BR112015015824B1 - Molécula que se liga ao antígeno biespecífico que ativa células t, polinucleotídeo isolado ou pluralidade de polinucleotídeos, vetor, método para produzir uma molécula, composição farmacêutica e uso da molécula - Google Patents

Molécula que se liga ao antígeno biespecífico que ativa células t, polinucleotídeo isolado ou pluralidade de polinucleotídeos, vetor, método para produzir uma molécula, composição farmacêutica e uso da molécula Download PDF

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Abstract

moléculas que se ligam ao antígeno biespecífico que ativam células t, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produzir a molécula, composição farmacêutica e uso da molécula a presente invenção geralmente refere-se a novas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas para ativação de células t e redirecionamento para células alvo específicas. além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam essas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, e vetores e células hospedeiras que compreendem esses polinucleotídeos. a invenção refere-se ainda a métodos para produzir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, e aos métodos de uso dessas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas no tratamento de doença.

Description

MOLÉCULA QUE SE LIGA AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO QUE ATIVA CÉLULAS T, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO OU PLURALIDADE DE POLINUCLEOTÍDEOS, VETOR, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA MOLÉCULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DA MOLÉCULA Campo da Invenção
[001] A presente invenção geralmente refere-se a moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas para ativar células T. Além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam essas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, e vetores e células hospedeiras que compreendem esses polinucleotídeos. A invenção refere-se ainda a métodos para produzir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, e aos métodos de uso dessas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas no tratamento de doença.
Antecedentes da Invenção
[002] A destruição seletiva de uma célula individual ou de um tipo celular específico é frequentemente desejável em uma variedade de situações clínicas. Por exemplo, é um objetivo primário da terapia de câncer especificamente destruir células tumorais, ao mesmo tempo deixando as células e tecidos saudáveis intactos e sem danos.
[003] Uma forma atrativa de conseguir isto é induzir uma resposta imune contra o tumor, para fazer com que as células efetoras imunes, como células exterminadoras naturais (Natural Killer - NK) ou linfócitos T citotóxicos (CTLs), ataquem e destruam as células tumorais. CTLs constituem as células efetoras mais potentes do sistema imune, no entanto, elas não podem ser ativadas pelo mecanismo efetor mediado pelo domínio Fc de anticorpos terapêuticos convencionais.
[004] A este respeito, os anticorpos biespecíficos projetados para se ligar com um "braço” a um antígeno de superfície nas células alvo, e com o segundo "braço” a um componente invariante de ativação do complexo receptor de células T (TCR), tornaram-se de interesse nos anos recentes. A ligação simultânea desse anticorpo a ambos de seus alvos irá forçar uma interação temporária entre célula alvo e células T, provocando ativação de qualquer célula T citotóxica e subsequente lise da célula alvo. Então, a resposta imune é redirecionada para as células alvo e é independente da apresentação do antígeno peptídico pela célula alvo ou da especificidade da célula T, como poderia ser relevante para ativação restrita a MHC normal de CTLs. Neste contexto, é crucial que CTLs sejam somente ativadas quando uma célula alvo está apresentando o anticorpo biespecífico para as mesmas, isto é, a sinapse imunológica é imitada. São particularmente desejáveis anticorpos biespecíficos que não necessitam de pré-condicionamento ou coestimulação a fim de obter lise eficiente de células alvo.
[005] Vários formatos de anticorpos biespecíficos foram desenvolvidos e a sua adequação para imunoterapia mediada por células T foi investigada. Destas, as moléculas denominadas BiTE (engajadoras de células T biespecíficas, bispecific T cell engager) foram muito bem caracterizadas e já mostraram uma promessa nos consultórios (revisado em Nagorsen e Bäuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)). BiTEs são moléculas scFv tandem em que duas moléculas scFv são fusionadas por um ligante flexível. Formatos biespecíficos adicionais sendo avaliados para o engajamento de células T incluem diacorpos (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) e derivados dos mesmos, como diacorpos tandem (Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)). Um desenvolvimento mais recente são as moléculas denominadas DART (redirecionamento de dupla afinidade), que são baseadas no formato diacorpo, mas apresentam uma ligação bissulfeto C-terminal para estabilização adicional (Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)). Os denominados triomabs, que são moléculas inteiras híbridas de IgG de camundongo/rato e também estão sendo atualmente avaliadas em ensaios clínicos, representam um formato de maior tamanho (revisado em Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)).
[006] A variedade de formatos que estão sendo desenvolvidos mostra o grande potencial atribuído à direção e ativação de células T em imunoterapia. A tarefa de gerar anticorpos biespecíficos adequados para esse efeito é, no entanto, por meios não triviais, mas envolve uma série de desafios que têm de ser satisfeitos, relacionados à eficácia, toxicidade, aplicabilidade e produtibilidade dos anticorpos.
[007] Constructos pequenos como, por exemplo, moléculas BITE, embora sendo capazes de reticular eficientemente células efetoras e alvo, têm uma meia-vida no soro muito curta, necessitando que sejam administradas aos pacientes por infusão contínua. Formatos tipo IgG, por outro lado, embora tenham a grande vantagem de uma meia-vida longa, sofrem de toxicidade associada a funções efetoras nativas inerentes às moléculas de IgG. Seu potencial imunogênico constitui outra característica desfavorável de anticorpos biespecíficos tipo IgG, especialmente formatos não humanos, para desenvolvimento terapêutico com sucesso. Finalmente, um desafio principal no desenvolvimento geral de anticorpos biespecíficos tem sido a produção de constructos de anticorpos biespecíficos com uma quantidade e pureza clinicamente suficiente, devido ao pareamento não compatível das cadeias pesada e leve do anticorpo de diferentes especificidades mediante coexpressão, o que diminui o rendimento do constructo montado corretamente e resulta em uma série de produtos colaterais não funcionais, a partir dos quais o anticorpo biespecífico desejado pode ser difícil de separar.
[008] Dadas as dificuldades e desvantagens associadas a anticorpos biespecíficos atualmente disponíveis para mediar imunoterapia de células T, permanece uma necessidade para formatos novos e aprimorados dessas moléculas. A presente invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, projetadas para ativação e redirecionamento de células T que combinam boa eficácia e produtibilidade com baixa toxicidade e propriedades farmacocinéticas favoráveis.
Descrição Resumida da Invenção
[009] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, que compreende:
  • (i) um primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3, que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (CDR) selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10;
  • (ii) uma segunda porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a um antígeno de célula alvo.
[0010] Em uma realização, a primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3 e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33 e uma cadeia leve variável que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 31.
[0011] Em uma realização, a primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3 e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
[0012] Em uma realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA, CEACAM5) e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.
[0013] Em outra realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CEA e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
[0014] Em outra realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a MCSP (CSPG4) e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50.
[0015] Em outra realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao Proteoglicano Sulfato de Condroitina Associado a Melanoma (MCSP, CSPG4) e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20.
[0016] Em outra realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a MCSP e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 51.
[0017] Em outra realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a MCSP e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
[0018] Em uma realização específica, a primeira porção que se liga ao antígeno é um cruzamento da molécula Fab, em que tanto as regiões variáveis como as constantes da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas. Em uma realização ainda mais específica, a primeira porção que se liga ao antígeno é um cruzamento da molécula Fab, em que as regiões constantes da cadeia leve de Fab como a cadeia pesada de Fab são trocadas.
[0019] Em uma realização, a segunda porção que se liga ao antígeno é uma molécula Fab convencional.
[0020] Em uma realização específica adicional, não mais que um componente de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a CD3 está presente na molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T (isto é, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T fornece ligação monovalente a CD3).
[0021] Em uma realização adicional, a dita molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende ainda uma terceira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a um antígeno de célula alvo. Em uma realização, a dita terceira molécula de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional. Em uma realização, a dita terceira molécula de ligação ao antígeno é idêntica à segunda molécula de ligação ao antígeno.
[0022] Em uma realização específica, a dita molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende ainda um terceira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CEA, e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.
[0023] Em uma realização específica, a dita molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende um terceira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CEA, e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
[0024] Em uma realização, a dita molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende ainda um terceira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a MCSP, e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50.
[0025] Em uma realização específica, a dita molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende ainda um terceira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a MCSP, e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20.
[0026] Em uma realização, a dita molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende um terceira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a MCSP, e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 51.
[0027] Em uma realização específica, a dita molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende um terceira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a MCSP, e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
[0028] Em algumas realizações, o primeiro e a segunda porção que se liga ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T são fusionados entre si, opcionalmente através de um ligante peptídico. Nessa realização, a segunda porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno. Em outra realização, a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno. Em realizações em que tanto (i) a segunda porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno como (ii) a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno, adicionalmente a cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno e a cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno podem ser fusionadas entre si, opcionalmente através de um ligante peptídico.
[0029] Em uma realização, a dita molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende ainda (iii) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável.
[0030] Em uma realização, a segunda porção que se liga ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc. Em outra realização, a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc. Em uma realização, o primeiro e a segunda porção que se liga ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T são, cada um, fusionados na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N de uma das subunidades do domínio Fc.
[0031] Em uma realização, a terceira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc. Em uma realização específica, o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno que ativa células T são, cada um, fusionados na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N de uma das subunidades do domínio Fc, e a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno. Em outra realização específica, o primeiro e a terceira porção que se liga ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno que ativa células T são, cada um, fusionados na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N de uma das subunidades do domínio Fc, e a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno. Os componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T podem ser fusionados diretamente ou através de ligantes peptídicos adequados. Em uma realização, o primeiro e o terceiro componentes de ligação ao antígeno e o domínio Fc são parte de uma molécula de imunoglobulina.
[0032] Em uma realização específica, a molécula de imunoglobulina é uma imunoglobulina da classe IgG. Em uma realização ainda mais específica, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da classe IgG1. Em outra realização, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG4.
[0033] Em uma realização específica, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG. Em uma realização específica, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Em outra realização específica, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4. Em uma realização ainda mais específica, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4 que compreende a substituição de aminoácido S228P (numeração de EU). Em realizações específicas, o domínio Fc é um domínio Fc humano.
[0034] Em realizações específicas, o domínio Fc compreende uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. Nessa realização específica, um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc é substituído por um resíduo de aminoácido que tem um volume de cadeia lateral maior, gerando assim uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável em uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, e um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc é substituído por um resíduo de aminoácido que tem um volume de cadeia lateral menor, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.
[0035] Em uma realização específica, o domínio Fc exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação a um domínio Fc de IgG1 nativo. Em certas realizações, o domínio Fc é elaborado geneticamente para ter afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação a um domínio Fc não elaborado geneticamente. Em uma realização, o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem ligação a um receptor Fc e/ou função efetora. Em uma realização, uma ou mais substituições de aminoácidos no Fc domínio que reduzem ligação a um receptor Fc e/ou função efetora estão em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo de L234, L235, P329 (numeração EU). Em realizações específicas, cada subunidade do domínio Fc compreende três substituições de aminoácidos que reduzem ligação a um receptor Fc e/ou função efetora, em que as ditas substituições de aminoácidos são L234A, L235A e P329G. Em uma realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG1 humana. Em outras realizações, cada subunidade do domínio Fc compreende duas substituições de aminoácidos que reduzem ligação a um receptor Fc e/ou função efetora, em que as ditas substituições de aminoácido são L235E e P329G. Em uma realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4, particularmente um domínio Fc de IgG4 humana. Em uma realização, o domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é um domínio Fc de IgG4 e compreende as substituições de aminoácidos L235E e S228P (SPLE).
[0036] Em uma realização, o receptor Fc é um receptor Fcү. Em uma realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em uma realização, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em uma realização específica, o receptor Fc é FcүRIIa, FcүRI e/ou FcүRIIIa. Em uma realização, a função efetora é citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
[0037] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção ou um fragmento do mesmo. A invenção também engloba polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos da invenção. A invenção ainda fornece um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo isolado da invenção, e uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo isolado ou o vetor de expressão da invenção. Em algumas realizações, a célula hospedeira é uma célula eucarionte, particularmente uma célula de mamífero.
[0038] Em outro aspecto, é fornecido um método para produzir as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção, que compreende as etapas de a) cultivar a célula hospedeira da invenção sob condições adequadas para a expressão da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T e b) recuperar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T. A invenção também engloba uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T produzida pelo método da invenção.
[0039] A invenção fornece ainda uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0040] São também englobados pela invenção métodos de uso da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T e composição farmacêutica da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T ou uma composição farmacêutica da invenção para uso como um medicamento. Em um aspecto é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso no tratamento de uma doença em um indivíduo com necessidade da mesma. Em uma realização específica, a doença é câncer.
[0041] Também é fornecido o uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo com necessidade do mesmo, bem como um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição que compreende a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T de acordo com a invenção sob uma forma farmaceuticamente aceitável. Em uma realização específica, a doença é câncer. Em qualquer uma das realizações acima, o indivíduo é preferencialmente um mamífero, particularmente um humano.
[0042] A invenção também fornece um método para induzir lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral, que compreende colocar uma célula alvo em contato com uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção na presença de uma célula T, particularmente uma célula T citotóxica.
Breve Descrição das Figuras
[0043] FIGURA 1. Configurações exemplares da ativação das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T (TCBs) da invenção. (A) Ilustração da molécula "1+1 IgG Crossfab”. (B) Ilustração da molécula "2+1 IgG Crossfab”. (C) Ilustração da molécula "2+1 IgG Crossfab” com ordem alternativa dos componentes Crossfab e Fab ("invertidos”). (D) Ilustração da molécula "1+1 IgG Crossmab”. (E) Ilustração da molécula "2+1 IgG Crossfab, cadeia leve ligada”. (F) Ilustração da molécula "1+1 IgG Crossfab, cadeia leve ligada”. (G) Ilustração da molécula "2+1 IgG Crossfab, invertida, cadeia leve ligada”. (H) Ilustração da molécula "1+1 IgG Crossfab, invertida, cadeia leve ligada” Ponto preto: modificação opcional no domínio Fc que promove heterodimerização.
[0044] FIGURA 2. Alinhamento dos clones anti-MCSP maturados por afinidade, em comparação ao clone parental não maturado (M4-3 ML2).
[0045] FIGURA 3. Desenho esquemático da molécula MCSP TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertida).
[0046] FIGURA 4. Análise CE-SDS de MCSP TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertida, SEQ ID NOs: 12, 53, 54 e 55). Eletroferograma mostrado como SDS-Page de MCSP TCB: A) não reduzido, B) reduzido.
[0047] FIGURA 5. Desenho esquemático da molécula CEA TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertida).
[0048] FIGURA 6. Análise CE-SDS de molécula CEA TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertida, SEQ ID NOs: 22, 56, 57 e 58). Eletroferograma mostrado como SDS-Page de CEA TCB: A) não reduzido, B) reduzido.
[0049] FIGURA 7. Ligação de MCSP TCB (SEQ ID NOs: 12, 53, 54 e 55) a células A375 (MCSP+) (A) e Jurkat (células CD3+) (B). "TCB não direcionado”: anticorpo biespecífico que se engaja a CD3, mas não ao segundo antígeno (SEQ ID NOs: 59, 60, 61 e 62).
[0050] FIGURA 8. Morte por células T induzidas por anticorpo MCSP TCB (SEQ ID NOs: 12, 53, 54 e 55) de A375 (MCSP alto) (A), MV-3 (MCSP médio) (B), HCT-116 (MCSP baixo) (C) e LS180 (MCSP negativo) (D) células alvo (E: T = 10:1, PBMCs efetoras humanas, tempo de incubação 24 h). "TCB não direcionado”: anticorpo biespecífico que se engaja a CD3, mas não ao segundo antígeno (SEQ ID NOs: 59, 60, 61 e 62).
[0051] FIGURA 9. Suprarregulação de CD25 e CD69 em células T CD8+ (A, B) e CD4+ (C, D) humanas após morte das células de melanoma MV3 mediada por células T (E:T = 10:1, incubação de 24 h) induzida por anticorpo MCSP TCB (SEQ ID NOs: 12, 53, 54 e 55). "TCB não direcionado”: anticorpo biespecífico que se engaja a CD3, mas não ao segundo antígeno (SEQ ID NOs: 59, 60, 61 e 62).
[0052] FIGURA 10. Secreção de IL-2 (A), IFN-γ (B), TNFα (C), IL-4 (D), IL-10 (E) e Granzima B (F) por PBMCs humanas após morte das células de melanoma MV3 mediada por células T (E:T = 10:1, incubação de 24 h) induzida por anticorpo MCSP TCB (SEQ ID NOs: 12, 53, 54 e 55). "TCB não direcionado”: anticorpo biespecífico que se engaja a CD3, mas não ao segundo antígeno (SEQ ID NOs: 59, 60, 61 e 62).
[0053] FIGURA 11. Ligação de CEA TCB (SEQ ID NOs: 22, 56, 57 e 58) às células de adenocarcinoma de pulmão A549 que expressam CEA (A) e linhagens de linfócito T humana e de cynomolgus imortalizadas que expressam CD3 (Jurkat (B) e HSC-F (C), respectivamente).
[0054] FIGURA 12. Morte por células T induzida por CEA TCB (SEQ ID NOs: 22, 56, 57 e 58) de células HPAFII (CEA alto) (A, E), BxPC-3 (CEA médio) (B, F), ASPC-1 (CEA baixo) (C, G) e HCT-116 (CEA negativo) (D, H). E:T = 10:1, PBMCs humanas efetoras, tempo de incubação 24 h (A a D) ou 48 h (E a H). "TCB não direcionado”: anticorpo biespecífico que se engaja a CD3, mas não ao segundo antígeno (SEQ ID NOs: 59, 60, 61 e 62).
[0055] FIGURA 13. Proliferação de células T CD8+ e CD4+ humanas (A a D) e suprarregulação de CD25 em células T CD8+ e CD4+ humanas (E a H) 5 dias após morte mediada por células T das células HPAFII (CEA alto) (A, E), BxPC-3 (CEA médio) (B, F), ASPC-1 (CEA baixo) (C, G) e HCT-116 (CEA negativo) (D, H) induzida por CEA TCB (SEQ ID NOs: 22, 56, 57 e 58). "DP47 TCB”: anticorpo biespecífico que se engaja a CD3, mas não ao segundo antígeno (SEQ ID NOs: 59, 60, 61 e 62).
[0056] FIGURA 14. Secreção de IFN-γ (A), TNFα (B), Granzima B (C), IL-2 (D), IL-6 (E) e IL-10 (F) após morte das células tumorais MKN45 mediada por células T (E:T = 10:1, incubação de 48 h) induzida por CEA TCB (SEQ ID NOs: 22, 56, 57 e 58). "TCB não direcionado”: anticorpo biespecífico que se engaja a CD3, mas não ao segundo antígeno (SEQ ID NOs: 59, 60, 61 e 62).
[0057] FIGURA 15. Morte mediada por células T das células alvo tumorais LS180 que expressam CEA induzida por CEA TCB (SEQ ID NOs: 22, 56, 57 e 58) na presença de concentrações crescentes de CEA vertido (shed CEA) detectado 24 h (A) ou 48 h (B) após incubação com o CEA TCB e sCEA.
[0058] FIGURA 16. Morte mediada por células T das células A549 (adenocarcinoma de pulmão) que superexpressam CEA humano (A549-hCEA), avaliadas 21 h (A, B) e 40 h (C, D) após incubação com CEA TCB (SEQ ID NOs: 22, 56, 57 e 58) e PBMCs humanas (A, C) ou PBMCs de cynomolgus (B, D) como células efetoras.
[0059] FIGURA 17. Morte mediada por células T de linhagens celulares de câncer colorretal humano que expressam CEA induzida por CEA TCB (SEQ ID NOs: 22, 56, 57 e 58) a 0,8 nM (A), 4 nM (B) e 20 nM (C). (D) correlação entre expressão de CEA e % de lise específica a 20 nm de CEA TCB, (E) correlação entre expressão de CEA e EC50 de CEA TCB.
[0060] FIGURA 18. Eficácia antitumoral in vivo de CEA TCB (SEQ ID NOs: 22, 56, 57 e 58) em um carcinoma de cólon humano LS174T-fluc2 coenxertado com PBMC humana (E:T razão 5:1). Os resultados mostram a média e SEM de 12 camundongos de volume tumoral medido por paquímetro (A e C) e por bioluminescência (Fluxo Total, B e D) nos diferentes grupos de estudo. (A, B) tratamento inicial começando no dia 1, (C, D) tratamento atrasado começando no dia 7. O MCSP TCB (SEQ ID NOs: 12, 53, 54 e 55) foi usado como controle negativo.
[0061] FIGURA 19. Eficácia antitumoral in vivo de CEA TCB (SEQ ID NOs: 22, 56, 57 e 58) em um carcinoma de cólon humano LS174T-fluc2 coenxertado com PBMC humana (E:T razão 1:1). Os resultados mostram a média e SEM de 10 camundongos de volume tumoral medido por paquímetro (A) e por bioluminescência (Fluxo Total, B) nos diferentes grupos de estudo. O MCSP TCB (SEQ ID NOs: 12, 53, 54 e 55) foi usado como controle negativo.
[0062] FIGURA 20. Eficácia in vivo de CEA TCB murinizado em um modelo tumoral ortotópico Panco2-huCEA em camundongos transgênicos huCD3ε/huCEA imunocompetentes.
[0063] FIGURA 21. Estabilidade térmica de CEA TCB. Dispersão de Luz Dinâmica medida em uma rampa de temperatura de 25 a 75°C a 0,05°C/min. A duplicata é mostrada em cinza.
[0064] FIGURA 22. Estabilidade térmica de MCSP TCB. Dispersão de Luz Dinâmica medida em uma rampa de temperatura de 25 a 75°C a 0,05°C/min. A duplicata é mostrada como linha cinza.
[0065] FIGURA 23. Morte mediada por células T induzida por anticorpos MCSP TCB (SEQ ID NOs: 12, 53, 54 e 55) e MCSP 1+1 CrossMab TCB de células alvo tumorais (A) A375 (MCSP alto), (B) MV-3 (MCSP médio) e (C) HCT-116 (MCSP baixo). (D) LS180 (linhagem celular tumoral MCSP negativa) foi usada como controle negativo. A morte das células tumorais foi avaliada 24 h (A a D) e 48 h (E a H) após a incubação das células alvo com os anticorpos e as células efetoras (PBMCs humanas).
[0066] FIGURA 24. Suprarregulação de CD25 e CD69 em células T CD8+ e CD4+ após morte por células T das células tumorais que expressam MCSP (A375, A a D e MV-3, E a H) mediada pelos anticorpos MCSP TCB (SEQ ID NOs: 12, 53, 54 e 55) e MCSP 1+1 CrossMab TCB.
[0067] FIGURA 25. Análise CE-SDS de DP47 GS TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertida = "TCB não direcionado” SEQ ID NOs: 59, 60, 61 e 62) contendo DP47 GS como anticorpo não ligante e CH2527 humanizado como anticorpo anti-CD3. Eletroferograma mostrado como SDS-PAGE de DP47 GS TCB: A) não reduzido, B) reduzido.
Descrição Detalhada da Invenção Definições
[0068] Os termos são usados no presente pedido como geralmente usados na técnica, a menos que definido de outra forma a seguir.
[0069] Como usado no presente pedido, o termo "molécula de ligação ao antígeno” refere-se em seu sentido mais amplo a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Exemplos de moléculas de ligação ao antígeno são as imunoglobulinas e seus derivados, por exemplo, fragmentos das mesmas.
[0070] O termo "biespecífica” significa que a molécula de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a pelo menos dois determinantes antigênicos diferentes. Tipicamente, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende dois sítios de ligação ao antígeno, cada um dos quais é específico para um determinante antigênico diferente. Em certas realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de se ligar simultaneamente a dois determinantes antigênicos, particularmente dois determinantes antigênicos expressos em duas células distintas.
[0071] O termo "valente”, como usado no presente pedido, denota a presença de um número especificado de sítios de ligação ao antígeno em uma molécula de ligação ao antígeno. Assim, o termo "ligação monovalente a um antígeno” indica a presença de um (e não mais de um) sítio de ligação ao antígeno específico para o antígeno na molécula de ligação ao antígeno.
[0072] Um "sítio de ligação ao antígeno” refere-se ao sítio, isto é, um ou mais resíduos de aminoácidos, de uma molécula de ligação ao antígeno que fornece interação com o antígeno. Por exemplo, o sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende resíduos de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Uma molécula de imunoglobulina nativa tem tipicamente dois sítios de ligação ao antígeno, uma molécula Fab tem tipicamente um único sítio de ligação ao antígeno.
[0073] Como usado no presente pedido, o termo "componente de ligação ao antígeno” refere-se a uma molécula de polipeptídeo que se liga especificamente a um determinante antigênico. Em uma realização, um componente de ligação ao antígeno é capaz de direcionar a entidade à qual está fixado (por exemplo, uma segunda porção que se liga ao antígeno) a um sítio alvo, por exemplo, a um tipo específico de célula tumoral ou tumor do estroma portador do determinante antigênico. Em outra realização, um componente de ligação ao antígeno é capaz de ativar sinalização através de seu antígeno alvo, por exemplo, um complexo receptor de antígeno de células T. Componentes de ligação ao antígeno incluem anticorpos e fragmentos dos mesmos, conforme ainda definido no presente pedido. Componentes de ligação ao antígeno específicos incluem um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo, que compreende uma região variável da cadeia pesada do anticorpo e região variável da cadeia leve do anticorpo. Em certas realizações, os componentes de ligação ao antígeno podem compreender regiões constantes do anticorpo, conforme ainda definido no presente pedido e conhecido na técnica. Regiões constantes da cadeia pesada úteis incluem qualquer um dos cinco isotipos: α, δ, ε, γ ou μ. Regiões constantes da cadeia leve úteis incluem qualquer um dos dois isotipos: κ e λ.
[0074] Como usado no presente pedido, o termo "determinante antigênico” é sinônimo de "antígeno” e "epítopo”, e refere-se a um local (por exemplo, um trecho contínuo de aminoácidos ou uma configuração conformacional composta de diferentes regiões de aminoácidos não contíguos) em uma macromolécula polipeptídeo a qual um antígeno que se liga ao componente se liga, formando um complexo componente-antígeno que se liga ao antígeno. Determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados, por exemplo, nas superfícies de células tumorais, nas superfícies de células infectadas por vírus, nas superfícies de outras células doentes, na superfície de células imunes, livres no soro sanguíneo e/ou na matriz extracelular (ECM). As proteínas referidas como antígenos no presente pedido (por exemplo, MCSP, CEA, CD3) podem ser qualquer forma nativa das proteínas de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outro modo. Em uma realização específica, o antígeno é uma proteína humana. Sempre que se faça referência a uma proteína produzida no presente pedido, o termo engloba proteína inteira, não processada, bem como qualquer forma de proteína que resulte do processamento na célula. O termo também engloba variantes da proteína que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas. Proteínas humanas exemplares úteis como antígenos incluem, mas não se limitam a: Proteoglicano Sulfato de Condroitina Associado a Melanoma (MCSP), também conhecido como Sulfato de Condroitina Proteoglicano 4 (CSPG4, UniProt n° Q6UVK1 (versão 70), NCBI RefSeq n° NP_001888.2); Antígeno Carcinoembrionário (CEA), também conhecido como molécula 5 de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário (CEACAM5, UniProt n° P06731 (versão 119), NCBI RefSeq n° NP_004354.2); e CD3, particularmente a subunidade epsilon de CD3 (consulte UniProt n° P07766 (versão 130), NCBI RefSeq n° NP_000724.1, SEQ ID NO: 103 para a sequência humana; ou UniProt n° Q95LI5 (versão 49), NCBI GenBank n° BAB71849.1, SEQ ID NO: 104 para a sequência de cynomolgus (Macaca fascicularis)). Em certas realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção se liga a um epítopo de CD3 ou a um antígeno de célula-alvo que é conservado entre o antígeno CD3 ou alvo de diferentes espécies. Em certas realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção se liga a CD3, e CEACAM5, mas não se liga a CEACAM1 ou CEACAM6. Por "ligação específica” entende-se que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminada a partir de interações não desejadas ou não específicas. A capacidade de um componente de ligação ao antígeno se ligar a um determinante antigênico específico pode ser medida tanto através de um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) como por outras técnicas familiares para um técnico no assunto, por exemplo, técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (analisada em um sistema BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Em uma realização, a medida de ligação de um componente de ligação ao antígeno a uma proteína não relacionada é menor que cerca de 10% da ligação da porção que se liga ao antígeno ao antígeno conforme medido, por exemplo, por SPR. Em certas realizações, um componente de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno, ou a uma molécula de ligação ao antígeno que compreende a porção que se liga ao antígeno, tem uma constante de dissociação (KD) ≤ 1 μΜ, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M).
[0075] "Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um receptor) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um ligante). A menos que indicado de outra forma, como usado no presente pedido, "afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, um componente de ligação ao antígeno e um antígeno, ou um receptor e seu ligante). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y pode ser geralmente representada pela constante de dissociação (KD), que é a razão das constantes das taxas de dissociação e de associação (koff e kon, respectivamente). Dessa forma, afinidades equivalentes podem compreender constantes de taxas diferentes, já que a razão das constantes de taxas permanece a mesma. A afinidade pode ser medida por métodos bem estabelecidos conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente pedido. Um método específico para medir a afinidade é a Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR).
[0076] "Ligação reduzida”, por exemplo, ligação reduzida a um receptor Fc, refere-se a uma diminuição na afinidade para a respectiva interação, conforme medido, por exemplo, por SPR. Para clareza, o termo também inclui redução da afinidade para zero (ou abaixo do limite de detecção do método analítico), isto é, eliminação completa da interação. Ao contrário, "ligação aumentada” refere-se a um aumento na afinidade de ligação para a respectiva interação.
[0077] "Ativação de células T”, como usado no presente pedido, refere-se a uma ou mais respostas celulares de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, selecionado a partir de: proliferação, diferenciação, secreção de citocina, liberação de molécula efetora citotóxica, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção são capazes de induzir ativação de células T. Ensaios adequados para medir a ativação de células T são conhecidos na técnica e descritos no presente pedido.
[0078] Um antígeno de célula alvo, como usado no presente pedido, refere-se a um determinante antigênico apresentado na superfície de uma célula alvo, por exemplo, uma célula em um tumor, como uma célula cancerosa ou uma célula do estroma tumoral.
[0079] Como usado no presente pedido, os termos "primeiro” e "segundo” em relação a componentes de ligação ao antígeno, etc., são usados por conveniência para distinguir quando há mais de um de cada tipo de componente. O uso desses termos não se destina a conferir uma ordem ou orientação específica da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, a menos que explicitamente assim declarado.
[0080] Uma "molécula Fab” refere-se a uma proteína que consiste no domínio VH e CH1 da cadeia pesada (a "cadeia pesada de Fab”) e o domínio VL e CL da cadeia leve (a "cadeia leve de Fab”) de uma imunoglobulina.
[0081] Por "fusionado” entende-se que os componentes (por exemplo, uma molécula Fab e uma subunidade do domínio Fc) estão ligados por ligações peptídicas, tanto diretamente como através de um ou mais ligantes peptídicos.
[0082] Como usado no presente pedido, o termo "cadeia única” refere-se a uma molécula que compreende monômeros de aminoácidos ligados linearmente por pontes peptídicas. Em certas realizações, um dos componentes de ligação ao antígeno é uma molécula Fab de cadeia única, isto é, uma molécula Fab em que a cadeia leve de Fab e a cadeia pesada de Fab estão conectadas por um ligante peptídico para formar uma única cadeia peptídica. Nessa realização específica, a terminação C da cadeia leve de Fab está conectada à terminação N da cadeia pesada de Fab na molécula Fab de cadeia única.
[0083] Por um "cruzamento” de molécula Fab (também chamado de "Crossfab”) entende-se uma molécula Fab em que tanto as regiões variáveis como as regiões constantes das cadeias pesada e leve de Fab são trocadas, isto é, o cruzamento da molécula Fab compreende uma cadeia peptídica composta pela região variável da cadeia leve e região constante da cadeia pesada, e uma cadeia peptídica composta pela região variável da cadeia pesada e pela região constante da cadeia leve. Para maior clareza, em um cruzamento da molécula Fab em que as regiões variáveis da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas, a cadeia peptídica que compreende a região constante da cadeia pesada é referida no presente pedido como "cadeia pesada” do cruzamento da molécula Fab. Inversamente, em um cruzamento da molécula Fab em que as regiões constantes da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas, a cadeia peptídica que compreende a região variável da cadeia pesada é referida no presente pedido como "cadeia pesada” do cruzamento da molécula Fab.
[0084] Ao contrário, por uma molécula Fab "convencional” entende-se uma molécula Fab no seu formato natural, isto é, que compreende uma cadeia pesada composta pelas regiões variáveis e constantes da cadeia pesada (VH-CH1), e uma cadeia leve composta pelas regiões variáveis e constantes da cadeia leve (VL-CL).
[0085] O termo "molécula de imunoglobulina” refere-se a uma proteína que tem a estrutura de um anticorpo de ocorrência natural. Por exemplo, as imunoglobulinas da classe IgG são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por bissulfeto. A partir da terminação N até C, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também chamada de domínio variável pesado ou um domínio variável da cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), também chamada de região constante da cadeia pesada. De maneira similar, a partir da terminação N até C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de domínio variável leve ou um domínio variável da cadeia leve, seguido por um domínio constante leve (CL), também chamada de região constante da cadeia leve. A cadeia pesada de uma imunoglobulina pode ser designada para um dos cinco tipos, chamados α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) ou μ (IgM), alguns dos quais podem ser ainda divididos em subtipos, por exemplo, γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) e α2 (IgA2). A cadeia leve de uma imunoglobulina pode ser designada para um dos dois tipos, chamados kappa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante. Uma imunoglobulina consiste essencialmente em duas moléculas Fab e um domínio Fc, ligado através da região de dobradiça da imunoglobulina.
[0086] O termo "anticorpo” no presente pedido é usado no sentido mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpos incluindo, mas não se limitando a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.
[0087] Um "fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual se liga o anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos de domínio único. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, consulte Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, consulte, por exemplo, Plückthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova York, páginas 269-315 (1994); consulte também documento WO 93/16185; e patentes US 5.571.894 e 5.587.458. Para discussão de fragmentos Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epítopo que se ligam a receptores de resgate e têm meia-vida aumentada in vivo, consulte patente US 5.869.046. Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Consulte, por exemplo, patente EP 404,097; documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); e Hollinger et al, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Anticorpos com domínio único são fragmentos que compreendem todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; consulte, por exemplo, patente US 6.248.516 B1). Fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por várias técnicas incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), conforme descrito no presente pedido.
[0088] O termo "domínio de ligação ao antígeno” refere-se à parte de um anticorpo que compreende a área que se liga especificamente, e é complementar, a parte ou todo de um antígeno. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis do anticorpo (também chamado de regiões variáveis do anticorpo). Particularmente, um domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia leve do anticorpo (VL) e uma região variável da cadeia pesada do anticorpo (VH).
[0089] O termo "região variável” ou "domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo, geralmente têm estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). Consulte, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno.
[0090] O termo "região hipervariável” ou "HVR”, como usado no presente pedido, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável do anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formas estruturalmente definidas como alças ("alças hipervariáveis”). Geralmente, anticorpos de quatro cadeias nativas compreendem seis HVRs, três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs geralmente compreendem resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis e/ou das "regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), sendo esta última de variabilidade de sequência mais alta e/ou envolvida no reconhecimento de antígeno. Com exceção de CDR1 na VH, CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácidos que formam as alças hipervariáveis. Regiões hipervariáveis (HVRs) também são chamadas de "regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), e esses termos são usados no presente pedido alternadamente em referência a porções da região variável para formar as regiões de ligação ao antígeno. Essa região específica foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) e por Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), em que as definições incluem sobreposição ou subgrupos de resíduos de aminoácidos quando comparados uns aos outros. No entanto, a aplicação de qualquer definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou variantes do mesmo é destinada a estar dentro do escopo do termo, conforme definido e usado no presente pedido. Os resíduos de aminoácidos apropriados que englobam as CDRs, conforme definido por cada uma das referências acima citadas são definidos a seguir na Tabela A como uma comparação. Os números exatos de resíduos que englobam uma CDR específica irão variar dependendo da sequência e do tamanho da CDR. Técnicos no assunto podem rotineiramente determinar quais resíduos compreendem uma CDR específica dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo.
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1 A numeração de todas as definições de CDR na Tabela A está de acordo com as convenções de numeração apresentadas por Kabat et al. (consulte abaixo).
2 "AbM” com uma letra minúscula "b” como usado na Tabela A refere-se às CDRs conforme definido pelo programa de computação Oxford Molecular’s "AbM” antibody modeling.
[0091] Kabat et al. também definiu um sistema de numeração de sequências de região variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Geralmente, um técnico no assunto pode atribuir inequivocamente esse sistema de "numeração de Kabat” para qualquer sequência de região variável, sem confiança em qualquer dado experimental além da própria sequência. Como usado no presente pedido, a "numeração de Kabat” refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983). A menos que especificado de outra forma, referências à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicos em uma região variável do anticorpo estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[0092] As sequências de polipeptídeos da lista de sequências não estão numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabat. No entanto, ele está bem dentro das competências normais de um técnico no assunto para converter a numeração das sequências da Listagem de Sequências para a numeração de Kabat.
[0093] "Região de estrutura” ou "FR” refere-se a resíduos de domínio variável, exceto resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
[0094] A "classe” de um anticorpo ou imunoglobulina refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante de sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem, ainda, ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de α, δ, ε, γ e μ, respectivamente.
[0095] O termo "domínio Fc” ou "região Fc” no presente pedido é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar ligeiramente, a região Fc de uma cadeia pesada de IgG humano é usualmente definida como se estendendo de Cys226, ou de Pro230, até a terminação carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma no presente pedido, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Uma “subunidade” de um domínio Fc, conforme usado no presente pedido, refere-se a um dos dois polipeptídeos que formam o domínio Fc dimérico, isto é, um polipeptídeo que compreende as regiões constantes C-terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina, capazes de se autoassociar de maneira estável. Por exemplo, uma subunidade de um domínio Fc de IgG compreende um domínio constante CH2 de IgG e um CH3 de IgG.
[0096] Uma “modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc” é uma manipulação do esqueleto peptídico ou as modificações pós-traducionais de uma subunidade do domínio Fc que reduz ou previne a associação de um polipeptídeo que compreende a subunidade do domínio Fc com um polipeptídeo idêntico para formar um homodímero. Uma modificação que promove associação, como usado no presente pedido, inclui particularmente modificações separadas feitas para cada uma das subunidades do domínio Fc que se deseja associar (isto é, a primeira e a segunda subunidade do domínio Fc), em que as modificações são complementares umas às outras, a fim de promover a associação de duas subunidades do domínio Fc. Por exemplo, uma modificação que promove associação pode alterar a estrutura ou a carga de uma ou de ambas as subunidades do domínio Fc de modo a fazer sua associação estericamente ou eletrostaticamente favorável, respectivamente. Assim, a (hetero)dimerização ocorre entre um polipeptídeo que compreende a primeira subunidade do domínio Fc e um polipeptídeo que compreende a segunda subunidade do domínio Fc, que podem não ser idênticas no sentido de que componentes adicionais fusionados em cada uma das subunidades (por exemplo, componentes de ligação ao antígeno) não são os mesmos. Em algumas realizações, a modificação que promove associação compreende uma mutação de aminoácido no domínio Fc, especificamente uma substituição de aminoácido. Em uma realização específica, a modificação que promove associação compreende uma mutação de aminoácido separada, especificamente uma substituição de aminoácido em cada uma das duas subunidades do domínio Fc.
[0097] O termo "funções efetoras” refere-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam conforme o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação C1q e citoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação de receptor Fc, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), secreção de citocina, percepção de antígeno mediada por complexo imune por células apresentadoras de antígeno (por exemplo, receptor de células B) e ativação de células B.
[0098] Como usado no presente pedido, os termos "elaborar geneticamente, elaborado geneticamente, elaboração genética”, são considerados para incluir qualquer manipulação do esqueleto do peptídeo ou das modificações pós-traducionais que ocorrem naturalmente, ou de um polipeptídeo recombinante ou fragmento dos mesmos. Elaboração genética inclui modificações da sequência de aminoácidos, do padrão de glicosilação, ou do grupo de cadeia lateral dos aminoácidos individuais, bem como combinações dessas abordagens.
[0099] O termo "mutação de aminoácidos”, como usado no presente pedido, destina-se a englobar substituições de aminoácidos, deleções, inserções e modificações. Qualquer combinação de substituição, deleção, inserção e modificação pode ser feita para se chegar ao constructo final, contanto que o constructo final possua as características desejadas, por exemplo, ligação reduzida a um receptor Fc ou associação aumentada a outro peptídeo. Deleções e inserções de sequências de aminoácidos incluem deleções de aminoácidos amino e/ou carbóxi-terminais. Mutações de aminoácidos específicas são substituições de aminoácidos. Para os propósitos de alteração, por exemplo, das características de ligação de uma região Fc, substituições de aminoácidos não conservativas, isto é, a substituição de um aminoácido por outro aminoácido que têm propriedades diferentes propriedades químicas e/ou estruturais diferentes, são particularmente preferenciais. Substituições de aminoácidos incluem a substituição por aminoácidos que não ocorrem naturalmente ou por derivados de aminoácidos dos vinte aminoácidos padrão ocorrem naturalmente (por exemplo, 4-hidróxi prolina, 3-metil histidina, ornitina, homoserina, 5-hidróxi lisina). Mutações de aminoácidos podem ser geradas com o uso de métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Métodos genéticos podem incluir mutagênese sítio-dirigida, PCR, síntese de genes e similares. É contemplado que os métodos de alteração do grupo de cadeia lateral de um aminoácido por métodos exceto elaboração genética, como modificação química, podem também ser úteis. Várias designações podem ser usadas no presente pedido para indicar a mesma mutação de aminoácido. Por exemplo, uma substituição de prolina na posição 329 do domínio Fc para glicina pode ser indicada como 329G, G329, G329, P329G ou Pro329Gly.
[00100] Como usado no presente pedido, o termo “polipeptídeo” refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) ligados linearmente por pontes de amida (também conhecidas como pontes peptídicas). O termo “polipeptídeo” refere-se a qualquer cadeia de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Dessa forma, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, “proteína”, “cadeia de aminoácidos” ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos na definição de "polipeptídeo” e o termo "polipeptídeo” pode ser usado, ao invés de, ou de forma intercambiável com qualquer um desses termos. O termo "polipeptídeo” também é destinado para se referir aos produtos de modificações de pós-expressão do polipeptídeo, incluindo sem limitação glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico designada. Pode ser gerado de qualquer maneira, inclusive por síntese química. Um polipeptídeo da invenção pode ter um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora não necessariamente tenham tal estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas de preferência podem adotar um grande número de conformações diferentes e são referidos como se desdobrados.
[00101] Por um polipeptídeo "isolado”, uma variante ou derivado do mesmo, entende-se um polipeptídeo que não está em seu meio natural. Nenhum nível específico de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos e proteínas produzidos de modo recombinante, expressos em células hospedeiras, são considerados isolados para o propósito da invenção, como são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados, ou parcialmente, ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.
[00102] "Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação a uma sequência de polipeptídeos de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeos de referência, após alinhamento das sequências e introdução de gaps, se necessário, para alcançar o percentual máximo de identidade de sequência, e não considerando qualquer substituição conservativa como parte da identidade de sequência. Alinhamento, para os propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos, pode ser alcançado de várias maneiras, as quais estão dentro da técnica, por exemplo, com o uso de programas de computação disponíveis publicamente, como os programas de computação BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo das sequências inteiras sendo comparadas. Para os propósitos no presente pedido, no entanto, valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são obtidos com o uso do programa de computação de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computação de comparação de sequência ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e o código fonte foi depositado com a documentação de usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado mediante U.S. Copyright Registration n° TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível junto à Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, inclusive UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam. Nas situações em que o ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com ou contra, uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende certa % de identidade de sequência de aminoácidos a, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma:
100 vezes a fração X/Y
[00103] em que X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como comparações idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 nesse alinhamento de programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Considera-se que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos A em relação a B não é igual à % de identidade de sequência de aminoácidos B em relação a A. A menos que especificamente declarado de outra forma, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos usados no presente pedido são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior, com o uso do programa de computação ALIGN-2.
[00104] O termo “polinudeotídeo” refere-se a uma molécula ou constructo de ácido nucleico isolado, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA), RNA derivado de vírus ou DNA plasmidial (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, como encontrada em ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). O termo “molécula de ácido nucleico” refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo.
[00105] Por molécula de ácido nucleico “isolada” ou polinucleotídeo entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Exemplos adicionais de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo isolado inclui uma molécula de polinucleotídeo contida nas células que normalmente contêm a molécula de polinucleotídeo, mas a molécula de polinucleotídeo está presente fora do cromossomo ou em um local do cromossomo diferente daquele de localização natural no cromossomo. Moléculas de RNA isoladas incluem transcrições de RNA in vivo ou in vitro da presente invenção, bem como formas de fita positiva e negativa e formas de fita dupla. Polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção ainda incluem essas moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador como um promotor, sítio de ligação do ribossomo ou um terminador de transcrição.
[00106] Por um ácido nucleico ou polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos, pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica” a uma sequência de nucleotídeos de referência da presente invenção, pretende-se que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo seja idêntica à sequência de referência, exceto que a sequência de polinucleotídeos pode incluir até cinco pontos de mutações para cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro nucleotídeo ou um número de nucleotídeos até 5% do total de nucleotídeos na sequência de referência pode ser inserido na sequência de referência. Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições 5’ ou 3’ terminal da sequência de nucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre as posições terminais, intercaladas tanto individualmente entre resíduos na sequência de referência como em um ou mais grupos contíguos na sequência de referência. Como uma questão prática, se qualquer sequência de polinucleotídeos específica é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos da presente invenção pode ser determinada convencionalmente com o uso de programas de computação conhecidos, como aqueles discutidos acima para polipeptídeos (por exemplo, ALIGN-2).
[00107] O termo "cassete de expressão” refere-se a um polinucleotídeo gerado de modo recombinante ou sinteticamente, com uma série de elementos especificados de ácido nucleico que permitem a transcrição de um ácido nucleico específico em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA de plastídeo, vírus ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em certas realizações, o cassete de expressão da invenção compreende sequências de polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno da invenção ou fragmentos das mesmas.
[00108] O termo "vetor” ou "vetor de expressão” é sinônimo de "constructo de expressão” e refere-se a uma molécula de DNA que é usada para introduzir e direcionar a expressão de um gene específico ao qual está associado de maneira funcional em uma célula alvo. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual este foi introduzido. O vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão. Vetores de expressão permitem transcrição de grandes quantidades de mRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula alvo, a molécula de ácido ribonucleico ou proteína que é codificada pelo gene é produzida pela transcrição celular e/ou máquinas de tradução. Em uma realização, o vetor de expressão da invenção compreende um cassete de expressão que compreende sequências de polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção ou fragmentos das mesmas.
[00109] Os termos "célula hospedeira”, "linhagem celular hospedeira” e "cultura celular hospedeira” são usados de forma intercambiável e referem-se às células em que o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie dessas células. Células hospedeiras incluem "transformantes” e "células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada a partir das mesmas sem consideração ao número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica a uma célula parental no conteúdo de ácido nucleico, mas pode conter mutações. Progênies mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica como as triadas ou selecionadas para a célula originalmente transformada são incluídas no presente pedido. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser usado para gerar as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção. Células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas de mamíferos, como células CHO, células BHK, células NOS, células Sp2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de inseto, células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou planta cultivada ou tecido animal.
[00110] Um "receptor Fc de ativação” é um receptor Fc que após acoplamento por um domínio Fc de um anticorpo produz eventos que estimulam células portadoras de receptores a realizar funções efetoras. Receptores Fc de ativação humanos incluem FcүRIIIa (CD16a), FcүRI (CD64), FcүRIIa (CD32) e FcαRI (CD89).
[00111] Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) é um mecanismo imune que leva à lise de células alvo revestidas por anticorpo pelas células efetoras imunes. As células alvo são células às quais os anticorpos ou derivados das mesmas que compreendem uma região Fc se ligam especificamente, em geral, através de parte da proteína que é N-terminal à região Fc. Como usado no presente pedido, o termo "ADCC reduzida” é definido tanto como uma redução no número de células alvo que são lisadas em um determinado tempo, a uma determinada concentração de anticorpos no meio ao redor das células alvo, pelo mecanismo de ADCC definido acima, e/ou um aumento na concentração de anticorpo, no meio ao redor das células alvo, necessários para obter a lise de um determinado número de células alvo em um determinado tempo, pelo mecanismo de ADCC. A redução em ADCC está relacionado à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, com o uso da mesma produção padrão, purificação, formulação e métodos de armazenamento (os quais são conhecidos pelos técnicos no assunto), mas que não foram elaborados geneticamente. Por exemplo, a redução na ADCC mediada por um anticorpo que compreende em seu domínio Fc uma substituição de aminoácido que reduz ADCC, é relativa à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo sem essa substituição de aminoácido no domínio Fc. Ensaios adequados para medir ADCC são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, publicação PCT documento WO 2006/082515 ou publicação PCT documento WO 2012/130831).
[00112] Uma "quantidade efetiva” de um agente refere-se à quantidade que é necessária para resultar em uma alteração do estado fisiológico na célula ou tecido ao qual é administrado.
[00113] Uma "quantidade terapeuticamente efetiva” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade efetiva nas dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado. A quantidade terapeuticamente efetiva de um agente, por exemplo, elimina, diminui, atrasa, minimiza ou evita efeitos adversos de uma doença.
[00114] Um "indivíduo” ou "sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Particularmente, o indivíduo ou sujeito é um humano.
[00115] O termo "composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que está nessa forma para permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido na mesma seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada.
[00116] Um "veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma composição farmacêutica, exceto um ingrediente ativo, que não é tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não se limita a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[00117] Como usado no presente pedido, "tratamento” (e variações gramaticais do mesmo como "tratar” ou "tratando”) refere-se à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural de uma doença no indivíduo sendo tratado, e pode ser realizado tanto para profilaxia como durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejados de tratamento incluem, mas não se limitam a, prevenção de ocorrência ou recorrência da doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença e remissão ou prognósticos de melhora. Em algumas realizações, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção são usadas para retardar o desenvolvimento de uma doença ou reduzir a progressão de uma doença.
[00118] O termo "bula” é usado para se referir às instruções incluídas como de costume em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contra indicações e/ou advertências referentes ao uso desses produtos terapêuticos.
Descrição Detalhada das Realizações
[00119] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, que compreende:
  • (i) um primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3, e que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (CDR) selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10;
  • (ii) uma segunda porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a um antígeno de célula alvo.
[00120] Em uma realização, a primeira porção que se liga ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 31.
[00121] Em uma realização, a primeira porção que se liga ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
[00122] Em uma realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CEA e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.
[00123] Em outra realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CEA e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
[00124] Em outra realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a MCSP e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50.
[00125] Em outra realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a MCSP e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20.
[00126] Em outra realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a MCSP e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 51.
[00127] Em outra realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a MCSP e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
[00128] Em uma realização, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, que compreende:
(i) um primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3, que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (CDR) selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10;
(i) um segunda porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CEA, que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (CDR) selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.
[00129] Em uma realização, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, que compreende:
(i) um primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3 que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7,
(i) um segunda porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CEA que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
[00130] Em uma realização, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, que compreende:
(i) um primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3, que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (CDR) selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10;
(i) um segunda porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a MCSP, que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (CDR) selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20.
[00131] Em uma realização, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, que compreende:
(i) um primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3 que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
(i) um segunda porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CEA que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
[00132] Em uma realização específica, a primeira porção que se liga ao antígeno é um cruzamento da molécula Fab, em que tanto as regiões variáveis como as constantes da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas.
[00133] Em uma realização, a segunda porção que se liga ao antígeno é uma molécula Fab convencional.
[00134] Em uma realização específica, a primeira porção que se liga ao antígeno é um cruzamento de molécula Fab, em que as regiões constantes da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas, e a segunda porção que se liga ao antígeno é uma molécula Fab convencional. Em uma realização específica adicional, o primeiro e a segunda porção que se liga ao antígeno são fusionados um ao outro, opcionalmente através de um ligante peptídico.
[00135] Em realizações específicas, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende ainda um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável.
[00136] Em uma realização específica adicional, não mais que um componente de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a CD3 está presente na molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T (isto é, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T fornece ligação monovalente a CD3).
FORMATOS DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICAS QUE ATIVAM CÉLULAS T
[00137] Os componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T podem ser fusionados uns aos outros em uma variedade de configurações. Configurações exemplares são representadas nas Figuras1, 3 e 5.
[00138] Em realizações específicas, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável. Em algumas realizações, a segunda porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc.
[00139] Em uma realização, a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno. Nessa realização específica, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T consiste essencialmente em um primeiro e um segunda porção que se liga ao antígeno, um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade, e opcionalmente um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno, e a segunda porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. Opcionalmente, a cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno e a cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno podem ser adicionalmente fusionadas uma à outra.
[00140] Nessa outra realização, a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc. Nessa realização específica, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T consiste essencialmente em um primeiro e um segunda porção que se liga ao antígeno, um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade, e opcionalmente um ou mais ligantes peptídicos, em que o primeiro e a segunda porção que se liga ao antígeno são fusionados na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N de uma das subunidades do domínio Fc.
[00141] Em outras realizações, a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc.
[00142] Nessa realização específica, a segunda porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno. Nessa realização específica, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T consiste essencialmente em um primeiro e um segunda porção que se liga ao antígeno, um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade, e opcionalmente um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno, e a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. Opcionalmente, a cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno e a cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno podem ser adicionalmente fusionadas uma à outra.
[00143] Os componentes de ligação ao antígeno podem ser fusionados ao domínio Fc ou uns aos outros diretamente ou através de um ligante peptídico, que compreende um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2 a 20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos na técnica ou são descritos no presente pedido. Ligantes peptídicos não imunogênicos adequados, incluem, por exemplo, ligantes peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n. "n” é geralmente um número entre 1 e 10, tipicamente entre 2 e 4. Um ligante peptídico particularmente adequado para fusão das cadeias leves de Fab do primeiro e da segunda porção que se liga ao antígeno um ao outro é (G4S)2. Um ligante peptídico exemplar adequado para conectar as cadeias pesadas de Fab do primeiro e da segunda porção que se liga ao antígeno é EPKSC(D)-(G4S)2 (SEQ ID NOs 105 e 106). Adicionalmente, ligantes podem compreender (uma porção de) uma região de dobradiça de imunoglobulina. Particularmente, quando um componente de ligação ao antígeno é fusionado à terminação N de uma subunidade do domínio Fc, pode ser fusionado através de uma região de dobradiça da imunoglobulina ou de uma porção da mesma, com ou sem um ligante peptídico adicional.
[00144] Uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T com um única porção que se liga ao antígeno capaz de ligar a um antígeno de célula alvo específico (por exemplo, conforme mostrado na Figura 1A, 1D, 1F ou 1H) é útil, particularmente nos casos em que a internalização do antígeno da célula alvo é esperada após ligação de um componente de ligação ao antígeno com alta afinidade. Nesses casos, a presença de mais de um componente de ligação ao antígeno específico para o antígeno de célula alvo pode aumentar a internalização do antígeno de célula alvo, reduzindo assim sua disponibilidade.
[00145] Em muitos casos, no entanto, será vantajoso ter uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende dois ou mais componentes de ligação ao antígeno para um antígeno de célula alvo específico (consulte exemplos mostrados na Figura 1A, 1C, 1E ou 1G), por exemplo, para otimizar o direcionamento para o sítio alvo ou para permitir reticulação de antígenos de célula alvo.
[00146] Consequentemente, em certas realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção compreende ainda uma terceira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a um antígeno de célula alvo. Em uma realização, a terceira porção que se liga ao antígeno é uma molécula Fab convencional. Em uma realização, a terceira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao mesmo antígeno de célula alvo, assim como a segunda porção que se liga ao antígeno. Em uma realização específica, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3, e o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno são capazes de se ligarem especificamente a um antígeno de célula alvo. Em uma realização específica, o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno são idênticos (isto é, eles compreendem as mesmas sequências de aminoácidos).
[00147] Em uma realização específica, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3, e o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno são capazes de se ligarem especificamente a CEA, em que o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.
[00148] Em uma realização específica, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3, e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; e o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno são capazes de se ligarem especificamente a CEA, em que o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.
[00149] Em uma realização específica, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3, e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; e o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno são capazes de se ligarem especificamente a CEA, em que o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.
[00150] Em uma realização específica, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3 e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 31, e o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno são capazes de se ligarem especificamente a CEA, em que o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno compreendem uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
[00151] Em uma realização específica, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3 e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno são capazes de se ligarem especificamente a CEA, em que o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno compreendem uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
[00152] Em uma realização, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3, e o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno são capazes de se ligarem especificamente a MCSP, em que o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50.
[00153] Em uma realização específica, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3, e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; e o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno são capazes de se ligarem especificamente a MCSP, em que o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50.
[00154] Em uma realização, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3, e compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; e o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno são capazes de se ligarem especificamente a MCSP, em que o segundo e terceiro componentes de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20.
[00155] Em uma realização, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3 e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 31, e o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno são capazes de se ligarem especificamente a CEA, em que o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno compreendem uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 51.
[00156] Em uma realização, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3 e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno são capazes de se ligarem especificamente a MCSP, em que o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno compreendem uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
[00157] Em uma realização, a terceira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc. Em uma realização mais específica, o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno são, cada um, fusionados na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N de uma das subunidades do domínio Fc, e a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno. Opcionalmente, a cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno e a cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno podem ser adicionalmente fusionadas uma à outra.
[00158] A segundo e a terceira porção que se ligam ao antígeno podem ser fusionados ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em uma realização específica, o segundo e a terceira porção que se liga ao antígeno são, cada um, fusionados ao domínio Fc através de uma região de dobradiça da imunoglobulina. Em uma realização específica, a região de dobradiça da imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG1 humana. Em uma realização, o segundo a terceira porção que se liga ao antígeno e o domínio Fc são parte de uma molécula de imunoglobulina. Em uma realização específica, a molécula de imunoglobulina é uma imunoglobulina da classe IgG. Em uma realização ainda mais específica, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da classe IgG1. Em outra realização, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG4. Em uma realização específica adicional, a imunoglobulina é uma imunoglobulina humana. Em outras realizações, a imunoglobulina é uma imunoglobulina quimérica ou uma imunoglobulina humanizada. Em uma realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T consiste essencialmente em uma molécula de imunoglobulina capaz de se ligar especificamente a um antígeno de célula alvo, e um componente de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a CD3, em que a porção que se liga ao antígeno é uma molécula Fab, particularmente uma molécula Fab cruzada, fusionada à terminação N de uma das cadeias de imunoglobulina, opcionalmente através de um ligante peptídico.
[00159] Em uma realização específica, o primeiro e a terceira porção que se liga ao antígeno são, cada um, fusionados na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N de uma das subunidades do domínio Fc, e a segunda porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno. Nessa realização específica, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T consiste essencialmente em um primeiro, um segundo e um terceira porção que se liga ao antígeno, um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade, e opcionalmente um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno, e a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc, e em que a terceira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da segunda subunidade do domínio Fc. Opcionalmente, a cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno e a cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno podem ser adicionalmente fusionadas uma à outra.
[00160] Em uma realização, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, que compreende:
(i) um primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3, que compreende a região determinante de complementaridade (CDR) 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 4, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 5, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 6, a CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 8, a CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 9 e a CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 10, em que a primeira porção que se liga ao antígeno é um cruzamento da molécula Fab, em que tanto as regiões variáveis como as constantes, particularmente as regiões constantes, da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas.
(i) um segundo e um terceira porção que se liga ao antígeno, cada um, dos quais é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CEA que compreende a CDR 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 24, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 25, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 26, a CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 28, a CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 29 e a CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 30.
[00161] Em uma realização, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, que compreende:
(i) um primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3 que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, em que a primeira porção que se liga ao antígeno é um cruzamento da molécula Fab, em que tanto as regiões variáveis como as constantes, particularmente as regiões constantes, da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas.
(i) um segundo e um terceira porção que se liga ao antígeno, cada um dos quais é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CEA que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
[00162] Em uma realização, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, que compreende:
(i) um primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3, que compreende a região determinante de complementaridade (CDR) 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 4, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 5, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 6, a CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 8, a CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 9 e a CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 10, em que a primeira porção que se liga ao antígeno é um cruzamento da molécula Fab, em que tanto as regiões variáveis como as constantes, particularmente as regiões constantes, da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas.
(i) um segundo e um terceira porção que se liga ao antígeno, cada um, dos quais é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a MCSP que compreende a CDR 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 14, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 15, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 16, a CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 18, a CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 19 e a CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 20.
[00163] Em uma realização, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, que compreende:
(i) um primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3 que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, em que a primeira porção que se liga ao antígeno é um cruzamento da molécula Fab, em que tanto as regiões variáveis como as constantes, particularmente as regiões constantes, da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas.
(i) um segundo e um terceira porção que se liga ao antígeno, cada um dos quais é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a MCSP que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
[00164] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, de acordo com qualquer uma das quatro realizações acima, pode ainda compreender (iii) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável, em que a segunda porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno, e a primeira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da primeira subunidade do domínio Fc, e em que a terceira porção que se liga ao antígeno é fusionado na terminação C da cadeia pesada de Fab à terminação N da segunda subunidade do domínio Fc.
[00165] Em algumas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção, a cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno e a cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno são fusionadas uma à outra, opcionalmente através de um peptídeo ligante. Dependendo da configuração do primeiro e da segunda porção que se liga ao antígeno, a cadeia leve de Fab da primeira porção de ligação ao antígeno pode ser fusionada na sua terminação C à terminação N da cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno, ou a cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno pode ser fusionada na sua terminação C à terminação N da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno. A fusão das cadeias leves de Fab do primeiro e da segunda porção que se liga ao antígeno reduz ainda o pareamento mal sucedido das cadeias pesada e leve de Fab, e também reduz o número de plasmídeos necessários para a expressão de algumas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção.
[00166] Em certas realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno (isto é, um primeira porção que se liga ao antígeno compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), a qual por sua vez compartilha uma ponte peptídica com uma subunidade do domínio Fc (VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)), e um polipeptídeo em que a cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). Em algumas realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno (VH(1)-CL(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno (VL(2)-CL(2)). Em certas realizações, os polipeptídeos são ligados de modo covalente, por exemplo, por uma ponte bissulfeto.
[00167] Em realizações alternativas, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno (isto é, a primeira porção que se liga ao antígeno compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), a qual por sua vez compartilha uma ponte peptídica com uma subunidade do domínio Fc (VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4)), e um polipeptídeo em que a cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). Em algumas realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno (VL(1)-CH(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno (VL(2)-CL(2)). Em certas realizações, os polipeptídeos são ligados de modo covalente, por exemplo, por uma ponte bissulfeto.
[00168] Em algumas realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno (isto é, a primeira porção que se liga ao antígeno compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), a qual por sua vez compartilha uma ponte peptídica com a cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno, a qual por sua vez compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). Em outras realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno (isto é, a primeira porção que se liga ao antígeno compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), a qual por sua vez compartilha uma ponte peptídica com a cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno, a qual por sua vez compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). Ainda em outras realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende um polipeptídeo, em que a cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno, a qual por sua vez compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada de Fab (isto é, a primeira porção que se liga ao antígeno compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). Ainda outras realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende um polipeptídeo, em que a cadeia pesada de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno, a qual por sua vez compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve de Fab (isto é, a primeira porção que se liga ao antígeno compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4)).
[00169] Em algumas dessas realizações, a molécula que se liga ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende ainda um polipeptídeo da cadeia leve de Fab cruzada da primeira porção que se liga ao antígeno, em que a região variável da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno (VH(1)-CL(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno (VL(2)-CL(2)). Em outras dessas realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende ainda um polipeptídeo da cadeia leve de Fab cruzada, em que a região variável da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno (VL(1)-CH(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno (VL(2)-CL(2)). Ainda em outras dessas realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno, que por sua vez compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com o polipeptídeo da cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno (VL(1)-CH1(1)-VL(2)-CL(2)), um polipeptídeo em que a região variável da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno, que por sua vez compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com o polipeptídeo da cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno (VH(1)-CL(1)-VL(2)-CL(2)), um polipeptídeo em que o polipeptídeo da cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno, que por sua vez compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno (VL(2)-CL(2)-VL(1)-CH1(1)), ou um polipeptídeo em que o polipeptídeo da cadeia leve de Fab da segunda porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia pesada de Fab da primeira porção que se liga ao antígeno, que por sua vez compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve de Fab da primeira porção que se liga de antígeno (VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1)).
[00170] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, de acordo com essas realizações, pode ainda compreender (i) um polipeptídeo da subunidade do domínio Fc (CH2-CH3(-CH4)), ou (ii) um polipeptídeo em que a cadeia pesada de Fab de uma terceira porção que se liga ao antígeno compartilha uma ponte peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) e o polipeptídeo da cadeia leve de Fab de uma terceira porção que se liga ao antígeno (VL(3)-CL(3)). Em certas realizações, os polipeptídeos são ligados de modo covalente, por exemplo, por uma ponte bissulfeto.
[00171] De acordo com qualquer uma das realizações acima, componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T (por exemplo, componente de ligação ao antígeno, domínio Fc) podem ser fusionados diretamente ou através de vários ligantes, particularmente ligantes peptídicos que compreendem um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2 a 20 aminoácidos, que são descritos no presente pedido ou são conhecidos na técnica. Ligantes peptídicos não imunogênicos adequados, incluem, por exemplo, ligantes peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n ou G4(SG4)n, em que n é geralmente um número entre 1 e 10, tipicamente entre 2 e 4.
Domínio Fc
[00172] O domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T consiste em um par de cadeias polipeptídicas que compreendem domínios da cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina. Por exemplo, o domínio Fc de uma molécula de imunoglobulina G (IgG) é um dímero, cada subunidade deste compreende os domínios constantes de cadeia pesada CH2 e CH3 de IgG. As duas subunidades do domínio Fc são capazes de realizar associação estável uma com a outra. Em uma realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção compreende não mais do que um domínio Fc.
[00173] Em uma realização de acordo com a invenção, o domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é um domínio Fc de IgG. Em uma realização específica, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Em outra realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4. Em uma realização mais específica, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4 que compreende uma substituição de aminoácido na posição S228 (numeração de KabatEU), particularmente a substituição de aminoácido S228P. Essa substituição de aminoácido reduz a troca do braço de Fab in vivo de anticorpos IgG4 (consulte, Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). Em uma realização particular adicional, o domínio Fc é humano. Uma sequência exemplar de uma região de Fc de IgG1 é fornecida na SEQ ID NO: 107.
MODIFICAÇÕES DE DOMÍNIO FC QUE PROMOVEM HETERODIMERIZAÇÃO
[00174] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T, de acordo com a invenção, compreendem diferentes componentes de ligação ao antígeno, fusionados a uma ou outra das duas subunidades do domínio Fc, assim as duas subunidades do domínio Fc estão tipicamente compreendidas nas duas cadeias polipeptídicas não idênticas. A coexpressão recombinante desses polipeptídeos e subsequente dimerização leva a várias combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para melhorar o rendimento e pureza das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T na produção recombinante, será assim vantajoso introduzir no domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T uma modificação que promove a associação dos polipeptídeos desejados.
[00175] Consequentemente, em realizações específicas do domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, de acordo com a invenção, compreende uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. O sítio de interação proteína-proteína mais extenso entre as duas subunidades de um domínio Fc de IgG humana está no domínio CH3 do domínio Fc. Dessa forma, em uma realização, a dita modificação está no domínio CH3 do domínio Fc.
[00176] Em uma realização específica, a dita modificação é também conhecida como uma modificação de "protuberância em orifício” (knob-into-hole), que compreende uma modificação de protuberância (knob) em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação de orifício (hole) na outra das duas subunidades do domínio Fc.
[00177] A tecnologia de protuberância em orifício é descrita, por exemplo, nas patentes US 5.731.168, US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Geralmente, o método envolve introduzir uma protuberância ("saliência”) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade correspondente ("buraco”) na interface de um segundo polipeptídeo, de modo que a protuberância pode ser posicionada na cavidade a fim de promover a formação de heterodímero e retardar a formação de homodímero. Protuberâncias são construídas para substituir as pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou similar às protuberâncias são criadas sobre a interface do segundo polipeptídeo por substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina).
[00178] Consequentemente, em uma realização específica, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem um volume de cadeia lateral maior, gerando assim uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável em uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem um volume de cadeia lateral menor, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.
[00179] A protuberância e a cavidade podem ser feitas por alteração do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese sítio-específica, ou por síntese peptídica.
[00180] Em uma realização específica, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V). Em uma realização, na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A).
[00181] Ainda em uma realização adicional, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C). A introdução desses dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte bissulfeto entre as duas subunidades do domínio Fc, estabilizando ainda o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
[00182] Em uma realização específica, a porção que se liga ao antígeno capaz de ligação a CD3 é fusionado (opcionalmente através da porção que se liga ao antígeno capaz de ligação a um antígeno de célula alvo) à primeira subunidade do domínio Fc (que compreende a modificação "de protuberância”). Sem se ater à teoria, a fusão da porção que se liga ao antígeno capaz de ligação a CD3 à protuberância contendo a subunidade do domínio Fc minimizará a geração de molécula de ligação ao antígeno que compreendem dois componentes de ligação ao antígeno capazes de ligação a CD3 (choque estérico de dois polipeptídeos contendo protuberância).
[00183] Em uma realização alternativa, uma modificação que promove associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc compreende uma modificação que media efeitos eletrostáticos de direção, por exemplo conforme descrito na publicação PCT documento WO 2009/089004. Geralmente, esse método envolve substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das subunidades do domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados, de modo que formação de homodímero torne-se eletrostaticamente desfavorável, mas a heterodimerização eletrostaticamente favorável.
[00184] Modificações no domínio Fc que reduzem a ligação ao receptor Fc e/ou função efetora
[00185] O domínio Fc confere à molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T propriedades farmacocinéticas favoráveis, incluindo uma meia-vida no soro longa que contribui para o bom acúmulo no tecido alvo e uma razão favorável de distribuição de tecido-sangue. Ao mesmo tempo pode, no entanto, levar ao direcionamento indesejável da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T para células que expressam receptores Fc ao invés das células portadoras de antígeno preferenciais. Além disso, a coativação de vias de sinalização de receptor Fc pode levar à liberação de citocina que, em combinação com as propriedades de ativação de células T e a meia-vida longa da molécula de ligação ao antígeno, resulta em ativação excessiva de receptores de citocina e efeitos colaterais severos mediante administração sistêmica. A ativação de células imunes (portadoras de receptor Fc), exceto as células T, pode até mesmo reduzir a eficácia da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T devido ao potencial de destruição de células T, por exemplo, por células NK.
[00186] Consequentemente, em realizações específicas, o domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T, de acordo com a invenção, exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação a um domínio Fc de IgG1 nativo. Nessa realização, o domínio Fc (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende o dito domínio Fc) exibe menos que 50%, preferencialmente menos que 20%, mais preferencialmente menos que 10% e com a máxima preferência menos que 5% de afinidade de ligação a um receptor Fc, em comparação a um nativo domínio Fc de IgG1 nativo (ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende um domínio Fc de IgG1 nativo), e/ou menos que 50%, preferencialmente menos que 20%, mais preferencialmente menos que 10% e com a máxima preferência menos que 5% da função efetora, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo (ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende um domínio Fc de IgG1 nativo). Em uma realização, o domínio Fc (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende o dito domínio Fc) não se liga substancialmente a um receptor Fc e/ou induz função efetora. Em uma realização específica, o receptor Fc é um receptor Fcү. Em uma realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em uma realização, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em uma realização específica, o receptor Fc de ativação é uma ativação de receptor Fcү humano, mais especificamente FcүRIIIa, FcүRI ou FcүRIIa humano, mais especificamente FcүRIIIa humano. Em uma realização, a função efetora é um ou mais dentre as selecionadas a partir do grupo de CDC, ADCC, ADCP e secreção de citocina. Em uma realização específica, a função efetora é ADCC. Em uma realização, o domínio Fc exibe substancialmente afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn), em comparação a um domínio Fc de IgG1 nativo. A ligação substancialmente similar a FcRn é alcançada quando o domínio Fc (ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende o dito domínio Fc) exibe mais que cerca de 70%, particularmente mais que cerca de 80%, mais particularmente mais que cerca de 90% da afinidade de ligação de um domínio Fc de IgG1 nativo (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende um domínio Fc de IgG1 nativo) a FcRn.
[00187] Em certas realizações, o domínio Fc é elaborado geneticamente para ter afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação a um domínio Fc não elaborado geneticamente. Em realizações específicas, o domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do domínio Fc para um receptor Fc e/ou função efetora. Tipicamente, a mesma ou mais mutações de aminoácidos estão presentes em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em uma realização, a mutação de aminoácido reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc. Em uma realização, a mutação de aminoácido reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc por pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes. Em realizações onde há mais de uma mutação de aminoácido que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc ao receptor Fc, a combinação dessas mutações de aminoácidos pode reduzir a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc por pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes ou mesmo pelo menos 50 vezes. Em uma realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende um domínio Fc elaborado geneticamente exibe menos de 20%, particularmente menos de 10%, mais particularmente menos de 5% da afinidade de ligação a um receptor Fc, em comparação a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende um domínio Fc não elaborado geneticamente. Em uma realização específica, o receptor Fc é um receptor Fcү. Em algumas realizações, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em algumas realizações, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em uma realização específica, o receptor Fc de ativação é uma ativação de receptor Fcү humano, mais especificamente FcүRIIIa, FcүRI ou FcүRIIa humano, mais especificamente FcүRIIIa humano. Preferencialmente, a ligação a cada um desses receptores é reduzida. Em algumas realizações, a afinidade de ligação a um componente de complemento, especificamente afinidade de ligação a C1q, também é reduzida. Em uma realização, a afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) não é reduzida. A ligação substancialmente similar a FcRn, isto é, a conservação da afinidade de ligação ao domínio Fc ao dito receptor, é obtida quando o domínio Fc (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende o dito domínio Fc) exibe mais que cerca de 70% da afinidade de ligação a uma forma não elaborada geneticamente do domínio Fc (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende a dita forma não elaborada geneticamente do domínio Fc) ao FcRn. O domínio Fc ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção que compreendem o dito domínio Fc, podem exibir mais que cerca de 80% e mesmo mais que cerca de 90% dessa afinidade. Em certas realizações, o domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é elaborado geneticamente para ter função efetora reduzida, em comparação a um domínio Fc não elaborado geneticamente. A função efetora reduzida pode incluir, mas não se limita a, um ou mais dentre os seguintes: citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzida, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) reduzida, fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) reduzida, secreção de citocina reduzida, absorção de antígeno mediada por complexo imune reduzida por células apresentadoras de antígeno, ligação a células NK reduzida, ligação a macrófagos reduzida, ligação a monócitos reduzida, ligação a células polimorfonucleares reduzida, indução de sinalização direta de apoptose reduzida, reticulação de anticorpos ligados ao alvo reduzida, maturação de células dendríticas reduzida, preparação de células T reduzida. Em uma realização, a função efetora reduzida é um ou mais selecionadas a partir do grupo dentre, CDC reduzida, ADCC reduzida, ADCP reduzida e secreção de citocina reduzida. Em uma realização específica, a função efetora reduzida é ADCC reduzida. Em uma realização, a ADCC reduzida é menor que 20% da ADCC induzida por um domínio Fc não elaborado geneticamente (ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende um domínio Fc não elaborado geneticamente).
[00188] Em uma realização, a mutação de aminoácido que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ou função efetora é uma substituição de aminoácido. Em uma realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de E233, L234, L235, N297, P331 e P329. Em uma realização mais específica, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de L234, L235 e P329. Em algumas realizações, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A. Em uma realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG1 humana. Em uma realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido em posição P329. Em uma realização mais específica, a substituição de aminoácido é P329A ou P329G, particularmente P329G. Em uma realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição P329 e uma substituição adicional em uma posição selecionada a partir de E233, L234, L235, N297 e P331. Em uma realização mais específica, a substituição de aminoácido adicional é E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S. Em realizações específicas, o domínio Fc compreende substituições de aminoácidos nas posições P329, L234 e L235. Em realizações mais específicas, o domínio Fc compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G ("P329G LALA”). Em uma realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG1 humana. A combinação "P329G LALA” de substituições de aminoácidos quase que elimina completamente a ligação ao receptor Fcy (bem como ao complemento) de um domínio Fc de IgG1 humana, conforme descrito na publicação PCT documento WO 2012/130831, integralmente incorporada ao presente pedido como referência. O documento WO 2012/130831 também descreve métodos para preparar esses domínios Fc mutantes e métodos para determinar suas propriedades como ligação ao receptor Fc ou funções efetoras.
[00189] Os anticorpos IgG4 exibem afinidade de ligação reduzida a receptores Fc e funções efetoras reduzidas, em comparação com anticorpos IgG1. Portanto, em algumas realizações o domínio Fc da célula T que ativa moléculas de ligação ao antígeno biespecíficos da invenção é um domínio de de IgG4, particularmente um domínio Fc de IgG4 humana. Em uma realização, o domínio Fc de IgG4 compreende substituições de aminoácidos na posição S228, especificamente a substituição de aminoácido S228P. Para ainda reduzir sua afinidade de ligação a um receptor Fc e/ou sua função efetora, em uma realização o domínio Fc de IgG4 compreende uma substituição de aminoácido na posição L235, especificamente a substituição de aminoácido L235E. Em outra realização, o domínio Fc de IgG4 compreende uma substituição de aminoácido na posição P329, especificamente a substituição de aminoácido P329G. Em uma realização específica, o domínio Fc de IgG4 compreende substituições de aminoácido nas posições S228, L235 e P329, especificamente substituições de aminoácidos S228P, L235E e P329G. Esses domínios Fc de IgG4 mutantes e suas propriedades de ligação ao receptor Fcү são descritos na publicação PCT documento WO 2012/130831, integralmente incorporada ao presente pedido como referência.
[00190] Em uma realização específica, o domínio Fc que exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação a um domínio Fc de IgG1 nativo, é um domínio Fc de IgG1 humano que compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e opcionalmente P329G, ou um domínio Fc de IgG4 humano, que compreende as substituições de aminoácidos S228P, L235E e opcionalmente P329G.
[00191] Em certas realizações, N-glicosilação do domínio Fc foi eliminada. Nessa realização, o domínio Fc compreende uma mutação de aminoácido mutação na posição N297, particularmente uma substituição de aminoácido que substitui asparagina por alanina (N297A) ou ácido aspártico (N297D).
[00192] Além dos domínios Fc descritos anteriormente no presente pedido e na publicação PCT documento WO 2012/130831, domínios Fc com ligação ao receptor Fc reduzida e/ou função efetora também incluem aqueles com substituição de um ou mais resíduos dentre os resíduos do domínio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (patente US 6.737.056). Esses mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições dos aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o também conhecido como mutante Fc "DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 para alanina (patente US 7.332.581).
[00193] Os domínios Fc mutantes podem ser preparados por deleção de aminoácido, substituição, inserção ou modificação, com o uso de métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Métodos genéticos podem incluir mutagênese sítio-dirigida da sequência de DNA codificadora, PCR, síntese de genes e similares. As mudanças corretas de nucleotídeos podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento.
[00194] A ligação a receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA, ou por ressonância plasmônica de superfície (SPR) com o uso de instrumentos convencionais, como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e receptores Fc, como podem ser obtidos por expressão recombinante. Um ensaio de ligação adequado é descrito no presente pedido. De maneira alternativa, a afinidade de ligação de domínios Fc ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que compreendem um domínio Fc para receptores Fc pode ser avaliada com o uso de linhagens celulares conhecidas por expressar receptores Fc específicos, como células NK humanas que expressam o receptor FcүIIa.
[00195] A função efetora de um domínio Fc, ou de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende um domínio Fc, pode ser medida por métodos conhecidos na técnica. Um ensaio adequado para medir ADCC é descrito no presente pedido. Outros exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na patente US 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) e Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); patente US 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De maneira alternativa, os métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (consulte, por exemplo, ACTI™ ensaio de citotoxicidade não radioativo para fluxo citométrico (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); e CytoTox 96® ensaio de citotoxicidade não radioativo (Promega, Madison, WI)). Células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (Natural Killer-NK). De maneira alternativa ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como o divulgado em Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
[00196] Em algumas realizações, a ligação do domínio Fc a um componente de complemento, especificamente a C1q, é reduzida. Consequentemente, em algumas realizações em que o domínio Fc é elaborado geneticamente para ter função efetora reduzida, a dita função efetora inclui CDC reduzida. Ensaios de ligação a C1q podem ser realizados para determinar se a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é capaz de se ligar a C1q e, então, ter atividade CDC. Consulte, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar ativação de complemento, um ensaio CDC pode ser realizado (consulte, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); e Cragg e Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
COMPONENTES DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO
[00197] A molécula de ligação ao antígeno da invenção é biespecífica, isto é, compreende pelo menos dois componentes de ligação ao antígeno capazes de se ligarem especificamente a dois determinantes antigênicos distintos. De acordo com a invenção, os componentes de ligação ao antígeno são moléculas de Fab (isto é, domínios de ligação ao antígeno compostos por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, cada uma compreendendo uma região variável e uma constante). Em uma realização, as ditas moléculas de Fab são humanas. Em outra realização, as ditas moléculas de Fab são humanizadas. Em ainda outra realização, as ditas moléculas de Fab compreendem regiões constantes da cadeia pesada e leve humanas.
[00198] Pelo menos um dos componentes de ligação ao antígeno é um cruzamento de molécula Fab. Essa modificação previne pareamento mal sucedido das cadeias pesada e leve de diferentes moléculas de Fab, aprimorando assim o rendimento e pureza da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção na produção recombinante. Em uma molécula Fab cruzada específica útil para a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção, as regiões constantes da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas. Em outra molécula Fab cruzada específica útil para a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção, as regiões variáveis da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas.
[00199] Em uma realização específica, de acordo com a invenção, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é capaz de ligação simultânea a um antígeno de célula alvo, particularmente um antígeno de célula tumoral, e CD3. Em uma realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é capaz de reticular uma célula T e uma célula alvo por ligação simultânea a um antígeno de célula alvo e CD3. Em uma realização ainda mais específica, essa ligação simultânea resulta na lise da célula-alvo, particularmente uma célula tumoral. Em uma realização, essa ligação simultânea resulta na ativação da célula T. Em outras realizações, essa ligação simultânea resulta em uma resposta celular de um linfócito T, especialmente, um linfócito T citotóxico, selecionada a partir do grupo de: proliferação, diferenciação, secreção de citocina, liberação de molécula efetora citotóxica, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. Em uma realização, a ligação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T a CD3 sem ligação simultânea ao antígeno da célula-alvo não resulta na ativação de células T.
[00200] Em uma realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é capaz de redirecionar a atividade citotóxica de uma célula T para uma célula alvo. Em uma realização específica, o dito redirecionamento é independente de apresentação de antígeno peptídico mediada por MHC pela célula alvo e/ou especificidade da célula T.
[00201] Particularmente, uma célula T de acordo com qualquer uma das realizações da invenção é uma célula T citotóxica. Em algumas realizações, a célula T é uma célula T CD4+ ou uma célula T CD8+, particularmente uma célula T CD8+.
COMPONENTE DE LIGAÇÃO A CD3
[00202] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção compreende pelo menos um componente de ligação ao antígeno capaz de se ligar a CD3 (também citado como "componente de ligação ao antígeno CD3” ou "primeira porção que se liga de antígeno”). Em uma realização específica, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende não mais que um componente de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a CD3. Em uma realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T fornece ligação monovalente a CD3. A ligação ao antígeno CD3 é uma molécula Fab cruzada, isto é, uma molécula Fab em que tanto a região variável como a constante das cadeias pesada e leve são trocadas. Em realizações onde há mais de um componente de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno de célula alvo compreendido na molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, a porção que se liga ao antígeno capaz de se ligar especificamente a CD3 é preferencialmente uma molécula Fab cruzada e os componentes de ligação ao antígeno capazes de se ligar especificamente a um antígeno de célula são moléculas de Fab convencionais.
[00203] Em uma realização específica, CD3 é CD3 humano (SEQ ID NO: 103) ou CD3 de cynomolgus (SEQ ID NO: 104), mais particularmente CD3 humano. Em uma realização específica, a porção que se liga ao antígeno tem reatividade cruzada (isto é, se liga especificamente) a CD3 humano e de cynomolgus. Em algumas realizações, a primeira porção que se liga ao antígeno é capaz de se ligar especificamente à subunidade épsilon de CD3.
[00204] A porção que se liga ao antígeno CD3 compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.
[00205] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno CD3 compreende CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 4, a CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 5, a CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 6, a CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 8, a CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 9 e a CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 10.
[00206] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno CD3 compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33, e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 31.
[00207] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno CD3 compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 31.
[00208] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno CD3 compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 3, e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 7.
[00209] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno CD3 compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
[00210] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno CD3 compreende a sequência de região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e a sequência de região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 7.
COMPONENTE DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DE CÉLULA ALVO
[00211] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção compreende pelo menos um componente de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um antígeno de célula alvo (também citado no presente pedido como um "componente de ligação ao antígeno de célula alvo” ou "segundo” ou "terceiro” componente de ligação de antígeno). Em certas realizações, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende dois componentes de ligação ao antígeno capazes de ligação a um antígeno de célula alvo. Nessa realização específica, cada um desses componentes de ligação ao antígeno se liga especificamente ao mesmo determinante antigênico. Em uma realização ainda mais específica, todos esses componentes de ligação ao antígeno são idênticos. Em uma realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende uma molécula de imunoglobulina capaz de se ligar especificamente a um antígeno de célula alvo. Em uma realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende não mais que dois componentes de ligação ao antígeno capazes de ligação a um antígeno de célula alvo.
[00212] A porção que se liga ao antígeno de célula alvo geralmente é uma molécula Fab, particularmente uma molécula Fab convencional que se liga a um determinante antigênico específico e é capaz de direcionar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T para um sítio alvo, por exemplo, para um tipo específico de célula tumoral que produz o determinante antigênico.
[00213] Em certas realizações, a porção que se liga ao antígeno de célula alvo se liga especificamente a um antígeno de superfície celular. Em uma realização específica, a porção que se liga ao antígeno de célula alvo se liga especificamente a uma região proximal de membrana de um antígeno de superfície celular. Nessa realização específica, o antígeno de superfície celular é Antígeno Carcinoembrionário (CEA) e a região proximal de membrana é o domínio B3 de CEA (resíduos 208 a 286 SEQ ID NO: 119). Em uma outra realização específica, o antígeno de superfície celular é Proteoglicano Sulfato de Condroitina Associado a Melanoma (MCSP) e a região proximal de membrana é o domínio D3 de MSCP (SEQ ID NO: 118).
[00214] Em certas realizações, a porção que se liga ao antígeno de célula alvo é direcionado a um antígeno associado a uma condição patológica, como um antígeno apresentado em uma célula tumoral ou em um ambiente de célula tumoral ou em uma célula infectada por vírus. Antígenos adequados são antígenos de superfície celular, por exemplo, mas não se limitam a, receptores de superfície celular. Em realizações específicas, o antígeno é um antígeno humano. Em uma realização específica, o antígeno de célula alvo é selecionado a partir de Proteoglicano Sulfato de Condroitina Associado a Melanoma (MCSP, CSPG4) e Antígeno Carcinoembrionário (CEA, CEACAM5).
[00215] Em algumas realizações, a molécula que se liga ao antígeno biespecífico que ativa células T compreende pelo menos um componente de ligação ao antígeno que é específico para Proteoglicano Sulfato de Condroitina Associado a Melanoma (MCSP). Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno que é específico para MCSP compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50.
[00216] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno que é específico para MCSP compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20.
[00217] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno que é específico para MCSP compreende a CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 14, a CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 15, a CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 16, a CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 18, a CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 19 e a CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 20.
[00218] Em uma realização adicional, a porção que se liga ao antígeno que é específico para MCSP compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41 e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 51.
[00219] Em uma realização adicional, a porção que se liga ao antígeno que é específico para MCSP compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 51.
[00220] Em uma realização adicional, a porção que se liga ao antígeno que é específico para MCSP compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 13, e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 17 ou variantes da mesma que mantêm funcionalidade.
[00221] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno que é específico para MCSP compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
[00222] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno que é específico para MCSP compreende a sequência de região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 13 e a sequência de região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 17.
[00223] Em uma realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 12, uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 53, uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 54, e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 55.
[00224] Em realizações específicas, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende pelo menos um componente de ligação ao antígeno que é específico para Antígeno Carcinoembrionário. Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno que é específico para CEA compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.
[00225] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno que é específico para CEA compreende a CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 24, a CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 25, a CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 26, a CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 28, a CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 29 e a CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 30.
[00226] Em uma realização adicional, a porção que se liga ao antígeno que é específico para CEA compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 23, e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 27, ou variantes da mesma que mantêm funcionalidade.
[00227] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno que é específico para CEA compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
[00228] Em uma realização, a porção que se liga ao antígeno que é específico para CEA compreende a sequência de região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 23 e a sequência de região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 27.
[00229] Em uma realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 22, uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 56, uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 57, e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 58.
POLINUCLEOTÍDEOS
[00230] A invenção fornece ainda polinucleotídeos isolados que codificam uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, conforme descrito no presente pedido, ou um fragmento da mesma. Em algumas realizações, o dito fragmento é um fragmento de ligação ao antígeno.
[00231] Polinucleotídeos da invenção incluem aqueles que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos às sequências apresentadas nas SEQ ID NOs 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 ,93, 94, 95, 96, 97 e 98, incluindo fragmentos funcionais ou variantes dos mesmos.
[00232] Os polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção podem ser expressos como um polinucleotídeo único que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T inteira ou como polinucleotídeos múltiplos (por exemplo, dois ou mais) que são coexpressos. Polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são coexpressos podem associar-se através de, por exemplo, pontes bissulfeto ou outros meios para formar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T funcional. Por exemplo, a porção da cadeia leve de um componente de ligação ao antígeno pode ser codificada por um polinucleotídeo separado a partir da porção da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende a porção da cadeia pesada da porção que se liga ao antígeno, uma subunidade do domínio Fc e opcionalmente (parte de) outra porção que se liga ao antígeno. Quando coexpressos, os polipeptídeos da cadeia pesada irão associar-se aos polipeptídeos da cadeia leve para formar a porção que se liga ao antígeno. Em outro exemplo, a porção da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, que compreende uma das duas subunidades do domínio Fc e opcionalmente (parte de) um ou mais componentes de ligação ao antígeno, poderia ser codificada por um polinucleotídeo separado a partir da porção da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que compreende a outra das subunidades do domínio Fc e opcionalmente (parte de) um componente de ligação ao antígeno. Quando coexpressas, as subunidades do domínio fc irão se associar para formar o domínio Fc.
[00233] Em algumas realizações, o polinucleotídeo isolado codifica a molécula inteira de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, de acordo com a invenção, conforme descrito no presente pedido. Em outras realizações, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo compreendido na molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, de acordo com a invenção, conforme descrito no presente pedido.
[00234] Em outra realização, a presente invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção ou um fragmento do mesmo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma sequência de região variável, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 3, 7, 13, 17, 23, 27, 31, 32, 33, 34, 36, 39, 41, 43, 46, 47 ou 51. Em outra realização, a presente invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T ou fragmento do mesmo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma sequência de polipeptídeos, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 22, 56, 57, 58, 12, 53, 54 e 55. Em outra realização, a invenção ainda é direcionada a um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção ou um fragmento do mesmo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de nucleotídeos mostrada nas SEQ ID NOs: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 ,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 ,93, 94, 95, 96, 97 ou 98. Em outra realização, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção ou um fragmento do mesmo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácido nucleico mostrada nas SEQ ID NOs: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 ,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 ,93, 94, 95, 96, 97 ou 98. Em outra realização, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção ou um fragmento do mesmo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma sequência de região variável que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos nas SEQ ID NOs: 3, 7, 13, 17, 23, 27, 31, 32, 33, 34, 36, 39, 41, 43, 46, 47 ou 51. Em outra realização, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T ou um fragmento do mesmo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos nas SEQ ID NOs: 22, 56, 57, 58, 12, 53, 54 ou 55. A invenção engloba um polinucleotídeo isolado que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção ou um fragmento do mesmo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica a sequência de região variável de SEQ ID NOs: 3, 7, 13, 17, 23, 27, 31, 32, 33, 34, 36, 39, 41, 43, 46, 47 ou 51 com substituições de aminoácidos conservativas. A invenção também engloba um polinucleotídeo isolado que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção ou um fragmento do mesmo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NOs: 22, 56, 57, 58, 12, 53, 54 ou 55 com substituições de aminoácidos conservativas.
[00235] Em certas realizações, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. Em outras realizações, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA). O RNA da presente invenção pode ser de fita simples ou de fita dupla.
MÉTODOS RECOMBINANTES
[00236] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção podem ser obtidos, por exemplo, por síntese peptídica de fase sólida (por exemplo, síntese de fase sólida Merrifield) ou produção recombinante. Para produção recombinante, um ou mais polinucleotídeos que codificam a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T (fragmento), por exemplo, conforme descrito acima, são isolados e inseridos em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Esses polinucleotídeos podem ser facilmente isolados e sequenciados com o uso de procedimentos convencionais. Em uma realização, é fornecido um vetor, preferencialmente um vetor de expressão, que compreende um ou mais dos polinucleotídeos da invenção. Métodos que são bem conhecidos pelos técnicos no assunto podem ser usados para construir vetores de expressão contendo a sequência codificadora de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T (fragmento), juntamente com sinais de controle transcricionais/tradução apropriados. Estes métodos incluem técnicas in vitro de DNA recombinante, técnicas sintéticas e recombinação in vivo/recombinação genética. Consulte, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y (1989). O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus, ou pode ser um fragmento de ácido nucleico. O vetor de expressão inclui um cassete de expressão no qual o polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T (fragmento) (isto é, a região codificadora) é clonado em associação funcional a um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução. Como usado no presente pedido, uma "região codificadora” é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Apesar de um "códon de parada” (TAG, TGA ou TAA), não ser traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região codificadora, se presente, mas qualquer uma das sequências adjacentes, por exemplo, promotores, sítios de ligação de ribossomo, terminadores de transcrição, íntrons, regiões não traduzidas 5’ e 3’, e similares, não são parte de uma região codificadora. Duas ou mais regiões codificadoras podem estar presentes em um constructo de polinucleotídeo único, por exemplo, em um vetor único ou em constructos de polinucleotídeos separados, por exemplo, em vetores (diferentes) separados. Além disso, qualquer vetor pode conter uma região codificadora única ou pode compreender duas ou mais região codificadoras, por exemplo, um vetor da presente invenção pode codificar um ou mais polipeptídeos, que são separados após ou na tradução em proteínas finais através de clivagem proteolítica. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção podem codificar regiões codificadoras heterólogas, tanto fusionadas como não fundidas a um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T (fragmento) da invenção, variante ou derivada da mesma. Regiões codificadoras heterólogas incluem, sem limitação elementos especializados ou motivos, como um secretório de peptídeo sinal ou um domínio funcional heterólogo. Uma associação funcional é quando uma região codificadora para um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo, está associada a uma ou mais sequências reguladoras de modo a colocar a expressão do produto gênico sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (como uma região codificadora de polipeptídeos e um promotor associado a isso) são "associados de maneira funcional” se a indução da função promotora resultar na transcrição de mRNA que codifica o produto gênico desejado, e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferir na capacidade da expressão de sequências reguladoras para dirigir a expressão do produto gênico ou interferir na capacidade do molde de DNA ser transcrito. Dessa forma, uma região promotora seria operacionalmente associada a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição desse ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor de células específicas que direciona a transcrição substancial do DNA somente em células pré-determinadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, enhancers, operadores, repressores e sinais de terminação de transcrição, podem ser operacionalmente associado ao polinucleotídeo para dirigir transcrição específica de célula. Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são divulgados no presente pedido. Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conhecida pelos técnicos no assunto. Essas incluem, sem limitação, regiões de controle da transcrição, que funcionam em células de vertebrados, como, mas não limitadas a, promotores e segmentos enhancer de citomegalovírus (por exemplo, o promotor inicial imediato, em conjunto com íntron-A), vírus 40 de símio (por exemplo, o promotor inicial) e retrovírus (como, por exemplo, vírus de sarcoma de Rous). Outras regiões de controle da transcrição incluem aquelas derivadas de genes vertebrados, como actina, proteína de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e globina-β de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão gênica em células eucariontes. Regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores tecido-específicos e enhancers, bem como promotores induzíveis (por exemplo, promotores induzíveis por tetraciclinas). De maneira similar, uma variedade de elementos de controle de tradução é geralmente conhecida pelos técnicos no assunto. Esses incluem, mas não se limitam a, sítios de ligação de ribossomo, iniciação de tradução e códons de terminação e elementos derivados de sistemas virais (especialmente um sítio interno de entrada de ribossomo ou IRES, também citado como uma sequência CITE). O cassete de expressão também pode incluir outras características como uma origem de replicação e/ou elementos de integração de cromossomo, como repetições terminais longas de retrovírus (LTRs), ou repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus associado a adeno (AAV).
[00237] Polinucleotídeos e regiões codificadoras de ácido nucleico da presente invenção podem ser associados a regiões codificadoras adicionais que codificam peptídeos secretórios ou sinal, que dirigem a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, se a secreção da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é desejada, o DNA que codifica uma sequência sinal pode ser colocado a montante do ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção, ou um fragmento da mesma. De acordo com a hipótese do sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm uma sequência peptídeo sinal ou líder secretória que é clivada da proteína madura, uma vez que a exportação da cadeia de proteína crescente através do retículo endoplasmático rugoso foi iniciada. Técnicos no assunto têm conhecimento de que polipeptídeos secretados por células de vertebrados geralmente têm um peptídeo sinal fusionado à terminação N do polipeptídeo, que é clivado a partir do polipeptídeo traduzido para produzir uma forma secretada ou "madura” do polipeptídeo. Em certas realizações, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, um peptídeo sinal de cadeia pesada ou cadeia leve da imunoglobulina é usado, ou um derivativo funcional dessa sequência que mantém a capacidade de dirigir a secreção do polipeptídeo que é associado de maneira funcional a ele. Alternativamente, um peptídeo sinal de mamíferos heterólogo ou um derivativo funcional do mesmo, pode ser usado. Por exemplo, a sequência líder tipo selvagem pode ser substituída com a sequência líder do ativador do plasminogênio tecidual humano (TPA) ou β glicuronidase de camundongo. Aminoácidos exemplares e sequências de polinucleotídeos de peptídeos sinal secretórios são dados nas SEQ ID NOs 108 a 116.
[00238] O DNA que codifica uma sequência curta de proteína que poderia ser usado para facilitar purificação posterior (por exemplo, marcador de histidina), ou auxiliar na marcação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T pode ser incluído dentro ou nas extremidades da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T (fragmento) que codifica o polinucleotídeo.
[00239] Em uma realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende um ou mais polinucleotídeos da invenção. Em certas realizações, é fornecida uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores da invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, descritas no presente pedido em relação a polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Nessa realização, uma célula hospedeira (por exemplo, foi transformada ou transfectada) compreende um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica (parte de) uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção. Como usado no presente pedido, o termo "célula hospedeira” refere-se a qualquer tipo de sistema celular que pode ser elaborado geneticamente para gerar as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção ou fragmentos das mesmas. Células hospedeiras adequadas para replicar e para suportar a expressão de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T são bem conhecidas na técnica. Essas células podem ser transfectadas ou transduzidas, conforme apropriado, com o vetor de expressão específico, e grandes quantidades de células contendo vetor podem ser cultivadas para semear fermentadores de grande escala para se obter quantidades suficientes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T para aplicações clínicas. Células hospedeiras adequadas incluem microrganismos procariontes, como E. coli, ou várias células eucariontes, como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de inseto, ou similares. Por exemplo, polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias, em particular, quando a glicosilação não é necessária. Após expressão, o polipeptídeo pode ser isolado a partir da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e ainda pode ser purificado. Além de procariontes, micróbios eucariontes como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam polipeptídeos, incluindo linhagens de fungos e leveduras, cujas vias de glicosilação foram "humanizadas”, resultando na produção de um polipeptídeo com um padrão de glicosilação parcialmente ou totalmente humano. Consulte Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), e Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos (glicosilados) também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas linhagens de baculovírus que podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Culturas celulares de plantas também podem ser usadas como hospedeiras. Consulte, por exemplo, patentes US 5.959.177, 6.040.498, PLANTIBODIES™ para produção de anticorpos em plantas transgênicas). Células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293T, conforme descrito acima, por exemplo, em Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de rim de filhotes de hamster (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4, conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23 243-251 (1980)), células de rim de macaco (CV1), células de rim de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células de rim canino (MDCK), células de fígado de rato búfalo (BRL 3A), células de pulmão humano (W138), células de fígado humano (Hep G2), células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562), células TRI (conforme descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC 5 e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO dhfr - (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma como YO, NS0, P3X63 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens celulares hospedeiras de mamíferos adequadas para produção de proteína, consulte, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), páginas 255-268 (2003). Células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas de mamíferos, células de levedura, células de inseto, células bacterianas e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas em um animal transgênico, planta transgênica, planta cultivada ou tecido animal. Em uma realização, a célula hospedeira é uma célula eucarionte, preferencialmente uma célula de mamífero como, por exemplo, célula de ovário de hamster chinês (CHO), célula de rim embrionário humano (HEK) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp20).
[00240] Tecnologias padrão para expressar genes estranhos nesses sistemas são conhecidas na técnica. Células que expressam um polipeptídeo que compreende tanto a cadeia pesada como a cadeia leve de um domínio de ligação ao antígeno como um anticorpo, podem ser elaboradas geneticamente de modo a expressar outras cadeias do anticorpo, de modo que o produto expresso seja um anticorpo que tem tanto uma cadeia pesada como uma cadeia leve.
[00241] Em uma realização, é fornecido um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T de acordo com a invenção, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, conforme fornecido no presente pedido, sob condições adequadas para expressão da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, e recuperar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura de célula hospedeira).
[00242] Os componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T são geneticamente fusionados uns aos outros. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T pode ser projetada de modo que seus componentes sejam fusionados diretamente uns aos outros ou indiretamente através de uma sequência ligante. A composição e o comprimento do ligante podem ser determinados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e podem ser testados quanto à eficácia. Exemplos de sequências ligantes entre diferentes componentes de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T são encontrados nas sequências fornecidas no presente pedido. Sequências adicionais também podem ser incluídas para incorporar um sítio de clivagem para separar os componentes individualmente da fusão, se desejável, por exemplo, uma sequência de reconhecimento de endopeptidase.
[00243] Em certas realizações, um ou mais componentes de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T compreendem pelo menos uma região variável do anticorpo capaz de ligar um determinante antigênico. Regiões variáveis podem formar parte de, e podem ser derivadas, de anticorpos de ocorrência natural ou não natural e fragmentos dos mesmos. Métodos para produzir anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Harlow e Lane, "Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Anticorpos que não ocorrem naturalmente podem ser construídos com o uso de síntese peptídica de fase sólida, podem ser produzidos de forma recombinante (por exemplo, conforme descrito na patente US 4.186.567) ou podem ser obtidos, por exemplo, por triagem de bibliotecas combinatórias que compreendem cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis (consulte, por exemplo, patente US 5.969.108 para McCafferty).
[00244] Qualquer espécie de anticorpo animal, fragmento de anticorpo, domínio de ligação ao antígeno ou região variável podem ser usados nas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção. Anticorpos, fragmento de anticorpo, domínios de ligação ao antígeno ou regiões variáveis úteis na presente invenção podem ser de origem murina, primata ou humana. Se a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é destinada ao uso humano, uma forma quimérica de anticorpo pode ser usada, em que as regiões constantes do anticorpo são de um humano. Uma forma totalmente humana ou humanizada do anticorpo pode também ser preparada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, patente US 5.565.332 para Winter). A humanização pode ser realizada por vários métodos, incluindo, mas não se limitando a, (a) enxerto de CDRs não humanas (por exemplo, anticorpo doador) em estrutura humana (por exemplo, anticorpo receptor) e de regiões constantes, com ou sem retenção de resíduos estruturais importantes (por exemplo, aqueles que são importantes para a manutenção de boa afinidade de ligação ao antígeno ou funções de anticorpos), (b) enxertos apenas nas regiões determinantes de especificidade não humanas (SDRs ou a-CDRs, resíduos importantes para a interação anticorpo-antígeno) na estrutura humana e regiões constantes, ou (c) transplante de domínios variáveis não humanos inteiros, mas "camuflagem” dos mesmos com uma seção similar a humano por substituição dos resíduos de superfície. Anticorpos humanizados e métodos para fabricar os mesmos são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), e são ainda descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); patentes US 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 e 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (que descreve enxerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (que descreve "resurfacing”); Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (que descreve "embaralhamento de FR”); e Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) e Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (que descreve a abordagem de "seleção guiada” para embaralhamento de FR). Anticorpos humanos e regiões variáveis humanas podem ser produzidos com o uso de várias técnicas conhecidas. Anticorpos humanos são geralmente descritos em van Dijk e van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) e Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Regiões variáveis humanas podem formar parte de, e serem derivadas de anticorpos monoclonais humanos fabricados pelo método de hibridoma (consulte, por exemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51 a 63 (Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1987)). Anticorpos humanos e regiões variáveis humanas também podem ser preparados por administração de um imunógeno para um animal transgênico, que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com as regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico (consulte, por exemplo Lonberg, Nat. Biotech 23, 1117-1125 (2005). Anticorpos humanos e regiões variáveis humanas também podem ser gerados por isolamento de sequências da região variável do clone Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição por fagos derivadas de humanos (consulte, por exemplo, Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); e McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). O fago tipicamente exibe fragmentos de anticorpos, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab.
[00245] Em certas realizações, os componentes de ligação ao antígeno úteis na presente invenção são elaborados geneticamente para ter afinidade de ligação melhorada, por exemplo, de acordo com os métodos divulgados na publicação de pedido de patente US 2004/0132066, cujo conteúdo desta é incorporado ao presente pedido como referência. A capacidade da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção se ligar a um determinante antigênico específico pode ser medida tanto através de um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) como por outras técnicas familiares para um técnico no assunto, por exemplo, técnica de ressonância plasmônica de superfície (analisada em um sistema BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo, fragmento de anticorpo, domínio de ligação ao antígeno ou domínio variável que compete com um anticorpo de referência para ligação a um antígeno específico, por exemplo, um anticorpo que compete com o anticorpo V9 para ligação a CD3. Em certas realizações, esse anticorpo de competição se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou um conformacional) que é ligado por um anticorpo de referência. Métodos exemplares detalhados para mapeamento de um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols”, em Methods in Molecular Biology volume 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Em um ensaio de competição exemplar, o antígeno imobilizado (por exemplo, CD3) é incubado em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado que se liga ao antígeno (por exemplo, anticorpo V9, descrito na patente US 6.054.297) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado quanto à sua capacidade para competir com o primeiro anticorpo para ligação ao antígeno. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, o antígeno imobilizado é incubado em uma solução que compreende o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após incubação mediante condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo ao antígeno, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associado com o antígeno imobilizado é medida. Se a quantidade de marcador associado ao antígeno imobilizado é substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra controle, então isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para ligação ao antígeno. Consulte Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
[00246] Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T preparadas como descrito no presente pedido podem ser purificadas por técnicas conhecidas como cromatografia líquida de alto desempenho, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão por tamanho, e similares. As condições atuais usadas para purificar uma proteína específica dependerão, em parte, de fatores como carga líquida, hidrofobicidade, hidrofilicidade, etc., e serão evidentes para técnicos no assunto. Para purificação por cromatografia de afinidade, um anticorpo, ligante, receptor ou antígeno pode ser usado, ao qual a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T se liga. Por exemplo, para purificação por cromatografia de afinidade de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção, pode ser usada uma matriz com proteína A ou proteína G. Cromatografia de afinidade com proteína A ou G sequencial e cromatografia de exclusão por tamanho podem ser usadas para isolar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T essencialmente conforme descrito nos Exemplos. A pureza da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T pode ser determinada por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos, incluindo eletroforese em gel, cromatografia líquida de alta pressão, e similares. Por exemplo, as proteínas de fusão de cadeia pesada expressas conforme descrito nos Exemplos mostraram estar intactas e adequadamente montadas conforme demonstrado por SDS-PAGE de redução (consulte, por exemplo, Figura 4). Três bandas foram resolvidas em aproximadamente Mr 25.000, Mr 50.000 e Mr 75.000, correspondendo aos pesos moleculares previstos da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da proteína de fusão da cadeia leve, cadeia pesada e cadeia pesada/cadeia leve.
ENSAIOS
[00247] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T fornecidas no presente pedido podem ser identificadas, selecionadas ou caracterizadas por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.
ENSAIOS DE AFINIDADE
[00248] A afinidade da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T a um receptor Fc ou um atígeno alvo, pode ser determinada de acordo com os métodos apresentados nos Exemplos por ressonância plasmônica de superfície (SPR), com o uso de instrumentação padrão como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e receptores ou proteínas alvo podem ser obtidos por expressão recombinante. De maneira alternativa, a ligação de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T a diferentes receptores ou antígenos alvo pode ser avaliada com o uso de linhagens celulares que expressam o receptor específico ou antígeno alvo, por exemplo, por citometria de fluxo (FACS). Uma realização ilustrativa específica e exemplar para medir a afinidade de ligação é descrita a seguir e nos Exemplos abaixo.
[00249] De acordo com uma realização, KD é medido por ressonância plasmônica de superfície com o uso de uma máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25°C.
[00250] Para analisar a interação entre a porção Fc e receptores Fc, o receptor Fc recombinante marcado com His é capturado por um anticorpo anti-Penta His (Qiagen) imobilizado em chips CM5 e os constructos biespecíficos são usados como analito. Resumidamente, chips biossensores dextrano carboximetilado (CM5, GE, Inc.) são ativados com hidrocloreto de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS), de acordo com as instruções do fornecedor. O anticorpo anti-Penta-His é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 5,0, a 40 μg/mL antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 μL/min para obter aproximadamente 6500 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do ligante, etanolamina 1M é injetada para bloquear grupos não reagidos. Subsequentemente o receptor Fc é capturado por 60 s a 4 ou 10 nM. Para medições cinéticas, diluições em série quatro vezes do constructo biespecífico (faixa entre 500 nM e 4000 nM) são injetadas em HBS-EP (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensoativo P20 0,05 %, pH 7,4) a 25°C, a uma taxa de fluxo de 30 μL/min por 120 s.
[00251] Para determinar a afinidade ao antígeno alvo, constructos biespecíficos são capturados por um anticorpo específico anti-Fab humano (GE Healthcare) que é imobilizado em uma superfície de chip sensor CM5 ativado, conforme descrito para o anticorpo Penta-His. A quantidade final de proteína acoplada é aproximadamente 12.000 RU Os constructos biespecíficos são capturados por 90s a 300 nM. Os antígenos alvo são passados através das células de fluxo por 180 s a uma faixa de concentração de 250 a 1.000 nm, com uma taxa de fluxo de 30 μL/min. A dissociação é monitorada por 180 s.
[00252] As diferenças do índice de refração de massa são corrigidas por subtração da resposta obtida na célula de fluxo de referência. A resposta do estado estacionário foi usada para obter a constante de dissociação KD por ajuste de curva não linear da isoterma de ligação de Langmuir. As taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir um para um simples (Programa de Computação de Avaliação BIACORE® T100) por ajuste simultâneo dos sensorgramas de associação e dissociação. O equilíbrio da constante de dissociação (Kd) é calculado como a razão koff/kon. Consulte, por exemplo, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).
ENSAIOS DE ATIVIDADE
[00253] A atividade biológica das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção pode ser medida por vários ensaios, conforme descrito nos Exemplos. As atividades biológicas podem, por exemplo, incluir a indução da proliferação de células T, a indução de sinalização em células T, a indução da expressão de marcadores de ativação em células T, a indução da secreção de citocinas por células T, a indução da lise de células alvo como células tumorais, e a indução da regressão tumoral e/ou o aprimoramento de sobrevida.
COMPOSIÇÕES, FORMULAÇÕES E ROTAS DE ADMINISTRAÇÃO
[00254] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T fornecidas no presente pedido, por exemplo, para uso em qualquer dos métodos terapêuticos abaixo. Em uma realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T fornecidas no presente pedido e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T fornecidas no presente pedido e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo.
[00255] É ainda fornecido no presente pedido um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção sob a forma adequada para administração in vivo, cujo método compreende (a) obter uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T de acordo com a invenção, e (b) formular a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável, pelo qual uma preparação de molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é formulada para administração in vivo.
[00256] Composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma ou mais das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T dissolvidas ou dispersas em um veículo farmaceuticamente aceitável. As frases "farmacêutica ou farmacologicamente aceitável” referem-se a entidades moleculares e composições que geralmente são não tóxicas aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas, isto é, não produzem uma reação adversa, alérgica ou desagradável quando administradas a um animal, como, por exemplo, um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém pelo menos uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T e, opcionalmente, um ingrediente ativo adicional será conhecida por técnicos no assunto, em consideração a presente divulgação, como exemplificado por Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado ao presente pedido como referência. Além disso, para a administração em animal (por exemplo, humano), será entendido que as preparações devem atender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade segurança geral e pureza como requerido pelo FDA Office of Biological Standards ou autoridades correspondentes em outros países. Composições preferenciais são formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Como usado no presente pedido, "veículo farmaceuticamente aceitável” inclui todos e quaisquer solventes, tampões, meios de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de atraso de absorção, sais, conservantes, drogas, estabilizadores de drogas, géis, ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, corantes, como materiais e combinações dos mesmos, como seria conhecido por um técnico no assunto (consulte, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, páginas 1289-1329, incorporado ao presente pedido como referência). Exceto na medida em que qualquer veículo convencional seja incompatível com o componente ativo, o seu uso nas composições terapêuticas ou farmacêuticas é contemplado.
[00257] A composição pode compreender diferentes tipos de veículoes, dependendo se será administrada sob a forma sólida, líquida ou aerossol e se esta precisa ser estéril por essas rotas de administração, como injeção. Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da presente invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) podem ser administradas de modo intravenoso, intradérmico, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniano, intra-articular, intraprostática, intraesplênico, intrarrenal, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, retal, tópico, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutâneo, subconjuntival, intravesicular, via mucosa, intrapericardial, intraumbilical, intraocular, via oral, tópico, localmente, por inalação (por exemplo, inalação de aerossol), injeção, infusão, infusão contínua, perfusão localizada que banha células alvo diretamente, através de um cateter, através de uma lavagem, em cremes, em composições de lipídios (por exemplo, lipossomas), ou por outro método ou qualquer combinação das antecedentes como geralmente seria conhecido por um técnico no assunto (consulte, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado ao presente pedido como referência). Administração parenteral, em injeção intravenosa específica é mais comumente usada para administrar moléculas de polipeptídeos como as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção.
[00258] Composições parenterais incluem aquelas designadas para administração por injeção, por exemplo, injeção subcutânea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intratecal ou intraperitoneal. Para injeção, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes formuladores como suspensão, estabilização e/ou agentes de dispersão. De forma alternativa, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T podem estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água apirogênica estéril, antes de usar. Soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção na quantidade requerida no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados abaixo, conforme necessário. A esterilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação de vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ou os outros ingredientes. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsões, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vácuo ou liofilização que produzem um pó de ingrediente ativo e mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de um meio líquido previamente esterilizado-filtrado do mesmo. O meio líquido deve ser adequadamente tamponado, se necessário, e o primeiro diluente líquido isotônico processado antes da injeção com solução salina ou glicose suficiente. A composição deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e preservado contra a ação de contaminação de microrganismos, como bactérias e fungos. Estima-se que a contaminação de endotoxina deve ser minimamente mantida em um nível seguro, por exemplo, menos que 0,5 ng/mg de proteína. Veículoes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não se limitam a: tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, butila ou álcool benzílico, alcila parabenos, como metila ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formação de sais de contra íons como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como polietileno glicol (PEG). Suspensões de injeção aquosa podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão, como sódio carboximetilcelulose, sorbitol, dextrano ou similares. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Adicionalmente, suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosa apropriada. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos gordurosos como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, como acetato de etila ou triglicérides, ou lipossomos.
[00259] Os ingredientes ativos podem ser retidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são divulgadas em Remington’s Pharmaceutical Sciences (18a Ed. Mack Printing Company, 1990). Podem ser preparadas preparações de liberação sustentada. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o polipeptídeo, cujas matrizes estão sob a forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Em realizações específicas, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser provocada pelo uso das composições de agentes de atraso de absorção como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos.
[00260] Além das composições descritas anteriormente, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T também podem ser formuladas como uma preparação de depósito. Essas formulações de longa ação podem ser administradas por implantação (por exemplo, por via subcutânea ou intramuscular) ou por injeção intramuscular. Dessa forma, por exemplo, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T podem ser formuladas com materiais poliméricos adequados ou hidrofóbicos (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica ou como derivados pouco solúveis, por exemplo, como um sal escassamente solúvel.
[00261] Composições farmacêuticas que compreendem as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção podem ser fabricadas por meio de processos de mistura convencionais, dissolução, emulsificação, encapsulamento, inserção ou liofilização. Composições farmacêuticas podem ser formuladas de maneira convencional usando-se um ou mais veículoes fisiologicamente aceitáveis, diluentes, excipientes ou auxiliares que facilitam o processamento das proteínas em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação adequada é dependente da via de administração escolhida.
[00262] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T podem ser formuladas em uma composição com uma forma livre de ácido ou base, neutra ou salgada. Sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que mantêm a atividade biológica do ácido ou base livre. Esses incluem os sais de adição, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados por ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos ou como ácidos orgânicos como ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Sais formados com os grupos livre de carboxila também podem ser derivados a partir de bases inorgânicas, como por exemplo, hidróxido de sódio, de potássio, de amônio, de cálcio ou de ferro; ou bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e outros próticos do que são as correspondentes formas de base livre.
MÉTODOS TERAPÊUTICOS E COMPOSIÇÕES
[00263] Qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T fornecidas no presente pedido podem ser usadas em métodos terapêuticos. As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção podem ser usadas como agentes imunoterapêuticos, por exemplo, no tratamento de câncer.
[00264] Para uso nos métodos terapêuticos, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção seriam formuladas, dosadas e administradas de um modo consistente com as boas práticas médicas. Os fatores para consideração nesse contexto incluem a disfunção específica a ser tratada, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa da disfunção, o local de distribuição do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos especialistas.
[00265] Em um aspecto, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção para uso como um medicamento. Em aspectos adicionais, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção para uso no tratamento de uma doença. Em certas realizações, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção para uso em um método de tratamento. Em uma realização, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T conforme descrito no presente pedido para uso no tratamento de uma doença em um indivíduo com necessidade da mesma. Em certas realizações, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T para uso em um método para tratar um indivíduo que tem uma doença, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T. Em certas realizações, a doença a ser tratada é uma disfunção proliferativa. Em uma realização específica, a doença é câncer. Em certas realizações, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, se a doença a ser tratada for câncer. Em realizações adicionais, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, conforme descrito no presente pedido, para uso na indução de lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral. Em certas realizações, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T para uso em um método para induzir lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral, em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T para induzir lise de uma célula alvo. Um "indivíduo”, de acordo com qualquer uma das realizações acima é um mamífero, preferencialmente um humano.
[00266] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma realização, o medicamento é para o tratamento de uma doença em um indivíduo com necessidade do mesmo. Em uma realização adicional, o medicamento é para uso em um método para tratar uma doença que compreende administrar a um indivíduo que tem a doença, uma quantidade terapeuticamente efetiva do medicamento. Em certas realizações, a doença a ser tratada é uma disfunção proliferativa. Em uma realização específica, a doença é câncer. Em uma realização, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, se a doença a ser tratada for câncer. Em uma realização adicional, o medicamento é para induzir lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral. Ainda em uma realização adicional, o medicamento é para uso em um método de indução de lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva do medicamento para induzir lise de uma célula alvo. Um "indivíduo”, de acordo com qualquer uma das realizações acima, pode ser um mamífero, preferencialmente um humano.
[00267] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para tratar uma doença. Em uma realização, o método compreende administrar a um indivíduo que tem essa doença uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção. Em uma realização, é administrada uma composição ao dito indivíduo, que compreende a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em certas realizações, a doença a ser tratada é uma disfunção proliferativa. Em uma realização específica, a doença é câncer. Em certas realizações, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, se a doença a ser tratada for câncer. Um "indivíduo”, de acordo com qualquer uma das realizações acima, pode ser um mamífero, preferencialmente um humano.
[00268] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para induzir a lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral. Em uma realização, o método compreende colocar uma célula alvo em contato com uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção na presença de uma célula T, particularmente uma célula T citotóxica. Em um aspecto adicional, é fornecido um método para induzir lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral em um indivíduo. Nessa realização, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T para induzir lise de uma célula alvo. Em uma realização, um "indivíduo” é um humano.
[00269] Em certas realizações, a doença a ser tratada é uma disfunção proliferativa, particularmente câncer. Exemplos não limitantes de cânceres incluem o câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, câncer cervical, câncer endometrial, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer retal, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer de sangue, câncer de pele, carcinoma de célula escamosa, câncer ósseo e câncer de rim. Outras disfunções de proliferação celular que podem ser tratadas com o uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da presente invenção incluem, mas não se limitam a neoplasmas localizados no: abdômen, osso, seio, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas (adrenal, paratireoide, glândula pituitária, testículos, ovário, timo, tiroide), olhos, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pelve, pele, tecidos moles, baço, região torácica e sistema urogenital. Também incluídas estão condições ou lesões pré-cancerosas e metástase de câncer. Em certas realizações, o câncer é escolhido a partir do grupo que consiste em câncer de células renais, câncer de pele, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de cérebro, cabeça e pescoço. Um técnico no assunto prontamente reconhece que em muitos casos a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T pode não fornecer uma cura, mas pode somente fornecer benefício parcial. Em algumas realizações, uma alteração fisiológica que tem algum benefício também é considerada terapeuticamente benéfica. Dessa forma, em algumas realizações, uma quantidade de molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T que fornece uma alteração fisiológica é considerada uma "quantidade efetiva” ou uma "quantidade terapeuticamente efetiva”. O sujeito, paciente ou indivíduo com necessidade de tratamento é tipicamente um mamífero, mais especificamente um humano.
[00270] Em algumas realizações, uma quantidade efetiva de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção é administrada a uma célula. Em outras realizações, uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção é administrada a um indivíduo para o tratamento da doença.
[00271] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção (quando usada sozinha ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, da rota de administração, do tipo de molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, da severidade e curso da doença, se a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos, intervenções terapêuticas prévias ou concorrentes, o histórico clínico do paciente e a resposta à molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T, e do diagnóstico do médico. O médico responsável pela administração irá, em todo caso, determinar a concentração de ingrediente(s) ativo(s) em uma composição e dose(s) apropriada(s) para o paciente individual. Várias programações de dosagem incluindo, mas não se limitando a, administrações únicas ou múltiplas durante vários pontos no tempo, administração em bolus e infusão de pulso são contempladas no presente pedido.
[00272] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T é adequadamente administrada ao paciente de vez em quando ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T pode ser uma dosagem candidata inicial para administrar ao paciente, por exemplo, tanto por uma ou mais administrações separadas como por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T estaria na faixa de cerca de 0,005 mg/kg a cerca de 10mg/kg. Em outros exemplos não limitantes, uma dose também pode compreender cerca de 1 micrograma/kg de peso corporal, cerca de 5 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 10 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 50 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 100 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 200 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 350 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 500 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 1 miligrama/kg de peso corporal, cerca de 5 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 10 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 50 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 100 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 200 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 350 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 500 miligramas/kg de peso corporal a cerca de 1000 mg/kg de peso corporal ou mais por administração e qualquer faixa derivável nisso. Em exemplos não limitantes de uma faixa derivável dos números listados no presente pedido, uma faixa de cerca de 5 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 5 microgramas/kg de peso corporal a cerca de 500 miligramas/kg de peso corporal, etc., podem ser administrados com base nos números descritos acima. Dessa forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba de duas a cerca de vinte ou, por exemplo, cerca de seis doses da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T). Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
[00273] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção geralmente serão usadas em uma quantidade efetiva para alcançar o objetivo pretendido. Para uso para tratar ou prevenir uma condição de doença, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção ou composições farmacêuticas das mesmas, são administradas ou aplicadas em uma quantidade terapeuticamente efetiva. A determinação de uma quantidade terapeuticamente efetiva está bem dentro das capacidades de técnicos no assunto, especialmente em consideração com a divulgação detalhada fornecida no presente pedido.
[00274] Para a administração sistêmica, uma dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro, como ensaios de cultura celular. Uma dose pode então ser formulada em modelos animais para obter uma faixa de concentração circulante que inclui o IC50, conforme determinado em cultura celular. Essa informação pode ser usada para determinar com mais precisão doses úteis em humanos.
[00275] Doses iniciais também podem ser estimadas a partir de dados in vivo, por exemplo, modelos animais, com o uso de técnicas que são bem conhecidas. Geralmente um técnico no assunto poderia facilmente otimizar a administração para humanos com base em dados de animais.
[00276] A quantidade e intervalo de dosagem podem ser ajustadas individualmente para fornecer os níveis de plasma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T que são suficientes para manter o efeito terapêutico. Dosagens usuais para pacientes para administração por injeção na faixa de cerca de 0,1 a 50 mg/kg/dia, tipicamente de cerca de 0,5 a 1 mg/kg/dia. Níveis de plasma terapeuticamente efetivos podem ser alcançados por administração de doses múltiplas a cada dia. Níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por HPLC.
[00277] Nos casos de administração local ou absorção seletiva, a concentração local efetiva das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T não pode estar relacionada à concentração de plasma. Um técnico no assunto será capaz de otimizar as dosagens locais terapeuticamente eficazes sem experimentação exagerada.
[00278] Uma dose terapeuticamente efetiva da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T descrita no presente pedido geralmente fornecerá benefícios terapêuticos sem causar toxicidade substancial. A toxicidade e eficácia terapêutica de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais. Os ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser usados para determinar LD50 (a dose letal para 50% de uma população) e ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50% de uma população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, que pode ser expresso como a razão LD50/ED50. As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T que exibem grandes indicadores terapêuticos são preferenciais. Em uma realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T de acordo com a presente invenção exibe um alto índice terapêutico. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura celular e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens adequadas para uso em humanos. A dosagem situa-se preferencialmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que inclui ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo de uma variedade de fatores, por exemplo, a forma de dosagem empregada, a rota de administração usada, a condição do sujeito, e similares. A formulação exata, rota de administração e dosagem podem ser escolhidas por cada médico em vista das condições do paciente (consulte, por exemplo, Fingl et al., 1975, em: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Capítulo 1, página 1, integralmente incorporado ao presente pedido como referência).
[00279] O médico para os pacientes tratados com moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção saberá como e quando terminar, interromper ou ajustar a administração devido à toxicidade, disfunção de órgão, e similares. Inversamente, o médico também saberá ajustar o tratamento para níveis mais altos, se a resposta clínica não for adequada (impedindo a toxicidade). A magnitude de uma dose administrada no gerenciamento da disfunção de interesse irá variar com a severidade da condição a ser tratada, com a rota de administração, e similares. A severidade da condição pode, por exemplo, ser avaliada, em parte, por métodos padrão de avaliação de prognóstico. Além disso, a dose e talvez a frequência da dose irão também variar de acordo com a idade, peso corporal e resposta do paciente individual.
OUTROS AGENTES E TRATAMENTOS
[00280] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T da invenção podem ser administradas em combinação com um ou mais outros agentes na terapia. Por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção pode ser coadministrada com pelo menos um agente terapêutico adicional. O termo "agente terapêutico” compreende qualquer agente administrado para tratar um sintoma ou doença em um indivíduo com necessidade desse tratamento. Esse agente terapêutico adicional pode compreender quaisquer ingredientes ativos adequados para a indicação específica a ser tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se afetam contrariamente uns aos outros. Em certas realizações, um agente terapêutico adicional é um agente imunomodulador, um agente citostático, um inibidor da adesão celular, um agente citotóxico, um ativador de apoptose celular, ou um agente que aumenta a sensibilidade das células a indutores apoptóticos. Em uma realização específica, o agente terapêutico adicional é um agente anticâncer, por exemplo, um disruptor de microtúbulos, um antimetabólito, um inibidor de topoisomerase, um intercalador de DNA, um agente alquilante, uma terapia hormonal, um inibidor da quinase, um antagonista do receptor, um ativador da apoptose de células tumorais ou um agente antiangiogênico.
[00281] Esses outros agentes estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são efetivas para o propósito desejado. A quantidade efetiva desses outros agentes depende da quantidade de molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T usada, do tipo de disfunção ou tratamento e dos outros fatores discutidos acima. As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T são geralmente usadas na mesma dosagem e com rotas de administração conforme descritas no presente pedido, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente pedido, ou qualquer dosagem e por qualquer rota que seja empiricamente/clinicamente determinada como sendo apropriada.
[00282] Essas terapias de combinação apontadas acima englobam administração combinada (quando dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma composição ou separados), e administração separada, neste caso, administração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que ativam células T também podem ser usadas em combinação com radioterapia.
ARTIGOS DE FABRICAÇÃO
[00283] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de fabricação que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das disfunções descritas acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo, ou uma bula associada ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas para solução IV, etc. Os recipientes podem ser fabricados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si mesma ou combinada com outra composição, eficaz para tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfurável para uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção. O rótulo ou bula indicam que a composição é usada para tratar a condição recomendada. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional ou de outro modo um agente terapêutico. O artigo de fabricação nessa realização da invenção pode, além disso, compreender uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição específica. De maneira alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode, ainda, compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), fosfato tamponado salino, solução de Ringer e solução de dextrose. Além disso, pode incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
EXEMPLOS
[00284] A seguir estão os exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.
MÉTODOS GERAIS TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE
[00285] Os métodos padrão foram usados para manipular o DNA, conforme descrito em Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989. Os reagentes biológicos moleculares foram usados de acordo com as instruções dos fabricantes. As informações gerais relacionadas às sequências de nucleotídeos de cadeias leves e pesadas de imunoglobulinas humanas são fornecidas em: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edição, publicação NIH n° 91-3242.
SEQUENCIAMENTO DE DNA
[00286] As sequências de DNA foram determinadas por sequenciamento de fita dupla.
SÍNTESE GÊNICA
[00287] Os segmentos gênicos desejados, quando necessários foram gerados tanto por PCR com o uso de moldes apropriados como foram sintetizados pela Geneart AG (Regensburg, Alemanha) a partir de oligonucleotídeos sintéticos e produtos de PCR por síntese gênica automatizada. Nos casos em que nenhuma sequência exata do gene estava disponível, os primers dos oligonucleotídeos foram desenhados com base nas sequências de homólogos mais próximos e os genes foram isolados por RT-PCR a partir do RNA originado a partir do tecido apropriado. Os segmentos gênicos flanqueados por sítios únicos de clivagem de endonucleases de restrição foram clonados em vetores de clonagem padrão ou vetores de sequenciamento. O plasmídeo de DNA foi purificado a partir de bactérias transformadas e a concentração determinada por espectroscopia UV. A sequência de DNA dos fragmentos de genes subclonados foi confirmada por sequenciamento de DNA. Os segmentos gênicos foram projetados com sítios de restrição adequados para permitir a sub clonagem nos respectivos vetores de expressão. Todos os constructos foram projetados com uma extremidade 5’ de codificação de sequência de DNA para um peptídeo líder que direciona a secreção de proteínas em células eucariotas. Peptídeos líderes e sequências de polinucleotídeos exemplares que os codificam são representadas nas SEQ ID NOs: 108 a 116.
ISOLAMENTO DE CÉLULAS PAN T PRIMÁRIAS HUMANAS A PARTIR DE PBMCS
[00288] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram preparadas por centrifugação de densidade de Histopaque a partir de preparações de linfócitos enriquecidos (camada leucoplaquetária) obtidos a partir de bancos de sangue locais ou de sangue fresco de doadores humanos saudáveis. Resumidamente, o sangue foi diluído com PBS estéril e cuidadosamente separado em camadas sobre um gradiente de Histopaque (Sigma, H8889). Após centrifugação por 30 minutos a 450 x g à temperatura ambiente (freio desligado), parte do plasma acima da PBMC contendo a interfase foi descartado. As PBMCs foram transferidas para novos tubos Falcon de 50 mL que foram completados com PBS para um volume total de 50 mL. A mistura foi centrifugada à temperatura ambiente por 10 minutos a 400 x g (freio ligado). O sobrenadante foi descartado e o pélete de PBMC lavado duas vezes com PBS estéril (etapas de centrifugação a 4°C por 10 minutos a 350 x g). A população de PBMC resultante foi contada automaticamente (ViCell) e armazenada em meio RPMI1640, contendo FCS 10% e L-alanil-L-glutamina 1% (Biochrom, K0302) a 37°C, CO2 5% na incubadora até ao início do ensaio.
[00289] O enriquecimento de células T a partir de PBMCs foi realizado com o uso de Kit II Pan T Cell Isolation (Miltenyi Biotec n° 130091-156), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os péletes celulares foram diluídos em 40 μL de tampão frio por 10 milhões de células (PBS com BSA 0,5%, EDTA 2 mM, filtrado estéril) e incubados com 10 μL de Coquetel de Biotina-Anticorpo por 10 milhões de células por 10 minutos a 4°C. 30 μL de tampão frio e 20 μL de microesferas magnéticas Anti-Biotina por 10 milhões de células foram adicionados, e a mistura foi incubada por outros 15 minutos a 4°C. As células foram lavadas por adição de 10 a 20x o volume de tampão e uma etapa de centrifugação subsequente a 300 x g por 10 minutos. Mais de 100 milhões de células foram ressuspensas em 500 μL de tampão. A separação magnética de células pan T humanas não marcadas foi realizada com o uso de colunas LS (Miltenyi Biotec n° 130-042-401) de acordo com as instruções do fabricante. A população de células T resultante foi contada automaticamente (ViCell) e armazenada em meio AIM-V a 37°C, CO2 5% na incubadora até o início do ensaio (não mais do que 24 horas).
ISOLAMENTO DE CÉLULAS T VIRGENS HUMANAS PRIMÁRIAS A PARTIR DE PBMCS
[00290] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram preparadas por centrifugação de densidade de Histopaque a partir de preparações de linfócitos enriquecidos (camadas leucoplaquetárias) obtidos a partir de bancos de sangue locais ou de sangue fresco de doadores humanos saudáveis. O enriquecimento de células T a partir de PBMCs foi realizado com o uso de Kit de isolamento de células T CD8+ Virgens obtido junto à Miltenyi Biotec (n° 130-093-244), de acordo com as instruções do fabricante, mas pulando a última etapa de isolamento de células T CD8+ (consulte também a descrição para isolamento de células pan T humanas primárias).
ISOLAMENTO DE CÉLULAS PAN T MURINAS A PARTIR DE ESPLENÓCITOS
[00291] Os baços foram isolados de camundongos C57BL/6, transferidos para um tubo GentleMACS C (Miltenyi Biotech n° 130-093-237) contendo tampão MACS (PBS + BSA 0,5% + EDTA 2 mM) e dissociados com o dissociador GentleMACS para obter uma suspensão de células única de acordo com as instruções do fabricante. A suspensão de células foi passada através de um filtro de pré-separação para remover as partículas restantes do tecido não dissociado. Após centrifugação a 400 x g por 4 minutos a 4°C, o tampão de lise ACK foi adicionado para lisar as células vermelhas do sangue (incubação por 5 minutos à temperatura ambiente). As células restantes foram lavadas duas vezes com tampão MACS, contadas e usadas para o isolamento de células pan T murinas. A seleção negativa (magnética) foi realizada com o uso do Kit Pan T Cell Isolation obtidas junto à Miltenyi Biotec (n° 130-090-861), seguindo as instruções do fabricante. A população de células T resultante foi contada automaticamente (ViCell) e imediatamente usada para ensaios adicionais.
ISOLAMENTO DE PBMCS DE CYNOMOLGUS PRIMÁRIAS A PARTIR DE SANGUE HEPARINIZADO
[00292] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram preparadas por centrifugação de densidade a partir de sangue fresco a partir de doadores cynomolgus, da seguinte forma: O sangue heparinizado foi diluído 1:3 com PBS estéril e meio Lymphoprep (Axon Lab n° 1114545) foi diluído a 90% com PBS estéril. Dois volumes do sangue diluído foram separados em camadas sobre um volume de gradiente de densidade e a fração de PBMC foi separada por centrifugação por 30 minutos a 520 x g, sem freio, à temperatura ambiente. A banda de PBMC foi transferida para um novo tubo Falcon de 50 mL e lavada com PBS estéril por centrifugação por 10 minutos a 400 x g a 4°C. Uma centrifugação a baixa velocidade foi realizada para remover as plaquetas (15 minutos a 150 x g, 4°C), e a população de PBMC resultante foi contada automaticamente (ViCell) e imediatamente usada para ensaios adicionais.
CÉLULAS ALVO
[00293] Para a avaliação de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se direcionam a MCSP, as seguintes linhagens celulares tumorais foram usadas: a linhagem celular de melanoma humano WM266-4 (ATCC n° CRL-1676), derivadas de um sítio metastático de um melanoma maligno e expressando níveis elevados de MCSP humano; a linhagem celular de melanoma humano MV-3 (gentilmente cedida por The Radboud University Nijmegen Medical Centre), que expressa níveis médios de MCSP humano; a linhagem celular do melanoma maligno humano (tumor primário) A375 (ECACC n° 88113005) expressando níveis elevados de MCSP; a linhagem celular de carcinoma do cólon humano HCT-116 (ATCC n° CCL-247) que não expressa MCSP; e a linhagem celular caucasiana de adenocarcinoma de cólon humano LS180 (ECACC n° 87021202) que não expressa MCSP.
[00294] Para a avaliação de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se direcionam a CEA, as seguintes linhagens celulares tumorais foram usadas: a linhagem celular de tumor gástrico humano MKN45 (DSMZ n° ACC 409), que expressa níveis elevados de CEA humano; a linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano HPAF-II (gentilmente cedida por Roche Nutley), que expressa níveis elevados de CEA humano; a linhagem celular primária de adenocarcinoma pancreático humano BxPC-3 (ECACC n° 93120816) que expressa níveis médios de CEA humano; a linhagem celular de fêmeas caucasianas de adenocarcinoma de cólon humano LS-174T (ECACC n° 87060401), expressando níveis médios de CEA humano; a linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano ASPC-1 (ECACC n° 96020930) expressando baixos níveis de CEA humano; a linhagem celular de carcinoma epitelióide pancreático humano Panc-1 (ATCC n° CRL-1469), expressando (muito) baixos níveis de CEA humano; a linhagem celular de carcinoma de cólon humano HCT-116 (ATCC n° CCL-247) que não expressa CEA; a linhagem celular de adenocarcionoma epitelial alveolar basal humano A549-huCEA, que foi transfectada estavelmente internamente (in-house) para expressar CEA humano; e a linhagem celular de carcinoma de cólon murino MC38-huCEA, que foi projetada internamente (in-house) para expressar estavelmente CEA humano.
[00295] Além disso, uma linhagem celular de leucemia de células T humanas, Jurkat (ATCC n° TIB-152), foi usada para avaliar a ligação de diferentes constructos biespecíficos à CD3 humano nas células.
EXEMPLO 1 MATURAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTICORPO ANTI-MCSP M4-3/ML2
[00296] A maturação de afinidade foi realizada através do procedimento de mutagênese direcionada por oligonucleotídeos. Para isso, a variante M4-3 da cadeia pesada, e a variante ML2 da cadeia leve foram clonadas em um vetor de fagomídeo, similar aos descritos por Hoogenboom, (Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-4137). Os resíduos a serem randomizados foram identificados pela primeira geração de um modelo 3D daquele anticorpo através de modelação por homologia clássica e, em seguida, identificação dos resíduos de solventes acessíveis das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da cadeia pesada e leve. Os oligonucleotídeos com randomização baseada em síntese de trinucleotídeo conforme mostrado na Tabela 1 foram adquiridos junto à Ella Biotech (Munich, Alemanha). Três sub-bibliotecas independentes foram geradas através de PCR clássica, e compreendem randomização em CDR-H1 juntamente com CDR-H2, ou CDR-L1 juntamente com CDR-L2. CDR-L3 foi randomizado em uma abordagem separada. Os fragmentos de DNA dessas bibliotecas foram clonados no fagomídeo através de digestão de restrição e de ligação, e, subsequentemente, eletroporados em bactérias TG1.
SELEÇÃO DE BIBLIOTECA
[00297] As variantes de anticorpos dessa forma geradas foram exibidas de modo monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusões com o produto do gene III de M13 empacotado dentro de cada partícula. As variantes exibidas por fagos foram então triadas para as suas atividades biológicas (no presente pedido: afinidade de ligação) e os candidatos que têm uma ou mais atividades melhoradas foram usados para o desenvolvimento adicional. Os métodos para preparar as bibliotecas de exibição por fago podem ser encontrados em Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093.
[00298] As seleções com todas as bibliotecas de maturação de afinidade foram realizadas em solução de acordo com o seguinte procedimento:
  • 1. ligação de aproximadamente 1.012 partículas de fagomídeo de cada biblioteca de maturação de afinidade para hu-MCSP(domínio D3)-avi-his biotinilado 100 nM (SEQ ID NO: 118) por 0,5 hora em um volume total de1 mL,
  • 2. captura de hu-MCSP(domínio D3)-avi-his biotinilado e partículas de fago ligadas especificamente por adição de 5,4 χ 107 micro esferas magnéticas revestidas com estreptavidina por 10 minutos, 3. lavagem de micro esferas com o uso de 1 mL de PBS/Tween-20 5 a 10x e 1 mL de PBS 5 10x, 4. eluição de partículas de fago por adição de 1 mL de TEA (trietilamina) 100 mM por 10 minutos e neutralização por adição de 500 μL de Tris/HCl 1M, pH 7,4 e 5. reinfecção da bactéria E. coli TG1 com crescimento exponencial, a infecção com o fago auxiliar VCSM13 e subsequente precipitação com PEG/NaCl das partículas de fagomídeo a serem usadas em rodadas de seleção subsequentes. As seleções foram realizadas ao longo de 3 a 5 rodadas com o uso de concentrações de antígeno tanto constantes como diminuindo (a partir de 10-7 M para 2 x 10-9 M). Na rodada dois, a captura de complexos antígeno-fago foi realizada com o uso de placas de neutravidina ao invés de microesferas de estreptavidina. Os ligantes específicos foram identificados por ELISA da seguinte forma: 100 μL de hu-MCSP(domínio D3)-avi-his biotinilado 10 nM por poço foram revestidos em placas de neutravidina. Os sobrenadantes contendo Fab bacteriano foram adicionados e as ligações Fabs foram detectadas através de seus marcadores Flag com o uso de anticorpo secundário anti-Flag/HRP. Os clones positivos por ELISA foram expressos em bactérias como fragmentos solúveis de Fab em formato de 96 poços e os sobrenadantes foram sujeitos a um experimento de triagem cinética por análise SPR com o uso de ProteOn XPR36 (BioRad). Os clones que expressam Fabs com as maiores constantes de afinidade foram identificados e os fagomídeos correspondentes foram sequenciados.
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[00299] A Figura 2 mostra o alinhamento dos clones anti-MCSP maturados por afinidade em comparação ao o clone parental não amadurecido (M4-3 mL2). A randomização da cadeia pesada foi realizada apenas em CDR1 e 2. A randomização da cadeia leve foi realizada em CDR1 e 2, e independente em CDR3.
[00300] Durante a seleção, algumas mutações nas estruturas ocorreram como F71Y em clone G3 ou Y87H em clone E10.
PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE IGG1 HUMANA
[00301] As regiões variáveis das sequências de DNA da cadeia pesada e leve das variantes de afinidade amadurecida foram subclonadas no quadro tanto com a cadeia pesada constante como a cadeia leve constante pré-inseridas no respectivo vetor de expressão de mamífero recipiente. A expressão do anticorpo foi conduzida por um promotor MPSV e transporta para uma sequência sintética de sinal poliA na extremidade 3 de CDS. Além disso, cada vetor continha uma sequência EBV OriP.
[00302] A molécula foi produzida por células HEK293-EBNA cotrasnsfectadas com os vetores de expressão de mamífero com o uso de polietilenimina (PEI). As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma razão de 1:1. Para a transfecção, células HEK293 EBNA foram cultivadas em suspensão em meio de cultura CD CHO livre de soro. Para a produção em frasco de agitação de 500 mL, 400 milhões de células HEK293 EBNA foram cultivadas 24 horas antes da transfecção. Para a transfecção as células foram centrifugadas por 5 minutos a 210 x g, o sobrenadante foi substituído por 20 mL de meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em 20 mL de meio CD CHO para um valor final de 200 μg de DNA. Após a adição de 540 μL de solução PEI, a mistura foi vortexada por 15 segundos e subsequentemente incubada por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram misturadas com a solução de DNA/PEI, transferidas para um frasco de agitação de 500 mL e incubadas por 3 horas a 37°C em uma incubadora com uma atmosfera de 5% de CO2. Após o tempo de incubação, 160 mL de meio F17 foi adicionado e as células foram cultivadas por 24 horas. Um dia após a transfecção, ácido valpoico 1 mM e Feed 1 7% (Lonza) foram adicionados. Após 7 dias de cultivo, o sobrenadante foi coletado por purificação por centrifugação por 15 minutos a 210 x g, a solução foi esterilizada por filtração (filtro de 0,22 μm) e azida de sódio em uma concentração final de 0,01 % p/v foi adicionada, e mantido a 4°C.
[00303] A proteína secretada foi purificada a partir de sobrenadantes de cultura celular por cromatografia de afinidade com o uso de Proteína A. O sobrenadante foi carregado em uma coluna HiTrap Protein A HP (CV = 5 mL, GE Healthcare) equilibrado com 40 mL de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida por lavagem com pelo menos 10 volumes da coluna de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5. A proteína foi eluída durante um gradiente ao longo de 20 volumes de coluna de citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5 citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 2,5. A solução de proteína foi neutralizada por adição de 1/10 de fosfato de sódio 0,5 M, pH 8. A proteína alvo foi concentrada e filtrada anteriormente ao carregamento em uma coluna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada com histidina 20 mM, solução de cloreto de sódio 140 mM de pH 6,0.
[00304] A concentração de proteína das amostras de proteínas purificadas foi determinada através da medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, com o uso de coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. A pureza e o peso molecular das moléculas foram analisadas por análise CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor. O sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Life Sciences) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. 2 μg de amostra foram usados para as análises. O conteúdo agregado de amostras de anticorpo foi analisado com o uso de uma coluna de exclusão por tamanho analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) em K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, monocloridrato de L-arginina 200 mM, 0,02% (p/v) de NaN3, tampão de corrida com pH 6,7 a 25°C.
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DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE ANÁLISE PROTEON
[00305] KD foi medida por ressonância plasmônica de superfície com o uso de uma máquina ProteOn XPR36 (BioRad) a 25°C com fragmento F(ab’)2 de anticorpo anti-humano de captura específica (Jackson ImmunoResearch n° 109-005-006) imobilizado pelo acoplamento de amina em chips CM5 e subsequente captura das Fabs do sobrenadante bacteriano ou a partir de preparações de Fab purificadas. Resumidamente, chips biossensores de dextrano carboximetilo (CM5, GE Healthcare) foram ativados com N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O fragmento F(ab’)2 de anticorpo anti-humano de captura específica foi diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 5,0 a 50 μg/mL antes da injeção a uma taxa de fluxo de 10 μL/minuto para obter aproximadamente 10.000 unidades de resposta (RU) do anticorpo de captura acoplado. Após a injeção do anticorpo de captura, etanolamina 1 M é injetada para bloquear os grupos que não reagiram. Para as medições cinéticas, Fabs de sobrenadante bacteriano ou Fabs purificadas foram injetadas a uma taxa de fluxo de 10 μL/minuto por 300 segundos e uma dissociação de 300 segundos para a estabilização de captura de linha de base. Os níveis de captura estavam na faixa de 100-500 RU. Em uma etapa subsequente, o analito MCSP (domínio D3)-avi-his humano foi injetado tanto com uma concentração única como com uma série de concentrações (dependendo da afinidade do clone em uma faixa entre 100 nM e 250 pM) diluído em HBS-EP+ (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,05% Tensoativo P20, pH 7,4) a 25°C a uma taxa de fluxo de 50 μΕ/minuto. A superfície do sensorchip foi regenerada por injeção de glicina pH 1,5 por 30 segundos a 90 μL/minuto seguida por injeção de NaOH por 20 segundos na mesma taxa de fluxo. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (koff) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir um para um simples (programa de computação XPR36 Evaluation ou programa de computação Scrubber (BioLogic)) por ajuste simultâneo dos sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada como a razão koff/kon. Esses dados foram usados para determinar a afinidade de ligação comparativa das variantes de afinidade amadurecida com o anticorpo parental. A Tabela 3a mostra os dados gerados a partir desses ensaios.
[00306] G3, E10, C5 para a cadeia leve, e D6, A7, B7, B8, C1 para a cadeia pesada foram escolhidos para a conversão no formato de IgG1 humana. Uma vez que CDR1 e 2 da cadeia leve foram randomizadas independente de CDR3, as CDRs obtidas foram combinadas durante a conversão de IgG.
[00307] Os formatos de afinidade de IgG foram medidos novamente com o antígeno MCSP humano (SEQ ID NO: 118), além disso, também para o homólogo de cynomolgus (SEQ ID NO: 117).
[00308] O método usado foi exatamente conforme descrito para os fragmentos Fab, apenas com o uso de IgG purificada a partir da produção de mamífero.
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[00309] Experimentos de ressonância plasmônica de superfície (SPR) para determinar a afinidade e a avidez da afinidade de IgGs maduras foram realizadas em um Biacore T200 a 25°C com HBS-EP como tampão de corrida (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensoativo P20 0,005%, Biacore, Freiburg/Alemanha).
[00310] Para analisar a avidez da interação de diferentes IgGs anti-MCSP para acoplamento direto de MCSP D3 humano e cynomolgus de cerca de 9.500 unidades de ressonância (RU) do anticorpo His anti-Penta (Qiagen) foi realizada em um chip CM5 em pH 5,0 com o uso do kit de acoplamento de amina padrão (Biacore, Freiburg/Alemanha). Os antígenos foram capturados por 60 segundos a 30 nM com 10 μL/minuto respectivamente. IgGs foram passadas a uma concentração de 0,0064 a 100 nM com uma taxa de fluxo de 30 μL/minuto através do fluxo das células ao longo de 280 segundos. A dissociação foi monitorada por 180 segundos. As diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas por subtração da resposta obtida na célula de fluxo de referência. No presente pedido, as IgGs foram fluidas em uma superfície com anticorpo anti-Penta His imobilizado mas em que HBS-EP foi injetado de preferência em MCSP D3 humano ou MCSP D3 de cynomolgus.
[00311] Para medições de afinidade, IgGs foram capturadas em uma superfície do sensorchip CM5 com Fc anti-humano imobilizado. A captura de IgG foi acoplada à superfície do sensorchip por imobilização direta de cerca de 9.500 unidades de ressonância (RU) a pH 5,0 com o uso de kit de acoplamento de amina padrão (Biacore, Freiburg/Alemanha). IgGs são capturadas por 25 segundos a 10 nM com 30 μL/mintuo. MCSP D3 Humana e de cynomolgus foram passadas a uma concentração de 2 a 500 nM com uma taxa de fluxo de 30 μL/minuto através de fluxo de células acima de 120 segundos. A dissociação foi monitorada por 60 segundos. Associação e dissociação para a concentração de 166 e 500 nM foram monitoradas por 1200 e 600 segundos, respectivamente. As diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas por subtração da resposta obtida no fluxo de célula referência. No presente pedido, os antígenos foram liberados em uma superfície com um anticorpo anti-Fc humano imobilizado, mas no qual HBS-EP foi injetado de preferência em IgGs anti-MCSP.
[00312] As constantes cinéticas foram derivadas com o uso do programa de computação Biacore T200 Evaluation (vAA, Biacore AB, Uppsala/Suécia), para ajustar equações de razão para 1:1 de ligação de Langmuir por integração numérica.
[00313] Maiores afinidades ao MCSP D3 humano e de cynomolgus foram confirmadas por meio de medições de ressonância plasmônica de superfície com o uso de Biacore T200. Além disso, as medições de avidez mostraram um aumento de até 3 vezes na ligação bivalente (Tabela 3b)
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EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE MCSP TCB (2+1 CROSSFAB-IGG P329G LALA INVERTIDA) CONTENDO M4-3(C1) ML2(G3) COMO ANTICORPO ANTI MCSP E CH2527 HUMANIZADO COMO ANTICORPO ANTI CD3
[00314] A região variável de sequências de DNA da cadeia pesada e cadeia leve foram subclonadas na estrutura tanto com a cadeia pesada constante como a cadeia leve constante pré-inseridas no respectivo vetor de expressão de mamífero recipiente. O anticorpo de expressão foi dirigido por um promotor MPSV e carrega uma sequência sintética de sinal poliA na extremidade 3’ de CDS. Além disso, cada vetor contém uma sequência EBV OriP.
[00315] A molécula foi produzida por cotransfecção de células HEK293-EBNA com os vetores de expressão de mamíferos com o uso de polietilenimina (PEI). As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma taxa 1:2:1:1 ("vetor Fc da cadeia pesada (orifício)”: "vetor da cadeia leve” : "vetor Crossfab da cadeia leve” : "vetor Fc(protuberância)-FabCrossfab da cadeia pesada”).
[00316] Para a transfecção, células HEK293 EBNA foram cultivadas em suspensão em meio de cultura CD CHO livre de soro. Para a produção em frasco de agitação de 500 mL, 400 milhões de células HEK293 EBNA foram cultivadas 24 horas antes da transfecção. Para a transfecção as células foram centrifugadas por 5 minutos a 210 x g, o sobrenadante foi substituído por 20 mL de meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em 20 mL de meio CD CHO para uma quantidade final de 200 μg de DNA. Após a adição de 540 μL de solução PEI, a mistura foi vortexada por 15 segundos e subsequentemente incubada por 10 minutos à temperatura ambiente. Depois as células foram misturadas com a solução DNA/PEI, transferidas para um frasco de agitação de 500 mL e incubadas por 3 horas a 37°C em incubadora com atmosfera de 5% de CO2. Após o tempo de incubação, 160 mL de meio F17 foram adicionados e as células foram cultivadas por 24 horas. Um dia após a transfecção, de ácido valproico 1 mM e de Feed 1 7% (Lonza) foram adicionados. Após 7 dias de cultura o sobrenadante foi coletado para a purificação por centrifugação por 15 minutos a 210 x g, a solução foi esterilizada por filtração (filtro de 0,22 μm) e azida de sódio em uma concentração final de 0,01% p/v foi adicionada, e mantido a 4°C.
[00317] A proteína secretada foi purificada a partir de sobrenadantes de cultura celular por cromatografia de afinidade com o uso de Proteína A. O sobrenadante foi carregado em uma coluna HiTrap Protein A HP (CV=5 mL, GE Healthcare) equilibrado com 40 mL de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida por lavagem com pelo menos 10 volumes da coluna de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5. A proteína alvo foi eluída durante um gradiente ao longo de 20 volumes da coluna de citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5 citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 2,5. A solução de proteína foi neutralizada por adição de 1/10 de fosfato de sódio 0,5 M, pH 8. A proteína alvo foi concentrada e filtrada antes de carregamento em coluna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada com histidina 20 mM, solução de cloreto de sódio 140 mM de pH 6,0
[00318] A concentração de proteína de amostras de proteínas purificadas foi determinada pela medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, com o uso de coeficiente de extinção molar calculada com base na sequência de aminoácidos.
[00319] A pureza e o peso molecular de moléculas foram analisados por análise CE-SDS na presença e na ausência de um agente redutor. O sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Lifescience) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. 2 μg de amostra foram usados para as análises.
[00320] O conteúdo agregado de amostras de anticorpos foi analisado com o uso de uma coluna analítica de exclusão por tamanho TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) em K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monocloridrato de L-arginina 200 mM, NaN3 0,02% (p/v), pH 6,7 e tampão de corrida a 25°C.
Figure img0008
[00321] A Figura 3 mostra um desenho esquemático da molécula de MCSP TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertida).
[00322] A Figura 4 e a Tabela 4b mostram as análises CE-SDS de uma molécula de MCSP TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertida) (SEQ ID NOs: 12, 53, 54 e 55).
Figure img0009
EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE CEA TCB (2+1 CROSSFAB-IGG P329G LALA INVERTIDA) CONTENDO CH1A1A 98/99 2F1 COMO ANTICORPO ANTI CEA E CH2527 HUMANIZADO COMO ANTICORPO ANTI CD3
[00323] A região variável de sequências de DNA da cadeia pesada e cadeia leve foram subclonadas no quadro tanto com a cadeia pesada constante como com a cadeia leve constante pré-inseridas no respectivo vetor de expressão de mamíferos recipiente. A expressão do anticorpo foi conduzida por um promotor MPSV e carrega uma sequência sintética de sinal de PoliA na extremidade 3’ de CDS. Além disso, cada vetor continha uma sequência EBV OriP.
[00324] A molécula foi produzida por cotransfecção de células HEK293 EBNA com os vetores de expressão de mamíferos com o uso de polietilenimina (PEI). As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma taxa de 1:2:1: 1 ("vetor Fc da cadeia pesada (orifício) ”: "vetor da cadeia leve”: "vetor Crossfab da cadeia leve”: "vetor Fc-FabCrossfab da cadeia pesada (protuberância).
[00325] Para a transfecção, as células HEK293 EBNA foram cultivadas em suspensão em meio de cultura CD CHO livre de soro. Para a produção em frascos de agitação de 500 mL, 400 milhões de células HEK293 EBNA foram cultivadas 24 horas antes da transfecção. Para a transfecção as células foram centrifugadas por 5 minutos a 210 x g, o sobrenadante foi substituído por 20 mL de meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em 20 mL de meio CD CHO para uma quantidade final de 200 μg de DNA. Após a adição de 540 μL de solução PEI, a mistura foi vortexada por 15 segundos e subsequentemente incubada por 10 minutos a temperatura ambiente. Depois as células foram misturadas com a solução DNA/PEI, transferidas para um frasco de agitação de 500 mL e incubadas por 3 horas a 37°C em incubadora com atmosfera de CO2 5%. Após o tempo de incubação, 160 mL de meio F17 foram adicionados e as células foram cultivadas por 24 horas. Um dia após a transfecção, ácido valproico 1 mM e Feed 1 7% (Lonza) foram adicionados. Após 7 dias de cultura, o sobrenadante foi coletado para a purificação por centrifugação por 15 minutos a 210 x g, a solução foi esterilizada por filtração (filtro de 0,22 Mm) e azida de sódio em uma concentração final de 0,01 % p/v foi adicionada, e mantido a 4°C.
[00326] A proteína secretada foi purificada a partir de sobrenadantes de cultura celular por cromatografia de afinidade com o uso de Proteína A. O sobrenadante foi carregado em uma coluna a HiTrap Protein A HP (CV=5 mL, GE Healthcare) equilibrado com 40 mL de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida por lavagem com pelo menos 10 volumes de coluna de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5. A proteína alvo foi eluída durante um gradiente ao longo de 20 volumes de coluna de citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5 citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 2,5. A solução de proteína foi neutralizada por adição de 1/10 de fosfato de sódio 0,5 M, pH 8. A proteína alvo foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada com histidina 20 mM, solução de cloreto de sódio 140 mM de pH 6,0.
[00327] A concentração de proteína de amostras de proteínas purificadas foi determinada através da medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, com o uso de o coeficiente de extinção molar calculada com base na sequência de aminoácidos.
[00328] A pureza e o peso molecular das moléculas foram analisados por análise de CE-SDS na presença e na ausência de um agente redutor. O sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Lifescience) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. 2 μg amostra foram utilizados para as análises.
[00329] O conteúdo agregado de amostras de anticorpo foi analisado com o uso de uma coluna analítica de exclusão de tamanho TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) em K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monocloridrato de L-arginina 200 mM, 0,02% de (p/v) NaN3, pH 6,7 e tampão de corrida a 25°C.
Figure img0010
[00330] A Figura 5 mostra um desenho esquemático da molécula de CEA TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertida).
[00331] A Figura 6 e a Tabela 6 mostram as análises CE-SDS de uma molécula de CEA TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertida) (SEQ ID NOs: 22, 56, 57 e 58).
Figure img0011
[00332] Em um método de purificação alternativo, CEA TCB foi capturado a partir de sobrenadante de fermentação, coletado e clarificado por cromatografia de afinidade de Proteína A (MabSelect SuRe). A Proteína A eluída foi então submetida a cromatografia de troca catiônica (Poros 50 HS) e subsequentemente fracionada e analisada por meio de SE-HPLC e eletroforese capilar. Os produtos contendo as frações foram agrupados e submetidos a cromatografia de interação hidrofóbica (Butyl -Sepharose 4FF) à temperatura ambiente de um modo ligação-eluição. O eluído foi então fracionado e analisado por meio de SE-HPLC e eletroforese capilar. Os produtos contendo as frações foram agrupados e cromatografia de troca aniônica (Q-Sepharose FF) em modo de fluxo foi realizada. O material obtido com o uso desse método de purificação tinha um conteúdo de monômero >98%.
EXEMPLO 4 LIGAÇÃO DE MCSP TCB EM MCSP- E CÉLULAS QUE EXPRESSAM CD3
[00333] A ligação de MCSP TCB foi testada em uma linhagem celular de melanoma maligno humano que expressa MCSP (A375) e em uma linhagem linfocitária de células T imortalizadas que expressam CD3 (Jurkat). Resumidamente, as células foram coletadas, contadas, verificadas para a viabilidade e ressuspensas a 2 x 106 células/mL em tampão FACS (100 μL PBS 0,1% de BSA). 100 μL da suspensão celular (contendo 0,2 x 106 de células) foram incubados em placas de 96 poços de fundo redondo por 30 minutos a 4°C com concentrações crescentes de MCSP TCB (2,6 pM a 200 nM), lavados duas vezes com PBS 0,1% BSA frio, incubados novamente por outros 30 minutos a 4°C com o anticorpo secundário Específico de Fragmento Fcy de IgG anti-humano de cabra fragmento F(ab’)2 AffiniPure conjugado a PE (Jackson Immuno Research Lab PE n° 109-116-170), lavado duas vezes com PBS 0,1% BSA frio e imediatamente analisados por FACS com o uso de FACS CantolI (programa de computação FACS Diva) por gating live para células DAPI-negativas. As curvas de ligação foram obtidas com o uso de GraphPadPrism5 (Figura 7A ligação às células A375, EC50 = 3381 pM; Figura 7B, ligação às células Jurkat).
EXEMPLO 5 MORTE DE CÉLULAS T INDUZIDA POR ANTICORPO MCSP TCB
[00334] A morte de células T mediada por anticorpo MCSP TCB foi avaliada com o uso de um painel de linhagens de células de tumorais que expressam diferentes níveis de MCSP (A375 = MCSP alto, MV-3 = MSCP médio, HCT-116 = MCSP baixo, LS180 = MCSP negativo). Resumidamente, as células alvo foram coletadas com tripsina/EDTA, lavadas, e plaqueadas a uma densidade de 25.000 células /poço com o uso de placas de 96 poços de fundo plano. As células foram deixadas para adesão durante a noite. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram preparadas por centrifugação de densidade de Histopaque das preparações de linfócitos enriquecidos (camada leucoplaquetária) obtidas a partir de doadores humanos saudáveis. O sangue fresco foi diluído com PBS estéril e separado em camadas sobre gradiente de Histopaque (Sigma, n° H8889). Após centrifugação (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), o plasma acima de PBMC contendo a interfase foi descartado e as PBMCs transferidas para um novo tubo subsequentemente preenchido com 50 mL de PBS. A mistura foi centrifugada (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), o sobrenadante foi descartado e o pélete de PBMC lavado duas vezes com PBS estéril (etapas da centrifugação 350 x g, 10 minutos). A população de PBMC resultante foi contada automaticamente (ViCell) e armazenada em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS e 1% de L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) a 37°C, CO2 5% em incubadora de células até o seu uso (não mais do que 24 horas). Para o ensaio de morte, o anticorpo foi adicionado nas concentrações indicadas (faixa de 1 pM a 10 nM em triplicata. PBMCs foram adicionadas a células alvo no efetor final ao alvo (E:T) à uma taxa de 10:1. A morte das células alvo foi avaliada após 24 horas de incubação a 37°C, CO2 5% por quantificação de LDH liberado para sobrenadantes celulares por células em apoptose/necrose (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science, n° 11 644 793 001). A lise máxima de células alvo (= 100%) foi obtida por incubação das células alvo com Triton X-100 1%. A lise mínima (= 0%) refere-se a células alvo coincubadas com células efetoras sem constructo biespecífico. Os resultados mostram que MCSP TCB induziu fortemente e de modo alvo-específico a morte de linhagens de células alvo MCSP-positivas sem a morte de linhagens celulares MCSP-negativas (Figura 8, A a D). Os valores EC50 relacionados com os ensaios de morte, calculados com o uso de GraphPadPrism5 são mostrados na Tabela 7.
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SUPRARREGULAÇÃO DE CD25 E CD69 EM CÉLULAS EFETORAS CD8+ E CD4+ APÓS A MORTE DE CÉLULAS T DE CÉLULAS TUMORAIS QUE EXPRESSAM MCSP INDUZIDA POR ANTICORPO MCSP TCB
[00335] A ativação de células T CD8+ e CD4+ após a morte de células T de células tumorais MV-3 que expressam MCSP, mediada pelo anticorpo MCSP TCB foi avaliada por análise FACS com o uso de anticorpos que reconhecem os marcadores de ativação das células T CD25 (marcador de ativação tardia) e CD69 (marcador de ativação precoce). O anticorpo e as condições de ensaio de morte foram essencialmente conforme descrito acima (Exemplo 5), com o uso da mesma faixa de concentrações de anticorpos (1 pM a 10 nM em triplicatas), E:T razão 10:1 e um tempo de incubação de 24 horas.
[00336] Após a incubação, as PBMC foram transferidas para uma placa de fundo redondo de 96 poços, centrifugadas a 350 x g por 5 minutos e lavadas duas vezes com PBS contendo BSA 0,1%. A coloração da superfície para CD8 (FITC anti CD8 humano, BD n° 555634), CD4 (PECy7 anti CD4 humano, BD n° 557852), CD69 (PE anti CD9 humano, Biolegend n° 310906) e CD25 (APC anti CD25 humano, BD n° 555434) foi realizada de acordo com as indicações dos fornecedores. As células foram lavadas duas vezes com 150 μL/poço de PBS contendo BSA 0,1% e fixadas por 15 minutos a 4°C com o uso de 100 pL/poço de tampão de fixação (BD n° 554655). Após centrifugação, as amostras foram ressuspensas em 200 pL/poço de PBS contendo BSA 0,1% DAPI para excluir as células mortas para a medição de FACS. As amostras foram analisadas no BD FACS Fortessa. Os resultados mostram que MCSP TCB induziu uma suprarregulação forte e alvo-específica dos marcadores de ativação (CD25, CD69) em células T CD8+ (Figura 9 A, B) e células T CD4+ (Figura 9 C, D) após a morte.
EXEMPLO 7 SECREÇÃO DE CITOCINAS PELAS CÉLULAS EFETORAS HUMANAS APÓS A MORTE DE CÉLULAS T DE CÉLULAS T TUMORAIS EXPRESSANDO MCSP INDUZIDAS PELO ANTICORPO MCSP TCB
[00337] A secreção de citocinas por PBMC humana após a morte de células T tumorais expressando MCSP MV-3 induzida por anticorpo MCSP TCB foi avaliada por análise FACS de sobrenadantes de células após o ensaio de morte.
[00338] O mesmo anticorpo foi usado e o ensaio de morte foi realizado essencialmente conforme descrito (Exemplos 5 e 6), com o uso e uma razão E:T de 10:1 e um tempo de incubação de 24 horas.
[00339] Ao final do tempo de incubação, a placa foi centrifugada por 5 minutos a 350 x g, o sobrenadante foi transferido para uma nova placa de 96 poços e armazenado a -20°C até a análise subsequente. A Granzima B, TNFa, IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10 secretadas nos sobrenadantes celulares foram detectadas com o uso de BD CBA Human Soluble Protein Flex Set, de acordo com as instruções do fabricante em um FACS CantolI. Os seguintes kits foram usados: BD CBA humano Granzima B BD CBA humano granzima B Flex Set n° BD 560304; BD CBA humano TNF Flex Set n° BD 558273; BD CBA humano IFN-γ Flex Set n° BD 558269; BD CBA humano IL-2 Flex Set n° BD 558270; BD CBA humano IL-4 Flex Set n° BD 558272; BD CBA humano IL-10 Flex Set n° BD 558274.
[00340] Os resultados mostram que MCSP TCB induziu a secreção de IL-2, IFN-γ, TNFα, Granzima B e IL-10 (mas não de IL-4) após a morte (Figura 10, A a F).
[00341] Em conjunto, esses exemplos mostram que o anticorpo biespecífico MCSP CD3:
  • Mostrou uma boa ligação às células A375 MCSP-positivas
  • Induziu uma morte forte e alvo-específica de linhagens de células alvo MCSP-positivas e nenhuma morte de linhagens celulares MCSP-negativas.
  • Induziu uma suprarregulação forte e alvo-específica de marcadores de ativação (CD25, CD69) em células T CD8+ e CD4+ após a morte.
  • Induziu secreção de IL-2, IFN-γ, TNFα, Granzima B e IL-10 (mas não de IL-4) após a morte.
EXEMPLO 8 LIGAÇÃO DE CEA TCB A CEA- E CÉLULAS QUE EXPRESSAM CD3
[00342] A ligação de CEA TCB foi testada em CEA células de adenocarcinoma de pulmão que expressam CEA transfectadas (A549-huCEA) e linhagens de linfócitos T humanos e de cynomolgus imortalizadas que expressam CD3 (Jurkat e HSC-F, respectivamente). Um TCB não direcionado (SEQ ID NOs: 59, 60, 61 e 62; consulte o exemplo 24) foi usado como controle. Resumidamente, as células foram colhidas, contadas, verificadas por viabilidade e ressuspensas a 2 x 106 células/mL em tampão FACS (100 μL de PBS de BSA 0,1%). 100 μL de suspensão celular (contendo 0,2 x 106 células) foram incubadas em uma placa de 96 poços de fundo redondo por 30 min a 4°C com concentrações crescentes de CEA TCB (61 pM a 1000 nM), lavada duas vezes com PBS de BSA 0,1% frio, reincubada por mais 30 min a 4°C com o anticorpo secundário Específico do Fragmento F(ab’)2 de IgG anti-humana de cabra do Fragmento F(ab’)2 AffiniPure conjugado com FITC (Jackson Immuno Research Lab FITC n° 109-096-097), lavado duas vezes com PBS de BSA 0,1% frio e analisado imediatamente por FACS com o uso de um FACS CantoII ou Fortessa (Programa de computação FACS Diva) por do bloqueio de células PI negativas vivas. As curvas de ligação foram obtidas com o uso de GraphPadPrism5 (Figura 11A, ligação para células A549 (EC50 6.6 nM); Figura 11B, ligação para células Jurkat; Figura 11C, ligação para células HSC-F).
EXEMPLO 9 MORTE MEDIADA POR CÉLULAS T DE CÉLULAS ALVO TUMORAIS QUE EXPRESSAM CEA INDUZIDAS POR ANTICORPO CEA TCB
[00343] A morte mediada por células T de células alvo induzida por anticorpo CEA TCB foi avaliada em células tumorais humanas HPAFII (CEA alto), BxPC-3 (CEA médio) e ASPC-1 (CEA baixo). HCT-116 (linhagem celular tumoral negativa CEA) e TCB não direcionado foram usados como controles negativos. PBMCs humanas foram usadas como efetores e a morte detectada 24h e 48h após a incubação com anticorpo biespecífico. Resumidamente, células alvo foram colhidas com Tripsina/EDTA, lavadas e plaqueadas na densidade de 25.000 células/poço com o uso de placas de 96 poços de fundo plano. Células foram deixadas para aderirem durante a noite. Células mononucleares do sangue periférico (PMBCs) foram preparadas por centrifugação de densidade Histopaque de preparações de linfócitos enriquecidos (camadas leucoplaquetárias), obtidas a partir de doadores humanos saudáveis. Sangue fresco foi diluído com PBS estéril e disposto em camadas sobre o gradiente de Histopaque (Sigma, n° H8889). Após a centrifugação (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), o plasma acima da interfase contendo PBMC foi descartado e as PBMCs transferidas para um novo tubo falcon, subsequentemente preenchido com 500mL de PBS. A mistura foi centrifugada (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), o sobrenadante descartado e o pélete de PMBC lavado duas vezes com PBS estéril (centrifugação em etapas 350 x g, 10 minutos) A população de PBMC resultante foi contada automaticamente (ViCell) e mantida em meio RPMI1640 contendo FCS 10% e L-alanil-L-glutamina 1% (Biochrom, K0302) no incubador celular (37°C, CO2 5%), até o uso posterior (não mais que 24 h). Para o ensaio de morte, os anticorpos foram adicionados nas concentrações indicadas (faixa de 6 pM a 100nM em triplicatas). As PBMCs foram adicionadas às células alvo na razão final E:T de 10:1. A morte de células alvo foi avaliada e após 24h e 48h de incubação por quantificação de LDH (lactato desidrogenase), liberado em sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science, n° 11 644 793 001). A lise máxima das células alvo (= 100%) foi obtida por incubação de células alvo com Triton X-100 1%. A lise mínima (= 0%) se refere às células alvo coincubadas com células efetoras sem anticorpo biespecífico. Os resultados mostram que CEA TCB induziu uma morte forte e específica ao alvo de células alvo CEA positivas (Figura 12, A a H). Os valores de EC50 relacionados com os ensaios de morte, calculados com o uso de GraphPadPrism5 são fornecidos na Tabela 8.
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EXEMPLO 10 PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T E ATIVAÇÃO 5 DIAS APÓS A MORTE MEDIADA POR CEA TCB DE CÉLULAS ALVO TUMORAIS QUE EXPRESSAM CEA
[00344] A proliferação e ativação de células T foi detectada 5 dias após a morte mediada por CEA TCB de CEA expressando células tumorais humanas HPAFII (CEA alto), BxPC-3 (CEA médio) e ASPC-1 (CEA baixo). HCT-116 (linhagem celular tumoral negativa CEA) e TCB não direcionado foram usados como controles negativos. As condições experimentais para o ensaio de proliferação foram similares às descritas no Exemplo 9, mas apenas 10.000 células alvo foram plaqueadas por poço de uma placa de 96 poços de fundo plano. Para avaliar a proliferação de células T, as PBMCs recém isoladas foram marcadas com o uso de CFSE (Sigma n° 21888). Resumidamente, a solução estoque de CFSE foi diluída para obter uma solução de trabalho de 100 μΜ. 90 x 106 células de PBMC foram ressuspensas em 90 mL de PBS pré-aquecido e suplementados com 90μL de solução de trabalho CFSE. As células foram misturadas imediatamente e incubadas 15min a 37°C. 10mL de FCS pré-aquecido foram adicionados às células para parar a reação. As células foram centrifugadas por 10 min a 400 g, ressuspensas em 50 mL de meio e incubadas por 30 min a 37°C. Após a incubação, as células foram lavadas uma vez com meio aquecido, contadas, ressuspensas em meio e adicionadas às células alvo para o ensaio de morte e subsequentemente medição de proliferação celular e ativação a uma E:T de 10:1. A proliferação foi avaliada 5 dias após a morte em células T CD4 e CD8 positivas por quantificação de diluição de corante CFSE. A expressão de CD25 foi avaliada nos mesmos subconjuntos de células T com o uso de um anticorpo CD25 anti-humano. Resumidamente, após a centrifugação (400 x g por 4 min), as células foram ressuspensas com tampão FACS e incubadas com 25 μL da mistura de anticorpo CD4/CD8/CD25 diluída por 30 min 4°C (CD4 anti-humano APC/Cy7 n° 317418, CD8 anti-humano APC n° 301014, CD25 anti-humano PE/Cy7 n° 302612). As células foram então lavadas três vezes para remover o anticorpo não ligado e finalmente ressuspensas em 200 μL de tampão FACS contendo iodeto de propídio (PI) para excluir células mortas para a medição de FACS. A Fluorescência foi medida com o uso de BD FACS CantolI. Os resultados mostram que CEA TCB induziu uma proliferação forte e alvo-específica de células T CD8+ e CD4+ T (Figura 13, A a D), bem como sua ativação, conforme detectado por suprarregulação do marcador de ativação CD25 (Figura 13, E a H).
EXEMPLO 11 SECREÇÃO DE CITOCINA POR CÉLULAS EFETORAS HUMANAS APÓS A MORTE MEDIADA POR CÉLULAS T DE CÉLULAS ALVO TUMORAIS QUE EXPRESSAM CEA INDUZIDAS POR CEA TCB
[00345] A secreção de citocina por PBMCs humanas após a morte mediada por células T de células tumorais MKN45 que expressam CEA induzida por CEA TCB foi avaliada por análise FACS (kit CBA) de sobrenadantes celulares 48h após a morte.
[00346] As condições experimentais foram idênticas às descritas no Exemplo 9. Ao final do tempo de incubação, a placa foi centrifugada por 5min a 350 x g, o sobrenadante transferido em uma nova placa de 96 poços e armazenado a -20°C até a análise subsequente. (A) IFN-γ, (B) TNFa, (C) Granzima B, (D) IL-2, (E) IL-6 e (F) IL-10 secretadas nos sobrenadantes celulares foram detectadas com o uso do Conjunto BD CBA Human Soluble Protein Flex Set, conforme as instruções do fabricante em um FACS CantoII. Os seguintes kits foram usados: Conjunto CD CBA human IL-2 BD Flex n° BD 558270; Conjunto BD CBA human Granzyme B BD Flex n° BD 560304; Conjunto BD CBA human TNF Flex n° BD 558273; Conjunto BD CBA human IFN-γ Flex n° BD 558269; Conjunto BD CBA human IL-4 Flex n° BD 558272; ConjuntoBD CBA human IL-10 Flex n° BD 558274.
[00347] Os resultados mostram que CEA TCB mediou a morte (mas não a morte mediada por controle TCB sem alvo), induziu secreção de IFN-γ, TNFα, Granzima B, IL-2, IL-6 e IL-10 (Figura 14, A a F).
EXEMPLO 12 MORTE MEDIATA POR CÉLULAS T DE CÉLULAS ALVO NA PRESENÇA DE CONCENTRAÇÕES CRESCENTES DE SHED CEA (SCEA)
[00348] A morte mediada por células T de células alvo tumorais que expressam CEA (LS180) induzida pelo anticorpo CEA TCB na presença de concentrações crescentes de shed CEA (sCEA 2.5 ng/mL a 5 μg/mL) foi avaliada. PBMCs humanas foram usadas como células efetoras e a morte detectada 24h e 48h após a incubação com anticorpo biespecífico e sCEA. Resumidamente, células alvo foram colhidas com Tripsina/EDTA, lavadas e plaqueadas na densidade de 25.000 células/poço com o uso de placas de 96 poços de fundo redondo. As células foram deixadas para aderirem durante a noite. Células mononucleares do sangue periférico (PMBCs) foram preparadas por centrifugação de densidade Histopaque de preparações de linfócitos enriquecidos (camadas leucoplaquetárias), obtidas de doadores humanos saudáveis. Sangue fresco foi diluído com PBS estéril e disposto em camadas sobre o gradiente Histopaque (Sigma, n° H8889). Após a centrifugação (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), o plasma acima da interfase contendo PBMC foi descartado e as PBMCs transferidas em um novo tubo Falcon, subsequentemente preenchido com 500mL de PBS. A mistura foi centrifugada (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), o sobrenandante descartado e o pélete PMBC lavado duas vezes com PBS estéril (centrifugação em etapas 350 x g, 10 minutos) A população de PBMC resultante foi contada automaticamente (ViCell) e mantida em meio RPMI1640 contendo FCS 10% e L-alanil-L-glutamina 1% (Biochrom, K0302) em incubador celular (37°C, CO2 5%), até o uso posterior (não mais que 24 h). Para o ensaio de morte, o anticorpo CEA TCB foi usado em uma concentração fixa de 1 nM e sCEA foi enriquecida no experimento em uma razão de concentração de 2,5 ng a 5 μg/mL. As PBMCs foram adicionadas às células alvo na razão final E:T de 10:1. A morte de células alvo foi avaliada e após 24h e 48h de incubação por quantificação de LDH (lactato desidrogenase), liberado em sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science, n° 11 644 793 001). A lise máxima das células alvo (= 100%) foi obtida por incubação de células alvo com Triton X-100 1%. A lise mínima (= 0%) se refere às células alvo coincubadas com células efetoras sem anticorpo biespecífico. A morte mediata por CEA TCB na ausência de sCEA foi ajustada a 100% e a morte obtida na presença de concentrações crescentes de sCEA foi normalizada para ela. Os resultados mostram que sCEA apresentou apenas um impacto menor na morte mediata por CEA-TCB de células alvo que expressam CEA (Figura 15 A, B). Nenhum efeito sobre a morte de células T foi detectado até 0,2 μg/m L de sCEA. As concentrações de sCEA acima de 0,2 μg/mL apenas apresentaram um impacto menor na morte geral (10 a 50% de redução).
EXEMPLO 13 MORTE MEDIADA POR CÉLULAS T DE CÉLULAS ALVO USANDO PBMCS HUMANAS E DE CYNOMOLGUS COMO CÉLULAS EFETORAS
[00349] A morte mediada por células T de células A549 (adenocarcinoma pulmonar) que superexpressam CEA humana (A549-hCEA), avaliada 21 h e 40 h após a incubação com anticorpo CEA TCB e PBMCs humana ou PBMCs de cynomolgus como células efetoras foi avaliada. Resumidamente, as células alvo foram colhidas com Tripsina/EDTA, lavadas e plaqueadas na densidade de 25.000 células/poço com o uso de placas de 96 poços de fundo plano. As células foram deixadas para aderirem durante várias horas. Células mononucleares do sangue periférico (PMBCs) foram preparadas por centrifugação de densidade Histopaque de preparações de linfócitos enriquecidos (camadas leucoplaquetárias), obtidas de doadores humanos saudáveis ou de macacos cynomolgus saudáveis. Para o último, um gradiente de densidade Histopaque-PBS90% foi usado. Sangue fresco foi diluído com PBS estéril e disposto em camadas sobre o gradiente Histopaque (Sigma, n° H8889). Após a centrifugação (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente para PBMCs humanas, respectivamente 520 x g, 30 min, temperatura ambiente para PBMCs de cynomolgus), o plasma acima da interfase contendo PBMC foi descartado e as PBMCs transferidas em um novo tubo Falcon, subsequentemente preenchido com 500mL de PBS. A mistura foi centrifugada (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), o sobrenandante descartado e o pélete PMBC lavado duas vezes com PBS estéril (centrifugação em etapas 350 x g, 10 minutos) Para a preparação das PBMCs de cynomolgus, uma etapa adicional de centrifugação à baixa velocidade foi realizada a 150 x g por 15 min. A população de PBMC resultante foi contada automaticamente (ViCell) e mantida em meio RPMI1640 contendo FCS 10% e L-alanil-L-glutamina 1% (Biochrom, K0302) em incubador celular (37°C, CO2 5%), até o uso posterior (até 4 h). Para o ensaio de morte, os anticorpos foram adicionados nas concentrações indicadas (faixa de 6 pM a 100 nM em triplicatas). As PBMCs foram adicionadas para células alvo na razão final E:T de 10:1. A morte de células alvo foi avaliada e após 21 h e 40 h de incubação por quantificação de LDH (lactato desidrogenase), liberada em sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science, n° 11 644 793 001). A lise máxima das células alvo (= 100%) foi obtida por incubação de células alvo com Triton X-100 1%. A lise mínima (= 0%) se refere às células alvo coincubadas com células efetoras sem anticorpo biespecífico. Os resultados mostram que CEA TCB mediou morte alvo-específica de células alvo CEA positivas com o uso tanto de células efetoras humanas (Figura 16, A, C) como de cynomolgus (Figura 16, B, D) (PBMCs). Os valores de EC50 relacionados a 40 h de morte, calculados com o uso de GraphPadPrism5 são 306 pM para PBMCs humanas e 102 pM para PBMCs de cynomolgus.
EXEMPLO 14 MORTE MEDIADA POR CÉLULAS T DE LINHAGENS CELULARES DE CÂNCER COLORRETAL HUMANO QUE EXPRESSAM CEA INDUZIDA POR ANTICORPO CEA TCB
[00350] A morte mediada por células T de linhagens celulares de câncer colorretal humano que expressam CEA 48 h após a incubação com PBMCs humanas e anticorpo CEA TCB a 0,8 nM, 4 nM foi avaliada. Resumidamente, as PBMCs foram isoladas de cones de leucócitos obtidos de doadores saudáveis únicos. As células foram diluídas com PBS (1:10) e dispostas em camadas sobre Lymphoprep em tubos Falcon de 50 mL. Após a centrifugação (1800 rpm por 25 min), a camada de PBMC foi retirada da interface e lavada 4x com PBS. As PBMCs foram contadas, congeladas em DMSO 10% em FCS sob condições de congelamento de razão controlada a 40 x 106 células/mL e armazenadas em nitrogênio líquido até o uso posterior. Para o ensaio de morte de células T, células tumorais foram plaqueadas diretamente em placas de 96 poços a partir dos estoques congelados. As células foram aquecidas rapidamente e transferidas imediatamente no meio pré-aquecido, centrifugadas e ressuspensas em meio completo (DMEM, Iscoves ou RPMI-1640, todos suplementados com FCS 10% e penicilina/estreptomicina 1%) e plaqueadas a uma densidade de 2,5 x 104 células/poço. As células foram então incubadas a 37°C o incubador de CO2 10% umidificado e o meio substituído no dia seguinte por 100 μL de RPMI FCS 2% com glutamina 1%e 50 μL de CEA TCB (concentrações finais variando de 6,4 a 20000 pM, 1:5 etapas de titulação, em poços duplicados para cada condição). PBMCs recém descongelados foram usadas para o ensaio (descongeladas a partir dos frascos congelados dentro de 2 horas do início do ensaio) e 50 μL (3 x 105) foi adicionado para cada poço para dar uma razão efetor : alvo (E:T) de 10:1 Triton X100 (50 μL de 4%) foi adicionada a 150 μL de células alvo para obter os valores máximos de liberação. As placas foram incubadas a 37°C por 48 h e a atividade de morte determinada com o uso do Kit Lactose Dehydrogenase Cytotoxicity Detection (Roche) em conformidade com as instruções do fabricante. A porcentagem de lise celular específica foi calculada como (liberação da amostra - liberação espontânea) / (liberação máxima -liberação espontânea) x 100. A Figura 17, A a C, mostra a correlação entre a expressão de CEA (número de cópia do receptor quantificado com o uso de QIFIKIT, consulte abaixo) e a % de morte para 31 linhagens celulares de câncer colorretal (listadas no eixo x). A Figura 17 mostra a correlação entre a expressão de CEA e a % de lise específica em 20 nM de CEA TCB (correlação de Spearman = 0,7289, p < 0,0001, n = 31), indicando que as células tumorais apresentando números altos de cópias de receptor cEA (> 50.000) são lisadas de forma eficiente por CEA TCB, enquanto que um grupo de células apresentando baixo número de cópias de receptor CEA (< 10.000) não está sendo lisado por CEA TCB sob as mesmas condições experimentais. A Figura 17, E, mostra a correlação entre a expressão de CEA e EC50 de CEA TCB. Apesar da correlação não ser estatisticamente significativa (Correlação de Spearman = -0,3994, p = 0,1006, R2 = 0,1358), o gráfico demonstra claramente um padrão de potência de CEA TCB melhor (por exemplo, valores de EC50 menores) sobre as linhagens celulares tumorais expressando números altos de cópias de receptor CEA.
[00351] Para a análise de expressão de superfície de CEA em linhagens celulares de câncer, foi usado o Qifikit (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) para calibrar os sinais fluorescentes e determinar o número de sítios de ligação por célula. As células foram incubadas no gelo por 30 min com um anticorpo monoclonal CEACAM5 anti-humano de camundongo (0,5 μg para 5 x 105 células, clone: CI-P83-1, sc-23928, Santa Cruz), lavadas duas vezes com PBS1X-BSA 0,1% seguido por uma incubação de 45 min com anticorpo anti-camundongo de cabra conjugado com isotiocianato de fluoresceína policlonal, fornecido com o Qifikit. As células mortas foram excluídas da análise com o uso de coloração 4’,6-diamidino-2-fenilindola (DAPI). As amostras foram analisadas em um Analisador CyAn™ ADP (Beckman Coulter). Todas as intensidades médias de fluorescência (MFIs) foram obtidas após as análises de dados com o uso do programa de computação Summit 4.3. Essas MFIs foram usadas para determinar o número relativo de sítios de ligação de anticorpo nas linhagens celulares (denominados como números de cópias CEA nos resultados), com o uso da equação obtida a partir da curva de calibração (microesferas de calibração do Qifikit).
[00352] As linhagens celulares de câncer colorretal usadas para os ensaios de morte de células T e a quantificação de expressão de superfície de CEA foram semeadas a partir de Cryovials. O método usado para manter o estoque congelado foi conforme descrito em Bracht et al. (Bracht et al. (2010), Br J Cancer 103, 340-346).
EXEMPLO 15 EFICÁCIA ANTI-TUMORAL IN VIVO DE CEA TCB EM UM CARCINOMA DE CÓLON HUMANO LS174T-FLUC2 COENXERTADO COM PBMC HUMANA (RAZÃO E:T 5:1)
[00353] Camundongos NOG (NOD/Shi-scid/IL-2RYnull) (n=12) foram injetados subcutaneamente com 1 x 106 células LS174T-fluc2 pré-misturadas com PBMC humano em um volume total de 100 μL em PBS, razão E:T 5:1. As células LS174T-fluc2 foram elaboradas geneticamente para expressarem luciferase, o que permite o monitoramento da progressão do tumor por bioluminescência (BLI) de uma forma não invasiva e altamente sensível. Para avaliar os efeitos do tratamento prematuro e tardio, camundongos receberam injeções intravenosas duas vezes por semana ou de 0,5 ou 2,5 mg/kg de CEA TCB, iniciando no dia 1 (tratamento prematuro) ou no dia 7 (tratamento tardio), após coenxerto subcutâneo (s.c.) de células tumorais/PBMCs. Como um controle, um grupo de camundongos recebeu duas vezes por semana injeções intravenosas de 2,5 mg/kg de um TCB de controle que tinha o mesmo formato como o CEA TCB (neste caso, o MCSP TCB serviu como um controle não direcionado, na medida em que as células LS174T-fluc2 não expressam MCSP), e um grupo de controle extra recebeu apenas PBS (veículo), iniciando no dia 1. O volume tumoral foi medido uma vez por semana por paquímetro digital. Além disto, os camundongos foram injetados intraperitonialmente uma vez por semana com Luciferina D e a emissão leve bioluminescente de células do tumor vivo foi medida com IVIS Spectrum (Perkin Elmer). O tratamento foi administrado até 19 dias após a inoculação de células tumorais, o que corresponde ao dia do término do estudo. Os resultados do experimento são mostrados na Figura 18 A a D. Os resultados mostram a média e SEM de 12 camundongos de volume de tumor medido por paquímetro (A e C) e por bioluminescência (Total Flux, B e D) nos diferentes grupos de Estudo ((A, B) tratamento prematuro, (C, D), tratamento partido).
EXEMPLO 16 EFICÁCIA ANTI-TUMORAL IN VIVO DE CEA TCB EM UM CARCINOMA DE CÓLON HUMANO LS174T-FLUC2 COENXERTADO COM PBMC HUMANA (RAZÃO E:T 1:1)
[00354] Camundongos NOG (NOD/Shi-scid/IL-2RYnull) (n=10) foram injetados subcutaneamente com 1 x 106 células LS174T-fluc2 (consulte o Exemplo 15), pré-misturadas com PBMC humana em um volume total de 100 μL em PBS, razão E:T 1:1. Para avaliar os efeitos do tratamento iniciais e tardio, os camundongos receberam injeções intravenosas (i.v.) duas vezes por semana de 2,5 mg/kg de CEA TCB, iniciando no dia 1 (tratamento inicial) ou dia 7 (tratamento tardio) após a inoculação de células tumorais. Como controle, um grupo de camundongos recebeu duas vezes por semana injeções intravenosas de 2,5 mg/kg de MCSP TCB (consulte também o Exemplo 15) e um grupo de controle extra recebeu apenas PBS (veículo), iniciando no dia 1. O volume do tumor foi medido uma vez por semana com paquímetro digital. Além disto, os camundongos foram injetados intraperitonialmente uma vez por semana com Luciferina D e a emissão leve bioluminescente de células do tumor vivo foi medida com IVIS Spectrum (Perkin Elmer). O tratamento foi administrado até 23 dias após a inoculação de células tumorais, o que corresponde ao dia do término do estudo. Os resultados do experimento são mostrados na Figura 19. Os resultados mostrama média e SEM do volume de tumor medido por paquímetro (A), bem como por bioluminescência (B) nos diferentes grupos de estudo (n=10).
EXEMPLO 17 EFICÁCIA IN VIVO DE CEA TCB MURINIZADO EM UM MODELO TUMORAL ORTOTÓPICO PANCO2-HUCEA EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS HUCD3E/HUCEA IMUNOCOMPETENTES
[00355] Camundongos transgênicos huCD3ε/huCEA (n=10) receberam uma injeção intra-pancreátiva de 2 x 105 células Panco2-huCEA em um volume total de 10 μL em PBS. Na medida em que as células murinas não expressam CEA, a linhagem celular de carcinoma pancreático murina Panco2 foi elaborada geneticamente para superexpressar CEA humano como o antígeno alvo para CEA TCB. Camundongos foram injetados duas vezes por semana intravenosamente com CEA TCB ou PBS como um grupo de controle (veículo) e a sobrevida foi monitorada. Os animais foram controlados diariamente por sintomas clínicos e detecção de efeitos adversos. Os critérios de terminação para animais foram doenças visíveis: pele suja, costas arqueadas, problemas respiratórios, locomoção prejudicada. O resultado como sobrevida geral é mostrado na Figura 20. O resultado mostra a porcentagem de animais sobreviventes por ponto de tempo. A significância do grupo de tratamento para o grupo de controle PBS foi comparado com o uso de um teste de de Student pareado (p = 0,078).
EXEMPLO 18 AFINIDADE DE CEA TCB PARA CEA E CD3 POR RESSONÂNCIA PLASMÔMICA DE SUPERFÍCIE (SPR)
[00356] Os experimentos de ressonância plasmônica de superfície foram realizados em um Biacore T100 a 25°C com HBS-EP como tampão de corrida (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensoativo P20 0,005%, Biacore, Freiburg/Alemanha).
[00357] Para medições de afinidade, o CEA TCB foi capturado em uma superfície do sensorchip CM5 com Fab anti-humano imobilizado (GE Healthcare n° 28-9583-25). A lgG de captura foi acoplada à superfície do sensorchip por imobilização direta de cerca de 10.000 unidades de ressonância (RU), com pH 5,0 com o uso do kit de acoplamento de amina padrão (Biacore, Freiburg/Alemanha).
[00358] Para analisar a interação com CD3ε stalk-Fc (protuberância)-Avi/CD3δ-stalk-Fc(orifício) (SEQ ID NOs: 120 e 121, respectivamente), CEA TCB foi capturado por 30 s a 50 nM com 10 μL/min. CD3ε/CD3δ foi passado em uma concentração de 0,68 a 500 nM com uma taxa de fluxo de 30 μL/min através das células do fluxo ao longo de 360 s. A dissociação foi monitorada por 360 s.
[00359] O valor Kp da interação entre CEA TCB e o antígeno humano NABA-avi-his do tumor-alvo recombinante (contendo o domínio B3 de CEA humano (CEACAM5) cercado pelos domínios N, A1 e A2 de CEACAM1 humano com um marcador de terminação C avi 6his; consulte SEQ ID NO: 119) foi determinado através da captura da molécula TCB por 40 s a 10 μL/min. O antígeno fluiu sobre o fluxo celular por 240 s em uma faixa de concentração de 0,68 a 500 nM a uma taxa de fluxo de 30 μL/min. A dissociação foi medida ao longo de 240 s.
[00360] As diferenças do índice de refração de massa foram corrigidas através da subtração da resposta obtida em um fluxo celular de referência. No presente pedido os antígenos fluíram sobre uma superfície com anticorpo Fab anti-humano imobilizado, mas sobre o qual HBS-EP foi injetado ao invés de CEA.
[00361] As constantes cinéticas foram derivadas com o uso do programa de computação Biacore T200 Evaluation (vAA, Biacore AB, Uppsala/Suécia) para adequar as equações de razão para a ligação Langmiur 1:1 por integração numérica. A meia-vida (t1/2) da interação foi calculada com o uso da seguinte fórmula: t1/2 = ln2/koff.
[00362] O CEA TCB se liga ao tumor alvo e CD3ε/CD3δ na faixa nM com os valores de KD de 62 nM para NABA humano e 75,3 nM para CD3ε/CD3δ humano. A meia-vida da ligação monovalente é de até 5,3 minutos para NABA, a meia-vida da ligação a CD3ε/CD3δ é 5,7 minutos. Os valores cinéticos estão resumidos na Tabela 9.
Figure img0014
EXEMPLO 19 AFINIDADE DE MSCP TCB A MCSP E CD3 POR RESSONÂNCIA PLASMÔMICA DE SUPERFÍCIE (SPR)
[00363] Os experimentos de ressonância plasmônica de superfície foram realizados em um Biacore T100 a 25°C com HBS-EP como tampão de corrida (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensoativo P20 0,005%, Biacore, Freiburg/Alemanha).
[00364] Para medições de afinidade, o MCSP TCB foi capturado em uma superfície do sensorchip CM5 com Fab anti-humano imobilizado (GE Healthcare n° 28-9583-25). A lgG de captura foi acoplada à superfície do sensorchip por imobilização direta de cerca de 7.500 unidades de ressonância (RU), com pH 5,0 com o uso do kit de acoplamento de amina padrão (Biacore, Freiburg/Alemanha). MCSP TCB foi capturado por 60 s a 30 nM com 10 μL/min. MCSP D3 humano e de cynomolgus (consulte SEQ ID NOs: 118 e 117, respectivamente) foram passados a uma concentração de 0,024 a 50 nM com uma vazão de 30 μL/min através do fluxo de células ao longo de 90 s. A faixa de concentração para CD3ε stalk-Fc (protuberância)-Avi/CD3δ-stalk-Fc(furo) humano e de cynomolgus foi de 1,17-600 nM. Na medida em que a interação com MCSP D3 murina (SEQ ID NO: 122 foi esperada como sendo fraca, a faixa de concentração para esse antígeno foi escolhida entre 3,9 e 500 nM. A dissociação para todas as interações foi monitorada por 120 s. As diferenças do índice de refração de massa foi corrigida através da subtração da resposta obtida em uma célula de fluxo de referência. No presente pedido os antígenos fluíram sobre uma superfície com anticorpo Fab anti-humano imobilizado, mas sobre o qual HBS-EP foi injetado ao invés de MCSP TCB.
[00365] As constantes cinéticas foram derivadas com o uso do programa de computação Biacore T200 Evaluation (vAA, Biacore AB, Uppsala/Suécia) para adequar as equações de razão de ligação de Langmiur 1:1 por integração numérica. A interação para o MCSP TCB com o MCSP D3 murino foi determinada em estado estacionário. A meia-vida (t1/2) da interação foi calculada com o uso da seguinte fórmula: t1/2 = ln2/koff.
[00366] P MCSP TCB se liga ao tumor alvo na faixa de pM com os valores kD de 0,15 nM para o antígeno humano e 0,12 nM para o de cynomolgus. O recombinante CD3ε/CD3δ é ligado pelo MCSP TCB com um valor KD de 78 nM (humano) e 104 nM (cynomolgus). A meia-vida da ligação monovalente é de até 260 minutos para o tumor alvo e 2,9 minutos para CD3e/CD3d. Na maturação da afinidade, o anticorpo MCSP obteve alguma ligação com o murino MCSP D3 recombinante. O valor kD para essa interação está na faixa de mM (1,6 mM). Os valores cinéticos estão resumidos na Tabela 10.
Figure img0015
EXEMPLO 20 ESTABILIDADE TÉRMICA DE CEA TCB
[00367] A estabilidade térmica de CEA TCB foi monitorada por Dispersão de Luz Dinâmica (DLS). 30 μg de amostra de proteína filtrada com uma concentração proteica de 0,5 mg/mL foi aplicada em um leitor de placas Dynapro (Wyatt Technology Corporation; USA). A temperatura foi aumentada progressivamente de 25 para 75°C a 0,05°C/min, com o raio e a intensidade total de dispersão sendo coletada.
[00368] O resultado é mostrado na Figura 21. A temperatura de agregação de CEA TCB foi medida a 55°C.
EXEMPLO 21 ESTABILIDADE TÉRMICA DE MCSP TCB
[00369] A estabilidade térmica de MCSP TCB foi monitorada por Dispersão de Luz Dinâmica (DLS). 30 μg de amostra de proteína filtrada com uma concentração protéica de 0,5 mg/mL foi aplicada em um leitor de placas Dynapro (Wyatt Technology Corporation; USA). A temperatura foi aumentada progressivamente de 25 para 75°C a 0,05°C/min, com o raio e a intensidade total de dispersão sendo coletados.
[00370] O resultado é mostrado na Figura 22. A temperatura de agregação de MCSP TCB foi medida a 55°C.
EXEMPLO 22 MORTE MEDIADA POR CÉLULAS T DE CÉLULAS ALVO TUMORAIS QUE EXPRESSAM MCSP INDUZIDAS POR ANTICORPOS MCSP TCB E MCSP 1+1 CROSSMAB
[00371] A morte mediada por células T de células alvo induzidas por anticorpos MCSP TCB e MCSP 1 +1 CrossMab TCB (um anticorpo biespecífico que ativa células T, que têm as mesmas sequências de ligação CD3 e MCSP como o MCSP TCB, com o formato molecular mostrado na Figura 1 D) foi avaliada em células alvo tumorais A375 (MCSP alto), MC-3 (MCSP médio) e HCT-116 (MCSP baixo). LS180 (linhagem celular tumoral negativa para MCSP) foi usada como controle negativo. A morte de células tumorais foi avaliada 24 h e 48 h após a incubação de células alvo com os anticorpos e células efetoras (PBMCs humanas). Resumidamente, células alvo foram colhidas com Tripsina/EDTA, lavadas e plaqueadas na densidade de 25.000 células/poço com o uso de placas de 96 poços de fundo redondo. As células foram deixadas para aderirem durante a noite. Células mononucleares do sangue periférico (PMBCs) foram preparadas por centrifugação de densidade Histopaque de preparações de linfócitos enriquecidos (camadas leucoplaquetárias), obtidas de doadores humanos saudáveis. Sangue fresco foi diluído com PBS estéril e disposto em camadas sobre o gradiente Histopaque (Sigma, n° H8889). Após a centrifugação (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), o plasma acima da interfase contendo PBMC foi descartado e as PBMCs transferidas em um novo tubo Falcon, subsequentemente preenchido com 500mL de PBS. A mistura foi centrifugada (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), o sobrenandante descartado e o pélete de PMBC lavado duas vezes com PBS estéril (centrifugação em etapas 350 x g, 10 minutos) A população de PBMC resultante foi contada automaticamente (ViCell) e mantida em meio RPMI1640 contendo FCS 10% e L-alanil-L-glutamina 1% (Biochrom, K0302) no incubador celular (37°C, CO2 5%), até o uso posterior (não mais que 24 h). Para o ensaio de morte, os anticorpos foram adicionados nas concentrações indicadas (faixa de 0,01 pM a 100nM em triplicatas). As PBMCs foram adicionadas para células alvo na razão final E:T de 10:1. A morte de células alvo foi avaliada e após 24h e 48h de incubação por quantificação de LDH (lactato desidrogenase), liberado em sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science, n° 11 644 793 001). A lise máxima das células alvo (= 100%) foi obtida por incubação de células alvo com Triton X-100 1%. A lise mínima (= 0%) se refere às células alvo coincubadas com células efetoras sem anticorpo biespecífico. Os resultados mostram que o anticorpo MCSP TCB é mais potente que o MCSP 1 +1 CrossMab TCB na medida em que ele induziu morte mais forte de células alvo positivas para MCSP em ambos os pontos de tempo e em todas as células alvo tumorais (Figura 23 A-H). Os valores de EC50 relacionados com os ensaios de morte, calculados com o uso de GraphPadPrism5 são fornecidos na Tabela 11.
Figure img0016
EXEMPLO 23 SUPRARREGULAÇÃO DE CD25 E CD69 EM CÉLULAS EFETORAS CD8+ E CD4+ APÓS A MORTE MEDIADA POR CÉLULAS T DE CÉLULAS TUMORAIS QUE EXPRESSAM MCSP INDUZIDA POR ANTICORPOS MCSP TCB E MCSP 1+1 CROSSMAB
[00372] A ativação de células T CD8+ e CD4+ após a morte por células T de células tumorais que expressam MCSP (A375 e MV-3) mediada pelos anticorpos MCSP TCB e MCSP 1+1 CrossMab foi avaliada por análise FACS com o uso de anticorpos reconhecendo marcadores de ativação de células T CD25 (marcador de ativação tardia) e CD 69 (marcador de ativação inicial). O anticorpo e as condições do ensaio de morte foram essencialmente conforme descritos acima (Exemplo 22), com o uso da mesma faixa de concentração de anticorpos (0,01 pM a 10 nM em triplicadas), razão E:T 10:1 e um tempo de incubação de 48 h.
[00373] Após a incubação, as PBMCs foram transferidas para uma placa de 96 poços de fundo redondo, centrifugadas a 350 x g por 5 min e lavadas duas vezes com PBS contendo BSA 0,1%. A coloração da superfície para CD8 (CD8 anti-humano FITC, BD n° 555634), CD4 (CD4 anti-humano PECy7, BD n° 557852), CD69 (CD69anti-humano PE, Biolegend n° 310906) e CD25 (CD25 anti-humano APC, BD n° 555434) foi realizada conforme as indicações dos fornecedores. As células foram lavadas duas vezes com 150 μL/poço com PBS contendo BSA 0,1% e fixadas por 15 min a 4°C com o uso de 100 pL/poço de tampão de fixação (BD n° 554655). Após a centrifugação, as amostras foram ressuspensas em 200 pL/poço de PBS com BSA 0,1% contendo DAPI para excluir células mortas para a medição de FACS. As amostras foram analisadas em BD FACS Fortessa. Os resultados mostram que MCSP TCB induziu uma suprarregulação forte e alvo específica de marcadores de ativação (CD25, CD69) em células T CD8+ (Figura 24 A, B (para células A375) e E, F (para células MV-3)) e células T CD4+ (Figura 24 C, D (para células A375) e G, H (para células MV-3)) após a morte. Como para os resultados da morte, a ativação de células T foi mais forte com MCSP TCB do que com MCSP 1+1 CrossMab.
EXEMPLO 24 PREPARAÇÃO DE DP47 GS TCB (2+1 CROSSFAB-IGG P329G LALA INVERTIDO = “TCB NÃO DIRECIONADO”) CONTENDO DP47 GS COMO ANTICORPO NÃO LIGANTE E CH2527 HUMANIZADO COMO ANTICORPO ANTI CD3
[00374] O "TCB não direcionado” foi usado como um controle nos experimentos acima. O anticorpo biespecífico emprega CD3ε, mas não se liga a nenhum outro antígeno e, portanto, não pode fazer reticulação de células T para nenhuma outra célula alvo (e subsequentemente não pode induzir nenhuma morte). Ele foi, portanto, usado como controle negativo nos ensaios para monitorar qualquer ativação de células T não especificas.
[00375] A região variável de sequências de DNA das cadeias pesadas e leves foi subclonada na estrutura, ou tanto com a cadeia pesada constante como a cadeia leve constante pré-inserida no respectivo vetor de expressão de receptor mamífero. A expressão do anticorpo é orientada por um promotor MPSV e carrega uma sequência sinal PoliA sintética na extremidade 3’ do CDS. Além disso, cada vetor contém uma sequência OriP de EBV.
[00376] A molécula foi produzida por cotransfecção de células HEK293 EBNA com os vetores de expressão de mamíferos com o uso de polietilenimina (PEI). As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma razão 1:2:1:1 ("Fc da cadeia pesada do vetor(orifício)” : "cadeia leve do vetor”: "cadeia leve do vetor Crossfab”: "cadeia pesada de vetor Fc(protuberância)-FabCrossfab”).
[00377] Para transfecção, células HEK293 EBNA foram cultivadas em suspensão livre de soro em meio de cultura CD de CHO. Para a produção em frasco de agitação de 500 mL, 400 milhões de células HEK293 EBNA foram semeadas 24 horas antes da transfecção. Para a transfecção, as células foram centrifugadas por 5 min a 210 x g, o sobrenadante substituído por 20 mL de meio CD de CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em 2 mL de meio CD de CHO para uma quantidade final de 200 μg DNA. Após a adição de 540 μL de solução PEI, a mistura foi vortexada por 15 s e subsequentemente incubada por 10 min à temperatura ambiente. Subsequentemente, as células foram misturadas com a solução DNA/PEI, transferidas para um frasco de agitação de 500 mL e incubadas por 3 horas a 37°C em um incubador com atmosfera de CO2 5%. Após o tempo de incubação, 160 mL do meio F17 foi adicionado e as células foram cultivadas por 24 horas. Um dia após a transfecção, ácido valproico 1 mM e Feed 1 7% (Lonza) foi adicionado. Após 7 dias de cultivo, o sobrenadante foi coletado para purificação por centrifugação por 15 min a 210 x g, a solução foi esterilizada por filtração (filtro de 0,22 μm) e azido de sódio em uma concentração final de 0,01 % de p/v foi adicionado e mantido a 4°C.
[00378] A proteína secretada foi purificada a partir dos sobrenadantes da cultura celular por cromatografia de afinidade com o uso de Proteína A. O sobrenadante foi carregado em uma coluna HiTrap Protein A (CV=5 mL, GE Healthcare), equilibrado com 40mL de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida por lavagem com no mínimo 10 volumes de coluna de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5. A proteína alvo foi eluída durante um gradiente ao longo de 20 volumes de coluna de citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5 para citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 2,5. A solução proteica foi neutralizada por adição de 1/10 de fosfato de sódio 0,5 M, pH 8. A proteína alvo foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HiLoad Superdex (GE Healthcare), equilibrada com histidina 20 mM, solução de cloreto de sódio 140 mM de pH 6,0.
[00379] A concentração proteica de amostras de proteína purificada foi determinada medindo a densidade ótica (OD) a 280nm, com o uso do coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos.
[00380] A pureza e o peso molecular de moléculas foram analisados por análises CE-SDS na presença e ausência de agente redutor. O sistema de Caliper LabChip GXII (Caliper lifescience) foi usado conforme as instruções do fabricante. 2 μg de amostra foi usado para as análises.
[00381] O conteúdo agregado de amostras de anticorpos foi analisado com o uso de uma coluna de exclusão por tamanho analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) em K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, monoidrocloreto de L-arginina 200 mM, NaN3 0,02% (p/v), tampão de corrida pH 6,7 a 25°C.
Figure img0017
[00382] A Figura 25 e a Tabela 13 mostram as análises CE-SDS de DP47 GS TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertida) contendo DP47 GS como anticorpo não ligante e CH2527 humanizado como anticorpo anti-CD3. (SEQ ID NOs: 59, 60, 61 e 62).
Figure img0018
[00383] Embora a invenção acima mencionada tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e exemplos para propósitos de clareza de entendimento, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitação ao escopo da invenção. As divulgações de todas as patentes e literaturas científicas citadas no presente pedido são expressamente incorporadas em sua totalidade como referência.

Claims (26)

  1. MOLÉCULA QUE SE LIGA AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO QUE ATIVA CÉLULAS T, caracterizada por compreender:
    • (i) uma primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3, que compreende a região determinante de complementaridade (CDR) 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 4, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 5, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 6, a CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 8, a CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 9 e a CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 10, em que a primeira porção que se liga ao antígeno é uma molécula Fab cruzada, em que tanto as regiões variáveis como as constantes, particularmente as regiões constantes, da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas;
    • (ii) uma segunda e uma terceira porção que se liga ao antígeno, cada um dos quais é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CEA que compreende a CDR 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 24, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 25, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 26, a CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 28, a CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 29 e a CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 30; e
    • (iii) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no terminal C da extremidade Cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira subunidade do domínio Fc, e em que a terceira porção de ligação ao antígeno é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da segunda subunidade do domínio Fc.
  2. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela primeira porção que se liga ao antígeno compreender uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
  3. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pela segunda porção e pela terceira porção que se ligam ao antígeno compreendem, cada uma, uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
  4. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela primeira porção de ligação a antígeno ser uma molécula Fab cruzada em que as regiões constantes da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são trocadas, e que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e em que cada uma das segunda e terceira porções de ligação ao antígeno são uma molécula Fab convencional que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
  5. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por compreender:
    • (i) uma primeira porção que se liga ao antígeno que é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CD3 que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, em que a primeira porção que se liga ao antígeno é um cruzamento da molécula Fab, em que tanto as regiões variáveis como as constantes, particularmente as regiões constantes, da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas;
    • (ii) uma segunda e um terceira porção que se ligam ao antígeno, cada uma das quais é uma molécula Fab capaz de se ligar especificamente a CEA que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e
    • (iii) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no terminal C da extremidade Cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira subunidade do domínio Fc, e em que a terceira porção de ligação ao antígeno é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da segunda subunidade do domínio Fc.
  6. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender não mais que uma porção que se liga ao antígeno capaz de especificamente se ligar a CD3.
  7. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo domínio Fc ser uma IgG, especificamente um domínio Fc de IgG1.
  8. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo domínio Fc ser um domínio Fc humano.
  9. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo domínio Fc compreender uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidades do domínio Fc.
  10. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc, um resíduo de aminoácido ser substituído por um resíduo de aminoácido que tem um volume de cadeia lateral maior, gerando assim uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável em uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácidos que tem um volume de cadeia lateral menor, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.
  11. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 10, caracterizada por, no domínio CH3 da primeira subunidade de domínio Fc, o resíduo de treonina da posição 366 ser substituído por um resíduo de triptofano (T366W) e, no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de tirosina da posição 407 ser substituído por um resíduo de valina (Y407V); e em que opcionalmente
    • (a) na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de treonina da posição 366 é substituído por resíduo de serina (T336S) e o resíduo de leucina da posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A); e/ou
    • (b) na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina da posição 354 é substituído com um resíduo de cisteína (S354C), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo da tirosina da posição 349 é substirtuído por um resíduo de cisteína (Y349C) (Numeração EU de acordo com Kabat).
  12. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 11, caracterizada pelo domínio Fc compreender uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc, particularmente um receptor Fcy, e/ou função efetora, particularmente uma célula dependente de anticorpo mediada por citotoxicidade (ADCC), em que as ditas uma ou mais substituições de aminoácidos serem em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo de L234, L235 e P329 (numeração EU de acordo com Kabat).
  13. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada por cada subunidade do domínio Fc compreender as ditas substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração EU de acordo com Kabat).
  14. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada por compreender uma sequência de polipeptídeo da SED ID NO: 22, uma sequência de polipeptídeo da SED ID NO: 56, uma sequência de polipeptídeo da SED ID NO: 57 e uma sequência de polipeptídeo da SED ID NO: 58.
  15. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO OU PLURALIDADE DE POLINUCLEOTÍDEOS, caracterizado por codificar a molécula que se liga ao antígeno biespecífico que ativa células T, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 compreendendo
    • (i) as sequências de SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72, ou sequências degeneradas da mesma, que codificam as CDRs de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente, e
    • (ii) as sequências de SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 e SEQ ID NO: 92, ou sequências degeneradas da mesma, que codificam as CDRs de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30, respectivamente.
  16. VETOR, particularmente um vetor de expressão, caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 15.
  17. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA MOLÉCULA, que se liga ao antígeno biespecífico que ativa células T, capaz de se ligar especificamente a CD3 e a CEA, caracterizado por compreender as etapas de a) cultivar uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 15, ou o vetor, conforme definido na reivindicação 16, sob condições adequadas para a expressão da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T e b) recuperar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células T.
  18. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a molécula que se liga ao antígeno biespecífico que ativa células T, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  19. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada por ser para uso como um medicamento.
  20. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por ser para uso como um medicamento.
  21. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada por ser para uso no tratamento de uma doença em um indivíduo com necessidade do mesmo.
  22. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pela doença ser câncer.
  23. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por ser para uso no tratamento de uma doença em um indivíduo com necessidade do mesmo.
  24. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pela doença ser câncer.
  25. USO DA MOLÉCULA, que se liga ao antígeno biespecífico que ativa células T, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo com necessidade do mesmo.
  26. USO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela dita doença ser câncer.
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