CN116322691A

CN116322691A - T细胞双特异性抗体相关不良反应的预防或减轻

Info

Publication number: CN116322691A
Application number: CN202180065376.9A
Authority: CN
Inventors: H·C·海格尔; C·克莱因; G·勒克莱尔; A·托索; T·齐默尔曼
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2021-09-22
Publication date: 2023-06-23
Also published as: US20220088195A1; IL300543A; AU2021350075A1; BR112023005399A2; KR20230074146A; TW202228773A; EP4216998A1; MX2023003133A; CA3193478A1; JP2023542212A; WO2022063803A1

Abstract

本发明涉及预防或减轻与T细胞双特异性抗体有关的不良反应，例如细胞因子释放综合征。具体地，本发明涉及预防或减轻因使用例如达沙替尼的酪氨酸激酶抑制剂而产生的副作用。

Description

T细胞双特异性抗体相关不良反应的预防或减轻

技术领域

本发明涉及预防或减轻与T细胞双特异性抗体有关的不良反应，例如细胞因子释放综合征。具体地，本发明涉及预防或减轻因使用例如达沙替尼等酪氨酸激酶抑制剂而产生的副作用。

背景技术

T细胞结合子或T细胞双特异性抗体(TCB)是通过一个结合部分识别靶细胞抗原(例如在肿瘤细胞上表达的肿瘤抗原)的双特异性抗体，以及通过另一个结合部分识别T细胞受体。TCB作为癌症免疫治疗剂有着广阔的前景。CD3与靶细胞抗原的交联触发T细胞活化、增殖和细胞因子释放，导致靶细胞杀伤(Bacac等人，Clin Cancer Res(2016)22,3286-97；Bacac等人，Oncoimmunology(2016)5,e1203498)。然而，因为中靶在瘤(on-target ontumor)、中靶脱瘤(on target off tumor)细胞毒性活性和细胞因子释放，TCB治疗有时与安全责任相关。据报道，TCB最常见的不良反应之一是细胞因子释放综合征(CRS)。这种复杂的临床综合征以发热、低血压和呼吸不足为特征，并与促炎细胞因子诸如IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-1β的释放有关(参见例如Shimabukuro-Vornhagen等人，J Immunother Cancer(2018)6,56)。如果靶抗原在健康细胞中表达，则可能会发生肿瘤外毒性，这可能会导致组织损伤并危及患者的安全。非常需要减轻这些危及生命的毒性的方法，例如对TCB诱导的T细胞活化和增殖的药理学阻断。酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼被认定为关闭CAR-T细胞功能的有效候选药物(Weber等人，Blood Advances(2019)3,711-7；Mestermann等人，SciTransl Med(2019)11,eaau5907)。另一方面，达沙替尼与T细胞结合子blinatumomab的同时施用似乎不会损害后者的活性(Chiaretti等人，Blood(2019)134(Supplement 1),740；Foà等人，N Engl J Med(2020)383,1613-1623)。

发明内容

本发明人已经发现，酪氨酸激酶抑制剂，特别是达沙替尼，可以用作药理学开/关的开关以通过T细胞参与疗法减轻肿瘤外毒性或CRS。

使用人外周血单核细胞的靶细胞杀伤的体外模型，发明人评估了达沙替尼与四种示例性TCB(CEA-TCB、CD20-TCB和CD19-TCB，作为肿瘤表面靶向TCB的实例，以及HLA-A2 WT-1-TCB，作为TCR样-TCB的实例)组合对T细胞活化和增殖、靶细胞杀伤和细胞因子释放的可逆作用。使用达沙替尼的剂量反应进行杀伤测定，以确定完全抑制TCB诱导的T细胞活化的阈值。此外，发明人提出低于该阈值的达沙替尼浓度可用于控制TCB诱导的细胞因子释放。这些抵消作用可以在临床相关剂量的达沙替尼浓度下获得，并且可用于在CRS症状无法通过标准干预控制的情况下诱导阻断TCB诱导的T细胞活化或用于减少细胞因子释放作为TNF的替代品或IL-6R阻断。本实例中的数据表明，达沙替尼可以作为TCB介导的T细胞活化的可逆开/关的开关，该可逆开/关的开关可用于减轻TCB诱导的肿瘤内和肿瘤外毒性，包括CRS。

因此，在第一方面，本发明提供T细胞双特异性抗体，其用于治疗个体中的疾病，其中该治疗包括

(a)对该个体施用该T细胞双特异性抗体，以及

(b)对该个体施用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)以预防或减轻与施用该T细胞双特异性抗体有关的不良反应。

本发明进一步提供了T细胞双特异性抗体在制备用于治疗个体中的疾病的药物中的用途，其中该治疗包括

(a)对该个体施用该T细胞双特异性抗体，以及

本发明还提供了治疗个体中的疾病的方法，其中该方法包括

(a)对该个体施用T细胞双特异性抗体，以及

在另一方面，本发明提供了酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，其用于预防或减轻与向个体施用T细胞双特异性抗体有关的不良反应。

本发明进一步提供了酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在制备用于预防或减轻与向个体施用T细胞双特异性抗体有关的不良反应的药物中的用途。

本发明还提供了预防或减轻与向个体施用T细胞双特异性抗体有关的不良反应的方法，该方法包括向个体施用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。

供使用的T细胞双特异性抗体、供使用的TKI、以上和本文所述的用途或方法可以单独或组合地并入以下描述的任何特征(除非上下文另有说明)。

除非本文另外定义，否则本文所用的术语为本技术领域中的一般使用。

在一些方面，TKI是Lck和/或Src激酶抑制剂。在更具体的方面，TKI是达沙替尼。

“达沙替尼”是一种酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。它以

(除其他外)品牌出售，用于治疗某些慢性骨髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)的病例。其CAS号、IUPAC名称和化学结构如下所示。

CAS号：302962-49-8

IUPAC名称：N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺一水合物

化学结构：

在一些方面，(施用)TKI引起T细胞双特异性抗体活性的抑制。

T细胞双特异性抗体的“活性”是指由T细胞双特异性抗体在个体体内引起的反应。这种活性可以包括T细胞，特别是CD4+和/或CD8+ T细胞的细胞反应，诸如增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达，和/或对靶细胞的效应，特别是表达T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原的靶细胞(例如肿瘤细胞)，诸如靶细胞的裂解。

在一些方面，(施用)TKI引起(由T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞活化的抑制。

如本文中所使用的“T细胞活化”(Activation of T cells或T cellactivation)，是指T淋巴细胞(特定是CD4+或CD8+ T细胞)的一种或多种细胞反应，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。测定T细胞活化的合适分析是本技术中已知的并在本文中描述。在特定方面，T细胞活化通过测量T细胞上CD25和/或CD69的表达来确定，例如通过流式细胞术。

在一些方面，(施用)TKI引起(由T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞增殖的抑制。在一些方面，(施用)TKI引起(由T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞的细胞毒性活性的抑制。

T细胞的“细胞毒性活性”是指T淋巴细胞，特别是CD4+或CD8+ T细胞对靶细胞的裂解(即杀伤)的诱导。细胞毒性活性通常涉及T淋巴细胞的脱粒，这与T淋巴细胞释放细胞毒性效应分子诸如颗粒酶B和/或穿孔素有关。

在一些方面，(施用)TKI引起(由T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞中的T细胞受体信号传导的抑制。

“T细胞受体信号传导”是指T淋巴细胞中T细胞受体(TCR)下游信号传导通路在TCR接合后的活性(诸如T细胞双特异性抗体接合TCR的CD3ε亚单位)，涉及信号传导分子，包括酪氨酸激酶，诸如Lck激酶。

在一些方面，(施用)TKI引起(由T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞细胞因子分泌的抑制。在一些方面，该细胞因子是选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β所组成的组中的一种或多种细胞因子。在一些方面，该T细胞是CD8+ T细胞或CD4+细胞。

在一些方面，该抑制是可逆的(即，该抑制可以被解除，使得被抑制参数的水平恢复到接近其在抑制之前的水平)。在一些方面，在给定时间段内(即在停止施用TKI之后)TKI没有被施用(向个体)后，该抑制被逆转。在一些方面，该时间段是约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。

该抑制可以是部分的或完全的。在一些方面，该抑制具有临床意义和/或统计学意义。

在一些方面，(施用)TKI引起个体中一种或多种细胞因子的血清水平减少。在一些方面，该一种或多种细胞因子选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β所组成的组。在一些方面，在给定的时间量未(向个体)施用TKI之后，该减少持续。在一些方面，该时间量是约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。在一些方面，该减少在后续施用T细胞双特异性抗体之后持续。特别地，即使在停止施用TKI/没有进一步施用TKI之后，该减少仍持续。该血清水平的减少特别是与未施用TKI的个体(包括同一个体)中的血清水平相比(即在这种情况下，与未施用/施用TKI之前相比，血清水平减少)。该血清水平的减少特别是与施用(特别是第一次施用)T细胞双特异性抗体但不施用TKI的个体(包括同一个体)中的血清水平相比(即在这种情况下，与施用T细胞双特异性抗体/施用T细胞双特异性抗体之后但未施用TKI/施用TKI之前相比，血清水平减少)。在没有该减少的情况下，血清水平和/或细胞因子分泌特别地可能相对于(施用)T细胞双特异性抗体而升高/增加。在一些方面，该减少具有临床意义和/或统计学意义。

在一些方面，该不良反应是细胞因子释放综合征(CRS)。

有时也称为“副作用”或“不良事件”(特别是在临床研究中)的“不良反应”是药物治疗个体(在本文中特别是使用T细胞双特异性抗体)导致的有害和不希望的影响。

“细胞因子释放综合征”(简称“CRS”)是指在施用治疗剂(例如T细胞双特异性抗体)期间或之后不久(例如，在1天内)在受试者的血液中细胞因子水平升高，诸如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素2(IL-2)及其他，导致不良症状。CRS是对治疗剂的不良反应，并且与施用治疗剂及时相关。它通常发生在施用治疗剂期间或之后不久，即通常在施用(通常是输注)之后24小时内，主要是在第一次施用时。在一些情况下，例如在施用CAR-T细胞后，CRS也可能会在稍后发生，例如在CAR-T细胞扩增施用之后几天。发生率和严重程度通常随着后续施用而降低。症状可能从症状性不适到致命事件，并且可能包括发烧、发冷、头晕、高血压、低血压、缺氧、呼吸困难、烦躁、出汗、潮红、皮疹、心动过速、呼吸急促、头痛、肿瘤痛、恶心、呕吐和/或器官衰竭。

在一些方面，该不良反应是发烧、低血压和/或缺氧。在一些方面，该不良反应是一种或多种细胞因子的血清水平升高。该升高的血清水平特别是与健康个体的血清水平和/或未施用T细胞双特异性抗体的个体(包括同一个体)中的血清水平相比(即在这种情况下血清水平与未施用T细胞双特异性抗体的血清水平相比升高)。在一些方面，该一种或多种细胞因子选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β所组成的组。

在一些方面，该不良反应是与T细胞双特异性抗体与表达T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原的非癌细胞结合相关的不良反应(即，在靶/脱肿瘤效应)。非癌细胞可以是正常(即非癌性)细胞和/或健康组织中(即肿瘤外)的细胞。在一些方面，该不良反应是与T细胞双特异性抗体与其靶细胞抗原的结合无关的不良反应(即脱靶效应)。

在一些方面，TKI的施用是在(个体的)不良反应的(临床上)显现时进行的。该施用可以是，例如，在不良反应显现(即出现副作用的临床症状，如发热)后约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时内。在一些方面，TKI的施用是响应(个体的)不良反应的(临床上)显现。

在一些方面，TKI的施用是在T细胞双特异性抗体的施用之前。在一些方面，TKI的施用与T细胞双特异性抗体的施用同时进行。在一些方面，TKI的施用是在T细胞双特异性抗体的施用之后。当TKI的施用是在T细胞双特异性抗体的施用之前或之后，TKI的这种施用可以是例如分别在施用T细胞双特异性抗体之前或之后的约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时内。TKI的施用可以是间歇性或连续性地。在一些方面，TKI的施用为口服。

在一些方面，TKI的施用剂量足以引起T细胞双特异性抗体活性的抑制。在一些方面，TKI的施用剂量足以引起(由T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞活化的抑制。在一些方面，TKI的施用剂量足以引起(由T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞增殖的抑制。在一些方面，TKI的施用剂量足以引起(由T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞的细胞毒性活性的抑制。在一些方面，TKI的施用剂量足以引起(由T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞中T细胞受体信号传导的抑制。在一些方面，TKI的施用剂量足以引起(由T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞分泌细胞因子的抑制。在一些方面，该细胞因子是选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β所组成的组中的一种或多种细胞因子。在一些方面，该T细胞是CD8+ T细胞或CD4+细胞。该抑制可以是部分的或完全的。在一些方面，该抑制具有临床意义和/或统计学意义。

在一些方面，TKI的施用剂量足以引起个体中一种或多种细胞因子的血清水平的减少。在一些方面，TKI的施用剂量足以引起个体中一种或多种细胞因子的血清水平的减少但不足以引起T细胞双特异性抗体活性的抑制。在一些方面，施用TKI的剂量足以造成个体中的免疫细胞的一种或多种细胞因子的分泌减少，但不足以抑制T细胞活化和/或抑制由T细胞双特异性抗体所诱导的T细胞的细胞毒性活性。在一些方面，该一种或多种细胞因子选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β所组成的组。在一些方面，该T细胞是CD8+ T细胞或CD4+细胞。免疫细胞可包括各种免疫细胞类型，诸如T细胞、巨噬细胞、NK细胞等。

该血清水平或细胞因子分泌的降低特别是与未施用TKI的个体(包括同一个体)中的血清水平或细胞因子分泌相比(即在这种情况下，与未施用/施用TKI之前相比，血清水平降低)。该血清水平或细胞因子分泌的降低特别是与施用(特别是第一次施用)T细胞双特异性抗体但不施用TKI的个体(包括同一个体)中的血清水平或细胞因子分泌相比(即在这种情况下，与施用T细胞双特异性抗体/施用T细胞双特异性抗体之后但未施用TKI/施用TKI之前相比，血清水平降低)。在没有该减少的情况下，血清水平和/或细胞因子分泌特别地可能相对于(施用)T细胞双特异性抗体而升高/增加。在一些方面，该减少具有临床意义和/或统计学意义。该抑制可以是部分的或完全的。在一些方面，该抑制具有临床意义和/或统计学意义。

在一些方面，以有效剂量施用TKI。

药剂例如TKI或T细胞双特异性抗体的“有效量”或“有效剂量”是指在必要的剂量和时间段达到预期的治疗或预防效果所需的有效量。

在一些方面，TKI的施用剂量为约10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg或200mg。在一些方面，TKI的施用剂量为约20mg。在一些方面，TKI的施用剂量为约70mg。在一些方面，TKI的施用剂量为约80mg。在一些方面，TKI的施用剂量为约100mg。在一些方面，TKI的施用剂量为约140mg。

在一些方面，TKI的施用剂量为约100mg或更低。在一些方面，TKI的施用剂量为约20mg。在一些方面，TKI的施用剂量为约70mg。在一些方面，TKI的施用剂量为约80mg。在一些方面，TKI的施用剂量为约100mg。在此类方面，TKI的剂量可能足以引起个体中一种或多种细胞因子的血清水平降低但不足以抑制T细胞双特异性抗体的活性，或足以引起个体中免疫细胞对一种或多种细胞因子的分泌减少，但不足以抑制由T细胞双特异性抗体诱导的T细胞的活化和/或T细胞的细胞毒性活性。

在一些方面，TKI为每天施用。在一些方面，TKI每天施用一次。在一些方面，TKI以约100mg的剂量每天施用一次。在一些方面，TKI的施用是在不良反应持续的时间段期间(即TKI的施用是从不良反应的显现到不良反应的减轻或消失)。在一些方面，在防止或减轻不良反应后停止施用TKI。在一些方面，在不良反应减轻或消失后停止施用TKI。该减少特别具有临床意义和/或统计学意义。在一些方面，TKI的施用是一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次，特别是在用T细胞双特异性抗体治疗个体的过程中的一次、两次、三次、四次、五次，六次、七次、八次、九次或十次。在一些方面，TKI的施用持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些方面，TKI的施用为每日一次持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些方面，TKI的施用与T细胞双特异性抗体的第一次施用相关。该第一次施用特别是在用T细胞双特异性抗体治疗个体的过程中第一次施用T细胞双特异性抗体。在一些方面，TKI的施用与T细胞双特异性抗体的第一次施用同时进行。在一些方面，TKI的施用是在T细胞双特异性抗体的第一次施用之前。在一些方面，TKI的施用是在T细胞双特异性抗体的第一次施用之后。在一些方面，TKI的施用是在T细胞双特异性抗体的第一次施用之后并且在T细胞双特异性抗体的第二次施用之前。当TKI的施用是在T细胞双特异性抗体的(第一次)施用之前或之后，TKI的这种施用可以是例如分别在施用T细胞双特异性抗体之前或之后的约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时内。

在一些方面，T细胞双特异性抗体的施用比TKI的施用持续更长的时间段。在一些方面，在停止施用TKI后继续施用T细胞双特异性抗体。在一些方面，T细胞双特异性抗体的施用是单次施用或重复施用。在用T细胞双特异性抗体治疗个体的过程中，T细胞双特异性抗体可以施用一次或多次。例如，用T细胞双特异性抗体治疗个体可包括多个治疗周期，每个治疗周期包括T细胞双特异性抗体的一次或多次施用。在一些方面，T细胞双特异性抗体的施用包括第一次和第二次施用。

为了在本发明中使用，T细胞双特异性抗体将以符合良好医疗实践的方式予以配制、给药和施用。在这种情况下，考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排以以及执业医师已知的其他因素。

在一些方面，以有效剂量施用T细胞双特异性抗体。对于全身施用，最初可以从诸如细胞培养物测定的体外测定估计有效剂量。然后可以在动物模型中制定剂量，以达到包括细胞培养物中确定的IC₅₀在内的循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人体有用的剂量。也可以使用本技术领域中熟知的技术，根据体内数据(例如动物模型)估计初始剂量。可以单独调节剂量和间隔来提供足以维持治疗效果的T细胞双特异性抗体的血浆水平。通过注射施用的常见患者剂量在约0.1-50mg/kg/天的范围内，通常范围为0.5-1mg/kg/天。可以通过每天施用多种剂量来实现治疗有效的血浆浓度。血浆中的浓度可以例如通过HPLC来测量。

可以施用有效量的T细胞双特异性抗体来预防或治疗疾病。T细胞双特异性抗体的适当施用途径和剂量可基于所治疗的疾病类型、T细胞双特异性抗体的类型、疾病的严重程度和病程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的反应，以及主治医生的判断力来确定。给药可通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于短暂施用还是长期施用。本文中考虑各种给药方案，其包括但不限于在多种时间点单次或多次给药、快速注射给药和脉冲输注。

T细胞双特异性抗体和TKI可以通过任何合适的途径施用，并且可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径来施用。在一些方面，T细胞双特异性抗体的施用是肠胃外的，特别是静脉内的。

在一些方面，T细胞双特异性抗体的施用是T细胞双特异性抗体对个体的第一次施用，特别是在用T细胞双特异性抗体治疗个体的过程中第一次施用T细胞双特异性抗体。

在一些方面，(施用)T细胞双特异性抗体诱发(即引起或增加)T细胞的活化。在一些方面，(施用)T细胞双特异性抗体诱发T细胞的增殖。在一些方面，(施用)T细胞双特异性抗体诱发T细胞的细胞毒性活性。在一些方面，(施用)T细胞双特异性抗体诱发T细胞中的T细胞受体信号传导。在一些方面，(施用)T细胞双特异性抗体诱发T细胞分泌细胞因子。在一些方面，细胞因子是选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β所组成的组中的一种或多种细胞因子。在一些方面，该T细胞是CD8+ T细胞或CD4+细胞。

在一些方面，T细胞双特异性抗体的施用导致T细胞，特别是细胞毒性T细胞的活化，特别是在癌症部位(例如在实体瘤癌症内)。该活化可包含T细胞增殖、T细胞分化、T细胞分泌细胞因子、T细胞释放细胞毒性效应分子、T细胞的细胞毒性活性和T细胞活化标志物的表达。在一些方面，T细胞双特异性抗体的施用导致癌症部位(例如实体瘤癌症内)的T细胞，特别是细胞毒性T细胞的数量增加。

下面描述可用于本发明的T细胞双特异性抗体。

“T细胞双特异性抗体”是指能够结合，包括同时结合T细胞(通常经由在T细胞上表达的抗原决定簇，诸如Cd3)和靶细胞(通常经由在靶细胞上表现的抗原决定簇，诸如CEA、CD19、CD20或HLA-A2/WT1)的抗体。

在根据本发明的优选方面，T细胞双特异性抗体能够同时结合T细胞上的抗原决定簇(即第一抗原，例如CD3)和靶细胞上的抗原决定簇(即第二抗原，例如CEA、CD19、CD20或HLA-A2/WT1)。在一些方面，T细胞双特异性抗体能够通过同时结合CD3和靶细胞抗原而交联T细胞和靶细胞。在甚至更优选的方面，这种同时结合导致靶细胞，特定是表达肿瘤细胞的靶细胞抗原(例如CEA、CD19、CD20或HLA-A2/WT1)裂解。在一些方面，这种同时结合导致T细胞活化。在一些方面，这种同时结合导致T细胞的细胞反应，该细胞反应选自以下项的组：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。在一些方面，T细胞双特异性抗体与CD3结合而不同时与靶细胞抗原结合，不导致T细胞活化。在一些方面，T细胞双特异性抗体能够将T细胞的细胞毒性活性重定向至靶细胞。在优选方面，该重定向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。

术语“双特异性”是指抗体能够与至少二个不同的抗原决定簇结合。通常，双特异性抗体包含两个抗原结合位点，其中每个抗原结合位点对不同抗原决定簇具有特异性。在某些方面，双特异性抗体能够同时结合两个抗原决定簇，特定是在两种不同细胞上表达的两个抗原决定簇。

如本文所使用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上与抗原结合部分结合，形成抗原结合部分-抗原复合物的位点(例如，一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)。例如，可用的抗原决定簇可存在于肿瘤细胞的表面上、受病毒感染的细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上，不存在于血清中，和/或存在于细胞外基质(ECM)中。

如本文所使用，术语“抗原结合部分”，是指结合，包括特异性结合抗原决定簇的多肽分子。在一些方面，抗原结合部分能够将其所附接的实体(例如第二抗原结合部分)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞。在另外的方面，抗原结合部分能够通过其靶抗原(例如T细胞受体复合物抗原)活化信号传导。抗原结合部分包括如本文进一步定义的抗体及其片段。特定抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些方面，抗原结合部分可包括如本文进一步定义和本技术中已知的抗体恒定区。可用的重链恒定区包括五种同种型(isotype)中的任一者：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括二种同种型中的任一者：κ和λ。

“特异性结合”是指结合对抗原具有选择性并且可区分出不想要或非特定的相互作用。本文中的术语“结合”(bind/binding)一般是指“特异性结合”。抗原结合部分结合特异性抗原决定簇的能力可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振(SPR)技术(例如于BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，GlycoJ17，323-329(2000))和传统的结合测定(Heeley，Endocr Res 28，217-229(2002))来测定。在一些方面，抗原结合部分结合不相关的蛋白质的程度小于抗原结合部分结合抗原的约10％，例如通过SPR。在某些方面，与抗原结合的抗原结合部分或包含该抗原结合部分的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更小，例如10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_D)。

“亲和力”指分子(例如受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所使用的“结合亲和力”，是指反映结合对成员(例如，抗原结合部分和抗原或受体及其配体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力通常可以用解离常数(K_D)表示，其是解离速率常数与缔合速率常数(分别为k_off和k_on)的比。因此，等效亲和力可包括不同速率常数，只要速率常数比保持相同即可。可通过本领域已知的成熟的方法测量亲和力，该方法包括那些本文所述的方法。用于测定亲和力的特定方法为表面等离子体共振(SPR)。

除非另有说明，否则“CD3”是指源自任何脊椎动物的任何天然CD3，该脊椎动物包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”、未处理的CD3以及在细胞处理中得到的任何形式的CD3。该术语还涵盖天然生成的CD3变体，例如，剪接变体或等位基因变体。在一些方面，CD3是人CD3，特定是人CD3的ε亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(版本144)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1。也可参见SEQ ID NO:25。食蟹猴[Macaca fascicularis]CD3ε的氨基酸序列显示于NCBI GenBank号BAB71849.1。也可参见SEQ ID NO:26。

如本文中所使用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞例如肿瘤中的细胞，诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞(在此情况下为“肿瘤细胞抗原”)。优选地，靶细胞抗原不是CD3，和/或与CD3在不同的细胞上表达。在一些方面，靶细胞抗原为CEA，特别是人CEA。在其他方面，靶细胞抗原为HLA-A2/WT1，特别是人HLA-A2/WT1。在一些方面，靶细胞抗原为CD20，特别是人CD20。在一些方面，靶细胞抗原为CD19，特别是人CD19。

如本文所使用，关于抗原结合部分的术语“第一”、“第二”或“第三”，是用于方便区分每一类型的部分何时存在多于一个。除非明确说明，否则使用这些术语并非旨在赋予双特异性抗体特定的顺序或方向。

如本文中所使用的术语“价”，表示抗体中存在指定数量的抗原结合位点。因此，术语“与抗原单价结合”表示在抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。

本文中的术语“抗体”以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示出预期抗原-结合活性即可。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本类似的结构的抗体。

“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括(但不限于)Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')₂、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9，129-134(2003)。关于scFv片段的综述，请参见Pluckthün，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；也可参见WO 93/16185；以及美国专利第5,571,894号和第5,587,458号。关于包含补救受体结合抗原决定簇残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段的论述，参见美国第5,869,046号专利。双体抗体为具有两个抗原结合位点(其可以是二价或双特异性的)的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9，129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA90，6444-6448(1993)。Hudson等人，Nat Med9，129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或抗体的全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些方面，单结构域抗体为人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利第6,248,516B1号)。抗体片段可通过各种技术制造，包括但不限于如本文所述的完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的产生。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有类似的结构，且每个结构域均包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。请参见Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman和Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。如在本文中结合可变区序列所使用的“Kabat编号”，是指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda,MD(1991)描述的编号系统。

如本文中所使用的重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置，根据描述于Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的Kabat编号系统(在本文中称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”)编号。具体地，Kabat编号系统(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的第647-660页)用于卡帕和兰姆达同种型的轻链恒定结构域CL和Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，在此情况中，其于本文中通过参考“根据Kabat EU索引编号”进一步阐明。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中序列高度可变并确定抗原结合特异性的各个区，例如“互补决定区”(“CDR”)。通常，抗体包括六个CDR：三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，以及三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在本文中，例示性CDR包括：

(a)高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)处(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；

(b)CDR存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、和95-102(H3)处(Kabat et al.,Sequencesof Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及

(c)抗原接触存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、和93-101(H3)处(MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。

除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人在上述文献中所述的方法来确定。本领域的技术人员将理解，也可以根据Chothia在上述文献、McCallum在上述文献中所述的方法或任何其他科学上接受的命名系统来确定CDR名称。

“骨架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因此，HVR和FR序列通常以如下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

抗体或免疫球蛋白的“类别(class)”是指为其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中的几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域和轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白质。

“交叉(crossover)”Fab分子(也称为“Crossfab”)是指这样的Fab分子，其中Fab重链和Fab轻链的可变结构域或恒定结构域被交换(即彼此替换)，即，交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1组成的肽链(VL-CH1，在N末端至C末端方向上)，以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL组成的肽链(VH-CL，在N末端至C末端方向上)。为清楚起见，在Fab轻链和Fab重链的可变结构域被交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。相反地，在Fab轻链和Fab重链的恒定结构域被交换的交叉Fab分子中，包含重链可变结构域VH的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。

与此相反，“常规”Fab分子是指其天然形式(即包含由重链可变结构域和恒定结构域组成的重链(VH-CH1，在N末端至C末端方向中)和由轻链可变结构域和恒定结构域组成的轻链(VL-CL，在N末端至C末端方向中))的Fab分子。

术语“免疫球蛋白分子(immunoglobulin molecule)”是指具有天然生成的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白为约150,000道耳顿、由两条轻链和两条重链经二硫键键合所组成的异四聚体糖蛋白。从N末端至C末端，每条重链具有可变结构域(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变区，其后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N末端至C末端，每条轻链具有可变结构域(VL)，也称为轻链可变结构域或轻链可变区，接着为轻链恒定(CL)结构域，也称为轻链恒定区。免疫球蛋白的重链可被归类为五种类型中的一种，称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可进一步分为亚型，例如γ₁(IgG₁)、γ₂(IgG₂)、γ₃(IgG₃)、γ₄(IgG₄)、α₁(IgA₁)和α₂(IgA₂)。基于其恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可被归类为两种类型中的一种，称为卡帕(kappa,κ)和兰姆达(lambda,λ)。免疫球蛋白基本上由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。

本文中的术语“Fc结构域”或“Fc区”，用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区域和变体Fc区域。尽管IgG重链的Fc区的边界可能略有变化，但通常将人IgG重链的Fc区定义为从Cys226或Pro230延伸至该重链的羧基末端。但是，由宿主细胞产生的抗体可能经历重链C末端的一种或多种，特别是一种或两种氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子而产生的抗体可包括全长重链，或者可包括全长重链的切割变体。可能是这种情况，其中重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引编号)。因此，可以存在或可以不存在Fc区域的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号系统(也称为EU指数)进行，如Kabat等人所述(Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)(另见上文)。如本文中所使用的Fc结构域的“亚基”，是指形成二聚体Fc结构域的两个多肽之一，即包含能够稳定自缔合的免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。

“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或对Fc结构域亚基的翻译后修饰，该操纵或翻译后修饰减少或阻止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽的缔合形成同型二聚体。本文所用的促进缔合的修饰，特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一个所进行的单独修饰，其中，该修饰彼此互补，以便促进两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可改变一个或两个Fc结构域亚基的结构或电荷，以分别使其在空间或静电上有利。因此，(异)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，其就进一步融合到每个亚基(例如，抗原结合部分)的组分而言可能有所不同。在一些方面，促进缔合的修饰包含Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在特定方面，促进缔合的修饰包含Fc结构域的两个亚基的每一个中的单独的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。

术语“效应子功能”，是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖型细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、抗原呈现细胞摄取的免疫复合物介导抗原、细胞表面受体(例如，B细胞受体)降调和B细胞活化。

相对于参考多肽序列所述的“百分比(％)氨基酸序列同一性”，是指候选序列中氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比，在比对序列并引入差异后(如有必要)，可实现最大的序列同一性百分比，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分。为确定氨基酸序列同一性百分比的目的而进行的比对可通过本领域中技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包实现。本领域的技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。但是，出于本文的目的，使用FASTA包36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序和BLOSUM50比较矩阵来生成％氨基酸序列同一性值。FASTA程序包由以下作者开发：W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)(“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”,PNAS 85:2444-2448)；W.R.Pearson(1996)(“Effective protein sequence comparison”Meth.Enzymol.266:227-258)；以及Pearson等人(1997)(Genomics 46:24-36)，并可从以下网址公开获得：http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml。可替代地，可使用通过http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi获得的公共服务器，使用ggsearch(global protein:protein)程序和默认选项(BLOSUM50；open:-10；ext:-2；Ktup＝2)比较序列，以确保执行全局而不是局部比对。氨基酸同一性百分比在输出比对标题中给出。

“活化Fc受体”为在抗体的Fc结构域参与之后引起刺激受体携带细胞执行效应子功能的信号转导事件的Fc受体。人活化Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。

“减少结合”，例如减少结合Fc受体，是指(例如)通过SPR测得各自相互作用的亲和力降低。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即相互作用完全消除。相反，“增加结合”是指各自相互作用的结合亲和性增加。

“融合”是指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)经肽键直接或经由一或多个肽接头连接。

在特定方面，T细胞双特异性抗体结合CD3和靶细胞抗原。因此，在一些方面，T细胞双特异性抗体包含结合CD3的抗原结合部分和结合靶细胞抗原的抗原结合部分。

在一些方面，第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分为Fab分子。在一些方面，第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区被交换。在这些方面，第二抗原结合部分优选是常规Fab分子。

在一些方面，其中T细胞双特异性抗体的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分两者均为Fab分子，并且在抗原结合部分的一(特别是第一抗原结合部分)中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，

i)在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸(根据Kabat编号)取代，并且其中，在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被带负电荷的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)取代；或

ii)在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸(根据Kabat编号)取代，并且其中，在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被带负电荷的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)取代。

T细胞双特异性抗体不包含i)和ii)两者所提及的修饰。具有VH/VL交换的抗原结合部分的恒定结构域CL和CH1未彼此取代(即保持未交换状态)。

在更具体的方面，

i)在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立取代，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立取代；或

ii)在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立取代。

在一些方面，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立取代。

在另外的方面，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立取代。

在优选的方面，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，且123位的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且213位的氨基酸独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)取代。

在一些方面，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代。

在一些方面，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且123位的氨基酸被精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代。

在特定的方面，如果根据上述方面的氨基酸取代发生在第二抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中，则第二抗原结合部分的恒定结构域CL为κ同种型。

在一些方面，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分彼此融合，任选地经由肽接头彼此融合。

在一些方面，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为Fab分子，并且(i)第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，或(ii)第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。

在一些方面，T细胞双特异性抗体提供与CD3的单价结合。

在特定方面，T细胞双特异性抗体包含结合CD3的单个抗原结合部分和结合靶细胞抗原的两个抗原结合部分。因此，在一些方面，T细胞双特异性抗体包含结合靶抗原的第三抗原结合部分，特别是Fab分子，更特别是常规Fab分子。第三抗原结合部分可以单独或组合地并入本文描述的与第二抗原结合部分相关的所有特征(例如CDR序列、可变区序列和/或恒定区中的氨基酸取代)。在一些方面，第三抗原部分与第一抗原结合部分相同(例如也是常规Fab分子并包含相同的氨基酸序列)。

在特定的方面，T细胞双特异性抗体另外包含Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成。在一些方面，Fc结构域为IgG Fc结构域。在特定的方面，Fc结构域为IgG₁Fc结构域。在其他方面，Fc结构域为IgG₄Fc结构域。在更具体的方面，Fc结构域为IgG₄Fc结构域，其包含在位置S228(根据Kabat EU索引编号)的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P。该氨基酸取代减少体内IgG₄抗体的Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，Drug Metabolismand Disposition 38，84-91(2010))。在进一步特定方面，Fc结构域为人Fc结构域。在特定优选的方面，Fc结构域为人IgG₁Fc结构域。人IgG₁Fc区的一个示例性序列在SEQ ID NO:27中给出。

在一些方面，其中该第一抗原结合部分、该第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分各自为Fab分子，(a)该第二抗原结合部分在该Fab重链的C末端与该第一抗原结合部分的该Fab重链的N末端融合，并且该第一抗原结合部分在该Fab重链的C末端与该Fc结构域的该第一亚基的N末端融合，或是(ii)该第一抗原结合部分在该Fab重链的C末端与该第二抗原结合部分的该Fab重链的N末端融合，并且该第二抗原结合部分在该Fab重链的C末端与该Fc结构域的该第一亚基的N末端融合；并且(b)该第三抗原结合部分(在存在时的)在该Fab重链的C末端与该Fc结构域的该第二亚基的N末端融合。

在一些方面，T细胞双特异性抗体基本上由第一、第二和第三抗原结合部分(特别是Fab分子)、由第一和第二亚基组成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成。

T细胞双特异性抗体的成分可直接彼此融合或优选地经由一个或多个合适的肽接头融合。在Fab分子与Fc结构域的亚基的N末端融合的情况下，其通常通过免疫球蛋白铰链区融合。

抗原结合部分可与Fc结构域直接融合或彼此融合，或者通过胜肽接头与Fc融合或彼此融合，该胜肽接头包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸。胜肽接头为本领域中所公知的并且如本文所述。合适的非免疫肽接头包括例如(G₄S)_n、(SG₄)_n、(G₄S)_n、G₄(SG₄)_n或(G₄S)_nG₅肽接头。“N”通常为1至10的整数，特别为2至4。在一些方面，该肽接头的长度为至少5个氨基酸；在一些方面，长度为5至100个氨基酸；在另外的方面，长度为10至50个氨基酸。在一些方面，该肽接头为(GxS)_n或(GxS)_nG_m，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3，n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝1、2、3、4或5，并且m＝0、1、2、3、4或5)；在一些方面，x＝4并且n＝2或3；在另外的方面，x＝4并且n＝2；在又另外的方面，x＝4，n＝1，并且m＝5。在一些方面，该肽接头为(G₄S)₂。在其他方面，该肽接头为G₄SG₅。另外，连接子可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别是，在其中Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可通过包含附加的肽接头或不含附加的肽接头的免疫球蛋白铰链区或其一部分融合。

在特定的方面，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基与第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用位点在CH3结构域中。因此，在一些方面，该修饰在Fc结构域的CH3结构域中进行。

在具体的方面，该促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰为所谓的“突出物入孔(knob-into-hole)”修饰，其包括在Fc结构域的两个亚基中的一个的“突出物”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个的“孔”修饰。“突出物入孔”技术描述于例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9，617-621(1996)；以及Carter，JImmunolMeth 248，7-15(2001)。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入一个突起(“突出物”)，并且在第二多肽的界面中引入一个对应的空腔(“孔”)，以使该突起可定位于空腔中，从而促进异源二聚体形成并阻碍同源二聚体形成。通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽界面上的较小的氨基酸侧链来构建突起。通过将较大氨基酸侧链替换为较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)，在第二多肽的界面中形成与突起具有相同或相近大小的互补空腔。

因此，在一些方面，该Fc结构域的该第一亚基的该CH3结构域中的氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在该第一亚基的该CH3结构域内产生突起，该突起为可位在该第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且该Fc结构域的该第二亚基的该CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在该第二亚基的该CH3结构域内产生空腔，该第一亚基的该CH3结构域内的该突起为可位在该空腔内。优选地，该具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由以下项所组成的组：精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。优选地，该具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由以下项所组成的组：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。可通过改变编码多肽的核酸(例如通过针对特定位点的突变或通过胜肽合成)来制备突起和空腔。

在具体的这些方面，在Fc结构域的第一亚基中，在366位的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)取代，并且在该Fc结构域的第二亚基中，在407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)取代，并且任选地，在366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)取代，并且在368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)取代(根据Kabat EU索引编号)。在另外的方面，在Fc结构域的第一亚基中，354位的丝氨酸残基又被半胱氨酸残基替换(S354C)或356位的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换)，并且在Fc结构域的第二亚基中，349位的酪氨酸残基又被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据KabatEU索引编号)。在优选的方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。

在一些方面，Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一种或多种氨基酸取代。

在特定的方面，Fc受体为Fcγ受体。在一些方面中，Fc受体为人Fc受体。在一些方面中，Fc受体为活化Fc受体。在具体的方面，Fc受体为活化人Fcγ受体，更具体地人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地人FcγRIIIa。在一些方面，效应子功能是选自补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和细胞因子分泌的组中的一种或多种。在特定的方面，效应子功能为ADCC。

通常，在Fc结构域的两个亚基中的每个中都存在相同的一个或多个氨基酸取代。在一些方面，一个或多个氨基酸取代降低了Fc结构域与Fc受体的结合亲和力。在一些方面，一个或多个氨基酸取代将Fc结构域与Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。

在一些方面，Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据KabatEU索引编号)的组的位置处的氨基酸取代。在更具体的方面，Fc结构域包含在选自L234、L235和P329(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处的氨基酸取代。在一些方面中，Fc结构域包含L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)的氨基酸取代。在一些此类方面，Fc结构域为IgG₁Fc结构域，特别是人IgG₁Fc结构域。在一些方面，Fc结构域包含在位置P329的氨基酸取代。在更具体的方面，氨基酸取代为P329A或P329G，特别是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一些方面，Fc结构域包含在位置P329的氨基酸取代，以及在选自E233、L234、L235、N297和P331(根据Kabat EU索引编号)的位置的另一个氨基酸取代。在更具体的方面，另一个氨基酸取代为E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定方面，Fc结构域包含在位置P329、L234和L235(根据Kabat EU索引编号)的氨基酸取代。在更特定的方面，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地，在优选方面中，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据KabatEu索引编号)，即在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每个中，234位的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L234A)，235位的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L235A)，并且329位的脯氨酸残基被甘氨酸残基替换(P329G)(根据Kabat EU索引编号)。在一些此类方面，Fc结构域为IgG₁Fc结构域，特别是人IgG₁Fc结构域。

在一些方面，T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原是癌胚抗原(CEA)。

除非另有说明，否则“癌胚抗原”或“CEA”(也称为癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5))，是指源自任何脊椎动物的任何天然CEA，该脊椎动物包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”、未处理的CEA以及在细胞处理中得到的任何形式的CEA。该术语亦涵盖天然生成的CEA变体，例如，剪接变体或等位基因变体。在一些方面，CEA为人CEA。人CEA的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号P06731或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeqNP_004354.2。在一些方面，CEA是细胞膜结合的CEA。在一些方面，CEA是在细胞表面表达的CEA，例如癌细胞。

结合CEA的用于本发明的有用的T细胞双特异性抗体描述于例如PCT公开号WO2014/131712(通过引用整体并入本文)中。

在一些方面，T细胞双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合部分和结合CEA的第二抗原结合部分。

在一些方面，第一抗原结合部分包含：含有SEQ ID NO:28的重链CDR(HCDR)1、SEQID NO:29的HCDR2和SEQ ID NO:30的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:32的LCDR2和SEQ ID NO:33的LCDR3的轻链可变区。

在一些方面，第二抗原结合部分包含：含有SEQ ID NO:36的重链CDR(HCDR)1、SEQID NO:37的HCDR2和SEQ ID NO:38的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:39的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:40的LCDR2和SEQ ID NO:41的LCDR3的轻链可变区。

在一些方面，CEA CD3双特异性抗体包含

(i)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分结合至CD3并且包含：含有SEQ IDNO:28的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:29的HCDR2和SEQ ID NO:30的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:32的LCDR2和SEQ ID NO:33的LCDR3的轻链可变区；以及

(ii)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分结合至CEA，并且包含：含有SEQ IDNO:36的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:37的HCDR2和SEQ ID NO:38的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:39的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:40的LCDR2和SEQ ID NO:41的LCDR3的轻链可变区。

在一些方面，第一抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ IDNO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:34的重链可变区序列和SEQ ID NO:35的轻链可变区序列。

在一些方面，第二抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:42的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ IDNO:43的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:42的重链可变区序列和SEQ ID NO:43的轻链可变区序列。

在一些方面，T细胞双特异性抗体包含结合CEA和/或由第一和第二亚基组成的Fc结构域的第三抗原结合部分，如本文所述。

在优选的方面，T细胞双特异性抗体包含

(i)结合至CD3的第一抗原结合部分，其包含：含有SEQ ID NO:28的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:29的HCDR2和SEQ ID NO:30的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:32的LCDR2和SEQ ID NO:33的LCDR3的轻链可变区，其中第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变区或恒定区，特别是恒定区是经交换的；

(ii)结合至CEA的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含：含有SEQ IDNO:36的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:37的HCDR2和SEQ ID NO:38的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:39的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:40的LCDR2和SEQ ID NO:41的LCDR3的轻链可变区，其中第二抗原结合部分和第三抗原结合部分各为Fab分子，特别是常规Fab分子；

(iii)由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域，

其中该第二抗原结合部分在该Fab重链的C末端融合至该第一抗原结合部分的该Fab重链的N末端，并且该第一抗原结合部分在该Fab重链的C末端融合至该Fc结构域的该第一亚基的N末端，并且其中该第三抗原结合部分在该Fab重链的C末端融合至该Fc结构域的该第二亚基的N末端。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CEA和CD3)的第一抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:34的重链可变区序列和SEQ ID NO:35的轻链可变区序列。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CEA和CD3)的第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:42的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:43的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含SEQ ID NO:42的重链可变区和SEQ ID NO:43的轻链可变区。

根据上述方面的Fc结构域可以单独或组合地并入上文关于Fc结构域描述的所有特征。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CEA和CD3)的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰，和/或Fc结构域包含减少与Fc受体和/或效应子功能结合的一个或多个氨基酸取代。

在一些方面，抗原结合部分和Fc区通过肽接头彼此融合，特别是通过SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47中的肽接头。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CEA和CD3)包含：含有与SEQ ID NO:44的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；含有与SEQ IDNO:45的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；含有与SEQ ID NO:46的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；以及含有与SEQ ID NO:47的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽。在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CEA和CD3)包含：含有SEQ IDNO:44的序列的多肽(特别是两种多肽)；含有SEQ ID NO:45的序列的多肽；含有SEQ ID NO:46的序列的多肽；以及含有SEQ ID NO:47的序列的多肽。

在优选的方面，T细胞双特异性抗体是cibisatamab(WHO药物信息(药物的国际非专利名称)，推荐的INN：List 80,2018,vol.32,no.3,p.438)。

在一些方面，T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原是HLA-2/WT1。

除非另有说明，否则“WT1”，也称为“Wilms肿瘤1”或“Wilms肿瘤蛋白”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然WT1，该脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”、未处理的WT1以及在细胞处理中得到的任何形式的WT1。该术语还涵盖天然生成的WT1变体，例如，剪接变体或等位基因变体。在一些方面，WT1是人WT1，特别是是SEQ ID NO:21的蛋白质。人WT1描述于UniProt(www.uniprot.org)登录号P19544(输入版本215)中，并且人WT1的氨基酸序列也示于SEQ ID NO:21中。

“VLD”、“VLD肽”或“WT1_VLD”是指具有氨基酸序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO:22；SEQ IDNO:21的WT1蛋白质的37-45位)的WT1衍生肽。

“RMF”、“RMF肽”或“WT1_RMF”意指具有氨基酸序列RMFRNAPYL(SEQ ID NO:23；SEQ IDNO:21的WT1蛋白质的126-134位)的WT1衍生肽。

“HLA-A2”、“HLA-A*02”、“HLA-A02”或“HLA-A*2”(可互换使用)是指HLA-A血清型组中的人白细胞抗原血清型。HLA-A2蛋白质(由相应的HLA基因编码)构成相应的I类MHC(主要组织相容性复合物)蛋白质的α链，其进一步包含β2微球蛋白亚基。特异性HLA-A2蛋白质是HLA-A201(也称为HLA-A0201、HLA-A02.01或HLA-A*02:01)。在特定方面，本文所述的HLA-A2蛋白质是HLA-A201。人HLA-A2的例示性序列于SEQ ID NO:24中给出。

“HLA-A2/WT1”是指HLA-A2分子与WT1衍生肽(在本文中也称为“WT1肽”)，具体地RMF或VLD肽(分别为“HLA-A2/WT1_RMF”和“HLA-A2/WT1_VLD”)的复合物。本发明中使用的双特异性抗体可以与HLA-A2/WT1_RMF或HLA-A2/WT1_VLD复合物特异性结合。

用于本发明的与HLA-A2/WT1结合的有用的T细胞双特异性抗体被描述于例如PCT公开号WO 2019/122052(通过引用整体并入本文)中。

在一些方面，T细胞双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合部分，和结合HLA-A2/WT1，特别是HLA-A2/WT1_RMF的第二抗原结合部分。

在一些方面，第一抗原结合部分包含：含有SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3的轻链可变区。

在一些方面，第二抗原结合部分包含：含有SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3的轻链可变区。

在一些方面，T细胞双特异性抗体包含

(i)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分结合至CD3并且包含：含有SEQ IDNO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3的轻链可变区；以及

(ii)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分结合至HLA-A2/WT1并且包含：含有SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3的轻链可变区。

在一些方面，第一抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ IDNO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列。

在一些方面，第二抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ IDNO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列。

在一些方面，T细胞双特异性抗体包含结合HLA-A2/WT1和/或由第一和第二亚基组成的Fc结构域的第三抗原结合部分，如本文所述。

在优选的方面，T细胞双特异性抗体包含

(i)结合至CD3的第一抗原结合部分，其包含：含有SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3的轻链可变区，其中第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变区或恒定区，特别地可变区是经交换的；

(ii)结合至HLA-A2/WT1的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含：含有SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3的轻链可变区，其中该第二抗原结合部分和该第三抗原结合部分各为Fab分子，特别是为常规Fab分子；

(iii)由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域，

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合HLA-A2/WT1和CD3)的第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中该Fab轻链和该Fab重链的这些可变区是经交换的，并且其中该T细胞双特异性抗体的该第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分是常规Fab分子，其中在该恒定结构域CL中，124位的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且123位的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且在该恒定结构域CH1中，147位的氨基酸是独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且213位的氨基酸独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)取代。

特别是，在上述方面，在(ii)下的第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CL中，124位的氨基酸可被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且123位的氨基酸可被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(特别是被精氨酸(R))取代(根据Kabat编号)，并且在(ii)下的第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸可被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且213位的氨基酸可被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合HLA-A2/WT1和CD3)的第一抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合HLA-A2/WT1和CD3)的第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含SEQ ID NO:15的重链可变区和SEQ ID NO:16的轻链可变区。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合HLA-A2/WT1和CD3)的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰，和/或Fc结构域包含减少与Fc受体和/或效应子功能结合的一个或多个氨基酸取代。

在一些方面，抗原结合部分和Fc区通过肽接头彼此融合，特别是通过SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20中的肽接头。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合HLA-A2/WT1和CD3)包含：含有与SEQ IDNO:17的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；含有与SEQ ID NO:18的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；含有与SEQ ID NO:19的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；以及含有与SEQ ID NO:20的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽。在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合HLA-A2/WT1和CD3)包含：含有SEQ ID NO:17的序列的多肽(特别是两种多肽)；含有SEQ ID NO:18的序列的多肽；含有SEQ ID NO:19的序列的多肽；以及含有SEQ ID NO:20的序列的多肽。

在一些方面，T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原是CD20。

除非另有说明，否则“CD20”，也称为“B淋巴细胞抗原B1”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD20，该脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”、未处理的CD20以及在细胞处理中得到的任何形式的CD20。该术语还涵盖天然生成的CD20变体，例如，剪接变体或等位基因变体。在一些方面，CD20为人CD20。人CD20描述于UniProt(www.uniprot.org)登录号P11836(输入版本200)中，并且人CD20的氨基酸序列也示于SEQ ID NO:60中。

用于本发明与CD20结合的有用的T细胞双特异性抗体被描述于例如PCT公开号WO2016/020309(通过引用整体并入本文)中。

在一些方面，T细胞双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合部分和结合CD20的第二抗原结合部分。

在一些方面，第二抗原结合部分包含：含有SEQ ID NO:48的重链CDR(HCDR)1、SEQID NO:49的HCDR2和SEQ ID NO:50的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:51的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:52的LCDR2和SEQ ID NO:53的LCDR3的轻链可变区。

在一些方面，T细胞双特异性抗体包含

(ii)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分结合至CD20并且包含：含有SEQ IDNO:48的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:49的HCDR2和SEQ ID NO:50的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:51的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:52的LCDR2和SEQ ID NO:53的LCDR3的轻链可变区。

在一些方面，第二抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:54的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ IDNO:55的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:54的重链可变区序列和SEQ ID NO:55的轻链可变区序列。

在一些方面，T细胞双特异性抗体包含结合CD20和/或由第一和第二亚基组成的Fc结构域的第三抗原结合部分，如本文所述。

在优选的方面，T细胞双特异性抗体包含

(i)结合至CD3的第一抗原结合部分，其包含：含有SEQ ID NO:28的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:29的HCDR2和SEQ ID NO:30的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:32的LCDR2和SEQ ID NO:33的LCDR3的轻链可变区，其中第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变区或恒定区，特别地可变区是经交换的；

(ii)结合至CD20的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含：含有SEQ IDNO:48的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:49的HCDR2和SEQ ID NO:50的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:51的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:52的LCDR2和SEQ ID NO:53的LCDR3的轻链可变区；其中该第二抗原结合部分和该第三抗原结合部分各为Fab分子，特别是常规Fab分子；

(iii)由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域，

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD20和CD3)的第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中该Fab轻链和该Fab重链的这些可变区是经交换的，并且其中该T细胞双特异性抗体的该第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分是常规Fab分子，其中在该恒定结构域CL中，124位的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且123位的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且在该恒定结构域CH1中，147的氨基酸是独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且213位的氨基酸独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)取代。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD20和CD3)的第一抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:34的重链可变区序列和SEQ ID NO:35的轻链可变区序列。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD20和CD3)的第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:54的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含SEQ ID NO:54的重链可变区和SEQ ID NO:55的轻链可变区。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD20和CD3)的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰，和/或Fc结构域包含减少与Fc受体和/或效应子功能结合的一个或多个氨基酸取代。

在一些方面，抗原结合部分和Fc区通过肽接头彼此融合，特别是通过SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:59中的肽接头。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD20和CD3)包含：含有与SEQ ID NO:56的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；含有与SEQ IDNO:57的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；含有与SEQ ID NO:58的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；以及含有与SEQ ID NO:59的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽。在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD20和CD3)包含：含有SEQ IDNO:56的序列的多肽(特别是两种多肽)；含有SEQ ID NO:57的序列的多肽；含有SEQ ID NO:58的序列的多肽；以及含有SEQ ID NO:59的序列的多肽。

在优选的方面，T细胞双特异性抗体是glofitamab(WHO药物信息(药物的国际非专利名称)，推荐的INN：List 83,2020,vol.34,no.1,p.39)。

在一些方面，T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原是CD19。

除非另有说明，否则术语“CD19”代表分化簇19(也称为B淋巴细胞抗原CD19或B淋巴细胞表面抗原B4)，并且是指源自任何脊椎动物的任何天然CD19，该脊椎动物包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”、未处理的CD19以及在细胞处理中得到的任何形式的CD19。该术语还涵盖天然生成的CD19变体，例如，剪接变体或等位基因变体。在一些方面，CD19为人CD19。另见人蛋白质UniProt(www.uniprot.org)登录号P15391(版本211)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_001761.3。人CD19的例示性序列于SEQ ID NO:81中给出。

结合CD19的用于本发明的有用的T细胞双特异性抗体描述于例如EP申请号20181056.1和20180968.8(通过引用整体并入本文)中。

在一些方面，T细胞双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合部分和结合CD19的第二抗原结合部分。

在一些方面，第一抗原结合部分包含：含有SEQ ID NO:61的重链CDR(HCDR)1、SEQID NO:29的HCDR2和SEQ ID NO:62的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:32的LCDR2和SEQ ID NO:33的LCDR3的轻链可变区。

在其他方面，第一抗原结合部分包含：含有SEQ ID NO:64的重链CDR(HCDR)1、SEQID NO:29的HCDR2和SEQ ID NO:65的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:32的LCDR2和SEQ ID NO:33的LCDR3的轻链可变区。

在一些方面，第二抗原结合部分包含：含有SEQ ID NO:67的重链CDR(HCDR)1、SEQID NO:68的HCDR2和SEQ ID NO:69的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:70的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:71的LCDR2和SEQ ID NO:72的LCDR3的轻链可变区。

在一些方面，T细胞双特异性抗体包含

(i)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分结合至CD3并且包含：含有SEQ IDNO:61的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:29的HCDR2和SEQ ID NO:62的HCDR3的重链可变区，或含有SEQ ID NO:64的HCDR1、SEQ ID NO:29的HCDR2和SEQ ID NO:65的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:32的LCDR2和SEQ ID NO:33的LCDR3的轻链可变区；以及

(ii)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分结合至CD19并且包含：含有SEQ IDNO:67的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:68的HCDR2和SEQ ID NO:69的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:70的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:71的LCDR2和SEQ ID NO:72的LCDR3的轻链可变区。

在一些方面，第一抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或重链可变区序列，其与SEQ IDNO:66的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:63的重链可变区序列或SEQ ID NO:66的重链可变区序列和SEQ ID NO:35的轻链可变区序列。

在一些方面，第二抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ IDNO:74的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:73的重链可变区序列和SEQ ID NO:74的轻链可变区序列。

在一些方面，T细胞双特异性抗体包含结合CD19和/或由第一和第二亚基组成的Fc结构域的第三抗原结合部分，如本文所述。

在优选的方面，T细胞双特异性抗体包含

(i)结合至CD3的第一抗原结合部分，其包含：含有SEQ ID NO:61的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:29的HCDR2和SEQ ID NO:62的HCDR3的重链可变区，或含有SEQ ID NO:64的HCDR1、SEQ ID NO:29的HCDR2和SEQ ID NO:65的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:32的LCDR2和SEQ ID NO:33的LCDR3的轻链可变区，其中第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区，特别是可变区是经交换的；

(ii)结合至CD19的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含：含有SEQ IDNO:67的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:68的HCDR2和SEQ ID NO:69的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:70的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:71的LCDR2和SEQ ID NO:72的LCDR3的轻链可变区；其中该第二抗原结合部分和该第三抗原结合部分各为Fab分子，特别是常规Fab分子；

(iii)由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域，

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD19和CD3)的第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中该Fab轻链和该Fab重链的这些可变区是经交换的，并且其中该T细胞双特异性抗体的该第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分是常规Fab分子，其中在该恒定结构域CL中，124位的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且123位的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且在该恒定结构域CH1中，147的氨基酸是独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且213位的氨基酸独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)取代。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD19和CD3)的第一抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或重链可变区序列，其与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:63的重链可变区序列或SEQ ID NO:66的重链可变区序列和SEQ ID NO:35的轻链可变区序列。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD19和CD3)的第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含：重链可变区序列，其与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；以及轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含SEQ ID NO:73的重链可变区和SEQ ID NO:74的轻链可变区。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD19和CD3)的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰，和/或Fc结构域包含减少与Fc受体和/或效应子功能结合的一个或多个氨基酸取代。

在一些方面，抗原结合部分和Fc区通过肽接头彼此融合，特别是通过SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77中的肽接头。

在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD19和CD3)包含：含有与SEQ ID NO:78的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；含有与SEQ IDNO:75的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；含有与SEQ ID NO:77的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；以及含有与SEQ ID NO:79的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽。在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD19和CD3)包含：含有SEQ IDNO:78的序列的多肽(特别是两种多肽)；含有SEQ ID NO:75的序列的多肽；含有SEQ ID NO:77的序列的多肽；以及含有SEQ ID NO:79的序列的多肽。

在其他方面，T细胞双特异性抗体(结合CD19和CD3)包含：含有与SEQ ID NO:78的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；含有与SEQ IDNO:76的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；含有与SEQ ID NO:77的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽；以及含有与SEQ ID NO:80的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多肽。在一些方面，T细胞双特异性抗体(结合CD19和CD3)包含：含有SEQ IDNO:78的序列的多肽(特别是两种多肽)；含有SEQ ID NO:76的序列的多肽；含有SEQ ID NO:77的序列的多肽；以及含有SEQ ID NO:80的序列的多肽。

在一些方面，所述疾病(待由T细胞双特异性抗体治疗)是癌症。

如本文所用，“治疗”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating))，是指试图改变待治疗个体的疾病自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、缓解或改善预后。

术语“癌症”是指通常以不受调节的细胞增殖为特征的哺乳动物生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。癌症的更多非限制性实例包括血液学癌症(诸如白血病)、膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、胆管癌、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、肉瘤、骨癌和肾癌。其他细胞增殖性疾患包括但不限于位在以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部和泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌症转移。

在一些方面，癌症是表达T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原的癌症。

在一些方面，癌症是表达癌胚抗原(CEA)的癌症(特别是在一些方面，其中T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原是CEA)。“CEA阳性癌症”或“表达CEA的癌症”是指特征在于癌细胞上CEA表达或过表达的癌症。CEA的表达可以通过例如免疫组织化学(IHC)或流式细胞术测定来确定。在一些方面，癌症表达CEA。在一些方面，癌症在至少20％、优选至少50％或至少80％的肿瘤细胞中表达CEA，如使用CEA特异性抗体通过免疫组织化学(IHC)所确定。

在一些方面，癌症是结肠癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、前列腺癌或本文所述的其他癌症。

在特定方面，癌症是选自由结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌和胃癌所组成的组的癌症。在优选的方面，癌症为结肠直肠癌(CRC)。在一些方面，结肠直肠癌为转移性结肠直肠癌(mCRC)。在一些方面，结肠直肠癌是微卫星稳定(MSS)的结肠直肠癌。在一些方面，结肠直肠癌是微卫星稳定的转移性结肠直肠癌(MSS mCRC)。

在一些方面，癌症是表达Wilms肿瘤蛋白(WT1)的癌症(特别是在一些方面，其中T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原是HLA-A2/WT1)。“WT1阳性癌症”或“表达WT1的癌症”是指特征在于癌细胞中WT1表达或过表达的癌症。WT1的表达可以通过例如定量实时PCR(测量WT1mRNA水平)、流式细胞术、免疫组织化学(IHC)或蛋白印迹法来确定。在一些方面，癌症表达WT1。在一些方面，癌症在至少20％、优选至少50％或至少80％的肿瘤细胞中表达WT1，如使用WT1特异性抗体通过免疫组织化学(IHC)确定。

在一些方面，癌症为血液学癌症。血液学癌症的非限制性实例包括：白血病(例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL))、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤(MM))、骨髓增生异常综合征(MDS)和骨髓增生性疾病。

在某些方面，癌症选自由以下项所组成的组：血液学癌症(诸如白血病)、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌和前列腺癌。

在特定方面，癌症是血液学癌症，特别是是白血病，最特别是是急性淋巴细胞性白血病(ALL)或急性骨髓性白血病(AML)。在优选的方面，癌症是急性骨髓性白血病(AML)。在另外的特定方面，癌症是骨髓增生异常综合征(MDS)。

在一些方面，癌症是表达CD20的癌症(特别是在一些方面，其中T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原是CD20)。“CD20阳性癌症”或“表达CD20的癌症”是指特征在于癌细胞中CD20表达或过表达的癌症。CD20的表达可以通过例如定量实时PCR(测量CD20 mRNA水平)、流式细胞术、免疫组织化学(IHC)或蛋白印迹法来确定。在一些方面，癌症表达CD20。在一些方面，癌症在至少20％、优选至少50％或至少80％的肿瘤细胞中表达CD20，如使用CD20特异性抗体通过免疫组织化学(IHC)确定。

在一些方面，癌症是B细胞癌，特别是CD20阳性B细胞癌。在一些方面，癌症选自由以下项所组成的组：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、多发性骨髓瘤(MM)或霍奇金淋巴瘤(HL)。在特定方面，癌症选自由以下项所组成的组：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和边缘区淋巴瘤(MZL)。在更特定的方面，癌症是NHL，特别是复发性/难治性(r/r)NHL。在一些方面，癌症为DLBCL。在一些方面，癌症为FL。在一些方面，癌症为MCL。在一些方面，癌症为MZL。

在一些方面，癌症是表达CD19的癌症(特别是在一些方面，其中T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原是CD19)。“CD19阳性癌症”或“表达CD19的癌症”是指特征在于癌细胞中CD19表达或过表达的癌症。CD19的表达可以通过例如定量实时PCR(测量CD19 mRNA水平)、流式细胞术、免疫组织化学(IHC)或蛋白印迹法来确定。在一些方面，癌症表达CD19。在一些方面，癌症在至少20％、优选至少50％或至少80％的肿瘤细胞中表达CD19，如使用CD19特异性抗体通过免疫组织化学(IHC)确定。

在一些方面，癌症是B细胞癌，特别是CD19阳性B细胞癌。在一些方面，癌症是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。在一些方面，癌症为非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。

在一些方面，癌症可由T细胞双特异性抗体治疗。在一些方面，T细胞双特异性抗体适用于治疗癌症。

在一些方面，癌症是实体瘤癌症。“实体瘤癌症”是指形成位于患者体内特定位置的离散肿瘤块(也包括肿瘤转移)的恶性肿瘤，诸如肉瘤或癌(与例如血癌诸如白血病相反，其通常不形成实体瘤)。实体瘤癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、肝癌和肾癌。在本发明的背景下考虑的其他实体瘤癌症包括但不限于位在以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、肌肉、脾脏、胸部和泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌症转移。

在一些方面，其中T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原是CD19，所述疾病(待由T细胞双特异性抗体治疗)是自身免疫性疾病。在具体的方面，自身免疫性疾病为狼疮，特别是系统性红斑狼疮(SLE)或狼疮肾炎(LN)。

本文“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人类灵长类动物诸如猴)、兔以和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，受试者或个体为人。在一些方面，个体患有疾病，特别是可由T细胞双特异性抗体治疗或待治疗的疾病。在一些方面，个体患有癌症，特别是可由T细胞双特异性抗体治疗或待治疗的癌症。特别地，本文中的个体是正在经历或已经经历癌症的一种或多种体征、症状或其他指标的有资格接受治疗的任何单一人类受试者。在一些方面，个体患有癌症或已被诊断患有癌症，特别是上文所述的任何癌症。在一些方面，个体患有局部晚期或转移性癌症或已被诊断患有局部晚期或转移性癌症。个体之前可能已经接受过T细胞双特异性抗体或另一种药物治疗，或者没有接受过这种治疗。在特定方面，患者之前没有接受过T细胞双特异性抗体治疗。在开始T细胞双特异性抗体疗法之前，患者可能已经接受过包含一种或多种药物而不是T细胞双特异性抗体的疗法的治疗。

在一些方面，个体的一种或多种细胞因子的血清水平升高。在一些方面，该升高的血清水平与向个体施用T细胞双特异性抗体有关。该升高的血清水平特别是与健康个体的血清水平和/或未施用T细胞双特异性抗体的个体(包括同一个体)中的血清水平相比(即在这种情况下血清水平与未施用T细胞双特异性抗体的血清水平相比升高)。在一些方面，该一种或多种细胞因子选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β所组成的组。

根据本发明任一方面的细胞因子优选为促炎细胞因子，特别是选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和Il-1β所组成的组的一种或多种细胞因子。在一些方面，细胞因子为IL-2。在一些方面，细胞因子为TNF-α。在一些方面，细胞因子为IFN-γ。在一些方面，细胞因子为IL-6。在一些方面，细胞因子为IL-1β。

优选地，根据本发明的任何方面的T细胞为细胞毒性T细胞。在一些方面，T细胞为CD4⁺或CD8⁺T细胞。在一些方面，T细胞为CD4⁺T细胞。

在一些方面，用T细胞双特异性抗体治疗或施用T细胞双特异性抗体可导致个体中的反应。在一些方面，反应可以是完全反应。在一些方面，反应可以是治疗停止后的持续反应。在一些方面，反应可以是治疗停止后持续的完全反应。在其他方面，反应可以是部分反应。在一些方面，反应可以是治疗停止后持续的部分反应。在一些方面，与单独使用T细胞双特异性抗体的治疗或施用T细胞双特异性抗体(即不使用TKI)相比，使用T细胞双特异性抗体的治疗或施用T细胞双特异性抗体和TKI可以改善反应。在一些方面，与单独用T细胞双特异性抗体(即，没有TKI)治疗的相应患者群体相比，T细胞双特异性抗体和TKI的治疗或施用可以增加患者群体中的反应率。

T细胞双特异性抗体可单独或连同其他药剂用于治疗。例如，T细胞双特异性抗体可以与至少一种附加治疗剂联合施用。在某些方面，附加治疗剂是抗癌剂，例如化疗剂、肿瘤细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞凋亡活化剂。

氨基酸序列

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附图说明

图1.在100nM至0nM不同浓度的达沙替尼存在下，10nM HLA-A2WT-1-TCB实时杀伤装载有RMF肽的红色萤光A375细胞(A)以及1nM CEA-TCB实时杀伤红色萤光MKN45细胞(B)。(A)用RMF肽脉冲作用于A375 NucLight Red(NLR)靶细胞(杀伤测定前2小时)，并与HLA-A2WT1-TCB、达沙替尼(dasa)和PBMC共培养，效应子与标靶比(E:T)＝10:1(E:T＝50000PBMC：5000靶细胞)。杀伤之后是

(每3小时扫描1次，放大10x，相位和红色为400ms采集时间)。通过将t＝0小时的值的总红色区域和每个时间点的靶细胞+PBMC+达沙替尼(不含TCB)对照孔进行标准化来测量杀伤百分比。1位供体的技术重复平均值+/-SEM。(B)MKN45 NLR靶细胞与CEA TCB、达沙替尼和PBMC共培养，E:T＝10:1(E:T＝50 000PBMC：5000靶细胞)。杀伤之后是Incucyte(每3小时扫描1次，放大10x，相位和红色为400ms采集时间)。通过将t＝0小时的值的总红色区域和每个时间点的靶细胞+PBMC+达沙替尼对照孔进行标准化来测量杀伤百分比。1位供体的技术重复平均值+/-SEM。

图2.细胞因子释放。在图1中的测定终点(96小时)收集上清液，并通过多重细胞因子分析(Luminex)测量细胞因子((A)IFNγ、(B)IL-2、(C)TNF-α)。1nM CEA-TCB，1个供体。

图3.体外杀伤测定设置和时间表。将PBMC与SKM-1靶细胞(E:T＝10:1)和10nMHLA-A2 WT-1-TCB共培养。活化24小时后加入达沙替尼(100nM)。PBMC用CellTrace^TMViolet(CTV)标记以允许T细胞增殖评估。

图4.T细胞活化。根据图3的测定，在存在和不存在达沙替尼的情况下活化24小时和48小时后，通过FACS测量CD4+和CD8+ T细胞上CD25和CD69的表达。(A)CD8+ T细胞上的CD25表达，(B)CD4+ T细胞上的CD25表达，(C)CD8+ T细胞上的CD69表达，(D)CD4+ T细胞上的CD69表达。

图5.细胞因子释放。在24小时和48小时从图3的测定中收集上清液，并使用多重试剂盒(Luminex)测量细胞因子(IFN-γ(A)、TNF-α(B)和IL-2(C))。3个供体的平均值+/-SD。

图6.T细胞增殖。在图3的测定中，通过分析CTV染料稀释度，在用HLA-A2 WT-1TCB刺激144小时后，通过FACS测量CD4+(A)和CD8+(B)T细胞的增殖。

图7.CD4+和CD8+ T细胞的计数。在图3的测定中，CD4+(A)和CD8+(B)T细胞计数通过FACS测量，3个供体的平均值+/-SD。配对t检验，单尾p值：0.1234(ns)，0.0332(*)，0.0021(**)，0.0002(***)，<0.0001(****)。

图8.体外杀伤测定设置和时间表。将PBMC与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的SKM-1靶细胞(E:T＝5:1)和10nM HLA-A2 WT-1-TCB共培养20小时。在存在或不存在100nM达沙替尼的情况下，洗涤活化的PBMC并在新鲜的、CTV标记的SKM-1靶细胞(E:T＝5:1)和10nM HLA-A2 WT-1-TCB上重新刺激活化的PBMC。

图9.根据图8的测定，使用和不使用达沙替尼用HLA-A2 WT-1TCB刺激后和用HLA-A2 WT-1-TCB重新刺激之前的20小时处的T细胞活化。通过FACS测量CD4+和CD8+ T细胞上的CD69和CD25表达。数据显示为3个供体的平均值+/-SEM。(A)CD8+ T细胞上的CD69表达，(B)CD8+ T细胞上的CD25表达，(C)CD4+ T细胞上的CD69表达，(D)CD4+T细胞上的CD25表达。

图10.在不存在达沙替尼的情况下(左)，用10nM HLA-A2 WT-1-TCB进行第一次刺激以及在存在100nM达沙替尼的情况下(右)，用10nM HLA-A2 WT-1-TCB进行第二次刺激时的SKM-1靶细胞活性。在图8的测定中44小时后通过FACS测量靶细胞活性。死的CFSE标记的SKM-1细胞在阳性近红外(NIR)细胞上被门控(左侧)。死的CTV标记的SKM-1细胞在阳性NIR细胞上被门控(右侧)。

图11.HLA-A2 WT-1-TCB对死的CFSE和CTV SKM-1细胞的剂量反应，用于在图8的测定中在存在和不存在达沙替尼的情况下进行第一次和第二次刺激。3个供体的平均值+/-SEM，双尾配对t检验(对每个浓度)，双尾p值：0.1234(ns)，0.0332(*)，0.0021(**)，0.0002(***)，<0.0001(****)。

图12.用HLA-A2 WT-1-TCB在有和没有达沙替尼的情况下进行第二次刺激后的细胞因子释放。在第二次刺激后24小时收集来自图8的杀伤测定的上清液，并用多重细胞因子试剂盒(Luminex技术)测量IFN-γ(A)、TNF-α(B)和IL-2(C)。n＝3个供体。

图13.评估T细胞脱粒的体外杀伤测定设置和时间表。在存在和不存在100nM达沙替尼的情况下，将PBMC与SKM-1靶细胞(E:T＝5:1)和10nM HLA-A2 WT-1-TCB共培养。在用TCB活化后3小时加入Golgistop和Golgiplug(两者均为BD)以及CD107a抗体，以防止细胞因子外化。

图14.在图13的测定中，一名代表性供体在存在和不存在达沙替尼的情况下，CD4+和CD8+ T细胞中的CD107a+群体。在24小时通过FACS测量CD4+和CD8+ T细胞上的CD107a的表达。

图15.在图13的测定中，在存在和不存在达沙替尼的情况下CD4+(A)和CD8+(B)T细胞中的CD107a+细胞的百分比。在24小时通过FACS测量CD4+和CD8+ T细胞上的CD107a的表达。3个供体的平均值，+/-SD。

图16.体外杀伤测定设置和时间表。PBMC在MKN45 NLR(E:T＝10:1)靶细胞上用1nMCEA-TCB刺激96小时。在存在25nM达沙替尼的情况下，洗涤活化的PBMC并且在新的MKN45NLR靶细胞(E:T＝10:1)上用1nM CEA-TCB重新刺激活化的PBMC 72小时。洗涤活化的PBMC以去除达沙替尼，并在新的MKN45 NLR靶细胞(E:T＝10:1)上用1nM CEA-TCB(“ON/OFF/ON”，见表的上一行)重新刺激活化的PBMC，反之亦然(“OFF/ON/OFF”，见表的下一行)。杀伤之后是

图17.在图16的测定中，在存在25nM达沙替尼(0-72h)时的第一次刺激和不存在25nM达沙替尼(96-170h)时的重新刺激，通过CEA-TCB实时杀伤MKN45 NLR靶细胞(“OFF/ON”)。

图18.在图16的测定中，在存在25nM达沙替尼的情况下的第一次刺激后以及在不存在达沙替尼的情况下的第二次刺激后，测定上清液中的细胞因子水平(“OFF/ON”)。用多重细胞因子试剂盒(Luminex技术)测量细胞因子((A)IFN-γ、(B)IL-2、(C)TNF-α)。1个供体。

图19.在图16的测定中，通过CEA-TCB实时杀伤MKN45 NLR靶细胞(“ON/OFF/ON”)。

图20.在图16的测定中，在不存在25nM达沙替尼的情况下的第一次刺激后以及在存在25nM达沙替尼的情况下的第二次刺激后，测定上清液中的细胞因子水平(“ON/OFF”)。用多重细胞因子试剂盒(Luminex技术)测量细胞因子((A)IFN-γ、(B)IL-2、(C)TNF-α)。1个供体。

图21.CEA-TCB介导的靶细胞杀伤。(A)PBMC在MKN45 NLR(E:T＝10:1)靶细胞上用1nM CEA-TCB在存在和不存在达沙替尼的情况下刺激96小时。(B)洗涤活化的PBMC以去除达沙替尼，并在新的MKN45 NLR靶细胞(E:T＝10:1)上用1nM CEA-TCB重新刺激活化的PBMC。杀伤之后是

图22.细胞因子释放。在图16的测定中，第一次和第二次刺激后收集上清液，并使用多重细胞因子试剂盒(Luminex)测量细胞因子((A)TNF-α、(B)IFN-γ、(C)IL-2)。

图23.体外杀伤测定设置和时间表。将PBMC与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的Z138靶细胞(E:T＝5:1)和10nM 1nM CD20-TCB共培养20小时。在存在或不存在100nM达沙替尼的情况下，洗涤活化的PBMC并在新的、CTV标记的Z138靶细胞(E:T＝5:1)和1nMCD20-TCB上重新刺激活化的PBMC。

图24.在图23的测定中，在存在和不存在100nM达沙替尼的情况下，用1nM CD20-TCB第一次和第二次刺激时的死的Z138细胞，如通过流式细胞术测量的。第一次刺激后20小时和第二次刺激后24小时收集细胞，并用活/死NIR染料(live dead NIR dye)染色。技术重复的平均值，+/-SD。N＝3个供体。

图25.在图23的测定中，在存在和不存在100nM达沙替尼的情况下，用1nM CD20-TCB第二次刺激死的Z138细胞，如通过流式细胞术测量的。在第二次刺激后24小时收集细胞并用活/死NIR染料染色。技术重复的平均值，+/-SD。三个供体D1-D3(A-C)。

图26.体外杀伤测定设置。PBMC与CellTrace^TMViolet(CTV)标记的SUDLH-8肿瘤细胞(E:T＝10:1)共培养，并在存在和不存在100nM达沙替尼的情况下增加CD19-TCB的浓度。

图27.100nM达沙替尼防止CD19-TCB杀伤CTV标记的SUDLH-8细胞。SUDLH-8肿瘤细胞的杀伤通过流式细胞术使用Live Dead Near InfraRed(NIR)染料进行测量，允许在图26中描述的测定中排除死细胞(24小时)。n＝3个供体的平均值，+SD。单因素方差分析、Friedman检验、p值：0.1234(ns)，0.0332(*)，0.0021(**)，0.0001(***)，<0.0001(****)。

图28.100nM达沙替尼防止CD19-TCB诱导的CD4+ T细胞活化。在图26中描述的测定中在24小时，通过流式细胞术测量在CD4+ T细胞上CD69(A)和CD25(B)的表达。n＝3个供体的平均值，+SD。单因素方差分析、Friedman检验、p值：0.1234(ns)，0.0332(*)，0.0021(**)，0.0001(***)，<0.0001(****)。

图29.100nM达沙替尼防止CD19-TCB诱导的CD8+ T细胞活化。在图26中描述的测定中在24小时，通过流式细胞术测量在CD8+ T细胞上CD69(A)和CD25(B)的表达。n＝3个供体的平均值，+SD。单因素方差分析、Friedman检验、p值：0.1234(ns)，0.0332(*)，0.0021(**)，0.0001(***)，<0.0001(****)。

图30.100nM达沙替尼防止CD19-TCB诱导的细胞因子释放。在图26中描述的测定的上清液中，通过Luminex测量IL-2(A)、IFN-γ(B)、TNF-α(C)、IL-6(D)、GM-CSF(E)和IL-8(F)的水平。3个代表性供体中的1个。

图31.100nM达沙替尼防止由1nM CD19-TCB诱导的细胞因子释放。在图26中描述的测定的上清液中，通过Luminex测量IFN-γ(A)、TNF-α(B)、IL-2(C)、IL-6(D)、GM-CSF(E)和IL-8(F)的水平。n＝3个供体的平均值，+/-SEM。

图32.评估达沙替尼(50mg/kg)对人源化NSG小鼠中CD19-TCB诱导的细胞因子释放和B细胞耗竭的影响的体内实验的时间表和给药方案。人源化NSG小鼠每天两次用0.5mg/kgCD19-TCB(i.v.)和50mg/kg达沙替尼(p.o.)共治疗。在用CD19-TCB治疗后1.5小时、6小时和48小时，通过尾静脉出血收集血液。在第72小时，在实验终止前，经眶后收集血液。每组N＝4只小鼠。

图33.从图32中描述的实验中，达沙替尼防止小鼠血液中CD19-TCB依赖性B细胞耗竭。在用媒介物(A)、0.5mg/kg CD19-TCB(B)或0.5mg/kg CD19-TCB和50mg/kg达沙替尼(C)治疗的动物血液中(48小时)，人CD45+细胞中门控的CD20+B细胞的代表性流式细胞术点图。

图34.达沙替尼防止CD19-TCB依赖性B细胞耗竭，直至体内治疗后48小时。在来自图32中描述的实验的动物血液中在48小时(A)和72小时(B)通过流式细胞术，测量CD20+B细胞计数。n＝4只小鼠的平均值，+/-SEM。单因素方差分析、Kruskal Wallis检验、p值：0.1234(ns)，0.0332(*)，0.0021(**)，0.0001(***)，<0.0001(****)。

图35.达沙替尼防止CD19-TCB诱导的体内细胞因子释放。从在图32中描述的实验中用CD19-TCB治疗后1.5小时收集的血样中收集血清。通过Luminex测量IL-2(A)、TNF-α(B)、IFN-γ(C)和IL-6(D)的水平。n＝4只小鼠的平均值，+/-SEM。单因素方差分析、KruskalWallis检验、p值：0.1234(ns)，0.0332(*)，0.0021(**)，0.0001(***)，<0.0001(****)。

图36.达沙替尼防止CD19-TCB诱导的体内细胞因子释放。从在图32中描述的实验中用CD19-TCB治疗后6小时收集的血样中收集血清。通过Luminex测量IL-2(A)、TNF-α(B)、IFN-γ(C)和IL-6(D)的水平。n＝4只小鼠的平均值，+/-SEM。单因素方差分析、KruskalWallis检验、p值：0.1234(ns)，0.0332(*)，0.0021(**)，0.0001(***)，<0.0001(****)。

图37.人源化NSG小鼠移植了淋巴瘤PDX(500万个细胞，s.c.)。当肿瘤体积达到200mm³时，根据肿瘤大小将小鼠随机分为8组或7组。他们用媒介物(i.v.)、0.5mg/kg CD19-TCB(i.v.)作为单一疗法、20mg/kg达沙替尼(p.o.)单独或与0.5mg/kg CD19-TCB(i.v.)联合治疗。在第一次用CD19-TCB治疗后6小时，通过尾静脉出血收集媒介物、CD19-TCB和CD19-TCB+达沙替尼组中每只小鼠的血清以及达沙替尼组中n＝4只小鼠的血清。

图38.图37中描述的实验中每只个体小鼠中的细胞因子水平。使用Luminex通过多重细胞因子分析测量血清中IFN-γ(A)、TNF-α(B)、IL-2(C)和IL-6(D)的水平。n＝6-8只小鼠的平均值+/-SEM，其中*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，通过单因素方差分析(Kruskal Wallis检验)。

图39.图37中描述的实验中每只个体小鼠的体重减轻。体重的变化[％]测量为每只小鼠第一次用CD19-TCB治疗前体重的百分比。框和须显示每组n＝6-8只小鼠的最小值到最大值。

图40.图37中描述的实验的肿瘤生长曲线。从使用卡尺测量的肿瘤体积中绘制肿瘤生长曲线，n＝6-8只小鼠的平均值+SD，**p≤0.01，通过单因素方差分析(KruskalWallis检验)。

具体实施方式

实例

以下为本发明的方法和组合物的实例。应当理解，鉴于上文给出的一般描述，可以实施各种其他方面。

实例1.达沙替尼是药理学相关剂量下TCB介导的靶细胞杀伤的有效抑制剂

为了评估达沙替尼对TCB介导的靶细胞杀伤的抑制作用，我们在补充有不断升高的达沙替尼浓度的培养基中使用外周血单核细胞(PBMC)、NucLight Red(NLR)靶细胞和相应的TCB进行了杀伤测定。

system(Essen Bioscience)用于捕获红色萤光蛋白信号随时间的丢失，作为靶细胞杀伤的读数。浓度为100nM(48.8ng/mL)和50nM(24.4ng/mL)的达沙替尼分别对1nM CEA-TCB(SEQ ID NO 28-47)产生90.4％和88.2％的靶细胞杀伤抑制以及分别对10nM HLA-A2 WT1-TCB(SEQ ID NO 1-20)产生86.5％和89.0％的靶细胞杀伤抑制(图1)。浓度为12.5nM的达沙替尼对1nM CEA-TCB产生69％的靶细胞杀伤抑制，对10nMHLA-A2 WT-1-TCB产生78.2％的靶细胞杀伤抑制。对于低于12.5nM的浓度，达沙替尼与1nMCEA-TCB和10nM HLA-A2 WT-1-TCB组合仅部分抑制杀伤(图1)。此外，在1nM CEA-TCB时，用高于12.5nM的达沙替尼浓度进行治疗防止IFN-γ、IL-2和TNF-α的释放，这与较低浓度的达沙替尼和未添加达沙替尼的阳性对照相反(图2)。总体而言，该数据表明达沙替尼可以有效地阻止由高于12.5nM的体外浓度阈值的两种TCB刺激的PBMC触发的T细胞介导的靶细胞裂解。

然后，我们验证了导致靶细胞杀伤抑制的达沙替尼的体外剂量是否会转化为使用批准的达沙替尼剂量方案获得的药理学活性剂量之一。因此，我们将体外剂量与暴露于达沙替尼不同标记药理学剂量的患者中的PK参数C_min、C_max和稳态浓度进行了比较。Wang等人报道，来自146名接受100mg达沙替尼QD治疗的患者的PK参数与2.61ng/mL的C_min值和54.6ng/mL的C_max值相关(Wang等人，Clinical Pharmacology:advances and applications(2013)5,85-97)。因此，12.5nM(6ng/mL)的体外剂量似乎可转化为每天一次(QD)100mg的达沙替尼给药方案，因此达沙替尼在药理学标记剂量下有效预防不期望的TCB介导的靶细胞杀伤。

实例2.达沙替尼迅速关闭TCB诱导的T细胞功能

为了评估达沙替尼是否可以作为活化T细胞的快速且有效抑制剂，我们首先用HLA-A2 WT-1-TCB刺激SKM-1肿瘤细胞上的PBMC 24小时。然后我们用100nM达沙替尼补充这些活化的效应细胞(图3)。在24小时在CD8+和CD4+ T细胞上CD69和CD25的表达显示了用10nM HLA-A2 WT-1TCB刺激的T细胞的部分活化表型(图4)。在用10nM HLA-A2 WT-1-TCB活化24小时后，这些杀伤测定的上清液中也发现了IFN-γ、TNF-α和IL-2，揭示了T细胞活化(图5)。

在24小时添加100nM达沙替尼后，发现48小时CD4+和CD8+ T细胞上早期活化标志物CD69和晚期活化标志物CD25的表达处于无达沙替尼治疗的样品中介于24小时测量的表现与48小时测量的表达之间的中间水平(图4)。与未用达沙替尼治疗的样品相比，在48小时测量的CD4+和CD8+ T细胞上的CD25和CD69表达突出表明，添加100nM达沙替尼迅速阻断表型活化标志物的表达。

我们还查看了在48小时杀伤测定的上清液中发现的细胞因子水平，以评估达沙替尼对T细胞介导的细胞因子释放的影响。有趣的是，与在48小时未接受达沙替尼的阳性对照相反，在24小时(0nM达沙替尼)和48小时(100nM达沙替尼)测量的IFN-γ、TNF-α和IL-2水平没有观察到差异(图5)。这表明在24小时添加100nM达沙替尼迅速阻止细胞因子从活化的T细胞中释放。

此外，我们在杀伤测定中加入100nM达沙替尼120小时后，我们通过流式细胞术测量CellTrace^TMviolet(CTV)染料的稀释峰来评估T细胞增殖。如图6所示，与仅用10nM HLA-A2 WT-1-TCB治疗的阳性对照相比，用10nM HLA-A2 WT-1-TCB和100nM达沙替尼的治疗延迟了CD4+和CD8+的增殖峰，对CD4+ T细胞的作用更强。当与未观察到增殖峰的阴性对照SKM-1靶细胞和PBMC(图6中的上迹线)相比，在24小时将达沙替尼添加到系统导致T细胞的部分增殖。在不存在100nM达沙替尼的情况下，历经活化的前24小时诱发了这些早期增殖峰。此外，在未用100nM达沙替尼治疗的阳性对照样品中，CD4+和CD8+ T细胞计数显著高于用100nM达沙替尼治疗的样品(图7)。用100nM达沙替尼治疗的样品中的CD8+ T细胞计数高于SKM-1细胞和PBMC阴性对照样品(图7B)。用100nM达沙替尼治疗的样品中的CD4+ T细胞计数并不高于SKM-1细胞和PBMC阴性对照样品(图7A)。总体而言，这表明100nM达沙替尼抑制了TCB诱导的T细胞增殖，对CD4+ T细胞的影响比CD8+T细胞更强。

总之，达沙替尼治疗迅速导致T细胞活化、细胞因子释放和增殖的下调，表明它诱发了T细胞功能的丧失。然而，该测定不允许评估达沙替尼对TCB介导的靶细胞杀伤的影响，因为大多数SKM-1肿瘤细胞在24小时后以及加入达沙替尼之前死亡。

实例3.达沙替尼防止TCB诱导的活化T细胞的细胞毒性

为了评估达沙替尼是否可以有效地阻止活化的T细胞对TCB介导的靶细胞杀伤，我们建立了具有两个刺激步骤的体外杀伤测定，模拟了ON/OFF开关。在第一次刺激期间，在不存在达沙替尼(ON)的情况下，PBMC在带有HLA-A2 WT-1-TCB的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的SKM-1肿瘤细胞上被活化。在第二次刺激期间，在存在100nM达沙替尼(OFF)的情况下，在新的CTV标记的SKM-1肿瘤细胞上通过HLA-A2WT-1-TCB洗涤并且重新刺激活化的PBMC连同死的CFSE标记的SKM-1肿瘤细胞。CFSE和CTV标记的SKM-1肿瘤的使用允许通过流式细胞术区分用于第一次和第二次刺激的肿瘤细胞(图8)。在第一次刺激期间用HLA-A2-WT-1-TCB的治疗诱发CD8+和CD4+ T细胞上早期和晚期T细胞活化标志物CD69和CD25的上调(图9)以及杀伤CFSE标记的SKM-1靶细胞(图10和图11)。一致地，在系统中加入达沙替尼之前，T细胞被活化并发挥作用。在存在100nM达沙替尼的情况下，用10nM HLA-A2WT-1TCB进行第二次刺激时，87.6％的CTV标记的SKM-1细胞存活，但在不存在达沙替尼的情况下，用10nMHLA-A2 WT-1-TCB重新刺激时，只有2.04％的CTV标记的SKM-1肿瘤细胞存活(图10)。与阳性对照(ON/ON)相反，在用HLA-A2 WT-1-TCB的新CTV标记的SKM-1肿瘤细胞上重新刺激活化的T细胞和死的CFSE标记的SKM-1肿瘤细胞时，添加100nM达沙替尼有效地阻止了CTV标记的SKM-1细胞的杀伤(ON/OFF)(图10和图11)。此外，与阳性对照ON/ON相比，在存在100nM达沙替尼的情况下，重新刺激时，T细胞衍生的IFN-γ和IL-2以及T细胞和单核细胞衍生的TNF-α释放被完全抑制(图12)。这一结果强调了达沙替尼在活化的T细胞上充当药理学ON/OFF开关，关闭T细胞功能以及快速杀伤T细胞介导的靶细胞。为了研究达沙替尼如何预防T细胞毒性，在存在和不存在100nM达沙替尼的情况下用10nM HLA-A2 WT-1-TCB刺激后，通过细胞内染色我们测量了脱粒标志物CD107a的表达作为T细胞脱粒的读数(图13)。在CD4+和CD8+ T细胞中，当培养基补充有100nM达沙替尼时，CD107a阳性细胞分别为16.6％和7.53％，而CD107a阳性细胞分别仅为1.22％和2.08％(图14)。用10nM HLA-A2WT-1-TCB的治疗诱发CD4+和CD8+ T细胞上的CD107a表达，在测定中添加100nM达沙替尼阻止该表达(图15)。通过防止T细胞脱粒，达沙替尼可以制止细胞毒性颗粒的释放，如负责杀伤肿瘤细胞的穿孔素和颗粒酶B。总体而言，在第二次刺激时添加100nM达沙替尼可阻断TCB诱导的T细胞的细胞毒性。

用不同的TCB进行类似的重新刺激实验，靶向CD20(CD20-TCB(SEQ ID NO 28-35，48-59)，1nM)，并在第一次和第二次刺激后测量对Z138靶细胞的杀伤(图23)。正如HLA-A2WT-1TCB所见，与阳性对照(ON/ON)相反，在该实验中，在用CD20-TCB的新鲜CTV标记的靶细胞上重新刺激活化的T细胞和死的CFSE标记的靶细胞时，添加100nM达沙替尼有效地阻止了CTV标记的靶细胞(ON/OFF)的杀伤(图24和图25)。

实例4.达沙替尼可逆地阻止TCB诱导的T细胞活化

然后我们验证了达沙替尼的作用在其去除时是否可逆。因此，在存在和不存在达沙替尼的情况下，我们设置了两个和三个刺激的杀伤测定，并使用

系统跟踪杀伤动力学(图16)。每次刺激后，在存在和不存在达沙替尼的情况下，在新的MKN45 NLR靶细胞上用1nM CEA TCB洗涤和重新刺激效应细胞，以允许模拟OFF/ON开关和ON/OFF/ON开关。当在第一次刺激期间加入25nM达沙替尼时，会导致杀伤抑制，然后在第二次刺激(OFF/ON)去除达沙替尼时逆转(图17)。在存在25nM达沙替尼的情况下用1nM CEA-TCB进行第一次刺激后，在上清液中未发现IFN-γ、IL-2和TNF-α，表明在存在达沙替尼的情况下完全抑制了T细胞衍生的细胞因子释放。然而，去除25nM达沙替尼并用1nM CEA-TCB重新刺激导致IFN-γ、IL-2和TNF-α的释放，表明去除达沙替尼时T细胞功能恢复(图18)。

最后，我们评估了达沙替尼对活化T细胞的影响是否可逆。因此，我们在用1nMCEA-TCB进行第二次刺激时用25nM达沙替尼补充培养基，以防止活化的T细胞的杀伤，并且然后在用1nM CEA-TCB进行第三次刺激时去除达沙替尼，以验证杀伤力是否会恢复。第一次刺激后，1nM CEA-TCB触发了MKN45细胞的杀伤，然后在第二次刺激时加入25nM将其抑制，并在第三次刺激时通过去除达沙替尼恢复(图19)。在杀伤测定中加入25nM达沙替尼也阻止了IFN-γ、IL-2和TNF-α的释放(图20)。我们得出结论，达沙替尼在预防T细胞活化和细胞毒性方面的作用是可逆的。

实例5.低剂量的达沙替尼在用TCB进行的第一次和第二次刺激时平衡细胞因子的释放

如图21所示，12.5nM和6.25nM的达沙替尼浓度没有导致完全的杀伤抑制，但降低了TCB诱导的细胞因子释放。对于T细胞接合抗体，第一次治疗时的细胞因子释放峰高于后续治疗后。我们很好奇低剂量的达沙替尼是否可以阻止细胞因子释放，同时在第一次刺激时对TCB效力的影响最小。在图16中描述的杀伤测定中，在存在6.25nM和12.5nM达沙替尼的情况下用1nM CEA-TCB进行第一次治疗时以及在不存在达沙替尼的情况下用1nM CEA-TCB进行第二次治疗时，测量上清液中的细胞因子水平。第一次刺激期间6.25nM和12.5nM达沙替尼的存在降低了IFN-γ、IL-2和TNF-α的释放(图22)，而它仅部分抑制了通过1nM CEA-TCB诱导的杀伤(图21A)。与达沙替尼的可逆特性一致，在第二次刺激期间去除达沙替尼时恢复了杀伤(图21B)，而TNF-α、IL-2和IFN-γ的水平仍然很低(图22)。该数据表明，低剂量的达沙替尼可能会阻止首次用TCB治疗时触发的TCB诱导的细胞因子释放。由于达沙替尼的可逆特性，它在第二次刺激时的去除也可以平衡细胞因子的释放并恢复TCB诱导的细胞毒性。

实例6.达沙替尼防止CD19-TCB诱导的体外T细胞细胞毒性、T细胞活化和细胞因子释放

为了评估达沙替尼是否可以防止通过另一种TCB、CD19-TCB(SEQ ID NO 29、31-33、35、64-74、76-78、80)诱导的T细胞细胞毒性、T细胞活化和细胞因子释放，在不存在和存在100nM达沙替尼的情况下，PBMC连同

(CTV)标记的SUDLH-8细胞和递增剂量的CD19-TCB共培养(图26)。

使用Live/Dead Near Infra Red(NIR)染料通过流式细胞术测量CTV标记的SUDLH-8细胞的杀伤。结果，添加100nM达沙替尼防止CD19-TCB杀伤SUDLH-8肿瘤细胞(图27)。通过流式细胞术在CD4+(图28)和CD8+(图29)T细胞上测量CD69和CD25的表达作为T细胞活化的读数。添加100nM达沙替尼防止CD4+和CD8+ T细胞活化。最后，通过Luminex分析测定上清液中的细胞因子水平，以评估达沙替尼对CD19-TCB诱导的细胞因子释放的影响(图30和图31)。与杀伤和T细胞活化数据一致，达沙替尼防止IL-2(图30A、31C)、IFN-γ(图30B、31A)、TNF-α(图30C、31B)、IL-6(图30D、31D)、GM-CSF(图30E、31E)和IL-8(图30F、31F)的释放。

总之，这些体外数据表明达沙替尼可有效防止CD19-TCB诱导的T细胞细胞毒性、T细胞活化和细胞因子释放。

实例7.达沙替尼防止CD19-TCB诱导的体内T细胞细胞毒性、T细胞活化和细胞因子释放

为了验证达沙替尼是否可以在体内阻止CD19-TCB诱导的B细胞耗竭和细胞因子释放，或者用0.5mg/kg CD19-TCB治疗人源化NSG小鼠，或者用0.5mg/kg CD19-TCB和50mg/kg达沙替尼共同治疗，如图32所示。为了最好地模拟达沙替尼在临床中的药效学特征并验证由此产生的暴露是否足以防止CD19-TCB诱导的T细胞细胞毒性和细胞因子释放，达沙替尼每天口服两次。

在48小时和72小时，给小鼠放血并通过流式细胞术测量CD20+B细胞计数(图33)。结果，达沙替尼防止在48小时CD19-TCB对CD20+B细胞的杀伤(图34)，然而在72小时部分恢复了杀伤(图34)。达沙替尼在小鼠血液中的半衰期约为6小时，达沙替尼的暴露可能不足以持久防止CD19-TCB诱导的T细胞细胞毒性，导致CD19-TCB部分具有活性。与体外观察结果一致，这些数据表明达沙替尼的体内抑制作用是可逆的。

最后，小鼠在用CD19-TCB和达沙替尼治疗后1.5和6小时放血以收集血清，通过Luminex进行细胞因子测量(图35和图36)。在两个时间点，达沙替尼均抑制CD19-TCB诱导的IL-2(图35A、36A)、TNF-α(图35B、36B)、IFN-γ(图35C、36C)和IL-6(图35D、36D)，表明达沙替尼通过CD19-TCB迅速关闭了T细胞衍生的细胞因子释放。

与体外发现一致，达沙替尼活性的快速发挥可以防止在人源化NSG小鼠中首次输注CD19-TCB诱导的B细胞耗竭和细胞因子释放。总的来说，这些数据证明了达沙替尼在每天两次给药时具有良好的药效学特征，可防止CD19-TCB诱导的T细胞细胞毒性和细胞因子释放长达48小时，以及达沙替尼抑制作用的可逆性。

实例8.预防性使用达沙替尼可强烈阻止TCB介导的细胞因子释放，同时保持抗肿瘤功效。

我们评估了人源化NSG小鼠中达沙替尼瞬时干预对CD19-TCB抗肿瘤活性的影响，这些小鼠移植了淋巴瘤患者衍生的异种移植物(PDX)。因此，用媒介物、0.5mg/kg CD19-TCB作为单一疗法或20mg/kg达沙替尼单独或与0.5mg/kg CD19-TCB联合治疗小鼠(图37)。在第一次用CD19-TCB治疗前一小时和后6小时给予达沙替尼，并且然后在接下来的2天内每天两次以防止细胞因子释放，主要发生在第一次输注时。此外，还在每次后续治疗前一小时施用达沙替尼以防止最终残留的细胞因子分泌(图37)。

如图38中IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-6的水平所示，达沙替尼在第一次输注时显著减少CD19-TCB介导的细胞因子释放。在第一次CD19-TCB治疗后24小时，细胞因子水平的降低与较轻微的体重变化相关(图39)，表明达沙替尼可有效预防CRS症状。此外，如图40中的肿瘤生长曲线所示，短暂使用达沙替尼对抗肿瘤功效的干扰最小，但并不显著。

由于达沙替尼短的PK/PD特性与CD19-TCB较长的PK/PD特性相组合，并且与其可逆抑制特性一致，达沙替尼在第一次输注后强烈减少细胞因子释放，同时保留CD19-TCB抗肿瘤功效。因此，CD19-TCB具有更好的耐受性并保持有效，这表明在临床中暂时预防性使用达沙替尼可能会在首次输注TCB时预防CRS的发生。

***

尽管为了清楚理解起见，通过图示和实例的方式对上述发明进行了详细描述，但是这些描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均以引用的方式明确地全部并入本文。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司

<120> T 细胞双特异性抗体相关不良反应的预防或减轻

<130> P36412

<150> EP20198050.5

<151> 2020-09-24

<150> EP20201583.0

<151> 2020-10-13

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<151> 2021-05-07

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Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe

165 170 175

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln

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Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser

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Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp

210 215 220

Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln

225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser

245 250 255

Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu

260 265 270

Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile

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His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro

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Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys

305 310 315 320

Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys

325 330 335

Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro

340 345 350

Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp

355 360 365

Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln

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Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala

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Leu

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<213> 智人

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<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

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1 5

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly

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Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys

130 135 140

His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His

180 185 190

Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe

195 200 205

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210 215 220

Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp Glu

275

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<212> PRT

<213> 智人

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Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

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100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

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Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

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Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn

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Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

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<212> PRT

<213> 食蟹猴

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Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp

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Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys

130 135 140

Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly

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Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

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1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

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65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

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210 215 220

Pro

225

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 36

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 37

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 38

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 39

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 41

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 42

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 43

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

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<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

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65 70 75 80

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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 45

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 45

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

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Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

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<210> 46

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 46

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

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65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

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Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

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Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

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Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

180 185 190

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

195 200 205

Val Glu Pro Lys Ser Cys

210

<210> 47

<211> 694

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu

225 230 235 240

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

245 250 255

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val

260 265 270

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser

275 280 285

Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

290 295 300

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

305 310 315 320

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His

325 330 335

Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

340 345 350

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val

355 360 365

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

370 375 380

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

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Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

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435 440 445

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Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

485 490 495

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

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580 585 590

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Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

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Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

645 650 655

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

660 665 670

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

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Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 49

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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65 70 75 80

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 56

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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

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100 105 110

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 57

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成构建体

<400> 58

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

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<223> 合成构建体

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180 185 190

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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

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<210> 60

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 60

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Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 63

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<220>

<223> 合成构建体

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 67

Asp Tyr Ile Met His

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 68

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 69

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr

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<210> 70

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 70

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 71

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 72

Leu Gln Leu Leu Glu Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 73

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 73

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 74

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 74

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

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20 25 30

Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

<210> 75

<211> 674

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 75

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

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130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr

225 230 235 240

Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr

245 250 255

Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp

260 265 270

Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr

275 280 285

Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu

290 295 300

Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu

305 310 315 320

Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly

325 330 335

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

340 345 350

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

355 360 365

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

370 375 380

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

385 390 395 400

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

405 410 415

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

420 425 430

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

435 440 445

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

450 455 460

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

465 470 475 480

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

485 490 495

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

500 505 510

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

515 520 525

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

530 535 540

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

545 550 555 560

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

565 570 575

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

580 585 590

Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

595 600 605

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

610 615 620

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

625 630 635 640

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

645 650 655

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

660 665 670

Ser Pro

<210> 76

<211> 674

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 76

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gln Ala Val Val Thr

225 230 235 240

Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr

245 250 255

Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp

260 265 270

Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr

275 280 285

Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu

290 295 300

Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu

305 310 315 320

Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly

325 330 335

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

340 345 350

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

355 360 365

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

370 375 380

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

385 390 395 400

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

405 410 415

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

420 425 430

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

435 440 445

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

450 455 460

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

465 470 475 480

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

485 490 495

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

500 505 510

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

515 520 525

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

530 535 540

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

545 550 555 560

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

565 570 575

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

580 585 590

Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

595 600 605

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

610 615 620

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

625 630 635 640

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

645 650 655

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

660 665 670

Ser Pro

<210> 77

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 77

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro

<210> 78

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 78

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser

20 25 30

Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 79

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 79

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr

100 105 110

Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 80

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 80

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 81

<211> 556

<212> PRT

<213> 智人

<400> 81

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val

325 330 335

Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu

340 345 350

Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala

355 360 365

Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp

370 375 380

Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly

385 390 395 400

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu

405 410 415

Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu

420 425 430

Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly

435 440 445

Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu

450 455 460

Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser

465 470 475 480

Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly

485 490 495

Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln

500 505 510

Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala

515 520 525

Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp

530 535 540

Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg

545 550 555

Claims

1.一种T细胞双特异性抗体，其用于治疗个体的疾病，其中所述治疗包括

(a)对所述个体施用所述T细胞双特异性抗体，以及

(b)对所述个体施用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)以预防或减轻与施用所述T细胞双特异性抗体有关的不良反应。

2.一种T细胞双特异性抗体在制备用于治疗个体的疾病的药物中的用途，其中所述治疗包括

(a)对所述个体施用所述T细胞双特异性抗体，以及

3.一种治疗个体的疾病的方法，其中所述方法包括

(a)对所述个体施用T细胞双特异性抗体，以及

4.一种酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，其用于预防或减轻与对个体施用T细胞双特异性抗体有关的不良反应。

5.酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在制备用于预防或减轻与对个体施用T细胞双特异性抗体有关的不良反应的药物中的用途。

6.一种预防或减轻与对个体施用T细胞双特异性抗体有关的不良反应的方法，其包括对所述个体施用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。

7.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI是Lck和/或Src激酶抑制剂，特别是达沙替尼。

8.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI(的施用)造成

(i)抑制所述T细胞双特异性抗体的活性，

(ii)抑制(由所述T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞的活化，

(iii)抑制(由所述T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞的增殖，

(iv)抑制(由所述T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞的细胞毒性活性，

(v)抑制(由所述T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞中的T细胞受体信号传导，和/或

(vi)抑制(由所述T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞进行的细胞因子分泌，特别是其中所述细胞因子是选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β所组成的组的一种或多种细胞因子；

任选地其中所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+细胞。

9.根据权利要求8所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述抑制是可逆的。

10.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI(的施用)造成所述个体的一种或多种细胞因子的血清水平降低，特别是其中所述一种或多种细胞因子是选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β所组成的组。

11.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述不良反应是(i)细胞因子释放综合征(CRS)、(ii)发烧、低血压和/或缺氧，和/或(iii)一种或多种细胞因子的血清水平升高，特别是其中所述一种或多种细胞因子是选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β所组成的组。

12.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述不良反应是与所述T细胞双特异性抗体与表达所述T细胞双特异性抗体的靶细胞抗原的非癌症细胞的结合有关的不良反应(即在靶/脱肿瘤效应)，和/或与所述T细胞双特异性抗体与其靶细胞抗原的结合无关的不良反应(即脱靶效应)。

13.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI的施用是在(所述个体)的不良反应的(临床)显现时进行的。

14.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI的施用是(i)在所述T细胞双特异性抗体的施用之前、同时或之后、(ii)间歇地或连续地和/或(iii)口服。

15.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI的施用以足以造成以下的剂量

(i)抑制所述T细胞双特异性抗体的活性，

(ii)抑制(由所述T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞的活化，

(iii)抑制(由所述T细胞双特异性抗体诱导的)T细胞的增殖，

任选地其中所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+细胞。

16.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI的施用是以足以造成所述个体的一种或多种细胞因子的血清水平降低，且任选地不足以造成抑制所述T细胞双特异性抗体的活性的剂量。

17.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI的施用是以足以造成所述个体的免疫细胞的一种或多种细胞因子的分泌减少，但不足以造成抑制由所述T细胞双特异性抗体诱导的T细胞活化和/或T细胞细胞毒性活性的剂量。

18.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI的施用是以有效剂量。

19.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI的施用是以约10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg或200mg的剂量，特别是约100mg或更低的剂量。

20.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI的施用是以所述不良反应持续期间的时间段，和/或在所述不良反应受到预防或减轻后停止。

21.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述TKI的施用与所述T细胞双特异性抗体的第一次施用相关，且任选地早于、同时于或晚于所述T细胞双特异性抗体的所述第一次施用。

22.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的施用是

(i)以有效剂量，

(ii)肠胃外，特别是为静脉内，和/或

(iii)所述T细胞双特异性抗体对所述个体的第一次施用。

23.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体(的施用)诱发

(i)T细胞的活化，

(ii)T细胞的增殖，

(iii)T细胞的细胞毒性活性，

(iv)T细胞中的T细胞受体信号传导，

(v)T细胞进行的细胞因子分泌，特别是其中所述细胞因子是选自由IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β所组成的组的一种或多种细胞因子；

任选地其中所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+细胞。

24.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体结合至CD3和靶细胞抗原。

25.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含结合至CD3的抗原结合部分和结合至靶细胞抗原的抗原结合部分。

26.根据权利要求24或25所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述靶细胞抗原是癌胚抗原(CEA)。

27.根据权利要求26所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含

(i)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分结合至CD3且包含：含有SEQ ID NO：28的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：29的HCDR2和SEQ ID NO：30的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：32的LCDR2和SEQ ID NO：33的LCDR3的轻链可变区；以及

(ii)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分结合至CEA，且包含：含有SEQ ID NO：36的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：37的HCDR2和SEQ ID NO：38的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：39的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：40的LCDR2和SEQ ID NO：41的LCDR3的轻链可变区。

28.根据权利要求26或27所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含结合至CEA的第三抗原结合部分和/或由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含

(i)结合至CD3的第一抗原结合部分，其包含：含有SEQ ID NO：28的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：29的HCDR2和SEQ ID NO：30的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：32的LCDR2和SEQ ID NO：33的LCDR3的轻链可变区，其中所述第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变区或恒定区是经交换的；

(ii)结合至CEA的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含：含有SEQ ID NO：36的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：37的HCDR2和SEQ ID NO：38的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：39的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：40的LCDR2和SEQ ID NO：41的LCDR3的轻链可变区；其中所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分各为Fab分子，特别是为常规Fab分子；

(iii)Fc结构域，所述Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成，

其中所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N末端，并且所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的所述C末端处融合至所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端，且其中所述第三抗原结合部分在所述Fab重链的所述C末端处融合至所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端。

30.根据权利要求26至29中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的所述第一抗原结合部分包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO：35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，和/或所述T细胞双特异性抗体的所述第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含与SEQID NO：42的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO：43的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。

31.根据权利要求28至30中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基与所述第二亚基的缔合的修饰，和/或所述Fc结构域包含减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的一种或多种氨基酸取代。

32.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体是赛必妥单抗。

33.根据权利要求24或25所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述靶细胞抗原是HLA-2/WT1。

34.根据权利要求33所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含

(i)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分结合至CD3且包含：含有SEQ ID NO：1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：2的HCDR2和SEQ ID NO：3的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQID NO：4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3的轻链可变区；以及

(ii)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分结合至HLA-A2/WT1且包含：含有SEQID NO：9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：10的HCDR2和SEQ ID NO：11的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：13的LCDR2和SEQ ID NO：14的LCDR3的轻链可变区。

35.根据权利要求33或34所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含结合至HLA-A2/WT1的第三抗原结合部分和/或由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域。

36.根据权利要求33至35中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含

(i)结合至CD3的第一抗原结合部分，其包含：含有SEQ ID NO：1的重链CDR(HCDR)1、SEQID NO：2的HCDR2和SEQ ID NO：3的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3的轻链可变区，其中所述第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变区或恒定区是经交换的；

(ii)结合至HLA-A2/WT1的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含：含有SEQID NO：9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：10的HCDR2和SEQ ID NO：11的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：13的LCDR2和SEQ ID NO：14的LCDR3的轻链可变区，

其中所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分各为Fab分子，特别是为常规Fab分子；

(iii)Fc结构域，所述Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成，

37.根据权利要求33至36中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的所述第一抗原结合部分包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，和/或所述T细胞双特异性抗体的所述第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含与SEQID NO：15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO：16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。

38.根据权利要求33至37中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的所述第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变区是经交换的，并且其中所述T细胞双特异性抗体的所述第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分是常规Fab分子，其中在恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，且位置123处的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且在恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸是独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据KabatEU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据KabatEU索引编号)取代。

39.根据权利要求35至38中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基与所述第二亚基的缔合的修饰，和/或所述Fc结构域包含减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的一种或多种氨基酸取代。

40.根据权利要求24或25所述T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述靶细胞抗原是CD20。

41.根据权利要求40所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含

(i)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分结合至CD3且包含：

含有SEQ ID NO：28的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：29的HCDR2和SEQ ID NO：30的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：32的LCDR2和SEQ IDNO：33的LCDR3的轻链可变区；以及

(ii)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分结合至CD20并且包含：含有SEQ IDNO：48的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：

49的HCDR2和SEQ ID NO：50的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：51的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：52的LCDR2和SEQ ID NO：53的LCDR3的轻链可变区。

42.根据权利要求40或41所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含结合至CD20的第三抗原结合部分和/或由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含

(ii)结合至CD20的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含：含有SEQ ID NO：48的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：49的HCDR2和SEQ ID NO：50的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：51的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：52的LCDR2和SEQ ID NO：53的LCDR3的轻链可变区；其中所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分各为Fab分子，特别是为常规Fab分子；

(iii)Fc结构域，所述Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成，

44.根据权利要求40至43中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的所述第一抗原结合部分包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO：35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，和/或所述T细胞双特异性抗体的所述第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含与SEQID NO：54的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO：55的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。

45.根据权利要求40至44中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的所述第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变区是经交换的，且其中所述T细胞双特异性抗体的所述第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分是常规Fab分子，其中在恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且在恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸是独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据KabatEU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据KabatEU索引编号)取代。

46.根据权利要求42至45中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基与所述第二亚基的缔合的修饰，和/或所述Fc结构域包含减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的一种或多种氨基酸取代。

47.根据权利要求24或25所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述靶细胞抗原是CD19。

48.根据权利要求47所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含

(i)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分结合至CD3且包含：含有SEQ ID NO：61的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：29的HCDR2和SEQ ID NO：62的HCDR3的重链可变区，或含有SEQ ID NO：64的HCDR1、SEQ ID NO：29的HCDR2和SEQ ID NO：65的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：32的LCDR2和SEQ ID NO：33的LCDR3的轻链可变区；以及

(ii)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分结合至CD19并且包含：含有SEQ IDNO：67的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：68的HCDR2和SEQ ID NO：69的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：70的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：71的LCDR2和SEQ ID NO：72的LCDR3的轻链可变区。

49.根据权利要求47或48所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含结合至CD19的第三抗原结合部分和/或由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域。

50.根据权利要求47至49中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体包含

(i)结合至CD3的第一抗原结合部分，其包含：含有SEQ ID NO：61的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：29的HCDR2和SEQ ID NO：62的HCDR3的重链可变区，或含有SEQ ID NO：64的HCDR1、SEQ ID NO：29的HCDR2和SEQ ID NO：65的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：31的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：32的LCDR2和SEQ ID NO：33的LCDR3的轻链可变区，其中所述第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变区或恒定区是经交换的；

(ii)结合至CD19的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含：含有SEQ ID NO：67的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：68的HCDR2和SEQ ID NO：69的HCDR3的重链可变区；以及含有SEQ ID NO：70的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：71的LCDR2和SEQ ID NO：72的LCDR3的轻链可变区；其中所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分各为Fab分子，特别是为常规Fab分子；

(iii)Fc结构域，所述Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成，

51.根据权利要求47至50中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的所述第一抗原结合部分包含与SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列或与SEQ ID NO：66的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ IDNO：35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列；和/或所述T细胞双特异性抗体的所述第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分包含与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。

52.根据权利要求47至51中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的所述第一抗原结合部分是交叉Fab分子，其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变区是经交换的，且其中所述T细胞双特异性抗体的所述第二抗原结合部分和(在存在时的)第三抗原结合部分是常规Fab分子，其中在恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)取代，并且在恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸是独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据KabatEU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据KabatEU索引编号)取代。

53.根据权利要求49至52中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述T细胞双特异性抗体的所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基与所述第二亚基的缔合的修饰，和/或所述Fc结构域包含减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的一种或多种氨基酸取代。

54.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中(待由所述T细胞双特异性抗体治疗的)所述疾病是癌症，特别是表达所述T细胞双特异性抗体的所述靶细胞抗原的癌症。

55.根据权利要求54所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述癌症是

(i)表达癌胚抗原(CEA)的癌症，和/或

(ii)选自由以下所组成的组：结肠直肠癌、肺癌、胰脏癌、乳腺癌和胃癌。

56.根据权利要求54所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述癌症是

(i)表达肾母细胞瘤蛋白(WT1)的癌症，和/或

(ii)血液学癌症，特别是为白血病，最特别是为急性淋巴细胞性白血病(ALL)或急性骨髓性白血病(AML)。

57.根据权利要求54所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述癌症是

(i)表达CD20的癌症，

(ii)B细胞癌症，和/或

(ii)选自由以下所组成的组：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和边缘区淋巴瘤(MZL)。

58.根据权利要求54所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中所述癌症是

(i)表达CD19的癌症，

(ii)B细胞癌症，和/或

(ii)选自由以下项所组成的组：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)及慢性淋巴细胞白血病(CLL)。

59.根据权利要求47至53中任一项所述的T细胞双特异性抗体、TKI、用途或方法，其中(待由所述T细胞双特异性抗体治疗的)所述疾病是自身免疫性疾病，特别是为狼疮，更特别是全身性红斑狼疮(SLE)或狼疮肾炎(LN)。

60.如前所述的本发明。