JP2022546454A - がん処置のためのｈｅｒ２、ｎｋｇ２ｄおよびｃｄ１６に結合する多重特異性結合タンパク質の医薬製剤および投薬量レジメン - Google Patents

がん処置のためのｈｅｒ２、ｎｋｇ２ｄおよびｃｄ１６に結合する多重特異性結合タンパク質の医薬製剤および投薬量レジメン Download PDF

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Abstract

本開示は、上皮成長因子受容体２（ＥｒｂＢ２またはＨＥＲ２）結合ｓｃＦｖとＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂと抗体Ｆｃドメインとを有する多重特異性結合タンパク質の医薬製剤に関する。局所進行または転移性固形腫瘍などのがんの処置に使用するためのそのような多重特異性結合タンパク質および医薬製剤の投薬量レジメンも提供される。本開示は、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖとＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂと抗体Ｆｃドメインとを有する多重特異性結合タンパク質を含む医薬製剤を提供し、この製剤中の成分は、多重特異性結合タンパク質の安定性について最適化されている。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年８月３０日に出願した米国仮特許出願第６２／８９４，０４７号、２０１９年９月３日に出願した米国仮特許出願第６２／８９５，３２０号、および２０１９年１０月１８日に出願した米国仮特許出願第６２／９１６，９３５号に基づく利益および優先権を主張するものであり、これらの仮出願の各々の開示は、その全体があらゆる目的でこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２０年８月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、ＤＦＹ－０７８ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１９４，９７２バイトのサイズである。
開示の分野
本開示は、一般に、上皮成長因子受容体２（ＥｒｂＢ２またはＨＥＲ２）結合一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）とＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂと抗体Ｆｃドメインとを有する多重特異性結合タンパク質の医薬製剤、ならびに局所進行または転移性固形腫瘍などのがんの処置に使用するためのそのような多重特異性結合タンパク質および医薬製剤の投薬量レジメンに関する。
背景
がんは、この疾患の処置についての文献で報告されている相当な研究努力および科学的進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進するために、がん免疫療法の開発が進められている。がん免疫療法によって活性化される免疫細胞としては、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞を腫瘍細胞に方向付けることによって腫瘍細胞に対して細胞傷害性にするように設計される。ＮＫ細胞および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する二重特異性抗体も、がん処置のために作出されている（例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１を参照されたい）。
ＨＥＲ２は、上皮成長因子受容体ファミリーにおける膜貫通糖タンパク質である。それは、受容体チロシンキナーゼであり、細胞生存、増殖および成長を調節する。ＨＥＲ２は、ヒト悪性腫瘍において重要な役割を果たす。ＥＲＢＢ２遺伝子は、ヒト乳がんのおよそ３０％において増幅または過剰発現される。ＨＥＲ２過剰発現乳がんを有する患者は、がんがＨＥＲ２を過剰発現していない患者よりも実質的に低い全生存率および短い無病期間を有する。さらに、ＨＥＲ２の過剰発現は、乳がん転移の増大をもたらす。また、ＨＥＲ２の過剰発現は、卵巣がん、食道がん、膀胱がんおよび胃がん、唾液腺導管癌、肺の腺癌、ならびに攻撃的形態の子宮がん、例えば、子宮漿液性子宮内膜癌を含む、多くの他のがんの種類において起こることが公知である。
ＨＥＲ２および１つまたは複数の免疫細胞表面タンパク質に結合する多重特異性結合タンパク質が研究されている。例えば、ＷＯ２０１８／１５２５１８には、ＨＥＲ２、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６に結合する多重特異性結合タンパク質が記載されている。本開示は、これらの開発に貢献するものであり、所望の安定性および有効性を有する特異的ＨＥＲ２標的化がん免疫療法で患者を処置するための投薬量レジメンを含む臨床的方法を提供する。さらに、本開示は、十分安定しており、患者への投与に適している、そのようながん免疫療法薬を含む製剤を提供することによって、当分野における先行開発に貢献する。
国際公開第２０１６／１３４３７１号 国際公開第２０１８／１５２５１８号
開示の概要
本開示は、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖとＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂと抗体Ｆｃドメインとを有する多重特異性結合タンパク質を含む医薬製剤を提供し、この製剤中の成分は、多重特異性結合タンパク質の安定性について最適化されている。局所進行または転移性固形腫瘍などのがんの処置において多重特異性結合タンパク質および医薬製剤を使用するための投薬量レジメンも提供される。
加えて、一態様では、本開示は、ヒスチジンと、ポリソルベートと、糖または糖アルコールと、抗体Ｆｃドメイン、ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ、およびＨＥＲ２に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性結合タンパク質とを含む、５．５～６．５のｐＨの医薬製剤を提供する。
ある特定の実施形態では、医薬製剤中のヒスチジンの濃度は、１０～２５ｍＭである。ある特定の実施形態では、医薬製剤中のヒスチジンの濃度は、約２０ｍＭである。
ある特定の実施態様では、糖または糖アルコールは、二糖である。ある特定の実施形態では、二糖は、スクロースである。ある特定の実施態様では、糖または糖アルコールは、単糖に由来する糖アルコールである。ある特定の実施形態では、単糖に由来する糖アルコールは、ソルビトールである。ある特定の実施形態では、医薬製剤中の糖または糖アルコールの濃度は、２００～３００ｍＭである。ある特定の実施形態では、医薬製剤中の糖または糖アルコールの濃度は、約２５０ｍＭである。
ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート８０である。ある特定の実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度は、０．００５％～０．０５％である。ある特定の実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度は、約０．０１％である。
ある特定の実施形態では、ＮａＣｌがある場合その濃度は、医薬製剤中、約１０ｍＭまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、ＮａＣｌがある場合その濃度は、医薬製剤中、約１ｍＭまたはそれ未満である。
ある特定の実施形態では、医薬製剤のｐＨは、５．８～６．２である。ある特定の実施形態では、医薬製剤のｐＨは、５．９５～６．０５である。
ある特定の実施形態では、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の濃度は、約１０～約２０ｍｇ／ｍＬである。
ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の９４％より多くが、５０℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、未変性コンフォメーションを有する。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の４％未満は、５０℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、高分子量複合体を形成している。
別の態様では、本開示は、がんの処置における本明細書で開示される医薬製剤の使用を提供する。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、使用の前に０．９％ＮａＣｌ溶液で希釈される。
別の態様では、本開示は、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、最初の４週間処置サイクルにおいて１日目、８日目および１５日目に多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含み、多重特異性結合タンパク質が、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ；（ｂ）ＨＥＲ２に結合するｓｃＦｖ；および（ｃ）抗体Ｆｃドメインを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、方法は、対象に、最初の処置サイクルの後、１または複数の後続の４週間処置サイクルにおいて多重特異性結合タンパク質を投与するステップをさらに含み、多重特異性結合タンパク質は、各々の後続の処置サイクルにおいて１日目および１５日目に投与される。ある特定の実施形態では、用量の各々は、多重特異性結合タンパク質を、５．２×１０－５ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－４ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－４ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－３ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－３ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－２ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－２ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－１ｍｇ／ｋｇ、０．５２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、５．２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量で含む。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、静脈内注入によって投与される。
ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、単剤療法として使用される。
ある特定の実施形態では、方法は、対象に抗ＰＤ－１抗体を投与するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブである。ある特定の実施形態では、２００ｍｇのペムブロリズマブが、最初の処置サイクルの１日目に投与される。ある特定の実施形態では、対象が１または複数の後続の処置サイクルを受ける場合、２００ｍｇのペムブロリズマブが、後続の処置サイクルにおいて３週間に１回投与される。
ある特定の実施形態では、がんは、免疫組織化学的検査によって判定して、ＨＥＲ２陽性である。ある特定の実施形態では、がんにおけるＨＥＲ２レベルは、免疫組織化学的検査によって判定して、少なくとも１＋とスコア付けされる。ある特定の実施形態では、がんにおけるＨＥＲ２レベルは、２＋または３＋とスコア付けされる。ある特定の実施形態では、がんにおけるＨＥＲ２レベルは、３＋とスコア付けされる。
ある特定の実施形態では、がんは、ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅を有する。ある特定の実施形態では、ＥＲＢＢ２遺伝子増幅は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって判定される。ある特定の実施形態では、ＥＲＢＢ２遺伝子増幅は、ＤＮＡ配列決定によって判定される。
ある特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、がんは、局所進行または転移性固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、がんは、胃がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部がん、胆道がん、神経膠芽腫、肉腫、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、食道がん、皮膚の扁平上皮癌、前立腺がん、唾液腺癌、乳がん、膵臓がん、および胆嚢がんからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、がんは、尿路上皮膀胱がんまたは転移性乳がんである。
以下の特徴は、上述の実施形態のいずれかに組み込まれ得る。
ある特定の実施形態では、Ｆａｂは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、（ａ）重鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号１６８、９６および１８８のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含み、（ｂ）軽鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。
ある特定の実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号１６８、９６および１６９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、（ｂ）軽鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号９４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号９４のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、（ａ）重鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号１１５、１１６および１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、（ｂ）軽鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号１１９、１２０および１２１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、配列番号１９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインは、配列番号１９６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、配列番号１９５のアミノ酸配列を含み、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインは、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインは、フレキシブルリンカーを介してｓｃＦｖの重鎖可変ドメインに連結している。ある特定の実施形態では、フレキシブルリンカーは、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、フレキシブルリンカーは、配列番号１４３のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。
ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。ある特定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される。
ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、Ｆａｂに連結した第１の抗体Ｆｃ配列と、ｓｃＦｖに連結した第２の抗体Ｆｃ配列とを含む。ある特定の実施形態では、第１の抗体Ｆｃ配列は、Ｆａｂの重鎖部分に連結している。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して第２の抗体Ｆｃ配列に連結している。
ある特定の実施形態では、第１および第２の抗体Ｆｃ配列は、各々、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む。ある特定の実施形態では、第１および第２の抗体Ｆｃ配列は、各々、野生型ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１および第２の抗体Ｆｃ配列は、ヘテロ二量体化を促進する異なる変異を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗体Ｆｃ配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列である。ある特定の実施形態では、第２の抗体Ｆｃ配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列である。
ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、（ａ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および（ｃ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む。
本開示の他の実施形態および詳細は、本明細書において下記に提示される。
図１は、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖと、ＮＫＧ２Ｄ標的化Ｆａｂと、ＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定Ｆｃドメインとを含有する三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）（「Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ」フォーマット）を示す。例示的な実施形態では、Ｆｃヘテロ二量体（図１でＦｃドメインの三角形の鍵と鍵穴のフォーマットとして示される）を形成するために、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、変異Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含み、ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、適合変異Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔを含む。別の例示的な実施形態では、ヘテロ二量体を形成するために、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの変異を含み、ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、適合変異Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含む。
図２Ａは、５０℃での３週間インキュベーション後に動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定したときの平均サイズの交互作用プロットである。図２Ｂは、２～８℃での３週間インキュベーション後にＤＬＳによって測定したときの平均サイズの交互作用プロットである。
図３Ａは、５０℃での３週間インキュベーション後にＤＬＳによって測定したときの単量体サイズの交互作用プロットである。図３Ｂは、２～８℃での３週間インキュベーション後にＤＬＳによって測定したときの単量体サイズの交互作用プロットである。
図４Ａは、５０℃での３週間インキュベーションについてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって判定した主要種％の交互作用プロットである。図４Ｂは、２～８℃での３週間インキュベーションについてＳＥＣによって判定した主要種％の交互作用プロットである。
図５Ａは、５０℃での３週間インキュベーションについてＳＥＣによって判定した高分子量種のパーセント（ＨＭＷ％）の交互作用プロットである。図５Ｂは、２～８℃での３週間インキュベーションについてＳＥＣによって判定したＨＭＷ種％の交互作用プロットである。
図６Ａは、５０℃での３週間インキュベーションについてＳＥＣによって判定した低分子量種のパーセント（ＬＭＷ％）の交互作用プロットである。図６Ｂは、２～８℃でｐＨ６．０での３週間インキュベーションについてＳＥＣによって判定したＬＭＷ種％の交互作用プロットである。
図７Ａは、５０℃での３週間インキュベーションについてイメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）によって判定した酸性種％の交互作用プロットである。図７Ｂは、４～８℃での３週間インキュベーションについてｉｃＩＥＦによって判定したときのスクロースのみの場合の塩基性種％の交互作用プロットである。
図８Ａは、５０℃での３週間インキュベーションについてｉｃＩＥＦによって判定した主要種％の交互作用プロットである。図８Ｂ－８Ｄは、４℃でｐＨ５．５（図８Ｂ）、ｐＨ６．０（図８Ｃ）およびｐＨ６．５（図８Ｄ）での３週間インキュベーションについてｉｃＩＥＦによって判定したスクロースのみの製剤中の主要種％の交互作用プロットである。 図８Ａは、５０℃での３週間インキュベーションについてｉｃＩＥＦによって判定した主要種％の交互作用プロットである。図８Ｂ－８Ｄは、４℃でｐＨ５．５（図８Ｂ）、ｐＨ６．０（図８Ｃ）およびｐＨ６．５（図８Ｄ）での３週間インキュベーションについてｉｃＩＥＦによって判定したスクロースのみの製剤中の主要種％の交互作用プロットである。
図９Ａは、５０℃での３週間インキュベーションについてｉｃＩＥＦによって判定した塩基性種％の交互作用プロットである。図９Ｂは、２～８℃での３週間インキュベーションについてｉｃＩＥＦによって判定したときのスクロースのみの場合の塩基性種％の交互作用プロットである。
図１０Ａは、５０℃での３週間インキュベーションについてキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって判定した純度％の交互作用プロットである。図１０Ｂは、５０℃での３週間インキュベーションについてＣＥによって判定した不純物％の交互作用プロットである。
図１１Ａは、５０℃でｐＨ６．０での３週間インキュベーションについてキャピラリー電気泳動（非還元）（ＣＥ（ＮＲ））によって判定した主要種％の交互作用プロットである。図１１Ｂは、２～８℃でｐＨ６．０での３週間インキュベーションについてＣＥ（ＮＲ）によって判定した主要種％の交互作用プロットである。
図１２Ａは、５０℃での３週間インキュベーションについてＣＥ（ＮＲ）によって判定したＨＭＷ種％の交互作用プロットである。図１２Ｂは、２～８℃での３週間インキュベーションについてＣＥ（ＮＲ）によって判定したＨＭＷ種％の交互作用プロットを示す。
図１３Ａは、５０℃での３週間インキュベーションについてＣＥ（ＮＲ）によって判定したときのスクロースのみの場合のＬＭＷ種％の交互作用プロットである。図１３Ｂは、２～８℃での３週間インキュベーションについてＣＥ（ＮＲ）によって判定したときのスクロースのみの場合のＬＭＷ種％の交互作用プロットである。
図１４Ａ～１４Ｂは、臨床試験デザインの概要図である。図１４Ａは、用量漸増相についての試験デザインを記載する。図１４Ｂは、有効性拡大コホート相についての試験デザインを記載する。図中で使用されている略号は、次のものを含む：ＤＬ＝用量レベル；Ｃｏｍｂｏ ＰＤ－１＝ペムブロリズマブとの併用療法；ＰＫ＝薬物動態；ＰＤ＝薬力学；Ｈｅｒ２ ＨＩＧＨ＝免疫組織化学的検査による、３＋のＨＥＲ２の高度発現；ＭＢＣ ＨＥＲ２ ２＋／１＋＝免疫組織化学的検査による、２＋／１＋のＨＥＲ２の中等度／低度発現を伴う転移性乳がん；ＵＢＣ ２Ｌ／３Ｌ＝尿路上皮膀胱がんのセカンドライン／サードライン処置。 図１４Ａ～１４Ｂは、臨床試験デザインの概要図である。図１４Ａは、用量漸増相についての試験デザインを記載する。図１４Ｂは、有効性拡大コホート相についての試験デザインを記載する。図中で使用されている略号は、次のものを含む：ＤＬ＝用量レベル；Ｃｏｍｂｏ ＰＤ－１＝ペムブロリズマブとの併用療法；ＰＫ＝薬物動態；ＰＤ＝薬力学；Ｈｅｒ２ ＨＩＧＨ＝免疫組織化学的検査による、３＋のＨＥＲ２の高度発現；ＭＢＣ ＨＥＲ２ ２＋／１＋＝免疫組織化学的検査による、２＋／１＋のＨＥＲ２の中等度／低度発現を伴う転移性乳がん；ＵＢＣ ２Ｌ／３Ｌ＝尿路上皮膀胱がんのセカンドライン／サードライン処置。
詳細な説明
定義
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語および句を以下で定義する。
本明細書で使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は「１つまたは複数」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数形を含む。
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ」および「ｓｃＦｖ」という用語は、各々が抗原結合部位を含む２つの異なる形態のタンパク質断片を指す。本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に参加する免疫グロブリン分子の部分を指す。ヒト抗体では、抗原結合部位は、それぞれ、「ＶＨ」および「ＶＬ」とも呼ばれる、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様な範囲は「超可変領域」と呼ばれ、これらは「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接範囲の間に挿入されている。よって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間におよびこれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、抗原結合表面を形成するように三次元空間で互いに対して配置されている。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定の動物では、抗原結合部位が単一抗体鎖によって形成されて、「単一ドメイン抗体」をもたらす。抗原結合部位は、インタクト抗体に、Ｆａｂなどの、抗原結合性表面を保持する抗体の抗原結合性断片に、または単一のポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに接続するペプチドリンカーを使用するｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドに存在し得る。本明細書で開示する重鎖または軽鎖可変領域の全てのアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って番号付けている。
抗原結合部位のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２， ６６０９－６６１６ （１９７７）およびＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ． （１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７ （１９８７）、およびＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２：７３２－７４５ （１９９６）に記載される方法によって決定することができる。これらの定義の下で決定されるＣＤＲは、典型的には互いに対して比較すると、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。ある特定の実施形態では、「ＣＤＲ」という用語は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２：７３２－７４５ （１９９６）およびＭａｒｔｉｎ Ａ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ， ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ， ｅｄｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ ３１， ｐｐ． ４２２－４３９， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ （２００１）によって定義されるＣＤＲである。ある特定の実施形態では、「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２， ６６０９－６６１６ （１９７７）およびＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ． （１９９１）によって定義されるＣＤＲである。ある特定の実施形態では、抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲは、種々の規則（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）を使用して定義される。例えば、ある特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲはＭａｃＣａｌｌｕｍ（上記）に従って定義され、軽鎖ＣＤＲはＫａｂａｔ（上記）に従って定義される。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は重鎖ＣＤＲを表し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は軽鎖ＣＤＲを表す。
本明細書で使用される場合、「医薬製剤」という用語は、活性剤と、組成物をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断的または治療的使用に特に適したものにする、不活性または活性の担体との組合せを指す。
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載される方法および組成物によって処置される生物を指す。このような生物には、好ましくは、それだけに限らないが、哺乳動物（例えば、マウス、類人猿、ウマ、ウシ、ブタ、霊長類、イヌ、ネコなど）が含まれ、より好ましくは、ヒトが含まれる。
本開示で使用される場合の「処置する」、「処置すること」または「処置」という用語、および他の文法的等価表現は、疾患、状態もしくは症状を軽減する、和らげる、軽快させる、もしくは防ぐこと、さらなる症状を防ぐこと、症状の根底にある代謝原因を軽快させる、もしくは防ぐこと、疾患もしくは状態を阻害すること、例えば、疾患もしくは状態の発症を阻止すること、疾患もしくは状態を緩和すること、疾患もしくは状態の退行を生じさせること、疾患もしくは状態によって引き起こされる状態を緩和すること、または疾患もしくは状態の症状を停止させることを含み、発病予防を含むように意図されている。これらの用語は、治療利益および／または予防利益を得ることをさらに含む。治療利益とは、処置されている基礎障害の根絶または軽快を意味する。また、治療利益は、患者が依然として基礎障害に罹患している可能性があったとしても患者に改善が認められるような、基礎障害に関連する生理的症状の１つまたは複数についての根絶または軽快によって得られる。
「約」という用語は、製剤の調製中および疾患または障害の処置中に薬剤の有効性を変化させない、薬剤の濃度または量のあらゆる最小変更を指す。ある特定の実施形態では、「約」という用語は、指定数値またはデータ点の±５％、±１０％、または±１５％を含み得る。
範囲は、本開示では、「約」特定の１つの値から、および／または「約」別の特定の値まで、と表され得る。そのような範囲が表されている場合、別の態様は、特定の１つの値から、および／または他の特定の値まで、を含む。同様に、値が、先行する「約」の使用によって近似値として表されている場合、その特定の値が別の態様を形成することは理解されよう。範囲の各々についての終点が、他の終点との関係において重要でもあり、他の終点とは無関係に重要でもあることは、さらに理解されよう。本開示で開示されるいくつかの値があること、および各値がその値自体に加えて「約」その特定の値としても開示されることも、理解されよう。本願を通して、データがいくつかの異なるフォーマットで提供されること、ならびにこのデータがデータ点の任意の組合せについての終点および始点および範囲を表すことも、理解されよう。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点「１５」が開示される場合、１０および１５より大きい、１０および１５より大きいもしくはそれらに等しい、１０および１５未満、１０および１５未満もしくはそれらに等しい、ならびに１０および１５に等しいデータ点が、開示され、１０～１５の間のデータ点も開示されると考えられることは、理解されよう。２つの特定の単位の間の各単位も開示されることも理解されよう。例えば、１０および１５が開示される場合には、１１、１２、１３および１４も開示される。
本明細書を通して、組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、さらに、列挙される成分から本質的になるまたはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびに列挙される処理ステップから本質的になるまたはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが企図される。
一般に、パーセンテージを指定する組成物は、特に指定しない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の前の定義が支配する。
多重特異性結合タンパク質
本開示は、多重特異性結合タンパク質の安定性について最適化された製剤中の成分である、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖとＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂと抗体Ｆｃドメインとを有する多重特異性結合タンパク質を含む医薬製剤を提供する。局所進行または転移性固形腫瘍などのがんの処置において多重特異性結合タンパク質および医薬製剤を使用するための投薬量レジメンも提供される。多重特異性結合タンパク質は、がん細胞上のＨＥＲ２ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６に結合することができる。そのような結合は、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近づけ、このことは、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的破壊を促進する。
多重特異性結合タンパク質の第１の成分は、それだけに限らないが、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδ Ｔ細胞およびＣＤ８＋αβ Ｔ細胞を含み得るＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する。ＮＫＧ２Ｄに結合すると、多重特異性結合タンパク質は、天然リガンド、例えばＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫ細胞を活性化するのを遮断し得る。多重特異性結合タンパク質の第２の成分は、それだけに限らないが、乳がん、卵巣がん、食道がん、膀胱がんおよび胃がん、唾液腺導管癌、肺の腺癌、ならびに攻撃的形態の子宮がん、例えば、子宮漿液性子宮内膜癌を含み得るＨＥＲ２発現細胞に結合する。多重特異性結合タンパク質の第３の成分は、ＣＤ１６を発現する細胞、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞および濾胞樹状細胞に結合する、抗体Ｆｃドメインである。
本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、さまざまなフォーマットをとることができる。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体多重特異性抗体を含む（図１）。第１の免疫グロブリン重鎖は、重鎖可変ドメインとＣＨ１ドメインとを含むＦａｂの重鎖部分に、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して融合された、第１の抗体Ｆｃ配列（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）を含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とを含むＦａｂの軽鎖部分を含み、Ｆａｂ断片の重鎖部分および軽鎖部分は、対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する。第２の免疫グロブリン重鎖は、対形成してＨＥＲ２に結合する重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとで構成されている一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して融合された、第２の抗体Ｆｃ配列（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）を含む。
多重特異性結合タンパク質の個々の成分を、以下により詳細に説明する。
ＮＫＧ２Ｄ結合部位
ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびにがん細胞上の腫瘍関連抗原への結合に際して、多重特異性結合タンパク質は、１種類より多くのＮＫ活性化受容体と結合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいてＮＫ細胞に対してアゴニストとして作用することができる。一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいて、ならびに他の種、例えば、げっ歯類およびカニクイザルにおいて、ＮＫ細胞に対してアゴニストとして作用することができる。
表１は、組み合わせて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙する。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、Ｆａｂフォーマットで配置される。これらのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄへのそれらの結合親和性の点で異なり得るが、それにもかかわらず、それらは全て、ヒトＮＫ細胞を活性化する。別段の指示がない限り、表１に提供されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔに基づいて決定される。
Figure 2022546454000002
Figure 2022546454000003
Figure 2022546454000004
Figure 2022546454000005
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一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号９４に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号９４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９４のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号９７または１６９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号１４４に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号１４４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１４４のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１７２または１７３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号１７４に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号１７４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１７４のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１７５または１７６）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号１７７に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号１７７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１７７のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１７８または１７９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号１８０に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号１８０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１８０のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１８１または１８２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号１８３に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号１８３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１８３のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１８４または１８５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号１８６に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号１８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１８６のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１８７または１８８）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号８６に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号９０に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号８７または１６６）、ＣＤＲ２（配列番号８８）およびＣＤＲ３（配列番号８９または１６７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号９０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９０のＣＤＲ１（配列番号９１）、ＣＤＲ２（配列番号９２）およびＣＤＲ３（配列番号９３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号１０２に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号１０６に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号１０２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１０２のＣＤＲ１（配列番号７１または１６２）、ＣＤＲ２（配列番号７２）およびＣＤＲ３（配列番号１０５または１７０）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号１０６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１０６のＣＤＲ１（配列番号１０７）、ＣＤＲ２（配列番号１０８）およびＣＤＲ３（配列番号１０９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号７０に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号７４に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７０のＣＤＲ１（配列番号７１または１６２）、ＣＤＲ２（配列番号７２）およびＣＤＲ３（配列番号７３または１６３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号７４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７４のＣＤＲ１（配列番号７５）、ＣＤＲ２（配列番号７６）およびＣＤＲ３（配列番号７７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号７０に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号７４に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７０のＣＤＲ１（配列番号７１または１６２）、ＣＤＲ２（配列番号７２）およびＣＤＲ３（配列番号７３または１６３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号７４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７４のＣＤＲ１（配列番号７５）、ＣＤＲ２（配列番号７６）およびＣＤＲ３（配列番号７７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号７８に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号８２に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、Ｆａｂの重鎖可変ドメインは、配列番号７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７８のＣＤＲ１（配列番号７９または１６４）、ＣＤＲ２（配列番号８０）およびＣＤＲ３（配列番号８１または１６５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、Ｆａｂの軽鎖可変ドメインは、配列番号８２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８２のＣＤＲ１（配列番号７５）、ＣＤＲ２（配列番号７６）およびＣＤＲ３（配列番号７７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
多重特異性結合タンパク質は、それだけに限らないが、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋αβＴ細胞を含むＮＫＧ２Ｄ発現細胞に結合することができる。ＮＫＧ２Ｄに結合すると、多重特異性結合タンパク質は、天然リガンド、例えばＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫ細胞を活性化するのを遮断し得る。
ある特定の実施形態では、Ｆａｂまたは多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに２ｎＭ～１２０ｎＭ、例えば、２ｎＭ～１１０ｎＭ、２ｎＭ～１００ｎＭ、２ｎＭ～９０ｎＭ、２ｎＭ～８０ｎＭ、２ｎＭ～７０ｎＭ、２ｎＭ～６０ｎＭ、２ｎＭ～５０ｎＭ、２ｎＭ～４０ｎＭ、２ｎＭ～３０ｎＭ、２ｎＭ～２０ｎＭ、２ｎＭ～１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１３ｎＭ、約１２ｎＭ、約１１ｎＭ、約１０ｎＭ、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～３ｎＭ、約３ｎＭ～４ｎＭ、約４ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約６ｎＭ、約６ｎＭ～約７ｎＭ、約７ｎＭ～約８ｎＭ、約８ｎＭ～約９ｎＭ、約９ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約２ｎＭ～約１０ｎＭ、約３ｎＭ～約１０ｎＭ、約４ｎＭ～約１０ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約６ｎＭ～約１０ｎＭ、約７ｎＭ～約１０ｎＭ、または約８ｎＭ～約１０ｎＭのＫＤの親和性で結合する。
ある特定の実施形態では、Ｆａｂは、表面プラズモン共鳴によって測定して、２ｎＭ～１２０ｎＭのＫＤでＮＫＧ２Ｄに結合する。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定して、２ｎＭ～１２０ｎＭのＫＤでＮＫＧ２Ｄに結合する。ある特定の実施形態では、Ｆａｂは、表面プラズモン共鳴によって測定して、１０ｎＭ～６２ｎＭのＫＤでＮＫＧ２Ｄに結合する。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定して、１０ｎＭ～６２ｎＭのＫＤでＮＫＧ２Ｄに結合する。
一部の実施形態では、上記のＦａｂは、抗体Ｆｃ配列に連結している。一部の実施形態では、Ｆａｂの重鎖部分は、抗体Ｆｃ配列のＮ末端に連結している。
ＨＥＲ２結合部位
本明細書で開示する多重特異性結合タンパク質のＨＥＲ２結合部位は、互いに融合されてｓｃＦｖを形成する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。表２は、組み合わせて、ＨＥＲ２に結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙する。
Figure 2022546454000015
Figure 2022546454000016
Figure 2022546454000017
Figure 2022546454000018
あるいは、ＨＥＲ２に結合することができる新規抗原結合部位は、配列番号１３８によって定義されるアミノ酸配列またはその成熟細胞外断片への結合についてのスクリーニングによって同定することができる。
Figure 2022546454000019
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１９５に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号１９６に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、配列番号１９５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９５のＣＤＲ１（配列番号１１５）、ＣＤＲ２（配列番号１１６）およびＣＤＲ３（配列番号１１７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインは、配列番号１９６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９６のＣＤＲ１（配列番号１１９）、ＣＤＲ２（配列番号１２０）およびＣＤＲ３（配列番号１２１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１９７に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号１９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、配列番号１９７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９７のＣＤＲ１（配列番号１２３）、ＣＤＲ２（配列番号１２４）およびＣＤＲ３（配列番号１２５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインは、配列番号１９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９８のＣＤＲ１（配列番号１２７）、ＣＤＲ２（配列番号１２８）およびＣＤＲ３（配列番号１２９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１９９に関連する重鎖可変ドメイン、および配列番号２００に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、配列番号１９９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９９のＣＤＲ１（配列番号１３１）、ＣＤＲ２（配列番号１３２）およびＣＤＲ３（配列番号１３３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインは、配列番号２００と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２００のＣＤＲ１（配列番号１３５）、ＣＤＲ２（配列番号１３６）およびＣＤＲ３（配列番号１３７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１７１のアミノ酸配列を含む。
上記のｓｃＦｖは重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成して、ｓｃＦｖの安定性を増強する。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と軽鎖可変ドメインのＣ１００残基との間に形成され得、アミノ酸位置はＫａｂａｔで番号付けされる。
ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬは、さまざまな向きで位置することができる。ある特定の実施形態では、ＶＬは、ＶＨのＮ末端に位置する。ある特定の実施形態では、ＶＬは、ＶＨのＣ末端に位置する。
ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬは、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して接続することができる。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、フレキシブルリンカーである。リンカーのアミノ酸組成について、ペプチドは、柔軟性を与え、本発明のタンパク質の他のドメインの構造および機能に干渉せず、かつプロテアーゼによる切断に抵抗する特性を有するように選択される。例えば、グリシンおよびセリン残基は、一般的に、プロテアーゼ抵抗性を与える。ある特定の実施形態では、ＶＬは、ＶＨのＮ末端に位置し、リンカーを介してＶＨに接続している。
リンカーの長さ（例えば、フレキシブルリンカー）は、「短く」てもよく、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２個のアミノ酸残基であってもよく、または「長く」てもよく、例えば、少なくとも１３個のアミノ酸残基であってもよい。ある特定の実施形態では、リンカーは、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～５０、２０～４０、２０～３０または２０～２５個のアミノ酸残基の長さである。
ある特定の実施形態では、リンカーは、（ＧＳ）ｎ（配列番号２０４）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号２０５）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１５１）、（ＧＧＳＧ）ｎ（配列番号１５３）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（配列番号１５６）および（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１５７）配列を含むか、またはこれからなり、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。ある特定の実施形態では、リンカーは、表３で列挙される、配列番号１４３、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１５０、配列番号１５２および配列番号１５４から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号１４３の配列からなる（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０３）リンカーである。
Figure 2022546454000020
Figure 2022546454000021
特定の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、フレキシブルリンカー、例えば（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）を介して重鎖可変ドメインのＮ末端に連結している。
一部の実施形態では、上記のｓｃＦｖは、ヒンジ配列を介して抗体Ｆｃ配列に連結している。一部の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－Ｓｅｒを含む。一部の他の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－ＳｅｒおよびＴｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙを含む。ヒンジ配列は、標的抗原への結合の柔軟性を提供し、柔軟性と最適な形状寸法との間のバランスをとることができる。
Ｆｃドメイン
多重特異性結合タンパク質の抗体Ｆｃドメインは、Ｆａｂに連結した第１の抗体Ｆｃ配列と、ｓｃＦｖに連結した第２の抗体Ｆｃ配列とを含む。２つの抗体Ｆｃ配列は、対形成し、二量体を形成し、この二量体がＣＤ１６に結合する。
抗体Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６結合が、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用が、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５－Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７－Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７－Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４－Ｓｅｒ２３９、およびＣＨ２ドメイン中の炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに主に集中している（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０６ （６７９３）：２６７－２７３参照）。公知のドメインに基づいて、例えば、ファージディスプレイライブラリーもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーを使用することにより、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強もしくは減少させるように変異を選択することができる、または相互作用の公知の三次元構造に基づいて変異を設計することができる。
ヘテロ二量体抗体重鎖の組立は、同じ細胞中で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることにより達成することができるが、これは各抗体重鎖のホモ二量体の組立ならびにヘテロ二量体の組立をもたらし得る。ヘテロ二量体の優先的な組立の促進は、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０およびＵＳ１４／８３０３３６に示されるように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン中に異なる変異を組み込むことにより達成することができる。例えば、ヒトＩｇＧ１に基づくＣＨ３ドメインにおいて、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にするアミノ酸置換の異なるペアをこれらの２つの鎖内に組み込むことにより、変異を導入することができる。以下に例示されるアミノ酸置換の位置は全てＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされている。
１つのシナリオでは、第１のポリペプチド中のアミノ酸置換が元のアミノ酸をアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるより大きなアミノ酸で置き換え、第２のポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸置換が元のアミノ酸（複数可）をアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）またはバリン（Ｖ）から選択されるより小さなアミノ酸（複数可）で置き換えて、結果としてより大きなアミノ酸置換（突出部）がより小さなアミノ酸置換（窪み）の表面にはまる。例えば、一方のポリペプチドがＴ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方がＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる。
本発明の抗体重鎖可変ドメインを、必要に応じて、ＣＨ１ドメインを含むまたは含まない、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの抗体定常領域と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列に連結することができる。一部の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域またはＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。一部の他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスまたはウマなどの別の哺乳動物の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９で、１つまたは複数の変異を定常領域に組み込むことができる。例示的な置換としては、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅが挙げられる。本明細書で開示するＦｃドメインまたはヒンジ領域の全てのアミノ酸位置は、ＥＵナンバリングに従って番号付けている。
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込むことができる変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１および／またはＶ１７３にあり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込むことができる変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４および／またはＴ１６４にあり得る。
アミノ酸置換を、表４に示される以下の置換のセットから選択することができる。
Figure 2022546454000022
あるいは、アミノ酸置換を、表５に示される以下の置換のセットから選択することができる。
Figure 2022546454000023
あるいは、アミノ酸置換を、表６に示される以下の置換のセットから選択することができる。
Figure 2022546454000024
あるいは、各ポリペプチド鎖中の少なくとも１つのアミノ酸置換を表７から選択することができる。
Figure 2022546454000025
Figure 2022546454000026
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換を、第１のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられている、表８の以下の置換のセットから選択することができる。
Figure 2022546454000027
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換を、第１のポリペプチドの例に示される位置（複数可）が任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられている、表９の以下の置換のセットから選択することができる。
Figure 2022546454000028
あるいは、アミノ酸置換を、表１０の以下のセットから選択することができる。
Figure 2022546454000029
Ｆｃ置換を選択するとき、当業者は、表４～１０における第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、それぞれ、第１の抗体Ｆｃ配列および第２の抗体Ｆｃ配列に対応し得ることを理解し得る。あるいは、当業者は、表４～１０における第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、それぞれ、第２の抗体Ｆｃ配列および第１の抗体Ｆｃ配列に対応し得ることを理解し得る。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、位置Ｔ３６６でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、位置Ｔ３６６でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
あるいは、またはさらに、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃ、および反対側のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入して、２つのポリペプチドの界面内に人工的なジスルフィド架橋を形成することにより、ヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性を増加させることができる。一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
Ｆｃ置換を選択するとき、当業者は、上記の抗体定常領域の「一方のポリペプチド鎖」および「他方のポリペプチド鎖」が、それぞれ、第１の抗体Ｆｃ配列および第２の抗体Ｆｃ配列に対応し得ることを理解し得る。あるいは、上記の抗体定常領域の「一方のポリペプチド鎖」および「他方のポリペプチド鎖」は、それぞれ、第２の抗体Ｆｃ配列および第１の抗体Ｆｃ配列に対応し得る。
例示的な多重特異性結合タンパク質
各々、抗体定常領域に連結した、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖおよびＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂを含むＴｒｉＮＫＥＴの例を以下に列挙し、抗体定常領域は、２つのＦｃ鎖のヘテロ二量体化を可能にする変異を含む。ｓｃＦｖは、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）由来の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＬの１００位およびＶＨの４４位のアミノ酸残基についてＣｙｓの置換をさらに含み、それによって、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド架橋の形成を促進する。ＶＬは、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）を介してＶＨのＮ末端に連結しており、ＶＨは、Ａｌａ－Ｓｅｒリンカーを介してＦｃのＮ末端に連結している。Ａｌａ－Ｓｅｒリンカーはエルボーヒンジ領域配列に含まれ、柔軟性と最適形状寸法との間で平衡を保つ。ある特定の実施形態では、追加の配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙは、ヒンジのＡｌａ－Ｓｅｒ配列のＮ末端またはＣ末端に付加され得る。これらの例示的なＴｒｉＮＫＥＴを説明するために本明細書で使用される場合、Ｆｃとは、抗体ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。
したがって、以下に説明するＴｒｉＮＫＥＴの各々は、以下の３つのポリペプチド鎖、
Ｎ末端～Ｃ末端：ＮＫＧ２Ｄ結合ＦａｂのＶＨ、ＣＨ１、およびＦｃを含む、鎖Ａ；
Ｎ末端～Ｃ末端：ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖのＶＬ、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖのＶＨ、Ａｌａ－Ｓｅｒリンカー、およびＦｃを含む、鎖Ｂ；ならびに
Ｎ末端～Ｃ末端：ＮＫＧ２Ｄ結合ＦａｂのＶＬ、およびＣＬを含む、鎖Ｃ
を含む。
例示的なＴｒｉＮＫＥＴのアミノ酸配列を、表１１に要約する。
ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性結合タンパク質は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖および第３のポリペプチド鎖を含み、第１、第２および第３のポリペプチド鎖は、表１１で開示されるＴｒｉＮＫＥＴの、それぞれ、鎖Ａ、鎖Ｂおよび鎖Ｃのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１、第２および第３のポリペプチド鎖は、表１１で開示されるＴｒｉＮＫＥＴの、それぞれ、鎖Ａ、鎖Ｂおよび鎖Ｃのアミノ酸配列からなる。
例示的な実施形態では、ヘテロ二量体を形成するために、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの変異を含み、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、適合変異Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含む。別の例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、ノブ（ｋｎｏｂ）変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、「ホール（ｈｏｌｅ）」変異Ｔ３６６Ｗを含む。例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃのＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。
Figure 2022546454000030
Figure 2022546454000031
特定のＴｒｉＮＫＥＴおよびそれらのポリペプチド鎖を、以下により詳細に説明する。アミノ酸配列では、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０３）およびＡｌａ－Ｓｅｒリンカーは、太字下線で示し；ジスルフィド架橋を形成するｓｃＦｖのＣｙｓ残基は、太字イタリック体下線で示し；Ｆｃヘテロ二量体化変異は、太字下線で示し；Ｋａｂａｔに基づくＣＤＲ配列は、下線で示す。
例えば、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブである。Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、ＨＥＲ２に結合するトラスツズマブ由来の一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）（配列番号１３９）と；重鎖可変ドメイン（配列番号９４）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号９８）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、Ａ４９由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインは、ＣＨ１ドメインに接続しており、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続している。Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、配列番号１４０、配列番号１４１および配列番号１４２の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
配列番号１４０は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換、ならびに以下に説明する配列番号１４１のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号１３９）は、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）を介してトラスツズマブの軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続したトラスツズマブの重鎖可変ドメインを含み、ｓｃＦｖは、ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）４－ＶＨと表される（「（Ｇ４Ｓ）４」は、配列番号２０３または配列番号１４３によって表される）。また、ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖可変ドメインは、それぞれ、ＶＬおよびＶＨのＱ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果として、ＶＬのＣ１００とＶＨのＣ４４との間のジスルフィド架橋を通して接続している。
トラスツズマブｓｃＦｖ
Figure 2022546454000032
 トラスツズマブｓｃＦｖ－Ｆｃ（ＲＶＴ）
Figure 2022546454000033
配列番号１４１は、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表し、それは、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号９４）と、Ｆｃドメインに接続したＣＨ１ドメインとを含む。配列番号１４１のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４０）のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１４１では、また、Ｆｃドメインは、配列番号１４０のＦｃとのヘテロ二量体化のためのＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。
Ａ４９ ＶＨ
Figure 2022546454000034
 Ａ４９ ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ（ＥＷ）
Figure 2022546454000035
配列番号１４２は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメイン（配列番号９８）と軽鎖定常ドメインとを含むＦａｂ断片の軽鎖部分を表す。
Ａ４９ ＶＬ
Figure 2022546454000036
 Ａ４９ ＶＬ－ＬＣ
Figure 2022546454000037
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブである。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）と；重鎖可変ドメイン（配列番号１４４）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号９８）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、Ａ４９ＭＩ由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインは、ＣＨ１ドメインに接続しており、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続している。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、配列番号１４０（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）、配列番号１４５および配列番号１４２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
配列番号１４５は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号１４４）と、Ｆｃドメインに接続したＣＨ１ドメインとを含む、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表す。配列番号１４４では、配列番号９４のＣＤＲ３のメチオニンは、イソロイシンによって置換されている（Ｍ→Ｉ置換；配列番号１４４および配列番号１４５で第３の括弧［］内に示される）。配列番号１４５のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４０）のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１４５では、また、Ｆｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。
Ａ４９ＭＩ ＶＨ
Figure 2022546454000038
 Ａ４９ＭＩ ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ（ＥＷ）
Figure 2022546454000039
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブである。ＫｉＨは、ノブイントゥホール（ＫｉＨ）Ｆｃ技術を指し、それは、ＣＨ３ドメインを操作して、各重鎖において「ノブ」または「ホール」のいずれかを作製してヘテロ二量体化を促進することを伴う。ＫｉＨ Ｆｃ技術の背景にある概念は、小さな残基の、嵩高い残基での置換（例えば、ＥＵナンバリングでＴ３６６ＷＣＨ３Ａ）によって一方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に「ノブ」を導入することであった。「ノブ」を収容するために、ノブに最も近い隣接残基をより小さい残基で置き換えること（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶＣＨ３Ｂ）によって他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）上に相補的な「ホール」面が作製された。「ホール」変異は、構造に指南されたファージライブラリースクリーニングによって最適化された（Ａｔｗｅｌｌ Ｓ， Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ， Ｗｅｌｌｓ ＪＡ， Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．， Ｓｔａｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９７） ２７０（１）：２６－３５）。ＫｉＨ ＦｃバリアントのＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ ＪＭ， Ｕｌｔｓｃｈ Ｍ， Ｌｅｅ Ｊ， Ｔｏｎｇ Ｒ， Ｔａｋｅｄａ Ｋ， Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｈａｌｆ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ＣＨ２－ＣＨ３ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２０１４） ４２６（９）：１９４７－５７；Ｍｉｍｏｔｏ Ｆ， Ｋａｄｏｎｏ Ｓ， Ｋａｔａｄａ Ｈ， Ｉｇａｗａ Ｔ， Ｋａｍｉｋａｗａ Ｔ， Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ． Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ＦｃγＲｓ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１４） ５８（１）：１３２－８）によって、ヘテロ二量体化が、ＣＨ３ドメイン間のコア界面で立体的相補性によって駆動される疎水性相互作用により熱力学的に好まれる一方で、ノブ－ノブおよびホール－ホール界面は、それぞれ立体障害および好ましい相互作用の破壊のためにホモ二量体化を好まないことが実証された。
Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含むＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）と；ＣＨ１ドメインがＴ３６６Ｗの「ノブ」置換を含むＦｃドメインに接続している、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、配列番号１４６、配列番号１４７および配列番号１４２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
配列番号１４６は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換、ならびに以下に説明する配列番号１４７のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。
トラスツズマブｓｃＦｖ－Ｆｃ（ＫｉＨ）
Figure 2022546454000040
配列番号１４７は、Ａ４９由来のＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号９４）と、Ｆｃドメインに接続したＣＨ１ドメインとを含む、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表す。配列番号１４７のＦｃドメインは、Ｓ３５４Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４６）のＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１４７では、また、Ｆｃドメインは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む。
Ａ４９ ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ（ＫｉＨ）
Figure 2022546454000041
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブである。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含むＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）と；ＣＨ１ドメインがＴ３６６Ｗの「ノブ」置換を含むＦｃドメインに接続している、Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、配列番号１４６（Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）、配列番号１９４および配列番号１４２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
配列番号１９４は、Ａ４９ＭＩ由来のＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号１４４）と、Ｆｃドメインに接続したＣＨ１ドメインとを含む、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表す。配列番号１９４のＦｃドメインは、Ｓ３５４Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４６）のＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１９４では、また、Ｆｃドメインは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む。
Ａ４９ＭＩ ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ（ＫｉＨ）
Figure 2022546454000042
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブである。Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）と；重鎖可変ドメイン（配列番号８６）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号９０）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、Ａ４４由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインは、ＣＨ１ドメインに接続しており、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続している。Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、配列番号１４０（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）、配列番号１５５および配列番号１４９の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
配列番号１５５は、Ｆｃドメインに接続した、Ａ４４由来のＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号８６）を表す。配列番号１５５のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４０）のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１５５では、また、Ｆｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。
Ａ４４ ＶＨ
Figure 2022546454000043
 Ａ４４ ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ（ＥＷ）
Figure 2022546454000044
配列番号１４９は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメイン（配列番号９０）と軽鎖定常ドメインとを含む、Ｆａｂ断片の軽鎖部分を表す。
Ａ４４ ＶＬ
Figure 2022546454000045
 Ａ４４ ＶＬ－ＣＬ
Figure 2022546454000046
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブである。Ａ４４－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含むＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）と；ＣＨ１ドメインがＴ３６６Ｗの「ノブ」置換を含むＦｃドメインに接続している、Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。Ａ４４－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、配列番号１４６（Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）、配列番号１４８および配列番号１４９（Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
配列番号１４８は、Ｆｃドメインに接続した、Ａ４４由来のＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号８６）を表す。配列番号１４８のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４６）のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１４８では、また、Ｆｃドメインは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む。
Ａ４４ ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ（ＫｉＨ）
Figure 2022546454000047
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブである。Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、ＨＥＲ２に結合するペルツズマブ由来のｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、配列番号１９０、配列番号１４１（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
配列番号１９０は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換、ならびに上記の配列番号１４１のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号１８９）は、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）を介してペルツズマブの軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続したペルツズマブの重鎖可変ドメインを含み、ｓｃＦｖは、ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）４－ＶＨと表される（「（Ｇ４Ｓ）４」は、配列番号２０３または配列番号１４３によって表される）。また、ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖可変ドメインは、それぞれ、ＶＬおよびＶＨのＱ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果として、ＶＬのＣ１００とＶＨのＣ４４との間のジスルフィド架橋を通して接続している。
ペルツズマブｓｃＦｖ
Figure 2022546454000048
 ペルツズマブｓｃＦｖ－Ｆｃ
Figure 2022546454000049
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブである。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、配列番号１９０（Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブと同様）、配列番号１４５（Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブである。Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、配列番号１９１、配列番号１４７（Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
配列番号１９１は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換、ならびに上記の配列番号１９１のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。
ペルツズマブｓｃＦｖ－Ｆｃ（ＫｉＨ）
Figure 2022546454000050
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブである。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、配列番号１９１（Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブと同様）、配列番号１９４（Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブである。Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、配列番号１９０（Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブと同様）、配列番号１５５（Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４９（Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブである。Ａ４４－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４４－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブは、配列番号１９１（Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ペルツズマブと同様）、配列番号１４８（Ａ４４－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４９（Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２である。Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、ＨＥＲ２に結合するＭＧＡＨ２２由来のｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９２、配列番号１４１（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
配列番号１９２は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換、ならびに上記の配列番号１４１のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号１７１）は、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）を介してペルツズマブの軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続したペルツズマブの重鎖可変ドメインを含み、ｓｃＦｖは、ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）４－ＶＨと表される（「（Ｇ４Ｓ）４」は、配列番号２０３または配列番号１４３によって表される）。また、ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖可変ドメインは、それぞれ、ＶＬおよびＶＨのＧ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果として、ＶＬのＣ１００とＶＨのＣ４４との間のジスルフィド架橋を通して接続している。
ＭＧＡＨ２２ ｓｃＦｖ
Figure 2022546454000051
 ＭＧＡＨ２２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ
Figure 2022546454000052
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２である。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２と同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２と同様）、配列番号１４５（Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２である。Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２と同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９３、配列番号１４７（Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
配列番号１９３は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換、ならびに上記の配列番号１４７のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。
ＭＧＡＨ２２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ＫｉＨ）
Figure 2022546454000053
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２である。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２と同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９３（Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２と同様）、配列番号１９４（Ａ４９ＭＩ－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２である。Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２と同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９２（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２と同様）、配列番号１５５（Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４９（Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２である。Ａ４４－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２と同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４４－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９３（Ａ４９－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＧＡＨ２２と同様）、配列番号１４８（Ａ４４－Ｆ３’－ＫｉＨ－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）および配列番号１４９（Ａ４４－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ヘテロ二量体を形成するために、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインが、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの置換を含み、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインが、適合置換Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含むことを除いては、ＥＷ－ＲＶＴ Ｆｃ変異を含む上記の例示的なＴｒｉＮＫＥＴのうちの１つと同一である。ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ヘテロ二量体を形成するために、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインが、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含むことを除いては、ＫｉＨ Ｆｃ変異を含む上記の例示的なＴｒｉＮＫＥＴのうちの１つと同一である。
ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ジスルフィド結合を形成するために、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインが、ＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｃ置換を含み、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインが、ＣＨ３ドメインの適合Ｙ３４９Ｃ置換を含むことを除いては、上記の例示的なＴｒｉＮＫＥＴのうちの１つと同一である。
国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４５５６１号に記載されているように、本明細書で開示される多重特異性結合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび動物モデルにおいて腫瘍成長を低減させることおよびがん細胞を死滅させることに有効である。例えば、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブは、低レベルのＨＥＲ２を発現する７８６－Ｏ細胞（ＨＥＲ２＋）、中程度レベルのＨＥＲ２を発現するＨ６６１細胞（ＨＥＲ２＋＋）、および高レベルのＨＥＲ２を発現するＳｋＢｒ３細胞（ＨＥＲ２＋＋＋）などの、さまざまなヒトがん細胞系に対するＮＫ細胞媒介細胞傷害を誘導することにおいて、トラツズマブよりも優れている。さらに、多重特異性結合タンパク質は、健康な非がん性ヒト細胞（例えば、ヒト心筋細胞）のＮＫ媒介殺滅を有意に誘導しない。
多重特異性結合タンパク質の産生
上記の多重特異性結合タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができる。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベクターにクローニングすることができ；第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ；免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ；第１、第２および第３の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定的にトランスフェクトして、多量体タンパク質を生成することができる。
当業者は、タンパク質の産生および／または保存中、Ｎ末端グルタミン酸（Ｅ）またはグルタミン（Ｑ）を環化させて、ラクタムを形成してもよいこと（例えば、自発的に、または産生および／もしくは保存中に存在する酵素によって触媒して）を理解し得る。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端残基がＥまたはＱである一部の実施形態では、ピログルタメートで置き換えられたＥまたはＱを有する対応するアミノ酸配列もまた、本明細書で企図される。
また、当業者は、タンパク質産生および／または保存中、タンパク質のＣ末端リシン（Ｋ）を除去してもよいこと（例えば、自発的に、または産生および／もしくは保存中に存在する酵素によって触媒して）を理解し得る。そのようなＫの除去は、多くの場合、Ｃ末端にＦｃドメインを含むタンパク質で観察される。
したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、Ｆｃドメイン配列）のＣ末端残基がＫである一部の実施形態では、Ｋが除去された対応するアミノ酸配列もまた、本明細書で企図される。
多重特異性タンパク質の最高収量を達成するために、異なる比の第１、第２および第３の発現ベクターを調査して、宿主細胞へのトランスフェクションのための最適な比を決定することができる。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当技術分野で公知の方法を使用して、単一クローンを細
胞バンク生成のために単離することができる。
クローンを、バイオリアクタースケールアップおよび多重特異性結合タンパク質の維持された発現に適した条件下で培養することができる。遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結－解凍、アフィニティ精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーを含む当技術分野で公知の方法を使用して、多重特異性結合タンパク質を単離および精製することができる。
医薬製剤
本開示は、治療有効量の本明細書で開示される多重特異性結合タンパク質（例えば、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブ）を含有する医薬製剤も提供する。医薬製剤は、１つまたは複数の賦形剤を含み、ある特定のｐＨで維持される。本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、所望の物理的または化学的特性、例えば、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、透明性、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着性、または透過性を提供するために製剤に添加される任意の非治療剤を意味する。
賦形剤およびｐＨ
本発明の医薬製剤中の１つまたは複数の賦形剤は、緩衝剤を含む。本明細書で使用される場合、「緩衝剤」という用語は、水溶液に添加されたとき、その溶液を、酸もしくはアルカリの添加時にまたは溶媒での希釈の際にｐＨが変動しないように保護することができる１つまたは複数の成分を指す。リン酸バッファーに加えて、グリシン酸バッファー、炭酸バッファー、クエン酸バッファー、ヒスチジンバッファーなどを使用することができ、その場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして役立ち得る。
ある特定の実施形態では、バッファーまたは緩衝液系は、ｐＨ５．５～７．４の範囲と完全にまたは部分的に重複する緩衝範囲を有する少なくとも１つのバッファーを含む。ある特定の実施形態では、バッファーは、約６．０±０．５のｐＫａを有する。ある特定の実施形態では、バッファーは、ヒスチジンバッファーを含む。ある特定の実施形態では、ヒスチジンは、５～１００ｍＭ、１０～１００ｍＭ、１５～１００ｍＭ、２０～１００ｍＭ、５～５０ｍＭ、１０～５０ｍＭ、１５～１００ｍＭ、２０～１００ｍＭ、５～２５ｍＭ、１０～２５ｍＭ、１５～２５ｍＭ、２０～２５ｍＭ、５～２０ｍＭ、１０～２０ｍＭ、または１５～２０ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、ヒスチジンは、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、または５０ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、ヒスチジンは、２０ｍＭの濃度で存在する。
本発明の医薬製剤は、５．５～６．５のｐＨを有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、医薬製剤は、５．５～６．５（すなわち、６．０±０．５）、５．６～６．４（すなわち、６．０±０．４）、５．７～６．３（すなわち、６．０±０．３）、５．８～６．２（すなわち、６．０±０．２）、５．９～６．１（すなわち、６．０±０．１）、または５．９５～６．０５（すなわち、６．０±０．０５）のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、６．０のｐＨを有する。科学的丸めの法則に従って、５．９５より大きいまたはそれに等しい、かつ６．０５より小さいまたはそれに等しいｐＨは、６．０として丸められる。
ある特定の実施形態では、医薬製剤の緩衝液系は、６．０±０．２のｐＨで１０～２５ｍＭのヒスチジンを含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤の緩衝液系は、６．０±０．２のｐＨで２０ｍＭのヒスチジンを含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤の緩衝液系は、６．０±０．０５のｐＨで１０～２５ｍＭのヒスチジンを含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤の緩衝液系は、６．０±０．０５のｐＨで２０ｍＭのヒスチジンを含む。
本発明の医薬製剤中の１つまたは複数の賦形剤は、糖または糖アルコールをさらに含む。糖および糖アルコールは、医薬製剤において熱安定剤として有用である。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、糖、例えば、単糖（グルコース、キシロース、またはエリトリトール）、二糖（例えば、スクロース、トレハロース、マルトース、またはガラクトース）、またはオリゴ糖（例えば、スタキオース）を含む。特定の実施形態では、医薬製剤は、スクロースを含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、糖アルコール、例えば、単糖に由来する糖アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール、またはキシリトール）、二糖に由来する糖アルコール（例えば、ラクチトールまたはマルチトール）、またはオリゴ糖に由来する糖アルコールを含む。特定の実施形態では、医薬製剤は、ソルビトールを含む。
製剤中に含有される糖または糖アルコールの量は、製剤が使用される特定の状況および所期の目的によって変わり得る。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、５０～３００ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、１００～３００ｍＭ、１００～２５０ｍＭ、１５０～３００ｍＭ、１５０～２５０ｍＭ、２００～３００ｍＭ、２００～２５０ｍＭ、または２５０～３００ｍＭの糖または糖アルコールを含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、または３００ｍＭの糖または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、医薬製剤は、２５０ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロースまたはソルビトール）を含む。
本明細書で開示される医薬製剤中の１つまたは複数の賦形剤は、界面活性剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、「界面活性剤」という用語は、疎水性部分（例えば、アルキル鎖）と親水性部分（例えば、カルボキシル基およびカルボン酸基）の両方を含有する界面活性分子を指す。界面活性剤は、医薬製剤において治療用タンパク質の凝集を低減させるのに有用である。医薬製剤における使用に適した界面活性剤は、一般に、非イオン性界面活性剤であり、それだけに限らないが、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；ソルビタンエステルおよび誘導体；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；ラウリル硫酸ナトリウム（sodium laurel sulfate）；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル－もしくはステアリル－スルホベタイン（sulfobetadine）；ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル－もしくはステアリル－サルコシン；リノレイル－、ミリスチル－もしくはセチル－ベタイン；ラウラミドプロピル－コカミドプロピル－、リノールアミドプロピル－、ミリスタミドプロピル－、パルミドプロピル－、もしくはイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウラミドプロピル（lauroamidopropyl））；ミリスタミドプロピル－、パルミドプロピル－、もしくはイソステアラミドプロピル－ジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウムまたはオレイルメチルタウリン二ナトリウム；ならびにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール（polypropyl glycol）、およびエチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）が挙げられる。ある特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベートである。ある特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。
本発明の医薬製剤に含有される非イオン性界面活性剤の量は、製剤に対して所望される特定の特性、ならびに製剤の使用が意図される特定の状況および目的によって、変わり得る。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、０．００５％～０．５％、０．００５％～０．２％、０．００５％～０．１％、０．００５％～０．０５％、０．００５％～０．０２％、０．００５％～０．０１％、０．０１％～０．５％、０．０１％～０．２％、０．０１％～０．１％、０．０１％～０．０５％、または０．０１％～０．０２％の非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）を含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％の非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）を含む。
ある特定の実施形態では、医薬製剤は、等張性である。「等張性」製剤は、ヒトの血液と本質的に同じ浸透圧を有するものである。等張性製剤は、一般に、約２５０～３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。等張性は、蒸気圧または氷凍結型浸透圧計を使用して測定することができる。ある特定の実施形態では、医薬製剤の容量オスモル濃度は、２５０～３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。ある特定の実施形態では、医薬製剤の容量オスモル濃度は、３００～３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。
糖、糖アルコールおよびＮａＣｌなどの物質を、所望の容量オスモル濃度のために医薬製剤に含めることができる。ある特定の実施形態では、医薬製剤中にＮａＣｌがある場合、その濃度は、１０ｍＭ、９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、または１μＭに等しいか、またはそれ未満である。ある特定の実施形態では、医薬製剤中のＮａＣｌの濃度は、検出限界未満である。ある特定の実施形態では、ＮａＣｌ塩は、医薬製剤を調製する際に添加されない。
本発明の医薬製剤は、１つまたは複数の他の物質、例えば、増量剤または保存剤をさらに含み得る。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に嵩（ｍａｓｓ）を加え、凍結乾燥ケークの物理構造に寄与する（例えば、開孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケークの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤はこのような増量剤を含有し得る。保存剤は、細菌作用を減少させ、例えば、マルチユース（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。
例示的な製剤
ある特定の実施形態では、本発明の医薬製剤は、ｐＨ５．５～６．５で、多重特異性結合タンパク質、ヒスチジン、糖または糖アルコール（例えば、スクロースまたはソルビトール）、およびポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を含む。
ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．５～６．５で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、１０～２５ｍＭのヒスチジン、２００～３００ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロースまたはソルビトール）、および０．００５％～０．０５％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．５～６．５で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロースまたはソルビトール）、および０．０１％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．８～６．２で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロースまたはソルビトール）、および０．０１％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．９５～６．０５で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロースまたはソルビトール）、および０．０１％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を含む。
ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．５～６．５で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、１０～２５ｍＭのヒスチジン、２００～３００ｍＭのスクロース、および０．００５％～０．０５％のポリソルベート８０を含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．５～６．５で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのスクロース、および０．０１％のポリソルベート８０を含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．８～６．２で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのスクロース、および０．０１％のポリソルベート８０を含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．９５～６．０５で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのスクロース、および０．０１％のポリソルベート８０を含む。
ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．５～６．５で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、１０～２５ｍＭのヒスチジン、２００～３００ｍＭのソルビトール、および０．００５％～０．０５％のポリソルベート８０を含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．５～６．５で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのソルビトール、および０．０１％のポリソルベート８０を含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．８～６．２で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのソルビトール、および０．０１％のポリソルベート８０を含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ｐＨ５．９５～６．０５で、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのソルビトール、および０．０１％のポリソルベート８０を含む。
多重特異性結合タンパク質の安定性
本発明の医薬製剤は、高レベルの安定性を示す。医薬製剤は、製剤中の多重特異性結合タンパク質が、定義された条件下での保存後に許容される程度の物理的特性、化学構造および／または生物学的機能を保持する場合、安定している。
安定性は、定義された時間にわたって定義された温度での保存後に未変性コンフォメーションのままである、製剤中の多重特異性結合タンパク質のパーセンテージを判定することによって測定することができる。未変性コンフォメーションのタンパク質のパーセンテージは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー）によって判定することができ、未変性コンフォメーションのタンパク質は、凝集しておらず（高分子量画分中に溶出されない）、分解してもいない（低分子量画分中に溶出されない）。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より多くが、４℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、未変性コンフォメーションを有する。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より多くが、５０℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、未変性コンフォメーションを有する。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％または１％未満が、４℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、高分子量複合体を形成している（すなわち、天然タンパク質より高い分子量を有する）。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の１％、２％、３％、４％または５％未満が、５０℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、高分子量複合体を形成している（すなわち、天然タンパク質より高い分子量を有する）。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％または１％未満が、４℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、分解している（すなわち、天然タンパク質より低い分子量を有する）。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の１％、１．５％、２％、２．５％または３％未満が、５０℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、分解している（すなわち、天然タンパク質より低い分子量を有する）。
安定性は、タンパク質の主要画分（「主電荷形態」）と比較して、より酸性度の高い画分に（「酸性形態」で）存在する多重特異性結合タンパク質のパーセンテージを判定することによって測定することもできる。理論により拘束されることを望まないが、タンパク質の脱アミドは、タンパク質を非脱アミドタンパク質と比較してより負に帯電させることになり得、したがってより酸性にし得る（例えば、Robinson, Protein Deamidation, (2002) PNAS 99(8):5283-88を参照されたい）。酸性形態のタンパク質のパーセンテージは、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換高速液体クロマトグラフィー）またはイメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）によって判定することができる。ある特定の実施形態では、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、４℃で３週間のインキュベーション後に主電荷形態である。ある特定の実施形態では、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、５０℃で３週間のインキュベーション後に主電荷形態である。ある特定の実施形態では、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以下が、４℃で３週間のインキュベーション後に酸性形態である。ある特定の実施形態では、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％または８５％以下が、５０℃で３週間のインキュベーション後に酸性形態である。
安定性は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）でタンパク質を変性させた後、電気泳動により多重特異性結合タンパク質の純度を判定することによって測定することもできる。タンパク質試料を、タンパク質のジスルフィド結合を還元する薬剤（例えば、β－メルカプトエタノール）の存在または非存在下で変性させることができる。ある特定の実施形態では、タンパク質試料を還元条件下（例えば、β－メルカプトエタノールの存在下）で変性させた後にキャピラリー電気泳動によって測定した場合の、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の純度は、４℃で３週間のインキュベーション後に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。ある特定の実施形態では、タンパク質試料を還元条件下（例えば、β－メルカプトエタノールの存在下）で変性させた後にキャピラリー電気泳動によって測定した場合の、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の純度は、５０℃で３週間のインキュベーション後に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。ある特定の実施形態では、タンパク質試料を非還元条件下で変性させた後にキャピラリー電気泳動によって測定した場合の、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の純度は、４℃で３週間のインキュベーション後に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。ある特定の実施形態では、タンパク質試料を非還元条件下で変性させた後にキャピラリー電気泳動によって測定した場合の、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の純度は、５０℃で３週間のインキュベーション後に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
安定性は、タンパク質溶解のパラメーターを動的光散乱により判定することによって測定することもできる。Ｚ平均および多分散指数（ＰＤＩ）値は、溶液中の粒子の平均直径を示し、これらの測定値は、凝集体が溶液中に存在すると増加する。単量体Ｐｄ％値は、検出される種々の単量体の広がりを示し、より低い値は単分散溶液を示し、単分散溶液が好ましい。ＤＬＳによって検出される単量体サイズは、主集団が単量体であることを確認する際に、および存在し得るあらゆるより高次の凝集体を特徴付けるのに、有用である。ある特定の実施形態では、医薬製剤のＺ平均値は、４℃で３週間のインキュベーション後に５％、１０％または１５％より大きく増加しない。ある特定の実施形態では、医薬製剤のＺ平均値は、５０℃で３週間のインキュベーション後に５％、１０％、１５％、２０％または２５％より大きく増加しない。ある特定の実施形態では、医薬製剤のＰＤＩ値は、４℃で３週間のインキュベーション後に１０％、２０％、３０％、４０％または５０％より大きく増加しない。ある特定の実施形態では、医薬製剤のＰＤＩ値は、５０℃で３週間のインキュベーション後に２倍、３倍、４倍または５倍より大きく増加しない。
医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の安定性を判定するための例示的な方法は、本開示の実施例１に記載されている。加えて、タンパク質の安定性は、ＷＯ２０１８／１５２５１８に記載されているＮＫ細胞活性化アッセイおよび細胞傷害性アッセイなどの、ある特定のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで、多重特異性結合タンパク質のその標的に対する結合親和性または多重特異性結合タンパク質の生物活性を測定することによって、評価することができる。
剤形
医薬製剤を液体製剤または凍結乾燥製剤として調製し、保管することができる。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、２～８℃（例えば、４℃）で保管するための液体製剤、または－２０℃もしくはそれ未満で保管するための凍結製剤である。製剤中の糖または糖アルコールは、リオプロテクタントとして使用される。
薬学的使用の前に、医薬製剤は、投与経路に適している水性担体で、希釈または復元することができる。他の例示的な担体としては、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液、またはデキストロース溶液が挙げられる。例えば、医薬製剤が静脈内投与用に調製される場合、医薬製剤は、０．９％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液で希釈され得る。ある特定の実施形態では、希釈された医薬製剤は、等張性であり、静脈内注入による投与に適している。
医薬製剤は、多重特異性結合タンパク質を保管に適した濃度で含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、多重特異性結合タンパク質を、１０～５０ｍｇ／ｍＬ、１０～４０ｍｇ／ｍＬ、１０～３０ｍｇ／ｍＬ、１０～２５ｍｇ／ｍＬ、１０～２０ｍｇ／ｍＬ、１０～１５ｍｇ／ｍＬ、１５～５０ｍｇ／ｍＬ、１５～４０ｍｇ／ｍＬ、１５～３０ｍｇ／ｍＬ、１５～２５ｍｇ／ｍＬ、１５～２０ｍｇ／ｍＬ、２０～５０ｍｇ／ｍＬ、２０～４０ｍｇ／ｍＬ、２０～３０ｍｇ／ｍＬ、２０～２５ｍｇ／ｍＬ、３０～５０ｍｇ／ｍＬ、３０～４０ｍｇ／ｍＬ、または４０～５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、多重特異性結合タンパク質を、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、または５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。
ある特定の実施形態では、医薬製剤は、容器（例えば、バイアル、バッグ、ペンまたはシリンジ）内に包装される。ある特定の実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤または液体製剤であり得る。ある特定の実施形態では、容器内の多重特異性結合タンパク質の量は、単回投与としての投与に適している。ある特定の実施形態では、容器内の多重特異性結合タンパク質の量は、複数回投与での投与に適している。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、多重特異性結合タンパク質を０．１～２０００ｍｇの量で含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、多重特異性結合タンパク質を１～２０００ｍｇ、１０～２０００ｍｇ、２０～２０００ｍｇ、５０～２０００ｍｇ、１００～２０００ｍｇ、２００～２０００ｍｇ、５００～２０００ｍｇ、１０００～２０００ｍｇ、０．１～１０００ｍｇ、１～１０００ｍｇ、１０～１０００ｍｇ、２０～１０００ｍｇ、５０～１０００ｍｇ、１００～１０００ｍｇ、２００～１０００ｍｇ、５００～１０００ｍｇ、０．１～５００ｍｇ、１～５００ｍｇ、１０～５００ｍｇ、２０～５００ｍｇ、５０～５００ｍｇ、１００～５００ｍｇ、２００～５００ｍｇ、０．１～２００ｍｇ、１～２００ｍｇ、１０～２００ｍｇ、２０～２００ｍｇ、５０～２００ｍｇ、１００～２００ｍｇ、０．１～１００ｍｇ、１～１００ｍｇ、１０～１００ｍｇ、２０～１００ｍｇ、５０～１００ｍｇ、０．１～５０ｍｇ、１～５０ｍｇ、１０～５０ｍｇ、２０～５０ｍｇ、０．１～２０ｍｇ、１～２０ｍｇ、１０～２０ｍｇ、０．１～１０ｍｇ、１～１０ｍｇ、または０．１～１ｍｇの量で含む。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、多重特異性結合タンパク質を０．１ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、または２０００ｍｇの量で含む。
投薬量レジメンおよび治療的使用
別の態様では、本開示は、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、最初の４週間処置サイクルにおいて１日目、８日目および１５日目に、本明細書で開示される多重特異性結合タンパク質（例えば、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブ）を投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、最初の４週間処置サイクルではこれらの３日にのみ、対象に投与される。特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２２日目には対象に投与されない。このレジメンは、患者に対する注入負荷を最小限に抑えつつ処置の過程でできる限り早期に目標の最大飽和に達するように設計されている、用量強化スケジュールである。
ある特定の実施形態では、方法は、対象に、最初の処置サイクルの後、１または複数の後続の４週間処置サイクルにおいて多重特異性結合タンパク質を投与するステップをさらに含み、多重特異性結合タンパク質は、各々の後続の処置サイクルにおいて１日目および１５日目に投与される。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、後続の４週間処置サイクルではこれらの２日にのみ、対象に投与される。特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、８日目または２２日目には対象に投与されない。対象が多重特異性結合タンパク質の投与を２週間に１回受ける後続の処置サイクルは、ある特定のレベルの多重特異性結合タンパク質を対象において維持するように設計されている。ある特定の実施形態では、対象は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の後続の処置サイクルを受ける。ある特定の実施形態では、対象は、がんが退縮するまで後続の処置サイクルを受ける。
ある特定の実施形態では、最初のおよび後続の処置サイクルにおける１または複数用量は、多重特異性結合タンパク質を０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１～５ｍｇ／ｋｇ、０．１～２ｍｇ／ｋｇ、０．１～１ｍｇ／ｋｇ、０．１～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１～０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２～２０ｍｇ／ｋｇ、０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、０．２～５ｍｇ／ｋｇ、０．２～２ｍｇ／ｋｇ、０．２～１ｍｇ／ｋｇ、０．２～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５～２０ｍｇ／ｋｇ、０．５～１０ｍｇ／ｋｇ、０．５～５ｍｇ／ｋｇ、０．５～２ｍｇ／ｋｇ、０．５～１ｍｇ／ｋｇ、１～２０ｍｇ／ｋｇ、１～１０ｍｇ／ｋｇ、１～５ｍｇ／ｋｇ、または１～２ｍｇ／ｋｇの量で含む。ある特定の実施形態では、最初のおよび後続の処置サイクルにおける１または複数用量は、多重特異性結合タンパク質を０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量で含む。
ある特定の実施形態では、最初のおよび後続の処置サイクルにおける用量の各々は、多重特異性結合タンパク質を０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１～５ｍｇ／ｋｇ、０．１～２ｍｇ／ｋｇ、０．１～１ｍｇ／ｋｇ、０．１～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１～０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２～２０ｍｇ／ｋｇ、０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、０．２～５ｍｇ／ｋｇ、０．２～２ｍｇ／ｋｇ、０．２～１ｍｇ／ｋｇ、０．２～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５～２０ｍｇ／ｋｇ、０．５～１０ｍｇ／ｋｇ、０．５～５ｍｇ／ｋｇ、０．５～２ｍｇ／ｋｇ、０．５～１ｍｇ／ｋｇ、１～２０ｍｇ／ｋｇ、１～１０ｍｇ／ｋｇ、１～５ｍｇ／ｋｇ、および１～２ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量で含む。ある特定の実施形態では、最初のおよび後続の処置サイクルにおける用量の各々は、多重特異性結合タンパク質を０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１～５ｍｇ／ｋｇ、０．１～２ｍｇ／ｋｇ、０．１～１ｍｇ／ｋｇ、０．１～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１～０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２～２０ｍｇ／ｋｇ、０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、０．２～５ｍｇ／ｋｇ、０．２～２ｍｇ／ｋｇ、０．２～１ｍｇ／ｋｇ、０．２～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５～２０ｍｇ／ｋｇ、０．５～１０ｍｇ／ｋｇ、０．５～５ｍｇ／ｋｇ、０．５～２ｍｇ／ｋｇ、０．５～１ｍｇ／ｋｇ、１～２０ｍｇ／ｋｇ、１～１０ｍｇ／ｋｇ、１～５ｍｇ／ｋｇ、および１～２ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される同じ量で含む。
ある特定の実施形態では、最初のおよび後続の処置サイクルにおける用量の各々は、多重特異性結合タンパク質を０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量で含む。ある特定の実施形態では、最初のおよび後続の処置サイクルにおける用量の各々は、多重特異性結合タンパク質を０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される同じ量で含む。
ある特定の実施形態では、最初のおよび後続の処置サイクルにおける用量の各々は、多重特異性結合タンパク質を５．２×１０－５ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－４ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－４ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－３ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－３ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－２ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－２ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－１ｍｇ／ｋｇ、０．５２ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、５．２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量で含む。ある特定の実施形態では、最初のおよび後続の処置サイクルにおける用量の各々は、多重特異性結合タンパク質を５．２×１０－５ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－４ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－４ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－３ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－３ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－２ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－２ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－１ｍｇ／ｋｇ、０．５２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、５．２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される同じ量で含む。
ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、静脈内投与される。例えば、ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、静脈内注入によって、例えば、充填済みのバッグ、充填済みのペンまたは充填済みのシリンジを用いて、投与される。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質は、投与の前に希釈される。例えば、ある特定の実施形態では、医薬製剤は、塩化ナトリウムで希釈され、２５０ｍｌ食塩水バッグから静脈内投与される。静脈内注入は、約１時間（例えば、５０～８０分）にわたっての注入であり得る。ある特定の実施形態では、バッグは、チューブおよび／または針を含むチャネルに接続される。
本明細書で開示される多重特異性結合タンパク質または医薬製剤で処置することができるがんの種類としては、それだけに限らないが、乳がん、甲状腺がん、胃がん、腎細胞癌、肺の腺癌、前立腺がん、胆管癌、子宮がん、膵臓がん、結腸直腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫、食道がん、皮膚の扁平上皮癌、唾液腺癌、胆道がん、肺扁平上皮がん、中皮腫、肝臓がん、肉腫、膀胱がん、および胆嚢がんが挙げられる。ある特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、がんは、局所進行または転移性固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、がんは、尿路上皮膀胱がんまたは転移性乳がんである。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって処置される対象は、ＨＥＲ２陽性がんを有する。がんにおけるＨＥＲ２発現を判定する方法としては、それだけに限らないが、免疫組織化学的検査が挙げられる。抗ＨＥＲ２抗体（例えば、Ｖｅｎｔａｎａ ４Ｂ５抗体およびＢｏｎｄ Ｏｒａｃｌｅ ＣＢ１１抗体）は、ＦＤＡによってＨＥＲ２の検出用に承認されており、免疫組織化学的検査キット（例えば、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標））が市販されている。腫瘍試料におけるＨＥＲ２発現レベルを、免疫組織化学的検査によって検出された場合、定量し、ＡＳＣＯ／ＣＡＰガイドライン（Wolff et al., (2007) J. Clin. Oncol. 25(1):118-45）に従って１＋、２＋または３＋としてスコア付けすることができる。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって処置される対象は、１＋、２＋または３＋としてスコア付けされるＨＥＲ２レベルを有する腫瘍を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって処置される対象は、２＋または３＋としてスコア付けされるＨＥＲ２レベルを有する腫瘍を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって処置される対象は、３＋としてスコア付けされるＨＥＲ２レベルを有する腫瘍を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ２レベルは、免疫組織化学的検査（例えば、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標））によって判定される。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって処置される対象は、少なくとも、腫瘍細胞の少なくとも１０％または１０％より多くにおいて検出されるかすかな／辛うじて知覚できる膜染色として、ＨＥＲ２発現を示す腫瘍を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって処置される対象は、少なくとも、腫瘍細胞の少なくとも１０％または１０％より多くにおいて検出される弱～中程度の完全な膜染色として、ＨＥＲ２発現を示す腫瘍を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって処置される対象は、少なくとも、腫瘍細胞の少なくとも１０％または１０％より多くにおいて検出される強い完全な膜染色として、ＨＥＲ２発現を示す腫瘍を有する。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって処置される対象は、ＥＲＢＢ２遺伝子増幅があるがんを有する。ＥＲＢＢ２遺伝子増幅は、一般に、ＨＥＲ２過剰発現と相関し、ＥＲＢＢ２遺伝子ががん組織試料において増幅されているかどうかを判定することは、同じ試料の免疫組織化学的検査からの擬陽性結果を低減させるのに役立ち得る（例えば、Sarode et al., (2015) Arch. Pathol. Lab. Med. 139:922-28を参照されたい）。遺伝子増幅を検出する方法としては、それだけに限らないが、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、定量的ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＥＲＢＢ２遺伝子増幅は、ＦＩＳＨによって判定される。ある特定の実施形態では、ＥＲＢＢ２遺伝子増幅は、ＤＮＡ配列決定（例えば、ディープ配列決定）によって判定される。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従って処置される対象は、がんを処置するための治療を過去に受けたことがない。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従って処置される対象は、がんを処置するための化学療法も免疫療法も過去に受けたことがない。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従って処置される対象は、過去に治療（例えば、化学療法または免疫療法）を受けたことがあるが、過去の治療にもかかわらずがんの進行を経験し続けている。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従って処置される対象は、過去の治療（例えば、化学療法または免疫療法）を受けた後にがんの退縮を経験したが、その後、がんの再発を経験した。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従って処置される対象は、過去の治療（例えば、化学療法または免疫療法）に不耐容である。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従って処置される対象は全て、実施例３に記載されている臨床試験コホート（例えば、加速漸増コホート、「３＋３」用量漸増コホート、安全性／ＰＫ／ＰＤ拡大コホート、尿路上皮膀胱がん（ＵＢＣ）コホート、転移性乳がん（ＭＢＣ）コホート、高いＨＥＲ２発現（ＨＥＲ２ ３＋）を有するバスケット型固形腫瘍コホート、またはペムブロリズマブとの併用療法コホート）の組み入れ基準を満たす。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従って処置される対象は、実施例３に記載されているいずれの除外基準も満たさない。
本明細書で開示される多重特異性結合タンパク質を単剤療法として使用することができ、または１つもしくは複数の治療と組み合わせて使用することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、本明細書で開示される投薬量レジメンに従って単剤療法として使用される。他の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、１つまたは複数の治療と組み合わせて使用され、多重特異性結合タンパク質は、本明細書で開示される投薬量レジメンに従って投与され、１つまたは複数の治療は、特定のがんを有する特定の対象を処置することに適していることが公知の投薬量レジメンに従って投与される。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される処置の方法は、原発巣の外科的除去の補助として使用される。
多重特異性結合タンパク質と組み合わせて使用され得る例示的な治療剤としては、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、サイマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－２アルファ、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、コロニー刺激因子－１、コロニー刺激因子－２、デニロイキン・ジフチトクス、インターロイキン－２、黄体ホルモン放出因子、およびそれらの同族受容体に対する示差的結合、または増加もしくは減少した血清半減期を示し得る上記薬剤のバリエーションが挙げられる。
がんを処置することにおいて併用療法の部分として使用され得る薬剤の追加のクラスは、免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤は、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７－Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７－Ｈ４および（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つまたは複数を阻害する薬剤を含む。ＣＴＬＡ４阻害剤イピリムマブは、黒色腫を処置することについて米国食品医薬品局によって承認されている。
がんの処置で併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的化するモノクローナル抗体剤（例えば、ハーセプチン）および非細胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。
抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトンチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫとｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２－クロロ－デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１とＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ－ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤およびＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦおよびＧ－ＣＳＦから選択されるサイトカインが含まれる。
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、対象に抗ＰＤ－１抗体を投与するステップをさらに含む。多くの抗ＰＤ－１抗体が治療のために開発されており、例えば、Gong et al., (2018) J. ImmunoTher Cancer (2018) 6:8に記載されている。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブである。ある特定の実施形態では、２００ｍｇのペムブロリズマブが、最初の処置サイクルの１日目に投与される。ある特定の実施形態では、対象が１または複数の後続の処置サイクルを受ける場合、後続の第１の処置サイクルの１日目から開始して、２００ｍｇのペムブロリズマブが、後続の処置サイクルにおいて３週間に１回投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される処置の方法は、対象または患者の疾患応答または生存の改善をもたらす。例えば、ある特定の実施形態では、疾患応答は、完全奏効、部分奏効、または安定疾患である。ある特定の実施形態では、生存の改善は、無進行生存（ＰＦＳ）または全生存期間の改善である。改善（例えば、ＰＦＳの）は、本開示の処置の開始前の期間と比較して判定することができる。ＢＴＣ（例えば、進行ＢＴＣ、転移性ＢＴＣ）についての疾患応答（例えば、完全奏効、部分奏効または安定疾患）および患者の生存（例えば、ＰＦＳ、全生存期間）を判定する方法、または胆道腫瘍療法は、当技術分野では通例であり、本明細書で企図される。一部の実施形態では、疾患応答は、処置される患者に、患部（例えば、胸部／腹部、および胸郭入口の上部から恥骨結合までの領域を包含する骨盤）の造影コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を受けさせた後、ＲＥＣＩＳＴ １．１に従って評価される。
ここで一般的に説明されている本開示は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。以下の実施例は、単に本開示のある特定の態様および実施形態の例証を目的として含まれているものに過ぎず、いかなる点においても本開示の範囲を限定することを意図したものではない。
（実施例１）
Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの製剤、包装および保管
Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブ（Ｋｅｒｍｉｔ ＢＤＳロット７４４３－Ｃ３、１１．９ｍｇ／ｍＬ）の安定性に対するｐＨおよび賦形剤の効果を評価するために、表１２に列挙する製剤を２回ずつおよび無作為化した状態で評価した。Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブを、３０ｍｇ／ｍＬの標的濃度への遠心式限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４ ３０ｋデバイスＭＷＣＯ）によって緩衝液交換してそれぞれのバッファーと賦形剤の組合せにした。最終緩衝液交換および標的濃度の確認後、Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号ＵＦＣ４０ＧＶＯＳ）を装着した０．２２μｍ ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＣＬ遠心式フィルターデバイスを使用して、各製剤化試料を滅菌濾過した。滅菌濾過後は各製剤を層流フード内で無菌で取り扱った。製剤化試料にポリソルベート８０（ＰＳ８０）をスパイクとして添加して０．０１％の最終濃度にした。各製剤の一定分量をゼロ時間試験のために除去し、残りの材料を２つの等しいサイズの一定分量に分けて脱パイロジェン１型ホウケイ酸ガラスバイアル、２ｍＬ×１３ｍｍ（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ カタログ番号６８０００３７７）に入れ、１３ｍｍのＦｌｕｏｒｏｔｅｃ栓（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ カタログ番号１９７００３０２）で打栓し、密封した。ゼロ時間の一定分量を、表１３による最初の時点の試験に使用した。一方のバイアルを２～８℃で保管し、他方のバイアルを３週間の加速安定性研究のために５０℃で置いておいた。３週間インキュベーション後、２～８℃および５０℃試料を、表１３に示す試験方法に従って分析した。
Figure 2022546454000054
Figure 2022546454000055
Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの加速安定性研究を実行し、その際、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブを２０の製剤で表１２に示したように調製した。試料を２回ずつ実験し、３週間、２～８℃および５０℃でインキュベートした。ゼロ時間でおよび３週間インキュベーションの終了時に、表１３に概要を示した通りのアッセイを使用して各製剤化試料の試験を行った。全ての製剤は、外観、濃度、ｐＨおよび重量オスモル濃度によって評価したところ、同様に挙動し、予想の範囲内であった。
外観
試料バイアルを開ける前に周囲実験条件で白黒背景の下で試料を眺めた。全ての試料で、目視可能な微粒子は、ゼロ時間においても３週間条件においても存在しなかった。
紫外線濃度の判定
光学密度（ＯＤ）２８０ｎｍでの紫外線（ＵＶ）吸収によってタンパク質濃度を試料および条件ごとに判定した。ゼロ時間での、２～８℃での３週間インキュベーション後の、および５０℃での３週間インキュベーション後のタンパク質濃度を、表１４に要約する。
ｐＨの判定
ｐＨを試料および条件ごとに判定した。ゼロ時間での、２～８℃での３週間インキュベーション後の、および５０℃での３週間インキュベーション後のｐＨ値を、表１５に要約する。
動的光散乱
３００秒平衡させた後に２５℃で動的光散乱（ＤＬＳ）試料を収集した。試料ごとに５つの測定値を収集した。ゼロ時間での、２～８℃での３週間インキュベーション後の、および５０℃での３週間インキュベーション後のＺ平均値を、表１６に要約する。
平均多分散指数（ＰＤＩ％）も記録した。ゼロ時間での、２～８℃での３週間インキュベーション後の、および５０℃での３週間インキュベーション後のＰＤＩ％値を、表１７に要約する。
試料中のＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブのさらなるＤＬＳ分析を行った。ゼロ時間での、２～８℃での３週間インキュベーション後の、および５０℃での３週間インキュベーション後の単量体多分散性の平均パーセンテージ（ＰＤ％）を、表１８に要約する。ゼロ時間での、２～８℃での３週間インキュベーション後の、および５０℃での３週間インキュベーション後の平均単量体サイズの値を、表１９に要約する。
Figure 2022546454000056
Figure 2022546454000057
Figure 2022546454000058
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Figure 2022546454000063
ＤＬＳによって評価して、平均サイズおよび単量体サイズ≦２０ｎｍ、ならびに多分散性（ＰＤＩ）≦０．３００で、全てのＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブ製剤は、コンフォメーションの安定性を示した。賦形剤とｐＨの組合せを評価した際、ソルビトールのみの製剤およびスクロースのみの製剤は、３週間、２～８℃および５０℃でのインキュベーション時に、ＮａＣｌとソルビトールの組合せ製剤およびＮａＣｌとスクロースの組合せ製剤と比較して低い平均サイズを有した（比較モデリングを図２Ａおよび図２Ｂに示す）。平均単量体サイズも、ソルビトールのみの製剤およびスクロースのみの製剤では、３週間、２～８℃および５０℃でのインキュベーション後にＮａＣｌとの組合せ製剤と比較して小さかった（図３Ａおよび３Ｂ）。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
サイズ排除クロマトグラフィーをドラフト法に従って行って、高分子量種のパーセンテージ（ＨＭＷ％）、主要種のパーセンテージ（主要％）、および低分子量種のパーセンテージ（ＬＭＷ％）を判定した。試料を移動相バッファー（１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する、ｐＨ７．３）で２．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、１００μｇの負荷量で注入した。分離は、２８０ｎｍでの検出と８ｎｍのバンド幅で東ソー株式会社Ｇ３０００ＳＷ×１（７．８×３００ｍｍ、カタログ番号０８５４１）カラムによって行った。試料を、実時間で、ゼロ時間で、２～８℃または５０℃のいずれかでの３週間のインキュベーション後に分析した。ＨＭＷ％値を表２０に要約し、主要％値を表２１に要約し、ＬＭＷ％値を表２２に要約する。
Figure 2022546454000064
Figure 2022546454000065
Figure 2022546454000066
Figure 2022546454000067
５０℃での３週間インキュベーション後、製剤化試料は、９１．３％～９５．２％の範囲の主ピーク％値を有し、ソルビトールのみを有する製剤およびスクロースのみを有する製剤は、ＮａＣｌとソルビトールの組合せ賦形剤およびＮａＣｌとスクロースの組合せ賦形剤と比較して高い主ピーク％および低いＨＭＷ種％を維持した（それぞれ、図４Ａおよび図５Ａに示す）。重要なこととして、単一賦形剤スクロースと単一賦形剤ソルビトールの両方は、ｐＨ範囲５．５～６．５にわたって主ピーク種％を維持し、両方とも、ｐＨが５．５から６．５に上昇してもＨＭＷ種％のわずかな上昇しか示していない。ＬＭＷ種％は、全ての賦形剤についてｐＨが５．５から約６．２に上昇するにつれて低下する傾向があった（図６Ａ）。
２～８℃での３週間インキュベーション後、全ての製剤化試料は、９８％より高い主要種ピークのパーセンテージを維持した。主ピーク％は、図４Ｂに示すように、高い方のｐＨ値（ｐＨ６．５）と比べて低い方のｐＨ値（５．５）の方が高かった。単一賦形剤ソルビトールおよび単一賦形剤スクロースは、ＨＭＷ％が、ＮａＣｌとソルビトールの組合せ賦形剤およびＮａＣｌとスクロースの組合せ賦形剤と比較して低い傾向があった。全ての賦形剤について、ｐＨが上昇するとＨＭＷ種％が増加する傾向があった（図４Ｂ）。ＬＭＷ種％は、組合せ賦形剤の方が低い傾向があったが、ｐＨ依存性であった（図６Ｂ）。
重量オスモル濃度
全ての試料の重量オスモル濃度（ｏｓｍｏ）を、凝固点降下によって測定した。重量オスモル濃度は、全ての条件にわたって全ての試料について維持された。ゼロ時間での、２～８℃での３週間インキュベーション後の、および５０℃での３週間のインキュベーション後の重量オスモル濃度データを、表２３に要約する。
Figure 2022546454000068
イメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）
チャージバリアント分析を判定するために、イメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）を使用した。電荷不均一性を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ－Ｍａｕｒｉｃｅのドラフト法を使用して評価した。出発材料および試料を水で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで、９０μＬのマスターミックスに対して１０μＬの試料でマスターミックスと併せた。このマスターミックスは、１％メチルセルロース、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ８－１０．５、ｐＩマーカー５．１２、ｐＩマーカー９．５０、およびＤＩ水の組合せであった。システム適合性標準物質を調製し、試料の泳動前に泳動し、試料は、９６ウェルプレートフォーマットで泳動した。Ｍａｕｒｉｃｅに用いた方法パラメーターは、次の通りであった：電気泳動時間＃１＝１分、１５００Ｖ、電気泳動時間＃２＝８分、３０００Ｖ、検出＝５露光、試料負荷＝５５秒、低い方のｐＩのマーカー＝５．１２、３００ピクセル、高い方のｐＩのマーカー＝９．５０、１８００ピクセル。一貫した読み取りを確実にするために、１８注入ごとに出発材料を泳動した。
「主ピーク」は、ゼロ時間での製剤化試料における主ピークと定義した。インキュベーション後、同じ溶出時間を有するピークは、減少してしまって最大曲線下面積を有するピークをもはや表さないことがあったが、それでもやはり「主ピーク」と定義した。２～８℃での３週間インキュベーション後および５０℃での３週間インキュベーション後の酸性画分中に存在するタンパク質のパーセンテージ（酸性％）の値を、表２４に要約する。主ピーク画分中に存在するタンパク質のパーセンテージ（主ピーク％）の値を表２５に要約する。塩基性画分中に存在するタンパク質のパーセンテージ（塩基性％）の値を表２６に要約する。
Figure 2022546454000069
Figure 2022546454000070
Figure 2022546454000071
Figure 2022546454000072
２～８℃での３週間インキュベーション後の製剤化試料について、主ピーク％値は、５８．３％～６２．２％の範囲であり、酸性％値は、３４．３％～３８．４％の範囲であり、塩基性％値は、３．３％～３．７％の範囲であった。主ピーク％データに当てはまる有意なモデルはなかったが、これは、ｐＨも賦形剤もｉｃＩＥＦ値に対して有意な影響を及ぼさなかったことを示す（図８Ｂ～８Ｄ）。賦形剤は、酸性種％および塩基性種％をモデル化する上でも重要でなく、酸性種％は、ｐＨと共に上昇する傾向があったが、塩基性種％は、低下した（図７Ｂおよび９Ｂ）。変化はわずかであったが、全ての値について狭い範囲で観察された。
５０℃での３週間インキュベーション後の製剤化試料について、主ピーク％値は、１４．９％～２２．７％の範囲であり、酸性％値は、７０．６％～８１．６％の範囲であり、塩基性％値は、２．４％～８．８％の範囲であった。このデータは、主ピーク種％から酸性種％への移行を示し、塩基性％は、依然として、３週間２～８℃インキュベーション結果と比較的一致している。３週間５０℃製剤化試料の評価では、唯一の賦形剤としてスクロースを有する試料が、最高の酸性種％（図７Ａ）ならびに最低の主ピーク％および塩基性種％（図８Ａおよび９Ａ）を有した。これは、全てのｐＨ値（５．５～６．５）にわたって一貫していたが、他の３つの賦形剤を有する製剤は、酸性種％が、ｐＨ値が低いほど低く、ｐＨの上昇に伴って上昇する傾向があった。
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）
純度を評価するために還元キャピラリーゲル電気泳動を行った。ドラフトＡＴＭに従って、Ｓｃｉｅｘ ＰＡ８００＋を使用して２２０ｎｍでＵＶ検出して、ＳＤＳ－ＣＧＥを評価した。試料は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＤＳ試料バッファーで１００μｇの試料を希釈して５μＬのβ－メルカプトエタノールを添加することによって調製した。試料を７０℃で１０分間加熱した。正極性、昇温１分、電圧１５ｋＶ、および圧力２０ｐｓｉを使用して、２０分にわたって分離を行った。キャピラリー長は、３０．２ｃｍであり、検出器までの長さは１０．２ｃｍであった。出発材料をリファレンスとして使用した。試料純度パーセンテージの概要を表２７に示す。試料不純物パーセンテージの概要を表２８に示す。
Figure 2022546454000073
Figure 2022546454000074
Figure 2022546454000075
純度を評価するために非還元キャピラリーゲル電気泳動も行った。ドラフトＡＴＭに従って、Ｓｃｉｅｘ ＰＡ８００＋を使用して２２０ｎｍでＵＶ検出して、ＳＤＳ－ＣＧＥを評価した。試料は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＤＳ試料バッファーで１００μｇの試料を希釈して５μＬの２５０ｍＭヨードアセトアミドを添加することによって調製した。試料を７０℃で１０分間加熱した。正極性、昇温１分、電圧１５ｋＶ、および圧力２０ｐｓｉを使用して、２０分にわたって分離を行った。キャピラリー長は、３０．２ｃｍであり、検出器までの長さは１０．２ｃｍであった。出発材料をリファレンスとして使用した。ＨＭＷ％ ＣＥ（ＮＲ）データの概要を表２９に示す。主ピーク％ ＣＥ（ＮＲ）データの概要を表３０に示す。ＬＭＷ％ ＣＥ（ＮＲ）データの概要を表３１に示す。
Figure 2022546454000076
Figure 2022546454000077
Figure 2022546454000078
Figure 2022546454000079
還元ＣＥによって評価して、３週間５０℃試料間で、ソルビトールのみおよびスクロースのみの製剤についての純度％値は、ｐＨ範囲（ｐＨ５．５～６．５）にわたって維持された（図１０Ａ）が、組合せ賦形剤は、より低いｐＨ値（６．５に対して５．５）で純度％が低下されたことからｐＨに関してより大きい変動性を示した（図１０Ｂ）。
非還元ＣＥによって評価して、３週間５０℃試料間で、ソルビトールのみまたはスクロースのみを含む製剤は、ＮａＣｌとソルビトールの組合せ賦形剤およびＮａＣｌとスクロースの組合せ賦形剤と比較して低いＨＭＷ種％を有した（図１１Ａおよび１２Ａ）。ｐＨレベルは、主ピーク％値に対して有意な影響を及ぼさなかった。
還元および非還元ＣＥによって評価して、３週間２～８℃試料について還元ＣＥデータに当てはまる有意なモデルはなく、非還元ＣＥデータについては、ソルビトールのみおよびスクロースのみの製剤は、より高い主ピーク種％を有した（図１１Ｂ）。
統計解析
Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ｖ９ソフトウェアを使用して傾向を解析した。解析の概要を表３２に示す。太字のモデルは、最終最適化評価に含めなかった。
Figure 2022546454000080
賦形剤選択
２５０ｍＭソルビトールまたは２５０ｍＭスクロースを賦形剤として含有する製剤の性能は、ソルビトールとＮａＣｌの組合せまたはスクロースとＮａＣｌの組合せを含有する製剤より望ましかった。したがって、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの最適な製剤は、ｐＨ６．０で、２０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロースまたはソルビトール、および０．０１％ＰＳ８０であると判定した。
（実施例２）
Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの薬物動態（ＰＫ）分析
この研究は、研究の１日目および１５日目にカニクイザルに１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇで３０分ＩＶ注入として投与し、続いてそれぞれ１３日および６日の観察期間としたときの、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを判定するように設計した。雄および雌カニクイザルへのＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの１日目の初回静脈内注入後の主要ＰＫパラメーターの概要を、表３３および表３４にそれぞれ提示する。
Figure 2022546454000081
Figure 2022546454000082
雄および雌カニクイザルへのＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの１５日目の２回目静脈内注入後の主要ＰＫパラメーターの概要を、表３５および表３６にそれぞれ提示する。
Figure 2022546454000083
Figure 2022546454000084
ｔｍａｘが生じる時間は、一般に、注入終了（ＥＯＩ）の１５分後であった。しかし、表３３および３５に示したように、ｔｍａｘはまた、１０ｍｇ／ｋｇを受けた雄カニクイザルでは１日目のＥＯＩに、５０ｍｇ／ｋｇを受けた雄カニクイザルでは１５日目のＥＯＩの３０分後に、それぞれ生じた。表３４および３６に示したように、ｔｍａｘはまた、１ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ受けた雌カニクイザル（the females receiving cynomolgus monkeys 1 mg/kg or 50 mg/kg, respectively）では１５日目のＥＯＩの１時間後に生じた。これらのデータは、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブが、３０分ＩＶ投与後に、例えば９０時間を越える、長い終末半減期（ｔ１／２）で、ゆっくりと減少したことを示した。これらのデータはまた、低い血清クリアランスと、分布体積が血液量（７３．４ｍＬ／ｋｇ）と同様であり、体内総水分体積（６９３ｍＬ／ｋｇ）より小さかったこととを示した。
用量レベルについての血清Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの最大血清濃度（Ｃｍａｘ）と濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ０～１４４時間）との比も評価した。表３７は、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブについてのＣｍａｘ比およびＡＵＣ比を用量レベルごとに示す。
Figure 2022546454000085
表３７に示したように、ＣｍａｘおよびＡＵＣ０－１４４時間値は、１～５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって用量の増加とほぼ比例して増加した。雌カニクイザルにおけるＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブのＣｍａｘおよびＡＵＣ０－１４４時間値は、雄カニクイザルにおける曝露指数と同様であった。１５日目の２回目注射時に、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブのＣｍａｘおよびＡＵＣ０－１４４時間値は、１および１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでは１日目の初回投与後のものと同様であったが、５０ｍｇ／ｋｇ用量レベルでは一般にわずかに高かった。ＡＵＣ０－１４４時間値に基づく蓄積比は、５０ｍｇ／ｋｇ用量レベルでのものよりもわずかに高かった。これは、ある程度の蓄積が、この用量レベルでのＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの反復ＩＶ注入投与後に生じたことを示す。
加えて、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブで処置した動物からのいずれの試料にも抗薬物抗体陽性が認められず、したがって、被験物質に関連する抗薬物抗体がこの研究では見られないと結論付けた。
（実施例３）
Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブでの局所進行または転移性固形腫瘍の処置
目的
この臨床研究は、用量漸増相、および有効性に続いての有効性拡大コホート相という、２相で設計されている。研究の用量漸増相の主要目的は、有効な標準的治療が存在しない進行（切除不能な、再発性または転移性）固形腫瘍を有する患者または再発した患者または標準的治療に対して不耐容である患者において、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの安全性およびそれに対する耐容性を評価すること、ならびにＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの最大耐用量を決定することである。研究の有効性拡大コホート相の主要目的は、独立評価項目審査委員会（ＩＥＲＣ）によって改訂版固形腫瘍における治療効果の評価基準バージョン１．１（ｍＲＥＣＩＳＴ １．１）に従って全奏効率（ＯＲＲ）を評価することである。
この臨床研究の副次目的は、以下である：
－ Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの薬物動態を特徴付けること；
－ Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの免疫原性を評価することならびにその曝露および臨床活性と相関させること；
－ ＩＥＲＣによってＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの奏効期間（ＤＯＲ）を評価すること；
－ ＩＥＲＣによって最良総合効果（ＢＯＲ）を評価すること；
－ ＩＥＲＣによってＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの無憎悪生存期間（ＰＦＳ）を評価すること；
－ 全生存（ＯＳ）期間を評価すること；ならびに
－ ペムブロリズマブとの併用療法でのＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの安全性を評価すること。
研究デザイン
この研究は、単独でのおよびペムブロリズマブとの組合せでのＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの安全性、耐容性、薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、および予備的な抗腫瘍活性を判定するために設計された、継続的な並行群有効性拡大研究を伴う第Ｉ／ＩＩ相、非盲検、用量漸増研究である。この研究は、以下の２パートからなる：
（１）用量漸増パート（第Ｉ相）は、次の３相に分けられる：
（Ａ）加速漸増、
（Ｂ）「３＋３」用量漸増、および
（Ｃ）安全性／薬物動態（ＰＫ）／薬力学（ＰＤ）拡大コホート
（２）有効性拡大コホートパート（第ＩＩ相）は、次の４つのコホートに分けられる：
（Ａ）尿路上皮膀胱がん（ＵＢＣ）
（Ｂ）転移性乳がん（ＭＢＣ）
（Ｃ）高いＨＥＲ２発現（ＨＥＲ２ ３＋）を有するバスケット型固形腫瘍
（Ｄ）ペムブロリズマブとの併用療法。
１つの例示的な実施形態では、用量漸増パートおよび有効性拡大（ＵＢＣ、ＭＢＣ、またはバスケット型［ＨＥＲ２ ３＋］コホート）パートに登録した患者には、単剤療法としてのＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブを４週間処置サイクルで１時間注入として静脈内投与する。処置サイクル１については、患者にＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブを１日目、８日目および１５日目に投与する。処置サイクル２および後続のサイクルについては、進行、許容し難い毒性（本実施例の「用量制限毒性（ＤＬＴ）」セクションに記載される通り）、または試験用もしくは治験医薬品（ＩＭＰ）からの離脱の何らかの理由の発生が認められるまで、２週間に１回（例えば、１日目および１５日目）、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブを患者に投与する。有効性拡大コホートパートのペムブロリズマブコホートとの併用療法に登録した患者には、３週間処置サイクルでＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブを１時間ＩＶ注入としておよびペムブロリズマブを３０分ＩＶ注入として投与する。１つの例示的な実施形態では、２００ｍｇのペムブロリズマブをそのラベルの通りにＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブと共に投与する。
処置サイクル１については、患者に、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブとペムブロリズマブを１日目に、および単独でのＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブを８日目に投与する。処置サイクル２および後続のサイクルについては、進行、許容し難い毒性（本実施例の「用量制限毒性（ＤＬＴ）」セクションに記載される通り）、または試験もしくはＩＭＰからの離脱の何らかの理由の発生が認められるまで、３週間に１回、各サイクルの１日目にＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブおよびペムブロリズマブを患者に投与する。
確定された完全奏効（ＣＲ）が得られる患者には、研究責任医師の自由裁量で、確定後最大１２カ月間の処置を投与する。研究責任医師が、研究依頼者メディカルモニターとの議論を経てそのような患者に処置の継続が有効であると考えた場合、１２カ月を超える処置が許容される。
図１４Ａ～Ｂは、臨床試験デザインの概要図である。図１４Ａは、用量漸増相についての試験デザインを記載する。図１４Ｂは、有効性拡大コホート相についての試験デザインを記載する。
組み入れ基準
本実施例の臨床研究におけるコホートのいずれかに登録する患者の一般的な組み入れ基準は、以下を含む：
－ 書面によるインフォームドコンセントにサインした患者；
－ ≧１８歳である患者（男性および女性患者を含む）；
－ 標準的治療が存在しない、または標準的治療が奏効しなかった、組織病理学的におよび細胞学的に証明された局所進行または転移性固形腫瘍を有する患者。原発腫瘍は、免疫組織化学的検査によってＨＥＲ２発現が立証されていなければならない；
－ ０または１のＥＣＯＧパフォーマンスステータスを研究登録時に有し、少なくとも３カ月の推定寿命を有する患者；
－ 心エコー検査（好ましい）またはマルチゲート収集（ＭＵＧＡ）スキャンによって測定してベースライン左室駆出率（ＬＶＥＦ）≧５５％を有する患者；
－ 白血球（ＷＢＣ）数≧３×１０９／Ｌと絶対好中球数（ＡＮＣ）≧１．５×１０９／Ｌ、リンパ球数≧０．５×１０９／Ｌ、血小板数≧７５×１０９／Ｌおよびヘモグロビン≧９ｇ／ｄＬ（輸血を受けたことがあってもよい）によって定義される、十分な血液機能を有する患者；
－ 総ビリルビンレベル≦１．５×正常上限（ＵＬＮ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル≦２．５×ＵＬＮ、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル≦２．５×ＵＬＮ、または肝臓への転移性疾患が立証された患者については、ＡＳＴおよびＡＬＴレベル≦５×ＵＬＮによって定義される、十分な肝機能を有する患者；
－ コッククロフト・ゴールトの式に従って推定クレアチニンクリアランス＞５０ｍＬ／分によって定義される、十分な腎機能を有する患者；ならびに
－ 妊娠の可能性がある女性（ＷＯＣＢＰ）患者の場合は１「非常に有効な」方法または２「有効な」方法についてのＷＨＯガイドラインによって定義されているような有効な避妊をしている患者。
本実施例に記載の用量漸増パートの加速漸増または「３＋３」用量漸増相に登録する患者の追加の組み入れ基準は、以下を含む：
－ 対象疾患の証拠がある患者、しかし参加には測定可能な病巣は求められない；および
－ 利用可能な保存腫瘍生検標本（≦６カ月経過、少なくとも８つのスライド）またはスクリーニング期間内に得られた新鮮な生検標本（少なくとも１０のスライドおよび３のコア）がある患者。
本実施例に記載の用量漸増パートの安全性／ＰＫ／ＰＤ拡大コホート相に登録する患者の追加の組み入れ基準は、以下を含む：
－ ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）パラフィンブロックを得るためにスクリーニング期間中に得られた新鮮な腫瘍生検標本がある患者、または全体で少なくとも１２のスライドがあり、少なくとも３つの新鮮なコアがある、ＩＨＣを行うために十分な未染色スライド（未染色の少なくとも３つのスライド）がある患者；および
－ スクリーニング時にＩＨＣによって少なくとも１＋のＨＥＲ２が認められた患者。
本実施例に記載のＵＢＣ拡大コホートに登録する患者の追加の組み入れ基準は、以下を含む：
－ 尿路上皮（腎盂、尿管、尿路上皮、尿道を含む）の組織病理学的にまたは細胞学的に立証された局所進行または転移性移行上皮癌を有する患者；
－ 最終ラインの治療後にＸ線写真で疾患進行が認められた患者；
－ 手術不可能な局所進行または転移性尿路上皮癌のための１つ（および最大で１つ）の白金含有レジメン（例えば、白金に加えて別の薬剤、例えば、ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシンなど）を受けたが、Ｘ線写真で進行が認められた患者、またはアジュバントとしての白金含有レジメンの最終投与後６カ月以内に再発し、ファーストラインの白金含有レジメンが不奏効であったと考えられる患者；
－ チェックポイント阻害剤（すなわち、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１）での処置を受けたがＸ線写真で進行が認められた（必要に応じて、白金に基づく治療とＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に基づく治療の組合せを受けた）患者；
－ ＩＨＣによってＨＥＲ２の少なくとも１＋発現が認められた患者；および
－ ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）パラフィンブロックを得るためにスクリーニング期間中に得られた新鮮な腫瘍生検標本がある患者、または全体で少なくとも１２のスライドがあり、少なくとも３つの新鮮なコアがある、ＩＨＣを行うために十分な未染色スライド（未染色の少なくとも３つのスライド）がある患者。
本実施例に記載のＭＢＣ拡大コホートに登録する患者の追加の組み入れ基準は、以下を含む：
－ 組織病理学的に確定されたＭＢＣを有する患者；
－ 転移性疾患のための３ライン以下の細胞傷害性療法を過去に受けたことがある患者；
－ タキサンと、アントラサイクリンが禁忌である場合を除いてアントラサイクリンとを受けたことがある患者；
－ ＩＨＣによるスコア付け１＋または２＋の腫瘍を有する患者。スコア付け２＋の場合、ＥＲＲＢ２の腫瘍増幅の存在は、ＦＤＡにより承認された方法によって規定されたものでなければならない；
－ 最終ラインの全身治療後に（Ｘ線写真上）進行した患者；および
－ ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）パラフィンブロックを得るためにスクリーニング期間中に得られた新鮮な腫瘍生検標本がある患者、または全体で少なくとも１２のスライドがあり、少なくとも３つの新鮮なコアがある、ＩＨＣを行うために十分な未染色スライド（未染色の少なくとも３つのスライド）がある患者。
本実施例に記載のバスケット型（ＨＥＲ２ ３＋）コホートに登録する患者の追加の組み入れ基準は、以下を含む：
－ 乳がんまたは胃がんを除く何らかの固形腫瘍があり、腫瘍内のＥＲＲＢ２増幅の履歴があり、次のうちの一方がある患者：１）最終ラインでのＸ線写真による進行後、６カ月以内の最新の生検において立証されたＩＨＣによるＨＥＲ２ ３＋、または２）スクリーニング期間中のＩＨＣによるＨＥＲ ３＋；
－ 少なくとも１ラインの承認されたまたは確立された治療を受けたことがある患者；および
－ ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）パラフィンブロックを得るためにスクリーニング期間中に得られた新鮮な腫瘍生検標本がある患者、または全体で少なくとも１２のスライドがあり、少なくとも３つの新鮮なコアがある、ＩＨＣを行うために十分な未染色スライド（未染色の少なくとも３つのスライド）がある患者。
本実施例に記載の有効性拡大パートのペムブロリズマブとの併用療法コホート相に登録する患者の追加の組み入れ基準は、以下を含む：
－ 上皮起源の悪性腫瘍についてそのラベルに則ったペムブロリズマブの投与に適格である患者；および
－ ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）パラフィンブロックを得るためにスクリーニング期間中に得られた新鮮な腫瘍生検標本がある患者、または全体で少なくとも１２のスライドがあり、少なくとも３つの新鮮なコアがある、ＩＨＣを行うために十分な未染色スライド（未染色の少なくとも３つのスライド）がある患者。
除外基準
本実施例の臨床研究に登録する患者の除外基準は、以下を含む：
－ 次のものを含む無許可薬物との併用処置の患者：
○ 免疫療法、免疫抑制薬（アレルギー反応の短期処置またはｉｒＡＥの処置を除く化学療法または全身性コルチコステロイドを含む）、または他の実験的医薬製品。
・ 例外：
● 全身性ステロイドの（例えば、アレルギー反応のためのまたはｉｒＡＥの管理のための）短期投与は許可される。
● 全身性の作用がないまたは極小であるステロイド（局部性または吸入）は許可される；
○ ＨＥＲ２を標的とするＴＫＩ、またはＨＥＲ２もしくはＮＫＧ２Ｄを標的とする任意の組換え分子；
○ 成長因子（顆粒球コロニー刺激因子または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）。
・ 例外：
● エリスロポエチンおよびエリスロポエチンアナログは、研究責任医師の自由裁量で処方してもよい；
○ ビスホスホネートまたはデノスマブ処置は、許可されない。
・ 例外：ビスホスホネートまたはデノスマブは、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの初回投与を受けた日から１４日より前にそれを開始したのでなければ許可される。
－ ＨＥＲ２経路を特異的に標的とする薬物での処置を過去に受けたことがある患者。
・ 例外：ｍＡｂまたはチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、休薬期間（ｍＡｂまたはタンパク質治療薬については４週間、およびＴＫＩについては２週間）があることを条件に許容され得る；
－ 併用抗がん処置（例えば、細胞減少療法、放射線療法（姑息的骨指向性放射線療法を除く）、免疫療法、またはエリスロポエチンを除くサイトカイン療法）の患者、大手術（過去の診断的生検を除外する）を受けた患者、ステロイドもしくは他の免疫抑制剤との併用全身療法の患者、または研究処置の開始前２８日以内の治験薬の使用がある患者。全身性ステロイドの（例えば、アレルギー反応のためのまたはｉｒＡＥの管理のための）短期投与は許可される。ビスホスホネートを受けている患者は、適格であるが、ただし、処置がＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの初回投与の少なくとも１４日前に開始されたことを条件とする。
－ 過去３年以内に、皮膚の基底もしくは扁平上皮癌または子宮頸部上皮内癌を除く、本研究において調査される標的悪性腫瘍以外の過去の悪性疾患がある患者；
－ 急速進行性疾患がある患者；
－ 活動性中枢神経系（ＣＮＳ）転移、または中枢神経系（ＣＮＳ）の病歴がある患者；
－ 自家または同種異系間幹細胞移植を含む、何らかの臓器移植を受けたことがある患者；
－ 有意な急性または慢性感染症がある患者（スクリーニング期間中に検査した、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、または活動性もしくは潜在的Ｂ型肝炎、または活動性Ｃ型肝炎についての病歴検査陽性を含む）；
－ 過去３年以内に２８日を超えて全身性免疫抑制剤での処置を必要とした既存の自己免疫疾患（白斑患者を除く）、または臨床的に意義のある免疫不全（例えば、先天性ガンマグロブリン血症または先天性免疫不全）、または１日目から７日以内に発熱がある患者；
－ ｍＡｂに対する重度過敏性反応（≧グレード３ ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥ ｖ５．０）、アナフィラキシーの何らかの病歴、またはコントロールされていない喘息（例えば、ある程度コントロールされている喘息の３つまたはそれより多くの特徴）がある患者；
－ 過去の治療に関連する残留毒性＞グレード１ ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥ ｖ５．０の患者、しかし、脱毛症および感覚ニューロパチー≦グレード２は、許容され得る；
－ 研究中に妊娠または授乳する女性患者；
－ アルコールまたは薬物乱用がある患者；
－ 次のものを含むがそれだけに限らない重篤な心臓病または医学的状態の患者：
○ ニューヨーク心臓協会クラスＩＩＩまたはＩＶ心不全または収縮機能障害（ＬＶＥＦ＜５５％）の病歴；
○ 高リスクのコントロールされていない不整脈、すなわち、安静時に心拍数＞１００／分である頻拍；
○ 有意な心室性不整脈（心室頻拍）またはより悪性度の高いＡＶブロック（２度ＡＶブロック２型（モビッツ２）または３度ＡＶブロック）；
○ 抗狭心症薬を必要とする狭心症；
○ 臨床的に有意な心臓弁膜症；
○ ＥＣＧでの貫壁性梗塞の証拠；
○ コントロール不良の高血圧（収縮期＞１８０ｍｍＨｇまたは拡張期＞１００ｍｍＨｇによって定義される）；
○ 本研究への参加を制限し得る、研究責任医師の見解で臨床的に意義のあるコントロールされていない心リスク因子、臨床的に意義のある肺疾患または何らかの臨床的に意義のある医学的状態；
－ 研究責任医師の見解で、患者の参加能力を損なわせる可能性がある全ての他の有意な疾患（例えば、炎症性腸疾患）の患者；
－ インフォームドコンセントの理解または解釈を妨げる何らかの精神医学的状態の患者；
－ 法的能力がないまたは法的能力が制限されている患者；あるいは
－ インフォームドコンセント用紙（ＩＣＦ）および本プロトコールに列挙されている要件および制限の順守を含む、インフォームドコンセントにサインして提供することができない患者。
用量制限毒性（ＤＬＴ）
コホートごとに、安全性および耐容性を評価する。用量制限毒性（ＤＬＴ）を用量漸増パートに登録した患者およびペムブロリズマブ組合せコホートに登録した患者について最初の２１日間評価する。ＤＬＴは、用量漸増コホートのＤＬＴ評価期間に発生する、米国国立がん研究所－有害事象共通用語基準（ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥ）ｖ５．０に従って≧グレード３の薬物有害反応である。薬物有害反応は、研究責任医師および／または研究依頼者によってＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブに関連するのではないかと疑われる有害事象であり得る。ＤＬＴは、用量漸増パートに登録した患者およびペムブロリズマブ組合せコホートに登録した患者について処置から最初の２１日以内に起こる以下のうちのいずれかと定義する：
－ 次のものを除く、何らかのグレード３～４非血液学的毒性：
ｉ．最大限の内科的治療の非存在下で＜７２時間続くグレード３の悪心、嘔吐および下痢；
ｉｉ．最大限の内科的治療の非存在下で＜７２時間続くグレード４の嘔吐および下痢；
ｉｉｉ．＜５日のグレード３の疲労；
ｉｖ．最大限の内科的治療の非存在下でのグレード３の高血圧。
－ 次の血液学的毒性のいずれか：
ｉ．＞５日のグレード４の好中球減少；
ｉｉ．出血を伴うグレード３の血小板減少；
ｉｉｉ．グレード４の血小板減少。
－ および次のものを除く：
ｉ．研究責任医師によると研究処置に関連する可能性が低い、いずれの臨床症状を伴わない、および適切な医学的管理で７日以内に≦グレード１に回復する、正常範囲外の単一の検査値。
ＤＬＴの観察期間は、最大耐用量（ＭＴＤ）の決定のための用量漸増アルゴリズムの実行に使用するデータがある全ての患者の全ての用量コホートについての用量漸増パートにおける最初の３週間の治験医薬品での処置を含み得る。追加の患者を用量漸増相に登録してもよく、これらの患者は、収集された有害事象を有することがあり；必要に応じて、これらの患者には特定のＤＬＴ観察期間がないこともある。安全性監視委員会は、処置関連毒性が薬物に関連するものと見なす際に保守的なアプローチを採用し得る。処置に関連する重篤有害事象は、基礎疾患または一般に認められている併存症との明らかな関係が明白である場合を除いて、薬物に関連するものと見なされる。
安全性は、ベースラインの医学的状態、有害事象（ＡＥ）、バイタルサインおよび左室駆出率の決定を含む健康診断所見、心電図、ならびに検査室検査についての記録、報告および分析によって評価する。
投薬量および投与
Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブ用量漸増
用量レベルを試験参加時に患者ごとに割り当てる。用量レベルを必要に応じて体重変化に適応させる。次の用量レベルへの漸増の決定は、コホートの全ての患者が２１日目に到達した後（ＤＬＴ評価期間）の安全性評価に基づく。ある特定の実施形態では、患者には、２週間に１回、１時間（例えば、５０～７０分）にわたってＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブのＩＶ注入を投与する。Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの投薬量を、各薬物投与の前日または当日に判定される患者の体重に基づいて計算する。例示的な実施形態では、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの開始用量は、５．２×１０－５ｍｇ／ｋｇであり、最初の８用量レベル（ＤＬ）は、加速型の用量漸増デザインに従い、３．３倍以下の漸増ステップでの単一患者コホートからなる。ＤＬＴが観察された場合には、ＤＬＴが観察される用量レベルの患者をさらに５名集積して用量漸増を「３＋３」デザインに切り替える。
加速漸増相と同様に、用量漸増は、「３＋３」漸増相における用量レベル間の増加３．３倍以下で進行することになる。表３８は、漸増スキームの体重による開始用量（ｍｇ／ｋｇ）および用量レベル（ＤＬ）の概要を示す。
Figure 2022546454000086
例示的な実施形態では、患者３名を「３＋３」相の間に先ず所与の用量コホートに登録する。第１の患者を登録した後、第１の患者へのＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの２回目の注射から２日間経過後ただちに第２の患者を登録する。第２の患者へのＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの投与後、少なくとも４８時間の経過観察の後に、第３の患者にＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの初回投与を施す。注入反応、またはサイトカイン放出症候群、またはグレード３もしくはそれより高いグレードの処置関連毒性が、最初の患者３名の処置中に観察されない限り、処置開始間に事前に定義された間隔を一切とらずに、３名より多くの患者を、特定の用量コホートに（例えば、特定のコホートの最初の患者３名で観察されたＤＬＴの場合、または患者３名がＤＬ ７に登録した後）登録することができる。そのような場合、最初の患者３名のものと同じ事前に定義された間隔を繰り返す。ＤＬＴがこれらのいずれの患者においても観察されなかった場合には、研究は進行して追加の患者３名を、次の高さの用量のコホートに登録する。患者１名が特定の用量でＤＬＴを発症した場合、追加の患者３名をその同じ用量のコホートに登録する。特定の用量のコホートの患者６名のうちの１名より多くにおけるＤＬＴの発症は、ＭＴＤを超えたこと、およびさらなる用量漸増を追求しないことを示唆する（本実施例における用量制限毒性（ＤＬＴ）セクションを参照されたい）。
例示的な実施形態では、ＤＬ １０（１．６ｍｇ／ｋｇ）の安全性が、安全性監視委員会によって確証されたら、追加の患者１０名以下（ＤＬごとに患者合計１６名以下の）をＤＬ９で処置してそのＤＬでの安全性、ＰＫおよびＰＤデータベースを増加させるが、「３＋３」則に従ってＤＬ １１で集積を続行する。同様のプロセスをＤＬ １０～１３に適用する。安全性／ＰＫ／ＰＤ拡大コホート相における集積は、事前に定義された観察期間なしに進行し続ける。必須の腫瘍生検を、スクリーニング時に（初回の治験医薬品の前３０日以内に）、および６回目の治験医薬品投与前１～７日以内に行う。安全性情報をこれらの患者の処置中に生成し、安全性監視委員会に伝える。同じプロセスを安全性／ＰＫ／ＰＤ拡大コホートの後続のＤＬについて実行する。
有効性拡大コホート投薬量
本実施例において前に述べたように、４つの有効性拡大コホート：ＵＢＣコホート；ＭＢＣコホート；確立されたまたは承認された治療からなる少なくとも１つのファーストライン処置を受けている、ＨＥＲ２を高度に発現する固形腫瘍を有する患者を有するバスケット型（ＨＥＲ２ ３＋）コホート；およびペムブロリズマブとの併用療法コホートがある。これらのコホートにおける集積を以下のように開始する：
－ ３つの単剤療法コホートを、最初の３つのコホート（ＵＢＣ、ＭＢＣ、およびバスケット型（ＨＥＲ２ ３＋））におけるＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの用量決定およびスケジュール決定後に開始する
－ ＤＬ１１の安全性が安全性監視委員会によって確証されたら、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブとペムブロリズマブの組合せについての安全性導入期間の集積を開始する。ペムブロリズマブと組み合わせるＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの用量は、ペムブロリズマブとの組合せで試験する前の、単剤療法としてのＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブでの「３＋３」用量漸増中に、安全と断定される（用量漸増中に後続のＤＬが安全なものとして安全性監視委員会による承認を受ける）。
最初の３つの有効性拡大コホートでは、患者にＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブを単剤療法として投与する。患者４０名以下をこれら３つの拡大コホートの各々に登録することができ、各コホート内の最初の患者２０名を少なくとも３カ月間観察した後、無益性解析を行う。必須の腫瘍生検を、スクリーニング時に（初回の治験医薬品の前３０日以内に）、および６回目の治験医薬品投与前１～７日以内に行う。
ペムブロリズマブとの併用療法の有効性拡大コホートでは、患者に、３週間処置サイクルで、ＤＬ １０のＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブ（１時間ＩＶ注入として）および２００ｍｇの承認用量のペムブロリズマブ（３０分ＩＶ注入として）を投与する。この安全性導入期間を行った後に、前に説明したのと同じ「３＋３」デザインが続く。この研究における患者は、「組み入れ基準」セクションで説明した患者の組み入れ基準を満たす。
有効性拡大コホート（Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブ単剤療法コホート）中の安全性：参加患者からの全ての安全性情報は、安全性監視委員会によって継続的にモニターされる。例示的な実施形態では、患者２０名の群を登録し、４週間、安全性監視委員会が経過観察する。その後、患者４０名を処置して少なくとも４週間経過観察した後４週間以内に、上記の安全審査が行われる。次いで、同様のプロセスを実行し、毎回、患者４０名を登録し、少なくとも４週間経過観察する。
有効性拡大コホート（ペムブロリズマブとＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの併用療法コホート）中の安全性：参加患者からの全ての安全性情報は、「３＋３」用量漸増パートについて説明したのと同様に安全性監視委員会によって継続的にモニターされる。患者ごとに、安全性および耐容性データを安全性監視委員会が２１日ＤＬＴ評価期間にわたって審査し、さらなる用量投与への進行は、安全性監視委員会に依存する。併用処置が進行しても安全である場合（安全性監視委員会の決定に従って）、患者２０名の群を登録し、３週間経過観察する。
評価項目
本研究を、主要および副次的評価項目を評価して、局所進行または転移性固形腫瘍を有する患者の処置としての、必要に応じてペムブロリズマブと組み合わせた、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの臨床的利益を評価するように設計する。
主要評価項目および主要評価項目の分析
処置の最初の３週間の間のＤＬＴの発生を、用量漸増パートにおける主要評価項目として測定する。最大耐用量（ＭＴＤ）は、用量漸増パート中に決定し、処置した患者６名のうちのわずか１名の患者しかＤＬＴ事象を経験しない最高用量レベル（ＤＬ）と定義する。最大耐用量は、用量漸増パートからの個々の患者データによって決定する。加えて、最終的な統計解析のために、以下のことを解析することができる：
－ 各用量レベルでの、第１のＤＬＴ評価期間中にＤＬＴを経験するＤＬＴ集団内の患者の数および比率；
－ 各用量レベルでの、第１のＤＬＴ評価期間中にＤＬＴ集団内の患者が経験する治療創発的有害事象の数および比率。
独立評価項目審査委員会（ＩＥＲＣ）によって裁定されたｍＲＥＣＩＳＴ １．１に則った確定全奏効率を、有効性拡大コホートについての主要評価項目として測定する。全奏効率は、確定のための以下の要件を考慮に入れて、試験処置の開始後、疾患進行を立証するまでの全ての腫瘍評価のための来診中に得られる、最良効果と定義する。完全奏効および部分奏効については、ｍＲＥＣＩＳＴ １．１に従って奏効を確定する必要がある。定期的に予定された６週間の評価間隔で、しかし、完全奏効または部分奏効の最初の立証から４週間経過後ただちに、確定を評価することができる。部分奏効の確定は、部分奏効の最初の立証後の次の評価よりも後の評価で確定することができる。
安定疾患の最良総合効果は、安定疾患の総合効果が研究処置の開始後少なくとも３７日の時点で判定されることを必要とし得る。各々の予定された腫瘍評価時の効果、および最良総合効果を、患者ごとに列挙する。
副次的評価項目および副次的評価項目の分析
本研究の副次的評価項目は、以下を含み得る：
－ ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥ ｖ５．０による全ての用量群／適応症についての治療創発的有害事象の数、重症度および継続期間；
－ ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥ ｖ５．０による治療関連有害事象の数、重症度および継続期間；
－ 研究責任医師の評価に則った、ｍＲＥＣＩＳＴ １．１による奏効期間；
－ 薬物動態プロファイル；
－ 研究責任医師の評価に則った、ｍＲＥＣＩＳＴ １．１による最良総合効果；
－ 研究責任医師の評価に則った、ｍＲＥＣＩＳＴ １．１による無増悪生存；
－ 全生存期間；
－ 進行性疾患プロファイル；
－ 抗Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブ抗体の血清力価；
－ 腫瘍組織上でのＨＥＲ２の発現；
－ ＥＲＢＢ２ステータス（増幅した／増幅していない、変異した／変異していない）；
－ ｍＲＥＣＩＳＴ １．１による１３週目における未確定効果（安全性／ＰＫ／ＰＤ拡大コホートについて）；
－ ＩＥＲＣによる、ｍＲＥＣＩＳＴ １．１による無憎悪生存期間；ＩＥＲＣによる、ｍＲＥＣＩＳＴ １．１による奏効期間（有効性拡大コホートについて）。
有効性パラメーター：拡大パートにおける主要有効性パラメーターは、ｍＲＥＣＩＳＴ １．１による最良総合効果である。研究責任医師評価に則ったＯＲＲを、ｍＲＥＣＩＳＴ １に従って決定することになる。全奏効率を全試験期間にわたって評価する。部分奏効および完全奏効の最良総合効果については、ｍＲＥＣＩＳＴ １．１による効果の確定が必要である。各々の予定された腫瘍評価時の効果、および最良総合効果を、患者ごとに列挙する。全奏効率（完全奏効＋部分奏効と定義した）の数値および比率をコホートごとに作表する。ＨＥＲ２ ｈｉｇｈバスケット型コホートについては、全相効率の数値および比率を、登録して４週間処置した患者が５名より多い各腫瘍型について作表する。患者５名未満（患者１名～患者４名）によって示される腫瘍型を、１つの下位群として示す。ｍＲＥＣＩＳＴ １．１による奏効期間を拡大コホート内の確定効果を有する患者ごとに計算し、全てのコホートにおいてカプラン－マイヤー法を使用して解析する。無増悪生存期間および全生存期間を患者リストで提示し、全予定数の患者を登録した拡大コホートのフルアナリシスセットにおいてカプラン－マイヤー法を使用して解析する。
薬物動態プロファイル：Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブの血清濃度を、妥当性が確認されている方法によって判定する。以下のＰＫパラメーターを推定し、報告する：
－ ＡＵＣ０→ｔ：投与時から最終観察時までの濃度－時間曲線下面積（線形台形総和によって計算する）；
－ ● ＡＵＣ０→∞：無限大に外挿した投与時間からの曲線下面積（線形台形総和によって計算し、Ｃｌａｓｔ／λｚを使用して無限大に外挿する）；
－ λｚ：終末消失速度定数。λｚの値は、次の制約を加えて時間に対するｌｏｇ（濃度）の回帰直線の傾きから決定する：（ｉ）少なくとも３つの連続した測定可能な濃度がなければならない、（ｉｉ）全ての濃度が時間と共に低下しなければならない、および（ｉｉｉ）回帰の相関係数（ｒ）が≧０．９５でなければならない；
－ Ｃｍａｘ：投与後に観察される最大血清濃度；
－ ｔｍａｘ：Ｃｍａｘが生じるとき；ならびに
－ ｔ１／２：０．６９３／λｚとして決定される推定半減期。
ＰＫパラメーターを、記述統計を使用して要約する。個々の濃度－時間プロットはもちろん平均濃度－時間プロットも描示する。解析の一貫性が影響を受ける場合には未解明の欠測データを補完してもよい。保守的な原則をデータの補完に使用する。
抗薬物抗体の血清力価：安全性免疫原性試験戦略を、以下に従って実行および実施する：
－ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Guideline on Immunogenicity Assessment of Therapeutic Proteins. 18 May 2017 EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006 Rev 1 Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP)；European Medicines Agencyを参照されたい）；
－ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｍＡｂｓ ｉｎｔｅｎｄｅｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ（Guideline on Immunogenicity Assessment of Monoclonal Antibodies Intended for In Vivo Clinical Use. 24 May 2012 EMA/CHMP/BMWP/86289/2010 Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP)；European Medicines Agencyを参照されたい）；
－ ＦＤＡ（２００９，草案）Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ。
ヒト血清中の過剰な薬物の存在下で抗薬物（すなわち、抗Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブ）抗体を検出するために酸解離ステップを使用する適格な方法を適用する。酸処理後に薬物を除去する必要はない。陽性試料のＡＤＡ力価を判定する。
バイオマーカー：バイオマーカーの要約統計量を、あらかじめ計画した全ての時点について、ＤＬまたはコホートごとに別々に提供する。ベースラインレベルへの変化を、該当する場合には提示する。経時的なプロファイルを患者ごとに示す。
安全性分析：Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブへの曝露の程度を、期間（週数）、投与数、蓄積用量（ｍｇ／ｋｇ）、用量強度（ｍｇ／ｋｇ／週）、相対用量強度（投与した実際の用量／計画した用量）、用量低減の数、および投与遅延の数によって特徴付ける。安全性分析は、安全性解析対象集団で行う。記述統計を使用してＤＬおよびコホートごとに安全性評価項目を作表する。安全性評価は、特に関心のある有害事象、薬物有害反応、ならびにバイタルサイン、心電図、体重および検査値（血液学および血清化学）の変化を含む、有害事象の発生の審査に基づく。オントリートメント期間は、研究処置の初回投与から、研究処置の最終投与＋３０日または新たな抗がん療法の最初の日付－１日のいずれか早いほうまでの期間と定義する。
有害事象（ＡＥ）：有害事象をＭｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ（ＭｅｄＤＲＡ）に従ってコード化する。ＡＥの重症度にＮＣＩ－ＣＴＣＡＥ ｖ５．０毒性グレード付け尺度を使用してグレードを付ける。治療創発的有害事象（ＴＥＡＥ）は、オントリートメント期間中の開始日のＡＥ、またはオントリートメント期間中に事象の増悪があった場合のＡＥである。原因を問わないＴＥＡＥの発生およびＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブに関連する可能性があるものと定義されるＡＥの発生を、基本語および器官別大分類によって要約し、強度およびＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－トラスツズマブとの関係に関して記載する。全ての時期尚早の／恒久的中止を、研究離脱についての主な理由ごとに要約する。ＴＥＡＥの継続期間は、開始とベースラインまでの解消との間の時間と定義する。グレード３および４の継続期間は、特定のＴＥＡＥがその過程でグレード３または４の重症度に達する期間によって定義する。用量に関連するＡＤＲを示すために記述統計を調査する。
検査変数：検査結果をＮＣＩ－ＣＴＣＡＥに従ってグレードによって分類する。初回試験処置後に最も悪いオントライアルグレードを要約する。初回処置から最高グレードへの毒性グレード付けの変化を示す。ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥの一部でない変数についての結果を、正常範囲未満、それ以内、またはそれより上として提示する。ベースライン後の検査値を有する患者のみをこの解析に含める。
ＰＥ（バイタルサイン、１２誘導心電図、および経胸壁心エコー検査（ＴＴ－ＥＣＨＯ）／ＭＵＧＡを含む）：バイタルサイン（体温、呼吸数、心拍数および血圧）および１２誘導ＥＣＧを含む、ＰＥデータを記録する。
参照による組込み
本明細書で参照される特許文献および科学論文の各々の全開示を、全ての目的について参照により組み込む。
均等物
本開示を、その趣旨または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で実施することができる。したがって、上記の実施形態は、全ての点において、本明細書に記載の本開示を限定するものではなく、実例であると考えられるべきである。異なる実施形態のさまざまな構造要素および開示したさまざまな方法ステップをさまざまな組合せおよび順列で用いることができ、全てのそのような変形形態が、本開示の考えられる形態となる。したがって、本開示の範囲は、上記の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示すものであり、特許請求の範囲と均等の意味および範囲に入る全ての変更は、本特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (107)

  1. （ａ）（ｉ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ、
    （ｉｉ）ＨＥＲ２に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、および
    （ｉｉｉ）抗体Ｆｃドメイン
    を含む多重特異性結合タンパク質と；
    （ｂ）ヒスチジンと；
    （ｃ）糖または糖アルコールと；
    （ｄ）ポリソルベートと
    を含む、ｐＨ５．５～６．５の医薬製剤。
  2. 前記医薬製剤中のヒスチジンの濃度が、１０～２５ｍＭである、請求項１に記載の医薬製剤。
  3. 前記医薬製剤中のヒスチジンの濃度が、約２０ｍＭである、請求項２に記載の医薬製剤。
  4. 前記糖または糖アルコールが、二糖である、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  5. 前記二糖が、スクロースである、請求項４に記載の医薬製剤。
  6. 前記糖または糖アルコールが、単糖に由来する糖アルコールである、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  7. 単糖に由来する前記糖アルコールが、ソルビトールである、請求項６に記載の医薬製剤。
  8. 前記医薬製剤中の前記糖または糖アルコールの濃度が、２００～３００ｍＭである、請求項４から７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  9. 前記医薬製剤中の前記糖または糖アルコールの濃度が、約２５０ｍＭである、請求項８に記載の医薬製剤。
  10. 前記ポリソルベートが、ポリソルベート８０である、請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  11. 前記医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度が、０．００５％～０．０５％である、請求項１０に記載の医薬製剤。
  12. 前記医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度が、約０．０１％である、請求項１１に記載の医薬製剤。
  13. ＮａＣｌがある場合その濃度が、前記医薬製剤中、約１０ｍＭまたはそれ未満である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  14. ＮａＣｌがある場合その濃度が、前記医薬製剤中、約１ｍＭまたはそれ未満である、請求項１３に記載の医薬製剤。
  15. 前記ｐＨが、５．８～６．２である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  16. 前記ｐＨが、５．９５～６．０５である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  17. 前記Ｆａｂが、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、
    （ａ）前記重鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１６８、９６および１８８のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含み、
    （ｂ）前記軽鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、
    請求項１から１６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  18. （ａ）前記重鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１６８、９６および１６９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、
    （ｂ）前記軽鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、
    請求項１７に記載の医薬製剤。
  19. 前記Ｆａｂの前記重鎖可変ドメインが、配列番号９４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  20. 前記Ｆａｂの前記重鎖可変ドメインが、配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  21. 前記ｓｃＦｖが、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、
    （ａ）前記重鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１１５、１１６および１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、
    （ｂ）前記軽鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１１９、１２０および１２１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、
    請求項１から２０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  22. 前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、配列番号１９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１９６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の医薬製剤。
  23. 前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、配列番号１９５のアミノ酸配列を含み、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む、請求項２１または２２に記載の医薬製剤。
  24. 前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、フレキシブルリンカーを介して前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインに連結している、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  25. 前記フレキシブルリンカーが、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の医薬製剤。
  26. 前記フレキシブルリンカーが、配列番号１４３のアミノ酸配列からなる、請求項２４または２５に記載の医薬製剤。
  27. 前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  28. 前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  29. 前記ジスルフィド架橋が、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される、請求項２８に記載の医薬製剤。
  30. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  31. 前記抗体Ｆｃドメインが、前記Ｆａｂに連結した第１の抗体Ｆｃ配列と、前記ｓｃＦｖに連結した第２の抗体Ｆｃ配列とを含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  32. 前記第１の抗体Ｆｃ配列が、前記Ｆａｂの重鎖部分に連結している、請求項３１に記載の医薬製剤。
  33. 前記ｓｃＦｖが、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して前記第２の抗体Ｆｃ配列に連結している、請求項３１または３２に記載の医薬製剤。
  34. 前記第１および第２の抗体Ｆｃ配列が、各々、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  35. 前記第１および第２の抗体Ｆｃ配列が、各々、野生型ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の医薬製剤。
  36. 前記第１および第２の抗体Ｆｃ配列が、ヘテロ二量体化を促進する異なる変異を含む、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  37. 前記第１の抗体Ｆｃ配列が、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列である、請求項３６に記載の医薬製剤。
  38. 前記第２の抗体Ｆｃ配列が、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列である、請求項３６または３７に記載の医薬製剤。
  39. 前記多重特異性結合タンパク質が、
    （ａ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
    （ｂ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および
    （ｃ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
    を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  40. 前記医薬製剤中の前記多重特異性結合タンパク質の濃度が、約１０～約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項１から３９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  41. 前記多重特異性結合タンパク質の９４％より多くが、５０℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、未変性コンフォメーションを有する、請求項１から４０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  42. 前記多重特異性結合タンパク質の４％未満が、５０℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、高分子量複合体を形成している、請求項１から４１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  43. がんの処置に使用するための、請求項１から４２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  44. 前記使用の前に０．９％ＮａＣｌ溶液で希釈される、請求項４３に記載の医薬製剤。
  45. がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、最初の４週間処置サイクルにおいて１日目、８日目および１５日目に多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含み、前記多重特異性結合タンパク質が、
    （ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ；
    （ｂ）ＨＥＲ２に結合するｓｃＦｖ；および
    （ｃ）抗体Ｆｃドメイン
    を含む、方法。
  46. 前記対象に、前記最初の処置サイクルの後、１または複数の後続の４週間処置サイクルにおいて前記多重特異性結合タンパク質を投与するステップをさらに含み、前記多重特異性結合タンパク質が、各々の後続の処置サイクルにおいて１日目および１５日目に投与される、請求項４５に記載の方法。
  47. 用量の各々が、前記多重特異性結合タンパク質を、５．２×１０－５ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－４ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－４ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－３ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－３ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－２ｍｇ／ｋｇ、５．２×１０－２ｍｇ／ｋｇ、１．６×１０－１ｍｇ／ｋｇ、０．５２ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、５．２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量で含む、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記多重特異性結合タンパク質が、静脈内注入によって投与される、請求項４５から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記多重特異性結合タンパク質が、単剤療法として使用される、請求項４５から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記対象に抗ＰＤ－１抗体を投与するステップをさらに含む、請求項４５から４８のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記抗ＰＤ－１抗体が、ペムブロリズマブである、請求項５０に記載の方法。
  52. ２００ｍｇのペムブロリズマブが、前記最初の処置サイクルの１日目に投与される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記対象が１または複数の後続の処置サイクルを受ける場合、２００ｍｇのペムブロリズマブが、前記後続の処置サイクルにおいて３週間に１回投与される、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 前記がんが、免疫組織化学的検査によって判定して、ＨＥＲ２陽性である、請求項４５から５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記がんにおけるＨＥＲ２レベルが、免疫組織化学的検査によって判定して、少なくとも１＋とスコア付けされる、請求項４５から５３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記がんにおける前記ＨＥＲ２レベルが、２＋または３＋とスコア付けされる、請求項５４または５５に記載の方法。
  57. 前記がんにおける前記ＨＥＲ２レベルが、３＋とスコア付けされる、請求項５４または５５に記載の方法。
  58. 前記がんが、ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅を有する、請求項４５から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. ＥＲＢＢ２遺伝子増幅が、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって判定される、請求項５８に記載の方法。
  60. ＥＲＢＢ２遺伝子増幅が、ＤＮＡ配列決定によって判定される、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記がんが、固形腫瘍である、請求項４５から６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記がんが、局所進行または転移性固形腫瘍である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記がんが、尿路上皮膀胱がんまたは転移性乳がんである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記がんが、胃がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部がん、胆道がん、神経膠芽腫、肉腫、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、食道がん、皮膚の扁平上皮癌、前立腺がん、唾液腺癌、乳がん、膵臓がん、および胆嚢がんからなる群から選択される、請求項６１または６２に記載の方法。
  65. 前記Ｆａｂが、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、
    （ａ）前記重鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１６８、９６および１８８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、
    （ｂ）前記軽鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、
    請求項４５から６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. （ａ）前記重鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１６８、９６および１６９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、
    （ｂ）前記軽鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、
    請求項６５に記載の方法。
  67. 前記Ｆａｂの前記重鎖可変ドメインが、配列番号９４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４５から６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記Ｆａｂの前記重鎖可変ドメインが、配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含む、請求項４５から６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記ｓｃＦｖが、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、
    （ａ）前記重鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１１５、１１６および１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、
    （ｂ）前記軽鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１１９、１２０および１２１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、
    請求項４５から６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、配列番号１９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１９６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、配列番号１９５のアミノ酸配列を含み、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む、請求項６９または７０に記載の方法。
  72. 前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、フレキシブルリンカーを介して前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインに連結している、請求項６９から７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記フレキシブルリンカーが、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記フレキシブルリンカーが、配列番号１４３のアミノ酸配列からなる、請求項７２または７３に記載の方法。
  75. 前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、請求項６９から７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項６９から７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ジスルフィド架橋が、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、請求項６９～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記抗体Ｆｃドメインが、前記Ｆａｂに連結した第１の抗体Ｆｃ配列と、前記ｓｃＦｖに連結した第２の抗体Ｆｃ配列とを含む、請求項４５から７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記第１の抗体Ｆｃ配列が、前記Ｆａｂの重鎖部分に連結している、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記ｓｃＦｖが、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して前記第２の抗体Ｆｃ配列に連結している、請求項７９または８０に記載の方法。
  82. 前記第１および第２の抗体Ｆｃ配列が、各々、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、請求項７９から８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記第１および第２の抗体Ｆｃ配列が、各々、野生型ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記第１および第２の抗体Ｆｃ配列が、ヘテロ二量体化を促進する異なる変異を含む、請求項７９から８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記第１の抗体Ｆｃ配列が、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列である、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記第２の抗体Ｆｃ配列が、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列である、請求項８４または８５に記載の方法。
  87. 前記多重特異性結合タンパク質が、
    （ａ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
    （ｂ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および
    （ｃ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
    を含む、請求項４５から８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記多重特異性結合タンパク質が、ヒスチジンと糖または糖アルコールとポリソルベートとを含む、ｐＨ５．５～６．５の医薬製剤中にある、請求項４５から８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記医薬製剤中のヒスチジンの濃度が、１０～２５ｍＭである、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記医薬製剤中のヒスチジンの濃度が、約２０ｍＭである、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記医薬製剤中の前記糖または糖アルコールが、二糖である、請求項８８から９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記二糖が、スクロースである、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記医薬製剤中の前記糖または糖アルコールが、単糖に由来する糖アルコールである、請求項８８から９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 単糖に由来する前記糖アルコールが、ソルビトールである、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記医薬製剤中の前記糖または糖アルコールの濃度が、２００～３００ｍＭである、請求項８８から９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記医薬製剤中の前記糖または糖アルコールの濃度が、約２５０ｍＭである、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記医薬製剤中の前記ポリソルベートが、ポリソルベート８０である、請求項８８から９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度が、０．００５％～０．０５％である、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度が、約０．０１％である、請求項９８に記載の方法。
  100. ＮａＣｌがある場合その濃度が、前記医薬製剤中、約１０ｍＭまたはそれ未満である、請求項８８から９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. ＮａＣｌがある場合その濃度が、前記医薬製剤中、約１ｍＭまたはそれ未満である、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記医薬製剤の前記ｐＨが、５．８～６．２である、請求項８８から１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記医薬製剤の前記ｐＨが、５．９５～６．０５である、請求項８８から１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記医薬製剤中の前記多重特異性結合タンパク質の濃度が、約１０～約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項８８から１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記医薬製剤中の前記多重特異性結合タンパク質の９４％より多くが、５０℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、未変性コンフォメーションを有する、請求項８８から１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記医薬製剤中の前記多重特異性結合タンパク質の４％未満が、５０℃で３週間のインキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定して、高分子量複合体を形成している、請求項８８から１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記医薬製剤が、それを必要とする対象に投与する前に０．９％ＮａＣｌ溶液で希釈される、請求項８８から１０６のいずれか一項に記載の方法。
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