CN116635419A - 使用CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂的癌症治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及癌症治疗，特别地涉及使用CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂的癌症治疗。

Description

使用CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂的癌症 治疗

技术领域

本发明涉及癌症治疗，特别地涉及使用CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂的癌症治疗。

背景技术

T细胞活化性双特异性抗体是一类新型的癌症治疗剂，它们被设计成使细胞毒性T细胞对抗肿瘤细胞。这种抗体与T细胞上的CD3以及与肿瘤细胞上表达的抗原的同时结合将迫使肿瘤细胞与T细胞之间产生短暂的相互作用，从而引起T细胞活化和随后的肿瘤细胞裂解。

T细胞双特异性抗体赛必妥单抗(cibisatamab)(RG7802、RO6958688、CEA-TCB)是一种新型的T细胞活化双特异性抗体，其靶向肿瘤细胞上的癌胚抗原(CEA)和T细胞上的CD3，不依赖于T细胞受体特异性将T细胞重定向至在细胞表面处表达CEA糖蛋白的肿瘤细胞(Bacac等人,Oncoimmunology.2016；5(8):1-30)。T细胞重定向双特异性抗体的一个主要优点是它们不依赖于新抗原负荷而介导T细胞对癌细胞的识别。CEA在许多结直肠癌(CRC)的细胞表面上过表达，因此赛必妥单抗是一种有前景的免疫治疗剂，用于非高突变的微卫星稳定(MSS)CRC。

赛必妥单抗具有用于T细胞上的CD3ε链的单个结合位点，以及调节对具有中等至高CEA细胞表面表达的癌细胞的结合亲合力的两个CEA结合位点(Bacac等人，Clin CancerRes.2016；22(13):3286–97)。这避免了靶向在生理上存在于某些组织中的具有低CEA表达水平的健康上皮细胞。赛必妥单抗与癌细胞表面上的CEA以及T细胞上的CD3结合触发T细胞活化、细胞因子分泌和细胞毒性颗粒释放。赛必妥单抗在患有表达CEA的转移性CRC且在至少两个先前的化疗方案中失败的患者中的I期试验显示了抗肿瘤活性，其中放射性缩小分别出现在用单一疗法治疗或与PD-L1抑制性抗体组合治疗的患者的11％(4/36)和50％(5/10)中(Argilés等人,Ann Oncol.2017年6月1日；28(增刊_3):mdx302.003-mdx302.003；Tabernero等人,J Clin Oncol.2017年5月20日；35(15_增刊):3002)。尽管该剂量递增试验中的一些患者用低于最终推荐剂量的剂量进行治疗，但反应率仍然表明肿瘤亚组对治疗具有抗性。

因此，希望增加对赛必妥单抗的反应率和/或赛必妥单抗的治疗功效。

具体实施方式

使用源自患者的结直肠癌类器官(PDO)，发明人已发现TGF 是抗衡赛必妥单抗功效的有效免疫抑制因子，且因此通过将CEA CD3双特异性抗体(诸如赛必妥单抗)与TGFβ信号传导抑制剂组合可以增加对这些抗体的反应率和/或这些抗体的治疗功效。

因此，在第一个方面，本发明提供了一种用于治疗个体的癌症的CEA CD3双特异性抗体，其中该治疗包括将CEA CD3双特异性抗体与TGFβ信号传导抑制剂组合施用。

在另一个方面，本发明提供了CEA CD3双特异性抗体在制造用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中该治疗包括将CEA CD3双特异性抗体与TGFβ信号传导抑制剂组合施用。

在又一个方面，本发明提供了一种用于治疗个体的癌症的方法，其包括向该个体施用CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂。

在一个方面，本发明还提供了一种药盒，其包括含有CEA CD3双特异性抗体的第一药物和含有TGFβ信号传导抑制剂的第二药物，并且任选地进一步包括包装插页，该包装插页包括将第一药物与第二药物组合施用以治疗个体的癌症的说明。

上文和本文所述的CEA CD3双特异性抗体、方法、用途或药盒可以单独地或组合地结合下文描述的任何特征(除非上下文另有说明)。

本文的CEA CD3双特异性抗体是特异性地结合CD3和CEA的双特异性抗体。特别有用的CEA CD3双特异性抗体为例如PCT公开号WO 2014/131712(其全文以引用方式并入本文)中描述的抗体。

术语“双特异性”意指该抗体能够特异性地结合至少两种独特的抗原决定簇。典型地，双特异性抗体包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每一个对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些方面，该双特异性抗体能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。

如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。

如本文所用，术语“抗原结合部分”是指特异性地结合抗原决定簇的多肽分子。在一个方面，抗原结合部分能够将其所附接的实体(例如第二抗原结合部分)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞。在另一个方面，抗原结合部分能够通过其靶抗原(例如T细胞受体复合物抗原)激活信号传导。抗原结合部分包括如本文进一步定义的抗体及其片段。特定的抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些方面，所述抗原结合部分可以包含如本文进一步定义的和本领域已知的抗体恒定区。可用的重链恒定区包括以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下两种同种型中的任一种：κ和λ。

“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个方面，抗原结合部分与不相关蛋白质的结合程度小于该抗原结合部分与抗原的结合程度的约10％，如例如通过SPR所测得的。在某些方面，与抗原结合的抗原结合部分，或包含该抗原结合部分的抗体具有以下解离常数(K_D)：≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更小，例如从10^-8M至10^-13M，例如从10^-9M至10^-13M)。

“亲和力”是指分子(例如，受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，该固有结合亲和力反映了结合对的成员(例如，抗原结合部分与抗原，或者受体与其配体)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(K_D)表示，所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为k_off和k_on)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域中已知的完善确立的方法(包括本文所述的那些方法)来测量。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。

除非另外指明，否则“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工CD3，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个方面，CD3是人CD3，特别是人CD3的ε亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列以UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(144版)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1示出。还可参见SEQ ID NO:24。食蟹猴[Macaca fascicularis]CD3ε的氨基酸序列以NCBI GenBank号BAB71849.1示出。还可参见SEQ ID NO:25。

除非另有说明，“癌胚抗原”或“CEA”(也称为癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5))是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CEA，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工CEA，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CEA。该术语还涵盖CEA的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个方面，CEA是人CEA。人CEA的氨基酸序列以UniProt(www.uniprot.org)登录号P06731或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004354.2示出。在一个方面，CEA是细胞膜结合的CEA。在一个方面，CEA是在细胞(例如癌细胞)的表面上表达的CEA。

如本文所用，关于Fab分子等的术语“第一”、“第二”或“第三”在每种类型的部分多于一种时用于方便区分。除非明确说明，否则使用这些术语并不旨在赋予所述双特异性抗体特定的次序或取向。

如本文所用，术语“价”表示在抗体中存在指定数目的抗原结合位点。因此，术语“与抗原单价结合”表示在抗体中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。

本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，其包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。

“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')₂，双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)，以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,New York，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段的讨论，请参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些方面，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生产，如本文所述。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。如本文所用，与可变区序列有关的“Kabat编号”是指由Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。

如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和恒定结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统进行编号，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”。具体地讲，将Kabat编号系统(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647页至第660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat EU索引编号系统(参见第661页至第723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，这在本文中通过在此种情况下称为“根据Kabat EU索引编号”来进一步阐明。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并且确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。一般来讲，抗体包含六个CDR；三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，并且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。本文中的示例性CDR包括：

(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；

(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))处发生的CDR；以及

(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。

除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定CDR名称。

“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常在VH(或VL)中以如下次序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁，以及IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白质。

所谓“交叉”Fab分子(也称为“Crossfab”)，意指以下Fab分子：其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域发生交换(即互相替换)，即交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1构成的肽链(VL-CH1，在N末端至C末端方向)，以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL构成的肽链(VH-CL，在N末端至C末端方向)。为清楚起见，在其中Fab轻链的可变结构域和Fab重链的可变结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。相反地，在其中Fab轻链的恒定结构域和Fab重链的恒定结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链可变结构域VH的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。

与之相比，所谓“常规”Fab分子，意指处于其天然形式的Fab分子，即，包含由重链可变结构域和恒定结构域构成的重链(VH-CH1，在N末端至C末端方向)，以及由轻链可变结构域和恒定结构域构成的轻链(VL-CL，在N末端至C末端方向)。

术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链构成。从N末端到C末端，每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变区)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类型中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚型，例如γ₁(IgG₁)、γ₂(IgG₂)、γ₃(IgG₃)、γ₄(IgG₄)、α₁(IgA₁)和α₂(IgA₂)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。

本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的C末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子所产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的经切割变体。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引编号)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或可以不存在。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)来编号的，如在Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991(还可参见上文)中所述。如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。

“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，“促进缔合的修饰”特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，这在融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合部分)不相同的意义上可能是不同的。在一些方面，所述促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个特定方面，所述促进缔合的修饰在Fc结构域的两个亚基中的每个亚基中包含单独的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。

术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。

相对于参考多肽序列的“氨基酸序列相同的百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列相同的百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列相同的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列相同的百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列一致性％的值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequence comparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人，(1997)Genomics 46:24-36，并且可公开地从http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml获得。或者，可以使用可在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出比对标头中给出氨基酸同一性百分比。

“活化性Fc受体”是这样的Fc受体：其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。

“降低的结合”(例如降低的与Fc受体的结合)是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。

所谓“融合”，意指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接地或经由一个或多个肽接头通过肽键链接。

CEA CD3双特异性抗体包含与CD3特异性地结合的第一抗原结合部分，以及与CEA特异性地结合的第二抗原结合部分。

在一个方面，第一抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3。

在一个方面，第二抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3。

在一个特定方面，所述CEA CD3双特异性抗体包含

(i)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分与CD3特异性地结合并且包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ IDNO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3；以及

(ii)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分与CEA特异性地结合并且包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3。

在一个方面，所述第一抗原结合部分包含下述重链可变区序列和轻链可变区序列：所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

在一个方面，所述第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQID NO:8的轻链可变区序列。

在一个方面，第二抗原结合部分包含重链可变区序列和轻链可变区序列，该重链可变区序列与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，该轻链可变区序列与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

在一个方面，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ IDNO:16的轻链可变区序列。

在一些方面，所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分是Fab分子。在一些方面，第一抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区(特别是恒定区)发生交换。在此类方面，第二抗原结合部分优选地是常规的Fab分子。

在一些方面，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合，任选地经由肽接头融合。

在一些方面，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自是Fab分子并且(i)所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N末端，或(ii)所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处融合至所述第二抗原结合部分的所述Fab重链的N末端。

在一些方面，CEA CD3双特异性抗体提供了与CD3的单价结合。

在特定方面，CEA CD3双特异性抗体包含特异性地结合CD3的单个抗原结合部分，以及特异性地结合CEA的两个抗原结合部分。因此，在一些方面，CEA CD3双特异性抗体包含与CEA特异性地结合的第三抗原结合部分，特别是Fab分子，更特别是常规Fab分子。第三抗原结合部分可以单独或组合地并入本文描述的与第二抗原结合部分相关的所有特征(例如CDR序列、可变区序列和/或恒定区中的氨基酸取代)。在一些方面，第三抗原部分与第一抗原结合部分相同(例如也是常规Fab分子并且包含相同的氨基酸序列)。

在特定方面，CEA CD3双特异性抗体进一步包含Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成。在一个方面，所述Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个特定方面，所述Fc结构域是IgG₁ Fc结构域。在另一个方面，所述Fc结构域是IgG₄ Fc结构域。在一个更具体的方面，所述Fc结构域是在位置S228(Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代(特别是氨基酸取代S228P)的IgG₄ Fc结构域。该氨基酸取代减少了IgG₄抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一个特定方面，所述Fc结构域是人Fc结构域。在一个特别优选的方面，所述Fc结构域是人IgG₁ Fc结构域。人IgG₁ Fc区的示例性序列以SEQ ID NO:23给出。

在其中所述第一抗原结合部分、所述第二抗原结合部分和(在存在时的)所述第三抗原结合部分各自是Fab分子的一些方面，(a)(i)所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N端，并且所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端，或(ii)所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处融合至所述第二抗原结合部分的所述Fab重链的N末端，并且所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端；并且(b)所述第三抗原结合部分(在存在时的)在所述Fab重链的C末端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N末端。

在特定方面，所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在CH3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。

在一个具体方面，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰是所谓的“杵臼结构”修饰，其包括Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的“臼”修饰。杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。

因此，在一些方面，所述Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内产生凸起，所述凸起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且所述Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的所述凸起可定位在所述空腔内。优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。

在一个具体的这种方面，在所述Fc结构域的第一亚基中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基取代(T366W)替换，并且在所述Fc结构域的第二亚基中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)并且任选地，位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，并且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。在另一个方面，在所述Fc结构域的第一亚基中，除此之外，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换)，并且在所述Fc结构域的第二亚基中，除此之外，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。在一个优选方面，所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。

在一些方面，所述Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。

在特定方面，Fc受体为Fcγ受体。在一个方面，所述Fc受体是人Fc受体。在一个方面，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体方面，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，所述效应子功能为选自由以下项组成的组中的一种或多种：补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和细胞因子分泌。在特定方面，效应子功能为ADCC。

典型地，相同的一个或多个氨基酸取代存在于所述Fc结构域的两个亚基中的每个亚基中。在一个方面，所述一个或多个氨基酸取代降低了所述Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个方面，所述一个或多个氨基酸取代将所述Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。

在一个方面，所述Fc结构域在选自包括E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，所述Fc结构域在选自包括L234、L235和P329(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一些方面，所述Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个这样的方面，Fc结构域是IgG₁ Fc结构域，特别是人IgG₁ Fc结构域。在一个方面，所述Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个方面，Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代，并且在选自E233、L234、L235、N297和P331(根据Kabat EU索引编号)的位置处包含另外的氨基酸取代。在一个更具体的方面，所述另外的氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定方面，所述Fc结构域在位置P329、L234和L235(根据Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代。在更特定的方面，所述Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地讲，在优选的方面，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，位置234处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L234A)，位置235处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L235A)，并且位置329处的脯氨酸残基被甘氨酸残基替换(P329G)(根据Kabat EU索引编号)。在一个这样的方面，Fc结构域是IgG₁ Fc结构域，特别是人IgG₁ Fc结构域。

在一些方面，CEA CD3双特异性抗体基本上包含第一、第二和第三抗原结合部分(特别是Fab分子)、由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头。

CEA CD3双特异性抗体的组分可以直接彼此融合，或优选地经由一个或多个合适的肽接头融合。当Fab分子与Fc结构域的亚基的N末端融合时，该融合通常是经由免疫球蛋白铰链区。

抗原结合部分可以直接或通过肽接头与Fc结构域融合(或彼此融合)，所述肽接头包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G₄S)_n、(SG₄)_n、(G₄S)_n、G₄(SG₄)_n或(G₄S)_nG₅肽接头。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。在一些方面，所述肽接头具有至少5个氨基酸的长度，在一些方面5至100个氨基酸的长度，在另一些方面10至50个氨基酸的长度。在一些方面，所述肽接头为(GxS)_n或(GxS)_nG_m，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3，n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝1、2、3、4或5并且m＝0、1、2、3、4或5)，在一些方面，x＝4并且n＝2或3，在另一些方面，x＝4并且n＝2，在又另一些方面，x＝4，n＝1并且m＝5。在一些方面，所述肽接头为(G₄S)₂。在其他方面，所述肽接头为G₄SG₅。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。

在一个优选方面，所述CEA CD3双特异性抗体包含

(i)与CD3特异性地结合的第一抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQID NO:6的LCDR3，其中所述第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区(特别是恒定区)发生交换；

(ii)与CEA特异性地结合的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3，其中所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分各自是Fab分子，特别是常规Fab分子；

(iii)Fc结构域，所述Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成，

其中所述第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N末端，并且所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端融合至所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端，并且其中所述第三抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端。

在一个方面，所述第一抗原结合部分包含下述重链可变区序列和轻链可变区序列：所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

在一个方面，所述第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQID NO:8的轻链可变区序列。

在一个方面，所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分包含下述重链可变区序列和轻链可变区序列：所述重链可变区序列与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

在一个方面，所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分包含SEQ ID NO:15的重链可变区和SEQ ID NO:16的轻链可变区。

根据上述方面的Fc结构域可以单独地或组合地结合上文关于Fc结构域描述的所有特征。

在一个方面，所述抗原结合部分和所述Fc区通过肽接头(特别是通过如以SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20所示的肽接头)彼此融合。在一个方面，所述CEA CD3双特异性抗体包含以下多肽：包含的序列与SEQ ID NO:17的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽(特别是两种多肽)；包含的序列与SEQ ID NO:18的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽；包含的序列与SEQ ID NO:19的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽；以及包含的序列与SEQ ID NO:20的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽。

在一个特别优选的方面，所述CEA CD3双特异性抗体包含以下多肽：包含SEQ IDNO:17的序列的多肽(特别是两种多肽)、包含SEQ ID NO:18的序列的多肽、包含SEQ ID NO:19的序列的多肽，以及包含SEQ ID NO:20的序列的多肽。

在一个特别优选的方面，CEA CD3双特异性抗体为赛必妥单抗(WHO药物信息(国际药用物质非专利名称)，推荐INN：清单80，2018，第32卷，第3期，第438页)。

技术人员将获知的其他CEA CD3双特异性抗体也被考虑用于本发明。

本文的CEA CD3双特异性抗体与转化生长因子(TGF)β信号传导抑制剂组合使用。

术语“TGFβ信号传导抑制剂”是指抑制通过TGFβ通路的信号传导的分子。“TGFβ”涵盖TGFβ的所有三种亚型，TGFβ1、2和3。在特定方面，TGFβ为TGFβ1，特别是人TGFβ1。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为人TGFβ信号传导通路的抑制剂。

TGFβ信号传导通路可通过TGFβ与其I型和II型受体(分别为TβRI和TβRII)相互作用而活化，这些受体为单程跨膜受体并具有内在的丝氨酸/苏氨酸激酶活性。

TGFβ以潜伏形式分泌，可经由整联蛋白依赖性过程激活。整联蛋白αvβ6在潜伏TGFβ的激活中起作用。活化的TGFβ最初与TGFβ共受体β聚糖(也称为TβRIII)接合。在β聚糖上呈递后，TGFβ与TβRII结合，后者随后募集TβRI以形成异聚信号传导复合物。TβRI在其甘氨酸-丝氨酸近膜结构域中的丝氨酸和苏氨酸残基处被TβRII磷酸化(受体转磷酸化)。活化的TβRI使下游效应子蛋白SMAD2和SMAD3磷酸化，然后这些下游效应子蛋白与SMAD4组装成异聚复合物。SMAD复合物转运到细胞核中，在那里它们充当转录因子来调节基因表达。TGFβ信号传导靶基因包括纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)和SMAD7基因。SMAD7通过募集E3泛素连接酶SMURF2到活化的TβR1并由此靶向该受体以用于蛋白酶体/溶酶体降解，从而充当TGFβ/SMAD信号传导的抑制剂。TβR1的泛素化可被USP4/15去泛素化酶逆转。

TGFβ信号传导抑制剂可以是靶向参与TGFβ信号传导的一种或多种蛋白质并且抑制TGFβ信号传导通路的活性的分子，其中抑制TGFβ信号传导通路的活性例如通过抑制这种蛋白质与TGFβ信号传导通路的其他组分之间的相互作用、促进这种蛋白质的降解、抑制/降低这种蛋白质的表达或者抑制这种蛋白质的功能(例如酶功能)来实现。示例性抑制位点包括但不限于TGFβ配体、TGFβ(共)受体(Tβ1、2和/或3)、SMAD蛋白质(特别是SMAD2、3和/或4)、参与潜伏TGFβ的激活的整联蛋白(诸如整联蛋白αvβ6)，或去泛素化酶(诸如USP4/15)。此外或可替代地，TGFβ信号传导通路的活性可以通过促进下调TGFβ信号传导的蛋白质(诸如SMAD7和/或SMURF2)的功能来抑制。

例如在Huynh等人,Biomolecules(2019)9,743或Akhurst,Cold Spring HarbPerpect Biol(2017)9,a022301(两者均通过引用整体并入本文)中综述了TGFβ信号传导及其抑制剂。

TGFβ信号传导抑制剂可包括多种形式，诸如中和抗体、配体陷阱、TGFβ信号传导通路的组分的突变形式、小分子(诸如受体酪氨酸激酶抑制剂)、肽或反义寡核苷酸。

在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂抑制参与TGFβ信号传导的两种或更多种蛋白质的相互作用。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂促进参与TGFβ信号传导的一种或多种蛋白质的降解。在一个方面，TGFβ抑制剂抑制或降低参与TGFβ信号传导的一种或多种蛋白质的表达。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂抑制参与TGFβ信号传导的一种或多种蛋白质的功能(例如酶功能)。在一个方面，参与TGFβ信号传导的此类蛋白质选自由TGFβ(特别是TGFβ-1和/或TGFβ-2)、TGFβ(共)受体(特别是Tβ1、2和/或3)、SMAD蛋白质(特别是SMAD2、3和/或4)、整联蛋白(特别是整联蛋白αvβ6)和去泛素化酶(特别是USP4和/或USP15)组成的组。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂靶向(例如特异性地结合至)TGFβ信号传导通路的组分，其选自由TGFβ(特别是TGFβ-1和/或TGFβ-2)、TGFβ(共)受体(特别是Tβ1、2和/或3)、SMAD蛋白质(特别是SMAD2、3和/或4)、整联蛋白(特别是整联蛋白αvβ6)和去泛素化酶(特别是USP4和/或USP15)组成的组。

在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为TGFβ，特别是TGFβ-1和/或TGFβ-2抑制剂。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂抑制TGFβ(特别是TGFβ-1和/或TGFβ-2)与TGFβ(共)受体(特别是TβRI、TβRII和/或TβRIII)的相互作用。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂靶向(例如特异性地结合至)TGFβ，特别是TGFβ-1和/或TGFβ-2。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为结合至TGFβ(特别是TGFβ-1和/或TGFβ-2)的抗体，特别是人抗体和/或单克隆抗体。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为抗体非苏木单抗(fresolimumab)(也称为GC1008)(一种完全人源化IgG₄单克隆泛TGFβ1/2/3抗体；参见例如Morris等人,PloS ONE 2014,9,e90353(其全文以引用方式并入本文))。在一个方面，TGFβ抑制剂为抗体LY2382770(也称为TβM1)(一种IgG₄单克隆TGFβ1抗体；参见例如Cohn等人,Int J Oncol 2014,45,2221-31(其全文以引用方式并入本文))。在一个方面，TGFβ抑制剂为抗体XPA.42.681或抗体XPA.42.089，描述于Bbedinger等人,Mabs 2016,8,389-404(其全文以引用方式并入本文)。

在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂抑制或降低TGFβ，特别是TGFβ-1和/或TGFβ-2，最特别是TGFβ-2的表达。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为反义寡核苷酸。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为曲贝德生(trabedersen)(也称为AS12009)(参见例如Vallières,IDrugs2009,12(7),445-53(其全文以引用方式并入本文))。曲贝德生为单链硫代磷酸酯反义寡核苷酸(18聚体)，序列为5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3'。

在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为TGFβ(共)受体，特别是TβRI、TβRII和/或TβRIII抑制剂。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂抑制TGFβ(共)受体(特别是TβRI、TβRII和/或TβRIII)与TGFβ(特别是TGFβ-1和/或TGFβ-2)的相互作用。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂抑制TGFβ(共)受体(特别是TβRI、TβRII和/或TβRIII)与另一种TGFβ(共)受体(特别是TβRI、TβRII和/或TβRIII)的相互作用。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂靶向(例如特异性地结合至)TGFβ受体，特别是TβRI、TβRII和/或TβRIII。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为结合至TGFβ受体(特别是TβRI、TβRII和/或TβRIII，更特别是TβRII)的抗体，特别是人抗体和/或单克隆抗体。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为抗体LY3022859(也称为IMC-TR1)(参见例如Zhong等人,Clin Cancer Res 2010,16,1191-205；Tolcher等人,CancerChemother Pharmacol 2017,79,673-680(两者均通过引用整体并入本文))。

在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂抑制TGFβ(共)受体(特别是TβRI、TβRII和/或TβRIII，更特别是TβRI和/或TβRII，最特别是TβRI)的功能，特别是酶功能，最特别是激酶功能。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为小分子。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为激酶抑制剂，特别是TGFβ受体激酶抑制剂。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为加卢尼塞替布(galunisertib)(也称为LY2157299)(参见例如Faivre等人,J Clin Oncol 2017,34,4070(其全文以引用方式并入本文))。加卢尼塞替布的结构、IUPAC名称和CAS编号如下所示。

[IUPAC名称：4-(5,6-二氢-2-(6-甲基-2-吡啶基)-4H-吡咯并(1,2-b)吡唑-3-基)-6-喹啉甲酰胺；CAS编号：700874-72]

在另一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为vactosertib(也称为TEW-7197)(参见例如Jin等人,J Med Chem 2014,22,4213-38(其全文以引用方式并入本文)。vactosertib的结构、IUPAC名称和CAS编号如下所示。

[IUPAC名称：2-氟-N-[[5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-1H-咪唑-2-基]甲基]苯胺；CAS编号：1352608-82-2]

在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为TGFβ配体陷阱。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为可溶形式的TGFβ(共)受体，特别是TβRI、TβRII和/或TβRIII。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂包含TGFβ受体(特别是TβRI、TβRII和/或TβRIII)的部分(特别是胞外结构域(的部分))。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为融合蛋白，其包含TGFβ受体(特别是TβRI、TβRII和/或TβRIII)的部分(特别是胞外结构域(的部分))，并且包含另外的蛋白质结构域，特别是Fc结构域，更特别是人和/或IgG1 Fc结构域。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为融合蛋白，其包含TβRII的胞外结构域(的部分)和Fc结构域(参见例如Muraoka等人,J ClinInvestig 2002,109,1551-1559(其全文以引用方式并入本文))。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为融合蛋白，其包含TβRIII(β聚糖)的胞外结构域(的部分)和(人)Fc结构域(参见例如Bandyopadhyay等人,Cancer Res 2002,62,4690-4695(其全文以引用方式并入本文))。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为融合蛋白，其包含超过一种TGFβ受体(特别是TβRI、TβRII和TβRIII中的超过一种)的部分(特别是胞外结构域(的部分))。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为融合蛋白，其包含TβRII的部分，特别是胞外结构域(的部分)，和TβRIII的部分，特别是胞外结构域(的部分)。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为融合蛋白RER(其包含TβRIII的单个胞外结构域和TβRII的两个胞外结构域；参见例如Qin等人,Oncotarget2016,7,86087-86102(其全文以引用方式并入本文))。

在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为整联蛋白，特别是整联蛋白αvβ6抑制剂。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂靶向(例如特异性地结合至)参与TGFβ信号传导的整联蛋白，特别是整联蛋白αvβ6。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为结合至参与TGFβ信号传导的整联蛋白(特别是整联蛋白αvβ6)的抗体，特别是人抗体和/或单克隆抗体。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为抗体264RAD(参见例如Eberlein等人,Oncogene 2013,32,4406-4416(其全文以引用方式并入本文))。

在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为去泛素化酶，特别是USP4和/或USP15抑制剂。

在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为SMAD蛋白，特别是SMAD2、3和/或4抑制剂。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂抑制SMAD蛋白(特别是SMAD2、3和/或4)与另一种SMAD蛋白(特别是SMAD2、3和/或4)的相互作用。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂抑制SMAD蛋白(特别是SMAD2、3和/或4)与DNA的相互作用。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为SMAD相互作用肽适体。SMAD相互作用肽适体描述于例如Cui等人,Oncogene 2005,24,3864-3874(其全文以引用方式并入本文)。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为细胞穿透肽。选择性靶向SMAD3的细胞穿透肽描述于例如Kang等人,J Clin Invest 2017,127,2541-2554(其全文以引用方式并入本文)。

在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为参与TGFβ信号传导的蛋白质的经修饰形式，例如与相应的天然蛋白质相比，具有氨基酸缺失/取代/添加或结构域缺失/取代/添加的蛋白质。在一个方面，与相应的天然蛋白质相比，此类经修饰的蛋白质具有减少或逆转(例如激动性而不是拮抗性，或反之亦然)的功能。在一个方面，TGFβ信号传导抑制剂为TGFβ的经修饰形式(例如突变TGFβ)，特别是具有拮抗功能的TGFβ的经修饰形式。

技术人员将获知的其他TGFβ信号传导抑制剂也被考虑用于本发明。

术语“癌症”是指哺乳动物中通常以细胞增殖不受调控为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体示例包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺非鳞状细胞癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌症(包括胃肠道癌)、胰腺癌(包括转移性胰腺癌)、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌(包括局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌和局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌)、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾脏癌症、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌和各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级别/滤泡性NHL、中级别弥散性NHL、高级别免疫原性NHL、高级别淋巴母细胞性NHL、高级别小非裂解细胞性NHL、巨大肿块NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和华氏巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性粒细胞性白血病和移植后的淋巴增生性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(诸如与脑肿瘤有关的水肿)和梅格斯综合征(Meigs'syndrome)相关联的异常血管增生。

在本发明的CEA CD3双特异性抗体、方法、用途和药盒的一些方面，癌症是实体瘤癌症。所谓“实体瘤癌症”，意指形成位于患者体内特定位置处的离散肿瘤块(也包括肿瘤转移)的恶性肿瘤，诸如肉瘤或癌(与例如血液癌症(诸如白血病)相反，后者通常不形成实体瘤)。实体瘤癌症的非限制性示例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、肝癌和肾癌。本发明上下文中考虑的其他实体瘤癌症包括但不限于位于以下部位中的赘生物：腹部、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头颈部、神经系统(中枢神经系统和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、肌肉、脾脏、胸腔区以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌转移。

在一些方面，癌症是CEA阳性癌症。所谓“CEA阳性癌症”或“表达CEA的癌症”，意指以癌细胞上表达或过表达CEA为特征的癌症。CEA的表达可以例如通过免疫组织化学(IHC)或流式细胞术测定法来测定。在一个方面，癌症表达CEA。在一个方面，如使用对CEA具有特异性的抗体通过免疫组织化学(IHC)测定的，癌症在至少20％、优选地至少50％或至少80％的肿瘤细胞中表达CEA。

在一些方面，患者中的癌细胞表达PD-L1。PD-L1的表达可以通过IHC或流式细胞术测定法来测定。

在一些方面，癌症是结肠癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、前列腺癌或本文所述的其他癌症。

在特定方面，癌症为选自由结直肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌和胃癌组成的组的癌症。在一个优选方面，癌症为结直肠癌(CRC)。在一个方面，结直肠癌是转移性结直肠癌(mCRC)。在一个方面，结直肠癌是微卫星稳定(MSS)结直肠癌。在一个方面，结直肠癌是微卫星稳定的转移性结直肠癌(MSS mCRC)。

本文中的“患者”、“受试者”或“个体”是正在经历或已经历过癌症的一种或多种体征、症状或其他指标的有资格接受治疗的任何单个人类受试者。在一些方面，患者患有癌症或已被诊断患有癌症。在一些方面，患者患有局部晚期或转移性癌症，或者已被诊断患有局部晚期或转移性癌症。患者可能先前已用CEA CD3双特异性抗体或另一种药物治疗过，或者没有这样治疗过。在特定方面，患者之前没有用CEA CD3双特异性抗体治疗过。在开始CEACD3双特异性抗体疗法之前，患者可能已用包括一种或多种除CEA CD3双特异性抗体之外的药物的疗法治疗过。

如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或在临床病理学过程中执行的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。

CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂以有效量施用。

药剂(例如药物组合物)的“有效量”是指能够以必需的剂量在必需的时段内有效地实现期望的治疗或预防结果的量。

在一个方面，所述CEA CD3双特异性抗体的施用导致T细胞，特别是细胞毒性T细胞的活化，特别是在癌症部位处(例如在实体瘤癌症内)。所述活化可以包括T细胞增殖、T细胞分化、T细胞分泌细胞因子、从T细胞释放细胞毒性效应分子、T细胞的细胞毒性活性，以及T细胞表达活化标记物。在一个方面，所述CEA CD3双特异性抗体的施用导致T细胞，特别是癌症部位处(例如在实体瘤癌症内)的细胞毒性T细胞的数量增加。

在上文和此处所述的CEA CD3双特异性抗体、方法、用途或药盒的一些方面，与单独施用CEA CD3双特异性抗体或使用其治疗相比，施用CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂或使用其治疗导致T细胞、特别是CD4 T细胞和/或CD8 T细胞特别是在癌症部位处的增殖增加。在上文和此处所述的CEA CD3双特异性抗体、方法、用途或药盒的一些方面，与单独施用CEA CD3双特异性抗体或使用其治疗相比，施用CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂或使用其治疗导致T细胞、特别是CD4 T细胞和/或CD8 T细胞特别是在癌症部位处的活化增加。在特定方面，活化包括表达活化标记物(诸如CD25和/或CD69)、T细胞的细胞毒性活性(特别是癌细胞的裂解)和/或T细胞分泌细胞因子(特别是IL-2、TNF-α和/或干扰素-γ)。在上文和此处所述的CEA CD3双特异性抗体、方法、用途或药盒的一些方面，与单独施用CEA CD3双特异性抗体或使用其治疗相比，施用CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂或使用其治疗导致T细胞、特别是CD4 T细胞和/或CD8 T细胞特别是在癌症部位处的溶细胞分子(诸如颗粒酶和/或穿孔素)表达增加。

在上文和此处所述的CEA CD3双特异性抗体、方法、用途或药盒的一些方面，CEACD3双特异性抗体和TGFβ抑制剂的治疗或施用可导致个体的反应。在一些方面，该反应可以是完全反应。在一些方面，该反应可以是治疗停止后的持续反应。在一些方面，该反应可以是在治疗停止后持续的完全反应。在其他方面，该反应可以是部分反应。在一些方面，该反应可以是在治疗停止后持续的部分反应。在一些方面，与单独的CEA CD3双特异性抗体(即没有TGFβ信号传导抑制剂)的治疗或施用相比，该反应可以得到改善。

在一些方面，与用单独的CEA CD3双特异性抗体(即没有TGFβ信号传导抑制剂)治疗的相应患者群体相比，CEA CD3双特异性抗体和TGFβ抑制剂的治疗或施用可以增加患者群体的反应率。

本发明的组合疗法包括施用CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂。

如本文所用，“组合”(及其语法变体)涵盖了根据本发明的CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂的组合，其中CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂在相同或不同的容器中、在相同或不同的药物制剂中、一起施用或分开施用、同时施用或按顺序(以任何次序)施用，以及通过相同或不同的途径施用，前提是CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂可以同时在体内发挥其生物学作用。例如，将根据本发明的CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂“组合”可以意指首先在特定的药物制剂中施用CEA CD3双特异性抗体，之后在另一种药物制剂中施用TGFβ信号传导抑制剂，或将次序颠倒。

CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂可以以本领域已知的任何合适的方式施用。在一个方面，CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂按顺序(在不同时间)施用。在另一个方面，CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂同时(在相同时间)施用。不希望受理论的束缚，在CEA CD3双特异性抗体之前和/或与之同时施用TGFβ信号传导抑制剂可能是有利的。在一些方面，CEA CD3双特异性抗体处于与TGFβ信号传导抑制剂分离的组合物中。在一些方面，CEA CD3双特异性抗体处于与TGFβ信号传导抑制剂相同的组合物中。

CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂可以通过任何合适的途径施用，并且可以通过相同的施用途径或不同的施用途径施用。在一些方面，CEA CD3双特异性抗体通过静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、透皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在一个特定方面，所述CEA CD3双特异性抗体静脉内施用。在一些方面，TGFβ信号传导抑制剂通过静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、透皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。可以施用有效量的CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂来预防或治疗疾病。CEA CD3双特异性抗体和/或TGFβ信号传导抑制剂的适当的施用途径和剂量可以基于以下各项来确定：待治疗的疾病类型、CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂的类型、疾病的严重性和进程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的反应，以及主治医师的判断。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂适宜一次性地或在一系列治疗中施用于患者。

本发明的组合可以单独使用或连同其他药剂一起用于治疗。例如，本发明的组合可以与至少一种附加治疗剂共同施用。在某些方面，另外的治疗剂是抗癌剂，例如化疗剂、肿瘤细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞凋亡激活剂。在一个特定方面，另外的治疗剂是PD-L1结合拮抗剂，诸如阿特珠单抗(atezolizumab)。

在上文和此处所述的CEA CD3双特异性抗体、方法、用途或药盒的一些方面，治疗进一步包括施用PD-L1结合拮抗剂，特别是阿特珠单抗。

本发明的组合还可以与放射疗法结合。

本文提供的药盒典型地包括一个或多个容器，以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。该容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。所述组合物中的至少一种活性剂是将用于本发明的组合中的CEA CD3双特异性抗体。另一种活性剂是将用于本发明的组合中的TGFβ信号传导抑制剂，其可以与双特异性抗体在相同的组合物和容器中，或者可以在不同的组合物和容器中提供。该标签或包装插页指出所述化合物用于治疗所选择的病症，诸如癌症。

在一个方面，本发明提供了旨在用于治疗癌症的药盒，其包括在相同的容器或分开的容器中的(a)CEA CD3双特异性抗体和(b)TGFβ信号传导抑制剂，并且任选地进一步包括(c)包装插页，该包装插页包括指导使用该组合治疗作为治疗癌症的方法的印刷说明。此外，该药盒可以包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中该组合物包含CEA CD3双特异性抗体；(b)其中装有组合物的第二容器，其中该组合物包含TGFβ信号传导抑制剂；以及任选地(c)其中装有组合物的第三容器，其中该组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。在一个方面，另外的治疗剂是PD-L1结合拮抗剂，特别是阿特珠单抗。本发明的这些方面的药盒可以进一步包括包装插页，所述包装插页指出所述组合物可以用于治疗癌症。替代性地或除此之外，所述药盒可以进一步包括第三(或第四)容器，所述容器装有药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

附图说明

图1.TGFβ对赛必妥单抗(CEA-TCB)体外免疫疗法的影响。(A)三个具有高细胞表面CEA表达水平的源自患者的结直肠癌类器官系(PDO)在存在或不存在重组TGFβ的情况下，在与预活化的CD8 T细胞共培养12天期间用赛必妥单抗或DP47-TCB处理的生长曲线。(B)与(A)相同，除了使用了两个PDO系和CD4 T细胞而不是CD8 T细胞。(C)与(A)相同，除了使用了两个PDO系和离体CD8 T细胞而不是预活化的CD8 T细胞。一式三份进行所有实验，并且显示的结果是平均值。

图2.(A)在第12天使用预活化的T细胞对PDO生长进行量化。(B)在第12天用离体T细胞对PDO生长进行量化。误差线表示从三次重复计算的一个标准偏差。

图3.TGFβ对颗粒酶表达和CD8 T细胞增殖的影响。(A)在与表达高细胞表面CEA的PDO共培养8天后，通过流式细胞术测定离体CD8 T细胞中的颗粒酶表达。(B)在与表达高细胞表面CEA的PDO共培养8天后，通过流式细胞术评定的用DP47-TCB或赛必妥单抗处理的离体CD8 T细胞的增殖。(C)与(B)相同，除了用重组TGFβ处理共培养物。

图4.用TGFβ抑制剂加卢尼塞替布逆转TGFβ对赛必妥单抗活性的抑制作用。两个具有高细胞表面CEA表达水平的源自患者的结直肠癌类器官系(PDO)在存在或不存在重组TGFβ以及加卢尼塞替布的情况下，在与离体CD8 T细胞共培养12天期间用赛必妥单抗或DP47-TCB处理的生长曲线。

实例

以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他方面。

实例1.TGFβ对赛必妥单抗(CEA-TCB)体外免疫疗法的影响。

三个具有高细胞表面CEA表达水平的源自患者的结直肠癌类器官系(PDO)在存在或不存在重组TGFβ1(10ng/ml)的情况下，在与同种异体CD8 T细胞以2:1的效应子与靶标之比共培养12天期间用赛必妥单抗(20nM)或相应的非靶向对照抗体DP47-TCB(VH和VL区分别参见SEQ ID NO 21和22)(20nM)处理(图1A)。通过荧光显微术监测核GFP标记的类器官细胞的生长。CD8 T细胞是从同种异体健康供体细胞产生的，方式为：提取外周血单核(PBMC)细胞，之后用IL-2珠和CD3/CD28珠刺激并且体外扩增。在添加赛必妥单抗或DP47-TCB之前，将CD8 T细胞和PDO+/-TGFβ(10ng/ml)一起预孵育72小时。

使用两个PDO系和CD4 T细胞而不是CD8 T细胞重复相同的实验(图1B)。如上所述，CD4+CD25-T细胞分离自同种异体健康供体PBMC，并在体外扩增。

TGFβ削弱了赛必妥单抗对CD8和CD4 T细胞两者的功效，即使在使用具有高抗原表达的靶细胞时也表现出强大的免疫抑制活性。

用体外扩增的和预活化的CD8 T细胞生成初始筛选。许多参与肿瘤的T细胞可能处于初始状态，因此我们还测试了对从健康供体血液样本中离体提取的CD8 T细胞的影响。TGFβ对活化和离体T细胞的作用相似(图1C)。

实例2.第12天PDO生长的量化。

为了计算赛必妥单抗处理的PDO相对于DP47-TCB处理的PDO的生长，计算从第0天到第12天的生长倍数变化并减去1。然后将赛必妥单抗处理的PDO的倍数变化除以DP47-TCB处理的对照的倍数变化并转化为百分比。这使DP47-TCB处理的对照从第0天到第12天的生长归一化为100％。

正如预期的那样，相对于DP47-TCB处理的(对照)PDO，用赛必妥单抗处理减少了PDO的生长。然而，随着TGFβ的加入，这种生长抑制在CD8+和CD4+T细胞两者存在的情况下降低，即对于CD8+和CD4+T细胞两者，与单独用赛必妥单抗处理的PDO相比，TGFβ增加了赛必妥单抗处理的PDO的生长(图2)。

与PDO共培养8天的CD8 T细胞的FACS分析证实，在CEA-TCB处理期间，TGFβ强烈降低了T细胞颗粒酶表达(图3A)和T细胞增殖(图3B、3C)。因此，TGFβ通过阻断增殖和效应子功能有效抑制赛必妥单抗介导的肿瘤控制。

实例3.赛必妥单抗与TGFβ抑制剂的组合疗法

研究了组合疗法如何抵消TGFβ对赛必妥单抗疗效的影响。

稳定表达高CEA水平的PDO与从健康供体PBMC分离的离体同种异体CD8 T细胞在2D共培养中以1:1的效应子与靶标(E:T)之比组合。在添加DP47或赛必妥单抗有或没有TGFβ抑制剂加卢尼塞替布处理之前，将T细胞与TGFβ(10ng/ml)预孵育。

通过用荧光显微术来监测汇合度的变化来跟踪GFP PDO的生长，并通过比较单一疗法和联合疗法条件下的生长减少来评定组合疗法的疗效。

在与CD8 T细胞和赛必妥单抗共培养的两种PDO模型中，加卢尼塞替布强烈降低了TGFβ效应(图4)。

实例4.材料和方法

产生源自患者的类器官

直接由核心活检建立来自CRC-01的PDO培养物，方式为：粗切，随后包埋在生长因子减少的Matrigel(Corning)中。极小的活检片段获自CRC-05和CRC-07，这些片段首先由英国癌症研究所(英国内政部许可证号PD498FF8D)肿瘤分析部门皮下移植或者在雌性CD1裸鼠的肾包膜下移植。一旦肿瘤生长，就将小鼠挑选出来，取出肿瘤，置于gentleMAX Octo解离器中使用人肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec)解离。使用小鼠细胞剔除试剂盒(Miltenyi Biotec)磁性去除小鼠细胞，并且将经纯化的人肿瘤细胞包埋到生长因子减少的Matrigel中。使用高级DMEM/F12培养基，如文献所述(Sato等人,Gastroenterology.2011；141(5):1762–72)在Matrigel中扩增PDO，该培养基补充有1XGlutamax、100单位/ml青霉素/链霉素、1X B27、1X N2、10mM HEPES(全部来自ThermoFisher)、1mM N-乙酰半胱氨酸、10mM烟酰胺、10μM SB202190、10nM胃泌素、10μM Y27632(Sigma Aldrich)、10nM前列腺素E2、500nM A-83-01、100ng/ml Wnt3a(Biotechne)、50ng/ml EGF(Merck)、1μg/ml R-Spondin、100ng/ml Noggin和100ng/ml FGF10(Peprotech)。在Matrigel基质中连续生长至少2个月(最少12代)之后，PDO首先用eGFP加标签(见下文)，然后在含有2％Matrigel且具有20％胎牛血清(FBS)、1X Glutamax、100单位/ml青霉素/链霉素的DMEM/F12(Sigma Aldrich)中适应生长。将PDO培养物保持在这些条件下，并且根据需要用于T细胞共培养测定和FACS分析。对每个PDO系进行了结肠癌驱动基因的遗传分析，这些分析与在匹配的肿瘤活检中鉴定的突变相同。

用核eGFP标记PDO

通过引入带eGFP标签的组蛋白2B构建体(pLKO.1-LV-H2B-GFP)来标记PDO的细胞核(Beronja等人，Nat Med.2010年7月；16(7):821–7)，以使得能够通过自动化显微镜法进行细胞定量。为了产生病毒，将HEK-293T细胞置于补充有10％ FBS、1X Glutamax和100单位/ml青霉素/链霉素的DMEM中培养。通过使用TransIT-293转染试剂(Mirus)，用质粒混合物过夜转染来生产慢病毒颗粒，该混合物含有9μg的pLKO.1-LV-H2B-GFP、2.25μg的psPAX2包装质粒(Didier Trono馈赠；Addgene质粒编号12260；http://n2t.net/addgene:12260；RRID:Addgene_12260)和0.75μg的pMD2.G包膜质粒(Didier Trono馈赠；Addgene质粒编号12259；http://n2t.net/addgene:12259；RRID:Addgene_12259)。次日更换细胞培养基，24小时后收获病毒，并且在使用前使其通过0.45μM滤器。对于慢病毒转导，从Matrigel中的培养物收获PDO，并且使用TrypLE Express(Thermo Fisher)将其解离成单细胞，然后沉淀。将沉淀重悬于添加了病毒和1nM聚凝胺的培养基(Sigma Aldrich)中，并且以300x g离心1小时。在更换培养基之前，将样品重悬并且铺板于培养物中，维持介于6小时至过夜之间的一段时间。在恢复和扩增后，通过流式细胞术对eGFP阳性细胞进行分选，并且在使用前进一步扩增。

从外周血单核细胞分离和扩增CD8/CD4 T细胞

根据制造商的方案(GE Healthcare)，用Ficoll-Paque从血沉棕黄层中分离外周血单核细胞(PBMC)。用人CD8 Dynabeads FlowComp试剂盒(Thermo Fisher)从PBMC中分离CD8 T细胞。使用Dynabeads Regulatory CD4+/CD25+T细胞试剂盒(Thermo Fisher)从PBMC中分离出CD4+CD25-T细胞。通过流式细胞术评定CD8和CD4 T细胞的纯度(Alexa Fluor 488抗人CD8，Sony Biotechnology；APC-Cy7抗人CD4，Biolegend)，并且仅仅将具有至少90％CD8或CD4阳性细胞的群体直接作为离体T细胞用于实验或用于用CD3/CD28 Dynabeads人T细胞激活剂试剂盒(Thermo Fisher)在补充有10％ FBS(Labtech)、1X Glutamax、100单位青霉素/链霉素和30U/mL IL-2(Sigma Aldrich)的RPMI 1640中按照制造商的方案扩增以用于生成预活化的T细胞。

用TGFβ处理的PDO和CD8/CD4 T细胞的共培养

用TrypLE Express收获PDO，并且用含有10％ FBS的DMEM/F12Ham培养基(SigmaAldrich)中和。将细胞通过70μm滤器过滤，计数并且重悬于补充有10％ FBS(Labtech)、1XGlutamax和100单位青霉素-链霉素的RPMI培养基(Thermo Fisher)中。在第-4天，在96孔板(Corning特殊光学微孔板(Special Optics Microplate))的每孔中铺板5000个肿瘤细胞。在第-3天，以2:1的效应物与靶标(E:T)之比添加预活化的CD8或CD4 T细胞，有或没有TGFβ(10ng/ml,R&D Systems)。在有或没有TGFβ的情况下预孵育72小时后，在第0天用20nM赛必妥单抗或20nM非靶向阴性对照抗体DP47-TCB(均由Roche提供)处理孔。对于离体CD8T细胞实验，将T细胞与TGFβ(10ng/ml)预孵育72小时，然后在第0天将它们与DP47-TCB或赛必妥单抗+/-TGFβ以1:1的效应物与靶标之比添加到肿瘤细胞中。单独的肿瘤细胞也包括在内作为对照。所有条件均重复三次铺板。

用TGFβ抑制剂加卢尼塞替布处理PDO和T细胞共培养物

如上所述从PBMC中分离出离体CD8 T细胞，并与TGFβ(10ng/ml)预孵育72小时，然后与24小时前如上所述以每孔5000个肿瘤细胞的密度接种在96孔板(E:T 1:1)中的肿瘤细胞组合。在同一天(第0天)，用20nM赛必妥单抗或20nM非靶向阴性对照抗体DP47-TCB+/-TGFβ(10ng/ml)+/-加卢尼塞替布(5μM或10μM，Tocris)处理共培养物。所有条件均重复三次铺板。

通过免疫荧光显微术评定癌细胞生长

在12天的时段内，在Celigo成像细胞仪(Nexcelom Bioscience)上使用GFP汇合度应用程序，每48至96小时对GFP汇合度进行定量。GFP汇合度分析能够在多个时间点追踪GFP阳性PDO细胞的生长，而不会错误地计数共培养物中的T细胞。汇合度分析还优于细胞核计数，后者在高癌细胞密度区域(诸如PDO中心)产生不准确的结果。汇合度分析优于测量球体直径的主要优点是甚至能够追踪显示高度可变形状的PDO的生长。在PDO显示生长迟缓(可能是由于生长培养基耗尽)之前，根据第10至12天之间的读数计算生长减少百分比。为了计算生长减少百分比，计算从第0天到第12天的生长倍数变化并减去1。然后将赛必妥单抗处理的PDO的倍数变化除以DP47-TCB处理的对照的倍数变化，并转化为百分比，从而使DP47-TCB处理的对照从第0天到第12天的生长归一化为100％。

统计分析

使用GraphPad Prism从每个时间点的3次重复计算标准偏差。

***

尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实施方案相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实施方案不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司

<120> 使用 CEA CD3 双特异性抗体和 TGFβ 信号传导抑制剂的癌症治疗

<130> P36413

<160> 25

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 HCDR1

<400> 1

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 HCDR2

<400> 2

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 HCDR3

<400> 3

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 LCDR1

<400> 4

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 LCDR2

<400> 5

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 LCDR3

<400> 6

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1 5

<210> 7

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 VH

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 8

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 VL

<400> 8

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA HCDR1

<400> 9

Glu Phe Gly Met Asn

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA HCDR2

<400> 10

Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA HCDR3

<400> 11

Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA LCDR1

<400> 12

Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA LCDR2

<400> 13

Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA LCDR3

<400> 14

His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr

1 5 10

<210> 15

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA VH

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA VL

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA CD3 bsAb LC(CEA)

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA CD3 bsAb LC(CD3)

<400> 18

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala

100 105 110

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

145 150 155 160

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

180 185 190

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

195 200 205

Val Glu Pro Lys Ser Cys

210

<210> 19

<211> 694

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA CD3 bsAB HC(CEA-CD3-Fc)

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu

225 230 235 240

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

245 250 255

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val

260 265 270

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser

275 280 285

Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

290 295 300

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

305 310 315 320

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His

325 330 335

Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

340 345 350

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val

355 360 365

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

370 375 380

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

385 390 395 400

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

405 410 415

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

420 425 430

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

435 440 445

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

450 455 460

Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

465 470 475 480

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

485 490 495

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

500 505 510

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

515 520 525

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

530 535 540

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

545 550 555 560

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly

565 570 575

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

580 585 590

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

595 600 605

Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

610 615 620

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

625 630 635 640

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

645 650 655

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

660 665 670

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

675 680 685

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

690

<210> 20

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CEA CD3 bsAB HC(CEA-Fc)

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 21

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DP47 VH

<400> 21

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DP47 VL

<400> 22

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 225

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro

225

<210> 24

<211> 207

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

145 150 155 160

Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn

165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg

180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195 200 205

<210> 25

<211> 198

<212> PRT

<213> 食蟹猴

<400> 25

Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys

50 55 60

Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu

65 70 75 80

Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro

85 90 95

Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn

100 105 110

Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp

115 120 125

Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys

130 135 140

Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly

145 150 155 160

Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn

165 170 175

Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly

180 185 190

Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195

Claims (18)

1.一种用于治疗个体的癌症的CEA CD3双特异性抗体，其中所述治疗包括将所述CEACD3双特异性抗体与TGFβ信号传导抑制剂组合施用。

2.CEA CD3双特异性抗体在制造用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中所述治疗包括将所述CEA CD3双特异性抗体与TGFβ信号传导抑制剂组合施用。

3.一种用于治疗个体的癌症的方法，其包括向所述个体施用CEA CD3双特异性抗体和TGFβ信号传导抑制剂。

4.一种药盒，其包括含有CEA CD3双特异性抗体的第一药物和含有TGFβ信号传导抑制剂的第二药物，并且任选地进一步包括包装插页，所述包装插页包括将所述第一药物与所述第二药物组合施用以治疗个体的癌症的说明。

5.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述CEA CD3双特异性抗体包含：

(i)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分与CD3特异性地结合并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3；以及

(ii)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分与CEA特异性地结合并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3。

6.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述CEA CD3双特异性抗体包含第三抗原结合部分和/或Fc结构域，所述第三抗原结合部分与CEA特异性地结合，所述Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成。

7.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述CEA CD3双特异性抗体包含：

(i)与CD3特异性地结合的第一抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQID NO:6的LCDR3，其中所述第一抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区发生交换；

(ii)与CEA特异性地结合的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3；

(iii)Fc结构域，所述Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成，其中所述第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N末端，并且所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端融合至所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端，并且其中所述第三抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端。

8.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述CEA CD3双特异性抗体的所述第一抗原结合部分包含重链可变区序列和轻链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，并且/或者所述CEA CD3双特异性抗体的所述第二抗原结合部分和(在存在时的)所述第三抗原结合部分包含重链可变区序列和轻链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

9.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述CEA CD3双特异性抗体的所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基的缔合的修饰，并且/或者所述Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。

10.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述CEA CD3双特异性抗体为赛必妥单抗。

11.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述TGFβ信号传导抑制剂靶向TGFβ信号传导通路的组分，所述组分选自由TGFβ(特别是TGFβ-1和/或TGFβ-2)、TGFβ(共)受体(特别是Tβ1、2和/或3)、SMAD蛋白质(特别是SMAD2、3和/或4)、整联蛋白(特别是整联蛋白αvβ6)和去泛素化酶(特别是USP4和/或USP15)组成的组。

12.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述TGFβ信号传导抑制剂为TGFβ或TGFβ(共)受体抑制剂。

13.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述TGFβ信号传导抑制剂为激酶抑制剂，特别地为TGFβ受体激酶抑制剂。

14.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述TGFβ信号传导抑制剂为加卢尼塞替布。

15.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述治疗进一步包括施用PD-L1结合拮抗剂，特别是阿特珠单抗。

16.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述癌症为CEA阳性癌症。

17.根据前述权利要求中任一项所述使用的CEA CD3双特异性抗体、用途、方法或药盒，其中所述癌症为选自由以下项组成的组的癌症：结直肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌和胃癌，特别是结直肠癌。

18.如前所述的本发明。