2016-06-10 «160» 160 «170» Раїепійп версія 3.5 «21051 «2115 121 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220»
Зо «223» м-ділянка «4005» 1
Зі чаї бін сез УВІ Бін зег о Біу бу біу ви хві бів вра бі біу і 5 ! їа 15 заг о бец Агт омец его Суб віз Уаї 5ег о біу Туб баг Ї1е тТагобБеб су а 25 зо
Ту бак То АвпотгРо їі дга бів Аза вго сі уз Біу во 53 то 15 0 Я
УВІ АЇа Звг жі6 ТИг о тТук ар о Біу бак Таб оба Туг Ак" вро бег Ууді 5 5 Бо
Су БУ Ага те твгоїіе чего Арго Ар Ар об5ег бух лай тик РВЕ Тут
БУ 70 та ЩО їец біп меї дкп бек іо Аг АТа бін Ав Тв Аза Уді Туг Тук Сух 85 за 5 ліз ага біу зве ні Туг РНе ші Ні тега о ніб РН Аїд Уді теРробіу 106 195 ма сія біу Твгофяв Уві твгоувді бегб бек
ЩІ 120
«2115 363 «212» ДНК -213» штучна послідовність «220» «223» М-ділянка «40052 павтасасі стозсповас загозавц ссбтнютаснвє сбоддсооваю соте що село асс гасссодата стссвіжвсх Кссоєтасх сота сто дпаїсвазсав ХВ пса аск ов Зоо сссвісасо асзасозсотс засво що завсссатссо їопзазоЗоассо саїсвссае ссосзсозасо зсзосвазна тасветттає 4 сісславтва всзоєстзсВ зассвааЧчає астоассзтої асїастосас зеснрвшякся КЕН саткасттсо осбсасіех сотсвссеис хоззоасаво зво сасреисюсо За
Ок Зк «2105 3 «2115 139 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з сигнальною послідовністю «4005 З мех суб тТкроУЗІ ТВге вве ті 5вг оси ве вне се Ре Зеб Зак 4а1З ї 5 1 їх тТУг ОБГ бів Уві бій їв чаї сів звек обі бі б51у бен ові дів овго о а 30 сім бБіу зак іви Ага сен ЗвгоСу5 аїв уві Зв обіу Туг бе жів так 5 | о 45 зем обіш Тук его оте; оди Тер о ї118 Аго вів АЇЗ Вго бі фу БУ Св» 5 55 во січ тгвоУа) АЇВ бек зів тТвнготуУук Азо о біу Зак тТвг дей ТУК Аа га а то 75 во зег Уві був бі Ага її ТР ої16 Зег о Аго Азроа5р Заг Був Аяй ОТГ а о 55
Бе тук зей бій Меб Ахи Зег о іеу АБО Аа сін аЗр отвк віз ді Тук їла за5 чїй щАМО Мам КА тек бух аїд дта біУ Зевкб Ні тує Ре Зіу НІ тер онії вне АВ Уві щЬх 125 125 тТев осі» Бі сту Те орец ха! ТвгоУуа! век о5ег 130 135 «2105» 4 «2115 417 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «Р23» м-ділянка з сигнальною послідовністю зевааасо ссзссттсаЄ стссстасто стЕстоаттст ссадодестя сессоадУо во см аціоє ваїсацаса яевщетоакО свасетоцсо бізаєссюзає вста есетує 3206 сага Есса затастссях тасстссоос тастсотоаоа астооаксво свое ї5О цазавозовс стовотасах зоасесссатс асствсоасо сієзаєсаз статавсско 0 їссаізазоо оссоєзксає сазїттсосос Засовсвося возаїаскк стасстссва. ща зссзасвосс сосодассоз зазсастасє зссассасо жосасвна зієвсвітає 350 шеспоавзсаст одасаєтісає саїстодоаз сенсассс ссессастає стспаос 47 «21055 «2115 224 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка -- СНІ константна ділянка гама-1-ланцюга «4005 5 іш уві ціп сви Уа біб бек сі біу біу свв Ууаї бів врго біу бію у 5 10 ї5 его іви дго се 5ев сСух Аїд Уа! Беб сбіу тТук Бек ї1ю тТВе зве СТУ за рун за ка З 2 тТуУуг БЕ ТРр Аа ТРОо Ті АКа бів Аїя вго сту Ух біу ген бів тер 35 40 45
Уа! Аа бег їТе Тк Туг АБр ОбБІуУ Бег ТВг АБ Туг Ап РКО 5Вг чаї за 55 що
СУ БІіу ага іа Тег оті дев дка АБО Аза баб бух ай ТВР овве тук 3 70 78 53
Яви бій Меї Ахи его іви Ага Аа сів д5о о твг Аїа баї Ту тТук сСух ка зо З
Ат АгО Зі зав онів Туг РВе біу ніх троні Ре Аа Узі Тер обу 160 105 що вій сту тнгобеу ма! тТиг узі! бек о5евб дій Бек ТВг рух біу рго бек 115 120 125
Уа! РНе вро їен Аа Рго 5ег о бес бух Заг ТНгозає біу бі Те аа 130 і155 140
АБ гц біУу Суб сви маї іхж5 Або тує вве о вго піц вго ма тТВеЕ о Уді
1 15 155 160 бот ткуми йсоп че У ІЗ бе; жнНе. Кв йїУу У З ні: ть сх хі по фу Аїд
Зек трап его бБІіУу дій бец тТиг о Бек піу УЗ 1 тТвг опе РгОо АТа ка їх
Уві йви іп Зак обег біу цем Туг 5вг бен хагобЗев уаї Ууді ТНг Уві! ї15о 185 їй
Бго заг бек обеб огрец бі Тйгосій Тйготуг ї16 Суб аа Ууді дей Ні 195 РЕ 203 їцуя Бго ЗегоАвп ТВгозмув чаї Азробує руб мВ бід го рух вт Сух 219 25 ка «210556 «2115 672 «212» ДНК 5 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка -- СНІ константна ділянка гама-1-ланцюга «4005 6 азазтосачі їззбозазЕс зЗчсзоаоза стоатосазс сік чзіяаа сстааасто во тсстатоссоа тоїтссосата стссзітасс тссооастасї соатппазастоа датслоадсдо 1250 чсетсссозах зосзасттов зЗхозззосЯ ссасассх асодсзасіє зассаастах 180 заєссатсєса тоазоЗЗссо сатсассатт тсососоаасо асадсавадя кастЕтТетас ш-О сіссвниоа дсазсетасЗ доссзвачяї астзесотує астастоєоє зсодозаїся Б саттвсттсо сосастодса сттсоссЯЄс тоозоасаоа зсассстсвх Сас ї5О восчстістЇ сладззЗссє аесшатетее ссссстоЗсас сстостссла дазсасстех ча чЧочсасв соспссстоцо сере задзастаєт сесесаваєє дата Б тсЧчісааст садосЗссст зассвосоазе зсосбасасст тсссоастає сствсвакее Бей їсаоспастсї вес сазсеасоасо ассосасесх севосзоасе опосасскаЗ ВШ асстасаєст дсвасасова Тсасазассс зосаазсвссв здотозасва зазаоскава БО сссзаажеКЄ ве БУ «2105 7 «2115 242 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка 4 СНІ константна ділянка гама-1-ланцюга з сигнальною послідовністю «400» 7
МежЖ і ТРроуді тТвк РНе уів 5ег бе іви БВе ву вве Зег зек дз
Х 5 то 15 тук ваг бій узі Бій їви Уа! бід бек біу біу Біж їву Уа! Бій вго 20 25 30
ЗіУу біу б5ег бви Ако сви бек осбуз із Ма)? зеб Бі Туг Бек Ті тВЕ 35 40 45
Зег обі Тук Заг тер Аа тер їі ага бів вів рго бі буз бі цей 55 Бо бів Тер омжі віза Заг тіе Твг отТук ар о біу Бег ТБ дк ТУ Акт КЕО 65 2 75 БО ек маі губ піу Аго ТІ16 тТвиК ТРЄ 5ег АгО АБО Аз ЗаБ руб да ТАК 5 90 5 вве туг бен О1п Мет ди чек іви Аг АЇа біс АБО отТвг дів ма! тує 100 105 110 ту Сух Аа АгРо біу Баг ні Туг РНе біу нів тгтр нів вве Аїв Уві що 120 ї25
Тев о Біу іп бі тТВгобец Уві ТйготУаЇ бвег обег Аів Зег ТВг офбуз пі ї3и їІ5 140
Рг бек уаї Ре Рбо іц Аа бго Зегозег рух заг отве Вк шу оту 145 150 155 160
ТЕ АТа АЇа цев сіу Суз цец ма! бух др Тук ВВЕ РКО о Бгто ув ї95 170 175
Тнг о маї бер тер Аза бег бБіу Аїа грец те Зег о біу Уа! нія тт Ре 159 1855 що
Рго Аїа Уа! бен біп бег Заг біб рец туго бег беб баг бек оуаії уд 93 200 05
ТКеоУщі БКо 5БГ Обег бек ев бу так обій твготТук ї1та Сух дп хв 210 2І5 о ап оНія гу ггОо Зег ап тнгоїуб ча! Ав гу кух уві бін Бго губ ях 230 215 3 еко сує -2105» 8 5 «2115 726 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка -- СНІ константна ділянка гама-1-ланцюга з сигнальною послідовністю «400» 8 діхачіФ тсасстесях стссстаста СЕКСУ ссавсоєста сек БО сзвагсдотоЗз азавтсвЗоЗсой аЗоЗстовеО сявзсстоосо ЗевЗсстовО ЗстатсстЄ ТО сФесобатссв патастссяє сасстссвас бастсосаЗа застава засада 10 зада жннкис уча єс сссакс асстасоася ясЕсааккаа СЕВЕВаСКСу КЕ тест оссосяссас састтсоасоє засзасявсвз адзатастех саке аа зо
Зізаасвцсс пососсзчя адатастасс візтастаст зсосасаача зісзсвітає ї50
Ето саск ссасисоє соссчнива синнкассс ссексаскеє січня г
Естасазазоа зсссассяає ссссссста асасоестссх ссашщсає стстопдцає 80 аслосацссс срюестосст ооссваддас тастссссз заассдатнає потоїсяков 4 дасстсяЗасоа ссстоаассац саозсатасас ассттсссвз ст сстасв посі свопи ЩО сістастссс тслаосавсяї сосоассота сестссаоса осітодасас ссвовсстає ББО атстослясо траассасаз осєсвосаве ассвацатаз зсазозаваї тозоасссвав уга
Ов ТІВ «21059 «2115» 451 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка -- повнорозмірна константна ділянка гама-1-ланцюга «4005» 9 віз маі бів Беца! біб бек бу біу сі сеу муаї бій рго бі ШУ ї 5 їй 15 ек іец Ага фей баг осСуз Аа Уаї Заг о біуУ Туг Зег їі ТВгохев біу в 25 зо
Ту бег тТгр аа ТРИ ЇХ Аго сів АТа РРО бу уз бі бе) сф тгр 35 Бо 45 маї діа ек Ті ТВгоТУуг Арі Заг Твгоахи Туг ода Бго его ха 50 З БО їуз БТУ ага їі ТБг жшіє бог Арго АБИ д5р обег Бу дап о тТВт вне туг а "о 75 БО ізо іп мет ап Зегоіви дпа Аїа пів АБ о Тг АТЯ Уві Тег Ту Сух 45 ща Б аїа га піу Бегонія Тут РМНе біу Ні тТгб нія Епе лів Ууді тгросіу
М 195 МЕ я оту ту щ сх ек ух Бе з де те З. тая С ж ххх ВТ х ух оду ух зів 'сіу Те орео мі ТВе УВІ бег оявге АЇВ Заг ТВгоБух бу го бе ії15 та 125 чі ВВ овсо о їво Аа Вго бвг обег фу его тТвг обеає бі Сі Твг ліз зим 355 зай й й
Ка Аз Її
С ще етркх аю са А се - ОД щи ую ух п и: ни А КРАН ЧА
Аа іву бі Суб із Уві Гу АБр о тТуг РНе вго бів бго уді Твгоуді тА І ка зве ЗЕ
Ка 3 КЗ Бе асо отк. ака Хове сі дій НЕ тв з оо їх З код 1 оці: те х ок а без діа
ЗВГ ОТО АХп его ту АБ БЕ Тпгозег о БіУу Маф нт ТАТ Ра БгРО Аа ї63 150 175
Уа фер ій ве чав ові вв тує ак і зав ще мі маії тв оУді /ЩРІ ву ІМ ЗБК Маг ові Бе отут звгоїед ЗваБ о бег а: Уа аг ОоУда с сУЇх 7 за ел
КО Іо КО
Вго жат бек баг овен одпіу тва бів тТВеотує тіє су5 Ай УЗ! Ада Ні з 200 ях
МУБ го Бек аБи ТИГР оСуз Уві йо цу їх Уа сіц Рко був Бек Сум зу ех з є з тую і і «М х Я а М коми Ан и и ОАЕ А х луг У ЕчУ Ан и У ЧАННЯ хе
АЗроіУ твг нтів ТК Суб ВО РгО Су Річ дія го бів вно огви біу
ЗЕ жа т аг кока «ЗМ Ежее «а кока дм я ії Хічах ху їі Км хх в хи аж й ху не их ї : хх
Чі БгО вк УвР ов ре. Бе Рг ко гу вго Уу5 АБО Тиг о гбеу Мет 24 2 За то Фу мі жук ноя шк ше я ша рифу р я мо чую ВЕ У ті БЕВК АК ТАаг БгОо бів Уві тТнгосСух УДІ У Ма АЗОВ УВІ вк Ні
БІ з ХВ
МІ ХАКІ ГКУ
2-х щ пря я ПК огорож з шу жи з су «т з трак хі зі дв вгОо йБіц Уа! бух Рйе Аки Тго Туг уві АБО обі Уаї бів Узі с тус щі зх
НІ дай Аїд о Буя ТТГ Орух ВЗ Ага бів бБіц ба тує аа Заг о тВкотує
НИ 235 ща чи с першим МО гак Камо мя кою ще ї ях дже ОН
Мгц оУВІ ді Мак Уві 83 вгочаі бе нія бів АВ Тк ви А ву
ОН Іо 5 2 тане зу; стер оф биуж іме мя ско де педа щу кт ад ошнав тк уз Бін ТУ бу Сух зує Уаі щЩег Азв обу Аа ав ро дід его їв 325 зо ї35 вени чн ЧИН а жан ке АТ се віл сен х нет пухку и ух АЛ зі ме тб Оої1е Зб СУБ вів Су віУу Бій ВР Аг Біб БгРО бів ді 345 чка
Жук ТБ іо Вко Бго беб о дго біз бій Меї ТР осуб5 дя Біп Уді бег 350 ї65 ви ТК осСуУх ви Уа! уз сбіж вве ТуУуг го 5ег двр тів ій мі
ЗО 5 їв тк Зі Зак ай пі бій бе 5 аАЗп аа ТУК ме Те отТвКовко вКОо ве що 35 ще ча! це ав 5ег Ахв 5іУ Баг овйе ве грец тує Вб обух беи тгоУді 05 -О 15 азв вух Зак одга їго бів ціп Зіу ап узі ває его Су5 бегомаі Меї
З 35 А ні Ззім Аїд ївм ніх дей нта Ту ТВк бій уз бег во бег бем Хег 440 45
Ве пі Суб не «210510 «2115 1353 «2125» ДНК 5 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка -- повнорозмірна константна ділянка гама-1-ланцюга «4005 10 пледтосаєє тозсосаціє оазгЗазаза сточрасяює стос сота ВО тсстатасса тпіссобата стєсвітасс тесфтасх сзбнаєта Зассадаєай 120
ЧетссспЗях зпозасесоа стр езва тссаксасоєж аеоасстс взассаавсках їКо засссзтсса засос сатсвссат серовсо асо нзав ТАКА щи стссанатоза яасаосстосо бассоавоавї зстассЗтоє астястосВс песо ов. Зо свттВсжтсЗ зЗсзсхаасВ стхсцесатс соподаєзЗаа пса сао ЗБО висцстеста савани сіпоцїао ссоастеосс сатсатсова ЧСС о чонцисаста сс сва СО сстсято заоцасвасх ссссочачсс засо зко опточаса ссазасссст зассозасоча асасасассє тес х стоасаціса ке задсщсстеї астссстатс вісвеїтоачео ястасссах ссвосжсятї падаасссва ОЗ звестясатсх опсзавогтона ссасваасст восаасассв заЗсконсяя пзвавакецо вва печених пфізасазовк спсасаств сосках соска соая астастоца тей пеїсссВвсо сет стахх сестссвазо ссозазонся составіЯаЕ сс саВє т сні сєз сага пос все їсвсатовооз асссацааах озазЕксаяе ЗО тотасзтоз авізасотсоди завтсєсасват одссававста аосссвувув вЗзазовотае З ввітсансс ассозсекої чт зба тас вІсвопакта зогосес а зацшантяся зессванас зсссаасвао состава сасєсоасоа бзвавоссвє їОхО тссзвацсза за свасс стазадааєсь сазасстаєз сассаєсасс ассасодова ТО плавенестя аваАятсеаЗК сесасеца татів заз а сс Іо дхтшсситиЗ ауто саасокм ссвозовавов аокасВаає ша Ка Та зстшстевнесю спас с ЗЕ зсув є СвссесоЗ свЗассооца та швшесншксеи азасчсвке стоку са савта зацссокска свассововах КО ассснанацкх сествесесу проаосдоза вза 1355 -2105 11 «2115 469 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка - повнорозмірна константна ділянка гама-І-ланцюга з сигнальною послідовністю «4005 11
Має сук їгроУуВі тТйгобБе ї1Є бег ве о рец Ве реє Ве Заг ве Вів 1 З 18 їЗ
Ти баг бів Узі бів іви Уді і ек обі бі» 5ЗіУу гер узі Бій го
І зв І 5 Й й 7 іх о си З сію зу заг іви акЯ сен Бак Суб Аїда Уві чего бі Тук бек Т16 тТВе 35 Я 5
Баг обіу Туг бек Те Аза то жів го бів дія го Зі рук біу фев 50 55 ВІ йпім Тгтвомаї ліз аб Хі те тук Або фу «сег ТВНг ох ТУК АЖ бге п 7 УЗ о що я З зах чо чи пн се и З а лу де ПИ Я ха р ах заг Маі буз Бі ак їі тТнеоїій бБегоАга АВ АЗо Заг БУ Аля ТВ 85 щ З
Би тТУК фен Осій Мет Ах оБегофев Ага Аїа ів Або о тнг ліз хаї Тук 00 ї05 що
Тек Сук ад дга сі Шек ніх тує ве бБіу ніз тез ніх вне АїВ хУді
Тр і20 25 тТРвооіу Бій оіу ТК вен ха! Твгоча! 5еБ бек дід Баг о твг бух сію
То її ї140
Бгто его омаії Ра его мес АїВ го Зег о бегобух бег оте бек о біу сту 145 150 1155 їФо тТвВке о діа Ага Беу біу Су во ма! руб АБО тТУК вве Ра бр вга ма 155 17 175 чую СН жу УЖ ру їх Скре ж 51 З о А а зак зх СТ
ТВгоУуаі бек тео Аа шаг о біУ АТ фе тНг бе біу ма вік тиБ вне су 7 з су. Ех ї1КхО 85 190 иа ї х ре ТУ З 5 щі Зк К К-хя оку ж с 1 хіх УК ех и аж вм ї 55 яку ах 2 у з су
Кт ме мк МАМО ме сш І СК ТУ м ща ис заз шт же: че А У бів баг о бег біу їву Тут бег івц бер баг о уві уз
Ка: 205 тТвгожді вра бек обег о беБ вен ойіу Тк о дій ТВкБ тує тів Сух аа мд! за КЕ Й З
А каще я А ДАО дока її о вози Бех, Кк У Бе ху УЛ о дае ї джке гу м жу міхи їх да ні був го 5ег аа їбг обу Узі дру бух Уві Бій вга Гу т | 38 5 | Зщ
КУКИ рах Б Ж У звгосСуб ави фу ТВ Ні тВгосу5 го орвго Су вго АВ вро Бі Бей 45 850 235 тах ох Же ру ху тя Кч уж о ха жк кує хіх ех Сх пец піу БіУу Рго бек уд! БВе ба ве Бгто вгРОо бух ВГО бух АБО СТВ,
ОО -О5 ТО ї їх: дир СИ о Уа рах тю У, т туя Б АН ге зи ГО сеї іви ет бів Зег заго ївговго піц Уді тТнг Суб Узі ді уд! ахроУд! ни5 ак 285 том КК АЛЕ ши кашу Жах її Уч как м ск хг зум я кА зх Ка пат кю лак аг оНнія БИ аАшо Рг пів Узі бух Ве дай Тер отує УДі дж бі ха
Б 5 з піз Уві НІВ Ах АіВ Суб ТВгосує вро ака віз із бій ТуКк вва Заг 5 т 35 320 тура кі вона і ке кум вн фу Сфдах хи ом стик зву мух ї їй
ТвВготУв Ак оУаі Уві баб оуУуді це) ТВК В рен НІ Бін Азов тк ев 155 330 5 вай ру БУ бін ТУук бух Суб рух УДі Хег о д5п бух діа Беу вгО АВ 14 зах З дак та й; ОН ж Ж Фу фут ії шо Зх куучух кое КУ; гу
Вво її біб бух ТВК її бек уз із бух біу бій го Ага обі Рг 5 ї60 їБ5 ші рел не : ки шах жах ек У: дере З фон дух фе «іп жа Тук ТигоСец вго бо Зег Ако бів Фів мес ТВБ бух ав дій
Ка ЗУ ЗВО ре яз я ТУ а а о Вч восхеу; 2 2113» ВЕЖ тек Ве хв ве ж із пов НИ ЯК НЕ У ін УЗ і Су З НБУ вне Ї КВ Рг хе: АЙ їте дід 5 що 335 В
Уві Фів Тгвобів баг аа бі бій бго біб Ап Аза Туг ру ТВРОТВР
С я
Рг Вго Уді ге АЩо 5ег Ар обіу баб вне ринв їеу Туг бек Буз Вау - 7 Ук сх
У 425 430
ТВк Уаі Або Суб бек Аго Тго об1ївБ Сів біу аз узі ре бек су» явкг 15 440 445 узі Меї ніх бі: Аїа Єви Ні Ап Ні Туг ТВк бій рев бек фо бек 30 435 о іви ваг овгО бі вух ща «2105 12 «2115 1407 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка - повнорозмірна константна ділянка гама-і-ланцюга з сигнальною послідовністю «4005 12 аЗвезсзне ткасеетсиЕ стсестестю вЕЕстТоКЕсТ сесзасвста сс саваЗКо 5О сашссоВстОо засродаєви аоБастаеєо сазссснко заасстава соєву в шко засВстссве тасстссає сзссеса зсзавісВ воза ік чозаааодас стаз ща сасціссаїє всстасуасо зсксаассаа сова в тссзугоазаоо зессатсає саггтсососє озсобасачса аздазовот стасстекай БЕН пмааслосс ХЗсооссоаа заавтастосс скатаєтаєт засососоацдоа вісвсвутиє 35 тес сасе зЗсасжесЗс соєстодода сВооасєзссс тсотсастї стсовасосї во тЕтасвааовз зсссстссвВе чЕсессастЄ встссаїсат салацтстає слоасоачацас 480 зи нлчс сс сосоааеяасє тасеЕсссоо висозтоас сот З40 мис ссстдасс спон сасає воски ссоа сосок дес оє що с жаст сто саме осо тоавс соці ссв састозяає сесзавсюєа БО зістоєзата затсасвя зсстяченас зва зовадфеанеє сазосссава Б щкоцизнсв зазвсісасає стцссс со гОсссщнає скозастист поза сх -Ка щфесажстЕТс тат ссКес заанссвай озасасастеа сааЕсеКссв Сас ща шсасіттеасо ос оаЧа спів сясяї сою есвоа зоцтаваціх сааоа сах щк зпопатоесяі сецашатеса савідсєсвав астацєсся чадазозаєв зовсааевсо чо весна сечтчсосе зсЕсасаОво сна сина акта Суду МЕ їтасзадіоса аапсвсссай сладасостоа ссасвассаЯ ксЗлозааає сасктбсвай 1955 порнимюас здсстіаоооа асстсаааЕс ївсасостис сассятсясо зозауааке ьо зстзацазіс запїстсвсх застосо чідаапаваЄ сттассстаа сосвіхасє ПЕН чинна ацо авіссвасоз ссавссвоазо азсавстаєв аваскасссс тоесвоектє ищИ зЗасісозата засос сстттастсо засотсвосо тозатаацеє соощеоусво 15520 сазеазлазсв састетестеа стсеоаа о сзіцааносс сага свое сва 1350 вачісоЗскує ссссуссвсс сода Її «210513 «2115 25 «212» Білок 213» Штучна послідовність
«020» «223» ЕВ НІ «4005» 13 сів У бій ван Уа! бів 5ег біу СТУ віу сей уаї бів Ро сіУ б1у 1 5 Іо 15
Заг ів Аго вп 5ег сСуз лів Ууді 5ег 20 У «-2105» 14 «2115 11 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВНІ «400» 14 соіУу ТУК обек тів таб БВ бі тує бе тт лай ї 5 10 «-210515 «2115 14 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕВ Н2 «4005» 15 тт оїтв др біз АЗіа вго біу губ біж без бів тро омаї Аїд ї ії зо «-210516 -211516 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВН2 «4005» 16
Заг о хів Те о тТуг А5о біу Зако ТВгт о Ай Туг дп о вго бегоУуді су їх ї 5 ІК 15 «-2105 17 «-2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕВ НЗ «4005 17
Ага жів твг жів баг о Аго Ар оАбв Заг Су; АвпотВгоРна тує Гео чіп
Мес Аби ег реч Аго Аза бін Авр тн Аа ма тує Тут н АТ Аг «о 25 З «-2105 18 «-211512 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВНЗ «400» 18
Фу зве нів туго Рне оїу іє тер нів ене Аїз Уві «-2105 19 «2115 11
«212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ НА «400» 19 тв обіУу віп Біб тк рву Уа ТВе Уа! беб 5ег 1 З Що «210» 20 «2115 111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка легкого ланцюга «400» 20
АВ Ктє ій фев їйК осів бек овго б5ебозак Кен як АЇв явг оба о1у 1 5 10 ї5 ази оагоа УВІ Твготів ТвгосСУХ Аго АіЗ зЗвбобій Баг Узі Ав отУК АЮ 20 ще с сіу АБ Зак Тук меж аа Теротук бів сів іх го бі ме АВ о вго а 4 їжа сем ви бів туго Аїя аа бекотук ен бій 5ек обі Узі Бго 5Вг
Б 55 о дк вве заг ці бек обі бек обіу ТВг Ав вне тТве рев тве хів ее
ЩА т 7 що заб івн бів го біз др вве АТа ТВ ТУуг Тук Су бів бів бек нів 5 що З5 ів ашо вго Туг Те вве ді бій «і1Уу тр орух Ві бі 1 був
ІНН т8х 38 15 КАХ МИХ. КОДАХ «2105» 21 «2115» 333 «212» ДНК -213» штучна послідовність «220» «223» м-ділянка легкого ланцюга «400» 21 затв ссвое базвсїсвдає сссепостса стстссзсже ссотоцоЗаа палат БО іст пасвіссса пісватовас саспйсоваЯ зстсстасах заставка х ї2о сздсаоллус ссфіааавос сссзааате стовістася ссосстсата ссттодадос іо «час соссте сососттстс Зобазосоою ссудасасса агттскасосї зассаїсУ що тво зсаос сззаодасеЕ сосзасттяс састоассзає зоїсссавсла соасссстах Бе мет оасєс яоззаассяй зассоалатс аа ї14 «2105» 22 «2115 129 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка легкого ланцюга з сигнальною послідовністю
«4005» 22 мех цу Тер Уа! Тк РОе 16 Зег цез іву Ре іеу Ре бег обек Аіз ї 5 т 15 тТук щагк ав їі бій іжу ТК бів баб ге бек бер ро хек аТд ве й о тк. з
КО й КВ
Уві піу ав Ага Ма! тк іє їТвкоСух дра віз Зеб біп Заг У дяв 35 я 45
Тжтг аБоробі АБО г тує меж деп їгО тує бій бій мук ВГ ОсТУ бух
КН Ух БО діва вгОо ух свв їем їїв Туг а! Аза Заг оту" сер об) Баг ові ма т 75 ща
Бгто заг ода РБе бег біу бек о сфіу ек обЗіу Те оазо вне о твгобев ТАг 35 ща З5 їі ек баг ге бій Бгто біб Азробна Аїд те Ту тує сує бів сів ов 105 що зе нів бід ази о БРО Ту ТгбОРВе біу Зій ту ТВгобух Узі біб тів 5 ї2о 125 «2105 23 5 «2115 387 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка легкого ланцюга з сигнальною послідовністю «4005» 23 атязвасооо ксасскісат стссстнсе іс тсЕ сстоссзсета стос щЩ состав тє задапеєссоцаа стсастсжсс зсесссосою зооасаоааає пассатевех ї325 тоссосесах сссзатсовах одастасвас созоаасєтссх асатадасто зтассаВесВу 180 зачессовааз задоєссваа детестоаес сзспсКоКех сатзесітчв засос КЕ сет хстспоцаву сзазтсвн всесвіт єв сесіозассає сс снеу ТО стфрсоовос асттсасозс стзетастос сзасвоїскс асдлоЗасес статасаттх 150 ззссазосаз ссввоцієса зассваВ ЗКУ «2105» 24 «2115 218 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка легкого ланцюга -- константна ділянка капа-ланцюга «400» 24 ав їі бів бао тТвгобіпй Зек реа бег Зегб о вбец Бак Аз бек уді б1У і х 10 15
АВ Аг Уві Так її твКоСу5 Аг Ав бек бій бек уві Ажв о Туг АБр 2О ах 30 іш ав заг тТугк Мет Ав отТгв о Туг бів біп бух вго біжу дія вго 15 Бе 45 їУуз сви ев ків тує від Аїв бек Туг сви ів бвг обі Уві вро сбег
Б) 55 в
Ага РН Заг озіж бек обіт ек бі тТвгоАБроРвйе Твгосву тТВг бів 5ег ща г Кк ЕІ
ТЕХ о З шу ання 5 Ком ч же в : ах ку т Ух яко бю ук жи ит «о ж я Фошу кю БІ
Его ев бів го сів а Ре Аа ТВ Тув Туг су Бій бій бек НІ й Зо ЗУ цій ав5рВ го Тук тТВг ве зіу сів біу ТигорУ5 УДЬ ЗБЕ ТТ Був Ага і а 105 на
Бе БУ КИ
ТнНгЕ Уві Ааіа Аїд о РкОо бег о уді Ре Ті вне РКО Ре бек Ав ові й 15 12 125 іви вух 5БЕ ОРУу ТНг АТ ЕГО Уді Узі Ку Бей еп АБ АБИ БВе туг
М 135 ії вто дка бів АВ Гуз Ууді Бій ТРб обу Уві Ав Ап Аїд ви бів Бе їх ЕВ 155 БО пік дви бек зів бій еко Уді ТВРосїо сій Ав) Зег ої уш АВ Яве тВе 1655 ї17О 175 тТуг БЕР о вви Заг ес твг овец Те без его губ діа АВ о туУК сів фу 180 ї85 390
НІ бух Уві ТУуг АТя Сує Зі ма! ТВгоніх бів о біу ге его зве овко ща 200 205
Уві тк ру Бак вйе дей ака С1іу Бі Су
ЗІ 7 Ка Кк й й
Оля од «2105 25 «2115 654 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка ж константна ділянка капа-ланцюга «4005 25 прита стсвас тазстсаоао «ссзавстсо сис ссеотаЗа садах. г аісасжжео: децевжссса зов с таподсвоВО всжсстасат зазастюмах Та папсщьенс сеззаавоас сссЯНнЖсаЯ ствах сенс ССО 18
ЧусцкВссЕЕ сясастжстс фивесзцю ссобЗсасса австсвкосх даєсагттсе я тсассосвос саме скЕ сосовскс тастассаз зУбсссасза чазвсссотах цю всі жасюєс зоераассва Зоссоавато дазопсатасоо хаосоазсссс акстоее Я ви есссовс свісцаісе Зсаохвоайа стоЗаасюа сбістектоє зтасстасто чЕв ззІдастїст вісссвузоаа засслазоса сзОаоашк споаівасоє сскесасу о паза с запала? сзслзачсвоа басєвзоасазва зсазсвосЕа саке 40 зжсвссстоа состозаосая азсзодстис Забаваєвсв вааотстасяє стоасоваЗЕе юю зсксатсвци та сіс еккаісвсв задавав асаоЗоса Ох в «210» 26 «2115» 236 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка -- константна ділянка капа-ланцюга з сигнальною послідовністю «400» 26
Мет вух ТгО Уа! ТВгоРве ЖЕ 5евг оіввобец Бе фен РНЕе бек Заг А1З
З - іні Ж НЕ 5 я ву КУ КЗ
Туг Заг авр тів сій веб тТйг бів заг оБего бего5ев ів бБегб діа ет й 25 5
Уа ші аз Ага Уді ТВк жі ТБе Суб Ага Аїд его овій Зег УуДІ АБ
КО 43 45
Туг Ар оаіу Авроваг тує Мет Аба ТР тує ба бів Сух РКО біу ух 5 5 що дід вБо бух рев Бе Хі ТУуг АЇз дід бек Туг сечо бів бек о біу Уді п 7О Ка во вго 5ви аг вва зве обі Зб обім заг обіу ТКА РЕ ТВ осв тА ме з а5 їі: 5ег баг бер бій Рго сів АБО о РНе дія тс отує Ту бух Тв дій
НВ 105 ци заг ні Бін дай рев о тув твРоввв бу бій іо тве реооке УЗ пвх загоні Бін АБО вро тує ТВгоБйе бБіУ цій 5ЗБУ ТНгРоїУу5 Ущі БІ Тв 15 120 ї2х5 ре Ка Тв чаї А1а АВ Вр дат Уа вва її вна вк ВкО двк дев
ЗМУ аг пт дк дів вія Вго виг ХВ вп зе Впе о бкбБ го 5вг АВ таб 135 зай во До я біш бій сви губ зЗвгбоціу ТНК Аїд ЗК о мді УЗІ Сух Себ гец дай лей 143 150 55 Ко впа тує го Агу бів АЇа бух Уді піп откросцух УВі дхр о А5п Аїя уец
М 170 їуУз сів заг осіУу аби Зег обБій бів Бек оУаії Те б бів АБО 5Вг Був АВ їва 155 їі
Щак о ТВготТуУук Бк оїви бек обеє ТВг обеу Твгробеу Заг огруз аа Ар о ТуУг 1 па Ох
Бів куз Мія зуб узі ТУук діа Суб Бі УдДІ їВг Ні БІВ біж це Баг їв їх зе
Заг Бгто ма! Тс оБбух хек о бне ап Аго сіУу Бі сСуЗ «-2105 27 -2115 708 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» м-ділянка -- константна ділянка капа-ланцюга з сигнальною послідовністю «4005» 27 атодаосзао ссасст стомат тт сетссвосте стссоатаЕ ВО сазстчасес жвасссоазва слсаскстсс зсттесосю ЗзаззізоавУЄ пасе есВех 128 щшссачшснЕ сссаЗтсзах постає сасастссе зсвкоазасте саке Іо зап сооаз вк сссааа Я тоахє їаснизЗвї сатасстіоа амнчнноа Ра тсттсСоесаЄєх соска спос ассеасстса сестопдесав тс Оост БЕ своассзоаоо Всі цис КтастастЗзс сазсваїссс зсопоавзавссс стахасокх ЗБ
Ффсецкщяя ссвачагсоз азісзвавсцЕ засос засоав ссесеатсіс сетсяесс Я кассзио ат Фаза с сода астесетсто стос ащє зстозванас ко їіствісссз сазаоЗссла зотасацізо заобтодатаи асдеестсва звісвни вас 530 кс пааз сосптсаснеяа см своє звобзсаасе сеасаВвсск садове БО стоясостоЗя осСазаосеца сіеасочазаца сасавасї звеосскосца абсвессає БО сне оСтоасєсах сазсзаазас ста Запах ОВ «-210» 28 «2115 23 «212» Білок «213» штучна послідовність «020» «223» ЕРНІ «400» 28 ав тів бів іво тТВг обі бек оРго бек Заг орец хг дід его мді ціх
А 5 то 15
Ар оагц о Ууді Те же таг Су «-210» 29 «-211515 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВІ 1 «400» 29 дга від Зв Бій его Ууді Ар отТуг дав о оїу АБ о бег Туг МЕ дум ї 5 ке) ї5
«210» 30 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕВІ2 «400» 30
ТтвотТуУє біб бій вуз РГО БіУ УЗ Аа рРГО рух Цей бен жів Тут 1 З ій 15 «-2105 31 -21157 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВІ2 «400» 31 дів ід его тує реч бів хет
К. З «-2105 32 «-2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕВІЗ «4005» 32 сі уві Бгто Заг о АКО РНе бек обі бег біу Бек біуУу тТвг ойхв вве тр ї 7 12 15
Мец отвиг оті Зего5ек ве бін о Рго біч АБО вве дя так тує тув Су
ВІ Ка 30 «2105» 33 «-21159 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВІ З «400» 33
Фів ців хвг ні Бі) А5робго Тук о тве
Х. З «-210» 34 -211510 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕНІ4 «400» 34 вве дію ів бБіж ТК був Удї біз жів бух ї 5 10 «210» 35 «2115 111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» М-ділянка з 5Хб6ОМ 5778 0798 «400» 35
АвІ тів віп ів тТвгобій баб бро 5Зее бегоівц бек дів Бек Уа! вію
Її 5 То 15
Аза Аг Ома! Тнг оті твтг о сузх Аго Аїд бегобіп бег узі АБ тує зв 2 о З сіу АБ; бас Ту мес АБ ТгротТуУК Бій бів ух вго біу суб діа вго ї5 о яв зЯжв вен оіви ів тує віз АТ бек оту вен бів б5ек обі Уді Бго Мет 5О а що дк о гнЕ его піу бек бпіу Бек о фіу ТВг дж Бе ТНК Ге ївт їі 58 7 5 ще ага івн АБО Рг бів аа Бпе Аїя ТАК тує Тук Сух зів бів Бег ві 85 Зо З
Зі джхв вгО тТук Таб Рна бі бій 5зіу твгогу5 Уа ЗР Ії рух
ЕЕ 115 о «210» 36 «2115 333 5 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з 56ОМ 5778 0798 «400» 36 цасаттсває сеастслевноа ссосолостсз стстссасЕх ссокооав Сара ЕЕ аиліокс зчзвсаксосса воза гзсЗасзоаз асісстасах зааскає 80 саасвозазс ссооажен сссзадоскО стазтстасо ссоссісвта сеттозавоє іо циасцтаєста сассивестс сфопалесозо тсазЗаснссо втстезссєю асо ай застає сешоеншасех созсодсттає стастоассвяс зобессвсооа бовсссста мо зи ттеєс аашмассайа сотсозавтє аа 333 -2105 37 «2115 129 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з 5ХбОМ 577ВА О79В і з сигнальною послідовністю «4005» 37
Мет бу ТввоУаі ве вне тіє баг огец ів ве ів) Ре баг бек Аа ї 5 10 15
Туг баг ах тів сій іев ТВ одій дек орга бек баг огец За" віза ар а 5 їо
Уа! йіу а5р Ага УВІ ТвК о ї1і2е твг осСуб5 дго АїЗ Заг обів Зег оУуді ЕВ
Туг ази біу ахр его Туг Меї дхи ТРротуг сів бій уз Рг оту ух 55 0
Міа вго уз цеи вкец їі Тук А1іа Аза ЗВГ о Тук івм ій Баг о біхж уд! 55 та тд І
Бе Мат ага вне 5ег обі бег обі зак дію ТВг одер ва так офрец тв 85 За Ку їів дек аго реб ага го бій Ав о впе дід ТВготуєк ТуУуК Суб бій бів
ЩЕ 105 це зак онтя бів Ар вго тук тег оРне біу бій біу тТне бух Уві бін хте ву 120 125 «210» 38 «2115 387 5 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з 560М 577В О79В і з сигнальною послідовністю «400» 38 акозвосацо гсасстесат стссосюсра кс ташс сстессосста стссоакатх 5 савостовсЕс зозасссоза стсвстсвсс Ст ссай аа вовах даковмох ЕВ тассозоасяЄ сссзавсочі дозстасовс созоастске зсакузаєта чівісвуєиа І завсссоцав звассссзза зпстоставЕс свсоссцєсю свівесквуа ав цеа 24 ссжатосаст тстсзсозза сао тсоадас азссовіїїсв сосбтавссах сЕсувоВска Зло звасссчаама зсктспасоас сівстастцс сбзавобазтссс зодацазссє схвізсакх ЩО здасслодава ссладагсоза ваїсаво 387 «210» 39 «2115 218 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка з 560М 577В8 О79В -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе
І154Р «400» 39 ач Бі піп фев о твгобів ее о вБго баг обег ви бек Аїд Бек узі оту
ЩІ КЕ та тк
Кк й м «М аВроаАгОа Уа Тйг їі тТвВК Су5 Аку аз бБегб бів бек Узі Ар Туг Ар кеВ 25 ЗО сіу ав бак о тук Мет Ав їко тує бій Біз бух вро пі су дів вго ї5 ча 45
Муз бен ої) жів Туг ліз дій 5ег тує сечо бій Бе пі Уді Бго Мет а З 5О
АБО РЕ бек обі бек бі бак бої Так о АероВВе ТВг Бен о тВе хів дек йо 0 У І ага БИ Ага вгО бій аз Ре АТЗ Те Туг Тук Сух бій бів Бек ніх 85 БІ 25 зів Ай вго Тук ТВе РВЕ СТУ сій БіУ ТВг обу УВІ ОТ ТТ Бу АгЕ цю 305 ща
ТК он! ліз Аа его БекоУуВ! РН Ті вне вро бро Зак ода Зі бів
М і20 125 іви буз его Біу ТНгРОоАїа 5ег о Ууді Узі Суб сер о сец АБИ Аа РН ту
ЇХ 135 ТЯ вгору Бі Аза кує узі ств ТР бує Уа! ар дхи аів его ів зер тах і5а 155 ї50
ФіУу йажи бек бій Бів Зв оУузі їваг обі бій а55 бегогу5 АвроЗвВе ТА ї65 170 175 тТУук аг Ген бер обеє Тв орен Твгобев Зак бух Аїа АбБр отує 51 бух цю їя5 ЩІ
Мі уз УЗі Туг дів Су бів Уві ТвК нія Бін сіу рен бак 5ВгоОвго ї95 Ра 203 чаї тне вух его вйе деп АгОо ві Зі Сух «2105» 40 «2115 654 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка з 560М 577 079ВЕ -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе
І154Р «400» 40 цатнттсяос саастсвова сссмОстся стр ссеоастоооооз зав тпнсс ща актсасічне зЗаосатссса зссозточас басоасозав астсстасат зазстосах ТО саосядаацс сспчааалує сссзазаїта стзатстас ссосстсиа сс 1 зпзсчеасстя тосокжжсс здддаазсююо ссодосассч еВ зассассєсо І зпастоавоос сосаИзаєскх своаасттаЄє кастосєсвас авзЕссеасаа часта ЗВ везти авоочавосва абсоааатс задсогтасоо саосовосес ато: 350 ас тсссоє сасссоаатЗа ссзостозаа сстоЗавско сстсБає зУскоєс че ааїеастЕсе зісссацица пзссааваїа саззаацо птозахазсас сесокадЕсо ЗВО цитачстссс заопзазУєЗЕ Сбасладосзо басзосвань пса сааКсксаа 540 вмиассства стозасза васацасєтає здазазваєсвсв ашрстас сісовавте ОО зсєсвісзов песедвоасітс Ззсссоассвся ддодасттка асани аса соках а «2105» 41 «2115 236 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка з 5ХбОМ 577ЩА8 О79В -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе 154Р і сигнальну послідовність «4005» 41
Мет вуз тТгроУВІ те вве їі вк оіви ви вБе зіву бе баг о хег а1В ї 5 19 15
Туг дво дквВ жів шіп цев ТВК осів Звгб вро бак обег о іву чего олія бе на) Ка БІ ча Оу Ахр йга Уа! тТве хів тТВгоСух аг Аїа ес бій бег У! Ар 35 49 45 їус а5р пі а5р Заг Ту мес Азпоїбр тує бій бів ім вгОо Шіу ух 5 55 5О іа ря фу іван іш тів тує ту 3із Фекотек ів жів как ох чУді щи гтОо СУух Ву Бей З зе туго Аеів дія Баг тує без бі Баг ціУ уд це 70 5 Ні
Рго о Ммеї ага пе звр обі его обі Заг о біу ТВ дрова о тве рез те 85 Зо 45 її бег ага без ага Бко ЗІ Ар вве АВ ТК о тук Ту сСух вів ців ке М це сла парі НН «т ем ср сте ЗЕ А «сту: ее, сн я «7 СИ я загонів біц Абв Рго ту тТнговпе бі бів Бі тав осуз жд) бів тів 11 ТО 125 їж ага твнЕ Уді Аїд Аїв РгОо бев Уа! вве 118 вве о ребо БгОо Заг АВ і 35 14 сін бій оіви ух баг обіу Твг Аа Заг худі чаї Суб сви гей дей АЄЙ ія 150 53 іо
Бе отуг вко ак біб АТя ру маї бів Тгрогу5 УР Ар АБИ АЇа го їв ї70 їУх бів олег ші Аа 5ег сів бі зег уві ТР об біб Азр о Заг орубх ар
М 185 ша заг отнг ТУук Заг оре Заг 5ег тТйг оре тТигогбеу баг ої уз ді АБротуг 155 200 Ох шо
Зім цує ніх був Уаі тТУуг дів Суб бів маї тв нів бІй дім бе ваг
АВ 215 Меч зве ого Ущі Твгобуб бек вне Аби го Бі Бін сСух «2105» 42 «2115 708 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з 56ОМ 577 07928 -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І 154Р і сигнальну послідовність «400» 42 зжпаватоЗца ссасстесає сессстоста БЕТеватТтст сстоесцеста стсспатату БО сзодстоастс зозасссоз сІсастстсс сте соЇТе ЗаЗасаЦяат ВССУ 128 тассапЗсаЕ сссзоатсоаа сс тасоас поза ст ясавЗВНтяЯ засос 185 задсссЗозва авоассссазаа остоастоас басВесосст сасасстта зВОсаас що сстасаст тосЧочадо соодесве ассцакется сестоувеках сосок ЗюЮ завссчоазо азссісосаас стастастоас саясоязКосс асо свв їв зассзваодля ссладоатсоа затсадоасзчї зозаїазсаа ссссаїтстаї сттсатсіс КИ сис Есва Згода Кх саке зсмьКстсто сне остудакаас БО їкстясссса ож сла аосасязсоо дача ка лозоссеоея дДесоЗасяк У щссяозана Зізсясва зсазЗзЗасазс зазасязса сстасСаЗсеЄ сезсацсвос що слово тЗа асвазосвоз ствсваззава саовагаєст ас тасоа аассессає ЕН савщасктоа зесклксках саебаазоааває сосааеВа ану я «2105 43 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з 5БбАМ 560М «400» 43 щі Ма! его Меї Ага оБпе баг обіу его сіу чек СТУ ТВг о АБроРВЕВ ТАг 1 З 10 їх це) тк оїів бегбобекб бе зів вго біз Або РНе ад Те о Тук Туг Суб
НЕО І
20 «210» 44 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність
«223» ЕНІЗ з 5818 5778 «400» 44 дію ві вго дак Або вве заг о Біу баб обі Зегбс бі тТвкКоаБб вна тег їх 5 10 15 мец твг жів Звг Ага Бвь бів бго біб аЗр ББе ад ТББоТуг Туг Сук о в 30 «2105» 45 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з О8ЗА 0798 «400» 45 шіу уві вго 5вгодво ее о Бег біу Баб обіу баг обу ТНРоАВВ вве тВг і 5 1 ї5 сви твгожТе бегобег сен о Аго Бго бів А5ровве Аа о тне тує тук су «2105» 46 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 564М 5818 560М 5778 «400» 46 пік Уві Бго Мек йга ве звгобіу Заг обіу зак обіу ТИР о АБр ВЕ ТВ ії 5 | М | ле цей те жів его аку бец бів вго бів А5р вве дів тв оту" тТук Су 2о 25 30 «2105» 47 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 564М О83А 560М 0798 «400» 47
Зіу а Рг оМеї Ага Ре Заг обіу баб біу дес обіУу ТВг оаБр о ен так
Н 5 їв 15 їви ТАК ї18 Бек ЗВГ гей АгО Рго біз Абр РНе Аїа Твг о тТук Туг суз й 25 ЗО «2105» 48
Зо «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВІЗ з БВІВ 0838 5778 0798 «400» 48 січ чаї вто явг ага вне беб о біу Зегосбіу бек бір Твгод5р оевеотиге ї 5 10 15 іви тТве їв 5ег дбай беб ага вго біз аб5р вве АВ ТВ туго тує Су в 25 КО «2105» 49
«-2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕНІЗ з 564М 5818 0838 560М 5778 0798 «400» 49 бЗіу ча! Рго Меб алго РМпе бек сіу бек о біу 5ег б01у ТНК о Ахв вив тег ї 5 10 ї5
Бец Те їі 5ег Аго Бен АгОо РгОо біз Аз вве АТ ТВе тТУуР тТук бух о 25 ЗО «210» 50 -21157 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВІ2 з 5560 5520 «400» 50 кіз Аіз АБ оту сем бін 5ег і 5 «-2105 51 -21157 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВІ 2 з 556Е 552Е «400» 51 дів Аа вій тут ів бін хвг ї 5 «-2105 52 «-2115 32 «212» Білок «213» штучна послідовність «020» «223» ЕВІЗ з 571М 567М
Ко) «400» 52
Зі ді вРо Заг дга вве бвгоБіу ак о біу 5вгобіу ТВгодяр ве о тТве ї 5 10 15 їви тТВг жів хек Бек бен бій РРО бів Ар ОРЕ АЇВ ТВг о Тук Туг Сух о 25 З «2105» 53 «-2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕВ ІЗ з 564М 571М 560М 567М «400» 53 сі уві Бго мех ага вп Зег о біу Зеб обіу має бі таб АБ орНа те ї кШ 10 15
Мей тнгоїТе баг оБег бву бів Рео бів ахр ве АЇз тнє ту тТук Сух то 25. 30 «-210» 54 «-2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕВ ІЗ з 5818 571М 5778 567М
«4005» 54 сіУу Ууді го Зегодко вве бек обіу бег біу Мебс біу ТВг Аз РВЕ ТНг 1 Й 16 ї5
Без тиг їв Зег Ага Цеч бій вго Біб А5р вве дія тТвг Туг тТук сув 20 25 Зо «2105 55 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з О8ЗА 571М 0798 567М «4005 55 пі Уа! РРО бег дгу Ре Зегобіу бек о біу Мет сбіу тТиг азр Ве Те ї 5 Щі) їй бен тТвг оті бегобег бен Ага Рго біз Ахр рве АТа Тве Туг Тук сСуз 20 я БІ «2105 56 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 564М 5818 571М 560М 5778 567М «4005» 56 сбіУу ма Вко мес ага вав о бегобіу бег біу Мас біу тТйг ар рве тв 1 5 їо їх ев те хе ЗЕг оАКу Шви іп вго Ів Ар опе діа тк ней тТуг сСух де З «2105 57 20 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з БбБаМ О8З3А 571М 56ОМ 0798 567М «4005 57 чіУу Уві БВго Мет Ако РВЕ бБев о біу бек бі МежЄ бі ТАг о Азв Ре Тв 1 5 та ї5 і8и твг ої Заб бек оієв Ага Рго бі АброРве АТМ твготук Тує Сув о 25 30 «-2105 58 «2115 32 «212» Білок
Зо «213» Штучна послідовність «220» «223» ЕНІЗ з ВІВ О83А 571М 5778 0798 567М «4005» 58 сі Узі Рго Зек Ага ей Заб сіу 5вбобіу мех бі твгоавр вве тиг ї 5 то 15 зМен Тиг їі бек АгО Беу АгО го біз АБр о РНе Аа ТЕ ТуУК Тук Суз 20 5 30 2105 59 «2115 32 «212» Білок
213» Штучна послідовність «223» ЕН ІЗ з 564М 5818 О83А 57ІМ 560М 5778 0798 567М «4005» 59 ім Уві Бго Мет Аг Не бег біу бЗег біу Меї СіуУ ТНг АВ рне Та ї 5 іо 15 іен тн хе їег АгО ін Аго Рго біц АБроРВе Афа Таг оТуг Тук су 28 5 За ня г «2105» 60 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з 567У 563У «400» 60
Зі чаї вгО баг оАКБо рив о тТук пі бек обі бек о йбіу Твк о дхв вве отиг ї 5 їо 15
Бевотигс Кі заг о5ек бви бій Бге біб дхр ве Аа тТВг тує Ту сух 2 5 30 «2105» 61 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 564М 567У 560М 563У «400» 61 спіу ув! вго мех ага вве туго біу баг біу баг обіу ТВ одер рН ТВг
Мви твг осів его бегобец бів бго бів АброРае АТа твг тує Тук Су о 25 БІВ «2105» 62 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕНІЗ з 5818 567 5778 563У «4005 62 ціуУу Уві РБго его дго РНе тує біУу баг обіУ Зев сі тВк АБО ВВЕ отв ї 5 о НЕ ви Твг оте беб Аго ви о біп Бге біз або ве ліз ТТГ отТуг Туг Сух «о 5 БЕ
Зо «-2105 63 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з О8ЗА 567 0798 563У «4005» 63 йіу Уві Бго бегбоагу вве тує ссзіу Бек біу Бек о5іУ тТВг оаБрЬ вне стне
Бец о тиг тів Зег бек бе Ага бго Зі АБ о РНа Аїа ТВК Тук Тук Су о 25 30 «2105» 64 «2115 32
«212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з 564М 5818 567 560М 5778 563У «400» 64 сіу уві Рго Мет Ага ве тує бу бег іУ Баг пі ТК др Не ТНг ї 5 10 15 їши так тів бек о дго цей вів Бго бі) аБроРле Аїд ТК тує Тув Сжх
Ку 25 ЗО «2105 65 «2115 32 «212» Білок «213» штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з БбБАМ О83В8 567У 560М 0798 563У «4005» 65 сім Уві Бго Меф Аго бін тТук біу бек біУу Заг обБіу ТБ оАБОо ває ТВег ї 5 10 і5 мез тб їі заг бек івц аАгОо Рго бій Акр Рпе діа ТВ отТуг Тук Су 20 5 зо «2105» 66 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 5818 0838 567У 5778 0798 563У «400» 66
ЄТу уд! Рго 5ег дгу вБе Туг Ту 5ег щу зек оі1уУ ТНК АБО те ТВг
Х З Ж, КУ увн о тТВг оте 5ег Аго сез Ага вго бі) Азробне Аїа тТагОТугє тТуг сСув о 25 Ке «2105» 67 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з БбАМ 5818 0838 567У 560М 5778 0798 563У «400» 67 сіу уві про мес Ага бе Тук бі бек сіу бек сіу ТАБ оАБрорне тА
А 5 їй її івц їВг о її бек Ага без ага вро сін АБ Ре АЇа тТвг о їуг Тук Суб 20 25 30 «-2105» 68 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з 5ВОМ 576М «400» 68
ФіуУ УВІ Рго Заг Ага ба Бек о біу Зак сіу баб сбіу тег оазв вна тв ї 5 То 15
Ма тв ув АхпоБек ву піп Рг бій АБр ене Аїв тТнготук тує Суз
Кк 5 Що «2105» 69 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 564М 580М 560М 576М «400» 69 іх Уві Бго мех Аг ее Заг бі Заг й Зег бі тт аве ве Тв ї З 10 15
Мец Тнг бів дай бБег сви бій Рго обі АБО Рйе Аїда ТВ отТук Тує Суб го 25 КВ «210» 70 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВІЗ з 5818 580М 577А 576 «4005» 70 бі Уа рр Заг Ага Рвае Беб біу хакобіу бек діу ТЕ ОАвВО Ре тТиг 1 5 10 15 цен таг тів й Ага вен вій рго бів АБО РНЕ АТа те ни ТУук сух
М 5 щі «2105 71 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з О83А З58ОМ 0798 576М «400» 71
Бі уві БРго бег АгО Ре бек о біу Заг обу кг о 51Уу ТВгОАБроРне тТве 1 5 10 їх
Бе ТР ТТ Аби бег бе аку РГО сії АБО о Рнпе Аа тТВАг о тує тує Суб "о 25 За «2105 72 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» ЕН ІЗ з 564М 5818 580М 560М 577 576М «400» 72 піу жаї Рго Мет агуо Бпе зЗег о біу его біу Зег бо1фу ТВгоАБро вне тнг
Ії о ї0 15 іжи Твгеоїів Ап одга рец бій го бів А5о оба Аїд ТВг тує Тук сСув 29 т з «210» 73 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220»
«223» ЕВ ІЗ з 564М О83А8 580М 560М 0798 576М «400» 73
Оу Уаі го Мет Ага РМпе 5ег сіу бег Фіу Ззег бі Тег Ахо гне Тне ї 5 15 15 іви тнгб тів кеп ваг огец Ага Вго бін аа вк аа те Тут Тут суз
ТК 3 КВ «210» 74 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕНІЗ з 5ВІВ О83А 580М 5778 0798 576М «400» 74 і УВІ вго ЗВ Аг Ра ев бі бек о ціу Бек обіу ТВ одер рве тег її 5 10 15
Кв отае тів асп о Агу ге дб оБго бій бер НЕ АТа Твг оТує Тут Суб с аа ЗО «2105» 75 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 564М 5818 О83А 580М 560М 5778 0798 576М «400» 75
Зі Уа! го Меб Аг о РНЕ бек бі его обі Заг обі тТаг Ав вне тТве ії 5 10 15 уви тТве жів дев заго іей аку с рга біз Ар оре Аа тТВготує Туг Сух о 25 зо «210» 76 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з БВОМ 567У 576М 563У «400» 76 сбіу узі вго баг Аго РН Тук сі Заг обі ек осіу ТР оазо ввБЕОтТВе 1 5 10 15 ев тТйг о Її1е деп бек оїву біп Ро бів АБ вне аіа ТВготув Туг Су 2 25 3 «2105 77 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 564М 580М 567 560М 576М 563У «400» 77 сі уаї рко мех ага вне тує Бі бек сіу его бі ТтВгоАзо Ре ТВг
Її 5 КК 15 рей тиг Ме ака 5ев ів шіп Рг ів дер рве АїЗ тВг їх Туг Ссух «210» 78 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність
«223» ЕНІЗ з 5818 580М 567У 5778 576М 563У «400» 78 оту ущі вго бег Аг ре туго біу заг обіу Яег обіу Тагод5р орав тТАг ї 5 10 їх рен о їве Ті дхп ага без біб бго бів дб Ре діа тТвготТук Тук Сух за р 30 «2105 79 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з О8ЗА ЗВОМ 567 0798 576М 563У «400» 79 віх Уаї го ек Ага вве тує сіу бег сіу бег сіу твгодяр ей стих ї 5 10 15 ей твг їі зай Зегобеци дга Рг вів Аза обне ад Те отук Туг Сув 20 25 хо -2105» 80 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з 564М 5818 580М 567У 560М 5778 576М 563У «400» 80 5іу ча! Вго Мех АгО Бе Туг бБ1іУу бег о біу бегосіу ТнгоАжОо Ре Тег ї і: 10 її ей тнг хів Аза Ага фе біп вто бій АБО РМ Аїа Тнг о Тук тТуг сСух та 25 30 -210» 81 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з БбБаМ О8З3А ВОМ 567 560М 0798 576М 563У «400» 81
Зі уаії бго Ме зга РВе Туг біу бег осіу чего біу ТБг Аброрйе та 1 5 10 15
Ммевотвг їТів аа Зег бен АКо Рго о1и Азр Ре Аа Те Ту Туг сСув «В Ка БІ -2105 82
Зо «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з БВІВ 0838 580М 567 5778 0798 576М 563У «4005» 82 сі узі Рго о бег о дга вве туго біу Заг сіу 5ег Біу ТНе Азов вне Тв ї 5 о ї5
Мев тир тів вав Ага Сей Аг вто ку з Аза вне АТа ТР оТук ту Су зо 25 30 -2105» 83
«2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з БбАМ 5818 0838 580М 567 560М 5778 0798 576М 563У «400» 83
ЗіУу Уа! Рг омеї Ага рРВв тТук бі чегобіу хек Біу ТВг дер о вве те і 5 10 15 вжи ТВг Оті Аби АгО ів Ага Рго бін АБр оре дія вс тує тує ух
Ка ах 3 «210» 84 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з 567У 571М 563У 567М «400» 84 с1У Уві во баг Ага ве тук бі Баг обіу Мет сі ТНК АБО Рна тег ї 5 за ї5 ман отак бів бек бек рев бів Рго біб Ащз ре АТа ТВг тую тук су га 25 30 -2105» 85 «2115 32 «212» Білок «213» штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ 3 564М 567 571М 560М 563У 567М «4005» 85
Зі ув! РгОо Меє Аг рве Туб сіу ввг обі Ме сіу Те АЗроввЕ тТВР ї З 10 І5
Кей отне Те 5ег зер ів бів вго бін АвБроРНЕ Аа Тпиг Ту ТЖуг Су о 25 Би «-2105» 86 «2115 32 «212» Білок «213» штучна послідовність «220»
Зо «223» ЕНІЗ з 5818 567 571М 5778 563У 567М «400» 86 оіу Уйі вго хав о Аго РВа їуг біб бег біу Меї біу Тнг одер вйе о тнг 1 5 ій 15
Кви твге їі бек дво бен бій рго бів Ач вве Аїв тТЬг Тут Тек Сух 2 й 19 «210» 87 «2115 32 «212» Білок «213» штучна послідовність «220» «223» ЕНІЗ з О8ЗА 567 571М 0798 563У 567М «400» 87 зі Уа го бегодец Бе ТУгб бі бегооту Меї біу ТвВе од5ровве тар ї 5 16 15 вжи тТвРОЇів Бегб 5вг Гео Ага РКО бі АЗрова діа ТВг отТук Туб Суб ще 25 Її -2105» 88 «2115 32 «212» Білок «213» штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з 564М 5818 567 571М 560М 5778 563 567М «400» 88 сім Уа! рго мех Ага вве тує біу 5ег біу мет ту Тк А рае тНе 1 й зо 15
Мец тат Ті зег ага іви бій Рг обіц Ар Рйе Аїд тТАг ТУг тут СУух -2105» 89 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 5Б64М О83А 567У 571М 560М 0798 563 567М «400» 89
Зі Узі рго Меб да о Рае тує Біу Заг обіу Меї біу Тнг дар о Рве о тТве ї 5 10 15 ів Так тів Зеб 5егогрен одга Бго бів АЗр Ре дія ТВготує Тук о сСух ка. 25 30 -2105» 90 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕНІЗ з 5818 О83А 567 571М 5778 0798 563 567М «400» 90
ЗТУ чаї рго 5Вг Ага вне Ту Біу бег о Фіу Межх 5Іу ТНК ОАБр РАВ Тв ї 2 1о ї5 рец о твг оїів его Ага сем ага го сій А5роРЙе Аа ТВгоТує тТук Суд хо 28 ВІВ -2105» 91 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» ЕВ ІЗ з 5Б64М 5818 О83А 567 571М 560М 577 0798 563 567М «400» 91 зів уві вго мех Ага РМНе Тук Бу бек б5іУ Ме 5іу ТНгоАБрорне тав ії З 10 15 цен Те о їїе зег Ага їец Аг ро ів Ар ОвВе Аїа Те Тук Тук Суз 20 Ко ЗО «2105» 92 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність
«223» ЕВ ІЗ з БВОМ 571М 576М 567М «4005» 92 бік Уді РКО ЗВГ оАко риє бегобіу бек о біу Меї бі ТВг дрова тНг ї 5 ї0 15 ви ївВеозі6 йвап хероген бій Рго біз дер вве о АТа ТВг тує ТУук Ку о 5 зо «210» 93 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з 5Б64М 58ВОМ 571М 560М 576М 567М ( «400» 93 сі чаї РКО мет ага вне бек Біу хек о біу Меї БіУу ТВ оАхв РН ТВг
Н 5 То ї5 уво Те оті Аза его гео біб бго біб А5роввае Аїя Тв о Тує тує сух о 25 Зо «210» 94 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕНІЗ з 5818 580М 571М 5778 576М 567М «400» 94
ЗіУу Ущі Бко аг АгОо РЕ 5ек біу бек бі Мет оту тТагоащі рве ве
Х 5 10 15 іви тТве Тіє да Ага сви бій Рго біз Аве вне дія ТВ отуг Тук Сук 2 2-5 за «2105» 95 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з О8ЗА 58ОМ 571М 0798 576М 567М «4005» 95
ЩіуУ УВІ Ко ЗЕйг АКо рив бег біу бек біу Мет оіу Тк АЮ впе тве 1 5 10 15 іви Твг хів ашп о 5ег бви яго РгО вів дер о вйе аїа тв тує Туг КСує га 25 30 «-2105» 96
Зо «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 564М 5818 580М 571М 560М 5778 576М 567М «400» 96
ЗУ Уві Вго меж Ага РБе БЕгобіУ Баг сбіу Меб біу ТНг АБО вне таке 1 5 10 15 май тВг хів ах Ага сви вій Ро бій) А5р о РН АТ ТвВготук тує сСуз то ке КІВ «210» 97 «2115 32
«212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з БбБАМ 0838 580М 571М 560М 0798 576М 567М «400» 97 5іУу ма! РКО мех Аг бе баг обі бак обіу Мет біу Тиг одов РНЕ тТаг ї 5 їО ї5
Меч тВе сів аА5и бебоіву дга бко бів Ад5роРйе Аді тТве оту туг Суб 20 25 30 -2105» 98 «2115 32 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» ЕНІЗ з 5818 О83А 580М 571М 577 0798 576М 567М «400» 98 сі Уа Рго бег Аго РНе заг обіу баг осіу Мас сіу ТНг оаврорНа тАг 1 у 10 їх ів ТР ОоТів Авп Ага ец Ага вго ція АБр о РнНае Аїда тат ЦП Туг Су о 25 БІВ «2105» 99 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 564М 5818 0838 580М 571М 560М 5778 0798 576М 567М «400» 99 сі УВІ РРО мех ака вве Зак обі бек біу Меї сіу тТАР АБО ВВЕ ТВе ї 5 10 15
Мав оте Кв соя Ага Би Аго его ві п оАБВ ве Аа те 1ує туг Сух 20 5 Зо «2105100 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з БВОМ 567 571М 576М 563У 567М «400» 100 спіу Уві го бег АгРо вйе туг Ту 5ег Фіу мех сту Тнг о АБр ле тег
Мер о твгоїів ди Заб орео бів го бій ар Ре Аа Те тує Тук Сух 20 25 36 й «2105101 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з 564М 580М 567 571М 560М 576М 563 567М «4005 101 су Уа! вБго мМеї дго вве тТук б1у Бак віу Має біу тТнг Азов вна тар ї 5 Мо 15
Мей тиг їі да бек сац бів гро обіц а5б о Бпе віз їВг оту ту Су 29 5 БІЄ 2105102 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з 5818 580М 567У 571М 5778 576М 563 567М -4005 102 сі ма! го баг одго РНЄ Туг біу 5ег обі Ме бі ТВг одхровае те ї 5 іо ї5 іев тв їі ав Ага во зів рРго вів Азр вне діа Тйг туго тук Сух а 25 їй -2105 103 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з О8ЗА 58ОМ 567 571М 0798 576М 563 567М «4005» 103 сіу уві Вго Баг ага вБе тує біу 5Бег біж Мет біу тТиг о азо ве ТВ ї 5 10 15
Ме тиго тів ей бег Їви Акад рРго пі АБИ вве аЇа тВг 1Туг тує Сух «2105104 «2115 32 20 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН ІЗ з 564М 5818 580М 567У 571М 560М 5778 576М 563У 567М «4005 104 сіу Уві вБго МОХ Аг ве луг бу чег о1у мес біу ТВР аж Ве тат у 5 їй 15 цей твгошів Аби Абу без біп Бо бій АЗроБне Аїд тТВРОТук Туг сСух 25 - 29 25 30 «2105105 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» ЕН ІЗ з БбБаМ О8З3А ВОМ 567 571М 560М 0798 576М 563У 567М «4005 105
Зіу мі рго мет Агу вне тує біу бЗегобіу Меї біу тнгоАБр оре лвг
І 5 | 19 15 рен отнг хів дБ ЗВГ оре АгО Бго сін ар о РНе а13 тне Тут Тут Су яО 25 хо «2105 106 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність
«223» ЕВ ІЗ з БВІВ 0838 580М 567У 571М 5778 0798 576М 563У 567М «4005» 106 бі Уві вго Баг Аг спе туго 5іуУу баг біу мех бі Тнг оавр вне те 1 5 зо 15 меш ївг осів 58 Агу ви АГРО Ргообіз аБр о Рйе Аа тб оТує тТуг Сує та 25 30 «2105» 107 «2115» 30 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ ІЗ з БбАМ 5818 О8З3А 580М 567У 571М 560М 5778 0798 576М 563У 567М «400» 107 го Мех Ака бе тує біу Заг обіу мет біу тик АБр оре тТВгоге) Тве ї 5 10 35 її Ав дк ів Ага БгОо сій Авр РБе дія ТВг отут тук Сух ки 25 За «2105 108 «2115» 325 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Людський ІДЕ-Рс дикого типу (СЕ2-СЕ4 домени з нумерацією М224-К547 згідно з
Вогтіпдаюп 4. Веппісп (1978) «400» 108 чаї Ав бег Аг Ар Ре ТпгоргоО бро тТвгоУа?ї бух їі Цву бів щег ії 5 іо 15
Заг осСуз Ар осі біу сіу нів Впе о бго вра отТвВе її бій іа тей сух
В ках за ох й АХ спец уві 5ег сіу тує ТвК вро бі тТВк бів Ав оЇїТЕ тв о тго їв 015 35 40 45
Ак оЗіу бій уді меж Ав Уа! АЗрогбви Зак о таг Аїда бек те так сів 5 55 БО біз бі бів веб АТа БВ те сій 5егобій їеу ТВ оре) бе бій ув 65 Не 75 що ні Тгроїеи бег дер ака тТаготТує ТВг оСуб бів уд! тТвгбоОтує Бій іу 55 ЗО 5
Ні тТпгРОРНе біб Ашробег ТНБ ОКуб уз Куб АТа АЗроБег Аа РРО Ага 180 105 мо
ФУ Уві Заг АЇЗ Туг феу заг оаку Рга бек рго вве Ахи ге РН їв 113 128 195
АКО Був зак оРгОо Твг оті твк о Суз рей уді узі АВ іви Аа Рго бек ав 140 ув Фіу ТИгРоУВІ АЗп Бен тиР Тгробек аго АЇй беб о біу суб Бго уд! 145 ї5а 155 150
Ап онНІіВ его Твг о дга уз ів біб Ух бій ага Ап о біу ТВгоїви твк 1655 178 175
Уді твгоЗаг о їйг рен овго Узі біу тТигоаго Ар отр хів бі біу бів 180 185 що
ТВе тує сів Суз ага Узі тТвВгоніз вго ніЗ ви Вго Аго віз сви оМех 135 20Ю 05
Аго ваг о тТваг о твг вує ТР обБаг б1у го Аг АТа АЇз вго Бій уві тує 210 815 22 діа вне Аїа ТНгоРго бід тТРроРГО Сіу 5ег АКУ АБО Був Аг тпг ої ву я 230 235 240
Аіз Су вен їі біп дхй вп мак вго біз А5р о тів Зек уві сів Тео
У Ка «Зо вен нів Аєпобін уа! біо бец го ар о АЇя Аго ніх бек тТаР Отак їв
БО 205 27
Бгто Ага бух ТвР обу зі Зак біу ве вне Уві вве баг АКОо ви 610 275 280 285 чаї тт Аго АЇВ бів тео бів сій бу5 Або обі РВе їв Суб Ага Аа
ЗО 95 ВН чі ніх біз із АТа бег о вБго Зеб обі тТВге о Маї бій Ага Аїд о УВі бек чаї да вро сту руб
ЗЕ
ШЕ
«2105» 109 «2115111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка (Барт) з 5778 0798 «4005» 109 дер оІте бів без їве бів бек обро бек заг оїей бег Аа Хего узі су і 5 10 15 дер Ага Уа? ТР оті тТвгоСух ага Аа баг обівй яве Уді дав о тук дхр 2 Зк 3 гав е; пс віє
ЗіУу Ар оЗег Туг Меї Ап отр Тут бій сів ух Рга обіу бух Аїд рга 25 40 45 ух їецофїец Ті Тує АТтТа діа Заг отТук сви бі Заг обіу ві го Бег зо 55 5
Аг вве бек о біу Заг сіу бегосіє Тнг Або бе тТвеоїви Тв оті бек 55 70 75 во ака ів АК РГО СТИ Ах ОРИЄ АТ Тв тує Тук Су5 біп дій дак нів 85 Зо З іш АВровго Туг ТВгоРне біу бів біу твгоцує уаї 1) 112 Суб цю 105 110 «2105 110 «2115 333 «212» ДНК «213» штучна послідовність «220» «223» М-ділянка (Раб) з 778. 0798 «4005 110 зчатактсвеас коастсаоаао ссесЗвустсва сист ссоходасуа таза БО зЕсасіїцєс додсахссся пссЗосоФфас тзсоасодао астсстасах засто 128 скасоваає ссоЗоОзаазає сссаннчекоа стзЗассЕаКо ссоосстскта ссккпааноє ї5О дасокассто сасосткскс соацазосово сотоосассо а евосс аассвкся рних ззастсонозс сразосвстї сосозсттає свстассаяс зотсссвсза заасссстах НЕ зт тоцес ан яссдя загсовавтє 38 БЖ «2105 111 «2115 129 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка (Раб) з 5778. 079 і сигнальною послідовністю «4005 111 меї бух ТгО УВІ так оРНе Ї16 5Зег о іви рев вне рез Ре Бек хвг Аїд 1 5 10 15
Туг Жег Ар оті стій фен тТнгобів бег о Бго ВегобЗек о фівн бек дів бе о 23 КА чаї Біу ар Ага уд Тег ої ТНгРОСУух АгО АТа бегобій бек узі Або їй «0 45
Ту дб біу дв обер о Тує Меї лап о Тго Тук біп бій ГуУу5 во біжу був
ЗВ 5 ЩО аїд вго ух це іец ТіЄє Тук ліз аЇЗ бег туго се бій Зеб біу уд! па то ТУ 80 вго заг Ага РНе бек о сіу зег біу бек біу Тйг Ар овпе Твгореб тТНе є | ВО 5
І1в бБег дра ре дга Рго ЗіБ Ар ве АЇВ ТВгоТУує Тує См вів бів що 105 ме
Зег ніх біц Або вго туго твгоРВе біу бій біу тТнготух ма? бін те 115 ї2о 145
СУ
«2105 112 «2115 387 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка (Раб) з 5778. 079 і сигнальною послідовністю «4005 112 зІОанаєню їсвосібсви стсссвусто текстах сстссасства стссратаєе в садстпастс аазесссова схсастсссс зсссосатоє Форасзовоє засос ї2О тоссоцосах сссапскоаОЄ ббастасозас ЧодчассссЄ зсатазасєто чассжай що чзаЗзсссопяй йацскссаза состостовес тасассяссх ссжзссвеЗа зазсЧоасота 240 сет слассх сс ощеаЧчазО соч Естоос ассаашетса состоаВса сова аси Мю зачссзачоа асттсркеВс ттаєтастоє садсацтсєсс звсозцовкеєс стат аАсчЕЕ Ка сзссацаза ссзазОекоа застава ік «2105 113 «2115 111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка Гар2 «4005 113 авщі Іі віп бец тг осів 5ег вро его его іеу его дів Бак оуді пі 1 5 іо 15 якрАго УВІ Так ої1іа т Сук Ага Аа бег обій бегб Уа! Авротуг Азов о 25 КТ; сі АБр озВг тує Має АБАа Тео тТук о пій бій бух го піу уз Аа его 15 БІ 45 іїуз цею їез 116 Ту А1їа Аа аг о Тук кв сій 5егобіу Узі вго Бер 5О 55 во
Аго вне беє о біу бек йіу бек йпіу ТВ дев овНе твгогец твголів Баг
То 75 зо ек бан Біп вгРо бій АзробнЕ АТа тнготук Туг Суз біп бів 5еб Ні ва З 55
Зі: яр вгОо тує ТВ о РНЕ біу шій біу тТагогжв Уві бід Ті Гуз
НН 05 па
«2105 114 «2115» 333 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка Барг «4005» 114 зататтсвис їдзстісвава сссоадстса стстссєте ссогааоцоча сзаватавее БО вісасттсє сдцеаїссса зссоасодас свсозсооно зстсстасат чаастовтах 5 син адаоєс ссодлавадс ссбазайта стовсстасо ссосстсата сестгозавоє 1що зЗчсотссти сосастесвс одазазсаца ссозоасаєсю аттсассост дассасстсу 248 оствсяос суЗаЗоВсе сосоаасттас їасіоссває ацдієссасза зассесстяє щю агеатсттадес віназяссаа содссчалатс ава З «2105 115 «2115 129 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка Рарг з сигнальною послідовністю «4005» 115
Маї бух тТероуві тТвг о РБе її6 бег івц осец вйе се ве бБег о бег АЇВ ї З 10 і
Туг 5ег ар їі бій фе тве осів Заг обго баг о 5ег бен бек дій 5ег зл ЗЕ и
КО «й кі чаї біУу Ав5родга маі Те обі тТвгоСух ака Аз бегобій бек УЗ дер 35 40 45 тук дхп біу ав бек тує Мет ай Тер отуг біп сій бух РКО б1у кух за 35 що діа вго ух сви ге їі туг АТа Аіз бек туго їви бін зас бБіУ та 55 7 75 хо
Бевз о бегойга РБе баг бі бак о Фіє Заг бі ТНг Азова таб оїву тТВег 85 чо з їїе баг бек осец бій Рго оїц Абро Рв Аа тВкоТук тує Суб бій бів 100 105 що загоні бТб Ако рго Ту? Тс о рРНе сіу бів бФіу тб гук ма! бід їв 115 120 155 «2105 116 «2115» 387 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка Рарг з сигнальною послідовністю «4005 116 тдааатодча ссассктсаЕ сіссстаста КЕСстЗЕЕе сстсКесста сЕссоааКЕ С «ацетат аевзсссваз стсастстсс зсттссЗсЗо За еозаЄ засос 12о тасспоаосає сссвоатсоах озассаєдає пдоазаасісєст зсасоласта згас ЩО заесссозаа зако ссаза зсЗстзасєс стасасенссх сасассьсвь пазсасога юю сотжоасесх хстсопцзао соч ссазас зосаатетси ссстцассях секс щю свесесозоач астссоаєцає тастастає сзасватсєсєс асевадасєсє ставок ЗО поссводоая сезацаїсдза заїсзав ЗУ «2105 117 «2115 218 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка Рара2 -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І 154Р «4005 117
АБ Ті сій беб тТвгобій его Бго Зегобев фви бег Ав бек Уа! Оу
К з ТО 15
АБ АгО Уа! ТВР ОЇ тб осСух Аго Аза ве обій бег о Уді АБО Туг Або
В 25 КІ
ЗУ Ар о бБег туг Мет дЗпотго туго бі» бій гу го бік бує АЇв Вго ї5 БІВ 4 ух ви вен їі тТуг АТа АВ 5вг тує бен піц Ягобію Узі Рго 5вг зо 55 во аго бе Заг обіу его біу заг обу ТНг о АЗровНа тТвговец тт ті баг п ув 7 ко
Баг осв піп го пін АБровне АЇв тТвВгоТук тук Суб бів бій 5Звег онів 85 в 25 сій дБ вго ТУР ТК оРНЕ біУ бій оту ТВР обуз чаї бів бів СУБ Аго що ме мВ
Твеомаі Аїа АТа го Зег о маї не тів Ре рго ро зБг о Авробіц бів 5 то 123 ви бух чек обі ТНе дія Зак УВІ Узі Суз іви їец ди дов Вб тТук
НЯ: 75 тий 7
КО АЛЕ ке го Ага бів Аїа губ УВІ сів Тктроїуз Уа дво Ап Аїя Бго бій бек 145 158 їі55 Же пік ази его біб біц бебоуді Твг обі ої АБ баг гу Ан бек ТВЕ 1655 ТУ 175
Туг бек їв беБ о5еб ТАБ овео тТигоіец беб уз АЇЯ Ар о ТУуг Бій Ух 1 їх 190 ніх Був уві Туг Аа Су біб Уві ТВгб обі біп бі сев о бегб Бек орго 195 200 НЕ ма! тик бух Бек РНе Ап Ако біУу Біб сСух 23а ма щ «2105 118 «2115 654 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка Рарг -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І 154Р «4005 118 чатасткснає свастсяже сссоааскса стстссосто соска тазазтЗасе БО зи Зозсатсска пісне басоасооав астестасах завстозкає Не «кзвосзаазасє ссооззазвис сссзаацїта стватстаса сесоссссата стада їх
Фі сессттстс поцазосава роопасвоса асссасссє засеастесо о па тасвис сЯозоаасхї сосавсттає састаскаве засос засос ска є ще асчЕктЗосс язЗзЗаассва пОхсоваавтсє задецтвсзиа їзпсадессє Вже ккс 5 акстссссЗс саєстонеов зсяоктовяа сстодааста сскстоаткох окассцио з зажавстист атсссжщнай зосслазава сага тодатазеоє сссосавжсо ко аЯсзастссс нразаазКах Сас свсаосадоо асаосасста сао зчО звижасстоз сзссаадсаа застає саасяся ваУсстасос стосоавВОе БО пса сзоОо Зсстовастс дессексаса аеаосекся асаодоЗаа зо пу «2105 119 «2115 236 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка Бар2 -ї- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе І154Р і сигнальну послідовність «4005 119 мех же тк УВІ тТВгоВне тів баг оїбемз ву Ве сви вре чег бек дів ії 5 їй 15 тег щаг Аз ТІ бій ее твг осів 5еб Рг Бек Заг оре бЗег Ай ер
В КУ зо
Ма! бік а5р Ага УудІ тТвгохІТе твгоСув ага діа Заг обій бвгомаї дей 35 ай 45
Тут А біУу Ар Бег тТуг МеК ди Тео отТуг Бій бій уз Рго сі ув з 5 бо дів кко бух Кер оіви їі тТуг Аїд АЇЗ Заг тук сви бій 5еб Б1у мді по ЕЕ 75 що го Бек Ага вне баг у хегобіу дек обіу ТЕг о А5ВОРВе те рей тТвг 85 50 в, їі бек баг ів іп о вБго біб Ао Рв АТа тТВР тує тує Си Біп обів
ЦЕ 105 о заг нії бін АБробко тує ТВг о ввВе бі бій бі Твговув Узі ств ті1є 115 130 125
Муз аго тТвгоуа! Аза Аа га бегоузі Ре Ів Ре ко РгГО бег Акр 159 135 140 біш бів 'їви уз чего біу тнг дід бек ха УЗ! сСух сей ви Ай дхи 145 155 155 150 впе Тут го ага сі Аа губ Уа! бій твор обу Уа! Ар дей Аій вКо 155 170 175 бів ек су дп бек сій біу 5ебомаї ТВгосін бій АБО его гу дер ї5О 155 190 заботТак ту хаб ре) 5ег Бак тТвг гц тТве іек бе рух Аа ще тує 395 АЮ КН пі бує ні бух Ууді тує віз бух Фі маії тТВгоніЗ ів бі зіву Заг 218. їх г зеговго уві ТК рух Зег Ра Ах Ако о1у іш Су а я 235 «2105 120 «2115 708 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка Бар2 -ї- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе 1154Р і сигнальну послідовність «400» 120 асзаязЕЗда стсассгесвЕ сптсстуєта сома тісх ссіссасста сіссоТВх БО сасзстовстс аЗвозсссово сесастсєсс чессссціцо озоаівоаої пассатсвсї 128 тоассоазосах сссацссоає очастасцас зожасісст асатоддесто діатсаосао 180 зазсссоаза заассссала зн ствакс васоссоссх сатасстеоя азоасоЗсокз 0 стен асх сстсаццзао сан свн ассзатттсв сестоВвссах Тесс єта м сзрасснвод асттсасовс гтастаєтас сзасавіссс асозооассс стасвсвтЕє ТО сФесадоуаа ссзаЗохсза заїсазасох зсоптаосоав ссссовесвах стае з ссзссаїсто зба зазазсєтоов зстесссто стсотогоєєє ста яко пістаЕсесв бадазоссяй аосасвоєуя заоохосата всусссссз вісвоукане о тсссвоаовоа зі сасвов зссвздасаоє забозовеса сетасаосї садсвнакє ЩО сіцдвсастця зсаааЯсвуа сізсцацаяя сасааауїст асдєстоєза ааЕсасссах ща сиесства зстсосєссє саєзазоває сесавсвоча одаовосах яв «2105 121 «2115111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка Гарз з 5778 0798 «400» 121 а їв бів вед Твгб о Бів бегобго бег баг оген баг Аїд Заг Уа! б5і1у ї а 10 15 захо ага Уві таб обі тТве Су Адго аїа Заг бій Зег Уві й5ротує АВ ке 4х ЗО
Фу Ар одег о Тук Мет АБа ТРо ОтТук біз біп гух Бо сіу бух АТа го 35 Бо 45
Бук сен оіви Хі тує аїв дія бек оТуг ув біо бек обіу уд! вро зет 5 5 5
АгО вна о Зек бі баг обіу Зак о біу Таб Аза вве ТвВе орБец Тйг тів 5ег 55 7 УЗ що ага іїец Ага го бів Ав о Бве Аїа тик тег ТугосСує іп дія Заг нів а Зо 25 іч др овго тує тТве о Рна сіб зів бі тв" губ узі бів їв бух 100 ще мо «2105 122 «2115 333 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка Гарз з 5778 0798 «400» 122 чаїаттсзас таастслодо сссозастса стстссасте ссатнннв казав 5 зі ттасс поса са зо очає тасозсозас астсстасає озастацтас ке савсеспавос ссбозазаас сосидазето стат ствсв ссвсетеста секта їх запосассте сасосттсїє пооззоссі єстаосвсса ассссвсссї зассвітсса р заассиазаєє сешастї сесоастіве астосснвс воїсоссасоз опдассесстях Зо асвеетацес зані зссла озтсоааатє аа 33 «2105 123 «2115 129 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка ГарЗ з 5778 О79Н і сигнальною послідовністю «400» 123 мет кує ттромаї тТвг РМ їі бег сен бер вБе веу Ре бек Заг ді
Е 5 о ї5
Тукг Бек Або їі бін Сен ТВгодій бег о Бго бег о 5вговБев бвг о аїд щег о У 30
Уа БіУ аз о аАко Уа тТве ї16 тТве о Суб Ага Аз бат сів хаб уд! др ї5 БІ 48
Туг Аєр пі Ар о яек тТук Мет Ахп Теи отТув бій бів був го сім Був 5 За БО
Аа вго вБу5 іву о змецв (16 туго дів АТа Явге туго іви бі Заг оє1у Уді й то 75 що
Бко ЗВГ оАгО ве бек біу бек біу бек бі Так Аа вве тТВК Би тТве 5 За 5 їіє заг о аго ів аку рРго біз йо ве одів тв тує Тук Сук бів Бій 10 105 410 зеконі бій дев Рго тує Твена сіу бій осі тТагорує УВІ піц ї16
М 138 125 ух «210» 124 «2115» 387 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка Гарз з 577А О079В і сигнальною послідовністю «400» 124 зкдавчтадо ссасстссвЕ сессстостоа СЕС сскссоєсста сессоКаК що «азс сіс довзсссово сесастстсс осжтссасоЗ зззасаени пасаж що тассцоЗзсях сосаОжсЗоє озастасЗас дозЗасеєст асатовасту втассяосяо здо аачсссоЗува авзссссвай чЕжЗстоаКс сасВссвсКо сесВсстТОя вашсБОосУТе ке сежтсвсостх їстсоаоЗуаво сЗЗзасстЗас ассоажевся ссстцассяЄ сао Веку КУКД ззассозаоз астісосає ттастастЗс савсаєссс ясоаЗЗассє статасУЄсх ЗО звссжнвюта сснзуУкса аасеааи ЗА «2105 125 «2115 218 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка ГарЗ з 5778 079 -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе
І154Р «4005 125
А5р ті бій 'іїви так сій 5еБ РРО бек бег бе г оАїа Зек ма бі 1 5 їв 1
Аз» оага ма! тТнгожіє тТвге оСу5х дга Зіз баг обі Заг о уд) АБ о тТук Ах т Б ще - ї- "з; м о 5 3
Зі Ар зег тує меж Аби Ткротуг він біп рух Рго бу ух АТ бго ї5 я 45 іх вен іви ів туг Аїз дія бек о Туг ев бін бек сію ді Бго бек 5 ЗВ БО вата ба б5іу бег біУу баг обіу так азр вне тТвк рад тТнк жа кет 53 хо 5 ОО і З і и Ж х
Ага ей Аго го оф АБ о РБе Аїд тТвАготуєк Тук Суб бій сій зеб нів 5 Зо 95
ЗіБ Ак овгО тує ТАК Овна БіУ бів сіу ТВеорув уді бі Те гу АК здо 105 ї11о
Тнг УФі їз діз Бго Бех уді РНе тів РНЕ РГО ко Зв Ар отв бій 128 125 цен баб обіУ ТР Аїд хегохмаї уві Сук ви Бе Аа ап оРнНа тує 155 135 ї4о пічкАКа Зі дід вух уд! сів Тео іх чаї дев АБй АЇВ Вго вій 5ве 145 5 ї55 ї6О бі Ап ваг бій бі бег узі тк обі бів Ар оЗЕг уз АБр Бек тиг 163 170 155
Туг бег і ву бег 5Бг о ТНгб Бу Твг ор бек їу5 Аа ар тує сів Гуз ї15о 185 НВ
Мі вух маі Туг АТЗ Сух біц о Ууді твг оніз Бій біу ви бек 5еговго 135 БЕК 25
УВІ ТВК Бук бег РЕ Ап Ага Сіу бів Су
ЛО ІЗ
«2105 126 «2115 654 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка ГарЗ з 5778 079 -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе
І154Р «400» 126 що
ЧетатЕсаос бТоастсвВавИй сссовостса стстссост состав пава асе що зЕсасттосс шоссвтссса чо сЗовс тасзасазаз астостасат озастацЗас 120 сзосзозвеє ссозваваає «ско оа стікає сс сеа соска що часакцсстї сасеттетс соодавасвоо сстресассо акттсвоссЕ пасок о зпастцадасє соаозЗазстт сосзасєтає встассвасє воссссасоа сазасссстає ню засохктоасс вршатассаз зЗссоааасс айзсоївеза гавсозсосс вста ЗО атсеттсссас сзіскнаса часа Чааа ссср тв сссаТаЄ ост осто С звезастст аїсссвовоя соссяадоса сага сопаїласає ссозсваса Як птавстссс вочаозкаї сасачаусао пасСаосвазо зсаасасста садсстєвоє ЗАВ шроассстаз сестожвасяа зосаетає запаласаса зазкстасос стесоаааоке ЯКЕ зсссатсвод есссуаустс зсссоісасв аззацвсссва асзодосвоа чо БУ «2105 127 «2115 236 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка ГарЗ з 5778 079 -- константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе 154Р і сигнальну послідовність «4005» 127 мех ву Тк Оу! ТВг вве її бвг оре ів ВВе ів Рв хак о бЗег ДВ
Її х І) ї5
Тут «ек Аа тів біп бе) ТВгобій его Бго бе баб рад баг Аїд Баг зо 25 Зо
Узі Біт дк Ага Узі Тк ої їв Сх Аго Аїз баб обі» бегоуді Ахв ї5 0 415 туг Азв пі ар яв о Тук МОХ АБИ Тео о Туб бів бів Буб Рг обі бух 50 55 5О ат го іже кец їжу ів туг АД АЇа чего тує вв бів зеб Оіу уд 53 7) 7 КО рРго щег Ага вве Зак Зіу Бр обу Бек бРу тТг Ар вне тТвгоїеб тТввЕ
ВН 35 їі бег о аАго беу Ага вго Бі Або Ре АТд ТВг оту Тук сСух 1 сів
Мщю їх 11 зак ні піз дав о бге Ту Те овВе біу бів біу ТР огух УВІ БІВ ХВ 15 120 125 му ага Тйг о Уаї Аїа Аїа бро бегоуві РБе о тія Ра бго Рго 5ег А5р 130 і15 140 зіш бів ей рух бек обі Тк Аїд Зек о Ууді УВІ Сж» іерівц Ап щи зи ЖЕ чт ок
ТРУ 150 155 їБО
Ва тує ргб аго Бі Аа У Уа? бій Тгрогу5 зді Аз ди а га ї65 175 175 дій бек і ап его біп бін бек уд! ТР осін Бій АЗо щегогух АБО 18 ї55 Не
Зак ТВг тує баг оби бе щеє ТВ оїян ТВг обво Бегогух віз дар тує 5 200 205
Зіц муз НІ Був Уві Туг АтТа Су Біц ма! ТВгРоНіЗ бів біу еб зер
ІЙ 215 КЕ
Заг оВго Узі ІВР о рУух Зек РНЕе дяп Ага бі Бі Су ке а 235 5 «2105 128 «2115 708 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка ГабЗ з 5778 О079В -« константна ділянка капа-ланцюга, що включає у себе 154Р і сигнальну послідовність «4005» 128 асваазісса ссасстсВК сс ст тости сехссаКа КкЕКЦа що сазстодастс ззазсссово стсастсесс ассстссахза зазасаавах засос 120 тоассваЗсах сесазееВоє озястасояс одасастост зсвідазсето зквссавсвЗ 15 звасссооза ааосессвяа збсЗстаасс таспссоєст сстассттаз азасодсоо 40 совка стсооцази совок стеас зссчакекса ссестпассах сла зоб зи соацвац зсітсасоцас стастастас свасассєс асуазаассс стажасотХ зо жссаозаїа ссаводісєча загсазосає асоотаосвю соска оха сероаеееЕс Я8О спсссасто зібассвахх дазатессоаа астосстста со таєсї остозатаає БЕ їтстатсєса дадасоссвва зосасацв яса асзссссзса асо ав Ко ссссазалоаа ЗзсзжксасвЗав дсзадасвиє аацпасезса сстасавссє садсаосасє ЩО сторасостов зсвазослов стасозозав сєзсавацтєє асуєстосоя зїсасссах ВО сенс все ссоя саслазовоє ТісзасаоЗо озз93ас ОВ «210» 129 «2115 107 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка омалізумабу «400» 129
Твтобій 5ег рго бек бег із 5ег Аїд 5егоуді Су азр.Агоу Узі Тве ї З 10 т їв тк осСу5 Аго Аїа Зег бій Зегоуаі Ар о Тук а5робіу АБроБаве Тут го а 30 мес аа тТго оТує бій сіп бух вгОо біу руб ліз РгОо бух во кец ів 3 о У
ТУ" Вів діа беє тук рвав бів бек о біу УЗі бго бег дра Бе бог о сіу а 5 5о чего бі бек обіу ТВг ав оРНе Тв зви ТВгоїів беб Звг гер обі Его 55 го 75 НІ
О10 АВ РВе Аїда тик отТуг тТуР Сух 5 біп бек ніх біщ А5Д ово тТуг 85 | зо В
Твге ве ФіУу бів бі твговБує Уа ЗБЕ Тв вух ї00 105 -2105 130 «2115 321 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка омалізумабу «400» 130 встсвиааєє сдвасісвсв стсссттсс зсЗаоцваса зазтовссак сасіїпссод до зпсасжсвах софмадцаєта созсоалове ссссасаєоз зетодтатсв дсзоаваЗсее ї80 сзазазоссс сзаваєтаст чаїстасасс Зсстсатасс сСтазазасов соатассгса ї855 спсіжстсоц зазососасс одЧесассвиє стсассостаа сСеВіжсакс астосзоссо иа пазоазвсіїсоа счасіїаста стоассзасяо ссссасовой зессстатає згас 5ЖН
Чузассаводв їсозавїсаа КК «2105» 131 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕНЗ «4005» 131 спіх Уві вто Меї ага спе бек бі Заг біу меє біу Тйг о аво ваБ ТАК
Її 5 То 15 ци ТВгОоХів беб да сем одкй вго бі АБО вне Аа Те ТУ Тук Су теКь Щі ЗЕ КІ Й 7 у Ж ОКУ «2105 132 «2115 111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з ББОМ 5520 567М 5778 0798 «4005 132
Ав тів бій вн Те Бій бак ово Звб обеб гео бег Аїд его уд! Бі і З 10 ї5 ав ага уві Таб їі тТвагоСух АгО аіз Зего5ілй бек уві вхо тук АВ
М 25 30 сі Ар оБег тТук Меб Аа ТРО Тук бів бій бух вго оіу уз А1Х РгО 35 40 Я іух кец іви їїе туг АТа АТЗ Авр тує ей сін Зек біу удї бко Мет 5 55 БО
Ага вве Заг озіУ Звг Бі меж су ТР азо вне тТигБ огрец твгохів Зак
Б т їх ЩО
Ага Сей Аго Рго бів АБрорне зі те отук тує Суб Бій бів бек нів 85 що ч5 шій АБрорго Тугб тТве вне обіу бій бі ТВгобуз УЗ! біб 18 бух 100 105 що «2105 133 «2115» 333 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з ЗбОМ 5520 567М 5778 0798 «4005 133 пахахісвоає озсксваа сесзаастса стстсКскЕ ссозсовзОнМа сяЧаВЕвнее 5 захист касс пбодзсвтссса зесозтоЗаис такозсзоац зстсстасат паястоотах о сазпсаразос ссодааааас сосааазіто стзасстаєуь ссзссваста сеставаоє ще часекцста сс ттсс доазаасоно зсСсаєсе азс аКист чассаАсесв МН зозскозводе соозааст се ає сво кзає засос факси Б асвтітіозосс зосЗазссва Зоесеювазвіс зах БУ «2105» 134 «2115 129 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка з 5ббОМ 5520 567М 5778 079 і сигнальною послідовністю «400» 134
Мет іуУує ТтроУуді ТВговве їі Звк рен вв рве ву вве баб бек АТа
Її 5 їб 15 тТук бек дав іє бій грец те осів 5вг рга Бек ав рен баг Аа бе 20 5 т
Уві біж Азов Ага Уді Тнг Оті ТВгоСуб аго від бег бів Бег Уді АБО 55 40 45
Туг Ар Оіу ах баг отТук мех Ахп тк Тут Бій бій уз в біу цух ще 55 щі аіа Его Бу івц бер; їі тек АЇв Аіз Ар о тТУК Зав бін Заг б1Уу ча 65 7 ях че
БР Мет Ага Ре зак осіму ек біб Меб б5іу ТВгоАбровбе ТК реву Так 85 БІВ, З їїе зе Ага івц Агу РКО біб Абр оре Аа Твг отТук Тут Куб бів бів
Й аа вач и: ве іп МО зек ніх бін АБ рго Тук Тиг овес бі бів бїУ тав обу Уді 1 Те 1135 120 1955 а ще «2105» 135 «2115» 387 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка з БбБОМ 5520 567М 577В8 О79БВ і сигнальною послідовністю «4005 135 атозассвюю їсассессвЕ сссссотасте БТ кою секс сс а 5 сацєетоавсїє зЗазсссоац сісастстсє зсгессорв попясасавє дпассяксясх 150 пасщаоасаї сс тКщИ Здастаєас зпаоцасісс зсвізааста час 150 ззоасссодаз ззассссзаа пскоастааїЄ тасдєсоассо зствескох ааосЗпсва ей сстазтасасЕ сссоцизза садзатадає зссоакзїсв сестоааєсвх сксоадаєта ЗО вазссодлоо асЕгсоасцає їтастаєтооє сзасацієсс зсоавадзаєсє статасцитх зо зассазоачай ссавзоїсза заїсзай 387 «2105 136 «2115 218 «212» Білок «213» штучна послідовність «220» «223» м-ділянка з БбБОМ 5520 567М 5778 079 -- константна ділянка капа-ланцюга «4005 136 450 їТе бій ви твгобій бек обко Звг о Яег гео баг АЇВ Заг уд! бі
Її 5 10 15
АБ ОАТО УВІ ТВгОої1ів Таб Су Аго Аів бе бій ев уві АБО Туг АЮ за 5 30 біж Абр заг тТук Мех ап Тгротук ів бій Ух кгОо СТУ Су АТа его 35 48 45
Муз івцоїео їі Тук АЇз діа Ар оту вен бій баг бів ді Рро Меї 50 КТ 50
Ага вйя дек обБіу бак о біу Мет біу тнг о Ар вна ТВКоге) ТвК отів Заг ва 70 5 що аго вв ага вВко біц ар вне Аа о тТВг тує стує Суб бів бій дек ні
З чо з5
З кі 5 аім ази бго Туг ТК о вБе біу бів зіу ТК огуУу5 Уаї біб ї18 руб ДК цю їх що
ТАг УВІ дія АЇв РРО Зек уві вне їі Ре вго Рго бвгодяв сів бів 115 о 125 ши уз Бвг обі ТнгоАЇд бек оуді Узі Суз5 ев о іви Ай дхй вве тур що 135 140
Ргоа Ага бі Ат вух УВІ бів Тк бух УДІ Ав ап а1з їв бів ек їа5 Їхо ї55 158 біу Ах Зег сію бію Хег уж! Тве біб бій Ар обек руб Аве беє о твне іб5У 170 175 тТУуг ВГ оБе) жЖег бак ТР обер ТвРоїев бек вт АВ АВ отТук 61 Гуз 158 185 цю
Ні іх Ууді Туг Аїз Сух бів Ма! ТвРОонів бїп Бім Сец бек б5ег вКо 135 зо 205
Уа! тве рув Заг ве дай Ага іу бів СУБ з1й 215 «2105 137 «2115 654 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з БбОМ 5520 567М 5778 О79В -- константна ділянка капа-ланцюга «4005» 137 | І
Чататтснас ЗЧвсїсасац сссовоєтея стстссастї ссотоаоооа Сарра БО ежтсясЕтосс Фодсвіссса зссзатоес гасовсоздоа встссєтасвх вас кат ї2о сзоасацанос ссодайаавос сссзазатто стозтстася ссдссоаста ссттозазає ї15о засЗтвестя тосесстстс здоззаоасоаво зезадсзссо атттсВссстї пассвіїтсо 240 азгастЗасг спожвоцастт сосоасттвс тастассвас ваїсссасов паассоствх ЗО сок жтоЧес зоцюозаасслаА сЗзссоладіс азосоїасов їазсоЗсссс астмі 300 кос ссис саксзата зсазстаца сСеЗзоаасто сссстоКаЕ ЗсОссвосо СУ чатласттст атсссловов сЗссаааота садіодавою содасласос сссссавісо Зако сїтавстссс вдо тах сасазазсяо Засадсавоз асапсасстя саЗсссвоє 540 звасессстаа соссавсза засаястас Зачазасася яаиазЕстясас ссасоацес ще зо ісзцоа чес псксоатсаса задацдстіся заслання сах 55а 2105 138 «2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВЗ «400» 138 сіу Уві вгОо АгО АБО РМ Зак Оу Заг бі Ме ТУ ТВгодер о еваотне ї З 15 5 іец тТйг жів бек Ага ібу Ага вго бій Ар Ре Аїд ТВР оту Туг сСуз 2 28 0 «2105 139 «2115111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянказ 560 5520 567М 5778 0798 «400» 139
Азв їі бій іо тб обів его Рго бегобеає сем бек АЇв Зегоуді іх і З ня 15 дхро ага уві Твг оїіє тик осСу5 ага дів его бій его уві дер тує вхо 2 25 за
ОіУу ар о бег о тує меж дей тгротукю бій бій Су вго біб вух дів рго 35 Ся 45 їув івц ївь сів тТуг Аїз Аїд Абротуг ге бін об5егопйіху Уаї Рго Ага 50 ща во кга впе 5ег біу бег біу Меї біу ТБРОАБО вве таг осв тТпготіє 5вг 70 5 ВО
Ага сМеи Ага рРгО під АБО пе Ав тТйб тує Тук Су бів вій баг ніх 35 що 35 іш а5роРго Туг ТАгоРне Біу бій 5іУ ТвгбоБуз УЗ бі Тв вух 3д0о 195 ца «210» 140 «2115 333 5 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «22О» «223» М-ділянка з БОНН 5520 567М 5778 0798 «400» 140 чатаєтсвос таастсвоаа сссоалоастса сістссНяї сспоаоода тала БО аЕсасттасс соя тссся ЗксоЗзсачас тасзасозаз астсстасає зчавстоскає 130 саюсвцдяаде ссопааяйос сссаааоєто стаєте ссоссааа состава воє що сесисКсс ес Ксс оозааосзоо атоЗосассз астесасссю пас со КЕН заастзасчис ссоашасже сосеасстас тасіоссває аозссскасув пасе З ші ксвасс асознассвя ЗассЗааатс аа ке «2105» 141 «2115 129 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з БбОВН 5520 567М 577 079 і сигнальною послідовністю «4005» 141
Мек уз тТрРр Уаі Тк РнНе Жіе Бек сер сви вбе їви Бе бЗег Заг Дів і 5 18 15 тТуг ввг 50 тів біпіву Таб бів 5ег о рго ек баг оре ве Аїд хе а 25 30
Уві бі Ар одго ма Те Її твг о Суб Ага Аїда Хег бій бег ма! дев 5 43 45
Туг др оіу да бек Туг Меї дкп тТрРо о тТУуг бів бій іу5 рго біу рух що 55 50
Аїа га бу во ви ті Туг дід дія Ахо Туг гец бібв Бек о БіУ Ущі 55 й 75 що
Ргоа Аго Ага вве баг о біу Заг обіу Мет Бі Твгод5р она ТвК ово тТВе чо зе її Зає дга ви ага го бів дБ вББе о аїв ТВ отуг тує бух бів бів 100 з що хаб оміз «іш АВ рго Ту твеовббе Ту бів біу ТК бу5 УВІ біб її 115 120 125
НЕК
«2105 142 «2115» 387 5 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з БбОВН 5520 567М 577 079 і сигнальною послідовністю «4005 142 зкгозабтодо єсСсассттсвт ссссстасте сстссаВксх сесосасева стссоака БО сапстозсє зоаацессоза стос соску садах пдассвееасх Во
Би сесосвЕ сссватсцу озастасовс цддавастссї зсзічааста засос 1 амшсссочая адоассссааа згсзстзатс тасЗссоссо вітаєссітовз зазсацсото о сстсшксосх їстсдооазо соозатодаЄ ассоатітсв сестовссаї сгптсововста 300 ждассзодцю асттсосозс їтастастоЗє сазсзотсссє асозоадаєсс статас зБ5а шеассадооааа сова ссод автсало ЗК 2105» 143 «2115 218 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка з 5Бб6ОВ 5520 567М 5778 О79В -- константна ділянка капа-ланцюга «400» 143 дер тів сів сем тТвгобій Заг обго бек бек оїео 5ег діа его оуді іх ї 5 то 15
Ар Ага хаі тнгоїіе таб суб ака Аа чего бів чего омаї дар тує дер
КК. У за сіУу а5робаєс Тук Меб аби То Тук бів біб бує Рго о1у ку Аїа га 48 45 вух ям іви тіж тує аїя АїВ Аа туго бей біз Зег бфіу уві Вс дга за 5 БО
Аг оБне его біу его обіу Мах бБіу ТНг Аврора Твесрви тТвге о ХІТе Заг 85 "о 75 о
Ага ів ага вгОо бій до РВЕ оАїа тк отук тує Суб бій бів Заг нів ах Чо 35 зіц аз его Тук тТвРОвве сіу сію бі Те обмв У) бів ів ух АГЗ ве 105 мо
Тнг Уа! Аїа віз Рго бек ма! Ре тів Ре Бго РгО б5ег ар бів бій 115 хо 125
Кувн о їе5 Зае бі Те діа Заєе уді чаї Су5 бе) ви Ах Ай ве ту че ек же уко 159 ІЗ 50
Рго Ага бІч АТа був Уа! бій тер о у УВІ ар ав" Аїд уву Бій ет 345 150 155 150 сту аб зе бів бів 5еб Уа Тйгбобіц бій АБробег Ку Абр оЗВк Отак 165 70 Ж тТук бег сви его ек о тТНе ву Тве гео бе бух ліз Ар тує він вує ї1кха 155 9
Ні ух Уді туг Аїд Су бів маї тВе Ні біп біу во Бек зЗвг Бо 155 аа 205
Уді твг оїу5 его КВе дяв Ага бі бін Су аа 945 ваше Ж спека «2105» 144 «2115» 654 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з БбБОВН 5520 567М 577 079В -- константна ділянка капа-ланцюга «400» 144 чатаїтсвис тоастслова сесоацєтса стстсеЗсех ссцбдпоЗов зов соасе 5О аксастсосс собсассса чссопіоазас сасеВсвння астсстасаї засл ах їх
Тс оо а чзЕсозіооас гасоасоєна стасаї оаастоцка сарсацавоє ссоодзааавас сесаааажва стдзістасв ссоссваєка состава 155 фак асскс что давно атЗозсассо асежевссюх зассескісо Ба застави соозвоастЕ соасоазсттас гасірссвас засссвсаВ поета ЗО ас тоЗсс зодоазассаа зассоадатс ааасосаса слоасовсссс астатес М асасттоаЧсс здаззасскаа зоссодадаїсє азасасис слаЗсЗсссс Віста хес Мч ажІсттсєссоає сатстоамоа зсвоаставаа їсгдоаасто сстстатВаЕ ги я заївасттст вієссзвоаЗа зжессзадцєз свитеадавод тодатаавсє сстссзатсо 450 цатззсїссс зддзазатаї сасзоовосад ззсозоасазвад зовасзсста сзасстовцє ща мизсссказ состовосва восвоаствс чззаваасзасв аваїсєїтавсас стос щю зсссвісвоа спссіоазастс осссцісзса ззодаоєттсв зсадодцоазаз Зої ви «210» 145 «2115111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з ББОК 5520 567М 5778 0798 «400» 145
Ар оті біп їев таб дій бек обко баг Бег Кац 5ег дія бебі бу 1 З 10 15
Ар одго ма! ТвВе оті тБгосСух Аго Аїд бег бій бег Улі Азов о тТуг АВ о 23 30
ЗУ Аа бек о Туг Меї дк тТго Туг віп Біп уз Рго бі бух Аїд его 35 40 45 був ін їво тів тТук дів віз АБО Ту бен осіц бегобію Узі Рго вух зо х5 оо
Ага РН баг ВРУ Заг обі мес біу Тпгоаво Не тТвг орви тб жів Зав 55 7 75 хо йко ев Аг рго сів аб рве Аа тег отук Туг Суб віп о1п 5ег НІ 85 ЗО З біш лей вгО ту ТАБ Овна сіу Бій біу ТВРг о їув Уа? біо їі ух «2105» 146 «2115 111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з БбОО 5520 567М 5778 0798 «400» 146
Ар тів бів рев тТВг Осій Звгборго явгоЗег ів бЗеговів бек уві Ту 1 З їй ї5 вар ака мя! ТВ оїіє Тве Су5 йгу Аїд бегбобій бек Уві АзроТуг Або о 25 щі
ОБУ Ахрочає ТУг Меє депотКо Туб сій 51 уз Бго біу цуз Аїд ово ї5 40 45
УЖ вн фев Те Туг АТ АЇз Ар отук івн біб бе обі Узі вго бів 5 55 бо дк пе бек біу Берг б5іу Меї бїуУ Тйг др вве ТВгогев Твг о їіе ер
Ага це дго РгОо бів АБровйе дів тТаг отТує тТуг сСуз бів віп бег нів 85 щі 25 іч АБО ВгОо Тує ТВК о РНЕ оіу біз оту тб оїу5 Уаї бів її6 Су5 що 105 мо «2105» 147 «2115 506 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» м-ділянка 4 СНІ константна ділянка гама-1-ланцюга, плюс лінкер, плюс 5сЕм ді 49Н5
САбА45 з сигнальною послідовністю «4005» 147 мех буз тТкроУВІ те вне тіе г цен ізо РрєЄ сей Бе б5ег заг Аїда 1 5 13 15
Туг Заг біб ма! СІЙ іс уаї бін бе біу ТУ б1у цеп уві! бій Рго 20 У за
Бі біу бег фвц АгО Кв бег Сух Аа чаї его Офу Ту бег бів ТВ 35 0 43
Заг осіу тТУК баг тк Аа Тер Зі Ага бій АЇа вро біУу бух Оу ву 55 по
Чі ткромаі АЇа б5ег бів тТВготує ар обу ек ТВ ОАБа Тугб АшА вро 55 то 75 що заг оУуді бу біу АгО те тТпг тів бе Ага АБр о Ахв бек бух деп Оотне вх о з вне Тук іву бів мех або 5ег ген Аго Аїд біз Ар тТвг дів Уаі тТуг 05 ща тТуУуК Су йіз Ага сбіу бегонія Туг ВНе біу ні тт оні вне аїд ув! 115 122 155 ттвр осі бів о оіу ТбгоївеноУуді Те Узі Заг бек дій бек ТВг офуз О1У о 135 1495 вго бег уБі Ре вгОо реч Аїа Рі баг Заг о фу5 Берг отВг о Зег бу Ту 145 150 155 1505
ТнНг АТЗ АЇТЯ фей біу Суб б Уа ГУБ АБО тує Рв бе Ота го ма 65 170 4175
Тнтгомаї баг о тгродялй бег сі Аїа Беоотпгб бек біу чаї ні таб вве 150 їх 190
Рг Аїда Уа?! рез обів бЗегобеє біу веб тує вк оїецу Заг обеє чаї Уві 195 200 5
Твг ода рео Зек бдеб баг ви сім ТВРОБІВ Твг оту КТів Су5 дяй Уді «а 15 ко
АБИ Ні рух ргО ег Аа ТВг обу УаТ АБО рух БУу5 ді бі рРгО 155 225 230 245 240
Бек Суз Зег біу йіж біу біж Твг о біу біу біу біу 56г біб маї бів 5 т5А ів орви бі бегобіу біу СТУ вен оУуаї сів во біу бу заг Бей Аго кі то ів) его сує Аїз ма! бег 01у ї16 АБО гео его а5п Туг АїЯ ї1е д5е
ТВ УВІ яго бів Аїз го БіУу Був Суб Бен біб тїТго ї16 біу 18 її чо а 100 тТгр олія Заг Бу ТИГР ОТВе вве тує дів твг тео АЇя Бу бу або Рне 305 БАК ТЕ 320
ТвК Хі бек Ага А5р Ах Заг о гру5 Ач ТВг Ома! Тук се) бій меж Аа 325 33 335
Бек ви АгО Аа бів Або ТК оАТа ма! Тук о ТУб Су ІЗ Аго ТВг У о 345 БЕ
Рго 5іУу тук бек тиг о Аїз го Тук РНЕЄ Ар ово тро обі бів фу Твг 355 50 зах івепсузві тТВг Узі бек хаг бі бі Бі бі зег бі біу сіє б1у бак ик УТ РІК
І7О 375 ЗВО
Бі Бі піуУ біу бек Біж бі біу біу Заг Ах тів бів Мет о тнг сій ях 190 335 щ
Бе" Рг бек бего Уа! Заг Аа хего уд! біу Ар Ага Уві ТВг осі тве 495 419 315
Суз Бій 5аг бек вго бек узі Тер обер Ап Рв ев Бек твр тує Бій чий 425 в сіп бух Бго 5іу уз діа вБго гу5 фвб сен тів Туб бів Віз Зег гу 415 440 445 ецотвке Зеб о сіу уд) вго Бек АгОо Ве Заг обіу Зег обі заг обі тн я 455 4650
АБИ Ре ТВгоцез ТВР Оті 5ег бЗвгогїву бів вго бів аБровйе віз о твг 455 зуо 475 а
Тук Тув Сух о1іу 61іу біу Туг зер бег їТе 5ег АЮ ТВеОтТне Ббе Ту 4к5 о щ- су біУу тт рух маї біз ті губ Ага тТНе
ОО 55 5 «210» 148 «2115 1518 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка 4 СНІ константна ділянка гама-1-ланцюга, плюс лінкер, плюс 5сЕм ді 439Н5
САбА45 з сигнальною послідовністю «400» 148 зісавосопйоа бсвссттове стссстасєта стат сслососста стссзаауу Що сваткпотоо заісодбосо зодасстовто саосссивко зсаЗсстова Зстессих хо пссоБасссо засзстссає сасссснзнн басссвсюа астзцассва засаду В паззаоває того цес ас саака дсссавесва ера а тессотозаЗо зссосзтсає саєетсосос часазсваєз звозаївеєїїх гтассіссаа Зо аспявсаесс тосодассча зопасастасс асастасї зссасозоз аїсасагтас 300 тЕСОВОсЗсЄ Ка сттсс сто свнююсассс тост сс 430 шстасаайвц ссссасовзЕ сксссссто сосассетесск ссазоаазсає сЕстОое Б зсацсцаєсє еапоастаєсх зоассазЗаає тасттсссосв азссазеЗає зас свтод Бе застісвоцта сєсетоавсєво срсосткас ассттсссоо стптестаса сс саах БО стстастссс сохвсаасвх зшиозосе ссстссаЗсв Зстовоасас сс НІ заістоасвасо ре ссВсва псосвасвас ассавозісо аїлазайаеї мини севва 20 тсттосвако ооо сасеуєв ооо саосо позі тсаВох пет ансх 258 поча часс тафсссявесс стодзоцозесє стос сетососацю аа аєв 40 пасстозося Зскясссяї свастооато асоасзавстс соасододаатоа тттаваатни аю звісодтасза табоаздссао содозспаєс Ії ївтоста свтодасова зона ЗО зсзатєвас зоЗавсватаЗ сазазаасасо атататсїсс зазтозасес сетасацса Того чачезсзсциа сзчсасаста стузнлсяс астатсскас сттатадевас тасВссескае мо тіеєдатює собозвсвяоо часестовто сс сва сін лювою сота ова ля дазочебоосї стодасцасац судавосоої зесззозаєє ссцасатаса засазстево ТЮ хсхсстжхсаї сочізессяас чесссаттосс датаоааєця стассасаєо ссзазасксх 1250 сива Човасваско сстатсєстоо гатсзасаом авассооцавя стос ВО сити атозансстс ззазстсвсс запо вс сотесаацаєе са ЗО пежесннюа сСадасєттсає аетозсавтє аа тсоастоас дассваацва сеггоаВее ї8340 цетатота зтооузпаїв своїзосата загоасасовй сабо сопоазстаао ав жсосцазаїтсз застає: РІ «210» 149 «211511 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Лінкер між СНІ і зсЕм ді 49Н5 САб45 «400» 149 зев бі сіє бТу сту тб оєіу біт бу Ту вет
Я 5 16 «2105 150 «2115 253 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» зсЕм 9І 49Н5 САб45 «4005» 150 бій маії бій без сей б оЗеє о бту Сі Ту Беуд Узі Бій Рг бТу біх ї 5 16 ї5
Заг о їец ага ів зеб сСуз5 дій Уа бек бі Ї15 ар ев бят Аа тТув и а Зо
Аїд їі Ахап тТвромаї Аго бій АВ РРО біу ух Су без бі тер ов
Кк ча 45 сім жів ї1іа Тео Аїд бек обіу ТВеотТне вве тує Аїа тане тко віз ув хо 55 5
Фі ага рне ТВг їі Звг о Аг Аз АБИ Зегобуя Ай ТВгоУуді тТук рев 55 7 5 що
Ззіп мет Ап оЗег сец аку АТВ бін Ар о Тве Аїд Уа! Туг Тук Сх дів
НІВ. 55
Ага твеоузі рго біу Тук обБеє ТвВг дів вго Тук Ре дер їв їго Фу 100 105 о піп біу ТВг бен Уа! Так Уві бек хат біУу бі біу біу бек сі йіу 115 ко 125 сіу біУу заг обіу сіу Біу біу бБег біу Б1у біу біу бег А5р тів бій 130 135 148
Мес тТнгобіп 5ег о Рго Бег Зак УЗ! звг Аїз Заг жд! бу АБр Ага. Уві ї45 130 ї55 150
Тве о хтіе тв о Сух бій бег Заг о Рго бег омаї Трек АВ вне ів) Бек 165 170 175
Тгротує бів бій фуб5 го біу бує йіа Рко уз грец ів бі туг б 180 іа щюЮ
АтТа бег су Ген Тиг обег бїу Уа! рго бек ага Ре его осіу его оту 135 2а0 205
Заг бі ТР оазр ов Твгобао тб Зів бек бвгогрео бін во біб Ар 218 215 й вве Аа ТвгОотТук Туг сух біу С1у б1у тТук Зак бег їі бек дер ТВе 225 230 235 240 тв овна сіу Сух соіу тиг обу Уві сть тів бу АК тар 245 аа «2105 151 5 «2115» 20 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Лінкер міжаНн5Ь САбАа45 і ді 4 САб45 у зсЕм «4005 151
«у біу сім біу Бек обіу сі б1у сх Зег сію б1у біу віх ее ту 4 З о 15
ЗіУу БіУу сіу Баг 20 «-2105152 -211510 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВНІ САб45 «4005 152 сі їіе Ази оцей б Ас Туг АД ОЇ Ап 1 х 10 «-2105 153 -211516 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВН2 САб45 «400» 153 тів їі тер оаів бег о сіу тТвг отТве ве тук діз тик тер оаїа губ біх ї З ка 15 «2105 154 «-2115 13 «212» Білок «213» штучна послідовність «020» «223» СОВНЗ САб45 «4005» 154
Тне УВІ Бко йіу Тук ГО Так АіЯ вгОо тТуг Ве Ар ер 1 5 10 «-2105 155 «-211512 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВІ 1 САб45 «400» 155 пій бек бег вго Заг о уді теор обес дев вве Гей Берг ї 5 то «210» 156 -21157 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВІ 2 САб45 «400» 156 сів Аа бек Гуз рец тнг о бег 1 5 «-2105 157 -211510 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» СОВІ З САб45 «4005 157
Біу 5іж туг зак бек тів 5еб Ахо ТК тн
«2105» 158 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з БбБОМ 5520 567М 5778 0798 563МУ 576М «4005 158
Азр жів бін зви твг осів бегб Бра его обБег овву зве вів Бек УВІ щіу ї 5 10 ї5
Ахр Ага Уаї Тйг їі тТйк бує ага Аїа бег бій 5ег Уві Авр Туг Атр й 25 30 зіж Ав Заг тує Меї Ап Тгротук вій бій бух Бго бі уз дій РгО 35 40 45
Бу рец о існ Ті ТУР ОАЇа Аїд Ар отТУуг Сец оїв бек о піу Уді Рго Меї 5 5 БО го Рне те сію 5ек бі мек бі твгодяр вне твге рез те їв деп 05 7 75 30 дга вв АгОо Бго біб АБр Ре АТа тб оТує Туг сухо б1п бій бев Ні 55 ВО 5
Зіш Ажр РРО Туг Тве вве сіу бта біу тик мує Ууаї бій ї185 вує 106 105 о «2105» 159 «2115111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» М-ділянка з БбОМ 5520 567М 5778 0798 563 576М «4005 159
АБИ гі біло їву ТВгобів бег вго бег зер цец его АЇїВа его Уа! б1у ї 5 10 15
Акроако уд! Твгоїїе Тек оСуз Ага Аїз Бебобій Бег уві АВ ОТуБ дар 23 30 чіУ АзробБаБ Туг Ммаї Ази ТгроТує 10 51 у5 Рго біУ рух Аїда РКО що 45 іжв фей уво Ті6 Туг ліз дід А5ротуг рец 013 бек бі Ууді рга мех
БО
Ага ейе туг бБіу Бек сбіу Меє біу ТНК оАєвВ вно ТВе ву те т18 Ап
Ба о а во аг ім Ага г біц Ав рве дія тТвг отТуг їже Сух біп зів бЗаегб нів
Б 90 55 5 АжроРгОо тує Те РВЕ бі бій біу твгокує маї біо їв ух 100 ць 110 «2105» 160 20 «211518 «212» Білок
213» Штучна послідовність «020» «223» Сигнальна послідовність -4005 160
Меї ух тероуді ТаговНае тіє Заг обев іби Бе ву бе бЗег бер дів ї 5 10 і туго заг

Claims (14)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Антитіло до ЇДЕ або антигензв'язувальний засіб, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить ділянку, що визначає комплементарність, СОК-НІ з амінокислотною послідовністю, яка являє собою ЗЕО ІЮ МО: 14, СОВ-Н2 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО МО: 16, СОВ-НЗ з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮ МО: 18, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить ділянку, що визначає комплементарність, СОК-І1 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО МО: 29, СОВ-12 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮО МО: 50 або 51, СОБ-ІЗ з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮ МО: 33; причому варіабельна ділянка легкого ланцюга додатково містить каркасну ділянку, ЕК-І З з амінокислотною послідовністю, вибраною з 5ЕО ІЮ МО: 32, яка має одну, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім або більше амінокислотних замін для посилення взаємодії антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу з Сє2-доменом людського ІДЕ; і при цьому: а) ділянка ЕК-І З має мутацію у положенні 560 (за Кабай із заміною на М, ЕК, К, М, О або Т; р) ділянка ЕК-І З має мутацію у положенні 567 (за Кара із заміною на М; с) ділянка ЕК-ІЗ має мутацію у положенні 577 (за Кабра) із заміною на К; а) ділянка ЕК-ІЗ має мутацію у положенні 279 (за Кабад із заміною на К.
2. Антитіло до ЇДЕ або антигензв'язувальний засіб, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, причому: а) варіабельна ділянка важкого ланцюга містить СОБ-НІ з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮО МО: 14, СОВ-Н2 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮ МО: 16, та СОВ-НЗ з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮО МО: 18, та варіабельна ділянка легкого ланцюга містить СОБК-11 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою ЗЕО ІЮ МО: 29, СОВ-1І2 з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ МО: 50, СОВ-ЇЗ з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮ МО: 33, та каркасну ділянку ЕМУ-І З з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ МО: 131 або 138; або р) варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка являє собою ЗЕО ІЮ МО: 1, та варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ МО: 132 або 139.
3. Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за п. 2, що додатково містить константну ділянку легкого ланцюга, причому варіабельна ділянка легкого ланцюга та константна ділянка легкого ланцюга, МІ-СІ,, мають амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ МО: 137 або 145, що, необов'язково, містить сигнальну послідовність, яка має амінокислотну послідовність, що являє собою 5ЕО ІЮ МО: 160.
4. Антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за п. 2 або 3, що додатково містить константну ділянку важкого ланцюга, СНІ.
5. Антитіло до ЇДЕ або антигензв'язувальний засіб за п. 4, де варіабельна ділянка важкого ланцюга та константна ділянка важкого ланцюга, МН-СНІ, мають амінокислотну послідовність, що являє собою ЗЕО ІЮ МО: 5.
6. Антитіло до (ДЕ або антигензв'язувальний засіб за пп. 1-5, що вибирають з групи, яка складається з: ЕРар-фрагмента, модифікованого РаБр'-ррагмента, Еар'-фрагмента, Е(аб)»- фрагмента, Ем, зсЕм, 5саб, діатіла, біспецифічного антитіла, триатіла, РарЕм, Рар-Ех-Рм, тріотіла або (Рар-Ем)2-Ес.
7. Антитіло до ІДЕ за п. 6, яке являє собою Рар-фрагмент, з'єднаний безпосередньо або через лінкер із 5СЕм, що зв'язується з сироватковим білком-носієм, таким як людський сироватковий альбумін.
8. Антитіло до ІДЕ за п. 7, у якому 5сЕм містить варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, переважно з'єднані через лінкер, що має ЗЕО ІЮ МО: 151, причому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить СОК-НІ1і з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮ МО: 152, СОВ-Н2 з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ МО: 153, та СОВБ-НЗ з амінокислотною послідовністю, яка являє собою ЗЕО ІО МО: 154, та варіабельна ділянка легкого ланцюга містить СОК-Ї1 з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ МО: 155, СОВ-І2 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою ЗЕО ІЮ МО: 156, СОВ-Ї З з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ МО: 157.
9. Антитіло до ІДЕ за п. 7 або п. 8, у якому РГар-фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, причому: а) варіабельна ділянка важкого ланцюга містить СОБ-НІ з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮО МО: 14, СОВ-Н2 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮ МО: 16, та СОВ-НЗ з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮО МО: 18, та варіабельна ділянка легкого ланцюга містить СОБК-11 з амінокислотною послідовністю, яка являє собою ЗЕО ІЮ МО: 29, СОВ-1І2 з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ МО: 50, СОВ-ЇЗ з амінокислотною послідовністю, яка являє собою 5ЕО ІЮ МО: 33, та каркасну ділянку ЕМУ-І З з амінокислотною послідовністю, що являє собою 5ЕО ІЮ МО: 131 або 138; або р) варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка являє собою ЗЕО ІЮ МО: 1, та варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ МО: 132 або 139.
10. Виділена послідовність ДНК, що кодує важкий та легкий ланцюги антитіла до ДЕ або антигензв'язувального засобу за пп. 1-9.
11. Вектор клонування або експресії, що містить одну або декілька послідовностей ДНК, вибраних із БЕО ІЮ МО: 36, 5ЕО ІО МО: 38, 5ЕО ІЮ МО: 40 або 5ЕО ІО МО: 42, або 5ЕО ІО МО: 133, або 5ЗЕО ІЮ МО: 135, або 5ЕО ІЮ МО: 137, або 5ЕО ІЮ МО: 140, або 5ЕО ІЮО МО: 142, або ЗЕО ІЮО МО: 144; причому, необов'язково, вектор клонування або експресії додатково містить одну або декілька послідовностей ДНК, вибраних із БЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІО МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІО МО: 8, 5ЕО І МО: 10 або 5ЕО ІЮ МО: 12, або БЕО ІЮ МО: 148.
12. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло до ІДЕ або антигензв'язувальний засіб за пп. 1-9 у комбінації з одним або декількома з фармацевтично прийнятної допоміжної речовини, розріджувача або носія.
13. Застосування антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу за пп. 1-9 або композиції за Зо п. 12 як лікарського препарату.
14. Застосування антитіла до ІДЕ або антигензв'язувального засобу за пп. 1-9 або композиції для застосування за п. 12 у лікуванні або попередженні одного або декількох з: алергії; алергічної астми; тяжкої астми; помірної астми; хронічної спонтанної кропив'янки; хронічної ідіопатичної кропив'янки; цілорічного алергічного риніту; сезонного алергічного риніту; гострих нападів астми; гострого бронхоспазму; астматичного стану; гіпер-ІДЕ-синдрому; алергічного бронхолегеневого аспергільозу; попередження анафілактичних реакцій; харчової алергії; атопічного дерматиту; алергічного риніту; чутливості до бджолиної отрути; ідіопатичної анафілаксії; алергії на арахіс; алергії на латекс; запальних захворювань шкіри; кропив'янки (викликаної впливом сонячних променів, викликаної впливом холоду, викликаної локальним тепловим впливом та/або відстроченої, викликаної стисненням); шкірного мастоцитозу; системного мастоцитозу; шлунково-кишкового розладу, асоційованого з еозинофілами; бульозного пемфігоїду; інтерстиційного циститу; носових поліпів; ідіопатичного ангіоневротичного набряку або неалергічної астми.
и а и т й
-ко. ж у ., 3: з шви З о ПИ шо с Я її ОО ще Сон 1.
Фіг. 1 а ех щи Енея З я ва 0 вс . З я
М З. ще ЩА 5 З КО о КОЖ с в інв. КОНКУ -- КУ - нн и а й Я ее й і М Я як ше ес Й Сей 5 од жк ЕТ в ав пф ВО МОХ ж і оз 5» ої товіуй з дж в п З і ска «ах. що в. 0 : о о. г Бо с вва С КО а ОБ ЕФ (/ Евір Се б | са» Ко ВЖК ЕТ Що х МОХ, КК ОХ НО З за ОТО Весь В ОБ я сеї ч- 0: У ОКХ Х ще НК В 7 МУ ОО НК ВО не ож і Ше З
Фіг. 2 а вої -ні шо шт, Кх ва В. ев в. ь 0 й, ан и бай в с ПЕ й ПАК т ШКОДА ОО ВУ еВ ОК ! я шин ще : З т де НО В ОК МОХ щЩ зи я нс й шоу вв з Що а ко тех. .
о. учи У
Фіг. З р в щу АЄТД се винні То у с шу Ффучии ?
і. юДдДЦ( (ЩЕ шь ли. шщ. ЩЕ | --0 каш нн шив 3 У -ш | ьо п
Фіг. 4 в щ- - в - -
ЕЕ. о З о. шо ОК В Я СОБКО сш КО о є о п х Бе шо М п о . Ж Я ОО ОО дО ее ПК пе пн АК АЖ я А - - М ЧО У АК й Є ко ще МОВ МК ВЖК КАК. сао, яд п А ОО ОО ї В о а ОК КК х б те Бех СКД в я г. шк. | ї ло А Кн КК не В В її. СО, ВО ЗИ В о Я 5 ох їгхз ще й З КО ОХ КЕ Я ОН ВН Х 0. АК ЗХ Жкх, 5 МАЕ о КВ КОКО ЗО х ще ж с ше нн в Ж ії «ДВК ах КОКОН п В НК .: ОКОНя ск З КК. ОО ж Ж що ХХ з КОКО жи Ж А КК КК : КА с КО : а ІЗ еВ В 5 се БО ох х МК КК КК ХАН КОН о ХО Я З ще . а х 1 ЕЕ | п. Ш ох Я 0. що ТЕ ЕЕ з ів З ен в о. 5 ве п и В хх о еЯ й 4 тк ХК. ще ПК Ж Ма ЕН 53 0 й. й т . ши - ШО / КУ ОХ ШИХ Бе йо: сан Ей ОО
Фіг. 5
ІЙ ПОН ЗОН АХ ККОМННЯЯ . г о. і | » з с о | і
Ф. с о 5 о» и ОО м З Ше Б М(М (о я о. ше щі ад яка с. : ох с . ее Е ЗВ КО СОМ
Фіг. 6
СЕ ке З. Ж ЩО ШЕ Ше : і | . з . МБ я 5 г сх на 5 ОХ ОКУ ККЯ ЩО КН дО о КС ПИ по ОХ т СМ ОХ ДОН ВК оООШЕ У їх ПИШИ У ЗКУ ох ОО ЕЕ. З ЩА Н п ЗИ Ееше в І ї ї Б 5 Бе З «5 ж денні КО Не х Ов її ш-- ще 3 ь аз я: с ВО шк Б 3 баб й 5 о а Ша ЩЕ Се БК о ЗНО ОХ: Б ЗеННВЯ КУ СТВ ся ХХ. 5 Же й й ОБ ЩІ ШИХ шов ій чт о З БР ее й ШИ З йо:
ш-.. п. шщщ о: й ШИЯ ее й - щи че ши З ж 5 З І -е 0 Шо ге, КК; і ши ша» б ес ШЕ Я Ж бю М х Ку Ж що т а, ж й ей БУ о ЕВ ЕЕ не НН МИНАЄ ; зи лек КОКО ОЗ бен шосте Ин бубсайт а ш- їй бо 2 Е її ще ше: ще і В с ле ОБ Ж, СЗШ "ззбча і пшШвї Що 5 ТВ. 00 бедеит», с й же о кт ЕНН ВО о в ШЕ щи а Ше і. - Є с: ШІ ХАЛВИ БК КИТ СТИХ их Пил ЖКУКТ) ро Фіг: т З ще ех. 2 -ж сен вь ше ши є чий ни м ише шще ч ша ше ши Хрккенккоя у шо КУ ХОЛ 7х ЕК С ще КЗ КЗ с Ка ЩО й ЗЕ, З "75 5 СХ Ж й Тї Жак Її ка 5 Ей ії Б о иє ША - її і. ай З в. о Є ж Шш ше «доня Е Ве Ж ОХ Ж, Б в ши ХМ ой «0 АК К- КО с. М І о що хх З х я Й озна р її 6 ї їх М ех вве Ше о Б Оп с ШО і НИ 5 і й й ек я що 5 й з кі ще ша і ши ен не І ШЕ ши ре БЕ С педа Кк люк» сов оо еко з ши и і й ооо ЕЕ НН в я. - - ть ЩЕ - хх пл Що | я з ще З ши її сох ши ше 5 ВО ОН НИЙ о ЕЗ ве, У М С Ве й ша й Ме й ФО ев я КУ ОО ОС ех Фіг: 8
«ку ау ку ке няЕ Ко ден -. ЕЕ «ізн що - ї о Ж ОД ХЕ Зх ї Денис ДК жХ вк З ох ІЗ І ше КО я сх | їх їй - ХО Ух. хну, шої Те зо МО ОКХ Б Ж, т А Бех о я що ХОБІ я Я З КЗ С. - Б НИ рей по що З Бе ОВ З ен ад З БА ши КМ "хни х М «ОБ ЕК ее мий со Ши - Ж ЕК а Я КЗ а Хе ре У ау У Кя яко в З жк дев В х 3 КУ ем ОХ Е Х жу КВ реа З Уа х Зк ОВ чі жк Е КІ й; с м жк г ще Ка коду о нвввоввя ие В точ В Зх ЗУ БИК с а вно Сак о ху Х ож хе СО ї ВО Й у в хх: ЗВ В жк пос, В - ПОВ - Ум, УМХ ЖЖ З й ск, Я я ЗО а Й Кк Е Е ї бежж, еВ. Б ї КК Кит Е г ва Ах, с Х Я ши ха з З жк: ке Я Б ДОА єч кю уккихххм : ехо ЗВ Ї й ру З Ж ХХХ КК кккккк Ко ях 2 Ж ЩЕ НЯ - і: я ї ЗУреНН: и Ї х «Я Б й ЕЙ да ЗКУ я ша ж х : Шу ї нн нн КВ В ОК ПИ В ВО шк ня щш м ще ж Ж ще ОК я Я її в нн и кн зма зара С МАО ХК КМ ЩІ ЖЖ ОХ х ж НК ще мшжл. лм а се. сок как ща й е Ж Ж ЖЕ ОК Мо Же. ВМ ОБ Же ЖИ ВО РО ОО ВЕ ви с ска шо Дод Й МНЕ НХ як де Вдкоох. ІБК с Едіт х Е с ЖИМОТ - З одини т КК жк ща о 00 денну ї ОДУ, Ш Же 84 ко ШИ |у як Е дея ТИ, ї З ТУ сою Я дак ВОМ О ЖЖ дини, ї Ї 1 БАД Жохх 3 ОЗНАК УНК ТО, Коша їх 3 Ен ее Ман х дю Ж ХО ваеконя де ї І: ї 3 а ИЙ ронних сх хо Ж ТОЖ, мк Х о ї дмюк юки юю зак Я Ж Се х еще Ї ї в Я Химия й ро «МЕ З хх: сшижжт МКК ї-еої УТА ї ї хх ї 7 а Я ГК НЕ с ИН и жк ї 7 ї Сай В - : Во и ен -к 3 і ї же : : т Кос т КК 3 ї З ее я ре пох 3 рез У но Кон хан свое 3 і как КК У Ми Кк Ку Я яке й Х Сл ан НН - ТЕМУ З Ї пн я Б їх Мо ВН а вн Е: у Ї КОЖ ї -к З мя п а мАникя Я КЗ : о : ою; ІЗ хи пнлжхнці КН, хх о ч Ї 1 ем ї Я їх ї «Мк кю юю плн, КИ з «М ї ЕОМ КДККМ юки У Ко ще - пак, іс мае З ї МОСК ЗК ж М ї ОХ СУХА УВО У З : ї - ї Я июня, х Ж і я ДЕД ку щ х ї І х 5: хх : гом З Ж Ж Ко 3 Я Ж Тк УХАмюх міакхкююк жк ккнккккнккх З ку -МЕБЯ Ж не ї Со ЯКУ Я : : ще ї ше : зсх 3 КК : т 1 я ХК дин Її ек шхх З НН еЯ ії БсЯ ЕЕ : пи : «а ЗЕ ШЕЗ : їв НИ тре х як рф с З : Є «Я ШЛЖМмМмни ї вк ЕКЗ ПЕ х х 3 Ех ОБОХ їх Я ї ХЕ В х я ї Е; х В Ох, 3 Е2оу її Ж х ї Я їх по ЖеК ня ВК що В 3 з их тех т ХХ Зоо охкжжжю ї «ФК Я у у у ук З 3 ї Пронюк ВК й З Хе кнК що ях ся ЗИ, ПК, т З ДН оф ссососсосогерооссох «ТИЖ ЯВноаннтуючнння ДО ОО нн ш ОХ ЗХ я хх ххх с Кож х скл вай Щи у ; З х ЕХ КУ ке я ЖЕ Ме З й ЩЕ ЖЕ БЖ БЖ ЗБК Час й Час
Фіг. З ма Я дит М Ши же Ж К: Ж ГДК КМ п Зошити шої 5 я В, Я дян Ж ЖЖ ех ОВ зе СИ ле Ж с: НЕ зи В ТЕ и же аа Сх і шим М : х ЯВИ ях в в ЕН ту же Год РЕ: рен ОКХ хе ШЕ ж х ОК уже ; й ше п шо у і Я хх сих ох З -: с КО Кок З Ко Й і Е Ка склеює кн Не а х щи скл Ж і Щи че, ХЕ Ме у: догетч дуття соти. Е ї КУН т СВ . ЗО її «й, 73 їх й ИЙ ж ТЗ ПЖК З гей СК ща Кз З зе МУ СИ Й Ох Задля "зе зі Ж, ден хи шоу Ко з дасєкуюня и птн куувкнх зе: а КК В ТІ вк НЕ НАХ го В ше У М Еш оовіК а ОМ я я АВК ОО МОМ дн т ч ж ЖК А КВ Чак: Око ЩЕ Хоуметуютття "Ж Пет вен КОВЕ й іх СЕК хх ЗУ ек п Мн Й кт жк о жЖх и пло мох «ХЕ с й п Хе М мк й у З ИдОМККкю
З ї. КОКО ЖЖ пугкуккуюх й о ївеіс УСТ З МО хм ж м жк М і т ж м М ле з ї з ПО МО сю КУ ЗШ Час МК доку і: муку ак що зкмзнлюмня Го ї х У. й Мк ї дея З ЗБК: : 3 я й ВЕКх я пюжктм щ Ї я меси і хх МОБ ТУНЖМ ПЕК ЖЕ біжу КІ а х хх ММА о ВИ Кі ше Дистон дк па ще шк ї ЦК ж Жію г Ве Ко й Кй р - Е і о х Ко зе Ж КН бек ЩІК ї ї - що ЕЕ я ШИ з ї є Ж ї Її і кун х ско ЩЕ жо Десни ж ; Ї ; ев, ші ВЕ А а Бо ! У ше пух Я а Ж ще НИ: Ї Я Я скл, : ше в І Хе ше Ша Кк а ша я гя і у ши «5 зе з «се Ше се жк І: Ї ск мент нниоя зе инекітан ненйй НИ т Я і ! Ше я й т ЗЕМ х. жі,
мк . в х ланах В кін й : і ПУ лттк ет х х Рі щ- ів і : ШЕ і ; ф сек. я УКХ Її 7 резнни Бін і що що З ів шко ху ЩЕ Є ся ШИ У р же со Й Я Фіг 5 же во Же й пити, ПТК со ОВК ше Час ці жи нка ЕК о я м Ж КО КЕ Он 7 З ОА УВВНННЯ МЕ що 5 ШЕ о Х ОБ де ес СК . Ва 0 о 5 |і -к ве о КО Ех п ж ох под "й ПММ а о ОО Шї Й з» Її о. БО : ЛЕК с і звей ох ЗОВ і Ес дод вен і ша в си ПНЯ ЗОВ о ноя ЗВ ох и КЗ ЕОЯ ПОШЕЕ ОО ІШНКНя ПЕВ т і ОВ й КО У ЕН ПЕКИ па. ХЕ СО й КО ще М: ЕНН Моя Бі нн шт ПЕ я ОО ОЗОН ТОЖ ВЗ ж що ЕЕ ('" ОККО КЕН я в пе Я Ме шт ДЕК й ОАЕ ОБОХ Зння СОМ ОК ОВЕЯИТ Й ЕЕ й о г п З бе й ЕЕ ОН Нв ОКО шли По, КОКО ВМ п. ші ОК Я ПОТ ВВ Ден БУ Ой ОК он ПЕК ОМ КОООКЕ ОКО ХВ Й її о п. Я с я Б ЗОВ в г ЕК, ОЕМ шо ДВКЕ Я ШЕ її пи ПОКИ М З Ж о ї о Ес 0 пи шт й «й Б. р В п па птоМВЖ Б КО поли Ж ПИЛОК ши. ОО пд о ШЕЙК ств ВО БО ЕК Я Оз 0 в о У ДОД Ну 7 ПОВ й В БУ до ня шої я С: в: Ех с ії З С пи і: Б по я о ВО» дО пи п о СУЯ Б Ко с ОН пд ща ях п В Ящ Й . Б пе що СО ПЕК п Я р ТЕО, де ЕЕ Ж ши що ся КОКОН КК п де Же Ж ЗОВ Овни БО ШО з ! я о жо за й Ж ооо вх г БО ПоНе В КО г дже слу де КОВКК Нд М ЩЕ ех Я зе ї в Сх я на ся в. ОВ о Б М ско пт тощо с СЖЕЕО Ой ПК я по ОО ОО йо З ВИ ШИ в ШЕ: | Ж ж НИ: п їй І Б с жо
Фіг. 11 я
1005 пееееенюннтеннн ше . їде ше Буфер с х Я я Жов дже ІЗ 7 ОЇ За, ««- ВМаЛІЛУМАЮ МК, мкл х Е; щ І й З "ке - Ж м мйщ, ко - Ух Я Ж і х Е ШИ ПЛ док «я» ЖаБі вмалюуМмабу МО мкгма і ка й ЩО пе 7 Шк -х» БайО омацізучайу НИ мкг/мл ї : те ж. ви» Ко, «-: Каб) вмалзумабу НЮ магма я | Шк м | миша Б шт ння й щоб 2000 зю 4000 Час бекунля
Фіг. 12 ож пт Кт, с и ЧИ ЧИ ЕЕ «0 4 ї ТЛІ пече х К, т, ту ки в : х. хх ; Х є й "ха ха Х - 00- ; Пеня -к 7 й : 4 ще ; і 5 ; й ж х КЗ - | і знененє Комірки чл ькия З Кен ко і 7 в оч б мутація зем тяж Бав омалізумабу САТ - 0 Жов омаліумайбе Часісекундя)
Фіг. 13
СОмалізумаб Гав омалізумабу 1 Бгто тето сте тнючччнст фбрунннння Ве | Цех відки СД |! «Без обробки є | знівзиетумає 1005 яко ся з Гав омаліву мабу і мкпнл Бех | малій Зі мкм бо й «Бар омалівумабу 3,1 мкм К-Ш СЕН о себОмауваб Шмелн Шк не -Бав омалізумабу 10 мег/ма що Гармаш імя ще і «ав омалізумабу Зі мкг/ма а Що п уівжвй мети 0 ее Ка оманізумаєт ЦЮ мигоми є пнненчнтененнн контентні" СІЯКУМИЄ | Мюім сненеся міння й ЛК КАК з Е: тиж ОХ Кама Час (секунди) Чис (секундні Бабві Ба? Ів и и Ду колоти Ж А неясне ! ї зх а м х І дО - зБез обробки с-о і ГИ у З я їй з У ххх подав ОО ви | еКаевіїмкжума 5 ! » Без обробки Ж Ка ни и КН і рив ц меня же Шк дет і еЖКаБі ГО мжеми всех жи І Еабу З. мкг/мя ТО ик і ерБаві Зі меми | дивак | еБаво 10 мкріма ви ВК тькхентютемтуннохний КВН ОМЕГА з кокеткою тав ЗЕ мкруяя ванн ЦІ пн я КВ й ЩО ххю ке а ЗМ ЖК ках Час (секунди) Часісекундні аб Ізотипічний контраль зр те тт оттиня нн В й! до ши еБезобробкно ос « Нез обробки СЕ Ка Таб) і меми ж жізмни і мкг/ма .. уд я рані З, мкрмл с яна Зі ким Мах ка де нн УК . ре й й р й Ме ой й р «53 ІВ Вк Ма в ««Биурни Мі мкм ої нас | жЕЗБі 3 мкм я ««ізотни Лі мкглвя ад Пк екю ння ЕВ Об желмя 0 еоренеф оролтхтне їзотяп 100 меглня гу МКК Кия Ехо з ОЙ хкю зака Часісекундя! Час ісекундні
Фіг. 14 З сіко лж юка їй хо Молель 72-годвнвої РОСА РВЕ жи шк Б Б ей ск й й . в | шк Кай наліт аву іднкоаго еп й 1 зн щі я швів щи Шк з ов : х шо ж : Ез83 зналізузау ше. | ше ще НЕ вужт ВІЙ
Є.
ЕЕ . я хо що | шк що | ! їт- МОБ. | мой «і й екю, і шо ко - . ЩКУ г. ежк пк схуча г сук Ж я Я бтатнетечний вант: екритерії, ЯКУ: пеовияєвнк З Е г М- середовищем в е сере значення ЕБЕМ, веб, Кк З Відсоткове зниження У виинновх вопівняне ях прупОою г5 зх керсловаця ІРБ5)
Фіг. 15 во ХО МО: ЗОВ КІ ХХ ех ЖЖ ЕТ ЕМ я Х ТЕЗЕ Ех узі ФжеКУЮТМТт ХЕ їх Жеж дос иУуУто ух ЖЖ ККУ МУХИ А УЮЕУХ ФУЮЮ Ух, жЖвеМокіюиї жКщІіАюМю мокко око Км Х іа їіх Сем АХ жо еж ож жом оюх «учи УЮ же тих ще У М У сек щІВУВ З жі стцУвух У сУкулух ких улкикУ щит УМ жудутУЄ ІМ Ж ХУ сх УХ І КМЗ мі ФІ МКК УТІМ ПЕК АГМ МКС УБАХІ ЛЕ Кк й се миле Х СЕ ЖЕ Кох З су Дитпине ЇХ - е МОЖ МК ох хх ші ев уз у ТУ Ус тиву тіми Я Ж умі чЗУч УЮ о ух гу МУБеБУМ Ух БУМІюту ху рик тних как пьКІінК БТІ САОКОКУМ ЕБЕКАОКЕУ Вик ММК ЕЕ жов Кк ох сх т ши тек ух ге и КК тУЗхІї ПУ т ВЖК ли ех ду жі Ох ІІІ в шу пут ти КК и їх огжораАмМтвАІ Бі шЖМмоЕКАВВНОВЗ КЕБІСЕ КАА ОРЕУХЛАЕАТЕК ВЕС Ті. жо ох ож Б-я жу тут гут хе МІЖ щиУЄ ХТО МО ут ЕІ УЖ ЩЕ Ж ж мкА У ХХ ме Ви Масиви МЕ МАМУ МиКвІ ВЕУ ІМК КК тучІ Вища ви слу ІМ пнАУМНЕВАВ ВБОГУ ах ІНК ща Комп' М.
М омп'ютерна верстка М.
Мацело ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул.
Глазунова, 1, м.
Київ - 42, 01601
UAA201812606A 2016-06-10 2017-06-08 АНТИТІЛА ДО IgE UA126468C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1610198.2A GB201610198D0 (en) 2016-06-10 2016-06-10 Anti-ige antibodies
GBGB1702435.7A GB201702435D0 (en) 2016-06-10 2017-02-15 Anti-ige antibodies
PCT/EP2017/063916 WO2017211928A1 (en) 2016-06-10 2017-06-08 ANTI-IgE ANTIBODIES

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA126468C2 true UA126468C2 (uk) 2022-10-12

Family

ID=56894897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201812606A UA126468C2 (uk) 2016-06-10 2017-06-08 АНТИТІЛА ДО IgE

Country Status (26)

Country Link
US (2) US11214627B2 (uk)
EP (1) EP3468995A1 (uk)
JP (2) JP7164439B2 (uk)
KR (1) KR102456813B1 (uk)
CN (1) CN109379892B (uk)
AR (1) AR108707A1 (uk)
AU (1) AU2017277600A1 (uk)
BR (1) BR112018074838A2 (uk)
CA (1) CA3027120A1 (uk)
CL (2) CL2018003556A1 (uk)
CO (1) CO2018013006A2 (uk)
EA (1) EA201990004A1 (uk)
EC (1) ECSP19001438A (uk)
GB (2) GB201610198D0 (uk)
IL (2) IL309516A (uk)
MA (1) MA45231A (uk)
MX (1) MX2018014761A (uk)
PE (1) PE20190212A1 (uk)
PH (1) PH12018502574A1 (uk)
SG (1) SG11201810199WA (uk)
TN (1) TN2018000423A1 (uk)
TW (1) TW201802114A (uk)
UA (1) UA126468C2 (uk)
UY (1) UY37290A (uk)
WO (1) WO2017211928A1 (uk)
ZA (2) ZA201807822B (uk)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109641949B (zh) * 2016-08-26 2023-09-15 赛诺菲 促进选择性轻链配对的多特异性抗体
US20210115156A1 (en) 2018-04-13 2021-04-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fc-engineered anti-human ige antibodies and methods of use
AU2019361247A1 (en) * 2018-10-16 2021-05-27 UCB Biopharma SRL Method for the treatment of Myasthenia Gravis
GB2589049C (en) * 2019-04-11 2024-02-21 argenx BV Anti-IgE antibodies
AU2019456113A1 (en) * 2019-07-11 2022-03-03 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Tetravalent symmetric bispecific antibody
CN113372450A (zh) * 2020-03-10 2021-09-10 北京万华生物工程有限公司 IgE嵌合性双特异性抗体制备及应用
WO2021225980A1 (en) * 2020-05-04 2021-11-11 Dna-Seq, Inc. Methods and systems for determination of an effective therapeutic regimen and drug discovery
WO2021250546A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 University Of Washington Micrornas as predictors of response to anti-ige therapies in chronic spontaneous urticaria
CN111875706B (zh) * 2020-07-16 2021-03-30 广州康盛生物科技股份有限公司 一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用
WO2022061236A1 (en) * 2020-09-21 2022-03-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High affinity anti-ige antibodies
TW202332691A (zh) * 2021-10-12 2023-08-16 聯合生物製藥股份有限公司 Ige調節的疾病的治療
WO2023070502A1 (zh) * 2021-10-29 2023-05-04 天辰生物医药(苏州)有限公司 分离的抗原结合蛋白及其用途
CN114028569B (zh) * 2021-12-20 2023-04-28 中国医学科学院基础医学研究所 免疫球蛋白IgE在诊断和/或治疗高血压中的用途
CN114504644B (zh) * 2021-12-24 2024-02-13 北京大学第一医院 抗IgE抗体在用于治疗腺样体肥大中的应用
WO2024003376A1 (en) * 2022-07-01 2024-01-04 Alk-Abelló A/S Displacers of ige-fceri
CN116143932A (zh) * 2022-12-07 2023-05-23 南开大学 一种针对IgE的抗体或其抗原结合片段以及Fc变体

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
GB2183661B (en) 1985-03-30 1989-06-28 Marc Ballivet Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptides or proteins by means of a dna recombinant technique
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
WO1990014443A1 (en) 1989-05-16 1990-11-29 Huse William D Co-expression of heteromeric receptors
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0602126B1 (en) 1991-08-14 2003-03-05 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants for specific fc epsilon receptors
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
CA2507749C (en) 1991-12-13 2010-08-24 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
FR2716640B1 (fr) 1994-02-28 1996-05-03 Procedes Machines Speciales Dispositif de centrage et de blocage d'une pièce en vue de son rodage à l'aide d'un rodoir à expansion.
ZA966075B (en) 1995-07-27 1998-01-19 Genentech Inc Protein formulation.
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
CN1151842C (zh) 1995-07-27 2004-06-02 基因技术股份有限公司 稳定等渗的冻干蛋白制剂
ZA971607B (en) * 1996-03-12 1998-08-25 Univ Johns Hopkins Methods of treatment of allergic diseases
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6172213B1 (en) 1997-07-02 2001-01-09 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and method of improving polypeptides
US5994511A (en) 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
CN1289253A (zh) * 1998-01-29 2001-03-28 泰诺士公司 以lgE拮抗剂治疗特应性皮炎
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
AU5020700A (en) * 1999-05-26 2000-12-18 Tanox, Inc. Treating allergic diseases with immunotherapy and ige antagonists
WO2001090190A2 (en) 2000-05-26 2001-11-29 National Research Council Of Canada Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
GB0129105D0 (en) 2001-12-05 2002-01-23 Celltech R&D Ltd Expression control using variable intergenic sequences
EP1570267B1 (en) 2002-12-03 2011-10-12 UCB Pharma, S.A. Assay for identifying antibody producing cells
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
SI1644412T2 (sl) 2003-07-01 2018-11-30 Ucb Biopharma Sprl Modificirani fab fragmenti protiteles
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
GB0411186D0 (en) 2004-05-19 2004-06-23 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0412181D0 (en) 2004-06-01 2004-06-30 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0502358D0 (en) 2005-02-04 2005-03-16 Novartis Ag Organic compounds
EP1928506A4 (en) 2005-08-19 2009-10-21 Abbott Lab IMMUNOGLOBULIN HAVING TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
GB0619291D0 (en) 2006-09-29 2006-11-08 Ucb Sa Altered antibodies
MX2009010765A (es) * 2007-04-02 2009-10-26 Amgen Fremont Inc Anticuerpos anti-ige.
CN101801407B (zh) * 2007-06-05 2013-12-18 耶鲁大学 受体酪氨酸激酶抑制剂及其使用方法
CN101842387B (zh) 2007-09-26 2014-05-07 Ucb医药有限公司 双特异性抗体融合物
DK2245064T3 (da) 2007-12-21 2014-10-27 Medimmune Ltd BINDINGSELEMENTER TIL INTERLEUKIN-4-RECEPTOR-ALFA (IL-4Ralfa)
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
CN101230103B (zh) * 2008-03-25 2011-09-07 中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所 一全人源重组抗-IgE抗体
CN105601745B (zh) 2008-09-26 2020-09-08 Ucb医药有限公司 生物产品
WO2011030107A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Ucb Pharma S.A. Multivalent antibodies
SI2494356T1 (sl) 2009-10-26 2017-07-31 Genentech, Inc. Preizkusi za detektiranje protiteles, specifičnih za terapevtska protitelesa proti IgE, in njihova uporaba pri anafilaksi
BR112013002578A2 (pt) 2010-08-03 2019-05-14 Abbvie Inc. imunoglobinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
DK2776466T3 (da) * 2011-11-11 2017-11-20 Ucb Biopharma Sprl Albuminbindende antistoffer og bindingsfragmenter deraf
JP2015506950A (ja) 2012-01-31 2015-03-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｉｇ−ｅｍ１’抗体およびそれを用いる方法
WO2013181577A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to omalizumab
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
US10196458B2 (en) * 2013-07-26 2019-02-05 The Regents Of The University Of California Anti-immunoglobulin E antibodies and methods of using thereof
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
CN104987412A (zh) 2015-07-14 2015-10-21 上海拜豪生物科技有限公司 一种砷-IgE螯合物及其制备方法和应用
US20180273626A1 (en) * 2015-09-11 2018-09-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junio University Omalizumab resistant ige variants and their use in anti-ige therapy
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
CL2021002696A1 (es) 2022-06-03
AU2017277600A2 (en) 2019-01-17
CN109379892B (zh) 2023-07-04
RU2019100034A3 (uk) 2020-11-20
US20190144565A1 (en) 2019-05-16
EA201990004A1 (ru) 2019-06-28
WO2017211928A1 (en) 2017-12-14
ECSP19001438A (es) 2019-01-31
JP7164439B2 (ja) 2022-11-01
BR112018074838A2 (pt) 2019-03-26
CA3027120A1 (en) 2017-12-14
MA45231A (fr) 2021-05-05
KR20190017949A (ko) 2019-02-20
GB201610198D0 (en) 2016-07-27
JP2019522470A (ja) 2019-08-15
ZA202000803B (en) 2021-08-25
IL263452A (en) 2019-01-31
KR102456813B1 (ko) 2022-10-20
SG11201810199WA (en) 2018-12-28
US20220235146A1 (en) 2022-07-28
TN2018000423A1 (en) 2020-06-15
UY37290A (es) 2018-01-31
TW201802114A (zh) 2018-01-16
IL263452B1 (en) 2024-01-01
RU2019100034A (ru) 2020-07-13
CN109379892A (zh) 2019-02-22
IL309516A (en) 2024-02-01
EP3468995A1 (en) 2019-04-17
PH12018502574A1 (en) 2019-10-28
AU2017277600A1 (en) 2019-01-03
CL2018003556A1 (es) 2019-04-05
MX2018014761A (es) 2019-04-25
IL263452B2 (en) 2024-05-01
US11214627B2 (en) 2022-01-04
GB201702435D0 (en) 2017-03-29
PE20190212A1 (es) 2019-02-07
CO2018013006A2 (es) 2019-04-30
JP2023021974A (ja) 2023-02-14
AR108707A1 (es) 2018-09-19
ZA201807822B (en) 2020-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA126468C2 (uk) АНТИТІЛА ДО IgE
EP3328893B1 (en) Bispecific antibody constructs binding mesothelin and cd3
US10894818B2 (en) Antibodies that bind Ebola glycoprotein and uses thereof
CN110462038A (zh) 抗gprc5d抗体和包含所述抗体的分子
CN109715667A (zh) 抗-gprc5d抗体、结合gprc5d和cd3的双特异性抗原结合分子及其用途
US8852593B2 (en) Antagonist antibodies and their fab fragments against GPVI and uses thereof
JP7094941B2 (ja) Ｆｃｒｎ抗体及びその使用方法
UA126275C2 (uk) Конструкція антитіла для cd70 та cd3
UA118267C2 (uk) Антитіло до інгібітора активатора плазміногену 1 (раі-1) та його застосування
US11377497B2 (en) PD-L1 binding polypeptide or composite
TW200817437A (en) Monoclonal antibodies against stromal cell derived factor-1 (SDF-1)
UA121844C2 (uk) Людське антитіло до cd27, спосіб його одержання та застосування
PT2486941T (pt) Anticorpos humanos que ligam a cxcr4 e utilizações dos mesmos
UA118961C2 (uk) Антитіло, яке зв'язується з tl1a, та його застосування
US20210009663A1 (en) Antibodies that bind zika virus envelope protein and uses thereof
UA108201C2 (xx) Антитіла, специфічні для кадгерину-17
JP7438180B2 (ja) 新規抗ｌａｇ－３抗体ポリペプチド
US20220213176A1 (en) Antibodies against sars-cov-2 spike protein
WO2021257665A1 (en) Human monoclonal antibody that targets a conserved site on the plasmodium falciparum circumsporozoite protein
JP2023538098A (ja) Ｆｇｆｒ３抗体および使用の方法
ES2881346T3 (es) Anticuerpos que se unen a C6 humano y usos de los mismos
CA3160526A1 (en) Pharmaceutical combination and use thereof
AU2013202434B2 (en) Dengue virus neutralizing antibodies and uses thereof