CN110869050A - 双特异性抗体配制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体的药学配制剂,制备和使用该配制剂的方法。

Description

双特异性抗体配制剂
发明领域
本发明涉及结合癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体(CEA CD3双特异性抗体)的药学配制剂，用于制备该配制剂的方法和该配制剂的用途。
发明概述
除非下面另有定义，在本文中像本领域一般使用的那样使用术语。
在第一个方面，本发明涉及一种药学配制剂，其包含：
1至200mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
1至100mM缓冲剂；
0.001至1％(w/v)表面活性剂；
1至500mM至少一种稳定剂；
处于4.0至7.0的范围中的pH。
可以以液体形式，以冻干形式或以自冻干形式重建的液体形式提供依照本发明的配制剂。
发明详述
本文中下文详细描述在依照本发明的配制剂中有用的CEA CD3双特异性抗体。
在一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的该CEA CD3双特异性抗体的浓度在1至100mg/ml，优选10至75mg/ml，最优选20至50mg/ml的范围中。特别优选的是50mg/ml的浓度。在一些实施方案中，该配制剂中包含的该CEA CD3双特异性抗体的浓度是5mg/ml。
如本文中使用的，术语“缓冲剂”表示稳定药学制备物的pH的药学可接受赋形剂。合适的缓冲液是本领域公知的且能在文献中找到。例如，可采用柠檬酸盐，乙酸盐，组氨酸盐，琥珀酸盐，苹果酸盐，磷酸盐或乳酸盐，和/或其各自游离酸或碱，以及各种盐和/或其酸和碱的混合物。优选的药学可接受缓冲液包含但不限于组氨酸缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，琥珀酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。供本发明中使用的优选的缓冲液是组氨酸缓冲液，即具有组氨酸，一般是L-组氨酸作为缓冲剂的缓冲液。最优选的是L-组氨酸/HCl缓冲液，其包含L-组氨酸或L-组氨酸和L-组氨酸氢氯化物的混合物和用氢氯酸实现的pH调节。除非另外指明，术语“L-组氨酸”在本文中用于描述缓冲剂时指L-组氨酸/HCl缓冲液。L-组氨酸/HCl缓冲液可通过在水中溶解合适量的L-组氨酸和L-组氨酸氢氯化物，或通过在水中溶解合适量的L-组氨酸并通过添加氢氯酸将pH调节至期望值制备。上述缓冲液一般以约1mM至约100mM，优选约10mM至约50mM，更优选约15至30mM，和最优选20mM的浓度使用。不管所使用的缓冲液，可以用本领域已知的酸或碱，例如氢氯酸，乙酸，磷酸，硫酸和柠檬酸，氢氧化钠和氢氧化钾将pH调节至在约4.0至约7.0，优选约5.0至约6.0，和最优选约5.5的范围中的值。
如本文中使用的，术语“表面活性剂”表示药学可接受的，有表面活性的药剂。优选地，使用非离子的表面活性剂。药学可接受表面活性剂的例子包括但不限于聚氧乙烯-山梨聚糖脂肪酸酯(Tween)，聚氧乙烯烷基醚(Brij)，烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton X)，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer，Pluronic)，和十二烷基硫酸钠(SDS)。优选的聚氧乙烯-山梨聚糖脂肪酸酯是聚山梨酯20(聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯，以商标Tween 20TM销售)和聚山梨酯80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯，以商标Tween 80TM销售)。优选的聚乙烯-聚丙烯共聚物是以名称
Figure BDA0002354113170000021
F68或Poloxamer 188TM销售的那些。优选的聚氧乙烯烷基醚是以商标BrijTM销售的那些。优选的烷基苯基聚氧乙烯醚是以商品名Triton X销售的，最优选的是对-叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(以商品名Triton X-100TM销售)。供本发明中使用的优选的表面活性剂是聚氧乙烯-山梨聚糖脂肪酸酯，优选聚山梨酯20或聚山梨酯80，最优选聚山梨酯20。当使用聚山梨酯20(Tween 20TM)和聚山梨酯80(Tween 80TM)时，一般以约0.001至约1％，优选约0.01至约0.1％，更优选约0.02％至约0.05％，最优选约0.05％的浓度范围使用它们。在本发明的配制剂中，表面活性剂的浓度作为以重量/体积(w/v)表述的百分比描述。
如本文中使用的，术语“稳定剂”表示在制造，贮存和应用期间保护活性药学组分和/或配制剂免于化学和/或物理降解的药学可接受赋形剂。稳定剂包括但不限于糖，氨基酸，多元醇(例如甘露醇，山梨醇，木糖醇，右旋糖苷，甘油，阿拉伯糖醇，丙二醇，聚乙二醇)，环糊精(例如羟基丙基-β-环糊精，磺基丁基乙基-β-环糊精，β-环糊精)，聚乙二醇(例如PEG3000，PEG 3350，PEG 4000，PEG 6000)，清蛋白(例如人血清清蛋白(HSA)，牛血清清蛋白(BSA))，盐(例如氯化钠，氯化镁，氯化钙)，螯合剂(例如EDTA)，如下文定义的。如上文提到的，稳定剂可以以约1至约500mM的量，优选以约10至约300mM的量和更优选以约120mM至约300mM的量存在于配制剂中。配制剂中可以存在多于一种选自相同或不同组的稳定剂。
如本文中使用的，术语“糖”包括单糖和寡糖。单糖是不能被酸水解的单体碳水化合物，包括简单的糖和它们的衍生物，例如氨基糖。糖通常处于它们的D构型。单糖的例子包括葡萄糖，果糖，半乳糖，甘露糖，山梨糖，核糖，脱氧核糖，神经氨酸。寡糖是分支或直链的由经由糖苷键连接的多于一个单体糖单元组成的碳水化合物。寡糖内的单体糖单元可以是相同的或不同的。取决于单体糖单元的数目，寡糖是二，三，四，五等等糖。与聚糖形成对比，单糖和寡糖是水溶性的。寡糖的例子包括蔗糖，海藻糖，乳糖，麦芽糖和棉子糖。供本发明中使用的优选的糖是蔗糖和海藻糖(即α，α-D-海藻糖)，最优选的是蔗糖。海藻糖作为海藻糖二水合物可得。糖可以以约100至约500mM的量，优选以约200至约300mM的量，更优选以约220至约250mM的量，特别是以约230mM或约240mM的量，最优选以约230mM的量存在于配制剂中。
如本文中使用的，术语“氨基酸”表示拥有位于羧基基团α-位置的氨基模块的药学可接受有机分子。氨基酸的例子包括但不限于精氨酸，甘氨酸，鸟氨酸，赖氨酸，组氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，丝氨酸，脯氨酸。在每种情况中，所采用的氨基酸优选处于L-形式。优选以它们的无机盐的形式(有利地，处于氢氯酸盐的形式，即作为氨基酸氢氯化物)采用碱性氨基酸，诸如精氨酸，组氨酸，或赖氨酸。供本发明中使用的优选的氨基酸是甲硫氨酸。优选以约5至约25mM，最优选约10mM的浓度使用甲硫氨酸。
稳定剂内的一个亚组是冻干保护剂。术语“冻干保护剂”表示在冻干过程，随后的贮存和重建期间针对失稳条件保护易变活性组分(例如蛋白质)的药学可接受赋形剂。冻干保护剂包含但不限于由糖，多元醇(诸如例如糖醇)和氨基酸组成的组。优选的冻干保护剂可以选自由糖，诸如蔗糖，海藻糖，乳糖，葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，半乳糖，果糖，山梨糖，棉子糖，神经氨酸，氨基糖，诸如葡糖胺，半乳糖胺，N-甲基葡糖胺(“Meglumine”(葡甲胺))，多元醇，诸如甘露醇和山梨醇，和氨基酸，诸如精氨酸和甘氨酸或其混合物组成的组。冻干保护剂一般以约10至500mM的量，优选以约10至约300mM的量和更优选以约100至约300mM的量使用。
稳定剂内的一个亚组是抗氧化剂。术语“抗氧化剂”表示防止活性药学组分氧化的药学可接受赋形剂。抗氧化剂包含但不限于抗坏血酸，谷胱甘肽，半胱氨酸，甲硫氨酸，柠檬酸，EDTA。抗氧化剂可以以约0.01至约100mM的量，优选以约5至约50mM的量和更优选以约5至约25mM的量使用。
依照本发明的配制剂还可以包含一种或多种张度剂。术语“张度剂”表示用于调控配制剂的张度的药学可接受赋形剂。配制剂可以是低张的，等张的或高张的。等张性一般涉及溶液的渗透压，通常相对于人血清的渗透压(250-350mOsmol/kg左右)而言。依照本发明的配制剂可以是低张的，等张的或高张的但会优选是等张的。等张的配制剂是液体或自固体形式，例如冻干形式重建的液体，而且表示与同它比较的一些其它溶液，诸如生理盐溶液和血清具有相同张度的溶液。合适的张度剂包含但不限于氯化钠，氯化钾，甘油和来自氨基酸或糖的组的任何成分，特别是葡萄糖。张度剂一般以约5mM至约500mM的量使用。
在稳定剂和张度剂内有能以这两种方式发挥功能的一组化合物，即它们能在同一时间是稳定剂和张度剂。可以在糖，氨基酸，多元醇，环糊精，聚乙二醇和盐的组中找到其例子。能在同一时间是稳定剂和张度剂的糖的一个例子是海藻糖。
配制剂还可以含有佐剂，诸如防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。通过灭菌规程和通过包括各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，酚，山梨酸，等等均可以确保防止存在微生物。防腐剂一般以约0.001至约2％(w/v)的量使用。防腐剂包含但不限于乙醇，苯甲酸，酚，间-甲酚，对-氯-间-甲酚，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，苯扎氯铵。
依照本发明的配制剂中包含的CEA CD3双特异性抗体是特异性结合CD3和CEA的双特异性抗体。特别是有用的CEA CD3双特异性抗体描述于例如PCT公开号WO 2014/131712(通过援引完整收入本文)。
术语“双特异性”意指抗体能够特异性结合至少两种不同的抗原性决定簇。通常，双特异性抗体包含两种抗原结合位点，其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，所述双特异性抗体能够同时结合两种抗原性决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。
如本文中使用的，术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且指多肽大分子上与抗原结合模块结合，从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区构成的构象性构造)。可用的抗原性决定簇可以在例如肿瘤细胞表面上，病毒感染的细胞的表面上，其它患病细胞的表面上，免疫细胞的表面上，游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中找到。
如本文中使用的，术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原性决定簇的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合模块能够将与其附接的实体(例如第二抗原结合模块)引导至靶部位，例如至携有抗原性决定簇的特定类型的肿瘤细胞。在另一个实施方案中，抗原结合模块能够经由其靶抗原例如T细胞受体复合物抗原来激活信号传导。抗原结合模块包括如本文中另外定义的抗体及其片段。具体的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中，抗原结合模块可以包含抗体恒定区，如本文中另外定义和本领域中已知的。可用的重链恒定区包括以下5种同种型中的任何一种：α，δ，ε，γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下2种同种型中的任何一种：κ和λ。
“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特定抗原性决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪上分析)(Li1jeblad等，Glyco J 17，323-329(2000))，以及传统的结合测定法(Heeley，Endocr Res 28，217-229(2002))来测量。在一个实施方案中，抗原结合模块对无关蛋白质的结合程度是抗原结合模块对抗原结合的小于约10％，如例如通过SPR测量的。在某些实施方案中，结合抗原的抗原结合模块，或包含抗原结合模块的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗原结合模块和抗原，或受体及其配体)之间1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(KD)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量，包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
“CD3”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)，非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD3，除非另外指明。术语涵盖“全长”，未加工的CD3以及源自细胞中加工的任何形式的CD3。术语还涵盖CD3的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中，CD3是人CD3，特别是人CD3的ε亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(型式144)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1。还见SEQ ID NO：22。食蟹猴[Macaca fascicularis]CD3ε的氨基酸序列显示于NCBI GenBank No.BAB71849.1。还见SEQID NO：23。
“癌胚抗原”或“CEA”(也称作癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5))指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)，非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然CEA，除非另外指明。术语涵盖“全长”，未加工的CEA以及源自细胞中加工的任何形式的CEA。术语还涵盖CEA的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中，CEA是人CEA。人CEA的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号P06731，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004354.2。
如本文中使用的，术语“第一”，“第二”或“第三”就Fab分子等而言为了在有超过一个每类模块时便于区分而使用。除非明确如此陈述，这些术语的使用不意图赋予双特异性抗体的特定次序或取向。
如本文中使用的，术语“价”指抗体中规定数目的抗原结合位点的存在。因而，术语“对抗原的单价结合”指抗体中一个(且不超过一个)特异于抗原的抗原结合位点的存在。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构的抗体。
“抗体片段”指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’SH，F(ab’)2，双抗体，线性抗体，单链抗体分子(例如scFv)，和单域抗体。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等，NatMed 9，129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，于The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)；亦参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的论述，参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat Med 9，129-134(2003)；和Hollinger等，Proc Natl Acad Sci USA 90，6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等，Nat Med 9，129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域，或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516 B1)。可以通过各种技术来制备抗体片段，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中描述的。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt等，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freemanand Co.，第91页(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。如本文中结合可变区序列使用的，“Kabat编号方式”指由Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)提出的编号系统。
如本文中使用的，所有重和轻链的恒定区和域的氨基酸位置是依照Kabat，etal.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号的，在本文中称作“依照Kabat的编号方式”或“Kabat编号方式”。具体而言，将Kabat编号系统(参见Kabat，et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thed.，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的第647-660页)用于卡帕和拉姆达同种型的轻链恒定域CL并将Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于重链恒定域(CH1，铰链，CH2和CH3)，在这种情况中在本文中通过提到“依照Kabat EU索引的编号方式”来进一步澄清。
如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环的(“高变环”)和/或含有抗原接触残基的(“抗原接触”)每一个区域。一般地，抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1，H2，H3)，且三个在VL中(L1，L2，L3)。本文中的例示性HVR包括：
(a)高变环，其存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
(b)CDR，其存在于氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)(Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；
(c)抗原接触，其存在于氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)，和93-101(H3)(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)，(b)，和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)，和94-102(H3)。
除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因而，HVR和FR序列一般以下列次序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ和μ。
“Fab分子”指由免疫球蛋白的重链的VH和CH1域(“Fab重链”)以及轻链的VL和CL域(“Fab轻链”)组成的蛋白质。
“交换”Fab分子(也称作“Crossfab”)意指其中Fab重链和轻链的可变域或恒定域交换(即彼此替换)的Fab分子，即交换Fab分子包含由轻链可变域VL和重链恒定域1CH1构成的肽链(VL-CH1，N至C端方向)，和由重链可变域VH和轻链恒定域CL构成的肽链(VH-CL，N至C端方向)。为了清楚，在其中Fab轻链和Fab重链的可变域交换的交换Fab分子中，包含重链恒定域1CH1的肽链在本文中称作(交换)Fab分子的“重链”。相反，在其中Fab轻链和Fab重链的恒定域交换的交换Fab分子中，包含重链可变域VH的肽链在本文中称作(交换)Fab分子的“重链”。
与之相反，“常规”Fab分子意指处于它的天然型式的Fab分子，即包含由重链可变和恒定域构成的重链(VH-CHl，N至C端方向)，和由轻链可变和恒定域构成的轻链(VL-CL，N至C端方向)。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条重链具有可变域(VH)，也称作可变重域或重链可变区，接着是3个恒定域(CH1，CH2和CH3)，也称作重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变域(VL)，也称作可变轻域或轻链可变区，接着是恒定轻(CL)域(也称作轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称作α(IgA)，δ(IgD)，ε(IgE)，γ(IgG)或μ(IgM)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ1(IgG1)，γ2(IgG2)，γ3(IgG3)，γ4(IgG4)，α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。
本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，由宿主细胞生成的抗体可能经历翻译后切割，自重链的C端切除一个或多个，特别是一个或两个氨基酸。因此，通过表达编码全长重链的特定核酸分子由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链，或者它可包括全长重链的切割变体。当重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，编号方式依照Kabat EU索引)时可能就是这种情况。因此，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)，或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或不存在。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称作EU索引，如记载于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991(也参见上文)。如本文中使用的，Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如，IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。
“促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含Fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或Fc域亚基的翻译后修饰。如本文中使用的，具体地，促进联合的修饰包括对期望联合的两个Fc域亚基(即Fc域的第一亚基和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个Fc域亚基的联合。例如，促进联合的修饰可以改变一种或两种Fc域亚基的结构或电荷，从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此，(异)二聚化在包含第一Fc域亚基的多肽和包含第二Fc域亚基的多肽之间发生，其在融合至每个亚基的别的组分(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中，促进联合的修饰包含在Fc域中的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。在一个具体的实施方案中，促进联合的修饰包含Fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。
术语“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，细胞因子分泌，免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守性替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，Clustal W，Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本文中的目的，％氨基酸序列同一性值是使用36.3.8c或更晚的版本FASTA包的ggsearch程序及BLOSUM50比较矩阵生成的。FASTA程序包由W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”，PNAS 85∶2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266：227-258；和Pearson et al.(1997)Genomics 46：24-36撰写且自http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml公众可得。或者，可使用在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处可及的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；打开：-10；延伸：-2；Ktup＝2)以确保实施全局而非局部比对。百分比氨基酸同一性在输出比对标题中给出。
“活化性Fc受体”是一种在抗体的Fc域衔接后，引发刺激携带受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
“降低的结合”，例如降低的对Fc受体的结合，指相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为了清楚，术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反，“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。
“融合”意指组分(例如Fab分子和Fc域亚基)直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。
该CEA CD3双特异性抗体包含特异性结合CD3的第一抗原结合模块和特异性结合CEA的第二抗原结合模块。
在一个实施方案中，该第一抗原结合模块包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含SEQ ID NO：1的重链CDR(HCDR)1，SEQ ID NO：2的HCDR2，和SEQ ID NO：3的HCDR3；且轻链可变区包含SEQ ID NO：4的轻链CDR(LCDR)1，SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含SEQ ID NO：9的重链CDR(HCDR)1，SEQ ID NO：10的HCDR2，和SEQ ID NO：11的HCDR3；且轻链可变区包含SEQ ID NO：12的轻链CDR(LCDR)1，SEQ ID NO：13的LCDR2和SEQID NO：14的LCDR3。
在一个特定实施方案中，该CEA CD3双特异性抗体包含(i)第一抗原结合模块，其特异性结合CD3且包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含SEQ ID NO：1的重链CDR(HCDR)1，SEQ ID NO：2的HCDR2，和SEQ ID NO：3的HCDR3；且轻链可变区包含SEQ ID NO：4的轻链CDR(LCDR)1，SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3；和(ii)第二抗原结合模块，其特异性结合CEA且包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含SEQ ID NO：9的重链CDR(HCDR)1，SEQ ID NO：10的HCDR2，和SEQ ID NO：11的HCDR3；且轻链可变区包含SEQ IDNO：12的轻链CDR(LCDR)1，SEQ ID NO：13的LCDR2和SEQ ID NO：14的LCDR3。
在一个实施方案中，该第一抗原结合模块包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，该第一抗原结合模块包含SEQ ID NO：7的重链可变区序列和SEQ ID NO：8的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块包含与SEQ ID NO：15的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO：16的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块包含SEQ ID NO：15的重链可变区序列和SEQ ID NO：16的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，该第一和/或该第二抗原结合模块是Fab分子。在一些实施方案中，该第一抗原结合模块是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区是交换的。在此类实施方案中，该第二抗原结合模块优选是常规Fab分子。
在一些实施方案中，该第一和该第二抗原结合模块彼此融合，任选地经由肽接头。
在一些实施方案中，该第一和该第二抗原结合模块各自是Fab分子且或是(i)该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端，或是(ii)该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端。
在一些实施方案中，该CEA CD3双特异性抗体提供对CD3的单价结合。
在特定实施方案中，该CEA CD3双特异性抗体包含一个特异性结合CD3的抗原结合模块和两个特异性结合CEA的抗原结合模块。如此，在一些实施方案中，该CEA CD3双特异性抗体包含特异性结合CEA的第三抗原结合模块。在一些实施方案中，该第三抗原模块与该第一抗原结合模块相同(例如，也是Fab分子且包含相同的氨基酸序列)。
在特定实施方案中，该CEA CD3双特异性抗体进一步包含由第一和第二亚基构成的Fc域。在一个实施方案中，该Fc域是IgG Fc域。在一个特定实施方案中，该Fc域是IgG1 Fc域。在另一个实施方案中，该Fc域是IgG4 Fc域。在一个更加具体的实施方案中，该Fc域是包含位置S228(Kabat EU索引编号方式)处的氨基酸替代，特别是氨基酸替代S228P的IgG4 Fc域。这种氨基酸替代降低IgG4抗体的体内Fab臂交换(见Stubenrauch et al.，DrugMetabolism and Disposition 38，84-91(2010))。在又一个特定实施方案中，该Fc域是人Fc域。在一个特别优选的实施方案中，该Fc域是人IgG1 Fc域。SEQ ID NO：21中给出人IgG1Fc区的一种例示性序列。
在其中该第一，该第二和(在存在的情况中)该第三抗原结合模块各自是Fab分子的一些实施方案中，(a)或是(i)该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端且该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，或是(ii)该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端且该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端；且(b)该第三抗原结合模块(在存在的情况中)在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。
在特定的实施方案中，Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgGFc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在CH3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc域的CH3域中。
在一个具体的实施方案中，所述促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰是所谓的“节-入-穴”修饰，其包含在Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。节-入-穴技术记载于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等，Prot Eng 9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)。一般地，方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。
因而，在一些实施方案中，Fc域的第一亚基的CH3域中的一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，其可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，而且Fc域的第二亚基的CH3域中的一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，其中可安置第一亚基的CH3域内的隆起。优选地，所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组：精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，和色氨酸(W)。优选地，所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组：丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，和缬氨酸(V)。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。
在一个具体的此类实施方案中，在Fc域的第一亚基中，第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)，而在Fc域的第二亚基中，第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)，而且任选地，第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照Kabat EU索引)。在又一个实施方案中，在Fc域的第一亚基中，另外，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或第356位的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换)，而在Fc域的第二亚基中，另外，第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个优选的实施方案中，Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W，且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C，T366S，L368A和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一些实施方案中，Fc域包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。
在一个特定的实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体的实施方案中，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应器功能是选自下组的一项或多项：补体依赖性细胞毒性(CDC)，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，和细胞因子分泌。在一个特定的实施方案中，效应器功能是ADCC。
典型地，Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸替代。在一个实施方案中，一处或多处氨基酸替代降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，一处或多处氨基酸替代将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍，至少5倍，或至少10倍。
在一个实施方案中，Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代：E233，L234，L235，N297，P331和P329(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个更加具体的实施方案中，Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代：L234，L235和P329(编号方式依照Kabat EU索引)。在一些实施方案中，Fc域包含氨基酸替代L234A和L235A(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域，特别是人IgG1 Fc域。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代。在一个更加具体的实施方案中，氨基酸替代是P329A或P329G，特别是P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代和又一处在选自以下位置处的氨基酸替代：E233，L234，L235，N297和P331(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个更加具体的实施方案中，又一处氨基酸替代是E233P，L234A，L235A，L235E，N297A，N297D或P331S。在特定的实施方案中，Fc域包含在位置P329，L234和L235处的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。在更加特定的实施方案中，Fc域包含氨基酸突变L234A，L235A和P329G(“P329G LALA”，“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地，在优选的实施方案中，Fc域的每个亚基包含氨基酸替代L234A，L235A和P329G(Kabat EU索引编号方式)，即在Fc域的第一和第二亚基的每个中，第234位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L234A)，第235位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L235A)且第329位的脯氨酸残基用甘氨酸残基替换(P329G)(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域，特别是人IgG1 Fc域。
在一个优选的实施方案中，该CEA CD3双特异性抗体包含(i)第一抗原结合模块，其特异性结合CD3，包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含SEQ ID NO：1的重链CDR(HCDR)1，SEQ ID NO：2的HCDR2，和SEQ ID NO：3的HCDR3；且轻链可变区包含SEQ ID NO：4的轻链CDR(LCDR)1，SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3，其中该第一抗原结合模块是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区，特别是恒定区是交换的；(ii)第二和第三抗原结合模块，其特异性结合CEA，包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含SEQ ID NO：9的重链CDR(HCDR)1，SEQ ID NO：10的HCDR2，和SEQ ID NO：11的HCDR3；且轻链可变区包含SEQ ID NO：12的轻链CDR(LCDR)1，SEQ ID NO：13的LCDR2和SEQ ID NO：14的LCDR3，其中该第二和第三抗原结合模块各自是Fab分子，特别是常规Fab分子；(iii)由第一和第二亚基构成的Fc域，
其中该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端，且该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且其中该第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。
在一个实施方案中，该第一抗原结合模块包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，该第一抗原结合模块包含SEQ ID NO：7的重链可变区序列和SEQ ID NO：8的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，该第二和第三抗原结合模块包含与SEQ ID NO：15的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO：16的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，该第二和第三抗原结合模块包含SEQ ID NO：15的重链可变区和SEQ ID NO：16的轻链可变区。
依照上述实施方案的Fc域可单独地或组合地并入本文中上文涉及Fc域描述的所有特征。
在一个实施方案中，该抗原结合模块和该Fc区通过肽接头，特别是通过如SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20中的肽接头彼此融合。在一个实施方案中，该CEA CD3双特异性抗体包含：包含与SEQ ID NO：17的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一的序列的多肽(特别是两条多肽)，包含与SEQ ID NO：18的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一的序列的多肽，包含与SEQ ID NO：19的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一的序列的多肽，和包含与SEQ ID NO：20的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一的序列的多肽。
在一个特别优选的实施方案中，该CEA CD3双特异性抗体包含：包含SEQ ID NO：17的序列的多肽(特别是两条多肽)，包含SEQ ID NO：18的序列的多肽，包含SEQ ID NO：19的序列的多肽，和包含SEQ ID NO：20的序列的多肽。(CEATCB)
在一个特别优选的实施方案中，该CEA CD3双特异性抗体是CEA TCB。
对于依照本发明的配制剂，以约1至约200mg/ml，优选约1至约100mg/ml，更优选约10至约75mg/ml，和最优选约20至约50mg/ml的浓度使用该CEA CD3双特异性抗体。在一个优选的实施方案中，该配制剂包含约20至约50mg/ml CEA CD3双特异性抗体，特别是约50mg/ml CEA CD3双特异性抗体。在一些实施方案中，该配制剂包含约5mg/ml CEA CD3双特异性抗体。
在第一个方面，本发明涉及一种药学配制剂，其包含：
1至200mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
1至100mM缓冲剂；
0.001至1％(w/v)表面活性剂；
1至500mM至少一种稳定剂；
处于4.0至7.0的范围中的pH。
本文中上文详细描述依照本发明的配制剂中可以包含的优选的CEA CD3双特异性抗体。特别优选的是CEATCB。
在一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的该CEA CD3双特异性抗体的浓度在1至100mg/ml，优选10至75mg/ml，最优选20至50mg/ml的范围中。特别优选的是20mg/ml或50mg/ml，最优选50mg/ml的浓度。在又一个优选的实施方案中，该CEA CD3双特异性抗体的浓度在5至50mg/ml的范围中。依照此类实施方案特别优选的是5mg/ml，20mg/ml或50mg/ml的浓度。在又一个优选的实施方案中，该CEA CD3双特异性抗体的浓度在1至10mg/ml的范围中。依照此类实施方案特别优选的是5mg/ml的浓度。
在另一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的该缓冲剂是组氨酸缓冲剂，优选L-组氨酸/HCl缓冲剂。特别优选的是L-组氨酸/HCl缓冲剂(即L-组氨酸作为缓冲剂)。
优选地，该缓冲剂处于10至50mM，更优选15至30mM，最优选20mM的浓度。
优选地，该缓冲剂提供5.0至6.0，更优选5.5±0.5，最优选5.5±0.3的pH。
在一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的该表面活性剂是聚山梨酯，优选聚山梨酯20或聚山梨酯80，最优选聚山梨酯20。
优选地，该表面活性剂处于0.01至0.1％(w/v)，更优选0.02至0.05％，最优选0.05％的浓度。
在还有另一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的该至少一种稳定剂选自盐，优选氯化钠，糖，优选海藻糖二水合物或蔗糖，和氨基酸，优选精氨酸氢氯化物的组。优选地，该至少一种稳定剂是蔗糖。
优选地，该至少一种稳定剂处于120至300mM，更优选220至250mM，最优选230至240mM的浓度。
在一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含选自盐，糖和氨基酸的组的第一稳定剂，和作为第二稳定剂的甲硫氨酸。
在一个优选的实施方案中，该第一稳定剂处于120至300mM，优选220至250mM，更优选230至240mM的浓度，且该第二稳定剂甲硫氨酸以5至25mM，优选5至15mM，更优选10mM的浓度存在。
在一个特别优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含糖，优选蔗糖作为第一稳定剂，和作为第二稳定剂的甲硫氨酸。该糖优选处于约230mM的浓度(特别是在其中该CEACD3双特异性抗体的浓度是50mg/ml或更多的实施方案中)，且甲硫氨酸优选处于约10mM的浓度。在一些实施方案中，特别是在其中该CEA CD3双特异性抗体的浓度低于50mg/ml(例如5mg/ml，或20mg/ml)的实施方案中，该糖处于约240mM的浓度且甲硫氨酸处于约10mM的浓度。
在一个实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
5至50mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
15至30mM L-组氨酸；
0.02至0.05％(w/v)聚山梨酯20；
120至300mM蔗糖；
任选地，5至25mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.5的pH。
在又一个实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
5至50mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
15至25mM L-组氨酸；
0.03至0.05％(w/v)聚山梨酯20；
220至250mM蔗糖；
5至15mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.5的pH。
在又一个实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
5至50mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
15至25mM L-组氨酸；
0.03至0.05％(w/v)聚山梨酯20；
220至250mM蔗糖；
5至15mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.3的pH。
在仍有又一个实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
20至50mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
15至30mM L-组氨酸；
0.02至0.05％(w/v)聚山梨酯20；
120至300mM蔗糖；
任选地，5至25mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.5的pH。
在又一个实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
20至50mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
15至25mM L-组氨酸；
0.03至0.05％(w/v)聚山梨酯20；
220至250mM蔗糖；
5至15mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.5的pH。
在又一个实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
20至50mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
15至25mM L-组氨酸；
0.03至0.05％(w/v)聚山梨酯20；
220至250mM蔗糖；
5至15mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.3的pH。
在仍有又一个实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
1至10mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
15至30mM L-组氨酸；
0.02至0.05％(w/v)聚山梨酯20；
120至300mM蔗糖；
任选地，5至25mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.5的pH。
在又一个实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
1至10mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
15至25mM L-组氨酸；
0.03至0.05％(w/v)聚山梨酯20；
220至250mM蔗糖；
5至15mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.5的pH。
在又一个实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
1至10mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
15至25mM L-组氨酸；
0.03至0.05％(w/v)聚山梨酯20；
220至250mM蔗糖；
5至15mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.3的pH。
在一个特别优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
50mg/ml CEA CD3双特异性抗体，优选CEA TCB；
20mM L-组氨酸；
0.05％(w/v)聚山梨酯20；
230mM蔗糖；
10mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.5的pH。
在又一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
50mg/ml CEA CD3双特异性抗体，优选CEA TCB；
20mM L-组氨酸；
0.05％(w/v)聚山梨酯20；
230mM蔗糖；
10mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.3的pH。
在又一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
20mg/ml CEA CD3双特异性抗体，优选CEA TCB；
20mM L-组氨酸；
0.05％(w/v)聚山梨酯20；
240mM蔗糖；
10mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.5的pH。
在又一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
20mg/ml CEA CD3双特异性抗体，优选CEA TCB；
20mM L-组氨酸；
0.05％(w/v)聚山梨酯20；
240mM蔗糖；
10mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.3的pH。
在又一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
5mg/ml CEA CD3双特异性抗体，优选CEA TCB；
20mM L-组氨酸；
0.05％(w/v)聚山梨酯20；
240mM蔗糖；
10mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.5的pH。
在又一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含：
5mg/ml CEA CD3双特异性抗体，优选CEA TCB；
20mM L-组氨酸；
0.05％(w/v)聚山梨酯20；
240mM蔗糖；
10mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.3的pH。
在某些实施方案中，依照本发明的配制剂并不包含氯化钠。在某些实施方案中，该配制剂并不包含二价阳离子。在某些实施方案中，该配制剂并不包含柠檬酸盐。在某些实施方案中，该配制剂并不包含多元醇。在某些实施方案中，该配制剂并不包含右旋糖酐/葡聚糖。在某些实施方案中，该配制剂并不包含赖氨酸。
依照本发明的配制剂可以处于液体形式，处于冻干形式或处于自冻干形式重建的液体形式。在某些实施方案中，该配制剂处于液体形式。
如本文中结合依照本发明的配制剂使用的，术语“液体”表示在大气压下于至少约2至约8℃的温度是液体的配制剂。
如本文中结合依照本发明的配制剂使用的，术语“冻干的”表示通过本领域本身已知的冷冻-干燥方法制造的配制剂。通过冷冻，继以冰在真空下升华和残留的水于升高的温度的解吸，去除溶剂(例如水)。冻干物通常具有约0.1至5％(w/w)的残留水分且作为粉末或物理上稳定的饼存在。冻干物特征在于在添加重建介质后快速溶解。
如本文中结合依照本发明的配制剂使用的，术语“重建形式”表示冻干和通过添加重建介质再溶解的配制剂。合适的重建介质包含但不限于注射用水(WFI)，注射用抑菌水(BWFI)，氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)，葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)，含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨酯20)，pH缓冲的溶液(例如磷酸盐缓冲的溶液)。
依照本发明的配制剂在生理上耐受较好，可以容易地制备，能精确分配且在贮存的持续时间上，在反复冷冻和融化循环期间和在机械应力下就分解产物和聚集物而言是稳定的。
本发明进一步包含一种用于制备依照本发明的配制剂的方法。所述方法包含将CEA CD3双特异性抗体针对含有预期缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液交换，和在需要时，通过渗滤浓缩抗体，继以作为储备溶液将赋形剂(例如海藻糖二水合物，蔗糖，精氨酸，氯化钠，甲硫氨酸)添加至抗体溶液，继以作为储备溶液将表面活性剂添加至抗体/赋形剂溶液，和最终使用缓冲溶液将抗体浓度调节至期望的终浓度，由此还达到最终的赋形剂和表面活性剂浓度。
或者，也可以作为固体将赋形剂添加至包含CEA CD3双特异性抗体的起始溶液。如果CEA CD3双特异性抗体处于固体形式，例如冻干物的话，可以通过首先在任选地包含一种或多种赋形剂的水或缓冲溶液中溶解双特异性抗体，和随后作为储备溶液或固体添加别的赋形剂来制备依照本发明的配制剂。也可以有利地在包含所有别的赋形剂的溶液中直接溶解CEA CD3双特异性抗体。可以在制备CEACD3双特异性抗体的方法期间或在其结束时早就添加依照本发明的配制剂中存在的一种或多种赋形剂，例如通过在制备双特异性抗体后进行的纯化的最后步骤中在包含配制剂的一种，多于一种，或优选所有赋形剂的溶液中直接溶解CEA CD3双特异性抗体。如果包含双特异性抗体和赋形剂的溶液尚未具有期望pH的话，这通过添加酸或碱来调节，优选使用缓冲系统中早就存在的酸或碱。这继以无菌过滤。
本发明进一步包含供治疗疾病中使用的依照本发明的配制剂，或依照本发明的配制剂用于制备对于治疗其中CEA表达，特别是其中CEA与相同细胞类型的正常组织相比异常表达(例如过表达)的疾病，特别是细胞增殖病症有用的药物的用途。此类病症包括不同类型的癌症，诸如结肠直肠癌，肺癌，胰腺癌，乳腺癌，和胃癌。可以通过本领域已知的方法(例如经由免疫组织化学测定法，免疫荧光测定法，免疫酶测定法，ELISA，流式细胞术，放射免疫测定法，Western印迹，配体结合，激酶活性，等)测定CEA表达水平。本发明还包含用于治疗上文所述疾病的方法，其包含将依照本发明的配制剂施用于有需要的个体。
可以通过本领域已知的多种方法来施用本发明的配制剂。正如本领域技术人员会领会的，施用路径和/或模式会随期望的结果而变化。
为了通过某些施用路径施用本发明的配制剂，可能必须在稀释剂中稀释配制剂。药学可接受稀释剂包括盐水，葡萄糖，林格(Ringer)和缓冲水溶液。
优选地，通过静脉内(i.v.)，皮下(s.c.)，或任何其它胃肠外施用手段，诸如药学领域已知的那些施用依照本发明的配制剂。
如本文中使用的，短语“胃肠外施用”意味着除了肠和表面施用以外的施用模式，通常通过注射，而且包括但不限于静脉内，肌肉内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下，脊髓内，硬膜外和胸骨内注射和输注。
配制剂必须是无菌的且流动性达到配制剂通过注射器或输注系统可投递的程度。在水以外，载剂可以是等张缓冲盐水溶液，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，和液体聚乙二醇，等等)，和其合适的混合物。
可以通过本领域已知方法来制备依照本发明的配制剂，例如超滤-渗滤，透析，添加和混合，冻干，重建，和其组合。下文可以找到依照本发明的配制剂的制备物的例子。
实施例更加详细地解释本发明但不应解释为限制本发明的范围。通过提述明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。
实施例
依照本发明的CEA CD3双特异性抗体配制剂是基于如下文提供的实验结果(使用如下文概述的一般性制备和分析方法和测定法)开发的。
实施例1：用于配制剂的各成分的制备
通过一般自重组蛋白的生产知道的技术制造CEA CD3双特异性抗体CEA TCB。为了制备依照这些实施例的配制剂，在处于大约5.5的pH的20mM组氨酸缓冲液(L-组氨酸/HCl缓冲液)中以超出目标浓度大约20-30％的浓度提供CEA TCB抗体。
依照本发明的配制剂中的赋形剂在实践中广泛使用且是本领域技术人员知道的。因此这里不需要详细解释它们。
依照本发明的液体药物产品配制剂是如下开发的。
实施例2：液体配制剂的制备
为了制备液体配制剂，将CEA TCB针对含有预期缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液交换并在需要时通过渗滤浓缩至超出目标浓度大约20-30％的抗体浓度。渗滤操作完成后，作为储备溶液将赋形剂(例如蔗糖，氯化钠，甲硫氨酸)添加至抗体溶液。然后作为50至200倍储备溶液添加表面活性剂。最后，用缓冲液将蛋白质浓度调节至大约5mg/ml或大约20mg/ml或大约50mg/ml的最终CEA TCB浓度。
将所有配制剂无菌过滤穿过0.22μm低蛋白质结合滤器并无菌填充入用ETFE(乙烯和四氟乙烯的共聚物)涂层的橡胶塞和铝压帽封闭的无菌6ml玻璃管形瓶。填充体积是大约2.7ml。将这些配制剂于不同ICH气候条件(5℃，25℃和40℃)保存不同时间间隔并通过摇动(1周，以200min-1的摇动频率，于5℃和25℃)和冷冻-融化压力方法施压。通过下面的分析方法在应用压力测试之前和之后分析样品：
1)UV分光光度法；
2)大小排阻层析术(SEC)；
3)离子交换层析术(IEC)；
4)测量溶液的浊度；
5)检查可见颗粒。
在240nm至400nm的波长范围中在Perkin Elmerλ35UV分光光度计上实施用于测定蛋白质含量的UV光谱术。用相应的配制缓冲液将纯净的蛋白质样品稀释至大约0.5mg/ml。依照方程1计算蛋白质浓度。
方程1：
Figure BDA0002354113170000251
针对320nm处的光散射校正280nm处的UV光吸收并乘以自纯净的样品和稀释缓冲液的称重质量和密度确定的稀释因子。将分子除以比色杯的路径长度d和消光系数ε的乘积。
使用大小排阻层析术(SEC)检测配制剂中的可溶性高分子量种类(聚集物)和低分子量水解产物(LMW)。在带有UV检测仪且配备有Tosoh Bioscience TSK凝胶G3000SWXL柱的Waters Alliance HPLC仪器上实施方法。使用0.2M磷酸钾，0.25M氯化钾，pH 7.0作为流动相，通过等度洗脱曲线将完整单体，聚集物和水解产物分开，并于280nm的波长检测。
实施离子交换层析术(IEC)以检测配制剂中改变CEA TCB的净电荷的化学降解产物。该方法使用合适的配备有UV检测仪(检测波长280nm)和ThermoScientific MabPacSCX-10BioLC柱(4mmx250mm)的HPLC仪器。以1.0mL/min的流速使用水中的10mM HEPES，pH7.7和10mM HEPES，1M NaCl，pH 7.7分别作为流动相A和B。
为了测定浊度，于室温使用HACH 2100AN浊度计以FTU(浊度单位)测量乳光。
通过使用Seidenader V90-T外观检查仪器对配制剂A，B，C，H，I和J的样品分析可见颗粒。使用单路安瓿测试仪器OPTIMA I对配制剂D，E，F和G的样品分析可见颗粒。
在下文添加的表1中提供配制剂A至J的稳定性测试的结果。
结果显示，为了获得最大抗体稳定性和没有颗粒的抗体配制剂，L-组氨酸/HCl缓冲剂是最有利的缓冲剂，与甲硫氨酸组合的蔗糖是最有利的稳定剂，而聚山梨酯20是最有利的表面活性剂。
Figure BDA0002354113170000271
Figure BDA0002354113170000281
Figure BDA0002354113170000291
Figure BDA0002354113170000301
Figure BDA0002354113170000311
Figure BDA0002354113170000321
Figure BDA0002354113170000331
Figure BDA0002354113170000341
Figure BDA0002354113170000351
Figure BDA0002354113170000361
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 双特异性抗体配制剂
<130> P34356
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR1
<400> 1
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR2
<400> 2
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR3
<400> 3
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR1
<400> 4
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR2
<400> 5
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR3
<400> 6
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 7
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 8
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VL
<400> 8
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA HCDR1
<400> 9
Glu Phe Gly Met Asn
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA HCDR2
<400> 10
Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA HCDR3
<400> 11
Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA LCDR1
<400> 12
Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA LCDR2
<400> 13
Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA LCDR3
<400> 14
His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr
1 5 10
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA VH
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA VL
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA CD3 bsAb LC(CEA)
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA CD3 bsAb LC(CD3)
<400> 18
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 19
<211> 694
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA CD3 bsAB HC(CEA-CD3-Fc)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu
225 230 235 240
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val
260 265 270
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser
275 280 285
Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
290 295 300
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
305 310 315 320
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His
325 330 335
Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
340 345 350
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
355 360 365
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
370 375 380
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
385 390 395 400
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
405 410 415
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
420 425 430
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
435 440 445
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
450 455 460
Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
485 490 495
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
500 505 510
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
515 520 525
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
530 535 540
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
545 550 555 560
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
565 570 575
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
580 585 590
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
595 600 605
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
610 615 620
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
625 630 635 640
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
645 650 655
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
660 665 670
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
675 680 685
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690
<210> 20
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA CD3 bsAB HC(CEA-Fc)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 21
<211> 225
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 21
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 22
<211> 207
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 22
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 23
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 23
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195

Claims (20)

1.一种药学配制剂,其包含:
1至200mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
1至100mM缓冲剂；
0.001至1％(w/v)表面活性剂；
1至500mM至少一种稳定剂,
处于4.0至7.0的范围中的pH。
2.依照权利要求1的配制剂,其中该CEA CD3双特异性抗体浓度在1至100mg/ml的范围中。
3.依照权利要求1或2的配制剂,其中该缓冲剂是组氨酸缓冲剂。
4.依照权利要求1至3任一项的配制剂,其中该缓冲剂处于10至50mM的浓度。
5.依照权利要求1至4任一项的配制剂,其中该缓冲剂提供5.0至6.0的pH。
6.依照权利要求1至5任一项的配制剂,其中该表面活性剂是聚山梨酯。
7.依照权利要求1至6任一项的配制剂,其中该表面活性剂处于0.01至0.1％(w/v)的浓度。
8.依照权利要求1至7任一项的配制剂,其中至少一种稳定剂选自盐,糖,和氨基酸的组。
9.依照权利要求1至8任一项的配制剂,其中该至少一种稳定剂处于120至300mM的浓度。
10.依照权利要求1至9任一项的配制剂,其包含选自盐,糖和氨基酸的组的第一稳定剂,和作为第二稳定剂的甲硫氨酸。
11.依照权利要求10的配制剂,其中该第一稳定剂处于120至300mM的浓度,且该第二稳定剂甲硫氨酸处于5至25mM的浓度。
12.依照权利要求1至11任一项的配制剂,其包含:
5至50mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
15至30mM L-组氨酸；
0.02至0.05％(w/v)聚山梨酯20；
120至300mM蔗糖；
任选地5至25mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.5的pH。
13.依照权利要求1至12任一项的配制剂,其包含:
50mg/ml CEA CD3双特异性抗体,20mM L-组氨酸,0.05％(w/v)聚山梨酯20,230mM蔗糖,10mM甲硫氨酸,处于pH 5.5；
或
20mg/ml CEA CD3双特异性抗体,20mM L-组氨酸,0.05％(w/v)聚山梨酯20,240mM蔗糖,10mM甲硫氨酸,处于pH 5.5；
或
5mg/ml CEA CD3双特异性抗体,20mM L-组氨酸,0.05％(w/v)聚山梨酯20,240mM蔗糖,10mM甲硫氨酸,处于pH 5.5。
14.依照权利要求1至13任一项的配制剂,其包含
50mg/ml CEA CD3双特异性抗体；
20mM L-组氨酸；
0.05％(w/v)聚山梨酯20；
230mM蔗糖；
10mM甲硫氨酸；
处于5.5±0.5的pH。
15.依照权利要求1至14任一项的配制剂,其中该CEA CD3双特异性抗体包含
(i)第一抗原结合模块,其特异性结合CD3且包含重链可变区和轻链可变区,重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR2,和SEQ ID NO:3的HCDR3；且轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3；和
(ii)第二抗原结合模块,其特异性结合CEA且包含重链可变区和轻链可变区,重链可变区包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:10的HCDR2,和SEQ ID NO:11的HCDR3；且轻链可变区包含SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3。
16.依照权利要求1至15任一项的配制剂,其中该CEA CD3双特异性抗体包含特异性结合CEA和/或由第一和第二亚基构成的Fc域的第三抗原结合模块。
17.依照权利要求1至16任一项的配制剂,其中该CEA CD3双特异性抗体包含
(i)第一抗原结合模块,其特异性结合CD3,包含重链可变区和轻链可变区,重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR2,和SEQ ID NO:3的HCDR3；且轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3,其中该第一抗原结合模块是交换Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区,特别是恒定区是交换的；
(ii)第二和第三抗原结合模块,其特异性结合CEA,包含重链可变区和轻链可变区,重链可变区包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:10的HCDR2,和SEQ ID NO:11的HCDR3；且轻链可变区包含SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQID NO:14的LCDR3,其中该第二和第三抗原结合模块各自是Fab分子,特别是常规Fab分子；
(iii)由第一和第二亚基构成的Fc域,
其中该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端,且其中该第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。
18.依照权利要求1至17任一项的配制剂,其处于液体形式,处于冻干形式或处于自冻干形式重建的液体形式。
19.依照权利要求1至18任一项的配制剂用于制备对于治疗癌症有用的药物的用途。
20.说明书中描述的发明。
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