概要
本明細書では、真核細胞に大核酸を導入するための組成物について報告をする。この方法は、siRNAやLNAなどの低分子核酸には適していない。導入された大核酸は、前記大核酸に含まれる構造遺伝子によってコードされるポリペプチドの一過性または安定した発現を促進することができる。
本発明は、正しく組み立てられ機能的なクロマチンのみが、大核酸を細胞へと首尾よく標的指向させるという発見に少なくとも部分的に基づいている。さらに、正しく組み立てられていないクロマチンも非特異的ヒストン凝集体も、大核酸の標的指向送達には機能しないことが見出された。
本発明による大核酸の標的指向送達のための実体は、ヒストンまたは細胞透過性ペプチドなどの非特異的に組み立てられた複合体と比較して、大核酸の細胞内送達においてより効率的である。
本発明による実体および方法は、ウイルス、細菌または化学合成起源の化合物または実体を含まない。
したがって、大核酸の効率的な細胞内送達のために、ヒストンは最初に正しく折りたたまれた機能的なクロマチンに組み立てられなければならず、次に標的ドメイン/実体と組み合わされなければならないことが見出された。
定義された「ヒストンを機能的クロマチンに組み立てる」は、送達される大核酸との明確な相互作用をもたらし、大核酸の細胞内送達に不可欠である。
当技術分野から知られているのは、例えば、トランスフェクション増強培地または緩衝液中のペプチドまたはポリペプチドによる「トランスフェクション」である。本明細書で報告される組成物は、従来の培地での標的化された取り込みに適している。本明細書で報告される組成物の使用を容易にする特定の媒体の設計は必要とされない。
当技術分野で知られているのは、ターゲティングを伴わない「トランスフェクション」(したがって、特異性を伴わない)であり、すなわち、溶液中に存在するすべての細胞は、それらの表現型とは無関係にトランスフェクトされる。したがって、当技術分野で知られている方法では、トランスフェクションのために細胞集団の特定の亜集団を選択することは不可能である。本明細書に報告されている組成物では、これは当てはまらない。ターゲティングにより、より大きな細胞集団内で、1つまたは複数の特定の細胞表面マーカー、すなわち細胞表面標的に陽性の細胞の亜集団を選択的に同定することが可能である。これにより、in vivoで適用した場合の望ましくない「副作用」を回避できる。本明細書で報告される組成物は、それぞれの細胞表面標的を提示する細胞が存在しない場合、不活性であり、すなわちトランスフェクトされないことを指摘しなければならない。これにより、in vivoでの使用時に安全性が高まる。
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物を用いて、大核酸の標的特異的送達を達成できるという発見に基づいている。
当技術分野から知られているのは、ヒストンおよびDNAを含む未定義の複合体である。本明細書で報告される組成物は、(化学量論的に)定義された組成物である。本明細書で報告される組成物は、正しく定義され、組み立てられたヌクレオソームに基づいている。これにより、トランスフェクション効率が向上する。
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物では、トランスフェクション増強剤の添加は必要とされない、すなわち省略され得るという発見に基づいている。それにより、例えば、トランスフェクション後の細胞生存率への影響は、もしあれば、減少するか、あるいは無視できる程度にさえなる。
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物により、同等の条件下での既知の方法と比較したトランスフェクション効率が改善されるという発見に基づいている。
本発明は、細胞内標的指向送達および大核酸の細胞内機能性のための発現プラスミドを含む実体を含む。これらの実体は以下を含む:
(i)送達される核酸、例えば、プラスミド、
(ii)核酸と機能的に組み立てられて1つまたは複数のヌクレオソームを形成する1つまたは複数のヒストン、
および
(iii)プラスミド-ヌクレオソームアセンブリに結合した細胞表面を標的とする実体(この細胞表面を標的とする実体により、定義された細胞集団への特定の送達が可能になる)。
細胞表面を標的とする実体の核酸-ヌクレオソーム複合体への結合は、異なる方法で達成することができる。1つの可能性は、ハプテンをヒストン(例えば、化学的または遺伝的結合を介して)またはプラスミドDNA(たとえば、DNA結合ペプチドを介して)に結合させた後、ハプテン結合二重特異性抗体(bsAb)と複合体を形成することである。別の可能性としては、細胞表面を標的とする実体のヒストンへの直接組換え融合または化学的結合によるものである。
本発明による新しい送達実体は、ウイルス成分を含まない。さらに、これらの実体は、タンパク質成分がヒト配列(ヒトヒストンおよびヒト化抗体誘導体)から生成されるため、免疫原性のリスクが低くなる。さらに、これらの送達実体は、非特異的な膜相互作用特性をまったくまたは非常に低いだけで示す。これは、細胞表面を標的とする実体によって認識されない細胞への取り込みの欠如によって証明されている。細胞表面を標的とする実体によって認識される表面抗原を発現する細胞への遺伝子送達の有効性は、ウイルス送達に匹敵するレベルに達し、トランスフェクションのようなナノ粒子/ポリマー法と比較してより効率的である。
本明細書で報告される1つの態様は、真核細胞核への大核酸の標的指向送達のための組成物であり、以下を含む:
-ヒストン(1つまたは複数のヒストンポリペプチド)、
-大核酸、
-ハプテン、および
-ハプテンへの第1結合特異性(特異的に結合する第1の結合部位)および真核細胞上の抗原(存在する細胞表面標的)への第2結合特異性(第2結合部位)を有する二重特異性結合分子、
ここでは、
-ヒストンおよび/または核酸は/ハプテンに共有結合/結合している、
-ヒストンと大核酸は(非共有結合で)互いに結合している/非共有結合複合体を形成している/機能的なクロマチン複合体を形成している/(1つ以上の)ヌクレオソームを形成している、そして
-ハプテンと二重特異性結合分子は、二重特異性結合分子の最初の結合特異性によって互いに関連している/互いに結合している。
一実施形態では、ヒストンおよび大核酸は(機能的)クロマチンを形成する。
一実施形態では、組成物は細菌タンパク質を含まない。
一実施形態では、組成物は、大核酸を除いてウイルス要素を含まない。
一実施形態では、組成物の要素は、(化学量論的に)定義されたおよび/または安定なおよび/または分離可能な複合体を形成する。
一実施形態では、組成物は、非定義/非特異的ヒストン-核酸複合体、すなわち非機能性クロマチンを含む組成物の効率の少なくとも2倍の効率を有する。
一実施形態では、組成物は、大核酸を1つまたは複数のヌクレオソームに組み立てるために十分な数のヒストンポリペプチドをさらに含む。一実施形態では、組成物は、大核酸の150bpあたり最大で/およそ/約1つのヌクレオソームを含む。
一実施形態では、組成物は、最大で150bpの大核酸あたり約8つのヒストンポリペプチドをさらに含む。
一実施形態では、組成物は、最大で150bpの大核酸あたり約1つのヌクレオソームをさらに含む。
一実施形態では、組成物中のヒストンは、2つまたは複数の異なるヒストンの混合物である。一実施形態では、混合物は、ヒストンH2A、H2B、H3およびH4の混合物である。
一実施形態では、組成物中のヒストン/ヒストンは、子牛胸腺ヒストン、ニワトリ赤血球ヒストン、組換えヒトヒストン、またはそれらの混合物である。
一実施形態では、組成物中のヒストン/ヒストンは、ヒストンH2AおよびヒストンH3ポリペプチドの混合物である。
一実施形態では、組成物中のヒストンは、組換えヒトヒストンH3である。
一実施形態では、組成物中のヒストンは、組換えヒトヒストンH3.1またはH3.3である。
上記の実施形態で同定された異なるヒストンは、以下のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、大核酸は、正確に1つの大核酸分子である。
一実施形態では、大核酸は、少なくとも1つの発現カセットおよび単離された発現カセットを含む発現プラスミドから選択される。
一実施形態では、大核酸は、1,000から100,000のヌクレオチドまたは塩基対を含む。別の実施形態では、大核酸は、1,250~20,000ヌクレオチドまたは塩基対を含む。さらなる実施形態において、大核酸は、1,500から10,000のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
一実施形態では、ヒストンは、ヒトヒストンH3.1またはH3.3または子牛胸腺ヒストンである。一実施形態では、ヒトヒストンは化学的に誘導体化されていない。一実施形態では、ヒトヒストンはハプテンに結合していない。
一実施形態では、ヒストンは子牛の胸腺ヒストンであり、大核酸1μgあたり約2μgのヒストンが使用される。
一実施形態では、ヒストンは組換えヒトヒストンであり、大核酸1μgあたり約0.8~1μgのヒストンが使用される。
一実施形態では、ヒストンはニワトリ赤血球ヒストンであり、大核酸1μgあたり約1μgのヒストンが使用される。
一実施形態では、組成物は、少なくとも1つのハプテン分子をさらに含む。一実施形態では、組成物は2つまたは複数のハプテン分子を含み、2つまたは複数のハプテン分子は同じハプテン分子または異なるハプテン分子である。一実施形態では、ハプテン/ハプテン分子は、ビオチン、ジゴキシゲニン、テオフィリン、ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、DOTAMおよびヘリカーモチーフポリペプチドから選択される。
組成物の一実施形態では、ハプテンはさらにヒストンまたは大核酸に化学的に結合している。
組成物の一実施形態では、ハプテンは、大核酸に付着しているDNA結合ペプチドにさらに結合している。
組成物の一実施形態では、その/各ヒストンポリペプチドは、単一のハプテン分子にさらに結合され、および/または大核酸分子は、少なくとも1つのハプテン分子にさらに結合される。
組成物の一実施形態では、二重特異性結合分子は、二重特異性抗体、二重特異性足場、二重特異性ペプチド、二重特異性アプタマー、二重特異性低分子量構造から選択される。一実施形態では、二重特異性抗体は、二重特異性完全長抗体、二重特異性CrossMab、二重特異性T細胞二重特異性、DAF、およびDutaMabから選択される。一実施形態では、二重特異性抗体は二重特異性抗体フラグメントである。一実施形態では、二重特異性抗体フラグメントは、DutaFab、F(ab’)2、タンデムscFv、ダイアボディ、tandAb、scFv2-CH1/CL、およびVHH2-CH1/CLから選択される。
組成物の一実施形態では、細胞表面標的は、内在化する細胞表面受容体である。一実施形態では、細胞表面標的は、細胞型特異的炭水化物、HER1、HER2、HER3、IGF1Rなどの受容体チロシンキナーゼ、およびメソテリン、PSMA、CD19、CD20、CD44、TfR、LRP、IL受容体などの細胞型特異的抗原からなる群から選択される内在化細胞表面受容体である。
一実施形態では、組成物は、正確に1つの二重特異性結合分子または二重特異性結合分子の2つまたは複数のコピーをさらに含む。
組成物の一実施形態では、ハプテンはビオチンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は、以下を含む抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である。(a)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR-H3、(d)配列番号27のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(e)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(f)配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
組成物の一実施形態では、ハプテンはジゴキシゲニンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は、以下を含む抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である。(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR-H3、(d)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(e)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(f)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
組成物の一実施形態では、ハプテンはテオフィリンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は、以下を含む抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である。(a)配列番号31のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR-H3、(d)配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(e)配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(f)配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
組成物の一実施形態では、ハプテンはフルオレセインであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は、以下を含む抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である。(a)配列番号39のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号40のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号41のアミノ酸配列を含むHVR-H3(d)配列番号43のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(e)配列番号44のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(f)配列番号45のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
組成物の一実施形態では、ハプテンはブロモデオキシウリジンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は、以下を含む抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である。(a)配列番号47のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号48のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号49のアミノ酸配列を含むHVR-H3(d)配列番号51のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(e)配列番号52のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(f)配列番号53のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
組成物の一実施形態では、ハプテンは配列番号57のヘリカーモチーフポリペプチドであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は、抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である(配列番号55のHVR-H1、HVR-H2およびHVR-H3、ならびに配列番号56のHVR-L1、HVR-L2およびHVR-L3を含む)。
組成物の一実施形態では、各ハプテンは、1つ/単一の二重特異性結合分子によってさらに特異的に結合される。
組成物の一実施形態では、大核酸はCRISPR/Cas9をコードしている。
組成物の一実施形態では、大核酸はさらに以下を含む:
-CRISPR/Casシステム核酸、および/または
-哺乳動物細胞に内因性のポリペプチドの発現カセット、および/または
-治療機能を有する酵素または他のタンパク質/ペプチドをコードするポリペプチドの発現カセット、および/または
-マイクロRNA、短干渉RNA、長鎖ノンコーディングRNA、RNAデコイ、RNAアプタマー、リボザイムなどの治療機能を備えたノンコーディングRNAの転写システム。
一実施形態では、ヒストンは、野生型アミノ酸配列を有する天然に存在するヒストンである。
一実施形態では、組成物は、送達される大核酸の配列を除いて、ウイルスまたは細菌起源の化合物を含まない。
本明細書で報告される1つの態様は、本明細書で報告される組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤である。
一実施形態では、医薬製剤はさらに薬剤として使用するためのものである。
一実施形態では、医薬製剤はさらに遺伝子治療で使用するためのものである。
本明細書で報告される1つの態様は、医薬品の製造における本明細書で報告される組成物の使用である。
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される有効量の組成物を個体に投与することを含む、遺伝病を有する個体を治療する方法であり、ここで、大核酸は、(発現カセット内に)遺伝病を治療するために必要なポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む。
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される有効量の組成物を個体に投与することを含む、個体の細胞における遺伝子発現を改変する方法であり、ここで、大核酸は、(発現カセット内に)遺伝子発現を改変するために必要なポリペプチドをコードする構造遺伝子または治療用核酸のいずれかを含む。
本明細書で報告される一態様は、以下のステップを含む、本明細書で報告される組成物を調製するための方法である。
a)大核酸とヒストンをインキュベートして、大核酸またはヒストン、あるいはその両方が少なくとも1つのハプテン分子に結合している、大核酸-ヒストン複合体を形成する。
b)a)で形成された複合体を二重特異性結合分子とインキュベートして、二重特異性結合分子-大核酸-ヒストン複合体を生成し、
c)ステップb)で形成された複合体を単離および/または精製し、それにより、本明細書で報告される組成物を生成する。
本明細書で報告される一態様は、以下のステップを含む、真核細胞に大核酸を導入するための方法である。
a)細胞表面標的への二重特異性結合分子の結合に適した条件下で、本明細書に報告されている組成物で真核細胞をインキュベートし、
b)大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞に導入する。
本明細書で報告される一態様は、以下のステップを含む真核細胞をトランスフェクトするための方法である:
a)細胞表面標的への二重特異性結合分子の結合に適した条件下で、本明細書に報告されている組成物で真核細胞をインキュベートし、
b)大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって真核細胞をトランスフェクトする。
本明細書で報告される一態様は、以下のステップを含む、核酸を真核細胞に輸送するための方法である。
a)細胞表面標的への二重特異性結合分子の結合に適した条件下で、本明細書に報告されている組成物で真核細胞をインキュベートし、
b)大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞に輸送する。
本明細書で報告される一態様は、以下のステップを含む、真核細胞核に核酸を輸送するための方法である:
a)細胞表面標的への二重特異性結合分子の結合に適した条件下で、本明細書に報告されている組成物で真核細胞をインキュベートし、
b)大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞の核に輸送する。
本明細書で報告される一態様は、真核細胞への大核酸の標的指向送達のための本明細書で報告される組成物の使用である。
本明細書で報告される一態様は、真核細胞核への大核酸またはその機能的断片の導入のための、本明細書で報告される組成物の使用である。
一実施形態では、組成物はさらに、大核酸またはその機能的断片を真核細胞に導入するためのものである。
一実施形態では、組成物はさらに、大核酸またはその機能的断片による真核細胞のトランスフェクションのためのものである。
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される組成物およびその子孫を使用する方法で得られる細胞である。
本明細書で報告される一態様は、真核細胞の集団の定義された亜集団をトランスフェクトするための方法であり、以下のステップを含む:
-本明細書で報告される組成物を有する少なくとも1つの細胞表面抗原が異なる少なくとも2つの亜集団を含む真核細胞の集団をインキュベートする。ここで、二重特異性結合分子の第2結合特異性は、(単一)真核細胞の集団の亜集団、およびそれによって真核細胞の集団の定義された亜集団をトランスフェクトする。
上で概説したハプテンに加えて、標的指向実体を大核酸に連結するための他の手段も使用することができる。これらには、これだけでは限定されないが、以下を含む:
-ヒストンへの結合体または融合、
-ハプテンまたは結合実体のDNA結合実体/ペプチドへの結合体または融合、
-ヒストンに結合する二重または多重特異性実体(例:抗ヒストンbsAb)、
-DNAに結合する二重または多重特異性実体(例:抗DNA bsAb)、
-修飾ヌクレオチドに結合する二重または多重特異性実体(例:抗BrdU bsAb)。
本発明による組成物の利点は、細胞アクセス、細胞内輸送、およびプラスミドの核内保持を伴う、レシピエント細胞または生物に対する最小の毒性である。
本発明による組成物は、プラスミド保持、エンドソーム捕捉の欠如、およびヌクレアーゼなどの細胞プロセスからの保護の利点を付与しながら、治療用ペプチド/核酸の核局在化を促進するのに役立つことができる。
本発明による組成物/輸送物質の提供もまた、遺伝子治療のための完全に人工的な遺伝子導入システムに向けた重要なステップである。このような遺伝子導入システムは、3つの機能コンポーネントを備えている必要がある。1つは細胞膜を通過するDNAのコンポーネント、2つ目は(通常は非分裂)標的細胞核へのDNAの転送、3つ目はDNAのゲノムへの統合を仲介する。遺伝子治療に使用できる完全人工遺伝子導入組成物は、おそらく、現在適用されているウイルスシステムよりも製造が容易で安価であり、取り扱いが容易であり、これらのシステムの内在的なリスクの影響を受けない。
本発明による組成物はまた、培養細胞におけるトランスフェクション効率を増加させる。
本発明の好ましい実施形態において、上記の方法は、休止している、ゆっくりと分裂している、または分裂していない細胞、好ましくは初代細胞、および/または核酸としての少なくとも1つのDNA分子である真核細胞を用いて達成される。
[本発明1001]
真核細胞核への大核酸の標的指向送達用の組成物であって、
-1つまたは複数のヒストンポリペプチド、
-大核酸
-ハプテン、および
-ハプテンに特異的に結合する第1結合部位と、真核細胞上に存在する細胞表面標的に特異的に結合する第2結合部位とを有する、二重特異性結合分子
を含み、
ここで
-ヒストンおよび/または核酸がハプテンに結合し、
-ヒストンと大核酸がヌクレオソームを形成し、および
-ハプテンと二重特異性結合分子は、二重特異性結合分子の第1結合部位によって互いに結合している、組成物。
[本発明1002]
1つまたは複数のヒストンポリペプチドは、ヒストンH2A、H2B、H3、およびH4の混合物である、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
1つまたは複数のヒストンポリペプチドは、ヒストンH2AとヒストンH3の混合物である、本発明1001から1002のいずれかの組成物。
[本発明1004]
ヒストンポリペプチドは子牛の胸腺ヒストンポリペプチドである、本発明1001から1003のいずれかの組成物。
[本発明1005]
ヒストンポリペプチドは組換えヒトヒストン3.1または3.3である、本発明1001から1003のいずれかの組成物。
[本発明1006]
大核酸はプラスミドであり、1,500~10,000塩基対で構成されている、本発明1001から1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
1つのハプテン分子を含む、本発明1001から1006のいずれかの組成物。
[本発明1008]
ハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン、テオフィリン、ブロモデオキシウリジン、およびフルオレセインから選択される、本発明1001から1007のいずれかの組成物。
[本発明1009]
ハプテンはヒストンまたは大核酸に化学的に結合している、本発明1001から1008のいずれかの組成物。
[本発明1010]
ハプテンは、大核酸に結合しているDNA結合ペプチドに結合している、本発明1001から1008のいずれかの組成物。
[本発明1011]
二重特異性結合分子は二重特異性抗体である、本発明1001から1010のいずれかの組成物。
[本発明1012]
二重特異性結合分子の1つまたは複数の分子を含む、本発明1001から1011のいずれかの組成物。
[本発明1013]
大核酸は以下を含む、本発明1001から1012のいずれかの組成物:
-CRISPR/Casシステム核酸、および/または
-哺乳動物細胞に内因性のポリペプチド用の発現カセット、および/または
-治療機能を持つ酵素または他のタンパク質/ペプチドをコードするポリペプチド用の発現カセット、および/または
-マイクロRNA、短干渉RNA、長鎖ノンコーディングRNA、RNAデコイ、RNAアプタマー、およびリボザイムなどの治療機能を備えたノンコーディングRNA用の転写システム。
[本発明1014]
以下のステップを含む、真核細胞に大核酸を導入する方法:
a)二重特異性結合分子の第2結合特異性が本発明1001から1013のいずれかの組成物と特異的に結合する、細胞表面標的を提示する真核細胞をインキュベートするステップ、
b)大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞に導入するステップ。
[本発明1015]
真核細胞への大核酸の標的指向送達のための、本発明1001から1013のいずれかの組成物の使用。
[本発明1016]
以下のステップを含む、真核細胞の集団の定義された亜集団を大核酸でトランスフェクトするための方法:
-本発明1001から1013のいずれかの組成物を有する少なくとも1つの細胞表面抗原が異なる少なくとも2つの亜集団を含む真核細胞の集団をインキュベートするステップであって、ここで、二重特異性結合分子の第2結合特異性は、真核細胞の集団の亜集団にのみ存在する細胞表面抗原に特異的に結合し、それにより、真核細胞の集団の定義された亜集団を大核酸でトランスフェクトする、ステップ。
発明の態様の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物を用いて、ペプチドまたはポリペプチドをコードする大核酸による真核細胞のトランスフェクションが従来の培地で達成され得るという発見に基づいている。
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物を用いて、それらの表現型に応じて、真核細胞集団による亜集団の標的化されたトランスフェクションが可能であるという発見に基づく。標的化により、より大きな細胞集団内で、1つまたは複数の特定の細胞表面マーカー、すなわち細胞表面標的に陽性の細胞の亜集団を選択的に同定することが可能である。これにより、in vivoで適用した場合の望ましくない「副作用」を回避できる。これにより、in vivoでの使用時に安全性が高まる。
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物を用いて、大核酸の標的特異的送達を達成できるという発見に基づいている。
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物では、トランスフェクション増強剤の添加は必要とされない、すなわち省略され得るという発見に基づいている。それにより、例えば、トランスフェクション後の細胞生存率への影響は、もしあれば、減少するか、あるいは無視できる程度にさえなる。
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物により、同等の条件下での既知の方法と比較したトランスフェクション効率が改善されるという発見に基づいている。
定義
Carter P.;Ridgway J.B.B.;Presta L.G.:Immunotechnology,Volume 2,Number 1,February1996,pp.73-73(1)では、ノブイントゥホール二量体化モジュールおよび抗体工学におけるそれらの使用について説明する。
抗体の重鎖のCH3ドメインは、「ノブイントゥホール」技術によって変更することができる。これは、WO96/027011,Ridgway,J.B.,ら.,Protein Eng.9(1996)617-621;and Merchant,A.M.,ら,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681でいくつかの例を使用して詳細に説明されている。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用表面を変更して、これら2つのCH3ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。(2重鎖の)2つのCH3ドメインのそれぞれを「ノブ」にすることができ、もう1つを「穴」にすることができる。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロダイマー(Merchant,A.M.,ら.,Nature Biotech.16(1998)677-681;Atwell,S.,ら.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)をさらに安定化し、収率を高める。しかし、これは本発明の分子には存在しない。
(抗体重鎖の)CH3ドメインの変異T366Wは、「ノブ変異」または「変異ノブ」として示され、(抗体重鎖の)CH3ドメインの変異T366S、L368A、Y407Vは、「ホール変異」または「変異ホール」(Kabat EUインデックスによる番号付け)として示される。CH3ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋(Merchant,A.M.,ら.,Nature Biotech.16(1998)677-681)は、例えば、「ノブ変異」(「ノブ-cys-変異」または「変異ノブ-cys」として示される)を使用して重鎖のCH3ドメインにS354C変異を導入するおよび「ホール変異」(「ホール-cys-変異」または「変異ホール-cys」として示される)を使用して重鎖のCH3ドメインにY349C変異を導入する(Kabat EUインデックスによる番号付け)ことによっても使用できる。しかし、これは本発明の分子には存在しない。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、次のとおりである。Kabat,E.A.,ら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。
本明細書で使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabatら.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)にあり、ここでは「Kabatによる番号付け」と呼ばれる。具体的には、カッパおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLにはKabatナンバリングシステム(Kabatら.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)の647-660ページを参照のこと)が使用され、定常重鎖ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3、この場合、「Kabat EUインデックスによる番号付け」を参照することでさらに明確になる)にはKabat EUインデックスナンバリングシステム(661-723ページを参照のこと)が使用される。
本発明を実施するための有用な方法および技術は、以下に記載されている:例えば、Ausubel,F.M.(ed.),Current Protocols in Molecular Biology,Volumes I to III(1997);Glover,N.D.,and Hames,B.D.,ed.,DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(1985),Oxford University Press;Freshney,R.I.(ed.),Animal Cell Culture - a practical approach,IRL Press Limited(1986);Watson,J.D.,ら,Recombinant DNA,Second Edition,CHSL Press(1992);Winnacker,E.L.,From Genes to Clones;N.Y.,VCH Publishers(1987);Celis,J.,ed.,Cell Biology,Second Edition,Academic Press(1998);Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,second edition,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。
組換えDNA技術の使用は、核酸の誘導体の生成を可能にする。そのような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって実施することができる。そのような修正は、当業者によって容易に実行され得る。(例えば、Sambrook,J.,ら,Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA;Hames,B.D.,and Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization - a practical approach(1985)IRL Press,Oxford,Englandを参照のこと)。
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形の参照を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「a cell」への言及は、当技術分野で知られている複数のそのようなセルおよびその同等物などを含む。同様に、「a」(または「an」)、「one or more」および「at least one」という用語は、本明細書では交換可能に使用することができる。「comprising」、「including」、および「having」という用語は、交換可能に使用できることにも留意されたい。
「about」という用語は、その後の数値の+/-20%の範囲を意味する。一実施形態では、「about」という用語は、その後に続く数値の+/-10%の範囲を示す。一実施形態では、「about」という用語は、その後に続く数値の+/-5%の範囲を示す。
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例には、Fv、scFv、Fab、scFab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子(例:scFv)、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントのレビューについては、Hudson,P.J.ら.,Nat.Med.9(2003)129-134を参照のこと。scFvフラグメントのレビューについては、例えば、Plueckthun,A.,In;The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore(eds.),Springer-Verlag,New York(1994),pp.269-315を参照のこと;WO93/16185;US 5,571,894 and US 5,587,458にも参照のこと。
ダイアボディは、二価または二重特異性であってもよい、2つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、EP 0 404 097;WO1993/01161;Hudson,P.J.ら.,Nat.Med.9(2003)129-134;and Holliger,P.ら.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448を参照のこと。トライアボディとテトラボディもHudson,P.J.ら.,Nat.Med.9(20039 129-134)で説明されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部、あるいは軽鎖可変ドメインの全部または一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis,Inc.,Waltham,MA;e.g.,US 6,248,516を参照のこと)。
抗体フラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、ならびに組換え宿主細胞(例えば、大腸菌またはファージ)による産生を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。
「抗体フラグメント」という用語は、2つの異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用Fab」または「DAF」も含む(例えば、US2008/0069820を参照のこと)。
「(抗原への)結合」という用語は、インビトロアッセイにおける抗体の結合を意味する。一実施形態では、結合は、抗体が表面に結合し、抗原の抗体への結合が表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定される結合アッセイで決定される。結合とは、例えば10-8M以下の結合親和性(KD)、10-13~10-8Mのいくつかの実施形態では、10-13~10-9Mのいくつかの実施形態。「結合」という用語は、「特異的に結合する」を含む。
例えば、BIAcore(登録商標)アッセイの1つの可能な実施形態において、抗原は表面に結合され、抗体結合部位の結合は、表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定される。結合の親和性は、ka(結合定数:複合体を形成するための結合の速度定数)、kd(解離定数;複合体の解離の速度定数)、およびKD(kd/ka)という用語によって定義される。あるいは、SPRセンサーグラムの結合シグナルは、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、参照の応答シグナルと直接比較することができる。
本明細書で使用される「結合部位」という用語は、第2ポリペプチドに特異的に結合することができるポリペプチドまたはポリペプチドの対を意味する。一実施形態では、結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメイン、抗体重鎖および抗体軽鎖可変ドメインの対、その受容体または機能的フラグメント、そのリガンドまたは機能的フラグメント、酵素またはその基質から選択される。「含む」という用語には、「からなる」という用語も含まれる。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的または予防的結果を実現するために必要な投薬量および期間での有効な量を指す。
「全長抗体」、「インタクト抗体」および「全抗体」との用語は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。
「全長抗体」という用語は、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を意味する。全長抗体は、それぞれが軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む2つの全長抗体軽鎖、ならびにそれぞれが重鎖可変ドメイン、第1定常ドメイン、ヒンジ領域、第2定常ドメインおよび第3定常ドメインを含む2つの全長抗体重鎖を含む。全長抗体は、全長抗体の1つまたは複数の鎖に結合したさらなるドメイン(例えば、追加のscFvまたはscFabなど)を含み得る。これらの結合体は、全長抗体という用語にも含まれる。
用語「真核細胞」、「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」とは、互換的に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代の形質転換された細胞、および初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一でなくてもよいが、変異を含んでいてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか、または選択されるのと同じ機能または生体活性を有する変異体子孫が本発明に含まれる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRsからのアミノ酸残基およびヒトFRsからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、実質的に少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインのすべてを含み、ここで、すべてまたは実質的にすべてのHVRs(例えば、CDRs)は、非ヒト抗体のものに対応し、または実質的にすべてのFRがヒト抗体のFRに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書で使用される「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列が超可変(「相補性決定領域」または「CDR」)である、および/または構造的に定義されたループ(「超可変ループ」)を形成する、および/または抗原接触残基(「抗原接触」)を含むアミノ酸残基ストレッチを含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、抗体は、6つのHVRを含み、3つがVH(H1、H2、H3)にあり、3つがVL(L1、L2、L3)にある。
HVRは以下を含む:
(a)アミノ酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、および96-101(H3)で発生する超可変ループ(Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917);
(b)アミノ酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、および95-102(H3)で発生するCDR(Kabat,E.A.ら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242.);
(c)アミノ酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)および93-101(H3)で生じる抗原接触(MacCallumら.J.Mol.Biol.262:732-745(1996));ならびに
(d)(a)、(b)、および/または(c)の組合せ、アミノ酸残基46~56(L2)、47~56(L2)、48~56(L2)、49~56(L2)、26~35(H1)、26~35b(H1)、49~65(H2)、93~102(H3)、および94~102(H3)を含む。
本明細書で別途示されない限り、可変ドメイン中のHVR残基および他の残基(例えば、FR残基)は、Kabatら、上記参照に従って本明細書において番号付けされる。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ)、霊長類(例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、げっ歯類(例えば、マウスおよびラット)が挙げられる。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
「隔離された」組成物は、その自然環境の構成要素から分離されたものである。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)またはクロマトグラフィー(例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換HPLCまたは逆相HPLC)によって決定されるように、95%または99%を超える純度に精製される。例えば抗体の純度を評価する方法のレビューについては、例えばFlatman,S.ら.,J.Chrom.B 848(2007)79-87を参照のこと。
「単離核酸」は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、および/または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得る変異型抗体は例外であり、かかる変異型は一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な組み立てから得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように構築されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含めた(これらに限定されない)多様な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
「単一特異性抗体」は、1つの抗原に対して単一の結合特異性を有する抗体を意味する。単一特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント(例えば、F(ab’)2)またはそれらの組み合わせ(例えば、完全長抗体と追加のscFvまたはFabフラグメント)として調製することができる。
「多重特異性抗体」は、同じ抗原または2つの異なる抗原上の少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を意味する。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)またはそれらの組み合わせ(例えば、完全長抗体と追加のscFvまたはFabフラグメント)として調製することができる。2つ、3つ、またはそれを越える(例えば4つ)の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も報告されている(例えば、US2002/0004587 A1を参照のこと)。1つの多重特異性抗体は二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、抗体のFcヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作することによっても作製できる(WO2009/089004)。
「ネイキッド多重特異性抗体」とは、部分(例えば、細胞毒性部分)または放射性標識に結合されていない多重特異性抗体を指す。ネイキッド多重特異性抗体は、医薬製剤中に存在し得る。
「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然IgG抗体は、ジスルフィド結合されている2つの同一の軽鎖および2つの同一の重鎖からなる約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端まで、各重鎖には可変領域(VH)があり、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれ、その後に3つの定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)が続く。そして、第1および第2定常ドメインの間には、ヒンジ領域が位置している。同様に、NからC末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)を有し、続いて定常軽(CL)ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2種類の1つに割り当てられてもよい。
「ヌクレオソーム」という用語は、DNAとヒストンを含む粒子を意味する。クロマチンは、核DNAが細胞内にパッケージされている高分子状態である。ヌクレオソームはクロマチンの構造単位である。各ヌクレオソームは、約150bpの二本鎖DNAと、各コアヒストン(H2A、H2B、H3、およびH4)の2つのコピーを含むヒストン八量体で構成されている。リンカーヒストンであるヒストンH1は、ヌクレオソーム間の結合に関与して、クロマチンをさらに圧縮する(Luger,K.,らNature 389(1997)251-260;Chakravarthy,S.,ら.FEBS Lett.579(2005)895-898)。したがって、真核生物では、ヌクレオソームがDNAパッキングの基本単位である。ヌクレオソームコア粒子は、ヒストン八量体の周りの左巻きの超らせんターンに包まれた約150塩基対(bp)のDNAで構成されている。例えば、ヒストン八量体は、ヒストンH2A、H2B、H3、およびH4のそれぞれ2つのコピーからなり得る。コア粒子は一般に、いわゆる「リンカーDNA」のストレッチによって接続されている。このリンカーDNAは最大約80bpsを含むことができる。本明細書において、「ヌクレオソーム」という用語は、必要に応じてコア粒子に加えてリンカーDNAの1つを意味する。1つまたは複数のヌクレオソームの存在は、機能的なクロマチンの要件である。
用語「添付文書」とは、そのような治療製品の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症、および/またはその使用に関する警告についての情報を含有する、治療製品の商業用パッケージに通例含まれる指示書を指すために使用される。
「パラトープ」という用語は、標的と結合部位との間の特異的結合に必要とされる所与の抗体分子のその部分を指す。パラトープは、アミノ酸残基の一次配列では連続的(すなわち、結合部位に存在する隣接するアミノ酸残基によって形成される)または不連続的(すなわち、異なる位置にあるアミノ酸残基によって形成される)である可能性があるが(アミノ酸残基のCDRのアミノ酸配列など)、結合部位が採用する三次元構造では近接している可能性がある。
「ペプチドリンカー」という用語は、天然および/または合成起源のリンカーを意味する。ペプチドリンカーは、アミノ酸の線形鎖で構成されており、20個の天然に存在するアミノ酸は、ペプチド結合によって接続されている単量体の構成要素である。鎖の長さは1~50アミノ酸残基であり、1~28アミノ酸残基が好ましく、特に3~25アミノ酸残基が好ましい。ペプチドリンカーは、反復アミノ酸配列または天然に存在するポリペプチドの配列を含み得る。ペプチドリンカーは、環状融合ポリペプチドのドメインが、ドメインが正しく折りたたまれ、適切に提示されることを可能にすることによって、それらの生物学的活性を実行できることを確実にする機能を有する。好ましくは、ペプチドリンカーは、グリシン、グルタミン、および/またはセリン残基が豊富であると指定されている「合成ペプチドリンカー」である。これらの残基は、例えば最大5アミノ酸の小さな反復単位で配置される(例えば、GGGS(配列番号58)、GGGGS(配列番号59)、QQQG(配列番号60)、QQQQG(配列番号61)、SSSG(配列番号62)またはSSSSG(配列番号63))。この小さな反復単位を2~5回繰り返して、多量体単位を形成することができる(例えば、(GGGS)2(配列番号64)、(GGGS)3(配列番号65)、(GGGS)4(配列番号66)、(GGGS)5(配列番号67)、(GGGGS)2(配列番号68)、(GGGGS)3(配列番号69)、(GGGGS)4(配列番号70)、(GGGGS)4GG(配列番号73)、GG(GGGGS)3(配列番号72)および(GGGGS)6(配列番号74))。多量体ユニットのアミノ末端および/またはカルボキシ末端に、最大6つの追加の任意の天然に存在するアミノ酸を加えることができる。他の合成ペプチドリンカーは、10~20回繰り返される単一のアミノ酸で構成され、アミノ末端および/またはカルボキシ末端に最大6つの追加の任意の天然アミノ酸を含み得る(例えば、リンカーGSSSSSSSSSSSSSSSGのセリン(配列番号71))。すべてのペプチドリンカーは、核酸分子によってコードされ得るため、組換え的に発現され得る。リンカーはそれ自体がペプチドであるため、抗融合性ペプチドは、2つのアミノ酸間で形成されるペプチド結合を介してリンカーに結合する。
用語「薬学的製剤」とは、調製物中に含有される活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を全く含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されるすべての抗体(キメラ、ヒト化およびヒト)を意味する。これには、NS0、HEK、BHK、CHO細胞などの宿主細胞から、またはヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物(マウスなど)から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現プラスミドを使用して発現された抗体が含まれる。そのような組換え抗体は、再配列された形で可変および定常領域を有する。本明細書で報告される組換え抗体は、in vivoでの体細胞超変異に供することができる。したがって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VHおよびVL配列に由来し、in vivoでのヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在しない可能性がある。
本明細書で使用される場合、「治療(treatment)」(および「治療する(treat)」または「治療すること(treating)」などのその文法上の変形)とは、治療されている個体の自然経過を変更することを目的とした臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過中に行われ得る。所望の処置効果として、限定されないが、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病的状態、転移の予防、疾患の進行率を下げる、疾患状態の軽減または緩和、回復または改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、または疾患の進行を遅らせるために使用される。
本出願内で使用される「価」という用語は、(抗体)分子内に特定の数の結合部位が存在することを意味する。したがって、「二価」、「四価」、および「六価」という用語は、(抗体)分子内にそれぞれ2つの結合部位、4つの結合部位、および6つの結合部位が存在することを示す。本明細書で報告される本明細書で報告される二重特異性抗体は、1つの好ましい実施形態では「二価」である。
「可変領域」または「可変ドメイン」との用語とは、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖(それぞれVHおよびVL)の可変ドメインは一般に類似の構造を持ち、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(HVR)を含む(例えば、Kindt,T.J.ら.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),page 91を参照のこと)。単一のVHまたはVLドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分かもしれない。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からVHまたはVLドメインを使用して単離して、それぞれ相補的なVLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる(例えば、Portolano,S.,ら.,J.Immunol.150(1993)880-887;Clackson,T.,ら.,Nature 352(1991)624-628を参照のこと)。
用語「ベクター」とは、本明細書で使用される場合、連結している別の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、および導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
本明細書で使用される「ドメインクロスオーバー」という用語は、抗体重鎖VH-CH1フラグメントとそれに対応する同族抗体軽鎖のペアにおいて(つまり、抗体結合アーム内(つまり、Fabフラグメント内))、ドメイン配列は少なくとも1つの重鎖ドメインが対応する軽鎖ドメインで置換されている(およびその逆)という点で天然の配列とは異なるということを意味する。ドメインクロスオーバーには3つの一般的なタイプがある。(i)CH1とCLドメインのクロスオーバー。これにより、VL-CH1ドメイン配列を持つドメインクロスオーバー軽鎖とVH-CLドメイン配列を持つドメインクロスオーバー重鎖フラグメント(またはVH-CLヒンジ-CH2-CH3ドメイン配列を持つ完全長抗体重鎖)が生じる;(ii)VHおよびVLドメインのドメインクロスオーバー。これにより、VH-CLドメイン配列を持つドメインクロスオーバー軽鎖およびVL-CH1ドメイン配列を持つドメインクロスオーバー重鎖フラグメントが生じる;および(iii)完全な軽鎖(VL-CL)と完全なVH-CH1重鎖フラグメントのドメインクロスオーバー(「Fabクロスオーバー」)。これにより、VH-CH1ドメイン配列を持つドメインクロスオーバー軽鎖とVL-CLドメイン配列を持つドメインクロスオーバー重鎖フラグメントが生じる(前述のすべてのドメイン配列は、N末端からC末端の方向に示されている)。
本明細書で使用される場合、対応する重鎖および軽鎖ドメインに関して「互いに置換された」という用語は、前述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、CH1とCLドメインが「互いに置き換えられる」場合、項目(i)で説明したドメインクロスオーバーと、結果として生じる重鎖および軽鎖ドメインシーケンスが参照される。したがって、VHとVLが「相互に置き換えられる」場合、項目(ii)で説明したドメインクロスオーバーが参照される。また、CH1ドメインとCLドメインが「相互に置き換えられ」、VH1ドメインとVLドメインが「相互に置き換えられた」場合、項目(iii)で説明したドメインクロスオーバーが参照される。たとえば、WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254およびSchaefer,W.,ら,Proc.Natl.Acad.Sci USA 108(2011)11187-11192では、ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体が報告されている。
本明細書で報告される方法で産生される多重特異性抗体はまた、上記項目(i)で述べたCH1およびCLドメインのドメインクロスオーバー、または上記項目(ii)で述べたVHおよびVLドメインのドメインクロスオーバーを含むFabフラグメントを含み得る。同じ抗原に特異的に結合するFabフラグメントは、同じドメイン配列になるように構築される。したがって、ドメインクロスオーバーを伴う複数のFabフラグメントが多重特異性抗体に含まれる場合、前記Fabフラグメントは同じ抗原に特異的に結合する。
本明細書で使用される「結合部位」という用語は、第2ポリペプチドに特異的に結合することができるか、または特異的に結合することができるポリペプチドを意味する。一実施形態では、結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメイン、抗体重鎖および抗体軽鎖可変ドメインの対、その受容体または機能的フラグメント、そのリガンドまたは機能的フラグメント、酵素またはその基質から選択される。
遺伝子輸送
受容体を介したエンドサイトーシスプロセスにより、受容体が原形質膜から細胞内に移動する。このプロセスは、細胞表面受容体がリガンド誘導性の活性化に続いてモノユビキチン化されるときに始まる。その後、受容体はエンドサイトーシス小胞に取り込まれ、そこから分解のためにリソソームまたは液胞を標的とするか、原形質膜に再循環される。
本発明に記載されるような非ウイルス遺伝子導入は、より低いレベルの毒性をもたらすことを目的とした効率的な遺伝子送達の代替方法を提供する。非ウイルス遺伝子治療の目標は、遺伝子送達に関連する毒性を最小限に抑えながら、標的遺伝子の効率的な発現をブロックする細胞障壁を克服するための成功したウイルスメカニズムを模倣することである。合成非ウイルスベクターの機能には、細胞表面への特異的結合、侵入、エンドソーム脱出、核への移行、および標的細胞ゲノムへの安定した組み込みが含まれる可能性がある。
非ウイルス遺伝子送達技術の律速段階は、カプセル化されたプラスミドをエンドソームから核に移すことである(Felgner,Sci.Am.276(1997)102-106)。この設定では、プラスミドは細胞によってエンドソームコンパートメントにエンドサイトーシスされる。このコンパートメントの酸性度は、そのヌクレアーゼ活性とともに、プラスミドを急速に分解すると予想される(Felgner,Sci.Am.276(1997)102-106)。クロロキンはエンドソームの酸性pHを上昇させることが知られており、エンドソーム放出を促進するために特定の遺伝子治療プロトコルで使用される(Fritzら.,Hum.Gene Ther.7(1996)1395-1404)。
本発明は、DEAEデキストラン、ポリブレンおよびミネラルリン酸カルシウム、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションを含む、化学的および物理的方法に関連する固有の欠点を克服する非ウイルス性遺伝子導入を提供する。本発明はさらに、リポソーム遺伝子導入よりも有用である。リポソーム遺伝子導入には、免疫原性の欠如、調製の容易さ、大きなDNA分子をパッケージングする能力など、いくつかの利点があるが、毒性凝集体の発生を回避するには、リポソーム/DNAの比率を注意深く制御する必要がある。さらに、リポソームは送達および遺伝子発現の効率が限られており、負に帯電した高分子との潜在的に有害な相互作用を持っている。
タンパク質およびペプチド遺伝子輸送におけるDNAとの複合体形成(すなわち、ポリプレックス形成(Feignerら,Hum.Gene Ther.8(1997)511-512))は、正に帯電したリジンおよびアルギニン残基とDNA骨格の負に帯電したリン酸との間の静電相互作用によって媒介される(Sternbergら,FEBS Lett.356(1994)361-366)。ペプチド遺伝子導入の例は、内在化のために受容体を介したエンドサイトーシスの生理学的細胞プロセスを利用する。
受容体を介した遺伝子送達コンストラクトには、受容体結合リガンドとDNA結合部分(通常はポリ-L-リジン)が含まれる。細胞は、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、免疫グロブリン、インスリン、EGF受容体、インテグリン結合ペプチドなど、さまざまなリガンドを使用して標的化されている。DNA結合要素には、プロタミン、ヒストンH1、H2A、H3およびH4、ポリ-L-リジン、および反復配列を持つカチオン性両親媒性α-ヘリックスオリゴペプチドが含まれる(Niidomeら,J.Biol.Chem.272(1997)15307-15312)。
本発明のタンパク質/ペプチド遺伝子導入の潜在的な利点には、使用の容易さ、生産、および突然変異誘発、純度、均一性、特定の細胞型に核酸を標的指向する能力、費用効果の高い大規模製造、ターゲティングリガンドのモジュール式付着および送達できる核酸のサイズまたはタイプに制限がないことが含まれる。
効率的な遺伝子送達のための重要なステップは、ポリプレックスの形成である。ポリプレックス形成の条件を最適化するために、粒径、タンパク質/ペプチド/DNA電荷比、緩衝培地などを含むタンパク質/ペプチドとプラスミド間の相互作用の分析が必要である。(Adamiら,J.Pharm.Sci.87(1998)678-683;Duguidら.,Biophys.J.74(1998)2802-2814;Murphyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)1517-1522;Wadhwaら,Bioconjug.Chem.8(1997)81-88)リン酸カルシウム沈殿、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、脂質システムを含む現在利用可能な遺伝子送達方法とは対照的に、タンパク質/ペプチド遺伝子導入には、その特性を予測および制御でき、外因性核酸の侵入および持続的発現に必要な活性を高めるのに役立つ可能性のある送達用媒体の作製が含まれる。さらに、タンパク質/ペプチドを介したDNA凝縮は、多くのカチオン性リポソームとは異なり、製剤中にポリプレックスを安定化し、血清中でその構造を維持する(Adamiら,J.Pharm.Sci.87(1998)678-683;Wilkeら,Gene Ther.3(1996)1133-1142)。活性ペプチドモチーフが同定されると、それらを組み合わせて、ウイルスキャプシドの機能に類似した機能を備えた多機能複合体を得ることができる。
オリゴヌクレオチドよりもサイズが大きいDNAは、エンドサイトーシスが容易ではないため、細胞に効率的に入ることができる媒体にパッケージする必要がある(Bongartzら,Nucleic Acids Res.22(1994)4681-4688;Felgner,Sci.Am.276(1997)102-106)。細胞のDNA取り込みに対する主な障害は電荷である(Felgner,Sci.Am.276(1997)102-106)。水溶液では、DNAは正味の負電荷を持っている。DNAも細胞膜が負に帯電しているため、細胞膜からはじかれる傾向がある。細胞がネイキッドDNAを吸収できるように見えるいくつかの例外がある。これには、マウスへの直接筋肉注射後の標的タンパク質発現の成功が含まれる(Blau and Springer,N.Engl.J.Med.333(1995)1554-1556;Cohen,Science,259(1993)1691-1692;Felgner,Sci.Am.276(1997)102-106;Wolffら.,Science 247(1990)1465-1468)。担体を使用しない限り、ほとんどの細胞はトランスフェクションに対して非常に耐性がある。
組成物および方法
本明細書では、細胞へのおよび細胞への非常に効率的かつ特異的な標的遺伝子送達のための新規システムが報告されている。プラスミドDNAとコアヒストンは、塩勾配透析によってクロマチンにアセンブルされている。このような「プラスミドクロマチン」の抗体媒介ターゲティングを可能にするために、二重特異性抗体誘導体とクロマチンが(例えば、核酸結合ペプチドブリッジを介して)結合される。このような組成/複合体を使用すると、クロマチンで組み立てられたプラスミドDNAを高効率で細胞にターゲティングできる。
通常の培養条件下でnM濃度の細胞に抗体標的プラスミドクロマチンを適用すると、90%を超える細胞で細胞内送達および核(発現)機能が可能になることがわかっている。ターゲティングおよび導入遺伝子の機能は、絶対的な特異性で観察され、異なる細胞株および異なる抗体標的に対して検出可能な細胞毒性はなかった。標的導入遺伝子送達および細胞内機能の例には、レポーターコンストラクトおよびCRISPR/Cas9遺伝子編集をコードする導入遺伝子が含まれ、この標的遺伝子送達アプローチの幅広い適用性を示している。
ハプテン結合bsAbを適用する大核酸の標的指向送達のための媒体の生成および組成
図1は、適用される実体の例示的かつ非限定的な概要、プロセスステップ、プラスミドなどの大核酸の特異的標的化および効率的細胞内送達を可能にする、本発明による送達実体を生成するための異なるオプションを示した。
本明細書で報告される標的指向送達実体および方法は、発現プラスミドみたいな大核酸の送達に特に適しているので、以下の例示的な説明は、発現プラスミドを使用して行われる。これは、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。それは単に本発明を例示するために行われる。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
目的配列、遺伝子、または発現カセットをコードするプラスミドDNAをヒストンと組み合わせてヌクレオソームを形成し、「プラスミドクロマチン」を生成した。
その後、図1の左側のパネル「A」に示すように、活性化ハプテン試薬(NHS-ハプテンまたはマレイミド-ハプテンまたは他のハプテン誘導体など)をヌクレオソームに化学結合させることにより、ハプテンを結合させた。ハプテンをヌクレオソーム-プラスミド複合体に結合させる別の方法を、図1の右側のパネル「B」に示している。ここでは、DNA結合機能を持つハプテニル化ヒトペプチドをヌクレオソーム組み立てられたプラスミドに添加して、ハプテニル化プラスミド-ヌクレオソーム-ペプチド複合体を形成した。
最後に、使用したハプテンと細胞表面抗原を認識する二重特異性抗体を、ハプテン化プラスミドクロマチン(図1のAまたはBでハプテン化)に添加した。これらの二重特異性抗体は、ハプテン結合部分によってハプテン化プラスミドヌクレオソームに結合する。得られた二重特異性抗体-プラスミド-クロマチン複合体は、標的細胞の表面上の標的に対する結合特異性を有するbsAbの第2特異性の遊離結合実体を含む。
ヒストンは、DNA二本鎖をヒストン八量体に巻き付けることにより、DNAを高度に圧縮することができる。ヒストンはまた、細胞の取り込みを促進する配列/ドメインを含み得る(Wagstaff,K.M.,ら.Mol.Ther.15(2007)721-731;Rosenbluh,J.ら.,J.Mol.Biol.345(2005)387-400;Rosenbluh,J.,ら.,Biochim.Biophys.Acta 1664(2004)230-240;Wagstaff,K.M.ら,Faseb J.22(2008)2232-2242)。ヒストン-DNA複合体、すなわちヌクレオソームまたはクロマチンも、負に帯電した核酸と比較して、全体的な電荷が大幅に減少している。したがって、プラスミドDNAをヌクレオソーム/プラスミドクロマチンに「パッケージ化」して、サイズの圧縮と負電荷の減少が細胞内プラスミド送達を促進できるかどうかを評価し、優先的に細胞または組織特異的送達と組み合わせた。
DNA上のヒストンの組み立ては、さまざまな規模でのin vitro塩勾配透析によって効率的に達成できる。
ヒストン八量体は、定義された方法でDNA上に組み立てる(約147塩基対が1つの八量体に巻き付く)。ヌクレオソーム/プラスミドクロマチンの形成に成功したら、ヒストン単独(正電荷)またはプラスミドDNA(負電荷)と比較して、クロマチンの全体的な電荷が減少している。ヌクレオソーム結合DNAもヌクレアーゼから保護されているため、プラスミドDNAのヌクレアーゼ耐性は、プラスミドクロマチンの形成の成功を評価するための別のパラメーターとして機能する。
コアヒストンは、塩勾配透析によってDNA上に効率的に組み立てることができることがわかっている。この方法は、プラスミドクロマチンを生成するためのスーパーコイルプラスミドDNAにも適用できる。この方法は、eGFP発現プラスミドでプラスミドクロマチンを生成するために適用される。ヒストン八量体は高度に定義された方法でDNA上に組み立てるため(正確に147塩基対が1つの八量体に巻き付く)、ヌクレアーゼ消化とそれに続くアガロースゲル電気泳動によってクロマチンの品質を分析できる。効率的に組み立てられたクロマチンのヌクレアーゼ消化は、短い消化時間で147塩基対の倍数のDNAフラグメントを生成し、複数のヒストンが1つのプラスミド上に近接して組み立てられたことを示す。さらに、147bpより短いDNAフラグメントは、遅い時点で最大でわずかに見えるように、ごくわずかな部分でのみ発生する。
アセンブルされたプラスミドクロマチンの電荷およびヌクレアーゼ耐性の実験的評価を図2B(EMSA)および図2A(ヌクレアーゼ耐性アッセイ)に示す。
これらの分析の結果は、プラスミドクロマチンの生成の成功を明らかにした:EMSAアッセイ(図2B)は、わずかな保持、つまりプラスミドDNAのみと比較して組み立てられたクロマチンの電荷減少を明らかにした。ヌクレアーゼ感受性アッセイ(図2A)は、147塩基対の倍数のDNAフラグメントによって示されるように、プラスミドDNAがヌクレアーゼ耐性になることも示した。これは、複数のヒストンが1つのプラスミド上で近接して組み立てられたことを示している。さらに、147bpより短いDNAフラグメントは、ごく一部でしか発生しなかった(すべての時点でわずかに見える)。
ハプテンへの活用には、次のようなさまざまな同じようにうまく機能するアプローチが可能である。
(A)リジン側鎖結合によるクロマチンのハプテニル化
(B)ヌクレオソーム組み立て前のプラスミドDNAのハプテニル化によるクロマチンのハプテニル化
(C)クロマチン組み立てのためにハプテニル化ヒストンを適用することによるクロマチンのハプテニル化。
例示的なハプテンとしてのビオチンについて、これらの異なるアプローチのそれぞれで得られた結果を図3に示す。図3Aは、化学結合反応後、プラスミド-クロマチンがストレプトアビジンに結合することを示している。これは、ビオチンがプラスミドクロマチンに化学的に付着していることを証明している。図3Bは、ビオチンのプラスミドDNAへの化学的結合が、ストレプトアビジンに結合する能力によって表されるように、ビオチン化プラスミドクロマチンももたらすことを示している。図3Cは、クロマチンアセンブリ反応でビオチン化ヒストンを使用して複合体を形成し、ビオチン化プラスミド-クロマチンを生成することを示している。
Haasら(例えばWO2011/157715)の以前の研究では、分泌されたヒトタンパク質に由来する、核酸に結合する正に帯電したヒトペプチドが特定された(すなわち、ヒトにおける低い免疫原性が提案されている)(Haas,A.K.ら,Biochem.J.442(2012)583-593)。それらの正に帯電した両親媒性ペプチドのいくつかは、生体膜を通過する能力を示した。つまり、ヒト細胞透過性ペプチド(huCPP)と見なすことができる。他のペプチドには、同量の正電荷が含まれ、DNAが結合しているが、CPP機能はない。
ハプテンをプラスミドDNAに結合するのに適したペプチドを特定するために、Haasらによって記述されたペプチドのサブセットのプラスミド結合機能ならびにそのいくつかの変異誘導体が分析された。これらには、ハプテニル化(ジゴキシゲニル化)NRTN、ASM3BおよびCPXM2(有効なCPP機能)、WNT(CPP機能なし/低下)、FALL(CPP機能なし/低下)、および参照としてのTATペプチド(CPP)、p53に由来するDNA結合ペプチド、およびリジンまたはアルギニンの代わりにヒスチジンを含む変異FALLペプチドが含まれていた。His-Fallと組み合わせたNRTNで構成される融合ペプチドも含まれていた。
ペプチドとプラスミドDNAの相互作用は、EMSAシフトアッセイおよび/またはマイクロスケール熱泳動分析(MST)によって分析された。どちらの技術も、DNAに結合するペプチドと結合しないペプチドを区別する。これらの実験の結果(図4A(EMSA)、図4B(MST)、下表)は、いくつかのヒトペプチドがプラスミドDNAに結合するため、ハプテンをプラスミドDNAに結合するために使用できることを示している。これらには、ヒトP53、NRTN、FALL、CPXM2、WNT、ASM3Bおよびそれらの誘導体に由来するペプチドが含まれる。
また、ハプテニル化DNA結合ペプチドをプラスミドクロマチンに結合させることもできる。これにより、ペプチドに結合したハプテンがプラスミドヌクレオソームに組み込まれる。
このアプローチを示すために使用された1つの例示的なペプチドは、ヒト細胞透過性ペプチドCPXM2であった。このペプチドは、負に帯電したDNAバックボーンとの電荷相互作用を介してプラスミドクロマチンを捕捉する。ハプテン(この場合はビオチン)のプラスミドクロマチンへの取り込みの成功は、上記で実証された。図5は、ビオチン化ペプチドがプラスミドクロマチンに結合し、ストレプトアビジンへの結合を可能にするバイオレイヤー干渉法(Octet)分析を示している。図5は、bio-CPXM2ペプチドの付着によるプラスミドクロマチンのビオチン化を示している。
ヒトタンパク質由来およびHaasらによって同定された核酸結合ペプチドCPXM2は、負に帯電したDNAバックボーンとの電荷相互作用を介してプラスミドDNAまたはクロマチンを捕捉するための例示的な分子として使用することができる(Haas,A.K.,ら,Biochem.J.442(2012)583-593)。CPXM2ペプチドの抗体への結合を可能にするために、CPXM2ペプチドのハプテン化(例えばビオチン化)変異体およびハプテン(つまり、この例ではビオチン)結合二重特異性抗体を使用した。クロマチンに対する抗体-ペプチドコンストラクトの親和性は、マイクロスケール熱泳動(MST)によって測定された。この方法では、アビディティ効果によりこのシステムの親和性に影響を与えるため、抗体やペプチドを捕捉する必要なしに、溶液中で親和性データが生成された。最も適切な抗体フォーマットを特定するために、一価ビオチン結合triFabを、分子の架橋による親和性および潜在的な凝集に向けて、二価ビオチン結合二重特異性抗体と比較をした(Mayer,K.,ら.,Int.J.Mol.Sci.16(2015)27497-27507;Schneider,B.,ら.,Mol.Ther.Nucleic Acids1(2012)e46)。一価抗ビオチンtriFab~ビオチンCPXM2コンストラクトのクロマチンへの親和性は、3桁のナノモル範囲(300nM)だった。二価抗ビオチン二重特異性抗体~ビオチンCPXM2構築物は、2つのCPXM2ペプチドが1つの抗体によって結合される可能性があるため、おそらくアビディティ効果のために、この理論に結合されることなくさらなる安定化(2桁のnMアフィニティまで)を示した。両方の抗体-ペプチド構築物で凝集は観察されず、両方の抗体フォーマットで架橋が起こらないことを示している。特異性は、ペプチドを含まないそれぞれの対照によって証明された。MSTデータセットは次の表にまとめられている。
クロマチン、ペプチド、抗体間の相互作用は、オクテットシステムによって検証された。ペプチドが二価の二重特異性抗体フォーマットに結合したときに最も強い相互作用が観察されたため、このシステムはさらなる研究に使用された。抗体ペプチドコンストラクトは負に帯電したDNAバックボーンと相互作用するため、この相互作用が抗体-ペプチド組み立て後のプラスミドクロマチンのヌクレアーゼ耐性を変化させるかどうかが確認されていた。クロマチンを抗体およびペプチドとインキュベートし、続いてヌクレアーゼ消化した後、270秒後の消化されたDNAのパターンは、20秒後のヌクレアーゼ処理クロマチンのみのパターンと同様だった。このデータは、標的クロマチン複合体の形成により、プラスミドDNAがヌクレアーゼからさらに保護されることを明確に示している。
細胞表面抗原およびハプテンに結合するBsAbは、ハプテン化されたペイロードを捕捉し、抗体-ペイロード複合体を形成することが以前に記載されている(例えば、WO2011/003780;Schneider,B.ら,Mol.Ther.Nucleic Acids 1(2012)e46;Dengl,S.,ら.,Immunol.Rev.270(2016)165-177を参照のこと)。
上記の単純で堅牢な帯電反応を使用して、ビオチン化プラスミドクロマチンを、ビオチンおよびLeYやCD33などの癌細胞の表面に存在する抗原に結合するbsAbに結合した。これには、ビオチン化プラスミド-クロマチンとbsAbを4対25の比率で25℃で30分間インキュベートすることが含まれていた。癌細胞に存在する抗原に加えて、細胞の特定の亜集団に特異的な他の抗原を使用することができる。特に好ましいのは、細胞表面受容体の内在化である。
図6に示すように、bsAbとハプテニル化プラスミドクロマチンのアセンブリ反応をSPR分析(ForteBio Octet)でモニターした。したがって、抗Ley/ビオチン二重特異性抗体(bio-bsAb(LeY-Bio))がプロテインAディップで捕捉され、続いて、追加されたビオチン化プラスミドクロマチンのビオチン結合bsAbへの結合が評価された。
図6Aは、クロマチンの化学結合リジン側鎖によってビオチン化されたプラスミドクロマチンへのbsAbの結合の複雑な形成を示している。
図6Bは、クロマチンアセンブリの前にプラスミドDNAの化学的コンジュゲーションによってビオチン化されたプラスミドクロマチンへのbsAbの結合の複雑な形成を示している。
図6Cは、ビオチン化DNA結合ペプチドをプラスミドクロマチンに添加することによって得られたビオチン化プラスミドクロマチンへの結合の複雑な形成を示している。
図6Dは、ジゴキシゲニル化DNA結合ペプチドをプラスミドクロマチンに添加することによって得られた、ジゴキシゲニル化プラスミドクロマチンへの結合の複雑な形成を示している。この例では、anti-Dig-bsAb(LeY-Dig)がプロテインAディップでキャプチャされた。
bsAb-DNA複合体およびbsAb-クロマチン複合体の抗体を介したターゲティングは、それぞれのbsAbによって認識される標的抗原を運ぶ細胞で実証された。したがって、LeY抗原とジゴキシゲニンに同時に結合するbsAb、またはLeY抗原とビオチンに結合するbsAbを、LeYを発現するMCF7乳癌細胞と組み合わせて使用した。
したがって、抗体-クロマチン複合体の特異的形成および延長されたヌクレアーゼ耐性に加えて、関連する抗体を介した細胞表面へのDNA送達が決定された。送達の有効性および特異性を決定するために、ビオチンに対する特異性に加えてLewis YまたはCD33に対する特異性を有する抗体をMCF7細胞(LeY+++/CD33-)で比較した。さらに、Cy5フルオロフォアで標識されたプラスミドDNAを使用して、細胞処理の1時間後にフローサイトメトリーによる細胞上のプラスミドDNAの定量化を可能にした。クロマチンアセンブリが送達の特異性と有効性に及ぼす影響を詳しく説明するために、プラスミドDNAの送達システムをクロマチンアセンブリの前後に適用した。図14は、抗LeY(赤の点線、右のピーク)および抗CD33(青の点線、左のピーク)抗体と複合体を形成するクロマチンアセンブリの前にプラスミドDNAで処理した後のMCF7細胞のCy5シグナルを示している。抗LeY-DNA-Cy5複合体で処理した後、明確な蛍光シグナルが検出され、DNA送達が非常に効率的であることを示している。対照的に、抗CD33-DNA-Cy5複合体は、Cy5陽性細胞をもたらさず、DNA送達が特異的であり、抗体を介したもののみを標的としていることを証明した。クロマチンアセンブリ後、抗LeY-クロマチン-Cy5複合体(図15、赤色、右ピーク)での処理後に同じ明確な蛍光シグナルが観察され、抗CD33-クロマチン-Cy5複合体(図15、青色の実線、右のピーク)ではCy5シグナルが検出されなかったため、プラスミドDNA送達の有効性と特異性は影響を受けなかった。送達システムに抗体が存在することを確認するために、Cy5標識クロマチンとともにCy3フルオロフォアで標識された抗CD33および抗LeY抗体を使用した。図16に示すように、抗CD33-Cy3-クロマチン-Cy5複合体で処理されたMCF7細胞は、Cy5およびCy3シグナルの上昇を示さず(青い輪郭、左下の象限)、抗体もクロマチンも細胞表面に存在しないことを示した。対照的に、抗LeY-Cy3-クロマチン-Cy5処理は、Cy3とCy5の異なる蛍光シグナルをもたらし(図16、赤い輪郭、右下と右上の象限にまたがる)、細胞表面で抗体を証明し、クロマチンの送達が成功したことを確認した。最後に、ビオチンに対するターゲティング抗体の2番目の特異性をチェックした。したがって、ビオチン化CPXM2ペプチドを含む標的クロマチン送達システムを、ビオチン化ペプチドが間違ったハプテン(ジゴキシゲニン)を有するペプチドに対して交換された標的システムと比較した。図16は、両方の複合体(ビオチン-CPXM2を含む左下の象限の青い輪郭とジゴキシゲニン-CPXM2を含む右下の象限の緑の輪郭)がMCF7細胞で明確なCy3蛍光シグナルを生成するのに対し、Cy5シグナルは 複合体を含むビオチン-CPXM2強調した。これは、細胞表面の特異性にもかかわらず、ハプテンに対する2番目の特異性もクロマチン、したがってプラスミドDNAの送達に必要であることを明確に示している。抗体とペプチド/クロマチンの間に非特異的な相互作用がないことに注意すべきである。
プラスミドの標的指向送達(ヌクレオソーム/クロマチンアセンブリなし)を分析するために、Cy5で標識されたGFPコードプラスミドをジゴキシゲニン標識ペプチド(CPXM2)とともにPBSで1時間インキュベートした後、二重特異性抗LeY/ジゴキシゲニン抗体と30分間インキュベートした。サンプルは、8ウェルチャンバースライドに播種されたMCF7細胞に、最終濃度4μg/mLのプラスミドDNA、250nMのペプチドおよび125nMの抗体を添加した。その後、細胞を共焦点顕微鏡で1時間、4時間、24時間、48時間後に画像化をした。
これらの分析の結果を図7に示す。DNAの内在化によって示されるように、プラスミドDNAがMCF7細胞に効率的に送達されたことがわかる。初期の時点では、抗体とDNAは主に細胞表面に存在する。後の時点で、DNAは小胞コンパートメントに内在化されていることが分かった。
ハプテニル化プラスミドクロマチンのbsAbを標的とした送達を分析するために、LeY-Dig bsAbの複合体と、上記のようにペプチド付着を介して生成されたdig-クロマチンに組み立てられたCy5標識プラスミドをコードするGFPをMCF7細胞に添加した。これらの細胞は、以下を含む複合体の最終濃度で8ウェルチャンバースライドに播種した:4μg/mLプラスミドDNA、250nMペプチドおよび125nM抗体を組み込んだプラスミドクロマチン。その後、細胞を共焦点顕微鏡で1時間、4時間、24時間、48時間後に画像化し、Cy5シグナルを介してプラスミドクロマチンを検出した。
これらの分析結果は、細胞上のプラスミドクロマチンのCy5シグナルによって示されるように、プラスミドDNAがMCF7細胞に効率的に送達されたことを示している。初期の時点では、抗体とプラスミドクロマチンは主に細胞表面に存在する。後の時点で、プラスミドクロマチンが小胞コンパートメントに内在化されていることがわかり、GFPレポーター遺伝子の発現が検出され、プラスミドDNAが核にも存在することが示された(図7、48時間)。
対照として、抗CD33/ジゴキシゲニンbsAbも付着させ、CD33陰性MCF7細胞に添加した。この組み合わせでは、すなわち、それぞれの細胞表面受容体なしでは、プラスミド/クロマチンは細胞に送達されなかった。これは、標的指向送達が細胞表面抗原へのbsAbの特異的結合によることを証明している。
二重特異性抗体-DNA複合体の抗体を介したターゲティングにより、細胞への取り込みが可能になる。続いて、送達されたプラスミドの細胞内存在は、一過性の発現(実施例に示されるように)、または統合時に安定した発現および/または機能性を可能にする。
これは、LeYを発現するMCF7乳がん細胞を、LeY抗原とジゴキシゲニンに同時に結合するbsAbに曝露し、dig-ペプチドの付着によってジゴキシゲニン化されたプラスミド(dig-NRTN)と複合体を形成することによって示されている。特定のターゲティングのコントロールとして、プラスミドを別の実験で、MCF7細胞には存在しないCD33抗原を認識するdig結合bsAbと複合体を形成した。
細胞内の取り込みと機能性は、MCF7細胞内の送達されたプラスミド内の発現カセットにコードされているGFPの発現を検出することによって示されていた。
送達複合体が生成され、MCF7細胞に適用され、続いて処理された細胞の蛍光顕微鏡イメージングが行われた。これらの分析の結果を図8に示す。イメージング蛍光顕微鏡法は、非ターゲティングCD33-bsAb-プラスミド複合体で処理された細胞集団に蛍光が完全に存在しないことを明らかにした。対照的に、GFPを発現した細胞は、LeY-bsAb-プラスミド複合体を標的とする細胞表面を受け取ったLeY+++/CD33-MCF7細胞で検出可能であった。細胞表面抗原に対して、LeYは明確に単一のGFP発現細胞(母集団の約2%、左パネル)を示したが、CD33に対する抗体を含む複合体で処理された細胞(右パネル)はバックグラウンドを超えるGFP発現を示さなかった。したがって、bsAbを標的とした特定の送達およびハプテニル化ペプチド-DNA複合体の蓄積は、細胞の細胞質/核への生産的な取り込みを可能にし、ある程度GFP発現をもたらす。
二重特異性抗体-プラスミド-クロマチン複合体の抗体媒介ターゲティングは、細胞への取り込みを可能にし、続いて送達されたbsAb-クロマチン複合体の細胞内機能を可能にする。
これは、LeYを発現するMCF7乳がん細胞を、LeY抗原とジゴキシゲニンに同時に結合するbsAbに曝露し、dig-ペプチド(例えば、ジゴキシゲニン化CPXM2、p53など)の付着によってジゴキシゲニン化されたプラスミド-クロマチンアセンブリと複合体を形成することによって実験的に示されている。特定のターゲティングのコントロールとして、プラスミドクロマチンは別の実験でMCF7細胞に存在しないCD33抗原を認識するDig結合bsAbと複合体を形成した。
実験のセットアップと送達用媒体の生成の概要を図9Aに示す。
細胞内の取り込みと機能(コード化されたGFP mRNAの転写と翻訳)は、FACS分析でGFP発現細胞を検出および定量化することによって評価された。
送達複合体は、ハプテン化プラスミド-クロマチン(GFP発現プラスミドを含む)を二重特異性LeY-ハプテン結合bsAbとインキュベートすることによって生成された。2つの異なるbsAb形式が使用された。適用された最初のフォーマットは、Mayerらによって記述されたTriFabフォーマットであった。(Mayer,K.ら,Int.J.Mol.Sci.16(2015)27497-27507)。このbsAbには、2つの細胞表面結合部位と1つのハプテン結合部位がある。第2のフォーマットは、2つの細胞表面結合部位と2つのハプテン結合部位がある四価のIgG誘導体であった(例えば、WO2011/003780;Schneider,B.ら,Mol.Ther.Nucleic Acids 1(2012)e46;Killian,T.ら,Sci.Rep.7(2017)15480を参照のこと)。細胞内送達と機能性を評価するために、bsAb-ハプテン-プラスミド-クロマチン複合体を、12ウェルプレートに播種したMCF7細胞に、最終濃度8μg/mLプラスミド-DNA(ジゴキシゲニル化DNA結合ペプチドの添加によりクロマチンに組み立てられた)、500nMペプチド、250nM抗体になるように添加した。
細胞内活性は、MCF7細胞の処理と、処理の48時間後のフローサイトメトリーによるeGFPプラスミド発現の定量化によって対処された。これらの分析の結果を図9B-Eに示す。
ペプチドと抗体を使用しないクロマチン処理後、GFP発現細胞は検出されなかった。さらに、細胞表面に結合しないトリプルFab(抗CD33)を含むクロマチン複合体での処理も、GFP発現MCF7細胞を生成しなかった。細胞表面結合トリプルFab(抗LeY)によってクロマチンに組み立てられなかったDNAの標的指向送達は、約0.5%の蛍光細胞をもたらした。対照的に、標的クロマチンコンストラクトは、PEIトランスフェクションポジティブコントロールよりも強いGFP送達効果を示た(図9B)。ハプテンに対して1価のトリプルFabの代わりに二価ハプテン結合を持つ二重特異性抗体を使用すると、特異性を低下させることなく送達効率がさらに向上する(0%GFP陽性細胞)(図9C)。クロマチンは、異なる配列のペプチドを介してハプテンをクロマチンに結合させることによって送達することができる。図9Dは、細胞への生産的な送達が、異なるペプチドとしてのペプチドの同一性に厳密に依存していないことを示している。CPXM2およびP53由来のペプチドなどを適用して、標的細胞内送達用のハプテンを付着させることができる。
図9Fに示すように、ハプテンが化学結合を介して結合しているプラスミドクロマチンも、MCF7標的細胞に特異的に送達され、GFP発現をもたらす。
本発明による実体は、異なる供給源のヒストンで構築することができる。これには、組換えヒトヒストン、ならびに例えば、子牛の胸腺またはニワトリの赤血球からのヒストンなどの天然源から単離されたヒストンが含まれる。結果として、本明細書で報告される送達システムが一般に適用可能であり、特定のヒストンの使用に限定されないことを実証するために、本明細書で提供される実施例におけるプラスミド-クロマチンアセンブリに異なる供給源のヒストンが使用された。したがって、標的指向送達実体は、さまざまなソースのヒストンを使用して組み立てられた。結果を図10に示す。
図10Aは、ニワトリ赤血球からのヒストン(他のヒストン源には存在しないヒストンH1も含む)が、GFP発現プラスミドの標的特異的細胞内送達を可能にしたことを示している。
図10Bは、未修飾のヒト組換えヒストンが子牛の胸腺ヒストンに匹敵する送達効率を示したことを示している。ヒト組換えヒストンのビオチン化バージョンを使用して、GFP発現プラスミドの標的特異的細胞内送達を可能にする複合体を組み立てることもできる。組み立てられたクロマチンの品質分析は、ヒストンH3のビオチン化がクロマチンの組み立てに影響を及ぼし、品質の低いプラスミドクロマチンをもたらすことを示した(図10C)。クロマチンの品質と送達効率の相関関係は、適切なヒストンアセンブリが、本明細書で報告されている組成物の機能的な細胞内送達の前提条件であることを示している。
一実施形態では、ヒストンは、組換えヒトヒストンまたは子牛胸腺ヒストンである。一実施形態では、組換えヒトヒストンは修飾されていない、すなわち、化学的に誘導体化されていない。
大核酸の細胞内送達および活性の別の例は、プラスミド上にコードされたCRISPR成分の細胞核への標的指向送達である。したがって、GFP発現カセットは、ヒトDPH1遺伝子に対応するCRISPR/Cas9コンポーネントをコードする発現カセットに置き換えられた。ジフテリア毒素(DT)に対する細胞感受性の評価と組み合わせた、DPH1の遺伝子編集を介した不活性化は、遺伝子編集の有効性を定量化するために使用できることが以前に説明されている(WO2018/060238;Killian,T.ら,Sci.Rep.7(2017)15480)。CRISPRを介した遺伝子編集には、コードする発現プラスミドが細胞に入り、十分なレベルで発現することが不可欠である。(遺伝子編集の結果として)DPH1のすべての細胞コピーを不活性化すると、細胞はDTに耐性を持つ。これにより、非常に堅牢な読み出しが生成され、遺伝子編集後にDT耐性コロニーをカウントすることで定量化できる。
CRISPR/Cas9の細胞内標的指向送達を評価するために、DPH1およびCas9ヌクレアーゼをコードするプラスミドに対するgRNAを使用した。続いて、細胞内送達の効率および編集成分の発現を、細胞をDTに曝露し、その後、Killianらによって以前に記載されたようにDT耐性コロニーを決定することによって評価した(Killian,T.ら,Sci.Rep.7(2017)15480;WO2018/060238)。結果を図11に示す。
図11は、CRISPR/Cas9実体をコードするプラスミドが特異的に標的化され、抗体標的化プラスミドクロマチンとして送達されると効果的な細胞内発現を誘発することを示している。細胞表面に対する抗体の標的となるプラスミドクロマチンは、標的遺伝子が編集/不活性化された高度の細胞につながる(DT耐性細胞のコロニー数が多い)。対照的に、細胞内送達およびCRISPR/Cas9を介した編集は、細胞を標的としないプラスミドクロマチンを投与された細胞では観察されていない。
したがって、本発明による複合体を用いて、細胞送達および特異性、ならびに高い核送達効率(フローサイトメトリーで細胞を発現するGFPレポーター遺伝子によって定量化される)に関して効率的である。
フローサイトメトリーによるGFPレポーター遺伝子発現細胞による定量化により、細胞内プラスミドDNA送達に対するクロマチン集合の影響を直接描写することも可能である。これは、細胞DNA送達のみがクロマチン集合の有無にかかわらず同等に効率的であるためである。レポーター遺伝子発現に対処するために、MCF7細胞をさまざまな複合体で48時間処理し、続いてGFP発現細胞をフローサイトメトリーで同定した。GFP陽性細胞の比率は、それぞれの媒体または抗体のみの対照と比較することによって決定された。DNAまたはクロマチンの存在下でのMCF7細胞のインキュベーションは、検出可能なレベルのGFPを発現する細胞を生成せず、クロマチンアセンブリの前後にプラスミドDNAの非特異的な取り込みがないことを示している。さらに、抗CD33-DNAおよび抗CD33-クロマチン複合体で示されるように、抗体が細胞表面に結合しない場合、抗体-ペプチドコンストラクトの結合もGFP陽性細胞を生成しない(図14~16を参照のこと;抗体-DNAおよび抗体-クロマチンの非特異的な取り込みは検出されなかった)。関連する抗体-ペプチドコンストラクトによるプラスミドDNAのターゲティングは、単一のGFP陽性細胞を生成したが(顕微鏡で観察)、図14に示すように、細胞表面への効率的な送達にもかかわらず、それほどではない。対照的に、現在クロマチンを標的としている同じ抗体-ペプチドコンストラクトは、GFP陽性細胞の比率を単一の例外から広大な主要集団(90%以上の陽性細胞)に引き上げる。最後に、Lipofectionをポジティブコントロールとして使用した結果、約60%のレポーター遺伝子発現細胞が得られた。
次に、異なる処理の細胞毒性を、媒体対照および完全な細胞溶解と比較したLDH放出によって測定した。ほとんどのトランスフェクション試薬で示されているように、リポフェクションはある程度(溶解コントロールに対して約15%)の細胞毒性を媒介していた。他の処理法はどれも検出可能な細胞毒性効果を示さなかった。
したがって、機能的なプラスミドDNA送達に対するクロマチンアセンブリの影響は驚くほど高かった。
異なる複合体で処理した後の抗体とDNAの細胞内分布に続いて、共焦点顕微鏡で評価した。図7は、標的(LeY-)クロマチン、標的(LeY-)DNA、または非標的(CD33-)クロマチンで処理してから4時間後の生細胞における抗体-Cy3(緑)とDNA-Cy5(赤)の分布を示している。クロマチンおよびDNAを標的とした後、抗体およびDNAが細胞表面および小胞系に存在した。両方の蛍光シグナルのオーバーレイは、抗体とDNAのほとんどが共局在しており、分離されていないことを示している。これらのデータは、標的DNAが細胞表面に送達され、クロマチン集合の有無にかかわらず、標的抗体を介して内在化されることを明確に示していた。抗体もDNAも細胞表面と小胞内で検出されなかったため、ターゲティングシステムの特異性は、非ターゲティングクロマチン複合体とのインキュベーション後のMCF7細胞の共焦点顕微鏡によって確認された。さらに、クロマチンターゲティングは、細胞表面および小胞系内での強力なDNA蓄積(シアン)だけでなく、GFP発現(緑)ももたらす。3日後のGFPシグナルのイメージングでは、標識として非標識抗体を使用し、クロマチン送達効率を低下させた。より詳細なイメージングで抗体を視覚化するために、細胞を固定し、抗体を抗ヒトIgG Cy3抗体で対比染色した。小胞系内に抗体(赤)とDNA(疑似色表現)の蓄積が確認された。
クロマチン送達が、より大きなサイズでより複雑な機能を持つプラスミドDNAに適用できるかどうかも取り上げられていた。したがって、ジフタミド合成遺伝子1(DPH1)に対するCRISPR/Cas9ノックアウトシステムをコードするプラスミドは、CRISPR/Cas9を介した遺伝子編集の定量化のために以前に公開されたジフテリア毒素(DT)ベースのアッセイと組み合わせて使用された(Killian,T.ら,Sci.Rep.7(2017)15480)。このアッセイは、Cas9による遺伝子編集が成功した細胞クローンの同定にホモ接合DPH1ノックアウトによって媒介されるDT耐性を利用している。したがって、細胞のみがDPH1をノックアウトし、ホモ接合体で生存し、2週間の連続DT選択後にコロニー形成を示した。まず、DPH1 gRNA Cas9発現プラスミド上のクロマチンアセンブリが転写され、それにより、アセンブリ条件がプラスミドに依存しない高品質のクロマチンを生成するのに適していることが実証された。その後、このクロマチンは、上記で概説したGFP発現プラスミドの場合と同じ方法で、Cas9 DPH1gRNAをコードするプラスミドの送達に使用された。MCF7細胞を非ターゲティング(LeY-)Cas9 DPH1 gRNAクロマチン、非ターゲティング(CD33-)Cas9 DPH1 gRNAクロマチン、および非ターゲティング(LeY-)GFPクロマチンで処理し、3日間インキュベートした後、細胞をDTに2週間曝露した。最後に、細胞を固定し、顕微鏡下でコロニーを数えた。コロニー数と最初に播種された細胞の数の比率は、DT耐性クローンのパーセンテージとして表示され、したがってホモ接合型遺伝子ノックアウトを持つクローンのパーセンテージとして表示される。Cas9 DPH1 gRNAクロマチンの標的指向送達はほぼ4%のDT耐性クローンをもたらすが、GFPコントロールクロマチンの標的指向送達は耐性コロニーをもたらさず、コロニー形成はCRISPR/Cas9編集システムの発現によってのみ発生することが確認された。GFPに対する上記のクロマチンターゲティングシステムの特異性と一致して、非ターゲティング(CD33-)Cas9 DPH1 gRNAクロマチンによるMCF7処理も、DT耐性コロニーの形成をもたらさなかった。以前の実験で決定された絶対CRISPR/Cas9ノックアウト頻度と比較すると、DT耐性クローンの決定されたパーセンテージはCas9発現細胞の60%以上に等しい。
考察
標的遺伝子送達システムの開発は、いくつかのハードルを克服する必要があり、したがってバランスの取れた特性が必要であるため、複数の課題に直面している(Ibraheem,D.ら,Int.J.Pharm.459(2014)70-83;Mann,A.,ら,Mol.Pharm.11(2014)683-696)。たとえば、DNA送達システムは、DNAの取り込みを効率的に仲介して、DNAの損失を最小限に抑え、送達経路に沿ったオフターゲット効果を回避するために、標的細胞に親和性を持たなければならない(ただし、並行して、血清成分や他の細胞や組織の細胞膜と相互作用してはならない)(Moffatt,S.ら,Gene Ther.13(2006)761-772;Schatzlein,A.G.,J.Biomed.Biotechnol.(2003)149-158;Varkouhi,A.Kら.,J.Cont.Rel.151(2011)220-228)。さらに、DNAは細胞質ゾルに入り、最終的に核に到達して導入遺伝子の発現を可能にするために膜バリアを越えて転座する必要がある(Cervia,L.D.ら,PLoS One 12(2017)e0171699;Sanders,N.ら.,Adv.Drug Deliv.Rev.61(2009)115-127)。したがって、DNA転座に必要な膜相互作用は効率的であると同時に、細胞毒性を回避するのに十分穏やかでなければならない。
これらの要件は、本発明による組成物によって満たされる。柔軟性が高く、モジュール式の遺伝子送達システムが提供される。プラスミドDNAの取り込みは、標的細胞表面での抗体-抗原相互作用によってのみ媒介されることを示すことができる。これは、標的細胞を優先する他の送達システムとは対照的に、本発明による組成物は、血清成分の存在下で活性を有する絶対特異性を有するシステムを提供することを意味する(cf.Wolff,J.A.and Rozema,D.B.,Mol.Ther.16(2008)8-15;McCaskill,J.,ら,Mol.Ther.Nucleic Acids 2(2013)e96;Novo,L.,ら,Exp.Opin.Drug Deliv.12(2015)507-512)。
本発明による組成物は、細胞毒性なしに、処理された細胞の90%以上において核プラスミドDNA送達を媒介する。したがって、最適化されたウイルス送達システムに匹敵する効率的でさらに穏やかなDNA膜移行のメカニズムが提供される(cf.Munch,R.C.ら,Mol.Ther.21(2013)109-118;Veldwijk,M.R.ら,Cancer Gene Ther.7(2000)597-604)。
さらに、本発明による組成物で生成されたデータは、DNA膜移行を促進する必須成分がプラスミドDNAのプラスミドクロマチンへの組織化であることを明確に示している。クロマチンアセンブリの有無にかかわらず、プラスミドDNAを同等の効率と特異性で標的細胞に送達することは可能だが、正しく組み立てられた(したがって機能的な)プラスミドクロマチンのみが高い比率の導入遺伝子発現細胞を媒介する。したがって、以前の観察とは対照的に、ヒストンアセンブリは非特異的な膜結合によるDNAの取り込みに影響を与えないが、プラスミドクロマチンはヒストンサブユニットの操作を必要とせずに膜の転座と核DNAの輸送を促進する。(cf.Wagstaff,K.M.,ら,Mol.Ther.15(2007)721-731 and FASEB J.22(2008)2232-2242).さらに、抗体を介したDNAまたはクロマチン細胞表面の結合に大きな違いは観察されなかった。
注目すべきことに、非毒性、柔軟性、非常に強力かつ特異的であるにもかかわらず、本発明による遺伝子送達システム、すなわち組成物は、哺乳動物起源のタンパク質およびペプチドのみからなる。したがって、細菌またはウイルス由来の化合物の安全性および免疫原性のリスクに関する懸念はかなり低いと予想される。
結論として、本明細書では、ウイルスベースのシステムのような効率と絶対的な特異性を備えたプラスミドDNAを、毒性のない哺乳類の実体によってのみ送達する新しいシステムが報告されている。さらに、本発明による組成物は、レポーター遺伝子発現から処理に関連するシステム(例えば、CRISPR/Cas9)への標的DNA送達を拡大することを可能にした。
上記およびブローで提示された実験の結果は、プラスミドクロマチンのbsAbを標的とする送達が大核酸の非常に効果的な細胞内送達を可能にすることを示している。この送達システムは、最大80%を超える効率(GFP発現細胞)を可能にしている。つまり、ウイルストランスフェクションと同等の効果であり、ほとんどのナノ粒子/トランスフェクションアプローチよりも優れている。
比較例
細胞内標的指向送達効率に対する適切なプラスミド-クロマチンアセンブリの影響が調べられた。
不規則的または非特異的なヒストン結合を伴う不適切なクロマチンアセンブリが機能に影響を与えるかどうかという質問に対処するために、修飾ヒストンがアセンブリに使用され、それによって修飾がクロマチン形成に影響を及ぼす。本発明による組成物について上に概説したのと同じ条件下で集合反応を実施すると、修飾ヒストンを有するサンプルは、修飾されていないヒストンを有するサンプルと比較してプラスミドクロマチンの品質が低下する(図12を参照のこと)。標的指向送達における両方のクロマチン品質の比較は、品質が低下したクロマチンは高品質クロマチンの半分の効力しかないため、適切な組み立てが送達効率にとって重要であることを明確に示している(図13を参照のこと)。
具体的な実施形態
1.真核細胞の核への大核酸の標的指向送達のための組成物、以下を含む:
-ヒストン(1つまたは複数のヒストンポリペプチド)、
-大核酸、
-ハプテン、および
-ハプテンへの第1結合特異性および真核細胞(ハプテンに特異的に結合する第1結合部位と真核細胞に存在する(細胞表面)標的に特異的に結合する第2結合部位を有する二重特異性結合分子)に存在する細胞表面標的への第2結合特異性を有する二重特異性結合分子、
ここでは、
-ヒストンおよび/または核酸は/ハプテンに共有結合/結合している、
-ヒストンと大核酸は(非共有結合で)互いに結合している/非共有結合の複合体を形成している/ヌクレオソームを形成している、および
-ハプテンと二重特異性結合分子は、二重特異性結合分子の最初の結合特異性によって互いに関連している/互いに結合している。
2.実施形態1に記載の組成物、ここで、組成物は、大核酸を1つまたは複数のヌクレオソームに組み立てるために十分な数のヒストンポリペプチドを含む。
3.実施形態1から2のいずれか1つに記載の組成物、ここで、150bpの大核酸DNA/プラスミドDNAあたり最大/およそ/約1ヌクレオソームを含む。
4.実施形態1から2のいずれか1つに記載の組成物、ここで、最大150bpの大核酸あたり約8ヒストンポリペプチド/最大150bpの大核酸あたり1ヌクレオソームを含む。
5.実施形態1から4のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ヒストンは(1つまたは複数のヒストンポリペプチドは)ヒストンH2A、H2B、H3およびH4(ポリペプチド)の混合物である。
6.実施形態1から5のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ヒストンポリペプチドは、子牛胸腺ヒストン、ニワトリ赤血球ヒストン、組換えヒトヒストン、またはそれらの混合物である。
7.実施形態1から6のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ヒストンは(1つまたは複数のヒストンポリペプチドは)組換えヒトヒストン(ポリペプチド)である。
8.実施形態7に記載の組成物、ここで、組換えヒトヒストンポリペプチドは、化学的に誘導体化されておらず、ハプテンに結合されていない。
9.実施形態1から6のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ヒストンは(1つまたは複数のヒストンポリペプチドは)子牛の胸腺ヒストン(ポリペプチド)である。
10.実施形態1から9のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ヒストンは(1つまたは複数のヒストンポリペプチドは)ヒストンH2AとヒストンH3(ポリペプチド)の混合物である。
11.実施形態1から10のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ヒストン(ポリペプチド)は組換えヒトヒストンH3である。
12.実施形態11に記載の組成物、ここで、組換えヒトヒストン(ポリペプチド)は組換えヒトヒストン3.1または3.3である。
13.実施形態1から12のいずれか1つに記載の組成物、ここで、
i)ヒトヒストンH2Aは配列番号01のアミノ酸配列を持っている、
ii)ウシヒストンH2Aは配列番号02のアミノ酸配列を持っている、
iii)ニワトリヒストンH2Aは配列番号03のアミノ酸配列を持っている、
iv)ヒトヒストンH2Bは配列番号04のアミノ酸配列を持っている、
v)ウシヒストンH2Bは配列番号05のアミノ酸配列を持っている、
vi)ニワトリヒストンH2Bは配列番号06のアミノ酸配列を持っている、
vii)ヒトヒストンH3.1は配列番号07のアミノ酸配列を持っている、
viii)ヒトヒストンH3.3は配列番号08のアミノ酸配列を持っている、
ix)ウシヒストンH3.3は配列番号09のアミノ酸配列を持っている、
x)ニワトリヒストンH3.3は配列番号10のアミノ酸配列を持っている、
xi)ヒトヒストンH4は配列番号11のアミノ酸配列を持っている、
xii)ウシトリヒストンH4は配列番号12のアミノ酸配列を持っている、
xiii)ニワトリヒストンH4は配列番号13のアミノ酸配列を持っている。
14.実施形態1から13のいずれか1つに記載の組成物、ここで、大核酸は1つの大核酸分子である。
15.実施形態1から14のいずれか1つに記載の組成物、ここで、大核酸は、少なくとも1つの発現カセットを含む発現プラスミドから選択される。
16.実施形態1から15のいずれか1つに記載の組成物、ここで、大核酸は、1,000から100,000のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
17.実施形態16に記載の組成物、ここで、大核酸は、1,250~20,000ヌクレオチドまたは塩基対を含む。
18.実施形態16から17のいずれか1つに記載の組成物、ここで、大核酸は、1,500~10,000ヌクレオチドまたは塩基対を含む。
19.実施形態1から18のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ヒストンは子牛の胸腺ヒストンであり、組成物は大核酸1μgあたり約2μgのヒストンで構成されている。
20.実施形態1から18のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ヒストンは組換えヒトヒストンであり、組成物は1μgの大核酸あたり約0.8~1μgのヒストンを含む。
21.実施形態1から18のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ヒストンはニワトリ赤血球ヒストンであり、組成物は大核酸1μgあたり約1μgのヒストンで構成されている。
22.実施形態1から21のいずれか1つに記載の組成物、ここで、組成物は少なくとも1つのハプテン分子を含む。
23.実施形態1から22のいずれか1つに記載の組成物、ここで、組成物は2つまたは複数のハプテン分子を含み、2つまたは複数のハプテン分子は同じハプテン分子または異なるハプテン分子である。
24.実施形態1から23のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン、テオフィリン、ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、DOTAM、およびヘリカーモチーフポリペプチドから選択される。
25.実施形態1から24のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ハプテンは(1つまたは複数の)ヒストン(ポリペプチド)または大核酸に化学的に結合する。
26.実施形態1から24のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ハプテンは、大核酸に結合しているDNA結合ペプチドに結合する。
27.実施形態1から26のいずれか1つに記載の組成物、ここで、各ヒストンポリペプチドは単一のハプテン分子に結合している、および/または大核酸分子は少なくとも1つのハプテン分子に結合している。
28.実施形態1から27のいずれか1つに記載の組成物、ここで、二重特異性結合分子は、二重特異性抗体、二重特異性足場、二重特異性ペプチド、二重特異性アプタマー、二重特異性低分子量構造から選択される。
29.実施形態1から28のいずれか1つに記載の組成物、ここで、二重特異性結合分子は、二重特異性完全長抗体、二重特異性CrossMab、二重特異性T細胞二重特異性、DAF、およびDutaMabから選択される。
30.実施形態1から29のいずれか1つに記載の組成物、ここで、二重特異性結合分子は二重特異性結合分子フラグメントである。
31.実施形態1から30のいずれか1つに記載の組成物、ここで、二重特異性結合分子フラグメントは、DutaFab、F(ab’)2、タンデムscFv、ダイアボディ、tandAb、scFv2-CH1/CL、およびVHH2-CH1/CLから選択される。
32.実施形態1から31のいずれか1つに記載の組成物、ここで、(細胞表面)標的は内在化する細胞表面受容体である。
33.実施形態1から32のいずれか1つに記載の組成物、ここで、細胞表面標的は、細胞型特異的炭水化物、受容体チロシンキナーゼ(HER1、HER2、HER3、IGF1Rなど)、および細胞型特異的抗原(メソテリン、PSMA、CD19、CD20、CD44、TfR、LRP、IL受容体など)からなる群から選択される内在化細胞表面受容体である。
34.実施形態1から33のいずれか1つに記載の組成物、ここで、組成物は、二重特異性結合分子の1つまたは複数の分子を含む。
35.実施形態1から34のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ハプテンはビオチンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む:(a)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR-H3、(d)配列番号27のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(e)配列番号28のアミノ酸配列を取得HVR-L2、および(f)配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
36.実施形態1から34のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ハプテンはジゴキシゲニンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む:(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR-H3、(d)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(e)配列番号20のアミノ酸配列を取得HVR-L2、および(f)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
37.実施形態1から34のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ハプテンはテオフィリンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む:(a)配列番号31のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR-H3、(d)配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(e)配列番号36のアミノ酸配列を取得HVR-L2、および(f)配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
38.実施形態1から34のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ハプテンはフルオレセインであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む:(a)配列番号39のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号40のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号41のアミノ酸配列を含むHVR-H3、(d)配列番号43のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(e)配列番号44のアミノ酸配列を取得HVR-L2、および(f)配列番号45のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
39.実施形態1から34のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ハプテンはブロモデオキシウリジンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む:(a)配列番号47のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号48のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号49のアミノ酸配列を含むHVR-H3、(d)配列番号51のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(e)配列番号52のアミノ酸配列を取得HVR-L2、および(f)配列番号53のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
40.実施形態1から34のいずれか1つに記載の組成物、ここで、ハプテンは配列番号57のヘリカーモチーフポリペプチドであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第1結合特異性は、抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む:配列番号55のHVR-H1、HVR-H2およびHVR-H3、ならびに配列番号56のHVR-L1、HVR-L2およびHVR-L3。
41.実施形態1から40のいずれか1つに記載の組成物、ここで、各ハプテンは、1つの二重特異性分子によって特異的に結合する。
42.実施形態1から41のいずれか1つに記載の組成物、ここで、大核酸はCRISPR/Cas9をコードする。
43.実施形態1から41のいずれか1つに記載の組成物、ここで、大核酸は以下を含む:
-CRISPR/Casシステム核酸、および/または
-哺乳類細胞内因性ポリペプチドの発現カセット、および/または
-治療機能を有する酵素または他のタンパク質/ペプチドをコードするポリペプチドの発現カセット、および/または
-マイクロRNA、短干渉RNA、長鎖ノンコーディングRNA、RNAデコイ、RNAアプタマー、リボザイムなどの治療機能を備えたノンコーディングRNAの転写システム。
44.実施形態1から43のいずれか1つに記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤。
45.実施形態1から43のいずれか1つに記載の薬剤として使用する組成物。
46.実施形態1から43のいずれか1つに記載の遺伝子治療として使用する組成物。
47.実施形態1から43のいずれか1つに記載の組成物の医薬品製造における使用。
48.実施形態1から43のいずれか1つの記載による有効量の組成物を個体に投与することを含む、遺伝病を有する個体を治療する方法。
49.実施形態1から43のいずれか1つの記載による遺伝子発現を改変するために、有効量の組成物を個体に投与することを含む、個体の細胞における遺伝子発現を改変する方法。
50.以下のステップを含む、実施形態1から43のいずれか1つの記載による組成物を調製するための方法:
a)大核酸とヒストンをインキュベートして、大核酸またはヒストン、あるいはその両方が少なくとも1つのハプテン分子に結合している、大核酸-ヒストン複合体を形成する、
b)a)で形成された大核酸-ヒストン複合体を二重特異性結合分子とインキュベートし、二重特異性分子-大核酸-ヒストン-複合体を生成する、
c)ステップb)で形成された二重特異性結合分子-大核酸-ヒストン複合体を単離および/または精製し、それにより、実施形態1から43のいずれか1つに記載の組成物を生成する。
51.以下のステップを含む、真核細胞に大核酸を導入する方法:
a)二重特異性結合分子と細胞表面標的の結合に適した条件下で、実施形態1から43のいずれか1つに記載の組成物と共に真核細胞をインキュベートする、
b)大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞に導入する。
52.以下のステップを含む真核細胞をトランスフェクトするための方法:
a)二重特異性結合分子と細胞表面標的の結合に適した条件下で、実施形態1から43のいずれか1つに記載の組成物と共に真核細胞をインキュベートする、
b)大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって真核細胞をトランスフェクトする。
53.以下のステップを含む、核酸を真核細胞に輸送する方法:
a)二重特異性結合分子と細胞表面標的の結合に適した条件下で、実施形態1から43のいずれか1つに記載の組成物と共に真核細胞をインキュベートする、
b)大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞に輸送する。
54.核酸を真核細胞の核に輸送するための以下のステップを含む方法:
a)二重特異性結合分子と細胞表面標的の結合に適した条件下で、実施形態1から43のいずれか1つに記載の組成物と共に真核細胞をインキュベートする、
b)大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞の核に輸送する。
55.実施形態1から43のいずれか1つに記載の組成物の真核細胞への大核酸の標的指向送達における使用。
56.実施形態1から43のいずれか1つに記載の組成物の真核細胞核への大核酸またはその機能的断片の導入における使用。
57.実施形態1から43のいずれか1つに記載の組成物、ここで、組成物は、真核細胞に大核酸またはその機能的断片を導入するためのものである。
58.実施形態1から43のいずれか1つに記載の組成物、ここで、組成物は、大核酸またはその機能的断片による真核細胞のトランスフェクション用である。
59.実施形態51から54のいずれか1つに記載の方法で得られた細胞およびその子孫。
60.真核細胞集団の定義された亜集団を大核酸でトランスフェクトする方法であり、以下のステップを含む:
-請求項1から43のいずれか一項に記載の組成物を有する少なくとも1つの細胞表面抗原が異なる少なくとも2つの亜集団を含む真核細胞の集団をインキュベートする。ここで、二重特異性結合分子の第2結合特異性は、真核細胞集団の亜集団にのみ存在する細胞表面抗原に特異的に結合し、それにより、大核酸が真核細胞集団の定義された亜集団にトランスフェクトする。
以下の実施例、配列および図は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の本意から逸脱しない限り、記載された手順に変更を加えることはできる。
実施例1
プラスミドクロマチンを生成するためのヒストンによるプラスミドDNAの組み立て
ヒストンとDNAの組み立ては、さまざまな規模でのin vitro塩勾配透析によって効率的に達成できる。
反応混合物は、300μL 200ng/mL BSA(Sigma)1倍低塩バッファー(10mM Tris-HCl pH7.6、50mM NaCl、1mM EDTA、0.05%w/v Igepal CA630)を使用した150~400μg/mLプラスミドDNA、2M NaCl、および異なる量のヒストン八量体(子牛胸腺:pEGFPプラスミドDNAまたはCas9 DPH1gRNAプラスミドDNA 1μgあたり2μgヒストン;ヒト組換えヒストン:pEGFPプラスミドDNA 1μgあたり0.8-1μgヒストン;ニワトリ赤血球ヒストン:pEGFPプラスミドDNA 1μgあたり1μgヒストン)で調製した。反応混合物を、高塩緩衝液(10mM Tris-HCl pH7.6,2M NaCl,1mM EDTA,0.05% w/v Igepal CA630)で15分間平衡化した3.5kDa MWCOミニ透析装置(Thermo Fisher Scientific)に移した。その後、1mMベータメルカプトエタノールを含む300mLの高塩緩衝液で4Lビーカーを調製し、1mMベータメルカプトエタノールを含む3Lの1倍低塩緩衝液で2番目のビーカーを調製した。高塩緩衝液を入れたビーカーにフローターとマグネチックスターラーを加えた。塩勾配透析は、4℃で一晩行った。したがって、ビーカーをマグネチックスターラーに置いてゆっくりと混合し、蠕動ポンプを設定し、3Lの低塩緩衝液を高塩緩衝液を含むビーカーに約300mL/hの速度で移した。バッファー希釈後、サンプルをタンパク質低結合チューブ(Eppendorf)に移し、ピペッティングによって体積を測定した。
クロマチンアセンブリに使用されるプラスミドは、以下の要素で構成されていた。
-pEGFP-AmpR(3967bp):-eGFP発現カセット(CMVプロモーター;eGFPコード配列;SV40 PolyA)
-F1複製起点
-アンピシリン耐性遺伝子
-Cas9 DPH1 gRNA(8033 bp):-hU6プロモーター
-DPH1gRNAの転写テンプレート
-Cas9転写開始のためのCMVプロモーター
-Myc-TagおよびFlag-Tagを含むCas9コード配列
-pBR322複製起点
-アンピシリン耐性遺伝子
実施例2
EMSAを用いた組み立てられたプラスミドクロマチンの耐電荷性の評価
クロマチンの全体的な電荷は、EMSAシフトアッセイによって分析した。EMSAシフトアッセイでは、ヒストンアセンブリの前後に500ngのDNAを使用し、1%臭化エチジウムアガロースゲルにロードし、180Vで45分間シフトした。
実施例3
組み立てられたプラスミドクロマチンのヌクレアーゼ耐性の評価
ヌクレアーゼ感受性アッセイでは、クロマチンで組み立てられた2μgのDNAをバッファー(10mM Tris-HCl、pH7.6、80mM KCl、10%v/vグリセロール、1.5mM MgCl2、1mM DTT)と1μLのBSAで希釈し、最終容量を50μLにした。反応を停止するために、1.5mLのチューブを4μLのストップバッファー(100mM EDTA、4%w/vドデシル硫酸ナトリウム)で調製した。ヌクレアーゼ消化は、50μLのMNaseミックス(6mM CaCl2、200ng/μLのBSAおよび40U MNase)の添加によって開始した。示された時点の後、30μLの反応混合物をストップバッファーを含むチューブに移した。1μLのプロテイナーゼKを添加し、50℃で1時間インキュベートすることにより、DNAを除タンパクした。DNAはエタノール沈殿によって精製され、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
実施例4
ハプテニル化プラスミド-クロマチンの生成
ハプテンをプラスミド-クロマチンに結合するために、サイズ排除クロマトグラフィーによってヒストンをeGFPをコードするプラスミド(詳細は実施例1を参照のこと)と組み立てた後、クロマチンを精製した。続いて、NHS-ビオチン試薬の化学的結合により、組み立てられたヒストン八量体のリジン側鎖にビオチンが結合した。したがって、精製後、クロマチンにアセンブルされた100μgのDNAを、製造元の指示に従ってBiotin-XX Microscale Protein Labeling Kit(Thermo Fisher Scientific)の反応に供した。ビオチン化後、未反応の遊離ビオチン化試薬を7kDa MWCO Zebaスピン脱塩カラム(Thermo Fischer Scientific)で除去した。続いて、ストレプトアビジンでコーティングされたディップを使用するForteBio Octetシステムを使用し、得られたコンジュゲートのストレプトアビジンへの結合を測定することにより、ビオチンのクロマチンへの付着を評価した。Octet分析では、ビオチン結合プラスミド-クロマチン(Bio-Chromatin)を210μL PBSTバッファーで最終濃度8μg/mLに希釈した。その後の分析は、30℃、1000rpmで一定に振とうしながら行った。図3Aは、化学結合反応後、プラスミド-クロマチンがストレプトアビジンに結合することを示している(Octet分析)。これは、ビオチンがプラスミドクロマチンに付着していることを証明している。
ビオチンをプラスミド-クロマチンに結合する別の方法は、実施例1に記載のヌクレオソーム/クロマチンアセンブリを実行する前に、ビオチンをプラスミド-DNA(製造元の仕様に従って、Label IT(登録商標)核酸ラベリングキット、Mirusを適用する)に化学的結合させることである。図3Bは、ストレプトアビジンに結合する能力によって表されるように、この手順によってビオチン化プラスミドクロマチンも生じることを示している。
最後に、市販のビオチン化ヒストン(Active Motif))を、実施例1に記載されているクロマチンアセンブリ反応に適用して、ビオチン化プラスミド-クロマチンを生成することができる(図3C)。
実施例5
ヒトタンパク質由来のハプテニル化ペプチドのプラスミドDNAとの結合
ペプチドとプラスミドDNAの相互作用は、EMSAシフトアッセイおよび/またはマイクロスケール熱泳動分析(MST)によって分析された。
EMSAの場合、500ngのDNAをさまざまな量のペプチドと30分間インキュベートした。ペプチドを含むまたは含まないDNAサンプルを、1%アガロースゲルを含む臭化エチジウムにロードした。EMSAシフトは180Vで45分間行った。紫外線下でゲルイメージャー(BioRad)で分析した。
MSTは、温度勾配を適用した後のプラスミドDNAの動きを測定する。リガンド(ペプチドなど)がプラスミドDNA分子に結合すると、この動きが変化する。したがって、ペプチドの存在下で動きが変化すると、ペプチドとDNAの間の相互作用が発生する。MSTは、ペプチド濃度5μMおよび10μMで2bind GmbH(Regensburg)によって実行され、ペプチドのDNAへの結合の読み出しとしてDNAとのインキュベーションによる蛍光の増加を検出した。
これらの分析の結果を図4A(EMSAシフトアッセイ)および図4B(MST)に示す。どちらの技術も、DNAに結合するペプチドと結合しないペプチドを区別する。これらの実験の結果(以下の表に要約されている)は、いくつかのヒトペプチドがプラスミドDNAに結合するため、ハプテンをプラスミドDNAに結合するために使用できることを示している。これらには、ヒトP53、NRTN、FALL、CPXM2、WNT、ASM3Bおよびそれらの誘導体に由来するペプチドが含まれる。
実施例6
bsAbを標的としたペプチド-プラスミドアセンブリの細胞内送達と機能性
これは、LeYを発現するMCF7乳がん細胞を、LeY抗原とジゴキシゲニンに同時に結合するbsAbに曝露し、dig-ペプチドの付着によってジゴキシゲニン化されたプラスミド(dig-NRTN)と複合体を形成することによって示されている。特定のターゲティングのコントロールとして、プラスミドを別の実験で、MCF7細胞には存在しないCD33抗原を認識するdig結合bsAbと複合体を形成した。
細胞内の取り込みと機能性は、MCF7細胞内の送達されたプラスミド内の発現カセットにコードされているGFPの発現を検出することによって示された。
送達複合体は、GFP発現プラスミドをPBS中で1時間、ジゴキシゲニン標識NRTN-ペプチドおよび二重特異性LeY-Dig bsAbとともにインキュベートすることによって生成された。その後、複合体を96ウェルプレートに播種したMCF7細胞に加え、最終濃度を4μg/mLのプラスミドDNA、10μMのペプチド、300nMの抗体にした。これに続いて、48時間後に処理細胞の蛍光顕微鏡イメージングが行われた。これらの分析の結果を図8に示す。イメージング蛍光顕微鏡法は、非ターゲティングCD33-bsAb-プラスミド複合体で処理された細胞集団に蛍光が完全に存在しないことを明らかにした。対照的に、GFPを発現した細胞は、LeY-bsAb-プラスミド複合体を標的とする細胞表面を受け取ったLeY+++/CD33-MCF7細胞で検出可能であった。細胞表面抗原に対して、LeYは明確に単一のGFP発現細胞(母集団の約2%、左パネル)を示したが、CD33に対する抗体を含む複合体で処理された細胞(右パネル)はバックグラウンドを超えるGFP発現を示さなかった。したがって、bsAbを標的とした特定の送達およびハプテニル化ペプチド-DNA複合体の蓄積は、細胞の細胞質/核への生産的な取り込みを可能にし、ある程度GFP発現をもたらす。
実施例7
bsAbを標的としたペプチド-クロマチン集合体の細胞内送達と機能性
eGFP蛍光
bsAbを標的としたペプチド-クロマチンアセンブリの細胞内送達と機能性を示すために、LeYを発現するMCF7乳がん細胞を、LeY抗原とジゴキシゲニンまたはビオチンに同時に結合するbsAbに曝露し、ジゴキシゲニン化またはビオチン化ペプチド(例えば、Dig-CPXM2、Dig-p53およびDig-Wntp53またはBio-CPXM2)と複合体を形成した。特定のターゲティングのコントロールとして、プラスミドクロマチンを、別の実験で、MCF7細胞には存在しないCD33抗原を認識するdigまたはbio結合bsAbと複合体を形成した。
細胞内の取り込みと機能性は、MCF7細胞内の送達されたプラスミド内の発現カセットにコードされているGFPの発現を検出することによって示された。
送達複合体は、GFP発現プラスミドをPBS中で少なくとも1時間、dig/bio標識ペプチド(例えば、Dig-CPXM2またはBio-CPXM2)および二重特異性LeY-Dig/Bio bsAbまたは二重特異性CD33-Dig/Bio bsAbと対照抗体としてインキュベートすることによって生成された。その後、複合体を、12ウェルプレートに播種したMCF7細胞(80,000細胞/ウェル)に最大最終濃度(クロマチン、500nMペプチドおよび250nM抗体にアセンブルされた8μg/mLプラスミドDNA)まで添加した。これに続いて、48時間後にFACSCanto II(BD Biosciences)を用いたフローサイトメトリーによる蛍光細胞の定量化が行われた。
CRISPR/Cas:
同様に、細胞核へのCRISPR/Cas9ノックアウトシステムをコードするプラスミドの標的指向送達を分析し、本明細書に報告されている組成物による大核酸の細胞内送達および活性を示した。
したがって、クロマチンアセンブリ反応は、eGFPプラスミドの代わりにDPH1遺伝子に対するCRISPR/Cas9コード化プラスミドを使用して上記のように実行された。ジフテリア毒素(DT)に対する細胞感受性の評価と組み合わせて、DPH1の遺伝子編集を介した不活性化を使用して、遺伝子編集の有効性を定量化できることは以前に説明されている(例えば、WO2018/060238;Killian,T.ら,Sci.Rep.7(2017)15480を参照のこと)。(遺伝子編集の結果として)DPH1のすべての細胞コピーを不活性化すると、細胞はDTに耐性を持つ。これにより、非常に確実な読み出しが生成され、遺伝子編集後にDT耐性コロニーをカウントすることで定量化できる。
複合体を、12ウェルプレートに播種したMCF7細胞(2,000細胞/ウェル)に最大最終濃度(クロマチン、500nMペプチドおよび250nM抗体にアセンブルされた8μg/mLプラスミドDNA)まで添加した。72時間の処理後、培地を除去し、細胞を最終濃度2nMのDTを含む培地に曝露した。DT曝露は2週間続けられ、3~4日ごとに培地交換が行われた。この期間の後、細胞をメチレンブルーで染色し、細胞内送達の効率および編集成分の発現を、Killianら(Killian,T.ら,Sci.Rep.7(2017)15480;WO2018/060238)によって以前に記載されたようにDT耐性コロニーの決定によって評価した。結果を図11に示す。
実施例8
共焦点顕微鏡でモニターされた標的プラスミドDNAまたはクロマチンの細胞内ルーティングと機能性
プラスミドDNAおよびプラスミドクロマチンのターゲティングとルーティングの蛍光顕微鏡分析を可能にするために、Cy5蛍光色素を、メーカーの仕様に従って、Label IT(登録商標)Nucleic Acid LabelingキットMirusを適用してプラスミド-DNAと化学的に結合させた。蛍光プラスミドクロマチンを生成するために、実施例1に記載されているように、Cy5標識プラスミドを用いてクロマチンアセンブリを実施した。
生細胞イメージングでは、MCF7細胞(NCI)を、10%ウシ胎児血清(FCS)と100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを添加したフェノールレッドを含まないRPMI培地で培養した。20,000細胞/ウェルを8ウェルチャンバースライド(Lab-Tek(商標),Thermo Fisher Scientific,Braunschweig,Germany)に播種し、一晩接着させた。ガラス表面は、37℃で1時間、PBS中の30μg/mlフィブロネクチンでコーティングされていた。抗体プラスミドDNA-Cy5および抗体-プラスミドクロマチン-Cy5複合体は、実施例7に記載されているように形成された。サンプルは、4μg/mLのプラスミドDNA、250nMのペプチドおよび125nMの抗体の最終濃度でMCF7に添加された。添加の1時間後、4時間後、24時間後、および48時間後に、抗体-クロマチン複合体の内在化とGFP発現に続いて、63×/1.2NA水浸対物レンズ(Leica,Mannheim,Germany)を使用してLeica SP5レーザー走査型共焦点顕微鏡で生細胞蛍光顕微鏡を実施した。温度、CO2レベルと湿度は、ステージトップのインキュベーションチャンバー(Oko-touch,Okolab,Ottaviano,Italy)を使用して37°Cと5%CO2に維持した。シーケンシャルスキャンは、488nm(561nm)および633nmでの白色光レーザー励起を使用して行った。蛍光発光は、HyD検出器を使用して、495~548nm(GFP)、570~628nm(Cy3)、および647~732nm(Cy5)で検出した。画像はImageJ(NIH,Bethesda,MD,USA)で処理した。