JP6913145B2 - 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子 - Google Patents

二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子 Download PDF

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Description

本発明は、概して、Ｔ細胞を活性化させるための二重特異性抗原結合分子に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞とに関する。本発明は更に、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成する方法と、このような二重特異性抗原結合分子を疾患の治療に使用する方法とに関する。
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、種々の臨床背景において時に望ましい。例えば、健常な細胞と組織を無傷のまま損傷を与えずに残しながら、腫瘍細胞を特異的に破壊することががん治療の主要目的である。
これを達成する魅力的な方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のような免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃させて破壊させることである。ＣＴＬは、免疫系の最も強力なエフェクター細胞を構成するが、従来の治療抗体のＦｃドメインにより媒介されるエフェクター機構によって活性化することができない。
これに関し、標的細胞上の表面抗原に一の「アーム」で結合し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント成分に第２の「アーム」で結合するように設計された二重特異性抗体が、近年注目を浴びている。このような抗体がその標的の両方に同時結合することにより、標的細胞とＴ細胞との間に一時的な相互作用が生じ、これはいずれかの傷害性Ｔ細胞を活性化させ、続いて標的細胞を溶解させる。したがって、免疫応答は、標的細胞に再指向（ｒｅ−ｄｉｒｅｃｔ）され、ＣＴＬの正常なＭＨＣ制限活性化がそうであるように、標的細胞によるペプチド抗原の提示又はＴ細胞の特異性とは無関係である。このような観点から、標的細胞がそれに対して二重特異性抗体を提示するとき、即ち免疫シナプスが模倣されるときにのみ、ＣＴＬが活性化されることが重要である。特に望ましいのは、標的細胞の効率のよい溶解を引き起こすために、リンパ球のプレコンディショニング又は同時刺激を必要としない二重特異性抗体である。
複数の二重特異性抗体のフォーマットが開発されており、Ｔ細胞媒介性免疫療法に対するそれらの適性が調査されている。これらの中でも、いわゆるＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞結合体）分子は、きわめて詳細な特徴付けが済んでおり、臨床の分野で既に何らかの見通しを示している（Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)に掲載）。ＢｉＴＥは、二つのｓｃＦｖ分子が可動性リンカーにより融合したタンデム型のｓｃＦｖ分子である。Ｔ細胞結合体について評価された更なる二重特異性フォーマットには、ダイアボディ（Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)）及びその誘導体、例えばタンデム型ダイアボディ（Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)）が含まれる。更に最近の開発は、ダイアボディフォーマットに基づくが、更なる安定性のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする、いわゆるＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）分子である（Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)）。全部がハイブリッドマウス／ラットのＩｇＧ分子であり、やはり現在臨床治験において評価の対象である、いわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）は、更に大きなフォーマットを表している（Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)に掲載）。
開発されている種々のフォーマットは、免疫療法におけるＴ細胞の再指向及び活性化により大きな可能性を示すものである。しかしながら、そのために適した二重特異性抗体を生成するというタスクは決して簡単はなく、抗体の有効性、毒性、実現可能性、及び生産可能性に関して克服されなければならない複数の困難性を伴っている。
例えばＢｉＴＥ分子といった小さなコンストラクトは、エフェクターと標的細胞を効率的に架橋することができる一方、非常に短い血清半減期を有し、持続的注入により患者に投与されなければならない。一方、ＩｇＧ−様フォーマットは、半減期が長いという大きな利点を有するが、ＩｇＧ分子に固有の天然エフェクター機能に関連付けられる毒性を欠点として有する。これらの免疫原性は、治療法開発の成功にとって、特に非ヒトフォーマットのＩｇＧ様二重特異性抗体の、別の好ましくない特徴を構成する。最後に、二重特異性抗体の一般的開発においてこれまで主に問題であったのは、臨床的に十分な量及び純度で二重特異性抗体コンストラクトを生産することで、これは、同時発現した際に異なる特異性の抗体重鎖と軽鎖とを誤って対にしてしまうことにより、正しく構築されたコンストラクトの収量が低減し、所望の二重特異性抗体の分離が困難な複数の非機能性副産物が生じることに起因している。
Ｔ細胞媒介免疫療法に現在利用可能な二重特異性抗体に関連する問題及び欠点を鑑み、このような分子の新規の改良されたフォーマットに対する需要が存在するといえる。本発明は、良好な有効性及び生産可能性を低毒性及び好ましい薬物動態的特性と組み合わせた、Ｔ細胞の活性化と再指向のために設計された二重特異性抗原結合分子を提供する。
第１の態様において、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
一実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分は、配列番号３、配列番号３２及び配列番号３３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７及び配列番号３１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含んでいる。
一実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５）に特異的に結合することができ、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＣＥＡに特異的に結合することができ、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＭＣＳＰ（ＣＳＰＧ４）に特異的に結合することができ、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号４０からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ、ＣＳＰＧ４）に特異的に結合することができ、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができ、配列番号１３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３９及び配列番号４１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７及び配列番号５１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができ、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。更に特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。
一実施態様では、第２の抗原結合部分が従来のＦａｂ分子である。
更なる特定の実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができる一を超えない抗原結合部分がＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子中に存在する（即ち、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＣＤ３に対する一価の結合を提供する）。
更なる実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分を更に含んでいる。一実施態様では、前記第３の抗原結合分子は従来のＦａｂ分子である。一実施態様では、前記第３の抗原結合分子は第２の抗原結合部分と同一である。
特定の実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＥＡに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分を更に含み、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
特定の実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＥＡに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分を更に含み、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
一実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分を更に含み、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号４０からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
特定の実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分を更に含み、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
一実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分を更に含み、配列番号１３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３９及び配列番号４１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７及び配列番号５１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
特定の実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分を更に含み、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第１及び第２の抗原結合部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。このような一実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別のこのような実施態様では、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している実施態様では、これに加えて、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とが、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合していてよい。
一実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉｉｉ）安定に結合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。別の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第１及び第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合している。
一実施態様では、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原結合分子の第２及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別の特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原結合分子の第１及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、直接融合していても、又は適切なペプチドリンカーを介して融合していてもよい。一実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。
特定の実施態様では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。
特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（カバット番号付け）を含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。特定の実施態様ではＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、第１及び第２のＦｃドメインサブユニットの結合を促進する修飾を含んでいる。このような特定の一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基は、大きな側鎖量を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基は、小さな側鎖量を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を収容可能な空洞を生成する。
特定の一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して小さな、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を呈する。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較して小さな、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を有するように改変される。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む。一実施態様では、Ｆｃドメイン内のＦｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（カバット番号付け）の群から選択される一又は複数の位置にある。特定の実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる三つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。他の実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる二つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸残基はＬ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇである。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４のＦｃドメインであり、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ（ＳＰＬＥ）を含んでいる。
一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
本発明の別の態様によれば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドも包含する。本発明は更に、本発明の単離されたポリヌクレオチド含む発現ベクター、及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物の細胞である。
別の態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、この方法は、ａ）本発明の宿主細胞を、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む。本発明は、本発明の方法によって生成されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子も包含する。
本発明は更に、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
本発明には、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的組成物を使用する方法も包含される。本発明の一態様では、医薬としての使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。一態様では、治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。
更に、治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用と；個体に対し、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を、薬学的に許容される形態で投与することを含む、前記個体の疾患の治療方法とが提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。上記実施態様のいずれにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
本発明は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞に本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を接触させることを含む、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法も提供する。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的構造である。Ａは、「１＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示している。Ｂは、「２＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示している。Ｃは、別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分（「反転型」）を有する（「２＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示している。Ｄは、「１＋１のＣｒｏｓｓＭａｂ」分子を示している。黒い点：ヘテロ二量体化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾 本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的構造である。Ｅは、「２＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、軽鎖リンク」分子を示している。Ｆは、「１＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、軽鎖リンク」分子を示している。Ｇは、「２＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型、軽鎖リンク」分子を示している。Ｈは、「１＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型、軽鎖リンク」分子を示している。黒い点：ヘテロ二量体化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾 非成熟親クローンに対する親和性成熟抗ＭＣＳＰクローンの配列比較である（Ｍ４−３ ＭＬ２）。 ＭＣＳＰ ＴＣＢ（２＋１のＣｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子の概略図である。 ＭＣＳＰ ＴＣＢ（２＋１のＣｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型、配列番号１２、５３、５４及び５５）のＣＥ−ＳＤＳ解析である。ＭＣＳＰ ＴＣＢのＳＤＳ−Ｐａｇｅとして示された電気泳動図：Ａ）低下なし、Ｂ）低下。 ＣＥＡ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子の概略図である。 ＣＥＡ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型、配列番号２２、５６、５７及び５８）分子のＣＥ−ＳＤＳ解析である。ＣＥＡ ＴＣＢのＳＤＳ−Ｐａｇｅとして示された電気泳動図：Ａ）低下なし、Ｂ）低下。 Ａ３７５細胞（ＭＣＳＰ＋）（Ａ）及びＪｕｒｋａｔ（ＣＤ３＋細胞）（Ｂ）に対するＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号１２、５３、５４及び５５）の結合を示している。「非標的ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 Ａ３７５（高ＭＣＳＰ）（Ａ）及びＭＶ−３（中ＭＣＳＰ）（Ｂ）標的細胞のＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号１２、５３、５４及び５５）によって誘導されたＴ細胞の死滅を示している。（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ、インキュベーション時間２４ｈ）。「非標的ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 ＨＣＴ−１１６（低ＭＣＳＰ）（Ｃ）及びＬＳ１８０（ＭＣＳＰ陰性）（Ｄ）標的細胞の、ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号１２、５３、５４及び５５）によって誘導されたＴ細胞の死滅を示している。（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ、インキュベーション時間２４ｈ）。「非標的ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号１２、５３、５４及び５５）によって誘導されたＭＶ３メラノーマ細胞のＴ細胞媒介性死滅後の、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーションを示している（Ｅ：Ｔ＝１０：１、２４ｈのインキュベーション）。「非標的ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号１２、５３、５４及び５５）によって誘導されたＭＶ３メラノーマ細胞のＴ細胞媒介性死滅後の、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーションを示している（Ｅ：Ｔ＝１０：１、２４ｈのインキュベーション）。「非標的ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号１２、５３、５４及び５５）によって誘導されたＭＶ３メラノーマ細胞のＴ細胞媒介性死滅後の、ヒトＰＢＭＣによるＩＬ−２（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｂ）及びＴＮＦα（Ｃ）の分泌を示している（Ｅ：Ｔ＝１０：１、２４ｈのインキュベーション）。「非標的ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号１２、５３、５４及び５５）によって誘導されたＭＶ３メラノーマ細胞のＴ細胞媒介性死滅後の、ヒトＰＢＭＣによるＩＬ−４（Ｄ）、ＩＬ−１０（Ｅ）及びグランザイムＢ（Ｆ）の分泌を示している（Ｅ：Ｔ＝１０：１、２４ｈのインキュベーション）。「非標的ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 ＣＥＡ発現Ａ５４９肺腺癌細胞（Ａ）及びＣＤ３発現不死化ヒト及びカニクイザルＴリンパ細胞株（それぞれＪｕｒｋａｔ（Ｂ）及びＨＳＣ−Ｆ（Ｃ））に対するＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）の結合を示している。 ＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）（Ａ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）（Ｂ）、ＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）（Ｃ）及びＨＣＴ−１１６細胞（ＣＥＡ陰性）（Ｄ）の、ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）によって誘導されたＴ細胞の死滅を示している。Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ、インキュベーション時間は２４ｈ。「非標的ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 ＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）（Ｅ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）（Ｆ）、ＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）（Ｇ）及びＨＣＴ−１１６細胞（ＣＥＡ陰性）（Ｈ）の、ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）によって誘導されたＴ細胞の死滅を示している。Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ、インキュベーション時間は４８ｈ。「非標的ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）によって誘導されたＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）（Ａ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）（Ｂ）、ＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）（Ｃ）及びＨＣＴ−１１６細胞（ＣＥＡ陰性）（Ｄ）のＴ細胞媒介性死滅の５日後の、ヒトＣＤ８＋及びＣＤ４＋におけるＴ細胞増殖を示している。「ＤＰ４７ ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）によって誘導されたＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）（Ｅ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）（Ｆ）、ＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）（Ｇ）及びＨＣＴ−１１６細胞（ＣＥＡ陰性）（Ｈ）のＴ細胞媒介性死滅の５日後の、ヒトＣＤ８＋及びＣＤ４＋におけるＣＤ２５のアップレギュレーションを示している。「ＤＰ４７ ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）によって誘導されたＭＫＮ４５腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅後の、ＩＦＮ−γ（Ａ）、ＴＮＦα（Ｂ）及びグランザイムＢ（Ｃ）の分泌を示している（Ｅ：Ｔ＝１０：１、４８ｈのインキュベーション）。「非標的ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）によって誘導されたＭＫＮ４５腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅後の、ＩＬ−２（Ｄ）、ＩＬ−６（Ｅ）及びＩＬ−１０（Ｆ）の分泌を示している（Ｅ：Ｔ＝１０：１、４８ｈのインキュベーション）。「非標的ＴＣＢ」：二重特異性抗体結合ＣＤ３、但し、第２の抗原なし（配列番号５９、６０、６１及び６２）。 漸増濃度のｓｈｅｄ ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）の存在下において、ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）によって誘導され、ＴＣＢ及びｓＣＥＡを用いたインキュベーションの２４時間後（Ａ）又は４８時間後（Ｂ）に検出された、ＣＥＡ発現ＬＳ１８０腫瘍標的細胞のＴ細胞媒介性死滅を示している。 エフェクター細胞としてＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）及びヒトＰＢＭＣ（Ａ、Ｃ）又はカニクイザルＰＢＭＣ（Ｂ、Ｄ）を用いたインキュベーションの２１時間後（Ａ、Ｂ）及び４０時間後（Ｃ、Ｄ）に評価された、ヒトＣＥＡ（Ａ５４９−ｈＣＥＡ）を過剰発現するＡ５４９（肺腺癌）細胞のＴ細胞媒介性死滅を示している。 ０．８ｎＭ（Ａ）のＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）によって誘導された、ＣＥＡ発現ヒト結腸直腸がん細胞株のＴ細胞媒介性死滅を示している。 ４ｎＭ（Ｂ）のＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）によって誘導された、ＣＥＡ発現ヒト結腸直腸がん細胞株のＴ細胞媒介性死滅を示している。 ２０ｎＭ（Ｃ）のＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）によって誘導された、ＣＥＡ発現ヒト結腸直腸がん細胞株のＴ細胞媒介性死滅を示している。 Ｄは、ＣＥＡ ＴＣＢが２０ｎＭである場合のＣＥＡ発現と％特異的溶解との相関を示しており、ＥはＣＥＡ発現とＣＥＡ ＴＣＢのＥＣ５０との相関を示している。 ヒトＰＢＭＣを共移植したＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２ヒト結腸癌におけるＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）のインビボでの抗腫瘍効果を示している（Ｅ：Ｔ比５：１）。結果は、異なる試験群における１２匹のマウスの、キャリパー（Ａ）及びバイオルミネセンス（全光束、Ｂ）により測定された腫瘍体積に基づく平均及びＳＥＭを示している。１日目に治療を開始した早期治療群である。ＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号１２、５３、５４及び５５）がネガティブコントロールとして使用された。 ヒトＰＢＭＣを共移植したＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２ヒト結腸癌におけるＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）のインビボでの抗腫瘍効果を示している（Ｅ：Ｔ比５：１）。結果は、異なる試験群における１２匹のマウスの、キャリパー（Ｃ）及びバイオルミネセンス（全光束、Ｄ）により測定された腫瘍体積に基づく平均及びＳＥＭを示している。７日目に治療を開始した遅延治療群である。ＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号１２、５３、５４及び５５）がネガティブコントロールとして使用された。 ヒトＰＢＭＣを共移植したＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２ヒト結腸癌におけるＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号２２、５６、５７及び５８）のインビボでの抗腫瘍効果を示している（Ｅ：Ｔ比１：１）。結果は、異なる試験群における１０匹のマウスの、キャリパー（Ａ）及びバイオルミネセンス（全光束、Ｂ）により測定された腫瘍体積の平均及びＳＥＭを示している。ＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号１２、５３、５４及び５５）がネガティブコントロールとして使用された。 免疫担当性ｈｕＣＤ３ε／ｈｕＣＥＡトランスジェニックマウスのＰａｎｃｏ２−ｈｕＣＥＡ同所性腫瘍モデルにおけるマウス化ＣＥＡ ＴＣＢのインビボでの効果を示している。 ＣＥＡ ＴＣＢの熱安定性を示している。０．０５℃／分での２５〜７５℃の温度勾配において測定された動的光散乱である。重複はグレーの線で示されている。 ＭＣＳＰ ＴＣＢの熱安定性を示している。０．０５℃／分での２５〜７５℃の温度勾配において測定された動的光散乱である。重複はグレーの線で示されている。 （Ａ）Ａ３７５（高ＭＣＳＰ）、（Ｂ）ＭＶ−３（中ＭＣＳＰ）及び（Ｃ）ＨＣＴ−１１６（低ＭＣＳＰ）腫瘍標的細胞のＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号１２、５３、５４及び５５）及びＭＣＳＰ１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢ抗体によって誘導されたＴ細胞媒介性死滅を示している。（Ｄ）ＬＳ１８０（ＭＣＳＰ陰性腫瘍細胞株）をネガティブコントロールとして用いた。腫瘍細胞の死滅を、抗体及びエフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）を用いた標的細胞のインキュベーションの２４時間後に評価した。 （Ａ）Ａ３７５（高ＭＣＳＰ）、（Ｂ）ＭＶ−３（中ＭＣＳＰ）及び（Ｃ）ＨＣＴ−１１６（低ＭＣＳＰ）腫瘍標的細胞のＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号１２、５３、５４及び５５）及びＭＣＳＰ１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢ抗体によって誘導されたＴ細胞媒介性死滅を示している。（Ｄ）ＬＳ１８０（ＭＣＳＰ陰性腫瘍細胞株）をネガティブコントロールとして用いた。腫瘍細胞の死滅を、抗体及びエフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）を用いた標的細胞のインキュベーションの４８時間後に評価した。 ＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号１２、５３、５４及び５５）及びＭＣＳＰ１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢ抗体によって媒介されたＭＣＳＰ発現腫瘍細胞（Ａ３７５）の、Ｔ細胞死滅後のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーションを示している。 ＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号１２、５３、５４及び５５）及びＭＣＳＰ１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢ抗体によって媒介されたＭＣＳＰ発現腫瘍細胞（ＭＶ−３）の、Ｔ細胞死滅後のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーションを示している。 非結合抗体としてＤＰ４７ＧＳを、及び抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含有するＤＰ４７ＧＳ ＴＣＢ（２＋１Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型＝「非標的ＴＣＢ」配列番号５９、６０、６１及び６２）のＣＥ−ＳＤＳ解析を示している。ＤＰ４７ＧＳ ＴＣＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示された電気泳動図：Ａ）低下なし、Ｂ）低下。
定義
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当該技術分野で一般に使用されるように使用される。
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えば、その断片である。
用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般的に、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な二つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原決定基、特に二つの別個の細胞上に発現した二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
本明細書において使用される用語「価」は、抗原結合分子内における特定数の抗原結合部位の存在を意味する。したがって、「抗原に結合する一価」という表現は、抗原結合分子内において、抗原に特異的な一つの（且つ一つを超えない）抗原結合部位の存在を意味する。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、即ち、一又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、一般に二つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は一般に単一の抗原結合部位を有する。
本明細書で使用される「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ（例えば、第２の抗原結合部分）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと直接方向付けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、抗体及びその断片が含まれる。これについては後述する。特定の抗原結合部分には、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインが含まれる。特定の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書で更に定義し、且つ当該技術分野において既知であるように、抗体定常領域を含むことができる。有用な重鎖定常領域は、五つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、二つのアイソタイプ：κ及びλのいずれかを含む。
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるたんぱく質（例えば、ＭＣＳＰ、ＣＥＡ、ＣＤ３）は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内での処理により得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質には、限定されないが：コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、ＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｑ６ＵＶＫ１（ｖｅｒｓｉｏｎ７０）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ．ＮＰ＿００１８８８．２）としても知られるメラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）；がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５、ＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｐ０６７３１（ｖｅｒｓｉｏｎ １１９）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ．ＮＰ＿００４３５４．２）としても知られるがん胎児性抗原（ＣＥＡ）；及びＣＤ３、特にＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｐ０７７６６（ｖｅｒｓｉｏｎ １３０）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１、ヒト配列の配列番号１０３；又はＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｑ９５ＬＩ５（ｖｅｒｓｉｏｎ ４９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１、カニクイザル配列［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］の配列番号１０４を参照）が含まれる。特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、様々な種由来のＣＤ３又は標的抗原の中でも保存された、ＣＤ３又は標的細胞抗原のエピトープに結合する。特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３及びＣＥＡＣＡＭ５に結合するが、ＣＥＡＣＡＭ１又はＣＥＡＣＡＭ６には結合しない。「特異的に結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合部分の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合部分の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
「親和性」とは、分子（例えば、受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書では、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表される。この解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含みうる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当該技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
例えばＦｃ受容体への結合減少といった「結合減少」は、例えばＳＰＲによって測定される、各相互作用に対する親和性の減少を指す。明確に示すために、用語はゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る値）への親和性の減少、即ち相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合増大」は、各相互作用に対する親和性の増大を指す。
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化」は、活性化マーカーの増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害性活性化、及び発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の一又は複数の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するために適切なアッセイは、本明細書において記載される技術分野で既知である。
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。
本明細書において、抗原結合部分などに関して使用される用語「第１」及び「第２」は、部分の各種類が複数存在するとき、便宜上区別するために使用されている。このような用語の使用は、明瞭に述べているのでない限り、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は方向を付与することを意図しているのではない。
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの、重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
「融合した」とは、複数の成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接又は一又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合により結合していることを意味する。
本明細書において使用される用語「一本鎖」は、ペプチド結合により線形に結合したアミノ酸モノマーを含む分子を指す。特定の実施態様では、抗原結合部分の一つは、一本鎖Ｆａｂ分子、即ちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖とがペプチドリンカーにより接続されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の一実施態様では、一本鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に接続している。
「クロスオーバーＦａｂ分子」（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも表記される）は、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域が交換されているＦａｂ分子を意味し、即ち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域と重鎖定常領域からなるペプチド鎖、及び重鎖可変領域と軽鎖定常領域からなるペプチド鎖を含んでいる。明瞭には、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバー分子では、重鎖可変領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットにおけるＦａｂ分子、即ち重鎖可変領域と定常領域（ＶＨ−ＣＨ１）からなる重鎖、及び軽鎖可変領域と定常領域（ＶＬ−ＣＬ）からなる軽鎖を含むＦａｂ分子を意味する。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している二つの軽鎖と二つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる五つの種類のうちの一つに割当てることができ、それらのいくつかは更にサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、基本的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された二つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは２価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部、又は軽鎖可変ドメインのすべて又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供される。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般に、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分でありうる。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に三つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に三つの六つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) and by Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及していずれかの定義が適用される場合、本明細書において定義及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表Ａに明記した。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。
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Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「カバット番号付け」のシステムをあらゆる可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「カバット番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、カバット番号付けシステムに従っている。
配列リストのポリペプチド配列は、カバット番号付けシステムに従って番号付けされている。しかしながら、当業者には、配列リストの番号付けをカバット番号付けに変換することは周知である。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に四つのＦＲのドメイン、即ちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の五つの主要なクラス、即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化しうるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びると定義される。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在してなくともよい。特に断らない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する二つのポリペプチドの一方、即ち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾」とは、Ｆｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドの、同一のポリペプチドとの会合結合によるホモダイマーの形成を低減又は抑制する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促す修飾には、特に、会合することが望ましい二つのＦｃドメインサブユニット（即ち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾が含まれ、これらの修飾は、二つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに相補的である。例えば、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させることにより、それらの会合を、それぞれ立体的に又は静電的に好ましいものにすることができる。このように、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これらのポリペプチドは、サブユニットの各々に融合した更なる成分（例えば、抗原結合部分）が同じでないという意味で非同一であり得る。いくつかの実施態様では、結合を促す修飾は、Ｆｃドメイン内におけるアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
本明細書において使用される「改変する、改変された、改変」などの用語は、ペプチド骨格のいずれかの操作、又は天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考慮される。改変には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、このような手法の組合せが含まれる。
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意図している。置換、欠失、挿入、及び修飾のあらゆる組み合わせは、最終的なコンストラクトが所望の特性、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増大を保持することを前提に、最終的なコンストラクトに到達するために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。Ｆｃ領域の結合特性などを変更する目的で、非保存的アミノ酸置換、即ち、一のアミノ酸を、異なる構造及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸で置換することは、特に好ましい。アミノ酸置換には、２０の標準のアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体又は天然に存在しないアミノ酸による置換が含まれる。アミノ酸変異体は、当該技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異原性、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。遺伝学的改変以外の方法、例えば化学的修飾によるアミノ酸の側鎖基の変更方法も有用でありうると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、種々の表記が使用される。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示される。
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）により線形に結合したモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、二つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特異的な長さの生成物を指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は二つ以上のアミノ酸の鎖を指す他のいずれの用語も「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語のいずれかの代わりに、又はいずれかと交換可能に、使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾の成果を指すことも意図しており、このような成果には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解的切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるか、又は組換え技術により生成されるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは、化学合成を含むあらゆる手法で生成されてよい。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上の大きさのアミノ酸からなってよい。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有するものではない。既定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると言われ、既定の三次元構造を有さず、多数の異なる形態をとりうるポリペプチドは折り畳まれていないと言われる。
「単離された」ポリペプチド若しくは変異体、又はその誘導体は、その自然の環境にない目的のポリペプチドである。特定のレベルのどのような精製も必要でない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から除去することができる。宿主細胞に発現される、組換えにより生成されたポリペプチド及びタンパク質を、任意の適切な技術により分離、画分化、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドのように、本発明のために単離することが考慮される。
「参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための配列比較は、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて完全一致のスコアを得たアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なりうることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、インビボ又はインビトロの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、更に、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった制御要素を含んでも含まなくてもよい。
少なくとも、例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５ポイントの変異を含んでよいという点以外は同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除又は別のヌクレオチドで置換されてよいか、又は参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％まで複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はこれら末端の間のいずれかで、参照配列に含まれる残基中において個々に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において、発生してよい。特定の事項として、いずれか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
用語「発現カセット」は、組換えにより又は合成により、標的細胞内の一連の特定の核酸の転写を許可する特定の核酸要素を用いて生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作用可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機械により生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、継代の数に関係なく、それに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができるいずれかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、更には、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞により抗体でコートされた標的細胞の溶解を招く免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣの低下」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞の数、及び／又は、ＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の上昇のいずれかと定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な生成、精製、製剤化、及び貯蔵方法（当業者に既知の）を用いて、但し改変されていない、同じ型の宿主細胞により生成される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと相対的なものである。例えば、そのＦｃドメインにＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低下は、このアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当該技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤が含まれる。
本明細書で用いられる場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている指示書を指すために使用される。
実施態様の詳細な説明
第１の態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含む。
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号３、配列番号３２及び配列番号３３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７及び配列番号３１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＣＥＡに特異的に結合することができ、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
別の特定の実施態様では、ＣＥＡに特異的に結合することができる第２の抗原結合部分は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができ、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号４０からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができ、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができ、配列番号１３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３９及び配列番号４１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７及び配列番号５１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができ，配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分
を含んでいる。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第１の抗原結合部分、並びに
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第２の抗原結合部分
を含んでいる。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）ＭＣＳＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分
を含んでいる。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第１の抗原結合部分、並びに
（ｉｉ）ＭＣＳＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第２の抗原結合部分
を含んでいる。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。
一実施態様では、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は一般的なＦａｂ分子である。更に特定の実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に結合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。
更なる特定の実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができる一を超えない抗原結合部分がＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子中に存在する（即ち、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＣＤ３に対する一価の結合を提供する）。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のフォーマット
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構造で互いに融合することができる。例示的構造を図１、３及び５に示す。
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に結合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
このような一実施態様では、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、基本的に、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とは、更に互いに融合していてよい。
別のこのような実施態様では、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、基本的に、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合している。
他の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
このような特定の一実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、基本的に、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とは、更に互いに融合していてよい。
抗原結合部分は、Ｆｃドメインに対して、又は互いに、直接又はペプチドリンカーを介して融合していてよく、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当分野において既知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ，（ＳＧ４）ｎ，（Ｇ４Ｓ）ｎ 又は４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は、通常は１〜１０、典型的には２〜４の数である。第１及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるための特定の適切なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖を接続するために適した例示的ペプチドリンカーはＥＰＫＳＣ（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１０５及び１０６）である。加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特に抗原結合部分がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合している場合には、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーを用いて又は用いずに、融合することができる。
標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（例えば、図１Ａ、１Ｄ、１Ｆ又は１Ｈ）は、特に高親和性抗原結合部分の結合に続いて標的細胞抗原の内部移行が予想される場合に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な一を超える抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を亢進し、それによりその利用可能性を低下させる。
しかしながら、他の多くの場合、標的細胞抗原に特異的な二つ以上の抗原結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（例えば、図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ又は１Ｇに示す）を有することは、例えば標的部位へのターゲティングを最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために有利であろう。
したがって、特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第３の抗原結合部分を更に含む。一実施態様では、第３の抗原結合部分は、一般的なＦａｂ分子である。一実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の原結合部分と同じ標的細胞抗原に特異的に結合することができる。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができ、第２及び第３の抗原結合部分は標的細胞抗原に特異的に結合することができる。特定の実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分は同一である（即ち、それらは同じアミノ酸配列を含む）。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合することができ、第２及び第３の抗原結合部分はＣＥＡに特異的に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができ、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０からなる群より選択される少なくとも一つ軽鎖ＣＤＲとを含み；第２及び第３の抗原結合部分はＣＥＡに特異的に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができ、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２及び第３の抗原結合部分はＣＥＡに特異的に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができ、配列番号３、配列番号３２及び配列番号３３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７及び配列番号３１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでおり、第２及び第３の抗原結合部分はＣＥＡに特異的に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができ、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでおり、第２及び第３の抗原結合部分はＣＥＡに特異的に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
一実施態様では、第１の抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合することができ、第２及び第３の抗原結合部分はＭＣＳＰに特異的に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号４０からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
特定の一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができ、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２及び第３の抗原結合部分はＭＣＳＰに特異的に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号４０からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができ、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０からなる群より選択される少なくとも一つ軽鎖ＣＤＲとを含み；第２及び第３の抗原結合部分はＭＣＳＰに特異的に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができ、 配列番号３、配列番号３２及び配列番号３３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７及び配列番号３１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでおり、第２及び第３の抗原結合部分はＭＣＳＰ特異的に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３９及び配列番号４１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７及び配列番号５１からなる群より選択されるアミノ酸と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができ、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでおり、第２及び第３の抗原結合部分はＭＣＳＰに特異的に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
一実施態様では、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。更に特定の実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とは、更に互いに融合していてよい。
第２及び第３の抗原結合部分は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。一実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、基本的に、標的細胞抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子、及びＣＤ３に特異的に結合することができる抗原結合部分であって、任意選択的にペプチドリンカーを介して、免疫グロブリン重鎖のうちの一つのＮ末端に融合するＦａｂ分子、特にクロスオーバーＦａｂ分子である抗原結合部分からなる。
特定の実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、基本的に、第１、第２及び第３の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、ここで第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とは、更に互いに融合していてよい。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含み、第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）それぞれがＣＥＡに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２及び第３の抗原結合部分であって、配列番号２４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む第２及び第３の抗原結合部分
を含んでいる。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）各々がＣＥＡに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２及び第３の抗原結合部分であって、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第２の抗原結合部分
を含んでいる。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含み、第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）各々がＭＣＳＰに特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分であって、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ３を含む第２及び第３の抗原結合部分
を含んでいる。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）各々がＭＣＳＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２及び第３の抗原結合部分であって、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第２及び第３の抗原結合部分
を含んでいる。
上記四つの実施態様のいずれかによるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、更に、（ｉｉｉ）安定に結合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含むことができ、ここで、第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいくつかにおいては、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とが、任意選択的にリンカーペプチドを介して、互いに融合している。第１及び第２の抗原結合部分の構造によっては、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合しうる、又は第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合しうる。第１及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖の融合は更に、マッチしないＦａｂ重鎖とＦａｂ軽鎖の誤対合を低減し、また本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいくつかの発現に必要なプラスミドの数を低減する。
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第１の抗原結合部分が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含んでいる）、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））ポリペプチドと、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））ポリペプチドとを含んでいる。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（１）−ＣＬ（１））、及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））と共有するポリペプチドを含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
代替的な実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第１の抗原結合部分が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含んでいる）、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））ポリペプチドと、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））ポリペプチドとを含んでいる。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））、及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））と共有するポリペプチドを含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第１の抗原結合部分が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域が、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））ポリペプチドを含む。他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第１の抗原結合部分が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域が、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖とカルボキシ端末ペプチド結合を共有し、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））ポリペプチドを含む。また別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖が、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第１の抗原結合部分が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域が、Ｆｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））ポリペプチドを含む。他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖が、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第１の抗原結合部分が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域が、Ｆｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））ポリペプチドを含む。
これらのうちのいくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（１）−ＣＬ（１））、及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））と共有する、第１の抗原結合部分のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチドを含む。これらのうちの他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））、及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））と共有する、クロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチドを含む。これらのうちの更に他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域が第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＬ（２））ポリペプチド、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域が第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＶＬ（２）−ＣＬ（２））ポリペプチド、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＬ（２）−ＣＬ（２）−ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））ポリペプチド、又は第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＬ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＬ（１））ポリペプチドを含む。
これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３の抗原結合部分のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインのサブユニット（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））及び第３の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））と共有するポリペプチドを含みうる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
上記実施態様のいずれによっても、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（例えば、抗原結合部分、Ｆｃドメイン）の成分は、直接融合するか、又は様々なリンカー、特に一又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合する。このようなリンカーは本明細書に記載されているか、又は当該技術分野で既知である。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ，（ＳＧ４）ｎ，（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ここでｎは通常１〜１０、典型的には２〜４の数である。
Ｆｃドメイン
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリン Ｇ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインはダイマーであり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に結合することができる。一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一を超えないＦｃドメインを含む。
本発明による一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８（カバット番号付け）の位置にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビボでのＦａｂアーム交換を低減する（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)参照）。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインはヒトである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的配列は、配列番号１０７に提示されている。
ヘテロ二量体化を促すＦｃドメインの修飾
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合した複数の異なる抗原結合部分を含み、したがってＦｃドメインの二つのサブユニットは、通常二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれている。これらのポリペプチドの組換え同時発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組合わせをもたらす。したがって、組換え生成におけるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメイン内に所望のポリペプチドの会合を促す修飾を導入することが有利であろう。
即ち、特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾を含んでいる。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの二つのサブユニット間においてタンパク質−タンパク質相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインである。したがって、一実施態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で行われる。
特定の一実施態様では、前記修飾はいわゆる「ノブ−イントゥ−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を、それぞれ含んでいる。
ノブ−イントゥ−ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。通常、方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
このように、特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６の位置のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７の位置のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３６６の位置のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８の位置のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）。
また更なる実施態様ではＦｃドメインの第１のサブユニットにおいて更に、３５４の位置のセリン残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３４９の位置のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、更にダイマーを安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
特定の実施態様では、ＣＤ３に結合することができる抗原結合部分は、（任意選択的に、標的細胞抗原に結合することができる抗原結合部分を介して）Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含んでいる）に融合する。理論に縛られることを望まないが、ＣＤ３に結合することができる抗原結合部分の、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は（更に）、ＣＤ３に結合することができる二つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の生成を最小化する（二つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突）。
代替的な位置実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による二つのＦｃドメインサブユニットの接触面における一又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。
Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低減するＦｃドメインの修飾
Ｆｃドメインは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞へのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の望ましくないターゲティングの原因となりうる。更には、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出の原因となりえ、サイトカイン放出は、Ｔ細胞活性化特性及び抗原結合分子の長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化を招き、全身投与されると重い副作用性をを引き起こす。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性により、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性を更に低下させることすらある。
したがって、特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較した場合に、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。このような一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体への結合親和性を呈する、及び／又は、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の、エフェクター機能を呈する。一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の群から選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。実質的に同様のＦｃＲｎに対する結合親和性は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の約７０％、特に約８０％、更には特に約９０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。
特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較して小さな、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を有するように改変される。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低下させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる複数のアミノ酸変異が存在する一実施態様では、これらアミノ酸変異の組合せにより、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性が、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は少なくとも５０分の１にまで低下する。一実施態様では、改変されたＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、改変されていないＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較して、２０％未満、特に１０％未満、更には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を呈する。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、即ち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）がＦｃドメインの改変されていない形態（又はＦｃドメインの前記改変されていない形態を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の約７０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％、及び場合によっては約９０％を上回る親和性を呈しうる。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較してエフェクター機能が低下するように改変される。エフェクター機能の低下は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減、及びサイトカイン分泌の低下からなる群より選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低減である。一実施態様では、低減したＡＤＣＣは、改変されていないＦｃドメイン（又は改変されていないＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一実施態様では、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施態様では、ＦｃドメインはＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又は Ｐ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一位実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置にアミノ酸置換を、更にＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５の位置にアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組合せは、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（並びに補体）結合をほぼ完全に無効にする。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能といったその特性を決定する方法も記載されている。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。よって、いくつかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能を更に低下させるために、一実施態様では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、Ｌ２３５の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。このようなＩｇＧ４ Ｆｃドメインの変異及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
特定の実施態様では、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインであるか、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
特定の実施態様ではＦｃドメインのＮグリコシル化は排除されている。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＮ２９７の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）酸によりアスパラギンを置き換えるアミノ酸置換を含む。
本明細書及び国際公開第２０１２／１３０８３１号において記載されるＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低下を有するＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の二つ以上における置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
変異Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の削除、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイは本明細書に記載される。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩTM非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。或いは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように改変されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合できるかどうか、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実行される。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。
抗原結合部分
本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、即ち二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができる少なくとも二つの抗原結合部分を含む。本発明によれば、抗原結合部分はＦａｂ分子（即ち、各々が可変及び定常領域を含む重鎖と軽鎖とからなる抗原結合ドメイン）である。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒトである。別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。また別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト重鎖及び軽鎖定常領域を含む。
抗原結合部分の少なくとも一つはクロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖との誤対合を防ぎ、それにより組換え生成において本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を向上させる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常領域が交換されている。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に有用な別のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域が交換されている。
本発明による特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、及びＣＤ３に同時結合することができる。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原とＣＤ３に同時結合することにより、Ｔ細胞と標的細胞を架橋することができる。更に特定の実施態様では、このような同時結合は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を引き起こす。一実施態様では、このような同時結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。他の実施態様では、このような同時結合は、活性化マーカーの増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害性活性化、及び発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を引き起こす。一実施態様では、標的細胞への同時結合を含まないＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＣＤ３に対する結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こさない。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞の細胞傷害性活性を標的細胞へと再指向することができる。特定の一実施態様では、前記再指向は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原の提示及び／又はＴ細胞の特異性と無関係である。
特に、本発明の実施態様のいずれかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞である。
ＣＤ３結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に結合することができる少なくとも一つの抗原結合部分（本明細書では「ＣＤ３抗原結合部分」又は「第１の抗原結合部分」とも呼ぶ）を含む。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、最大で一つの、ＣＤ３に特異的に結合することができる抗原結合部分を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に対する一価の結合を提供する。ＣＤ３抗原結合は、クロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域が交換されているＦａｂ分子である。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に特異的に結合することができる、一を上回る抗原結合部分が存在する実施態様では、好ましくはＣＤ３に特異的に結合することができる抗原結合部分はクロスオーバーＦａｂ分子であり、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合部分は一般的なＦａｂ分子である。
特定の実施態様では、ＣＤ３はヒトＣＤ３（配列番号１０３）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号１０４）、特にヒトＣＤ３である。特定の実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルのＣＤ３に交差反応性（即ち、特異的に結合する）である。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３のエプシロンサブユニットに特異的に結合することができる。
ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０の群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３、配列番号３２及び配列番号３３の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号７及び配列番号３１の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含んでいる。
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３、配列番号３２及び配列番号３３の群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７及び配列番号３１の群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含んでいる。
一実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３の重鎖可変領域配列と、配列番号７の軽鎖可変領域配列とを含んでいる。
標的細胞抗原結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる少なくとも一つの抗原結合部分（本明細書では「標的細胞抗原結合部分」又は「第２の」又は「第３の」抗原結合部分とも呼ぶ）を含む。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる二つの抗原結合部分を含む。このような特定の実施態様では、これら抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に特異的に結合する。更に特定の実施態様では、これら抗原結合部分のすべては同一である。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる最大で二つの抗原結合部分を含む。
標的細胞抗原結合部分は、通常、Ｆａｂ分子、特に特異的な抗原決定基に結合して、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を標的部位、例えば抗原決定基を保持する特定の型の腫瘍細胞に方向付けることができる一般的なＦａｂ分子である。
特定の実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、細胞表面抗原に特異的に結合する。特定の実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、細胞表面抗原の膜近位領域に特異的に結合する。このような特定の実施態様では、細胞表面抗原は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、膜近位領域はＣＥＡのＢ３ドメインである（配列番号１１９の残基２０８〜２８６）。別のこのような特定の実施態様では、細胞表面抗原はメラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）であり、膜近位領域はＭＳＣＰのＤ３ドメインである（配列番号１１８）。
特定の実施態様では、標的細胞の抗原結合部分は、病状に関連付けられる抗原、例えば、腫瘍細胞又はウイルス感染細胞上に現れる抗原に方向付けられる。適切な抗原は、細胞表面抗原、例えば、限定されないが、細胞表面受容体である。特定の実施態様では、抗原はヒト抗原である。特定の実施態様では、標的細胞抗原は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ、ＣＳＰＧ４）及びがん胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５）から選択される。
いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的な少なくとも一つの抗原結合部分を含む。一実施態様では、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、配列番号１４、配列番号１５、 配列番号１６、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号４０からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０の群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
一実施態様では、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０の群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
一実施態様では、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
更なる実施態様では、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３９及び配列番号４１の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１７、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７及び配列番号５１の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含んでいる。
更なる実施態様では、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３９及び配列番号４１の群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７及び配列番号５１の群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
更なる実施態様では、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、配列番号１３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含んでいる。
一実施態様では、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
一実施態様では、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、配列番号１３の重鎖可変領域配列と配列番号１７の軽鎖可変領域配列とを含んでいる。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１２と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号５３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号５４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号５５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的な少なくとも一つの抗原結合部分を含む。一実施態様では、ＣＥＡに特異的な抗原結合部分は、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
一実施態様では、ＣＥＡに特異的な抗原結合部分は、配列番号２４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
更なる実施態様では、ＣＥＡに特異的な抗原結合部分は、配列番号２３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号２７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含んでいる。
一実施態様では、ＣＥＡに特異的な抗原結合部分は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
一実施態様では、ＣＥＡに特異的な抗原結合部分は、配列番号２３の重鎖可変領域配列と配列番号２７の軽鎖可変領域配列とを含んでいる。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号５６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号５７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号５８と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を含む。いくつかの実施態様において、前記断片は抗原結合断片である。
本発明のポリヌクレオチドは、その機能的断片又は変異体を含め、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７及び９８に規定される配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるものを含む。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、二つ以上）のポリヌクレオチドとして発現されうる。同時発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分の重鎖部分、Ｆｃドメインサブユニット、及び任意選択的に別の抗原結合部分（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされうる。同時発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して抗原結合部分を形成することができる。別の例では、二つのＦｃドメインサブユニットの一方び任意選択的に一又は複数の抗原結合部分（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分は、二つのＦｃドメインサブユニットの他方及び任意選択的に抗原結合部分（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされうる。同時発現されるとき、Ｆｃドメインサブユニットは会合してＦｃドメインを形成する。
いくつかの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体を本明細書に鬼才のようにコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるポリヌクレオチドを、本明細書に記載のようにコードする。
別の実施態様では、本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を目的とし、このポリヌクレオチドは、配列番号３、７、１３、１７、２３、２７、３１、３２、３３、３４、３６、３９、４１、４３、４６、４７又は５１に示される可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を目的とし、このポリヌクレオチドは、配列番号２２、５６、５７、５８、１２、５３、５４及び５５に示されるポリペプチド配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は更に、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリペプチド又はその断片を目的とし、このポリヌクレオチドは、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７又は９８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含む。別の実施態様では、本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を目的とし、このポリヌクレオチドは、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７又は９８に示される核酸配列を含む。別の実施態様では、本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を目的とし、このポリヌクレオチドは、配列番号３、７、１３、１７、２３、２７、３１、３２、３３、３４、３６、３９、４１、４３、４６、４７又は５１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を目的とし、このポリヌクレオチドは、配列番号２２、５６、５７、５８、１２、５３、５４又は５５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含む。本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリペプチド又はその断片を包含し、このポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を有する配列番号３、７、１３、１７、２３、２７、３１、３２、３３、３４、３６、３９、４１、４３、４６、４７又は５１の可変領域配列をコードする配列を含む。本発明はまた、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリペプチド又はその断片を包含し、このポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を有する配列番号２２、５６、５７、５８、１２、５３、５４又は５５のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖である。
組換え法
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組換え生成によって得ることができる。組換え生成のために、例えば上述したように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）（即ち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御エレメントと作動可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。二つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、二つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種コード領域をコードしうる。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合にポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合される。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連動した即初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列に由来するものを含む。更なる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができる。例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。分泌型のシグナルペプチドの例示的なアミノ酸及びポリヌクレオチド配列は配列番号１０８〜１１６に示されている。
後の精製を容易にするため又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標識化における補助のために使用されうる短タンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチドの中又は末端に含まれうる。
更なる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。そのような一実施態様において、宿主細胞は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片を生成するよう改変できるいずれかの種類の細胞系を指す。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004),及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、並びにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方を発現するように改変することができる。
一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法が提供され、この方法は、本明細書に与えられるように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、宿主細胞（又は宿主細胞培地）からＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収することを含む。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、通常互いに融合している。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように、設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見出される。必要に応じて、融合の個々の成分を分離するための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。非天然に存在する抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に生成されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を意図する場合、定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体も、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様切片で「覆い隠す」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)；Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)；Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)；Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)；Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)；Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (describing SDR (a-CDR) grafting)；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (describing “resurfacing”)；Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (describing “FR shuffling”)；及びOsbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (describing the “guided selection” approach to FR shuffling）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つそのような抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)）。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片として表示する。
特定の実施態様では、本発明において有用な抗原結合部分は、例えば米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号（この全内容を出典明記によってここに援用する）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように改変される。特定の抗原決定基に結合する本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000))及び古典的な結合アッセイ(Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）によって測定することができる。競合アッセイを、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定するため、例えばＣＤ３への結合についてＶ９抗体と競合する抗体を同定するために使用することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための典型的な方法の詳細が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ）に提供されている。例示的な競合アッセイにおいて、固定化抗原（例えばＣＤ３）は、抗原に結合する第一の標識された抗体（例えばＶ９抗体、米国特許第６０５４２９７号に記載）、及び抗原への結合について第一の抗体と競合するその能力について試験されている第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第一の標識された抗体を含むが第二の未標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、抗原への結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
本明細書で記載のように調製されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるようにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を単離するために使用されうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法の何れかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される重鎖融合タンパク質は、インタクトで、且つＳＤＳ−ＰＡＧＥの低減により実証されるように適切に構築されていることが示された（図４参照）。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖、、及び重鎖／軽鎖融合タンパク質の予測される分子量に対応する、概ねＭｒ２５０００、Ｍｒ５００００及びＭｒ７５０００における三つの帯域が分離された。
アッセイ
本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、同定され、当技術分野で既知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされる、又は特徴づけられる。
アフィニティーアッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性を、実施例に規定される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、受容体又は組み換え発現により得られるもののような標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的で例示的な実施態様は、後述及び以下の実施例に記載されている。
一実施態様によれば、ＫＤは、２５ ℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
Ｆｃ−部分とＦｃ受容体との相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグを付した組換えＦｃ受容体を、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）により捕捉し、、二重特異性コンストラクトを被分析物として使用する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給業者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、結合したタンパク質のおよそ６５００反応単位（ＲＵ）を達成するために５μｌ／分の流速で注入する。リガンドの注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。その後、Ｆｃ受容体を４又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。反応速度論的な測定のため、二重特異性コンストラクトの４倍の連続希釈物（５００ｎＭ〜４０００ｎＭの）を、２５℃のＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ ７．４）に流速３０μｌ／分で１２０秒間注入する。
標的抗原に対する親和性を決定するため、二重特異性コンストラクトを、抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体について記載したように、活性化されたＣＭ５−センサーチップ表面上に固定化されている抗ヒトＦａｂ特異性抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により捕捉する。結合したタンパク質の最終的な量は、約１２０００ＲＵである。二重特異性コンストラクトは、３００ｎＭで９０秒間捕捉される。標的抗原は、流速３０μｌ／分且つ濃度範囲２５０〜１０００ｎＭでフローセルに１８０秒間通過させる。解離を１８０秒間モニタする。
バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正される。定常応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形曲線適合により解離定数ＫＤを得た。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照のこと。
活性のアッセイ
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物活性は、実施例に記載される様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞中のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞中の活性マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍後退の誘導及び／又は生存率の改善が含まれる。
投与の組成、製剤、及び経路
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１つの追加的な治療剤を、例えば後述するように含む。
更には、インビボでの投与に適した形態の、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を製造する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得ること、及び（ｂ）少なくとも一つの薬学的に許容される担体を用いてＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を製剤化することであって、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製物が、インビボでの投与のために製剤化される、製剤化することを含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解又は分散された一又は複数のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という表現は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、即ち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも一つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990によって例示されているように、本開示内容の検知から当業者には既知であろう。この文献は参照により本明細書に包含される。更に、動物（例えば、ヒト）への投与のために、調製物は、FDA Office of Biological Standards又は他の国の対応する官庁によって必要とされる滅菌状態、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たさねばならない。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」には、当技術者に既知のように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、分解剤、潤滑剤、甘味料、香料、染料、それらの類似物質及び組合せが含まれる（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照。この文献は参照により本明細書に包含される）。いずれの一般的な担体も、活性成分と不適合でない限り、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が考慮される。
組成物は、それが固体、液体、又はエアロゾルの形態で投与されるかどうかに応じて、及びそれが注射のような投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体を含むことができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（及び任意の追加的治療剤）は、当業者に既知であるように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎臓内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜内、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、局所内、局部内に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続的注入、標的細胞を直接浸す局所的かん流により、カテーテル経由で、洗浄により、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、又は他の方法、又は上記のいずれかの組合せで投与することができる。（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990参照。この文献は参照により本明細書に包含される）。非経口投与、特に静脈内注入が、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のようなポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使用される。
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に考案されたものが含まれる。注射の場合、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーといった生理的に適合性のバッファー中において製剤化される。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。代替的には、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌ピロゲンを含まない水を用いた組成に適した粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。通常、分散液は、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、その直前の滅菌濾過された液体媒質から活性成分の粉末と任意の所望の追加的成分とを生む真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要であれば適切にバッファーリングされなければならず、十分な食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染が安全レベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な担体としては、限定されないが；リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステルが含まれる。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって作られたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入されてもよい。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。持続放出性調製物が調製される。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
上記の組成物に加えて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈材、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる一般的な方法で製剤化することができる。適当な製剤は、選択される投与経路によって決定する。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
治療的方法及び組成物
本明細書において提供されるいずれのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子も、治療法に使用することができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫療法薬剤として使用することができる。
治療法において使用される場合、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、医学行動の規範に則って製剤化、投薬、及び投与される。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の障害、治療される特定の患者、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。
一態様では、医薬としての使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。更なる態様では、疾患の治療において使用される本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の実施態様では、治療法において使用される本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明は、治療を必要とする個体の疾患の治療に使用される、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体の治療法において使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、方法は更に、個体に対して少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。更なる実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導に使用される、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するためにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法に使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、治療を必要とする個体の疾患の治療を目的とするものである。更なる実施態様において、本医薬は、疾患を有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。一実施態様では、方法は更に、個体に対し、少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。更なる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。また更なる実施態様では、医薬は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために医薬の有効量を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用を目的とする。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
更なる態様において、本発明は、疾患を治療する方法を提供する。一実施態様では、方法は、そのような疾患を有する個体に対し、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を投与することを含む。一実施態様では、薬学的に許容される形態の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、方法は更に、個体に対して少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
更なる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様では、方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞に本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を接触させることを含む。更なる態様において、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法が提供される。このような一実施態様では、方法は、標的細胞の溶解を誘導するために、個体に対してＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの非限定的な例には、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがんからなる群より選択される。当業者は、多くの場合Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は治癒をもたらさず、部分的恩恵を提供するだけであることを認識する。いくつかの実施態様では、いくつかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの実施態様では、生理的変化をもたらすＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする被検体、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
いくつかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量が細胞に投与される。他の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量が、疾患の治療のために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の適切な容量は（単独で使用されるか、或いは一又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるときの）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が予防又は治療いずれの目的で投与されるか、直前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴及びＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定される。投与の責任を負う施術者は、いずれにしろ、組成物中の活性成分の濃度及び個別の被験者に適切な用量を決定する。限定されないが、様々な時点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考慮される。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となりうる。一つの典型的な一日あたり用量は、上記要因に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一つの例示的用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。他の非限定的実施例では、用量は、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約２００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約３５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約２００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約３５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ以上及びそこから導かれるあらゆる範囲を含む。本明細書に列挙される数字から導かれる範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム〜体重１ｋｇあたり約５００ミリグラムなどが投与されうる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらのいずれかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２〜約２０投与量、又は例えば約６投与量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、一つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。この治療法の進行は従来の手法及び試験により容易にモニタされる。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、通常、意図された目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、まずは細胞培養アッセイのようなインビトロアッセイに基づいて推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するために使用することができる。
初期投与量は、インビボデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
投与の量及び間隔は、治療効果を維持するために十分なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個別に調整される。注射による投与のための通常の患者への投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日にわたる。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
局所投与又は選択的取り込みの場合、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
本明細書に記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的に有効な用量は、通常、実質的な毒性なしで治療的恩恵を提供する。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物の研究は、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために使用することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表現することができる。大きな治療指数を呈するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動しうる。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択されうる（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1参照。この文献は参照により本明細書に包含される）。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療レベルを上げるように調整することも分かっているであろう。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動する。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。更に、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答により変動する。
その他の薬剤及び治療
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与される。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも一つの追加的治療剤と共投与される。用語「治療剤」は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与されるあらゆる薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療されている特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含む。特定の実施態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
このような他の薬剤は、好適には、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、及び上記他の要因によって決まる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路において、又は本明細書に記載された用量の１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
上記のこうした併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起きうる分離投与を包含する。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性な薬剤は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を包含する組成物を中に含む第一の容器；及び（ｂ）更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を中に含む組成物を含む第２の容器を含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療するために使用できることを示すパッケージ挿入物を更に含んでいてもよい。或いは、又は加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上記に提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうることが理解される。
一般的方法
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thed., NIH Publication No. 91-3242.
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。典型的リーダーペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１０８〜１１６で示される。
ＰＢＭＣからの初代ヒトｐａｎ Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、地方血液銀行から、又は健常なヒトドナーの新鮮血から得られた濃縮したリンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。簡潔には、血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に慎重に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。室温で４５０×ｇで３０分間遠心分離した後（ブレーキをオフに切り替えて）、ＰＢＭＣを含有する界面相の上の血漿の部分を棄てた。ＰＢＭＣを新しい５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、総体積５０ｍｌになるまでチューブをＰＢＳで満たした。混合物を室温で１０分間４００×ｇ（ブレーキをオンに切り替えて）で遠心分離した。上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程は４℃で１０分間、３５０×ｇで行った）。その結果得られたＰＢＭＣ集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、インキュベーター内において、３７℃、５％ＣＯ２で１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、アッセイ開始まで保管した。
ＰＢＭＣからのＴ細胞濃縮は、製造元の指示に従って、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０９１−１５６）を用いて実行された。簡潔には、細胞ペレットを、細胞１０００万個あたり４０μｌの冷バッファー（０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ、滅菌濾過）で希釈し、細胞１０００万個あたり１０μｌのビオチン抗体カクテルで１０分間４℃でインキュベートした。細胞１０００万個あたり３０μｌの冷バッファー及び２０μｌの抗ビオチン磁気ビーズを加え、混合物を更に１５分間４℃でインキュベートした。バッファーの現在の体積の１０〜２０×を加え、続いて３００×ｇで１０分間の遠心分離工程を行うことにより細胞を洗浄した。最大１億個の細胞を５００μｌのバッファーに再懸濁した。非標識ヒトｐａｎ Ｔ細胞の磁気分離を、製造元の指示に従ってＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０４２−４０１）を用いて実行した。その結果得られたＴ細胞集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、インキュベーター内において、３７℃、５％ＣＯ２でＡＩＭ−Ｖ培地中に、アッセイ開始まで（２４時間以内）保管した。
ＰＢＭＣからの初代ヒト天然Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、地方血液銀行から、又は健常なヒトドナーの新鮮血から得られた濃縮したリンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。ＰＢＭＣからのＴ細胞濃縮は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のＮａｉｖｅ ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（＃１３０−０９３−２４４）を製造元の指示に従って用い、但し最後のＣＤ８＋Ｔ細胞の単離工程を省いて実行された（初代ヒトｐａｎ Ｔ細胞の単離についての記載も参照）。
脾細胞からのマウスｐａｎ Ｔ細胞の単離
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を単離し、ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）を含むＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃ−チューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃１３０−０９３−２３７）に移し、製造元の指示に従ってＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを用いて解離させ、単一細胞の懸濁液を得た。細胞懸濁液をプリセパレーションフィルターに通し、解離していない残りの組織粒子を除去した。４００×ｇで４分間、４℃で遠心分離した後、ＡＣＫ溶解バッファーを加えて赤血球を溶解させた（室温で５分間のインキュベーション）。残りの細胞をＭＡＣＳバッファーで２回洗浄し、カウントし、マウスｐａｎ Ｔ細胞の単離に使用した。陰性（磁気性）選択を、製造元の指示に従って、Ｐａｎ Ｔ細胞単離Ｋｉｔ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０９０−８６１）を用いて実行した。その結果得られたＴ細胞集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、更なるアッセイに直ちに使用した。
ヘパリン添加血液からの一次的カニクイザルＰＢＭＣの単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、以下のようにして健常なカニクイザルドナーの新鮮血から密度遠心分離により調製した。ヘパリン添加血液を、滅菌ＰＢＳで１：３に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地（Ａｘｏｎ Ｌａｂ＃１１１４５４５）を滅菌ＰＢＳで９０％に希釈した。希釈した血液の二つの体積を、希釈した密度勾配の一体積上に重ね、ＰＢＭＣ画分を、ブレーキなし及び室温で、３０分間にわたり５２０×ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣバンドを新しい５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、１０分間にわたる４℃で４００×ｇでの遠心分離により滅菌ＰＢＳで洗浄した。一回の低速遠心分離を実行して血小板を除去し（１５０×ｇで１５分間、４℃）、その結果得られたＰＢＭＣ集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、更なるアッセイに直ちに使用した。
標的細胞
ＭＣＳＰ標的二重特異性抗原結合分子の評価のために、以下の腫瘍細胞株、即ち：悪性メラノーマの転移部位由来の、高レベルのヒトＭＣＳＰを発現するヒトメラノーマ細胞株ＷＭ２６６−４（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６７６）；中レベルのヒトＭＣＳＰを発現するヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３（Ｒａｄｂｏｕｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎｉｊｍｅｇｅｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅの寄贈）；高レベルのＭＣＳＰを発現するヒト悪性メラノーマ（原発腫瘍）細胞株Ａ３７５（ＥＣＡＣＣ＃８８１１３００５）；ＭＣＳＰを発現しないヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４７）；及びＭＣＳＰを発現しないヒト白色人種結腸腺癌細胞株ＬＳ１８０（ＥＣＡＣＣ＃８７０２１２０２）を使用した。
ＣＥＡ標的二重特異性抗原結合分子の評価のために、以下の腫瘍細胞株、即ち：極めて高レベルのヒトＣＥＡを発現するヒト胃がん細胞株ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ＃ＡＣＣ４０９）；高レベルのヒトＣＥＡを発現するヒト膵臓腺癌細胞株ＨＰＡＦ−ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｎｕｔｌｅｙの寄贈）；中レベルのヒトＣＥＡを発現するヒト原発膵臓腺癌細胞株ＢｘＰＣ−３（ＥＣＡＣＣ＃９３１２０８１６）；中レベルのヒトＣＥＡを発現するヒト女性白色人種結腸腺癌細胞株ＬＳ−１７４Ｔ（ＥＣＡＣＣ＃８７０６０４０１）；低レベルのヒトＣＥＡを発現するヒト膵臓腺癌細胞株ＡＳＰＣ−１（ＥＣＡＣＣ＃９６０２０９３０）；（極めて）低レベルのヒトＣＥＡを発現するヒト累上皮膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４６９）；ＣＥＡを発現しないヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４７）；室内で安定にトランスフェクトされてヒトＣＥＡを発現するヒト腺癌肺胞基底上皮細胞株Ａ５４９−ｈｕＣＥＡ；及び室内で改変されてヒトＣＥＡを安定に発現するマウス結腸癌細胞株ＭＣ３８−ｈｕＣＥＡを使用した。
加えて、ヒトＴ細胞白血病細胞株であるＪｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−１５２）を使用して、細胞上での異なる二重特異性コンストラクトのヒトＣＤ３に対する結合を評価した。
実施例１
抗ＭＣＳＰ抗体Ｍ４−３／ＭＬ２の親和性成熟
オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発手順を介して親和性成熟が行われた。このために、重鎖変異体Ｍ４−３及び軽鎖変異体ＭＬ２を、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍにより記載されたものと同様、ファージミドベクター中にクローニングした（Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-4137）。ランダム化される残基は、まず古典的なホモロジーモデリングによるその抗体の３Ｄモデルを作製し、次いで重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の溶媒接近可能残基を同定することにより同定された。表１に示すトリヌクレオチド合成に基づくランダム化を伴うオリゴヌクレオチドは、Ｅｌｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。古典的なＰＣＲにより三つの独立のサブライブラリーが作製され、それらはＣＤＲ−Ｈ１とＣＤＲ−Ｈ２とに、又はＣＤＲ−Ｌ１とＤＲ−Ｌ２とに、ランダム化を含んでいた。ＣＤＲ−Ｌ３は別の手法でランダム化した。これらライブラリーのＤＮＡ断片を、制限消化及びライゲーションを介してファージミド中にクローニングし、その後ＴＧ１細菌中に電気穿孔した。
ライブラリー選択
こうして作製された抗体変異体は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として、繊維状ファージ粒子から一価型で提示された。次いで、ファージディスプレイされた変異体は、それらの生物活性（ここでは結合親和性）についてスクリーニングされ、一又は複数の改善活性を有する候補が更なる開発に使用された。ファージディスプレイライブラリーの作製方法は、Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093に見ることができる。
すべての親和性成熟ライブラリーによる選択が、以下の手順によって液中で実施された：１．各親和性成熟ライブラリーの〜１０１２個のファージミド粒子を、１００ｎＭのビオチン化ｈｕ−ＭＣＳＰ（Ｄ３ドメイン）−ａｖｉ−ｈｉｓ（配列番号１１８）に０．５時間で１ｍｌの総体積において結合させ、２．ビオチン化ｈｕ−ＭＣＳＰ（Ｄ３ドメイン）−ａｖｉ−ｈｉｓ及び特異的に結合したファージ粒子を、５．４×１０７個のストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズを１０分間加えることにより捕捉し、３．ビーズを、５〜１０×１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０及び５〜１０×１ｍｌのＰＢＳを用いて洗浄し、４．ファージ粒子を、１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ（トリエチルアミン）を加えることにより１０分間溶出し、５００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加えることにより中和させ、５．指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌を再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させ、その後ファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降させて次の選択ラウンドに使用する。選択は、一定濃度の又は漸減濃度（１０−７Ｍから２×１０−９Ｍへ）の抗原を用いて、３〜５ラウンドにわたって行った。２ラウンド目では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを用いて抗原ファージ複合体の捕捉を行った。ＥＬＩＳＡにより、以下のようにして特異的結合剤が同定された。１ウェルあたり、１００μｌの１０ｎＭビオチン化ｈｕ−ＭＣＳＰ（Ｄ３ドメイン）−ａｖｉ−ｈｉｓをニュートラアビジンプレートにコートした。Ｆａｂ含有細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いることにより、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグにより検出した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンが、９６ウェルフォーマットにおいて可溶型Ｆａｂ断片として細菌により発現され、上清には、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ）を用いたＳＰＲ分析による動態スクリーニング実験が行われた。最も高い親和性定数でＦａｂを発現するクローンが同定され、対応するファージミドが配列決定された。
表１（Ｃｙｓは常に除外され、オリゴヌクレオチドが逆プライマーであった場合にはＭｅｔ．Ｌｙｓが一番に除外された）
Figure 0006913145
Figure 0006913145
図２は、非成熟親クローンと対照させた親和性成熟抗ＭＣＳＰクローンの配列比較を示している（Ｍ４−３ ＭＬ２）。重鎖ランダム化はＣＤＲ１及び２のみで行われた。軽鎖ランダム化はＣＤＲ１及び２で、並びに独立してＣＤＲ３で行われた。
選択の間、フレームワーク内でクローンＧ３におけるＦ７１Ｙ又はクローンＥ１０におけるＹ８７Ｈのようないくつかの突然変異が起こった。
ヒトＩｇＧ１の生成及び精製
親和性成熟した変異体の重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクター中に事前挿入された定常重鎖又は定常軽鎖を有するフレームにサブクローニングした。抗体発現は、ＭＰＳＶプロモーターによりドライブされたもので、ＣＤＳの３’末端に合成ポリＡシグナル配列を有する。加えて、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有していた。
分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて哺乳動物発現ベクターによりＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をコトランスフェクトすることにより生成された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１の比で用いてトランスフェクトされた。トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含まない懸濁液中で培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予め温めておいた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１（Ｌｏｎｚａ）を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離により精製のために培養物の上清を収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持した。
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養物の上清から精製した。上清を、４０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。標的タンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）から２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ２．５）の２０カラム容量にわたる勾配中に溶出した。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填する前に濾過した。
精製したタンパク質試料のタンパク質濃度が、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定された。分子の純度及び重量が、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が、製造元の指示に従って使用された。２μｇの試料が分析に使用された。抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍのＭＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
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親和性決定
ＰｒｏｔｅＯｎ分析
ＫＤの測定を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６マシン（ＢｉｏＲａｄ）を用いた表面プラズモン共鳴アッセイにより、２５℃で、ＣＭ５チップ上へのアミン結合とそれに続く細菌上清又は精製されたＦａｂ調製物からのＦａｂの捕捉により固定化された抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９−００５−００６）を用いて行った。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給元の指示に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的捕捉抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で５０μｇ／ｍｌに希釈した後、結合した捕捉抗体タンパク質のおよそ１００００反応単位（ＲＵ）を達成するために１０μｌ／分の流速で注入した。捕捉抗体の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。反応速度論的な測定のため、細菌の上清由来のＦａｂ又は精製されたＦａｂを、１０μｌ／分の流速で３００秒間、捕捉ベースラインの安定のために３００秒の解離で注入した。捕捉レベルは１００〜５００ＲＵの範囲内であった。次の工程において、ヒトＭＣＳＰ（Ｄ３ドメイン）−ａｖｉ−ｈｉｓ被分析物を、単一濃度として、又はＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中に希釈した（１００ｎＭ〜２５０ｐＭの範囲のクローン親和性に応じて）連続する濃度として、２５℃において５０μｌ／分の流速で注入した。センサーチップの表面を、グリシン（ｐＨ１．５）を３０秒間９０μｌ／分で注入し、それに続いてＮａＯＨを２０秒間同じ流速で注入することにより再生した。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６評価ソフトウェア又はＳｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ））を用いて、結合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。このデータを使用して、親和性成熟変異体と親抗体の比較結合親和性を決定した。表３ａは、これらのアッセイから生成されたデータを示している。
軽鎖のＧ３、Ｅ１０、Ｃ５、及び重鎖のＤ６、Ａ７、Ｂ７、Ｂ８、Ｃ１が、ヒトＩｇＧ１フォーマットへの変換のために選ばれた。軽鎖のＣＤＲ１及び２を、ＣＤＲ３とは別にランダム化し、得られたＣＤＲをＩｇＧ変換の間に組み合わせた。
ＩｇＧフォーマットにおいて、ヒトＭＣＳＰ抗原（配列番号１１８）に対する親和性と、更にはカニクイザルの相同体（配列番号１１７）に対する親和性を測定した。
使用される方法は、哺乳動物産出物由来の精製されたＩｇＧだけを用いて、Ｆａｂ断片について記載された通りに使用された。
Figure 0006913145
Figure 0006913145
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いた表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）による親和性決定
親和性成熟ＩｇＧの親和性及び結合活性を決定するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。
ヒト及びカニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３に対する様々な抗ＭＣＳＰ ＩｇＧの相互作用の結合活性を分析するために、約９５００共鳴単位（ＲＵ）の抗Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）の直接結合を、標準のアミン結合キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上で実行した。抗原はそれぞれ３０ｎＭで６０秒間１０μｌ／分で捕捉された。ＩｇＧは、濃度０．００６４〜１００ｎＭ、流速３０μｌ／分で、２８０秒間にわたりフローセルに通した。解離は１８０秒間モニタした。バルク屈折率の差異を、基準フローセルにおいて得られた応答を差し引くことにより修正した。ここで、ＩｇＧは、固定化された抗Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体を有する表面上に流したが、その上にはヒトＭＣＳＰ Ｄ３又はカニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３ではなくＨＢＳ−ＥＰが注入されていた。
親和性測定のために、固定化された抗ヒトＦｃを有するＣＭ５センサーチップ表面上にＩｇＧを捕捉した。捕捉ＩｇＧは、標準のアミン結合キット（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｐＨ５．０における約９５００共鳴単位（ＲＵ）の直接的固定化により、センサーチップの表面に結合した。ＩｇＧは、１０ｎＭを３０μｌ／分で、２５秒間捕捉される。ヒト及びカニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３は、濃度０．００６４〜１００ｎＭ、流速３０μｌ／分で、１２０秒間にわたりフローセルに通した。解離は６０秒間モニタした。１６６〜５００ｎＭの濃度について、それぞれ１２００及び６００秒間、会合及び解離をモニタした。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答差し引くことにより修正された。ここで、抗原は、固定化された抗ヒトＦｃ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗ＭＣＳＰ ＩｇＧではなくＨＢＳ−ＥＰが注入されていた。
運動定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により、１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いた表面プラズモン共鳴測定により、ヒト及びカニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３に対するより高い親和性が確認された。加えて、結合活性測定値により、二価の結合に最大３倍の上昇が示された（表３ｂ）。
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実施例２
抗ＭＣＳＰ抗体としてＭ４−３（Ｃ１）ＭＬ２（Ｇ３）を、抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含むＭＣＳＰ ＴＣＢ（２＋１Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）の調製
重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。抗体発現は、ＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ＣＤＳの３’末端に合成ポリＡシグナル配列を含む。加えて、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。
分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成された。細胞は、１：２：１：１の比（「ベクター重鎖Ｆｃ（ホール）」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター重鎖Ｆｃ（ノブ）−ＦａｂＣｒｏｓｓｆａｂ」）の対応発現ベクターでトランスフェクトされた。
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１（Ｌｏｎｚａ）を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２ μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持した。
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養物の上清から精製した。上清を、４０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラムに充填した（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。標的タンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）から２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ２．５）の２０カラム体積にわたる勾配中に溶出した。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍリン酸ナトリウム、リン酸エステル、リン酸塩又はリン酸エステル（ｐＨ ８）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
精製されタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。
分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造元の指示に従って使用した。２μｇの試料を分析に使用した。
抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ 分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
Figure 0006913145
図３は、ＭＣＳＰ ＴＣＢ（２＋１Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子の模式図である。
図４及び表４ｂは、ＭＣＳＰ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子（配列番号１２、５３、５４、及び５５）のＣＥ−ＳＤＳ分析を示している。
Figure 0006913145
実施例３
抗ＣＥＡ抗体としてＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１を、抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含有するＣＥＡ ＴＣＢ（２＋１Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）の調製
重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。抗体発現は、ＭＰＳＶプロモーターによりドライブされたもので、ＣＤＳの３’末端に合成ポリＡシグナル配列を有する。加えて、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて哺乳動物発現ベクターでＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をコトランスフェクトすることにより生成された。細胞は、１：２：１：１の比で対応する発現ベクター（「ベクター重鎖Ｆｃ（ホール）」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター重鎖Ｆｃ（ｋｎｏｂ）−ＦａｂＣｒｏｓｓｆａｂ」）を用いてトランスフェクトされた。
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１（Ｌｏｎｚａ）を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持した。
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養物の上清から精製した。上清を、４０ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。標的タンパク質を、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）から２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ２．５）の２０カラム容量にわたる勾配中に溶出した。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、２０ｍＭスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填する前に濾過した。
精製したタンパク質試料のタンパク質濃度が、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定された。
分子の純度及び分子量が、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）が、製造元の指示に従って使用された。２μｇの試料が分析に使用された。
抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ 分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
Figure 0006913145
図５は、ＣＥＡ ＴＣＢ（２＋１Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子の概略図である。
図６及び表６は、ＣＥＡ ＴＣＢ（２＋１Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子（配列番号２２、５６、５７、及び５８）のＣＥ−ＳＤＳ分析を示している。
Figure 0006913145
代替的な精製方法では、ＣＥＡ ＴＣＢは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ）により、回収及び清澄化した発酵上清から捕捉された。次いでプロテインＡ溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｐｏｒｏｓ５０ＨＳ）に供し、その後プロテインＡ溶出液を分画してＳＥ−ＨＰＬＣ及びキャピラリー電気泳動により分析した。断片を含有する生成物をプールし、結合−溶出モードにおいて室温で疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ）に供した。次いでその溶出液を分画し、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びキャピラリー電気泳動により分析した。断片を含有する生成物をプールし、その後流水モードにおいて陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ）に供した。この精製方法を用いて得られた物質のモノマー含有量は＞９８％であった。
実施例４
ＭＣＳＰ発現細胞及びＣＤ３発現細胞に対するＭＣＳＰ ＴＣＢの結合
ＭＣＳＰ ＴＣＢの結合を、ＭＣＳＰ発現ヒト悪性メラノーマ細胞株（Ａ３７５）及びＣＤ３発現不死化Ｔリンパ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）において試験した。簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中、１ｍｌあたり２×１０６個の細胞に再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．２×１０６個の細胞を含有）を、漸増濃度のＭＣＳＰ ＴＣＢ（２．６ｐＭ〜２００ｎＭ）と共に丸底９６ウェルプレートで３０分間４℃でインキュベートし、冷たいＰＢＳ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＰＥ−コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＰＥ＃１０９−１１６−１７０）と共に更に３０分間４℃で再インキュベートし、冷たいＰＢＳ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＤＡＰＩ陰性の生細胞をゲーティングすることによりＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いるＦＡＣＳにより直ちに分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて結合曲線を得た（図７Ａ、Ａ３７５細胞に対する結合、ＥＣ５０＝３３８１ｐＭ；図７Ｂ、ＪｕｒｋａＴ細胞に対する結合）。
実施例５
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体により誘導されるＴ細胞死滅
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体によって媒介されるＴ細胞死滅を、異なるレベルでＭＣＳＰを発現する腫瘍細胞株のパネル（Ａ３７５＝高ＭＣＳＰ、ＭＶ−３＝中ＭＳＣＰ、ＨＣＴ−１１６＝低ＭＣＳＰ、ＬＳ１８０＝ＭＣＳＰ陰性）を用いて評価した。簡潔には、標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて収集し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて２５０００細胞／ウェルの密度で播いた。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含有する界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳを用いて２回洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ、１０分間）。その結果得られたＰＢＭＣの集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内において、３７℃、５％ＣＯ２で１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、更なる使用まで（２４時間以内）保管した。死滅アッセイのために、抗体を示された濃度（１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲で３通り）になるように加えた。ＰＢＭＣを標的細胞に、最終的なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比が１０：１となるように加えた。標的細胞の死滅を、３７℃、５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーションの後に、アポトーシス／壊死細胞による細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。結果は、ＭＣＳＰ ＴＣＢが、ＭＣＳＰ陰性細胞株を死滅させずに、強力且つ標的特異的なＭＣＳＰ陽性標的細胞株の死滅を誘導したことを示すものである（図８Ａ−Ｄ）。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて計算した死滅アッセイに関連するＥＣ５０値を表７に示す。
Figure 0006913145
実施例６
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体によって誘導されたＭＣＳＰ発現腫瘍細胞のＴ細胞死滅後の、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋エフェクター細胞上におけるＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーション
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体によって媒介されるＭＣＳＰ発現ＭＶ−３腫瘍細胞のＴ細胞死滅後の、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（初期活性化マーカー）を認識する抗体を用いたＦＡＣＳ解析により評価した。抗体及び死滅アッセイの条件は、基本的に上述した通り（実施例５）であり、同じ抗体濃度範囲（１ｐＭ〜１０ｎＭ、３通り）、Ｅ：Ｔ比１０：１、及びインキュベーション時間２４時間が使用された。
インキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８、ＢＤ＃５５５６３４）、ＣＤ４（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ４、ＢＤ＃５５７８５２）、ＣＤ６９（ＰＥ抗ヒトＣＤ６９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３１０９０６）及びＣＤ２５（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２５、ＢＤ＃５５５４３４）の表面染色を、供給者の指示に従って実行した。細胞を、０．１％ＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定化バッファー（ＢＤ＃５５４６５５）を用いて４℃で１５分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＤＡＰＩ含有ＰＢＳ０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳ測定のために死細胞を除いた。試料をＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。結果は、ＭＣＳＰ ＴＣＢが、死滅後にＣＤ８＋Ｔ細胞（図９Ａ、Ｂ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（図９Ｃ、Ｄ）上において強力且つ標的特異的な活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９）のアップレギュレーションを誘導したことを示している。
実施例７
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体によって誘導されたＭＣＳＰ発現腫瘍細胞のＴ細胞死滅後の、ヒトエフェクター細胞によるサイトカイン分泌
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体によって誘導されたＭＣＳＰ発現ＭＶ−３腫瘍細胞のＴ細胞死滅後のヒトＰＢＭＣによるサイトカイン分泌を、死滅アッセイ後に細胞上清のＦＡＣＳ解析により評価した。
同じ抗体が用いられ、基本的に上述した通りに（実施例５及び６）死滅アッセイが実行され、１０：１のＥ：Ｔ比及び２４時間のインキュベーション時間が使用された。
インキュベーション時間の最後に、プレートを３５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を新しい９６ウェルプレートに移し、−２０℃でその後の分析まで保管した。細胞上清中に分泌されたグランザイムＢ、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩにおいて製造元の指示に従い、ＢＤ ＣＢＡヒト可溶型タンパク質Ｆｌｅｘ Ｓｅｔを用いて検出した。以下のキットが使用された：ＢＤ ＣＢＡヒトグランザイムＢ ＢＤ ＣＢＡヒトグランザイムＢ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ＃ＢＤ５６０３０４；ＢＤ ＣＢＡヒトＴＮＦ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ＃ＢＤ５５８２７３；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＦＮ−γ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ＃ＢＤ５５８２６９；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−２ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ＃ＢＤ５５８２７０；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−４ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ＃ＢＤ５５８２７２；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−１０ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ＃ＢＤ５５８２７４。
結果は、ＭＣＳＰ ＴＣＢが、死滅によりＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、グランザイムＢ及びＩＬ−１０（但しＩＬ−４はなし）の分泌を誘導したことを示している（図１０Ａ−Ｆ）。
まとめると、これらの実施例はＭＣＳＰ ＣＤ３二重特異性抗体が、
・ＭＣＳＰ陽性Ａ３７５細胞に対する良好な結合を示したこと、
・強力且つ標的特異的なＭＣＳＰ陽性標的細胞株の死滅を誘導したが、ＭＣＳＰ陰性細胞株の死滅は誘導しなかったこと、
・死滅後、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞上に活性化マーカー（ＣＤ２５、Ｃｄ６９）の強力且つ標的特異的なアップレギュレーションを誘導したこと、
・死滅時に、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、グランザイムＢ及びＩＬ−１０（Ｉｌ−４はなし）の分泌を誘導したこと
を示すものである。
実施例８
ＣＥＡ−及びＣＤ３−発現細胞に対するＣＥＡ ＴＣＢの結合
ＣＥＡ ＴＣＢの結合を、トランスフェクトされたＣＥＡ−発現肺腺癌細胞（Ａ５４９−ｈｕＣＥＡ）並びにＣＤ３−発現不死化ヒト及びカニクイザルＴリンパ細胞株（それぞれＪｕｒｋａｔ及びＨＳＣ−Ｆ）上で試験した。非標的ＴＣＢ（配列番号５９、６０、６１及び６２；実施例２４参照）をコントロールとして使用した。簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌ ＰＢＳ０．１％ＢＳＡ）中、１ｍｌあたり２×１０６個の細胞で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．２×１０６個の細胞を含有）を、漸増濃度のＣＥＡ ＴＣＢ（６１ｐＭ−１０００ｎＭ）を用いて丸底９６ウェルプレートで３０分間４℃でインキュベートし、冷たいＰＢＳ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＦＩＴＣ＃１０９−０９６−０９７）を用いて更に３０分間４℃で再インキュベートし、冷たいＰＢＳ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＰＩ陰性の生細胞をゲーティングすることによりＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ又はＦｏｒｔｅｓｓａ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより直ちに分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて結合曲線を得た（図１１Ａ、Ａ５４９細胞に対する結合（ＥＣ５０ ６．６ｎＭ）；図１１Ｂ、ＪｕｒｋａＴ細胞に対する結合；図１１Ｃ、ＨＳＣ−Ｆ細胞に対する結合）。
実施例９
ＣＥＡ ＴＣＢ抗体によって誘導されるＣＥＡ発現腫瘍標的細胞のＴ細胞媒介性死滅
ＣＥＡ ＴＣＢ抗体によって誘導される標的細胞のＴ細胞媒介性死滅を、ＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）及びＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）ヒト腫瘍細胞において評価した。ＨＣＴ−１１６（ＣＥＡ陰性腫瘍細胞株）及び非標的ＴＣＢをネガティブコントロールとして使用した。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体と共になされたインキュベーションの２４時間後及び４８時間後に死滅を検出した。簡潔には、標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて１ウェルあたり細胞２５０００個の密度で播いた。細胞を一晩付着させた。末梢血単核（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含有する界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳを用いて２回洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ、１０分間）。その結果得られたＰＢＭＣの集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内において（３７℃、５％ＣＯ２）１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、更なる使用まで（２４時間以内）貯蔵した。死滅アッセイのために、抗体を指定の濃度になるように加えた（６ｐＭ〜１００ｎＭの範囲で３重に）。ＰＢＭＣを標的細胞に、最終的なＥ：Ｔの比が１０：１となるように加えた。標的細胞の死滅を、インキュベーションの２４時間後及び４８時間後に、細胞上清中に放出されたＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の、アポトーシス／壊死細胞（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，＃１１ ６４４ ７９３ ００１）による定量化により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性抗体なしでエフェクター細胞を用いてコインキュベートされた標的細胞を指す。結果は、ＣＥＡ ＴＣＢが、強力且つ標的特異的なＣＥＡ陽性標的細胞の死滅を誘導したことを示すものである（図１２Ａ−Ｈ）。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて計算した死滅アッセイに関連するＥＣ５０値を表８に示す。
Figure 0006913145
実施例１０
ＣＥＡ発現腫瘍標的細胞のＣＥＡ ＴＣＢ媒介性死滅の５日後の、Ｔ細胞増殖及び活性化
ＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）及びＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）細胞で評価されたＣＥＡ発現腫瘍標的細胞のＣＥＡ ＴＣＢ−媒介性死滅の５日後に、Ｔ細胞増殖及び活性化を検出した。ＨＣＴ−１１６（ＣＥＡ陰性腫瘍細胞株）及び非標的ＴＣＢをネガティブコントロールとして使用した。増殖アッセイの実験条件は、実施例９において記載したものと類似であったが、標的細胞は、９６平底プレートの１ウェルあたり１００００個のみ撒いた。Ｔ細胞増殖を評価するために、新しく単離したＰＢＭＣをＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ＃２１８８８）を用いて標識した。簡潔には、ＣＦＳＥ貯蔵液を希釈して１００μＭの希釈標準溶液を得た。予め温めた９０ｍｌのＰＢＳに９０×１０６個のＰＢＭＣ細胞を再懸濁し、９０μｌのＣＦＳＥ希釈標準溶液を補充した。直ちに細胞を混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。予め温めた１０ｍｌのＦＣＳを細胞に加えて反応を止めた。細胞を４００ｇで１０分間遠心分離し、５０ｍｌの培養液に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を温かい培養液で１回洗浄し、カウントし、培養液中に再懸濁し、標的細胞に加え、死滅アッセイと、続く１０：１のＥ：Ｔでの細胞増殖及び活性化の測定とを行った。増殖は、ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞上において、ＣＦＳＥ色素希釈の定量化により死滅の５日後に評価した。ＣＤ２５の発現を、抗ヒトＣＤ２５抗体を用いて同じＴ細胞サブセット上で評価した。簡潔には、遠心分離（４００×ｇで４分間）後、細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、２５μｌの希釈したＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ２５抗体混合物と共にて４℃で３０分間インキュベートした（ＡＰＣ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４＃３１７４１８、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ８＃３０１０１４、ＰＥ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ２５＃３０２６１２）。次いで細胞を３回洗浄して未結合の抗体を除去し、最後にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁して死細胞を除き、ＦＡＣＳ測定値を行った。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを用いて蛍光性を測定した。結果は、ＣＥＡ ＴＣＢが強力且つ標的特異的なＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖（図１３Ａ−Ｄ）と、ＣＤ２５活性化マーカーのアップレギュレーションにより検出されるそれらの活性化（図１３Ｅ−Ｈ）とを誘導したことを示すものであった。
実施例１１
ＣＥＡ ＴＣＢによって誘導されたＣＥＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性の死滅後の、ヒトエフェクター細胞によるサイトカイン分泌
ＣＥＡ ＴＣＢによって誘導されたＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞のＴ細胞媒介性の死滅後のヒトＰＢＭＣによるサイトカイン分泌を、死滅の４８時間後に細胞上清のＦＡＣＳ解析（ＣＢＡキット）により評価した。
実験条件は、実施例９に記載したものと同一であった。インキュベーション時間の最後に、プレートを３５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を新しい９６ウェルプレートに移し、−２０℃でその後の分析まで保管した。細胞上清中に分泌された（Ａ）ＩＦＮ−γ，（Ｂ）ＴＮＦα，（Ｃ）グランザイムＢ，（Ｄ）ＩＬ−２，（Ｅ）ＩＬ−６及び（Ｆ）ＩＬ−１０を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩにおいて製造元の指示に従い、ＢＤ ＣＢＡヒト可溶型タンパク質Ｆｌｅｘ Ｓｅｔを用いて検出した。以下のキットが使用された：ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−２ ＢＤ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ＃ＢＤ５５８２７０；ＢＤ ＣＢＡヒトグランザイムＢ ＢＤ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ＃ＢＤ５６０３０４；ＢＤ ＣＢＡヒトＴＮＦ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ＃ＢＤ５５８２７３；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＦＮ−γ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ＃ＢＤ５５８２６９；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−４ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５５８２７２；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−１０ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ＃ＢＤ５５８２７４。
結果は、ＣＥＡ ＴＣＢ媒介性の死滅がＩＦＮ−γ ＴＮＦα、グランザイムＢ、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びＩＬ−１０（図１４Ａ−Ｆ）の分泌を誘導したことを示すものである（非標的ＴＣＢコントロールは死滅を媒介しなかった）。
実施例１２
漸増濃度のｓｈｅｄ ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）の存在下における標的細胞のＴ細胞媒介性死滅
漸増濃度のｓｈｅｄ ＣＥＡ（ｓＣＥＡ２．５ｎｇ／ｍｌ−５μｇ／ｍｌ）の存在下においてＣＥＡ ＴＣＢ抗体によって誘導されるＣＥＡ発現腫瘍標的細胞（ＬＳ１８０）のＴ細胞媒介性死滅を評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、二重特異性抗体及びｓＣＥＡと共になされたインキュベーションの２４時間後及び４８時間後に死滅を検出した。簡潔には、標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて１ウェルあたり細胞２５０００個の密度で播いた。細胞を一晩付着させた。末梢血単核（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいＦａｌｃｏｎチューブに移した後、５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳを用いて２回洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ、１０分間）。その結果得られたＰＢＭＣの集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内において（３７℃、５％ ＣＯ２）１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、更なる使用まで（２４時間以内）貯蔵した。死滅アッセイのために、ＣＥＡ ＴＣＢ抗体を１ｎＭの固定濃度で使用し、ｓＣＥＡを２．５ｎｇ〜５μｇ／ｍｌの濃度範囲で実験にスパイクした。ＰＢＭＣを標的細胞に、最終的なＥ：Ｔの比が１０：１となるように加えた。標的細胞の死滅を、インキュベーションの２４時間後及び４８時間後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性抗体なしでエフェクター細胞を用いてコインキュベートされた標的細胞を指す。ｓＣＥＡの非存在下においてＣＥＡ ＴＣＢによって媒介された死滅を１００％に設定し、漸増濃度のｓＣＥＡの存在下において得られた死滅をそれに合わせて正規化した。結果は、ｓＣＥＡがＣＥＡ発現標的細胞のＣＥＡ ＴＣＢ媒介性死滅に小さな影響しか与えなかったことを示すものである（図１５Ａ、Ｂ）。０．２μｇ／ｍｌまでのｓＣＥＡではＴ細胞死滅に対する影響は検出されなかった。０．２μｇ／ｍｌを上回るｓＣＥＡ濃度も、全体の死滅に小さな影響しか持たなかった（１０〜５０％の低減）。
実施例１３
ヒト及びカニクイザルのＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた標的細胞のＴ細胞媒介性死滅
ＣＥＡ ＴＣＢ抗体とエフェクター細胞としてのヒトＰＢＭＣ又はカニクイザルＰＢＭＣと共になされたインキュベーションの２１時間後及び４０時間後に評価されたヒトＣＥＡを過剰発現するＡ５４９（肺腺癌）細胞（Ａ５４９−ｈＣＥＡ）のＴ細胞媒介性死滅を評価した。簡潔には、標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて１ウェルあたり細胞２５０００個の密度で播いた。細胞を数時間付着させた。末梢血単核（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナー又は健常なカニクイザルから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。以降は、９０％のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−ＰＢＳ密度勾配が使用された。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。遠心分離（ヒトＰＢＭＣの場合は４５０×ｇ、３０分間、室温で、カニクイザルＰＢＭＣの場合は５２０×ｇ、３０分間、室温で）後、ＰＢＭＣ含有界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいＦａｌｃｏｎチューブに移した後、５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳを用いて２回洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ、１０分間）。カニクイザルＰＢＭＣの調製のために、追加の低速遠心分離工程を１５０×ｇで１５分間実行した。その結果得られたＰＢＭＣの集団を、自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）し、細胞インキュベーター内において（３７℃、５％ＣＯ２）１０％ ＦＣＳ及び１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中において更なる使用まで（４時間以内）保存した。死滅アッセイのために、抗体を指定の濃度になるように６ｐＭ〜１００ｎＭの範囲で３重に）。ＰＢＭＣを標的細胞に、最終的なＥ：Ｔ比が１０：１となるようにえた。標的細胞の死滅を、インキュベーションの２１時間後及び４０時間後に、細胞上清中に放出されたＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の、アポトーシス／壊死細胞（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）による定量化により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝ ０％）は、二重特異性抗体なしでエフェクター細胞を用いてコインキュベートされた標的細胞を指す。結果は、ＣＥＡ ＴＣＢが、ヒト（図１６Ａ、Ｃ）及びカニクイザル（図１６Ｂ、Ｄ）エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）の両方を使用して、ＣＥＡ陽性標的細胞の標的特異的な死滅を媒介したことを示すものである。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて算出された、４０時間の死滅に関するＥＣ５０値は、ヒトＰＢＭＣの場合は３０６ｐＭであり、カニクイザルＰＢＭＣの場合は１０２ｐＭである。
実施例１４
ＣＥＡ ＴＣＢ抗体によって誘導されるＣＥＡ−発現ヒト結腸直腸がん細胞株のＴ細胞媒介性死滅
ヒトＰＢＭＣと、０．８ｎＭ、４ｎＭ及び２０ｎＭのＣＥＡ ＴＣＢ抗体とを用いたインキュベーションの４８時間後の、ＣＥＡ発現ヒト結腸直腸がん細胞株のＴ細胞媒介性死滅を評価した。簡潔には、ＰＢＭＣを、単一の健常ドナーから得た白血球コーンから単離した。細胞を、ＰＢＳ（１：１０）で希釈し、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ内でＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ上に重ねた。遠心分離（１８００ｒｐｍで２５分間）後、ＰＢＭＣ層を接触面から取り除き、ＰＢＳで４回洗浄した。ＰＢＭＣをカウントし、１ｍＬあたり４０×１０６個の細胞に制御された速度の凍結条件下でＦＣＳ中において１０％ ＤＭＳＯで凍結させ、更なる使用まで液体窒素中に保管した。Ｔ細胞死滅アッセイのために、凍結したストックから腫瘍細胞を直接９６ウェルプレートに播いた。細胞を急速に温め、直ぐに予め温めた培地中に移し、遠心分離し、完全培地（ＤＭＥＭ，Ｉｓｃｏｖｅｓ又はＲＰＭＩ−１６４０、すべて１０％ＦＣＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充）中に再懸濁し、１ウェルあたり２．５×１０４個の細胞という密度で播いた。次いでプレートを、加湿した１０％ＣＯ２インキュベーター内において３７℃でインキュベートし、培地を翌日１％グルタミン及び５０μＬ ＣＥＡ ＴＣＢを含む１００μＬのＲＰＭＩ ２％ＦＣＳ（６．４〜２００００ｐＭの最終濃度、１：５の滴定工程、各条件につき二つのウェル）で置き換えた。アッセイには新しく解凍したＰＢＭＣを使用し（アッセイ開始前２時間以内に凍結したバイアルから解凍）、各ウェルに５０μＬ（３×１０５）を加え、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を１０：１にした。トリトンＸ１００（４％を５０μＬ）を１５０μＬの標的細胞に加え、最大放出値を得た。プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、死滅活性を、製造元の指示に従いラクトースデヒドロゲナーゼ細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。特異的細胞溶解割合を、［試料放出−自然放出］／［最大放出−自然放出］×１００で計算した。図１７Ａ〜Ｃは、ＣＥＡ発現（ＱＩＦＩＫＩＴを用いて定量化した受容体コピー数、以下参照）と３１の結腸直腸がん細胞株（ｘ軸上に列挙）の％死滅との相関を示している。図１７Ｄは、ＣＥＡ発現とＣＥＡ ＴＣＢ２０ｎＭにおける％特異的溶解との相関（スピアマンの相関＝０．７２８９、ｐ＜０．０００１、ｎ＝３１）を示しており、大きなＣＥＡ受容体コピー数（＞５００００）を呈する腫瘍細胞がＣＥＡ ＴＣＢにより効率的に溶解する一方、小さなＣＥＡ受容体コピー数（＜１００００）を呈する細胞のクラスタが同じ実験条件下でＣＥＡ ＴＣＢにより溶解しないことが示されている。図１７Ｅは、ＣＥＡ発現とＣＥＡ ＴＣＢのＥＣ５０との相関を示している。相関は統計的には有意でないが（スピアマンの相関＝−０．３９９４、ｐ＝０．１００６、Ｒ２＝０．１３５８）、グラフは、大きなＣＥＡ受容体コピー数を発現する腫瘍細胞株ほど良好なＣＥＡ ＴＣＢ効力（即ち、ＥＣ５０値が低い）を有するというパターンを明らかに示している。
がん細胞株におけるＣＥＡ表面発現の分析のために、Ｑｉｆｉｋｉｔ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して蛍光性シグナルを較正し、細胞毎の結合部位の数を決定した。細胞を、マウス抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５モノクローナル抗体（５×１０５細胞について０．５μｇ、クローン：ＣＩ−Ｐ８３−１、ｓｃ−２３９２８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と共に氷上で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ１Ｘ−ＢＳＡ０．１％で２回洗浄した後、Ｑｉｆｉｋｉｔで提供されたポリクローナルフルオレセインイソチオシアネート−コンジュゲートヤギ抗マウス抗体と共に４５分間インキュベートした。死細胞を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色を用いて分析から除いた。試料をＣｙＡｎTMＡＤＰ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。すべての平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、Ｓｕｍｍｉｔ４．３ソフトウェアを用いたデータ解析後に得られた。これらＭＦＩは、較正曲線（Ｑｉｆｉｋｉｔキャリブレーション用ビーズ）から得られた等式を用いて細胞株上の抗体結合部位の相対数（結果的ＣＥＡコピー数と呼ぶ）を決定するために使用された。
Ｔ細胞死滅アッセイ及びＣＥＡ表面発現定量化に使用される結腸直腸がんの細胞株は、クリオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）から播種した。凍結ストックを維持するために使用される方法は、Ｂｒａｃｈｔら（Bracht et al.(2010), Br J Cancer 103, 340-346）に記載されていた。
実施例１５
ヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ比５：１）を共移植したＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２ヒト結腸癌におけるＣＥＡ ＴＣＢのインビボでの抗腫瘍効果
ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）マウス（ｎ＝１２）に対し、予めヒトＰＢＭＣと混合した、ＰＢＳ中総体積１００μｌ、Ｅ：Ｔ比５：１の、１ｘ１０６個のＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２細胞を皮下注射した。ＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２細胞は、ルシフェラーゼを発現するように改変されており、バイオルミネセンス（ＢＬＩ）により非侵襲的且つ高度に感受性に腫瘍進行をモニタすることができた。早期及び遅延治療効果を評価するために、マウスは、腫瘍細胞／ＰＢＭＳの皮下共移植後１日目（早期治療）又は７日目（遅延治療）を開始日として、２週間に１回０．５又は２．５ｍｇ／ｋｇのＣＥＡ ＴＣＢを静脈内注入された。コントロールとして、１グループのマウスは、２週間に１回ＣＥＡ ＴＣＢと同じフォーマットを有する２．５ｍｇ／ｋｇのコントロールＴＣＢを静脈内注入され（この場合、ＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２細胞はＭＣＳＰを発現しないため、ＭＣＳＰ ＴＣＢは非標的コントロールの役割を果たした）、もう１つのコントロールグループは１日目を開始日としてＰＢＳ（ビヒクル）のみを投与された。腫瘍体積はデジタルキャリパーにより週に一度測定した。更に、マウスにはＤ−ルシフェリンを週に一度腹腔内注入し、生腫瘍細胞のバイオルミネセンス光の発光をＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。治療は腫瘍細胞接種の１９日後まで行われ、この日に試験を終了した。実験の結果を図１８Ａ〜Ｄに示す。結果は、異なる試験グループ（（Ａ、Ｂ）早期治療、（Ｃ、Ｄ）遅延治療）における、キャリパーにより（Ａ及びＣ）、及びバイオルミネセンスにより（全光束、Ｂ及びＤ）測定した１２匹のマウスの腫瘍体積に基づく平均及びＳＥＭを示している。
実施例１６
ヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ比１：１）を共移植したＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２ヒト結腸癌におけるＣＥＡ ＴＣＢのインビボでの抗腫瘍効果
ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）マウス（ｎ＝１０）に対し、ヒトＰＢＭＣと予め混合した、ＰＢＳ中総体積１００μｌ、Ｅ：Ｔ比１：１の、１×１０６個のＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２細胞を皮下注射した（実施例１５参照）。早期及び遅延治療効果を評価するために、マウスは、腫瘍細胞インキュベーション後１日目（早期治療）又は７日目（遅延治療）を開始日として、２週間に１回２．５ｍｇ／ｋｇのＣＥＡ ＴＣＢを静脈内注入された。コントロールとして、１グループのマウスは２週間に１回２．５ｍｇ／ｋｇのＭＣＳＰ ＴＣＢを静脈内注入され（実施例１５参照）、もう一つのコントロールグループは１日目からＰＢＳ（ビヒクル）のみを投与された。腫瘍体積はデジタルキャリパーにより週に一度測定した。更に、マウスにはＤ−ルシフェリンを週に一度腹腔内注入し、生腫瘍細胞のバイオルミネセンス光の発光をＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。治療は腫瘍細胞接種の２３日後まで行われ、この日に試験を終了した。この実験の結果を図１９に示す。結果は、異なる試験群（ｎ＝１０匹）における、キャリパー（Ａ）及びバイオルミネセンス（Ｂ）により測定された腫瘍体積の平均及びＳＥＭを示している。
実施例１７
免疫担当性ｈｕＣＤ３ε／ｈｕＣＥＡ トランスジェニックマウスのＰａｎｃｏ２−ｈｕＣＥＡ同所性腫瘍モデルにおけるマウス化ＣＥＡ ＴＣＢのインビボでの有効性
ｈｕＣＤ３ε／ｈｕＣＥＡトランスジェニックマウス（ｎ＝１０）に対し、ＰＢＳ中総体積１０μｌの、２×１０５個のＰａｎｃｏ２−ｈｕＣＥＡ細胞を膵臓内注入した。マウス細胞はＣＥＡを発現しないので、マウスの膵臓癌細胞株Ｐａｎｃｏ２を、ＣＥＡ ＴＣＢの標的抗原としてヒトＣＥＡを過剰発現するように改変した。マウスには、１週間に２度、０．５ｍｇ／ｋｇのマウス化ＣＥＡ ＴＣＢを、又はコントロールグループ（ビヒクル）としてＰＢＳを静脈内注入し、生存率をモニタした。動物は、臨床症状及び有害作用の検出について毎日コントロールされた。動物の終了基準は、視認できる病気、即ち汚い毛皮、曲がった背中、呼吸不全、運動障害であった。全生存としての結果を図２０に示す。結果は、各時点の生存動物の割合を示している。対応スチューデントｔ検定を用いて（ｐ＝０．０７８）、治療群の有意性をＰＢＳコントロールグループと比較した。
実施例１８
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、ＣＥＡ及びＣＤ３に対するＣＥＡ ＴＣＢの親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
親和性測定のために、固定化された抗ヒトＦａｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃２８−９５８３−２５）を用いてＣＥＡ ＴＣＢをＣＭ５センサーチップ表面に捕捉した。捕捉ＩｇＧは、標準のアミン結合キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｐＨ５．０での約１００００共鳴単位（ＲＵ）の直接的固定化により、センサーチップの表面に結合した。
ヒトＣＤ３ε ｓｔａｌｋ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３δ−ｓｔａｌｋ−Ｆｃ（ホール）（それぞれ、配列番号１２０及び１２１）への相互作用を分析するために、５０ｎＭのＣＥＡ ＴＣＢを１０μｌ／分で３０秒間捕捉した。ＣＤ３ε／ＣＤ３δは、濃度０．６８〜５００ｎＭ、流速３０μｌ／分で、３６０秒間にわたりフローセルに通した。解離を３６０秒間モニタした。
ＣＥＡ ＴＣＢと組換え腫瘍標的抗原ヒトＮＡＢＡ−ａｖｉ−ｈｉｓ（Ｃ末端ａｖｉ ６ｈｉｓタグを有するヒトＣＥＡＣＡＭ１のＮ、Ａ１及びＡ２ドメインによって取り囲まれたヒトＣＥＡのＢ３ドメイン（ＣＥＡＣＡＭ５）を含有；配列番号１１９参照）との相互作用のＫＤ値を、１０μｌ／分で４０秒間ＴＣＢ分子を捕捉することにより決定した。０．６８〜５００ｎＭの濃度範囲の抗原を、流速３０μｌ／分でフローセルに２４０秒間流した。解離を２４０秒間モニタした。
バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答差し引くことにより修正された。ここで、抗原は、固定化された抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面に流したが、その上には、ＣＥＡではなく、ＨＢＳ−ＥＰが注入されていた。
運動定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により、１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。相互作用の半減期（ｔ１／２）を、式：ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｆｆを用いて計算した。
ＣＥＡ ＴＣＢは、ｎＭ−範囲で腫瘍標的及びＣＤ３ε／ＣＤ３δに結合し、ＫＤ値はヒトＮＡＢＡについては６２ｎＭ、ヒトＣＤ３ε／ＣＤ３δについては７５．３ｎＭであった。ＮＡＢＡに対する一価の結合の半減期は５．３分であり、ＣＤ３ε／ＣＤ３δに対する結合の半減期は５．７分である。動態値を表９にまとめる。
Figure 0006913145
実施例１９
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＭＣＳＰ及びＣＤ３に対するＭＳＣＰ ＴＣＢの親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
親和性測定のために、固定化された抗ヒトＦａｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃２８−９５８３−２５）を用いてＭＣＳＰ ＴＣＢをＣＭ５センサーチップ表面に捕捉した。捕捉ＩｇＧは、標準のアミン結合キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｐＨ５．０における約７５００共鳴単位（ＲＵ）の直接的固定化により、センサーチップの表面に結合した。ＭＳＣＰ ＴＣＢは、３０ｎＭを１０μｌ／分で６０秒間捕捉した。ヒト及びカニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３（それぞれ、配列番号１１８及び１１７）は、濃度０．０２４〜５０ｎＭ、流速３０μｌ／分で、９０秒間にわたりフローセルに通した。ヒト及びカニクイザルのＣＤ３ε ｓｔａｌｋ−Ｆｃ（ｋｎｏｂ）−Ａｖｉ／ＣＤ３δ−ｓｔａｌｋ−Ｆｃ（孔）の濃度範囲は１．１７〜６００ｎＭであった。マウスＭＣＳＰ Ｄ３（配列番号１２２）との相互作用は弱いと思われたため、この抗原の濃度範囲を３．９〜５００ｎＭに選択した。すべての相互作用の解離を１２０秒間モニタした。バルク屈折率の差異を、基準フローセルで得られる応答を差し引くことにより修正した。ここで、抗原は、固定化された抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面に流したが、その上には、ＭＣＳＰ ＴＣＢではなく、ＨＢＳ−ＥＰが注入された。
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により、１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。ＭＣＳＰ ＴＣＢのマウスＭＣＳＰ Ｄ３との相互作用を、定常状態において決定した。相互作用の半減期（ｔ１／２）を、式：ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｆｆを用いて計算した。
ＭＣＳＰ ＴＣＢは、ｐＭ範囲の腫瘍標的に、ヒトについては０．１５ｎＭ、カニクイザル抗原については０．１２ｎＭのＫＤ値で結合した。組換えＣＤ３ε／ＣＤ３δには、７８ｎＭ（ヒト）及び１０４ｎＭ（カニクイザル）のＫＤ値でＭＣＳＰ ＴＣＢが結合する。一価の結合の半減期は、腫瘍標的については最大２６０分、及びＣＤ３ｅ／ＣＤ３ｄについては２．９分である。親和性成熟すると、ＭＣＳＰ抗体は組換えマウスＭＣＳＰ Ｄ３にいくらか結合する。この相互作用のＫＤ値はｍＭ範囲（１．６ｍＭ）内である。動態値を表１０にまとめる。
Figure 0006913145
実施例２０
ＣＥＡ ＴＣＢの熱的安定性
ＣＥＡ ＴＣＢの熱的安定性を、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）によりモニタした。タンパク質濃度０．５ ｍｇ／ｍｌの３０μｇの濾過済みタンパク質試料を二つ、Ｄｙｎａｐｒｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＵＳＡ）に適用した。温度勾配は、０．０５℃／分で２５から７５℃であり、半径及び総散乱強度が収集された。
結果を図２１に示す。ＣＥＡ ＴＣＢの凝集温度は５５℃で測定された。
実施例２１
ＭＣＳＰ ＴＣＢの熱的安定性
ＭＣＳＰ ＴＣＢの熱的安定性を、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）によりモニタした。タンパク質濃度０．５ ｍｇ／ｍｌの３０μｇの濾過済みタンパク質試料を二つ、Ｄｙｎａｐｒｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＵＳＡ）に適用した。温度勾配は、０．０５℃／分で２５から７５℃であり、半径及び総散乱強度が収集された。
結果を図２２に示す。ＭＣＳＰ ＴＣＢの凝集温度は５５℃で測定された。
実施例２２
ＭＣＳＰ ＴＣＢ及びＭＣＳＰ１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体によって誘導されるＭＣＳＰ発現腫瘍標的細胞のＴ細胞媒介性死滅
ＭＣＳＰ ＴＣＢ及びＭＣＳＰ１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢ（ＭＣＳＰ ＴＣＢと同じＣＤ３及びＭＣＳＰ結合配列を有し、分子フォーマットが図１Ｄに示されるＴ細胞活性化二重特異性抗体）抗体によって誘導される標的細胞のＴ細胞媒介性死滅を、Ａ３７５（高ＭＣＳＰ）、ＭＶ−３（中ＭＣＳＰ）及びＨＣＴ−１１６（低ＭＣＳＰ）腫瘍標的細胞において評価した。ＬＳ１８０（ＭＣＳＰ陰性腫瘍細胞株）をネガティブコントロールとして使用した。腫瘍細胞の死滅を、抗体及びエフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）を用いた標的細胞のインキュベーションの２４時間後及び４８時間後に評価した。簡潔には、標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて１ウェルあたり細胞２５０００個の密度で播いた。細胞を一晩付着させた。末梢血単核（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいＦａｌｃｏｎチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳを用いて２回洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ、１０分間）。その結果得られたＰＢＭＣの集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内において（３７℃、５％ＣＯ２）１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、更なる使用まで（２４時間以内）貯蔵した。死滅アッセイのために、抗体を指定の濃度になるように加えた（０．０１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲で３重に）。ＰＢＭＣを標的細胞に、最終的なＥ：Ｔの比が１０：１となるように加えた。標的細胞の死滅を、インキュベーションの２４時間後及び４８時間後に、細胞上清中に放出されたＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の、アポトーシス／壊死細胞（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）による定量化により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性抗体なしでエフェクター細胞を用いてコインキュベートされた標的細胞を指す。結果は、ＭＣＳＰ ＴＣＢが両時点ですべての腫瘍標的細胞に対してより強力なＭＣＳＰ陽性標的細胞の死滅を誘導することから、ＭＣＳＰ ＴＣＢの能力がＭＣＳＰ１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢより高いことを示している（図２３Ａ−Ｈ）。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて計算された死滅アッセイに関するＥＣ５０値を表１１に示す。
Figure 0006913145
実施例２３
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体及びＭＣＳＰ１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体によって誘導されたＭＣＳＰ−発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅後の、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋エフェクター細胞上におけるＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーション
ＭＣＳＰ ＴＣＢ及びＭＣＳＰ１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体によって媒介されるＭＣＳＰ−発現腫瘍細胞（Ａ３７５及びＭＶ−３）のＴ細胞死滅後の、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（初期活性化マーカー）を認識する抗体を用いたＦＡＣＳ解析により評価した。抗体及び死滅アッセイの条件は、基本的に上述した通り（実施例２２）であり、同じ抗体濃度範囲（０．０１ｐＭ〜１０ｎＭ、３重）、Ｅ：Ｔ比１０：１、及び４８時間のインキュベーション時間）を用いた。
インキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８、ＢＤ＃５５５６３４）、ＣＤ４（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ４、ＢＤ＃５５７８５２）、ＣＤ６９（ＰＥ抗ヒトＣＤ６９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３１０９０６）及びＣＤ２５（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２５、ＢＤ ＃５５５４３４）の表面染色を、供給者の指示に従って実行した。細胞を、０．１％ＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定バッファー（ＢＤ＃５５４６５５）を用いて４℃で１５分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＤＡＰＩ含有ＰＢＳ０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳ測定のために死細胞を除いた。試料をＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。結果は、ＭＣＳＰ ＴＣＢが、死滅後にＣＤ８＋Ｔ細胞（図２４Ａ、Ｂ（Ａ３７５細胞）及びＥ、Ｆ（ＭＶ−３細胞））上、並びにＣＤ４＋Ｔ細胞（図２４Ｃ、Ｄ（Ａ３７５細胞）及びＧ、Ｈ（ＭＶ−３細胞））上において強力且つ標的特異的な活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９）のアップレギュレーションを誘導したことを示している。死滅の結果に関して、Ｔ細胞の活性化は、ＭＣＳＰ ＴＣＢの方がＭＣＳＰ１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂより強力であった。
実施例２４
非結合抗体としてＤＰ４７ ＧＳを、抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含有する、ＤＰ４７ ＧＳ ＴＣＢ（２＋１Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型＝「非標的ＴＣＢ」）の調製
上記実験では「非標的ＴＣＢ」をコントロールとして使用した。二重特異性抗体は、ＣＤ３εに結合するが、他のいずれの抗原にも結合しないので、Ｔ細胞をいずれの標的細胞にも架橋させることができない（且つその後死滅をまったく誘導することができない）。したがって、二重特異性抗体は、任意の非特異的Ｔ細胞活性化をモニタするためのアッセイにおいてネガティブコントロールとして使用された。
重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。抗体発現は、ＭＰＳＶプロモーターによりドライブされ、ＣＤＳの３’末端に合成ポリＡシグナル配列を有する。加えて、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。
分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて哺乳動物発現ベクターによりＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をコトランスフェクトすることにより生成された。細胞は、１：２：１：１の比で、対応する発現ベクター（「ベクター重鎖Ｆｃ（ホール）」「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター重鎖Ｆｃ（ノブ）−ＦａｂＣｒｏｓｓｆａｂ」）を用いてトランスフェクトされた。
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含まない懸濁液で培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離した。上清は、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により置き換える。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１（Ｌｏｎｚａ）を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持した。
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養物の上清から精製した。上清を、４０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。標的タンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）から２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ ２．５）の２０カラム容量にわたる勾配中に溶出した。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍリン酸ナトリウム、リン酸エステル、リン酸塩又はリン酸エステル（ｐＨ ８）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填する前に濾過した。
精製したタンパク質試料のタンパク質濃度が、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定された。
分子の純度及び分子量が、還元剤の存在下及び非存在下においてＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）が、製造元の指示に従って使用された。２μｇの試料が分析に使用された。
抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ 分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
Figure 0006913145
図２５及び表１３は、非結合抗体としてＤＰ４７ ＧＳを、及び抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含有するＤＰ４７ ＧＳ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ 反転型）のＣＥ−ＳＤＳ分析を示している。（配列番号５９、６０、６１及び６２）。
Figure 0006913145
前述の発明は、理解を明確にするために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。すべての特許及び本明細書に引用される科学文献の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に包含される。

Claims (18)

  1. 疾病の治療を必要とする患者における疾病の治療に使用するための、ＣＤ３及びＣＥＡに特異的に結合することができるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む医薬であって、
    Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２の配列を含む２つのポリペプチド、配列番号５６の配列を含む１つのポリペプチド、配列番号５７の配列を含む１つのポリペプチド、及び配列番号５８の配列を含む１つのポリペプチドを含み、かつ
    疾病は、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、大腸がん（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、大腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮がん、骨がん、及び腎臓がんから選択されるがんである、
    医薬。
  2. 疾病は、大腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）である、請求項１に記載の医薬。
  3. 疾病は、肺がんである、請求項１に記載の医薬。
  4. 疾病は、膵臓がんである、請求項１に記載の医薬。
  5. 疾病は、胃がんである、請求項１に記載の医薬。
  6. 疾病は、乳がんである、請求項１に記載の医薬。
  7. 疾病の治療を必要とする患者における疾病の治療に使用するための医薬の製造のための、ＣＤ３及びＣＥＡに特異的に結合することができるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用であって、
    Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２の配列を含む２つのポリペプチド、配列番号５６の配列を含む１つのポリペプチド、配列番号５７の配列を含む１つのポリペプチド、及び配列番号５８の配列を含む１つのポリペプチドを含み、かつ
    疾病は、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、大腸がん（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、大腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮がん、骨がん、及び腎臓がんから選択されるがんである、
    使用。
  8. 疾病は、大腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）である、請求項７に記載の使用。
  9. 疾病は、肺がんである、請求項７に記載の使用。
  10. 疾病は、膵臓がんである、請求項７に記載の使用。
  11. 疾病は、胃がんである、請求項７に記載の使用。
  12. 疾病は、乳がんである、請求項８又は９に記載の使用。
  13. がんを治療するための、ＣＤ３及びＣＥＡに特異的に結合することができるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む医薬であって、
    Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２の配列を含む２つのポリペプチド、配列番号５６の配列を含む１つのポリペプチド、配列番号５７の配列を含む１つのポリペプチド、及び配列番号５８の配列を含む１つのポリペプチドを含み、かつ
    疾病は、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、大腸がん（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、大腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮がん、骨がん、及び腎臓がんから選択されるがんである、
    医薬。
  14. 疾病は、大腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）である、請求項１３に記載の医薬。
  15. 疾病は、肺がんである、請求項１３に記載の医薬。
  16. 疾病は、膵臓がんである、請求項１３に記載の医薬。
  17. 疾病は、胃がんである、請求項１３に記載の医薬。
  18. 疾病は、乳がんである、請求項１３に記載の医薬。
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