JP7407699B2 - 二重特異性抗体製剤 - Google Patents

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Description

本発明は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体（ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体）の薬学的製剤、同製剤の調製のための方法及び同製剤の使用に関する。
以下で別途指定のない限り、ここでは用語は当技術分野で一般的に使用されるように使用される。
第１の態様において、本発明は、４．０から７．０の範囲のｐＨで：
１から２００ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
１から１００ｍＭの緩衝剤；
０．００１から１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤；
１から５００ｍＭの少なくとも一つの安定剤；
を含む薬学的製剤に関する。
本発明による製剤は、液体形態、凍結乾燥形態、又は凍結乾燥形態から再構成された液体形態で提供されうる。
本発明による製剤において有用なＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体が、以下で詳細に記載される。
好ましい一実施態様では、本発明による製剤に含まれるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の濃度は、１から１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０から７５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは２０から５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。特に好ましいのは５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施態様では、製剤に含まれるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の濃度は５ｍｇ／ｍｌである。
本明細書において使用される用語「緩衝剤」は、薬学的に許容される添加剤を意味し、薬学的調製物のｐＨを安定させる。適切な緩衝剤は、当技術分野で周知であり、文献に見出すことができる。例えば、クエン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、リン酸塩又は乳酸塩、及び／又はそれぞれの遊離酸又はその塩基、並びにそれらの種々の塩及び／又は酸の混合物を用いることができる。薬学的に許容される好ましいバッファーは、ヒスチジンバッファー、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファー及びリン酸バッファーを含むがこれらに限定されない。本発明における使用のための好ましいバッファーは、ヒスチジンバッファー、即ちヒスチジン、一般にはＬ－ヒスチジンを緩衝剤として有するバッファーである。最も好ましいのは、Ｌ－ヒスチジン又はＬ－ヒスチジンとＬ－ヒスチジン塩酸塩との混合物を含み、ｐＨ調節が塩酸を用いて行われるＬ－ヒスチジン／ＨＣｌバッファーである。別途指示がない限り、緩衝剤を説明するためにここで使用される用語「Ｌ－ヒスチジン」は、Ｌ－ヒスチジン／ＨＣｌバッファーを指す。Ｌ－ヒスチジン／ＨＣｌバッファーは、適量のＬ－ヒスチジン及びＬ－ヒスチジン塩酸塩を水に溶解することにより、又は適量のＬ－ヒスチジンを水に溶解し、塩酸の付加によりｐＨを所望の値に調節することにより、調製することができる。上記バッファーは通常、約１ｍＭから約１００ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭから約５０ｍＭ、さらに好ましくは約１５から３０ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭの濃度で使用される。使用されるバッファーに関係なく、ｐＨは、当技術分野で既知の酸又は塩基、例えば塩酸、酢酸、リン酸、硫酸及びクエン酸、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムを用いて、約４．０から約７．０、好ましくは約５．０から約６．０、最も好ましくは約５．５の範囲の値に調節することができる。
ここで使用される用語「界面活性剤」は、薬学的に許容される界面活性剤を意味する。好ましくは、非イオン性界面活性剤が使用される。薬学的に許容される界面活性剤の例には、限定されないが、ポリオキシエチレン－ソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。好ましいポリオキシエチレン－ソルビタン脂肪酸エステルは、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレンソルビタン モノラウレート（ｍｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）、商標Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭの下で販売）及びポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタン モノオレート、商標Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭの下で販売）である。好ましいポリエチレン－ポリプロピレン共重合体は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８又はポロキサマー １８８ＴＭの名称の下で販売されているものである。好ましいポリオキシエチレンアルキルエーテルは、商標ＢｒｉｊＴＭの下で販売されているものである。好ましいアルキルフェニルポリオキシエチレンエーテルは、商品名Ｔｒｉｔｏｎ Ｘの下で販売されており、最も好ましいのは、ｐ－ｔｅｒｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（商品名Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ＴＭの下で販売）である。本発明における使用のための好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレン－ソルビタン脂肪酸エステル、好ましくはポリソルベート２０又はポリソルベート８０、最も好ましくはポリソルベート２０である。ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭ）及びポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）が使用されるとき、それらは通常、約０．００１から約１％、好ましくは約０．０１から約０．１％、さらに好ましくは約０．０２％から約０．０５％、最も好ましくは約０．０５％の濃度範囲で使用される。本発明の製剤において、界面活性剤の濃度は、重量／容量（ｗ／ｖ）で表されるパーセンテージとして記載される。
ここで使用される用語「安定剤」は、製造、貯蔵及び適用の間の化学的及び／又は物理的劣化から医薬品有効成分及び／又は製剤を保護する、薬学的に許容される添加剤を意味する。安定剤には、限定されないが、以下に定義される、糖類、アミノ酸、ポリオール（例えばマンニトール、ソルビトール、キシリトール、デキストラン、グリセロール、アラビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、シクロデキストリン（例えばヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、スルホブチルエチル－β－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン）、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ ３０００、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ４０００、ＰＥＧ ６０００）、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、塩（例えば塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）が含まれる。上述のように、安定剤は、製剤中に、約１から約５００ｍＭの量で、好ましくは約１０から約３００ｍＭの量で、さらに好ましくは約１２０ｍＭから約３００ｍＭの量で存在することができる。同じ又は異なるグループから選択された複数の安定剤が、製剤中に存在してよい。
ここで使用される用語「糖類」には、単糖類及びオリゴ糖が含まれる。単糖は、酸によって加水分解不能な単量体糖（炭水化物）であり、単純な糖類及びその誘導体、例えばアミノ糖を含む。糖類は、通常そのＤ形態にある。単糖類の例には、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、リボース、デオキシリボース、ノイラミン酸が含まれる。オリゴ糖は、分岐状又は直鎖状にグリコシド結合（複数可）を介して接続した複数の単量体糖類単位からなる糖（炭水化物）である。オリゴ糖内部の単量体糖類単位は、同一でも異なってもよい。単量体糖類単位の数に応じて、オリゴ糖は、ジ－、トリ－、テトラ－、ペンタ－などといった糖類である。多糖類とは対照的に、単糖類及びオリゴ糖は水溶性である。オリゴ糖の例には、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース及びラフィノースが含まれる。本発明における使用のための好ましい糖類は、スクロース及びトレハロース（即ちα，α－Ｄ－トレハロース）であり、最も好ましいのは、スクロースである。トレハロースは、トレハロース二水和物として入手可能である。糖類は、製剤中に、約１００から約５００ｍＭの量で、好ましくは約２００から約３００ｍＭの量で、さらに好ましくは約２２０から約２５０ｍＭの量で、特に約２３０ｍＭ又は約２４０ｍＭの量で、最も好ましくは約２３０ｍＭの量で存在することができる。
ここで使用される用語「アミノ酸」は、カルボキシ基のα位に位置するアミノ部分を保持する薬学的に許容される有機分子を意味する。アミノ酸の例には、限定されないが、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンが含まれる。用いられるアミノ酸は、好ましくはいずれの場合もＬ－形態である。アルギニン、ヒスチジン、又はリジンといった塩基性アミノ酸は、好ましくはそれらの無機塩の形態で（有利には塩酸塩の形態で、即ちアミノ酸塩酸塩として）用いられる。本発明における使用のための好ましいアミノ酸はメチオニンである。メチオニンは、好ましくは、約５から約２５ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭの濃度で使用される。
安定剤の中の一つのサブグループはリオプロテクタントである。用語「リオプロテクタント」は、凍結乾燥の過程、その後の貯蔵及び再構成の間の不安定化条件から、不安定な活性成分（例えばタンパク質）を保護する、薬学的に許容される添加剤を意味する。リオプロテクタントは、糖類、ポリオール（例えば糖アルコールなど）及びアミノ酸からなる群を含むがこれらに限定されない。好ましいリオプロテクタントは、糖類、例えばスクロース、トレハロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、ノイラミン酸、アミノ糖類、例えばグルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ－メチルグルコサミン（「メグルミン」）、ポリオール、例えばマンニトール及びソルビトール、並びにアミノ酸、例えばアルギニン及びグリシン、又はこれらの混合物からなる群より選択することができる。リオプロテクタントは通常、約１０から５００ｍＭの量で、好ましくは約１０から約３００ｍＭの量で、さらに好ましくは約１００から約３００ｍＭの量で使用される。
安定剤の中の一つのサブグループは抗酸化剤である。用語「抗酸化剤」は、医薬品有効成分の酸化を防止する薬学的に許容される添加剤を意味する。抗酸化剤は、アスコルビン酸、グルタチオン（ｇｌｕｔｈａｔｈｉｏｎｅ）、システイン、メチオニン、クエン酸、ＥＤＴＡを含むがこれらに限定されない。抗酸化剤は、約０．０１から約１００ｍＭの量で、好ましくは約５から約５０ｍＭの量で、さらに好ましくは約５から約２５ｍＭの量で、使用することができる。
本発明による製剤は、一つ又は複数の等張化剤を含みうる。用語「等張化剤」は、製剤の張度を調節するために使用される、薬学的に許容される添加剤を意味する。製剤は、低張性、等張性又は高張性とすることができる。一般に等張性は、通常はヒト血清（約２５０－３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）の浸透圧に対する溶液の浸透圧に関する。本発明による製剤は、低張性、等張性又は高張性とすることができるが、好ましくは等張性であろう。等張性製剤は、液体、又は固体形態から、例えば凍結乾燥形態から再構成された液体であり、比較対象である他のなんらかの溶液、例えば生理食塩水及び血清と同じ張度を有する溶液を意味する。適切な等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン及びアミノ酸又は糖類由来のいずれかの成分、特にグルコースを含むがこれらに限定されない。等張化剤は通常、約５ｍＭから約５００ｍＭの量で使用される。
安定剤及び等張化剤の中に、両方に機能しうる、即ち同時に安定剤及び等張化剤となりうる化合物のグループが存在する。その例は、糖類、アミノ酸、ポリオール、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール及び塩のグループに見出すことができる。同時に安定剤及び等張化剤となりうる糖の例は、トレハロースである。
製剤は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤といったアジュバントも含みうる。微生物の存在は、滅菌手順と、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを取り入れることの両方により、確実に防止することができる。防腐剤は、通常約０．００１から約２％（ｗ／ｖ）の量で使用される。防腐剤は、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロル－ｍ－クレゾール、メチル又はプロピルパラベン、ベンザルコニウムクロライドを含むがこれらに限定されない。
本発明による製剤に含まれるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３とＣＥＡに特異的に結合する二重特異性抗体である。特に有用なＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、例えば国際公開第２０１４／１３１７１２号（参照によりその全体がここに包含される）に記載されている。
用語「二重特異性」は、抗体が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般に、二重特異性抗体は二つの抗原結合部位を含み、それらの各々は異なる抗原決定基に特異性である。一部の実施態様では、二重特異性抗体は、二つの抗原決定基、特に二つの異なる細胞に発現される二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
ここで使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分－抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス－感染細胞の表面上に、その他の病気の細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中に遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に、見出すことができる。
ここで使用される用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ（例えば、第２の抗原結合部分）を標的部位へ、例えば抗原決定基を有する特定の型の腫瘍細胞へと方向付けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分は、後述でさらに定義される抗体及びその断片を含む。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合ドメインを含む。一部の実施態様では、抗原結合部分は、後述でさらに定義される、当技術分野で既知の抗体定常領域を含む。有用な重鎖定常領域には、五つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμのいずれかが含まれる。有用な軽鎖定常領域には、二つのアイソタイプ：κ及びλのいずれかが含まれる。
「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、望ましくない又は非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合部分の特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えばＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 （2000））、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 （2002））により測定することができる。一実施態様では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合部分の抗原への結合の約１０％未満である。一部の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は同抗原結合部分を含む抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ未満、例えば１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍから１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
「親和性」は、分子（例えば受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は通常、解離定数（Ｋｄ）によって表され、この解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性が異なる速度定数を含むことがある。親和性は、ここに記載のものを含む当技術分野で既知の確立された方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
特に断らない限り、「ＣＤ３」は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＣＤ３を指す。用語は、「完全長」の、未処理のＣＤ３と、細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ３とを包含する。この用語は、天然に存在するＣＤ３の変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様において、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）の登録番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号２２も参照のこと。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。配列番号２３も参照のこと。
特に断らない限り、「がん胎児性抗原」又は「ＣＥＡ」（がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られる）は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＣＥＡを指す。用語は、「完全長」の、未処理のＣＥＡと、細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＥＡとを包含する。この用語は、天然に存在するＣＥＡの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様において、ＣＥＡはヒトＣＥＡである。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）の登録番号Ｐ０６７３１、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４３５４．２に示されている。
ここでＦａｂ分子などに関して使用される用語「第１の」、「第２の」又は「第３の」は、部分の各種類が複数存在するとき、区別を簡便にするために使用されている。これら用語の使用は、特に断らない限り、二重特異性抗体の特定の順序又は配向を付与することを意図していない。
ここで使用される用語「価」は、抗体中における特定数の抗原結合部位の存在を意味する。したがって、用語「抗原に対する一価の結合」は、抗体中の抗原に対して特異性である一つの（且つ一つを超えない）抗原結合部位の存在を意味する。
ここでの用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、ここでは互換可能に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 （2003）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., （Springer-Verlag, New York）, pp. 269-315 （1994）を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 （2003）；及びHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 （1993）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 （2003）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。一部の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号参照）。抗体断片は様々な技術で作製することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般に、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 （2007）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。可変領域配列に関してここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）によって規定された番号付けシステムを指す。
ここで使用される場合、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域ドメインのアミノ酸部分は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）に記載される、ここでは「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ぶＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）の647-660頁参照）が、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、ここでさらに「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け」と呼ぶＫａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１－７２３頁参照）が重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用される。
ここで使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変である（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に定義されたループを形成する（「超可変ループ」）及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの領域の各々を指す。通常、抗体は、六つのＨＶＲ；ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ここでの例示的ＨＶＲは：
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 （1987））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）、及び９５－１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 （1996））；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６－５６（Ｌ２）、４７－５６（Ｌ２）、４８－５６（Ｌ２）、４９－５６（Ｌ２）、２６－３５（Ｈ１）、２６－３５ｂ（Ｈ１）、４９－６５（Ｈ２）、９３－１０２（Ｈ３）、及び９４－１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。
別途指示がない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えばＦＲ残基）は、ここではKabat et al., supraに従って番号付けされる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に四つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の順序で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の五つの主要なクラス、即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも称される）とは、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（即ち互いによって置き替えられている）Ｆａｂ分子を意味し、即ちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端の方向に）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端の方向に）から構成されるペプチド鎖とを含む。簡潔には、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖を、ここでは（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖を、ここでは（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。
それと対照的に、「一般的な」Ｆａｂ分子は、その天然形式の、即ち重鎖可変ドメイン及び定常ドメイン（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端の方向に）から構成される重鎖と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメイン（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端の方向に）を含む軽鎖とを含むＦａｂ分子である。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している二つの軽鎖及び二つの重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに、重鎖定常領域とも呼ばれる三つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、それに、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる五種類のうちの一つに割り当てられ、そのうちのいくつかはサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）へとさらに分割されうる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる二種類のうちのいずれか一つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された二つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は多少変動するが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までと定義される。しかしながら、宿主細胞によって生成された抗体は、重鎖のＣ末端から一つ又は複数、特に一つ又は二つのアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特異的核酸分子の発現により宿主細胞によって生成された抗体は、完全長重鎖を含みうるか、又は完全長重鎖の切断された変異体を含みうる。これは、重鎖の最後の二のＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）とリジン（Ｋ４４７）は、存在してもしなくてもよい。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991（上掲も参照のこと）に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する二つのポリペプチドの一方、即ち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドとの会合によるホモダイマーの形成を低減又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。ここで使用される会合を促進する修飾は、会合することが望ましい二つのＦｃドメインサブユニット（即ちＦｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾を特に含み、これらの修飾は、二つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために、互いに対して相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、これらＦｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を、それらの会合がそれぞれ立体的に又は静電気的に望ましいものになるように変化させる。したがって、（ヘテロ）二量体化が第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間に起こり、これは、サブユニット（例えば抗原結合部分）の各々に融合したさらなる成分が同じでないという意味で非同一でありうる。いくつかの実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の一実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの各々に、別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変化する、抗体のＦｃ領域に起因しうる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；サイトカイン分泌；抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が含まれる。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のために、％アミノ酸配列同一性の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを用いて又はその後ＢＬＯＳＵＭ５０比較行列を用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、W. R. Pearson and D. J. Lipman （1988）, “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson （1996） “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258; and Pearson et. al. （1997） Genomics 46:24-36により作製されたものであり、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ．から公的に入手可能である。代替的に、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉにおいてアクセス可能な公的サーバが、ローカルではなくグローバルなアラインメントを確実に実施するために、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ ＝ ２）を用いて、配列を比較するために使用可能である。パーセントアミノ酸同一性は、出力アラインメントヘッダ中に与えられる。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。
「結合の低減」、例えばＦｃ受容体に対する結合の低減は、例えばＳＰＲによって測定した場合の、それぞれの相互作用に対する親和性の低下を指す。簡潔には、この用語は、親和性のゼロ（又は分析方法の検出限界未満）への低下、即ち相互作用の完全な廃止も含む。逆に、「結合の増大」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の上昇を指す。
「融合した」とは、成分同士（例えばＦａｂ分子とＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合により、直接又は一つ又は複数のペプチドリンカーを介して結合されていることを意味する。
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部分、及びＣＥＡに特異的に結合する第２の抗原結合部分を含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
特定の一実施態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部分であって、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む第１の抗原結合部分；と
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合する第２の抗原結合部分であって、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む第２の抗原結合部分と
を含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号７の重鎖可変領域配列及び配列番号８の軽鎖可変領域配列を含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１５の重鎖可変領域配列及び配列番号１６の軽鎖可変領域配列を含む。
いくつかの実施態様では、第１及び／又は第２の抗原結合部分はＦａｂ分子である。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。このような実施態様では、第２の抗原結合部分は、好ましくは一般的なＦａｂ分子である。
いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合される。
いくつかの実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分の各々はＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。
いくつかの実施態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に対する一価の結合を提供する。
特定の実施態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する単一の抗原結合部分と、ＣＥＡに特異的に結合する二つの抗原結合部分とを含む。したがって、いくつかの実施態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡに特異的に結合する第３の抗原結合部分を含む。いくつかの実施態様では、第３の抗原部分は、第１の抗原結合部分と同一である（例えばやはりＦａｂ分子であり、同じアミノ酸配列を含む）。
特定の実施態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをさらに含む。一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧのＦｃドメインである。特定の一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。さらに詳細な一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４のＦｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を低減する（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 （2010）参照）。さらなる特定の一実施態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。特に好ましい一実施態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的配列は、配列番号２１に提示されている。
第１、第２、及び存在する場合は第３の抗原結合部分の各々がＦａｂ分子であるいくつかの実施態様では、（ａ）（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合ししており、且つ第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、且つ第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており；（ｂ）存在する場合は、第３の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの二つのサブユニット間においてタンパク質－タンパク質相互作用が最大である部位は、ＣＨ３ドメインである。したがって、一実施態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で行われる。
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する前記修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を、それぞれ含む。「ノブ・イントゥー・ホール」技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 （1996） 及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 （2001）に記載されている。通常、この方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロダイマー形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
したがって、いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成されており、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成されている。好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群より選択される。隆起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により変化させることにより作製することができる。
このような特定の一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられているか（Ｓ３５４Ｃ）又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。好ましい一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、さらに詳細にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も詳細にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）、及びサイトカイン分泌の群より選択される一つ又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。
一般に、同じ一つ又は複数のアミノ酸置換が、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様において、一つ又は複数のアミノ酸置換は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を低下させる。一実施態様において、一つ又は複数のアミノ酸置換は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低下させる。
一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群より選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらに詳細な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。そのような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。さらに詳細な一実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１より選択される位置にさらなるアミノ酸置換を、それぞれ含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらに詳細な一実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５位にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」，「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。詳細には、好ましい実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）、即ちＦｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々では、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基により置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。そのような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。
好ましい一実施態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部分であって、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域が交換されている第１の抗原結合部分；と
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合する第２及び第３の抗原結合部分であって、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、第２及び第３の抗原結合部分の各々がＦａｂ分子、特に一般的なＦａｂ分子である第２及び第３の抗原結合部分；と
（ｉｉｉ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含み、
第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号７の重鎖可変領域配列及び配列番号８の軽鎖可変領域配列を含む。
一実施態様において、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
一実施態様において、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１５の重鎖可変領域及び配列番号１６の軽鎖可変領域を含む。
上記実施態様によるＦｃドメインは、単独で又は組み合わせで、Ｆｃドメインに関連して上述した特徴のすべてを含むことができる。
一実施態様において、抗原結合部分とＦｃ領域とは、ペプチドリンカー、特に配列番号１９及び配列番号２０のペプチドリンカーにより互いに対して融合している。一実施態様において、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含むポリペプチド（特に二つのポリペプチド）、配列番号１８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含むポリペプチド、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含むポリペプチド、及び配列番号２０の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含むポリペプチドを含む。
特に好ましい一実施態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１７の配列を含むポリペプチド（特に二つのポリペプチド）、配列番号１８の配列を含むポリペプチド、配列番号１９の配列を含むポリペプチド、及び配列番号２０の配列を含むポリペプチドを含む。（ＣＥＡ ＴＣＢ）
特に好ましい一実施態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体はＣＥＡ ＴＣＢである。
本発明による製剤のために、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、約１から約２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１から約１００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０から約７５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０から約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用される。好ましい一実施態様では、製剤は、約２０から約５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、特に約５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を含む。いくつかの実施態様では、製剤は、約５ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を含む。
第１の態様において、本発明は、４．０から７．０の範囲のｐＨで：
１から２００ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
１から１００ｍＭの緩衝剤；
０．００１から１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤；
１から５００ｍＭの少なくとも一つの安定剤；
を含む薬学的製剤に関する。
本発明による製剤に含まれうる好ましいＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体について、上記に詳述した。特に好ましいのはＣＥＡ ＴＣＢである。
好ましい一実施態様では、本発明による製剤に含まれるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の濃度は、１から１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０から７５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは２０から５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。特に好ましいのは、２０ｍｇ／ｍｌ又は５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。さらに好ましい一実施態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の濃度は５から５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。このような実施態様によれば、特に好ましいのは、５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。さらに好ましい一実施態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の濃度は１から１０ｍｇ／ｍｌの範囲である。このような実施態様によれば、特に好ましいのは、５ｍｇ／ｍｌの濃度である。
別の好ましい実施態様では、本発明による製剤に含まれる緩衝剤は、ヒスチジンバッファー、好ましくはＬ－ヒスチジン／ＨＣｌバッファーである。特に好ましいのは、Ｌ－ヒスチジン／ＨＣｌバッファー（即ち緩衝剤としてのＬ－ヒスチジン）である。
好ましくは、緩衝剤の濃度は、１０から５０ｍＭ、さらに好ましくは１５から３０ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭである。
好ましくは、緩衝剤は、５．０から６．０、さらに好ましくは５．５±０．５、最も好ましくは５．５±０．３のｐＨを提供する。
好ましい一実施態様では、本発明による製剤に含まれる界面活性剤は、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート２０又はポリソルベート８０、最も好ましくはポリソルベート２０である。
好ましくは、界面活性剤の濃度は、０．０１から０．１％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．０２から０．０５％、最も好ましくは０．０５％である。
また別の好ましい実施態様では、本発明による製剤に含まれる少なくとも一つの安定剤は、塩、好ましくは塩化ナトリウム、糖類、好ましくはトレハロース二水和物又はスクロース、及びアミノ酸、好ましくはアルギニン塩酸塩の群より選択される。好ましくは、少なくとも一つの安定剤はスクロースである。
好ましくは、少なくとも一つの安定剤の濃度は、１２０から３００ｍＭ、さらに好ましくは２２０から２５０ｍＭ、最も好ましくは２３０から２４０ｍＭである。
好ましい一実施態様では、本発明による製剤は、塩、糖類及びアミノ酸の群より選択される第１の安定剤と、第２の安定剤としてのメチオニンとを含む。
好ましい一実施態様では、第１の安定剤の濃度は、１２０から３００ｍＭ、好ましくは２２０から２５０ｍＭ、さらに好ましくは２３０から２４０ｍＭであり、第２の安定剤メチオニンは、５から２５ｍＭ、好ましくは５から１５ｍＭ、さらに好ましくは１０ｍＭの濃度で存在する。
特に好ましい一実施態様では、本発明による製剤は、第１の安定剤としての糖類、好ましくはスクロースと、第２の安定剤としてのメチオニンとを含む。糖類の濃度は、好ましくは約２３０ｍＭであり（特にＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の濃度が５０ｍｇ／ｍｌ以上である実施態様において）、メチオニンの濃度は、好ましくは約１０ｍＭである。いくつかの実施態様では、特にＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の濃度が５０ｍｇ／ｍｌ未満（例えば５ｍｇ／ｍｌ、又は２０ｍｇ／ｍｌ）である実施態様において、糖類の濃度は約２４０ｍＭであり、メチオニンの濃度は約１０ｍＭである。
一実施態様において、本発明による製剤は、５．５±０．５のｐＨで：
５から５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
１５から３０ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０２から０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
１２０から３００ｍＭのスクロース；
任意選択的に５から２５ｍＭのメチオニン；
を含む。
さらなる一実施態様において、本発明による製剤は、５．５±０．５のｐＨで：
５から５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
１５から２５ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０３から０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２２０から２５０ｍＭのスクロース；
５から１５ｍＭのメチオニン；
を含む。
さらなる一実施態様において、本発明による製剤は、５．５±０．３のｐＨで：
５から５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
１５から２５ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０３から０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２２０から２５０ｍＭのスクロース；
５から１５ｍＭのメチオニン；
を含む。
別のさらなる実施態様では、本発明による製剤は、５．５±０．５のｐＨで：
２０から５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
１５から３０ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０２から０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
１２０から３００ｍＭのスクロース；
任意選択的に５から２５ｍＭのメチオニン；
を含む。
さらなる一実施態様において、本発明による製剤は、５．５±０．５のｐＨで：
２０から５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
１５から２５ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０３から０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２２０から２５０ｍＭのスクロース；
５から１５ｍＭのメチオニン；
を含む。
さらなる一実施態様において、本発明による製剤は、５．５±０．３のｐＨで：
２０から５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
１５から２５ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０３から０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２２０から２５０ｍＭのスクロース；
５から１５ｍＭのメチオニン；
を含む。
別のさらなる実施態様では、本発明による製剤は、５．５±０．５のｐＨで：
１から１０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
１５から３０ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０２から０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
１２０から３００ｍＭのスクロース；
任意選択的に５から２５ｍＭのメチオニン；
を含む。
さらなる一実施態様において、本発明による製剤は、５．５±０．５のｐＨで：
１から１０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
１５から２５ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０３から０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２２０から２５０ｍＭのスクロース；
５から１５ｍＭのメチオニン；
を含む。
さらなる一実施態様において、本発明による製剤は、５．５±０．３のｐＨで：
１から１０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
１５から２５ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０３から０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２２０から２５０ｍＭのスクロース；
５から１５ｍＭのメチオニン；
を含む。
特に好ましい一実施態様では、本発明による製剤は、５．５±０．５のｐＨで：
５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、好ましくはＣＥＡ ＴＣＢ；
２０ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２３０ｍＭのスクロース；
１０ｍＭのメチオニン；
を含む。
さらなる好ましい一実施態様では、本発明による製剤は、５．５±０．３のｐＨで：
５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、好ましくはＣＥＡ ＴＣＢ；
２０ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２３０ｍＭのスクロース；
１０ｍＭのメチオニン；
を含む。
さらなる好ましい一実施態様では、本発明による製剤は、５．５±０．５のｐＨで：
２０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、好ましくはＣＥＡ ＴＣＢ；
２０ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２４０ｍＭのスクロース；
１０ｍＭのメチオニン；
を含む。
さらなる好ましい一実施態様では、本発明による製剤は、５．５±０．３のｐＨで：
２０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、好ましくはＣＥＡ ＴＣＢ；
２０ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２４０ｍＭのスクロース；
１０ｍＭのメチオニン；
を含む。
さらなる好ましい一実施態様では、本発明による製剤は、５．５±０．５のｐＨで：
５ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、好ましくはＣＥＡ ＴＣＢ；
２０ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２４０ｍＭのスクロース；
１０ｍＭのメチオニン；
を含む。
さらなる好ましい一実施態様では、本発明による製剤は、５．５±０．３のｐＨで：
５ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、好ましくはＣＥＡ ＴＣＢ；
２０ｍＭのＬ－ヒスチジン；
０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
２４０ｍＭのスクロース；
１０ｍＭのメチオニン；
を含む。
一部の実施態様では、本発明による製剤は、塩化ナトリウムを含まない。一部の実施態様では、製剤は２価カチオンを含まない。一部の実施態様では、製剤はシトレートを含まない。一部の実施態様では、製剤はポリオールを含まない。一部の実施態様では、製剤はデキストランを含まない。一部の実施態様では、製剤はリジンを含まない。
本発明による製剤は、液体形態、凍結乾燥形態又は凍結乾燥形態から再構成された液体形態とすることができる。一部の実施態様では、製剤は液体形態である。
本発明による製剤との関連においてここで使用される用語「液体」は、気圧下において少なくとも約２から約８℃の温度で液体である製剤を意味する。
本発明による製剤との関連においてここで使用される用語「凍結乾燥」は、当技術分野で既知の凍結乾燥法により製造される製剤を意味する。溶媒（例えば水）は、凍結により、続いて減圧下での氷の昇華及び上昇させた温度での残留水の脱離により除去される。凍結乾燥物は通常、約０．１から５％（ｗ／ｗ）の残留水分を有し、粉末又は物理的に安定なケーキとして存在する。凍結乾燥物は、再構成培地の付加後の迅速な溶解を特徴とする。
本発明による製剤との関連においてここで使用される「～から再構成された」とは、凍結乾燥され、再構成培地の付加により再度溶解される製剤を意味する。適切な再構成培地には、限定されないが、注射用水（ＷＦＩ）、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例えば０．９％の（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、グルコース溶液（例えば５％のグルコース）、界面活性剤含有溶液（例えば０．０１％のポリソルベート２０）、ｐＨ緩衝液（例えばリン酸緩衝液）が含まれる。
本発明による製剤は、生理学的に良好な耐容性を示し、容易に調製することができ、正確に分配することができ、繰り返される凍結と解凍のサイクル及び機械的ストレスの間の、分解生成物及び凝集物に対して安定性である。
本発明はさらに、本発明による製剤の調製のための方法を含む。前記方法は、予期されるバッファー組成を含むダイアフィルトレーションバッファーに対するＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体のバッファー交換、必要であればダイアフィルトレーションによる抗体の濃縮を含み、これに続いて添加剤（例えばトレハロース二水和物、スクロース、アルギニン、塩化ナトリウム、メチオニン）を保存溶液として抗体溶液に付加し、続いて界面活性剤を保存溶液として抗体／添加剤溶液に付加し、最後に、バッファー溶液を用いて抗体濃度を所望の最終濃度に調節し、それにより最終的な添加剤及び界面活性剤濃度も達成される。
代替的に、添加剤は、固体として、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を含む開始溶液に加えることもできる。ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、固体、例えば凍結乾燥物の形態であり、本発明による製剤は、まず、添加剤のうちの一つ又は複数を含んでもよい水又はバッファー溶液に、二重特異性抗体を溶解すること、及びその後さらなる添加剤を保存溶液又は固体として付加することにより調製することができる。ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、有利には、すべてのさらなる添加剤を含む溶液に直接溶解することもできる。本発明による製剤中に存在する添加剤のうちの一つ又は複数は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の調製のための方法の間に又は最後に、例えば、二重特異性抗体の調製後に実行される精製の最終工程において、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を、製剤の添加剤のうちの一つ、複数、又は好ましくはすべてを含む溶液に直接溶解することにより、前もって付加されてもよい。二重特異性抗体及び添加剤を含む溶液が所望のｐＨを有していない場合、酸又は塩基の付加により、好ましくはバッファー系中に既に存在する酸又は塩基を用いて、調節される。この後、滅菌濾過が行われる。
本発明は、疾患の治療における使用のための本発明による製剤、又は疾患を治療するために有用な医薬の調製のための本発明による製剤の使用をさらに含み、この疾患は特に、ＣＥＡが発現される、特に同じ細胞型の正常組織と比較してＣＥＡが異常に発現される（例えば過剰発現）細胞増殖障害である。このような障害には、様々な種類のがん、例えば結腸直腸がん、肺がん、膵臓がん、乳がん、及び胃がんが含まれる。ＣＥＡの発現レベルは、当技術分野で既知の方法により（例えば、免疫組織化学アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫酵素アッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、リガンド結合、キナーゼ活性などを介して）決定することができる。本発明は、本発明による製剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、上述の疾患を治療するための方法も含む。
本発明の製剤は、当技術分野において知られている多様な方法により投与することができる。当業者であれば理解するように、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変化する。
本発明の製剤を特定の投与経路により投与するために、製剤を希釈剤中で希釈することが必要となりうる。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水、グルコース、リンゲル液及び緩衝溶液が含まれる。
好ましくは、本発明による製剤は、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は他のいずれかの非経口投与手段、例えば薬学分野で知られているものにより投与される。
ここで使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与」という表現は、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、隋腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び点滴を含むがこれらに限定されない。
製剤は、注射器又は点滴システムにより送達可能である程度に滅菌の流体でなければならない。水に加えて、担体は、等張性緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物とすることができる。
本発明による製剤は、当技術分野で既知の方法、例えば限外濾過－ダイアフィルトレーション、透析、添加及び混合、凍結乾燥、再構成、及びこれらの組み合わせにより調製することができる。本発明による製剤の調製の例は、以下に見ることができる。
実施例は、本発明をさらに詳細に説明するものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。ここに引用したすべての特許文献及び科学文献の開示内容は、参照により全体が明示的に包含される。
本発明によるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体製剤を、以下に説明する一般的な調製及び分析法方法及びアッセイを用いて、以下に提供される実験結果に基づいて開発した。
実施例１：製剤のための成分の調製
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体ＣＥＡ ＴＣＢを、組み換えタンパク質の生成から一般的に知られている技術により製造した。これら実施例に従って製剤を調製するために、ＣＥＡ ＴＣＢ抗体は、２０ｍＭのヒスチジンバッファー（Ｌ－ヒスチジン／ＨＣｌバッファー）中、約５．５のｐＨにおいて、標的濃度を約２０－３０％上回る濃度で提供される。
本発明による製剤の添加剤は、実践において広く使用されており、当業者に既知である。したがって、それらについてはここで詳細に説明する必要がない。
本発明による液体医薬製剤を、以下のように開発した。
実施例２：液体製剤の調製
液体製剤の調製のために、ＣＥＡ ＴＣＢを、予期されるバッファー組成物を含むダイアフィルトレーションバッファーに対してバッファー交換し、必要であればダイアフィルトレーションにより標的濃度を約２０－３０％上回る抗体濃度に濃縮した。ダイアフィルトレーション工程の完了後、添加剤（例えばスクロース、塩化ナトリウム、メチオニン）を保存溶液として抗体溶液に加えた。次いで界面活性剤を、５０から２００倍の保存溶液として加えた。最後に、バッファーを用いてタンパク質濃度を最終的なＣＥＡ ＴＣＢ濃度が約５ｍｇ／ｍｌ又は約２０ｍｇ／ｍｌ又は約５０ｍｇ／ｍｌとなるように調節した。
すべての製剤を、０．２２μｍの低タンパク質結合フィルタを通して滅菌濾過し、ＥＴＦＥ（エチレンとテトラフルオロエチレンの共重合体）でコーティングしたゴム栓及びアルミニウム製のクリンプキャップで閉じた６ｍｌの滅菌ガラスバイアルに無菌状態で充填した。充填容量は約２．７ｍｌであった。このような製剤は、異なるＩＣＨ気象条件（５℃、２５℃及び４０℃）で異なる期間の間貯蔵し、振とう（５℃及び２５℃において２００ｍｉｎ－１の振とう頻度で１週間）及び凍解ストレス法によりストレスを与えた。試料を、ストレス適用試験の前後において、以下の分析方法により分析した：
１）ＵＶ分光測光；
２）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）；
３）イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）；
４）溶液の混濁度の測定；
５）可視粒子の検査。
タンパク質含有量の決定に使用されるＵＶ分光測光法を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ λ３５ ＵＶ分光光度計で、２４０ｎｍから４００ｎｍの波長範囲で実施した。ニートタンパク質試料を、対応する製剤バッファーを用いて約０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。タンパク質濃度を、数式１に従って計算した。
Figure 0007407699000001
２８０ｎｍにおけるＵＶ光吸収を３２０ｎｍにおける光散乱について修正し、希釈因子を乗じた。希釈因子は、測定重量と、ニート試料及び希釈バッファーの密度から決定された。分子を、キュベットの経路長ｄと消衰係数εとの積により除した。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、製剤中の可溶型高分子量種（凝集物）及び低分子量加水分解生成物（ＬＭＷ）を検出した。この方法は、ＵＶ検出器を有し、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを備えるＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ機器で実施された。インタクトなモノマー、凝集物及び加水分解生成物を、０．２Ｍのリン酸カリウム、０．２５Ｍの塩化カリウム（ｐＨ７．０）を移動相として使用して、定組成溶離プロファイルにより分離し、２８０ｎｍの波長において検出した。
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）を実施して、製剤中のＣＥＡ ＴＣＢの正味荷電を変化させる化学的な分解生成物を検出した。この方法では、ＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）及びＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭａｂＰａｃ ＳＣＸ－１０ ＢｉｏＬＣカラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ）を備える適切なＨＰＬＣ機器を使用した。水中１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．７）を、１．０ｍＬ／分の流量で、それぞれ移動相Ａ及びＢとして使用した。
混濁度の決定のために、室温でＨＡＣＨ ２１００ＡＮ混濁度計を用いて、ＦＴＵ（混濁度単位）で蛋白光を測定した。
製剤Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ及びＪの試料を、Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｖ９０－Ｔ目視検査機器を用いることにより、可視粒子について分析した。製剤Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧの試料を、Ｓｉｍｐｌｅｘ Ａｍｐｏｕｌｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＯＰＴＩＭＡ Ｉを用いて可視粒子について分析した。
製剤ＡからＪに関する安定性試験の結果を、以下の表１に示す。
結果は、最大の抗体安定性及び粒子を含まない抗体製剤を得るために、Ｌ－ヒスチジン／ＨＣｌバッファーが最も好ましいバッファーであり、メチオニンと組み合わせたスクロースが最も好ましい安定剤であり、ポリソルベート２０が最も好ましい界面活性剤であることを示している。
表１：本発明による液体ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体製剤の組成及び安定性のデータ
製剤Ａは、５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＴＣＢ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン（ｐＨ５．５）、２３０ｍＭのスクロース、０．０５％のポリソルベート２０、１０ｍＭのメチオニンという組成を有する液体製剤である。
Figure 0007407699000002
製剤Ｂは、５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＴＣＢ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン（ｐＨ５．５）、１３０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５％のポリソルベート２０という組成を有する液体製剤である。
Figure 0007407699000003
製剤Ｃは、５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＴＣＢ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン（ｐＨ５．５）、２３０ｍＭのスクロース、０．０５％のポリソルベート２０という組成を有する液体製剤である。
Figure 0007407699000004
製剤Ｄは、５ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＴＣＢ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン（ｐＨ５．５）、２４０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのメチオニン、０．０５％のポリソルベート２０という組成を有する液体製剤である。
Figure 0007407699000005
製剤Ｅは、５ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＴＣＢ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン（ｐＨ５．５）、２４０ｍＭのスクロース、０．０５％のポリソルベート２０という組成を有する液体製剤である。
Figure 0007407699000006
製剤Ｆは、５ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＴＣＢ、Ｌ－ヒスチジン（ｐＨ５．５）という組成を有する液体製剤である。
Figure 0007407699000007
製剤Ｇは、５ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＴＣＢ、２０ｍＭのＮａ－ＰＯ３（ｐＨ７．０）という組成を有する液体製剤である。
Figure 0007407699000008
製剤Ｈは、５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＴＣＢ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン（ｐＨ５．５）、２４０ｍＭのスクロース、０．０５％のポリソルベート２０という組成を有する液体製剤である。
Figure 0007407699000009
製剤Ｉは、５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＴＣＢ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン（ｐＨ５．５）、２４０ｍＭのスクロース、０．０５％のポロキサマー１８８という組成を有する液体製剤である。
Figure 0007407699000010
製剤Ｊは、５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＴＣＢ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン（ｐＨ５．５）、２４０ｍＭのスクロースという組成を有する液体製剤である。
Figure 0007407699000011

Claims (13)

  1. ５．５±０．５のｐＨで、
    ５から５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体であって、
    （ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、且つ配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合部分と
    （ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、且つ配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む第２の抗原結合部分と
    を含む、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
    １５から３０ｍＭのＬ－ヒスチジン；
    ０．０２から０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
    １２０から３００ｍＭのスクロース；
    ５から２５ｍＭのメチオニン；
    を含む、薬学的製剤。
  2. ｐＨ５．５で、５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、２３０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのメチオニンを含むか；
    又は
    ｐＨ５．５で、２０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、２４０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのメチオニンを含むか；
    又は
    ｐＨ５．５で、５ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、２４０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのメチオニンを含む、
    請求項１に記載の製剤。
  3. ５．５±０．５のｐＨで、
    ５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体；
    ２０ｍＭのＬ－ヒスチジン；
    ０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
    ２３０ｍＭのスクロース；
    １０ｍＭのメチオニン；
    を含む、請求項１または２に記載の製剤。
  4. ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＥＡに特異的に結合する第３の抗原結合部分及び／又は第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の製剤。
  5. ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体が、
    （ｉ）ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部分であって、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；と
    （ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合する第２及び第３の抗原結合部分であって、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、各々がＦａｂ分子、特に一般的なＦａｂ分子である第２及び第３の抗原結合部分；と
    （ｉｉｉ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
    を含み、
    第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、
    請求項１から４のいずれか一項に記載の製剤。
  6. 第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の製剤。
  7. 第２の抗原結合部分、および（存在する場合は）第３の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の製剤。
  8. Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、且つ／または、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである、請求項４から７のいずれか一項に記載の製剤。
  9. Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項４から８のいずれか一項に記載の製剤。
  10. Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、かつ、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられてもよく（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられてもよい（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９に記載の製剤。
  11. Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々では、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基により置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９または１０に記載の製剤。
  12. 液体形態、凍結乾燥形態、又は凍結乾燥形態から再構成された液体形態にある、請求項１から１１のいずれか一項に記載の製剤。
  13. がんを治療するために有用な医薬の調製のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の製剤の使用。
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