CN111699001A - 达沙替尼和其他酪氨酸激酶抑制剂对基因修饰的嵌合抗原受体t细胞的功能的控制和调节 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及达沙替尼和其他酪氨酸激酶抑制剂对基因修饰的免疫细胞的免疫调节特性。本发明包括对达沙替尼和其他酪氨酸激酶抑制剂作为免疫细胞抑制剂或者免疫细胞增强剂的指示，这取决于治疗的剂量和治疗方案、施用途径、易感受体的变体和可以治疗的细胞类型，该指示用于免疫疗法中。
Description
技术领域
本发明涉及达沙替尼(dasatinib)和其他酪氨酸激酶抑制剂在癌症免疫治疗中控制和调节基因修饰的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的功能的用途。本发明包括达沙替尼和其他酪氨酸激酶抑制剂通过预防和治疗可能在CAR-T细胞免疫疗法中发生的威胁生命的副作用来提高安全性的用途，以及达沙替尼用于增强CAR-T细胞免疫疗法的抗癌作用和功效的用途。
背景技术
临床前以及临床研究中正在通过瞬时基因转移或稳定的基因转移进行工程改造得到表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞从而进行过继免疫疗法，其作为一种高度创新、高效的新型疗法，被用于治疗血液学和肿瘤学中的晚期化疗和放疗难治性的恶性肿瘤。
CAR是合成的经过设计的受体，其通常包括与肿瘤细胞表面分子或结构相结合的细胞外抗原结合部分；间隔区和将受体锚定在T细胞表面上的跨膜结构域；以及细胞内信号传导模块，最常见的是具有衍生自CD28或4-1BB的共刺激部分的顺式CD3ζ结构域，从而在结合各自的靶分子或结构后激活并刺激CAR-T细胞。此外，正在开发包括NKG2D结构域、T细胞受体恒定结构域和其他CD3亚基在内的替代性CAR设计。目前，对抗原的结合、信号产生和转导、随后的T细胞活化以及对CAR的刺激的过程尚未完全了解，其中至少部分原因是CAR包含以新的人工方式组装在CAR结构中的结构域(例如信号域如CD3ζ、CD28和4-1BB)，但其具体过程是发生在内源性的T细胞中。
已通过对表达在B细胞白血病和淋巴瘤的恶性肿瘤细胞上的CD19分子具有特异性的CAR-T细胞(CD19 CAR-T细胞)完成了对CAR-T细胞免疫疗法功效的临床概念验证[1]-[3]，最近还针对在多发性骨髓瘤(MM)中表达的B细胞成熟抗原(BCMA)具有特异性的CAR-T细胞(BCMA CAR-T细胞)完成了相关验证[4]。自体或异体CD19 CAR-T细胞的过继转移会在患有急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和MM的患者中引起持续的完全反应和部分反应。CD19 CAR-T细胞已于2017年被FDA批准用于治疗复发性/难治性ALL和NHL。BCMA CAR-T细胞的过继转移已引起MM患者持久的完全和部分反应。目前，针对CD19、BCMA和其他抗原的CAR-T细胞的许多临床试验正在全世界的癌症中心进行。
尽管CAR-T细胞疗法被认为是一种非常有力的高效抗癌新方法，但仍存在安全性相关的重大问题。CAR-T细胞(包括CD19 CAR-T细胞和BCMA CAR-T细胞)的临床使用已显示出许多急性的和慢性的、可能危及生命的、在某些情况下甚至是致命的副作用，这些副作用因此大大限制了CAR-T细胞的临床应用，并限制应用在具有深度的骨髓移植和免疫治疗经验的高度专业化的癌症中心的患者中。这些副作用可能是由于(但不限于)：i)由于存在大量表达不同靶抗原的肿瘤细胞，过继转移至患者后导致的CAR-T细胞的强烈活化以及随后细胞因子的释放(细胞因子释放综合征CRS)；ii)患者体内其他免疫细胞的活化，这些免疫细胞吸收了由于CAR-T细胞杀死肿瘤细胞而积聚的肿瘤细胞碎片(例如巨噬细胞活化综合征，MAS)；iii)按目标识别并消除患者体内表达相应靶抗原的正常细胞(例如：CD19 CAR-T细胞耗尽正常B细胞)；iv)脱靶识别患者体内正常(或恶性肿瘤)细胞，但这些细胞不表达CAR的相应靶抗原；v)由于患者免疫系统对转移的CAR-T细胞的免疫反应而导致的CAR-T细胞排斥，如果T细胞来自同种异体的供体，这可能是由于对CAR构建体或T细胞的识别；vi)CAR-T细胞的无意激活，如果CAR构建体带有被内源性免疫细胞识别的基序(例如Ig衍生的CAR间隔域中的Fc-基序)；vii)独立于抗原刺激的CAR-T细胞的强直信号传导(tonicsignaling)和活化。
CAR-T细胞疗法的严重副作用是CRS。CRS的症状是由包括GM-CSF、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10等在内的促炎性细胞因子的水平升高引起的，并且通常在初期会有发烧症状，通常是在CAR-T细胞转移后的几小时到几天内会发烧。CRS的症状可能包括心动过速/低血压、不适、疲劳、肌痛、恶心、厌食和毛细血管渗漏，并可能导致多器官衰竭[6]。发生CRS的风险与所施用的CAR-T细胞的总剂量以及CAR-T细胞治疗之前的肿瘤负荷有关[5],[7]。CRS是CAR-T细胞治疗中导致发病率和死亡率的主要原因。
目前在CAR-T细胞疗法的背景下，预防和治疗临床CRS以及预防或治疗其他副作用的能力非常有限。目前，将CAR-T细胞输注至患者后尚无有效控制其功能的方法。CAR-T细胞是一种“活体药物”，即在输注至患者体内后，它们会成为患者免疫系统的一部分，在患者体内扩增并随后收缩，并且可以长期作为记忆性的CAR-T细胞来预防肿瘤复发。已经证明CAR-T细胞的移植和持久性(曲线下面积，AUC)与治疗的功效相关。从这方面来说，CAR-T细胞与可以在患者体内消除、代谢或衰变以及具有可预测的且一致的半衰期的常规药物不同。
目前，存在三种减轻CRS以及治疗或预防CAR-T细胞疗法的副作用的主要策略。1)托珠单抗(Tocilizumab)：已显示白介素6(IL-6)在CRS中起关键作用，因此经常尝试通过抗IL-6R抗体托珠单抗来阻断IL-6受体(IL-6R)，并已显示可在相当多的患者中CRS得到了缓解。但是，这种干预对CAR-T细胞没有直接作用，仅是一种对症治疗。2)类固醇：通常施用地塞米松(Dexamethasone)或泼尼松(Prednisone)来尝试减轻CRS或其他CAR-T细胞介导的副作用。但是，它们控制CRS或其他副作用的能力很低。因为已知类固醇具有免疫抑制作用，所以将它们使用在CAR-T细胞疗法中引起了人们的担忧，即它们可能会对CAR-T细胞的治疗效果产生负面影响。3)自杀基因和耗竭标记(depletion marker)：某些CAR-T细胞产品配备了“紧急中断”，即自杀基因，例如可诱导的Caspase9(iCasp9)，其可以由二聚体药物触发以诱导CAR-T细胞凋亡。其局限性在于该策略对表达高水平自杀基因的CAR-T细胞有效，但对自杀基因低表达的那些CAR-T细胞[8]或低表达耗竭标记物(如EGFRt或CD20t)的CAR-T细胞无效，这些标记物可由能够诱导抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)所触发以去除CAR-T细胞的抗体[9]。但是，这些抗体依赖性的耗竭标记物只有在患者的免疫系统未改变的情况下才起作用，而在经过加强的前期化学疗法之后通常不属于这种情况，或者是由于正常免疫细胞的耗竭作为CAR对目标识别的一部分。自杀基因和耗竭标记的一个主要问题在于它们消除了CAR-T细胞并终止了其治疗作用。尤其值得关注的是，由于当前CAR构造的免疫原性，通常无法进行第二次输注(因为患者在第二次输注时会产生免疫反应并排斥CAR-T细胞)。因此，目前尚无报道在CAR-T细胞免疫疗法中触发iCasp9或EGFRt的病例。
最近显示，可以通过测量包括但不限于IFN-γ、IL-6、MCP1等血清细胞因子和测量患者体温等生命特征(viral sign)来鉴定施用了CAR-T细胞并具有发展的CRS和/或神经毒性高风险的患者[2],[10]。如果可以控制(并间歇性地暂停)此类患者中CAR-T细胞的功能，则有可能减轻或预防这些毒性。
当前，仍旧需要一种向患者施用CAR-T细胞后能够控制其功能的方法，以预防或治疗CRS或其他副作用，同时保留CAR-T细胞产物的后续抗癌作用。
CAR-T细胞癌症免疫疗法的另一个挑战是，在部分患者中，这种治疗没有效果并且不会导致预期的治疗反应。有几种可能导致CAR-T细胞治疗无效的机制(包括但不限于)：1)特别是在肿瘤负荷高的患者以及实体瘤患者中，CAR-T细胞由于持续暴露于抗原并持续从CAR发出信号而耗竭。2)CAR-T细胞在离体制备后会耗竭，随后无法移植、扩增、持续、增殖并无法抵抗患者体内的癌细胞；3)由于来自CAR构建体的进补信号传导，CAR-T细胞耗竭并且经历活化诱导的细胞死亡(AICD)；4)CAR-T细胞表达检查点分子，包括但不限于PD-1，其抑制它们的生存活力、增殖以及抗癌细胞的功能。程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)表达在T细胞表面。PD-1与其配体PD-L1结合后可促进T细胞凋亡，而配体PD-L1通常在癌细胞和肿瘤微环境中表达。正在寻求一种策略，通过检查点阻断剂(即抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)阻断PD-1_PD-L1轴(PD-1_PD-L1 axis)，以增强内源性T细胞和CAR修饰的T细胞在癌症免疫治疗中的功能[11]。
目前仍旧需要一种方法，以提高对CAR-T细胞免疫疗法无反应的患者中CAR-T细胞的生存活力和功能。
酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼(dasatinib，
)已被开发作为BCR-ABL融合蛋白的抑制剂[12]，所述BCR-ABL融合蛋白通常表达在费城染色体阳性(Ph+)慢性髓细胞性白血病(CML)[13]和占所有病例约20％的ALL中[14]。自2010年以来，达沙替尼被批准用于Ph+ALL和CML的一线治疗。此外，已证明达沙替尼可阻断SRC激酶Lck的ATP结合位点，所述的SRC激酶Lck通过内源的生理性T细胞受体刺激后，参与常规T细胞的信号级联反应[15]-[18]。
发明内容
本发明中发明人发现了酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的前所未知和出乎意料的能力，即通过连续给药能够阻断CAR-T细胞的功能。此外，本发明中发明人发现了酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的前所未知和出乎意料的能力，即通过间歇性给药能够增强CAR-T细胞的功能。
本发明中，达沙替尼的连续施用使得CAR-T细胞的功能快速且完全的阻断。只要CAR-T细胞以特定阈值以上的浓度连续暴露于达沙替尼，这种阻断作用就持续有效。这种阻断作用对于未活化的CAR-T细胞和已活化的CAR-T细胞均有效。这种阻断作用在CD8+杀伤性T细胞和CD4+辅助(和调节)T细胞中均有效。此外，这种阻断作用与CAR的抗原特异性无关，并且与CAR的抗原结合结构域、细胞外间隔结构域以及细胞内信号传导部分和共刺激部分等方面的特定设计无关。另外，只要保持与达沙替尼的接触，这种阻断作用就有效，但一旦停止与达沙替尼的接触，则迅速且完全的可逆。并且，这种阻断作用不会影响CAR-T细胞的生存活力，也不会影响在停止施用达沙替尼后CAR-T细胞发挥其抗癌功能的能力。本发明中，达沙替尼控制CAR-T细胞功能的能力不同于并且优于类固醇控制和抑制CAR-T细胞功能的能力。本发明中，可以利用达沙替尼阻断CAR-T细胞功能的能力来增强CAR-T细胞疗法的安全性，包括但不限于预防和治疗CRS。
本发明中，通过间歇性地施用达沙替尼可以增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能。这种增强是由于间歇性暴露于达沙替尼后CAR-T细胞的活力和功能增强所致。此外，这种增强是由于在间歇性地暴露于达沙替尼后，CAR-T细胞的移植、增殖和持久性有所增加。另外，这种增强是由于在间歇性地暴露于达沙替尼时，CAR的优越的信号传导所致。并且，这种增强是由于在间歇性地暴露于达沙替尼时，CAR-T细胞(包括但不限于PD-1)上抑制性免疫检查点分子的表达降低。间歇性地施用(给药)应包括在恒定的或可变长度的间隔时间内使用达沙替尼的任何情况，其中达沙替尼的浓度不连续高于阻断CAR-T细胞功能时所需的浓度。
通过以下优选的实施方案来举例说明本发明：
1.一种用于患者癌症治疗的方法的用途的组合物，所述组合物包含酪氨酸激酶抑制剂；
其中，在所述方法中，所述组合物用于施用于患者，和
其中，所述方法为用于治疗癌症的方法，其包括免疫疗法。
2.如项目1所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫疗法为过继免疫疗法。
3.如项目1-2中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫疗法为使用免疫细胞进行的免疫疗法。
4.如项目3所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫疗法为使用表达了嵌合抗原受体的免疫细胞进行的免疫疗法。
5.如项目4所述的用于所述用途的组合物，其中，所述嵌合抗原受体能够结合抗原。
6.如项目5所述的用于所述用途的组合物，其中，所述嵌合抗原受体能够结合细胞表面的抗原。
7.如项目5-6中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抗原为癌症抗原。
8.如项目5-7中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抗原选自由CD4、CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD52、CD64、CD70、CD72、CD123、CD135、CD138、CD220、CD269、CD319、ROR1、ROR2、SLAMF7、BCMA、αvβ3-整联蛋白、α4β1-整联蛋白、LILRB4、EpCAM-1、MUC-1、MUC-16、L1-CAM、c-kit、NKG2D、NKG2D-配体、PD-L1、PD-L2、Lewis-Y、CAIX、CEA、c-MET、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、Her2、FAP、FR-a、EphA2、GD2、GD3、GPC3、IL-13Ra、间皮素、PSMA、PSCA、VEGFR和FLT3组成的组。
9.如项目8所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD123、SLAMF7、ROR1、BCMA和FLT3组成的组。
10.如项目9所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抗原为CD19。
11.如项目9所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抗原为ROR1。
12.如项目9所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抗原为BCMA。
13.如项目9所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抗原为FLT3。
14.如项目9所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抗原为CD20。
15.如项目9所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抗原为CD22。
16.如项目9所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抗原为CD123。
17.如项目9所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抗原为SLAMF7。
18.如项目5-17中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症包括表达所述抗原的癌细胞。
19.如项目4-18中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述嵌合抗原受体包含选自由CD27共刺激结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域、ICOS共刺激结构域、DAP10共刺激结构域、NKG2D共刺激结构域、MyD88共刺激结构域和OX40共刺激结构域组成的组的共刺激结构域。
20.如项目19所述的用于所述用途的组合物，其中，所述嵌合抗原受体包含CD28共刺激结构域。
21.如项目19所述的用于所述用途的组合物，其中，所述嵌合抗原受体包含4-1BB共刺激结构域。
22.如项目19所述的用于所述用途的组合物，其中，所述嵌合抗原受体包含OX40共刺激结构域。
23.如项目3-22中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫细胞为淋巴细胞。
24.如项目3-23中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫细胞为B淋巴细胞或T淋巴细胞。
25.如项目24所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫细胞为T淋巴细胞。
26.如项目25所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫细胞为CD4+ T淋巴细胞和/或CD8+ T淋巴细胞。
27.如项目26所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫细胞为CD4+ T淋巴细胞。
28.如项目26所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫细胞为CD8+ T淋巴细胞。
29.如项目3-28中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫细胞选自由CD8+杀伤性T细胞、CD4+辅助性T细胞、初始T细胞、记忆性T细胞、中枢记忆性T细胞、效应记忆性T细胞、记忆性干细胞样T细胞、恒定T细胞、NKT细胞、细胞因子诱导的杀伤性T细胞、γ/δT细胞、天然杀伤性细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞组成的组。
30.如项目1-29中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂为Src激酶抑制剂。
31.如项目1-30中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂为NFAT上游激酶的抑制剂。
32.如项目1-31中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂为Lck激酶抑制剂。
33.如项目1-32中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂选自由达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、尼洛替尼和PP1抑制剂组成的组。
34.如项目33所述的用于所述用途的组合物，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂为达沙替尼。
35.如项目33所述的用于所述用途的组合物，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂为博舒替尼。
36.如项目33所述的用于所述用途的组合物，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂为PP1抑制剂。
37.如项目33所述的用于所述用途的组合物，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂为尼洛替尼。
38.如项目3-37中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂引起对所述免疫细胞的抑制。
39.如项目38所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抑制为对所述免疫细胞的细胞介导的效应子功能的抑制。
40.如项目38-39中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，对所述免疫细胞的所述抑制为对其
I)细胞溶解活性；和/或
II)细胞因子的分泌；和/或
III)增殖
的抑制。
41.如项目38-40中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抑制包括抑制所述免疫细胞中PD1的表达。
42.如项目38-41中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抑制包括抑制所述免疫细胞中细胞因子的分泌，所述细胞因子选自由GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8和IL-10组成的组中的一种或多种。
43.如项目38-42中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抑制包括抑制所述免疫细胞中IFN-γ和/或IL-2的分泌。
44.如项目43所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抑制包括抑制所述免疫细胞中IFN-γ的分泌。
45.如项目43所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抑制包括抑制所述免疫细胞中IL-2的分泌。
46.如项目38-45任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抑制为部分抑制或完全抑制。
47.如项目38-46中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抑制不降低所述免疫细胞的生存活力。
48.如项目47所述的用于所述用途的组合物，其中，在给定的时间段内将所述组合物施用于所述患者，所述抑制作用不会降低所述免疫细胞的生存活力，其中所述的时间段为1小时，优选2小时，优选3小时，优选4小时，优选5小时，优选6小时，优选8小时，优选12小时，优选18小时，优选1天，优选2天，更优选3天，进一步更优选7天，进一步更优选2周，进一步更优选3周，进一步更优选4周，进一步更优选2个月，进一步更优选3个月，进一步更优选6个月。
49.如项目38-48中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述抑制为可逆的。
50.如项目49所述的用于所述用途的组合物，其中，在给定的时间内未将所述组合物施用于所述患者后，所述抑制作用被逆转。
51.如项目50所述的用于所述用途的组合物，其中，所述给定的时间为3天，优选2天，更优选24小时，进一步更优选18小时，进一步更优选12小时，进一步更优选8小时，进一步更优选6小时，进一步更优选4小时，进一步更优选3小时，进一步更优选2小时，进一步更优选90分钟，进一步更优选60分钟，进一步更优选30分钟。
52.如项目1-51中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述组合物被连续施用或间歇性施用。
53.如项目52所述的用于所述用途的组合物，其中，所述组合物被连续施用。
54.如项目52所述的用于所述用途的组合物，其中，所述组合物被间歇性施用。
55.如项目1-54中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，通过施用所述组合物，使得在所述治疗期间，所述组合物的初始施用后所述酪氨酸激酶抑制剂的血清水平维持在阈值血清水平或超过阈值血清水平。
56.如项目1-55中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，在所述方法中，通过施用所述组合物，使得在所述治疗期间，所述组合物的初始施用后所述酪氨酸激酶抑制剂的血清水平至少一次维持在高于阈值血清水平并且至少一次低于同一阈值血清水平。
57.如项目55-56中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述阈值血清水平为0.1nM-1μM，优选1nM-500nM，更优选5nM-100nM，进一步更优选10nM-75nM，进一步更优选25nM-50nM。
58.如项目57所述的用于所述用途的组合物，其中，所述阈值血清水平为50nM。
59.如项目55-58中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述阈值血清水平为当所述免疫细胞的所述抑制为完全抑制所述免疫细胞的
I)细胞溶解活性；和/或
II)细胞因子的分泌；和/或
III)增殖
时的最低血清水平。
60.如项目1-59中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，所述癌症的治疗具有改善的临床结果。
61.如项目1-60中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述用途为用于减轻或预防与针对所述癌症的所述免疫疗法相关的毒性的用途。
62.如项目1-61中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，用于减轻所述患者的肿瘤负荷的用途。
63.如项目1-62中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，用于所述癌症治疗的所述用途不降低针对所述癌症进行的所述免疫疗法的治疗功效。
64.如项目1-63中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，用于所述癌症治疗的所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，用于提高针对所述癌症进行的所述免疫疗法的治疗功效的用途。
65.如项目1-64中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，用于所述癌症治疗的所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，用于降低针对所述癌症的所述免疫疗法的发病率和死亡率的用途。
66.如项目1-65中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，用于所述癌症治疗的所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，用于提高针对所述癌症进行的所述免疫疗法的抗肿瘤功效的用途。
67.如项目3-66中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，用于所述癌症治疗的所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法中所述免疫细胞的移植和/或持久性相比，用于在针对所述癌症进行的所述免疫疗法中增加所述免疫细胞的移植和/或持久性的用途。
68.如项目3-67中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，用于所述癌症治疗的所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法中所述免疫细胞的移植相比，用于提高所述免疫细胞在所述免疫疗法中的移植的用途。
69.如项目3-68中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法中所述免疫细胞的耗竭相比，用于减少在针对所述癌症进行的所述免疫疗法中所述免疫细胞的衰竭的用途。
70.如项目1-69中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，
I)在使用免疫疗法治疗癌症之前；和/或
II)使用免疫疗法治疗癌症的同时；和/或
III)使用免疫疗法治疗癌症之后；
施用所述组合物。
71.如项目70所述的用于所述用途的组合物，其中，在使用免疫疗法治疗癌症之前施用所述组合物。
72.如项目70所述的用于所述用途的组合物，其中，在使用所述免疫疗法治疗癌症的同时施用所述组合物。
73.如项目70所述的用于所述用途的组合物，其中，在使用免疫疗法治疗癌症之后施用所述组合物。
74.如项目70所述的用于所述用途的组合物，其中，在使用免疫疗法治疗癌症之前和在使用免疫疗法治疗癌症的同时施用所述组合物。
75.如项目70所述的用于所述用途的组合物，其中，在使用免疫疗法治疗癌症之前和在使用免疫疗法治疗癌症之后施用所述组合物。
76.如项目70所述的用于所述用途的组合物，其中，在使用免疫疗法治疗癌症的同时和在使用免疫疗法治疗癌症之后施用所述组合物。
77.如项目70所述的用于所述用途的组合物，其中，在使用免疫疗法治疗癌症之前、在使用免疫疗法治疗癌症的同时和在使用免疫疗法治疗癌症之后施用所述组合物。
78.如项目3-77中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述用途为用于在所述免疫疗法中预防所述免疫细胞活化的用途。
79.如项目78所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫细胞为休眠的免疫细胞。
80.如项目3-79中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫细胞为人来源的免疫细胞。
81.如项目80所述的用于所述用途的组合物，其中，所述人类来源的免疫细胞为原代的人细胞。
82.如项目81所述的用于所述用途的组合物，其中，所述原代的人细胞为原代的人T淋巴细胞。
83.如项目80-82中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述人来源的免疫细胞相对于所述患者为同种异体细胞。
84.如项目80-82中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述人来源的免疫细胞相对于所述患者为同源细胞。
85.如项目4-84中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫细胞为瞬时表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞或稳定表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞。
86.如项目4-85中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述嵌合抗原受体为第一代、第二代或第三代。
87.如项目5-86中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述嵌合抗原受体包含单链可变片段，优选地，所述单链可变片段能够结合所述抗原。
88.如项目5-86中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述嵌合抗原受体包含配体或其片段，其中所述配体或其片段能够结合所述抗原。
89.如项目5-88中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述嵌合抗原受体包含信号传导域，所述信号传导域包含选自由CD3ζ、CD3ε、CD3γ、T细胞受体α链、T细胞受体β链、T细胞受体δ链和T细胞受体γ链组成的组中的一种或多种结构域。
90.如项目1-89中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为与所述免疫疗法中具有较高的发病率和死亡率的风险相关的癌症。
91.如项目1-90中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症包括表达一种或多种检查点分子的细胞，所述检查点分子优选选自由A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA组成的组。
92.如项目91所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症包括表达PD-L1的细胞。
93.如项目1-92中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为选自由肿瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病和淋巴瘤组成的组中的癌症。
94.如项目93所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为骨髓瘤。
95.如项目93所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为白血病。
96.如项目93所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为淋巴瘤。
97.如项目93所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为肿瘤，优选地，所述癌症为选自由乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌和胰腺癌组成的组中的肿瘤。
98.如项目95所述的用于所述用途的组合物，其中，所述白血病为B细胞白血病、T细胞白血病、髓样白血病、急性淋巴细胞白血病或慢性髓样白血病。
99.如项目96所述的用于所述用途的组合物，其中，所述淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或B细胞淋巴瘤。
100.如项目1-99中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为表征为
I)CD19阳性；和/或
II)BCMA阳性；和/或
III)ROR1阳性；和/或
IV)FLT3阳性；和/或
V)CD20阳性；和/或
VI)CD22阳性；和/或
VII)CD123阳性；和/或
VIII)SLAMF7阳性
的癌症。
101.如项目100所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为CD19阳性。
102.如项目100所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为BCMA阳性。
103.如项目100所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为ROR1阳性。
104.如项目100所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为FLT3阳性。
105.如项目100所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为CD20阳性的。
106.如项目100所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为CD22阳性。
107.如项目100所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为CD123阳性。
108.如项目100所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为SLAMF7阳性。
109.如项目1-108中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述患者为不适合仅使用所述免疫疗法治疗所述癌症的患者。
110.如项目1-109中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述患者为不适合用表达嵌合抗原受体的T细胞进行常规过继免疫疗法的患者。
111.如项目1-110中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述患者发生细胞因子释放综合征的风险增加。
112.如项目1-111中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述患者发生与所述免疫疗法相关的神经毒性副作用的风险增加。
113.如项目1-112中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述患者发生与所述免疫疗法相关的靶向/脱靶的风险增加。
114.如项目1-113中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述患者中细胞因子的血清水平升高，所述细胞因子选自由IFN-γ、IL-6和MCP1组成的组中的一种或多种。
115.如项目1-114中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述患者为对所述免疫疗法产生免疫应答的患者，其中所述免疫应答为针对所述癌症进行所述免疫疗法的副作用。
116.如项目1-115中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述治疗方法为与同种异体的或自体的造血干细胞移植联合治疗的方法。
117.如项目1-116中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
118.如项目1-117中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，通过除口服施用以外的途径来施用所述组合物。
119.如项目1-118中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为除慢性髓细胞性白血病和急性淋巴细胞白血病以外的癌症。
120.一种组合物，其用于治疗患者中与免疫疗法相关的一种或多种副作用的方法的用途中，其中，所述组合物包含酪氨酸激酶抑制剂；
并且在所述方法中，所述组合物要施用于患者。
121.如项目120所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫疗法为如项目2-17和19-29中任一项所定义的免疫疗法。
122.如项目120-121任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为如项目18、90-108和119中任一项所定义的癌症。
123.如项目120-122任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述患者为如项目109-115中任一项所定义的患者。
124.如项目120-123任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述用途为如项目1-119中任一项所定义的用途。
125.如项目120-124中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述与免疫疗法相关的一种或多种副作用选自由：
I)细胞因子释放综合征，和/或
II)巨噬细胞活化综合征，和/或
III)脱靶毒性，和/或
IV)正常细胞和/或恶性细胞的靶向/脱靶(on-target/off-tumor)的识别，和/或
V)免疫治疗细胞的排斥，和/或
VI)免疫治疗细胞的意外活化，和/或
VII)免疫治疗细胞的进补信号传导和活化，和/或
VIII)神经毒性，和/或
IX)肿瘤溶解综合征组成的组。
126.如项目125所述的用于所述用途的组合物，其中，所述的与免疫疗法相关的副作用为细胞因子释放综合征。
127.如项目125所述的用于所述用途的组合物，其中，所述的与免疫疗法相关的副作用为脱靶毒性。
128.如项目125所述的用于所述用途的组合物，其中，所述的与免疫疗法相关的副作用为正常细胞和/或恶性细胞的靶向/脱靶的识别。
129.如项目125所述的用于所述用途的组合物，其中，所述的与免疫疗法相关的副作用为免疫治疗细胞的排斥。
130.如项目125所述的用于所述用途的组合物，其中，所述的与免疫疗法相关的副作用为免疫治疗细胞的意外活化。
131.如项目125所述的用于所述用途的组合物，其中，所述的与免疫疗法相关的副作用为免疫治疗细胞的强直信号和活化。
132.如项目125所述的用于所述用途的组合物，其中，所述的与免疫疗法相关的副作用为神经毒性。
133.如项目125所述的用于所述用途的组合物，其中，所述的与免疫疗法相关的副作用为肿瘤溶解综合征。
134.如项目126所述的用于所述用途的组合物，其中，所述细胞因子释放综合征的特征在于细胞因子的血清水平升高，所述细胞因子选自由GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8和IL-10组成的组中的一种或多种。
135.如项目134所述的用于所述用途的组合物，其中，所述用途为用于引起一种或多种所述升高的细胞因子的血清水平降低的用途。
136.如项目134-135中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述细胞因子释放综合征由所述免疫疗法引起。
137.一种组合物，其用于在治疗患者癌症的免疫疗法中用于调节表达嵌合抗原受体的细胞的方法的用途中，其中，所述组合物包含酪氨酸激酶抑制剂；
并且在所述方法中，所述组合物要施用于患者。
138.如项目137所述的用于所述用途的组合物，其中，所述免疫疗法为如项目2-17、19-29和125-136中任一项所定义的免疫疗法。
139.如项目137-138中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述癌症为如项目18、90-108和119中任一项所定义的癌症。
140.如项目137-139中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述患者为如项目109-115中任一项所定义的患者。
141.如项目137-140中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中，所述用途为如项目1-136中任一项所定义的用途。
142.一种组合物，其包含：
I)免疫细胞，以及
II)酪氨酸激酶抑制剂。
143.如项目142所述的组合物，其中，所述免疫细胞为如项目3-17、19-29和79-89中任一项所定义的免疫细胞。
144.如项目142-143中任一项所述的组合物，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂为如项目30-59中任一项所定义的酪氨酸激酶抑制剂。
145.如项目142-144中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含药学上可接受的载体。
146.I)免疫细胞，和
II)酪氨酸激酶抑制剂
的组合，其用于如项目1-141中任一项所述的用途。
147.如项目144所述的组合，其中，所述免疫细胞为如项目3-17、19-29和79-89中任一项所定义的免疫细胞。
148.如项目146-147中任一项所述的组合，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂为如项目30-59中任一项所定义的酪氨酸激酶抑制剂。
附图说明
图1：CAR构建体。
scFv：单链可变区片段(VH-(G4S)3接头-VL)。IgG4-FC铰链：免疫球蛋白G4的铰链域。CD28：CD28共刺激结构域。4-1BB：4-1BB共刺激结构域。3zeta(ζ)：CD3ζ刺激域。2A：T2A核糖体跳跃序列。tEGFR：截短的表皮生长因子受体。
(A)具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR。(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:9)
(B)具有CD28共刺激结构域的CD19 CAR。(SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:18)
(C)具有4-1BB共刺激结构域的ROR1 CAR。(SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:29)
(D)具有4-1BB共刺激结构域的SLAMF7 CAR(SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:40)
(E)具有CD28共刺激结构域的SLAMF7 CAR(SEQ ID NO:41-SEQ ID NO:51)
(A)至(E)的氨基酸序列在一个字母的氨基酸代码中以N端至C端的顺序表示。需注意，氨基酸序列的C末端由星号表示。
图2：达沙替尼可阻断CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性。
在基于生物发光的细胞毒性试验中，对CD8+ CAR-T细胞的体外细胞溶解活性进行了分析。图中显示了在不存在达沙替尼(0nM)的情况下和滴定剂量的达沙替尼(12,5-100nM)存在的情况下CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性。使用非CAR修饰的T细胞作为参考和对照，计算出CAR-T细胞介导的特异性裂解百分比。在12个小时内，以1小时的间隔时间测定特异性裂解。显示的数据是使用n＝3个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
A)达沙替尼阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞的细胞溶解活性。该测定中的靶细胞：K562/CD19。
B)达沙替尼阻断表达具有CD28共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞的细胞溶解活性。该测定中的靶细胞：K562/CD19。
C)达沙替尼阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的ROR1 CAR的CD8+ T细胞的细胞溶解活性。该测定中的靶细胞：K562/ROR1。
图3：达沙替尼阻断CD8+ CAR-T细胞中细胞因子的产生和分泌。
在不存在达沙替尼(0nM)或存在达沙替尼(6.25-100nM)的情况下，将CD8+ CAR-T细胞与抗原阳性(K562/CD19或K562/ROR1)的靶细胞共培养。在孵育20小时后，通过ELISA检测从这些共培养物中获得的上清液中的细胞因子IFN-γ和IL-2。响应抗原的刺激而特异性产生的每种细胞因子的量通过减去未受刺激时每种细胞因子的量而获得。图中显示了在达沙替尼存在的情况下，响应于抗原阳性靶细胞刺激而特异性产生的IFN-γ和IL-2的相对量(相对于在不存在达沙替尼的情况下释放的细胞因子的量归一化后的百分比)。除非另有说明，否则显示的数据是由n＝3个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。*p＜0.05，**p＜0.01。
A)达沙替尼阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞中IFN-γ(左图)和IL-2(右图)的产生和分泌。
B)达沙替尼阻断表达具有CD28共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞中IFN-γ(左图)和IL-2(右图，n＝2)的产生和分泌。
C)达沙替尼阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的ROR1 CAR的CD8+ T细胞中IFN-γ(左图)和IL-2(右图)的产生和分泌。
图4：达沙替尼可阻断CD8+ CAR-T细胞的增殖。
用CFSE标记CD8+ CAR-T细胞后，并将其在不存在达沙替尼(0nM)时或存在达沙替尼(3.125-100nM)时与抗原阳性(K562/CD19或K562/ROR1)的靶细胞共培养。孵育72小时后，通过流式细胞术分析CAR-T细胞的增殖，并测定增殖指数。图中显示了在达沙替尼存在的情况下响应于抗原阳性靶细胞刺激的相对增殖(相对于在不存在达沙替尼的情况下CAR-T细胞的增殖指数归一化后的百分比)。显示的数据是使用n＝3个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。*p＜0.05，**p＜0.01。
A)达沙替尼阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞的增殖。
B)达沙替尼阻断表达具有CD28共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞的增殖。
C)达沙替尼阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的ROR1 CAR的CD8+ T细胞的增殖。
图5：达沙替尼阻断了CD4+ CAR-T细胞中细胞因子的产生和分泌。
在不存在达沙替尼(0nM)或存在达沙替尼(3,125-100nM)的情况下，将CD4+ CAR-T细胞与抗原阳性(K562/CD19)的靶细胞共培养。在孵育20小时后，通过多重细胞因子测定法测定从这些共培养物中获得的上清液中的细胞因子GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-8。图中显示了特异性响应抗原阳性靶细胞刺激而产生的细胞因子的数量。显示的数据是使用n＝2个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
A)达沙替尼阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD4+ T细胞中细胞因子的产生和分泌。
B)达沙替尼阻断表达具有CD28共刺激结构域的CD19 CAR的CD4+ T细胞中细胞因子的产生和分泌。
图6：达沙替尼可阻断SLAMF7 CAR-T细胞的功能。
A)在基于生物发光的细胞毒性试验中分析了CD8+SLAMF7 CAR-T细胞的体外细胞溶解活性(上图：具有4-1BB共刺激结构域；下图：具有CD28共刺激结构域)。图中显示了在不存在达沙替尼(0nM)的情况下和存在滴定剂量的达沙替尼(20-100nM)的情况下，CD8+ CAR-T细胞对K562/SLAMF7的细胞溶解活性。使用非CAR修饰的T细胞作为参考和对照，计算出CAR-T细胞介导的特异性裂解百分比。在14个小时以内，以1小时的间隔时间测定特异性裂解。显示的数据是使用n＝2个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。
B)在不存在达沙替尼的情况下(0nM)或存在达沙替尼(20-100nM)的情况下，将CD8+SLAMF7 CAR-T细胞(浅灰色：具有4-1BB共刺激结构域；深灰色：具有CD28共刺激结构域)与抗原阳性(K562/SLAMF7)的靶细胞共培养。在孵育20小时后，通过ELISA测定从这些共培养物中获得的上清液中的细胞因子IFN-γ(左图)和IL-2(右图)。响应抗原的刺激而特异性产生的每种细胞因子的量通过减去未受刺激时每种细胞因子的量而获得。图中显示了在存在达沙替尼的情况下，响应于抗原阳性靶细胞刺激而特异性产生的IFN-γ和IL-2的相对量(相对于在不存在达沙替尼的情况下释放的细胞因子的量归一化后的百分比)。显示的数据是使用n＝2个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。***p＜0.001。
C)在不存在达沙替尼的情况下(0nM)或存在达沙替尼(20-100nM)的情况下，将CD4+SLAMF7 CAR-T细胞(浅灰色：具有4-1BB共刺激结构域；深灰色：具有CD28共刺激结构域)与抗原阳性(K562/SLAMF7)的靶细胞共培养。在孵育20小时后，通过ELISA测定从这些共培养物中获得的上清液中的细胞因子IFN-γ(左图)和IL-2(右图)。响应抗原的刺激而特异性产生的每种细胞因子的量通过减去未受刺激时每种细胞因子的量而获得。图中显示了在存在达沙替尼的情况下，响应于抗原阳性靶细胞刺激而特异性产生的IFN-γ和IL-2的相对量(相对于在不存在达沙替尼的情况下释放的细胞因子的量归一化后的百分比)。显示的数据是使用n＝2个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。***p<0.001，
图7：达沙替尼可阻断参与CAR信号传导的酪氨酸激酶的磷酸化。
在不存在达沙替尼(达沙替尼-)的情况下或存在达沙替尼(100nM；达沙替尼+)的情况下，将表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞与RCH-ACV靶细胞共培养。进行蛋白质印迹测定以确定Lck/Src家族激酶(Y416)，CAR相关CD3ζ(Y142)，ZAP70(Y319)的磷酸化和总蛋白表达。
A)Western印迹显示了在经达沙替尼处理的T细胞和未经达沙替尼处理的T细胞中，Src家族激酶(Y416)、与CAR相关的CD3ζ(Y142)、ZAP70(Y319)的磷酸化以及相应的蛋白Lck、CD3ζ和ZAP70的总表达。β-肌动蛋白被染色作为上样对照，用于归一化处理。
B)图中显示了未经达沙替尼处理的T细胞(100％)相对于经达沙替尼处理的T细胞的相对磷酸化(百分比)。在n＝3个独立实验中通过定量Western印迹测定获得的汇总数据。*p＜0.05。
图8：达沙替尼可阻断NFAT介导的CD8+和CD4+ CAR-T细胞中GFP的表达。
用NFAT诱导型GFP报告基因修饰表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+(左图)T细胞和CD4+(右图)T细胞。然后在存在达沙替尼(100nM；达沙替尼+)或不存在达沙替尼(达沙替尼-)的情况下，用CD19阳性(Raji)的靶细胞或CD19阴性(K562)的靶细胞刺激T细胞24小时，然后通过流式细胞术分析报告基因的诱导。图中显示了FITC通道中GFP(绿色荧光蛋白)的平均荧光强度(MFI)。结果显示了在n＝3个独立实验中获得的汇总数据。**p<0.01，***p<0.001。
图9：达沙替尼的阻断作用不会降低CAR-T细胞的生存活力
在不存在达沙替尼(达沙替尼-)或存在达沙替尼(100nM，达沙替尼+)的情况下，将表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞与CD19阳性的靶细胞(K562/CD19)共培养24小时。在一种情况下，在共培养[dasatinib(+)]开始后1小时将达沙替尼添加到培养基中。共培养结束时，通过流式细胞仪测定存活T细胞(Annexin-V-/7-AAD-)、凋亡T细胞(Annexin-V+/7-AAD-)和死亡T细胞(Annexin-V+/7-AAD+)。图中显示了在n＝3个独立实验中获得的存活T细胞、凋亡T细胞和死亡T细胞的平均百分比。*p＜0.05。
图10：达沙替尼可阻断活化的CD8+ CAR-T细胞的功能。
A)达沙替尼阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的活化CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性。如图2所示，在体外基于生物发光的细胞毒性试验中分析了CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性体外。在细胞毒性试验开始时(0h)或在细胞毒性试验后1小时(1h)添加达沙替尼(100nM)。结果显示了在n＝3个独立实验中获得的汇总数据。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
B)达沙替尼阻断了活化CD8+ CAR-T细胞的细胞因子的产生和分泌。通过ELISA分析细胞因子的产生和分泌，如图3所示。在共培养开始时(0h)或在共培养开始后2小时(+2h)加入达沙替尼(100nM)。结果显示了在n＝3个独立实验中获得的汇总数据。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
C)达沙替尼阻断活化的CD8+ CAR-T细胞的增殖。通过CFSE染料稀释来分析增殖，如图4所示。在共培养开始时(0h)或共培养开始后1小时(+1h)、3小时(+3h)或48小时(+48h)加入达沙替尼(100nM)。结果显示了在n＝3个独立实验中获得的汇总数据。*p＜0.05，***p＜0.001。
图11：达沙替尼可防止连续刺激期间CAR-T细胞的活化
用NFAT诱导型GFP报告基因修饰表达了具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+(左图)T细胞和CD4+(右图)T细胞。然后每24小时用CD19阳性(Raji)靶细胞刺激T细胞。在测定开始时(黑圈)或测定开始后一小时(dasa+1h，灰色圈)添加达沙替尼，然后每24小时与新的靶细胞同时加入培养基中。使用未经处理的CAR T细胞作为比较(未经处理的白色圆圈)。通过流式细胞术分析报告基因的诱导。图中显示了FITC通道中GFP(绿色荧光蛋白)的平均荧光强度(MFI)。显示的数据是在n＝2次实验(CD8+)和n＝3次实验(CD4+)中使用来自不同健康供体的T细胞获得的平均值+SD。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)进行分析。
图12：短期暴露于达沙替尼后，可以快速、完全地逆转对CAR-T细胞功能的阻断作用。
短时间内，即暴露于达沙替尼2小时后，可以迅速、完全地逆转对CAR-T细胞的细胞溶解活性的阻断作用。如图2所示，在体外基于生物发光的细胞毒性试验中分析了CD8+CAR-T细胞的体外细胞溶解活性。在细胞毒性试验开始时(-2h)添加了达沙替尼(100nM)，然后将其洗掉(0小时)。未暴露于达沙替尼(0nM)的CD8+ CAR-T细胞作为参考。***p＜0.001。
A)用表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞进行测定。所示数据是在n＝3个独立实验中获得的汇总数据。
B)用表达具有CD28共刺激结构域CD19 CAR的CD8+ T细胞与进行测定。所示数据是在n＝2个独立实验中获得的汇总数据。
图13：长期暴露于达沙替尼不会降低CAR-T细胞的生存活力。
表达了具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞培养在含有达沙替尼[100nM，(+)]的培养基中。共培养之前[d0(-)]、共培养之后的第2天(d2)和之后的第8天(d8)，通过流式细胞仪测定存活T细胞(Annexin-V-/7-AAD-)、凋亡T细胞(Annexin-V+/7-AAD-)和死亡T细胞(Annexin-V+/7-AAD+)的百分比。将未处理的CD8+ CAR-T细胞[(-)]染色以在这些参考日分别进行比较。图中显示了从一位健康供体获得的的数据中存活T细胞、凋亡T细胞和死亡T细胞的平均百分比。
图14：长期暴露于达沙替尼后，可以迅速、完全地逆转对CAR-T细胞功能的阻断作用。长期暴露于达沙替尼后，对CAR-T细胞功能的阻断仍然有效。
A)长期暴露于达沙替尼并随后除去达沙替尼后，可迅速且完全地逆转对CAR-T细胞的细胞溶解活性的阻断作用。长期暴露于达沙替尼后，对CAR-T细胞的细胞溶解活性的阻断仍然有效。
表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞培养在含有达沙替尼(100nM)的培养基中。1天后(左图)和7天后(右图)，将等分试样的CD8+ CAR-T细胞洗涤，并在体外基于生物发光的细胞毒性试验中分析其体外细胞溶解活性，如图2所示。为了分析长期暴露于达沙替尼后是否仍能有效抑制其细胞溶解活性，在细胞毒性试验开始时，将达沙替尼添加至共培养物中至终浓度为100nM。显示的数据是使用n＝3个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。
图例说明：无dasa/无dasa：在1天或7天的培养过程中未暴露于达沙替尼，并且在细胞毒性测定过程中不存在达沙替尼。无dasa/dasa：在1天或7天的培养过程中未暴露于达沙替尼，在细胞毒性测定过程中存在达沙替尼。dasa/无dasa：在1天或7天的培养过程中暴露于达沙替尼，而在细胞毒性测定中不存在达沙替尼。dasa/dasa：在1天或7天的培养过程中暴露于达沙替尼，在细胞毒性测定过程中存在达沙替尼。***p＜0.001。
B)长期暴露于达沙替尼并随后除去达沙替尼后，可快速且完全地逆转对CAR-T细胞的细胞因子产生和分泌的阻断；长期暴露于达沙替尼后，对CAR-T细胞细胞因子的产生和分泌的阻断仍然有效。
表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞培养在含有达沙替尼(100nM)的培养基中。1天后和7天后，将等分试样的CD8+ CAR-T细胞洗涤，分析其产生和分泌的细胞因子，如图3所示。为了分析长期暴露于达沙替尼后是否仍能有效阻断其细胞因子的产生和分泌，在共培养开始时添加达沙替尼至最终浓度为100nM。显示的数据是使用n＝3个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。
图例说明：Dasa pre-：在1天或7天的培养过程中未暴露于达沙替尼。Dasa pre 1：暴露于达沙替尼1天。Dasa pre 7：暴露于达沙替尼7天。Dasa during-：在共培养以进行细胞因子测定的过程中不存在达沙替尼。Dasa during+：在共培养以进行细胞因子测定的过程中存在达沙替尼。***p＜0.001。
C)长期暴露于达沙替尼并随后除去达沙替尼后，可快速且完全地逆转对CAR-T细胞增殖的阻断作用；长期暴露于达沙替尼后，对CAR-T细胞增殖的阻断仍然有效。
表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞培养在含有达沙替尼(100nM)的培养基中。1天后和7天后，将等分试样的CD8+ CAR-T细胞洗涤，然后进行增殖分析，如图4所示。为了分析长期暴露于达沙替尼后是否仍能有效阻止其增殖，在共培养开始时添加达沙替尼至终浓度为100nM。显示的数据是使用n＝3个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。
图例说明：Dasa pre-：在1天或7天的培养过程中未暴露于达沙替尼。Dasa pre 1：暴露于达沙替尼1天。Dasa pre 7：暴露于达沙替尼7天。Dasa during-：在共培养以进行增殖测定的过程中不存在达沙替尼。Dasa during+：共培养以进行增殖测定的过程中存在达沙替尼。**p<0.01，***p<0.001。
图15：达沙替尼可在体内阻断CAR-T细胞分泌细胞因子并且预防细胞因子释放综合征。
A)实验设置和治疗方案：第-7天通过尾静脉内注射萤火虫荧光素酶转导的Raji肿瘤细胞对NSG小鼠进行接种；从第0天的第0小时起至第1天的第30小时之间，每6小时通过腹腔注射达沙替尼一次(总共6剂)。在第0天的第3小时施用CAR-T细胞(即CD8+ CD19 CAR/4-1BB T细胞和CD4+ CD19 CAR/4-1BB T细胞，总剂量：5×10e6；CD8：CD4比＝1:1)或未转导的对照T细胞。在第-1天、第1天和第3天进行生物发光成像以测定肿瘤负荷。在第1天的第33小时和第3天，处死各组小鼠并分析其外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(SP)。
B)在第1天的第33小时和第3天通过多重细胞因子分析测定小鼠血清中的细胞因子水平。图中显示了分别在用未转导的对照T细胞治疗且未接受达沙替尼的小鼠组(ctrl/-)、用CD19 CAR-T细胞治疗且未接受达沙替尼(CAR/-)的小鼠组、用CD19 CAR-T细胞治疗且接受达沙替尼的小鼠组(CAR/+)中获得的GM-CSF、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-5和IL-6。*p<0.05；**p＜0.01。
C)在第-1天、第1天和第3天通过生物发光成像测定Raji肿瘤负荷。图中显示了在第-1天和第1天之间(黑色柱)以及第1天和第3天之间(灰色柱)分别在用未转导的对照T细胞治疗且未接受达沙替尼治疗的小鼠组(ctrl/-)、用未转导的对照T细胞治疗且接受达沙替尼的小鼠组(ctrl/+)、用CD19 CAR-T细胞治疗且未接受达沙替尼(CAR/-)的小鼠组、用CD19 CAR-T细胞且接受达沙替尼的小鼠组(CAR/+)中获得的生物发光信号的平均倍数变化。**p<0.01；***p＜0.001。
D)在第1天和第3天通过流式细胞仪分析了外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(Sp)中过继转移的CAR修饰的T细胞和对照未转导的T细胞的存在。图中显示了CAR修饰的T细胞和对照的未转导T细胞(鉴定为人CD3+/人CD45+)的频率，以活细胞(7-AAD-)的百分比表示。
图例说明：对照/未处理：小鼠接受了未转导的对照T细胞，未接受达沙替尼的处理；对照/处理：小鼠接受未转导的对照T细胞并接受了达沙替尼的处理；CAR/未处理：小鼠接受了CD19 CAR-T细胞，未接受达沙替尼的处理；CAR/处理：小鼠接受了CD19 CAR-T细胞，并接受了达沙替尼的处理。
E)过继转移的CD19 CAR/4-1BB修饰的T细胞和未转导的对照T细胞也已带有NFAT诱导型GFP报告基因。通过流式细胞术分析了在骨髓(底部图)和脾脏(顶部图)中CAR修饰的T细胞和对照T细胞中GFP-报告基因的表达。图中显示了CAR修饰的T细胞和对照的未转导T细胞(鉴定为人CD3+/人CD45+)中GFP的平均荧光强度(MFI)。
图例说明：对照/未处理：小鼠接受了未转导的对照T细胞，未接受达沙替尼的处理；对照/处理：小鼠接受未转导的对照T细胞并接受达沙替尼的处理；CAR/未处理：小鼠接受CD19 CAR-T细胞，未接受达沙替尼的处理；CAR/处理：小鼠接受了CD19 CAR-T细胞，并接受了达沙替尼的处理。
*p＜0.05；**p<0.01；***p＜0.001。
图16：达沙替尼暂停了活化的CD19 CAR/4-1BB-T细胞，使其在体内呈现功能关闭状态
A)实验设置和治疗方案：在第0天通过尾静脉内注射萤火虫荧光素酶转导的Raji肿瘤细胞对NSG小鼠进行接种。在第7天施用CAR-T细胞(即CD8+ CD19 CAR/4-1BB T细胞和CD4+ CD19 CAR/4-1BB T细胞，总剂量：5×10e6；CD8:CD4比＝1：1)或未转导的对照T细胞。在第10天至第12天之间每6个小时施用达沙替尼(总共8剂)，以创建功能开关开(ON OFFON)序列。在第7、10、12、14、17天进行生物发光成像和采血，随后每周一次(dx)继续进行生物发光成像以测定肿瘤负荷。
B)以随着时间变化的腹侧平均发光来检测的肿瘤负荷的发展。上图显示了单个小鼠中的发展情况，下图显示了每个治疗组的平均BLI。图例说明：ctrl(开/关/开，ON/OFF/ON)：小鼠在第10天至第12天之间接受了未转导的对照T细胞和达沙替尼的治疗；CAR(开，ON)：小鼠在第10天至第12天之间小鼠接受了CD19 CAR-T细胞但未接受达沙替尼的治疗；CAR(开/关/开，ON/OFF/ON)：小鼠在第10天到第12天之间接受了CD19 CAR-T细胞和达沙替尼的治疗。
C)图中显示从使用了未转导的对照T细胞和达沙替尼进行治疗的小鼠组(ctrl(ON/OFF/ON))、使用了CD19 CAR-T细胞且未使用达沙替尼进行治疗的小鼠组(CAR(ON))、使用了CD19 CAR-T细胞和达沙替尼(CAR(ON/OFF/ON)进行治疗的小鼠组中获得的指定天数之间肿瘤负荷的相对变化。**p<0.01；***p<0.001。
D)通过多重细胞因子分析在第10天、第12天、第14天和第17天获得的样品中测定小鼠血清中的细胞因子水平。图中显示了IFN-γ的浓度：左图显示了平均的IFNγ和各个数据点。右图显示了每个治疗组中每只小鼠的发展情况。*p<0.05；**p＜0.01。
图例说明：ctrl(开/关/开，ON/OFF/ON)：小鼠在第10天至第12天之间接受了未转导的对照T细胞和达沙替尼的治疗；CAR(开，ON)：小鼠接受了CD19 CAR-T细胞，未接受达沙替尼的治疗。CAR(开/关/开，ON/OFF/ON)：小鼠在第10天到第12天之间接受了CD19 CAR-T细胞和达沙替尼的治疗。
图17：达沙替尼暂停了活化的CD19 CAR/CD28-T细胞，使其在体内呈现功能关闭的状态
A)实验设置和治疗方案：第0天通过尾静脉内注射萤火虫荧光素酶转导的Raji肿瘤细胞对NSG小鼠进行接种。在第7天施用CAR-T细胞(即CD8+和CD4+ CD19 CAR/CD28 T细胞，总剂量：5×10e6；CD8:CD4比＝1:1)或未转导的对照T细胞。在第10天到第12天之间每6个小时施用一次达沙替尼(总共8剂)，以创建功能开关开(ON OFF ON)序列。在第7、10、12、14、17天进行生物发光成像和采血，随后继续每周一次(dx)进行生物发光成像以测定肿瘤负荷。
B)以随着时间变化的腹侧平均发光来检测的肿瘤负荷的发展。左图显示了每个治疗组的平均BLI。右图显示了单个小鼠的发展情况。
图例说明：CAR/Dasa：小鼠在第10天至第12天之间接受了CD19/CD28 CAR-T细胞和达沙替尼的治疗；CAR/DMSO：小鼠在第10天到第12天之间接受了CD19 CAR-T细胞，未接受达沙替尼的治疗，但接受了媒介物的注射；ctrl/Dasa：小鼠在第10天到第12天之间接受了未转导的对照T细胞和达沙替尼的治疗；CAR/-：小鼠仅接受了CD19 CAR-T细胞的治疗，未注射其他物质。
C)图中显示指定天数之间肿瘤负荷的相对变化；根据图例治疗过的一组小鼠中获得相关数据。
图例说明：ctrl/Dasa：小鼠在第10天到第12天之间接受了未转导的对照T细胞和达沙替尼的治疗；CAR/Dasa：小鼠在第10天到第12天之间接受了CD19/CD28 CAR-T细胞和达沙替尼的治疗；CAR/DMSO：小鼠在第10天到第12天之间接受了CD19 CAR-T细胞，未接受达沙替尼的治疗，但接受了媒介物的注射；CAR/-：小鼠仅接受了CD19 CAR-T细胞的治疗，未注射其他物质。**p<0.01；***p＜0.001。
图18：与地塞米松(dexamethasone)相比，达沙替尼能够更好地控制CAR-T细胞的功能。
A)与地塞米松相比，达沙替尼能够更好地控制CAR-T细胞的细胞溶解活性
在体外基于生物发光的细胞毒性试验中，分析了表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞的体外细胞溶解活性。图中显示了不存在地塞米松(0μM)的情况和存在滴定剂量的地塞米松(0.1-100μM)的情况下CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性(上图)。在一些实验中，将T细胞用地塞米松按指定剂量预处理24小时，并如上所述进行细胞毒性测定(下图)。图中显示了在存在0.1μM达沙替尼的情况下CAR-T细胞的细胞溶解活性作为参考以用于比较。使用非特异性对照T细胞计算由CAR-T细胞介导的特异性裂解百分比，10小时内每1小时测定一次。显示的数据是使用n＝3个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。*p＜0.05，***p＜0.001。
B)与地塞米松相比，达沙替尼能够更好地控制CAR-T细胞中的细胞因子的产生和分泌
不存在地塞米松(0μM)的情况或存在地塞米松(0.1-100μM)的情况下，将CD8+CAR-T细胞与抗原阳性(K562/CD19)的靶细胞共培养。在孵育20个小时后，通过ELISA检测从这些共培养物中获得的上清液中的细胞因子IFN-γ和IL-2。通过从用K562/CD19抗原阳性的靶细胞刺激后获得的量中减去未刺激时获得的量，来测定响应于抗原的刺激而特异性产生的每种细胞因子的量。图中显示了用抗原阳性的靶细胞刺激而特异性产生的IFN-γ(上图，灰色柱)和IL-2(下图，灰色柱)的相对量(以百分比表示，以不进行治疗的情况下释放的细胞因子的量进行归一化)。在某些实验中，将T细胞用地塞米松按指定剂量预处理24小时(黑色柱)。图中显示了在存在0.1μM达沙替尼的情况下CAR-T细胞产生的细胞因子作为参考以用于比较。显示的数据是使用n＝3个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。*p＜0.05，**p＜0.01。
C)就CD8+ CAR-T细胞的增殖而言，与地塞米松相比，达沙替尼能够更好地控制CAR-T细胞的增殖
用CFSE标记CD8+ CAR-T细胞，并在不存在地塞米松(0μM)的情况或存在地塞米松(0.1-100μM)的情况下与抗原阳性(K562/CD19)的靶细胞共培养。孵育72小时后，通过流式细胞术分析CAR-T细胞的增殖，并测定增殖指数。图中显示了响应于抗原阳性靶细胞刺激的相对增殖(以百分比表示，以未治疗时CAR-T细胞的增殖指数进行归一化)(灰色柱)。在某些实验中，将T细胞用地塞米松按指定剂量预处理24小时(黑色柱)。图中显示了在存在0.1μM达沙替尼的情况下CAR-T细胞的增殖作为参考以用于比较。显示的数据是使用n＝3个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。***p＜0.001。
图19：达沙替尼和其他临床批准的酪氨酸激酶抑制剂对CAR-T细胞功能的影响。
A)细胞溶解活性：在基于生物发光的细胞毒性试验中分析了表达具有4-1BB共刺激结构域的ROR1 CAR的CD8+ T细胞的细胞溶解活性。图中显示了在存在100nM达沙替尼、5.3μM伊马替尼(imatinib)、4.2μM拉帕替尼(lapatinib)和3.6μM尼洛替尼(nilotinib)的情况下、或未作处理的对照中的细胞溶解活性。使用非特异性对照T细胞作为参考，计算由CAR-T细胞介导的抗原阳性靶细胞(RCH-ACV)的特异性裂解百分比，8个小时内每隔1小时检测一次。显示的数据是使用n＝2个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。
B)IFN-γ的产生：在存在100nM达沙替尼、5.3μM伊马替尼、4.2μM拉帕替尼和3.6μM尼洛替尼的情况下，或未作处理作为对照的情况下，将表达具有4-1BB共刺激结构域的ROR1CAR的CD8+ CAR-T细胞与抗原阳性(RCH-ACV)靶细胞共培养。在孵育20小时后，通过ELISA检测从这些共培养物中获得的上清液中的IFN-培。通过从抗原阳性靶细胞获得的量中减去未刺激时获得的量，来确定特异性响应于抗原而产生的IFN-，的量。显示的数据是使用n＝2个供体制备的CAR-T细胞系在独立实验中获得的汇总数据。
C)增殖：用CFSE标记表达具有4-1BB共刺激结构域的ROR1 CAR的CD8+ T细胞，并在存在100nM达沙替尼、5.3μM伊马替尼、4.2μM拉帕替尼和3.6μM尼洛替尼的情况下、或未作处理作为对照的情况下与抗原阳性(RCH-ACV)靶细胞共培养。孵育72小时后，通过流式细胞术分析CAR-T细胞的增殖。直方图下方的表格分别提供了分别经历≥3/2/1次细胞分裂的CAR-T细胞的百分比。
图20：达沙替尼和其他Src激酶抑制剂对CAR-T细胞细胞溶解活性的影响。
在基于生物发光的细胞毒性试验中分析了表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19CAR的CD8+ T细胞的细胞溶解活性。图中显示了在存在滴定剂量(1-1000nM)的塞卡替尼(saracatinib)、博舒替尼(bosutinib)、PP1抑制剂或达沙替尼的情况下，CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性。共培养4小时后，确定与未转导的对照T细胞相比，抗原阳性靶细胞(K562/CD19)的特异性裂解百分比。
图21：间歇性暴露于达沙替尼可增强CAR-T细胞的体内抗肿瘤功能。
A)实验设置和治疗方案：第0天通过尾静脉内注射萤火虫荧光素酶转导的Raji肿瘤细胞对NSG小鼠进行接种。第7天通过尾静脉注射施用CAR-T细胞(即表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞和CD4+ T细胞，总剂量：5×10e6；CD8:CD4比＝1:1)或对照未转导的T细胞。从第7天至第11天之间，每24小时腹腔注射一次达沙替尼，然后在第12天和第14天之间每36小时腹腔注射一次达沙替尼(总共7剂)。进行连续生物发光成像以测定肿瘤负担。在第15天，处死小鼠并分析其外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(SP)。
B)通过生物发光成像评估肿瘤负荷。图中显示了背侧生物发光信号，以平均辐射度p/s/cm2/sr表示，该信号是从涵盖了各个治疗组中每只小鼠整个背侧的目标区域获得的。每个组中由两只动物组成。
图例说明：ctrl/-：小鼠接受了未转导的对照T细胞，没有接受达沙替尼的治疗；ctrl/+：小鼠接受了未转导的对照T细胞并接受了达沙替尼的治疗；CAR/-：小鼠已接受CD19CAR-T细胞，未接受达沙替尼的治疗；CAR/+：小鼠接受了CD19 CAR-T细胞，并接受了达沙替尼的治疗。
图22：间歇性暴露于达沙替尼会增强体内CAR-T细胞的移植、增殖和持久性。
实验设置和治疗方案与图21A相同。通过流式细胞术分析了外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(SP)中过继转移的CD19 CAR修饰的T细胞和未转导的对照T细胞的存在。
A)从接受CD19 CAR-T细胞但未接受达沙替尼的治疗组(CD19 CAR，上图)，以及接受CD19 CAR-T细胞和达沙替尼的治疗组(下图)的示例性小鼠中获得的门控策略和数据。
B)图中显示了CAR修饰的T细胞和对照的未转导的T细胞(鉴定为人CD3+/人CD45+)的频率，以活细胞(7-AAD-)的百分比表示。每个组由两只动物组成。
图例说明：ctrl/-：小鼠接受了未转导的对照T细胞，没有接受达沙替尼的治疗；ctrl/+：小鼠接受了未转导的对照T细胞并接受了达沙替尼的治疗；CAR/-：小鼠接受了CD19CAR-T细胞，未接受达沙的替尼治疗；CAR/+：小鼠接受了CD19 CAR-T细胞，并接受了达沙替尼的治疗。
图23：使用了达沙替尼的间歇性治疗降低了CAR-T细胞上PD1的表达。
实验设置和治疗方案与图21A相同。
图中显示了用抗PD1单抗染色后获得的CD-19CAR/4-1BB T细胞上PD-1的表达，以平均荧光强度表示(MDI)。每个组由4只动物组成。**p<0.01；***p＜0.001。
图例说明：CAR/-：小鼠接受了CD19 CAR-T细胞，但未接受达沙替尼的治疗(黑色柱)；CAR/+：小鼠接受了CD19 CAR-T细胞，并接受了达沙替尼的治疗(灰色柱)。
图24：被达沙替尼阻断的CAR-T细胞易于之后被iCasp9自杀基因消除。
用iCapase9自杀基因修饰表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞。在不存在达沙替尼或存在100nM达沙替尼的情况下以及不存在iCaspase诱导剂药物或存在iCaspase诱导剂药物的情况下，在补充有50U/ml IL-2的培养基中培养T细胞。24小时后，用抗CD3 mAB标记细胞，并通过流式细胞仪分析iCasp+ T细胞的存在。
图中显示了iCasp+细胞的百分比，以CAR-T细胞的百分比表示。
发明详述
基因修饰的CAR-T细胞的过继免疫疗法是医学领域一个快速发展的转化研究领域。已证明CD19特异性CAR-T细胞可在晚期白血病患者和淋巴瘤患者中诱导持续的完全缓解[2],[7],[10],[19],[20]。与CAR-T细胞疗法相关的主要问题涉及可能会危及生命的急性和慢性的副作用。一旦将这些工程改造的T细胞注入患者体内，便无法控制其功能和命运。
当前用于治疗CAR-T细胞疗法副作用的策略包括尝试中和与CRS临床发生有关的细胞因子如IL-6；使用类固醇来降低CAR-T细胞的活性，并引入自杀基因和耗竭标记以消除CAR-T细胞。所有这些策略都具有重大缺陷：如果细胞因子与其受体的结合作用是尝试中和或阻止该结合，这是一种对症处理，不会对CAR-T细胞本身产生直接影响；类固醇对CAR-T细胞仅发挥不完全的控制作用，无法预防或阻止CRS和其他副作用；自杀基因和耗竭标记旨在消除CAR-T细胞同时也会终止抗肿瘤作用，这是患者和医生所不希望的。当前没有已知的策略能够使得患者或治疗医师对患者体内CAR-T细胞的功能进行精确、及时地控制。
本发明中，达沙替尼被用于控制患者体内CAR-T细胞的功能，并使患者和医师在输注CAR-T细胞后能够对其进行精确、及时地“远程控制”。
本发明中，达沙替尼呈现出对CAR信号传导的剂量依赖性且可滴定的抑制作用，确保了CAR-T细胞功能的发挥。根据达沙替尼的剂量的不同，CAR-T细胞的功能可能会部分地受阻或完全受阻。达沙替尼诱导的CAR-T细胞的功能阻断可用于减轻或预防患者体内的毒性，并控制CAR-T细胞的功能(请参见实施例2)。
本发明中，达沙替尼能够快速地、即刻地功能性阻断CAR-T细胞。如果达沙替尼的浓度超过一定阈值，则阻断是完全的阻断(即完全抑制了CAR-T细胞的细胞溶解活性、细胞因子的分泌和增殖)。低于此阈值，达沙替尼会部分地阻断CAR-T细胞的功能。达沙替尼诱导的CAR-T细胞抑制/阻断的机制包括但不限于通过干扰内源性Src激酶如Lck的磷酸化以及干扰转录因子如NFAT的形成和功能来阻断CAR的信号传导(参见实施例2)。
本发明中，达沙替尼能够抑制和阻断CD8+ T细胞和CD4+ T细胞中的CAR-T细胞的功能，并且普遍适用于至少部分使用了通过内源性Src激酶如Lck和转录因子如NFAT进行信号传导的任何合成的受体构建体(请参见实施例2)。
本发明不仅能够防止休眠的(静止的)未活化的CAR-T细胞的活化，而且能够阻断已经被活化的CAR-T细胞的功能并在发挥其效应子功能的过程中发挥作用(参见实施例3)。鉴于在CRS的临床诊断和副作用的临床表现时，患者体内的CAR-T细胞已经被活化，因此上述功能尤其重要。
本发明中，达沙替尼对CAR-T细胞功能的阻断作用是快速且完全可逆的(参见实施例5)。CAR-T细胞暴露于达沙替尼中既不会降低其生存活力，也不会损害其随后恢复其抗肿瘤功能的能力(参见实施例5)。这与使用类固醇(降低CAR-T细胞的生存活力并损害其后续的功能)(参见实施例9)和自杀基因/耗竭标志物来终止CAR-T细胞(参见实施例13)有着非常重要且明显的区别。本发明中，达沙替尼能够完全控制所有CAR-T细胞的功能(即细胞溶解活性、包括IFN-活和IL-2在内的细胞因子分泌、增殖)，而类固醇仅干扰IL-2的分泌和增殖，但不抑制细胞溶解或IFN-殖的分泌(参见实施例2和9)。
本发明中，只要达沙替尼的浓度保持在一定阈值之上，达沙替尼对CAR-T细胞的阻断作用就是有效的，并且患者或治疗医师可以根据需要进行延长和持续(参见实施例5)。
本发明中，达沙替尼可用于预防、减轻或治疗在CAR-T细胞疗法期间或CAR-T细胞疗法之后发生的副作用。特别地，达沙替尼可用于减轻、预防和/或治疗细胞因子释放综合征(参见实施例6)。
本发明中，达沙替尼可以以适合于在患者体内达到所需浓度(例如血清水平)的任何方式进行施用。作为非限制性实例，所述方式可以包括使用任何种类的泵送、输注、注射和/或口服进行施用。
本发明中，其他干扰内源性Src激酶如Lck和转录因子如NFAT的化合物也可实现对CAR-T细胞功能的抑制和/或阻断(参见实施例10)。
本发明中，达沙替尼还可用于增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能。如实施例11所示，间歇性地暴露于达沙替尼会导致在遇到肿瘤细胞后CAR-T细胞的生存活力增加。此外，在体内过继转移后，CAR-T细胞间歇性暴露于达沙替尼会导致更佳的移植、增殖和持久性。此外，CAR-T细胞间歇性暴露于达沙替尼能够使得体内产生优异的抗肿瘤功能。
本发明中，达沙替尼还可以用于减少CAR-T细胞上包括但不限于PD-1的检查点分子的表达(参见实施例12)。因此，本发明还包括达沙替尼用于增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能的用途。
达沙替尼能够干扰并完全阻断CAR-T细胞功能，这一发现是无法预料且不可预见的。CAR是合成的经设计的受体，其包含在非基因修饰的人T细胞中存在的氨基酸序列和蛋白质结构域。然而，这些氨基酸序列和结构域是以新的和人工的方式进行结合，并且目前关于这些结构域如何在CAR中起作用并产生/传输其信号尚无或仅有非常有限的知识。
在间歇性地暴露于达沙替尼后，达沙替尼能够增强CAR-T细胞的功能并降低CAR-T细胞上PD1的表达，这一发现是无法预料且不可预见的。相反，人们可能预期将CAR-T细胞与达沙替尼接触不会产生任何作用，也不会产生毒性作用。
定义和实施方案
除非下文另外定义，否则应根据本领域技术人员公知的一般含义来理解本发明中使用的术语。
本发明中引用的每个出版物、专利申请、专利和其他参考文献在不与本发明矛盾的情况下出于所有目的通过引用其全文并入本发明。通过在方括号中的参考编号和相应的参考详细信息来表示参考文献，在“参考文献”部分中有提供这些参考文献的详细信息。
本发明所述的“激酶抑制剂”是通过与所述激酶结合并对所述激酶发挥抑制作用而抑制一种或多种激酶的分子化合物。激酶抑制剂能够与一种或多种激酶的种类结合，从而使得一种或多种激酶的激酶活性降低。本发明所指的激酶抑制剂通常是小分子，其中小分子是低分子量(通常小于1kDa)和小尺寸(直径通常小于1nm)的分子化合物。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂。在一个优选的实施方案中，激酶抑制剂是Src激酶抑制剂。在一个更优选的实施方案中，激酶抑制剂是Lck抑制剂。在一个非常优选的实施方案中，激酶抑制剂是达沙替尼。
术语“KD”或“KD值”涉及本领域已知的平衡解离常数。在本发明的上下文中，这些术语可以涉及靶向剂(例如CAR T细胞)相对于特定靶向抗原(例如CD19、ROR1、BCMA或FLT3)的平衡解离常数。平衡解离常数是复合物(例如抗原-靶向剂复合物)可逆地解离为其组分(例如抗原和靶向剂)的倾向的度量。测定KD值的方法是本领域已知的。
应当理解的是，诸如“酪氨酸激酶抑制剂”之类的术语是指存在一种激酶抑制剂，但不排除存在其他的激酶抑制剂例如一种、两种、三种或更多种其他的激酶抑制剂的可能性。在本发明的一个实施方案中，仅使用了一种激酶抑制剂。
在一个实施方案中，嵌合抗原受体能够结合抗原，优选癌症抗原，更优选癌细胞表面抗原。在一个优选的实施方案中，嵌合抗原受体能够结合癌症抗原的细胞外结构域。
在优选的实施方案中，嵌合抗原受体在免疫细胞中表达，优选在T细胞中表达。在本发明的优选实施例中，嵌合抗原受体在T细胞中表达，并使得所述T细胞高特异性地与表达抗原的癌细胞结合，从而对所述癌细胞产生生长抑制作用，优选产生细胞毒性作用。
如本发明所述，“过继免疫疗法”是指将免疫细胞转移到患者体内以靶向治疗癌症。这些细胞可能是源于患者或其他个体。在过继免疫疗法中，通常从个体、优选从患者中提取免疫细胞，优选提取T细胞，对其进行基因修饰并在体外培养以施用于患者。过继免疫疗法是有优势的，因为它能够靶向抑制肿瘤细胞的生长，优选靶向抑制其细胞毒性，而对常规治疗会发生的针对非肿瘤细胞的非靶向毒性较小。
在本发明的一个优选实施方案中，从患有癌症的患者中分离T细胞，用编码能够与所述癌症表达的抗原结合的嵌合抗原受体的基因转移载体转导，并施用于患者以治疗所述癌症。在一个优选的实施方案中，T细胞是CD8+ T细胞或CD4+ T细胞。
如本发明所用，与酪氨酸激酶抑制剂相关的术语“间歇性施用(给药)”或“间歇性地施用(给药)”是指将所述酪氨酸激酶抑制剂应用于给药方案中的用途，以使得所述患者具有的酪氨酸激酶抑制剂血清水平在治疗窗口的状态和所述患者具有的酪氨酸激酶抑制剂血清水平低于治疗窗口的状态之间间歇性变化。给定酪氨酸激酶抑制剂的治疗窗口可以通过本领域已知的任何方法进行测定。可选地，如本发明所用，术语与酪氨酸激酶抑制剂有关的“间歇性施用(给药)”或“间歇性地施用(给药)”是指将所述酪氨酸激酶抑制剂应用于给药方案中的用途，以使得所述患者具有的酪氨酸激酶抑制剂血清水平能够完全抑制所述酪氨酸激酶的状态和所述患者具有的酪氨酸激酶抑制剂血清水平能够部分抑制所述酪氨酸激酶的状态之间间歇性变化；或者使得所述患者具有的酪氨酸激酶抑制剂血清水平能够完全抑制所述酪氨酸激酶的状态和所述患者具有的酪氨酸激酶抑制剂血清水平无法抑制所述酪氨酸激酶的状态之间间歇性变化；或者使得所述患者具有的酪氨酸激酶抑制剂血清水平能够部分抑制所述酪氨酸激酶的状态和所述患者具有的酪氨酸激酶抑制剂血清水平无法抑制所述酪氨酸激酶的状态之间间歇性变化。可以通过本领域中已知的任何方法来检测这种抑制，例如通过使用适当的酶测定法检测酪氨酸激酶本身的活性，或通过检测所述激酶下游的细胞功能来进行检测。本发明中，部分抑制是指与不存在抑制剂的情况相比，抑制至少25％到至多75％。如本发明所用，“无法抑制”是指与不存在抑制剂的情况相比，抑制小于25％，优选小于10％。本发明中，在表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的情况下，抑制小于25％，优选小于10％，可以优选抑制所述T淋巴细胞的细胞毒性裂解、细胞因子的分泌和增殖。本发明中，在表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的情况下，至少25％但不超过75％的抑制可以优选抑制所述T淋巴细胞的细胞毒性裂解、细胞因子的分泌和增殖。本发明中，间歇性施用达沙替尼优选使得在达沙替尼的血清水平高于50nM的状态与达沙替尼的血清水平为或低于50nM的状态之间间歇性变化。可以优选通过使用比酪氨酸激酶抑制剂的末期半衰期更长的施用(给药)间隔来实现间歇性施用，更优选通过使用大于酪氨酸激酶抑制剂的末期半衰期两倍的施用(给药)间隔来实现间歇性施用，更优选通过使用比酪氨酸激酶抑制剂的末期半衰期长3倍、更优选4倍、进一步更优选5倍的施用(给药)间隔来实现间歇性施用。例如，可以优选通过至少6小时的给药间隔施用达沙替尼，更优选通过至少12小时的给药间隔施用达沙替尼来实现达沙替尼的间歇性给药。本领域技术人员将理解，对于每种给药方案，可以基于药代动力学和药效学常规实验选择合适剂量的相应的酪氨酸激酶抑制剂。
如本发明所用，与酪氨酸激酶抑制剂有关的术语“连续施用”或“连续给药”是指所述酪氨酸激酶抑制剂在以连续的方式引起酪氨酸激酶的完全抑制的给药方案中的使用。本发明中，完全抑制是指与不存在抑制剂的情况相比至少抑制75％。可以通过本领域中已知的任何方法来检测这种抑制，例如通过使用适当的酶测定法检测酪氨酸激酶本身的活性，或通过检测所述激酶下游的细胞功能来进行检测。本发明中，在表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的情况下，抑制至少75％可以优选是抑制所述T淋巴细胞的细胞毒性裂解、细胞因子的分泌和增殖。可选地，本发明所述的与酪氨酸激酶抑制剂相关的术语“连续施用”或“连续给药”是指所述酪氨酸激酶抑制剂在导致酪氨酸激酶抑制剂的血清水平持续维持在治疗窗口内的给药方案中的用途。本发明中，达沙替尼的连续施用包括使得达沙替尼的血清水平恒定保持在50nM或以上的任何施用方式。在一个示例性的优选实施方案中，连续施用达沙替尼，其中所述连续施用包括每6-8小时口服50mg-200mg的达沙替尼，优选每6小时口服140mg的达沙替尼。
如本发明所述，术语“细胞介导的效应子功能”或“细胞效应子功能”描述了细胞优选免疫细胞，对另一种细胞施加的效应。本发明中的示例性“细胞介导的效应子功能”为细胞毒性裂解，其中细胞优选免疫细胞，发挥针对另一细胞优选肿瘤或癌细胞的细胞溶解活性。
术语“靶向肿瘤/非靶向肿瘤的毒性”或“靶向肿瘤/非靶向肿瘤的识别”分别是指由对非肿瘤细胞的靶向作用引起的毒性或识别。这种毒性可以是由于免疫疗法(特别是所述免疫疗法的免疫细胞)的靶抗原特异性攻击对表达靶抗原的非恶性宿主组织或细胞造成的毒性。
如本发明所使用的，术语“非靶向毒性”是指由于非特异性攻击引起的毒性，例如免疫疗法的非特异性攻击引起的毒性，优选通过所述免疫疗法的免疫细胞对非恶性宿主组织，即不表达免疫疗法靶向的靶抗原的组织或细胞的非特异性攻击引起的毒性。
如本发明所用，术语“巨噬细胞活化综合征”或“MAS”是指由通过裂解肿瘤细胞释放细胞碎片而引起的巨噬细胞的过度活化和增殖。
如本发明所述的“细胞因子的分泌的抑制”可以通过本领域已知的任何方法来测定。这种抑制作用优选是降低细胞因子的血清水平，更优选是降低至少50％的细胞因子的血清水平。
如本发明所用，“细胞因子释放综合征”是指本领域已知的术语。本发明中，细胞因子释放综合征是指在针对癌症的免疫疗法中表达例如嵌合抗原受体的免疫细胞例如T淋巴细胞中细胞因子的释放，以致于这种细胞因子的释放在患者体内引起不良副作用。在针对癌症进行的过继免疫疗法中T淋巴细胞的释放可能导致的细胞因子释放综合征发生的典型细胞因子为GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8和IL-10，优选IFN-γ和IL2。
术语“排斥”或“免疫治疗细胞的排斥”是本领域已知的。其优选地是指在癌症患者中发生的针对所述癌症进行的过继免疫疗法治疗的免疫反应，其中所述过继免疫疗法包括移植表达能够与所述癌症的一部分细胞中的细胞表面抗原结合的嵌合抗原受体的同种异体或同源的T淋巴细胞，所述免疫反应引起所述同种异体或同源的T淋巴细胞的耗竭。
如本发明所使用的术语“意外活化”或“免疫治疗细胞的意外活化”是本领域已知的。它优选地是指使用表达了能够结合于细胞表面抗原的嵌合抗原受体的T淋巴细胞针对癌症进行的过继免疫疗法。本发明中，其他细胞优选免疫细胞与所述T淋巴细胞结合，而与所述嵌合抗原受体与靶抗原的特异性结合无关，在不存在通过其嵌合抗原受体特异性结合所述T淋巴细胞的情况下引起所述T淋巴细胞的活化。
术语“进补信号传导(tonic signaling)”或“免疫治疗细胞的进补信号传导和活化”是本领域已知的。优选地，它是指在针对癌症进行的过继免疫疗法中表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的活化，且与细胞相互作用无关。
如本发明所用，“肿瘤溶解综合征”是指本领域已知的术语。本发明中，当在免疫治疗期间，例如针对癌症进行的例如使用了表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的过继免疫治疗期间，大量肿瘤细胞被溶解时，会发生肿瘤溶解综合症，并且裂解的肿瘤细胞的细胞碎片释放在血流中，引起与所述免疫疗法相关的副作用。由于T淋巴细胞的细胞毒性裂解而导致的所述肿瘤细胞碎片的释放可引起例如肾脏损害。
如本发明所用，“神经毒性”是指对与中枢神经系统和/或外周神经系统相关的细胞产生毒性作用的任何过程。
如本发明所用，“生存活力”是指活细胞与死细胞的比例。确定活细胞比例的测定方法是本领域已知的。本发明证明的示例性非限制性方法包括使用膜联蛋白V和7-AAD染色以确定活细胞的比例。
如本发明所用，术语抗体是指能够特异性结合靶向抗原的任何功能性抗体。在没有特别限制的情况下，术语抗体包括来自任何适当物种来源的抗体，包括禽类(例如鸡)和哺乳动物(例如小鼠、羊、非人的灵长类和人类)。优选地，抗体是人源化抗体或人抗体。人源化抗体是包含人序列和一小部分赋予了与靶向抗原(例如人FLT3)结合特异性的非人序列的抗体。抗体优选为单克隆抗体，其可以通过本领域众所周知的方法制备。术语抗体包括IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4、IgE、IgA、IgM或IgD同种型抗体。术语抗体涵盖单体抗体(例如IgD、IgE、IgG)或寡聚抗体(例如IgA或IgM)。术语抗体还包括但不限于分离的抗体和修饰的抗体，例如基因工程抗体如嵌合抗体或双特异性抗体。
如本发明所用，抗体片段或抗体的片段是指保留了抗体特异性结合抗原能力的抗体的一部分。该能力可以例如使用本领域已知的方法通过确定抗原结合部分与抗体竞争特异性结合抗原的能力来测定。在没有特别限制的情况下，可以通过本领域已知的任何合适方法来产生抗体片段，包括重组DNA的方法和通过抗体的化学片段或酶促片段制备。抗体片段可以是Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、单链抗体(scFv)、单域抗体、双抗或其他任何保留抗体部分能力的能够特异性结合抗原的抗体。
如本发明所述的“抗体”(例如单克隆抗体)或“其片段”可能已经被衍生化或连接至不同的分子。例如，可以与抗体连接的分子是其他蛋白质(例如其他抗体)、分子标记(例如荧光、发光、有色的或放射性分子)、药物和/或毒性剂。抗体或抗原结合部分可以直接进行连接(例如以两种蛋白质之间融合的形式)，或通过接头分子(例如本领域已知的任何合适类型的化学接头)进行连接。
本发明中的术语诸如“癌症的治疗”或“治疗癌症”是指治疗性的治疗。可以例如通过评估治疗是否抑制被治疗的患者中的癌症生长来评估治疗方法是否有效。优选地，通过本领域已知的合适的统计测试所评估的抑制是统计学上显著的。可以通过将根据本发明治疗的一组患者中的癌症生长与未治疗的对照组中的癌症生长进行比较，或者通过比较接受本领域标准癌症治疗方法外加根据本发明治疗的一组患者中的癌症生长与仅接受标准癌症治疗的对照组患者中的癌症生长，来评估癌症生长的抑制作用。此类评估癌症生长的抑制的研究是根据临床研究公认的标准设计的，例如具有足够统计能力的双盲随机研究。术语“治疗癌症”包括癌症的生长被部分抑制的抑制作用(即与对照组的患者相比，患者体内的癌症生长被延迟)、癌症的生长被完全抑制的抑制作用(即患者体内癌症的生长停止)，以及癌症的生长被逆转的抑制作用(即癌症缩小)。可以基于已知的癌症进展临床指标评估治疗方法是否有效。
本发明中癌症的治疗并不排除也在患者中出现的附加的或次要的治疗益处。例如，附加的或次要的益处可以是在癌症治疗之前，在癌症治疗的同时或在癌症治疗之后进行的造血干细胞移植的增强。
术语“用于…癌症治疗的方法的用途的组合物，其中所述方法为用于治疗癌症的方法，其包括免疫疗法”可以涉及组合物对癌症有直接影响的情况，或者可以涉及该组合物对癌症有间接影响的情况，例如通过增强免疫疗法产生影响的情况。例如，包含酪氨酸激酶抑制剂例如达沙替尼的组合物可以增强过继免疫疗法，例如使用CAR T细胞的过继免疫疗法。
本发明中的癌症的治疗可以是一线治疗、二线治疗、三线治疗或四线治疗。治疗也可以是超越四线治疗的治疗。这些术语的含义在本领域中是已知的，并且与美国国家癌症研究所常用的术语一致。
本发明所述的术语“能够结合”是指与要结合的分子(例如CD19、FLT3、BCMA或ROR1)形成复合物的能力。通常通过诸如离子键、氢键和范德华力的分子间力非共价地发生所述的结合，并且通常是可逆的。各种检测结合能力的方法和测定法是本领域已知的。结合通常是具有高亲和力的结合，其中以KD值测定的亲和力优选小于1μM，更优选小于100nM，进一步更优选小于10nM，进一步更优选小于1nM，进一步更优选小于100pM，进一步更优选小于10pM，进一步更优选小于1pM。
如本发明中所述，每次出现的诸如“包含”或“包括”的术语都可以选择性地被“由……组成”代替。
如本领域已知的，包括任何合适稀释剂的药学上可接受的载体均可在本发明中使用。如本发明所用，术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的监管机构批准的或在美国药典、欧洲药典或其他普遍认可的药典中列出的，适用于哺乳动物尤其是人类。药学上可接受的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、无菌等渗水性缓冲液及其组合。应该理解的是，可以适当调整所述制剂以使其适合于施用的方式。
根据用于制备药物组合物和制剂的已知标准来制备本发明中的组合物和制剂。例如，组合物和制剂的制备方式应使它们可以适当地贮存和施用，例如通过使用药学上可接受的组分如载体、赋形剂或稳定剂。当向患者施用药物组合物或制剂时，此类药学上可接受的组分在使用量上是无毒的。添加至药物组合物或制剂中的药学上可接受的组分可取决于所述组合物或制剂中存在的酪氨酸激酶抑制剂的化学性质(取决于靶向剂是例如抗体或其片段还是表达嵌合抗原受体的细胞)、药物组合物的特定预期用途和施用(给药)途径。
在本发明的优选实施方案中，所述组合物或制剂适合施用于人，优选所述制剂是无菌的和/或无致热原的。
本发明中用于所述用途的免疫细胞和酪氨酸激酶抑制剂的“组合”不限于特定的施用(给药)方式。免疫细胞和酪氨酸激酶抑制剂可以例如同时且分开地施用，或以一种组合物的形式同时施用，或者它们可以分开且在不同的时间点施用。
一个优选的实施方案是将Src激酶抑制剂与过继免疫疗法联合用于治疗、减轻或预防与所述过继免疫疗法相关的副作用的用途。更优选的实施方案是Src激酶抑制剂，优选达沙替尼(dasatinib)、塞卡替尼(saracatinib)、博舒替尼(bosutinib)、尼洛替尼(nilotinib)或PP1抑制剂，与针对癌症进行的过继免疫疗法联合用于治疗、减轻或预防与所述针对癌症进行的过继免疫疗法相关的副作用的用途。其中所述针对癌症进行的过继免疫疗法包括免疫细胞的移植，优选T淋巴细胞的移植，所述免疫细胞表达嵌合抗原受体以识别由所述癌症的一部分细胞表达的抗原。进一步更优选的实施方案是达沙替尼用于治疗、减轻或预防与使用了具有经基因修饰以表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的针对癌症进行的过继免疫疗法相关的副作用的用途，其中所述嵌合抗原受体能够结合在所述癌症的一部分细胞中表达的细胞表面抗原。
一个优选的实施方案是Src激酶抑制剂，优选达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、尼洛替尼或PP1抑制剂，最优选达沙替尼，用于治疗、减轻或预防与针对癌症进行的过继免疫疗法相关的副作用的用途，其中所述免疫疗法包括移植经基因修饰以表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞，所述嵌合抗原受体能够结合在所述癌症的一部分细胞上表达的细胞表面抗原。在该实施方案中，在移植的T淋巴细胞中表达的嵌合抗原受体与癌细胞的细胞表面抗原结合，引起所述癌细胞的细胞毒性裂解，并且与所述过继免疫疗法相关的副作用主要或部分地由在表达嵌合抗原受体的所述T淋巴细胞介导的细胞毒性裂解后释放所述癌细胞的细胞碎片引起。在一个更优选的实施方案中，由所述细胞碎片的释放引起的与所述过继免疫疗法相关的副作用可分类为肿瘤溶解综合征或巨噬细胞活化综合征。
一个优选的实施方案是Src激酶抑制剂，优选达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、尼洛替尼或PP1抑制剂，最优选达沙替尼，用于治疗、减轻或预防与针对癌症进行的过继免疫疗法相关的副作用的用途，其中所述免疫疗法包括移植经基因修饰以表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞，所述嵌合抗原受体能够结合在所述癌症的一部分细胞上表达的细胞表面抗原。在该实施方案中，在移植的T淋巴细胞中表达的嵌合抗原受体与癌细胞的细胞表面抗原结合，以引起所述癌细胞的细胞毒性裂解和所述T淋巴细胞的活化，并且与所述过继免疫疗法相关的副作用主要或部分地由所述嵌合抗原受体与所述细胞表面抗原结合后表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的细胞因子的释放所引起，优选所述细胞表面抗原位于癌细胞的表面。在一个更优选的实施方案中，由表达嵌合抗原受体的所述T淋巴细胞中细胞因子的释放而引起的与所述免疫疗法相关的副作用可被分类为细胞因子释放综合征。
在一个优选的实施方案中，所述Src激酶抑制剂，优选达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、尼洛替尼或PP1抑制剂，最优选达沙替尼，用于预防与针对癌症进行的过继免疫疗法相关的副作用的用途，包括在过继免疫疗法之前施用所述Src激酶抑制剂。在另一个优选的实施方案中，所述Src激酶抑制剂，优选达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、尼洛替尼或PP1抑制剂，最优选达沙替尼，用于治疗或减轻与针对癌症进行的过继免疫疗法相关的副作用的用途，包括在针对癌症进行的过继免疫疗法之后施用所述Src激酶抑制剂，优选地当与所述针对癌症进行的过继免疫疗法相关的副作用的症状出现时施用所述Src激酶抑制剂。与针对癌症进行的过继免疫疗法相关的副作用的症状可以包括IFN-γ、IL-6或MCP1的血清水平升高和/或体温升高。
在一个优选的实施方案中，与针对癌症进行的过继免疫疗法相关的副作用主要或部分归因于GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8或IL-10的血清水平升高，优选归因于IFN-γ和IL-2的血清水平升高。在一个优选的实施方案中，治疗癌症的方法包括用同种异体或同源的T淋巴细胞进行过继免疫治疗，所述T淋巴细胞表达能够与所述癌症的一部分细胞表达的细胞表面抗原结合的嵌合抗原受体。在该实施方案中，所述T淋巴细胞在与所述细胞表面抗原结合后释放细胞因子GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8或IL-10，优选IFN-0和IL-2，引起其血清水平的升高。一个优选的实施方案是Src激酶抑制剂，优选达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、尼洛替尼或PP1抑制剂，最优选达沙替尼，通过抑制所述T淋巴细胞来减少所述细胞因子的释放的用途，从而减轻与所述细胞因子的所述血清水平升高有关的症状。
在另一个优选的实施方案中，与针对癌症进行的过继免疫疗法相关的副作用主要或部分归因于靶向/脱靶(on-target/off-tumor，靶向肿瘤/非靶向肿瘤)的识别。在一个优选的实施方案中，治疗癌症的方法包括用同种异体或同源的T淋巴细胞进行过继免疫治疗，所述T淋巴细胞表达能够与所述癌症的一部分细胞表达的细胞表面抗原结合的嵌合抗原受体。在该实施方案中，所述T淋巴细胞与在一部分非肿瘤、非恶性细胞上表达的所述细胞表面抗原结合，从而导致所述非肿瘤、非恶性细胞的不期望的细胞毒性裂解。一个优选的实施方案是使用Src激酶抑制剂，优选达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、尼洛替尼或PP1抑制剂，最优选达沙替尼，通过抑制所述T淋巴细胞的细胞溶解活性来降低靶向/脱靶的识别，从而减轻与所述靶向/脱靶的识别相关的症状。一个示例性实施方案是达沙替尼在使用表达能够结合CD19的嵌合抗原受体的T淋巴细胞治疗CD19阳性癌症的方法中的用途，其中所述T淋巴细胞与表达CD19的非肿瘤细胞结合，导致所述非肿瘤细胞的细胞毒性裂解，在患者中引起有害的靶向/脱靶的副作用。
一个优选的实施方案是Src激酶抑制剂，优选达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、尼洛替尼或PP1抑制剂，最优选达沙替尼，在使用表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞进行过继免疫疗法来治疗癌症的方法中的用途以抑制T淋巴细胞的细胞介导的效应子功能。在一个优选的实施方案中，所述Src激酶抑制剂引起所述T淋巴细胞的细胞因子的分泌减少、细胞毒性裂解或增殖减少。在一个优选的实施方案中，在施用所述Src激酶抑制剂后，与不存在所述Src激酶抑制剂的情况下分泌的所述细胞因子相比，所述T淋巴细胞分泌的细胞因子GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8或IL-10，优选IFN-0和IL-2减少至少10％、20％、30％、40％或50％。在一个优选的实施方案中，分泌的所述细胞因子减少了至少50％。
在一个优选的实施方案中，Src激酶抑制剂在使用T淋巴细胞的过继免疫疗法治疗癌症的方法中的用途不会显著降低所述T淋巴细胞的生存活力，所述T淋巴细胞表达能够与在所述癌症的一部分细胞上表达的细胞表面抗原结合的嵌合抗原受体。在一个优选的实施方案中，在施用Src激酶抑制剂之后，表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的生存活力为至少50％、60％、70％、80％或90％。在一个优选的实施方案中，在施用Src激酶抑制剂之后，表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的生存活力为至少80％。
在一个优选的实施方案中，Src激酶抑制剂在使用T淋巴细胞的过继免疫疗法治疗癌症的方法中的用途抑制所述T淋巴细胞的增殖，所述T淋巴细胞表达能够与在所述癌症的一部分细胞上表达的细胞表面抗原结合的嵌合抗原受体。在一个优选的实施方案中，在施用Src激酶抑制剂之后，与不存在所述Src激酶抑制剂的情况下T淋巴细胞的增殖相比，表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的增殖减少了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一个优选的实施方案中，在施用Src激酶抑制剂后，表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的增殖减少了至少50％。
在一个优选的实施方案中，Src激酶抑制剂在使用T淋巴细胞的过继免疫疗法治疗癌症的方法中的用途抑制所述T淋巴细胞的能力使得表达所述细胞表面抗原的靶细胞的细胞毒性裂解，所述T淋巴细胞表达能够与在所述癌症的一部分细胞上表达的细胞表面抗原结合的嵌合抗原受体。在一个优选的实施方案中，在施用Src激酶抑制剂之后，与不存在所述Src激酶抑制剂的情况下所述T淋巴细胞的增殖相比，表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的细胞毒性裂解在细胞裂解降低了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一个优选的实施方案中，在施用Src激酶抑制剂后，表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的细胞毒性裂解降低了至少90％。
在一个优选的实施方案中，Src激酶抑制剂在使用T淋巴细胞的过继免疫疗法治疗癌症的方法中的用途抑制所述T淋巴细胞表达PD1的能力，所述T淋巴细胞表达能够与在所述癌症的一部分细胞上表达的细胞表面抗原结合的嵌合抗原受体。在一个优选的实施方案中，与不存在所述Src激酶抑制剂的情况下所述T淋巴细胞中PD1的表达相比，所述T淋巴细胞中PD1的表达在统计学上显著降低。在一个优选的实施方案中，所述T淋巴细胞中PD1的表达降低了至少5％、10％、15％、20％或更多。在一个优选的实施方案中，所述T淋巴细胞中PD1的表达降低了至少10％。
一个优选的实施方案是将Src激酶抑制剂与过继免疫疗法联合用于改善或增强过继免疫疗法的用途，其中所述Src激酶抑制剂要间歇性施用。更优选的实施方案是Src激酶抑制剂，优选达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、尼洛替尼或PP1抑制剂与针对癌症进行的过继免疫疗法联合使用，以改善针对癌症进行的所述过继免疫疗法的抗癌作用，其中所述针对癌症进行的过继免疫疗法包括移植表达了嵌合抗原受体以识别由所述癌症的一部分细胞表达的抗原的免疫细胞，优选移植T淋巴细胞，并且间歇性施用所述Src激酶抑制剂。进一步更优选的实施方案是达沙替尼用于改善使用了经基因修饰以表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的针对癌症进行的过继免疫疗法的抗癌作用的用途，其中所述嵌合抗原受体能够结合在所述癌症的一部分细胞中表达的细胞表面抗原，并且间歇性施用达沙替尼。在该实施方案中，需要间歇性施用达沙替尼，以部分抑制所述的T淋巴细胞。部分抑制可以是对所述T淋巴细胞的细胞介导的效应子功能的抑制，其中所述抑制是对所述T淋巴细胞的一种或多种细胞介导的效应子功能中的至少25％至至多75％的抑制。在一个优选的实施方案中，间歇性施用达沙替尼，以使达沙替尼的血清水平不能连续达到50nM或高于50nM。在另一个优选的实施方案中，间歇性施用达沙替尼，以使达沙替尼的血清水平不能连续达到10nM或高于10nM。在一个示例性实施方案中，间歇性施用达沙替尼，其中所述的间歇性施用包括每天口服50-200mg的达沙替尼，优选每天100mg。
在一个优选的实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂为Src激酶抑制剂。在一个更优选的实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂为达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、尼洛替尼或PP1抑制剂。在一个更优选的实施方案中，抑制剂为博舒替尼。在一个更优选的实施方案中，抑制剂为塞卡替尼。在一个更优选的实施方案中，抑制剂为尼洛替尼。在一个更优选的实施方案中，抑制剂为PP1抑制剂。在一个进一步更优选的实施方案中，抑制剂为达沙替尼。
在一个优选的实施方案中，治疗癌症的方法包括使用表达嵌合抗原受体的同种异体或同源的T淋巴细胞进行过继免疫疗法，所述嵌合抗原受体能够结合在所述癌症的一部分细胞上表达的细胞表面抗原。在一个更优选的实施方案中，嵌合抗原受体能够结合CD4、CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD52、CD64、CD70、CD72、CD123、CD135、CD138、CD220、CD269、CD319、ROR1、ROR2、SLAMF7、BCMA、αvβ3-整联蛋白、α4β1-整联蛋白、LILRB4、EpCAM-1、MUC-1、MUC-16、L1-CAM、c-kit、NKG2D、NKG2D配体、PD-L1、PD-L2、Lewis-Y、CAIX、CEA、c-MET、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、Her2、FAP、FR-a、EphA2、GD2、GD3、GPC3、IL-13Ra、间皮素、PSMA、PSCA、VEGFR或FLT3。在进一步更优选的实施方案中，嵌合抗原受体能够结合CD19、BCMA、ROR1、FLT3、CD20、CD22、CD123或SLAMF7。
在一个优选的实施方案中，嵌合抗原受体包括CD27、CD28、4-1BB、ICOS、DAP10、NKG2D、MyD88或OX40共刺激结构域。在一个更优选的实施方案中，嵌合抗原受体包含CD28、4-1BB或OX40共刺激结构域。
在一个优选的实施方案中，嵌合抗原受体包含CD3ζ、CD3ε、CD3γ、T细胞受体α链、T细胞受体β链、T细胞受体δ链和T细胞受体γ链信号传导结构域。
具体实施方式
通过以下非限制性实施例来举例说明本发明。
实施例1：材料和方法
人类受试者
血液样本取自健康的捐献者，这些捐献者提供了书面知情同意书以参加维尔茨堡大学[德国维尔茨堡大学(
Würzburg，UKW)]的机构审查委员会批准的研究方案。在Ficoll-Hypaque(Sigma，St.Louis，MO)上离心分离出外周血单核细胞(PBMC)。
细胞系
293T、K562、Raji和RCH-ACV细胞系获自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ，位于德国不伦瑞克)。使用全长人ROR1基因进行慢病毒转导产生K562-ROR1。使用全长人CD19基因进行慢病毒转导产生K562-CD19。分别用编码萤火虫荧光素酶(ffluc)增强型绿色荧光蛋白(GFP)转基因的慢病毒载体转导至每种K562、Raji和RCH-ACV细胞系中，从而能够通过流式细胞术(GFP)，基于生物发光的细胞毒性测定(ffLuc)和小鼠的生物发光成像(ffLuc)进行检测。每个细胞系都在添加了10％的胎牛血清和100U/ml青霉素/链霉素的改良杜氏伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)中进行培养。
免疫分型
用一种或多种以下缀合的mAb：CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD62L、PD-1和对应的同型对照(BD Biosciences，San Jose，CA)对PBMC和T细胞系染色。通过使用已在公司内部进行生物素化(EZ-LinkTMSulfo-NHS-SS-Biotin，ThermoFisher Scientific，IL，根据制造商的说明书进行)的抗EGFR抗体(ImClone Systems Inc.)和链霉亲和素-PE(BDBiosciences)进行染色以检测CAR转导的(即EGFRt+)T细胞)。按照制造商的说明书，使用7-AAD(BD Biosciences)染色进行活细胞/死细胞的鉴别。在FACS Canto上进行流式分析，并使用FlowJo软件(Treestar，Ashland或OR)分析数据。
载体构建
参考文献[5]中描述了包含具有4-1BB或CD28共刺激结构域的ROR1或CD19特异性CAR的epHIV7慢病毒载体的构建，出于所有目的将其全文引入本发明作为参考。在图1A-C中提供了CAR构建体的示意图。所有载体均包含截短的表皮生长因子受体(EGFRt)，参见参考文献[9]，出于所有目的将其全文引入本发明作为参考，编码在CAR下游的转基因盒中。CAR和EGFRt转基因被T2A核糖体跳跃元件隔开。
发明人从epHIV7慢病毒载体中开发了一种报告基因载体，其中含有野生型绿色荧光蛋白(NFAT诱导型GFPwt)或GFP变体，其被小鼠鸟氨酸脱羧酶的第422-461位残基的突变形式去稳定化，并在NFAT响应元件的控制下，在体内的半衰期为约4小时(NFAT诱导的GFPd4)。
发明人构建了一种如[21]中所述的包含iCasp9自杀基因的诱导型自杀开关。
慢病毒的制备
通过Calphos转染试剂(Clontech，Mountain View，CA)用慢病毒载体质粒和包装载体pCHGP-2、pCMV-Rev2和pCMV-G共转染293T细胞，产生编码CAR/EGFRt、ffluc/GFP和NFATindGFP的慢病毒上清液。转染后16小时更换培养基，72小时后收集慢病毒。为了收集病毒颗粒，在4℃下以24,900rpm超速离心2小时。用增加量的病毒转导Jurkat细胞以进行慢病毒滴定，转导后第3天使用流式细胞仪分析细胞表面的蛋白表达。
CAR-T细胞的制备
如[5],[22]中所述方法产生CAR-T细胞。简而言之，通过使用免疫磁珠(MiltenyiBiotec，Bergisch-Gladbach，德国)进行阴性分离，从健康供体的PBMC中纯化出CD8+中央记忆T细胞和CD4+大T细胞，并根据磁珠的制造商的说明书(Life Technologies)使用抗CD3/CD28磁珠进行活化，并在感染(MOI)为5的部分上用慢病毒上清液进行转导。在一些实验中，将T细胞与编码CAR/EGFRt和NFATindGFP的慢病毒上清液共转导。在通过旋转接种刺激磁珠1天后进行慢病毒转导。在含有10％人血清、GlutaminMAX(LifeTechnologies)、100U/mL青霉素-链霉素和50U/mL IL-2的RPMI-1640中扩增和维持T细胞。进行台盼蓝染色以定量活的T细胞。在第6天去除磁珠并扩增至10-14天后，将T细胞根据EGFRt富集，并使用快速扩增方案(ROR1 CAR-T细胞和相应的未转导的对照T细胞)进一步扩增或用经辐射的CD19+饲养细胞进行抗原特异性扩增(CD19 CAR-T细胞s和相应的未转导的对照T细胞)。
CAR-T细胞功能分析
细胞毒性：用ffluc_GFP稳定转导靶细胞，并以效应子与靶标(E:T)为5:1的比例将效应子T细胞在1×104个细胞/孔的三孔中孵育。将D-荧光素底物(Biosynth，Staad，Switzerland)添加到共培养物中，终浓度为0.15mg/ml，并使用光度计(Tecan，
Switzerland)检测含有靶细胞和T细胞的孔中发光信号的降低。使用标准公式计算特异性裂解。
细胞因子的分泌：将5×104个T细胞与靶细胞以E:T为4:1(K562/ROR1，K562/CD19，R CH-ACV)的比例一式两份或一式三份铺板到孔中，并通过ELISA检测IFN-γ和IL-2，或通过多重细胞因子免疫测定法(Luminex)检测20小时孵育后去除的上清液中的细胞因子。通过从抗原特异性刺激后释放的细胞因子数量中减去未刺激的CAR-T细胞释放的细胞因子数量，计算出特定的细胞因子产量。如图所示，以％表示的残留的细胞因子的分泌相对于未施用达沙替尼治疗时的CAR-T细胞(100％)进行归一化。
增殖：用0.2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen)标记T细胞，洗涤并与经辐射(80Gy)的刺激细胞以4：1的E：T比率(K562/ROR1，K562/CD19或RCH-ACV)一式两份或一式三份铺板于孔中。没有外源细胞因子添加到培养基中。孵育72小时后，用抗CD3mAb标记细胞，并通过流式细胞术进行分析以评估T细胞的细胞分裂。使用FlowJo软件(FlowJo，LLC，Ashland，Oregon，USA)计算增殖指数，并用于确定“残留增殖”，即以在不存在达沙替尼(100％)的情况下归一化为CAR-T细胞的增殖。
蛋白质印迹分析
扩增后，洗涤T细胞并在不存在外源IL-2的情况下培养两天。用RCH-ACV刺激T细胞30分钟(E：T比为4：1)后分离出蛋白质。根据制造商的说明书，使用以下抗体在还原条件下进行蛋白质印迹(Western Blot)：抗pSrc家族Y416(cell signaling#2101S)、抗Lck(cellsignaling#2752S)、抗pCD247 Y142(CD3ζ，BD#558402)、抗CD247(Sigma Life science#HPA008750)，抗pZap70 Y319(cell signaling#2717S)和抗Zap70(…)。针对β-肌动蛋白的染色作为上样对照和用于归一化。Western印迹是使用ChemiDoc MP成像系统(Biorad,Munich,Germany)进行显影；使用Image Lab软件(Biorad,Munich,Germany)进行蛋白质印迹的定量分析。
NFAT报告基因检测
将(共)表达NFAT诱导型GFPwt报告基因的T细胞在10U IL-2存在下与受辐射的(80Gy)Raji或K562肿瘤细胞以5：1的E：T比共培养或无靶细胞进行培养。在不存在达沙替尼的情况下或存在100nM达沙替尼的情况下，共培养T细胞和靶细胞。共培养24小时后，用抗CD3 mAb标记细胞，并通过流式细胞仪进行分析以评估T细胞中GFP的表达。
凋亡测定
在50U IL-2存在时，单独培养CD8+ CD19 CAR-T细胞或将其与受辐射的(80Gy)K562/CD19肿瘤细胞以4：1的E：T比共培养。在测定开始时或测定开始后两个小时，添加达沙替尼至终浓度为100nM。共培养24小时后，按照制造商的说明书(BD Biosciences，Heidelberg，德国)用抗CD8 mAb、7AAD和AnnexinV标记共培养物，并通过流式细胞仪进行分析以评估凋亡T细胞和死亡T细胞的量。
消除ICasp+T细胞
共表达iCasp自杀基因的CAR-T细胞在50U/ml IL-2存在下，未经进一步处理的情况下进行培养、或在100nM达沙替尼的存在下以及存在或不存在10nM AP20187(一种iCaspase诱导剂)的情况下进行培养。24小时后，用抗CD3 mAB标记细胞，并通过流式细胞仪分析iCasp+ T细胞的存在。
达沙替尼的制备
冻干的达沙替尼购自Selleck Chemicals(Houston,TX,USA)，并在DMSO(AppliChem,Darmstadt,Germany)中复溶，得到浓度为10mM的储备溶液。通过在DMSO或适当的培养基中进一步稀释来制备工作溶液。
地塞米松的制备
将地塞米松(SigmaAldrich,Steinheim,Germany)在DMSO(AppliChem,Darmstadt,Germany)中复溶，得到浓度为100mM的储备溶液。通过在DMSO或适当的培养基中进一步稀释来制备工作溶液。
其他酪氨酸激酶抑制剂的制备
尼洛替尼、拉帕替尼和伊马替尼购自Cell Signaling(Leiden,Netherlands)，并在DMSO(Sigma Aldrich)中复溶，分别得到浓度为10mM的储备溶液。塞卡替尼、博舒替尼和PP1抑制剂购自Selleck Chemicals(Houston,TX,USA)，并在DMSO中复溶，分别得到浓度为10mM的储备溶液。通过在DMSO或适当的培养基中进一步稀释来制备工作溶液。
体内实验
UKW的机构动物护理和使用委员会批准了所有小鼠实验。NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠(雌性，6-8周龄)购自Charles River(Sulzfeld,Germany)。通过尾静脉注射(i.v.)将1×106个Raji/ffluc_GFP肿瘤细胞接种至小鼠。通过尾静脉注射(i.v.)使用5×106个CAR修饰的T细胞或对照的未转导T细胞(CD4:CD8比例＝1:1)处理小鼠。达沙替尼的腹腔注射(i.p.)剂量为10mg/kg达沙替尼(连续治疗)或5mg/kg(间歇性治疗)。通过在IVIS Lumina成像仪(Perkin Elmer,Baesweiler,Germany)上的连续生物发光成像分析肿瘤负荷和分布：将0.3mg/g的荧光素腹膜内注射至小鼠，并在注射荧光素10分钟后采集图像，在小分级模式(small binning mode)下以10s到1分钟的采集时间得到不饱和图像。使用LivingImage软件(Caliper)分析数据，并在涵盖每个小鼠全身的目标区域分析平均辐射度(或光子通量)。实验结束时处死小鼠，并通过流式细胞仪分析骨髓、外周血和脾脏中的人T细胞。使用多重细胞因子分析检测血清中(人类)细胞因子的存在。
实施例2：达沙替尼阻断CAR-T细胞的功能
A)达沙替尼阻断CD19 CAR-T细胞和ROR1 CAR-T细胞的功能
达沙替尼阻断CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性
发明人从n＝3个健康供体制备得到了CD8+ CAR-T细胞系。在每种T细胞系中，发明人使用EGFRt转导标记使表达CAR的T细胞富集至纯度＞90％。发明人使用已经转导了作为靶标的CD19(用于测试CD19 CAR-T细胞)或ROR1(用于测试ROR1 CAR-T细胞)的K562细胞，在基于生物发光的细胞毒性测定中分析了CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性。在测定开始时将达沙替尼加入测定培养基中。
数据显示，达沙替尼能够完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞的细胞溶解功能。达沙替尼诱导的对CAR-T细胞的细胞溶解功能的阻断程度呈剂量依赖性(图2A)：
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≤12.5nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能未受到显著影响(在t＝12h时经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率>88％，而未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为93％)；
-在测定培养基中达沙替尼的浓度为25nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能受到部分抑制(在t＝6h时经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为26％，而未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为53％；在t＝12h时经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为73％，而未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为93％)。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥50nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能被(几乎)完全抑制(在t＝6h时经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率低于7％；在t＝12h时，经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率低于12％，而未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为93％)。
发明人证实达沙替尼能够完全阻断表达具有CD28共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞的细胞溶解功能(图2B)。
-在测定培养基中达沙替尼浓度为50nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能受到部分抑制(在t＝5h时经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率低于23％，而未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为52％；在t＝10h时经处理的CAR-T细胞对靶细胞的残留特异性裂解为47％，而未经过达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为91％)。
-在测定培养基中达沙替尼浓度为100nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能被(几乎)完全抑制(在任何给定时间点，经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率均低于10％，而t＝10h时未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为91％)。
发明人还证实，达沙替尼能够完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的ROR1 CAR的CD8+ T细胞的细胞溶解功能(图2C)。
-在测定培养基中达沙替尼浓度为25nM时，而在t＝5h之前，经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率少于2％，而未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为73％；在测定培养基中达沙替尼的浓度≥50nM时，在任何给定的时间点，经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率均低于2％，而在t＝10h时，未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为94％。
达沙替尼阻断CD8+ CAR-T细胞中细胞因子的产生和分泌
发明人分析了在存在达沙替尼的情况下或不存在达沙替尼的情况下CD8+ CAR-T细胞系中细胞因子的产生和分泌。将CAR-T细胞与发明人已经转导了CD19(用于测试CD19CAR-T细胞)或ROR1(用于测试ROR1 CAR-T细胞)的K562细胞共培养。在共培养测定开始时将达沙替尼添加到测定的培养基中。进行ELISA以检测从共培养物中除去的上清液中的IFN-γ和IL-2。
数据表明，达沙替尼能够完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞中细胞因子的产生和分泌。达沙替尼诱导的对细胞因子产生和分泌的阻断的程度呈剂量依赖性(图3A)：
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥6.25nM时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留的特异性IFN-γ的产生少于45％，残留的特异性IL-2的产生少于60％；
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥测定培养时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，没有残留的特异性IFN-，产生，并且残留的特异性IL-2的产生少于1％。
发明人证实，达沙替尼能够完全阻断表达具有CD28共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞中细胞因子的产生和分泌(图3B)。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥测定培养基时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留的特异性IFN-，的产生少于4.5％，没有残留的特异性IL-2产生。
发明人还证实，达沙替尼能够完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的ROR1 CAR的CD8+ T细胞中细胞因子的产生和分泌(图3C)。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥50nM时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留的IFN-γ的产生少于3％，残留的II-2的产生少于8.5％。
这些数据证明了以下事实：达沙替尼是一种合适的CAR-T细胞分泌细胞因子的抑制剂，其不受受体的设计和特异性的影响。
达沙替尼阻断CD8+ CAR-T细胞的增殖
发明人分析了在存在达沙替尼的情况下或不存在达沙替尼的情况下CD8+ CAR-T细胞系的增殖。用CFSE标记CAR-T细胞，并将其与发明人已经转导了CD19(用于测试CD19CAR-T细胞)或ROR1(用于测试ROR1 CAR-T细胞)的K562细胞共培养。在共培养测定开始时将达沙替尼添加到测定培养基中。在共培养试验结束时进行流式细胞术分析以测定T细胞的增殖。计算表明在测定期间发生的平均细胞分裂数目的增殖指数，并用于确定在不存在达沙替尼时为100％的情况下相对于刺激的CAR-T细胞的增殖指数归一化时的残留增殖。
数据表明，达沙替尼能够完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞的增殖。达沙替尼诱导的对增殖的阻断程度呈剂量依赖性(图4A)：
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥3.125nM时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留增殖少于80％；
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥12.5nM时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留增殖少于45％；
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥50nM时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留增殖少于8％。
发明人证实，达沙替尼能够完全阻断表达具有CD28共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞的增殖(图4B)。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥50nM时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留增殖少于7％。
发明人还证实了达沙替尼能够完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的ROR1 CAR的CD8+ T细胞的增殖(图4C)。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥50nM时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留增殖少于7％。用IL-2的刺激作为阳性对照和参考。
达沙替尼阻断CD4+ CAR-T细胞中细胞因子的产生和分泌
发明人分析了在存在达沙替尼的情况下或不存在达沙替尼的情况下CD4+ CAR-T细胞系中细胞因子的产生和分泌。将CAR-T细胞与本发明人已经转导了CD19的K562细胞共培养。在共培养测定开始时将达沙替尼添加到测定培养基中。在从共培养物中去除的上清液中进行多重细胞因子的分析。
数据表明，达沙替尼能够完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD4+ T细胞中细胞因子的产生和分泌。达沙替尼诱导的对细胞因子产生和分泌的阻断的程度呈剂量依赖性(图5A)：
-在共培养的测定培养基中达沙替尼的浓度≥25nM时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，GM-CSF、IFN-S、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-8的产生和分泌为(几乎)完全被阻断(GM-CSF、IFN-S、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8降低>95％)。
发明人证实了达沙替尼能够完全阻断表达具有CD28共刺激结构域的CD19 CAR的CD4+ T细胞中细胞因子的产生和分泌(图5B)。
-在共培养的测定培养基中达沙替尼的浓度≥共培养的测时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，GM-CSF、IFN-S、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-8的产生和分泌为(几乎)完全被阻断(GM-CSF、IFN-S、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8降低>95％)。
B)达沙替尼阻断SLAMF7 CAR-T细胞的功能
达沙替尼阻断CD8+SLAMF7 CAR-T细胞的细胞溶解活性
发明人从n＝2个健康供体制备得到SLAMF7特异性的CD8+ CAR-T细胞系。在每种T细胞系中，发明人使用EGFRt转导标记使表达CAR的T细胞富集至纯度＞90％。发明人已经转导了作为靶标的SLAMF7的K562细胞，在基于生物发光的细胞毒性测定中分析了CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性。通过使用全长人SLAMF7基因进行慢病毒转导产生K562-SLAMF7。在测定开始时将达沙替尼加入测定培养基中。
数据表明，达沙替尼能够完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的SLAMF7-CAR的CD8+ T细胞的细胞溶解功能。达沙替尼诱导的对CAR-T细胞的细胞溶解功能的阻断程度呈剂量依赖性(图6A，上图；并请参见图1D中具有4-1BB共刺激结构域的SLAMF7-CAR的结构)：
-在测定培养基中达沙替尼的浓度为20nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能受到部分抑制(在t＝6h时经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为21％，而未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为63％；在t＝12h时经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为35％，而未经达沙替尼处理的CAR-T细胞的特异性裂解率为83％)。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥40nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能被(几乎)完全抑制(在t＝6h之前，经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率低于5.5％；在t＝12h时经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率低于10％，而未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为83％)。
发明人证实，达沙替尼还能够完全阻断表达具有CD28共刺激结构域的SLAMF7CAR的CD8+ T细胞的细胞溶解功能(图6A，下图；请参见图1E中具有CD28共刺激结构域的SLAMF7CAR的结构)。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度为20、40和60nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能受到部分抑制(在t＝6h时经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率低于21％，而未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为67％；在t＝12h时经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率低于35％，而未经达沙替尼处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为85％。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥80nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能被(几乎)完全抑制(与任何给定的时间点时，靶细胞的特异性裂解低于3％，而在t＝12h时未经达沙替尼处理的CAR-T细胞的特异性裂解率为85％)。
达沙替尼阻断CD8+SLAMF7 CAR-T细胞和CD4+SLAMF7
CAR-T细胞中细胞因子的产生
和分泌
发明人从n＝2个健康供体中制备得到SLAMF7特异性的CD8+ CAR-T细胞系和CD4+CAR-T细胞系。在每种T细胞系中，发明人使用EGFRt转导标记使表达CAR的T细胞富集至纯度＞90％。发明人分析了在存在达沙替尼的情况下或不存在达沙替尼的情况下CD8+CAR-T细胞系和CD4+ CAR-T细胞系中细胞因子的产生和分泌。将CAR-T细胞与发明人已经转导了SLAMF7的K562共培养。在共培养测定开始时将达沙替尼添加到测定培养基中。进行ELISA以检测从共培养物中除去的上清液中的IFN-γ和IL-2。
数据显示，达沙替尼能够完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的SLAMF7 CAR的CD8+ T细胞中细胞因子的产生和分泌。达沙替尼诱导的对细胞因子产生和分泌的阻断程度呈剂量依赖性(图6B)：
-在测定培养基中达沙替尼的浓度为20nM时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留的特异性IFN-，的产生少于15％，没有残留的特异性IL-2产生；
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥测定培养基时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留的特异性IFN-，产生少于0.8％，没有残留的特异性IL-2产生。
发明人证实，达沙替尼能够完全阻断表达具有CD28共刺激结构域的SLAMF7 CAR的CD8+ T细胞中细胞因子的产生和分泌(图6B)。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥测定培养基时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留的特异性IFN-，的产生少于4％，没有残留的特异性IL-2产生。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥测定培养基时，与未使用达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留的特异性IFN-，的产生少于0.2％，没有残留的特异性IL-2产生。
发明人还证实，达沙替尼能够完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的SLAMF7CAR的CD4+ T细胞中细胞因子的产生和分泌(图6C)。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥20nM时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留的IFN-γ少于0.5％，且没有残留的II-2产生。
发明人还证实，达沙替尼能够完全阻断表达具有CD28共刺激结构域的SLAMF7CAR的CD4+ T细胞中细胞因子的产生和分泌(图6C)。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥测定培养基时，与未经达沙替尼处理的CAR-T细胞相比，残留的IFN-，少于1.2％，并且没有残留的IL-2产生。
这些数据补充证实了以下事实：达沙替尼是合适的CAR-T细胞分泌细胞因子的抑制剂，且不受受体的设计和特异性的影响。
C)达沙替尼阻断CAR-T细胞的信号传导
达沙替尼可阻断参与CAR信号传导的激酶的磷酸化
发明人在存在100nM达沙替尼的情况下或不存在达沙替尼的情况下，将表达具有4-1BB共刺激结构域的CD8+ T细胞与RCH-ACV靶细胞(CD19+)共培养，并进行蛋白质印迹分析以测定在CAR信号传导中可能涉及的激酶的磷酸化状态。
与发明人在没有达沙替尼的情况下进行了共培养的CAR-T细胞相比，在发明人已经存在达沙替尼的情况下进行了共培养的CAR-T细胞中，在Lck/Src家族激酶的第416位酪氨酸、CAR CD3ζ的第142位酪氨酸和ZAP70的第319位酪氨酸的磷酸化程度较低(图7A)。作为参考和对照，发明人在经达沙替尼处理和未经达沙替尼处理的CAR-T细胞中均进行了Lck、CAR CD3ζ和ZAP70以及β-肌动蛋白的Western印迹分析。CAR中包含的CD3ζ结构域(CAR CD3ζ)与内源性CD3ζ的区别在于分子量的不同。
定量的蛋白质印迹分析表明，与不存在达沙替尼的条件下共培养的CAR-T细胞相比，经达沙替尼处理的CAR-T细胞的磷酸化分别仅为12.86％(CAR CD3ζ)、21.57％(Lck)和11.61％(ZAP70)(图7B)。
达沙替尼阻断NFAT介导的GFP的诱导表达
发明人制备了CD8+ CD19 CAR/4-1BB T细胞，发明人对其进行转导以共表达NFAT诱导型GFP报告基因。发明人在存在100nM达沙替尼的情况下或不存在达沙替尼的情况下，将这些T细胞与Raji(CD19+)肿瘤细胞或K562(CD19)肿瘤细胞共培养，并进行流式细胞术分析以测定GFP报告基因的表达。
数据显示，在达沙替尼的存在下，GFP报告基因表达的诱导被完全消除。在不存在达沙替尼的情况下，用Raji刺激后GFP表达的平均荧光强度(MFI)平均为1211；在存在达沙替尼的情况下，用Raji刺激后时仅为129，这类似于用未刺激T细胞获得的背景MFI值(MFI117)(图8，左图)。
发明人证实了达沙替尼的存在消除了CD4+ CD19CAR/4-1BB T细胞中NFAT的信号传导和GFP报告基因的表达(图8，右图)。
数据表明，达沙替尼可完全阻断CAR的信号传导并阻止NFAT转录因子在CD8+T细胞和CD4+ T细胞中表达。
达沙替尼中断信号传导不会降低CAR-T细胞的生存活力
发明人在不存在达沙替尼的情况下或存在100nM达沙替尼的情况下，单独培养CD8+CD19 CAR/4-1BB T细胞或与经辐射的K562/CD19共培养24小时。在共培养结束时，发明人用Annexin-V和7-AAD进行染色以测定存活CAR-T细胞(Annexin-V-阴性/7-AAD-阴性)、凋亡CAR-T细胞(Annexin-V阳性/7-AAD阴性)和死亡CAR-T细胞(Annexin-V阳性/7-AAD阳性)的百分比。
这些数据显示，在用K562/CD19肿瘤细胞刺激并施用达沙替尼后，与未施用达沙替尼时(存活：25.4％；凋亡：66.2％；死亡8.4％)相比，存在较高比例的存活CAR-T细胞和较少比例的死亡CAR-T细胞或凋亡CAR-T细胞(存活：47.4％；凋亡：45.7％；死亡6.9％)(图9)。在共培养测定开始后2小时，将达沙替尼加入CAR-T细胞和K562/CD19肿瘤细胞的共培养物中时观察到了类似的效果(存活：41.7％；凋亡：51.3％；死亡7％)。这些数据表明，达沙替尼在遇到肿瘤细胞后可以保护CAR-T细胞免受激活诱导的细胞死亡(AICD)。
总体而言，这些数据显示达沙替尼能够完全阻断休眠的CAR-T细胞的刺激、活化和随后的效应子功能。在CD8+ T细胞和CD4+ T细胞中的阻断均有效，并且独立于CAR构造的抗原特异性和特定设计(例如：共刺激部分)而起作用。达沙替尼对CAR-T细胞功能的阻断呈剂量依赖性。也可以实现对CAR-T细胞功能的部分抑制，取决于选定的达沙替尼的浓度。
实施例3：达沙替尼阻断活化的CAR-T细胞的功能
达沙替尼阻断活化的CAR-T细胞的功能
发明人试图确定达沙替尼是否能够阻断已经被活化的CAR-T细胞以及在执行其效应子功能的过程中CAR-T细胞的功能。发明人从n＝3个健康供体制备得到CD8+ CAR-T细胞系。在每种T细胞系中，发明人使用EGFRt转导标记使表达CAR的T细胞富集至纯度＞90％。发明人使用已经转导了CD19的K562靶细胞在基于生物发光的细胞毒性测定中分析CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性。共培养开始后1小时(dasa+1h)将达沙替尼添加到测定培养基中。为了进行比较，发明人将在共培养开始时立即添加达沙替尼的设置组(dasa；如实施例2中的实验中所进行的)，以及未添加达沙替尼的设置组(未处理)包括在内。
这些数据表明，达沙替尼能够阻断已经活化的表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞的细胞溶解功能。在共培养开始后1小时将达沙替尼(100nM)添加到测定培养基中的情况下，发明人检测到共培养7小时后特异性裂解的靶细胞的百分率有所降低。7小时后，特异性裂解的靶细胞的百分比达到稳定水平，并且没有进一步增加，在t＝10小时的特异性裂解率为34％(图10A)。为了便于比较，在没有向共培养物中添加达沙替尼的情况下，在整个10小时的测定期间，特异性靶细胞的裂解速度大大提高且很稳定。在超过2小时的每个分析时间点，特异裂解的靶细胞的百分比均比延迟添加(+1小时)达沙替尼的情况高。在10小时的分析时间点，特异裂解的靶细胞的百分比>90％(图10A)。在共培养开始时加入达沙替尼(100nM)的情况下，完全阻断了细胞溶解活性，这与实施例2中获得的数据一致。
发明人还表明，达沙替尼能够阻断已活化的表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19CAR的CD8+ T细胞中细胞因子的产生和分泌。将CD8+ CAR-T细胞与K562/CD19靶细胞共培养20小时，并通过ELISA测定从这些共培养物中获得的上清液中IFN-些和IL-2的存在。数据显示，在共培养开始后2小时将达沙替尼(100nM)添加到测定培养基的情况下，与未添加达沙替尼的情况(未处理的对照)相比，IFN-测和IL-2的水平较低(图10B)。归一化处理(未经处理的CAR-T细胞中细胞因子的产生水平＝100％)后，残留的IFN-残和II-2的产生的百分比分别为51％和28％(图10B)。
发明人还表明，达沙替尼能够阻断已活化的表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19CAR的CD8+ T细胞的增殖。用CFSE标记CD8+ CAR-T细胞，并与K562/CD19靶细胞共培养。72小时后，基于CFSE染料稀释度分析CAR-T细胞的增殖，并计算增殖指数。共培养开始时(0h)或开始后1小时(+1h)或3小时(+3h)或48小时(+48h)加入达沙替尼(100nM)共培养。在不存在达沙替尼的情况下，在用K562/CD19靶细胞刺激的CAR-T细胞中观察到的增殖作为参考(增殖＝100％)。这些数据显示，与未处理的CAR-T细胞相比，在共培养开始后1小时和3小时加入达沙替尼导致了较低的增殖指数，分别低于26％和72％(图10C)。与未处理的CAR-T细胞相比，共培养开始后48小时加入达沙替尼的增殖指数降低了91％。但是，这种差异在统计上并不显著(图10C)。
总的来说，这些数据表明达沙替尼能够阻断已经被活化且正在执行其效应子功能的CAR-T细胞的功能。在CAR-T细胞免疫疗法的背景下，这种能力对于减轻毒性或防止毒性的加剧具有特殊的临床意义。
实施例4：达沙替尼预防循序性刺激期间CAR-T细胞的活化
发明人采用了NFAT/GFP报告系统，根据信号传导的水平检测达沙替尼是否对活化的CAR-T细胞有效，并评估了达沙替尼介导的抑制作用能否随着时间的推移以及在连续的暴露于抗原期间得以持续(图11)。如实施例1中所述生产NFAT报告子CAR T细胞。
在与已经转导了CD19的K562靶细胞共培养之后，本发明人分析了CD8+ CAR-T和CD4+ CAR-T中NFAT驱动的GFP表达。共培养开始后1小时(dasa+1h)或在进行测定期间(dasa)，将达沙替尼添加到测定培养基中。为了进行比较，发明人将不添加达沙替尼的情况(未处理)包括其中。随后，每24小时同时添加靶细胞和100nM达沙替尼。
这些数据显示，在进行测定后一小时加入达沙替尼时的情况下，T细胞在第1天被部分激活并显示GFP的表达降低(MFI为734，在未经处理但受刺激的CAR-T细胞中为1949)。当从一开始就存在达沙替尼时，GFP的表达在第1天被完全抑制(MFI 137)。
这些数据显示，一旦存在达沙替尼，则在第2天或第3天，无论是从开始进行处理的T细胞，还是在测定后1小时处理的T细胞，都无法通过随后的刺激来诱导GFP。取而代之的是，GFP的水平直到第3天一直在下降，这表明达沙替尼可阻止进一步的抗原特异性刺激，并使细胞保持功能关闭(OFF)状态。
发明人证实，达沙替尼阻止了在具有4-1BB共刺激结构域和NFAT/GFP报告系统共表达的CD19 CAR的CD4+ T细胞中后续抗原的特异性刺激(图11)。
这些数据显示，在进行测定后一小时加入达沙替尼时的情况下，T细胞在第1天被部分激活并显示GFP的表达降低(MFI为841，在未经处理但受刺激的CAR-T细胞中为2288)。当从一开始就存在达沙替尼时，GFP的表达在第1天被完全抑制(MFI 317)。
这些数据显示，一旦存在达沙替尼，则在第2天或第3天，无论是从开始进行处理的T细胞，还是在测定后1小时处理的T细胞，都无法通过随后的刺激来诱导GFP。取而代之的是，GFP的水平直到第3天一直在下降(分别为MFI 108和MFI 326)，而在未经处理的CAR_T细胞中GFP的表达(MFI 2499)仍然很高，这表明达沙替尼可阻止进一步的抗原特异性刺激，并使细胞保持功能关闭(OFF)状态。
总体而言，这些数据证实达沙替尼能够阻断已经被活化的CAR-T细胞的功能。此外，数据表明达沙替尼可以中断已被诱导的活化，并且尽管存在抗原也可以阻止随后的转录因子诱导。
实施例5：去除达沙替尼后可快速且完全地逆转对CAR-T细胞功能的阻断
短期暴露于达沙替尼后，可快速且完全地逆转对CAR-T细胞功能的阻断
发明人从n＝3个健康供体制备得到表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞系。在每种T细胞系中，发明人使用EGFRt转导标记将表达CAR的T细胞富集至纯度＞90％。发明人使用已经转导了CD19的K562靶细胞在基于生物发光的细胞毒性测定中分析了CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性。
共培养开始时(t＝-2h)将达沙替尼(100nM)添加到测定培养基中。2小时(t＝0小时)后，丢弃测定培养基并用新鲜的测定培养基代替(即除去达沙替尼)。每隔1小时分析一次CAR-T细胞的细胞溶解活性，持续10小时。为了进行比较，本发明人将测定培养基中不存在达沙替尼的情况包括在其中(图12A)。
数据表明，在达沙替尼存在下(即在共培养测定的前2小时)，CAR-T细胞没有发挥任何细胞溶解活性，这与实施例2中获得的数据一致。然而改变培养基后(即，在除去达沙替尼后)，CAR-T细胞立即开始发挥其细胞溶解活性。在+4小时时，CAR-T细胞赋予了靶细胞77％的特异性裂解率。在共培养测定结束的10小时时，CAR-T细胞赋予了靶细胞>95％的特异性裂解率，其类似于在联合培养的前2小时未经达沙替尼处理的CAR-T细胞(图12A)。通过本发明人从n＝2个健康供体制备得到的表达具有CD28共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞系证实了这些数据(图12B)。
长期暴露于达沙替尼不会降低CAR-T细胞的生存活力
在不存在达沙替尼[(-)]的情况下或存在达沙替尼[100nM，(+)]的情况下，将CD8+CD19 CAR/4-1BB-T细胞维持在补充有50U/ml IL-2的培养基中连续培养八天。每24小时将达沙替尼添加到培养基中。
在第2天(即48小时，短期暴露)和在第8天(长期暴露)，发明人从每种培养条件中获得CAR-T细胞的等分试样，并使用7AAD和AnnexinV染色测定细胞活力。在每个时间点，与不使用达沙替尼培养的CAR-T细胞相比，在存在达沙替尼的情况下维持的CAR-T细胞系中，有活力的CAR-T细胞百分比更高(图13)。数据表明短期和长期暴露于达沙替尼均不会导致CAR-T细胞的活力降低。
暴露于达沙替尼并随后除去达沙替尼后，可以快速、完全地逆转对CAR-T细胞功能
的阻断作用
在不存在达沙替尼的情况下或存在达沙替尼(100nM)的情况下，将CD8+ CD19CAR/4-1BB-T细胞在补充有50U/ml IL-2的培养基中保持连续培养7天。每24小时将达沙替尼添加到培养基中。
在第1天(即24小时，短期暴露)和第7天(长期暴露)之后，发明人从每种培养条件中获得了CAR-T细胞的等分试样，并进行了完全培养基的更换以除去达沙替尼。然后，发明人进行了功能测试以评估先前暴露于达沙替尼是否对CAR-T细胞随后发挥其抗肿瘤功能的能力产生影响。这些数据显示，在短期和长期接触达沙替尼并随后除去达沙替尼后，CAR-T细胞能够以与在没有达沙替尼的情况下进行培养的CAR-T细胞具有相同的水平和效力发挥其抗肿瘤功能。
图14A中的数据显示，在暴露于达沙替尼1天后(左图)和7天后(右图)，以及随后去除达沙替尼时，CAR-T细胞对靶细胞具有快速有效的特异性细胞溶解活性，与从未接暴露于达沙替尼的CAR-T细胞(dasa/no dasa与no dasa/no dasa相比较)相当。图14A中的数据还显示，暴露于达沙替尼1天(左图)和7天之后(右图)，随后去除达沙替尼(洗涤)并重新暴露于达沙替尼(dasa/dasa)后，仍能够发挥对CAR-T细胞的细胞溶解活性的完全阻断。
图14B中的数据显示，在暴露于达沙替尼1天和7天后，以及随后除去达沙替尼后，CAR-T细胞响应于靶细胞的刺激而产生并分泌的IFN-γ(左图)和IL-2(右图)，其与从未暴露于达沙替尼(Dasa pre-)的CAR-T细胞相当。图14B中的数据还显示，在暴露于达沙替尼1天和7天后，随后除去达沙替尼、并重新暴露于达沙替尼(Dasa during)，仍然能够发挥对CAR-T细胞的细胞因子产生和分泌的完全阻断。
图14C中的数据显示，在暴露于达沙替尼1天和7天后并且随后除去达沙替尼，CAR-T细胞响应靶细胞刺激而增殖，这与从未暴露于达沙替尼(Dasa pre-)的CAR-T细胞相同。图14C中的数据还显示，在暴露于达沙替尼1天和7天后并且随后除去达沙替尼、然后重新接触达沙替尼(Dasa during)，仍能够完全阻断CAR-T细胞的增殖。
总体而言，这些数据表明达沙替尼对CAR-T细胞功能的阻断作用不会对CAR-T细胞的生存活力产生负面影响，并且去除达沙替尼后，对CAR-T细胞功能的阻断作用是快速、完全可逆的，与预处理的持续时间无关。先前接触达沙替尼并不排除达沙替尼在反复接触时具有阻断CAR-T细胞功能的能力。这些数据表明，达沙替尼可用于精确且非常有效地控制CAR-T细胞的功能。
实施例6：达沙替尼在体内阻断CAR-T细胞的功能并预防细胞因子释放综合征
达沙替尼在小鼠异种移植淋巴瘤模型中阻断CAR-T细胞的功能
发明人采用在免疫缺陷小鼠(NSG/Raji)中建立的异种移植模型以评估达沙替尼对体内CD19 CAR/4-1BB-T细胞的影响。实验设置和治疗方案见图15A。简而言之，在第0天将1×10^6萤火虫-荧光素酶_GFP(firefly-luciferase_GFP)转导的Raji肿瘤细胞接种至n≥3的小鼠组，在第7天使用CAR转导的T细胞或对照的未转导T细胞处理小鼠。T细胞产品由等比例的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞组成(比例为1：1)，总剂量为5×10^6个T细胞。在每个处理组中，一小部分组的小鼠在T细胞转移前3小时开始施用达沙替尼，然后每6小时施用一次，共施用6剂。
基于达沙替尼在小鼠中已知的药代动力学和药效学[23](假设腹腔注射后的药代动力学不会比静脉注射后的快)，这为T细胞转移前3小时至T细胞转移后33小时内提供了一个窗口(总窗口：36小时)，其中小鼠血清中存在的达沙替尼的浓度至少为100nM。因此在该小鼠模型中，达沙替尼的阻断作用应在CAR-T细胞转移后第+1天生效，而在CAR-T细胞转移后第3天不再有效。
达沙替尼可在体内阻断CAR-T细胞中细胞因子的产生和分泌并阻止细胞因子的释
放
发明人分析了同时使用CAR-T细胞和达沙替尼处理的小鼠(NSG/Raji)中血清细胞因子的水平。为了确定细胞因子的水平，本发明人在小鼠血清中进行了多重细胞因子分析(图15B)。
数据显示，与仅接受CAR-T细胞但未接受达沙替尼(CAR/-)的小鼠相比，在接受了CAR-T细胞和达沙替尼(第+1天，CAR/+)的小鼠中GM-CSF(6.4pg/ml)、IFN-p(13.4pg/ml)、TNF-(0.04pg/ml)、IL-2(低于检测限)、IL-5(21.4pg/ml)和IL-6(低检测限)的血清水平显著降低[即GM-CSF 3.2％，IFN-SF 3％，TNF-SF 3.％和IL-52.6％](图15B)。这些数据证实了发明人在体外先前观察到的结果，即达沙替尼能够阻断CAR-T细胞的细胞因子分泌(参见实施例2)。这些数据还证实了发明人在体外先前观察到的结果，即达沙替尼能够快速逆转对CAR-T细胞功能的阻断(参见实施例5)(图15B)。
在实验的第3天，停用达沙替尼后，与在第+1天(施用达沙替尼时)在相同的小鼠中观察到的血清细胞因子水平相比，细胞因子的血清水平升高至45.8pg/ml GM-CSF，411.8pg/mlIFN-γ，0.9pg/mlTNF-α，0.2pg/ml IL-2、331.2pg/ml IL-5和0.9pg/ml IL-6[GM-CSF的分泌变化了7.2倍，IFN-γ的分泌变化了30.7倍，TNF-α的分泌变化了22.9倍和IL-5的分泌变化了15.5倍](图15B)。
总的来说，这些数据表明：i)达沙替尼可在体内阻断CAR-T细胞中细胞因子的产生和分泌；ii)重复施用达沙替尼至少36小时可以维持对细胞因子产生和分泌的阻断；iii)在体内停用达沙替尼后，细胞因子分泌的阻断是可逆的。
在体内存在达沙替尼的情况下，CAR-T细胞的功能被阻断/一旦停止接触达沙替
尼，CAR-T细胞将在体内恢复其抗肿瘤功能
发明人分析了在接受CAR-T细胞或未转导的对照T细胞、并且已按照图15A中的治疗方案接受达沙替尼或未接受达沙替尼的小鼠中CAR-T细胞的抗肿瘤功能。在第-1天、第1天和第3天通过生物发光成像确定Raji肿瘤负荷。
数据显示，在第-1天和第1天之间，接受CAR-T细胞以及达沙替尼的小鼠的肿瘤进展(CAR/+；14.1倍变化)与接受未转导的对照T细胞和达沙替尼的小鼠(ctrl/+；15.4倍变化)相似(图15C，黑色柱)，即CAR没有效果。作为比较，在短期内接受了CAR-T细胞但未接受达沙替尼的小鼠中肿瘤的进展明显减慢。
数据显示，在第1天和第3天之间，当停用达沙替尼时，接受CAR-T细胞治疗(经或未经达沙替尼处理)的两组中肿瘤负荷均大大降低，特别是之前用达沙替尼处理过的小鼠中的肿瘤负荷显著降低，说明达沙替尼对CAR-T功能的阻断在体内可迅速逆转(图15C，灰色柱)。
发明人使用流式细胞术分析了在T细胞注射后第1天和第3天时小鼠的骨髓(BM)、脾脏(SP)和外周血(PB)中人T细胞的存在。活的人T细胞被鉴定为7AAD-、CD3+和CD4+。
数据显示，在第1天，与接受了CAR-T而未接受达沙替尼的小鼠(CAR/未处理：BM：0.099％；PB：0.16％)相比，接受了CAR-T细胞和达沙替尼的小鼠(CAR/处理：BM：0.087％；PB：0.19％)中人T细胞的频率没有差异细胞；即，达沙替尼的施用不损害CAR-T细胞的移植(图15D，d+1)。在第3天，与未接受达沙替尼(CAR/未处理：BM：0.56％；PB：0.61％)的小鼠相比，同时接受达沙替尼治疗的小鼠(CAR/处理：BM：0.23％；PB：0.36％)中CAR-T细胞的频率更低(图15D，d+3)，这与发明人在体外的观察一致，达沙替尼能够阻断CAR-T细胞的增殖和扩增。
达沙替尼在体内阻断CAR-T细胞中的CAR信号传导和NFAT转录因子的诱导
发明人制备了CD8+和CD4+ CD19CAR/41BB T细胞，并对其进行了转导以共表达NFAT诱导型GFP报告基因。发明人使用如上所述的异种移植小鼠模型(图15A)，并进行流式细胞术分析以测定在存在达沙替尼的情况下或不存在达沙替尼的情况下、以及在(d+1)达沙替尼治疗期间或在(d+3)达沙替尼治疗之后，从经CAR-T细胞或对照T细胞治疗的小鼠的骨髓和脾脏中分离的人T细胞中GFP报告基因的表达。
数据显示，在存在达沙替尼的情况下，与未经达沙替尼处理的小鼠相比，从接受达沙替尼处理的小鼠的骨髓和脾脏获得的CAR-T细胞中GFP报告基因的表达显著降低(图15E)。在d+1时不存在达沙替尼(CAR/未处理)的情况下，骨髓CAR-T细胞中GFP的平均荧光强度(MFI)为10687，而在存在达沙替尼(CAR/处理)的情况下，其平均荧光强度仅为6967，减少35％。在脾脏CAR-T细胞中，在d+1时观察到了类似的GFP报告基因表达的减少(减少36％)。在d+3时，当达沙替尼不再起作用时，骨髓中先前已处理的CAR-T细胞与未处理的CAR-T细胞之间的差异仅为10％，而脾脏中先前已处理的CAR-T细胞与未处理的CAR-T细胞之间仅相差23％。
总体而言，这些数据表明达沙替尼能够在体内控制CAR-T细胞的功能。特别地，这些数据显示达沙替尼的施用可防止细胞因子从CAR-T细胞释放，并防止细胞因子释放综合征。达沙替尼的治疗不会损害T细胞的移植。一旦停止接触达沙替尼，CAR-T细胞将恢复其抗肿瘤功能。
实施例7：达沙替尼在体内阻断活化的CD19CAR/4-1BB
CAR-T细胞的功能
达沙替尼可阻断小鼠异种移植淋巴瘤模型中CAR-T细胞的功能
发明人采用在免疫缺陷小鼠(NSG/Raji)中建立的异种移植模型以评估达沙替尼对体内活化的CAR/4-1BB-T细胞的影响。实验设置和治疗方案见图16A。简而言之，在第0天，将1x10^6萤火虫-荧光素酶_GFP转导的Raji肿瘤细胞接种至n≥6只小鼠组，并在第7天用CAR转导的T细胞或对照未转导的T细胞治疗小鼠。T细胞产品由等比例的CD4+T细胞和CD8+ T细胞组成(比例为1：1)，总剂量为5×10^6个T细胞。在指定组中，在T细胞转移至小鼠三天后接受达沙替尼的治疗，然后每6小时接受一次治疗总共8剂。基于达沙替尼在小鼠中已知的药代动力学和药效学，这为肿瘤接种后第10天至第12天之间提供了一个窗口，其中小鼠血清中达沙替尼的浓度高于阻断CAR-T细胞功能所需的阈值。在存在达沙替尼的情况下，CAR-T细胞功能处于关闭状态(OFF)，并且停用达沙替尼后，再次恢复功能为打开(ON)。
发明人分析了已经接受CAR-T细胞或未转导的对照T细胞治疗、以及已经按照图16A中的治疗方案接受达沙替尼或未接受达沙替尼治疗的小鼠中的CAR-T细胞抗肿瘤功能。通过在第7天、第10天、第12天、第14天、第17天以及随后每周一次的生物发光成像确定Raji肿瘤负荷(图16B)。这些数据显示，在T细胞转移后的第一个阶段(第7天至第10天)，CD19-CAR T细胞开始发挥其抗淋巴瘤活性，并延迟了淋巴瘤进展，如BLI所体现(图16B)。在T细胞转移后的第二阶段(第10天至第12天)，达沙替尼迅速诱导功能关闭(OFF)状态并停止了抗淋巴瘤反应活性，这体现在达沙替尼治疗组中BLI信号显著增强。相反，在接受CD19-CAR T细胞但未接受达沙替尼治疗的小鼠中，BLI信号在此阶段没有增加。在第三阶段(第12天后)，中断达沙替尼的给药以使CAR T细胞恢复至其功能性ON状态。如迅速减少的BLI信号所揭示的，CAR T细胞可迅速恢复其抗淋巴瘤功能。在第17天后，在用达沙替尼治疗的组中，CAR-T细胞甚至在控制肿瘤方面更加有效，因为一直到第59天内所有小鼠中的肿瘤都得到了控制。相反，接受了CAR-T细胞但未接受达沙替尼的组中大多数小鼠的肿瘤都复发了(图16B)。
这些数据显示，在第7天到第10天之间，与接受对照T细胞治疗的小鼠相比(生长率为2018％)，接受CAR-T细胞治疗的小鼠中肿瘤生长减少，与仅接受CAR治疗的小鼠和随后被确定接受达沙替尼的小鼠相同(生长率分别为298％和227％)。在第10天到第12天之间，与仅接受CAR-T细胞治疗的小鼠(CAR(ON)22.2％)相比，接受CAR-T细胞外加达沙替尼的小鼠显示出更高的肿瘤进展(CAR(ON/OFF/ON)；405％)(图16C)，即，尽管在达沙替尼的存在下存在初次活化CAR-T细胞的作用，但CAR没有效果。这些数据显示，在停止使用达沙替尼的第12天到第17天之间，接受CAR-T细胞治疗的两组中肿瘤负荷均大大降低(无论是否先前使用过达沙替尼治疗；肿瘤的发光值分别减少66％和97.8％)，特别是先前使用达沙替尼治疗的小鼠中肿瘤负荷大大降低，这说明达沙替尼对CAR-T功能的阻断在体内可迅速逆转(图16C)。
达沙替尼可阻断体内CAR-T细胞中细胞因子的产生和分泌并预防细胞因子释放综
合征
发明人分析了使用CAR-T细胞和达沙替尼同时治疗的小鼠(NSG/Raji)中的血清细胞因子水平。为了评估细胞因子的表达，发明人对小鼠血清中的IFNγ进行了分析(图16D)。
数据显示，在接受CAR-T细胞的小鼠中，在施用达沙替尼前的第10天，IFN小血清水平相同。在第12天施用达沙替尼后，与接受CAR-T但未接受达沙替尼的小鼠(CAR(ON))(157pg/ml，图16D)相比，接受达沙替尼(CAR(ON/OFF/ON))的小鼠中IFN-鼠的血清水平(24pg/ml)明显降低。这些数据证实了发明人先前在体外观察的结果，即达沙替尼能够阻断活化的CAR-T细胞的细胞因子分泌，并预防之后刺激被抑制的T细胞(参见实施例3和实施例4)。
这些数据还证实了发明人先前在体外的观察结果，即达沙替尼能够快速逆转对CAR-T细胞功能的阻断(参见实施例5)。在实验的第14天，停用达沙替尼后，IFN用的细胞因子血清水平增加至38pg/ml，与第12天在同一只小鼠(已施用达沙替尼)中观察到的细胞因子血清水平相比，变化了1.6倍(图16D)。
总的来说，这些数据表明：i)达沙替尼可在体内阻断活化的CAR-T细胞中细胞因子的产生和分泌；ii)通过重复施用达沙替尼至少54小时可以维持对细胞因子产生和分泌的阻断；iii)在体内停用达沙替尼后，对细胞因子分泌的阻断是可逆的。
实施例8：达沙替尼在体内阻断活化的CD19CAR-T细胞/CD28
CAR-T细胞的功能达
沙替尼可阻断小鼠异种移植淋巴瘤模型中CAR-T细胞的功能
发明人采用在免疫缺陷小鼠(NSG/Raji)中建立的异种移植模型以评估达沙替尼对体内活化的CAR/CD28-T细胞的影响。实验设置和治疗方案见图17A。简而言之，在第0天，将1×10^6个萤火虫荧光素酶_GFP转导的Raji肿瘤细胞接种至n≥8只小鼠的组，在第7天，用CAR转导的T细胞或对照的未转导的T细胞治疗小鼠。T细胞产品由等比例的CD4+T细胞和CD8+ T细胞组成(比例为1：1)，总剂量为5×10^6个T细胞。在指定组中，在T细胞转移至小鼠三天后(即第10天)施用达沙替尼，然后每6小时施用一次总共8剂。基于达沙替尼在小鼠中已知的药代动力学和药效学，这为肿瘤接种后第10天至第12天之间提供了一个窗口，其中小鼠血清中存在的达沙替尼的浓度高于阻断CAR-T细胞功能所需的阈值。另外用无达沙替尼的媒介物(表示为CAR/DMSO)治疗的接受了CAR-T细胞的一组小鼠作为对照。
在存在达沙替尼的情况下，CAR-T细胞功能处于OFF状态，一旦停止施用达沙替尼，便重新恢复功能为ON。
发明人分析了接受CAR-T细胞或未转导的对照T细胞、以及已经按照图17A中的治疗方案接受达沙替尼或未接受达沙替尼的小鼠中的CAR-T细胞抗肿瘤功能。通过在第7、10、12、14、17天以及随后每周一次的生物发光成像实验确定Raji肿瘤负荷。这些数据显示，在T细胞转移后的第一个阶段(第7天到第10天)，CD19-CAR T细胞开始发挥其抗淋巴瘤活性并被强烈活化，如降低的BLI所证实。同时，肿瘤在接受CAR T细胞和达沙替尼的小鼠中迅速生长(图17B)。在T细胞转移后的第二阶段(第10天至第12天)，达沙替尼迅速诱导了功能关闭(OFF)状态并停止了抗淋巴瘤反应，因为在达沙替尼治疗的组中，每10只动物中就有7只肿瘤开始重新生长。相比之下，在此阶段中已接受CD19-CAR T细胞但未接受额外治疗的10只小鼠中有9只的BLI信号迅速降低，在接受CD19-CAR T细胞和不含达沙替尼的媒介物治疗的10只小鼠中有8只的BLI信号迅速降低。在第三阶段(第12天后)，中断达沙替尼的施用使得CAR T细胞恢复至其功能性ON状态。实际上，与接受CAR-T细胞和媒介物治疗或仅接受CAR-T细胞治疗的小鼠相比(中位BLI值分别为966和839)，CAR T细胞迅速恢复了其抗淋巴瘤功能，这一点可通过迅速降低的BLI信号(图17B)证实，该信号导致了在第17天更深的缓解(中位BLI值为507)。
这些数据显示，在第7天至第10天之间，与接受对照T细胞治疗的小鼠(生长率为1628％)相比，接受CAR-T细胞治疗的小鼠中肿瘤的生长降低，表明T细胞已被活化(肿瘤分别减少75％(dasa)、15％(DMSO)和11％(仅CAR))(图17C)。在第10天至第12天之间，与单独接受CAR-T细胞治疗的小鼠(BLI分别降低32％(CAR/DMSO)和61％(CAR/-))相比，接受CAR-T细胞以及达沙替尼治疗的小鼠表现出肿瘤进展(CAR(ON/OFF/ON)，生长33％)(图17C)，也就是说，尽管在存在达沙替尼时CAR-T细胞发生初次活化，但是CAR没有效果。
数据显示，在停用达沙替尼的第12天到第14天之间，所有接受CAR-T细胞治疗的组中肿瘤负荷均大大降低(在CAR/DMSO中，每10只小鼠中有9只，在仅CAR的组中10只小鼠中有6只)，特别是先前用达沙替尼治疗过的小鼠中肿瘤负荷有了很大的降低(10只小鼠中有10只，BLI平均降低了71％)，这说明了达沙替尼对CAR-T体内功能的阻断可迅速逆转(图17C)。
实施例9：与地塞米松相比，达沙替尼能够更好地控制CAR-T细胞的功能
发明人从n＝3个健康供体制备得到具有4-1BB共刺激结构域的CD8+ CD19 CAR-T细胞系。在每种T细胞系中，发明人使用EGFRt转导标记将CAR-T细胞富集至纯度>90％。发明人使用已经转导了作为靶细胞的CD19的K562进行了功能试验，以评估地塞米松对CAR-T细胞功能的影响。在测定开始时将地塞米松添加到测定培养基中，或以指定剂量预处理24小时。
与地塞米松相比，达沙替尼可更好地控制CAR-T细胞的细胞溶解功能
发明人在基于生物发光的细胞毒性测定中分析了CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性。数据表明，地塞米松不能完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+CAR-T细胞的细胞溶解功能。地塞米松诱导的对细胞溶解功能的抑制程度并不主要取决于剂量，而是取决于治疗方案：
-当在测定开始时添加地塞米松，在任何应用的剂量下，CAR-T细胞的细胞溶解功能均未受到明显影响(图18A，左图)(经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率>87％，而未经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为91％)。
-当用地塞米松预处理CAR-T细胞24小时(图18A，右图)时，在任何应用的剂量下，CAR-T细胞的细胞溶解功能均被部分抑制(在t＝10h时经地塞米松处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率>45％，而未经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为91％)。
-在测定开始时，在经0.1μM达沙替尼处理过的细胞中观察到了由CAR-T细胞介导的对靶细胞特异性裂解的完全阻断，在两个图中均包括了该结果作为参考和比较(在t＝10h时的特异性裂解率<1％)。
与地塞米松相比，达沙替尼能够更好地控制CAR-T细胞中细胞因子的产生和分泌
发明人分析了在存在地塞米松的情况下或不存在地塞米松的情况下CD8+ CAR-T细胞系中细胞因子的产生和分泌。进行ELISA以检测从共培养物中除去的上清液中的IFN-共和IL-2。
数据显示，地塞米松不能完全阻断表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ CAR-T细胞中细胞因子的分泌。地塞米松对细胞因子分泌的影响取决于治疗方案，并随不同的细胞因子而变化：
-对于已经进行过预处理(黑色柱)或仅在测定过程中进行过处理(灰色柱)的CAR-T细胞而言，IFN-，的分泌没有明显减少(图18B，左图)。在任何给定浓度的地塞米松下，与未处理的CAR-T细胞相比，经地塞米松处理的CAR-T细胞中残留的特异性IFN-留的分泌量超过43％。
-对于已经进行过预处理(黑色柱)或仅在测定过程中用地塞米松处理(灰色柱)的CAR-T细胞而言，IL-2的分泌有部分减少(图18B，右图)。在任何给定浓度的地塞米松下，与未处理的CAR-T细胞相比，经地塞米松处理的CAR-T细胞中残留的特异性IL-2的分泌量少于17％。与实施例2中获得的数据一致，用0.1μM达沙替尼处理的CAR-T细胞显示出完整的对IL-2分泌的阻断，将其作为参考并用于比较。
与地塞米松相比，达沙替尼可更好地控制CAR-T细胞的增殖
发明人分析了在存在地塞米松的情况下或不存在地塞米松的情况下CD8+ CAR-T细胞系的增殖。用CFSE标记CAR-T细胞，并将其与本发明人已经转导了CD19的K562共培养。进行流式细胞仪分析以确定72小时后T细胞的增殖。计算表明在测定期间发生的平均细胞分裂数目的增殖指数，并用于确定残留的增殖，将其相对于在没有经进一步处理的情况下被刺激的CAR-T细胞的增殖指数视为100％进行归一化。
数据证实了地塞米松能够减少CD8+ CAR-T细胞的增殖。接受地塞米松预处理24h的CAR-T细胞和在共培养开始时接受地塞米松处理的CAR-T细胞之间的效果相同。在任何给定的浓度下，与未处理的CAR-T细胞相比，残留的增殖低于26％(图18C)。然而，地塞米松无法完成经0.1μM达沙替尼(<5.6％)处理时所观察到的对CAR-T细胞增殖的完全阻断。
总体而言，这些数据表明，与地塞米松相比，达沙替尼能够更好地控制CAR-T细胞。特别地，这些数据显示，在共培养开始时或在测定前24小时，向CAR-T细胞施用地塞米松均不可以如经0.1μM达沙替尼处理CAR-T细胞所观察到的完全阻断CAR-T细胞的功能。
实施例10：酪氨酸激酶抑制剂能够影响CAR-T细胞效应子的功能
达沙替尼和其他临床批准的酪氨酸激酶抑制剂对CAR-T细胞功能的影响
发明人从n＝2个健康供体制备得到具有4-1BB共刺激结构域的CD8+ROR1 CAR-T细胞系。在每种T细胞系中，发明人使用EGFRt转导标记将CAR表达T细胞富集纯度至>90％。发明人使用ROR1+RCH-ACV作为靶细胞进行了功能测试，以评估一组临床批准的TKI对CAR-T细胞功能的影响。在测定开始时将TKI添加到测定培养基中，使其最终浓度分别为100nM达沙替尼、5.3μM伊马替尼、4.2μM拉帕替尼或3.6μM尼洛替尼。未经处理的CAR-T细胞用于计算并作为对照。
发明人在基于生物发光的细胞毒性测定中分析了CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性。数据显示，在所测试的组中，达沙替尼是唯一能够完全阻断细胞溶解功能(在t＝8h时的特异性裂解率<5％)的TKI(图19A)。数据显示，在存在拉帕替尼、尼洛替尼或伊马替尼的情况下，CAR-T细胞的细胞溶解功能受到部分抑制(在t＝8h时，经拉帕替尼、尼洛替尼或伊马替尼处理的CAR-T细胞介导的特异性裂解率<75％，而未经处理的CAR-T细胞介导的特异性裂解率>90％)。
发明人通过使用从CAR-T细胞与RCH-ACV靶细胞的共培养物中去除的上清液进行ELISA测定，分析了CD8+ CAR-T细胞中IFN--的产生和分泌。数据表明达沙替尼和尼洛替尼能够减少IFN-分的产生和分泌的量(图19B)：
-在100nM达沙替尼的存在下，IFN-的的产生和分泌被完全阻断并且低于检测水平。
-在3.6μM尼洛替尼的存在下，CAR-T细胞中IFN-T的产生和分泌降低至480pg/ml，而未经处理的CAR-T细胞产生的IFN-的为1310pg/ml，这类似于残留的IFN似的分泌为36.6％。
然后，本发明人分析了在存在TKI处理的情况下或不存在TKI处理的情况下CD8+CAR-T细胞系的增殖。用CFSE标记CAR-T细胞，并将其与RCH-ACV共培养。共培养72小时后，通过流式细胞术评估CAR-T细胞的增殖。
数据显示，用100nM达沙替尼进行治疗可介导对CAR-T细胞增殖(几乎)完全的抑制，这与实施例2中显示的数据相似。数据还显示尼洛替尼能够部分阻断CD8+ CAR-T细胞的增殖：在测定培养基中尼洛替尼的浓度为3.6μM的情况下，与未经处理的CAR-T细胞具有2.84的增殖指数相比，其增殖指数降低至2.24。
达沙替尼和其他Src激酶抑制剂对CAR-T细胞的细胞溶解功能的影响
发明人从一位健康供体制备得到具有4-1BB共刺激结构域的CD8+ CD19 CAR-T细胞系。在T细胞系中，发明人使用EGFRt转导标志将表达CAR的T细胞富集至纯度＞90％。发明人使用已经转导了作为靶细胞的CD19的K562进行4小时的基于生物发光的细胞毒性测定，分析了CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解活性，以评估一组Src激酶抑制剂对CAR-T细胞的细胞溶解功能的影响。在测定开始时，以4对数浓度范围将Src激酶抑制剂添加到测定培养基中。
数据显示，在四种检测的Src激酶抑制剂中，三种抑制剂能够阻断CAR-T细胞的细胞溶解活性(图20)：
-在测定培养基中达沙替尼的浓度为10nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能受到部分抑制(经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为16.1％，而未经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解为82％)。
-在测定培养基中达沙替尼的浓度≥100nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能被(几乎)完全抑制(经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率<3％，而未经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解为<3％)。
-在测定培养基中PP1-抑制剂的浓度为10nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能受到部分抑制(经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为62.4％，而未经处理的CAR-T细胞介导的特异性裂解率为82％)。
-在测定培养基中PP1抑制剂的浓度≥100nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能被(几乎)完全抑制(经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率<3％，而未经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率为82％)。
-在测定培养基中博舒替尼的浓度为1000nM时，CAR-T细胞的细胞溶解功能被(几乎)完全抑制(经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解率<3％，而未经处理的CAR-T细胞介导的靶细胞的特异性裂解为82％)。
总体而言，这些数据表明除达沙替尼以外的酪氨酸激酶抑制剂可对CAR-T细胞功能发挥抑制作用。特别地，数据显示尼洛替尼是一种有效的从CAR-T细胞产生和分泌细胞因子的抑制剂。Src激酶抑制剂PP1抑制剂和博舒替尼能够完全阻断CD8+ CAR-T细胞的细胞溶解功能。
实施例11：达沙替尼的间歇性治疗增强了CAR-T细胞的功能
间歇性暴露于达沙替尼可增强体内CAR-T细胞的抗肿瘤功能
发明人采用在免疫缺陷小鼠(NSG/Raji)中建立的异种移植模型以评估达沙替尼对体内CD19 CAR/4-1BB-T细胞的影响。实验设置和治疗方案见图21A。简而言之，在第0天将1×10^6个firefly-luciferase_GFP转导的Raji肿瘤细胞接种至n≥2的小鼠组。在第7天通过尾静脉注射CAR-T细胞(即表达具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR的CD8+ T细胞和CD4+T细胞，总剂量：5×10e6；CD8：CD4比例＝1：1)或对照未转导的T细胞。从第7天到第11天内每24小时经腹腔注射5mg/kg达沙替尼，然后在第12天到第14天内每36小时经腹腔注射5mg/kg达沙替尼(共7剂)。在第7、9和15天进行一系列的生物发光成像以确定肿瘤负荷。
基于已知的达沙替尼在小鼠体内的药代动力学和动力学[23]，当达沙替尼以>50nM的浓度存在于小鼠血清中时，这为每次注射后～6小时提供了一个窗口，其应该会导致如实施例2中所示的对CAR-T细胞功能的临时阻断。在接下来的21小时内(直到下一次注射)，达沙替尼应低于50nM的抑制阈值，因此不应对CAR-T细胞的功能产生抑制作用。
数据显示，用达沙替尼间歇性治疗小鼠可提高体内CAR-T细胞的抗肿瘤功能(图21B)。与接受了未经达沙替尼处理的CAR-T细胞的小鼠相比，接受了CAR-T细胞和达沙替尼处理的小鼠表现出更好的肿瘤控制和较慢的肿瘤进展：在第8天，接受了未经达沙替尼处理的CAR-T细胞的小鼠的平均生物发光信号为1.9e10 p/s/cm*2/sr，而接受CAR-T细胞并用达沙替尼间歇性治疗的小鼠的平均生物发光信号仅为5.6e9 p/s/cm*2/sr(p<0.05)。在第8天，在接受了经达沙替尼处理或未经达沙替尼处理的未转导的对照T细胞的小鼠之间，生物发光信号在统计学上没有显著差异。
间歇性暴露于达沙替尼中可增强体内CAR-T细胞的移植、增殖和持久性
本发明人使用了如图21A所示的异种移植模型来分析间歇性暴露于达沙替尼的小鼠中CAR-T细胞的移植、增殖和持久性。在第15天处死小鼠，并通过流式细胞术分析外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(SP)中是否存在人CAR-T细胞。图22A显示了通过用于门控策略来评估活的人T细胞(7AAD-，CD3+，CD45+)和其余肿瘤细胞(GFP+)的百分比。
数据显示，间歇性暴露于达沙替尼可增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能，如图21B所示。在已经用CAR-T细胞治疗的一只小鼠的骨髓中检测到所有活细胞中GFP阳性肿瘤细胞为58.8％的高肿瘤负荷(图22A，上图)。与此相反，用CAR-T细胞治疗且间歇性施用达沙替尼的一只示例性小鼠中显示出骨髓的所有活细胞中残留的肿瘤负荷为0.22％(图22A，下图)。
图22B中的数据表明，用达沙替尼进行间歇性治疗增加了体内CAR-T细胞的移植、增殖和持久性。在接受达沙替尼间歇性治疗的动物中，与接受了CAR-T细胞但未间歇性施用达沙替尼动物相比(BM：1.9％，SP：3.2％)，在骨髓和脾脏中人CAR-T细胞的百分比更高(BM：7.3％；SP：6.9％)(p>0.05)。
总的来说，这些数据表明间歇性暴露于达沙替尼会增强体内CAR-T细胞的抗肿瘤功能。间歇性暴露于达沙替尼还增加了体内CAR-T细胞的移植、增殖和持久性。
实施例12：达沙替尼的间歇性治疗降低了CAR-T细胞上PD-1的表达
基于实施例11(图21A)中引入的小鼠模型，发明人通过流式细胞术分析了PD-1在在骨髓(BM)、外周血(PB)和脾脏(SP)中人CAR-T细胞的表面表达。
数据显示，与未间歇性暴露于达沙替尼的小鼠的相应器官中的CAR-T细胞相比，间歇性暴露达沙替尼显著降低了骨髓和外周血的CAR-T细胞中PD-1的表达(图23)：
-在骨髓(BM)中，在未暴露于达沙替尼(CAR/-)的小鼠中，用抗PD1 mAb染色的CAR-T细胞获得的平均荧光强度(MFI)为9461，而在使用达沙替尼(CAR/+)间歇性治疗的小鼠中的值仅为7025。
-在外周血(PB)中，在未暴露于达沙替尼(CAR/-)的小鼠中，用抗PD1 mAb染色CAR-T细胞后获得的平均荧光强度(MFI)为4110，而在使用达沙替尼(CAR/+)间歇性治疗的小鼠中的值仅为2775。
-在脾脏(SP)中，在未暴露于达沙替尼(CAR/-)的小鼠中，用抗PD1 mAb染色CAR-T细胞后获得的平均荧光强度(MFI)为4318，而在使用达沙替尼(CAR/+)间歇性治疗的小鼠中的值则为23652。
总体而言，这些数据表明，间歇性暴露于达沙替尼后降低了CAR-T细胞上PD-1的表达。
实施例13：被达沙替尼阻断的CAR-T细胞易于后续被iCasp9自杀基因清除
在不存在达沙替尼的情况或存在100nM达沙替尼的情况下、以及在不存在AP20187(一种iCaspase诱导剂)的情况或存在10nM AP20187的情况下，在补充有50U/ml IL-2的培养基中培养共表达iCasp自杀基因的CAR-T细胞。24小时后，将细胞用抗CD3 mAB标记，并通过流式细胞仪分析iCasp+ T细胞的存在。
数据表明，达沙替尼不影响T细胞的诱导自杀基因及其凋亡(图24)：
在存在二聚体(达沙替尼/二聚体+)的情况下，iCasp+细胞的百分比降低到45％，这与在存在100nM达沙替尼(36％)和二聚体(达沙替尼+/二聚体+)的情况下的iCasp+的百分比相当。
总体来说，这些数据表明，被达沙替尼阻断的CAR-T细胞易于被iCasp9自杀基因清除。
工业适用性
用于本发明所述用途的免疫细胞和酪氨酸激酶抑制剂以及用于本发明方法的材料均可被工业制造并作为所要求保护的方法和用途(例如用于治疗本发明所定义的癌症)的产品出售，并符合药品和诊断产品的已知生产标准。因此，本发明是工业上适用的。
参考文献
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序列表
以下氨基酸序列是构建体“具有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR”的一部分(参见图1A)：
SEQ ID NO:1(GMCSF信号肽):
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:2(CD19重链可变区(VH)):
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:3(IgG4铰链区):
ESKYGPPCPPCP
SEQ ID NO:4(CD28跨膜区):
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO:5(4-1BB共刺激结构域):
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO:6(CD3z信号传导结构域):
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:7(T2A核糖体跳跃序列):
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
SEQ ID NO:8(GMCSF信号肽):
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:9(EGFRt):
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
以下氨基酸序列是构建体“具有CD28共刺激结构域的CD19 CAR”的一部分(请参见图1B)：
SEQ ID NO:10(GMCSF信号肽):
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:11(CD19 scFv):
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTV
SEQ ID NO:12(IgG4铰链区):
ESKYGPPCPPCP
SEQ ID NO:13(CD28跨膜区):
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO:14(CD28共刺激结构域):
RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO:15(CD3z信号传导结构域):
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:16(T2A核糖体跳跃序列):
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
SEQ ID NO:17(GMCSF信号肽):
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:18(EGFRt):
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
以下氨基酸序列是构建体“具有4-1BB共刺激结构域的ROR1 CAR”的一部分(请参见图1C)：
SEQ ID NO:19(GMCSF信号肽):
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:20(hR12重链可变区(VH)):
QVQLVESGGALVQPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYAASVQGRFTISADNAKNTVYLQMNSLTAADTATYFCARDSYADDGALFNIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:21(4(GS)×3接头):
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:22(hR12轻链可变区(VL)):
QLVLTQSPSVSAALGSSAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLAGQAPRYLMYVQSDGSYEKRSGVPDRFSGSSSGADRYLIISSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVG
SEQ ID NO:23(IgG4铰链区):
ESKYGPPCPPCP
SEQ ID NO:24(CD28跨膜区):
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO:25(4-1BB共刺激结构域):
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO:26(CD3z信号传导结构域):
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:27(T2A核糖体跳跃序列):
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
SEQ ID NO:28(GMCSF信号肽):
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:29(EGFRt):
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
以下氨基酸序列是构建体“具有4-1BB共刺激结构域的SLAMF7 CAR”的一部分(请参见图1D)：
SEQ ID NO:30(GMCSF信号肽):
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:31(huLuc63重链可变区(VH)):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYAPSLKDKFIISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPDGNYWYFDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:32(4(GS)×3接头):
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:33(huLuc63轻链可变区(VL)):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSSYPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:34(IgG4铰链区):
ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:35(CD28跨膜区):
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO:36(4-1BB共刺激结构域):
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO:37(CD3z信号传导结构域):
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:38(T2A核糖体跳跃序列):
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
SEQ ID NO:39(GMCSF信号肽):
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:40(EGFRt):
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
以下氨基酸序列是构建体“具有CD28共刺激结构域的SLAMF7 CAR”的一部分(请参见图1E)：
SEQ ID NO:41(GMCSF信号肽):
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:42(huLuc63重链可变区(VH)):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYAPSLKDKFIISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPDGNYWYFDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:43(4(GS)×3接头):
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:44(huLuc63轻链可变区(VL)):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSSYPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:45(IgG4铰链区):
ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:46(CD28跨膜区):
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO:47(CD28共刺激结构域):
RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO:48(CD3z信号传导结构域):
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:49(T2A核糖体跳跃序列):
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
SEQ ID NO:50(GMCSF信号肽):
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:51(EGFRt):
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
SEQUENCE LISTING
<110> 尤利乌斯·马克西米利安维尔茨堡大学
<120> 达沙替尼和其他酪氨酸激酶抑制剂对基因修饰的嵌合抗原受体T细胞的功能
的控制和调节
<130> P20112755WP
<150> EP 17205922.2
<151> 2017-12-07
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSF 信号肽
<400> 1
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD19 重链可变区(VH)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG4 铰链区
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 跨膜区
<400> 4
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 5
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB 共刺激结构域
<400> 5
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3z 信号传导结构域
<400> 6
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A 核糖体跳跃序列
<400> 7
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSF 信号肽
<400> 8
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 9
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFRt
<400> 9
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSF 信号肽
<400> 10
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 11
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD19 scFv
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG4 铰链区
<400> 12
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 13
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 跨膜区
<400> 13
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 14
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 共刺激结构域
<400> 14
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
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<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3z 信号传导结构域
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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100 105 110
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 16
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1 5 10 15
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20
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<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
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20
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<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFRt
<400> 18
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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165 170 175
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180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
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210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
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<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSF 信号肽
<400> 19
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hR12 重链可变区 (VH)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<211> 111
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hR12 轻链可变区 (VL)
<400> 22
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1 5 10 15
Ser Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr
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Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Ala Gly Gln Ala Pro Arg Tyr Leu Met
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr
85 90 95
Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Gly
100 105 110
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<211> 12
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 28
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<213> Artificial Sequence
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<223> CD28 跨膜区
<400> 24
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
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Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
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<210> 25
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<213> Artificial Sequence
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<400> 25
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
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20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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<223> CD3z 信号传导结构域
<400> 26
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
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<220>
<223> T2A 核糖体跳跃序列
<400> 27
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20
<210> 28
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSF 信号肽
<400> 28
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1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
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<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFRt
<400> 29
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
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Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
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Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 30
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSF 信号肽
<400> 30
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> huLuc63 重链可变区(VH)
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4(GS)x3 接头
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> huLuc63 轻链可变区 (VL)
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG4 铰链区
<400> 34
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1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
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35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
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165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 35
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 跨膜区
<400> 35
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 36
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB 共刺激结构域
<400> 36
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 37
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3z 信号传导结构域
<400> 37
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
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<210> 38
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A 核糖体跳跃序列
<400> 38
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1 5 10 15
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<210> 39
<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSF 信号肽
<400> 39
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1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 40
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFRt
<400> 40
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
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210 215 220
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225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 41
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSF 信号肽
<400> 41
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 42
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> huLuc63 重链可变区 (VH)
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4(GS)x3 接头
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> huLuc63 轻链可变区 (VL)
<400> 44
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG4 铰链区
<400> 45
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
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100 105 110
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180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 46
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 跨膜区
<400> 46
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 47
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 共刺激结构域
<400> 47
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 48
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3z 信号传导结构域
<400> 48
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 49
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A核糖体跳跃序列
<400> 49
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 50
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSF 信号肽
<400> 50
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 51
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFRt
<400> 51
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
Claims (148)
1.一种用于患者癌症治疗的方法的用途的组合物，所述组合物包含酪氨酸激酶抑制剂；
其中，在所述方法中，所述组合物用于施用于患者，和
其中，所述方法为用于治疗癌症的方法，其包括免疫疗法。
2.如权利要求1所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫疗法为过继免疫疗法。
3.如权利要求1-2中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫疗法为使用免疫细胞进行的免疫疗法。
4.如权利要求3所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫疗法为使用表达了嵌合抗原受体的免疫细胞进行的免疫疗法。
5.如权利要求4所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述嵌合抗原受体能够结合抗原。
6.如权利要求5所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述嵌合抗原受体能够结合细胞表面的抗原。
7.如权利要求5-6中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抗原为癌症抗原。
8.如权利要求5-7中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抗原选自由CD4、CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD52、CD64、CD70、CD72、CD123、CD135、CD138、CD220、CD269、CD319、ROR1、ROR2、SLAMF7、BCMA、αvβ3-整联蛋白、α4β1-整联蛋白、LILRB4、EpCAM-1、MUC-1、MUC-16、L1-CAM、c-kit、NKG2D、NKG2D-配体、PD-L1、PD-L2、Lewis-Y、CAIX、CEA、c-MET、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、Her2、FAP、FR-a、EphA2、GD2、GD3、GPC3、IL-13Ra、间皮素、PSMA、PSCA、VEGFR和FLT3组成的组。
9.如权利要求8所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD123、SLAMF7、ROR1、BCMA和FLT3组成的组。
10.如权利要求9所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抗原为CD19。
11.如权利要求9所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抗原为ROR1。
12.如权利要求9所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抗原为BCMA。
13.如权利要求9所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抗原为FLT3。
14.如权利要求9所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抗原为CD20。
15.如权利要求9所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抗原为CD22。
16.如权利要求9所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抗原为CD123。
17.如权利要求9所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抗原为SLAMF7。
18.如权利要求5-17中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症包括表达所述抗原的癌细胞。
19.如权利要求4-18中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含选自由CD27共刺激结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域、ICOS共刺激结构域、DAP10共刺激结构域、NKG2D共刺激结构域、MyD88共刺激结构域和OX40共刺激结构域组成的组的共刺激结构域。
20.如权利要求19所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含CD28共刺激结构域。
21.如权利要求19所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含4-1BB共刺激结构域。
22.如权利要求19所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含OX40共刺激结构域。
23.如权利要求3-22中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫细胞为淋巴细胞。
24.如权利要求3-23中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫细胞为B淋巴细胞或T淋巴细胞。
25.如权利要求24所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫细胞为T淋巴细胞。
26.如权利要求25所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫细胞为CD4+T淋巴细胞和/或CD8+T淋巴细胞。
27.如权利要求26所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫细胞为CD4+T淋巴细胞。
28.如权利要求26所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫细胞为CD8+T淋巴细胞。
29.如权利要求3-28中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫细胞选自由CD8+杀伤性T细胞、CD4+辅助性T细胞、初始T细胞、记忆性T细胞、中枢记忆性T细胞、效应记忆性T细胞、记忆性干细胞样T细胞、恒定T细胞、NKT细胞、细胞因子诱导的杀伤性T细胞、γ/δT细胞、天然杀伤性细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞组成的组。
30.如权利要求1-29中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂为Src激酶抑制剂。
31.如权利要求1-30中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂为NFAT上游激酶的抑制剂。
32.如权利要求1-31中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂为Lck激酶抑制剂。
33.如权利要求1-32中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂选自由达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、尼洛替尼和PP1抑制剂组成的组。
34.如权利要求33所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂为达沙替尼。
35.如权利要求33所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂为博舒替尼。
36.如权利要求33所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂为PP1抑制剂。
37.如权利要求33所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂为尼洛替尼。
38.如权利要求3-37中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂引起对所述免疫细胞的抑制。
39.如权利要求38所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抑制为对所述免疫细胞的细胞介导的效应子功能的抑制。
40.如权利要求38-39中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，对所述免疫细胞的所述抑制为对其
I)细胞溶解活性；和/或
II)细胞因子的分泌；和/或
III)增殖的抑制。
41.如权利要求38-40中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抑制包括抑制所述免疫细胞中PD1的表达。
42.如权利要求38-41中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抑制包括抑制所述免疫细胞中细胞因子的分泌，所述细胞因子选自由GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8和IL-10组成的组中的一种或多种。
43.如权利要求38-42中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抑制包括抑制所述免疫细胞中IFN-γ和/或IL-2的分泌。
44.如权利要求43所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抑制包括抑制所述免疫细胞中IFN-γ的分泌。
45.如权利要求43所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抑制包括抑制所述免疫细胞中IL-2的分泌。
46.如权利要求38-45任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抑制为部分抑制或完全抑制。
47.如权利要求38-46中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抑制不降低所述免疫细胞的生存活力。
48.如权利要求47所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，在给定的时间段内将所述组合物施用于所述患者，所述抑制作用不会降低所述免疫细胞的生存活力，其中所述的时间段为1小时，优选2小时，优选3小时，优选4小时，优选5小时，优选6小时，优选8小时，优选12小时，优选18小时，优选1天，优选2天，更优选3天，进一步更优选7天，进一步更优选2周，进一步更优选3周，进一步更优选4周，进一步更优选2个月，进一步更优选3个月，进一步更优选6个月。
49.如权利要求38-48中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述抑制为可逆的。
50.如权利要求49所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，在给定的时间内未将所述组合物施用于所述患者后，所述抑制作用被逆转。
51.如权利要求50所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述给定的时间为3天，优选2天，更优选24小时，进一步更优选18小时，进一步更优选12小时，进一步更优选8小时，进一步更优选6小时，进一步更优选4小时，进一步更优选3小时，进一步更优选2小时，进一步更优选90分钟，进一步更优选60分钟，进一步更优选30分钟。
52.如权利要求1-51中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述组合物被连续施用或间歇性施用。
53.如权利要求52所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述组合物被连续施用。
54.如权利要求52所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述组合物被间歇性施用。
55.如权利要求1-54中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，通过施用所述组合物，使得在所述治疗期间，所述组合物的初始施用后所述酪氨酸激酶抑制剂的血清水平维持在阈值血清水平或超过阈值血清水平。
56.如权利要求1-55中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，在所述方法中，通过施用所述组合物，使得在所述治疗期间，所述组合物的初始施用后所述酪氨酸激酶抑制剂的血清水平至少一次维持在高于阈值血清水平并且至少一次低于同一阈值血清水平。
57.如权利要求55-56中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述阈值血清水平为0.1nM-1μM，优选1nM-500nM，更优选5nM-100nM，进一步更优选10nM-75nM，进一步更优选25nM-50nM。
58.如权利要求57所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述阈值血清水平为50nM。
59.如权利要求55-58中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述阈值血清水平为当所述免疫细胞的所述抑制为完全抑制所述免疫细胞的I)细胞溶解活性；和/或
II)细胞因子的分泌；和/或
III)增殖
时的最低血清水平。
60.如权利要求1-59中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，所述癌症的治疗具有改善的临床结果。
61.如权利要求1-60中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述用途为用于减轻或预防与针对所述癌症的所述免疫疗法相关的毒性的用途。
62.如权利要求1-61中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，用于减轻所述患者的肿瘤负荷的用途。
63.如权利要求1-62中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，用于所述癌症治疗的所述用途不降低针对所述癌症进行的所述免疫疗法的治疗功效。
64.如权利要求1-63中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，用于所述癌症治疗的所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，用于提高针对所述癌症进行的所述免疫疗法的治疗功效的用途。
65.如权利要求1-64中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，用于所述癌症治疗的所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，用于降低针对所述癌症的所述免疫疗法的发病率和死亡率的用途。
66.如权利要求1-65中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，用于所述癌症治疗的所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法相比，用于提高针对所述癌症进行的所述免疫疗法的抗肿瘤功效的用途。
67.如权利要求3-66中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，用于所述癌症治疗的所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法中所述免疫细胞的移植和/或持久性相比，用于在针对所述癌症进行的所述免疫疗法中增加所述免疫细胞的移植和/或持久性的用途。
68.如权利要求3-67中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，用于所述癌症治疗的所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法中所述免疫细胞的移植相比，用于提高所述免疫细胞在所述免疫疗法中的移植的用途。
69.如权利要求3-68中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述用途为与针对所述癌症单独进行所述的免疫疗法中所述免疫细胞的耗竭相比，用于减少在针对所述癌症进行的所述免疫疗法中所述免疫细胞的衰竭的用途。
70.如权利要求1-69中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，
I)在使用免疫疗法治疗癌症之前；和/或
II)使用免疫疗法治疗癌症的同时；和/或
III)使用免疫疗法治疗癌症之后；
施用所述组合物。
71.如权利要求70所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，在使用免疫疗法治疗癌症之前施用所述组合物。
72.如权利要求70所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，在使用所述免疫疗法治疗癌症的同时施用所述组合物。
73.如权利要求70所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，在使用免疫疗法治疗癌症之后施用所述组合物。
74.如权利要求70所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，在使用免疫疗法治疗癌症之前和在使用免疫疗法治疗癌症的同时施用所述组合物。
75.如权利要求70所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，在使用免疫疗法治疗癌症之前和在使用免疫疗法治疗癌症之后施用所述组合物。
76.如权利要求70所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，在使用免疫疗法治疗癌症的同时和在使用免疫疗法治疗癌症之后施用所述组合物。
77.如权利要求70所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，在使用免疫疗法治疗癌症之前、在使用免疫疗法治疗癌症的同时和在使用免疫疗法治疗癌症之后施用所述组合物。
78.如权利要求3-77中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述用途为用于在所述免疫疗法中预防所述免疫细胞活化的用途。
79.如权利要求78所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫细胞为休眠的免疫细胞。
80.如权利要求3-79中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫细胞为人来源的免疫细胞。
81.如权利要求80所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述人类来源的免疫细胞为原代的人细胞。
82.如权利要求81所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述原代的人细胞为原代的人T淋巴细胞。
83.如权利要求80-82中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述人来源的免疫细胞相对于所述患者为同种异体细胞。
84.如权利要求80-82中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述人来源的免疫细胞相对于所述患者为同源细胞。
85.如权利要求4-84中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫细胞为瞬时表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞或稳定表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞。
86.如权利要求4-85中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述嵌合抗原受体为第一代、第二代或第三代。
87.如权利要求5-86中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含单链可变片段，优选地，所述单链可变片段能够结合所述抗原。
88.如权利要求5-86中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含配体或其片段，其中所述配体或其片段能够结合所述抗原。
89.如权利要求5-88中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含信号传导域，所述信号传导域包含选自由CD3ζ、CD3ε、CD3γ、T细胞受体α链、T细胞受体β链、T细胞受体δ链和T细胞受体γ链组成的组中的一种或多种结构域。
90.如权利要求1-89中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为与所述免疫疗法中具有较高的发病率和死亡率的风险相关的癌症。
91.如权利要求1-90中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症包括表达一种或多种检查点分子的细胞，所述检查点分子优选选自由A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA组成的组。
92.如权利要求91所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症包括表达PD-L1的细胞。
93.如权利要求1-92中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为选自由肿瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病和淋巴瘤组成的组中的癌症。
94.如权利要求93所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为骨髓瘤。
95.如权利要求93所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为白血病。
96.如权利要求93所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为淋巴瘤。
97.如权利要求93所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为肿瘤，优选地，所述癌症为选自由乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌和胰腺癌组成的组中的肿瘤。
98.如权利要求95所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述白血病为B细胞白血病、T细胞白血病、髓样白血病、急性淋巴细胞白血病或慢性髓样白血病。
99.如权利要求96所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或B细胞淋巴瘤。
100.如权利要求1-99中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为表征为I)CD19阳性；和/或
II)BCMA阳性；和/或
III)ROR1阳性；和/或
IV)FLT3阳性；和/或
V)CD20阳性；和/或
VI)CD22阳性；和/或
VII)CD123阳性；和/或
VIII)SLAMF7阳性的癌症。
101.如权利要求100所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为CD19阳性。
102.如权利要求100所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为BCMA阳性。
103.如权利要求100所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为ROR1阳性。
104.如权利要求100所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为FLT3阳性。
105.如权利要求100所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为CD20阳性的。
106.如权利要求100所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为CD22阳性。
107.如权利要求100所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为CD123阳性。
108.如权利要求100所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为SLAMF7阳性。
109.如权利要求1-108中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述患者为不适合仅使用所述免疫疗法治疗所述癌症的患者。
110.如权利要求1-109中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述患者为不适合用表达嵌合抗原受体的T细胞进行常规过继免疫疗法的患者。
111.如权利要求1-110中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述患者发生细胞因子释放综合征的风险增加。
112.如权利要求1-111中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述患者发生与所述免疫疗法相关的神经毒性副作用的风险增加。
113.如权利要求1-112中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述患者发生与所述免疫疗法相关的靶向/脱靶的风险增加。
114.如权利要求1-113中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述患者中细胞因子的血清水平升高，所述细胞因子选自由IFN-γ、IL-6和MCP1组成的组中的一种或多种。
115.如权利要求1-114中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述患者为对所述免疫疗法产生免疫应答的患者，其中所述免疫应答为针对所述癌症进行所述免疫疗法的副作用。
116.如权利要求1-115中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述治疗方法为与同种异体的或自体的造血干细胞移植联合治疗的方法。
117.如权利要求1-116中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
118.如权利要求1-117中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，通过除口服施用以外的途径来施用所述组合物。
119.如权利要求1-118中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为除慢性髓细胞性白血病和急性淋巴细胞白血病以外的癌症。
120.一种组合物，其用于治疗患者中与免疫疗法相关的一种或多种副作用的方法的用途中，其特征在于，所述组合物包含酪氨酸激酶抑制剂；
并且在所述方法中，所述组合物要施用于患者。
121.如权利要求120所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫疗法为如权利要求2-17和19-29中任一项所定义的免疫疗法。
122.如权利要求120-121任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为如权利要求18、90-108和119中任一项所定义的癌症。
123.如权利要求120-122任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述患者为如权利要求109-115中任一项所定义的患者。
124.如权利要求120-123任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述用途为如权利要求1-119中任一项所定义的用途。
125.如权利要求120-124中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述与免疫疗法相关的一种或多种副作用选自由：
I)细胞因子释放综合征，和/或
II)巨噬细胞活化综合征，和/或
III)脱靶毒性，和/或
IV)正常细胞和/或恶性细胞的靶向/脱靶的识别，和/或
V)免疫治疗细胞的排斥，和/或
VI)免疫治疗细胞的意外活化，和/或
VII)免疫治疗细胞的进补信号传导和活化，和/或
VIII)神经毒性，和/或
IX)肿瘤溶解综合征组成的组。
126.如权利要求125所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述的与免疫疗法相关的副作用为细胞因子释放综合征。
127.如权利要求125所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述的与免疫疗法相关的副作用为脱靶毒性。
128.如权利要求125所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述的与免疫疗法相关的副作用为正常细胞和/或恶性细胞的靶向/脱靶的识别。
129.如权利要求125所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述的与免疫疗法相关的副作用为免疫治疗细胞的排斥。
130.如权利要求125所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述的与免疫疗法相关的副作用为免疫治疗细胞的意外活化。
131.如权利要求125所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述的与免疫疗法相关的副作用为免疫治疗细胞的强直信号和活化。
132.如权利要求125所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述的与免疫疗法相关的副作用为神经毒性。
133.如权利要求125所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述的与免疫疗法相关的副作用为肿瘤溶解综合征。
134.如权利要求126所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述细胞因子释放综合征的特征在于细胞因子的血清水平升高，所述细胞因子选自由GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8和IL-10组成的组中的一种或多种。
135.如权利要求134所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述用途为用于引起一种或多种所述升高的细胞因子的血清水平降低的用途。
136.如权利要求134-135中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述细胞因子释放综合征由所述免疫疗法引起。
137.一种组合物，其用于在治疗患者癌症的免疫疗法中用于调节表达嵌合抗原受体的细胞的方法的用途中，其特征在于，所述组合物包含酪氨酸激酶抑制剂；
并且在所述方法中，所述组合物要施用于患者。
138.如权利要求137所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述免疫疗法为如权利要求2-17、19-29和125-136中任一项所定义的免疫疗法。
139.如权利要求137-138中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述癌症为如权利要求18、90-108和119中任一项所定义的癌症。
140.如权利要求137-139中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述患者为如权利要求109-115中任一项所定义的患者。
141.如权利要求137-140中任一项所述的用于所述用途的组合物，其特征在于，所述用途为如权利要求1-136中任一项所定义的用途。
142.一种组合物，其包含：
I)免疫细胞，以及
II)酪氨酸激酶抑制剂。
143.如权利要求142所述的组合物，其特征在于，所述免疫细胞为如权利要求3-17、19-29和79-89中任一项所定义的免疫细胞。
144.如权利要求142-143中任一项所述的组合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂为如权利要求30-59中任一项所定义的酪氨酸激酶抑制剂。
145.如权利要求142-144中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含药学上可接受的载体。
146.I)免疫细胞，和
II)酪氨酸激酶抑制剂的组合，其用于如权利要求1-141中任一项所述的用途。
147.如权利要求144所述的组合，其特征在于，所述免疫细胞为如权利要求3-17、19-29和79-89中任一项所定义的免疫细胞。
148.如权利要求146-147中任一项所述的组合，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂为如权利要求30-59中任一项所定义的酪氨酸激酶抑制剂。
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