ES2549485T3 - Un complejo de anticuerpo biespecífico y digoxigenina conjugada a un agente terapéutico o de diagnóstico - Google Patents

Un complejo de anticuerpo biespecífico y digoxigenina conjugada a un agente terapéutico o de diagnóstico Download PDF

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Werner Scheuer
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Abstract

Un complejo de a) un anticuerpo biespecífico específico contra digoxigenina y una proteína diana, que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana, y b) digoxigenina, en el que la digoxigenina está conjugada a un agente terapéutico o de diagnóstico seleccionado del grupo que consiste en un péptido, un compuesto pequeño, un compuesto pequeño radiactivamente marcado y un reactivo de obtención de imágenes, en el que dicho sitio de unión al antígeno que se une específicamente a digoxigenina comprende como dominio variable de la cadena pesada SEQ ID NO. 3 con las mutaciones S49A, I57A y A60P, y como dominio variable de la cadena ligera SEQ ID NO. 5.

Description

Un complejo de anticuerpo biespecífico y digoxigenina conjugada a un agente terapéutico o de diagnóstico
5 Campo de la invención
La presente invención se refiere a complejos de a) anticuerpos biespecíficos y fragmentos de anticuerpos contra una proteína diana y b) una digoxigenina conjugada a un agente terapéutico o de diagnóstico, métodos para su producción, su uso como plataforma de administración para agentes terapéuticos o de diagnóstico, composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos, y usos de los mismos.
Antecedentes de la invención
La medicina molecular requiere agentes que interaccionen específica y eficazmente con células diana. La eficaz
15 administración in vivo de agentes terapéuticos o de diagnóstico funcionales a un tejido o célula diana todavía sigue siendo uno de los mayores obstáculos en el desarrollo de fármacos. Un enfoque es acoplar las cargas a un vehículo de administración que se dirige específicamente a células, por ejemplo, a un anticuerpo. Las cargas deben acoplarse con buena estabilidad para asegurar el direccionamiento específico y evitar la liberación no específica sistémica de la carga. Sin embargo, para permitir la entrada en la célula, la carga se libera idealmente en o dentro de células diana. Combinar la buena estabilidad dentro de la circulación con la liberación eficaz en la diana es un cuello de botella importante en el desarrollo de conjugados. La mayoría de los conjugados del estado de la técnica no consisten en un tipo de molécula definida, sino que son una mezcla de moléculas con diferentes cantidades de cargas acopladas en posiciones variables. Un inconveniente importante de estos conjugados es que los procedimientos de conjugación necesitan adaptarse a cada anticuerpo y cada carga; por tanto, las cargas no pueden
25 intercambiarse fácilmente, también el enlace covalente puede producir inmunogenicidad.
Se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de anticuerpos recombinantes en el pasado reciente, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos tetravalentes por fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios monocatenarios (véase, por ejemplo, Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163; documento WO 2001/077342; y Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234). También se han desarrollado varios otros formatos nuevos en los que la estructura central del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) ya no es retenida tal como dia-, tria-o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos monocatenarios (scFv, Bis-scFv), que pueden unirse a dos o más antígenos (Holliger P, et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126 -1136; Fischer N., Leger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen J, et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C. et al., Nature Biotech. 25
35 (2007) 1290-1297).
Los anticuerpos biespecíficos son capaces de unirse simultáneamente a dos dianas diferentes y así también de administrar una gran variedad de cargas a los tejidos o células diana. Hasta la fecha se han descrito anticuerpos biespecíficos específicos para ciertas dianas de células. Sin embargo, esta metodología tiene una desventaja importante, ya que requiere que los anticuerpos se produzcan contra cada agente deseado para uso de diagnóstico y terapéutico. El documento WO2005/004809 divulga anticuerpos biespecíficos que se unen a DTPA y CEA o CD20.
El documento US 7.429.381 divulga un método de direccionamiento previo de dos etapas, en el que un anticuerpo biespecífico específico para un hapteno de HSG y una proteína de la superficie celular se administra primero a la
45 célula y a continuación se usa para capturar un hapteno de HSG con el que está quelado un catión terapéutico o de diagnóstico o un agente terapéutico o de diagnóstico. Los haptenos son moléculas pequeñas, tales como pesticidas, fármacos, hormonas y toxinas, que son normalmente no inmunogénicas, a menos que se acoplen a algunas macromoléculas tales como proteínas. Sin embargo, el uso de anticuerpos anti-hapteno de HSG biespecíficos en un método de direccionamiento previo de dos etapas tiene varias limitaciones.
La principal desventaja es la complejidad del enfoque, que implica la preparación y dosificación de dos reactivos separados y las consiguientes cuestiones de momento preciso y relación. Además, no es posible analizar el complejo resultante del anticuerpo biespecífico y el agente terapéutico o de diagnóstico. Por tanto, es difícil predecir propiedades farmacológicas, estequiometría y posibles productos de degradación del agente terapéutico o de
55 diagnóstico capturado por el anticuerpo biespecífico.
Además, los conjugados actualmente usados no pueden aplicarse a la mayoría de los agentes terapéuticos, ya que la conjugación frecuentemente produce actividad reducida o eliminada del agente terapéutico o alteraciones no deseadas de las capacidades de unión del anticuerpo.
Por tanto, existe la necesidad de una plataforma de administración bien definida, eficaz y específica para agentes terapéuticos y de diagnóstico con liberación eficaz de la carga en la diana que puedan aplicarse ampliamente.
Sumario de la invención
65 La presente invención se refiere a un complejo de
a) un anticuerpo biespecífico específico contra digoxigenina y una proteína diana, que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana, y
5 b) digoxigenina, en el que la digoxigenina está conjugada a un agente terapéutico o de diagnóstico seleccionado del grupo que consiste en un péptido, un compuesto pequeño, un compuesto pequeño radiactivamente marcado y un reactivo de obtención de imágenes, en el que dicho sitio de unión al antígeno que se une específicamente a digoxigenina comprende como dominio variable de la cadena pesada SEQ ID NO. 3 con las mutaciones S49A, I57A y A60P, y como dominio variable de la cadena ligera SEQ ID NO. 5.
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza porque comprende
a) un anticuerpo bivalente monoespecífico que consiste en dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud
15 completa y dos cadenas ligeras del anticuerpo de longitud completa, por lo que cada cadena comprende solo un dominio variable,
b) dos conectores de péptido,
c) dos anticuerpos monocatenarios monovalentes monoespecíficos que consisten cada uno en un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo y un conector monocatenario entre dicho dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y dicho dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo;
25 En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza porque el anticuerpo está humanizado.
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza porque la proteína diana es un antígeno de la superficie celular. Preferentemente, el antígeno de la superficie celular es un antígeno de tumor. En una realización, la proteína diana es Her2. En una realización, la proteína diana es IGF1R. En una realización, la proteína diana es CD22.
En una realización, el complejo se caracteriza porque el agente terapéutico o de diagnóstico es un péptido.
En una realización, el complejo se caracteriza porque el agente terapéutico o de diagnóstico es un compuesto pequeño.
35 En una realización, el complejo se caracteriza porque el compuesto pequeño está radiactivamente marcado.
En una realización, el complejo se caracteriza porque el agente terapéutico o de diagnóstico es un reactivo de obtención de imágenes.
Otra realización de la invención es el complejo según la invención para su uso en la administración de un agente terapéutico o de diagnóstico a una célula o tejido diana.
Otra realización de la invención es el complejo según la invención para su uso en terapia contra el cáncer dirigida.
45 Otra realización de la invención es el complejo según la invención para su uso en radioterapia dirigida.
Otra realización de la invención es el complejo según la invención para su uso en terapia contra el cáncer dirigida.
Otra realización de la invención es el complejo según la invención para su uso en radioterapia dirigida.
Otra realización de la invención es el uso del complejo según la invención para la fabricación de un medicamento para terapia contra el cáncer dirigida.
55 Otra realización de la invención es el uso del complejo según la invención para la fabricación de un medicamento para radioterapia dirigida.
Otra realización de la invención es el complejo según la invención para su uso en obtención de imágenes de células
o tejidos.
Otra realización de la invención es una composición que comprende el complejo según la invención. En una realización la composición es una composición de diagnóstico. En una realización la composición es una composición farmacéutica.
65 Otra realización de la invención es el uso de la composición farmacéutica en terapia contra el cáncer dirigida.
Otra realización de la invención es el uso de la composición farmacéutica en radioterapia dirigida.
Descripción detallada de la invención
5 La invención proporciona métodos para producir los anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos, además de métodos para usarlos, en particular su uso como plataforma de administración para agentes terapéuticos y de diagnóstico, además de composiciones farmacéuticas y herramientas de diagnóstico que comprenden dichos anticuerpos.
Realizaciones preferidas incluyen anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos contra una proteína diana y digoxigenina, que comprenden un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina (denominado “Dig” o “DIG”) y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana. Dichos sitios de unión de los anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos se denominan “<proteína diana>” (o brevemente, “<diana>”) y “<Dig>”, respectivamente.
15 Adicionalmente, la presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos monoclonales y fragmentos de anticuerpos que comprenden un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana, codificando los ADN tales anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y vectores para expresar los ADN. Preferentemente, dichos anticuerpos biespecíficos son anticuerpos humanizados y quiméricos.
Una realización de la presente invención es un anticuerpo biespecífico que se une a digoxigenina y una proteína diana que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana, que comprende
25 a) un anticuerpo bivalente monoespecífico que consiste en dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa y dos cadenas ligeras del anticuerpo de longitud completa, por lo que cada cadena comprende solo un dominio variable,
b) dos conectores de péptido,
c) dos anticuerpos monocatenarios monovalentes monoespecíficos que consisten cada uno en un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo y un conector monocatenario entre dicho dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y dicho dominio variable de la
35 cadena ligera del anticuerpo;
y preferentemente dichos anticuerpos monocatenarios están ligados al mismo extremo (extremo C y N) de las cadenas pesadas del anticuerpo bivalente monoespecífico o, alternativamente al mismo extremo (preferentemente el extremo C) de las cadenas ligeras del anticuerpo bivalente monoespecífico, y más preferentemente al mismo extremo (extremo C y N) de las cadenas pesadas del anticuerpo bivalente monoespecífico.
En una realización, dicho anticuerpo bivalente monoespecífico parental bajo a) es un anticuerpo humano, preferentemente, un anticuerpo humano recombinante.
45 Preferentemente, dichos conectores de péptido bajo b) son péptidos con una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 10 aminoácidos. En una realización, dicho conector de péptido es (GxS)n con G = glicina, S = serina (x = 3 y n = 3, 4, 5 o 6) o (x= 4 y n = 2, 3, 4 o 5), preferentemente x= 4 y n = 2 o 3, más preferentemente con x = 4, n = 2.
Preferentemente, dicho conector monocatenario bajo c) es un péptido con una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 15 aminoácidos, más preferentemente con una longitud de al menos 20 aminoácidos. En una realización, dicho conector monocatenario es (GxS)n con G = glicina, S = serina, (x = 3 y n = 4, 5 o 6) o (x = 4 y n = 3, 4 o 5), preferentemente con x = 4, n = 4 o 5, más preferentemente con x = 4, n = 4.
55 Preferentemente, dichos dos anticuerpos monocatenarios monovalentes monoespecíficos bajo c) comprenden un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO. 3 con las mutaciones S49A, I57A y A60P, y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO. 5, y un conector monocatenario entre dicho dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y dicho dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo. Preferentemente, dichos dos anticuerpos monocatenarios monovalentes monoespecíficos bajo c) comprenden como fragmento Fd de la cadena pesada (VH y CH1) SEQ ID NO. 36 y como cadena L SEQ ID NO. 6.
En una realización de la invención, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza porque dicho sitio de unión al antígeno que se une específicamente a DIG comprende como dominio variable de la cadena pesada SEQ ID NO. 3 con las mutaciones S49A, I57A y A60P, y como dominio variable de la cadena ligera SEQ ID NO. 5.
65 En otra realización, dicho sitio de unión al antígeno que se une específicamente a DIG comprende como fragmento Fd de la cadena pesada (VH y CH1) SEQ ID NO. 36 y como cadena L SEQ ID NO. 6.
El término “mutación”, como se usa en el presente documento, se refiere a una o más sustituciones de aminoácidos en una región CDR y/o variable de un anticuerpo según la invención. El término “con las mutaciones S49A, I57A y A60P” se refiere a 3 sustituciones en el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO. 3 (numeración según
5 Kabat).
Además, dichos anticuerpos monocatenarios están preferentemente estabilizados con disulfuro. Tal estabilización con disulfuro adicional de los anticuerpos monocatenarios se logra por la introducción de un enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios y se describe, por ejemplo, en el documento WO 94/029350, Rajagopal, V., et al., Prot. Engin. Vol. 10 (12) 1453-59 (1997); Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, 387-393 (1998); o Schmidt, M., et al., Oncogene 18, 1711 -1721 (1999).
En otras realizaciones, el anticuerpo inventivo comprende un módulo de unión a digoxigenina humanizada que comprende al menos un fragmento variable monocatenario (scFv) que puede unirse a digoxigenina. Dicho scFv
15 comprende preferentemente una cadena de VL humanizada y una de VH humanizada unidas juntas por un conector. En otra realización, dicho anticuerpo comprende además una región Fc compuesta de dos cadenas pesadas que contribuyen a dos o tres dominios constantes.
En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una estructura que se basa en un anticuerpo de longitud completa que se une a una proteína diana, al que dos fragmentos variables monocatenarios (scFv) (opcionalmente estabilizados con disulfuro) que se unen a digoxigenina están ligados mediante un conector de péptido. En otra realización, dicho anticuerpo comprende IgG humanizada con dos sitios de unión a digoxigenina.
Los módulos de unión a digoxigenina pueden conectarse a entidades que eligen como diana células en una variedad
25 de formatos. Por ejemplo, no solo fragmentos de anticuerpos 'clásicos' y módulos derivados de anticuerpos tales como Fab o Fv pueden aplicarse para esto, sino también entidades similares a anticuerpos de un único dominio que se han descrito previamente en la bibliografía. Además de las fusiones del extremo C a la cadena H, formatos adicionales como se describen en los ejemplos son parte de la presente invención.
En una realización de la invención, dicha proteína diana es un antígeno de la superficie celular o intracelular, preferentemente dicha proteína diana es un antígeno asociado a tumor de la superficie celular o intracelular.
En una realización preferida de la invención, dicho anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a Her2. Preferentemente,
35 dicho anticuerpo biespecífico que se une específicamente a Her2 y digoxigenina comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 7 o SEQ ID NO. 8 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 9.
En una realización preferida de la invención, dicho anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a IGF1R. Preferentemente, dicho anticuerpo biespecífico que se une específicamente a IGF1R y digoxigenina comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 10 o SEQ ID NO. 11 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 12.
En una realización preferida de la invención, dicho anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a CD22. Preferentemente,
45 dicho anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CD22 y digoxigenina comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 13, y una cadena ligera de SEQ ID NO. 14. Preferentemente, dicho anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CD22 y digoxigenina comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 13 o SEQ ID NO. 55, y una cadena ligera de SEQ ID NO. 14 o SEQ ID NO. 56.
En una realización preferida de la invención, dicho anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a CD33. Preferentemente, dicho anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CD33 y digoxigenina comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 59 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 60.
55 En una realización preferida de la invención, dicho anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a VEGFR1. Preferentemente, dicho anticuerpo biespecífico que se une específicamente a VEGFR1 y digoxigenina comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 51 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 52.
En una realización preferida de la invención, dicho anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a Her2 (Lieberman). Preferentemente, dicho anticuerpo biespecífico que se une específicamente a Her2 (Lieberman) y digoxigenina comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 53 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 54.
65 En una realización preferida de la invención, dicho anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a LeY. Preferentemente,
dicho anticuerpo biespecífico que se une específicamente a LeY y digoxigenina comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 57 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 58.
En una realización preferida de la invención, dicho anticuerpo biespecífico se usa como vehículo de administración
5 de carga para un agente terapéutico o de diagnóstico. El agente terapéutico o de diagnóstico está conjugado con digoxigenina y así acoplado por el sitio de unión al antígeno del anticuerpo biespecífico de la invención para formar el complejo según la invención. Este complejo está definido y es estable y administra específicamente la carga a una célula o tejido diana. Como los agentes terapéuticos o de diagnóstico digoxigenados se acoplan de una forma no covalente al anticuerpo biespecífico, la carga se une establemente a su vehículo de administración durante la circulación, pero también se libera eficazmente después de la internalización. La conjugación con digoxigenina no afecta la actividad de la mayoría de los agentes terapéuticos o de diagnóstico. El anticuerpo biespecífico no contiene una adición covalente inusual y, por tanto, obvia cualquier riesgo de inmunogenicidad. Por tanto, puede usarse este simple procedimiento de conjugación para una gran variedad de moléculas de carga en combinación con solo un único anticuerpo; por ejemplo, péptidos, proteínas, moléculas pequeñas, reactivos de obtención de imágenes y
15 ácidos nucleicos, como se detalla en la descripción de las realizaciones específicas y ejemplos más adelante. Los complejos de agentes de diagnóstico o terapéuticos digoxigenados con derivados de anticuerpos biespecíficos que contienen módulo de unión a Dig pueden conferir comportamiento biofísico benigno y parámetros PK mejorados al agente de diagnóstico o terapéutico, por ejemplo, a proteínas, péptidos o moléculas pequeñas de diagnóstico o terapéuticas. Además, tales complejos son capaces de dirigir la carga de administración a células que muestran el antígeno que es reconocido por la variante del anticuerpo biespecífico.
El destino de las moléculas de carga terapéuticas o de diagnóstico digoxigenadas puede monitorizarse fácilmente en el paciente con agentes de diagnóstico comúnmente usados específicos para digoxigenina, por ejemplo, con ensayos tales como el método de digoxina Tina-quant para la detección de digoxina y tratamiento de sobredosis de
25 digoxina (Roche/Hitachi, documentos nº 12218623001 y US nº 7100001). La digoxigenina libre o sobredosis de las moléculas de carga terapéuticas o de diagnóstico digoxigenadas acopladas a los anticuerpos biespecíficos puede purificarse por anticuerpos anti-digoxigenina policlonales clínicamente autorizados (tales anticuerpos están contenidos, por ejemplo, en los ensayos anteriormente mencionados).
En una realización, el anticuerpo biespecífico vuelve cargarse in vivo después de la administración específica de célula de la carga.
En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno específico para digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a antígenos asociados a
35 tumor de la superficie celular o intracelulares. Así, el anticuerpo biespecífico cargado con el agente terapéutico o de diagnóstico se administra específicamente a una célula o tejido diana, preferentemente a un tumor.
El uso anteriormente descrito de anticuerpos biespecíficos como plataforma de administración específica de célula/tejido elegida como diana puede aplicarse a una gran variedad de cargas diferentes, en particular aquellas detalladas más adelante.
En una realización, dicho anticuerpo biespecífico se usa como vehículo de administración de carga para péptidos o proteínas terapéuticos y/o de diagnóstico. El acoplamiento de cargas peptídicas o proteináceas puede potenciar la potencia terapéutica de los anticuerpos, por ejemplo, toxina conjugada en terapia contra el cáncer. Los péptidos o
45 proteínas terapéuticos y/o de diagnóstico están conjugados con digoxigenina y así acoplados mediante una interacción de anticuerpo-hapteno a los anticuerpos biespecíficos descritos anteriormente. Este complejo definido y estable administra específicamente la carga de péptido o proteína a una célula o tejido diana y la carga de péptido o proteína se libera entonces dentro de las células diana.
En una realización preferida, el péptido o proteína digoxigenado se acopla a un anticuerpo biespecífico que tiene un primer sitio de unión al antígeno específico para digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno específico para una proteína diana, preferentemente un antígeno de la superficie celular o un antígeno intracelular. Preferentemente, dicho antígeno de la superficie celular o intracelular es un antígeno asociado a tumor. En una realización preferida, estos complejos están compuestos de una IgG <proteína diana>-<Dig> humanizada que une en sus dos sitios de
55 unión a Dig de alta afinidad dos péptidos digoxigenados (uno en cada sitio). Los péptidos retienen la buena actividad biológica a pesar de estar digoxigenados, además de mientras que están complejados con el anticuerpo. Además, la especificidad y actividad del anticuerpo biespecífico de la invención no se afecta por la unión del péptido digoxigenado. El sitio de unión diana de la superficie celular del derivado de anticuerpo biespecífico retiene su especificidad y afinidad de unión en presencia de péptidos digoxigenados complejados. Preferentemente, dicha proteína diana es Her2. En otra realización preferida, dicha proteína diana es IGFR1. En otra realización preferida, dicha proteína diana es CD22.
Tras la unión de un péptido o proteína digoxigenado a anticuerpos biespecíficos de la invención, el péptido o proteína retiene su actividad biológica completa. Se encontró sorprendentemente que los anticuerpos biespecíficos
65 humanizados recombinantes y fragmentos de anticuerpos de la invención mejoran la PK y estabilidad de péptidos terapéuticos.
Ejemplos no limitantes de péptidos digoxigenados preferidos son Dig-melitina, Dig-Fam5B, Dig-INF7, Dig-FallV1 y DigFallV2.
5 En un aspecto de la invención, los anticuerpos biespecíficos se usan para la administración de péptidos citotóxicos a células tumorales que expresan antígeno. Así, la presente invención proporciona una plataforma de administración específica para terapia contra el cáncer dirigida.
En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico se usa como vehículo de administración de carga para moléculas pequeñas terapéuticas o de diagnóstico. En una realización preferida, estos complejos están compuestos de una IgG <proteína diana>-<Dig> humanizada que une en sus dos sitios de unión a Dig de alta afinidad dos compuestos digoxigenados (uno en cada sitio). Los compuestos retienen la actividad biológica a pesar de estar digoxigenados, además de mientras que están complejados con el anticuerpo. El sitio de unión a la diana de la superficie celular del derivado de anticuerpo biespecífico retiene su especificidad y afinidad de unión en presencia de
15 compuestos de Dig complejados.
En una realización preferida, las moléculas pequeñas digoxigenadas se acoplan a derivados de anticuerpos biespecíficos <proteína diana>-<Dig>. Así se generan complejos de moléculas estables definidos que liberan la carga dentro de las células diana.
En una realización preferida, dicha molécula pequeña está digoxigenada y acoplada a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana. Preferentemente, dicha proteína diana es un marcador para células tumorales. En una realización preferida, dicha proteína diana es Her2. En otra realización preferida, dicha proteína
25 diana es IGF1R. En todavía otra realización preferida, dicha proteína diana es CD22.
En una realización preferida, dicho anticuerpo biespecífico se usa como vehículo de administración de carga para molécula citotóxica digoxigenada. Preferentemente, dichas moléculas citotóxicas se administran así específicamente a células tumorales que expresan antígeno. Así, la presente invención proporciona una plataforma de administración específica para terapia contra el cáncer dirigida.
En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico se usa como administración de carga para radioisótopos digoxigenados o radioisótopos unidos a una molécula pequeña digoxigenada. Así, la presente invención proporciona una plataforma de administración específica para radioterapia. El radioisótopo o radioisótopos digoxigenados unidos
35 a una molécula pequeña digoxigenada muestran eficaz penetración en el tejido, rápida eliminación, y solo son retenidos sobre células cubiertas por anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> (tejido diana/tumor). Esto permite el direccionamiento específico y evita la liberación no específica sistémica de radioisótopos terapéuticos. En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico unido a la célula o tejido diana se 'vuelve a cargar' con el radioisótopo digoxigenado o radioisótopo unido a una molécula pequeña digoxigenada in vivo. En una realización preferida, los anticuerpos biespecíficos de la invención se usan para la administración de radioisótopos digoxigenados o radioisótopos unidos a una molécula pequeña digoxigenada a tejidos enfermos. Preferentemente, dicho tejido enfermo es un tumor.
En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico se usa como vehículo de administración de carga para
45 reactivos de obtención de imágenes. Para fines de obtención de imágenes, se desea una buena relación de señal con respecto a ruido de fondo que requiere buena penetración en el tejido, además de buen direccionamiento del tejido. Los anticuerpos muestran buena estabilidad y buen direccionamiento, pero solo penetración en el tejido moderada. Estos inconvenientes se vencen ahora.
En una realización preferida, complejos de sustratos fluorescentes digoxigenados con derivados de anticuerpos biespecíficos que contienen módulos de unión a Dig recombinantes se aplican para la obtención de imágenes específicas de tejidos o células que llevan el antígeno diana. En una realización preferida, se obtienen imágenes de estos tejidos o células in vivo. Estos complejos están compuestos de una IgG <Diana>-<Dig> humanizada que une en sus dos sitios de unión a Dig de alta afinidad dos sustratos digoxigenados (uno en cada sitio) que pueden 55 visualizarse por tecnologías de obtención de imágenes. En una realización preferida, el compuesto de obtención de imágenes es un fluoróforo. En otra realización preferida, dicho compuesto de obtención de imágenes es un compuesto radiactivamente marcado. Los compuestos de obtención de imágenes retienen sus propiedades a pesar de estar digoxigenados, además de mientras que están complejados con el anticuerpo. En una realización preferida, dicho compuesto de obtención de imágenes es Cy5. El sitio de unión diana de la superficie celular del derivado de anticuerpo biespecífico retiene su especificidad y afinidad de unión en presencia de compuestos de Dig complejados. En una realización preferida, dicho anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana. Preferentemente, dicha proteína diana es un marcador para células tumorales. En una realización preferida, dicha proteína diana es Her2. En otra realización preferida, dicha proteína diana es IGF1R. En otra realización preferida
65 más, dicha proteína diana es CD22.
Los compuestos de obtención de imágenes digoxigenados muestran penetración en el tejido eficaz, rápida eliminación y son solo retenidos sobre células cubiertas por anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> (tejido diana/tumor). Esto permite la eficaz obtención de imágenes resueltas en el tiempo, y la evaluación de vascularización tumoral, o cambios dentro de la vascularización tumoral. En una realización preferida, el anticuerpo
5 biespecífico unido a la célula diana o tejido se 'vuelve a cargar' con el colorante digoxigenado in vivo. En una realización preferida, los anticuerpos biespecíficos de la invención se usan para la obtención de imágenes de tejidos enfermos. Preferentemente, dicho tejido enfermo es un tumor.
Otro aspecto de la invención es el direccionamiento específico y la administración de ácidos nucleicos a y en tejidos diana y células diana es un cuello de botella importante, que no se ha resuelto satisfactoriamente por las actuales tecnologías. Las mayorías de las entidades de administración de ácidos nucleicos descritas hasta la fecha no consisten en una molécula definida, sino que son una mezcla de moléculas o partículas. Sin embargo, para aplicaciones terapéuticas, se desean entidades definidas homogéneas. Se ha mostrado la administración de ácidos nucleicos mediada por anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en algunos ejemplos (por ejemplo, Lieberman et al.,
15 Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors, Nature Biotechnology [10870156] Song yr:2005 vol:23 pg:709), pero todavía se enfrenta a graves obstáculos técnicos. Es de particular interés el direccionamiento específico y la administración de moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) a y en tejidos diana y células diana. Se ha mostrado que las moléculas de ácido ribonucleico bicatenarias (ARNbc) bloquean la expresión génica en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia por ARN (iARN). Los ARNbc pueden conjugarse con anticuerpos con buena estabilidad para asegurar el direccionamiento específico y evitar la liberación no específica sistémica. Por otra parte, el ARNbc tiene que liberarse en o dentro de células diana para permitir la entrada en la célula. Los ARNbc elegidos como diana se acumulan frecuentemente en endosomas de los que necesitan escapar para ser activos. Sin embargo, todavía tienen que encontrarse mecanismos de escape de endosomas no inmunogénicos no tóxicos eficaces para ARNbc elegidos como diana.
25 Estos inconvenientes se vencen ahora usando el anticuerpo biespecífico de la invención como vehículo de administración de carga para ácidos nucleicos. Así, la presente invención proporciona una plataforma de administración específica para terapia génica elegida como diana y administración de iARN elegida como diana.
En una realización preferida, los complejos de ácidos nucleicos digoxigenados con derivados de anticuerpos biespecíficos que contienen módulos de unión a Dig recombinantes se aplican para dirigir específicamente ácidos nucleicos a células que expresan antígeno. Tales complejos pueden dirigir los péptidos a células que muestran el antígeno que es reconocido por la variante de anticuerpo biespecífico. Estos complejos están compuestos de una IgG <Diana>-<Dig> humanizada que une en sus dos sitios de unión a Dig de alta afinidad dos ácidos nucleicos 35 digoxigenados (uno en cada sitio). Los ácidos nucleicos retienen su funcionalidad a pesar de estar digoxigenados, además de mientras que están complejados con el anticuerpo. Además, el sitio de unión diana de la superficie celular del derivado de anticuerpo biespecífico retiene su especificidad y afinidad de unión en presencia de ácidos nucleicos digoxigenados complejados. Preferentemente, los complejos de ácidos nucleicos digoxigenados con variantes de anticuerpos biespecíficos <Diana>-<DIG> pueden aplicarse para dirigir los ácidos nucleicos específicamente a células que expresan el antígeno diana. Así, los ácidos nucleicos acceden selectivamente a las células que son reconocidas por antígenos de superficie, por tanto se potencian las actividades producidas por los ácidos nucleicos (por ejemplo, iARN o citotoxicidad mediada por ácidos nucleicos) en las células que expresan antígeno. En una realización, estas actividades se potencian adicionalmente aplicando adicionalmente agentes moduladores de endosomas elegidos como diana. Preferentemente, los ácidos nucleicos no solo se administran
45 específicamente a células que expresan antígeno, sino que también se internalizan en las células diana. Como los ácidos nucleicos digoxigenados se acoplan de una forma no covalente al anticuerpo biespecífico de la invención, la carga (es decir, ácidos nucleicos) se libera después de la internalización. En una realización preferida, tal antígeno diana es un marcador para células tumorales. En una realización preferida, dicho antígeno diana es Her2. En otra realización preferida, dicho antígeno diana es IGF1R. En todavía otra realización preferida, dicho antígeno diana es CD22.
En una realización preferida, el ácido nucleico es ADN, en otra realización preferida dicho ácido nucleico es ARNbc. En una realización preferida, dicho ARN bicatenario se usa para inhibir la expresión de un gen diana.
55 Métodos para acoplar digoxigenina a ácidos nucleicos y métodos analíticos para su caracterización son parte de la presente invención.
Para mediar en su actividad (por ejemplo, la destrucción específica de ARNm por ARNip), ácidos nucleicos terapéuticos o de diagnóstico tienen que acceder al citoplasma de sus células diana. Un factor importante para la administración de actividad de ácido nucleico específico es que las moléculas no solo se administran a células, sino que también tienen que transferirse cantidades suficientes de los ácidos nucleicos al citoplasma de estas células. Para esto, estas moléculas tienen que penetrar en una membrana biológica al menos una vez. Como las sustancias biológicas no pasan fácilmente a través de las membranas, este proceso es un cuello de botella que debe vencerse para la eficaz administración de actividad de ácido nucleico. Los medios para vencer este cuello de botella pueden
65 ser penetración de la membrana, translocalización de proteína a través de membranas, o mecanismos de escape de endosomas o de escape vesicular que pueden implicar procesos de rotura de la membrana.
En una realización preferida, los anticuerpos biespecíficos de la invención se usan como módulo de administración de carga para ácidos nucleicos a los que están ligados un modulador de la funcionalidad de endosomas, o módulos de escape/rotura de endosomas. Preferentemente, dicho modulo de escape de endosomas comprende un péptido.
5 En una realización preferida, un módulo de escape de endosomas tal comprende policonjugados dinámicos (DPC). Los DPC son entidades químicas que tras la unión a la célula e internalización producen el escape de endosomas de ARNip (Rozema DB et. al., Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of ARNip to hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 2007 Aug 7;104(32):12982-7 PMID:17652171). Tales DPC están compuestos de andamiajes de PBAVE (polímeros de butil-aminovinil éteres) con los que las moléculas de PEG están unidos reversiblemente usando un enlace maleamato bifuncional. Para lo último, puede aplicarse ácido dimetilmaleico carboxilado (CDM). Las unidades de PEG se usan para proteger las cargas positivas endosmolíticas de los PBAVE. También ligados al PBAVE está la carga de ARNip (por ejemplo, mediante un enlace disulfuro reversible). Los vehículos de administración resultantes se denominan policonjugados
15 dinámicos de ARNip debido a que los grupos protectores de ARNip (y ligandos que eligen diana adicionales) están conjugados con un polímero de una manera reversible. Las propiedades endosomolíticas de tales DPC que provocan la liberación citoplásmica del ARNip se inducen por su entorno químico: la disminución en el pH dentro de endolisomas en maduración induce la liberación del CDM-PEG, exponiendo cargas positivas de PBAVE que a su vez media en la endosmólisis.
Por tanto, en una realización preferida se combinan las características endosmolíticas de DPC con las propiedades de direccionamiento específico del sistema de liberación de digoxigenina biespecífico. Preferentemente, estos complejos están compuestas de una IgG <Diana>-<Dig> humanizada que une en sus dos sitios de unión a Dig de alta afinidad dos ácidos nucleicos digoxigenados (uno en cada sitio) conjugados con DPC.
25 En una realización, los anticuerpos biespecíficos complejados con ácidos nucleicos digoxigenados se usan para análisis de obtención de imágenes. En esta realización, los ácidos nucleicos se marcan simultáneamente con digoxigenina y una marca detectable. Así, es posible visualizar la localización de ácidos nucleicos dirigidos a células que expresan antígeno por microscopía u otras tecnologías de obtención de imágenes. Preferentemente, dicha marca detectable es una marca de fluorescencia. En una realización, la localización de ácidos nucleicos se visualiza en células, es decir, in vitro. En otra realización preferida, la localización de ácidos nucleicos se visualiza in vivo.
Los anticuerpos policlonales específicos para digoxigenina se usan ampliamente en ensayos de diagnóstico. Sin embargo, fragmentos estables pequeños y proteínas de fusión son deseables, pero no pueden generarse a partir de
35 estos anticuerpos derivados de hibridoma. Por tanto, existe la necesidad de <Dig> humanizada recombinante o quimérica o proteínas de fusión de <Dig> como reactivos de diagnóstico. En una realización de la invención, losanticuerpos biespecíficos inventivos o fragmentos se usan como herramientas y reactivos de diagnóstico. Éstos incluyen, pero no se limitan a, IgG humana recombinante funcional, fragmento Fab, scFv y Fv estabilizado con disulfuro específico para digoxigenina. Preferentemente, el anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo reconoce compuestos digoxigenados o moléculas, por ejemplo, pero no se limitan a proteínas digoxigenadas, péptidos o ácidos nucleicos. En una realización preferida, dichos anticuerpos biespecíficos o fragmentos están conjugados con una enzima, proteína A, (estrept)avidina, o una proteína de fusión para su uso en ensayos de diagnóstico.
45 <Dig> policlonal (Fab) se aplica terapéuticamente para contrarrestar la sobredosis de digitoxina. Los productos existentes pueden ser bastante indefinidos y probablemente inmunogénicos. Los anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos de un complejo según la invención se unen específicamente a digoxigenina y están bien definidos con baja o ninguna inmunogenicidad. En una realización, se usan <Dig> humanizada recombinante o quimérica o fragmentos de <Dig> como antídoto de digitoxina.
Como se usa en el presente documento, “anticuerpo” se refiere a una proteína de unión que comprende sitios de unión al antígeno. Los términos “sitio de unión” o “sitio de unión al antígeno” como se usan en el presente documento indican la(s) región (regiones) de una molécula de anticuerpo a la(s) que se une un ligando en realidad. En una realización de la actual invención, cada uno de los sitios de unión comprende un dominio variable de la
55 cadena pesada del anticuerpo (VH) y/o un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL), y preferentemente está formado por un par que consiste en un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) y un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH).
En una realización de la invención, dicho anticuerpo comprende un fragmento variable monocatenario (scFv).
Especificidad del anticuerpo se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo por un epítope particular de un antígeno. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecíficos. “Anticuerpos biespecíficos” según la invención son anticuerpos que tienen dos especificidades de unión al antígeno diferentes. Si un anticuerpo tiene más de una especificidad, los epítopes reconocidos pueden asociarse a un único antígeno o a más de un antígeno. Los
65 anticuerpos de la presente invención son específicos para dos antígenos diferentes, es decir, digoxigenina como primer antígeno y una proteína diana como segundo antígeno.
El término anticuerpo “monoespecífico”, como se usa en el presente documento, indica un anticuerpo que tiene uno
o más sitios de unión, cada uno de los cuales se une al mismo epítope del mismo antígeno.
El término “valente”, como se usa dentro de la presente solicitud, indica la presencia de un número especificado de
5 sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Como tales, los términos “bivalente”, “tetravalente” y “hexavalente” indican la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de anticuerpo. Los anticuerpos biespecíficos según la invención son al menos “bivalentes” y pueden ser “trivalentes” o “multivalentes” (por ejemplo, “tetravalentes” o “hexavalentes”).
Los anticuerpos de la presente invención tienen dos o más sitios de unión y son biespecíficos. Es decir, los anticuerpos pueden ser biespecíficos incluso en casos en los que hay más de dos sitios de unión (es decir, que el anticuerpo sea trivalente o multivalente). Los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios multivalentes, diacuerpos y triacuerpos, además de anticuerpos que tienen la estructura de dominio constante de anticuerpos de longitud completa a los que sitios de unión al antígeno adicionales (por 15 ejemplo, Fv monocatenario, un dominio VH y/o un dominio VL, Fab, o (Fab)2) están ligados mediante uno o más conectores de péptido. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa de una única especie, o estar quimerizados
o humanizados. Para un anticuerpo con más de dos sitios de unión al antígeno, algunos sitios de unión pueden ser idénticos, mientras que la proteína tiene sitios de unión para dos antígenos diferentes. Es decir, mientras que un primer sitio de unión es específico para digoxigenina, un segundo sitio de unión es específico para una proteína diana.
Al igual que los anticuerpos naturales, un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención normalmente contiene seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que contribuyen en grados variables a la afinidad del sitio de unión por el antígeno. Hay tres dominios variables de la cadena pesada CDR (CDRH1, CDRH2 y
25 CDRH3) y tres dominios variables de la cadena ligera CDR (CDRL1, CDRL2 y CDRL3). El grado de CDR y regiones estructurales (FR) se determina por comparación con una base de datos compilada de secuencias de aminoácidos en la que aquellas regiones se han definido según variabilidad entre las secuencias. También están incluidos dentro del alcance de la invención sitios de unión al antígeno funcionales que comprenden menos CDR (es decir, en las que la especificidad de unión se determina por tres, cuatro o cinco CDR). Por ejemplo, menos de un conjunto completo de 6 CDR puede ser suficiente para la unión. En algunos casos, un dominio VH o a VL será suficiente.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden comprender además regiones constantes de inmunoglobulina de una o más clases de inmunoglobulina. Las clases de inmunoglobulina incluyen isotipos IgG, IgM, IgA, IgD e IgE y, en el caso de IgG y IgA, sus subtipos. En una realización preferida, un anticuerpo de la invención
35 tiene una estructura de dominio constante de un anticuerpo tipo IgG, pero tiene cuatro sitios de unión al antígeno. Esto se lleva a cabo enlazando dos sitios de unión al antígeno completos (por ejemplo, un Fv monocatenario) que se une específicamente a DIG a tanto a la cadena pesada como ligera del extremo N o C de un anticuerpo completo que se une específicamente a una proteína diana. Los cuatro sitios de unión al antígeno comprenden preferentemente dos sitios de unión para cada una de las dos especificidades de unión diferentes.
Los términos “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal”, como se usan en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición de un único aminoácido.
El término “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir, región de
45 unión, de una fuente o especie y al menos una porción de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, normalmente preparado por técnicas de ADN recombinante. Se prefieren anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana. Otras formas preferidas de “anticuerpos quiméricos” englobadas por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado de aquella del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o la unión del receptor de Fc (FcR). Tales anticuerpos quiméricos también se denominan “anticuerpos de cambio de clase”. Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican ADN recombinante convencional y las técnicas de transfección de genes
55 son muy conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; documentos US 5.202.238 y US 5.204.244.
El término “anticuerpo humanizado” se refiere a anticuerpos en los que la región estructural o “regiones determinantes de la complementariedad” (CDR) se han modificado para comprender la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente en comparación con la de la inmunoglobulina. En una realización preferida, una CDR murina se injerta en la región estructural de un anticuerpo humano para preparar el “anticuerpo humanizado”. Véase, por ejemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. CDR particularmente preferidas se corresponden con aquellas que representan secuencias que reconocen los antígenos indicados anteriormente para anticuerpos quiméricos. Otras formas de 65 “anticuerpos humanizados” englobadas por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha
modificado adicionalmente o cambiado de la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o unión del receptor de Fc (FcR). El término “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los
5 anticuerpos humanos son muy conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, M.A., y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos también pueden producirse en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que pueden, tras la inmunización, producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal
10 producirá la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno (véase, por ejemplo, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). También pueden producirse anticuerpos humanos en bibliotecas de expresión en fago (Hoogenboom, H.R., y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Las técnicas de Cole et al. y Boerner, et al. también están disponibles para la
15 preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole, P.J., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); y Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Como ya se ha mencionado para anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, el término “anticuerpo humano” como se usa en el presente documento también comprende tales anticuerpos que se modifican en la región constante para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o la unión de FcR, por ejemplo, por
20 “conmutación de clase”, es decir, cambio o mutación de partes de Fc (por ejemplo, de IgG1 a IgG4 y/o mutación IgG1/IgG4).
El término “anticuerpo humano recombinante”, como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos 25 aislados de una célula huésped tal como una célula NS0 o CHO o de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes en una forma reorganizada. Los anticuerpos humanos recombinantes según la invención se han sometido a hipermutación somática in vivo. Así, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los
30 anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de y están relacionadas con secuencias de VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
El “dominio variable” (dominio variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)),
35 como se usa en el presente documento, indica cada uno del par de cadenas ligeras y pesadas que participa directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios de las cadenas ligeras y pesadas humanas variables tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones estructurales (FR) cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas por tres “regiones hipervariables” (o regiones determinantes de la complementariedad, CDR). Las regiones estructurales adoptan una conformación de hoja β y
40 las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de hoja β. Las CDR en cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional por las regiones estructurales y forman junto con las CDR de la otra cadena el sitio de unión al antígeno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo desempeñan una función particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de los anticuerpos según la invención y, por tanto, proporcionan otro objetivo de la invención.
45 Los términos “región hipervariable” o “porción de unión al antígeno de un anticuerpo”, cuando se usan en el presente documento, se refieren a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de las “regiones determinantes de la complementariedad” o “CDR”. La “región estructural” o regiones “FR” son aquellas regiones de dominio variable
50 distintas de los residuos de la región hipervariable como se definen en el presente documento. Por tanto, las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo comprenden del extremo N a C de los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las CDR en cada cadena están separadas por tales aminoácidos de la región estructural. Especialmente, CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión al antígeno. Las regiones CDR y FR se determinan según la definición estándar de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological
55 Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
Como se usa en el presente documento, el término “unión”, o “que se une específicamente”, se refiere a la unión del anticuerpo a un epítope de un antígeno en un ensayo in vitro, preferentemente en un ELISA basado en células con células CHO que expresan antígeno no mutante. La unión significa una afinidad de unión (KD) de 10-8 M o menos,
60 preferentemente 10-13 M a 10-9 M. La unión del anticuerpo al antígeno o FcγRIII puede investigarse por un ensayo BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia). La afinidad de la unión se define por los términos ka (constante para la asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno), kD (constante de disociación) y KD (kD/ka).
Como se usa en el presente documento, el término “acoplado” se refiere específicamente a la interacción de anticuerpo-hapteno por la que una carga terapéutica o de diagnóstico digoxigenada se une no covalentemente a los anticuerpos biespecíficos de la invención.
5 El término “molécula pequeña”, o “compuesto pequeño”, como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas orgánicas o inorgánicas tanto sintetizadas como encontradas en la naturaleza, que generalmente tienen un peso molecular inferior a 10.000 gramos por mol, opcionalmente inferior a 5.000 gramos por mol, y opcionalmente inferior a 2.000 gramos por mol.
El término “péptido”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier compuesto polimérico producido por la formación de amida entre un grupo alfa-carboxilo de un aminoácido y un grupo alfa-amino de otro grupo. El término “proteína”, como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos de secuencia específica de más de aproximadamente 50 residuos.
15 El término “ácido nucleico”, como se usa en el presente documento, significa un oligómero o polímero compuesto de nucleótidos, por ejemplo, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o compuestos producidos sintéticamente (por ejemplo, PNA como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.948.902 y las referencias citadas en su interior) que pueden hibridarse con ácidos nucleicos que se producen naturalmente en un modo específico de secuencia análogo al de dos ácidos nucleicos que se producen naturalmente, por ejemplo, pueden participar en interacciones por apareamiento de bases de Watson-Crick. Los ácidos nucleicos que no se producen naturalmente son oligómeros o polímeros que contienen secuencias de nucleobases que no se producen en la naturaleza, o especies que contienen equivalentes funcionales de nucleobases que se producen naturalmente, azúcares, o enlaces entre azúcares, como ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos de treosa (TNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o ácidos nucleicos de glicerol (GNA). Este término incluye oligómeros que contienen las nucleobases de ácidos nucleicos que
25 se producen naturalmente adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U), además de oligómeros que contienen análogos de bases o nucleobases modificadas. Los ácidos nucleicos pueden derivarse de una variedad de fuentes naturales tales como ADN y ARN virales, bacterianos y eucariotas. Otros ácidos nucleicos pueden derivarse de fuentes sintéticas, e incluyen cualquiera de los múltiples oligonucleótidos que están siendo fabricados para su uso como reactivos de investigación, agentes de diagnóstico o posibles y definitivos agentes terapéuticos. El término incluye oligómeros que comprenden un ácido nucleico monocatenario o un ácido nucleico bicatenario.
El término “epítope” incluye cualquier determinante de polipéptido capaz de unión específica a un anticuerpo. En ciertas realizaciones, el determinante de epítope incluye agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo, y, en ciertas realizaciones,
35 pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y o características de carga específica. Un epítope es una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo se dice que se une específicamente al antígeno cuando reconoce preferencialmente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
En una realización de la invención, el anticuerpo biespecífico comprende un anticuerpo de longitud completa como andamiaje. El término “anticuerpo de longitud completa” indica un anticuerpo que consiste en dos “cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa” y dos “cadenas ligeras del anticuerpo de longitud completa”. Una “cadena pesada del anticuerpo de longitud completa” es un polipéptido que consiste, en la dirección del extremo N al extremo C, en un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH), un dominio constante 1 del anticuerpo (CH1),
45 una región bisagra del anticuerpo, un dominio constante 2 del anticuerpo (CH2), un dominio constante 3 del anticuerpo (CH3), y opcionalmente un dominio constante 4 del anticuerpo (CH4) en caso de un anticuerpo de la subclase IgE. Una “cadena ligera del anticuerpo de longitud completa” es un polipéptido que cosiste, en la dirección del extremo N al extremo C, en un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) y un dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo (CL). Las cadenas del anticuerpo de longitud completa se enlazan juntas mediante enlaces disulfuro entre polipéptidos entre el dominio CL y el dominio CH1 y entre las regiones bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa.
Los sitios de unión en un anticuerpo según la invención pueden estar cada uno formado por un par de dos dominios variables, es decir, de un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera. El
55 determinante del sitio de unión mínimo en un anticuerpo es la región CDR3 de la cadena pesada.
En una realización de los anticuerpos monocatenarios estabilizados con disulfuro, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios comprendidos en el anticuerpo según la invención se selecciona independientemente para cada anticuerpo monocatenario de:
i) posición 44 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera,
ii) posición 105 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 43 del dominio variable de la cadena 65 ligera, o
iii) posición 101 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera.
En una realización, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios comprendidos 5 en el anticuerpo según la invención está entre la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera.
En una realización, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios comprendidos en el anticuerpo está entre la posición 105 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 43 del dominio 10 variable de la cadena ligera.
En otra realización, dicho anticuerpo biespecífico tetravalente se caracteriza porque dicho anticuerpo bivalente monoespecífico es de la subclase de IgG1 humana, o de la subclase de IgG1 humana con las mutaciones L234A y L235A.
15 En otra realización, dicho anticuerpo biespecífico tetravalente se caracteriza porque dicho anticuerpo bivalente monoespecífico es de la subclase de IgG2 humana.
En otra realización, dicho anticuerpo biespecífico tetravalente se caracteriza porque dicho anticuerpo bivalente 20 monoespecífico es de la subclase de IgG3 humana.
En otra realización, dicho anticuerpo biespecífico tetravalente se caracteriza porque dicho anticuerpo bivalente monoespecífico es de la subclase de IgG4 humana, o de la subclase de IgG4 con la mutación adicional S228P.
25 En otra realización, anticuerpo biespecífico se caracteriza por
-
se forman dos sitios de unión al antígeno por los dos pares de dominios variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo bivalente monoespecífico y ambos se unen al mismo epítope,
30 -los dos sitios de unión al antígeno adicionales se forman cada uno por el dominio variable de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo monocatenario,
-
los anticuerpos monocatenarios se ligan cada uno a una cadena pesada o a una cadena ligera mediante un conector de péptido, por lo que cada extremo de la cadena del anticuerpo se liga solo a un anticuerpo 35 monocatenario.
El término “conector de péptido”, como se usa dentro de la invención, indica un péptido con secuencias de aminoácidos, que es preferentemente de origen sintético. Estos conectores de péptido según la invención se usan para ligar los diferentes sitios de unión al antígeno y/o fragmentos de anticuerpos que comprenden eventualmente
40 los diferentes sitios de unión al antígeno (por ejemplo, Fv monocatenario, anticuerpos de longitud completa, un dominio VH y/o un dominio VL, Fab, (Fab)2, parte de Fc) juntos para formar un anticuerpo biespecífico según la invención. Los conectores de péptido pueden comprender una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos enumeradas en la Tabla 1, además de aminoácidos arbitrariamente seleccionados adicionalmente.
45 Tabla 1 -Secuencias de aminoácidos del conector de péptido
Secuencia de aminoácidos del conector peptídico
Referencia
M.J. Wright, y M.P. Deonarain, Mol. Immun. 44 (2007) 2860-2869
Yang, Anal. Bioanal. Chem. 390 (2008) 2133
Batra, J.K., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 15198-15202.
Secuencia de aminoácidos del conector peptídico
Referencia
Appl. Microbiol. Biotechnol. 48 (1997) 487-492
App. Microbiol. Biotechnol. 48 (1997) 487-492
El término “conector monocatenario”, como se usa dentro de la invención, indica un péptido con secuencias de aminoácidos, que es preferentemente de origen sintético. Estos conectores de péptido según la invención se usan para ligar un dominio VH y un VL para formar un Fv monocatenario. El conector monocatenario puede comprender una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos enumeradas en la Tabla 2, además de aminoácidos arbitrariamente seleccionados adicionales.
Tabla 2 -Secuencias de aminoácidos del conector monocatenario.
Secuencia de aminoácidos del conector monocatenario
Referencia
M.J. Wright, M.P. Deonarain, Mol. Immunol. 44 (2007)2860-2869
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Secuencia de aminoácidos del conector monocatenario
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J. mol. recog. 12 (1999) 258
J. Biol. Chem. 266 (1991) 14095-14103
Debido a sus propiedades químicas y físicas, tales como peso molecular y arquitectura de dominios que incluye modificaciones secundarias, el procesamiento aguas abajo de anticuerpos es muy complicado. Por ejemplo, no solo para fármacos formulados, sino también para productos intermedios en el procesamiento aguas abajo (DSP) de
disoluciones concentradas requeridas para lograr bajos volúmenes para la manipulación económica y almacenamiento de aplicaciones. Pero con concentración creciente del anticuerpo puede observarse una tendencia a formar agregados. Estos anticuerpos agregados tienen características alteradas en comparación con el anticuerpo aislado. Ahora se ha encontrado que la agregación de los anticuerpos según la invención puede reducirse por la
5 introducción de enlaces disulfuro entre los dominios pesados y variables de la cadena ligera de los anticuerpos monocatenarios conectados al anticuerpo bivalente monoespecífico parental. Esta estabilidad mejorada no solo es útil durante el proceso de producción, sino también para el almacenamiento de los anticuerpos. En una realización, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios comprendidos en el anticuerpo se selecciona independientemente para cada anticuerpo monocatenario de:
i) posición 44 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera,
ii) posición 105 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 43 del dominio variable de la cadena 15 ligera, o
iii) posición 101 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera.
En una realización, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios comprendidos en el anticuerpo según la invención está entre la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera.
En una realización, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios comprendidos
25 en el anticuerpo según la invención está entre la posición 105 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera.
El término “región constante”, como se usa dentro de las presentes solicitudes, indica la suma de los dominios de un anticuerpo distintos de la región variable. La región constante no participa directamente en la unión de un antígeno, pero presenta diversas funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases, tales como IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se denominan α, δ, ε, γ y µ, respectivamente. Las regiones constantes de la cadena ligera que pueden encontrarse en las cinco clases de
35 anticuerpo se denominan κ (kappa) y λ (lambda).
El término “región constante derivada de origen humano”, como se usa en la presente solicitud, indica una región constante de la cadena pesada de un anticuerpo humano de la subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 y/o una región kappa o lambda de la cadena ligera constante. Tales regiones constantes son muy conocidas en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, por Kabat, E.A. (véanse, por ejemplo, Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788). Mientras que los anticuerpos de la subclase IgG4 muestran unión del receptor de Fc reducida (FcγRIIIa), los anticuerpos de otras subclases de IgG muestran unión fuerte. Sin embargo, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida de hidrato de carbono de Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 y 45 His435 son residuos que, si se alteran, proporcionan también unión del receptor de Fc reducida (Shields, R.L., et al.,
J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; documento EP 0 307 434). En una realización, un anticuerpo según la invención tiene una unión de FcR reducida en comparación con un anticuerpo IgG1. Así, el anticuerpo bivalente monoespecífico parental es con respecto a la unión de FcR de subclase IgG4 o de subclase IgG1 o IgG2 con una mutación en S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. En una realización, las mutaciones en el anticuerpo bivalente monoespecífico parental son S228P, L234A, L235A, L235E y/o PVA236.
El anticuerpo según la invención se produce por medios recombinantes. Así, un aspecto de la presente invención es un ácido nucleico que codifica el anticuerpo según la invención y otro aspecto es una célula que comprende dicho 55 ácido nucleico que codifica un anticuerpo según la invención. Los métodos para la producción recombinante son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas con posterior aislamiento del anticuerpo y normalmente purificación a una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos como se ha mencionado anteriormente en una célula huésped, los ácidos nucleicos que codifican las cadenas ligeras y pesadas modificadas respectivas se insertan en vectores de expresión por métodos convencionales. La expresión se realiza en células huésped procariotas o eucariotas apropiadas como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levadura, o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (sobrenadante o células después de la lisis). Métodos generales para la producción recombinante de anticuerpos son muy conocidos en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 183-202 (1999);
65 Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 271-282 (1996); Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 151-161 (2000); Werner, R.G., Drug Res. 48 870-880 (1998).
Los anticuerpos biespecíficos se separan adecuadamente del medio de cultivo por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN y ARN que codifica los anticuerpos monoclonales
5 se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir de fuente de tal ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped tales como células HEK 293, células CHO, o células de mieloma que no producen de otro modo proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células huésped.
Las variantes de secuencias de aminoácidos (o mutantes) del anticuerpo biespecífico se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el anticuerpo ADN, o por síntesis de nucleótidos. Tales modificaciones pueden realizarse, sin embargo, solo en un intervalo muy limitado, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características de anticuerpos anteriormente mencionadas tales como
15 el isotipo de IgG y la unión a antígeno, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante, estabilidad de proteínas o facilitar la purificación.
El término “célula huésped”, como se usa en la presente solicitud, indica cualquier tipo de sistema celular que puede manipularse para generar los anticuerpos según la presente invención. En una realización se usan células HEK293 y células CHO como células huésped. Como se usa en el presente documento, las expresiones “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se usan indistintamente y todas aquellas designaciones incluyen progenie. Así, las palabras “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula sujeto primaria y cultivos derivados de la misma sin considerar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Está incluida la progenie de variante
25 que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada para la célula originalmente transformada.
La expresión en células NS0 se describe por, por ejemplo, Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 109-123 (2000); Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 261-270 (2001). La expresión transitoria se describe por, por ejemplo, Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 E9 (2002). La clonación de dominios variables se describe por Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 3833-3837 (1989); Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285 -4289 (1992); y Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 77-87 (1997). Un sistema de expresión transitorio preferido (HEK 293) se describe por Schlaeger, E.-J., y Christensen, K., en Cytotechnology 30 71-83 (1999) y por Schlaeger, E.-J., en J. Immunol. Methods 194 191-199 (1996).
35 Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Las células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, potenciadores y señales de poliadenilación.
Un ácido nucleico está “operativamente ligado” cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o conductor secretor está operativamente ligado a ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente ligado a una secuencia codificante si está posicionado de manera que se facilite la traducción. Generalmente, “operativamente ligado” significa que las
45 secuencias de ADN que están ligadas son contiguas, y, en el caso de un conductor secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se lleva a cabo por ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos se usan según la práctica convencional.
La purificación de anticuerpos se realiza con el fin de eliminar componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por técnicas convencionales, que incluyen tratamiento alcalino/SDS, bandeo con CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros muy conocidos en la técnica. Véase Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Diferentes métodos están bien establecidos y se usan generalizadamente para la
55 purificación de proteínas, tales como cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo, cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G), cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, intercambio catiónico (resinas de carboximetilo), intercambio aniónico (resinas de aminoetilo) e intercambio de modo mixto), adsorción tiófila (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos de SH), interacción hidrófoba o cromatografía de adsorción aromática (por ejemplo, con fenil-Sepharose, resinas aza-arenófilas, o ácido maminofenilborónico), cromatografía de afinidad por quelato metálico (por ejemplo, con material de afinidad de Ni (II) y Cu (II)), cromatografía de exclusión por tamaño y métodos electroforéticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A. Appl. Biochem. Biotech. 75 93-102 (1998)).
Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un complejo o anticuerpo según la
65 invención. Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención acoplado a un agente terapéutico o de diagnóstico digoxigenado (es decir, un complejo según la
invención). En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo acoplado a un agente terapéutico o de diagnóstico digoxigenado según la presente invención (es decir, un complejo según la invención), formulado junto con un vehículo farmacéutico.
5 Otro aspecto de la invención es dicha composición farmacéutica puede ser para el tratamiento de cáncer.
Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.
Otro aspecto de la invención es un método de tratamiento de un paciente que padece cáncer administrando un anticuerpo acoplado a un agente terapéutico o de diagnóstico digoxigenado según la invención a un paciente en necesidad de tal tratamiento.
Como se usa en el presente documento, “vehículo farmacéutico” incluye todos y cada uno de los disolventes,
15 medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión).
Una composición de la presente invención puede administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como será apreciado por el experto, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención por ciertas vías de administración puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un
25 diluyente. Diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y disoluciones tampón acuosas. Vehículos farmacéuticos incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones inyectables estériles o dispersión. Se conoce en la técnica el uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas.
Los términos “administración parenteral” y “administrado parenteralmente”, como se usan en el presente documento, significan modos de administración distintos de administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intrarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
35 Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto por procedimientos de esterilización, arriba, como por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede desearse incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede provocarse por la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se
45 formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos para aquellos expertos en la técnica.
Los niveles de dosificación actuales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse de manera que se obtenga una cantidad del principio activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición y modo de administración, sin ser tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de eliminación del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares
55 empleadas, la edad, sexo, peso, afección, salud general e historia médica previa del paciente que está tratándose, y factores similares muy conocidos en las ciencias médicas.
La composición debe ser estéril y fluida hasta el punto que la composición sea administrable por jeringa. Además del agua, el vehículo es preferentemente una solución salina tamponada isotónica.
La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro sódico en la composición.
El término cáncer, como se usa en el presente documento, se refiere a enfermedades proliferativas, tales como linfomas, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer de pulmón de células bronquioalveolares, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o el cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal,
5 cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de la vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje espinal, glioma del tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma de pituitaria y sarcoma de Ewing, incluyendo versiones resistentes al tratamiento de cualquiera de los cánceres anteriores, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.
15 Como se usa en el presente documento, las expresiones “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se usan indistintamente y todas aquellas designaciones incluyen progenie. Así, las palabras “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula sujeto primaria y cultivos derivados de la misma sin considerar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Está incluida la progenie de variante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada en la célula originalmente transformada. Si se prevén distintas designaciones, será evidente del contexto.
El término “transformación”, como se usa en el presente documento, se refiere al proceso de transferir un
25 vector/ácido nucleico a una célula huésped. Si se usan células sin las formidables barreras de pared celular como células huésped, la transfección se lleva a cabo, por ejemplo, por el método de precipitación con fosfato de calcio como se describe por Graham y Van der Eh, Virology 52 546ff (1978). Sin embargo, también pueden usarse otros métodos para introducir ADN en células tales como por inyección nuclear o por fusión de protoplastos. Si se usan células procariotas o células que contienen construcciones de pared celular sustanciales, por ejemplo, un método de transfección es el tratamiento con calcio usando cloruro de calcio como se describe por Cohen, F. N, et al., PNAS. 69 (1972) 7110ff.
Como se usa en el presente documento, “expresión” se refiere al proceso por el que un ácido nucleico se transcribe en ARNm y/o al proceso por el que el ARNm transcrito (también denominado transcrito) se traduce posteriormente
35 en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan conjuntamente producto génico. Si el polinucleótido se deriva de ADN genómico, la expresión en una célula eucariota puede incluir corte y empalme del ARNm.
Un “vector” es una molécula de ácido nucleico, en particular auto-replicante, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada a y/o entre células huésped. El término incluye vectores que sirven principalmente para la inserción de ADN o ARN en una célula (por ejemplo, integración cromosómica), replicación de vectores que sirven principalmente para la replicación de ADN o ARN, y vectores de expresión que sirven para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. También se incluyen vectores que proporcionan más de una de las funciones como se describen.
45 Un “vector de expresión” es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula huésped apropiada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Un “sistema de expresión” normalmente se refiere a una célula huésped adecuada que comprende un vector de expresión que puede servir para dar un producto de expresión deseado.
Breve descripción de las figuras:
Figura 1: ARNm aislados de 19-11 de hibridoma de <DIG>. Figura 2: Fragmentos de PCR generados a partir de ARNm de 19-11. Figura 3: Estructura predicha de Fv de <DIG> murino.
55 Figura 4: Estructura predicha de Fv de <DIG> humanizado. Figura 5: Purificación de IgG <Dig> humanizada. a) Modelo esquemático de IgG <Dig> humanizada, b): SDSPAGE reductora, c): HP-cromatografía de exclusión por tamaño. Figura 6: Purificación de la variante biespecífica <IGF1R> <Dig> humanizada. a): Modelo esquemático de anticuerpo biespecífico <IGF1R> <Dig> humanizado, b): SDS-PAGE reductora, c): HP-cromatografía de exclusión por tamaño (1 mg/ml). Figura 7: Purificación de la variante biespecífica <Her2> <Dig> humanizada. a): Modelo esquemático del anticuerpo biespecífico <Her2> <Dig> humanizado, b): SDS-PAGE reductora, c): HP-cromatografía de exclusión por tamaño (1 mg/ml). Figura 8: a) Modelos esquemáticos de IgG <Dig> humanizada (b) Modelo esquemático del anticuerpo
65 biespecífico <IGF1R> <Dig> humanizado, (c) Modelo esquemático del anticuerpo biespecífico <Her2> <Dig>
humanizado d) Los niveles de expresión se facilitan en rendimientos de proteína (mg de proteína purificada por litro de sobrenadante de cultivo celular en tales experimentos de expresión transitoria no optimizados). Figura 9: Niveles de expresión, agregación y estabilidad del anticuerpo biespecífico <Her2> <Dig> humanizado antes y después de la estabilización con disulfuro. a) Modelo esquemático de <Her2> <Dig>-2320 (no estabilizado) b) modelo esquemático de <Her2> <Dig>-2321 (estabilizado con disulfuro) c) Niveles de expresión, agregación y estabilidad del anticuerpo biespecífico <Her2> <Dig> humanizado antes y después de la estabilización con disulfuro. Figura 10: Unión del anticuerpo IgG <Dig> humanizado recombinante y el anticuerpo 19-11 <Dig> murino derivado de hibridoma a antígenos digoxigenados. Se analizaron las propiedades de unión por tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando un instrumento Biacore T100 o Biacore 3000. a) Anticuerpo IgG <Dig> humanizado. Unión de DIG-BP4 a IgG <DIG> hu, KD= <76 pM b) Anticuerpo IgG <Dig> humanizado. Unión de Eg5-ARNip-DIG a IgG <DIG> hu, KD= 12 nM c) Anticuerpo IgG <Dig> humanizado. Unión de Eg5-ARNip-(2x)DIG a IgG <DIG> hu, KD= 8 pM. d) Anticuerpo 19-11 <Dig> murino derivado de hibridoma. Unión de DIG-BP4, KD= 33 nM e) Anticuerpo 1911<Dig> murino derivado de hibridoma. Unión de Eg5-ARNip-DIG, KD= 269 pM f) Anticuerpo 19-11 <Dig> murino derivado de hibridoma. Unión de Eg5-ARNip-(2x)DIG, KD = 17 pM. Figura 11: Unión del anticuerpo biespecífico <Her2> <Dig> humanizado recombinante a antígenos digoxigenados. Se analizaron las propiedades de unión por tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando un instrumento Biacore T100 o Biacore 3000. a) Unión de DIG-BP4 KD= 68 pM b) Unión de Eg5-ARNip-DIG, KD= 35 nM c) Unión de Eg5-ARNip-(2x)DIG, KD= 162 pM. Figura 12: Unión de proteína de fusión de <Dig>-scFV estabilizado con disulfuro humanizado recombinante a DIG-RNasas (humanas y bovinas). Se analizaron las propiedades de unión por tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando un instrumento Biacore T100 o Biacore 3000. Figura 13: Unión del anticuerpo biespecífico <Her2> <Dig> estabilizado 44-100 murino recombinante a antígenos digoxigenados. Se analizaron las propiedades de unión por tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando un instrumento Biacore T100 o Biacore 3000. a) Unión de Eg5-ARNip-DIG, KD= 467 pM c) Unión de Eg5-ARNip-(2x)DIG, KD= 40 pM. Figura 14: Estructura de complejos de péptido -digoxigenina. Figura 15: Actividad biológica de los péptidos melitina, Fallv1 y Fallv2 y sus variantes modificadas con DIG. a) H322M tratado con Dig-melitina, b) H322M tratado con melitina, c) H322M tratado con FALLv1, d) H322M tratado con Dig-FALLv1, e) H322M tratado con FALLv2, f) H322M tratado con Dig-FALLv2. Figura 16: Los complejos de IgG con péptidos digoxigenados retienen la especificidad y afinidad de unión hacia los antígenos de la superficie celular, independiente del orden de unión. a) Unión a aditivo de DIG-INF7 e IGF1R a <IGF1R> <Dig>, b) unión aditiva de DIG-FALL e IGF1R a <IGF1R> <Dig>. Figura 17: Administración específica de péptidos a células que expresan antígeno por aplicación de complejos de derivados de anticuerpos biespecíficos con péptidos digoxigenados. a) Estructura esquemática b) FALLv1 b) Fam5b. Figura 18: Generación y composición de doxorubicina digoxigenada. Figura 19: La cromatografía de exclusión por tamaño de complejo de doxorubicina digoxigenada-anticuerpo biespecífico <Her2>-<Dig> indica carga con doxorubicina digoxigenada y homogeneidad de moléculas cargadas. a) Cromatograma: 1: Her2 Dig Doxo (1:0) 2: Her2 Dig Doxo (1:0,5), 3: Her2 Dig Doxo (1:1), 4: Her2 Dig Doxo (1:2), 5: Her2 Dig Doxo (1:3), 6: Her2 Dig Doxo (1:5). 7: Her2 Dig Doxo (0:1), b) análisis. Figura 20: Direccionamiento específico del complejo de doxorubicina digoxigenada -anticuerpo biespecífico <IGF1R>-<DIG> a células IGF1R positivas. a) H322M tratadas con doxorubicina, b) H322M tratadas con DIGdoxorubicina c) H322M tratadas con <IGF1R> <Dig> 2321 cargado con DIG-doxorubicina. Figura 21: Direccionamiento específico del complejo de doxorubicina digoxigenada -anticuerpo biespecífico <Her2>-<DIG> a células Her2 positivas. a) KPL4 tratadas con doxorubicina, b) KPL4 tratadas con DIGdoxorubicina c) KPL4 tratadas con <Her2> <Dig> 2321 cargado con DIG-doxorubicina. Figura 22: Direccionamiento específico y acumulación endosómica de doxorubicina digoxigenada. 120' de incubación a 5,0 µg/ml. a) Doxorubicina sola, b) Dig-Doxorubicina. c) <IGF-1R>-Dig> Dig-Doxorubicina Figura 23: Estructura de Cy5 digoxigenada. Figura 24: La cromatografía de exclusión por tamaño del complejo de Cy5 digoxigenada-anticuerpo biespecífico <Her2>-<Dig> indica carga con Cy5 digoxigenada y homogeneidad de moléculas cargadas. a) Cromatograma: 1: Her2 Dig Cy5 (1:0) 2: Her2 Dig Cy5 (1:0,5), 3: Her2 Dig Cy5 (1:1), 4: Her2 Dig Cy5 (1:2), 5: Her2 Dig Cy5 (1:3), 6: Her2 Dig Cy5 (1:5). 7: Her2 Dig Cy5 (0:1), b) análisis. Figura 25: Análisis FACS de células Raji o Ramos incubadas con anticuerpo <CD22>-<Dig> acoplado a Cy5 digoxigenada. a) Células Raji CD22 positivas. La combinación de DIG-Cy5 se une muy bien al anticuerpo primario <CD22>-WT<Dig> biespecífico (pico único). Múltiples picos: Raji Cy5DIG, células Raji solas. b) Células Ramos CD22 positivas. La entidad secundaria sola (Cy5DIG) da solo un pequeño ruido de fondo y la combinación con CD22 WT-DIG tiene un desplazamiento más fuerte (pico único) que indica una unión específica a las células. Figura 26: Obtención de imágenes de tumores con anticuerpo <Her2>-<Dig> biespecífico acoplado a Cy5 digoxigenada: a) Estructura esquemática del anticuerpo <Her2>-<Dig> biespecífico, b) <Her2Dig>digCy5, NIRF 24 h después de la inyección iv.
Figura 27: Obtención de imágenes de tumores con anticuerpo <IGF1R>-<Dig> biespecífico acoplado a Cy5 digoxigenada. a) Estructura esquemática del anticuerpo <IGF1R>-<Dig> biespecífico b) <IGF1R-DIG-hu2> + DIG-Cy5. c) DIG-Cy5 Figura 28: Obtención de imágenes de tumores con anticuerpo <Her2>-<Dig> biespecífico acoplado a Cy5 digoxigenada. a) Estructura esquemática b) Inyección de Cy5 digoxigenada 48 h después de la inyección del anticuerpo <Her2>-<Dig> 2321. Eje y: Intensidad promedio de la señal de NIRF/tiempo de exp. (1/ms). Figura 29: Estructura esquemática de un ácido nucleico digoxigenado. B: adenina, guanina, citosina, uracilo, desoxitimidina; X: OH, H; Y: O, S; R: secuencia de ARN. Figura 30: Análisis de cromatografía de exclusión por tamaño con módulos que eligen diana biespecífica y ácidos nucleicos fluorescentemente marcados. a) Estructura esquemática b) cromatograma. Figura 31: Actividad biológica de ARNip digoxigenados. a) Inactivación de ARNm de Eg5 mediada por Eg5ARNip, CI50= 0,016 nM. Eje y: % de expresión, eje y: concentración de ARNip (nM); b) inactivación de ARNm de Eg5 mediada por DIG-Eg5-ARNip, CI50= 0,035 nM. Eje y: % de expresión, eje x: concentración de ARNip (nM); c) inactivación de ARNm de Eg5 mediada por DIG-Eg5-Cy5-ARNip, CI50= 0,013 nM. Eje y: % de expresión, eje x: concentración de ARNip (nM); d) citotoxicidad mediada por ARNip de Eg5 medida en KPL-4 transfectadas con ARNip de Eg5, CI50= 28 nM, eje y: número de células vivas, eje x: concentración de ARNip (nM); e) citotoxicidad mediada por ARNip de DIGEg5 medida en KPL-4 transfectadas con ARNip de DIG Eg5, CI50= 4 nM, eje y: número de células vivas, eje x: concentración de ARNip (nM) f) citotoxicidad mediada por ARNip de DIG-Eg5-Cy5 medida en KPL-4 transfectadas con ARNip de DIG-Eg5-Cy5, CI50= 215 nM, eje y: número de células vivas, eje x: concentración de ARNip (nM), g) citotoxicidad mediada por ARNip de Eg5 hacia células KPL4; células KPL4 transfectadas con 50 ng del ARNip respectivo, columna izquierda: no tratadas, columna media: ARNip de Eg5, columna derecha DIG-Eg5-ARNip. Se muestra el porcentaje de células vivas. Figura 32: Unión simultánea de ARNip digoxigenado y antígeno diana para el anticuerpo <Her2>-<Dig> biespecífico. Análisis Biacore. Figura 33: a) Análisis FACS de células Raji incubadas con anticuerpo <CD22>-<Dig> acoplado a ARNip digoxigenado y marcado con Cy5. El anticuerpo WT-DIG CD22 sobre células Raji en combinación con la muestra de DIG-ARNip-Cy5 muestra una señal positiva muy clara (pico único a 5 x 103) en comparación con DIG-ARNip-Cy5 solo / células Raji solas (pico doble a 102). b) Análisis FACS de células Ramos incubadas con anticuerpo <CD22>-<Dig> acoplado a ARNip digoxigenado y marcado con Cy5. La entidad secundaria (DIGARNip-Cy5) no da ruido de fondo (pico doble junto con células solo) mientras que CD22 WT DIG es positivo (pico único). Figura 34: Direccionamiento específico in vitro de ARNip acoplados a anticuerpos <Her2>-<Dig> biespecíficos. Arriba: Ejemplo del complejo de Ab-ARNip unido a la superficie en células KPL4 tras 30' de incubación a 37 ºC. a) Eg5 ARNip_CY5, b) Herceptina anti-kappa Alexa 488, c) Superposición; centro: Ejemplo de complejo de Ab-ARNip unido a la superficie en células MDAMB468 tras 30' de incubación a 37 ºC. d) Eg5 ARNip_CY5, e) Herceptina anti-kappa Alexa 488, f) Superposición; abajo: Ejemplo de complejo de Ab-ARNip unido a la superficie en células KPL4 tras incubación durante la noche a 37 ºC. g) Eg5 ARNip_CY5, h) HerceptinaDIG_hu2-SS, i) transferrina, j) superposición. Figura 35: Direccionamiento específico in vitro de ARNip acoplados a anticuerpos <IGFR1>-<Dig> biespecíficos. a)-d): Complejo de Ab-ARNip unido a la superficie en H322M, 10' de incubación a 37 ºC. a) Detección de Eg5-ARNip (cy5), b) detección de <IGF1R>-<DIG> (Alexa), c) transferrina, d) núcleos de células; e) -h): complejo de Ab-ARNip internalizado en H322M, 1 h de incubación a 37 ºC. e) Detección de Eg5ARNip (cy5), f) detección de <IGF1R>-<DIG> (Alexa), g) transferrina, h) núcleos de células. Figura 36: Direccionamiento específico in vitro de ARNip acoplados a anticuerpos <Her2>-<Dig> biespecíficos. a) Estructura esquemática de anticuerpos biespecíficos, b) imagen de NIRF 24 h después de la inyección. <Her2Dig>digdsADNCy5 Figura 37: Direccionamiento específico in vivo de ARNip acoplados a anticuerpos <IGFR1>-<Dig> biespecíficos. a) Estructura esquemática del anticuerpo biespecífico, b) imagen de NIRF Figura 38: a) Separación de ARNip de módulos de direccionamiento después de la internalización. A: <IgG><DIG>, B: Eg5ARNip_CY5 C: superposición b) separación de eGFP marcada con DIG de módulos de direccionamiento después de la internalización. Fila superior: 2 h sobre hielo, fila inferior: durante la noche a 37 ºC. A: eGFP, B: IgG, C: superposición c) Sin separación de ARNip covalentemente ligado de los módulos de direccionamiento después de la internalización. Fila superior: 1 h sobre hielo, fila inferior: durante la noche a 37 ºC A: ARNip, B: IgG, C: superposición. d) Sin separación de citrina covalentemente ligada de módulos de direccionamiento después de la internalización. Fila superior: 2 h sobre hielo, fila inferior: durante la noche a 37 ºC A: citrina B: IgG C: superposición. Figura 39: Direccionamiento específico de la actividad de ARNip para células diana por complejos de anticuerpo <IGFR1>-<Dig> biespecífico -ARNip digoxigenado. Niveles de ARNm de Eg5 en células H322M que expresan IGF1R (% y relación de Eg5/GAPHD). A: 50 nM <IGF1R-Dig>Dig-Eg5ARNip XnM <IGF1RDig>Dig-péptido INF7; B: 50 nM <IGF1R-Dig>Dig-Eg5ARNip XnM <IGF1R-Dig>Dig-péptido INF7; C: 50 nM <IGF1R-Dig>Dig-LUCARNip XnM <IGF1R-Dig>Dig-péptido INF7; D: 50 nM <IGF1R-Dig> XnM <IGF1RDig>Dig-péptido INF7. Figura 40: Funcionalidad del antígeno de complejos del anticuerpo <IGFR1>-<Dig> / <CD22>-<Dig> -DPC digoxigenado. a): H322M, IGF1R positivas. Solo el conjugado de H322M muestra un pico a aproximadamente 2* 102. Múltiples picos a 101: anticuerpo <IGFR1>-<Dig>, H322M secundarias solo, H322 <DIG>, isotipo de H322M y células H322M solo. b): Raji, CD22positivas. Solo el conjugado de Raji (complejo de <CD22>-<Dig>
DPC digoxigenado) muestra un pico a aproximadamente 2* 101. Múltiples picos: anticuerpo <CD22>-<Dig>, Raji secundarias solo, Raji <DIG>, isotipo de Raji y células Raji solo. Figura 41: Direccionamiento específico de complejos de anticuerpo <IGFR1>-<Dig> -DPC digoxigenado para células diana. 1: Dig-DPC + <IGFR1>-<Dig> biespec. 2: DPC (sin DIG) + <IGFR1>-<Dig> biespec. 3: Dig-DPC
+ <IGFR1>-<Dig> biespec. A: DPC, B: Anticuerpo C: núcleos de anticuerpo DPC. Figura 42: Direccionamiento específico de complejos de anticuerpo <Her2>-<Dig> -DPC digoxigenado para células diana. Ratones beis SCID que llevan KPL4 se inyectaron i.v. con DIG-DPC Cy3 <Her2>-<Dig> (fila superior) y DIG-DPC Cy3 sin anticuerpo (fila inferior), se muestra NIRF después de 24 h. Figura 43: DIG-eGFP que está complejado con un anticuerpo biespecífico se dirige específicamente a tumores que expresan el antígeno relacionado. a) Pico único: anticuerpo biespecífico LeY-DIG, picos múltiples: DIG sola, secundario solo, isotipo solo y células solas. b) Pico único: anticuerpo biespecífico LeY-DIG, múltiples picos: 1:3 de LeY/DIG-GFP, 1:2 de LeY/DIG-GFP y células solas. Figura 44: La proteína eGFP marcada con DIG puede usarse para monitorizar endocitosis de anticuerpo biespecífico unido a células diana. a) MCF7 1:2 de LeY/DIG-GFP pico gris: 37 ºC, pico negro: 4 ºC b) MCF7 1:3 de LeY/DIG-GFP pico gris: 37 ºC, pico negro: 4 ºC Figura 45: Cristales del fragmento Fab <Dig> y estructura experimentalmente determinada de la región de unión a digoxigenina del anticuerpo parental murino. (a) Recogida de datos cristalográficos y estadística de refinamiento del modelo, (b) Complejo del Fab anti-DIG murina en presencia de antígeno (representación en cinta, cadena L en azul, cadena H en verde) con resto de DIG unido (modelo de varillas codificadas por colores). Zoom (panel B) sobre CDR con bucles CDR marcados. El mapa de densidad electrónica 2FoFc final alrededor del resto de DIG se muestra como malla azul centrada en 1σ. La línea discontinua indica la dirección del conector a Cy5. El panel C muestra el potencial superficial electrostático de Fab murino con DIG unida. (c) Los residuos que revisten el bolsillo de unión están dibujados como modelo de varillas. Los residuos que participan en las interacciones de enlace de hidrógeno con DIG se representan como modelo de varillas. Latabla con enlaces de hidrógeno enumera componentes y distancias en Å. Figura 46: a) Representación de superficie de Fab murino anti-DIG. b) Representación en cinta de Fab murinos anti-DIG. c) y d) Los experimentos de resonancia de plasmones superficiales (BiaCore) muestran la especificidad y afinidad de unión mejorada de módulos anti-Dig humanizados optimizados para secuencias. c): <DIG> antes de la optimización, KD= 12 nM, d): <DIG> optimizada a VH 49, 57, 60 (Kabat). KD= 1nM.
Figura 47:
a) Formatos bi-y multiespecíficos que se basan en IgG de longitud completa como molécula maestra. b) Formatos bi-y multiespecíficos que están compuestos de fragmentos de anticuerpos más pequeños y dominios de proteína. Un péptido similar a colágeno sintético (GPP) x10 adopta una conformación de hélice triple de colágeno (CTH) y puede usarse una secuencia de nudo de cisteína (NCI) para ligar covalentemente construcciones trímeras de colágeno c) Proteínas de fusión de estreptavidina-Dig diana d)-x): Los experimentos de resonancia de plasmones superficiales (BiaCore) y FACS muestran la retención completa de la especificidad de unión de entidades que contienen módulos de unión de digoxigenina en diferentes formatos. d) y e) Análisis BiaCore de unión de IGF-1R: series de conc. 1,5625; 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50 nM. d): <IGF1R-DIG>4421 (30 nM) KD = 5 nM. e) <IGF1R-DIG-DIG> 2321_4421 (16 nM) KD = 2 nM. f) Resumen de unión y afinidad de anticuerpos <DIG> biespecíficos. g) -i) Análisis BiaCore de unión de <IGF1R> scFv-(G4s)3-G4T-<DIG> scFv-His6 25 nM. g) Estructura esquemática, h): AKH-61 10 nM + DIG-ARNip 50 nM + sIGF1R 25 nM i): DIG-ARNip 50 nM + sIGF1R 25 nM + AKH-61 10 nM j) Análisis de FACS de unión de IGF1R, pico gris: H322MAKH60 + anti-His + anti-ratón, pico negro: H322MAKH60 + anti-ratón k) Análisis FACS de unión de DIG l)-m) Análisis BiaCore de unión de <IGF1R> scFv-His6 -<IGF1R> scFv-His6-<DIG> scFv-CTH 25 nM. 1) estructura esquemática. n) AKH-68/66 10 nM + DIG-ARNip 50 nM + sIGF1R 25 nM m): DIG-ARNip 50 nM + sIGF1R 25 nM + AKH-68/66 10 nM o) Análisis FACS de unión de IGF1R. Pico único: AKH-68/66 + anti-His + anti-ratón, múltiples picos: AKH68/66 + anti-ratón, anti-His (+ anti-ratón), eje y de isotipo de ratón: % del máx. p) Análisis FACS de unión de DIG. Pico gris claro: DIG-Cy5, pico gris oscuro: AKH-68/66 + DIG-Cy5, pico negro: eje y de isotipo humano: % del máx. q)-s) Análisis BiaCore de unión de proteína de fusión de estreptavidina-Dig diana. q) Estructura esquemática, r) AKH-42 10 nM + sIGF1R 25 nM + Biotina-ARNip 50 nM. s): sIGF1R 25 nM + DIG-ARNip 50 nM + Biotina-ARNip 50 nM sobre AKH-42 10 nM
(t) Análisis de FACS de unión de IGF1R. Pico único: AKH-42 + anti-His + anti-ratón, múltiples picos: AKH42 + anti-ratón, anti-His (+ anti-ratón), eje y secundario de ratón: % de máx. u) Análisis de FACS de unión de DIG. Pico único: AKH-42 + anti-His + DIG-Cy5, múltiples picos: DIG-Cy5, células solo. v)-x) Análisis BiaCore de unión de <HER2> scFv-PExII -<DIG> scFv-His6 25 nM. v) Estructura esquemática, w) análisis BiaCore, x) análisis BiaCore, zoom.
Figura 48: Experimentos de direccionamiento de doxorubicina digoxigenada con anticuerpos biespecíficos <Dig>.
a) y b): Se trataron células MDA-MB-468 (Her2+/-) con doxorubicina (Fig. 48 a)) o doxorubicina digoxigenada (Fig. 48 b)) en las concentraciones indicadas durante 48 horas. c)-e): Se trataron células H322M (IGF1R+++) (Fig. 48 c)) KPL-4 (Her2+++) (Fig. 48 d)) y MDA-MB-468 (Her2+/-) (Fig. 48 e)) con complejos <Her2>-<Dig>-Dig-Dox o <IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox durante 48 h. Se evaluó la viabilidad celular aplicando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo (Promega, Madison, WI).
Figura 49: a) y b) La cromatografía de exclusión por tamaño del complejo de Cy5 digoxigenada/ anticuerpo <Her2>-<Dig> biespecífico indica relación de carga de 2:1 (DIG-Cy5: <Her2>-<Dig>) c) y d) Evaluación de SEC Figura 50: a) Sistema experimental y zoom en espectros de masas nativos no deconvolucionados para la determinación de vehículo con respecto carga de carga. Unión de Eg5-ARNip-(2x)Dig (panel superior) y Eg5ARNip-(1x)Dig (panel inferior) a <Her2-Dig> b) La espectroscopía de masas nativa indica la carga de 2 o menos cargas por vehículo que elige diana. Aplicando ácidos nucleicos mono-digoxigenados se observa que los vehículos que eligen diana cargados contienen más de una, pero no más de dos cargas por vehículo. La aplicación de ácidos nucleicos bi-digoxigenados produce elevada detección de moléculas con menores relaciones de carga, es decir, la mayoría de los vehículos están cargados con una carga. Esto indica relaciones de carga de una Dig por entidad de unión a Dig. Figura 51: a) y b) Vehículos para la administración de carga mediada por hapteno a diferentes antígenos de la superficie celular. c) Vehículos que eligen como diana VEGFR2, d) a g): Los experimentos de resonancia de plasmones superficiales muestran retención completa de la especificidad y afinidad de unión del direccionamiento de la superficie celular y módulos de unión a digoxigenina. d) Unión de Her2 y ARNip a <Her2-DIG-hu2>, e) Unión de <CD33>-<DIG> a la fusión de CD33-Fc humana (ligando) y unión adicional de DIG-ARNip, f) unión de anticuerpos anti-CD22 a CD22/Fc inmovilizado, g) unión aditiva de DIG-ARNip y LeY-HAS a <LeY>-<DIG>, h) unión de <CDCP1>-<DIG>. Figura 52: a) y b) Se muestra el resultado de un análisis de FACS de células MCF7 a) tratadas con los complejos DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 y CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 b) tratadas con los complejos DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 y LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 (panel inferior). LeY-DIG conduce a una fuerte acumulación de DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 sobre las células diana. c) Se muestran niveles de ARNm de Eg5/GAPDH de células MCF7 tratadas con DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5, CD22DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 o LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 para los momentos de tiempo indicados. La iARN es visible en todos los grupos, pero la pegajosidad inespecífica de DharmaFECT afecta la especificidad de LeY-DIG. Figura 53: Se muestra el resultado de un análisis FACS de células MCF7 tratadas con concentraciones crecientes de DIG-DPC-ARNip-Cy3 (25, 50, 100, 150 nM, Figura 53 a) o tratadas con concentraciones crecientes del complejo LeY-DIG/DIG-DPC-ARNip-Cy3 (25, 50, 100, 150 nM, Figura 53 b). LeY-DIG conduce a una fuerte acumulación de DIG-DPC-ARNip-Cy3 sobre las células diana. c) Se presentan niveles de ARNm de AhaI/GAPDH de células MCF7 tratadas con concentraciones crecientes de DIG-DPC-AhaI o el complejo CD22DIG/DIG-DPC-AhaI. d) Se muestran niveles de ARNm de AhaI/GAPDH de células MCF7 tratadas con concentraciones crecientes del complejo CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI, VEGFR2-DIG/DIG-DPC-AhaI o LeYDIG/DIG-DPC-AhaI. e) Se presentan niveles de ARNm de AhaI/GAPDH de células MCF7 tratadas con concentraciones crecientes de DIG-DPC-AhaI o el complejo CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI o LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI en comparación con DIG-DPC-GL3 o el complejo CD22-DIG/DIG-DPC-GL3 o LeY-DIG/DIG-DPC-GL3. f) Se representa el factor de especificidad de elección de diana contra el tiempo, que indica que se alcanza la mayor especificidad cuando se tratan células MCF7 durante 4-8 horas con LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI. Figura 54: a) y b): Intervalo de peso molecular de DIG-DPC-ARNip AHAI (Fig. 54a) y LeY-DIG/DIG-DPC-ARNip AHAI (Fig. 54 b) medido por SEC-MALLS. Curva negra: señal generada por el detector de LS; mientras que la línea gris: peso molecular generado de la señal del detector de LS y de RI; el peso molecular generado es solo una aproximación, debido a que el valor de dn/dc exacto para DIG-DPC-ARNip AHAI no se conoce y se estimó como 0,146, que es el valor de dn/dc para PEG. c) y d): Intervalo de radio hidrodinámico de DIG-DPC-ARNip AHAI (Fig. 54 c) y LeY-DIG/DIG-DPC-ARNip AHAI (Fig. 54 d) medido por SEC-MALLS. Curva negra: señal generada por el detector de LS; línea de puntos: radio hidrodinámico generado de la señal del detector de QELS. La adición de LeY-DIG conduce a la formación de complejos de LeY-DIG y DIG-DPC-ARNip AHAI. Figura 55: (a) Vehículos para la administración de carga mediada por hapteno que contienen diferentes entidades para la complejación de carga. b) a d) Los experimentos de resonancia de plasmones superficiales muestran la retención de la especificidad y afinidad de unión de elección del direccionamiento de la superficie celular, además de la funcionalidad de módulos de unión a biotina. Figura 56: (a) Complejos compuestos de anticuerpos biespecíficos <Dig>, ARNip digoxigenados y entidades que ayudan en la transfección que contienen módulos de unión a ARNip. (b) Los ensayos de desplazamiento en gel demuestran la complejación de las entidades que ayudan en la transfección que contienen módulos de unión a ARNip a ARNip digoxigenado y la formación de 'supercomplejos' con entidades de direccionamiento biespecíficas. (c) Reducción específica del ARNm de Aha1 usando la administración dirigida ayudada por módulos de péptido/proteína que se unen a ARNip y poseen funcionalidad de transfección.
Figura 57: Inactivación de ARNm mediada por ARNip en células MCF-7 tras el tratamiento con nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG complejadas con anticuerpos biespecíficos <Diana-Dig>. Se determinaron niveles de ARNm de AHAI (con respecto a GAPDH) en células MCF-7 de cáncer de mama que expresan el antígeno LeY, pero no CD22, tras 12 h de incubación con nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG 5 pre-incubadas con anticuerpos biespecíficos <Diana-DIG>. Eje y: concentración relativa de ARNm de AHA1 [%]
Ejemplos
Ejemplo 1: Aislamiento y caracterización de ADNc que codifican los dominios VH y VL de una kappa de IgG1<Dig> murina del clon de hibridoma de ratón 19-11
Un requisito previo para el diseño, generación, optimización y caracterización de anticuerpos <Dig> recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión de anticuerpos es la disponibilidad de proteína e información de secuencia (ADN). Por tanto, esta información tuvo que generarse para los dominios VH y VL del anticuerpo <Dig> murino 'original' del
15 clon de hibridoma 19-11. Las etapas experimentales que necesitaron realizarse posteriormente fueron (i) el aislamiento de ARN de células de hibridoma 19-11 productoras de <Dig>, (ii) conversión de este ARN en ADNc, a continuación en fragmentos de PCR que alojan VH y VL, y (iii) integración de estos fragmentos de PCR en vectores de plásmidos para la propagación en E. coli y determinación de sus secuencias de ADN (y proteína deducida).
Preparación de ARN de células de hibridoma 19-11:
Se preparó ARN a partir de 5x10e6 células de hibridoma que expresan anticuerpo (clon 19-11) aplicando el kit Rneasy (Qiagen). Brevemente, se lavaron las células sedimentadas una vez en PBS y se sedimentaron y posteriormente se resuspendieron para la lisis en 500 µl de tampón RLT (+β-ME). Las células se lisaron
25 completamente pasando a través de un Qiashredder (Qiagen) y a continuación se sometieron al procedimiento de purificación mediado por matriz (ETOH, columnas RNeasy) como se describe en el manual del fabricante. Después de la última etapa de lavado, se recuperó ARN de las columnas en 50 ul de agua libre de RNasa. La concentración de ARN recuperado se determinó cuantificando a A260 y A280 de muestras diluidas 1:20. La integridad (calidad, grado de degradación) de las muestras de ARN aisladas se analizó por electroforesis en gel de ARN desnaturalizante sobre geles de formamida-agarosa (véase el Manual de Maniatis). Ejemplos de estas electroforesis en gel de ARN se muestran en la Figura 1. Las bandas discretas representan los ARN ribosómicos 18s y 28s intactos. La capacidad de ser intacto (y relaciones de intensidad de aprox. 2:1) de estas bandas indica una buena calidad de las preparaciones de ARN. Los ARN aislados del hibridoma 19-11 se congelaron y se guardaron a -80 ºC en alícuotas.
35 Generación de fragmentos de ADN que codifican VH de 19-11 y VH por RACE PCR
Se preparó ADNc para las posteriores reacciones de (RACE-) PCR a partir de preparaciones de ARN de 19-11 aplicando el kit de reactivos FirstChoice (Ambion) usando las reacciones descritas para un protocolo de 5'-RLM RACE estándar. Se usó ADN polimerasa Pwo para la reacción de PCR. Para esto, se aplicaron 10 ug de ARN de 19-11 o ARN de control (de timo de ratón) y se procesaron como se ha descrito para integrar el adaptador de 5'RACE. Los presentes inventores no necesitaron aplicar la reacción de 'PCR externa' y avanzaron directamente a la 'PCR interna': Esto implicó combinar pares de cebadores que consisten en el cebador interno 5'RACE (del kit) y tanto cebadores específicos de C-kappa como de CH1. La secuencia de cebadores para cKappa para amplificar la
(SEQ ID NO. 15). La secuencia de cebadores región VH fue
(SEQ ID NO. 16). Para estas combinaciones de cebadores, las temperaturas de hibridación de 60 ºC son adecuadas y se han aplicado temperaturas entre 55 y 65 ºC /(PCR en gradiente) para realizar la PCR (94 ºC 0,5 min, 55-65 ºC 1 min -72 ºC 1min, 35 ciclos, completitud por extensión de 10 min a 72 ºC). La amplificación específica satisfactoria de la región VH o VL del anticuerpo que contiene fragmentos de ADN se refleja por la manifestación de fragmentos de 600 pb a 800 pb discretos de ADN. La Figura 2 muestra que estos fragmentos de ADN definidos se obtuvieron a partir de ARN de 19-11. Estos fragmentos de ADN contienen las secuencias codificantes de VH y VL del hibridoma <Dig> 19-11.
55 Clonación de los fragmentos de ADN que codifican VH y VH de 19-11 en plásmidos y determinación de sus secuencias de ADN y proteínas
Se aislaron fragmentos de PCR que codifican VH y VL por extracción en gel de agarosa y posterior purificación por técnicas de biología molecular convencionales (Manual de Maniatis). Los fragmentos de PCR purificados generados por Pwo se insertaron en el vector pCR bluntII topo aplicando el kit pCR bluntII topo (Invitrogen) siguiendo exactamente las instrucciones del fabricante. Las reacciones de ligación de Topo se transformaron en células competentes OneShot Topo 10 de E. coli. Después, los clones de E. coli que contenían vectores con tanto insertos que contenían tanto VL como VH se identificaron como colonias sobre placas de agar de LB-kanamicina. Posteriormente se prepararon plásmidos a partir de estas colonias y la presencia del inserto deseado en el vector se 65 confirmó por digestión con restricción con EcoRI. Debido a que el esqueleto del vector contiene sitios de
reconocimiento de restricción EcoRI que flanquean cada lado del inserto, los plásmidos que alojan los insertos se definieron por tener insertos que liberan EcoRI de aprox. 800 pb (para VL) o 600 pb (para VH). La secuencia de ADN y la secuencia de proteínas deducida de VL y VH de 19-11 se determinaron por secuenciación de ADN automatizada en múltiples clones para VH y VL. La secuencia de VL del clon de <Dig> 19-11 se representa en
5 SEQ ID NO. 1 y la secuencia de VH del clon <Dig> 19-11 se representa en SEQ ID NO. 2.
Ejemplo 2: Humanización de los dominios VH y VL de 19-11 mu<Dig>
El objetivo de la humanización de secuencias de anticuerpos es generar moléculas que retienen la funcionalidad completa de los anticuerpos originales de origen murino, pero que no alojan secuencias (o solo muy pocas o no relevantes) o estructuras que son reconocidas como 'extrañas' por el sistema inmunitario humano. Están disponibles y se han publicado diferentes procedimientos que pueden tratar este reto (Almagro JC, Fransson J Humanization of antibodies. Frontiers in bioscience: a journal and virtual library; 2008 Jan 1;13:1619-33, Hwang WY, Foote J Immunogenicity of engineered antibodies. Methods (San Diego, Calif.); 2005 May;36(1):3-10).
15 La funcionalidad de regiones variables de anticuerpos se determina por estructuras secundarias y terciarias (y cuaternarias), cuya formación, sin embargo, se basa en la secuencia primaria de VH y VL (y de entidades adyacentes y que interaccionan). Debido a esto, el reto principal de la humanización es retener (completamente) la funcionalidad definida por la estructura, a pesar de la necesidad de cambiar la secuencia de proteínas primaria en algunas posiciones. Así, el conocimiento de la estructura de regiones de anticuerpos funcionalmente importantes (regiones CDR) es muy importante para soportar la humanización. Para generar variantes derivadas de 19-11 mu<Dig> humanizados, los presentes inventores combinaron los siguientes procedimientos experimentales de laboratorio húmedo, además de por ordenador. A partir de (i) predicciones por ordenador del sitio de unión al antígeno de 19-11 mu<Dig>, los presentes inventores fueron capaces de (ii) predecir variantes de hu<Dig> por
25 ordenador con un alto grado de similitud humana, además de alta probabilidad para retener la funcionalidad completa. Finalmente, (iii) los presentes inventores determinaron experimentalmente la estructura (por rayos X) de (fragmentos de) anticuerpos <Dig> con y sin antígeno para validar y mejorar el modelo por ordenador de los presentes inventores.
Modelado por ordenador del sitio de unión al antígeno de 19-11 mu<Dig>
La base del modelo estructural por ordenador de los presentes inventores para la región Fv de 19-11 mu<Dig> son las secuencias de proteínas que se dedujeron de las secuencias de ARNm de VH y VL experimentalmente determinadas (descritas en el Ejemplo 1, SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2). Un modelo de estructura de la proteína 35 codificada por estas secuencias se generó por ordenador por modelado de homología del dominio Fv del anticuerpo murino combinado con minimización de energía. Para eso, las CDR y secuencias de la región estructural a aplicar para el modelado por homología se buscaron por separado para homología con la PDB (Protein DataBank). Para cada CDR y para las regiones estructurales, las estructuras más homólogas se superpusieron. Posteriormente se construyó un modelo a partir de la parte diferente para tanto las cadenas ligeras como pesadas, seguido de una minimización (de energía) del complejo. El modelo de estructura de la región Fv de 19-11 mu<Dig> que resultó del procedimiento de modelado por homología se muestra en la Figura 3. Una característica bastante particular de la estructura predicha es una importante cavidad que parece extenderse profundamente en la interfase VH-VL. El principal determinante para la formación de esta estrecha cavidad es el largo bucle de CDR3 de VH. El interior de la cavidad está revestido con una metionina (residuo más profundo), 2 serinas, 2 prolinas y algunas tirosinas (paredes
45 flanqueantes). Es razonable asumir que el antígeno digoxigenina que es reconocido por este anticuerpo está unido en un modo similar a hapteno en la cavidad profunda.
Cristalización y determinación de la estructura por rayos X de la región de unión de la región Fv anti-Dig murina en presencia de antígeno
Para permitir adicionalmente la optimización de las secuencias de VH y VL humanizadas del anticuerpo antidigoxigenina, los presentes inventores determinaron experimentalmente la estructura del anticuerpo parental (murino). Para esto, se generaron fragmentos Fab por digestión con proteasas de las IgG purificadas, aplicando métodos del estado de la técnica muy conocidos (digestión con papaína). Se separaron fragmentos Fab de los
55 fragmentos Fc restantes por cromatografía con proteína A (que elimina Fc), después se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño (columna de filtración en gel Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60, GE Healthcare, Suecia) para eliminar fragmentos de proteínas.
Para la cristalización, Fab purificados en His-HCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, y digoxigenina marcada con Cy5 (DIG-3-cme-dea-Cy5 = DIG-Cy5 / polvo) se complejaron con colorante fluorescente digoxigenado Cy5 (Dig-Cy5). Antes de los establecimientos de cristales, la disolución de proteína se concentró. Para la formación de complejos, DIG-Cy5 se disolvió en His-HCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, y se añadió a una relación molar final de 5:1 a la disolución de proteína concentrada. Se obtuvieron cristales de Fab murino en el complejo con DIG-Cy5 usando el método de difusión de vapor por gota colgante a 25 ºC después de mezclar 1 µl de disolución de proteína (24 mg/ml) 65 con 1 µl de disolución de depósito que contiene 60 % (v/v) de 2-metil-1,3-propanodiol (MPD) / acetato sódico 0,1 M
pH 4,6 / CaCl2 5 mM. Los cristales se congelaron rápidamente en cristales de nitrógeno líquido sin la necesidad de ninguna crioprotección adicional.
Se recogieron datos de difracción del Fab murino en complejo con DIG-Cy5 en X06SA (SLS, Villingen, Suiza) el 11
5 de septiembre de 2009. Los datos se integraron y se escalaron con XDS [Kabsch, W., Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J Appl Cryst, 1993. 21: p. 91624]. Los cristales del complejo pertenecen al grupo espacial P42212 con a=b=138,01 Å, c=123,696, α=β=γ=90° ydifractaron a una resolución de 2,8 Å.
La estructura se resolvió por sustitución molecular usando el programa BALBES [Long, F., et al., BALBES: a molecular-replacement pipeline. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2008. 64(Pt 1): p. 125-32] generando un modelo de búsqueda basado en estructuras con PDB ID 3cfd, 2a6d, 2a6j Debler, E.W., et al., Deeply inverted electron-hole recombination in a luminescent antibody-stilbene complex. Science, 2008. 319(5867): p. 1232-5; Sethi, D.K., et al., Differential epitope positioning within the germline antibody paratope enhances promiscuity in the primary immune 15 response. Immunity, 2006. 24 (4): p. 429-38): p. 429-38]. En total pudieron localizarse 2 moléculas de Fab en la unidad asimétrica. Los modelos iniciales se completaron y se refinaron por construcción de modelos manuales con el programa COOT [Emsley, P. and K. Cowtan, Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004. 60(Pt 12 Pt 1): p. 2126-32] y refinamiento usando el programa PHENIX [Zwart, P.H., et al., Automated structure solution with the PHENIX suite. Methods Mol Biol, 2008. 426: p. 419-35]. Después de las primeras rondas de refinamiento apareció una densidad electrónica de diferencia para el resto de DIG de DIG-Cy5. Se obtuvo un modelo para DIG de PDB ID similar [Korndorfer, I.P., S. Schlehuber, and A. Skerra, Structural mechanism of specific ligand recognition by a lipocalin tailored for the complexation of digoxigenin. J Mol Biol, 2003. 330(2): p. 385-96] y se generaron parámetros de refinamiento para DIG por la herramienta en línea PRODRG [Schuttelkopf, A.W. and D.M. van Aalten, PRODRG: a tool for high-throughput crystallography of protein-ligand
25 complexes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004. 60(Pt 8): p. 1355-63]. El modelo de DIG se puso en la densidad electrónica para las etapas de refinamiento final. Para la estadística de refinamiento véase la Figura 45a. Las figuras se prepararon con el programa PYMOL [DeLano, W.L., The PyMOL Molecular Graphics System. 2008].
Los resultados de la determinación de la estructura experimental se muestran en la Figura 45b: La forma cristalina obtenida contuvo dos complejos de Fab DIG-Cy5:anti-DIG independientes en la unidad asimétrica y pudieron construirse modelos atómicos para ambos complejos. El resto de DIG de DIG-Cy5 está bien ordenado en ambas moléculas de Fab en la unidad asimétrica, aunque parece estar unido en una molécula de la unidad asimétrica más estrechamente que en la otra. DIG está unida en un bolsillo localizado en la interfase de la cadena L y cadena H en el centro de la CDR. El átomo 032 de DIG está indicando hacia el fondo del bolsillo y el conector con Cy5 se localiza
35 fuera de e indica hacia el disolvente. Además de DIG, una clara densidad electrónica 2Fo-Fc es visible para el primer átomo de C del conector para Cy5 (panel B en la Figura 45b). Debido a la flexibilidad del conector ni el resto del conector ni Cy5 son visibles en el mapa de densidad electrónica. Este problema indica que el conector no está unido a la proteína y es suficientemente largo para permitir la unión de moléculas de diferente naturaleza y tamaño tal como colorantes, ARNip y otros a DIG sin influir en el reconocimiento de DIG por el anticuerpo.
De forma interesante, el bolsillo de unión no es completamente hidrófobo como era de esperar para una molécula hidrófoba como DIG, pero contiene algún potencial de carga positiva (Panel C en la Figura 45b). El bolsillo de unión está revestido por cuatro residuos de tirosina (57, 59, 109, 110), además de A33, W47, P61, P99 y M112 de la cadena pesada. De los residuos de la cadena ligera, Q89, S91, L94, P96 y F98 participan en la formación del
45 bolsillo. Los posibles constituyentes del enlace de hidrógeno N35 y Y36 de la cadena ligera forman la parte inferior del bolsillo, pero no son alcanzados por la DIG (Panel A en la Figura 45c).
Solo un enlace de hidrógeno directo participa en la unión de DIG y se forma entre 032 de DIG y Q89 de la cadena ligera. Dos enlaces de hidrógeno más no son directos, pero están mediados por moléculas de agua. 012 está interaccionando con el oxígeno del carbonilo de Y109 y la cadena lateral de S35 de la cadena pesada (Panel B en la Figura 45c). Se forma un cuarto enlace de hidrógeno entre 014 y el oxígeno del carbonilo del esqueleto de S91 (cadena L), pero está mediado de nuevo por una molécula de agua. Las comparaciones del número y longitudes de los enlaces de hidrógeno en ambas moléculas de la unidad asimétrica indican que en el segundo complejo la DIG no es capaz de entrar completamente en el bolsillo. En una molécula, el resto de DIG se sumerge relativamente
55 profundo en el bolsillo y forma cuatro enlaces de hidrógeno. La segunda DIG está unida más libremente, no entra en el bolsillo tan profundamente como en la otra molécula y solo forma tres enlaces de hidrógeno que son más débiles que en la otra molécula (Panel C en la Figura 45c).
Los resultados de la determinación experimental de la región de unión a una resolución de 2,8 Å permite la caracterización del modo de unión del ligando a su anticuerpo. Confirma adicionalmente que la estructura es generalmente similar al modelo de estructura que los presentes inventores predijeron por análisis por ordenador de la secuencia primaria (véase anteriormente). La disponibilidad de la estructura modelada por ordenador, además de la estructura 'real' experimentalmente determinada de la región variable del anticuerpo parental, es un requisito previo para el modelado detallado y mejora adicionalmente mediante ingeniería de proteínas de módulos de unión
65 de digoxigenina recombinante.
Definición de variantes humanizadas de 19-11 mu<Dig> que retienen funcionalidad completa
Se definieron secuencias de aminoácidos que representan dominios de VH y VL humanizados deseados aplicando un procedimiento que se basa en injerto de CDR e introducción de mutaciones adicionales que modulan la 5 especificidad y afinidad de unión. El principio básico subyacente a este procedimiento es la atribución de un 'valor de puntuación' para cada aminoácido que se diferencia de la secuencia de ratón entre las líneas germinales humanas. Esta puntuación se define por su supuesta influencia del cambio de aminoácidos en la capacidad de reconocimiento de antígenos o en la estabilidad del complejo. La línea germinal humana se selecciona basándose en su menor puntuación y su alto uso relativo. Se incluyen análisis de TEPITOPE (que predicen epítopes de linfocitos T) en este procedimiento de humanización con el objetivo de tener de alguno a ningún epítope de linfocitos T en la molécula humanizada resultante. Las secuencias 'humanas' inicialmente definidas por este procedimiento pueden necesitar ser sustituidas por las murinas (originales) cuando la puntuación es demasiado alta (que indica alta probabilidad de interferencia negativa). Esto se requiere lo más frecuentemente para cambios de aminoácidos en las CDR o en la región de alrededor de las secuencias de CDR. En algunos casos se requieren 'retro-mutaciones' a residuos
15 murinos, no solo en las CDR, sino también dentro de la región estructural para retener estabilidad y funcionalidad.
La variante de hu<Dig> resultante que los presentes inventores eligen se basa en la combinación de regiones estructurales humanas VH3_11 y VL1_39, y tiene un alto grado de similitud con la humana. Para VL, no fue necesario integrar ninguna retromutación en la región estructural de VK1_39 humana y el elemento j humano de líneas germinales de IGKJ4-01/02. Esto conduce a un alto carácter humano y un número relativamente bajo de alertas de TEPITOPE. La variante de VH se origina a partir de la línea germinal VH3_23 humana y J humana IGHJ601-2. La variante J se construye sobre la línea germinal VH3_11 humana. Además, usando la metodología de puntuación de los presentes inventores, los presentes inventores fueron capaces de introducir un aminoácido humano dentro de CDRS con el fin de aumentar el carácter humano y disminuir el número de alertas de TEPITOPE.
25 La secuencia de proteínas de VH humanizada (y fragmento Fd) se representa en SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4 y la secuencia de proteínas de VL humanizada (y cadena L) se muestra representada en SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6. A pesar de la cuidadosa aplicación del procedimiento establecido por los presentes inventores, todavía existe la posibilidad de que las alteraciones de secuencia que son parte de VH y VL humanizadas pudieran interferir con la integridad estructural de la región Fv. Debido a esto, los presentes inventores generaron otro modo de estructura de <Dig> aplicando el mismo procedimiento por ordenador que se ha descrito anteriormente a la secuencia de Fv humanizada. Esta estructura se muestra en la Figura 4. Una comparación de la estructura de mu<Dig> (Fig 3) y la estructura de hu<Dig> (Fig 4) indican entonces que el sitio de unión al antígeno no está afectado por los cambios de aminoácidos que se introdujeron dentro del transcurso de la humanización.
35 Generación de módulos de unión a digoxigenina con elevada afinidad
Se aplicó optimización adicional de las secuencias de VH y VL humanizadas del anticuerpo anti-digoxigenina para generar módulos con incluso mayor afinidad hacia digoxigenina. Basándose en las estructuras experimentalmente determinadas, además de predichas calculadas por ordenador (véase anteriormente, basándose en el modelado de la estructura sin determinación de estructura experimental), los presentes inventores identificaron tres posiciones enlas que las alteraciones podrían afectar la afinidad. Éstas se localizaron en (posiciones de Kabat) Ser49, Ile57 y Ala60 del dominio VH (Figura 46). La sustitución del aminoácido VHSer49 con Ala, VHIle57 con Ala y de VHAla60 con Pro generó derivados de anticuerpo con secuencias que se enumeran SEQ ID NO. 36 y SEQ ID NO. 37. Las entidades de unión que están compuestas de esta secuencia podrían expresarse y purificarse con tecnologías 45 estándar con proteína A y exclusión por tamaño (véase el Ejemplo 3 'Composición, expresión y purificación de anticuerpos <Dig> humanizados recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión biespecíficas). Las moléculas resultantes fueron completamente funcionales y mostraron afinidad mejorada hacia digoxigenina en comparación con la molécula parental humanizada. Esto se demostró por experimentos de resonancia de plasmones superficiales (BiaCore) (véase el Ejemplo 4 'Unión de anticuerpos <Dig> recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión biespecíficas a antígenos digoxigenados' para detalles). Los resultados de estos experimentos se muestran en la FIGURA 46 y demostraron que la afinidad hacia digoxigenina mejora aproximadamente 10 veces introduciendo mutaciones VH49, VH57 y VH60. La relevancia de estas posiciones se confirmó después inspeccionando la estructura experimentalmente determinada de la región variable de unión a dig. El módulo de unión a digoxigenina con afinidad mejorada puede aplicarse como entidad de unión a hapteno para diversos derivados de anticuerpos bi
55 y multiespecíficos.
Ejemplo 3: Composición, expresión y purificación de anticuerpos <Dig> humanizados recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión biespecíficas
Para caracterización más detallada, se combinaron módulos de <Dig> murinos y humanizados con regiones constantes de anticuerpos humanos, tanto para formar IgG humanizadas como para generar proteínas de fusión biespecíficas con otras secuencias de anticuerpos. La generación de IgG <Dig> humanizadas, y derivados biespecíficos que se unen a Dig, además de otras dianas (por ejemplo, tirosina cinasas de receptor Her2 o IGF1R) requirió (i) diseño y definición de secuencias de aminoácidos y nucleótidos para tales moléculas, (ii) expresión de
65 estas moléculas en células de mamífero cultivadas transfectadas, y (iii) purificación de estas moléculas de los sobrenadantes de células transfectadas.
Diseño y definición de secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de IgG <Dig> y derivados de anticuerpos biespecíficos que se unen a digoxigenina, además de Her2 o IGF1R
5 Para generar una IgG humanizada que aloja la especificidad de unión de la región Fv de 19-11 mu<Dig> murino (original), los presentes inventores fusionaron la secuencia de VH humanizada anteriormente definida en marco con el extremo N de CH1-CH2-CH3 de IgG1. Similarmente, los presentes inventores fusionaron la secuencia de VL humanizada anteriormente definida en marco con el extremo N de Ckappa. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas H y L de IgG de hu<her2><Dig> resultantes se representan en SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO.
9. Para generar derivados de anticuerpos biespecíficos que contienen la especificidad de unión de hu<Dig>, además de especificidades por la tirosina cinasa de receptor Her2, los presentes inventores fusionaron el módulo de Fv monocatenario de <Dig> definido por secuencias de VH y VL humanizadas en marco con el extremo C de la cadena H de un anticuerpo <Her2> previamente descrito (por ejemplo, patente de EE.UU. 5.772.997). Este módulo de scFv de <Dig> se estabilizó adicionalmente por introducción de un enlace disulfuro VH44-VL100 que se ha descrito
15 previamente (por ejemplo, Reiter Y, Brinkmann U, Lee B, Pastan I Engineering antibody Fv fragments for cancer detection and therapy: disulfide-stabilized Fv fragments. Nature biotechnology; 1996 Oct;14(10):1239-45). El aminoácido y las secuencias de los derivados de anticuerpos biespecíficos resultantes que se unen a Her2, además de digoxigenina, se representan en SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 9.
Para generar derivados de anticuerpos biespecíficos que contienen la especificidad de unión de hu<Dig>, además de especificidades por la tirosina cinasa de receptor IGF1R, los presentes inventores fusionaron el módulo de Fv monocatenario de <Dig> definido por secuencias de VH y VL humanizadas en marco con el extremo C de la cadena H de un anticuerpo <IGF1R> previamente descrito. Este módulo de scFv de <Dig> se estabilizó adicionalmente por introducción de un enlace disulfuro VH44-VL100 que se ha descrito previamente (por ejemplo, Reiter Y, Brinkmann
25 U, Lee B, Pastan I Engineering antibody Fv fragments for cancer detection and therapy: disulfide-stabilized Fv fragments. Nature biotechnology; 1996 Oct;14(10):1239-45). Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de los derivados de anticuerpos biespecíficos resultantes que se unen a IGF1R, además de a digoxigenina, se enumeran en SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 y SEQ ID NO. 12.
Expresión de IgG <Dig> y de derivados de anticuerpos biespecíficos que se unen a digoxigenina, además de a Her2
o IGF1R
La IgG <Dig> y los derivados de anticuerpos biespecíficos se expresaron por transfección transitoria de células 293F de riñón embrionario humano usando el sistema de expresión FreeStyle™ 293 según las instrucciones del 35 fabricante (Invitrogen, EE.UU.). Para esto, las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos biespecíficos correspondientes se construyeron en vectores de expresión que llevaban marcadores de selección pro-y eucariotas. Estos plásmidos se amplificaron en E. coli, se purificaron y posteriormente se aplicaron a transfecciones transitorias. Se usaron técnicas de cultivo celular estándar para la manipulación de las células como se ha descrito en Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. y Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. Las células 293-F FreeStyle™ en suspensión se cultivaron en medio de expresión FreeStyle™ 293 a 37 ºC/8 % de CO2 y las células se sembraron en medio fresco a una densidad de 1-2x106 células viables/ml el día de la transfección. Se prepararon complejos de ADN-293fectin™ en medio Opti-MEM I (Invitrogen, EE.UU.) usando 333 µl de 293fectin™ (Invitrogen, Alemania) y 250 µg de ADN de plásmido de la cadena pesada y ligera en una relación molar 1:1 para un volumen de transfección final de 250 ml. Los sobrenadantes de cultivo
45 celular que contenían IgG o anticuerpos biespecíficos se clarificaron 7 días después de la transfección por centrifugación a 14000 g durante 30 minutos y filtración a través de un filtro estéril (0,22 µm). Los sobrenadantes se almacenaron a -20 ºC hasta la purificación.
Para determinar la concentración de anticuerpos y derivados en los sobrenadantes de cultivo celular, se aplicó cromatografía HPLC de afinidad. Para eso, sobrenadantes de cultivo celular que contienen anticuerpos y derivados que se unen a la proteína A se aplicaron a una columna Applied Biosystems Poros A/20 en KH2PO4 200 mM, citrato de sodio 100 mM, pH 7,4, y se eluyeron de la matriz con NaCl 200 mM, ácido cítrico 100 mM, pH 2,5, sobre un sistema de HPLC UltiMate 3000 (Dionex). La proteína eluida se cuantificó por absorbancia UV e integración de las áreas de picos. Un anticuerpo IgG1 estándar purificado sirvió de patrón.
55 Purificación de IgG <Dig> y de derivados de anticuerpos biespecíficos que se unen a digoxigenina, además de a Her2 o IGF1R
7 días después de la transfección de los plásmidos de expresión, se recogieron los sobrenadantes de células HEK
293. El anticuerpo recombinante (derivados) se purificó del sobrenadante en dos etapas por cromatografía de afinidad usando proteína A-SepharoseTM (GE Healthcare, Suecia) y cromatografía de exclusión por tamaño Superdex200. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo clarificados que contenían anticuerpos biespecíficos y triespecíficos se aplicaron sobre una columna de proteína A HiTrap HP (5 ml) equilibrada con tampón PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 13 mM y KCl 2,7 mM, pH 7,4). Las proteínas no unidas se lavaron con
65 tampón de equilibrio. Los anticuerpos biespecíficos se eluyeron con tampón citrato 0,1 M, pH 2,8, y las fracciones que contenían proteína se neutralizaron con 0,1 ml de Tris 1 M, pH 8,5. Entonces, las fracciones de proteína eluida
se reunieron, se concentraron con un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) a un volumen de 3 ml y se cargaron sobre una columna de filtración en gel Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60 (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0. La concentración de proteína de anticuerpos y derivados purificados se determinó determinando la densidad óptica (DO) a 280 nm con la DO a 320
5 nm como corrección del ruido de fondo, usando el coeficiente de extinción molar calculado basándose en la secuencia de aminoácidos según Pace et. al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423. Se reunieron las fracciones de anticuerpo monomérico, se congelaron rápidamente y se guardaron a -80 ºC. Parte de las muestras se proporcionaron para la posterior analítica y caracterización de proteínas.
La homogeneidad de la construcción de anticuerpo DIGHu2 y las construcciones de DIG biespecíficas se confirmó por SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y tinción con azul brillante de Coomassie. Se usó el sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante (4-20 % de geles de Tris-glicina).
15 Bajo condiciones reductoras (Figura 5-7), se mostraron cadenas de polipéptidos relacionadas con la IgG y también fusiones de scFv del extremo C tras SDS-PAGE a tamaños moleculares aparentes análogos a los pesos moleculares calculados. Los niveles de expresión de todas las construcciones se analizaron por HPLC de proteína A y fueron similares a los rendimientos de expresión de IgG 'estándar' o en el caso de IGF-IRDIGHu2-2321 menores. Los rendimientos promedio de proteínas estuvieron entre 6 y 35 mg de proteína purificada por litro de sobrenadante de cultivo celular en tales experimentos de expresión transitoria no optimizada (Figura 8).
Se analizó el contenido total de muestras de anticuerpo biespecífico por SEC de alto rendimiento en un sistema de HPLC UltiMate 3000 (Dionex) usando una columna de exclusión de tamaño analítica Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia) en KH2PO4 200 mM, KCl 250 mM, pH 7,0, tampón de electroforesis a 25 ºC. Se inyectaron 25 µg de 25 proteína sobre la columna a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min y se eluyeron isocráticamente durante 50 minutos. Para los análisis de estabilidad, se prepararon concentraciones de 0,1 mg/ml, 1 mg/ml y 3 mg/ml de proteínas purificadas y se incubaron a 4 ºC, 37 ºC durante 7 días y a continuación se evaluaron por SEC de alto rendimiento. La integridad del esqueleto de aminoácidos de cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo biespecífico reducidas se verificó por espectrometría de masas NanoElectrospray Q-TOF después de la eliminación de N-glicanos por tratamiento enzimático con Peptide-N-Glycosidase F (Roche Molecular Biochemicals). Los análisis de agregados por análisis de HP-cromatografía de exclusión por tamaño de las proteínas purificadas mostraron (en comparación con IgG 'normales') una tendencia enormemente elevada a agregar moléculas que contenían scFv que no estuvieran estabilizadas con disulfuros entre cadenas entre VH y VL. Para tratar los problemas de agregación de tales anticuerpos biespecíficos, se aplicó la estabilización con disulfuro de los restos de scFv. Para eso, los presentes
35 inventores introdujeron sustituciones de una única cisteína dentro de VH y VL del scFv en posiciones definidas (posiciones VH44/VL100 según el esquema de numeración de Kabat). Estas mutaciones permiten la formación de disulfuros entre cadenas estables entre VH y VL, que a su vez estabilizan el módulo de scFv estabilizado con disulfuro resultante. La introducción de los disulfuros de VH44/VL100 en scFv en el extremo N y C de Fv conduce a una mejora significativa en los niveles de expresión de proteínas para todas las construcciones (Figura 9). Her2DIGHu2-2320 tuvo un rendimiento final después de la purificación de 1 mg mientras que Her2DIGHu2-2321 tuvo un rendimiento final de aproximadamente 32 mg.
Ejemplo 4: Unión de anticuerpos <Dig> humanizados recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión aantígenos digoxigenados
45 Los análisis que se describen a continuación se realizaron para evaluar si el procedimiento de humanización produjo derivados de <Dig> que habían retenido la actividad de unión completa. Para esto, se analizaron las propiedades de unión de los derivados de <Dig> recombinantes por tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando un instrumento Biacore T100 o Biacore 3000 (GE Healthcare BioSciences AB, Uppsala). Este sistema está bien establecido para el estudio de interacciones de moléculas. Permite una monitorización en tiempo real continua de las uniones de ligando/analito y así la determinación de las constantes de asociación (ka), constantes de disociación (kd) y constantes de equilibrio (KD) en diversos entornos de ensayo. La tecnología SPR se basa en la medición del índice de refracción próximo a la superficie de un chip biosensor recubierto de oro. Cambios en el índice de refracción indican cambios de masa sobre la superficie producidos por la interacción de ligando
55 inmovilizado con analito inyectado en disolución. Si las moléculas se unen a ligando inmovilizado sobre la superficie la masa aumenta, en caso de disociación la masa disminuye. Para realizar los estudios de unión, el anticuerpo anti-IgG humana de captura se inmovilizó sobre la superficie de un chip biosensor CM5 usando química de acoplamiento a amina. Se activaron celdas de flujo con una mezcla 1:1 de N-hidroxisuccinimida 0,1 M y 3-(N,Ndimetilamino)propil-N-etilcarbodiimida 0,1 M a una velocidad de flujo de 5 µl/min. Si no se describe de otro modo, el anticuerpo anti-IgG humana se inyectó en acetato sódico, pH 5,0 a 10 µg/ml, que produjo una densidad superficial de aproximadamente 12000 UR. Se trató una celda de flujo de control de referencia de la misma forma, pero con tampones de vehículo solo en lugar del anticuerpo de captura. Las superficies se bloquearon con una inyección de etanolamina 1 M /HCl a pH 8,5. Para comparar la unión de las variantes de proteína humanizadas con la de IgG de <Dig> murina del hibridoma 19-11 original, se inmovilizó anticuerpo anti-IgG de ratón de captura sobre la superficie
65 de un chip biosensor CM5 del mismo modo que se ha descrito anteriormente para el anticuerpo anti-IgG humana. Para evaluar la funcionalidad de los derivados de <Dig> recombinantes, la unión de los módulos de hu<Dig>
recombinantes, incl. (i) IgG humanizada, (ii) proteínas de fusión que alojan scFv de hu<Dig> o (iii) scFv estabilizados con disulfuro se ensayó con diferentes antígenos digoxigenados. Las afinidades de unión resultantes se compararon con la unión de DIG-IgG 'no mutante' murina de la que se derivaron los módulos humanizados recombinantes.
5 Comparación de 19-11 de <Dig> murino derivado de hibridoma con IgG <Dig> humanizada
Se inmovilizó anticuerpo anti-IgG de ratón sobre la superficie de un chip biosensor CM5 del mismo modo que se ha descrito anteriormente. El anticuerpo anti-IgG humana se inyectó a 2 µg/ml, que produjo una densidad superficial de aproximadamente 600 UR. La regeneración se llevó a cabo inyectando 0,85 % de H3PO4 durante 60 s a 5 µl/min e inyectando luego NaOH 5 mM durante 60 s a 5 µl/min para eliminar cualquier proteína no covalentemente unida después de cada ciclo de unión. Las muestras que iban a analizarse se diluyeron en HBS-P (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,005 % de tensioactivo P20) y se inyectaron a una velocidad de flujo de 5 µl/min. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue 3 min para los anticuerpos a una concentración entre 1 y 5 nM. Con el fin de medir las afinidades de unión, se inyectaron diferentes antígenos digoxigenados a concentraciones crecientes, que fueron
15 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 nM para DIG-BP4, y entre 0,018 y 300 nM para DIG-ARNip. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue 3 min, el tiempo de disociación (lavando con tampón de electroforesis) 5 min para cada molécula a una velocidad de flujo de 30 µl/min. Todas las interacciones se realizaron a 25 ºC (temperatura estándar). En caso del 19_11 de <DIG> murino, la disolución de regeneración de glicina 10 mM/HCl a pH 1,5 se inyectó durante 60 s a 30 µl/min de flujo para eliminar cualquier proteína no covalentemente unida después de cada ciclo de unión. En caso de la IgG de <Dig> humanizada, la regeneración se llevó a cabo inyectando 0,85 % de H3PO4 durante 60 s a 5 µl/min e inyectando luego NaOH 5 mM durante 60 s a 5 µl/min. Se detectaron señales a una tasa de una señal por segundo.
Los resultados de estos análisis, mostrados a modo de ejemplo en la Figura 10 y resumidos en la Tabla 3, indican
25 que la <Dig> humanizada recombinante se une a proteínas digoxigenadas y ácidos nucleicos con la misma funcionalidad y alta afinidad que el anticuerpo parental murino. Se encontró que la Kd del anticuerpo murino hacia proteína digoxigenada (Dig-BP4, patente europea EP 1545623 B1) era 33 pM, y que la del anticuerpo humanizado era <76 pM. Similarmente, se encontró que la Kd de anticuerpo murino hacia ácidos nucleicos digoxigenados (ARNip-Dig, véase el Ejemplo 11) era 269 pM, y que la del anticuerpo humanizado era 12 nM. Así, los presentes inventores llegan a la conclusión de que la funcionalidad del anticuerpo <Dig> se retuvo en su variante humanizada (que se define por las secuencias como se representan en SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6).
Comparación de 19-11 de <Dig> murino derivado de hibridoma con proteínas de fusión de <Dig>-Fv monocatenario 35 humanizadas recombinantes
Se inmovilizaron anticuerpos anti-IgG de ratón y anti-humana sobre la superficie de un chip biosensor CM5 del mismo modo que se ha descrito en la introducción del Ejemplo 4. Las muestras que iban a analizarse se diluyeron en HBS-P y se inyectaron a una velocidad de flujo de 5 µl/min. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue 3 min para los anticuerpos a una concentración entre 1 y 5 nM. Con el fin de medir las afinidades de unión se inyectaron diferentes antígenos digoxigenados a concentraciones crecientes, que fueron 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 nM para DIG-BP4, y entre 0,018 y 120 nM para DIG-ARNip. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue 3 min, el tiempo de disociación (lavando con tampón de electroforesis) 5 min para cada molécula a una velocidad de flujo de 30 µl/min. Todas las interacciones se realizaron a 25 ºC (temperatura estándar). La disolución de regeneración de
45 glicina 10 mM/HCl a pH 1,5 se inyectó durante 60 s a 30 µl/min de flujo para eliminar cualquier proteína no covalentemente unida después de cada ciclo de unión. Cuando se usaron RNasas como ligandos, la regeneración se llevó a cabo inyectando 0,85 % de H3PO4 durante 60 s a 5 µl/min e inyectando luego NaOH 5 mM durante 60 s a 5 µl/min. Se detectaron señales a una tasa de una señal por segundo.
Los resultados de estos análisis, mostrados a modo de ejemplo en la Figura 11 (resultados de 19-11 de <Dig> murino en la Figura 10) y resumidos en la Tabla 3, indican que el módulo de scFv de <Dig> humanizado recombinante que está presente en la proteína de fusión biespecífica aplicada (Her2-Dig, véase el Ejemplo 3) se une a proteínas digoxigenadas y ácidos nucleicos con la misma funcionalidad y alta afinidad que el anticuerpo parental murino. Se encontró que la Kd del anticuerpo murino hacia proteína digoxigenada (Dig-BP4) era 33 pM, y la de Fv
55 monocatenario humanizado era 68 pM. Similarmente, se encontró que la Kd del anticuerpo murino hacia ácidos nucleicos digoxigenados (ARNip-Dig, véase Ejemplo 11) era 269 pM, y que la del Fv monocatenario humanizado era 35 nM. Así, los presentes inventores llegan a la conclusión de que la funcionalidad del anticuerpo no mutante se retiene también en el módulo de scFv de <Dig> humanizado recombinante que está presente en proteína de fusión biespecífica (Her2-Dig, véase el Ejemplo 3).
Comparación de 19-11 de <Dig> murino derivado de hibridoma con proteínas de fusión de <Dig> humanizada recombinante -Fv monocatenario estabilizado con disulfuro
Se inmovilizaron anticuerpos anti-IgG de ratón y anti-humana sobre la superficie de un chip biosensor CM5 del
65 mismo modo que se ha descrito en la introducción del Ejemplo 4. En aquellos ensayos en los que se añadieron DIG-RNasas como ligando, se inmovilizaron anticuerpos anti-IgG humana sobre la superficie del chip inyectando 2 µg/ml,
que produjeron una densidad superficial de aproximadamente 600 UR. Las muestras que iban a analizarse se diluyeron en HBS-P y se inyectaron a una velocidad de flujo de 5 µl/min. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue 3 min para los anticuerpos a una concentración entre 1 y 10 nM. Con el fin de medir las afinidades de unión se inyectaron diferentes antígenos digoxigenados a concentraciones crecientes, que fueron entre 0,018 y 120 nM para 5 DIG-ARNip. Con el fin de visualizar la unión, las diferentes RNasas digoxigenadas (humanas y bovinas) se inyectaron en dos duplicados a una concentración de 50 nM para cada RNasa. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue 3 min, el tiempo de disociación (lavando con tampón de electroforesis) 5 min para cada molécula a una velocidad de flujo de 30 µl/min. Todas las interacciones se realizaron a 25 ºC (temperatura estándar). La disolución de regeneración de glicina 10 mM/HCl a pH 1,5 se inyectó durante 60 s a 30 µl/min de flujo para eliminar
10 cualquier proteína no covalentemente unida después de cada ciclo de unión. Se detectaron señales a una tasa de una señal por segundo.
Los resultados de estos análisis, mostrados a modo de ejemplo en la Figura 12 (resultados de 19-11 de <Dig> murino en la Figura 10) y resumidos en la Tabla 3, indican que el módulo de scFv de <Dig> humanizado estabilizado 15 con disulfuro recombinante que está presente en la proteína de fusión biespecífica aplicada (Her2-Dig, véase Ejemplo 3) se une a ácidos nucleicos digoxigenados con la misma funcionalidad y alta afinidad que el anticuerpo parental murino. Se encontró que la Kd del anticuerpo murino hacia ácidos nucleicos digoxigenados (ARNip-Dig, véase el Ejemplo 11) era 269 pM, y la del módulo de scFv de <Dig> humanizado estabilizado con disulfuro era 32 nM. Así, los presentes inventores llegan a la conclusión de que la funcionalidad del anticuerpo no mutante también
20 se retiene en el módulo de scFv de <Dig> humanizado estabilizado con disulfuro recombinante que está presente en la proteína de fusión biespecífica (Her2-Dig, véase el Ejemplo 3).
Comparación de 19-11 de <Dig> murino derivado de hibridoma con proteínas de fusión de <Dig> murina recombinante -Fv monocatenario estabilizado con disulfuro
25 Las muestras que iban a analizarse se diluyeron en HBS-P y se inyectaron a una velocidad de flujo de 5 µl/min. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue 3 min para los anticuerpos a una concentración entre 1 y 5 nM. Con el fin de medir las afinidades de unión se inyectaron diferentes antígenos digoxigenados a concentraciones crecientes, que fueron 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 nM para DIG-BP4, y entre 0,018 y 120 nM para DIG-ARNip. El tiempo de
30 contacto (fase de asociación) fue 3 min, el tiempo de disociación (lavando con tampón de electroforesis) 5 min para cada molécula a una velocidad de flujo de 30 µl/min. Todas las interacciones se realizaron a 25 ºC (temperatura estándar). La disolución de regeneración de glicina 10 mM/HCl a pH 1,5 se inyectó durante 60 s a 30 µl/min de flujo para eliminar cualquier proteína no covalentemente unida después de cada ciclo de unión. Se detectaron señales a una tasa de una señal por segundo.
35 Los resultados de estos análisis, mostrados a modo de ejemplo en la Figura 13 (resultados de 19-11 de <Dig> murino en la Figura 10) y resumidos en la Tabla 3, indican que el módulo de scFv de <Dig> estabilizado con disulfuro murino recombinante que está presente en la proteína de fusión biespecífica aplicada (Her2-Dig, véase el Ejemplo 3) se une a ácidos nucleicos digoxigenados con la misma funcionalidad y alta afinidad que el anticuerpo
40 parental murino. Se encontró que la Kd de anticuerpo murino hacia ácidos nucleicos digoxigenados (ARNip-Dig, véase Ejemplo 11) era 269 pM y que la del módulo de scFv de <Dig> murino estabilizado con disulfuro fue 467 pM. Así, los presentes inventores llegan a la conclusión de que la funcionalidad del anticuerpo no mutante también se retiene en el módulo de scFv de <Dig> estabilizado con disulfuro murino recombinante que está presente en la proteína de fusión biespecífica (Her2-Dig, véase el Ejemplo 3).
45 Tabla 3: Afinidades de unión de DIG-IgG 'no mutante' murino y derivados de <Dig> recombinantes a diferentes antígenos digoxigenados
DIG-BP4
ARNip-DIG ARNip-(2x)DIG
19-11 DIG-IgG murino
33 pM 269 pM 17 pM
DIG-IgG humanizada
< 76 pM 12 nM 8 pM
proteínas de fusión humanizadas de <Dig>-Fv monocatenario
68 pM 35 nM 162 pM
DIG-RNasa (humana o bovina)
ARNip-DIG ARNip-(2x)DIG
proteínas de fusión humanizadas de <Dig>-Fv monocatenario estabilizado con disulfuro
aproximadamente 1-2 nM 32 nM 246 pM
proteínas de fusión murinas de <Dig>-Fv monocatenario estabilizado con disulfuro
n.d. 467 nM 40 pM
Se realizó otro estudio de SPR en el que la afinidad de unión de <DIG>-hu2, IGF1R-DIG y <DIG>M-19-11 se 50 comparó en términos de unión a la proteína mono-digoxigenada DIG-mioglobina. Las afinidades de unión de <DIG>hu2 y el <DIG>-scFv estabilizado con disulfuro a DIG-Mio son comparables (∼ 15-25 nM) y la afinidad de <DIG>M
19-11 murino fue aproximadamente cien veces mejor que la que también se ha descrito para la unión de ácido nucleico mono-digoxigenado (véase anteriormente). Las afinidades mucho mayores de <DIG>-hu2 por DIG-BP4 (<76 pM, véase la Tabla 3) y el <DIG>-scFv estabilizado con disulfuro por DIG-BP4 (68 pM, véase la Tabla 3) en comparación con sus afinidades por DIG-mioglobina (véase la Tabla 3a) son lo más probablemente debidas a un efecto de la afinidad de unión a DIG-BP4, debido a que la proteína DIG-BP4 lleva más de una molécula de DIG sobre su superficie.
Tabla 3a)
Anticuerpo
Analito ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
<DIG>hu2 <DIG>hu2
DIG-Mioglobina Repl. DIG-ARNip2349 Repl. 6,20E+05 7,49E+05 6,45E+05 6,28E+05 9,82E-03 8,81E-03 9,37E-03 9,80E-03 1,58E-08 1,18E-08 1,45E-08 1,56E-08
<IGF1R-DIG>2321 <IGF1R-DIG>2321
DIG-Mioglobina Repl. DIG-ARNip2349 Repl. 3,92E+05 4,40E+05 4,29E+05 4,93E+05 1,05E-02 1,07E-02 1,17E-02 1,23E-02 2,69E-08 2,43E-08 2,73E-08 2,51E-08
<DIG>M-19-11 <DIG>M-19-11
DIG-Mioglobina Repl. DIG-ARNip2349 Repl. 1,75E+06 2,28E+06 3,27E+06 2,26E+06 6,76E-04 6,75E-04 9,03E-04 8,38E-04 3,86E-10 2,95E-10 2,76E-10 3,71E-10
10 Pueden generarse entidades de unión a digoxigenina bi-y multiespecíficas con diferentes formatos
Los módulos de unión de digoxigenina pueden conectarse a entidades dirigidas a células en una variedad de formatos. Por ejemplo, no solo pueden aplicarse fragmentos de anticuerpos 'clásicos' y módulos derivados de anticuerpos tales como Fab o Fv para esto, sino también entidades similares a anticuerpos de un único dominio que 15 se han descrito previamente en la bibliografía. Además de las fusiones de los extremos C con la cadena H (representadas a modo de ejemplo en la Figura 6 y usadas como ejemplo para muchos análisis), se han producido formatos adicionales en el laboratorio de los presentes inventores y se evaluaron funcionalmente. La Figura 47 a muestra una selección de moléculas, basándose en las IgG de longitud completa como molécula maestra, que segeneraron para lograr administración de carga mediada por haptenos a células que expresan antígeno diana. Éstas 20 incluyen como ejemplos fusiones de scFv (estabilizadas con disulfuro) al extremo C de las cadenas L de IgG, fusiones de Fab monocatenarios a extremos C de tanto CH3 como C-kappa, fusiones de scFv (y/o scFab) a cadenas L, además de a cadenas H, para generar moléculas hexavalentes. Además, se produjeron satisfactoriamente entidades trivalentes, incluidas trivalentes que contienen Fv estabilizados con disulfuro sin conectores monocatenarios, y pueden aplicarse para la administración de carga mediada por hapteno. También se generaron
25 entidades biespecíficas que contenían proteínas fluorescentes fusionadas. Las secuencias de aminoácidos que se aplicaron para generar los diferentes formatos se enumeran como SEQIDNO. 38 -SEQIDNO. 45. Todas las moléculas pudieron expresarse en células de mamífero y purificarse con buenos rendimientos con tecnologías estándar de proteína A y de exclusión por tamaño (véase el Ejemplo 3 'Composición, expresión y purificación de anticuerpos de <Dig> humanizados recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión biespecíficas).
30 La Figura 47b y c muestran una selección de moléculas de tamaño más pequeño que aquellas que se basan en las IgG de longitud completa como molécula maestra. Estas moléculas están compuestas de fragmentos de anticuerpos más pequeños, pero también se generaron para lograr administración de carga mediada por hapteno a células que expresan antígeno diana. Módulos más pequeños pueden tener mejores propiedades de penetración de tejido y
35 tumor y tener una farmacocinética diferente en comparación con entidades derivadas de IgG. La composición modular de moléculas más pequeñas permite además la adición y expresión recombinante de módulos adicionales, por ejemplo, para la unión de biotina (por ejemplo, estreptavidina o avidina), o de entidades que pueden facilitar la entrada en células (por ejemplo, dominios de translocalización de patógenos). Las secuencias de aminoácidos que se aplicaron para generar los diferentes formatos se enumeran como SEQ ID NO. 46 -SEQ ID NO. 50. Todas estas
40 moléculas pudieron expresarse y purificarse por tecnologías de cromatografía de afinidad y exclusión de tamaño para caracterización adicional.
Las FIGURAS 47c) -47 o) muestran que todas estas moléculas de los diferentes formatos retuvieron completamente la especificidad de elección diana, además de la competencia de unión a digoxigenina como 45 requisito previo para la administración de carga: Esto se demostró por experimentos de resonancia de plasmones superficiales (BiaCore) (véase el Ejemplo 4 'Unión de anticuerpos de <Dig> recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión específicas a antígenos digoxigenados' para detalles) y análisis de FACS (véase el Ejemplo 10 'Cy5 digoxigenada y complejos con anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> retienen la unión específica a diana y características de fluorescencia que pueden usarse para la obtención de imágenes in vitro e in vivo' para detalles). 50 Los resultados de estos experimentos se muestran en las FIGURAS 47c) a 47o) y demuestran que la capacidad de unión hacia digoxigenina es comparable a los restos de unión a digoxigenina parental que se aplicaron como módulos recombinantes. Además, la especificidad por el reconocimiento del antígeno que elige diana también siguió
sin comprometerse en los diversos formatos. Así, pueden aplicarse muchos formatos diferentes como vehículos para la administración de carga dirigida mediada por hapteno.
Ejemplo 5 Generación de complejos definidos de péptidos digoxigenados con <Her2>-<Dig> y <IGF1R>5 <Dig> biespecíficos
Los complejos de péptidos digoxigenados con derivados de anticuerpos biespecíficos que contienen módulos de unión a Dig recombinantes pueden conferir comportamiento biofísico benigno y parámetros PK mejorados a péptidos. Además, tales complejos son capaces de dirigir los péptidos a células que muestran el antígeno que es reconocido por la variante de anticuerpo biespecífico. Estos complejos están compuestos de una IgG <Diana>-<Dig> humanizada que une en sus dos sitios de unión a Dig de alta afinidad dos péptidos digoxigenados (uno en cada sitio). Se desea que los péptidos retengan buena actividad biológica a pesar de estar digoxigenados, además de mientras que están complejados con el anticuerpo. También se desea que el sitio de unión diana de la superficie celular del derivado de anticuerpo biespecífico retenga su especificidad y afinidad de unión en presencia de péptidos
15 digoxigenados complejados.
Los péptidos que los presentes inventores han usado como ejemplos para evaluar esta tecnología son melitina, INF7, FALLLv1, FALLv2 y Fam5b. Los tres últimos péptidos se han identificado en un cribado para péptidos bioactivos de origen humano (que van a describirse por separado). La actividad biológica de los péptidos puede evaluarse in vitro determinando sus efectos citotóxicos hacia líneas celulares tumorales humanas in vitro.
Las secuencias de aminoácidos de estos péptidos son las siguientes:
Pueden aplicarse complejos biespecíficos de péptidos digoxigenados con variantes de anticuerpos <Diana><DIG>
35 biespecíficos para dirigir los péptidos específicamente a células que expresan el antígeno diana. Así, los péptidos accederán selectivamente a las células que son reconocidas por antígenos de superficie, la citotoxicidad mediada por péptidos debe potenciarse sobre células que expresan antígeno.
Para la generación de tales complejos de anticuerpo biespecífico para el direccionamiento selectivo, es necesario (i) acoplar digoxigenina mediante conectores adecuados al péptido de un modo que permita que el péptido retenga su actividad; (ii) generar y caracterizar complejos de péptidos digoxigenados con la IgG <Diana><Dig> biespecífica. Estos complejos deben formarse de una manera definida (2 péptidos de Dig se unen a 1 IgG <Dig>). (iii) asegurar que estos complejos retengan la actividad del péptido, además de la especificidad y afinidad del anticuerpo que elige diana, para mediar en la elevada actividad biológica mediada por péptidos (específicos) sobre células que expresan
45 el antígeno que elige diana.
Generación de péptidos con cisteína del extremo amino para conjugación de digoxigenina
Se realizaron síntesis de péptidos según protocolos establecidos (FastMoc 0,25 mmoles) en un sintetizador de péptidos automatizado ABI 433A de Applied Biosystems usando química de Fmoc. En ciclos iterativos, las secuencias de péptidos se ensamblaron por acoplamiento secuencial de los aminoácidos de Fmoc correspondientes. En cada etapa de acoplamiento, el grupo Fmoc del extremo N se eliminó por tratamiento de la resina (3 x 2,5 min) con 20 % de piperidina en N-metilpirrolidona. Los acoplamientos se llevaron a cabo empleando aminoácidos protegidos con Fmoc (1 mmol) activados por HBTU/HOBt (1 mmol cada uno) y DIPEA (2 mmoles) en 55 DMF (45-60 min de vórtex). Después de cada etapa de acoplamiento, los grupos amino sin reaccionar se taparon mediante tratamiento con una mezcla de Ac2O (0,5 M), DIPEA (0,125 M) y HOBt (0,015 M) en NMP (10 min de vórtex). Entre cada etapa, la resina se lavó ampliamente con N-metilpirrolidona y DMF. La incorporación de aminoácidos estéricamente impedidos se llevó a cabo en acoplamientos dobles automatizados. Para este fin, la resina se trató dos veces con 1 mmol del bloque de construcción activado sin una etapa de tapado entre los ciclos de acoplamiento. Tras completarse las secuencias diana, se acopló ácido Fmoc-12-amino-4,7,10-trioxadodecanoico (TEG-espaciador) a los péptidos FAM5B y INF7 usando condiciones de acoplamiento de aminoácidos estándar. Posteriormente, se unió Fmoc-Cys(Trt)-OH al extremo amino de todas las secuencias de péptidos (FAM5B y INF7 con espaciador, melitina, FALLv1 y FALLv2 sin espaciador). Después de la desprotección de Fmoc final, la resina de péptido se colocó en una frita de filtración y se trató con una mezcla de ácido trifluoroacético, agua y
triisopropilsilano (19 ml : 0,5 ml : 0,5 ml) durante 2,5 h. La disolución de escisión se filtró y los péptidos se precipitaron mediante la adición de éter diisopropílico frío (0 ºC) (300 ml) para suministrar un sólido incoloro, que se lavó repetidamente con éter diisopropílico. El producto en bruto se volvió a disolver en una mezcla de ácido acético/agua, se liofilizó y posteriormente se purificó por HPLC de fase inversa preparativa empleando un gradiente
5 de acetonitrilo/agua que contenía 0,1 % de TFA (columna Merck Cromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm).
Acoplamiento de péptidos con cisteína del extremo amino a digoxigenina
A una disolución del péptido modificado con cisteína correspondiente (6-20 mg) en un tampón KPO4 0,1 M (1 ml) se añadió una cantidad equimolar de digoxigenina-3-carboxi-metil-etilamidomaleimida disuelta en 100 µl de DMF. La mezcla de reacción se rodó suavemente durante 2-20 h a temperatura ambiente, se filtró y el compuesto diana se aisló por HPLC de fase inversa preparativa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía 0,1 % de TFA (columna Merck Cromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm). Después de la liofilización se obtuvo el conjugado de digoxigenina-péptido como un sólido incoloro.
15 El peso molecular del péptido melitina es 2949,64, el peso molecular del conjugado de péptido-Dig resultante es 3520,33. El peso molecular del péptido FALLv1 es 4710,59, el peso molecular del conjugado de péptido-Dig resultante es 5384,43. El peso molecular del péptido FALLv2 es 4791,76, el peso molecular del conjugado de péptido-Dig resultante es 5465,59. El peso molecular del péptido Fam5b es 3634,37, el peso molecular del conjugado de péptido-Dig resultante es 5410,47. El peso molecular del péptido INF7 es 2896,25, el peso molecular del conjugado de péptido-Dig resultante es 3466,94. Hasta el momento de la complejación con el anticuerpo, los presentes inventores guardaron el conjugado en alícuotas disueltas en H2O a -20 ºC. La Figura 14 representa esquemáticamente la composición de los complejos de péptido -digoxigenina.
25 Complejación de péptidos digoxigenados con anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> recombinantes
Se usaron anticuerpos biespecíficos <IGF1R>-<Dig> recombinantes y anticuerpos biespecíficos <Her2>-<Dig> como componentes de proteína de la reacción de acoplamiento. La composición y purificación de estas moléculas se ha descrito en el Ejemplo 1.
Para la generación de complejos de péptidos digoxigenados con <IGF1R>-<Dig> y anticuerpos biespecíficos <Her2>-<Dig>, los presentes inventores disolvieron el conjugado (melitina, INF7, FALLv1, FALLv2, Fam5b) de péptido-Dig en H2O a una concentración final de 1 mg/ml. El anticuerpo biespecífico se llevó a una concentración de 1 mg/ml (4,85 µM) en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, tampón a pH=6,0. Se mezclaron el péptido y el anticuerpo
35 biespecífico a una relación molar 2:1 (péptido con respecto a anticuerpo) pipeteando arriba y abajo y se incubaron durante 15 minutos a TA. Entonces, el complejo se usó en ensayos in vitro sin modificación adicional. Se llevaron a cabo diluciones del complejo para estos ensayos en Opti-MEM 1 (Invitrogen Madison, WI).
El complejo resultante se definió como molécula similar a IgG monomérica, que lleva 2 péptidos de Dig por un derivado de anticuerpo. La composición definida (y relación 2:1 de péptido con respecto a proteína) de estos complejos de péptido biespecíficos se confirmó por cromatografía de exclusión por tamaño y experimentos de carga/competición.
Ejemplo 6: Péptidos digoxigenados y complejos con anticuerpos biespecíficos <Diana><Dig> retienen unión45 específica de diana y actividad biológica
Un tópico muy importante que necesita ser tratado por cualquier tecnología que tiene como objetivo el direccionamiento específico de compuestos bioactivos es que la actividad biológica del compuesto debe ser retenida. Además, la especificidad y actividad del módulo que elige diana no debe afectarse por la unión de la carga. La tecnología de anticuerpos biespecíficos que los presentes inventores describen lleva dos etapas de modulación para péptidos bioactivos, una de las cuales también modifica el módulo que elige diana. En una primera etapa, los presentes inventores acoplan covalentemente digoxigenina al péptido bioactivo. En una segunda etapa, este péptido digoxigenado se compleja con el derivado de anticuerpo biespecífico, que es una proteína grande. Para retener la actividad del péptido es importante garantizar la actividad del péptido modificado para ambas etapas: los ensayos de
55 actividad necesitan mostrar que (i) la funcionalidad del péptido se retiene después de la digoxigenación, y (ii) la funcionalidad se retiene después de la complejación del péptido digoxigenado con la <Dig> murina o humanizada. Finalmente, es necesario mostrar que (iii) la especificidad y afinidad de unión del módulo que elige diana todavía se retiene en el complejo final.
Comparación de las actividades biológicas de péptidos citotóxicos sin modificar y digoxigenados
Para evaluar si las adiciones o alteraciones del péptido melitina, FALLv1 y FALLv2 por digoxigenina alteran su actividad biológica, los presentes inventores realizaron ensayos in vitro. Como estos péptidos son citotóxicos, su actividad biológica puede analizarse fácilmente monitorizando el número de células muertas. Para medir este
65 número se usó el ensayo CytoTox-Glo (Promega Madison, WI).
La Figura 15 muestra los resultados de estos ensayos CytoTox-Glo que se realizaron para evaluar la actividad biológica de los péptidos melitina, Fallv1 y Fallv2 y sus variantes modificadas con DIG. Para estos ensayos, se sembraron células H322M a una densidad de 15.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se incubaron durante 24 horas a 37 ºC, 5 % de CO2 y 85 % de humedad en RPMI con mezcla de 10 % de FCS,
5 piruvato de Na+, L-glutamina y NEAA. El péptido y su variante modificada con DIG se añadieron entonces a las células en las concentraciones indicadas. Las células se incubaron durante 48 horas adicionales. Después de este periodo, las células se trataron con el reactivo de ensayo CytoTox-Glo según las instrucciones del fabricante. En resumen, este ensayo detecta células muertas mediante la presencia de una proteasa en el medio que escinde un péptido flurogénico en el reactivo. Por tanto, la luminiscencia de este ensayo representa células muertas. A continuación, las placas de 96 pocillos se analizaron en un lector de luminiscencia InfiniteF200 (Tecan Austria, Gröding).
Los resultados de estos ensayos (Figura 15, resumidos en la Tabla 4) muestran que los péptidos digoxigenados retienen sus actividades biológicas cuando se compararon con péptidos no modificados. El valor de CI50 del ensayo
15 CytoTox-Glo fue 3,28 µM para el péptido sin modificar y 3,98 µM para el péptido digoxigenado melitina. Las actividades de Fallv1 y Fallv2 se retuvieron similarmente tras la conjugación a digoxigenina (Tabla 4). Así, la digoxigenación no interfirió con la actividad biológica. Los presentes inventores llegan a la conclusión de que la digoxigenación de los péptidos melitina, FALLv1 y FALLv2 no interfiere con su actividad biológica.
Direccionamiento específico de las actividades biológicas de péptidos complejados de digoxigenada-anticuerpo a células tumorales que expresan antígeno
No solo el acoplamiento covalente a haptenos, sino también la complejación de péptidos con moléculas de anticuerpos biespecíficos grandes, puede influir en su actividad biológica. Debido a que las moléculas biespecíficas
25 derivadas de IgG son proteínas grandes (10-40 veces el tamaño de los péptidos), a priori no puede excluirse que tales moléculas puedan impedir estéricamente la accesibilidad del péptido y, por tanto, interferir con la actividad biológica. Viceversa, puede ser posible que la complejación del péptido pueda interferir con la funcionalidad de unión al antígeno específica de los módulos de direccionamiento en el derivado de anticuerpo biespecífico. Para tratar estos tópicos, los presentes inventores analizaron la funcionalidad de unión al antígeno específica de los complejos de anticuerpo-péptido, además de la actividad in vitro de los complejos de péptido-anticuerpo hacia líneas de células tumorales que expresan antígeno.
Para determinar la funcionalidad de unión al antígeno del complejo, los presentes inventores aplicaron resonancia de plasmones superficiales. Debido al bajo peso molecular de los péptidos, se requiere mayor densidad superficial para
35 alcanzar las valiosas alturas de señal durante la unión. Por tanto, se creó una superficie de chip especial para evaluar la funcionalidad de los derivados de <Dig> recombinantes con péptidos Dig. Se activaron celdas de flujo con una mezcla 1:1 de N-hidroxisuccinimida 0,1 M y 3-(N,N-dimetilamino)propil-N-etilcarbodiimida 0,1 M a una velocidad de flujo de 5 µl/min. El anticuerpo anti-IgG humana se inyectó en acetato sódico, pH 5,0, a 5 µg/ml, con el objetivo de una densidad superficial de aproximadamente 2000 UR. Se trató una celda de flujo de control de referencia omitiendo igualmente el anticuerpo de captura. Las superficies se bloquearon con una inyección de etanolamina 1 M/HCl a pH 8,5.
Unión aditiva de antígeno y péptidos digoxigenados a anticuerpos biespecíficos <Diana><DIG>
45 Para estos experimentos Biacore, se aplicaron dominios extracelulares solubles recombinantemente producidos de RTK IGF1R para caracterizar los complejos de <IGF1R>-<Dig>-Dig-Péptido. Para mostrar la unión aditiva a péptidos digoxigenados, se usaron INF7 (SEQ ID NO. 21) y FALLv1 (SEQ ID NO. 18) digoxigenados. El anticuerpo se diluyó en HBS-P (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,005 % de tensioactivo P20) que incluye 0,1 % de BSA y se inyectó a una velocidad de flujo de 10 µl/min. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue 1 min para el anticuerpo a una concentración de 50 nM. Se usó INF7 digoxigenado a una concentración de 50 nM para DIG-INF7, se usó FALLv1 digoxigenado a una concentración de 90 nM. Se usó el fragmento de IGF1R soluble a una concentración de 50 nM. Se diluyeron los péptidos digoxigenados y sIGF1R en HBS-P (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,005 % de tensioactivo P20) y se inyectaron aditivamente a una velocidad de flujo de 10 µl/min. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue 3 min, el tiempo de disociación (lavando con tampón de electroforesis) 3 min para cada
55 molécula. La disolución de regeneración de 0,85 % de H3PO4 se inyectó durante 120 s a 10 µl/min de flujo, seguido de una inyección de NaOH 10 mM durante 120 s a 10 µl/min de flujo para eliminar cualquier proteína no covalentemente unida después de cada ciclo de unión. Se detectaron señales a una tasa de una señal por segundo. Todas las interacciones se realizaron a 25 ºC. Los resultados de estos ensayos (Figura 16) muestran que los complejos de IgG con péptidos digoxigenados retienen la especificidad y afinidad de unión hacia los antígenos de la superficie celular, independiente del orden de unión.
Para analizar si los complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-Péptido y los complejos de <IGF1R>-<Dig>-Dig-Péptido median en el direccionamiento específico de su carga hacia células que expresan antígeno, los presentes inventores hicieron uso del hecho de que los péptidos FALLv1 y Fam5b son citotóxicos. Monitorizando el número de células 65 muertas, los presentes inventores son, por tanto, capaces de comparar la actividad biológica de DIG-péptidos y los complejos de DIG-péptido -<Her2>-<Dig> elegidos como diana. Para medir el número de células muertas, se usó el
ensayo CytoTox-Glo (Promega Madison, WI). Para analizar la especificidad de la elección diana, se usaron dos líneas celulares: H322M que tienen bajos niveles de Her2 superficial y KPL4 que tienen altos niveles de Her2 superficial.
5 Para estos ensayos, se sembraron células H322M a una densidad de 15.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se incubaron durante 24 horas a 37 ºC, 5 % de CO2 y 85 % de humedad en RPMI con mezcla de 10 % de SBF, pirovato de Na+, L-glutamina y NEAA. Se sembraron células KPL4 a una densidad de 7.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se incubaron durante 24 horas a 37 ºC, 5 % de CO2 y 85 % de humedad en RPMI con 10 % de SBF y L-glutamina. Los DIG-péptidos y los complejos de DIG-péptido -<Her2><Dig> se añadieron entonces a las células en las concentraciones indicadas. Las células se incubaron durante 48 horas adicionales. Después de este periodo, las células se trataron con el reactivo de ensayo CytoTox-Glo según las instrucciones del fabricante. En resumen, este ensayo detecta células muertas mediante la presencia de una proteasa en el medio que escinde un péptido flurogénico en el reactivo. Por tanto, la luminiscencia de este ensayo representa células muertas. Entonces, las placas de 96 pocillos se analizaron en un lector de luminiscencia
15 InfiniteF200 (Tecan Austria, Gröding).
Los resultados de estos ensayos (Figura 17) muestran que los complejos de IgG con péptidos digoxigenados confieren citotoxicidad a células que expresan antígeno: cuando se compara la citotoxicidad de DIG-FALLv1 liberada por el anticuerpo biespecífico <Her2>-<Dig> para células H322M y KPL4, se encuentra coherentemente que es más tóxica para células que expresan mayores niveles de antígeno de superficie. La citotoxicidad del péptido DIG-Fam5b liberado por el anticuerpo biespecífico <Her2>-<Dig> también se correlaciona con los niveles de antígeno de superficie. Estos hallazgos muestran que los péptidos citotóxicos están específicamente enriquecidos sobre células que expresan antígeno cuando se administran por el anticuerpo biespecífico apropiado.
25 Cuando se comparó la citotoxicidad de los péptidos DIG con la citotoxicidad de los péptidos DIG administrados a las células que expresan antígeno por el AB biespecífico de DIG apropiado (Figura 18), se encontró coherentemente que los péptidos administrados conferían mayor toxicidad: la citotoxicidad del complejo de <Her2>-<Dig> hacia células que expresan antígeno diana es mayor para la del péptido FALLv1 en comparación con la aplicación del péptido no complejado. La citotoxicidad del péptido Fam5b también es mayor cuando se administra a células diana positivas para antígeno en comparación con el péptido de control no liberado. Esto muestra que los complejos de péptido están específicamente enriquecidos en (y, por tanto, median en mayor actividad biológica hacia) células que expresan antígeno diana.
Tabla 4
Molécula
CI50 de péptido sin modificar CI50 Dig-péptido
Melitina
3,3 uM 4,0 uM
FALLv2
9,3 uM 7,6 uM
FALLv1
7,4 uM 6,4 uM
35 Ejemplo 7: Generación de complejos definidos de compuestos pequeños digoxigenados con <Her2>-<Dig> y<IGF1R>-<Dig> biespecíficos
Los complejos de compuestos pequeños digoxigenados con derivados de anticuerpos biespecíficos que contienen módulos de unión a Dig recombinantes pueden conferir comportamiento biofísico benigno y parámetros PK mejorados a los compuestos pequeños. Además, tales complejos son capaces de dirigir los compuestos a células que muestran el antígeno que es reconocido por la variante de anticuerpo biespecífico. Estos complejos están compuestos de una IgG <Diana>-<Dig> humanizada que une en sus dos sitios de unión a Dig de alta afinidad dos compuestos digoxigenados (uno en cada sitio). Se desea que los compuestos retengan la actividad biológica a pesar
45 de estar digoxigenados, además de mientras que están complejados con el anticuerpo. También se desea que el sitio de unión diana de la superficie celular del derivado de anticuerpo biespecífico retenga su especificidad y afinidad de unión en presencia de compuestos de Dig complejados. El compuesto pequeño que los presentes inventores han usado como ejemplo para evaluar esta tecnología es doxorubicina. La actividad biológica de la doxorubicina y la doxorubicina digoxigenada (= Dig-Dox) pueden evaluarse determinando efectos citotóxicos hacia líneas celulares tumorales humanas in vitro.
Pueden aplicarse complejos biespecíficos de doxorubicina digoxigenada con variantes de anticuerpos <Diana><DIG> biespecíficos para dirigir la doxorubicina específicamente a células que expresan el antígeno diana. Así, las células que son reconocidas por los antígenos de superficie serán dirigidas por la doxorubicina. Debido a esto, la
55 citotoxicidad mediada por doxorubicina debe potenciarse sobre células que expresan antígeno.
Para la generación de tales complejos de anticuerpo biespecífico para el direccionamiento selectivo es necesario (i) acoplar digoxigenina mediante conectores adecuados a doxorubicina de un modo que permita que la doxorubicina retenga su actividad; (ii) generar y caracterizar complejos de doxorubicina digoxigenada con la IgG <Diana>-<Dig> biespecífica. Estos complejos deben formarse de una manera definida (2 Dig-doxorubicina se unen a 1 IgG <Dig>).
(iii) asegurar que estos complejos retienen la actividad de doxorubicina, además de la especificidad y afinidad del
anticuerpo que elige diana, para mediar en la actividad biológica mediada por doxorubicina específica sobre células que expresan el antígeno que elige diana.
Generación de doxorubicina digoxigenada
5 Se obtuvo doxorubicina de Sigma-Aldrich. Para acoplar la digoxigenina a doxorubicina, los presentes inventores realizaron el siguiente procedimiento: A una disolución de éster de N-hidroxisuccinimida del ácido digoxigenina-3-Ometilcarbonil-épsilon-aminocaproico (20 mg, 30,4 µmoles) en DMF (500 µl) se añadió trietilamina (8,4 µl, 60,8 µmoles) y la mezcla resultante se transfirió inmediatamente a una disolución de doxorubicina-HCl (16,6 mg, 30,4 µmol) en DMF (500 µl). La mezcla de reacción se rodó durante 2 h a temperatura ambiente, se filtró y el compuesto diana se aisló por HPLC de fase inversa preparativa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía 0,1 % de TFA (columna Merck Cromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm). Después de la liofilización se obtuvo el conjugado de doxorubicina-digoxigenina como un sólido incoloro (25,2 mg, 76 %). HPLC analítica: tR=13,9 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 4,6 mm, agua + 0,1 % de TFA acetonitrilo/agua + 0,1 % de TFA 80:20, 25
15 min); ESI-EM (modo de ión positivo): m/z: calcd para C58H75N2O18: 1087,5; hallada: 1087,6 [M+H]+. El peso molecular de la doxorubicina es 579,98 Da. El peso molecular del conjugado de doxorubicina-Dig resultante es 1087,24 Da. Hasta el momento de la complejación con el anticuerpo, los presentes inventores guardaron el conjugado en alícuotas en DMSO a -20 ºC. La Figura 18 muestra la estructura del conjugado de doxorubicinadigoxigenina.
Complejación de doxorubicina digoxigenada con anticuerpos biespecíficos <Diana-Dig> recombinantes
Se usaron anticuerpos biespecíficos <IGF1R>-<Dig> recombinantes y anticuerpos biespecíficos <Her2>-<Dig> como componentes de proteína de la reacción de acoplamiento. La composición y purificación de estas moléculas se ha
25 descrito en el Ejemplo 1. Para la generación de complejos de doxorubicina digoxigenada con anticuerpos biespecíficos <IGF1R>-<Dig> y <Her2>-<Dig>, los presentes inventores disolvieron el conjugado de doxorubicina-Dig en OptiMEM (Invitrogen) que contenía 1 % de acetonitrilo y 0,1 % de DMSO a una concentración final de 0,1 mg/ml . El anticuerpo biespecífico se usó en una concentración de 1 mg/ml (5 µM) en un tampón compuesto de histidina 20 mM y NaCl 140 mM, pH 6. Se mezclaron la doxorubicina digoxigenada y el anticuerpo biespecífico a una relación molar 2:1 (doxorubicina digoxigenada con respecto a anticuerpo). Este procedimiento produjo una preparación homogénea de complejos de composición definida. Posteriormente, esta preparación se aplicó en los ensayos de viabilidad celular que se describen más adelante.
35 La Figura 19 muestra el perfil de exclusión de tamaño del complejo de doxorubicina digoxigenada con <Her2><Dig>. Se revela elevada carga (señal al tamaño del complejo de proteína) aumentando las señales de fluorescencia hasta una relación de al menos una molécula de DIG-dox por una molécula de proteína. Después, la adición de más moléculas de DIG-dox no aumenta la señal en la posición de proteína de una manera lineal, pero tampoco aparece una señal donde se esperaba posiblemente la DIG-dox no unida debido a la asociación no específica con el material de columna. Los presentes inventores concluyen de estos experimentos que el complejo de Dig-dox y el anticuerpo biespecífico estuvieron compuestos de moléculas que contuvieron al menos un compuesto LMW por proteína.
La caracterización adicional del complejo aplicando estudios de resonancia de plasmones superficiales (Biacore, véase el Ejemplo 4 anterior) proporcionó pruebas adicionales de que la reacción de complejación generada definió
45 moléculas que retuvieron completamente la afinidad de unión específica del módulo de anticuerpo biespecífico.
Ejemplo 8: Doxorubicina digoxigenada y complejos con anticuerpos biespecíficos <Diana-Dig> retienen launión específica a diana y actividad biológica
Un tópico muy importante que necesita ser tratado para cualquier tecnología que tiene como objetivo el direccionamiento específico de compuestos bioactivos es que la actividad biológica del compuesto debe ser retenida. Además, la especificidad y actividad del módulo que elige diana no debe afectarse por la unión de la carga. La tecnología de anticuerpos biespecíficos que los presentes inventores describen lleva dos etapas de modulación para compuestos bioactivos, una de las cuales también modifica el módulo que elige diana. En una primera etapa,
55 los presentes inventores acoplan covalentemente digoxigenina a doxorubicina. En una segunda etapa, esta doxorubicina digoxigenada se compleja con el derivado de anticuerpo biespecífico, que es una proteína grande. Para retener la actividad de la doxorubicina es importante garantizar la actividad de doxorubicina modificada para ambas etapas: los ensayos de actividad necesitan mostrar que (i) la funcionalidad de la doxorubicina puede retenerse después de la digoxigenación, y (ii) la especificidad y afinidad de unión del módulo que elige diana es todavía retenida en el complejo final.
Comparación de las actividades biológicas de doxorubicina sin modificar y digoxigenada
Para evaluar si la digoxigenación de la doxorubicina altera su actividad biológica, los presentes inventores realizaron
65 bioensayos con diferentes líneas celulares que se cultivaron en presencia de doxorubicina o doxorubicina digoxigenada. Después se analizó la viabilidad celular. La Figura 20, 21 y 48a muestran los resultados de estos
ensayos de viabilidad celular que se realizaron para evaluar la actividad biológica de doxorubicina y doxorubicina digoxigenada. Para estos ensayos, los presentes inventores sembraron células KPL-4, H322M o MDA-MB-468 y dejaron que se unieran a las placas durante la noche. Al día siguiente se trataron con doxorubicina o doxorubicina digoxigenada en las concentraciones indicadas durante 48 horas. Entonces, las células se lisaron y la viabilidad 5 celular se evaluó aplicando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo (Promega, Madison, WI). Los resultados de estos ensayos (Figuras 20, 21 y 48a) muestran que la doxorubicina digoxigenada retiene algo de su actividad biológica cuando se incuba sobre células H322M. Las células KPL-4 no muestran ningún efecto después de la exposición a doxorubicina digoxigenada en las concentraciones usadas. El valor de CI50 del ensayo de viabilidad celular fue 25 µM para doxorubicina sin modificar y >1000 µM para doxorubicina digoxigenada cuando se incuba con células H322M. En el caso de células KPL-4, el valor de CI50 del ensayo de viabilidad celular fue 2,6 µM para doxorubicina sin modificar y >1000 µM para doxorubicina digoxigenada. El valor de CI50 del ensayo de viabilidad celular fue 17 µM para doxorubicina sin modificar y >1000 µM para doxorubicina digoxigenada cuando se incuba con células MDA-MB-468. Esto indica una pérdida de actividad significativa de la doxorubicina tras la modificación con digoxigenina. El motivo para esta actividad reducida no es la pérdida de funcionalidad, sino las
15 limitaciones en la penetración de la membrana celular de la doxorubicina digoxigenada. Esta molécula es mucho mayor que la doxorubicina original y, por tanto, no puede penetrar fácilmente en las membranas biológicas. Esta limitación se muestra experimentalmente en la Figura 22: La inmunofluorescencia muestra que la doxorubicina penetra en las membranas y se acumula en su sitio de acción en el núcleo. A diferencia, la masa de doxorubicina digoxigenada se acumula tras la exposición de células en endosomas, así no llega a su sitio de acción dentro de la célula. Sin embargo, todavía se retiene la funcionalidad molecular de la doxorubicina digoxigenada. Esto puede demostrarse por la co-aplicación de reactivos de escape de endosomas, que permite que la doxorubicina digoxigenada entre en el citoplasma y núcleos y en consecuencia conduce a citotoxicidad enormemente elevada (véase más adelante).
25 Direccionamiento específico de las actividades biológicas de doxorubicina complejada con anticuerpo digoxigenado para células tumorales que expresan antígeno
Para analizar si la funcionalidad de unión al antígeno específica de los complejos de anticuerpo puede utilizarse para administrar específicamente actividad de carga a células tumorales, los presentes inventores realizaron estudios de inmunofluorescencia seguidos de ensayos de citotoxicidad in vitro para determinar la actividad biológica de la doxorubicina elegida como diana. Puede visualizarse Dig-Dox por inmunofluorescencia por excitación con un láser de 514 nm, mientras que la emisión se detecta entre una longitud de onda de 520 y 560 nm. Debido a esto, los presentes inventores fueron capaces de visualizar ópticamente el direccionamiento y la acumulación de dig-dox complejada con <IGF1R>-<DIG> sobre células. La Figura 22 muestra análisis de IF de células MCF7 que expresan
35 IGF1R con el complejo de IGF1R-DIG y Dig-Dox acumulado sobre la superficie celular. Los resultados de estos estudios indican que dig-dox se administra específicamente a células diana eligiendo como diana restos del anticuerpo biespecífico.
Para analizar adicionalmente si los complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-Dox y los complejos de <IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox median en el direccionamiento específico de su carga (citotóxica) hacia células que expresan antígeno, los presentes inventores sembraron números definidos de células KPL-4 (Her2+++), H322M (IGF1R+++) y MDA-MB468 (Her2+/-) y dejaron que se unieran a las placas durante la noche. Al día siguiente se trataron con complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-Dox o <IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox en las concentraciones indicadas durante 48 horas. Entonces, se evaluó la viabilidad celular aplicando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo (Promega, Madison,
45 WI).
Los resultados de estos ensayos (Figuras 20, 21 y 48b) muestran que los complejos de IgG con doxorubicina digoxigenada confieren citotoxicidad a células que expresan antígeno: El valor de CI50 del complejo de Dig-Dox/<Her2>-<Dig> hacia células diana Kpl-4 que expresan Her2 fue 5,9 µM, mientras que para las células MDA-MB468 negativas para diana, el complejo de Dig-Dox y <Her2>-<Dig> no confirieron mucha más citotoxicidad que <Her2>-<Dig> sin ninguna carga. Similarmente, el valor de CI50 del complejo de Dig-Dox/<IGF1R>-<Dig> hacia células diana H322M que expresa IGF1R fue 5,8 µM. Para ambas líneas celulares diana (KPL-4 y H322M) se mostró que el anticuerpo que elige diana cargado con Dig-Dox tuvo una citotoxicidad más fuerte que el anticuerpo no cargado aplicado a las mismas concentraciones. Los presentes inventores llegan a la conclusión de que los
55 derivados de anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> pueden administrar específicamente cargas citotóxicas a células que son reconocidas por los módulos que eligen diana.
Las Figuras 48 muestran los resultados de experimentos de direccionamiento adicionales de doxorubicina digoxigenada con anticuerpos biespecíficos <Dig>. Estos experimentos incluyeron una línea celular de tumor de mama adicional MDA-MB-468. Para estos ensayos, los presentes inventores propagaron y sembraron células KPL4, H322M o MDA-MB-468 como se ha descrito anteriormente y las trataron con doxorubicina o doxorubicina digoxigenada en las concentraciones indicadas durante 48 horas. La determinación de la viabilidad celular con el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo (Promega, Madison, WI) (Figura 48a y b) confirmó que la doxorubicina digoxigenada pierde la mayoría de su actividad biológica cuando se incuba sobre células MDA-MB468. 65 Este fenotipo es muy similar al observado para células KPL-4 y H322M (véase anteriormente). El valor de CI50 sobre células MDA-MB-468 fue 17 µM para doxorubicina sin modificar y >1000 µM para doxorubicina digoxigenada.
Experimentos adicionales que tratan la posibilidad de administrar doxorubicina digoxigenada complejada con módulos que eligen diana biespecíficos se muestran en la Figura 48 c a e: Se trataron células KPL-4 (Her2+++), H322M (IGF1R+++) y MDA-MB-468 (Her2+/-) con complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-Dox o <IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox durante 48 h como se ha descrito anteriormente. Después, se evaluó la viabilidad celular aplicando el ensayo de
5 viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo (Promega, Madison, WI). Los resultados de estos ensayos confirman que los complejos de IgG con doxorubicina digoxigenada confieren citotoxicidad a células que expresan antígeno. Para ambas líneas celulares diana (KPL-4 y H322M) que expresan tanto her2 como IGF1R se mostró que el anticuerpo que elige diana cargado con Dig-Dox tuvo una citotoxicidad más fuerte que el anticuerpo no cargado aplicado a las mismas concentraciones. A diferencia, para las células MDA-MB-468 negativas para diana, el complejo de Dig-Dox y <Her2>-<Dig> no confirió mucha más citotoxicidad que <Her2>-<Dig> sin ninguna carga. Los presentes inventores llegan a la conclusión de que derivados de anticuerpos biespecíficos de <Diana>-<Dig> pueden administrar específicamente cargas citotóxicas a células que son reconocidas por los módulos que eligen diana.
Ejemplo 9: Generación de complejos definidos de sustratos fluorescentes digoxigenados con <Her2>-<Dig> 15 y <IGF1R>-<Dig> biespecíficos
Pueden aplicarse complejos de sustratos fluorescentes digoxigenados con derivados de anticuerpos biespecíficos que contienen módulos de unión a Dig recombinantes para la obtención de imágenes específica de tejidos o células que llevan el antígeno diana. Estos complejos están compuestos de una IgG <Diana>-<Dig> humanizada que une en sus dos sitios de unión a Dig de alta afinidad dos sustratos digoxigenados (uno en cada sitio) que pueden visualizarse por tecnologías de obtención de imágenes. Es necesario que los compuestos de obtención de imágenes retengan sus propiedades (fluorescencia) a pesar de estar digoxigenados, además de mientras que están complejados con el anticuerpo. También se desea que el sitio de unión diana de la superficie celular del derivado de anticuerpo biespecífico retenga su especificidad y afinidad de unión en presencia de compuestos de Dig
25 complejados.
El compuesto de obtención de imágenes que los presentes inventores han usado como ejemplo para evaluar esta tecnología es Cy5. Cy5 es un sustrato de fluorescencia que es excitado por una longitud de onda entre 575 -633 nm nM y tras la excitación emite luz en el espectro de infrarrojo cercano a una longitud de onda de 670 nM. Debido a esto, la presencia de Cy5 y Cy5 digoxigenada (= Dig-Cy5) puede evaluarse por microscopía de fluorescencia, además de por tecnologías de obtención de imágenes in vivo. Los complejos biespecíficos de Cy5 digoxigenada con variantes de anticuerpos biespecíficos <Diana>-<DIG> pueden aplicarse para dirigir Cy5 específicamente a células que expresan el antígeno diana. Así, las células que son reconocidas por antígenos de superficie pueden visualizarse por Cy5, y así distinguirse de células que no llevan el antígeno diana.
35 Para la generación de tales complejos de anticuerpo biespecífico para el direccionamiento selectivo de reactivos de obtención de imágenes es necesario (i) acoplar digoxigenina mediante conectores adecuados a Cy5 de un modo que permita que la Cy5 retenga sus características de fluorescencia; (ii) generar y caracterizar complejos de Cy5 digoxigenada con la IgG <Diana>-<Dig> biespecífica. Estos complejos deben formarse de una manera definida (2 Dig-Cy5 se unen a 1 IgG <Dig>); (iii) asegurar que estos complejos retengan la actividad de Cy5, además de la especificidad y afinidad del anticuerpo de elección de diana, para mediar en la visualización de Cy5 específica de células que expresan el antígeno que elige diana.
Generación de Cy5 digoxigenada
45 Para la generación de Cy5 digoxigenada se transformó éster de DIG-carboximetil-NHS (documento DE 3836656) con mono-boc-etilendiamina. Después se eliminó boc y la amina liberada se dejó reaccionar con éster de Cy5-NHS (GE Healthcare, PA15106). Con el fin de purificar DIG-Cy5 se llevó a cabo una HPLC usando una columna RP 18. El eluyente A fue H2O que contenía 0,1 % de TFA, el eluyente B fue acetonitrilo que contenía 0,1 % de TFA. Durante la elución que se realizó durante 60 min la concentración del eluyente B aumentó del 0 % al 100 %.
El peso molecular de Cy5 es 791,99 Da. El peso molecular del conjugado de Cy5 -Dig resultante es 1167,55 Da. Hasta el momento de la complejación con el anticuerpo, los presentes inventores guardaron el conjugado en alícuotas en PBS a -20 ºC. La Figura 23 muestra la estructura de conjugado de Cy5-digoxigenina.
55 Complejación de Cy5 digoxigenada con anticuerpos biespecíficos <Diana-Dig> recombinantes
Se usaron anticuerpos biespecíficos <IGF1R>-<Dig> recombinantes y anticuerpos biespecíficos <Her2>-<Dig> como componentes de proteína de la reacción de acoplamiento. La composición y purificación de estas moléculas se ha descrito en el Ejemplo 1.
Para la generación de complejos de Cy5 digoxigenada con anticuerpos biespecíficos <IGF1R>-<Dig> y <Her2><Dig>, los presentes inventores disolvieron el conjugado de Cy5-Dig en PBS a una concentración final de 0,5 mg/ml. Se usó el anticuerpo biespecífico a una concentración de 1 mg/ml (5 µM) en un tampón compuesto de histidina 20
65 mM y NaCl 140 mM, pH 6. Se mezclaron Cy5 digoxigenada y anticuerpo biespecífico a una relación molar 2:1 (Cy5 digoxigenada con respecto a anticuerpo). Este procedimiento produjo una preparación homogénea de complejos de
composición definida. Posteriormente, esta preparación se aplicó en los estudios de obtención de imágenes in vitro e in vivo que se describen más adelante.
La Figura 24 muestra el perfil de exclusión de tamaño del complejo de Cy5 digoxigenada con <Her2>-<Dig>. Se
5 revela elevada carga (señal al tamaño del complejo de proteína) aumentando las señales de fluorescencia hasta una relación de dos moléculas de DIG-Cy5 por una molécula de proteína. Si se aumenta la carga hasta una relación de cinco moléculas de DIG-Cy5 por proteína, la señal fluorescente ya no aumenta más, indicando que los dos sitios de unión a DIG se saturan a una relación de 2:1 (DIG-Cy5 : <Her2>-<Dig>). A diferencia, los anticuerpos dirigidos contra <Her2> o <IGF1R> sin una parte de unión a <Dig> no se unen en absoluto a DIG-Cy5 (Fig. 49b), que indica que DIG-Cy5 no se une no específicamente a aquellos anticuerpos. Los presentes inventores concluyen de estos experimentos que el complejo de Dig-Cy5 y el anticuerpo biespecífico estuvo compuesto de moléculas que contuvieron dos compuestos de Dig-Cy5 por proteína.
La caracterización del complejo aplicando estudios de resonancia de plasmones superficiales (Biacore, véase el
15 ejemplo anterior) proporcionó pruebas adicionales de que la reacción de complejación generó moléculas definidas que retuvieron completamente la afinidad de unión específica del módulo de anticuerpo biespecífico.
El refinamiento adicional de las condiciones experimentales mostró más claramente que la relación de unión entre <Her2>-<Dig> y DIG-Cy5 es 1:2. La Fig. 49a y b muestran el perfil de exclusión por tamaño y la evaluación de la SEC del complejo de Cy5 digoxigenada con<Her2>-<Dig> después del refinamiento del sistema experimental. Se revela elevada carga (señal al tamaño del complejo de proteína) aumentando las señales de fluorescencia hasta una relación de dos moléculas de DIG-Cy5 por una molécula de proteína. Si se aumenta la carga hasta una relación de cinco moléculas de DIG-Cy5 por proteína, la señal fluorescente no aumenta más, indicando que los dos sitios de unión a DIG se saturan a una relación de 2:1 (DIG-Cy5 : <Her2>-<Dig>). A diferencia, los anticuerpos dirigidos
25 contra <Her2> o <IGF1R> sin una parte de unión a <Dig> no se unen en absoluto a DIG-Cy5 (Fig. 49b), que indica que DIG-Cy5 no se une no específicamente a aquellos anticuerpos. Los presentes inventores concluyen de estos experimentos que el complejo de Dig-Cy5 y el anticuerpo biespecífico estuvo compuesto de moléculas que contuvieron dos compuestos de Dig-Cy5 por proteína.
Ejemplo 10: Cy5 digoxigenada y complejos con anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> retienen la uniónespecífica de diana y las características de fluorescencia que pueden usarse para obtención de imágenes in vitro e in vivo.
Un tópico muy importante que necesita ser tratado para cualquier tecnología que tiene como objetivo el
35 direccionamiento específico de compuestos bioactivos es que la actividad biológica del compuesto debe ser retenida. Además, la especificidad y actividad del módulo que elige diana no debe afectarse por la unión de la carga. La tecnología de anticuerpos biespecíficos que los presentes inventores describen lleva dos etapas de modulación para compuestos bioactivos, una de las cuales también modifica el módulo que elige diana. En una primera etapa, los presentes inventores acoplan covalentemente digoxigenina a Cy5. En una segunda etapa, esta Cy5 digoxigenada se compleja con el derivado de anticuerpo biespecífico, que es una proteína grande. Para retener la actividad de Cy5 es importante garantizar la actividad de Cy5 modificada para ambas etapas: necesita mostrarse que (i) la funcionalidad de la fluorescencia de Cy5 puede retenerse después de la digoxigenación, y (ii) la especificidad y afinidad de unión del módulo que elige diana es todavía retenida en el complejo final.
45 Actividades de fluorescencia de Cy5 sin modificar y digoxigenada
Para evaluar si la digoxigenación de Cy5 altera sus características de fluorescencia, los presentes inventores compararon los espectros de excitación y de emisión de Cy5 y los compararon con los espectros de Dig-Cy5 y con Dig-Cy5 recientemente generados dentro de un complejo con anticuerpos biespecíficos. La Tabla 4 resume los resultados de estos análisis: La conjugación de Cy5 con digoxigenina, además de la complejación de Dig-Cy5 con anticuerpos, no interfiere con las características de fluorescencia de Cy5. Los presentes inventores llegan a la conclusión de que Dig-Cy5 y los complejos pueden aplicarse al direccionamiento mediado por anticuerpo y obtención de imágenes in vivo.
55 Actividad de unión de módulos que eligen diana complejados con Dig-Cy5
Para evaluar si la complejación de Cy5 digoxigenada altera las características de unión de los módulos que eligen diana biespecífica, los presentes inventores aplicaron análisis de resonancia superficial. Se usaron el dominio extracelular de Her2 (además de IGF1R) como antígenos para determinar las afinidades por anticuerpo. Se han descrito detalles de estos análisis en el Ejemplo 4. La Tabla 5 resume los resultados de estos análisis: La complejación de Dig-Cy5 con anticuerpos no interfiere con la afinidad de unión de los módulos que eligen diana.
Tabla 5
Molécula
Cy5 Dig-Cy5 <Her2Dig > <Her2Dig>Dig-Cy5
Longitud de onda de excitación
575-605 nm 575-605 nm n.a. 575 -605 nm
Longitud de onda de emisión
máx. a 670 nm máx. a 670 nm n.a. máx. a 670 nm
La caracterización adicional del complejo aplicando análisis FACS proporciona pruebas adicionales de que la complejación de Dig-Cy5 con anticuerpos no interfiere con la unión de los módulos que eligen diana. Para estos análisis los presentes inventores usaron células Raji y Ramos CD22 positivas y el anticuerpo <CD22>-<DIG>
5 biespecífico. Se incubaron 3 x 105 células por pocillo de una placa de 96 pocillos con 5 µg/ml del anticuerpo <CD22>-<DIG> en tampón FACS (PBS que contienen 5 % de FCS). Después de lavar las células se incubaron con DIG-Cy5 a una concentración final de 66,4 nM. Después de otra etapa de lavado, las células se analizaron con FACSCanto II (BD Biosciences).
10 El resultado de este análisis se muestra en la Fig. 25. El complejo de <CD22>-<DIG> y DIG-Cy5 se une claramente a las células Raji o Ramos mientras que DIG-Cy5 solo muestra difícilmente cualquier unión. Por tanto, los presentes inventores llegan a la conclusión de que los complejos de Dig-Cy5 con anticuerpos biespecíficos pueden aplicarse a direccionamiento mediado por anticuerpo y obtención de imágenes in vivo.
15 Direccionamiento específico de Cy5 complejada con anticuerpo digoxigenado a células tumorales que expresan antígeno in vivo
Para analizar si la funcionalidad de unión al antígeno específica de los complejos de anticuerpo puede utilizarse para administrar específicamente reactivos de obtención de imágenes a células tumorales, los presentes inventores 20 realizaron estudios de obtención de imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIRF) in vivo. Para estos estudios, 50 µg de tanto complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-Cy5 como de <IGF1R>-<Dig> Dig-Cy5 se inyectaron intravenosamente en ratones inmunodeficientes que llevaban xenoinjertos de tumor subcutáneos. Estos xenoinjertos estuvieron expresando tanto el antígeno Her2 (células KPL4) como el antígeno IGF1R (células H322M). Posteriormente, se realizó obtención de imágenes de NIRF usando el sistema Maestro de CRI. Se pusieron
25 animales en una cámara de medición y la fluorescencia se midió sobre una matriz de longitud de onda espectral definida, dependiendo del colorante. La información espectral de cada píxel de la imagen obtenida se analizó por un software especial que permite separar diferentes espectros predefinidos, por ejemplo, autofluorescencia y la señal del colorante. Estas señales específicas separadas se cuantificaron por el software Maestro con el fin de comparar diferentes muestras.
30 Los resultados de estos ensayos (Figura 26 y 27) muestran que Dig-Cy5 que se compleja con anticuerpos biespecíficos se dirige específicamente a tumores que expresan el antígeno relacionado. Pueden visualizarse tumores KPL4 que expresan Her2 por NIRF con complejos <Her2>-<Dig> Dig-Cy5 24 horas después de la inyección. De una manera similar, tumores que expresan IGF1R pueden visualizarse específicamente por NIRF 30
35 min después de aplicar el complejo del derivado de anticuerpo biespecífico <IGF1R>-<Dig> con Dig-Cy5. A diferencia de los complejos de anticuerpo, que muestran fluorescencia del tumor elegido como diana, Dig-Cy que no está complejado con anticuerpo no muestra fluorescencia específica de tumor (sino en su lugar alguna acumulación en el hígado, como se indica por círculos en la Figura 29).
40 Un enfoque de obtención de imágenes adicional que hace uso de anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> combinados con sustratos de obtención de imágenes digoxigenados se muestra en la Figura 28: En este experimento, los presentes inventores no han formado previamente el complejo de módulos que eligen diana proteináceos con carga digoxigenada antes de la inyección en animales que llevan el tumor. En su lugar, los presentes inventores han inyectado el anticuerpo biespecífico y esperado 48 h antes de la posterior inyección del
45 sustrato de obtención de imágenes digoxigenado. Este procedimiento da tiempo al módulo que elige diana para la penetración en tumor/tejido y acumulación en tumores. Después, se administra el reactivo de obtención de imágenes que debido a su pequeño tamaño tiene rápida penetración del tumor y se acumula sobre el tejido diana en el que forma el complejo <Diana>-<Dig>Dig-Cy5 in vivo. Este método tiene la ventaja de que el tiempo para abrir la ventana de obtención de imágenes es bastante corto debido a que cualquier reactivo de obtención de imágenes sin
50 complejar se elimina rápidamente. Además, este enfoque puede ser particularmente útil para agentes de obtención de imágenes radiactivos (o terapéuticos) que deben solo dar solo exposición sistémica limitada a pacientes.
Los presentes inventores concluyen de estos experimentos que los complejos de anticuerpos <Diana>-<Dig> biespecíficos con reactivos de obtención de imágenes digoxigenados pueden usarse para fines de obtención de
55 imágenes in vivo específicos.
Ejemplo 11: Generación de complejos definidos de ácidos nucleicos digoxigenados con <Her2>-<Dig> y<IGF1R>-<Dig> biespecíficos
60 Pueden aplicarse complejos de ácidos nucleicos digoxigenados, tales como ARNip con derivados de anticuerpos biespecíficos que contienen módulos de unión a Dig recombinantes, para el direccionamiento específico de ácidos nucleicos a células que expresan antígeno. Tales complejos son capaces de dirigir los péptidos a células que muestran el antígeno que es reconocido por la variante de anticuerpo biespecífico. Estos complejos están compuestos de una IgG <Diana>-<Dig> humanizada que une en sus dos sitios de unión a Dig de alta afinidad dos
65 ácidos nucleicos digoxigenados (uno en cada sitio). Se desea que los ácidos nucleicos retengan su funcionalidad a
pesar de estar digoxigenados, además de mientras que están complejados con el anticuerpo. También se desea que el sitio de unión diana de la superficie celular del derivado de anticuerpo biespecífico retenga su especificidad y afinidad de unión en presencia de ácidos nucleicos digoxigenados complejados.
5 Los ácidos nucleicos que los presentes inventores han usado como ejemplos para evaluar esta tecnología son tanto fragmentos de ADN como ARNip. Los presentes inventores aplicaron ARNip que eligen Eg5 o luciferasa como diana como ejemplo que inactiva el ARNm respectivo dentro del citoplasma de células. Se generaron ADN y ARNip como ácidos nucleicos que estaban digoxigenados. Además, se digoxigenaron moléculas seleccionadas, además de acopladas a colorantes fluorescentes (incl. Cy5, véanse los Ejemplos 9 y 10). El direccionamiento específico y la
10 localización de ácidos nucleicos fluorescentes pueden visualizarse por tecnologías de obtención de imágenes como se ha descrito anteriormente. Además, la actividad biológica de los ARNip puede evaluarse in vitro determinando sus efectos de regulación por disminución de ARNm en líneas celulares tumorales humanas in vitro.
Tabla 6: Tapas pequeñas: cuu = modificación con 2'O-metilo, 2'F: 2'F sobre ribosa en lugar de 2'OH
Molécula (→ SEC 5 -3')
secuencia sentido SEQ ID NO. secuencia antisentido SEQ ID NO. Dúplexde pesomolecular
Luciferasa
22 29 13530,7
Dig-Luciferasa
23 30 14237
Eg5
24 31 13295,1
Dig-Eg5
25 32 14177,3
Dig-Eg5-Dig
26 33 14895,3
Dig-Eg5-Cy5
27 34 14552,1
Dig-Eg5-Dig-Cy5
28 35 15428
La composición de los ácidos nucleicos que los presentes inventores han aplicado para estos ejemplos se muestra en la Tabla 6.
20 Pueden aplicarse complejos biespecíficos de ácidos nucleicos digoxigenados con variantes de anticuerpos <Diana-Dig> biespecíficos para dirigir los ácidos nucleicos específicamente a células que expresan el antígeno diana. Así, los ácidos nucleicos accederán selectivamente a las células que son reconocidas por antígenos de superficie, actividades producidas por ácidos nucleicos, por ejemplo, iARN u otra citotoxicidad mediada por ácidos nucleicos, deben potenciarse sobre células que expresan antígeno.
25 Para la generación de tales complejos de anticuerpo biespecífico para el direccionamiento selectivo es necesario (i) acoplar digoxigenina mediante conectores adecuados al ácido nucleico de un modo que permita que el ácido nucleico retenga su actividad; (ii) generar y caracterizar complejos de ácidos nucleicos digoxigenados con la IgG <Diana>-<Dig> biespecífica. Estos complejos deben formarse de una manera predefinida (2 ácidos nucleicos de Dig
30 se unen a 1 IgG <Dig>). (iii) Asegurar que estos complejos retienen la actividad del ácido nucleico, además de la especificidad y afinidad del anticuerpo que elige diana, para mediar en la elevada actividad biológica mediada por ácidos nucleicos (específicos) sobre células que expresan el antígeno que elige diana.
Generación de ácidos nucleicos digoxigenados 35
1. Síntesis y purificación de oligorribonucleótidos:
Se sintetizaron oligorribonucleótidos según la tecnología de fosforamidito sobre fase sólida empleando un sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems) a la escala de 10 µmoles. Las síntesis se realizaron sobre un soporte sólido hecho de vidrio de poro controlado (CPG, 520Ǻ, con una carga de 75 µmol/g, obtenido de Prime Synthesis, Aston, PA, EE.UU., o 3'-PT-Amino-Mod. C6 CPG, con una carga de 37 µmol/g, de Glen Research, Sterling, Virginia,
5 EE.UU.). Se compraron fosforamiditos de ARN regulares, 2'-O-metilfosforamiditos y 2'-F fosforamiditos, además de reactivos secundarios, de Proligo (Hamburgo, Alemania). Sin ninguna modificación del ciclo de síntesis, el colorante fluorescente de Cy5 se unió al extremo 5' usando el fosforamidito correspondiente (obtenido de GE Healthcare, Múnich, Alemania). Después de la finalización de la síntesis en fase sólida, se llevó a cabo la escisión y desprotección del oligómero unido al soporte. Entonces, los oligómeros en bruto se purificaron por HPLC de intercambio aniónico (AEX) usando una fuente 15Q, SPSC-150, columna de 150 x 8 mm (Bischoff, Leonberg, Alemania) en un sistema AKTA Explorer (GE Healthcare).
2. Marcado con DIG del ARN modificado con amino
15 Se disolvió N-hidroxisuccinimida del ácido digoxigenina-3-O-metilcarbonil-ε-aminocaproico (Roche, Basilea, Suiza) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Fluka, Buchs, Suiza). Esta disolución se añadió al ARN modificado con amino purificado disuelto en tampón (borato de Na 0,1 M en KCl 0,1 M, pH 8,5). La reacción se controló por HPLC AEX. En caso de reacción cuantitativa, el ARN conjugado se aisló mediante precipitación con NaOAc 3 M, pH=5,2 y etanol (1:32). Si la reacción no fue cuantitativa se realizó una etapa de purificación. En este caso, los oligómeros se purificaron por HPLC AEX usando un DNAPac PA-100 22 x 250 mm (Dionex, Idstein, Alemania) sobre un sistema AKTA Explorer (GE Healthcare). El tampón A fue urea 6 M, NaClO4 10 mM, Tris 20 mM, EDTA 1 mM; pH 7,4, 20 % de ACN, y el tampón B urea 6 M, NaClO4 500 mM, Tris 20 mM, EDTA 1 mM; pH 7,4, 20 % de ACN. Se empleó una velocidad de flujo de 4,5 ml/min (a 60 ºC). Se registraron perfiles de UV a 260, 280 y en el caso de Cy5 a 643 nm. Se empleó un gradiente de 25 % de B a 55 % de B en el plazo de 55 min. Se reunieron fracciones apropiadas y se
25 precipitaron con NaOAc 3 M, pH=5,2 y etanol (1:32). Después de la centrifugación el sedimento se disolvió en agua. La concentración de la disolución se determinó por medición de absorbancia a 260 nm en un fotómetro de UV (Beckman Coulter, Krefeld, Alemania). Hasta la hibridación, las hebras individuales se almacenaron como disoluciones congeladas a -20 ºC.
3. Hibridación de oligorribonucleótidos para generar ARNip
Se hibridaron hebras complementarias combinando disoluciones de ARN equimolares. La mezcla se liofilizó y se reconstituyó con un volumen apropiado de tampón de hibridación (NaCl 100 mM, fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8) para lograr la concentración deseada. Esta disolución se dispuso en un baño de agua a 95 ºC que se enfrió a TA en
35 el plazode 3 h.
El peso molecular de los ácidos nucleicos, además de los heterodúplex de ARNip, se enumeran en la Tabla 6. Hasta el momento de la complejación con el anticuerpo, los presentes inventores guardaron los conjugados de ácido nucleico en alícuotas disueltas en NaCl 0,1 M, NaH2PO4 20 mM x H2O/ Na2HPO4 x 2H2O, pH 6,8 a -20 ºC. La Figura 29 representa esquemáticamente la composición de ácidos nucleicos acoplados a digoxigenina.
Complejación de ácidos nucleicos digoxigenados con anticuerpos biespecíficos <Diana-Dig> recombinantes
Se usaron anticuerpos biespecíficos <IGF1R>-<Dig> recombinantes y anticuerpos biespecíficos <Her2>-<Dig> como
45 componentes de proteína de la reacción de acoplamiento. La composición y purificación de estas moléculas se ha descrito en el Ejemplo 1.
Para la generación de complejos de ácidos nucleicos digoxigenados con <IGF1R>-<Dig> y anticuerpos biespecíficos <Her2>-<Dig>, los presentes inventores disolvieron el conjugado de ácido nucleico-Dig en NaCl 0,1 M, NaH2PO4 20 mM x H2O/ Na2HPO4 x 2H2O, pH 6,8, a una concentración final de 100 µM. El anticuerpo biespecífico se llevó a una concentración de 1 mg/ml (5 µM) en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, tampón a pH=6,0. Se mezclaron el ácido nucleico y el anticuerpo biespecífico a una relación molar 2:1 (ácido nucleico con respecto a anticuerpo) pipeteando arriba y abajo y se incubaron durante 15 minutos a TA. Entonces, el complejo se usó en ensayos in vitro o aplicaciones in vivo sin modificación adicional. Se llevaron a cabo diluciones del complejo para estos ensayos en 55 Opti-MEM 1 (Invitrogen Madison, WI). El complejo resultante se definió como molécula similar a IgG monomérica, que lleva 2 Dig-ARNip por un derivado de anticuerpo. La composición definida (y relación 2:1 de ácido nucleico con respecto a proteína) de estos complejos biespecíficos se confirmó por cromatografía de exclusión por tamaño y experimentos de carga/competición. Los resultados de este análisis de cromatografía de exclusión por tamaño con módulos que eligen diana biespecífica y ácidos nucleicos fluorescentemente marcados se muestran en la Figura 30: Se reveló elevada carga (señal al tamaño del mayor complejo de proteína) aumentando las señales de fluorescencia hasta una relación de dos ácidos nucleicos por una molécula de proteína. Después, la adición de más ácidos nucleicos marcados no aumenta la señal en la posición de proteína, sino en su lugar en una posición que refleja moléculas de menor peso molecular del tamaño de los ácidos nucleicos. Los complejos 2:1 de ARNip-proteína no muestran ninguna muestra de disociación. Los presentes inventores concluyen de estos experimentos que el
65 complejo de proteína-Dig-ARNip consiste en moléculas definidas que alojan 2 ARNip por una proteína.
Aplicación de espectrometría de masas nativa para analizar la carga de carga de vehículos de administración
Puede aplicarse espectrometría de masas nativa para determinar la masa molecular de complejos de proteína. Esta tecnología, que a diferencia de la espectrometría de masas desnaturalizante se realiza usando disolventes volátiles
5 acuosos a pH neutro, se optimiza de un modo que se minimice la disociación o destrucción de complejos de proteína no covalentes durante el análisis de espectrometría de masas (Sharon M, Robinson CV (2007), The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes, Annu Rev Biochem. 2007;76:167-93; Heck AJ (2008), Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology, Nat Methods. 5(11):92733). Sin embargo, una cierta estabilidad del complejo de proteína analizado es todavía un requisito previo para la espectrometría de masas nativa para prevenir la disociación del complejo durante la preparación de muestras y la adquisición de espectros de masas.
Para determinar la carga de carga de anticuerpos biespecíficos <Dig> con cargas digoxigenadas -en particular Dig-ARNip o Dig-péptidos-, los presentes inventores sometieron anticuerpos biespecíficos <Her2-Dig>, además del
15 anticuerpo <Dig> bivalente parental, a espectrometría de masas nativa. Las cargas que se unieron a estos módulos de unión fueron ARNip mono-digoxigenados y bi-digoxigenados y un péptido mono-digoxigenado.
Antes del análisis de espectrometría de masas, los anticuerpos se desglucosidaron usando PNGasa-F con el fin de reducir la complejidad espectral y facilitar la interpretación de datos. Para llevar las moléculas a disoluciones compatibles con EM nativa, el tampón de muestra inicial se intercambió secuencialmente a acetato de amonio acuoso 50 mM (pH 7,5) usando unidades de filtración centrífuga con un corte de 10 kDa (Millipore, Inglaterra). Después, los anticuerpos se mezclaron con las cargas respectivas en una relación de 1:2 (moles/moles), y la concentración de muestra final usada para las mediciones de espectrometría de masas se ajustó a ∼10 µM. Las muestras mezcladas se analizaron posteriormente en un instrumento de tiempo de vuelo por electropulverización
25 LCT (Waters, Manchester, RU). Se usaron capilares de nanopulverización para introducir las muestras en la fuente de pulverización Z. La presión de la fuente aumentó hasta ∼9 mbar para crear una elevada refrigeración colisional. La temperatura de la fuente se fijó a 80 ºC, y el voltaje del cono de muestra varió de 125 a 175 V. El voltaje del cono se fijó a ∼1200 V proporcionando una pulverización estable y apropiada desolvatación sin conducir a fragmentación de las moléculas de proteína y de carga. El voltaje del cono se varió entre 100 y 200 V con el fin de alcanzar la resolución óptima. Los espectros de masas se adquirieron con duraciones del barrido de 2 segundos y se interpretaron usando el software Mass Lynx (Waters, Manchester, RU).
Los resultados de estos análisis, mostrados a modo de ejemplo en la Figura 50a, indican que los complejos de vehículo de <Dig> y ARNip digoxigenados o péptidos digoxigenados pueden detectarse por espectrometría de
35 masas nativa. Pueden detectarse complejos de anticuerpo que contienen uno o dos dig-ARNip o dig-péptidos. Esto demuestra que los complejos de carga se forman en el tampón acuoso usado para la espectrometría de masas nativa y tiene una estabilidad suficiente para 'sobrevivir' al pretratamiento, desolvatación y procedimiento de espectrometría de masas como complejos intactos, aún cuando no están covalentemente ligados.
La Figura 50b resume y compara la composición de complejos que fueron detectables tras completarse el procedimiento: Todos los espectros contuvieron señales que indican anticuerpo sin complejar libre y, al bajo intervalo de m/z de los espectros, moléculas de carga sin complejar libres (no mostradas en los espectros con zoom representados). Sin embargo, en todas las muestras que contuvieron cargas digoxigenadas, la mayoría de las señales pudieron asignarse a complejos que contenían una o dos cargas. El máximo número de cargas observado
45 por vehículo fue dos o menos, que está completamente de acuerdo con la presencia de dos módulos de captura de Dig por proteína.
Cuando se aplican ARNip o péptidos que contuvieron una digoxigenina en una reacción de complejación con el vehículo que elige Dig como diana biespecífica, la fracción predominante de complejos contuvo dos cargas por anticuerpo. Esto se observó al mismo grado para ARNip mono-digoxigenados y para péptidos mono-digoxigenados. Esta observación está de acuerdo con una estequiometría de complejo de 2 (cargas) con respecto a uno (vehículo).
A diferencia, tras la aplicación de un ARNip que contuvo dos digoxigeninas en una reacción de complejación con el vehículo que elige Dig como diana biespecífica, complejos 1:1 entre carga (de Dig doble) y el anticuerpo biespecífico
55 de dig aparecieron como señales predominantes. Esto puede indicar que una carga se une en ambos extremos mediante el módulo de digoxigenina con respecto a una <Dig>. En este caso, la estequiometría 2:1 de Dig con respecto a vehículo se convierte en una estequiometría 1:1 debido a que la carga contiene dos digoxigeninas. Estos datos experimentales indican la formación de complejos definidos y bastante estables entre cargas digoxigenadas y vehículos que eligen diana que contienen <Dig>. Además, los resultados de los presentes inventores indican que la espectrometría de masas nativa puede ser una valiosa herramienta para analizar estequiometrías de carga y composiciones de complejos de vehículo-carga.
Ejemplo 12: ARNip digoxigenado y complejos con anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> retienen laactividad biológica de los ARNip, además de la unión específica de diana del módulo de proteína
Un tópico muy importante que necesita ser tratado para cualquier tecnología que tiene como objetivo el direccionamiento específico de compuestos bioactivos es que la actividad biológica del compuesto debe ser retenida. Además, la especificidad y actividad del módulo que elige diana no debe afectarse por la unión de la carga. La tecnología de anticuerpos biespecíficos que los presentes inventores describen lleva dos etapas de modulación 5 para ácidos nucleicos bioactivos, una de las cuales también modifica el módulo que elige diana. En una primera etapa, los presentes inventores acoplan covalentemente digoxigenina al ácido nucleico bioactivo, por ejemplo, ARNip. En una segunda etapa, este ácido nucleico digoxigenado (ARNip) se compleja con el derivado de anticuerpo biespecífico, que es una proteína grande. Para retener la actividad del ácido nucleico, es importante garantizar la actividad del ácido nucleico modificado para ambas etapas: los ensayos de actividad necesitan mostrar que (i) la
10 funcionalidad del ácido nucleico se retiene después de la digoxigenación, y (ii) la funcionalidad se retiene después de la complejación del ácido nucleico digoxigenado con el módulo que elige diana que contiene <Dig>. Finalmente, es necesario mostrar que (iii) la especificidad y afinidad de unión del módulo que elige diana es todavía retenida en el complejo final.
15 Comparación de las actividades biológicas de ARNip sin modificar y digoxigenados
Para evaluar si las adiciones o alteraciones de ARNip por digoxigenina alteran su actividad biológica, los presentes inventores realizaron ensayos in vitro en cultivo celular. Para eso, los presentes inventores eligieron evaluar la actividad de ARNip que inactiva el ARNm de Eg5. El efecto directo de la actividad del ARNip de Eg5 es la regulación 20 por disminución de su ARNm relacionado. Esto puede cuantificarse por ensayos de ADNr (ADN ramificado), que detectan la cantidad de ARNm específicos en células (Burris et al., 1999, Molecular Endocrinology). Para realizar estos ensayos, los presentes inventores sembraron un número definido del tipo de célula respectivo en placas de 96 pocillos y dejaron que se unieran durante la noche. Al día siguiente, las células se transfectaron con cantidades deseadas de un cierto ARNip o se trataron con el agente cuyo efecto debe analizarse sobre el nivel de ARNm. 25 Después de 24 horas se siguió el protocolo del kit QuantiGene según las instrucciones del fabricante (Affymetrix) con el fin de cuantificar los niveles de ARNm. Brevemente, los lisados celulares se transfirieron a una placa de captura en presencia de un conjunto de sonda específica de gen y a continuación se incubaron a 53 ºC durante la noche. Se lavaron los pocillos. A continuación se incubaron a 53 ºC secuencialmente con un amplificador y una sonda de marca ligada a fosfatasa alcalina con un lavado entre las incubaciones. Después de un lavado final, se 30 añadió el sustrato de fosfatasa alcalina luminiscente dioxitano y se incubó durante 30 min a 53 ºC. La luminiscencia se detectó usando un lector de luminiscencia InfiniteF200 (Tecan Austria, Gröding). La actividad biológica de ARNip que se dirigen a Eg5 puede no solo determinarse por análisis de ADNr, sino también por el fenotipo que se produce por el agotamiento del ARNm de Eg5 en células en crecimiento. Eg5 es una proteína motora que pertenece a la familia de las proteínas similares a kinesina. Eg5, también conocida como KSP (proteína del huso de kinesina), es 35 esencial para formación del huso mitótico bipolar y se requiere para la apropiada separación de los polos del husillo. El agotamiento de Eg5 conduce a la formación de husos de monoásteres característicos y activa el punto de regulación del huso. Esto produce una parada mitótica que, por último lugar, conduce a apoptosis (Tao et al., Molecular and celular biology. 2007 Jan; 27(2):689-98) (Tao W. et. al., Cancer Cell. 2005;8:49-59). Debido a esto, la inactivación de Eg5 por ARNip media en muchos casos en un fenotipo citotóxico para células cultivadas. Por tanto,
40 la actividad biológica del ARNip de Eg5 puede analizarse monitorizando el número de células vivas.
Para medir el número de células vivas se aplicó el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega Madison, WI) según el protocolo suministrado por el fabricante. En este ensayo, las células se lisan y se genera una señal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP. La cantidad de ATP es directamente proporcional al número
45 de células vivas. A continuación, las placas de 96 pocillos se analizaron en un lector de luminiscencia InfiniteF200 (Tecan Austria, Gröding).
La Tabla 7 resume los resultados de los ensayos de ARNr y de citotoxicidad que los presentes inventores realizaron para comparar las actividades biológicas de ARNip transfectados con las de sus homólogos digoxigenados 50 transfectados. Para los ensayos de ADNr, los presentes inventores sembraron células HeLa-S3 en placas de 96 pocillos y dejaron que se unieran durante la noche. Al día siguiente, las células se transfectaron con las cantidades indicadas de ARNip usando el reactivo de transfección LipofectamineTM 2000 según las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Después de 24 horas se siguió el protocolo del kit QuantiGene según las instrucciones del fabricante (Affymetrix) con el fin de cuantificar los niveles de ARNm del ARNm de Eg5. Los resultados de estos ensayos se
55 muestran en la Figura 31.
Para los ensayos de citotoxicidad, se sembraron células KPL-4 a una densidad de 7000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se incubaron durante 24 horas a 37 ºC, 5 % de CO2 y 85 % de humedad en RPMI con 10 % de SBF y L-glutamina. Al día siguiente, las células se transfectaron con las cantidades indicadas de ARNip
60 usando el reactivo de transfección Dharmafect según las instrucciones del fabricante (Dharmacon). Después de 48 horas, las células se trataron con el reactivo de ensayo CellTiter-Glo según las instrucciones del fabricante. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Fig. 33.
Tabla 7
Molécula
CI50 Ensayo de citotoxicidad [nM] CI50 Ensayo de ADNr de Eg5 [nM]
ARNip de luciferasa
n.a. > 100
ARNip de Dig-luciferasa
n.a. > 100
ARNip de Eg5
28 0,016
ARNip de Dig-Eg5
4 0,035
ARNip de Dig-Eg5-Cy5
215 0,013
El valor de CI50 del ensayo CellTiter-Glo fue 28 nM para ARNip de Eg5 sin modificar y 4 nM para el ARNip digoxigenado. Los valores de CI50 correspondientes de ensayos de ADNr fueron 0,016 nM para ARNip de Eg5 sin 5 modificar y 0,035 nM para el ARNip digoxigenado.
Otro ejemplo de los resultados de los ensayos de citotoxicidad de los presentes inventores con ARNip de Eg5 sin modificar y modificado con Dig se facilita en la Figura 31. Los presentes inventores concluyen de estos análisis que los ARNip pueden digoxigenarse sin interferir con su actividad biológica.
10 Pueden generarse entidades de unión a digoxigenina bi-y multiespecíficas que reconocen diferentes antígenos diana
Los módulos de unión a digoxigenina pueden conectarse a diferentes entidades dirigidas a células en una variedad
15 de formatos. Además de las fusiones del extremo C a anticuerpos que reconocen receptor de IGF1 humano o Her2, diversos otros anticuerpos que reconocen diferentes antígenos de la superficie celular se convirtieron en vehículos para administración de carga mediada por hapteno. Ejemplos que se produjeron, purificaron y caracterizaron incluyen vehículos de administración que contienen <Dig> que reconocen antígeno CD22 humano, antígeno CD33 humano, el antígeno de hidratos de carbono asociado al cáncer Lewis Y, receptor 2 de VEGF humano y murino o el
20 receptor CDCP1. Aplicando los formatos o combinaciones de formatos que se describen en la Figura 47, incluso moléculas que reconocen dos (o más) dianas separadas o epítopes separados sobre una molécula diana superficial pueden combinarse con entidades de eligen Dig como diana. La Figura 51a y b muestran una selección de moléculas que se generaron para lograr la administración de carga mediada por hapteno a células diana que expresan el antígeno que expresan diferentes moléculas diana superficiales. Las secuencias de aminoácidos que se
25 aplicaron para generar vehículos para la administración de carga elegida como diana que se dirigen a diferentes antígenos de la superficie celular se enumeran como SEQIDNO 51 -SEQIDNO 60. Las secuencias de aminoácidos que se usaron para generar entidades que se dirigen a diana biespecíficas que reconocen CDCP1 se describen en la solicitud EP 09011046.1. Todas las moléculas pudieron expresarse en células de mamífero y se purificaron con buenos rendimientos con tecnologías estándar de proteína A y exclusión por tamaño (véase el
30 Ejemplo 3 'Composición, expresión y purificación de anticuerpos <Dig> humanizados recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión biespecíficas). Las Figuras 51 c-g muestran que todas estas moléculas de los diferentes formatos que reconocen diferentes antígenos diana retuvieron completamente la especificidad de elección de diana, además de la competencia de unión a digoxigenina y afinidad como requisito previo para la administración de carga: Esto se demostró por experimentos de resonancia de plasmones superficiales (BiaCore) (véase el Ejemplo 4 'Unión
35 de anticuerpos de <Dig> recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión biespecíficas a antígenos digoxigenados' para detalles), además de por análisis FACS (datos no mostrados). Para análisis FACS, se incubaron anticuerpos biespecíficos Diana-Dig con las células, seguido de incubación separada de digoxigenina fluorescentemente marcada. Los resultados de estos experimentos se resumen en la FIGURA 51 c-g. Los datos demuestran que la especificidad y afinidad de unión hacia el antígeno diana de la superficie celular, además de hacia digoxigenina, no
40 cambia en comparación con los anticuerpos parentales o restos de unión a digoxigenina. Así, pueden aplicarse muchos formatos y módulos diferentes que reconocen muchos antígenos diana diferentes como vehículos para la administración de carga elegida como diana mediada por hapteno. Algunos de estos vehículos que eligen diana, especialmente aquellos que reconocen antígenos internalizados de alta densidad sobre células tumorales, pueden ser particularmente aptos para la administración de carga elegida como diana. Por ejemplo, moléculas biespecíficas
45 que reconocen el antígeno de hidrato de carbono LeY que es abundante sobre células tumorales son vehículos muy eficaces para la administración de ácidos nucleicos y otras cargas en células tumorales (véase más adelante, Ejemplo 15, direccionamiento mediado por LeY de DPC).
Ejemplo 13 Direccionamiento específico de ARNip complejado con anticuerpo digoxigenado a células 50 tumorales que expresan antígeno
Debido a que los ARNip tienen un tamaño considerable y están altamente cargados, puede ser posible que la complejación del módulo que elige diana biespecífico con ARNip pueda interferir con la funcionalidad de unión al antígeno específica de los módulos que eligen diana. Para tratar este tópico, los presentes inventores analizaron (i)
55 la funcionalidad de unión al antígeno específica de los complejos de anticuerpo-ARNip, además de (ii) la capacidad de estos complejos para direccionar ARNip a células que expresan antígeno diana in vitro. Finalmente, los presentes inventores también confirmaron la funcionalidad de los complejos de anticuerpo-ARNip por (iii) obtención de imágenes por NIRF del direccionamiento de ARNip en modelos de xenoinjerto de tumor in vivo.
Unión al antígeno específica de complejos de anticuerpo-ARNip
Para determinar la funcionalidad de unión al antígeno del complejo de <Diana>-<Dig> Dig-ARNip, los presentes inventores aplicaron resonancia de plasmones superficiales, utilizando el mismo sistema experimental que se ha 5 descrito en el Ejemplo 4, para <Her2>-<Dig>. Para <IGF1R>-<Dig> se aplicaron las siguientes alteraciones del método descrito en el Ejemplo 4: el anticuerpo anti-IgG humana se inyectó en acetato sódico, pH 5,0 a 2 µg/ml, que produjo una densidad superficial de aproximadamente 600 UR. La regeneración se llevó a cabo inyectando 0,85 % de H3PO4 durante 60 s a 5 µl/min e inyectando luego NaOH 5 mM durante 60 s a 5 µl/min para eliminar cualquier proteína no covalentemente unida después de cada ciclo de unión. Para estos experimentos Biacore se usaron 10 dominios extracelulares solubles recombinantemente producidos de RTK Her2 para caracterizar los complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-ARNip, y se aplicó dominio extracelular soluble recombinantemente producido de RTK IGF1R para caracterizar los complejos de <IGF1R>-<Dig>-Dig-ARNip. Los resultados de estos ensayos (resumidos en la Tabla 8) muestran que los complejos de IgG con ARNip de digoxigenada retienen la especificidad y afinidad de unión hacia los antígenos de la superficie celular. Esta tabla también muestra las afinidades de los ARNip
15 digoxigenados hacia los módulos que eligen diana biespecífica <Her2>-<Dig> o <IGF1R>-<Dig>.
Tabla 8
Molécula
antígeno ka [1/moles x s] kd [1/s] KD [nM]
<IGF1R>
IGF1R-ECD 2,00E05 1,01E-03 5
<IGF1R>-<Dig>
IGF1R-ECD 2,03E05 1,09E-03 5
<IGF1R>-<Dig>
Dig-ARNip 4,82E05 9,81E-03 20
<IGF1R>-<Dig>
Dig-ARNip-Dig-Cy5 3,94E06 3,54E-04 0,09
<Her2>
Her2-ECD n.d. n.d. n.d.
<Her2>-<Dig>
Her2-ECD n.d. n.d. n.d.
<Her2>-<Dig>
Dig-ARNip 3,77E05 1,20E-02 32
<Her2>-<Dig>
Dig-ARNip-Dig-Cy5 2,31E06 5,64E-04 0,246
Otro ejemplo que demuestra la unión simultánea del antígeno de la superficie celular, además del ARNip
20 digoxigenado, a las moléculas biespecíficas se muestra en la Figura 32: Para este experimento, los presentes inventores aplicaron los experimentos Biacore que se han descrito en el Ejemplo 4, pero con la siguiente modificación: Las muestras que iban a analizarse se diluyeron en HBS-P y se inyectaron a una velocidad de flujo de 5 µl/min. El anticuerpo <Her2>-<Dig>, Her2-ECD y DIG-ARNip se inyectaron secuencialmente a una concentración de 5 µg/ml cada uno. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue 3 min para cada molécula.
25 Los presentes inventores concluyen de los resultados de los estudios de unión de los presentes inventores (Tabla 8 y Figura 32) que los módulos biespecíficos se unen simultáneamente a Dig-ARNip, además de a antígeno diana. Además, los presentes inventores llegan a la conclusión de que la unión del antígeno diana no está afectada por la presencia de ARNip en el complejo de anticuerpo.
30 Direccionamiento específico de ARNip complejado con anticuerpo digoxigenado a células tumorales que expresan antígeno in vitro
Para analizar si los complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-ARNip y los complejos de <IGF1R>-<Dig>-Dig-ARNip median
35 en el direccionamiento específico de su carga hacia células que expresan antígeno, los presentes inventores hicieron uso del hecho de que los ARNip pueden marcarse simultáneamente con Dig, además de con marcas de fluorescencia. Así, es posible visualizar la localización de ARNip por microscopia u otras tecnologías de obtención de imágenes.
40 La caracterización por análisis de FACS proporciona pruebas de que la complejación de Dig-ARNip-Cy5 con anticuerpos no interfiere con la unión de los módulos que eligen diana. Para estos análisis, los presentes inventores usaron células Raji y Ramos CD22 positivas y el anticuerpo <CD22>-<DIG> biespecífico. Se incubaron 3 x 105 células por pocillo de una placa de 96 pocillos con 5 µg/ml del anticuerpo <CD22>-<DIG> en tampón FACS (PBS que contienen 5 % de SBF). Después de lavar las células se incubaron con DIG-ARNip-Cy5 a una concentración
45 final de 66,4 nM. Después de otra etapa de lavado, las células se analizaron con FACSCanto II (BD Biosciences).
El resultado de este análisis se muestra en la Fig. 35. El complejo de <CD22>-<DIG> y DIG-ARNip-Cy5 se une claramente a las células Raji o Ramos mientras que DIG-ARNip-Cy5 solo muestra difícilmente cualquier unión. Así, los presentes inventores concluyen que la complejación de Dig-ARNip-Cy5 con anticuerpos biespecíficos no
50 interfiere con la unión de los módulos que eligen diana. La Figura 34 muestra los resultados del análisis de obtención de imágenes in vitro por microscopía confocal, para los que los presentes inventores han expuesto células que expresan antígeno, además de células que no tenían expresión de antígeno (o solo débil) a complejos de módulos de <Her2>-<Dig> con ARNip marcados con Cy5 digoxigenada. La Figura 35 muestra los resultados del análisis de obtención de imágenes in vitro por microscopía confocal, para los que los presentes inventores han expuesto células
55 que expresan antígeno, además de células que no tenían expresión de antígeno (o solo débil), a complejos de módulos de <IGF1R>-<Dig> con ARNip marcados con Cy5 digoxigenada.
Para estos experimentos, se cultivaron células KPL-4, MDA-MB-468 o H322M sobre cubreobjetos de vidrio a una densidad de aproximadamente el 50-70 %. Entonces, se trataron con el complejo de <Her2>-<Dig>-Dig-ARNip-Cy5
o <IGF1R>-<Dig>-Dig-ARNip-Cy5 a una concentración de 5 nM para los tiempos indicados. Después, las células se
5 fijaron con paraformaldehído. Para la tinción del anticuerpo biespecífico, las células fijadas se lavaron, se incubaron con el reactivo de bloqueo GSDB y se incubaron con un anticuerpo de conejo anti-cadenas ligeras kappa humanas (DAKO) a una concentración de 6,5 µg/ml durante 1,5 a 2 horas en una cámara de humedad. Después de otro lavado, las células se incubaron con un anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con Alexa-fluor 488 (Molecular Probes) a una concentración de 28,6 µg/ml durante 1,5 horas en una cámara de humedad. Entonces, las células se
10 lavaron. A continuación, el ADN se marcó con DAPI (Roche) a una concentración de 10 µg/ml durante 2-3 min, se lavó de nuevo y se cubrió con medio de montaje. Las células se analizaron con un microscopio confocal Leica SP20.
Los resultados de estos análisis (Figura 34 y 35, resumidos en la Tabla 9) demuestran que los complejos de Dig-ARNip se administran específicamente a células que expresan antígeno por los módulos que eligen diana <Her2>15 <Dig> o <IGF1R>-<Dig> biespecíficos. Esta administración es específica para y dependiente del antígeno que elige diana que es reconocido por el complejo debido a que el ARNip no se administra a células negativas para antígeno. Más pruebas de la administración específica mediada por el módulo de unión al antígeno es el hecho de que puede competirse por la administración de ARNip por la aplicación de exceso de IgG (competidora) del mismo anticuerpo que es parte del módulo biespecífico (pero que no se une a ARNip). La incubación de células con complejos de
20 anticuerpo-ARNip a 37 ºC da una clara muestra de la internalización de anticuerpos, además de Dig-ARNip acoplados (Figura 34 y 35). Los presentes inventores llegan a la conclusión de que los ARNip no solo se administran específicamente a células que expresan antígeno, sino que también se internalizan en aquellas células.
Tabla 9
Molécula
xenoinjerto de tumor antígeno de superficie tinción con cy5 (ARNip) tinción con Alexa (proteína)
<Her2>-<Dig> Dig-ARNip-Cy5
KPL-4 Her2 + +
<Her2>-<Dig> Dig-ARNip-Cy5
MDA-MB468 EGF1R - -
<IGF1R>-<Dig> Dig-ARNip-Cy5
H322M IGF1R + +
Competición de <Her2>-<Dig> Dig-ARNip-Cy5 + <Her2>
KPL-4 Her2 - +
Dig-ARNip-Cy5
KPL4 Her2 - -
Dig-ARNip-Cy5
H322M IGF1R - -
25 Direccionamiento específico de ARNip complejado con anticuerpo digoxigenado a células tumorales que expresan antígeno in vivo
Para analizar si los complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-ARNip y los complejos de <IGF1R>-<Dig>-Dig-ARNip median
30 en el direccionamiento específico de su carga hacia células que expresan antígeno no solo en experimentos de cultivo celular, sino también en animales vivos, los presentes inventores hicieron uso del hecho de que los ARNip pueden marcarse simultáneamente con Dig, además de con marcas de fluorescencia. Así, es posible visualizar la localización de ARNip por tecnologías de obtención de imágenes en animales vivos. La tecnología que los presentes inventores han aplicado para esta tarea es la obtención de imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIRF) in
35 vivo. Para estos estudios, 50 ug de cualquiera de los complejos de <Her2>-<Dig>-Dig-ARNip-Cy5 o <IGF1R>-<Dig> Dig-ARNip-Cy5 se inyectaron intravenosamente en ratones inmunodeficientes que llevaban xenoinjertos de tumor subcutáneo. Estos xenoinjertos tanto expresaron el antígeno Her2 (células KPL4) como el antígeno IGF1R (células H322M). Posteriormente, se realizó obtención de imágenes de NIRF usando el sistema Maestro que se ha descrito en el Ejemplo 10.
40 Tabla 10
Molécula
xenoinjerto de tumor antígeno de superficie acumulación de tumor 30 min acumulación de tumor 24 h
<Her2>-<Dig> Dig-ARNip-Cy5
KPL-4 Her2 + +
<IGF1R>-<Dig> Dig-ARNip-Cy5
H322M IGF1R + -
Dig-ARNip-Cy5
KPL-4 Her2 n.d. n.d.
Dig-ARNip-Cy5
H322M IGF1R - -
Los resultados de estos ensayos (Figura 36 y 37) muestran que Dig-ARNip que se compleja con anticuerpos biespecíficos se dirige específicamente a tumores que expresan el antígeno relacionado. Estos datos se resumen en 45 la Tabla 10: pueden visualizarse tumores KPL4 que expresan Her2 por NIRF con complejos de <Her2>-<Dig> Dig-ARNip (Figura 36). Del mismo modo, tumores que expresan IGF1R pueden visualizarse específicamente por NIRF cuando se aplica el complejo del derivado de anticuerpo biespecífico <IGF1R>-<Dig> con Dig-ARNip (Figura 37). Los presentes inventores concluyen de estos experimentos que los complejos de anticuerpos <Diana-Dig> biespecíficos con ARNip digoxigenados se acumulan específicamente en tejidos o células que expresan el antígeno
50 diana in vivo.
Ejemplo 14: Actividad de ARNip en células tumorales que expresan antígeno que son dirigidas por ARNipcomplejado con anticuerpo digoxigenado
5 Para mediar en la destrucción específica de ARNm, los ARNip tienen que acceder al citoplasma de sus células diana. Así, un factor importante para la administración de actividad de ARNip específica es que las moléculas no solo se administren a las células (que se ha demostrado en los Ejemplos 12 y 13), sino también qué cantidades suficientes de ARNip tienen que transferirse al citoplasma de estas células. Para eso, estas moléculas tienen que penetrar en una membrana biológica al menos una vez. Como las sustancias biológicas no pasan fácilmente a través de las membranas, este proceso es un cuello de botella que debe vencerse para la eficaz administración de actividad de ácido nucleico. Los medios para vencer este cuello de botella pueden ser penetración de la membrana, translocalización de proteína a través de membranas, o mecanismos de escape de endosomas o de escape vesicular que pueden implicar procesos de rotura de la membrana. Un factor que puede ayudar en los procesos que consiguen ARNip para el citoplasma es (i) el potencial para liberar la carga de ARNip del resto que elige diana
15 biespecífico después de la internalización (la internalización de carga de ARNip se ha mostrado en el Ejemplo 13). Esto puede facilitar la entrada en el citoplasma debido a que la entidad que necesita transferirse es más pequeña (precisamente Dig-ARNip) que el complejo que elige como diana ARNip completo. Otro principio que puede facilitar la transferencia de ARNip al citoplasma de células diana es (ii) la combinación de complejos que eligen diana con moduladores de la funcionalidad de endosomas, o con módulos de escape/rotura de los endosomas.
La carga de Dig-ARNip se libera del resto de anticuerpo biespecífico después de la internalización
El complejo de ARNip digoxigenado con módulos que eligen diana biespecífica <Diana>-<Dig> está definido y es estable debido a la suficiente afinidad del módulo de <Dig>. Por otra parte, la conexión entre Dig-ARNip y la proteína 25 no es covalente, pero en su lugar consiste en una interacción anticuerpo-hapteno. Para analizar si el modo de acoplamiento no covalente de los complejos puede mediar en la liberación de carga después de la internalización, los presentes inventores realizaron experimentos de microscopía de fluorescencia con complejos de ARNip dobles marcados. Para estos experimentos, los presentes inventores aplicaron Dig-ARNip marcado con Cy5 para localizar la posición del ARNip dentro de células. Para visualizar el resto de proteína del complejo de elige diana se aplicó un anticuerpo de conejo anti-cadenas ligeras kappa humanas, seguido de una incubación con un anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con Alexa-fluor 488. Ambas entidades podrían visualizarse microscópicamente en diferentes canales de excitación y emisión. La visualización superpuesta de señales de ambos canales abre la oportunidad de seguir simultáneamente las vías de proteína y ARNip después de la aplicación a células que expresan antígeno. Los detalles experimentales de la visualización y tecnología de microscopía se han descrito en el Ejemplo 12. La Figura
35 33 y 34 muestra los resultados de estos experimentos de co-tinción. Se expusieron células KPL4 que expresan Her2 a complejos de <Her2>-<Dig> Dig-ARNip-Cy5 a 37 ºC y posteriormente se analizaron microscópicamente (Fig. 37). Del mismo modo, se expusieron células H322M que expresan IGF1R a complejos de <IGF1R>-<Dig> Dig-ARNipCy5 a 37 ºC y posteriormente se analizaron microscópicamente (Fig 40). En ambos ejemplos se observaron la unión del complejo a superficies celulares y la posterior internalización. En momentos de tiempo tempranos, las señales de proteína y de ARNip se co-localizaron sobre la superficie celular y en endosomas. Esto indica la unión a e internalización en células diana del complejo completo. En momentos de tiempo posteriores, los presentes inventores observaron la separación de señales asociadas a la proteína de señales asociadas a ARNip. Esta separación se observó en células KPL4 con <Her2>-<Dig> Dig-ARNip-Cy5, además de en células H322M expuestas a <IGF1R>-<Dig> Dig-ARNip-Cy5.
45 Para confirmar los resultados de los presentes inventores sobre la separación de la carga marcada con DIG del AB biespecífico de DIG, células MCF7 que expresan LeY se expusieron a <LeY>-<DIG> cargado con eGFP recombinante marcado con DIG. Se observaron la unión del complejo a superficies celulares y la posterior internalización. Estos datos se muestran en las Figuras 38c-d. En momentos de tiempo tempranos, las señales del anticuerpo y de eGFP se co-localizaron sobre la superficie celular y en endosomas. Esto indica la unión a e internalización en células diana del complejo completo. En momentos de tiempo posteriores, los presentes inventores observaron la separación de señales asociadas al anticuerpo de señales asociadas a eGFP. Este hallazgo indica que diferentes moléculas de carga se separan de los anticuerpos biespecíficos de DIG que eligen diana. Para mostrar que la separación observada se basa en el sistema de DIG, se realizaron experimentos
55 comparables con tanto ARNip marcado con Nu457 ligado covalentemente a un anticuerpo <IGF1R> mediante un conector de SMCC como una proteína de fusión en línea de un anticuerpo <IGF1R> con la proteína fluorescente citrina. En ninguno de estos casos se observó una separación significativa de la carga del anticuerpo que elige diana.
Los presentes inventores concluyen de estos experimentos que los complejos de Dig-ARNip <Diana>-<Dig> intactos se unen a superficies de células diana y se internalizan, y posteriormente liberan la carga de ARNip de la entidad del anticuerpo.
Actividad de ARNip elegido como diana en células que expresan antígeno 65
Para mediar en la destrucción específica de ARNm tienen que transferirse cantidades suficientes de ARNip al citoplasma de estas células en las que los componentes de la maquinaria de la iARN reconocen específicamente el dúplex de ARNip e incorporan la hebra de ARNip antisentido en un complejo de proteína llamado el complejo de silenciamiento inducido por ARN. Entonces, la hebra no codificante se empareja con el ARNm mensajero,
5 produciendo la escisión del ARNm por RISC, mediando así en la destrucción de ARNm específico.
Para analizar si los Dig-ARNip elegidos como diana pueden escapar de los endosomas y posteriormente mediar en la inactivación de ARNm, los presentes inventores aplicaron complejos de <IGF1R>-<Dig> Dig-ARNip a células tumorales H322M que expresan IGF1R. Además, los presentes inventores aplicaron complejos de <Her2>-<Dig>
10 Dig-ARNip a células tumorales que expresan Her2. Para facilitar el escape de endosomas de ARNip elegidos como diana, los presentes inventores también co-aplicaron los módulos de escape de endosomas elegidos como diana. El módulo usado en estos experimentos es el péptido INF7 digoxigenado descrito en el Ejemplo 5.
Tras la aplicación de ARNip elegidos como diana y péptidos elegidos como diana a células, se ensayó la
15 inactivación de ARNm mediada por ARNip, además de los fenotipos mediados por ARNip. Las moléculas que los presentes inventores aplicaron a estos experimentos fue Eg5-ARNip, que media en un fenotipo citotóxico hacia células dado que puede lograrse una inactivación de Eg5 suficiente. Los ARNip de Eg5 y los ensayos para cuantificar los niveles de ARNm de Eg5 (ensayos de ADNr) y fenotipos (ensayos de citotoxicidad) se han descrito en detalle en el Ejemplo 12 y la Tabla 7.
20 Los resultados de estos análisis se muestran en la Figura 34 y se resumen en la Tabla 11: Para estos experimentos se sembraron células H322M a una densidad de 15.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se incubaron durante 24 horas a 37 ºC, 5 % de CO2 y 85 % de humedad en RPMI con mezcla de 10 % de FCS, pirovato de Na+, L-glutamina y NEAA (se sembraron células KPL4 a una densidad de 7.000 células por pocillo en
25 placas de 96 pocillos.) Las células se incubaron durante 24 horas a 37 ºC, 5 % de CO2 y 85 % de humedad en RPMI con 10 % de SBF y L-glutamina. Para la generación de complejos de péptidos digoxigenados con anticuerpos biespecíficos <IGF1R>-<Dig> y <Her2>-<Dig>, los presentes inventores disolvieron el conjugado de péptido-Dig en H2O a una concentración final de 1 mg/ml. El anticuerpo biespecífico se llevó a una concentración de 1 mg/ml (4,85 µM) en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, tampón a pH=6,0. Se mezclaron péptido y anticuerpo biespecífico a una
30 relación molar 2:1 (péptido con respecto a anticuerpo) pipeteando arriba y abajo y se incubaron durante 15 minutos a TA. Se añadieron moléculas de ARNip de control de Eg5 y de luciferasa independientemente a anticuerpos biespecíficos en una relación 1:2 (AB con respecto a ARNip) y se mezclaron pipeteando arriba y abajo. Las tres mezclas se incubaron durante 15 minutos a TA. A continuación, los complejos se añadieron a las células en las concentraciones indicadas. Las células se incubaron durante 24 horas adicionales y se lisaron para análisis de ADNr
35 como se ha descrito previamente.
Por la co-aplicación de <Diana>-<Dig>-Dig-ARNip con <Diana-Dig>-Dig-INF7 (un péptido que media en el escape de endosomas (Esbjörner et al., 2007, Biochemistry)), los presentes inventores fueron capaces de observar la inactivación de ARNm en células que son elegidas como diana por el complejo de ARNip-proteína. Las células que 40 expresan IGF1R mostraron reducción de ARNm de Eg5 con los módulos de <IGF1R>-<Dig>-Dig ARNip en un modo dependiente de la dosis (dependencia de la dosis mostrada para el péptido INF en la Figura 35). Los experimentos de control en los que los presentes inventores aplicaron Dig-ARNip sin módulos que eligen diana, o péptidos INF7 elegidos como diana sin ARNip, no produjeron ningún agotamiento de ARNm. Esto indica que el complejo que elige como diana ARNip completo que reconoce el antígeno de la superficie celular se requiere para mediar en la
45 inactivación de ARNip. La correlación dependiente de la dosis de la actividad de ARNip con péptido INF7 elegido como diana indica que los moduladores de endosomas añadidos pueden aumentar la eficacia de direccionamiento específico de ARNip por derivados de anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig>.
Los presentes inventores concluyen de estos experimentos que las moléculas biespecíficas <Diana>-<Dig> pueden
50 dirigir específicamente actividad de ARNip a células que expresan antígeno. Los presentes inventores llegan además a la conclusión de que esta actividad puede aumentarse aplicando adicionalmente agentes moduladores de endosomas elegidos como diana.
Tabla 11
Molécula
línea celular antígeno de superficie ARNm de Eg5 ARNm de GapDH Eg5/ GapDH
<IGF1R>-<Dig> Dig-Eg5ARNip (ARNip 50 nM, Dig-INF7 500 nM)
H322M IGF1R 44% 71% 0,6
<IGF1R>-<Dig> Dig-LucARNip (ARNip 50 nM, Dig-INF7 500 nM)
H322M IGF1R 61% 71% 0,9
<IGF1R>-<Dig> Dig-INF7 (ARNip 0 nM, Dig-INF7 500 nM)
H322M IGF1R 87% 92% 0,9
<IGF1R>-<Dig> (ARNip 0 nM, Dig-INF7 0 nM)
H322M IGF1R 97% 85% 1,1
Anticuerpos biespecíficos de <DIG> en complejo con DharmaFECT-DIG-ARNip median en iARN
Se investigó la capacidad de los reactivos de transfección basados en lípidos para ayudar en el escape endosómico de ARNip específicamente elegidos como diana por anticuerpos biespecíficos <DIG>. Por tanto, se usó el reactivo 5 de transfección basado en lípidos comercialmente disponible DharmaFECT (proporcionado por Dharmacon).
Para analizar la formación de complejos de DIG-ARNip, DharmaFECT y anticuerpo <DIG> biespecífico y la acumulación sobre células diana se realizó análisis FACS usando células MCF7 (LeY positivas, CD22 negativas). Se usó LeY-DIG como anticuerpo que elige diana y CD22-DIG como anticuerpo de control que no elige diana, además, se usó un DIG-ARNip marcado con Cy5. Se incubó DharmaFECT con DIG-ARNip-Cy5 según las instrucciones del fabricante para permitir la formación de complejos. Después, el complejo de DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 se incubó con anticuerpos LeY-DIG o CD22-DIG. Las células MCF7 se suspendieron en PBS y se incubaron durante 30 min sobre hielo con tanto el complejo de DIG-ARNip-Cy y DharmaFECT como el complejo de LeYDIG/DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 o CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5. Antes de medir las muestras sobre
15 BD FACSCanto II, las células se lavaron. Se detectaron señales a la longitud de onda que es adecuada para detectar Cy5.
La Figura 52a y b muestra los resultados de este análisis FACS. En el panel superior, un comportamiento de unión similar de DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy y CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 a MCF7 es visible. Ambos complejos se unen a células MCF7 debido a la pegajosidad no específica de DharmaFECT que es una propiedad inherente a un reactivo de transfección. A diferencia, en el panel inferior, una acumulación más fuerte de complejos de LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 en comparación con DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 es una indicación claramente visible de direccionamiento específico de DharmaFECT/DIG-ARNip-Cy5 por LeY-DIG a células MCF7.
25 A continuación se analizó la capacidad de los complejos DharmaFECT/DIG-ARNip, CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip y LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip para mediar en iARN específica en células MCF7. Por tanto, se usó un EG5 que elige ARNip como diana. Se sembró un número definido de células MCF7 en placas de 96 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. Al día siguiente, las células se trataron con cantidades deseadas de DharmaFECT/DIG-ARNip, CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip y LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip durante 24 horas. La regulación por disminución de niveles de ARNm de Eg5 se analizó por un ensayo de ARNr (véase el Ejemplo 12 para descripción) y se normalizó a niveles de ARNm de GAPDH.
La Figura 52 c muestra los resultados de este ensayo de ARNr. La actividad de transfección de DharmaFECT/DIG-ARNip se retuvo cuando se complejó LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip con LeY-DIG y CD22-DIG. La regulación
35 por disminución del ARNm de Eg5 está mediada por el complejo LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip que se dirige a aquellas células (véase la Figura 52a). Sin embargo, también se observa una regulación por disminución con el complejo CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-ARNip. La acumulación elegida como diana de DharmaFECT/DIG-ARNip sobre células MCF7 mediada por LeY-DIG solo aumenta marginalmente la iARN. La acumulación de DharmaFECT/DIG-ARNip mediada por la pegajosidad de DharmaFECT ya es suficiente para obtener la transfección y posterior iARN. En conclusión, es posible la elección como diana de reactivos de transfección basados en lípidos complejados con ARNip como módulos de escape endosómico. Sin embargo, en casos en los que los reactivos de transfección tengan una fuerte capacidad de unión a célula por sí mismos, puede llegar a afectarse la especificidad de elección de diana mediada por anticuerpo.
45 Ejemplo 15: Pueden utilizarse DPC digoxigenados complejados con anticuerpos biespecíficos <Diana><Dig> para elegir como diana la administración de ARNip con actividad endosmolítica elegida como diana
Un tópico muy importante que necesita ser tratado por cualquier tecnología que tenga como objetivo el direccionamiento específico de ARNip es que los ácidos nucleicos tienen que llegar al citoplasma de la célula diana para la actividad biológica. Debido a que los ácidos nucleicos están altamente cargados y por sí mismos no consiguen cruzar fácilmente las membranas, la liberación de ARNip elegidos como diana (e internalizados) en el citoplasma de células es un cuello de botella importante para la administración de ARNip.
El cuello de botella 'escape de endosomas de ARNip' puede vencerse por la aplicación de policonjugados dinámicos
55 (DPC), entidades químicas que tras la unión a la célula e internalización producen el escape de endosomas de ARNip (Rozema DB et. al., Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of siRNA to hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 2007 Aug 7;104(32):129827PMID:17652171, y, entre otros, en el documento WO2008/0022309, publicación de EE.UU. nº US2008-0152661A1, US2008-0287630, US2008-0281074A1, US2008-0287628A1, US2008-0269450A1, patente de EE.UU. nº 7.098.032, 7.019.113, 6.919.091). Tales DPC están compuestos de andamiajes de PBAVE a los que se unen reversiblemente las moléculas de PEG usando un enlace maleamato bifuncional. Para lo último, puede aplicarse ácido dimetilmaleico (CDM) carboxilado. Las unidades de PEG se usan para proteger las cargas positivas endosmolíticas del PBAVE. También ligado al PBAVE está la carga de ARNip (por ejemplo, mediante un enlace disulfuro reversible). Los vehículos de administración resultantes se llaman policonjugados dinámicos de ARNip debido a que los grupos de
65 protección del ARNip (y ligandos que eligen diana adicionales) están conjugados al polímero de una manera reversible. Las propiedades endosomolíticas de tales DPC que producen la administración citoplásmica de ARNip se
induce por su entorno químico: la disminución en el pH dentro de los endosomas que maduran induce la liberación de CDM-PEG, exponiendo cargas positivas de PBAVE que a su vez median en la endosmólisis.
Para combinar las características endosmolíticas de DPC con las propiedades de direccionamiento específico del
5 sistema de digoxigenina o hapteno específico, se aplicó el siguiente procedimiento. En una primera etapa (i) necesitan generarse DPC que están conjugados con digoxigenina de un modo que la digoxigenina sea accesible a anticuerpos anti-Dig. Además, (ii) necesitan complejarse Dig-DPC con anticuerpos biespecíficos Diana-Dig de un modo que se retenga la especificidad y afinidad de unión del resto que elige diana de la superficie celular del anticuerpo biespecífico. Finalmente, es necesario mostrar que (iii) el complejo de anticuerpo-DPC que se mantiene junto por Dig-hapteno forma una composición definida que es suficientemente estable para conferir direccionamiento específico in vitro, además de in vivo.
Generación de DPC digoxigenados y complejos de DPC biespecíficos
15 Para generar DPC digoxigenados, se aplicaron procedimientos que se han descrito en cualquier parte (Rozema DB et. al., Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of siRNA to hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 2007 Aug 7;104(32):12982-7 PMID:17652171, y, entre otros, en el documento WO2008/0022309, publicación de EE.UU. nº US2008-0152661A1, US2008-0287630, US20080281074A1, US2008-0287628A1, US2008-0269450A1, patente de EE.UU. nº 7.098.032, 7.019.113, 6.919.091), con la modificación que NHS-digoxigenina se añadió a la mezcla de reacción de PBAVE-CDM-PEG a diferentes relaciones. Brevemente, para la generación de DPC digoxigenados, se mezcla una disolución 2,5 µM de poli butil amino vinil éter (PBAVE) en tampón HEPES (500 mM, pH 8) con una disolución 0,07 M de N-hidroxisuccinimida NHS-DIG (en tampón glucosa isotónico o en 1x solución salina tamponada con fosfato, PBS). La mezcla se incuba durante 30 min a temperatura ambiente. La relación de PBAVE con respecto a NHS-Dig que puede aplicarse a esto
25 incluye relaciones molares 1:1 o diversas otras relaciones. Después de la etapa de incubación de 30 min, se añade una disolución de CDM-PEG550 (0,11 M) al complejo de PBAVE-DIG a una relación 1 con respecto a 35 (Dig-PBAVE con respecto a CDM-PEG) y se incuba durante otros 60 min a temperatura ambiente. Después, se elimina cualquier exceso de CDM-PEG sin acoplar aplicando una columna de centrifugación Sephadex G-50 de 1,3 ml. La unión de NHS-Dig y CDM-PEG al andamiaje de PBAVE produce la formación de enlaces de anhídrido carboxidimetilmaleico CDM sensibles al pH.
Para analizar si estos DPC digoxigenados han expuesto sus digoxigeninas suficientemente de manera que puedan complejarse con anticuerpos biespecíficos con Dig, se realizaron análisis de SEC-MALLS. Esta tecnología analiza no solo tamaños de proteínas o complejos de proteína, sino que también da señales sobre el radio, es decir, forma,
35 de moléculas. Los resultados de los análisis de SEC-MALLS realizados con complejos de anticuerpos biespecíficos y DPC digoxigenados indican que los DPC digoxigenados se unen por los módulos que eligen Dig como diana biespecíficos de una manera bastante estable. Los presentes inventores llegan a la conclusión de que los DPC digoxigenados pueden aplicarse para formar complejos estables con módulos de anticuerpo biespecífico que alojan unidades de unión a Dig.
Complejos de anticuerpo anti-Dig biespecífico -DPC digoxigenado administran DPC a células diana cultivadas e internalizan DPC
Para determinar la funcionalidad de unión al antígeno del complejo de <Diana>-<Dig> Dig-DPC, los presentes
45 inventores aplicaron ensayos FACS. Para estos ensayos, se aplicaron complejos de <IGF1R-Dig>-DPC a células H322M que expresan el IGF1R. Se realizaron análisis FACS sobre líneas celulares H322M y Raji como se muestra en la Figura 40. Suspensas en PBS + 5 % de SBF, las células recibieron una molaridad de anticuerpo o complejo de 7,5 nM y una concentración de anticuerpo secundario (cuando se necesita, es decir, controles) de 30 nM. El anticuerpo primario se incubó durante 30 min sobre hielo y después de una etapa de lavado, el anticuerpo secundario se añadió durante 30 min sobre hielo. Antes de medir las muestras sobre BD FACSCanto II, las células se lavaron. Se detectaron señales a las longitudes de onda apropiadas que son adecuadas para detectar APC (controles) o Cy3 (muestras que contienen DPC). Para H322M, IGF1R se expresa dando una señal para el anticuerpo biespecífico IGF1R-DIG acoplado al conjugado. La línea de células Raji está expresando CD22 y esta línea celular tiene una señal positiva para el conjugado CD22-DIG +. Ambas líneas celulares muestran una señal de
55 ruido de fondo moderada que se produce por la concentración de anticuerpo secundario bastante alta. Sin embargo, como el anticuerpo biespecífico acoplado al conjugado no tiene un anticuerpo secundario en el ensayo, todas las señales detectadas en estas muestras son debidas a la unión al antígeno específica. Los análisis experimentales de los presentes inventores demostraron que el complejo de IGF1R.Dig :: Dig-DPC se une a células H322M que expresan el IGF1R. A diferencia, esta molécula no se une a células Raji o Ramos que no expresan el IGF1R. Esto demuestra que la unión y especificidad se retiene para anticuerpos biespecíficos acoplados a DPC. Experimentos adicionales demuestran que las células Ramos y Raji que expresan el antígeno CD22 se unen a DPC que están complejados con anticuerpos biespecíficos Dig que reconocen el antígeno CD22. Esto confirma que la unión y especificidad se retiene para anticuerpos biespecíficos acoplados a DPC.
65 Se aplicó adicionalmente microscopía confocal para demostrar la unión específica y posterior internalización de DPC elegidos como diana. Para estos experimentos, células H322M que expresan el IGF1R se trataron con complejos de
<IGF1R-Dig>-Dig DPC. La parte de DPC de estos complejos se marcó con el sustrato de fluorescencia Cy3 para visualizar las localizaciones de los DPC después de la unión al antígeno. La Figura 41 muestra que los DPC elegidos como diana se unen a la superficie de antígeno que expresa células H322M y se internalizan. En momentos de tiempo tempranos después de la unión e internalización, el anticuerpo y los DPC se co-localizan en endosomas.
5 Después, la detección de anticuerpos y la detección de DPC indican una separación del complejo dentro de la célula. Esto indica que los DPC complejados con Dig se disocian del resto que elige diana del anticuerpo dentro de la célula, para mediación de actividad endosmolítica no limitada.
Complejos de anticuerpo anti-Dig biespecífico -DPC digoxigenado administran DPC a xenoinjertos de tumor in vivo
Para tratar la cuestión si los complejos de anticuerpo-DPC son suficientemente estables para dirigir DPC a tumores in vivo, se realizaron experimentos en animales. Para estos experimentos, anticuerpos biespecíficos Her2-Dig marcados con Cy3 complejados con DPC digoxigenados marcados con Cy3 se inyectaron en animales que llevaban xenoinjertos de tumor KPL4 que expresa Her2. La acumulación de los DPC en el tumor se detectó por obtención de
15 imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIRF) en diferentes momentos de tiempo y en comparación con la acumulación de Dig-DPC marcado con Cy3 no elegido como diana (que no se complejaron con anticuerpo biespecífico). La Figura 42 muestra los resultados de este análisis: DPC que no son elegidos como diana muestran solo de mala a ninguna acumulación en el tumor positivo para antígeno. A diferencia, los DPC que son elegidos como diana mediante los anticuerpos de Dig biespecíficos muestran claras pruebas de acumulación en el tumor. Los presentes inventores llegan a la conclusión de que los anticuerpos biespecíficos de Dig pueden usarse para elegir como diana DPC para sitios diana deseados in vivo.
Direccionamiento de ARNip con LeY-DIG y DIG-DPC
25 LeY es un antígeno de hidrato de carbono de la familia LeY que se encuentra sobre la superficie de muchos carcinomas mucinosos del colon, estómago, ovario, mama y pulmón, además de algunos carcinomas epidérmicos. Para elegir como diana este antígeno, se construyó un anticuerpo LeY-DIG biespecífico en el que la secuencia de <LeY> se derivó del anticuerpo monoclonal B3, un anticuerpo murino dirigido contra el antígeno LeY (Pastan, et al., 1991, Cancer Research). Como B3 reacciona con solo un número limitado de tejidos normales, es un candidato ideal para el tratamiento de cáncer (Brinkmann et al., 1991, PNAS). Además, debido a que el antígeno LeY tiene una densidad muy alta sobre células derivadas de los carcinomas anteriormente mencionados, tras la unión al antígeno, el complejo de LeY y <LeY> muestra una alta tasa de internalización.
Se realizó análisis FACS para investigar la capacidad de LeY-DIG para dirigir DIG-DPC-ARNip a células MCF7 que
35 expresan LeY de cáncer de mama (Fig. 53a y b). El análisis FACS se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente. En la Fig. 53a se añadió DIG-DPC-ARNip a células MCF7 en concentraciones crecientes (25 nM, 50 nM, 100 nM y 150 nM) produciendo una unión no específica dependiente de la concentración de DIG-DPC-ARNip a la superficie de las células MCF7. En la Fig. 53b, el complejo de LeY-DIG y DIG-DPC-ARNip se incubó sobre las células en concentraciones crecientes (25 nM, 50 nM, 100 nM y 150 nM). Se observó un direccionamiento dependiente de la concentración de LeY-DIG a células MCF7 que supera mucho más el grado de unión no específica de DIG-DPC-ARNip solo. Tomados conjuntamente, LeY-DIG es capaz de dirigir fuertemente DIG-DPC-ARNip a células MCF7 que expresan LeY.
A continuación, se realizaron bioensayos usando células MCF7 con el fin de analizar si el direccionamiento de DIG
45 DPC-ARNip por LeY-DIG produce una regulación por disminución del ARNm relacionado, que es superior a la regulación por disminución del ARNm en células tratadas con DIG-DPC-ARNip solo o en complejo con un anticuerpo que no elige diana.
La Figura 53 c) muestra el resultado de un ensayo de ADNr (descrito anteriormente) de células MCF7 tratadas durante 24 horas con una concentración creciente de DIG-DPC-ARNip solo o en complejo con el anticuerpo que no elige diana CD22-DIG. En este experimento, un Ahal que elige como diana ARNip se unió a los DPC. Aha I (activador de la ATPasa Hsp90) es un regulador para chaperonas Hsp90 (Panaretou et al., 2002, Molecular Cell). El tratamiento de células MCF7 con DIG-DPC-Aha I solo produce una disminución dependiente de la concentración de la relación de ARNm de AhaI/GAPDH, que indica que la unión no específica de DIG-DPC-AhaI a células MCF7
55 también produce alguna inactivación del ARNm del ARNm diana. Además, el ARNm de GAPDH de mantenimiento también disminuye ligeramente si se usan mayores concentraciones de DIG-DPC-AhaI. Sin embargo, sorprendentemente, la incubación de células MCF7 con un complejo de CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI en un modo dependiente de la concentración invierte parcialmente la inactivación mediada por DPC no específica de ARNm de AhaI. Esto refleja probablemente un efecto protector del anticuerpo que no elige diana una vez conectado con el complejo de Dig-ARNip DPC.
En la Fig. 53 d) se muestra un análisis de ARNm de células MCF7 tratadas con DIG-DPC-AHAI en complejo con VEGFR2-DIG, otro anticuerpo que no elige diana, en un modo dependiente de la concentración. De nuevo, la unión a VEGFR2-DIG conduce a una disminución de la transfección no específica de DIG-DPC-AhaI. En conclusión, DIG
65 DPC-AhaI en complejo con anticuerpos que no eligen diana tienen menos actividad no específica que DIG-DPC-AhaI solo.
El tratamiento dirigido de células MCF7 con un complejo de LeY-DIG y DIG-DPC-AhaI en un modo dependiente de la concentración conduce a un fuerte aumento de la regulación por disminución de ARNm de AhaI (normalizado a GAPDH). Esto indica que el direccionamiento específico de LeY-DIG (Fig. 54a) también produce elevada
5 bioactividad de DIG-DPC-AhaI.
La Fig. 53e muestra el análisis de ARNm de células MCF7 tratadas con DIG-DPC-AHAI solo o en complejo con LeY-DIG o CD22-DIG en comparación con células tratadas con DIG-DPC-GL3 solo o en complejo con LeY-DIG o CD22DIG. El ARNip GL3 está dirigido contra luciferasa, un ARNm diana normalmente no presente en células cancerosas. El tratamiento con DIG-DPC-GL3 solo o en complejo con LeY-DIG o CD22-DIG no conduce a una disminución de la relación de AhaI/GAPDH a diferencia del tratamiento con DIG-DPC-AhaI solo o en complejo con LeY-DIG o CD22DIG. Este resultado indica que la disminución de la relación de AhaI/GAPDH indicada por DIG-DPC-AhaI es un efecto mediado por ARNip específico.
15 A continuación, se trataron células MCF7 con LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI y CD22-DIG/DIG-DPC-AHAI en un modo dependiente del tiempo (1, 4, 8, 24 o 48 horas) y de nuevo se evaluó la relación de niveles de ARNm de AhaI con respecto a GAPDH por ensayo de ADNr. A partir de aquellos experimentos se calcularon valores de CI40 y se generó un factor de especificidad de elección de diana dividiendo los valores de CI40 de células MCF7 tratadas con LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI entre los valores de CI40 de células MCF7 tratadas con CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI (abreviado IC40 de LeY/CD22). En la Fig. 53f, el factor de especificidad de elección de diana se representa contra el tiempo, que indica que se alcanza la mayor especificidad cuando se tratan células MCF7 durante 4-8 horas con LeYDIG/DIG-DPC-AhaI.
Puede usarse SEC-MALLS para el análisis de DIG-PBAVE-ARNip y complejos de LeY-DIG DIG-PBAVE-ARNip
25 SEC-MALLS (cromatografía de exclusión por tamaño-dispersión de luz láser de multiángulo) es una técnica analítica por la que las biomoléculas se separan sobre una columna de filtración en gel y se suministra a tres sistemas de detección: UV/visible, índice de refracción (RI) y dispersión de la luz (LS). Los detectores para UV/visible y RI proporcionan información sobre la concentración de la muestra. LS es una técnica no invasiva para caracterizar macromoléculas y un amplio intervalo de partículas en disolución. A diferencia de la mayoría de los métodos para caracterización, no requiere patrones de calibración externa. En este sentido, es una técnica absoluta. Los instrumentos de Wyatt Technology usados aquí hacen dos tipos diferentes de mediciones de la dispersión de la luz para la caracterización molecular absoluta:
35 • Dispersión de la luz clásica /dispersión de la luz estática: Aquí, la intensidad de la luz dispersada se mide en función del ángulo y puede dar la masa molar, radio de RMS y segundo coeficiente del virial (A2). Para ciertas clases de partículas, la dispersión de la luz clásica puede dar el tamaño, forma y estructura.
• Dispersión de la luz cuasi-elástica (QELS) o dispersión de la luz dinámica (DLS): En una medición de QELS, se miden fluctuaciones dependientes del tiempo en la señal de luz dispersada usando un contador de fotones rápido. Las mediciones de QELS pueden determinar el radio hidrodinámico de macromoléculas
o partículas.
Los métodos de dispersión de la luz estática y dinámica recogen diferentes tipos de información, proporcionando datos complementarios para una caracterización más completa de las biomoléculas.
45 Se analizaron DIG-DPC-ARNip AHAI y el complejo de LeY-DIG y DIG-DPC-ARNip AHAI por cromatografía de exclusión por tamaño en combinación con dispersión de la luz láser de ángulo múltiple (SEC-MALLS) y dispersión de la luz cuasi-elástica (QELS). La parte de SEC consistió en una bomba de HPLC, un desgasificador y un inyector automático de la serie 3000 de Dionex Ultimate. Se aplicaron 190 ul de una disolución de 5 mg/ml de DIG-DPC-ARNip AHAI o 190 µl de una disolución de 3,3 mg/ml del complejo de LeY-DIG y DIG-DPC-ARNip AHAI a una columna Superose 6 10/300 GL SEC de GE HealthcareBio-Sciences (Uppsala, Suecia). Se usó 1 x PBS como eluyente y una velocidad de flujo de 0,25 ml/min. Las muestras se detectaron por un detector del índice de refracción diferencial (RI) (Optilab rEx), un detector de dispersión de la luz láser de 3 ángulos (miniDAWN Treos, láser de GaAs 658 nm, 50 mW, celda K5) y un detector de dispersión de la luz dinámica (WyattQELS) de Wyatt Technology (Santa
55 Barbara, CA, EE.UU.). El cálculo de los pesos moleculares usando representaciones de Zimm y radios hidrodinámicos se hizo por ASTRA para Windows Software, versión 5.3.4.13.
Los resultados de los análisis de SEC-MALLS de DIG-DPC-ARNip AHAI y el complejo de LeY-DIG y DIG-DPC-ARNip AHAI se muestran en la Fig. 54.
En la Fig. 54a y b se presentan el análisis del peso molecular de DIG-DPC-ARNip AHAI (panel izquierdo) y LeY-DIG/DIG-DPC-ARNip AHAI (panel derecho). La curva negra indica la señal generada por el detector de LS mientras que la línea roja representa el peso molecular generado de la señal del detector de LS y de RI. El peso molecular dado es solo una aproximación, debido a que el valor de dn/dc exacto para DIG-DPC-ARNip AHAI no se conoce y
65 se estimó como 0,146, que es el valor de dn/dc para PEG. Como se muestra en la Fig. 54a, DIG-DPC-ARNip AHAI
muestran una disolución polidispersa con moléculas de un peso molecular estimado de ∼300 a ∼720 kD. La adición de LeY-DIG produce también una disolución polidispersa, pero con moléculas de un peso molecular estimado de∼500 a ∼1100 kD. El aumento de tamaño indica una formación de complejos entre LeY-DIG y DIG-DPC-ARNip AHAI.
5 En la Fig. 54 c) y d) se presenta el análisis del radio hidrodinámico de DIG-DPC-ARNip AHAI (panel izquierdo) y LeY-DIG/DIG-DPC-ARNip AHAI (panel derecho). La curva negra indica la señal generada por el detector de LS mientras que las líneas de puntos azules representan el radio hidrodinámico generado a partir de la señal del detector de QELS. DIG-DPC-ARNip AHAI contiene moléculas que oscilan de un radio hidrodinámico de ∼7 nm -∼10 nm, LeY-DIG/DIG-DPC-ARNip AHAI contiene moléculas que oscilan de un radio hidrodinámico de ∼9 nm -∼12,5 nm. De nuevo, la adición de LeY-DIG conduce a un aumento en el tamaño que indica de nuevo la formación de complejos de LeY-DIG y DIG-DPC-ARNip AHAI.
Ejemplo 16: Medición de la internalización de anticuerpos biespecíficos <LeY> <DIG> usando GFP marcada 15 con DIG
Pueden usarse anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> para administrar específicamente carga marcada con DIG a células (Ejemplo 6). Una cuestión que surge es si los anticuerpos biespecíficos <Diana>-<Dig> también pueden usarse para dirigir proteínas marcadas con DIG a células. Para responder esta cuestión, los presentes inventores conjugaron el resto de DIG con proteína verde fluorescente potenciada (eGFP) como se ha descrito previamente. eGFP es una forma mutante de GFP derivada de Aequorea victoria con características espectrales mejoradas, fluorescencia elevada, fotoestabilidad y un desplazamiento de la excitación principal a 488 nm (Heim R, Cubitt A, Tsien R (1995). Nature 373 (6516): 663-4).
25 Pueden usarse anticuerpos biespecíficos <LeY>-<DIG> para dirigir la proteína marcada con DIG eGFP a células diana
Para analizar si pueden usarse anticuerpos biespecíficos <LeY>-<DIG> para llevar la proteína marcada con DIG eGFP a células diana, los presentes inventores usaron análisis FACS. Como eGFP es fluorescente (excitación principal 488 nm, emisión principal 509 nm), la presencia de la proteína puede detectarse por conjuntos de filtros de FITC comúnmente disponibles. Los presentes inventores generaron dos variantes de eGFP acopladas a tanto dos
[1:2] como a tres [1:3] restos de DIG.
Para estos análisis, los presentes inventores usaron células MCF7 LeY positivas y el anticuerpo <LeY>-<DIG>
35 biespecífico. Se sembraron 3 x 105 células por pocillo de una placa de 96 pocillos y se usaron inmediatamente. Se añadieron 3,43 nM de anticuerpo biespecífico <LeY>-<DIG> en tampón FACS (PBS que contienen 5 % de FCS) a los pocillos. Se usó un anticuerpo <DIG> a la misma concentración que un control que no elige diana. Para la detección de anticuerpos unidos, un anticuerpo marcado con Cy5 secundario (Jackson Immunoresearch 709-1761490; Cy5-F(ab')2 de burro anti-IgG humana (H + L)) se añadió a una concentración final de 3,43 nM. Después de lavar en tampón FACS, las células se incubaron durante una hora a 4 ºC y a continuación se analizaron con FACSCanto II (BD Biosciences). Para mostrar la administración de eGFP mediada por anticuerpo biespecífico <LeY>-<DIG> a células, se añadieron 3,43 nM del anticuerpo biespecífico <LeY>-<DIG> en tampón FACS (PBS que contienen 5 % de SBF) pre-incubado con una cantidad molar doble de tanto [1:2] como [1:3] de DIG-eGFP a los pocillos. Después de lavar en tampón FACS, las células se analizaron con FACSCanto II (BD Biosciences).
45 Los resultados de estos ensayos (Figura 43) muestran que DIG-eGFP que se compleja con un anticuerpo biespecífico está específicamente dirigido a tumores que expresan el antígeno relacionado. Se observó una débil unión del ruido de fondo del anticuerpo de control <DIG>. Esta señal también se observó con el anticuerpo secundario solo y así es un artefacto de este anticuerpo secundario. Por otra parte, el anticuerpo biespecífico <LeY>-<DIG> muestra una clara unión a las células MCF7 que expresan LeY como se ha detectado por el anticuerpo secundario específico. Ninguno de estos anticuerpos generó una señal significativa en el canal de FITC. Cuando el anticuerpo biespecífico <LeY>-<DIG> se cargó con tanto [1:2] como [1:3] de DIG-eGFP, estos complejos no generaron una señal significativa cuando se analizaron para una señal de Cy5 en comparación con un anticuerpo no cargado detectado con el anticuerpo secundario acoplado a Cy5 (Fig 43). Cuando se analizaron los mismos
55 complejos en el canal de FITC, se obtuvieron señales significativas para tanto [1:2] como [1:3] de DIG-eGFP, pero no se observó señal para el anticuerpo biespecífico <LeY>-<DIG> (Fig 43, 4). Estos datos muestran que eGFP acoplado a DIG como proteína modelo puede reclutarse específicamente para elegir como diana células positivas por un anticuerpo biespecífico <Diana>-<DIG>.
La proteína marcada con DIG eGFP puede usarse para monitorizar la endocitosis de anticuerpo biespecífico unido a célula diana
Anticuerpos dirigidos a receptores asociados a la superficie celular frecuentemente se internalizan tras la unión. Después de la internalización, los anticuerpos unidos a la diana son transportados a los compartimentos
65 endosómicos. Estos compartimentos se acidifican sucesivamente. Con la ayuda de un fluoróforo dependiente del pH tal como eGFP, puede monitorizarse la internalización de un anticuerpo.
El cromóforo de eGFP que es responsable de la absorción y fluorescencia consiste en una phidroxibencilidenimidazolidinona dentro de un cilindro de hojas b. El cromóforo puede tanto existir en una forma de enol de pH neutro como en una forma de fenolato aniónico. Ambas formas presentan características de absorbancia
5 y fluorescencia distintas. El equilibrio entre estas formas depende del pH del medio de alrededor (Nakabayashi T, Wang HP, Kinjo M, Ohta N. Photochemical & photobiological sciences: Official journal of the European Photochemistry Association and the European Society for Photobiology; 2008 Jun;7(6):668-70). Se han usado características de fluorescencia diferentes de ambas formas del cromóforo en diversos ensayos (Puckett LG, Lewis JC, Bachas LG, Daunert S. Analytical biochemistry; 2002 Oct 15;309(2):224-31) (Kneen M, Farinas J, Li Y, Verkman AS. Biophysical journal; 1998 Mar;74(3):1591-9).
Para analizar la capacidad de DIG-eGFP para monitorizar la internalización, los presentes inventores realizaron experimentos FACS. Para este análisis, los presentes inventores usaron células MCF7 LeY positivas y el anticuerpo <LeY>-<DIG> biespecífico. Se sembraron 3 x 105 células por pocillo de una placa de 96 pocillos y se usaron
15 inmediatamente. Se añadió 3,43 nM del anticuerpo biespecífico <LeY>-<DIG> en tampón FACS (PBS que contienen 5 % de FCS) pre-incubado con una cantidad molar doble de tanto [1:2] como [1:3] de DIG-eGFP a los pocillos. Después de lavar en tampón FACS, las células se incubaron durante una hora a tanto 4 ºC como a 37 ºC. A continuación, las células se analizaron con FACSCanto II (BD Biosciences).
Los resultados de estos experimentos (Fig. 44) muestran que la fluorescencia de DIG-eGFP se reduce significativamente después de la internalización del anticuerpo biespecífico <LeY>-<DIG>. A 4 ºC, el complejo puede unirse al antígeno LeY localizado en la superficie celular, pero no puede internalizarse. Después de una hora, la fluorescencia se retiene completamente (Fig. 44). Sin embargo, una hora de incubación a 37 ºC es suficiente para iniciar la internalización del complejo de anticuerpo biespecífico DIG-eGFP <LeY>-<DIG>. La señal medida muestra
25 que todavía hay eGFP en estas células, pero en comparación con las células de control a 4 ºC, se observa una reducción significativa de la señal de fluorescencia (Fig. 44, 1,2). Estos datos muestran que puede utilizarse un fluoróforo dependiente del pH para medir la acidificación dependiente de la endocitosis de endosomas y así seguir el transporte de un anticuerpo biespecífico endocitosado.
Pueden generarse entidades de eligen dianas bi-y multiespecíficas que se unen a diferentes haptenos
La aplicación de módulos de unión a digoxigenina para acoplar cargas digoxigenadas a los vehículos que eligen diana es una posibilidad técnica por la que puede realizarse la administración de carga mediada por hapteno. Sin embargo, el concepto puede extenderse a diferentes haptenos u otras entidades que capturan cargas y las conectan
35 al módulo que elige diana. Por ejemplo, para la administración de ARNip, anticuerpos biespecíficos y derivados de anticuerpo que se unen a ácidos nucleicos pueden aplicarse para conectar ARNip al vehículo que elige diana.
Requisitos previos para la aplicación como módulos de captura de carga son (i) que el acoplamiento de las cargas al hapteno no interfiera con la actividad de carga y (ii) la posibilidad de unión / complejación eficaz de vehículos que eligen diana a cargas 'hapteniladas'. Este ejemplo describe dos módulos adicionales que pueden utilizarse para la administración de carga: entidades de unión a biotina (anticuerpos) y entidades de unión a PEG.
La biotina es una molécula pequeña que es estable y para la que están ampliamente disponibles robustas tecnologías de acoplamiento del estado de la técnica. La biotina puede acoplarse a proteínas, péptidos, compuestos
45 de bajo peso molecular o ácidos nucleicos y otras sustancias. Al igual que la digoxigenina, el acoplamiento mediante métodos convencionales puede hacerse sin afectar la actividad de cargas.
Bastante diferentes de los ligantes de 'haptenos' estándar son los anticuerpos que reconocen polietilenglicol (PEG). El PEG es un polímero y de ahí que pueda no considerarse un 'hapteno' estándar. Sin embargo, las entidades de unión a PEG pueden ser una buena elección para usar como entidad de captura de carga debido a que el PEG ya se usa como unión para proteínas recombinantes. Están disponibles robustas tecnologías y procedimientos optimizados para la PEGilación de proteínas, péptidos y otras sustancias; además, PEG es un componente de muchos vehículos de administración de ARNip tales como nanopartículas. Así, el tener restos de unión a PEG para la captura de carga en los vehículos que eligen diana permite la complejación por la simple combinación con
55 módulos ya existentes. Éstos pueden incluir compuestos PEGilados, proteína o ácidos nucleicos PEGilados, PEGliposomas u otras nanopartículas PEGiladas.
Los vehículo de administración que utilizan restos de unión a biotina o PEG para la complejación de carga pueden generarse basándose en los mismos formatos o combinaciones de formatos que se describen en la Figura 47. Estas moléculas, que se muestran en la Figura 55, pueden generarse reemplazando entidades de unión a digoxigenina de anticuerpos biespecíficos con derivados de anticuerpo que se unen a biotina o polietilenglicol. Los restos que eligen diana de la superficie celular que los presentes inventores aplicaron para la generación de anticuerpos biespecíficos de unión a biotina en este ejemplo se derivaron de un anticuerpo que reconoce el receptor de IGF1 humano. Las secuencias de unión a biotina se aislaron de ARNm de hibridomas murinos que produjeron anticuerpos anti-biotina 65 (de una manera similar a como que se ha descrito en el Ejemplo 1 para el módulo anti-Dig). Del mismo modo, las secuencias de unión a PEG pueden aislarse de ARNm de hibridomas que producen anticuerpos anti-PEG (una
manera similar a como que se ha descrito en el Ejemplo 1 para el módulo anti-Dig). Los anticuerpos anti-PEG que pueden aplicarse para esto se han descrito previamente (Wunderlichet al., Hybridoma 26(3): 168-172, 2007; Cheng et al., Bioconj. Chem. 16:1225-31, 2005; Tsai et al., Biotechniques 30: 396-402, 2001).
5 Las secuencias de aminoácidos que se aplicaron para generar vehículos para administración de carga elegida como diana que contienen módulos anti-biotina se enumeran como SEQIDNO 61 y SEQIDNO 62. El hibridoma de Roche <IGF1R-Biotina> podría expresarse en células de mamífero y purificarse a homogeneidad con tecnologías estándar de proteína A y exclusión por tamaño (véase el Ejemplo 3 'Composición, expresión y purificación de anticuerpos <Dig> humanizados recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión biespecíficas). La Figura 55b a d) muestra que las moléculas que contienen anti-biotina retuvieron completamente la especificidad de elección de diana, además de la competencia de unión a biotina como requisito previo para la administración de carga: Esto se demostró por experimentos de resonancia de plasmones superficiales (BiaCore) (véase el Ejemplo 4 'Unión de anticuerpos <Dig> recombinantes, fragmentos y proteínas de fusión biespecíficas a antígenos digoxigenados' para detalles). Los datos que se muestran en esta figura demuestran que se retiene la especificidad y afinidad de unión
15 hacia antígeno diana de la superficie celular, además de hacia biotina. Así, además de digoxigenina, pueden utilizarse otras sustancias con propiedades (similares a) de hapteno o con competencias de unión a carga directa para generar vehículos para administración de carga dirigida.
Pueden usarse entidades de unión a digoxigenina bi-específicas para administrar módulos de transfección de ARNip basado en proteína o péptido
Se ha mostrado que pueden usarse diversas secuencias de péptidos, los llamados péptidos que penetran en células (CPP), para transfectar moléculas de ARNip en células cancerosas humanas. El péptido TAT es un ejemplo publicado para capacidad de transfección con péptidos que poseen funcionalidad de CPP. Sin embargo, hasta la 25 fecha, la transfección de ARNip con módulos derivados de CPP no pudo combinarse fácilmente con especificidad de elección de diana. Los anticuerpos biespecíficos de unión a digoxigenina con capacidades mostradas para dirigir DIG-ARNip a diversas células diana (véase Ejemplo 13) pueden aplicarse para dirigir un complejo de DIG-ARNip y CPP de unión a ARNip a células que expresan antígeno diana. Para lograr esto, los CPP necesitan unirse al complejo que elige como diana el ARNip-anticuerpo. En algunos casos, los CPP pueden formar espontáneamente complejos con ácidos nucleicos. Puede lograrse enlace incluso más estable entre péptidos con funcionalidades similares a CPP y ARNip conectando los péptidos a entidades que unen ácidos nucleicos. Tales entidades pueden ser estiramientos de oligo-o poli-arginina que se unen a moléculas de ARNip bicatenario debido a las interacciones iónicas entre el esqueleto de fosfato negativamente cargado y los grupos amino positivamente cargados de las argininas. También pueden aplicarse dominios de péptido o de proteína más estructurados para conectar CPP a
35 ARNip, por ejemplo, dominios que se unen a ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios y derivados de ácido nucleico.
La Figura 56a muestra el sistema experimental que los presentes inventores aplicaron para demostrar que pueden usarse anticuerpos biespecíficos <Dig> para administrar complejos de ARNip-CPP a células diana: El módulo de péptido con funcionalidad de CPP que los presentes inventores aplicaron a estos análisis es un péptido 30-mero derivado del gen NRTN humano. Los presentes inventores identificaron recientemente que este péptido tenía funcionalidad similar a CPP y de transfección de ARNip. Para generar derivados de péptido para la eficaz unión a ARNip, los presentes inventores fusionaron este péptido a múltiples argininas. La secuencia de fusión resultante de un módulo de unión a ARNip y el CPP fue
La Figura 56b demuestra que el péptido NRTN similar a CPP que puede fusionarse con la entidad de unión a ARNip se compleja con ARNip (digoxigenado) de una manera bastante estable. Esto produce una fuerte retención mediada por proteína del ARNip complejado en experimentos de electroforesis en gel. El grado de desplazamiento del gel que los presentes inventores observaron indica que más de una fusión de péptido de unión a ARNip se compleja por cada ARNip.
Esto indica la formación de complejos que contienen ARNip <Dig>. Estos pueden ser elegidos como diana por la posterior formación de 'supercomplejos' con vehículos que eligen como diana <Dig> biespecíficos (véase la Figura
55 56a).
Para analizar estos complejos para su capacidad para inducir específicamente el silenciamiento de ARNm en células diana, los presentes inventores compararon la transfección de ARNip elegida como diana de complejos que contuvieron tanto un anticuerpo biespecífico <LeY>-<DIG> como <CD22>-<DIG>, que se cargaron con un ARNip marcado con DIG que elige como diana tanto Aha1 como una luciferasa de control. Estos complejos se formaron por pre-incubación de Dig-ARNip con anticuerpo biespecífico <Dig> a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de la adición de la entidad CPP-poliArg (unión a ARNip) para generar el complejo competente de transfección completa. Se incubó el complejo entero durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente antes de añadir a células MCF7 LeY positivas durante una duración de tres horas en medio Optimem. Después de la 65 posterior incubación en medio de crecimiento durante otras 21 horas, las células se lisaron, y su contenido de ARNm se analizó usando un ensayo de ADNr. Los resultados de estos análisis se muestran en la Figura 56c. Demuestran
que los complejos de anticuerpos biespecíficos con ARNip y péptidos o dominios de transfección complejados con ARNip pueden aplicarse para lograr administración de ARNip específicamente dirigida y posterior iARN dirigida. Se observó la reducción de ARNm de Aha1 con estos complejos en células MCF-7 que expresan LeY que fueron elegidas como diana por el anticuerpo biespecífico <Ley-Dig>. La aplicación de <CD22-Dig> como módulo
5 biespecífico bajo condiciones de otro modo idénticas mostraron iARN reducida en comparación con los efectos que podrían alcanzarse con el anticuerpo biespecífico <LeY-Dig>. Los efectos de iARN significativamente más fuertes con la administración de <Ley>-<DIG> que con la de <CD22>-<DIG> hacia células MCF7 que son LeY positiva y CD22 negativa indican direccionamiento mediado por anticuerpo de los complejos de ARNip-CPP a las células diana.
Ejemplo 17: Nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con digoxigenina (DIG) en combinación con anticuerpos biespecíficos dirigidos contra una diana específica y DIG (<Diana-DIG>) median en el direccionamiento de células específico, captación e iARN específico in vitro.
15 Los presentes inventores investigaron la cuestión de si los anticuerpos biespecíficos <Diana-DIG> serían capaces de dirigir las nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG a células sin interferir con el mecanismo de administración de tales nanopartículas. Para tratar esta cuestión, los presentes inventores
(i)
sintetizaron componentes de lípidos acoplados a DIG de nanopartículas de ARNip-lípido,
(ii)
formularon con aquellas nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG,
(iii) generaron complejos de nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG con anticuerpos biespecíficos
<Diana-DIG>, y, 25
(iv) evaluaron las propiedades de elección de diana y de silenciamiento de ARNm de nanopartículas de ARNiplípido marcadas con DIG en combinación con anticuerpos biespecíficos <Diana-DIG> in vitro.
(i)
Síntesis de 1,2-diestearoil-fosfatidiletanolamina acoplada a DIG [metoxi (polietilenglicol)-2000](DSPE-PEG2000-DIG). Se sintetizó DSPE-PEG2000-DIG acoplando DIG activada con NHS (Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Alemania) a DSPE-PEG2000 funcionalizado con amina (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AB).
(ii)
Fabricación de nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG. Las nanopartículas de ARNip
35 lípido marcadas con DIG consistieron en 1,2-diestearoil-3-fosfatidilcolina (DPPC) (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AB), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (sintetizado en casa), colesterol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Múnich, Alemania) y polietilenglicol (PEG)2000-lípido en una relación de (7,1, 57,1, 34,4, y 1,4 % en moles). El contenido total de PEG2000-lípido (1,4 % en moles) estuvo compuesto de Sunbright GM-020CE, α-[3'-(1,2-dimiristoil-3-propanoxi)-carboxamida-propil]-ω-metoxi-polioxietileno (NOF Europe, Grobbendonk, Bélgica) al 1,4 %, 1,36 %, 1 % o 0,4 %, respectivamente, y DSPE-PEG2000-DIG (véase anteriormente) al 0 %, 0,04 %, 0,4 % o 1 %, respectivamente. Se disolvieron los lípidos y el colesterol en etanol. Se disolvieron AHA1-ARNip, AHA1-ARNip acoplado a DIG o luciferasa (LUC)-ARNip en tampón citrato, pH 4. Se formaron nanopartículas de ARNip-lípido por la rápida inyección de volúmenes apropiados de mezcla etanólica de lípidos en disolución acuosa tamponada de ARNip.
45 Posteriormente se dializaron nanopartículas de ARNip-lípido contra solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando casetes Slide-A-Lyzer® de 10 kD MWCO (Thermo Scientific, Rockford. IL). Se confirmó el valor de pH de las preparaciones de nanopartículas de ARNip-lípido y la distribución de tamaño y el potencial zeta de las nanopartículas de ARNip-lípido se determinaron por dispersión de la luz dinámica en un Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments LTD, Malvern, RU). Se realizó un ensayo RiboGreen modificado (Invitrogen GmbH, Darmstadt, Alemania) para cuantificar el grado de atrapamiento de ARNip. El contenido de ARNip total se determinó espectrofotométricamente después de disolver el complejo de ARNip-lípido en metanol:cloroformo (10:1, vol:vol). Los tamaños de partícula medios de las nanopartículas de ARNip-lípido (RLX-107 -RLX-115) oscilaron de 119 nm a 128 nm (valores de zpromedio) con índices de polidispersidad que oscilan de 0,02 a 0,1. El potencial zeta en PBS osciló de -3 a -4 mV. La eficiencia de
55 encapsulación fue del 95 %-96 % y la concentración de ARNip final osciló de 0,4 mg/ml a 0,5 mg/ml.
(iii) Complejación de nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG con anticuerpos biespecíficos <Diana-DIG>. Se incubaron nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG que contienen 1 pmol de AHA1-ARNip, AHA1-ARNip acoplado a DIG o luciferasa (LUC)-ARNip con 3,24 pmoles de anticuerpos biespecíficos dirigidos contra tanto el sacárido LewisY asociado a tumor y DIG <LeY-DIG> como contra la proteína transmembrana de unión a ácido siálico, CD22, y DIG <CD22-DIG> o con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) en un volumen final de 200 µl de Opti-MEM® (Invitrogen GmbH, Darmstadt, Alemania) a TA durante 30 min.
65 (iv) Evaluación de las propiedades de direccionamiento y de silenciamiento de ARNm de nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG en combinación con anticuerpos biespecíficos
<Diana-DIG> in vitro; Se sembraron células MCF-7 sobre una placa de 96 pocillos con una densidad de
15.000 células/pocillo en 80 µl de medio (medio RPMI 1640, 10 % de suero de ternero fetal, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina; Biochrom AG, Berlín, Alemania) y se incubaron durante la noche en una estufa de incubación de células (37 ºC, 95 % de H2O, 5 % de CO2). Tras la pre-incubación de nanopartículas de 5 ARNip-lípido marcadas con DIG con anticuerpos biespecíficos <Diana-DIG> (véase anteriormente), se añadieron 20 µl de las mezclas a células MCF-7, conduciendo a un volumen final de 100 µl que contenía ARNip 1 nM y sin anticuerpos (sin AB) o ARNip 1 nM y 3,24 nM de tanto anticuerpos <LeY-DIG> (LeY) como <CD22-DIG> (CD22). Las células se incubaron durante 12 horas en una estufa de incubación de células. Como control, las células también se incubaron a la misma concentración de anticuerpo pero sin 10 ARNip o nanopartículas de ARNip-lípido (AB solo). Como control adicional, se transfectaron células con 50 nM de AHA1-ARNip o luciferasa-ARNip complejado con el reactivo de transfección comercialmente disponible Dharmafect 2 (Dh2) (Dharmacon Inc., Lafayette, CO) según las instrucciones del fabricante. Después de la incubación, las células se lisaron y se cuantificaron las concentraciones de AHA1-ARNm y de GAPDH-ARNm usando un sistema de cuantificación de ADNr comercialmente disponible (Affymetrix
15 Inc., Fremont, CA). Las señales de AHA1-ARNm se normalizaron a las señales de GAPDH-ARNm y se informaron relaciones de AHA1/GAPDH-ARNm con respecto a aquellas tras la transfección usando luciferasa-ARNip usando Dh2 (fijado al 100 %). Sin el uso de los anticuerpos biespecíficos <LeY-DIG>, la potencia de las nanopartículas de ARNip-lípido disminuyó con concentraciones de DSPE-PEG2000-DIG crecientes y nanopartículas de ARNip-lípido que contenían 1 % de
20 DSPE-PEG2000-DIG (RLX-107) no mediaron en la inactivación de AHA1-ARNm diana. A diferencia, la incubación de células MCF-7 durante 12 horas con formulaciones que no contienen DSPE-PEG2000-DIG (RLX-110 y RLX-115) conducen a una inactivación de AHA1-ARNm del 43 % o 41 %, respectivamente. Y, lo que es más importante, la eficacia de inactivación de AHA1-ARNm de formulaciones liposómicas que contienen 1 % (RLX-110), 0,4 % (RLX108) o 0,04% (RLX-109) de DSPE-PEG2000-DIG aumentó significativamente el 14 %, 45 % o 31 %, respectivamente,
25 tras la adición de anticuerpos biespecíficos <LeY-DIG> al medio de incubación. Ambos, los anticuerpos biespecíficos <LeY-DIG> y <CD22-DIG>, no tuvieron efecto sobre la eficacia de nanopartículas de ARNip-lípido que no contienen DSPE-PEG2000-DIG. Similarmente, la adición de anticuerpos biespecíficos <CD22-DIG> que no eligen diana a nanopartículas de ARNip-lípido que contienen DSPE-PEG2000-DIG tampoco tuvo efecto sobre la inactivación de AHA1-ARNm. También, las nanopartículas de ARNip-lípido que contienen luciferasa-ARNip (RLX-111 -RLX-114) no
30 afectan los niveles de AHA1-ARNm independientemente de los anticuerpos biespecíficos usados. Cuando se añaden anticuerpos biespecíficos <LeY-DIG> a nanopartículas de ARNip-lípido que no contienen DSPE-PEG2000DIG sino en su ligar AHA1-ARNip modificado con DIG, la eficacia aumentó solo el 5 % en comparación con la adición de anticuerpos <CD22-DIG> (RLX-115) (FIGURA 57).
35 Los resultados resumidos en la Tabla 12 y la Figura 57 implican que nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG pueden administrarse eficaz y específicamente a células que expresan el antígeno dirigido sobre su superficie celular usando anticuerpos biespecíficos <Diana-Dig>. La eficacia de nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG puede así aumentarse significativamente específicamente en células que expresan el antígeno diana. La especificidad de este enfoque por el anticuerpo, el antígeno y el ARNip podría haberse mostrado convincentemente
40 ya que los anticuerpos biespecíficos <CD22-DIG> no transportaron este efecto en nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG y los anticuerpos biespecíficos <LeY-DIG> no transportaron este efecto en nanopartículas de ARNip-lípido que fueron idénticas en sus composiciones, pero no contuvieron el resto que elige diana. Además, los niveles de AHA1-ARNm no se afectaron después del tratamiento de células MCF-7 con nanopartículas de ARNiplípido que contienen Luc-ARNip.
45 Tabla 12: Inactivación de ARNm mediada por ARNip en células MCF-7 tras el tratamiento con nanopartículasde ARNip-lípido marcadas con DIG complejadas con anticuerpos biespecíficos <Diana-Dig>. Se determinaron niveles de AHA1-ARNm (con respecto a GAPDH) en células MCF-7 de cáncer de mama que expresan el antígeno LeY, pero no CD22, tras 12 h de incubación con nanopartículas de ARNip-lípido marcadas con DIG pre-incubadas
50 con anticuerpos biespecíficos <Diana-DIG>.
Concentración relativa de AHA1ARNm / [%]
ARNip (conc.)
formulación Sin AB CD22-DIG LeY-DIG
AHA1 (50 nM)
Dharmafect 2 35,8 - -
Sin ARNip
solo anticuerpo - 96,3 94,6
AHA1 (1 nM)
RLX-107 (1 % de DIG) 95,9 94,2 81,7
RLX-108 (0,4 % de DIG)
86,3 84,6 41,3
RLX-109 (0,04 % de DIG)
67,2 70,7 36,1
RLX-110 (0 % de DIG)
57,0 52,7 58,6
DIG-AHA1 (1 nM)
RLX-115 (0 % de DIG) 59,1 54,5 50,0
LUC (1 nM)
RLX-111 (1 % de DIG) 94,7 97,8 86,8
RLX-112 (0,4 % de DIG)
95,0 95,8 98,0
RLX-109 (0,04 % de DIG)
99,6 92,6 101,2
RLX-110 (0 % de DIG
110,8 91,8 99,1
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> F. Hoffmann -La Roche AG
5 <120> Un complejo de anticuerpo biespecífico y digoxigenina conjugada a un agente terapéutico o de diagnóstico
<130> 26691 10 <150> EP 09164612.5
<151>
<160> 63 15 <170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 126
<212> PRT 20 <213> Mus musculus
<400> 1
25
<210> 2
<211> 144
<212> PRT
<213> Mus musculus
30
<400> 2
<210> 3
<211> 125 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VH de <dig> humanizada 10
<400> 3
<210> 4 5 <211> 455
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Cadena H <dig> humanizada
<400> 4
<210> 5 5 <211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> VL de <dig> humanizada
<900> 5
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> cadena L <dig> humanizada
<400> 6
10
15
<210> 7 <211> 707 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> cadena H <her2><dig> humanizada
65
<400> 7
<210> 8
<211> 712 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena H <her2><dig> humanizada, estabilizados con disulfuro 10
<400> 8
5
<210> 9 <211> 214 <212> PRT <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> cadena L <her2><dig> humanizada
<400> 9
71
5 <210> 10
<211> 705
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> cadena H <IGFR1> <dig> humanizada
<400> 10
<210> 11
<211> 705 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena H <IGFR1> <dig> humanizada, estabilizados con disulfuro 10
<400> 11
<210> 12
<211> 215 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena L <IGFR1> <dig> humanizada 10
<400> 12 5 <210> 13
<211> 715
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> cadena H <CD22><dig> humanizada, estabilizados con disulfuro
<400> 13
<210> 14
<211> 213 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena L <CD22><dig> humanizada 10
<400> 14 <210> 15
<211> 40 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región VL de secuencia cebadora 10
<400> 15
<210> 16
<211> 44 15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región VH de secuencia cebadora 20
<400> 16
<210> 17
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
<210> 18
<211> 39
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19 10 <211> 39
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19 15
<210> 20
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
35
<210> 22 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
40
<220> <223> hebra codificante de ARNbc <400> 22
86
<210> 23
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra codificante de ARNbc
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> el nucleósido está conjugado con digoxigenina
<400> 23
<210> 24
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra codificante de ARNbc
<210> 25
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra codificante de ARNbc
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> nucleósido conjugado con digoxigenina
<400> 25
<210> 26
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra codificante de ARNbc
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> nucleósido conjugado con digoxigenina
<400> 26
<210> 27
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra codificante de ARNbc <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> nucleósido conjugado con cy5
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> nucleósido conjugado con digoxigenina
<400> 27
<210> 28
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra codificante de ARNbc
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> nucleósido conjugado con cy5
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> nucleósido conjugado con digoxigenina
<400> 28
<210> 29
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra no codificante de ARNbc
<210> 30
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra no codificante de ARNbc
<210> 31
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra no codificante de ARNbc
<400> 31
<210> 32
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra no codificante de ARNbc
<210> 33
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra no codificante de ARNbc
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> nucleósido conjugado con digoxigenina
<400> 33
<210> 34
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra no codificante de ARNbc
<210> 35
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> hebra no codificante de ARNbc
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> nucleósido conjugado con digoxigenina
<400> 35
<211> 455
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena H <dig> humanizada -secuencia optimizada
<400> 36
<210> 37
<211> 214 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena L <dig> humanizada optimizada 10
<400> 37
<210> 38 5 <211> 448
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> cadena pesada <IGF1R> humanizada
<400> 38
<210> 39
<211> 477 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena ligera <IGF1R><DIG(kappa)> humanizada 10
<400> 39
5 <210> 40
<211> 705
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> cadena pesada <IGF1R><DIG> humanizada
<400> 40
<210> 41
<211> 464 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena ligera (citrina del extremo C) <IGF1R> humanizada 10
<400> 41
<210> 42
<211> 589 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena pesada 1 de <LeY><DIG>-dsFv humanizada 10
<400> 42
<210> 43
<211> 571 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena pesada 2 de <LeY><DIG>-dsFv humanizada 10
<400> 43
5
<210> 44 <211> 943 <212> PRT <213> Secuencia artificial
10
<220>
108
<223> cadena pesada <VEGFR2>(DIF7)-scFab <DIG> humanizada
<400> 44
<210> 45
<211> 943 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena pesada <VEGFR2>(D1F7)-scFab <DIG> 10
<400> 45
<210> 46
<211> 524 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dsFV <IGF1R> (G4S)3G4T-dsFv <DIG> 10
<400> 46
5 <210> 47
<211> 292
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> 10xGPP-dsFv <IGF1R>
<400> 47
<210> 48
<211> 526 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> 10xGPP-dsscFab-<DIG> 10
<400> 48
5 <210> 49
<211> 651
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dsFv < IGF1R>-núcleo-estreptavidina-dsFv <DIG>
<400> 49
5 <210> 50 <211> 639
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dsFv <Her2> (Lieberman)-exodominio II de Pseudomonas-dsFv <DIG>
<400> 50
5 <210> 51
<211> 712
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena pesada <VEGFR2(D1F7)><DIG> humanizada
<400> 51
<210> 52
<211> 218 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena ligera <VEGFR2(D1F7)><DIG> humanizada 10
<400> 52 <210> 53
<211> 716 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena pesada <Her2(Lieberman)>-<DIG> humanizada 10
<400> 53
5 <210> 54
<211> 217
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> cadena ligera <Her2(Lieberman)>-<DIG> humanizada
<400> 54
<210> 55
<211> 710
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 10
<220>
<223> cadena pesada <CD22><DIG> humanizada
<400> 55 15
<210> 56
<211> 214 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena ligera <CD22><DIG> humanizada 10
<400> 56 <210> 57
<211> 706 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena pesada <LeY><DIG> humanizada 10
<400> 57
5
<210> 58 <211> 219 <212> PRT <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> cadena ligera <LeY> humanizada
<400> 58
146
5 <210> 59
<211> 703
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> cadena pesada <CD33><DIG> humanizada
<400> 59
<210> 60
<211> 222 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena ligera <CD33> humanizada 10
<400> 60 <210> 61
<211> 705 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cadena pesada <IGF1R>-<Biotina> humanizada 10
<400> 61
5 <210> 62
<211> 215
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> cadena ligera <IGF1R> humanizada
<400> 62
5 <210> 63
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
10 <220>
<223> fusión de una molécula de unión a ARNip y CPP
<400> 63

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Un complejo de
    a) un anticuerpo biespecífico específico contra digoxigenina y una proteína diana, que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana, y b) digoxigenina, en el que la digoxigenina está conjugada a un agente terapéutico o de diagnóstico seleccionado del grupo que consiste en un péptido, un compuesto pequeño, un compuesto pequeño radiactivamente marcado y un reactivo de obtención de imágenes, en el que dicho sitio de unión al antígeno que se une específicamente a digoxigenina comprende como dominio variable de la cadena pesada SEQ ID NO. 3 con las mutaciones S49A, I57A y A60P, y como dominio variable de la cadena ligera SEQ ID NO. 5.
  2. 2.-El complejo según la reivindicación 1, en el que dicho sitio de unión al antígeno que se une específicamente a digoxigenina comprende como fragmento Fd de la cadena pesada (VH y CH1) SEQ ID NO. 36 y como cadena L SEQ ID NO. 37.
  3. 3.-El complejo según la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo biespecífico comprende
    a) un anticuerpo bivalente monoespecífico que consiste en dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa y dos cadenas ligeras del anticuerpo de longitud completa, por lo que cada cadena comprende solo un dominio variable, b) dos conectores de péptido, c) dos anticuerpos monocatenarios monovalentes monoespecíficos que consisten cada uno en un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo y un conector monocatenario entre dicho dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y dicho dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo.
  4. 4.-El complejo según la reivindicación 1 a 3, en el que la proteína diana es un antígeno de la superficie celular.
  5. 5.-El complejo según la reivindicación 4, en el que el antígeno de la superficie celular es un antígeno de tumor.
  6. 6.-El complejo según la reivindicación 4, en el que la proteína diana es Her2.
  7. 7.-El complejo según la reivindicación 4, en el que la proteína diana es IGF1R.
  8. 8.-El complejo según la reivindicación 4, en el que la proteína diana es CD22.
  9. 9.-El complejo según la reivindicación 1 a 8, en el que el agente terapéutico o de diagnóstico es un péptido.
  10. 10.-El complejo según la reivindicación 1 a 8, en el que el agente terapéutico o de diagnóstico es un compuesto pequeño.
  11. 11.-El complejo según la reivindicación 10, en el que el compuesto pequeño está radiactivamente marcado.
  12. 12.-El complejo según la reivindicación 1 a 8, en el que el agente terapéutico o de diagnóstico es un reactivo de obtención de imágenes.
  13. 13.-El complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso en la administración de un agente terapéutico o de diagnóstico a una célula diana o tejido.
  14. 14.-El complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso en terapia contra el cáncer dirigida.
  15. 15.-El complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso en radioterapia dirigida.
  16. 16.-Uso del complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para la fabricación de un medicamento para terapia contra el cáncer dirigida.
  17. 17.-Uso del complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para la fabricación de un medicamento para radioterapia dirigida.
  18. 18.-El complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso en obtención de imágenes de células o tejidos.
  19. 19.-Una composición que comprende el complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
  20. 20.- La composición de la reivindicación 19, en la que la composición es una composición de diagnóstico. 21.- La composición de la reivindicación 19, en la que la composición es una composición farmacéutica.
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