KR20180023035A - 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본원은 일반적으로 T 세포 활성화 및 특이적 표적 세포로의 방향 전환을 위한 신규한 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본원은 상기 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본원은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 생산하는 방법, 및 질환의 치료시 이러한 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

이중특이적 T 세포 활성화 항원 결합 분자{BISPECIFIC T CELL ACTIVATING ANTIGEN BINDING MOLECULES}
본 발명은 일반적으로 T 세포를 활성화시키는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 생산하는 방법, 및 질환의 치료에 있어서 이러한 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.
개별 세포 또는 특정 세포 유형의 선택적 파괴는 종종 다양한 임상적 환경에서 바람직하다. 예를 들면, 건강한 세포 및 조직을 온전한 손상되지 않은 상태로 남기면서 종양 세포를 특이적으로 파괴하는 것이 암 치료의 일차 목적이다.
이를 달성하는 흥미로운 방법은 종양에 대한 면역 반응을 유도함으로써 면역 효과기 세포, 예컨대, 천연 살해(NK) 세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL) 공격을 유발하고 종양 세포를 파괴하는 것이다. CTL은 면역계의 가장 강력한 효과기 세포를 구성하지만, 통상적인 치료 항체의 Fc 도메인에 의해 매개되는 효과기 기작에 의해 활성화될 수 없다.
이와 관련하여, 하나의 "아암(arm)"으로 표적 세포 상의 표면 항원에 결합하고 두 번째 "아암"으로 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화 불변 성분에 결합하도록 디자인된 이중특이적 항체가 최근에 관심을 끌고 있다. 이러한 항체와 이의 표적들 둘다의 동시적인 결합은 표적 세포와 T 세포 사이의 일시적인 상호작용을 발생시켜, 임의의 세포독성 T 세포의 활성화 및 표적 세포의 후속 용해를 야기할 것이다. 따라서, 면역 반응은 표적 세포로 방향 전환되고, CTL의 일반적인 MHC-제한된 활성화에 대해 관련되므로 표적 세포에 의한 펩티드 항원 제시 또는 T 세포의 특이성과 무관하다. 이와 관련하여, 표적 세포가 이중특이적 항체를 CTL에 제시할 때, 즉 면역학적 시냅스가 모방될 때에만 CTL이 활성화된다는 것은 매우 중요하다. 표적 세포의 효율적인 용해를 이끌어내기 위해 림프구 전처리화 또는 보조자극을 요구하지 않는 이중특이적 항체가 특히 바람직하다.
여러 이중특이적 항체 포맷이 개발되었고, T 세포 매개된 면역치료에 대한 이들의 적합성이 연구되었다. 이들 중에서 소위 BiTE(이중특이적 T 세포 개입유발자) 분자는 매우 잘 특징화되어 있고 이미 임상에서 일부 가능성을 보여주었다(문헌[Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260(2011)]에서 검토됨). BiTE는 2개의 scFv 분자들이 유연성 연결기에 의해 융합되어 있는 탠덤(tandem) scFv 분자이다. T 세포 개입에 대해 평가되는 추가 이중특이적 포맷은 다이아바디(문헌[Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305(1996)]) 및 이의 유도체, 예컨대, 탠덤 다이아바디(문헌[Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66(1999)])를 포함한다. 보다 최근의 개발은 다이아바디 포맷에 근거하지만 추가 안정화를 위한 C-말단 다이설파이드 가교를 특징으로 하는 소위 DART(이중 친화성 재표적화) 분자이다(문헌[Moore et al., Blood 117, 4542-51(2011)]). 전체 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자이고 현재 임상 시험에서 평가되고 있는 소위 트라이오맙(triomab)은 보다 큰 크기의 포맷을 대표한다(문헌[Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467(2010)]에서 검토됨).
개발되고 있는 다양한 포맷은 면역치료에서 T 세포 방향 전환 및 활성화에 기인하는 큰 잠재력을 보여준다. 그러나, 그에 적합한 이중특이적 항체를 발생시키는 작업은 결코 쉽지 않고 항체의 효능, 독성, 적용가능성 및 생산가능성과 관련되어 충족되어야 하는 다수의 과제들을 수반한다.
작은 구축물, 예컨대, BiTE 분자는 효과기와 표적 세포를 효율적으로 가교결합시킬 수 있지만 매우 짧은 혈청 반감기를 가지므로, 연속 관주에 의해 환자에게 투여될 필요가 있다. 다른 한편으로, IgG-유사 포맷은 긴 반감기라는 큰 이점을 갖지만 IgG 분자에 내재하는 천연 효과기 기능과 관련된 독성을 갖는다. 이들의 면역원성 잠재력은 성공적인 치료제 개발에 있어서 IgG-유사 이중특이적 항체, 특히 비인간 포맷의 또 다른 불리한 특징을 구성한다. 마지막으로, 이중특이적 항체의 일반적인 개발에 있어서 주요 과제는 이중특이적 항체 구축물을 임상적으로 충분한 양 및 순도로 제조하는 것인데, 이는 정확히 조립된 구축물의 수율을 감소시키고 원하는 이중특이적 항체를 분리하기 어려울 수 있는 다수의 비기능성 부산물을 초래하는, 공발현(co-expression)시 상이한 특이성의 항체 중쇄와 경쇄의 미스페어링(mispairing) 때문이다.
T 세포 매개된 면역치료를 위해 현재 사용가능한 이중특이적 항체들과 관련된 어려움 및 단점이 존재하는 한, 이러한 분자들의 신규 개선된 포맷에 대한 필요성이 남아있다. 본 발명은 낮은 독성 및 유리한 약동학적 성질과 함께 우수한 효능 및 생산가능성을 겸비하는, T 세포 활성화 및 방향 전환을 위해 디자인된 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
제 1 양상에서, 본 발명은 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(i) 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및
(ii) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티.
일 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 3, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 7 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 암배아 항원(CEA, CEACAM5)에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 MCSP(CSPG4)에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 흑색종-관련된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP, CSPG4)에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 13, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17, 서열번호 43, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이다. 더욱더 특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이다.
일 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다.
추가 특정한 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 항원 결합 모이어티는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 존재한다(즉, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3에 결합하는 1가를 제공한다).
추가 실시양태에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 제 3 항원 결합 분자는 통상적인 Fab 분자이다. 일 실시양태에서, 상기 제 3 항원 결합 분자는 제 2 항원 결합 모이어티와 동일하다.
특정한 실시양태에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함하고, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함하고, 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함하고, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함하고, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함하고, 서열번호 13, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17, 서열번호 43, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함하고, 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제 1 항원 결합 모이어티와 제 2 항원 결합 모이어티는, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해, 서로 융합되어 있다. 일 상기 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 또 다른 상기 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. (i) 제 2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있거나, (ii) 제 1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 실시양태에서, 추가로 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄와 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄가, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해, 서로 융합될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (iii) 안정된 회합을 할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 FC 도메인을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있다.
일 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 항원 결합 분자의 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 또 다른 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 항원 결합 분자의 제 1 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있고, 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분들은 직접적으로 융합될 수 있거나 적합한 펩티드 연결기를 통해 융합될 수 있다. 일 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티, 제 3 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다.
특정한 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 IgG 클래스 면역글로불린이다. 보다 특정한 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG1 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG4 서브클래스 면역글로불린이다.
특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 S228P[EU 넘버링]를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다.
특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 제 1 Fc 도메인 서브유닛과 제 2 Fc 도메인 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함한다. 구체적인 상기 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 아미노산 잔기는 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티(cavity)에 위치할 수 있는 돌출부(protuberance)를 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생시키고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 캐비티를 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생시킨다.
특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 비조작된 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 일 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 내의 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235 및 P329(EU 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 존재한다. 특정한 실시양태에서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 이때 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다. 일 상기 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 2개의 아미노산 치환을 포함하고, 이때 상기 아미노산 치환은 L235E 및 P329G이다. 일 상기 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인인고, 아미노산 치환 L235E 및 S228P(SPLE)를 포함한다.
일 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 FcγRIIa, FcγRI 및/또는 FcγRIIIa이다. 일 실시양태에서, 효과기 기능은 항체-의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)이다
본 발명의 또 다른 양상에 따라, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포괄한다. 본 발명은 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포이다.
또 다른 양상에서, a) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 b) 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 생산하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포괄한다.
본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학 조성물을 사용하는 방법을 포괄한다. 일 양상에서, 본 발명은 약제로서 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물을 제공한다. 일 양상에서, 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용되는 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물이 제공된다. 특정한 실시양태에서, 상기 질환은 암이다.
또한, 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도뿐만 아니라, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 약학적으로 허용가능한 형태로 포함하는 조성물을 치료 효과량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법도 제공된다. 특정한 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서, 개체는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
또한, 본 발명은 T 세포, 특히 표적 세포를 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 세포독성 T 세포의 존재 하에 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(TCB)의 예시적 입체구조를 보여준다. (A)는 "1+1 IgG 교차fab" 분자의 실례를 보여준다. (B)는 "2+1 IgG 교차fab" 분자의 실례를 보여준다. (C)는 교차fab 및 Fab 성분을 교대로 갖는("도립된") "2+1 IgG 교차fab" 분자의 실례를 보여준다. (D)는 "1+1 교차Mab" 분자의 실례를 보여준다. (E)는 "2+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄" 분자의 실례를 보여준다. (F)는 "1+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄" 분자의 실례를 보여준다. (G)는 "도립된 2+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄" 분자의 실례를 보여준다. (H)는 "도립된 1+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄" 분자의 실례를 보여준다. 흑색 점: 이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 내의 임의적 변형.
도 2는 비성숙된 모 클론(M4-3 ML2)과 비교하여 친화성 성숙된 항-MCSP 클론의 정렬을 도시한다.
도 3은 MCSP TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA) 분자의 도식도이다.
도 4는 MCSP TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA, 서열번호 12, 53, 54 및 55)의 CE-SDS 분석을 도시한다. 일렉트로페로그램(Electropherogram)은 MCSP TCB의 SDS-페이지로서 나타낸다: A) 감소되지 않음, B) 감소됨.
도 5는 CEA TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA) 분자의 도식도이다.
도 6은 CEA TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA, 서열번호 22, 56, 57 및 58) 분자의 CE-SDS 분석을 도시한다. 일렉트로페로그램은 CEA TCB의 SDS-페이지로서 나타낸다: A) 감소되지 않음, B) 감소됨.
도 7은 A375 세포(MCSP+)(A) 및 Jurkat(CD3+ 세포)(B)에 대한 MCSP TCB(서열번호 12, 53, 54 및 55)의 결합을 도시한다. "비표적화된 TCB": 이중특이적 항체는 CD3을 유도하지만 제 2 항원(서열번호 59, 60, 61 및 62)을 유도하지 않는다.
도 8a 및 8b는 A375(고 MCSP)(A), MV-3(중간 MCSP)(B), HCT-116(저 MCSP)(C) 및 LS180(MCSP 음성)(D) 표적 세포(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 항온처리 시간 24시간)의 MCSP TCB 항체(서열번호 12, 53, 54 및 55) 유도된 T 세포 사멸을 도시한다. "비표적화된 TCB": 이중특이적 항체는 CD3을 유도하지만 제 2 항원(서열번호59, 60, 61 및 62)을 유도하지 않는다.
도 9a 및 9b는 MCSP TCB 항체(서열번호 12, 53, 54 및 55)에 의해 유도된 MV3 흑색종 세포(E:T = 10:1, 24시간 항온처리)의 T 세포 매개된 사멸 후, 인간 CD8+(A, B) 및 CD4+(C, D) T 세포에서 CD25 및 CD69의 상향조절을 도시한다. "비표적화된 TCB": 이중특이적 항체는 CD3을 유도하지만 제 2 항원(서열번호 59, 60, 61 및 62)을 유도하지 않는다.
도 10a 및 10b는 MCSP TCB 항체(서열번호 12, 53, 54 및 55)에 의해 유도된 MV3 흑색종 세포(E:T = 10:1, 24시간 항온처리)의 T 세포 매개된 사멸 후, 인간 PBMC에 의한 IL-2(A), IFN-γ(B), TNFα(C), IL-4(D), IL-10(E) 및 그랜자임(Granzyme) B(F)의 분비를 도시한다. "비표적화된 TCB": 이중특이적 항체는 CD3을 유도하지만 제 2 항원(서열번호 59, 60, 61 및 62)을 유도하지 않는다.
도 11은 CEA-발현 A549 폐 선암종 세포(A) 및 CD3-발현 불멸화된 인간 및 시아노몰구스 T 임파 세포주(각각 Jurkat(B)및 HSC-F(C))에 대한 CEA TCB(서열번호 22, 56, 57 및 58)의 결합을 도시한다.
도 12a 내지 12d는 HPAFII(고 CEA)(A, E), BxPC-3(중간 CEA)(B, F), ASPC-1(저 CEA)(C, G) 및 HCT-116 세포(CEA 음성)(D, H)의 CEA TCB(서열번호 22, 56, 57 및 58)에 의해 유도된 T 세포 사멸을 도시한다. E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 항온처리 시간 24시간(A 내지 D) 또는 48시간(E 내지 H). "비표적화된 TCB": 이중특이적 항체는 CD3을 유도하지만 제 2 항원(서열번호 59, 60, 61 및 62)을 유도하지 않는다.
도 13a 내지 13b는 인간 CD8+ 및 CD4+ T 세포 증식(A 내지 D) 및 CEA TCB(서열번호 22, 56, 57 및 58)에 의해 유도된 HPAFII(고 CEA)(A, E), BxPC-3(중간 CEA)(B, F), ASPC-1(저 CEA)(C, G) 및 HCT-116 세포(CEA 음성)(D, H)의 T 세포 매개된 사멸로부터 5 일 후, 인간 CD8+ 및 CD4 T 세포(E 내지 H)에서 CD25의 상향조절을 도시한다. "DP47 TCB": 이중특이적 항체는 CD3을 유도하지만 제 2 항원(서열번호 59, 60, 61 및 62)을 유도하지 않는다.
도 14a 및 14b는 CEA TCB(서열번호 22, 56, 57 및 58)에 의해 유도된 MKN45 종양 세포(E:T = 10:1, 48시간 항온처리)의 T 세포 매개된 사멸 후, IFN-γ(A), TNFα(B), 그랜자임 B(C), IL-2(D), IL-6(E) 및 IL-10(F)의 분비를 도시한다. "비표적화된 TCB": 이중특이적 항체는 CD3을 유도하지만 제 2 항원(서열번호 59, 60, 61 및 62)을 유도하지 않는다.
도 15는 shed CEA(sCEA)의 농도 증가하에, CEA TCB 및 sCEA로 항온처리로부터 24시간(A) 또는 48시간(B) 후 검출된 CEA TCB(서열번호 22, 56, 57 및 58)에 의해 유도된 CEA-발현 LS180 종양 표적 세포의 T 세포 매개된 사멸을 도시한다.
도 16a 내지 16b는 CEA TCB(서열번호 22, 56, 57 및 58) 및 효과기 세포로서 인간 PBMC(A, C) 또는 시아노몰구스 PBMC(B, D)로 항온처리로부터 21시간(A, B) 및 40시간(C, D) 후 평가된 A549(폐 선암종) 세포 과발현 인간 CEA(A549-hCEA)의 T 세포 매개된 사멸을 도시한다.
도 17a 내지 17d는 0.8 nM(A), 4 nM(B) 및 20 nM(C)에서 CEA TCB(서열번호 22, 56, 57 및 58)에 의해 유도된 CEA-발현 인간 결장암 세포의 T 세포 매개된 사멸을 도시한다. (D)는 20 nM의 CEA TCB에서 CEA 발현과 특이적 용해율(%) 사이의 관계를 나타내고, (E)는 CEA TCB의 CEA 발현과 EC50 사이의 관계를 나타낸다.
도 18a 및 18b는 인간 PBMC(E:T 비 = 5:1)와 공접합된 LS174T-fluc2 인간 결장암에서 CEA TCB(서열번호 22, 56, 57 및 58)의 생체 내 항종양 효능을 도시한다. 상기의 결과는 1일에 초기 치료를 시작하고(A, B), 7일에 지연된 치료를 시작하는(C, D) 상이한 연구 군에서 캘리퍼(A 및 C) 및 생물발광[토탈 플럭스(Total Flux), B 및 D)에 의해 측정된 12 마리 마우스의 종양 부피의 평균 및 SEM을 나타낸다. MCSP TCB(서열번호 12, 53, 54 및 55)를 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 19는 인간 PBMC(E:T 비 = 1:1)와 공접합된 LS174T-fluc2 인간 결장암에서 CEA TCB(서열번호 22, 56, 57 및 58)의 생체 내 항종양 효능을 도시한다. 상기의 결과는 상이한 연구 군에서 캘리퍼(A) 및 생물발광(토탈 플럭스, B)에 의해 측정된 10 마리 마우스의 종양 부피의 평균 및 SEM을 나타낸다. MCSP TCB(서열번호 12, 53, 54 및 55)를 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 20은 면역성 huCD3ε/huCEA형질변환 마우스의 Panco2-huCEA 정위 종양 모델에서 뮤린화된 CEA TCB의 생체 내 효능을 도시한다.
도 21은 CEA TCB의 열 안정성을 도시한다. 25 내지 75℃의 램프 온도에서 0.05℃/분으로 동적 광 산란을 측정하였다. 중복을 회색으로 나타내었다.
도 22는 MCSP TCB의 열 안정성을 도시한다. 25 내지 75℃의 램프 온도에서 0.05℃/분으로 동적 광 산란을 측정하였다. 중복을 회색 선으로 나타내었다.
도 23a 내지 23d는 A375(고 MCSP)(A), MV-3(중간 MCSP)(B) 및 HCT-116(저 MCSP)(C) 종양 표적 세포의 MCSP TCB(서열번호 12, 53, 54 및 55) 및 MCSP 1+1 교차Mab TCB 항체에 의해 유도된 T 세포 매개된 사멸을 도시한다. LS180(MCSP 음성 종양 세포주)(D)을 음성 대조군으로서 사용하였다. 표적 세포를 항체 및 효과기 세포(인간 PBMC)로 항온처리하고 24시간(A 내지 D) 및 48시간(E 내지 H) 후 종양 세포 사멸을 평가하였다.
도 24a 내지 24d는 MCSP TCB(서열번호 12, 53, 54 및 55) 및 MCSP 1+1 교차Mab TCB 항체에 의해 매개된 MCSP-발현 종양 세포(A375: A 내지 D 및 MV-3: E 내지 H)의 T 세포 사멸 후 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 CD25 및 CD69의 상향조절을 도시한다.
도 25는 비결합 항체로서 DP47 GS 및 항-CD3 항체로서 인간화된 CH2527을 함유하는 DP47 GS TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA = "비표적화된 TCB" 서열번호 59, 60, 61 및 62)의 CE-SDS 합성을 도시한다. 일렉트로페로그램은 DP47 GS TCB의 SDS-페이지로서 나타낸다: A) 감소되지 않음, B) 감소됨.
정의
하기에서 달리 정의되어 있지 않은 한, 용어들은 당분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 분자"는 그의 가장 넓은 의미에서 항원성 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 이의 유도체, 예를 들면, 단편이다.
용어 "이중특이적"은 항원 결합 분자가 2개 이상의 상이한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위들을 포함하고, 상기 부위들 각각은 상이한 항원성 결정인자에 대해 특이적이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원성 결정인자, 특히 2개의 상이한 세포 상에서 발현된 2개의 항원성 결정인자에 동시적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "원자가"는 항원 결합 분자에 특정된 수의 항원 결합 부위가 존재한다는 것을 표시한다. 따라서, 용어 "항원과의 1가 결합"은 항원에 대해 특이적인 하나(및 하나 이하)의 항원 결합 부위가 항원 결합 분자에 존재한다는 것을 표시한다.
"항원 결합 부위"는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들면, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함한다. 천연 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 모이어티"는 항원성 결정인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 일 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 그 자신에 부착된 물질(예를 들면, 제 2 항원 결합 모이어티)이 표적 부위, 예를 들면, 항원성 결정인자를 보유하는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 간질(stroma)로 향하게 할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 그의 표적 항원, 예를 들면, T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 항원 결합 모이어티는 본원에 더 정의된 바와 같은 항체 및 이의 단편을 포함한다. 구체적인 항원 결합 모이어티는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 본원에 더 정의되어 있고 당분야에서 공지되어 있는 바와 같은 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 하기 5종의 동종형들 중 임의의 동종형을 포함한다: α, δ, ε, γ 및 μ. 유용한 경쇄 불변 영역은 하기 2종의 동종형들 중 임의의 동종형을 포함한다: κ 및 λ.
본원에서 사용된 용어 "항원성 결정인자"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이고, 항원 결합 모이어티가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들면, 아미노산의 연속 스트레치 또는 비연속 아미노산의 상이한 영역들로 구성된 입체구조적 배열)를 지칭한다. 유용한 항원성 결정인자는 예를 들면, 종양 세포의 표면 상에, 바이러스-감염된 세포의 표면 상에, 다른 병든 세포의 표면 상에, 면역 세포의 표면 상에, 혈액 혈청 내에 자유롭게 및/또는 세포외 매트릭스(ECM) 내에서 발견될 수 있다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 항원으로서 지칭된 단백질(예를 들면, MCSP, CEA, CD3)은 포유동물, 예컨대, 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터 유래된 임의의 천연 형태 단백질일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정 단백질이 언급되는 경우, 상기 용어는 "전장" 비프로세싱된 단백질뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 발생되는 임의의 형태의 단백질도 포괄한다. 상기 용어는 단백질의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체도 포괄한다. 항원으로서 유용한 예시적 인간 단백질은 하기 단백질을 포함하나 이로 한정되지 않는다: 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4로서도 공지된 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)[CSPG4, 유니프롯(UniProt) 번호 Q6UVK1(버전 70), NCBI RefSeq 번호 NP_001888.2]; 암배아 항원 관련 세포 부착 분자 5로서도 공지된 암배아 항원(CEA)[CEACAM5, 유니프롯 번호 P06731(버전 119), NCBI RefSeq 번호 NP_004354.2]; 및 CD3, 특히 CD3의 엡실론 서브유닛[유니프롯 번호 P07766(버전 130) 참조, NCBI RefSeq 번호 NP_000724.1, 인간 서열의 경우 서열번호 103; 또는 유니프롯 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI 진뱅크 번호 BAB71849.1, 사이노몰구스(필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) 서열)의 경우 서열번호 104]. 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 종들의 CD3 또는 표적 항원 사이에 보존되어 있는 CD3 또는 표적 세포 항원의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3 및 CEACAM5에 결합하지만, CEACAM1 또는 CEACAM6에 결합하지 않는다. "특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이고 원치 않거나 비특이적인 상호작용으로부터 구별될 수 있다는 것을 의미한다. 특이적 항원성 결정인자에 결합하는 항원 결합 모이어티의 능력은 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 알려진 다른 기법, 예를 들면, (비아코어 기계 상에서 분석되는) 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329(2000)]) 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002)])를 통해 측정될 수 있다. 일 실시양태에서, 항원 결합 모이어티와 관련없는 단백질의 결합 정도는 예를 들면, SPR에 의해 측정되었을 때 항원 결합 모이어티와 항원의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티, 또는 상기 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하 또는 0.001 nM 이하(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"친화성"은 분자(예를 들면, 수용체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들면, 리간드) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원(예를 들면, 항원 결합 모이어티와 항원, 또는 수용체와 그의 리간드) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 그의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 속도 상수 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 따라서, 상기 속도 상수의 비가 동일하게 유지되는 한, 동등한 친화성은 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 방법을 포함하는, 당분야에서 공지된 잘 확립된 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화성을 측정하는 구체적인 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR)이다.
"감소된 결합", 예를 들면, Fc 수용체와의 감소된 결합은 예를 들면, SPR에 의해 측정되었을 때 각각의 상호작용에 대한 친화성의 감소를 지칭한다. 명료함을 위해, 상기 용어는 0(또는 분석 방법의 검출 한계 미만), 즉 상호작용의 완전한 제거까지의 친화성의 감소도 포함한다. 대조적으로, "증가된 결합"은 각각의 상호작용에 대한 결합 친화성의 증가를 지칭한다.
본원에서 사용된 "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 지칭한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 측정하기에 적합한 분석은 본원에 기재된 바와 같이 당분야에서 공지되어 있다.
본원에서 사용된 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들면, 종양 내의 세포, 예컨대, 암세포 또는 종양 간질 세포의 표면에서 제시된 항원성 결정인자를 지칭한다.
본원에서 항원 결합 모이어티 등과 관련하여 사용된 용어 "제 1" 및 "제 2"는 각각 하나 초과의 유형의 모이어티가 존재할 때 구별의 편리함을 위해 사용된다. 달리 명시되어 있지 않은 한, 이들 용어들의 사용은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정 순서 또는 배향을 부여하기 위한 것이 아니다.
"Fab 분자"는 면역글로불린의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인(Fab 중쇄) 및 경쇄의 VL 및 CL 도메인(Fab 경쇄)으로 구성된 단백질을 지칭한다.
"융합된"은 성분(예를 들면, Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)이 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 연결기를 통해 펩티드 결합에 의해 연결되어 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "단일 쇄"는 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 모이어티 중 하나는 단일 쇄 Fab 분자, 즉 Fab 경쇄와 Fab 중쇄가 펩티드 연결기에 의해 연결되어 단일 펩티드 쇄를 형성하는 Fab 분자이다. 구체적인 상기 실시양태에서, Fab 경쇄의 C-말단은 단일 쇄 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N-말단에 연결되어 있다.
"교차" Fab 분자("교차fab"로도 지칭됨)는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되어 있는 Fab 분자를 의미한다(즉, 교차 Fab 분자는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 쇄를 포함한다). 명료함을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역들이 교환되어 있는 교차 Fab 분자에서 중쇄 불변 영역을 포함하는 펩티드 쇄는 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄"로서 지칭된다. 대조적으로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역들이 교환되어 있는 교차 Fab 분자에서 중쇄 가변 영역을 포함하는 펩티드 쇄는 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄"로서 지칭된다.
이와 대조적으로, "통상적인" Fab 분자는 이의 천연 포맷, 즉, 중쇄 가변 및 불변 영역(VH-CH1)으로 구성된 중쇄, 및 경쇄 가변 및 불변 영역(VL-CL)으로 구성된 경쇄를 포함하는 Fab 분자를 의미한다.
용어 "면역글로불린 분자"는 천연 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, IgG 클래스의 면역글로불린은 다이설파이드 결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 영역(VH)에 이어서 중쇄 불변 영역으로도 지칭되는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 영역(VL)에 이어서 경쇄 불변 영역으로도 지칭되는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)로 지칭되는 5종의 유형 중 하나로 배정될 수 있고, 이러한 유형 중 일부는 하위유형, 예를 들면, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2종의 유형 중 하나로 배정될 수 있다. 면역글로불린은 본질적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된 2개의 Fab 분자들 및 1개의 Fc 도메인으로 구성된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 항체 구조물을 포괄한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는, 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 다이아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자(예를 들면, scFv), 및 단일 도메인 항체가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 일부 항체 단편의 검토를 위해서는 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134(2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315(1994)]을 참조하고, WO 93/16185 및 US 5,571,894 및 US 5,587,458도 참조한다. 살비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해서는 US 5,869,046을 참조한다. 다이아바디는 2가일 수 있거나 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들면, EU 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134(2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448(1993)]을 참조한다. 트라이아바디 및 테트라바디도 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134(2003)]에 기재되어 있다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체[도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 메사추세츠주 왈탐 소재; 예를 들면, US 6,248,516 B1 참조]이다. 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이 온전한 항체의 단백질용해성 분해 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 파지)에 의한 제조를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 기법들에 의해 제조될 수 있다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 항원의 일부 또는 전부의 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부를 지칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 지칭됨)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Kindt et al., KubyImmunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열 면에서 초가변성을 갖고/갖거나 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4쇄 항체는 6개의 HVR(VH 내의 3개 HVR(H1, H2 및 H3) 및 VL 내의 3개 HVR(L1, L2 및 L3))을 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함하고, 이때 후자는 가장 높은 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 관여한다. VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역(HVR)은 "상보성 결정 영역"(CDR)으로도 지칭되고, 이들 용어들은 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 일부를 언급하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 특정 영역은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and HumanServices, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)] 및 문헌[Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 기재되어 있고, 이때 정의는 서로에 대해 비교되었을 때 아미노산 잔기들의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있기 위한 것이다. 상기 인용된 참고문헌들 각각에 의해 정의된 CDR을 구성하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 A에 기재되어 있다. 특정 CDR을 구성하는 정확한 잔기 수는 상기 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어졌을 때 어떤 잔기가 특정 CDR을 구성하는 지를 상용적으로 확인할 수 있다.
[표 A]
CDR 정의1
Figure pat00001
카밧 등의 문헌은 임의의 항체에 적용될 수 있는 가변 영역 서열에 대한 넘버링 시스템도 정의하였다. 당해 분야에서 통상의 기술을 가진 자는 서열 자체 이외의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않으면서 이 "카밧 넘버링" 시스템을 임의의 가변 영역 서열에 명확히 배정할 수 있다. 본원에서 사용된 "카밧 넘버링"은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and HumanServices, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)]에 기재된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 특정되어 있지 않은 한, 항체 가변 영역 내의 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 언급은 카밧 넘버링 시스템에 따른다.
서열목록의 폴리펩티드 서열은 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링되어 있지 않다. 그러나, 서열목록의 서열의 넘버링을 카밧 넘버링으로 전환시키는 것은 당분야에서 통상의 기술 범위 내에 있다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 하기 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH(또는 VL)f로 하기 순서로 나타낸다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
항체 또는 면역글로불린의 "클래스"는 그의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 하기 5종의 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스(동종형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 Cys226 또는 Pro230부터 중쇄의 카복실-말단까지 걸쳐 있는 것으로 정의된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정되어 있지 않은 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 지수로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다. 본원에서 사용된 Fc 도메인의 "서브유닛"은 안정한 자가 결합을 형성할 수 있는, 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드들 중 하나, 즉 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 제 1 서브유닛과 제 2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형"은 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드가 결합하여 동종이량체를 형성하는 것을 감소시키거나 방해하는, Fc 도메인 서브유닛의 펩티드 프레임워크 조작 또는 번역 후 변형이다. 본원에서 사용된 결합을 촉진하는 변형은 특히 원하는 2개의 Fc 도메인 서브유닛(즉, Fc 도메인의 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛) 각각이 결합하도록 만들어진 별도의 변형들을 포함하고, 이때 상기 변형들은 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 회합을 촉진하도록 서로 상보적이다. 예를 들면, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인 서브유닛의 결합을 각각 입체적으로 또는 정전기적으로 유리하게 만들도록 상기 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 또는 둘다의 구조 또는 전하를 변형시킬 수 있다. 따라서, (이종)이량체화는 서브유닛(예를 들면, 항원 결합 모이어티) 각각에 융합된 추가 성분이 동일하지 않다는 의미에서 동일하지 않을, 제 1 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드와 제 2 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드 사이에 일어난다. 일부 실시양태에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 각각에서 별도의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다.
용어 "효과기 기능"은 항체 동종형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC), 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 섭취, 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "조작한다", "조작된" 및 "조작하는"은 천연 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 임의의 펩티드 프레임워크 조작 또는 번역 후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작은 아미노산 서열, 글리코실화 패턴 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변형뿐만 아니라 이들 방법들의 조합도 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포괄하기 위한 것이다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들면, Fc 수용체와의 감소된 결합 또는 또 다른 펩티드와의 증가된 결합을 보유하는 한, 최종 구축물에 도달하기 위해 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합을 만들 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 구체적인 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들면, Fc 영역의 결합 특성을 변경시키기 위한 목적으로, 비보존적 아미노산 치환, 즉 한 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비천연 아미노산에 의한 치환 또는 20종의 표준 아미노산의 천연 아미노산 유도체(예를 들면, 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-하이드록시라이신)에 의한 치환을 포함한다. 당분야에서 잘 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 이용하여 아미노산 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 유전적 방법은 부위-지정된 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 아미노산의 측쇄 기를 유전적 조작 이외의 방법, 예컨대, 화학적 변형으로 변경시키는 방법도 유용할 수 있다고 생각된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 표시하기 위해 다양한 표기들이 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들면, Fc 도메인의 위치 329에서 프롤린을 글리신으로 치환시키는 것은 329G, G329, G329, P329G 또는 Pro329Gly로서 표시될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 (펩티드 결합으로서도 공지된) 아미드 결합에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산으로 구성된 임의의 쇄를 지칭하고, 특정 길이의 생성물을 지칭하지 않는다. 따라서, 2개 이상의 아미노산으로 구성된 쇄를 지칭하기 위해 사용되는 펩티드, 다이펩티드, 트라이펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄" 또는 임의의 다른 용어가 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어들 중 임의의 용어 대신에 또는 이러한 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질용해성 절단, 또는 비천연 아미노산에 의한 변형을 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리펩티드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하기 위한 것이다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 재조합 기술에 의해 제조될 수 있지만, 반드시 표기된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 폴리펩티드는 화학적 합성을 포함하는 임의의 방식으로 발생될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 크기는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상 또는 2,000개 이상의 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원적 구조를 가질 수 있지만 반드시 이러한 구조를 갖지는 않는다. 정의된 3차원적 구조를 갖는 폴리펩티드는 접혀진(folded) 폴리펩티드로서 지칭되고, 정의된 3차원적 구조를 보유하지 않는 폴리펩티드는 오히려 다수의 상이한 입체구조를 채택할 수 있고 접혀지지 않은(unfolded) 폴리펩티드로서 지칭된다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 변이체, 또는 이의 유도체는 그의 천연 환경에서 존재하지 않는 폴리펩티드를 의미하기 위한 것이다. 특정한 수준의 정제가 요구되지는 않는다. 예를 들면, 단리된 폴리펩티드는 그의 천연 상태 또는 천연 환경으로부터 분리될 수 있다. 재조합적으로 제조된 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현된 단백질은 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획화되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드처럼 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
기준 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당분야의 기술 내에 있는 다양한 방식, 예를 들면, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign[디엔에이스타(DNASTAR)] 소프트웨어를 이용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 퍼센트 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2의 이용을 통해 발생된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 소스 코드는 미국 저작권 협회(U.S. Copyright Office, 미국 워싱톤 디씨 20559 소재)에 사용자 문서로 출원되었고, 상기 미국 저작권 협회에서 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수될 수 있거나 상기 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 작동 시스템 상에서 사용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터들은 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변형되지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 퍼센트 아미노산 서열 동일성(대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 분율 X/Y
여기서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 정렬에서 상기 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치(match)로서 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 존재하는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우, B에 대한 A의 퍼센트 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 퍼센트 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않을 것임이 인식될 것이다. 달리 구체적으로 명시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 퍼센트 아미노산 서열 동일성 값들은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램의 이용을 통해 바로 이전 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "폴리펩티드"는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA), 바이러스로부터 유래된 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비통상적인 결합(예를 들면, 아미드 결합, 예컨대, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들면, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 환경으로부터 분리되어 있는 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미하기 위한 것이다. 예를 들면, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예에는 이종 숙주 세포 내에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 분자를 통상적으로 함유하지 않는 세포 내에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체 외부에 존재하거나 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체뿐만 아니라, 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중 가닥 형태도 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성 제조된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 리보좀 결합 부위 또는 전사 종결 요소일 수 있거나 이러한 조절 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 예를 들면 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각각 100개 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 다시 말해, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열에서 5% 이하의 뉴클레오티드가 결실될 수 있거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열 내의 총 뉴클레오티드의 5% 이하를 차지하는 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변형은 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 이들 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있거나, 기준 서열 내의 잔기들 사이에 개별적으로 산재되어 있을 수 있거나, 또는 기준 서열 내에서 하나 이상의 인접한 군으로 산재되어 있을 수 있다. 실질적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 지를, 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 폴리펩티드에 대해 상기 논의된 프로그램(예를 들면, ALIGN-2)을 이용하여 통상적으로 확인할 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정된 핵산 요소들과 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 발생된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스티드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편 내로 삽입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열들 중에서 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 "발현 구축물"과 동의어이고, 표적 세포 내로 도입되어 표적 세포에서 그 자신과 작동가능하게 연결된 특정 유전자의 발현을 지시하는 데에 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가 복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 그 자신이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 삽입된 벡터도 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 발현 벡터가 표적 세포 내부에 존재하면, 유전자에 의해 암호화된 리보핵산 분자 또는 단백질이 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 제조된다. 일 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 외래 핵산이 도입되어 있는 세포(이러한 세포의 자손을 포함함)를 지칭한다. 숙주 세포는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양의 수와 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량 면에서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 발생시키는 데에 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면, 배양된 포유동물 세포, 예컨대, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 식물 세포를 포함할 뿐만 아니라, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함한다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인의 개입 후 효과기 기능을 수행하도록 수용체 보유 세포를 자극하는 신호전달 사건을 이끌어내는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)를 포함한다.
항체-의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)은 면역 효과기 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 유발하는 면역 기작이다. 표적 세포는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 유도체가 일반적으로 Fc 영역의 N-말단에 위치하는 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 사용된 용어 "감소된 ADCC"는 상기 정의된 ADCC의 기작에 의해 표적 세포를 둘러싸는 매질 중의 항체의 주어진 농도에서 주어진 시간 이내에 용해되는 표적 세포 수의 감소, 및/또는 ADCC의 기작에 의해 주어진 시간 이내에 주어진 수의 표적 세포의 용해를 달성하는 데에 요구되는, 표적 세포를 둘러싸는 매질 중의 항체의 농도의 증가로서 정의된다. ADCC의 감소는 동일한 표준 제조, 정제, 제형화 및 저장 방법(당업자에게 공지되어 있음)을 이용하였을 때 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 제조되되, 조작되지 않은 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 비해 상대적인 감소이다. 예를 들면, ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 그의 Fc 도메인 내에 포함하는 항체에 의해 매개된 ADCC의 감소는 Fc 도메인 내에 이 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 비해 상대적인 감소이다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 국제특허출원공개 WO 2006/082515 또는 PCT 출원 WO 2012/130831 참조).
약제의 "효과량"은 이 약제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리적 변화를 발생시키기 위해 필요한 양을 지칭한다.
약제, 예를 들면, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 필요한 시간 동안 필요한 용량에서 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 치료 효과량의 약제는 예를 들면, 질환의 불리한 효과를 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나 방지한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 구체적으로, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "약학 조성물"은 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태로 존재하고 제제가 투여될 대상체에게 허용불가능한 독성을 나타내는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외에 대상체에게 독성을 나타내지 않는 약학 조성물 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 "치료"(및 이의 문법적 어미변화, 예컨대, "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서의 질환의 자연 경과를 변형시키기 위한 시도에서의 임상 시술을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업적 포장물 내에 통상적으로 포함되는 설명서로서, 증상, 용법, 용량, 투여, 병용 치료, 사용금지사유, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
실시양태의 상세한 설명
제 1 양상에서, 본 발명은 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(i) CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, 제 1 항원 결합 모이어티; 및
(ii) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인, 제 2 항원 결합 모이어티.
일 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 3, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 13, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17, 서열번호 43, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(i) 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및
(ii) 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티.
일 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(i) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및
(ii) 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티.
일 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(i) 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및
(ii) 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티.
일 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(i) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및
(ii) 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티.
특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이다.
일 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다.
특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이고, 제 2 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다. 추가 특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티는, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해, 서로 융합되어 있다.
특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정된 회합을 할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 추가로 포함한다.
추가 특정한 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 항원 결합 모이어티는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 존재한다(즉, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3에 결합하는 1가를 제공한다).
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 포맷
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분들은 다양한 배열로 서로 융합될 수 있다. 예시적 배열은 도 1, 3 및 5에 도시되어 있다.
특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정된 회합을 할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다.
이러한 일 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 항원 결합 모이어티, 제 2 항원 결합 모이어티, 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 구성되고, 이때 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 임의적으로, 제 1 항원 결합 모이어티가 교차 Fab 분자인 경우, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄와 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
이러한 또 다른 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 항원 결합 모이어티, 제 2 항원 결합 모이어티, 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 구성되고, 이때 제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있다
다른 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다.
특정한 상기 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 특정한 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 항원 결합 모이어티, 제 2 항원 결합 모이어티, 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 구성되고, 이때 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 임의적으로, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄와 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
항원 결합 모이어티는 Fc 도메인에 융합될 수 있거나, 직접적으로 또는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2개 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 연결기를 통해 서로 융합될 수 있다. 펩티드 연결기는 당분야에서 공지되어 있고 본원에 기재된 바와 같다. 적합한 비면역원성 펩티드 연결기는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 연결기를 포함한다. "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수이다. 제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄들을 서로 융합시키는 데에 특히 적합한 펩티드 연결기는 (G4S)2이다. 제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄들을 연결하는 데에 적합한 예시적 펩티드 연결기는 EPKSC(D)-(G4S)2(서열번호 105 및 106)이다. 추가로, 연결기는 면역글로불린 힌지 영역(의 일부)을 포함할 수 있다. 특히, 항원 결합 모이어티가 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는 경우, 추가 펩티드 연결기를 사용하거나 사용하지 않고 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 일부를 통해 상기 항원 결합 모이어티를 융합시킬 수 있다.
특히, 고친화성 항원 결합 모이어티의 결합 후 표적 세포 항원의 내재화가 예상되는 경우, (예를 들면, 도 1의 A, D, F 또는 H에 나타낸 바와 같이) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항원 결합 모이어티를 갖는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 유용하다. 이러한 경우, 표적 세포 항원에 대해 특이적인 하나 초과의 항원 결합 모이어티의 존재는 표적 세포 항원의 내재화를 향상시킴으로써 그의 사용가능성을 감소시킬 수 있다.
그러나, 많은 다른 경우에서, 예를 들면, 표적 부위로의 표적화를 최적화하거나 표적 세포 항원들의 가교결합을 가능하게 하기 위해 표적 세포 항원에 대해 특이적인 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 갖는 것이 유리할 것이다(도 1의 B, C, E 또는 G에 나타낸 예 참조).
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다. 일 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 제 2 항원 결합 모이어티에 의해 결합되는 표적 세포 항원과 동일한 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 동일하다(즉, 이들은 동일한 아미노산 서열을 포함한다).
특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 이때, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하고; 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 이때, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하고; 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 CEA에 결합할 수 있고, 이때, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 3, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 이때, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 이때, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 이때, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하고; 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 이때, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
일 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하고; 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 이때, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
일 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 3, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 이때, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 13, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17, 서열번호 43, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 이때, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 더욱 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 임의적으로, 제 1 항원 결합 모이어티가 교차 Fab 분자인 경우, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄와 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 직접적으로 또는 펩티드 연결기를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합되어 있다. 특정한 실시양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 일 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티, 제 3 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 특정한 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 IgG 클래스 면역글로불린이다. 보다 특정한 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG1 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG4 서브클래스 면역글로불린이다. 추가 특정한 실시양태에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화된 면역글로불린이다. 일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자, 및 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티로 구성되고, 이때 상기 항원 결합 모이어티는, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해, 면역글로불린 중쇄들 중 하나의 N-말단에 융합된 단일 쇄 Fab 분자 또는 교차 Fab 분자, 특히 교차 Fab 분자이다.
특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있고, 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 특정한 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 항원 결합 모이어티, 제 2 항원 결합 모이어티, 제 3 항원 결합 모이어티, 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 구성되고, 이때 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있고, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 임의적으로, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄와 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(i) 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 4의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 6의 중쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 이때, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역, 특히 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이고;
(ii) 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 각각 서열번호 24의 중쇄 CDR1, 서열번호 25의 중쇄 CDR2, 서열번호 26의 중쇄 CDR3, 서열번호 28의 경쇄 CDR1, 서열번호 29의 경쇄 CDR2 및 서열번호 30의 경쇄 CDR3을 포함하는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(i) 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 이때 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역, 특히 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이고;
(ii) 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 각각 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(i) 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 4의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 6의 중쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 이때, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역, 특히 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이고;
(ii) 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 각각 서열번호 14의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 16의 중쇄 CDR3, 서열번호 18의 경쇄 CDR1, 서열번호 19의 경쇄 CDR2 및 서열번호 20의 경쇄 CDR3을 포함하는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(i) 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 이때, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 변 영역 또는 불변 영역, 특히 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이고;
(ii) 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 각각 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이다.
임의의 상기 4가지 실시양태에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (iii) 안정된 회합을 할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 이때, 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있고, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 일부에서, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄와 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 임의적으로 연결기 펩티드를 통해 서로 융합되어 있다. 제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티의 배열에 따라, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 그의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있거나, 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 그의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있다. 제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄들의 융합은 불일치된 Fab 중쇄 및 경쇄의 미스페어링을 더 감소시키고, 또한, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자들 중 일부의 발현을 위해 필요한 플라스미드의 수를 감소시킨다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역이 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제 1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 이때, 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역으로 대체된다), Fc 도메인 서브유닛(VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드, 및 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 1 항원 결합 모이어티(VH(1)-CL(1))의 Fab 경쇄 불변 영역 및 제 2 항원 결합 모이어티(VL(2)-CL(2))의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합에 의해 공유적으로 연결되어 있다.
대안적인 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제 1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 이때 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역으로 대체된다), Fc 도메인 서브유닛(VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드, 및 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역이 제 1 항원 결합 모이어티(VL(1)-CH1(1))의 Fab 중쇄 불변 영역 및 제 2 항원 결합 모이어티(VL(2)-CL(2))의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들면 다이설파이드 결합에 의해 공유적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역이 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제 1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 이때, 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역으로 대체된다), 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, Fc 도메인 서브유닛(VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제 1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 이때, 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역으로 대체된다), 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, Fc 도메인 서브유닛(VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄가 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제 1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 이때, 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역으로 대체된다), Fc 도메인 서브유닛(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄가 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제 1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 이때, 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역으로 대체된다), Fc 도메인 서브유닛(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 항원 결합 모이어티의 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 이때, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역은 제 1 항원 결합 모이어티(VH(1)-CL(1))의 Fab 경쇄 불변 영역 및 제 2 항원 결합 모이어티(VL(2)-CL(2))의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다. 다른 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 이때, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역은 제 1 항원 결합 모이어티(VL(1)-CH1(1))의 Fab 중쇄 불변 영역, 및 제 2 항원 결합 모이어티(VL(2)-CL(2))의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다. 또 다른 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역이 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 항원 결합 모이어티(VL(1)-CH1(1)-VL(2)-CL(2))의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 항원 결합 모이어티(VH(1)-CL(1)-VL(2)-CL(2))의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드, 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 1 항원 결합 모이어티(VL(2)-CL(2)-VL(1)-CH1(1))의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드, 또는 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 1 항원 결합 모이어티(VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1))의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
상기 실시양태에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제 3 항원 결합 모이어티가 Fc 도메인 서브유닛(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) 및 제 3 항원 결합 모이어티(VL(3)-CL(3))의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들면 다이설파이드 결합에 의해 공유적으로 연결되어 있다.
상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따라, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분들(예를 들면, 항원 결합 모이어티, Fc 도메인)은 직접적으로 융합될 수 있거나, 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 다양한 연결기, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2개 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 연결기를 통해 융합될 수 있다. 적합한 비면역원성 펩티드 연결기는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 연결기를 포함하고, 이때 n은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수이다.
Fc 도메인
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이고, 이들의 각각의 서브유닛은 CH2 IgG 중쇄 불변 도메인 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개 서브유닛은 서로 안정된 회합을 형성할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또 다른 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 S228(EU 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 이 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 아암 교환을 감소시킨다(문헌[Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91(2010)] 참조). 추가 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 인간 IgG1 Fc 도메인의 예시적 서열은 서열번호 107에 제공되어 있다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 항원 결합 모이어티를 포함하므로, 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛은 전형적으로 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드 쇄들에 포함되어 있다. 이들 폴리펩티드들의 재조합 공발현 및 후속 이량체화는 상기 2개의 폴리펩티드들의 여러 가능한 조합을 유발한다. 따라서, 재조합 제조에 있어서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선하기 위해, 원하는 폴리펩티드들의 결합을 촉진하는 변형을 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인 내에 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제 1 서브유닛과 제 2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 서브유닛 사이의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다. 따라서, 일 실시양태에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다.
특정한 실시양태에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나에서 "놉" 변형을 포함하고 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 나머지 하나에서 "홀" 변형을 포함하는 소위 "놉-인투-홀(knob-into-hole)" 변형이다.
놉-인투-홀 기술은 예를 들면, US 5,731,168, US 7,695,936, 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621(1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15(2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌출부를 캐비티에 위치시켜 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해할 수 있도록 돌출부(놉)를 제 1 폴리펩티드의 계면에서 도입하고 상응하는 캐비티(홀)를 제 2 폴리펩티드의 계면에서 도입하는 단계를 포함한다. 돌출부는 제 1 폴리펩티드의 계면의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄(예를 들면, 티로신 또는 트립토판)로 치환됨으로써 구축된다. 상기 돌출부와 동일한 또는 유사한 크기의 상쇄 캐비티는 큰 아미노산 측쇄가 보다 작은 아미노산 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 쓰레오닌)로 치환됨으로써 제 2 폴리펩티드의 계면에서 생성된다.
따라서, 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 돌출부가 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생되고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 캐비티가 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생된다.
돌출부 및 캐비티는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 변경시킴으로써, 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이유발 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 위치 366의 쓰레오닌 잔기는 트립토판 잔기로 치환되고(T366W), Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 위치 407의 티로신 잔기는 발린 잔기로 치환된다(Y407V). 일 실시양태에서, Fc 도메인의 제 2 서브유닛에서 추가로 위치 366의 쓰레오닌 잔기는 세린 잔기로 치환되고(T366S) 위치 368의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다(L368A).
추가 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛에서 추가로 위치 354의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 치환되고(S354C), Fc 도메인의 제 2 서브유닛에서 추가로 위치 349의 티로신 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다(Y349C). 이들 2개의 시스테인 잔기들의 도입은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 사이에서 이량체를 더 안정화시키는 다이설파이드 가교의 형성을 야기한다(문헌[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15(2001)]).
특정한 실시양태에서, CD3에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 ("놉" 변형을 포함하는) Fc 도메인의 제 1 서브유닛에 (임의적으로 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 통해) 융합되어 있다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, CD3에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티와 Fc 도메인의 놉 함유 서브유닛의 융합은 CD3에 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자의 발생을 (더) 최소화할 것이다(2개의 놉 함유 폴리펩티드의 입체적 충돌).
대안적인 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛과 제 2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형은 예를 들면, WO 2009/089004에 기재된 바와 같이 정전기 조종(steering) 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 이 방법은 동종이량체 형성이 정전기적으로 불리하게 되지만 이종이량체화가 정전기적으로 유리하게 되도록 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기로 치환시키는 단계를 포함한다.
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
Fc 도메인은 표적 조직에서의 우수한 축적 및 유리한 조직-혈액 분포 비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하는 유리한 약동학적 성질을 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 부여한다. 그러나, 동시에 상기 Fc 도메인은 바람직한 항원 보유 세포로의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 표적화보다는 오히려 Fc 수용체를 발현하는 세포로의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 원치 않는 표적화를 유발할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 공활성화는 항원 결합 분자의 T 세포 활성화 성질 및 긴 반감기와 함께 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 전신 투여 시 심각한 부작용을 초래하는 사이토카인 방출을 유발할 수 있다. T 세포 이외의 (Fc 수용체 보유) 면역 세포의 활성화는 예를 들면, NK 세포에 의한 T 세포의 잠재적 파괴로 인해 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효능조차도 더 감소시킬 수 있다.
따라서, 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 일 상기 실시양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)은 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 비해 Fc 수용체에 대한 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 결합 친화성, 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 일 실시양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)은 실질적으로 Fc 수용체에 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정한 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 일 실시양태에서, 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토카인 분비로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과기 기능이다. 특정한 실시양태에서, 효과기 기능은 ADCC이다. 일 실시양태에서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 실질적으로 유사한 결합 친화성을 나타낸다. Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화성의 약 70% 초과, 구체적으로 약 80% 초과, 보다 구체적으로 약 90% 초과의 결합 친화성을 나타내는 경우 FcRn과의 실질적으로 유사한 결합이 달성된다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 비조작된 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에 존재한다. 일 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시킨다. 일 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상까지 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 존재하는 실시양태에서, 이들 아미노산 돌연변이들의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 10배 이상, 20배 이상 또는 심지어 50배 이상까지 감소시킬 수 있다. 일 실시양태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 비조작된 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 비해 Fc 수용체에 대한 20% 미만, 구체적으로 10% 미만, 보다 구체적으로 5% 미만의 결합 친화성을 나타낸다. 특정한 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게는, 이들 각각의 수용체에 대한 결합이 감소된다. 일부 실시양태에서, 보체 성분에 대한 결합 친화성, 구체적으로 C1q에 대한 결합 친화성도 감소된다. 일 실시양태에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화성은 감소되지 않는다. Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 비조작된 형태의 Fc 도메인(또는 상기 비조작된 형태의 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화성의 약 70% 초과의 결합 친화성을 나타내는 경우 FcRn과의 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성의 보존이 달성된다. Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 이러한 친화성의 약 80% 초과, 심지어 약 90% 초과의 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 비조작된 Fc 도메인에 비해 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 감소된 효과기 기능은 하기 효과기 기능들 중 하나 이상의 효과기 기능을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다: 감소된 보체 의존적 세포독성(CDC), 감소된 항체-의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포와의 감소된 결합, 대식세포와의 감소된 결합, 단핵세포와의 감소된 결합, 다형핵 세포와의 감소된 결합, 세포자멸을 유도하는 감소된 직접적인 신호전달, 표적 결합된 항체의 감소된 가교결합, 감소된 수지상 세포 성숙, 및 감소된 T 세포 프라이밍(priming). 일 실시양태에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP 및 감소된 사이토카인 분비로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과기 기능이다. 특정한 실시양태에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 일 실시양태에서, 감소된 ADCC는 비조작된 Fc 도메인(또는 비조작된 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
일 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 일 실시양태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 L234, L235 및 P329로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함한다. 일 상기 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 일 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 일 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함하고 E233, L234, L235, N297 및 P331로부터 선택된 위치에서 추가 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, 추가 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329, L234 및 L235에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 일 상기 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제특허출원공개 WO 2012/130831에 기재된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체(뿐만 아니라 완전) 결합을 거의 완전히 제거한다. 국제특허출원공개 WO 2012/130831에는 이러한 돌연변이체 Fc 도메인을 제조하는 방법 및 그의 성질, 예컨대, Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능을 측정하는 방법도 기재되어 있다.
IgG4 항체는 IgG1 항체에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 일 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P를 포함한다. Fc 수용체에 대한 그의 결합 친화성 및/또는 그의 효과기 기능을 더 감소시키기 위해, 일 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 L235에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G를 포함한다. 특정한 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함한다. 이러한 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체들 및 이들의 Fcγ 수용체 결합 성질은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제특허출원공개 WO 2012/130831에 기재되어 있다.
특정한 실시양태에서, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인의 N-글리코실화는 제거되어 있다. 일 상기 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 N297에서 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파르트산(N297D)으로 치환시키는 아미노산 치환을 포함한다.
전술되어 있고 국제특허출원공개 WO 2012/130831에도 기재된 Fc 도메인 이외에, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 도메인도 포함한다(US 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상의 아미노산 위치에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 7,332,581).
돌연변이체 Fc 도메인은 당분야에서 잘 공지되어 있는 유전적 또는 화학적 방법을 이용한 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면, 서열분석에 의해 검증될 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은 예를 들면, ELISA에 의해, 또는 표준 기계, 예컨대, 비아코어 기계[지이 헬쓰케어(GE Healthcare)]를 이용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 측정될 수 있고, Fc 수용체는 예컨대, 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 적합한 이러한 결합 분석은 본원에 기재되어 있다. 대안적으로, 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주, 예컨대, FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 이용하여 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합 친화성을 평가할 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효과기 기능은 당분야에서 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 본원에 기재되어 있다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관 내 분석의 다른 예는 US 5,500,362, 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063(1986)], 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502(1985), US 5,821,337 및 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361(1987)]에 기재되어 있다. 대안적으로, 비방사성 분석 방법이 이용될 수 있다(예를 들면, 유동세포계수에 대한 ACTI(상표) 비방사성 세포독성 분석[셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재], 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비방사성 세포독성 분석[프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재] 참조). 이러한 분석을 위한 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들면, 동물 모델, 예컨대, 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656(1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인과 보체 성분, 특히 C1q의 결합이 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작되어 있는 일부 실시양태에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 C1q에 결합할 수 있음으로써 CDC 활성을 갖는 지를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에 기재된 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163(1996)], 문헌[Cragg et al., Blood 101, 1045-1052(2003)] 및 문헌[Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743(2004)] 참조).
항원 결합 모이어티
본 발명의 항원 결합 분자는 이중특이적이다(즉, 상기 분자는 2개의 상이한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다). 본 발명에 따라, 항원 결합 모이어티는 Fab 분자(즉, 가변 영역 및 불변 영역을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄로 구성된 항원 결합 도메인)이다. 일 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 Fab 분자이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간화된 Fab 분자이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
항원 결합 모이어티 중 하나 이상은 교차 Fab 분자이다. 이러한 변형은 상이한 Fab 분자들의 중쇄와 경쇄의 미스페어링을 방해함으로써 재조합 제조에 있어서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 특정 교차 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역은 교환되어 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 또 다른 교차 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역은 교환되어 있다.
본 발명에 따른 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원, 특히 종양 세포 항원, 및 CD3에 동시적으로 결합할 수 있다. 일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원 및 CD3에 동시적으로 결합함으로써 T 세포와 표적 세포를 가교결합시킬 수 있다. 보다 특정한 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 야기한다. 일 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 T 세포의 활성화를 야기한다. 다른 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현으로 구성된 군으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 야기한다. 일 실시양태에서, 표적 세포 항원과의 동시적인 결합의 부재 하에 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 CD3의 결합은 T 세포 활성화를 야기하지 않는다.
일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포로 방향 전환시킬 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 방향 전환은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다.
특히, 본 발명의 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
CD3 결합 모이어티
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(본원에서 "CD3 결합 모이어티" 또는 "제 1 항원 결합 모이어티"로도 지칭됨)는 CD3에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3과의 1가 결합을 제공한다. CD3 항원 결합은 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는 Fab 분자이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 초과의 항원 결합 모이어티가 존재하는 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 바람직하게는 교차 Fab 분자이고, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다.
특정한 실시양태에서, CD3은 인간 CD3(서열번호 103) 또는 사이노몰구스 CD3(서열번호 104), 가장 구체적으로 인간 CD3이다. 특정한 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 인간 및 사이노몰구스 CD3에 대한 교차반응성을 나타낸다(즉, 인간 및 사이노몰구스 CD3에 특이적으로 결합한다). 일부 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3의 엡실론 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있다.
CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
일 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 6의 중쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함한다.
일 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 3, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 7 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 3, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 3과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 3의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 7의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
표적 세포 항원 결합 모이어티
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(본원에서 "표적 세포 항원 결합 모이어티" 또는 "제 2" 또는 "제 3" 항원 결합 모이어티로도 지칭됨)는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 구체적인 상기 실시양태에서, 이들 항원 결합 모이어티 각각은 동일한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합한다. 더욱더 특정한 실시양태에서, 모든 이러한 항원 결합 모이어티는 동일하다. 일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 포함한다. 일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이하의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 표적 세포 항원 결합 모이어티는 일반적으로 특정 항원성 결정인자에 결합하고 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 표적 부위, 예를 들면, 항원성 결정인자를 보유하는 특정 유형의 종양 세포로 향하게 할 수 있는 Fab 분자, 특히 통상적인 Fab 분자이다.
특정 실시양태에서, 표적 세포 항원 결합 모이어티는 구체적으로 세포 표면 항원에 결합한다. 특정한 실시양태에서, 표적 세포 항원 결합 모이어티는 구체적으로 세포 표면 항원의 막 근위 영역에 결합한다. 특정한 상기 실시양태에서, 세포 표면 항원은 암배아 항원(CEA)이고, 막 근위 영역은 CEA의 B3 도메인(서열번호 119의 잔기 208 내지 286)이다. 또 다른 특정한 상기 실시양태에서, 세포 표면 항원은 흑색종-관련된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)이고, 막 근위 영역은 MSCP의 D3 도메인(서열번호 118)이다.
특정 실시양태에서, 표적 세포 항원 결합 모이어티는 병리학적 상태와 관련된 항원, 예컨대, 종양 세포 또는 바이러스-감염된 세포 상에 제시된 항원으로 향한다. 적합한 항원은 세포 표면 항원, 예를 들면, 세포 표면 수용체이다(그러나, 이것으로 한정되지 않는다). 특정한 실시양태에서, 항원은 인간 항원이다. 특정한 실시양태에서, 표적 세포 항원은 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP, CSPG4) 및 암배아 항원(CEA, CEACAM5)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 흑색종-관련된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)에 대하여 특이적인 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 일 실시양태에서, MCSP에 대하여 특이적인 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 모이어티는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
일 실시양태에서, MCSP에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
일 실시양태에서, MCSP에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 14의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 16의 중쇄 CDR3, 서열번호 18의 경쇄 CDR1, 서열번호 19의 경쇄 CDR2 및 서열번호 20의 경쇄 CDR3을 포함한다.
추가 실시양태에서, MCSP에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 13, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 17, 서열번호 43, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
추가 실시양태에서, MCSP에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 13, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17, 서열번호 43, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
추가 실시양태에서, MCSP에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열 또는 작용기를 보유하는 이의 변이체를 포함한다.
일 실시양태에서, MCSP에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, MCSP에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 13의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 17의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 53과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 54와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열 및 서열번호 55와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 암배아 항원(CEA)에 대하여 특이적인 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 일 실시양태에서, CEA에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
일 실시양태에서, CEA에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 24의 중쇄 CDR1, 서열번호 25의 중쇄 CDR2, 서열번호 26의 중쇄 CDR3, 서열번호 28의 경쇄 CDR1, 서열번호 29의 경쇄 CDR2 및 서열번호 30의 경쇄 CDR3을 포함한다.
추가 실시양태에서, CEA에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 23과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 27과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 작용기를 보유하는 이의 변이체를 포함한다.
일 실시양태에서, CEA에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, CEA에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 27의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 22와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 56과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 57과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열 및 서열번호 58과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 단편은 항원 결합 단편이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 ,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 ,93, 94, 95, 96, 97 및 98에 기재된 서열들과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드(이의 기능성 단편 또는 변이체를 포함)를 포함한다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전체 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있거나 공발현되는 다수(예를 들면, 2개 이상)의 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합하여 기능성 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 형성할 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 모이어티의 경쇄 부분은 항원 결합 모이어티의 중쇄 부분, Fc 도메인 서브유닛 및 임의적으로 또 다른 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부로부터 분리된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공발현되는 경우, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합하여 항원 결합 모이어티를 형성할 것이다. 또 다른 예에서, 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 및 임의적으로 하나 이상의 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부는 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 나머지 하나 및 임의적으로 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부로부터 분리된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공발현되는 경우, Fc 도메인 서브유닛은 결합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 전체 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화한다. 다른 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 폴리펩티드를 암호화한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 3, 7, 13, 17, 23, 27, 31, 32, 33, 34, 36, 39, 41, 43, 46, 47 또는 51에 나타낸 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 22, 56, 57, 58, 12, 53, 54 및 55에 나타낸 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 뉴클레오티드로서, 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 ,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 또는 98에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 ,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 ,93, 94, 95, 96, 97 또는 98에 나타낸 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 3, 7, 13, 17, 23, 27, 31, 32, 33, 34, 36, 39, 41, 43, 46, 47 또는 51에 나타낸 아미노산 서열과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 22, 56, 57, 58, 12, 53, 54 또는 55에 나타낸 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 3, 7, 13, 17, 23, 27, 31, 32, 33, 34, 36, 39, 41, 43, 46, 47 또는 51의 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 22, 56, 57, 58, 12, 53, 54 또는 55의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 예를 들면, 고체 상태 펩티드 합성(예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고체상 합성) 또는 재조합 제조에 의해 수득될 수 있다. 재조합 제조를 위해, 예를 들면, 상기한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 단리하고 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 통상적인 절차를 이용하여 이러한 폴리뉴클레오티드를 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드들 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법들은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전적 재조합을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(1989)] 및 문헌[Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience, N.Y(1989)]에 기재된 기법을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스의 일부일 수 있거나 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동가능하게 연결된 상태로 클로닝되어 있는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 "암호화 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 구성된 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(태그, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, 암호화 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있고, 존재하는 경우 임의의 플랭킹 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 전사 종결 요소, 인트론, 5' 및 3' 비번역 영역 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 암호화 영역들은 단일 폴리뉴클레오티드 구축물 내에, 예를 들면, 단일 벡터에 존재할 수 있거나 별도의 폴리뉴클레오티드 구축물 내에, 예를 들면, 별도의 (상이한) 벡터에 존재할 수 있다. 더욱이, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나 2개 이상의 암호화 영역들을 포함할 수 있다(예를 들면, 본 발명의 벡터는 단백질용해성 절단을 통해 번역 후에 또는 번역과 동시에 최종 단백질로 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다). 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편), 또는 이의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 융합되지 않은 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 전문화된 요소 또는 모티프, 예컨대, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 작동가능한 연결은 유전자 생성물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열의 영향 또는 조절 하에 유전자 생성물이 발현되게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연결되어 있는 경우이다. 2개의 DNA 단편들(예컨대, 폴리펩티드 암호화 영역 및 이와 연결된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 생성물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우 및 상기 2개의 DNA 단편들 사이의 연결의 성질이 유전자 생성물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 연결"되어 있다. 따라서, 프로모터 영역은 이 프로모터가 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우 상기 핵산과 작동가능하게 연결되어 있을 것이다. 프로모터는 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 조절 요소, 예를 들면, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호는 세포 특이적 전사를 지시하도록 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역은 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예컨대, 사이토메갈로바이러스(예를 들면, 인트론-A와 함께 즉시 초기 프로모터), 원숭이 바이러스 40(예를 들면, 초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들면, 라우스 육종 바이러스)의 프로모터 및 인핸서 분절을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자, 예컨대, 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 α-글로빈으로부터 유래된 전사 조절 영역뿐만 아니라, 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열도 포함한다. 추가 적합한 전사 조절 영역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들면, 테트라사이클린 유도성 프로모터)도 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 이들은 리보좀 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보좀 도입 부위 또는 IRES)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 발현 카세트는 다른 특징, 예컨대, 복제기점 및/또는 염색체 삽입 요소, 예컨대, 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 또는 아데노 관련 바이러스(AAV) 도립 말단 반복부(ITR)도 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가 암호화 서열과 연결될 수 있다. 예를 들면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 분비를 원하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA를 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 배치할 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 일단 성장하는 단백질 쇄가 조면 소포체(rough endoplasmic reticulum)를 횡단하여 이출되기 시작하면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 이 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 갖고, 상기 신호 펩티드는 상기 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생성하기 위해 번역된 폴리펩티드로부터 절단된다는 것을 인식하고 있다. 특정 실시양태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그 자신과 작동가능하게 연결된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 이의 기능성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다. 분비 신호 펩티드의 예시적 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 108 내지 116에 제공되어 있다.
추후 정제를 용이하게 하기 위해 또는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 표지하는 것을 보조하기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열(예를 들면, 히스티딘 태그)을 암호화하는 DNA가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편) 암호화 폴리뉴클레오티드의 내부 또는 말단에 포함될 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터 각각과 관련하여 본원에 기재된 특징들 중 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다. 일 상기 실시양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(의 일부)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들면, 이러한 벡터로 형질전환되어 있거나 형질감염되어 있다). 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 발생시키기 위해 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현을 복제하고 뒷받침하기에 적합한 숙주 세포는 당분야에서 잘 공지되어 있다. 이러한 세포를 적절한 경우 특정 발현 벡터로 형질감염시킬 수 있거나 형질도입할 수 있고, 임상 적용에 충분한 양의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하기 위해 다량의 벡터 함유 세포를 대규모 발효기 시딩용으로 생장시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예컨대, 에스케리키아 콜라이 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들면, 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 폴리펩티드를 세균에서 제조할 수 있다. 발현 후, 상기 폴리펩티드를 가용성 분획으로 세균 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고 더 정제할 수 있다. 원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있어 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생성을 야기하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 사상 진균 또는 효모가 폴리펩티드 암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414(2004)] 및 문헌[Li et al., Nat Biotech 24, 210-215(2006)]을 참조한다. (글리코실화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터도 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 세포 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되어 있다. 식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, [형질전환 식물에서 항체를 제조하기 위한 플랜티바디스(PL항체: 상표) 기법을 기술하는] US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429를 참조한다. 척추동물 세포도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액 중에서 생장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7), 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59(1977)]에 기재된 293 또는 293T 세포), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251(1980)]에 기재된 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암종 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68(1982)]에 기재됨), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 dhfr- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216(1980)])를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대, YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0를 포함한다. 단백질 제조에 적합한 일부 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌[Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., HumanaPress, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)]을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포뿐만 아니라, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함한다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프계 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
이들 시스템들에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술은 당분야에서 공지되어 있다. 항원 결합 도메인, 예컨대, 항체의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는 나머지 항체 쇄도 발현하여 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄 둘다를 갖는 항체이도록 조작될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 생산하는 방법으로서, 본원에서 제공된 바와 같은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분들은 서로 유전적으로 융합되어 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 그의 성분들이 직접적으로 또는 연결기 서열을 통해 간접적으로 서로 융합되도록 디자인될 수 있다. 상기 연결기의 조성 및 길이는 당분야에서 잘 공지된 방법에 따라 결정될 수 있고 효능에 대해 시험될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 상이한 성분들 사이의 연결기 서열들의 예는 본원에 제공된 서열에서 발견된다. 원하는 경우 융합체의 개별 성분들을 분리하기 위한 절단 부위, 예를 들면, 엔도펩티다제 인식 서열을 도입하도록 추가 서열도 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나 이상의 항원 결합 모이어티는 항원성 결정인자에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비천연 항체 또는 이의 단편의 일부를 형성할 수 있고 이러한 천연 또는 비천연 항체 또는 이의 단편으로부터 유래될 수 있다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 제조하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 비천연 항체는 고체상 펩티드 합성의 이용을 통해 구축될 수 있거나, (예를 들면, US 4,186,567에 기재된 바와 같이) 재조합적으로 제조될 수 있거나, 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득될 수 있다(예를 들면, 맥카페티(McCafferty)의 US 5,969,108 참조).
임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역이 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 비제한적인 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 뮤린, 영장류 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 인간에 사용되기 위한 것인 경우, 키메라 형태의 항체가 사용될 수 있고, 이때 항체의 불변 영역은 인간으로부터 유래된다. 인간화된 또는 전체 인간 형태의 항체도 당분야에서 잘 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들면, 윈터(Winter)의 US 5,565,332 참조). 인간화는 (a) 중요한 골격 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 보유하는 데에 있어서 중요한 골격 잔기)를 보유하거나 보유하지 않으면서 비인간(예를 들면, 공여자 항체) CDR을 인간(예를 들면, 수용자 항체) 골격 및 불변 영역에 이식하는 방법, (b) 비인간 특이성 결정 영역(SDR 또는 a-CDR: 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)을 인간 골격 및 불변 영역에 이식하는 방법, 또는 (c) 전체 비인간 가변 도메인들을 이식하되, 표면 잔기의 치환을 통해 이들을 인간 유사 구획으로 "은폐"시키는 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화된 항체 및 이를 제조하는 방법은 예를 들면, 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633(2008)]에서 검토되고 있고, 예를 들면, 하기 문헌들에 더 기재되어 있다: 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329(1988)]; 문헌[Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033(1989)]; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321 및 US 7,087,409; 문헌[Jones et al., Nature 321, 522-525(1986)]; 문헌[Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855(1984)]; 문헌[Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92(1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536(1988)]; 문헌[Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217(1994)]; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36, 25-34(2005)](SDR(a-CDR) 이식이 기재됨); 문헌[Padlan, Mol Immunol 28, 489-498(1991)]("재표면화"가 기재됨); 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60(2005)]("FR 셔플링"이 기재됨); 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36, 61-68(2005] 및 문헌[Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260(2000)](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 방법이 기재됨). 당분야에서 공지된 다양한 기법들을 이용하여 인간 항체 및 인간 가변 영역을 제조할 수 있다. 인간 항체는 문헌[van Dijk and van de Winkel, CurrOpin Pharmacol 5, 368-74(2001)] 및 문헌[Lonberg, CurrOpin Immunol 20, 450-459(2008)]에 일반적으로 기재되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단일클론 항체의 일부를 형성할 수 있고 이러한 인간 단일클론 항체로부터 유래될 수 있다(예를 들면, 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 항원 챌린지에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 형질전환 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수도 있다(예를 들면, 문헌[Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125(2005)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 인간으로부터 유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 발생될 수도 있다(예를 들면, 문헌[Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178, 1-37(O'Brien et al., ed.), 인간 Press, Totowa, NJ, 2001)], 문헌[McCafferty et al., Nature 348, 552-554] 및 문헌[Clackson et al., Nature 352, 624-628(1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일 쇄 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 항원 결합 모이어티는 예를 들면, 전체 내용이 본원에 참고로 도입되는 WO 2004/0132066에 개시된 방법에 따라 향상된 결합 친화성을 갖도록 조작된다. 특정 항원성 결정인자에 결합하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 능력은 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 공지된 다른 기법, 예를 들면, (비아코어 T100 시스템 상에서 분석되는) 표면 플라스몬 공명 기법(문헌[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329(2000)]) 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002)])를 통해 측정될 수 있다. 경쟁 분석을 이용하여 특정 항원과의 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들면, CD3과의 결합에 대해 V9 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체구조형 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 상세한 예시적 방법은 문헌[Morris(1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다. 예시적 경쟁 분석에서, 고정된 항원(예를 들면, CD3)은 이 항원에 결합하는 제 1 표지된 항체(예를 들면, US 6,054,297에 기재된 V9 항체) 및 상기 항원과의 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁하는 그의 능력을 시험받는 제 2 비표지된 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제 2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 항원은 제 1 표지된 항체를 포함하되 제 2 비표지된 항체를 포함하지 않는 용액에서 항온처리된다. 제 1 항체와 항원의 결합을 허용하는 조건 하에 항온처리된 후, 과량의 비결합된 항체가 제거되고, 고정된 항원과 연결된 표지의 양이 측정된다. 고정된 항원과 연결된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 상대적으로 시험 샘플에서 실질적으로 감소되는 경우, 이것은 제 2 항체가 상기 항원과의 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁한다는 것을 표시한다. 문헌[Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 당분야에서 공지된 기법, 예컨대, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질의 정제에 이용되는 실제 조건은 부분적으로 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 의해 좌우될 것이고 당업자에게 자명할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 사용될 수 있다. 본질적으로 실시예에 기재된 바와 같이 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 단리할 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하는 잘 공지된 다양한 분석 방법들 중 임의의 분석 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이 발현된 중쇄 융합 단백질은 환원 SDS-페이지에 의해 입증된 바와 같이 온전하고 적절하게 조립되어 있는 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 도 4 참조). 3개의 밴드가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 경쇄, 중쇄 및 중쇄/경쇄 융합 단백질의 예측된 분자량에 상응하는 약 Mr 25,000, Mr 50,000 및 Mr 75,000에서 해상되었다.
분석
본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 당분야에서 공지된 다양한 분석에 의해 그들의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인될 수 있거나, 스크리닝될 수 있거나 특징규명될 수 있다.
친화성 분석
Fc 수용체 또는 표적 항원에 대한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화성은 표준 기계, 예컨대, 비아코어 기계(지이 헬쓰케어)를 이용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 기재된 방법에 따라 측정될 수 있고, 수용체 또는 표적 단백질은 예컨대, 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 상이한 수용체들 또는 표적 항원들의 결합은 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 이용함으로써 예를 들면, 유세포계수(FACS)에 의해 평가될 수 있다. 결합 친화성을 측정하는 구체적인 예증적 및 예시적 실시양태는 하기 설명 및 하기 실시예에 기재되어 있다.
한 실시양태에 따라, 25℃에서 비아코어(등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어)를 이용하여 표면 플라스몬 공명으로 KD를 측정한다.
Fc 부분과 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해, His 태그가 부착된 재조합 Fc 수용체를 CM5 칩 상에 고정된 항-펜타 His 항체[퀴아젠(Qiagen)]로 포획하고, 이중특이적 구축물을 분석물로서 사용한다. 요약하건대, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 약 6,500 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주입하기 전에 항-펜타 His 항체를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0)로 40 ㎍/㎖까지 희석한다. 리간드의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 비반응된 기를 차단한다. 그 후, Fc 수용체를 4 nM 또는 10 nM에서 60초 동안 포획한다. 동역학적 측정을 위해, HBS-EP(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4) 중의 이중특이적 구축물의 4배 연속 희석물들(500 nM 내지 4000 nM의 범위)을 25℃에서 30 ㎕/분의 유속으로 120초 동안 주입한다.
표적 항원에 대한 친화성을 측정하기 위해, 이중특이적 구축물을 항-펜타 His 항체에 대해 기재된 바와 같이 활성화된 CM5-센서 칩 표면 상에 고정된 항-인간 Fab 특이적 항체(지이 헬쓰케어)로 포획한다. 커플링된 단백질의 최종 양은 약 12000 RU이다. 이중특이적 구축물을 300 nM에서 90초 동안 포획한다. 표적 항원을 250 nM 내지 1000 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/의 유속으로 180초 동안 유동 셀에 통과시킨다. 해리를 180초 동안 모니터링한다.
기준 유동 셀에 대해 수득된 반응을 차감함으로써 벌크 굴절 지수 차이를 보정한다. 정상 상태 반응을 이용하여 랭뮤어(Langmuir) 결합 등온선의 비선형 곡선 피팅으로 해리 상수 KD를 유도하였다. 결합 센서그램 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 이용하여 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 계산한다. 평형 해리 상수(KD)를 비 koff/kon로서 계산한다. 예를 들면, 문헌(Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881(1999))을 참조한다.
활성 분석
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 생물학적 활성은 실시예에 기재된 바와 같이 다양한 분석에 의해 측정될 수 있다. 생물학적 활성은 예를 들면, T 세포의 증식의 유도, T 세포에서의 신호전달의 유도, T 세포에서의 활성화 마커 발현의 유도, T 세포에 의한 사이토카인 분비의 유도, 표적 세포, 예컨대, 종양 세포의 용해의 유도, 및 종양 퇴행의 유도 및/또는 생존의 개선을 포함할 수 있다.
조성물, 제제 및 투여 경로
추가 양상에서, 본 발명은 예를 들면, 하기 치료 방법들 중 임의의 치료 방법에서 사용되는, 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자들 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자들 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 예를 들면, 후술된 바와 같이 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자들 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다.
생체내 투여에 적합한 형태로 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 생산하는 방법으로서, (a) 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하는 단계, 및 (b) 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체로 제형화함으로써 생체내 투여를 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제제를 제형화하는 단계를 포함하는 방법도 제공된다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체에 용해되거나 분산된 치료 효과량의 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 어구 "약학적 또는 약학적으로 허용가능한"은 일반적으로, 사용된 용량 및 농도로 수용자에게 독성을 나타내지 않는, 즉 적절한 경우 동물, 예컨대, 인간에게 투여되었을 때 불리한, 알레르기 또는 다른 원치 않는 반응을 발생시키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 임의적으로 추가 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제조는 본원에 참고로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 의해 예시된 바와 같이 본 개시내용에 비추어 볼 때 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 더욱이, 동물(예를 들면, 인간) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학적 표준 관청 또는 다른 국가의 상응하는 정부기관에 의해 요구되는 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제제 또는 수용액이다. 본원에서 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"는 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 바와 같이(예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조) 임의의 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 방부제(예를 들면, 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 안료, 이와 유사한 물질 및 이들의 조합물을 포함한다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 상용불가능한 경우를 제외하고, 치료 또는 약학 조성물에서의 상기 담체의 사용이 고려된다.
조성물은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여될 지, 및 주사로서 이러한 투여 경로를 위해 멸균될 필요가 있는 지에 따라 상이한 유형의 담체들을 포함할 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(및 임의의 추가 치료제)는 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 바와 같이(예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990] 참조) 흡입(예를 들면, 에어로졸 흡입), 주사, 관주, 연속 관주, 직접적으로, 카테터를 통해 또는 세척을 통해 표적 세포를 세척하는 국소화된 관류, 크림, 지질 조성물(예를 들면, 리포좀) 또는 다른 방법, 또는 상기 방법들의 임의의 조합에 의해 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 비장내, 신장내, 흉막내, 경막내, 비내, 유리체내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 피하, 결막하, 소포내, 점막, 심장주위내, 배꼽내, 안구내, 경구, 국부 또는 국소 투여될 수 있다. 비경구 투여, 특히 정맥내 주사가 폴리펩티드 분자, 예컨대, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하기 위해 가장 통상적으로 사용된다.
비경구 조성물은 주사, 예를 들면, 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의한 투여용으로 디자인된 비경구 조성물을 포함한다. 주사의 경우, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 수용액, 바람직하게는 생리적으로 상용가능한 완충제, 예컨대, 행크(Hank) 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 생리적 식염수 완충제에서 제형화될 수 있다. 용액은 제형화제, 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 발열원 무함유 멸균수로 재구성될 분말 형태로 존재할 수 있다. 멸균 주사 용액은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 요구된 양으로 필요에 따라 하기 나열된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균성은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 염기성 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액, 현탁액 또는 유화액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가 원하는 성분으로 구성된 분말을 이의 미리 멸균-여과된 액체 매질로부터 생성하는 진공 건조 또는 동결 건조 기법이다. 상기 액체 매질은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 주사 전에 충분한 식염수 또는 당에 의해 등장성을 갖게 되어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고 미생물, 예컨대, 세균 및 진균의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준, 예를 들면, 단백질 mg 당 0.5 ng 미만에서 최소한으로 유지되어야 한다는 것을 인식할 것이다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 하기 담체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사 현탁액은 이 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 현탁액은 적합한 안정화제, 또는 화합물의 가용성을 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 물질도 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방유, 예컨대, 참깨유, 또는 합성 지방산 에스터, 예컨대, 에틸 클레에이트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포좀을 포함한다.
활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 각각 포획될 수 있다. 이러한 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다. 특정한 실시양태에서, 흡수를 지연하는 물질, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합물을 조성물에서 사용함으로써 주사가능한 조성물의 연장된 흡수를 달성할 수 있다.
상기한 조성물 이외에, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 보급창 제제로서 제형화될 수도 있다. 이러한 장기 작용 제제는(예를 들면, 피하 또는 근육내) 이식 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용가능한 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지로 제형화될 수 있거나, 약한 가용성을 나타내는 유도체, 예를 들면, 약한 가용성을 나타내는 염으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 과정으로 제조할 수 있다. 단백질을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 약학 조성물을 제형화할 수 있다. 적절한 제형화는 선택된 투여 경로에 의해 좌우된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 자유 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 자유 산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 염이다. 이들은 산 부가 염, 예를 들면, 단백질성 조성물의 자유 아미노 기에 의해 형성된 염, 또는 무기 산, 예컨대, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산에 의해 형성된 염을 포함한다. 자유 카복실 기에 의해 형성된 염도 무기 염기, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철; 또는 유기 염기, 예컨대, 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 수성 및 다른 양성자성 용매에서 상응하는 자유 염기 형태보다 더 높은 가용성을 나타내는 경향을 갖는다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자들 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 치료 방법 중에 사용될 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 예를 들면, 암의 치료시 면역치료제로서 사용될 수 있다.
치료 방법에서 사용되기 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 우수한 의학적 관행과 일치하는 방식으로 제형화되고 복용되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료될 구체적인 장애, 치료될 구체적인 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 상기 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다.
일 양상에서, 약제로서 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 추가 양상에서, 질환의 치료에 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에서 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 일 실시양태에서, 본 발명은 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용되는 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 치료 효과량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에서 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정한 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 데에 사용되는, 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 효과량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
추가 양상에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도를 제공한다. 일 실시양태에서, 약제는 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료를 위한 약제이다. 추가 실시양태에서, 약제는 치료 효과량의 약제를 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법에서 사용되는 약제이다. 특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정한 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 약제는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 약제이다. 추가 실시양태에서, 약제는 효과량의 약제를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용되는 약제이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 치료 효과량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 이러한 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 약학적으로 허용가능한 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정한 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재 하에 표적 세포를 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 추가 양상에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법이 제공된다. 일 상기 실시양태에서, 상기 방법은 효과량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애, 특히 암이다. 암의 비제한적인 예에는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암종, 골암 및 신장암이 포함된다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하여 치료할 수 있는 다른 세포 증식 장애는 복부, 골, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 정소, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역 및 비뇨생식계에 위치하는 신생물들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 전구암성 병태 또는 병변, 및 암 전이도 포함된다. 특정 실시양태에서, 암은 신장세포암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암 및 두경부암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 당업자는 많은 경우에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 치유를 제공할 수 없지만 부분적인 이점만을 제공할 수 있다는 것을 용이하게 인식한다. 일부 실시양태에서, 일부 이점을 갖는 생리적 변화도 치료적으로 유리한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 생리적 변화를 제공하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"으로서 간주된다. 치료를 필요로 하는 대상체, 환자 또는 개체는 전형적으로 포유동물, 보다 구체적으로 인간이다.
일부 실시양태에서, 효과량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 세포에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 치료 효과량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 질환의 치료를 위해 개체에게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가 치료제와 함께 사용될 때) 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 적절한 용량은 치료되는 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 유형, 질환의 중증도 및 경과, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 예방 목적으로 투여되는 지 아니면 치료 목적으로 투여되는 지, 선행 또는 병행 치료 시술, 환자의 임상 병력 및 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의해 좌우될 것이다. 투여를 담당하는 의사는 어떠한 경우에서든 개별 대상체를 위한 조성물 중의 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 용량(들)을 결정할 것이다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다회 투여, 볼루스 투여 및 펄스 관주를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 예를 들면, 1회 이상의 분리 투여에 의해 또는 연속 관주에 의해 환자에게 투여될 초기 후보 용량일 수 있다. 일 전형적인 1일 용량은 상기 언급된 인자들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 것이다. 수일 또는 이보다 오랜 시간에 걸친 반복된 투여의 경우, 병태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 한 예시적 용량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 다른 비제한적인 예에서, 용량은 투여 당 약 1 ㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중, 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중 또는 약 500 mg/kg 체중 내지 약 1000 mg/kg 체중 또는 그 이상, 및 상기 범위 내에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에서 나열된 수치들로부터 유도될 수 있는 범위의 비제한적인 예에서, 상기한 수치에 근거하여 약 5 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중의 범위 등이 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은(예를 들면, 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공받도록) 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다. 초기 보다 높은 적재 용량에 이어서 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있다. 이 치료의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 사용될 것이다. 질환 상태를 치료하거나 예방하기 위해 사용되는 경우, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 적용된다. 치료 효과량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어 볼 때 당업자의 능력 내에 있다.
전신 투여의 경우, 치료 유효 용량을 먼저 시험관내 분석, 예컨대, 세포 배양 분석으로부터 평가할 수 있다. 그 다음, 용량을 동물 모델에서 공식화하여 세포 배양에서 측정된 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 인간에게 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
당분야에서 잘 공지된 기법을 이용하여 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모델로부터 초기 용량을 평가할 수도 있다. 당업자는 동물 데이터에 근거하여 인간에게의 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
치료 효과를 유지하기에 충분한 혈장 수준의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하기 위해 투약 용량 및 간격을 개별적으로 조절할 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 일반적인 환자 용량은 약 0.1 mg/kg/일 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 mg/kg/일 내지 1 mg/kg/일이다. 매일 다회 용량을 투여함으로써 치료 유효 혈장 수준을 달성할 수 있다. 혈장 중의 수준은 예를 들면, HPLC에 의해 측정될 수 있다.
국소 투여 또는 선택 흡수의 경우, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 치료 유효 국소 용량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 치료 유효 용량은 일반적으로 실질적인 독성을 야기하지 않으면서 치료 이점을 제공할 것이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 독성 및 치료 효과는 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구를 이용하여 LD50(집단의 50%에게 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 비 LD50/ED50로서 표현될 수 있는 치료 지수이다. 큰 치료 지수를 나타내는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 바람직하다. 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용되기에 적합한 용량 범위를 공식화하는 데에 사용될 수 있다. 상기 용량은 바람직하게는 거의 또는 전혀 독성을 나타내지 않으면서 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 상기 용량은 다양한 인자들, 예를 들면, 사용되는 투약 제형, 이용되는 투여 경로, 대상체의 상태 등에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제제, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌[Fingl et al., 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1] 참조).
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로 치료된 환자의 주치의는 독성, 장기 기능장애 등으로 인해 투여를 종결하거나, 중단하거나 조절하는 방법 및 시기를 알 것이다. 대조적으로, 주치의는 임상 반응이 적절하지 않은 경우(방해 독성) 치료를 보다 높은 수준까지 조절하는 것도 알 것이다. 관심 있는 장애의 관리에 있어서 투여되는 용량의 크기는 치료되는 병태의 중증도, 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 상기 병태의 중증도는 예를 들면, 부분적으로 표준 예후 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 추가로, 용량 및 아마도 용량 빈도도 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
다른 약제 및 치료
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 치료시 하나 이상의 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이상의 추가 치료제와 공투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 이러한 치료를 필요로 하는 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 약제를 포괄한다. 이러한 추가 치료제는 치료되는 구체적인 증상에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 임의의 활성 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 면역조절제, 세포증식정지제, 세포 부착의 억제제, 세포독성제, 세포 세포자멸의 활성화제, 또는 세포자멸 유도제에 대한 세포의 민감성을 증가시키는 약제이다. 특정한 실시양태에서, 추가 치료제는 항암제, 예를 들면, 마이크로튜불 파괴제, 항대사물질, 토포이소머라제(topoisomerase) 억제제, DNA 인터칼레이터, 알킬화제, 호르몬 치료, 키나제(kinase) 억제제, 수용체 길항제, 종양 세포 세포자멸의 활성화제 또는 항혈관신생제이다.
이러한 다른 약제들은 적절하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다. 이러한 다른 약제들의 효과량은 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자들에 의해 좌우된다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 본원에 기재된 용량 및 투여 경로와 동일한 용량 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기재된 용량의 1% 내지 99%의 용량으로 사용되거나, 적절한 용량 및 경로로서 실험적으로/임상적으로 확인된 임의의 용량 및 임의의 경로로 사용된다.
상기 언급된 이러한 병용 치료는 병용 투여(2종 이상의 치료제가 동일한 또는 분리된 조성물에 포함되는 경우), 및 분리 투여를 포괄하고, 어느 경우에서든 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 투여는 추가 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 일어날 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 방사선치료와 함께 사용될 수도 있다.
제품
본 발명의 또 다른 양상에서, 상기한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 용기에 존재하거나 용기와 연결되어 있는 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 그 자체로 존재하거나 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되어 있는 조성물을 보유하고, 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들면, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성 물질은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자이다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은 상기 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제 1 용기, 및 (b) 추가 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서 제품은 상기 조성물이 특정 병태의 치료에 사용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대, 정균성 주사용수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적인 설명을 고려할 때, 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있음이 이해된다.
일반적인 방법
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같이 표준 방법을 이용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약들을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH PublicationNo. 91-3242]에 제공되어 있다.
DNA 서열분석
DNA 서열을 이중 가닥 서열분석으로 확인하였다.
유전자 합성
필요한 경우 적절한 주형을 사용하여 PCR로 원하는 유전자 절편을 생성하거나 젠아트 아게(Geneart AG, 독일 레겐스부르그 소재)에 의해 자동화된 유전자 합성으로 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 생성물로부터 원하는 유전자 절편을 합성하였다. 정확한 유전자 서열이 입수될 수 없는 경우, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 가장 유사한 상동체의 서열에 근거하여 디자인하였고, 유전자를 적절한 조직으로부터 유래된 RNA로부터 RT-PCR로 단리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 절단 부위에 의해 플랭킹된 유전자 절편을 표준 클로닝/서열분석 벡터 내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하였고 농도를 UV 분광법으로 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 각각의 발현 벡터 내로의 서브클로닝을 허용하기에 적합한 제한 부위를 갖도록 유전자 절편을 디자인하였다. 진핵 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 암호화하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 모든 구축물들을 디자인하였다. 예시적 리더 펩티드들 및 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 108 내지 116으로 도시된다.
PBMC로부터의 일차 인간 Pan T 세포의 단리
지역 혈액 은행으로부터 수득된 농축된 림프구 제제(버피 코트) 또는 건강한 인간 공여자로부터 수득된 새로운 혈액으로부터 히스토파크 밀도 원심분리로 말초혈 단핵세포(PBMC)를 제조하였다. 요약하건대, 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토파크 구배[시그마(Sigma), H8889]에 걸쳐 조심스럽게 층을 형성하였다. 실온에서 450 x g(브레이크 스위치 차단)에서 30분 동안 원심분리한 후, PBMC 함유 계면 위에 있는 혈장의 일부를 따라 버렸다. PBMC를 새로운 50 ㎖ 팔콘 튜브 내로 옮기고 튜브를 PBS로 50 ㎖의 총 부피까지 충전시켰다. 혼합물을 실온에서 400 x g(브레이크 스위치 작동)에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 따라 버리고 PBMC 플렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(4℃ 및 350 x g에서 10분 동안 원심분리하는 단계). 수득된 PBMC 집단을 자동적으로(ViCell) 계수하고, 분석이 시작될 때까지 항온처리기 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬(바이오크롬), K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에 저장하였다.
Pan T 세포 단리 키트 II[밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec), #130-091-156]를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 PBMC로부터의 T 세포 농축을 수행하였다. 요약하건대, 세포 펠렛을 1 x 107개 세포 당 40 ㎕의 냉각 완충제(0.5% BSA 및 2 mM EDTA를 갖는 PBS, 멸균 여과됨)로 희석하고 4℃에서 1 x 107개 세포 당 10 ㎕의 바이오틴-항체 칵테일과 함께 10분 동안 항온처리하였다. 1 x 107개 세포 당 30 ㎕의 냉각 완충제 및 20 ㎕의 항-바이오틴 자기 비드를 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 다시 15분 동안 항온처리하였다. 현재 완충액 부피의 10배 내지 20배를 첨가한 후 300 x g에서 10분 동안 원심분리 단계를 수행하여 세포를 세척하였다. 최대 1 x 108개 세포를 완충제(500 ㎕)에 재현탁하였다. LS 컬럼(밀테니이 바이오텍, #130-042-401)을 제조자의 설명서에 따라 사용하여 비표지된 인간 Pan T 세포의 자성 분리를 수행하였다. 수득된 T 세포 집단을 자동적으로(ViCell) 계수하고 분석이 시작될 때까지(24시간 이내) 항온처리기 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 AIM-V 배지에 저장하였다.
PBMC로부터의 일차 인간 무자극 T 세포의 단리
지역 혈액 은행으로부터 수득된 농축된 림프구 제제(버피 코트) 또는 건강한 인간 공여자로부터 수득된 새로운 혈액으로부터 히스토파크 밀도 원심분리로 말초혈 단핵세포(PBMC)를 제조하였다. 밀테니이 바이오텍의 무자극 CD8+ T 세포 단리 키트(#130-093-244)를 제조자의 설명서에 따라 사용하되 CD8+ T 세포의 마지막 단리 단계를 생략함으로써 PBMC로부터의 T 세포 농축을 수행하였다(일차 인간 Pan T 세포의 단리에 대한 설명 또한 참조).
비장 세포로부터의 뮤린 Pan T 세포의 단리
비장을 C57BL/6 마우스로부터 단리하고, MACS 완충제(PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA)를 함유하는 겐틀MACS C-튜브(밀테니이 바이오텍, #130-093-237) 내로 옮기고 제조자의 설명서에 따라 겐틀MACS 분리기로 분리하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 세포 현탁액을 예비분리 필터에 통과시켜 잔존하는 분리되지 않은 조직 입자를 제거하였다. 400 x g 및 4℃에서 4분 동안 원심분리한 후, ACK 용해 완충제를 첨가하여 적혈구 세포를 용해시켰다(실온에서 5분 동안 항온처리). 잔존하는 세포를 MACS 완충제로 2회 세척하고 계수하고 뮤린 Pan T 세포의 단리를 위해 사용하였다. 밀테니이 바이오텍의 Pan T 세포 단리 키트(#130-090-861)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 음성(자성) 선택을 수행하였다. 수득된 T 세포 집단을 자동적으로(ViCell) 계수하고 추가 분석을 위해 즉시 사용하였다.
헤파린처리된 혈액으로부터의 일차 사이노몰구스 PBMC의 단리
건강한 사이노몰구스 공여자로부터 수득된 새로운 혈액으로부터 밀도 구배로 말초혈 단핵세포(PBMC)를 다음과 같이 제조하였다: 헤파린처리된 혈액을 멸균 PBS로 1:3으로 희석하고 림포프렙(Lymphoprep) 배지[액손 랩(Axon Lab) #1114545]를 멸균 PBS로 90%까지 희석하였다. 1 부피의 희석된 밀도 구배에 걸쳐 2 부피의 희석된 혈액은 층을 형성하였고, PBMC 분획을 실온에서 브레이크 없이 520 x g에서 30분 동안 원심분리하여 분리하였다. PBMC 밴드를 새로운 50 ㎖ 팔콘 튜브 내로 옮기고 400 x g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 멸균 PBS로 세척하였다. 1회 저속 원심분리를 수행하여 혈소판을 제거하고(150 x g 및 4℃에서 15분), 수득된 PBMC 집단을 자동적으로(ViCell) 계수하고 추가 분석을 위해 즉시 사용하였다.
표적 세포
MCSP 표적화 이중특이적 항원 결합 분자의 평가를 위해, 하기 종양 세포주들을 사용하였다: 악성 흑색종의 전이 부위로부터 유래되고 높은 수준의 인간 MCSP를 발현하는 인간 흑색종 세포주 WM266-4(ATCC #CRL-1676); 중간 수준의 인간 MCSP를 발현하는 인간 흑색종 세포주 MV-3[라드바우드 대학 니히메겐 메디칼 센터(Radboud University Nijmegen Medical Centre)로부터 제공받음]); 높은 수준의 MCSP를 발현하는 인간 악성 흑색종(1차 종양) 세포주 A375(ECACC #88113005); MCSP를 발현하지 않는 인간 결장암 세포주 HCT-116(ATCC #CCL-247); 및 MCSP를 발현하지 않는 인간 백인 결장 선암 세포주 LS180(ECACC #87021202).
CEA 표적화 이중특이적 항원 결합 분자의 평가를 위해 하기 종양 세포주들을 사용하였다: 매우 높은 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 위암 세포주 MKN45(DSMZ #ACC 409); 높은 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 췌장 선암 세포주 HPAF-II(로슈 뉴틀리(Roche Nutley)의증여 종류); 중간 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 1차 췌장 선암 세포주 BxPC-3(ECACC #93120816); 중간 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 여성 백인 결장 선암 세포주 LS-174T(ECACC #87060401); 낮은 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 췌장 선암 세포주 ASPC-1(ECACC #96020930); (매우) 낮은 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 췌장 상피 암종 세포주 Panc-1(ATCC #CRL-1469); CEA를 발현하지 않는 인간 결장암 세포주 HCT-116(ATCC #CCL-247); 인간 CEA를 발현하도록 안정하게 형질감염되게 제작된 인간 선암성 치조 기저상피 세포주 A549-huCEA; 및 인간 CEA를 안정하게 발현하도록 제작된 뮤린 결장암종 세포주 MC38-huCEA.
추가로, 인간 T 세포 백혈병 세포주 Jurkat(ATCC#TIB-152)를 사용하여 상이한 이중특이적 구축물들과 세포 상의 인간 CD3의 결합을 평가하였다.
실시예 1
항- MCSP 항체 M4-3/ML2의 친화성 성숙
올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유도 과정을 통해 친화성 성숙을 수행하였다. 이를 위해, 중쇄 변이체 M4-3 및 경쇄 변이체 ML2를 문헌[Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-4137]에 기재된 것과 유사하게 파지미드 벡터로 클로닝하였다. 먼저 통상적인 상동성 모델링을 통해 항체의 3D 모델을 생성하고, 이어서 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 부위(CDR)의 용매 접근가능한 잔여물을 확인하여 무작위화된 잔여물을 확인하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이 트라이뉴클레오티드 합성에 기초한 무작위화를 갖는 올리고뉴클레오티드를 엘라 바이오테크(Ella Biotech, 독일 뮌헨 소재)로부터 구입하였다. PCR을 통해 통상적인 3개의 독립적인 하위 라이브러리를 생성하고, CDR-H1과 함께 CDR-H2, 또는 CDR-L1과 함께 CDR-L2로 무작위화를 포함하였다. CDR-L3을 별개 접근법으로 무작위화하였다. 이러한 라이브러리의 DNA 단편을 제한 효소 및 결찰을 통해 파지미드로 클로닝하고, 후속적으로 TG1 박테리아로 전기영동하였다.
라이브러리 선택
이와 같이 생성된 항체 변이체를 각각의 입자 내에 포장된 M13의 유전자 III 생성물로의 융합과 같이 사상파지 입자로부터 1가 방식으로 보여주었다. 이어서, 파지-디스플레이 변이체를 이의 생물학적 활성(본원에서, 결합 친화성)에 대하여 스크리닝하고 추가 개발을 위해 하나 이상의 개선된 활성을 갖는 후보자를 사용하였다. 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하기 위한 방법은 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol.(2004) 340, 1073-1093]에서 찾을 수 있다.
모든 친화성 성숙 라이브러리로의 선택은 하기 과정에 따라 용액에서 수행되었다:
1. 각각의 친화성 성숙 라이브러리의 약 1012개의 파지미드 입자를 100 nM 비오틴처리된 도메인)-avi-his(서열번호 118)에 0.5 시간 동안 1 ml의 총 용량으로 결합시켰다.
2. 비오틴처리된 도메인)-avi-his를 포획하고, 구체적으로 5.4 x 107 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 10분 동안 첨가하여 파지 입자와 결합시켰다.
3. 5 내지 10x PBS/트윈(Tween)-20(1 ml) 및 5 내지 10x PBS(1 ml)를 사용하여 비드를 세척하였다.
4. 100 mM TEA(트라이에틸아민)(1 ml)를 10분 동안 첨가하여 파지 입자를 용해하고, 1 M 트리스/HCl(pH 7.4)(500 ㎕)을 첨가하여 중성화하였다.
5. 기하급수적으로 성장하는 에스케리키아 콜라이) TG1 박테리아로 재감염시키고, 헬퍼 파지 VCSM13으로 감염시키고, 이후 파지미드 입자의 PEG/NaCl 침전을 후속 선택 단계에서 사용하였다.
변화없거나 감소하는(10-7 M로부터 2 x 10-9 M까지) 항원 농도를 사용하여 3 내지 5 단계에 걸쳐서 선택을 수행하였다. 단계 2에서, 항원-파지 복합체의 포획을 스트렙타비딘 비드 대신에 뉴트라비딘 플레이트를 사용하여 수행하였다. 특이적인 결합제를 다음과 같이 ELISA로 확인하였다: 웰당 10 nM 비오틴처리된 MCSP(D3 도메인)-avi-his(100 ㎕)를 뉴트라비딘 플레이트 위에 코팅하였다. Fab-함유 박테리아 상청액을 첨가하고, 항-Flag/HRP 2차 항체를 사용하여 결합 Fab를 이의 플래그-태그를 통해 검출하였다. ELISA-양성 클론을 96-웰 포맷으로 가용성 Fab 단편으로서 박테리아에 의해 발현시키고, 프로테온 XPR36[바이오래드(BioRad)]을 사용하여 SPR-분석에 의해 상청액을 동적 스크리닝 실험에 이용하였다. 가장 높은 친화성 상수를 갖는 클론 발현 Fab를 확인하고, 상응하는 파지미드를 서열확인하였다.
[표 1]
(항상 Cys 및 Met는 제외되었다. 올리고뉴클레오티드가 역 프라이머인 경우 Lys는 상부에서 제외되었다.)
Figure pat00002
도 2는 비성숙된 모 클론(M4-3 ML2)과 비교하여 친화성 성숙된 항-MCSP 클론의 정렬을 나타낸다. 중쇄 무작위화를 오직 CDR1 및 CDR2에서 수행하였다 경쇄 무작위화를 CDR1 및 CDR2에서 수행하였고, 독립적으로 CDR3에서 수행하였다.
선택 동안, 프레임워크에서 약간의 돌연변이가 클론 G3에서 F71Y 또는 클론 E10에서 Y87H와 같이 발생하였다.
인간 IgG 1 의 제조 및 정제
친화성 성숙된 변이체의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 각각의 수용자 포유동물 발현 벡터 내로 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 프레임내로 서브클로닝하였다. MPSV 프로모터로 항체 발현을 유도하고, 합성 폴리A 신호 서열을 CDS의 3'-말단에 전달하였다. 추가로, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유하였다.
HEK293 EBNA 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 공형질감염시켜 분자를 생산하였다. 세포를 1:1 비로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
EK293 EBNA 세포를 무혈청 CD CHO 배양 배지에서 현탁 배양하였다. 500 ㎖ 진탕 플라스크에서의 제조를 위해, 4 x 108개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 210 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 미리 가온된 CD CHO 배지(20 ㎖)로 교체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 배지(20 ㎖)에서 DNA의 최종 양(200 ㎍)까지 혼합하였다. PEI 용액(540 ㎕)을 첨가한 후, 혼합물을 15초 동안 볼텍싱한 후, 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 그 후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 500 ㎖ 진탕 플라스크로 옮기고 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기 내에서 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, F17 배지(160 ㎖)를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염으로부터 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드(Feed) 1[론자(Lonza)]을 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후, 정제를 위해 상청액을 210 x g에서 15분 동안 원심분리하여 모으고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터), 0.01%(w/v)의 최종 농도로 나트륨 아자이드를 첨가하고, 4℃에서 보관하였다.
분비된 단백질을 단백질 A를 사용하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트(40 ㎖), 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 염화나트륨(pH 7.5)으로 평형된 하이트랩(HiTrap) 단백질 A HP 컬럼(CV = 5 ㎖, 지이 헬쓰케어) 위에 로딩하였다. 비결합된 단백질을 컬럼 부피의 10배 이상의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 염화나트륨(pH 7.5)으로 세척하여 제거하였다. 표적 단백질을 20 컬럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 염화나트륨(pH 7.5) 내지 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 염화나트륨(pH 2.5)에 걸친 구배 동안 용리하였다. 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가하여 단백질 용액을 중화하였다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후, 20 mM 히스티딘 및 140 mM 염화나트륨 용액(pH 6.0)으로 평형된 하이로드 수퍼덱스(HiLoad Superdex)200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다.
아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 측정하였다. 분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석에 의해 분석하였다. 캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII 시스템[캘리퍼 라이프사이언스(Caliper Lifescience)]을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 샘플(2 ㎍)을 분석을 위해 사용하였다. 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드 및 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7) 런닝 완충제에서 TSKgel G3000 SW XL 분석 크기 배제 컬럼[토소(Tosoh)]을 사용하여 항체 샘플의 응집체 함량을 분석하였다.
[표 2]
친화성 성숙된 항-MCSP IgG의 제조 및 정제
Figure pat00003
친화성 측정
프로테온 ( ProteOn ) 분석
프로테온 XPR36 기기(바이오래드)를 사용하여 25℃에서 CM5 칩에서 아민 커플링 및 이후 박테리아 상청액 또는 정제된 Fab 제제로부터의 Fab의 포획에 의해 고정화된 항-인간 F(ab')2 단편 특이적 포획 항체[잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch) #109-005-006]로 표면 플라즈몬 공명에 의해 KD를 측정하였다. 간단히, 카복시베틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)을 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화하였다. 항-인간 F(ab')2 단편 특이적 포획 항체를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0)로 50 ㎍/ml에서 희석한 후 10 ㎕/분의 유속으로 주입하여 약 10,000 이하의 반응 단위(RU)의 커플링된 포획 항체를 달성하였다. 포획 항체의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응된 기를 차단하였다. 운동 측정을 위해, 박테리아 상청액으로부터의 Fab 또는 정제된 Fab를 10 ㎕/분의 유속으로 300 초 동안 주입하고, 포획 기저 안정화를 위해 300 초 동안 해리하였다. 포획 수준은 100 내지 500 RU의 범위 이내였다. 이후 단계에서, 인간 MCSP(D3 도메인)-avi-his 분해물질을 단일 농도로서 또는 25℃에서 50 ㎕/분의 유속으로 HBS-EP+(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4) 내에 희석된 연속 농도(100 nM 내지 250 pM 범위의 클론 친화성에 따라)로서 주입하였다. 글라이신(pH 1.5)을 30 초 동안 90 ㎕/분의 유속으로 주입한 후 NaOH를 20 초 동안 동일한 유속으로 주입하여 센서칩의 표면을 재생시켰다. 결합 및 해리 센서그램을 동시에 맞추어 단순 1-대-1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델[프로테온 XPR36 평가 소프트웨어 또는 스크러버 소프트웨어(바이오로직(BioLogic)]을 사용하여 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 계산하였다. 비 koff/kon로서 평형 해리 상수(KD)를 계산하였다. 이 데이터를 사용하여 모 항체를 갖는 친화성 성숙된 변이체의 비교 결합 친화성을 측정하였다. 표 3a는 이러한 분석으로부터 생성된 데이터를 나타낸다.
경쇄에 대하여 G3, E10, C5, 및 중쇄에 대하여 D6, A7, B7, B8, C1을 인간 IgG1 포맷으로 전환하기 위해 선택하였다. 경쇄의 CDR1 및 CDR2를 CDR3과 독립적으로 무작위화함으로써, 수득된 CDR을 IgG 전환 동안 조합하였다.
IgG 포맷에서, 인간 MCSP 항원(서열번호 118), 또한 시아노몰구스 동족체(서열번호 117)에 대하여 다시 친화성을 측정하였다.
사용된 방법은 포유동물 생성으로부터 정제된 IgG를 사용하여 단지, Fab 단편에 대하여 기재된 바와 같이 정확하였다.
[표 3a]
Figure pat00004
비아코어 T200을 사용하여 표면 플라즈몬 공명( SPR )에 의해 친화성 측정
비아코어 T200에서 25℃에서 분리 완충액[0.01 M HEPES(pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 독일 프라이부르크 소재]으로서 HBS-EP를 사용하여 친화성 성숙된 IgG의 친화성 및 결합활성을 측정하기 위한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험을 수행하였다.
인간 및 시아노몰구스에 대한 상이한 항-MCSP IgG의 상호작용의 결합활성을 분석하기 위해, 항-펜타 His 항체(퀴아젠)의 약 9,500 공명 단위(RU)의 MCSP D3 직접 커플링을 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩에서 수행하였다. 항원을 60초 동안 30 nM에서 10 ㎕/분으로 각각 포획하였다. IgG를 280개 이상의 유동 세포를 통해 0.0064 내지 100 nM의 농도로 30 ㎕/분의 유속으로 세포에 통과시켰다. 해리를 180 초 동안 모니터링하였다. 벌크 반사 지수 차이를 기준 유동 세포에서 수득된 공명을 빼고 수정하였다. 여기서, IgG는 고정화된 항-펜타 His 항체로 표면 위로 흐르지만, HBS-EP는 인간 MCSP D3 또는 시아노몰구스 MCSP D3보다 오히려 주입되었다.
친화성 측정을 위해, IgG를 고정화된 항-인간 Fc를 사용하여 CM5 센서칩 표면에서 포획하였다. 포획 IgG를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 pH 5.0에서 약 9,500 개의 공명 단위(RU)의 직접 불멸화에 의해 센서칩 표면에 커플링하였다. IgG를 25 초 동안 10 nM로 30 ㎕/분의 유속으로 포획하였다. 인간 및 시아노몰구스 MCSP D3을 유동 세포를 통해 120 초간에 걸쳐서 30 ㎕/분의 유속으로 2 내지 500 nM 농도로 통과시켰다. 해리를 60초 동안 모니터링하였다. 166 및 500 nM 농도에 대한 결합 및 해리를 각각 1200 초 및 600 초 동안 모니터링하였다. 벌크 반사 지수 차이를 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 뺌으로써 정정하였다. 이때, 항원을 고정화된 항-인간 Fc 항체를 갖는 표면 위로 흘렸지만, 항-MCSP IgG 보다는 HBS-EP를 주입하였다.
수치 적분에 의해 1:1 랭뮤어 결합에 대한 반응 속도식을 맞추기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 동역학 상수를 구동하였다.
인간 및 시아노몰구스 MCSP D3에 대한 높은 친화성을 비아코어 T200를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 측정으로 확인하였다. 또한, 결합활성 측정은 2가 결합에서 3배 이하의 증가를 보여줬다(표 3b).
[표 3b]
Figure pat00005
실시예 2
항- MCSP 항체로서 M4-3(C1) ML2(G3) 및 항-CD3 항체로서 인간화된 CH2527을 함유하는 MCSP TCB(도립된 2+1 교차fab - IgG P329G LALA )의 제조
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 각각의 수용체 포유동물 발현 벡터 내에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄로 프레임 내에 서브클로닝하였다. 항체 발현을 MPSV 프로모터에 의해 구동하고 CDS의 3' 말단에서 합성 폴리A 신호 서열을 가졌다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유하였다.
폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 공형질감염시켜 분자를 생성하였다. 세포를 1:2:1:1 비("벡터 중쇄 Fc(홀)":"벡터 경쇄":"벡터 경쇄 교차":"벡터 중쇄 Fc(놉)-Fab교차")로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
HEK293을 형질감염시키기 위해, EBNA 세포를 CD CHO 배양 매질에서 무혈청 현탁액에 배양하였다. 500 ml 진탕 플라스크에서 생성하기 위해, 4억 만개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염시키기 24시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상청액을 미리 가온된 CD CHO 매질(20 ml)로 대체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 매질(20 ml)에서 혼합하여 DNA의 총량(200 ㎍)을 수득하였다. PEI 용액(540 ㎕)을 첨가한 후, 혼합물을 15 초 동안 볼텍싱하고, 이후 10분 동안 상온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃에서 5% CO2 대기의 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, F17 매질(160 ml)을 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염으로부터 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드(Feed) 1(론자)을 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후, 상청액을 15분 동안 210 x g에서 원심분리에 의해 정제하여 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터), 0.01% w/v의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 단백질 A를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)(40 ml)로 평형된 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(CV=5 mL, 지이 헬쓰케어)에 로딩하였다. 비결합 단백질을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로 적어도 10 컬럼 용량으로 세척하여 제거하였다. 표적 단백질을 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로부터 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 2.5)까지의 20 컬럼 용량에 걸친 구배 동안 용리하였다. 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가하여 단백질 용액을 중성화하였다. 표적 단백질을 농축하고, 여과한 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액(pH 6.0)으로 평형된 하이로드 슈퍼덱스(HiLoad Superdex)200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 로딩하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를, 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 흡광도(OD)를 측정하여 결정하였다.
분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석으로 분석하였다. 제조자의 지시에 따라 캘리퍼 랩칩 GXII 시스템(캘리퍼 라이프사이언스)을 사용하였다. 분석을 위해 2 ㎍ 샘플을 사용하였다.
항체 샘플의 총 함량을 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기-배재 컬럼(토소)을 사용하여 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 분리 완충액 중에서 25℃에서 분석하였다.
[표 4a]
Figure pat00006
도 3은 MCSP TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA) 분자의 도식을 보여준다.
도 4 및 표 4b는 MCSP TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA) 분자(서열번호 12, 53, 54 및 55)의 CE-SES 분석을 보여준다.
[표 4b]
Figure pat00007
실시예 3
항- CEA 항체로서 CH1A1A 98/ 99 2F1 및 항-CD3 항체로서 인간화된 CH2527을 함유하는 이중특이적 CEA TCB(도립된 2+1 교차fab - IgG P329G LALA )의 제조
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 각각의 수용체 포유동물 발현 벡터 내에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄로 프레임 내에 서브클로닝하였다. 항체 발현을 MPSV 프로모터에 의해 구동하였고 CDS의 3' 말단에서 합성 폴리A 신호 서열을 갖는다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 공형질감염시켜 분자를 생성하였다. 세포를 1:2:1:1 비("벡터 중쇄 Fc(홀)":"벡터 경쇄":"벡터 경쇄 교차":"벡터 중쇄 Fc(놉)-Fab교차")로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
HEK293을 형질감염시키기 위해, EBNA 세포를 CD CHO 배양 매질에서 무혈청 현탁액에 배양하였다. 500 ml 진탕 플라스크에서 생성하기 위해, 4억 만개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염시키기 24시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상청액을 미리 가온된 CD CHO 매질(20 ml)로 대체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 매질(20 ml)에서 혼합하여 DNA의 총량(200 ㎍)을 수득하였다. PEI 용액(540 ㎕)을 첨가한 후, 혼합물을 15 초 동안 볼텍싱하고, 이후 10분 동안 상온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃에서 5% CO2 대기의 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, F17 매질(160 ml)을 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염으로부터 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1(론자)을 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후, 상청액을 15분 동안 210 x g에서 원심분리에 의해 정제하여 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터), 0.01% w/v의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 단백질 A를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)(40 ml)로 평형된 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(CV=5 mL, 지이 헬쓰케어)에 로딩하였다. 비결합 단백질을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로 적어도 10 컬럼 용량으로 세척하여 제거하였다. 표적 단백질을 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로부터 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 2.5)까지의 20 컬럼 용량에 걸친 구배 동안 용리하였다. 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가하여 단백질 용액을 중성화하였다. 표적 단백질을 농축하고, 여과한 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액(pH 6.0)으로 평형된 하이로드 슈퍼덱스(HiLoad Superdex)200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 로딩하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를, 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 흡광도(OD)를 측정하여 결정하였다.
분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석으로 분석하였다. 제조자의 지시에 따라 캘리퍼 랩칩 GXII 시스템(캘리퍼 라이프사이언스)을 사용하였다. 분석을 위해 샘플(2 ㎍)을 사용하였다.
항체 샘플의 총 함량을 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기-배재 컬럼(토소)을 사용하여 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 분리 완충액 중에서 25℃에서 분석하였다.
[표 5]
CEA TCB의 제조 및 정제 요약
Figure pat00008
도 5는 CEA TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA) 분자의 도면을 보여준다.
도 6 및 표 6은 CEA TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA) 분자(서열번호 22, 56, 57 및 58)의 CE-SDS를 보여준다.
[표 6]
CEA TCB의 CE-SDS 분석
Figure pat00009
대안적인 정제 방법에서, CEA TCB를 단백질 A 친화성 크로마토그래피[맵셀렉트 슈레(MabSelect SuRe)]에의해 수확되고 정화된 발효 상청액으로부터 포획하였다. 이어서, 단백질 A 용해액을 양이온 교환 크로마토그래피[포로스(Poros) 50 HS]에 이용하고, 이후 SE-HPLC 및 모세관 전기영동법에 의해 분획시키고 분석하였다. 분획을 함유하는 생성물을 모으고, 실온에서 결합-용해 방식으로 소수성 상호작용 크로마토그래피(부틸-세파로즈 4FF)에 이용하였다. 이어서, 상기로부터의 용해액을 SE-HPLC 및 모세관 전기영동법에 의해 분획시키고 분석하였다. 분획을 함유하는 생성물을 모으고 이후 흐름 방식으로 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로즈 FF)를 수행하였다. 상기 정제 방법을 사용하여 수득된 물질은 98% 초과의 단량체 함량을 갖는다.
실시예 4
MCSP -발현 및 CD3-발현 세포에 대한 MCSP TCB의 결합
MCSP TCB의 결합을 MCSP-발현 인간 악성 흑색종 세포주(A375) 및 CD3-발현 불멸화된 T 임파 세포주(Jurkat)에서 시험하였다. 간략하게, 세포를 수확하고, 계수하고, 생존력을 확인하고, FACS 완충액(100 ㎕ PBS 0.1% BSA) 중 2 x 106 /ml에서 현탁하였다. 100 ㎕ 세포 현탁액(0.2 x 106 세포 함유)을 MCSP TCB(2.6 pM 내지 200 nM)의 농도 증가와 함께 환저 96-웰 플레이트에서 30분 동안 4℃에서 항온처리하고, 냉 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, PE-결합된 아피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcγ 단편 특이적 2차 항체[잭슨 이뮤노 리서치 랩(Jackson Immuno Research Lab) PE #109-116-170]로 추가 30분 동안 4℃에서 다시 항온처리하고, 냉 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, FACS 칸토(Canto)II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 살아있는 DAPI-음성 세포를 게이팅함으로써 FACS에 의해 즉시 분석하였다. 그래프패드프리즘(GraphPadPrism)5를 사용하여 결합 곡선을 수득하였다(도 7A, A375 세포에 대한 결합, EC50 = 3381 pM; 도 7B, 세포에 대한 결합).
실시예 5
MCSP TCB 항체에 의해 유도된 T 세포 사멸
MCSP TCB 항체에 의해 매개된 T 세포 사멸을 MCSP의 상이한 수준을 발현하는 종양 세포주의 패널을 사용하여 평가하였다(A375 = MCSP 고, MV-3 = MSCP 중간, HCT-116 = MCSP 저, LS180 = MCSP 음성). 간단하게, 표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 환저 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 밤새 부착시켰다. 건강한 인간 기증자로부터 수득된 농후한 림프구 제제(버피 코트)의 히스토페이크(Histopaque) 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조하였다. 신선한 혈액을 멸균 PBS로 희석하고, 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 적층하였다. 원심분리 후(450 x g, 30분, 실온), PBMC-함유 중간상 위의 혈장을 버리고, PBMC를 신규 팔콘 튜브로 옮긴 후 PBS(50 ml)로 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(400 x g, 10분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계 350 x g, 10분). 생성된 PBMC 개체를 자동적으로 계수하고(Vicell), 추가로 사용할 때까지(24시간 이하) 37℃, 5% CO2의 세포 항온처리기로 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민[바이오크롬(Biochrom), K0302]을 함유하는 RPMI1640 매질에서 저장하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 제시된 농도(3회 1 pM 내지 10 nM의 범위)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 효과기 대 표적(E:T) 비로 표적 세포에 첨가하였다. 고사성/괴사성 세포에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH의 정량화에 의해 37℃, 5% CO2에서 24시간 항온처리 후 표적 세포 사멸을 평가하였다[LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), #11 644 793 001]. 표적 세포를 1% 트리톤 X-100으로 항온처리하여 표적 세포의 최대 용리(= 100%)를 달성하였다. 최소 용리(= 0%)는 이중특이적 구축물 없이 효과기 세포로 공항온처리된 표적 세포를 언급한다. 상기의 결과는, MCSP TCB가 MCSP-음성 세포주의 사멸 없이 MCSP-양성 표적 세포주의 강력하고 표적-특이적 사멸을 유도함을 보여준다(도 8, A 내지 D). 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산된 사멸 분석과 관련된 EC50 값을 하기 표 7에 제시하였다.
[표 7]
MCSP TCB 항체에 의해 유도된 MCSP-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸에 대한 EC50 값(pM)
Figure pat00010
실시예 6
MCSP TCB 항체에 의해 유도된 MCSP -발현 종양 세포의 T 세포 사멸 후 CD8 + 및 CD4 + 효과기 세포에서 CD25 및 CD69 상향조절
MCSP TCB 항체에 의해 매개된 MCSP-발현 MV-3 종양 세포의 T 세포 사멸 후 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화를 T 세포 활성화 표지자 CD25(말기 활성화 표지자) 및 CD69(초기 활성화 표지자)를 인식하는 항체를 사용하여 FACS에 의해 평가하였다. 항체 및 사멸 분석 조건은 동일한 항체 범위(3회 1 pM 내지 10 nM), E:T 비 10:1 및 항온처리 시간 24시간을 사용하여 본질적으로 상기한 바와 같다(실시예 5).
항온처리 후, PBMC를 환저 96-웰 플레이트로 옮기고, 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척하였다. CD8(FITC 항-인간 CD8, BD # 555634), CD4(PECy7 항-인간 CD4, BD # 557852), CD69(PE 항-인간 CD69, 바이오레전드 #310906) 및 CD25(APC 항-인간 CD25, BD #555434)에 대한 표면 염색을 공급자의 지시에 따라 수행하였다. 세포를 0.1% BSA를 함유하는 150 ㎕/웰 PBS로 2회 세척하고, 100 ㎕/웰 고정 완충액(BD #554655)을 사용하여 15분 동안 4℃에서 고정시켰다. 원심분리 후, 샘플을 DAPI를 함유하는 200 ㎕/웰 PBS 0.1% BSA에 재현탁하여 FACS 측정을 위한 죽은 세포를 제외하였다. 샘플을 BD FACS 포르테사(Fortessa)로 분석하였다. 상기의 결과는 CD8+(도 9A, B) 및 CD4+ T 세포(도 9C, D)에서 활성화 표지자(CD25, CD69)가 강력하고 표적-특이적 상향 조절을 유도함을 보여준다.
실시예 7
MCSP TCB 항체에 의해 유도된 MCSP -발현 종양 세포의 T 세포 사멸 후 인간 효과기 세포에 의한 사이토카인 분비
MCSP TCB 항체에 의해 유도된 MCSP-발현 MV-3 종양 세포의 T 세포 사멸 후 인간 PBMC에 의한 사이토카인 분비를 사멸 분석 후 세포 상청액의 FACS 분석에 의해 평가하였다.
동일한 항체를 사용하고, 사멸 분석을 10:1의 E:T 비 및 24시간의 항온처리 시간을 사용하여 본질적으로 상기한 바와 같이 수행하였다(실시예 5 및 6).
항온처리 시간의 끝에, 플레이트를 5분 동안 350 x g에서 원심분리하고, 상청액을 신규한 96-웰 플레이트로 옮기고, 후속 분석 때까지 -20℃에서 저장하였다.
BD CBA 인간 가용성 단백질 플렉스 세트를 사용하여 FACS 칸토II에서 제조자의 지시에 따라 세포 상청액으로 분비된 그랜자임 B, TNFα, IFN-γ, IL-2, IL-4 및 IL-10을 검출하였다. 다음 키트를 사용하였다: BD CBA 인간 그랜자임 B BD CBA 인간 그랜자임 B 플렉스 세트 #BD 560304; BD CBA 인간 TNF 플렉스 세트 #BD 558273; BD CBA 인간 IFN-γ 플렉스 세트 #BD 558269; BD CBA 인간 IL-2 플렉스 세트 #BD 558270; BD CBA 인간 IL-4 플렉스 세트 #BD 558272; BD CBA 인간 IL-10 플렉스 세트 #BD 558274.
결과는 MCSP TCB가 사멸시 IL-2, IFN-γ, TNFα, 그랜자임 B 및 IL-10(IL-4가 아님)의 분비를 유도함을 보여준다(도 10, A 내지 F).
이와 함께, 이러한 실시예는,
MCSP-양성 A375 세포에 우수한 결합을 나타내고;
MCSP-양성 표적 세포주의 강력하고 표적-특이적 사멸을 유도하고, MCSP-음성 세포주의 사멸을 유도하지 않고;
사멸 후 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 활성화 표지자(CD25, CD69)의 강력하고 표적-특이적인 상향조절을 유도하고;
사멸시 IL-2, IFN-γ, TNFα, 그랜자임 B 및 IL-10(IL-4가 아님)의 분비를 유도하는, MCSP CD3 이중특이적 항체를 보여준다.
실시예 8
CEA -발현 세포 및 CD3-발현 세포에 대한 CEA TCB의 결합
CEA TCB의 결합을 형질감염된 CEA-발현 폐 선암종 세포(A549-huCEA), 및 CD3-발현 불멸화된 인간 및 시아노몰구스 T 임파 세포주(각각, Jurkat및 HSC-F)에서 시험하였다. 비표적화된 TCB(서열번호 59, 60, 61 및 62; 실시예 24 참조)를 대조군으로서 사용하였다. 간단하게, 세포를 수확하고, 계수하고, 생존력에 대하여 확인하고, FACS 완충액(100 ㎕ PBS 0.1% BSA)에 2 x 106 세포/ml로 재현탁하였다. 세포 현탁액(0.2 x 106 세포 함유)(100 ㎕)을 CEA TCB의 증가하는 농도(61 pM 내지 1000 nM)로 환저 96-웰 플레이트에서 30분 동안 4℃에서 항온처리하고, 냉 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, FITC-결합된 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG F(ab')2 단편 특이적 2차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩 FITC #109-096-097)로 추가 30분 동안 4℃에서 다시 항온처리하고, 냉 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, 살아있는 PI-음성 세포를 게이팅함으로써 FACS 칸토II 또는 포르테사(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 FACS에 의해 즉시 분석하였다. 그래프패드프리즘5를 사용하여 결합 곡선을 수득하였다(도 11A, A549 세포에 대한 결합(EC50 6.6 nM); 도 11B, Jurkat세포에 대한 결합; 도 11C, HSC-F 세포에 대한 결합).
실시예 9
CEA TCB 항체에 의해 유도된 CEA -발현 종양 표적 세포의 T 세포 매개된 사멸
CEA TCB 항체에 의해 유도된 표적 세포의 T 세포 매개된 사멸을 HPAFII(고 CEA), BxPC-3(중간 CEA) 및 ASPC-1(저 CEA) 인간 종양 세포에서 평가하였다. HCT-116(CEA 음성 종양 세포주) 및 비표적화된 TCB를 음성 대조군으로서 사용하였다. 인간 PBMC를 효과기로서 사용하고, 이중특이적 항체로 24시간 및 48시간 항온처리 후 사멸을 검출하였다. 간단하게, 표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 평면-바닥 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 밤새 부착시켰다. 건강한 인간 기증자로부터 수득된 농후된 림프구 제제(버피 코트)의 히스토페이크 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조하였다. 신선한 혈액을 멸균 PBS로 희석하고, 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 적층하였다. 원심분리 후(450 x g, 30분, 실온), PBMC-함유 중간상 위의 혈장을 버리고, PBMC를 신규 팔콘 튜브로 옮긴후 PBS(50 ml)로 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(400 x g, 10분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계; 350 x g, 10분). 생성된 PBMC 개체를 자동적으로(Vicell)로 계수하고, 세포 항온처리기(37℃, 5% CO2) 중 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 매질에서 추가로 사용할 때까지(24시간 미만) 유지하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 제시된 농도(3회 6 pM 내지 100 nM의 농도)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 고사성/괴사성 세포(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH(락테이트 데하이드로게나아제)의 정량화에 의해 24시간 및 48시간 항온처리 후 표적 세포 사멸을 평가하였다. 표적 세포를 1% 트리톤 X-100으로 항온처리하여 표적 세포의 최대 용리(= 100%)를 달성하였다. 최소 용리(= 0%)는 이중특이적 항체가 없는 효과기 세포로 공항온처리된 표적 세포를 지칭한다. 결과는, CEA TCB가 CEA-양성 표적 세포의 강력하고 표적-특이적 사멸을 유도함을 보여준다(도 12, A 내지 H). 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산된 사멸 분석과 관련된 EC50 값을 하기 표 8에 제시하였다.
[표 8]
CEA 수용체 복제 수 및 CEA TCB 항체에 의해 유도된 CEA-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸에 대한 EC50 값(pM)
Figure pat00011
실시예 10
CEA -발현 종양 표적 세포의 CEA TCB - 매개된 사멸 5일 후 T 세포 증식 및 활성화
T 세포 증식 및 활성화를 HPAFII(고 CEA), BxPC-3(중간 CEA) 및 ASPC-1(저 CEA) 세포에서 평가된 CEA-발현 종양 표적 세포의 CEA TCB-매개된 사멸 5일 후 검출하였다. HCT-116(CEA 음성 종양 세포주) 및 비표적화된 TCB를 음성 대조군으로서 사용하였다. 증식 분석을 위한 실험 조건은 실시예 9에 기재된 것과 유사하지만, 10,000개 표적 세포만 96-평면 바닥 웰 플레이트의 웰당 플레이팅하였다. T 세포 증식을 평가하기 위해, 신선하게 단리된 PBMC를 CFSE(시그마 #21888)를 사용하여 표지하였다. 간단하게, CFSE 스톡 용액을 희석하여 100 μM의 작동 용액을 수득하였다. 90 x 106 PBMC 세포를 CFSE 작동 용액(90 ㎕)이 보충된 미리-가온된 PBS(90 ml)에 재현탁하였다. 세포를 즉시 혼합하고, 15분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 미리-가온된 FCS(10 ml)를 세포에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 세포를 10분 동안 400 x g에서 원심분리하고, 매질(50 ml)에 재현탁하고, 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 따뜻한 매질로 1회 세척하고, 계수하고, 매질에서 재현탁하고, 사멸 분석 및 이후 10:1의 E:T에서 세포 증식 및 활성화를 측정하기 위해 표적 세포에 첨가하였다. CFSE 염료 희석의 정량화에 의해 CD4 및 CD8 양성 T 세포에서 사멸 5일 후 증식을 평가하였다. 항-인간 CD25 항체를 사용하여 동일한 T 세포 부분집합에서 CD25 발현을 평가하였다. 간단하게, 원심분리 후(4분 동안 400 x g), 세포를 재현탁하고, FACS 완충액으로 세척하고, 희석된 CD4/CD8/CD25 항체 믹스(25 ㎕)로 30분 동안 4℃에서 항온처리하였다(APC/Cy7 항-인간 CD4 #317418, APC 항-인간 CD8 #301014, PE/Cy7 항-인간 CD25 #302612). 이어서, 세포를 3회 세척하여 비결합된 항체를 제거하고, 최종적으로 프로피듐 요오다이드(PI)를 함유하는 FACS 완충액(200 ㎕)에 재현탁하여 FACS 측정을 위해 죽은 세포를 제외하였다. BD FACS 칸토II를 사용하여 형광을 측정하였다. 결과는, CEA TCB가 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 강력하고 표적-특이적인 증식(도 13, A 내지 D) 뿐만 아니라 CD25 활성화 표지자에 상향 조절에 의해 검출된 이들의 활성화(도 13, E 내지 H)를 유도함을 보여준다.
실시예 11
CEA TCB에 의해 유도된 CEA -발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸 후 인간 효과기 세포에 의한 사이토카인 분비
사멸 48시간 후 세포 상청액의 FACS 분석(CBA 키트)에 의해 CEA TCB에 의해 유도된 CEA-발현 MKN45 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸 후 인간 PBMC에 의한 사이토카인 분비를 평가하였다.
실험 조건은 실시예 9에 기재된 것과 동일하다. 항온처리 시간의 끝에, 플레이트를 5분 동안 350 x g에서 원심 분리하고, 상청액을 신규한 96-웰 플레이트로 옮기고, 이후 분석 때까지 -20℃에서 저장하였다. 세포 상청액에 분비된 IFN-γ(A), TNFα(B), 그랜자임 B(C), IL-2(D), IL-6(E) 및 IL-10(F)을 FACS 칸토II에서 제조자의 지시에 따라 BD CBA 인간 가용성 단백질 플렉스 세트를 사용하여 검출하였다. 하기 키트를 사용하였다: BD CBA 인간 IL-2 BD 플렉스 세트 #BD 558270; BD CBA 인간 그랜자임 B BD 플렉스 세트 #BD 560304; BD CBA 인간 TNF 플렉스 세트 #BD 558273; BD CBA 인간 IFN-γ 플렉스 세트 #BD 558269; BD CBA 인간 IL-4 플렉스 세트 #BD 558272; BD CBA 인간 IL-10 플렉스 세트 #BD 558274.
결과는, CEA TCB 매개된 사멸(이지만 비표적화된 TCB 대조군에 의해 매개된 사멸이 아님)이 IFN-γ, TNFα, 그랜자임 B, IL-2, IL-6 및 IL-10의 분비를 유도함을 보여준다(도 14, A 내지 F).
실시예 12
shed CEA(sCEA)의 농도 증가하에 표적 세포의 T 세포 매개된 사멸
shed CEA(sCEA 2.5 ng/ml 내지 5 ㎍/ml)의 농도 증가의 존재하에 CEA TCB에 의해 유도된 CEA-발현 종양 표적 세포(LS180)의 T 세포 매개된 사멸을 평가하였다. 인간 PBMC를 효과기 세포로서 사용하고 이중특이적 항체 및 sCEA로 항온처리 24시간 및 48시간 후 사멸을 검출하였다. 간단하게, 표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 평면-바닥 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 밤새 부착시켰다. 건강한 인간 기부자로부터 수득된 농후한 림파구 제제(버피 코트)의 히스토페이크 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조하였다. 신선한 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 적층하였다. 원심분리 후(450 x g, 30분, 실온), PBMC-함유 중간상 위의 혈장을 버리고 PBMC를 신규한 팔콘 튜브로 옮긴 후 PBS(50 ml)로 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(400 x g, 10분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계: 350 x g, 10분). 생성된 PBMC 개체를 자동적으로(Vicell) 계수하고, 항온처리기(37℃, 5% CO2)에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI164 배지에서 추가 사용까지(24시간 미만) 유지하였다. 사멸 분석을 위해, CEA TCB 항체를 1 nM의 고정된 농도에서 사용하고, sCEA를 2.5 ng/ml 내지 5 ㎍/ml의 농도 범위에서 실험으로 스파이킹하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 고사성/괴사성 세포(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH(락테이트 데하이드로게나아제)의 정량에 의해 항온처리 24시간 및 48시간 후 표적 세포 사멸을 평가하였다. 표적 세포를 1% 트리톤 X-100으로 항온처리하여 표적 세포의 최대 용리(= 100%)를 달성하였다. 최소 용리(= 0%)는 이중특이적 항체가 없는 효과기 세포로 공항온처리된 표적 세포를 지칭한다. sCEA의 부재하에 CEA TCB에 의해 매개된 사멸을 100%로 설정하고, sCEA의 농도 증가의 존재하에 수득된 사멸을 이에 정규화하였다. 결과는, sCEA가 CEA-발현 표적 세포의 CEA TCB-매개된 사멸에 오직 적은 영향을 가짐을 보여준다(도 15 A 및 B). T 세포 사멸에서 0.2 ㎍/ml 이하의 sCEA로검출된 효과는 없었다. 0.2 ㎍/ml을 초과하는 sCEA 농도는 전체 사멸에 약간의 영향만 끼친다(10 내지 50% 감소).
실시예 13
효과기 세포로서 인간 및 시아노몰구스 PBMC를 사용하여 표적 세포의 T 세포 매개된 사멸
CEA TCB 항체로 21시간 및 40시간 항온처리 후 인간 CEA(A549-hCEA)를 발현하는 A549(폐 선암종) 세포의 T 세포 매개된 사멸을 평가하고, 효과기 세포로서 인간 PBMC 또는 시아노몰구스 PBMC를 평가하였다. 간단하게, 표적 세포 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 평면-바닥 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 수 시간 동안 부착시켰다. 건강한 인간 기증자 또는 건강한 시아노몰구스 원숭이로부터 수득된 농후한 림프구 제제(버피 코트)의 히스토페이크 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조하였다. 후자를 위해, 90% 히스토페이크-PBS 밀도 구배를 사용하였다. 신선한 혈액을 멸균 PBS로 희석하고, 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 적층하였다. 원심분리 후(각각, 인간 PBMC에 대하여 450 x g, 30분, 실온; 시아노몰구스 PBMC에 대하여 520 x g, 30분, 실온), PBMC-함유 중간상 위의 혈장을 버리고, PBMC를 신규 팔콘 튜브로 옮기고, 이후 PBS(50 ml)로 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(400 x g, 10분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계: 350 x g, 10분). 시아노몰구스 PBMC를 제조하기 위해, 추가 저속 원심분리 단계를 150 x g에서 15분 동안 수행하였다. 생성된 PBMC 개체를 자동적으로(Vicell) 계수하고, 세포 항온처리기(37℃, 5% CO2)에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 매질에서 추가 사용까지(4시간 이하) 유지하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 제시된 농도(3회, 6 pM 내지 100 nM의 범위)로 첨가하였다. PBMC를 410:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 고사성/괴사성 세포(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH(락테이트 데하이드로게나아제)의 정량에 의해 21시간 및 40시간 항온처리 후 표적 세포 사멸을 평가하였다. 표적 세포의 최대 용리(= 100%)는, 표적 세포를 1% 트리톤 X-100으로 항온처리하여 달성하였다. 최소 용리(= 0%)는 이중특이적 항체가 없는 효과기 세포로 공항온처리된 표적 세포를 지칭한다. 결과는, CEA TCB가 인간(도 16A 및 C) 및 시아노몰구스(도 16B 및 D) 효과기 세포(PBMC)를 사용하여 CEA-양성 표적 세포의 표적-특이적 사멸을 매개함을 보여준다. 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산된 40시간 사멸에 관한 EC50 값은 인간 PBMC에 대하여 306 pM 및 시아노몰구스 PBMC에 대하여 102 pM이다.
실시예 14
CEA TCB 항체에 의해 유도된 CEA -발현 인간 결장암 세포주의 T 세포 매개된 사멸
0.8 nM, 4 nM 및 20 nM의 인간 PBMC 및 CEA TCB 항체로 48시간 항온처리 후 CEA-발현 인간 결장암 세포주의 T 세포 매개된 사멸을 평가하였다. 간단하게, PBMC를 하나의 건강한 기증자로부터 수득된 백혈구 콘으로부터 단리하였다. 세포를 PBS(1:10)로 희석하고, 50 mL 팔콘 튜브에서 림포프렙에 적층하였다. 원심분리 후(25분 동안 1800 rpm), PBMC 층을 계면으로부터 회수하고, PBS로 4회 세척하였다. PBMC를 계수하고, 40 x 106 세포/mL에서 제어율 냉동 조건하에 FCS 중 10% DMSO에 냉동시키고, 추가 사용까지 액체 질소에서 저장하였다. T 세포 사멸 분석을 위해, 종양 세포를 냉동된 스톡으로부터 96-웰 플레이트에 직접 플레이팅하였다. 세포를 신속하게 녹이고, 미리-가온된 배지로 즉시 옮기고, 원심분리하고, 완전 매질[DMEM, 이스코브스(Iscoves) 또는 RPMI-1640, 10% FCS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 모두 보충됨]에 재현탁하고, 2.5 x 104 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 이어서, 플레이트를 가습식 10% CO2 항온처리기에서 37℃에서 항온처리하고, 다음날 매질을 1% 글루타민 및 CEA TCB(50 ㎕)를 갖는 RPMI 2% FCS(100 ㎕)(6.4 내지 20000 pM의 최종 농도, 1:5 역가 단계, 각각의 조건에 대하여 중복 웰)로 대체하였다. 새로 녹인 PBMC를 분석을 위해 사용하고(분석 시작 2시간 이내에 냉동 바이알로부터 녹임), 50 ㎕(3 x 105)를 각각의 웰에 첨가하여 10:1의 효과기:표적(E:T) 비를 수득하였다. 트리톤 X100(50 ㎕, 4%)을 표적 세포(150 ㎕)에 첨가하여 최대 방출 값을 수득하였다. 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 항온처리하고, 제조자의 지시에 따라 락토스 데하이드로게나아제 세포독성 검출 기트[로슈(Roche)]를 사용하여 사멸 활성을 측정하였다. 특이적 세포 용리율을 다음과 같이 계산하였다:
[샘플 방출 - 자연 방출]/[최대 방출 - 자연 방출] x 100.
도 17A 내지 C는, 31개 결장암 세포주(x 축에 나열됨)에 대한 CEA 발현(QIFIKIT를 사용하여 정량화된 수용체 복제 수, 하기 참조)와 사멸율 사이의 상관관계를 보여준다. 도 17D는, 20 nM의 CEA TCB에서 CEA 발현과 특이적 용리율 사이의 상관관계를 보여주고[스피어만 상관관계(Spearman correlation) = 0.7289, p < 0.0001, n = 31], 높은 CEA 수용체 복제 수(50,000 초과)를 나타내는 종양 세포는 CEA TCB에 의한 효율적으로 용리되는 반면, 낮은 CEA 수용체 복제 수(10,000 미만)를 나타내는 세포의 클러스터는 동일한 실험 조건하에 CEA TCB에 의해 용리되지 않음을 보여준다. 도 17E는, CEA 발현과 CEA TCB의 EC50 사이의 상관관계를 보여준다. 상관관계가 통계적으로 유의하지 않을지라도(스피어만 상관관계 = -0.3994, p = 0.1006, R2 = 0.1358), 그래프는 높은 CEA 수용체 복제 수를 나타내는 종양 세포주에서 더 나은 CEA TCB 효능(즉, 낮은 EC50 값)의 패턴을 명백히 보여준다.
암 세포주에서 CEA 표면 발현을 분석하기 위해, Qifikit[다코사이토매이션(DakoCytomation), 덴마트 글로스트럽 소재]를 사용하여 형고아 신호를 측정하고, 세포당 결합 부위의 수를 측정하였다. 세포를 얼음에서 30분 동안 마우스 항-인간 CEACAM5 단클론 항체[5 x 105 세포에 대하여 0.5 ㎍, 클론: CI-P83-1, sc-23928, 산타크루즈(Santa Cruz)]와 함께 항온처리하고, PBS1X-BSA 0.1%로 2회 세척한 후 Qifikit에서 제공된 다클론 플루오레세인 이소티오시아네이트-결합된 염소 항-마우스 항체와 함께 45분 항온처리하였다. 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 염색을 사용하여 분석으로부터 죽은 세포를 제거하였다. 시안(CyAn: 상표) ADP 분석기[베그만 코울터(Beckman Coulter)]로 샘플을 분석하였다. 수미트(Summit) 4.3 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한 후 모든 평균 형광 강도(MFI)를 수득하였다. 이러한 MFI를 사용하여, 보정 곡선(Qifikit 보정 비드)으로부터 수득된 수학식을 사용하여 세포주(생성물의 CEA 복제 수로서 명명됨)에서 항체 결합 부위의 비례수를 측정하였다.
T 세포 사멸 분석을 위해 결장암 세포주를 사용하고, CEA 표면 발현 정량을 저온바이알로부터 시딩하였다. 냉동된 스톡을 유지하기 위해 사용된 방법은 문헌[Bracht et al., (2010), Br J Cancer 103, 340-346]에 기재되어 있다.
실시예 15
인간 PBMC와 공접합된 LS174T - fluc2 인간 결장암( E:T 비 5: 1)에서 CEA TCB의 생체 내 항종양 효능
NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스(n=12)에 PBS 중 100 ㎕의 총 용량으로 인간 PBMC와 미리-혼합된 1 x 106 LS174T-fluc2 세포를 피하 주입하였다(E:T 비 5:1). LS174T-fluc2 세포를 조작하여 루시퍼라아제를 발현시키고, 이를 비침습적이고 고도로 민감한 방식의 생물발광(BLI)에 의해 종양 진행을 모니터링시켰다. 초기 및 지연된 치료 효과를 평가하기 위해, 종양 세포/PBMC 공접합 s.c.의 시작일로부터 1일 후(초기 치료) 또는 7일 후(지연된 치료) 마우스에 CEA TCB를 주당 2회씩 0.5 또는 2.5 mg/kg 정맥내 주입하였다. 대조군으로서, 마우스의 하나의 군에 주당 2회씩 CEA TCB에서와 동일한 포맷(이 경우, LS174T-fluc2 세포는 MCSP를 발현하지 않기 때문에 MCSP TCB는 비표적화된 대조군으로서 작용한다)을 갖는 대조군 TCB를 주당 2회씩 2.5 mg/kg TCB를 정맥내 주입하고, 추가 대조군 군에 시작일로부터 1일에 오직 PBS(비히클)을 주입하였다. 디지탈 캘리퍼로 1주에 1회 종양 부피를 측정하였다. 또한, 마우스에 D-루시페린을 1주에 1회 복강내 투여하고, IVIS 스펙트럼[퍼킨 엘머(Perkin Elmer)]으로 살아있는 종양 세포의 생물발광 광 방출을 측정하였다. 종양 세포 접종으로부터 19일까지 치료제를 투여하였고, 이는 연구 종료일에 상응한다. 상기 실험의 결과를 도 18A 내지 D에 도시하였다. 결과는 상이한 연구 군[초기 치료(A, B), 지연된 치료(C, D)]에서 캘리퍼(A 및 C) 및 생물발광[토탈 플럭스, B 및 D)에 의해 측정된 12마리 마우스의 종양 부피의 평균 및 SEM을 보여준다.
실시예 16
인간 PBMC와 공 접합된 LS174T - fluc2 인간 결장암( E:T 비 1: 1)에서 CEA TCB의 생체 내 항종양 효능
NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스(n=10)에 PBS 중 100 ㎕의 총 용량으로 인간 PBMC와 미리-혼합된 1 x 106 LS174T-fluc2 세포(실시예 15 참조)를 피하 주입하였다(E:T 비 5:1). 초기 및 지연된 치료 효과를 평가하기 위해, 종양 세포 접종 후 시작일로부터 1일 후(초기 치료) 또는 7일 후(지연된 치료) 마우스에 MCSP TCB를 주당 2회씩 2.5 mg/kg 정맥내 주입하였다. 대조군으로서, 마우스의 하나의 군에 MCSP TCB를 주당 2회씩 2.5 mg/kg 정맥내 주입하고(또한 실시예 15 참조), 추가 대조군 군에 시작일로부터 1일에 오직 PBS(비히클)을 주입하였다. 디지탈 캘리퍼로 1주에 1회 종양 부피를 측정하였다. 또한, 마우스에 D-루시페린을 1주에 1회 복강내 투여하고, IVIS 스펙트럼(퍼킨 엘머)으로 살아있는 종양 세포의 생물발광 광 방출을 측정하였다. 종양 세포 접종으로부터 23일까지 치료제를 투여하였고, 이는 연구 종료일에 상응한다. 상기 실험의 결과를 도 19에 도시하였다. 결과는 상이한 연구 군(n=10)에서 캘리퍼(A) 및 생물발광(B)에 의해 측정된 종양 부피의 평균 및 SEM을 보여준다.
실시예 17
면역성 huCD3ε / huCEA형질변환 마우스의 Panco2 - huCEA 정위 종양 모델에서 뮤린화된 CEA TCB의 생체 내 효능
huCD3ε/huCEA형질변환 마우스(n=10)에 PBS 중 10 ㎕의 총 용량으로 2 x 105 Panco2-huCEA 세포를 췌장 내 주입하였다. 뮤린 세포가 CEA를 발현하지 않으므로, 뮤린 췌장 암 세포주(Panco2)를 조작하여 CEA TCB에 대한 표적 항원으로서 인간 CEA를 과발현시켰다. 마우스에 0.5 mg/kg의 뮤린화된 CEA TCB 또는 대조군 군(비히클)으로서 PBS와 함께 주당 2회씩 정맥내 주입하고, 생존을 모니터하였다. 임상 증상 및 부작용을 검출하기 위해 동물을 매일 관리하였다. 동물에 대한 종료 기준은 시각적 질환, 즉, 지저분한 털, 굽은 등, 호흡 장애, 이동 장애이었다. 전체 생존에 대한 결과를 도 20에 도시하였다. 결과는 시점당 동물의 생존율을 보여준다. 치료 군 대 PBS 대조군 군의 유의성을 t-분포 검정을 사용하여 비교하였다(p=0.078).
실시예 18
표면 플라즈몬 공명( SPR )에 의한 CEA 및 CD3에 대한 CEA TAB의 친화성
분리 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 25℃에서 비아코어 T100에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험을 수행하였다.
친화성 측정을 위해, CEA TCB를 고정화된 항-인간 Fab(지이 헬쓰케어 #28-9583-25)를 사용하여 CM5 센서칩 표면에 포획하였다. 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 pH 5.0에서 약 10,000 공명 단위(RU)의 직접 고정화에 의해 포획 IgG를 센서칩 표면에 결합시켰다.
인간 CD3ε stalk-Fc(놉)-Avi/CD3δ-stalk-Fc(홀)(각각 서열번호 120 및 121)에 대한 상호작용을 분석하기 위해, CEA TCB를 30 초 동안 50 nM에서 10 ㎕/분으로 포획하였다. CD3ε/CD3δ를 30 ㎕/분의 유속으로 0.68 내지 500 nM의 농도로 유동 세포를 통해 360초간에 걸쳐서 통과시켰다. 해리를 360초 동안 모니터하였다.
TCB 분자를 40 초 동안 10 ㎕/분으로 포획하여 CEA TCB와 재조합 종양 표적 항원 인간 NABA-avi-his(C-말단 avi 6his 태그를 갖는 인간 CEACAM의 N, A1 및 A2 도메인에 의해 둘러쌓인 인간 CEA(CEACAM5)의 B3 도메인을 함유함; 서열번호 119 참조) 사이의 상호작용의 KD 값을 측정하였다. 항원을 유동 세포로 240 초 동안 0.68 내지 500 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 유속으로 흘렸다. 해리를 240 초간에 걸쳐서 측정하였다.
기준 유동 세포에 수득된 응답을 뺌으로써 벌크 반사 지수 차이를 교정하였다. 여기서, 항원을 고정화된 항-인간 Fab 항체를 갖는 표면 위로 흘렸지만 HSP-EP를 CEA 보다 주입하였다.
비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 동역학 상수를 유도하여, 수치 적분에 의해 1:1 랭뮤어 결합에 대한 반응 속도식을 맞췄다. 하기 수학식을 사용하여 상호작용의 반감기(t1/2)를 계산하였다:
t1/2 = ln2/koff.
CEA TCB는 인간 NABA에 대하여 62 nM 및 인간 CD3ε/CD3δ에 대하여 75.3 nM의 KD 값을 갖는 nM 범위에서 종양 표적 및 CD3ε/CD3δ에 결합한다. NABA에 결합하는 1가의 반감기는 5.3 분이고, CD3ε/CD3δ에 결합하는 반감기는 5.7 분이다. 운동 값을 하기 표 9에 요약하였다.
[표 9]
인간 NABA 및 인간 CD3ε/CD3δ에 대한 CEA TCB의 친화성(T = 25℃)
Figure pat00012
실시예 19
표면 플라즈몬 공명( SPR )에 의한 MCSP 및 CD3에 대한 MSCP TCB의 친화성
분리 완충액으로 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 25℃에서 비아코어 T100으로 표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험을 수행하였다.
친화성 측정을 위해, MCSP TCB를 고정화된 항-인간 Fab(지이 헬쓰케어 #28-9583-25)를 갖는 CM5 센서칩 표면에 포획하였다. 포획 IgG를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 pH 5.0에서 약 7,500 공명 단위(RU)의 직접 고정화에 의해 센서칩 표면에 결합하였다. MCSP TCB를 60초 동안 30 nM에서 10 ㎕/분으로 포획하였다. 인간 및 시아노몰구스 MCSP D3(각각 서열번호 118 및 117 참조)을 90초간에 걸쳐서 유동 세포를 통해 30 ㎕/분의 유속으로 0.024 내지 50 nM의 농도로 통과시켰다. 인간 및 시아노몰구스 CD3ε stalk-Fc(놉)-Avi/CD3δ-stalk-Fc(홀)에 대한 농도 범위는 1.17 내지 600 nM이었다. 뮤린 MCSP D3(서열번호 122)과의 상호작용이 약한 것으로 예상되었기 때문에 이 항원에 대한 농도 범위는 3.9 내지 500 nM로 선택되었다. 모든 상호작용에 대한 해리를 120 초 동안 모니터하였다. 기준 유동 세포에 수득된 응답을 뺌으로써 벌크 반사 지수 차이를 교정하였다. 여기서, 항원을 고정화된 항-인간 Fab 항체를 갖는 표면 위로 흘렸지만 HBS-EP를 MCSP TCB 보다 주입하였다.
비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 동역학 상수를 유도하여, 수치 적분에 의해 1:1 랭뮤어 결합에 대한 반응 속도식을 맞췄다. MCSP TCB와 뮤린 MCSP D3에 대한 상호작용을 정지 상태에서 측정하였다. 하기 수학식을 사용하여 상호작용의 반감기(t1/2)를 계산하였다:
t1/2 = ln2/koff.
MCSP TCB는 인간에 대하여 0.15 nM 및 시아노몰구스 항원에 대하여 0.12 nM의 KD 값을 갖는 pM-범위에서 종양 표적에 결합한다. 재조합 CD3ε/CD3δ는 78 nM(인간) 및 104 nM(시아노몰구스)의 KD 값을 갖는 MCSP TCB에 의해 결합된다. 1가 결합의 반감기는 종양 표적에 대하여 260분 이하 및 CD3e/CD3d에 대하여 2.9분이다. 친화성 성숙시 수득된 MCSP 항체는 재조합 뮤린 MCSP D3에 일부 결합한다. 이 상호작용에 대한 KD 값은 mM 범위(1.6 mM)이다. 동적 값을 하기 표 10에 요약하였다.
[표 10]
인간, 시아노몰구스 및 뮤린 MCSP D3 및 인간 및 시아노몰구스 CD3ε/CD3δ에 대한 MCSP TCB의 친화성(T = 25℃)
Figure pat00013
실시예 20
CEA TCB의 열 안정성
CEA TCB의 열 안정성을 동적 광 산란(DLS)으로 모니터하였다. 0.5 mg/ml의 단백질 농도의 여과된 단백질 샘플(30 ㎍)을 다이나프로(Dynapro) 플레이트 판독기[와이어트 테크놀로지 코포레이션(Wyatt Technology Corporation), 미국 소재]에 2회 적용하였다. 수집되는 반경 및 총 산란 강도와 함께 온도를 0.05℃/분으로 20℃로부터 75℃로 증가시켰다.
결과를 도 21에 도시하였다. CEA TCB의 응집 온도를 55℃에서 측정하였다.
실시예 21
MCSP TCB의 열 안정성
CEA TCB의 열 안정성을 동적 광 산란(DLS)으로 모니터하였다. 0.5 mg/ml의 단백질 농도의 여과된 단백질 샘플(30 ㎍)을 다이나프로 플레이트 판독기(와이어트 테크놀로지 코포레이션, 미국 소재)에 2회 적용하였다. 수집되는 반경 및 총 산란 강도와 함께 온도를 0.05℃/분으로 20℃로부터 75℃로 증가시켰다.
결과를 도 22에 도시하였다. MCSP TCB의 응집 온도를 55℃에서 측정하였다.
실시예 22
MCSP TCB 및 MCSP 1+1 교차Mab 항체에 의해 유도된 MCSP -발현 종양 표적 세포의 T 세포 매개된 사멸
MCSP TCB 및 MCSP 1+1 교차Mab TCB(도 1D에 도시된 분자 포맷을 갖는, MCSP TCB로서 동일한 CD3 및 MCSP 결합 서열을 갖는 T 세포 활성화 이중특이적 항체) 항체에 의해 유도된 표적 세포의 T 세포 매개된 사멸을 A375(고 MCSP), MV-3(중간 MCSP) 및 HCT-116(저 MCSP) 종양 표적 세포에서 평가하였다. LS180(MCSP 음성 종양 세포주)을 음성 대조군으로서 사용하였다. 항체 및 효과기 세포(인간 PBMC)로 항온처리한 후 24시간 및 48시간에 종양 세포 사멸을 평가하였다. 간단하게, 표적 세포 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 평면-바닥 96-웰 플레이트를 사용하여 25 000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 방치하여 밤새 부착시켰다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 인간 기증자로부터 수득된 풍부한 림프구 제제(버피 코트)를 히스토페이트 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 신선한 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 적층하였다. 원심분리 후(450 x g, 30분, 실온), PBMC-함유 중간상 위의 혈장을 버리고, PBMC를 신규 팔콘 튜브로 옮긴 후 PBS(50 ml)로 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(400 x g, 10분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계 350 x g, 10분). 생성된 PBMC 개체를 자동적으로(ViCell) 계수하고, 추가로 사용할 때까지(24시간 미만) 세포 항온처리기(37℃, 5% CO2) 중 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에서 유지하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 제시된 농도(0.01 pM 내지 10 nM 범위, 3회)로 첨가하였다. 10:1의 최종 E:T 비로 PBMC를 표적 세포에 첨가하였다. 고사성/괴사성 세포(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH(락테이트 데하이드로게나아제)의 정량에 의해 24시간 및 48시간 항온처리 후 표적 세포 사멸을 평가하였다. 표적 세포를 1% 트리톤 X-100으로 항온처리하여 표적 세포의 최대 용리(= 100%)를 달성하였다. 최소 용리(= 0%)는 이중특이적 항체 없이 효과기 세포로 공항온처리된 표적 세포를 지칭한다. 결과는, 시점 및 모든 종양 표적 세포 둘다에서 MCSP-양성 표적 세포의 더 강한 사멸을 유도함으로써 MCSP TCB 항체가 MCSP 1+1 교차Mab TCB보다 더욱 강력함을 보여준다(도 23 A 내지 H). 그래프패드프리즘 5를 사용하여 계산된 사멸 분석에 관한 EC50 값을 하기 표 11에 제시하였다.
[표 11]
MCSP TCB 항체에 의해 유도된 MCSP-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸에 대한 MCSP 수용체 복제 수 및 EC50 값(pM)
Figure pat00014
실시예 23
MCSP TCB 및 MCSP 1+1 교차Mab 항체에 의해 유도된 MCSP -발현 종양 세포의 세포 매개된 사멸 후 CD8 + 및 CD4 + 효과기 세포에서 CD25 및 CD69 상향조절
T 세포 활성화 표지자 CD25(늦은 활성화 표지자) 및 CD69(이른 활성화 표지자)를 인지하는 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 MCSP TCB 및 MCSP 1+1 교차Mab 항체에 의해 매개된 MCSP-발현 종양 세포(A375 및 MV-3)의 T 세포 사멸 후 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화를 평가하였다. 항체 및 사멸 분석 조건은 본질적으로 상기한 바와 같고(실시예 22), 동일한 항체 농도 범위(0.01 pM 내지 10 nM, 3회), 10:1의 E:T 비, 및 48시간의 항온처리 시간을 사용하였다.
항온처리 후, PBMC를 환저 96-웰 플레이트로 옮기고, 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척하였다. CD8(FITC 항-인간 CD8, BD #555634), CD4(PECy7 항-인간 CD4, BD #557852), CD69(PE 항-인간 CD69, 바이오레전드(Biolegend) #310906) 및 CD25(APC 항-인간 CD25, BD #555434)에 대한 표면 염색을 공급처의 지시에 따라 수행하였다. 세포를 0.1% BSA를 함유하는 150 ㎕/웰 PBS로 2회 세척하고, 100 ㎕/웰 고정 완충액(BD #554655)을 사용하여 15분 동안 4℃에서 고정시켰다. 원심분리 후, 샘플을 DAPI를 함유하는 200 ㎕/웰 PBS 0.1% BSA에 재현탁하여 FACS 측정을 위해 죽은 세포를 제거하였다. 샘플을 BD FACS 포르테사로 분석하였다. 결과는, MCSP TCB가 사멸 후 CD8+ T 세포[도 24 A, B( A375 세포에 대하여) 및 E, F(MV-3 세포에 대하여)] 및 CD4+ T 세포[도 24 C, D(A375 세포에 대하여) 및 G, H(MV-3 세포에 대하여)]에서 활성화 표지자(CD25, CD69)의 강력한 표적-특이적 상향조절을 유도함을 보여준다. 사멸 결과에서처럼, T 세포의 활성화는 MCSP 1+1 교차Mab보다 MCSP TCB와 더 강력하다.
실시예 24
비결합 항체로서 DP47 GS 및 항-CD3 항체로서 인간화된 CH2527을 함유하는 DP47 GS TCB(도립된 2+1 교차fab - IgG P329G LALA = " 비표적화된 TCB ")의 제조
"비표적화된 TCB"를 상기 실험에서 대조군으로서 사용하였다. 이중특이적 항체는 CD3ε를 개입시키지만 임의의 다른 항원에 결합하지 않고 따라서 임의의 표적 세포에 대하여 T 세포를 교차연결할 수 없다(이후 임의의 사멸을 유도할 수 없다). 따라서, 임의의 비특이적 T 세포 활성화를 모니터하기 한 분석에서 음성 대조군으로서 사용하였다.
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 각각의 수용체 포유동물 발현 벡터로 예비-삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄를 갖는 프레임에 서브클로닝하였다. 항체 발현은 MPSV 프로모터에 의해 구동되고 CDS의 3' 말단에서 합성 폴리A 신호 서열을 갖는다. 또한 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
EK293 EBNA 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 포유동물 발현 벡터와 공형질감염시켜 분자를 생성하였다. 세포를 1:2:1:1 비("벡터 중쇄 Fc(홀)":"벡터 경쇄":"벡터 경쇄 교차":"벡터 중쇄 Fc(놉)-Fab교차")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
HEK293의 형질감염을 위해, EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지 중 무혈청 현탁액에서 배양하였다. 500 ml 진탕 플라스크에 4억만 개 HEK293을 생성하기 위해, EBNA 세포를 형질감염하기 24시간 전에 시딩하였다. 형질감염 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상청액을 미리-가온된 CD CHO 매질(20 ml)에 의해 대체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 매질(20 ml)에서 DNA의 최종 양(200 ㎍)으로 혼합하였다. PEI 용액(540 ㎕)을 첨가한 후, 혼합물을 15초 동안 볼텍싱한 후, 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기에서 3 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, F17 매질(160 ml)을 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염으로부터 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1(론자)을 첨가하였다. 7일 후, 배양 상청액을 수집하여 15초 동안 210 x g에서 원심분리하여 정제하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터), 0.01% w/v의 최종 농도의 나트륨 아지드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 단백질 A를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5, 40 ml)가 장착된 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(CV=5 mL, 지이 헬쓰케어)에 로딩하였다. 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)의 10 배 이상의 컬럼 부피로 세척하여 비결합 단백질을 제거하였다. 표적 단백질을 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5) 내지 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 2.5)의 20배 이상의 컬럼 부피에서 구배 동안 용리하였다 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가하여 단백질 용액을 중성화하였다. 표적 단백질을 농축하고, 여과한 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액(pH 6.0)으로 평형시킨 하이로드 수퍼덱스(HiLoad Superdex)200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 로딩하였다.
아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡수 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 측정하였다.
분자의 순도 및 몰 중량을 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석으로 분석하였다. 제조자의 지시에 따라 캘리퍼 랩칩(LabChip) GXII 시스템[캘리퍼 라이프사이언스(Caliper lifescience)]을 사용하였다. 샘플(2 ㎍)을 사용하여 분석하였다.
항체 샘플의 응집 함량을 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7) 분리 완충액 중에서 25℃에서 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
[표 12]
DP47 GS TCB의 제조 및 정제 요약
Figure pat00015
도 25 및 표 13은 비-결합 항체로서 DP47 GS 및 항-CD3 항체로서 인간화된 CH2527을 함유하는 DP47 GS TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA)의 CE-SDS 분석을 보여준다(서열번호 59, 60, 61 및 62).
[표 13]
DP47 GS TCB의 CE-SDS 분석
Figure pat00016
상기 발명이 명확한 이해를 목적으로 예증 및 예시에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 전체적으로 명확히 참고로 도입된다.
<110> Roche Glycart AG <120> Bispecific T cell activating antigen binding molecules <130> 31447 <140> PCT/EP2014/053490 <141> 2014-02-24 <150> EP 13156686.1 <151> 2013-02-26 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC CD3 CH2527 (VH_3-23(12)) <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala 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atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct gacgttcggc 300 caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 100 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1) <400> 100 caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60 acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120 aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180 cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240 cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300 ggcggaggca 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Arg Val Val Arg Gly Pro Gln Leu Gly 35 40 45 Arg Leu Phe His Ala Gln Gln Asp Ser Thr Gly Glu Ala Leu Val Asn 50 55 60 Phe Thr Gln Ala Glu Val Tyr Ala Gly Asn Ile Leu Tyr Glu His Glu 65 70 75 80 Met Pro Pro Glu Pro Phe Trp Glu Ala His Asp Thr Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Leu Ser Ser Pro Pro Ala Arg Asp Val Ala Ala Thr Leu Ala Val Ala 100 105 110 Val Ser Phe Glu Ala Ala Cys Pro Gln His Pro Ser His Leu Trp Lys 115 120 125 Asn Lys Gly Leu Trp Val Pro Glu Gly Gln Arg Ala Arg Ile Thr Val 130 135 140 Ala Ala Leu Asp Ala Ser Asn Leu Leu Ala Ser Val Pro Ser Pro Gln 145 150 155 160 Arg Ser Glu His Asp Val Leu Phe Gln Val Thr Gln Phe Pro Ser Arg 165 170 175 Gly Gln Leu Leu Val Ser Glu Glu Pro Leu His Ala Gly Gln Pro His 180 185 190 Phe Leu Gln Ser Gln Leu Ala Ala Gly Gln Leu Val Tyr Ala His Gly 195 200 205 Gly Gly Gly Thr Gln Gln Asp Gly Phe His Phe Arg Ala His Leu Gln 210 215 220 Gly Pro Ala Gly Ala Ser Val Ala Gly Pro Gln Thr Ser Glu Ala Phe 225 230 235 240 Ala Ile Thr Val Arg Asp Val Asn Glu Arg Pro Pro Gln Pro Gln Ala 245 250 255 Ser Val Pro Leu Arg Leu Thr Arg Gly Ser Arg Ala Pro Ile Ser Arg 260 265 270 Ala Gln Leu Ser Val Val Asp Pro Asp Ser Ala Pro Gly Glu Ile Glu 275 280 285 Tyr Glu Val Gln Arg Ala Pro His Asn Gly Phe Leu Ser Leu Val Gly 290 295 300 Gly Gly Leu Gly Pro Val Thr Arg Phe Thr Gln Ala Asp Val Asp Ser 305 310 315 320 Gly Arg Leu Ala Phe Val Ala Asn Gly Ser Ser Val Ala Gly Ile Phe 325 330 335 Gln Leu Ser Met Ser Asp Gly Ala Ser Pro Pro Leu Pro Met Ser Leu 340 345 350 Ala Val Asp Ile Leu Pro Ser Ala Ile Glu Val Gln Leu Arg Ala Pro 355 360 365 Leu Glu Val Pro Gln Ala Leu Gly Arg Ser Ser Leu Ser Gln Gln Gln 370 375 380 Leu Arg Val Val Ser Asp Arg Glu Glu Pro Glu Ala Ala Tyr Arg Leu 385 390 395 400 Ile Gln Gly Pro Gln Tyr Gly His Leu Leu Val Gly Gly Arg Pro Thr 405 410 415 Ser Ala Phe Ser Gln Phe Gln Ile Asp Gln Gly Glu Val Val Phe Ala 420 425 430 Phe Thr Asn Phe Ser Ser Ser His Asp His Phe Arg Val Leu Ala Leu 435 440 445 Ala Arg Gly Val Asn Ala Ser Ala Val Val Asn Val Thr Val Arg Ala 450 455 460 Leu Leu His Val Trp Ala Gly Gly Pro Trp Pro Gln Gly Ala Thr Leu 465 470 475 480 Arg Leu Asp Pro Thr Val Leu Asp Ala Gly Glu Leu Ala Asn Arg Thr 485 490 495 Gly Ser Val Pro Arg Phe Arg Leu Leu Glu Gly Pro Arg His Gly Arg 500 505 510 Val Val Arg Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly Gly Ser Gln Leu 515 520 525 Val Glu Gln Phe Thr Gln Gln Asp Leu Glu Asp Gly Arg Leu Gly Leu 530 535 540 Glu Val Gly Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro Ala Gly Asp Ser 545 550 555 560 Leu Thr Leu Glu Leu Trp Ala Gln Gly Val Pro Pro Ala Val Ala Ser 565 570 575 Leu Asp Phe Ala Thr Glu Pro Tyr Asn Ala Ala Arg Pro Tyr Ser Val 580 585 590 Ala Leu Leu Ser Val Pro Glu Ala Ala Arg Thr Glu Ala Gly Lys Pro 595 600 605 Glu Ser Ser Thr Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Met Ala Ser Ser Pro 610 615 620 Glu Pro Ala Val Ala Lys Gly Gly Phe Leu Ser Phe Leu Glu Ala Asn 625 630 635 640 Met Phe Ser <210> 119 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NABA-avi-his <400> 119 Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15 Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Gln Leu Phe Gly Tyr Ser 20 25 30 Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Val Gly Tyr 35 40 45 Ala Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser Gly Arg 50 55 60 Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln 65 70 75 80 Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp Leu Val 85 90 95 Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110 Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125 Met Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140 Trp Ile Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn Asp Thr 165 170 175 Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Val Ser Ala Asn Arg Ser 180 185 190 Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Pro Thr Ile 195 200 205 Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser 210 215 220 Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn 225 230 235 240 Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr 245 250 255 Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr 260 265 270 Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Leu Ser 275 280 285 Pro Val Val Ala Lys Pro Gln Ile Lys Ala Ser Lys Thr Thr Val Thr 290 295 300 Gly Asp Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp Thr Gly 305 310 315 320 Ile Ser Ile Arg Trp Phe Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser Ser Glu 325 330 335 Arg Met Lys Leu Ser Gln Gly Asn Ile Thr Leu Ser Ile Asn Pro Val 340 345 350 Lys Arg Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Glu Val Phe Asn Pro Ile 355 360 365 Ser Lys Asn Gln Ser Asp Pro Ile Met Leu Asn Val Asn Tyr Asn Ala 370 375 380 Leu Pro Gln Glu Asn Leu Ile Asn Val Asp Leu Glu Val Leu Phe Gln 385 390 395 400 Gly Pro Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 405 410 415 Trp His Glu Ala Arg Ala His His His His His His 420 425 <210> 120 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3e stalk-Fc(knob)-Avi <400> 120 Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro 20 25 30 Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp 35 40 45 Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys 50 55 60 Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg 65 70 75 80 Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg 85 90 95 Val Ser Glu Asn Cys Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser 100 105 110 Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 115 120 125 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 130 135 140 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 145 150 155 160 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 165 170 175 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 180 185 190 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 195 200 205 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 210 215 220 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 225 230 235 240 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys 245 250 255 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 260 265 270 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 275 280 285 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 290 295 300 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 305 310 315 320 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 325 330 335 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu 340 345 350 Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 355 360 <210> 121 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3d stalk-Fc(hole) <400> 121 Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys 1 5 10 15 Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser 20 25 30 Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly 35 40 45 Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr 50 55 60 Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Arg Ser Glu Gln Leu Tyr Phe Gln 65 70 75 80 Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 85 90 95 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 100 105 110 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 115 120 125 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 130 135 140 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 145 150 155 160 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 165 170 175 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 180 185 190 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 195 200 205 Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 210 215 220 Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 225 230 235 240 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 245 250 255 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr 260 265 270 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 275 280 285 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 290 295 300 Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys 305 310 315 320 Ile Glu Trp His Glu 325 <210> 122 <211> 658 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 122 Leu Ser Leu Glu Gly Thr Arg Lys Leu Thr Val Cys Pro Glu Ser Val 1 5 10 15 Gln Pro Leu Ser Ser Gln Ser Leu Ser Ala Ser Ser Ser Thr Gly Ala 20 25 30 Asp Pro Arg His Leu Leu Tyr Arg Val Val Arg Gly Pro Gln Leu Gly 35 40 45 Arg Leu Leu His Ala Gln Gln Gly Ser Ala Glu Glu Val Leu Val Asn 50 55 60 Phe Thr Gln Ala Glu Val Asn Ala Gly Asn Ile Leu Tyr Glu His Glu 65 70 75 80 Met Ser Ser Glu Pro Phe Trp Glu Ala His Asp Thr Ile Gly Leu Leu 85 90 95 Leu Ser Ser Pro Pro Ala Arg Asp Leu Ala Ala Thr Leu Ala Val Met 100 105 110 Val Ser Phe Asp Ala Ala Cys Pro Gln Arg Pro Ser Arg Leu Trp Lys 115 120 125 Asn Lys Gly Leu Trp Val Pro Glu Gly Gln Arg Ala Lys Ile Thr Val 130 135 140 Ala Ala Leu Asp Ala Ala Asn Leu Leu Ala Ser Val Pro Ala Ser Gln 145 150 155 160 Arg Ser Arg His Asp Val Leu Phe Gln Val Thr Gln Phe Pro Thr Arg 165 170 175 Gly Gln Leu Leu Val Ser Glu Glu Pro Leu His Ala Arg Arg Pro Tyr 180 185 190 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Ala Ala Gly Gln Leu Val Tyr Ala His Gly 195 200 205 Gly Gly Gly Thr Gln Gln Asp Gly Phe Arg Phe Arg Ala His Leu Gln 210 215 220 Gly Pro Thr Gly Thr Ser Val Ala Gly Pro Gln Thr Ser Glu Ala Phe 225 230 235 240 Val Ile Thr Val Arg Asp Val Asn Glu Arg Pro Pro Gln Pro Gln Ala 245 250 255 Ser Ile Pro Leu Arg Val Thr Arg Gly Ser Arg Ala Pro Val Ser Arg 260 265 270 Ala Gln Leu Ser Val Val Asp Pro Asp Ser Ala Pro Gly Glu Ile Glu 275 280 285 Tyr Glu Val Gln Arg Ala Pro His Asn Gly Phe Leu Ser Leu Ala Gly 290 295 300 Asp Asn Thr Gly Pro Val Thr His Phe Thr Gln Ala Asp Val Asp Ala 305 310 315 320 Gly Arg Leu Ala Phe Val Ala Asn Gly Ser Ser Val Ala Gly Val Phe 325 330 335 Gln Leu Ser Met Ser Asp Gly Ala Ser Pro Pro Ile Pro Met Ser Leu 340 345 350 Ala Val Asp Val Leu Pro Ser Thr Ile Glu Val Gln Leu Arg Ala Pro 355 360 365 Leu Glu Val Pro Gln Ala Leu Gly Arg Thr Ser Leu Ser Arg Gln Gln 370 375 380 Leu Gln Val Ile Ser Asp Arg Glu Glu Pro Asp Val Ala Tyr Arg Leu 385 390 395 400 Thr Gln Gly Pro Leu Tyr Gly Gln Leu Leu Val Gly Gly Gln Pro Ala 405 410 415 Ser Ala Phe Ser Gln Leu Gln Val Asp Gln Gly Asp Val Val Phe Val 420 425 430 Phe Thr Asn Phe Ser Ser Ser Gln Asp His Phe Lys Val Val Ala Leu 435 440 445 Ala Arg Gly Val Asn Ala Ser Ala Thr Val Asn Val Thr Val Gln Ala 450 455 460 Leu Leu His Val Trp Ala Gly Gly Pro Trp Pro Gln Gly Thr Thr Leu 465 470 475 480 Arg Leu Asp Pro Thr Val Leu Asp Ala Ser Glu Leu Ala Asn Arg Thr 485 490 495 Gly Ser Met Pro His Phe Arg Leu Leu Ala Gly Pro Arg Tyr Gly Arg 500 505 510 Val Val Arg Val Ser Gln Gly Arg Thr Glu Ser Arg Ser Asn Gln Leu 515 520 525 Val Glu His Phe Thr Gln Arg Asp Leu Glu Glu Gly Gln Leu Gly Leu 530 535 540 Glu Val Gly Lys Pro Glu Gly Arg Ser Thr Gly Pro Ala Gly Asp Arg 545 550 555 560 Leu Thr Leu Glu Leu Trp Ala Lys Gly Val Pro Pro Ala Val Ala Leu 565 570 575 Leu Asp Phe Ala Thr Glu Pro Tyr His Ala Ala Lys Ser Tyr Ser Val 580 585 590 Ala Leu Leu Ser Val Pro Glu Ala Val Arg Thr Glu Thr Glu Lys Pro 595 600 605 Gly Arg Ser Val Pro Thr Gly Gln Pro Gly Gln Ala Ala Ser Ser Pro 610 615 620 Val Pro Thr Ala Ala Lys Gly Gly Val Asp Gly Leu Asn Asp Ile Phe 625 630 635 640 Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Arg Ala His His His His 645 650 655 His His

Claims (60)

  1. (i) 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및
    (ii) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티
    를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제 1 항원 결합 모이어티가 서열번호 3, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 1 항원 결합 모이어티가 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 항원 결합 모이어티가 암배아 항원(CEA)에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  5. 제 4 항에 있어서,
    제 2 항원 결합 모이어티가 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 항원 결합 모이어티가 흑색종-관련된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  7. 제 6 항에 있어서,
    제 2 항원 결합 모이어티가 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    제 2 항원 결합 모이어티가 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 13, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17, 서열번호 43, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 항원 결합 모이어티가 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항원 결합 모이어티가, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  11. 제 10 항에 있어서,
    제 1 항원 결합 모이어티가, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 항원 결합 모이어티가 통상적인 Fab 분자인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  15. 제 14 항에 있어서,
    제 3 항원 결합 모이어티가 통상적인 Fab 분자인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    제 3 항원 결합 모이어티가 제 2 항원 결합 모이어티와 동일한, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  17. 제 16 항에 있어서,
    제 3 항원 결합 모이어티가 제 4 항 또는 제 5 항에 정의된 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  18. 제 16 항에 있어서,
    제 3 항원 결합 모이어티가 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 정의된 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티가, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해, 서로 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  21. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄가, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해, 서로 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (iii) 안정된 회합을 할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 FC 도메인을 추가로 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  24. 제 23 항에 있어서,
    제 2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  25. 제 23 항에 있어서,
    제 1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  26. 제 23 항에 있어서,
    제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티가 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 1개 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  27. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 3 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  28. 제 27 항에 있어서,
    제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티가 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 1개 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  29. 제 27 항에 있어서,
    제 1 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티가 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 1개 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있고, 제 2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  30. 제 29 항에 있어서,
    제 1 항원 결합 모이어티, 제 3 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인이 면역글로불린 분자, 특히 IgG 클래스 면역글로불린의 일부인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  31. (i) 서열번호 4의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 6의 중쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이되, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역, 특히 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자인, 제 1 항원 결합 모이어티; 및
    (ii) 각각이 서열번호 24의 중쇄 CDR1, 서열번호 25의 중쇄 CDR2, 서열번호 26의 중쇄 CDR3, 서열번호 28의 경쇄 CDR1, 서열번호 29의 경쇄 CDR2 및 서열번호 30의 경쇄 CDR3을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티
    를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  32. 제 31 항에 있어서,
    (i) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이되, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역, 특히 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자인, 제 1 항원 결합 모이어티; 및
    (ii) 각각이 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티
    를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  33. (i) 서열번호 4의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 6의 중쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이되, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역, 특히 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자인, 제 1 항원 결합 모이어티; 및
    (ii) 각각이 서열번호 14의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 16의 중쇄 CDR3, 서열번호 18의 경쇄 CDR1, 서열번호 19의 경쇄 CDR2 및 서열번호 20의 경쇄 CDR3을 포함하는, MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티
    를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  34. 제 33 항에 있어서,
    (i) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이되, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역, 특히 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자인, 제 1 항원 결합 모이어티; 및
    (ii) 각각이 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티
    를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  35. 제 31 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (iii) 안정된 회합을 할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함하되, 제 2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있고, 제 3 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  36. 제 23 항 내지 제 30 항 및 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 IgG, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  37. 제 23 항 내지 제 30 항, 제 35 항 및 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 인간 Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  38. 제 23 항 내지 제 30 항 및 제 35 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  39. 제 38 항에 있어서,
    Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 돌출부를 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 생성하고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 캐비티를 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 생성하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  40. 제 23 항 내지 제 30 항 및 제 35 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  41. 제 23 항 내지 제 30 항 및 제 35 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  42. 제 41 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환이 L234, L235 및 P329(카밧 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 존재하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  43. 제 42 항에 있어서,
    Fc 도메인의 각각이 서브유닛이 활성화 FC 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환인 L234A, L235A 및 P329G를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  44. 제 40 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 수용체가 Fcγ 수용체인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  45. 제 40 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효과기 기능이 항체-의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  46. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  47. 제 46 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드.
  48. 제 46 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
  49. 제 46 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 48 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  50. (a) 제 49 항의 숙주 세포를 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계; 및
    (b) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계
    를 포함하는, CD3 및 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 생산하는 방법.
  51. 제 50 항의 방법에 의해 생산된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  52. 제 1 항 내지 제 45 항 및 제 51 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  53. 약제로서 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 45 항 및 제 51 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제 52 항에 따른 약학 조성물.
  54. 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질환의 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 45 항 및 제 51 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제 52 항에 따른 약학 조성물.
  55. 제 54 항에 있어서,
    질환이 암인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물.
  56. 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 45 항 및 제 51 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도.
  57. 제 1 항 내지 제 45 항 및 제 51 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물을 치료 효과량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법.
  58. 제 56 항 또는 제 57 항에 있어서,
    질환이 암인, 용도 또는 방법.
  59. 표적 세포를 제 1 항 내지 제 45 항 및 제 51 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 T 세포의 존재하에 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 표적 세포의 용해를 유도하는 방법.
  60. 상기한 바와 같은 발명.
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