ES2711003A1 - Marcadores para la miocardiopatía dilatada - Google Patents

Abstract

Marcadores para la miocardiopatía dilatada. La presente invención se refiere a firma de miRNA circulantes que permiten identificar pacientes con mutaciones patogénicas en el gen de LMNA. Este perfil también permite diferenciar entre sujetos sanos sin mutaciones patogénicas y aquellos sujetos portadores de mutaciones patogénicas pero aun fenotípicamente negativos para la MCD. Además, dos de estos miRNAs, let-7a-5p y miR-145-5p, permiten discriminar entre diferentes etiología de la enfermedad, MCD idiopática y MCD familiar asociada a mutaciones en el gen LMNA. El potencial de estos miRNA como biomarcadores es superior al de marcadores establecidos en la práctica clínica como el NT-proBNP. Es una herramienta no invasiva y de fácil acceso para el cribado clínico de pacientes y familiares que carecen de una etiología clara.

Description

D E S C R I P C I O N

MARCADORES PARA LA MIOCARDIOPATiA DILATADA.

SECTOR DE LA TECNICA

La presente invention pertenece al campo de la biomedicina, y mas concretamente se refiere a marcadores para identificar los individuos con mutaciones patogenicas en el gen Laminina A/C, cuyos portadores presentan un mal pronostico.

ESTADO DE LA TECNICA

La miocardiopatia dilatada (MCD) es una enfermedad del miocardio con etiologia heterogenea que constituye la causa mas frecuente de insuficiencia cardiaca y trasplante de corazon (Hershberger y cols., Nat Rev Cardiol, 2013). Por lo que el impacto socioeconomico que es enorme.

Entre el grupo de MCD idiopaticas, estudios recientes han propuesto que alrededor del 30-50% de los casos diagnosticados presentan un origen genetico (Perez-Serra y cols.. Int J Cardiol, 2016). Mas de 60 genes han sido asociados con la MCD (Garcia-Pavia y cols , Biomark Med, 2013). Entre ellos, una de las causas geneticas mas comunes de MCD secundaria a mutaciones patogenicas corresponde a mutaciones en el gen Laminina A/C (LMNA), entre el 10 y 15% de los casos (Perez-Serra y cols., Int J Cardiol, 2016). El fenotipo cardiaco asociado a mutaciones patogenicas de LMNA constituye una entidad agresiva que incluye fibrilacion auricular, aumento del tamano ventricular, disfuncion sistolica y alteraciones en la conduction (Hasselberg y cols., Europace, 2014). Los portadores de la mutacion LMNA presentan un mal pronostico debido al alto riesgo de arritmias ventriculares malignas, insuficiencia cardiaca en fase terminal, trasplante cardiaco y muerte subita cardiaca (van Rijsingen y cols., J Am Coll Cardiol, 2012; van Rijsingen y cols., Eur J Heart Fail, 2013; Perez-Serra y cols., J Card Fail, 2015).

La importancia de esta mutacion se sustenta en varios motivos:

i) la mayoria de las patologias derivadas de la mutacion de la LMNA afectan al corazon, siendo la mas prevalente la MCD con o sin afectacion musculoesqueletica ii) aunque es una entidad muy rara, los cardiologos dinicos estan extremadamente alerta por su agresividad y elevado indice arritmogenico comparada con otras MCD hereditarias.

iii) esta condition se ha unido a! incremento de episodios de muerte subita cardiaca, hasta el punto que los pacientes que presentan esta mutacion tienen un 46% de riesgo de muerte subita. Ademas, presentan un 64% de probabilidad de padecer un cuadro de insuficiencia cardiaca secundaria a la disfuncion sistolica antes de la quinta decada.

iv) el elevado riesgo de presentar complicaciones arritmogenicas influye en la necesidad de considerar la presencia de un desfibrilador automatico implantado en prevention primaria.

En la actualidad, existen varias estrategias terapeuticas para et manejo de estos pacientes (Meune y cols., N Engl J Med, 2006; Wang y cols. Curr Treat Options Cardiovasc Med, 2017). No obstante, el diagnostico y la estratificacion del riesgo de estos sujetos es complicado, especialmente en el caso de la MCD fenotipicamente negativa y pacientes con MCD esporadica.

El desarrollo de biomarcadores facilmente accesibles y no invasivos podria trazar un nuevo escenario para la identificacion de los portadores de mutaciones de LMNA (de Gonzalo-Calvo y cols., Int J Cardiol, 2017). Desde una perspectiva clinica, el diagnostico de individuos con variantes patogenas en el LMNA causante de la MCD familiar es crucial para el manejo del paciente (van Rijsingen y cols., J Am Coll Cardiol, 2012). El fenotipo clinico no proporciona ninguna pista real para detectar el genotipo subyacente. El reconocimiento precoz de los portadores de mutaciones de LMNA en riesgo podria permitir intervenciones terapeuticas para prevenir y/o retrasar la insuficiencia cardiaca y las complicaciones relacionadas con arritmias, incluyendo la muerte subita (Hershberger y cols., Nat Rev Cardioi, 2013; Priori y cols., Eur Heart J, 2015). Ademas, una evaluacion mas rigurosa de la etiologia de la MCD es de interes clinico en terminos de tratamientos dirigidos especificos de la enfermedad, necesidad de screening familiar o genetico, asesoramiento y pronostico (Japp y cols., J Am Coll Cardiol. 2016).

El diagnostico clinico actual de la MCD genetica tiene limitaciones relevantes (Pinto y cols , Eur Heart J, 2016). Segun lo establecido por las guias clinicas, se requiere un cribado clinico de parientes de primer grado durante el protocolo de seleccion de la MCD genetica. Sin embargo, una historia familiar detallada puede no ser concluyente en ciertas circunstancias: baja penetrancia, familias pequenas, reducido numero de miembros vivos de la familia, no todos los familiares estan disponibles. penetrancia incompleta relacionada con la edad o fenotipos variables, entre otros. La ecocardiografia es una herramienta util y accesible para el cardiologo, pero tiene una baja reproducibilidad y una disponibilidad limitada, ademas de las limitaciones para caracterizar estadios preclinicos de la enfermedad y definir la etiologia de la MCD. Las pruebas geneticas comienzan a estar ampliamente disponibles, sin embargo, el diagnostico de la MCD familiar rara vez comienza con la identificacion de mutaciones. Sorprendentemente, no han sido desarrollados biomarcadores circulantes que permitan, en un individuo geneticamente positivo para el gen de LMNA, llevar a cabo un seguimiento adecuado para detectar de forma precoz de la MCD antes incluso de la aparicion de eventos adversos como arritmias En este sentido, no se ha definido adecuadamente ni la estratificacion de riesgo en las poblaciones con MCD familiares con mutacion para el gen de la LMNA, m tampoco el pronostico de las diferentes mutaciones existentes.

Los microRNA (miRNA) son pequenas moleculas de RNA (20-27 nucleotidos) no codificantes que participan en la regulacion epigenetica a nivel post-transcripcional, actuando ya sea a traves del bloqueo de la traduccion del RNA mensajero (mRNA) o de la degradacion del mRNA, disminuyendo en ambos casos la expresion genica (Ebert y Sharp, Cell, 2012). Aunque los miRNA son reguladores intracelulares de la expresion genica, tambien han sido detectados en forma estable en diferentes fluidos corporales, incluido el plasma (Mitchell y cols., Proc Natl Acad Sci U S A , 2008). Del mismo modo que sus formas intracelulares, los miRNA extracelulares participan tanto en respuestas fisiologicas y adaptativas, como en el inicio y en el desarrollo de estados patologicos, incluyendo las enfermedades cardiovasculares (Bang y cols., J Clin Invest, 2014).

Los miRNA circulantes presentan las propiedades biologicas y fisicoqulmicas apropiadas para constituir biomarcadores utiles en la practica climca (de Gonzalo-Calvo y cols Rev Esp Cardiol (Engl Ed), 2017):

i) son liberados desde celulas necroticas o secretados activamente a partir de celulas vivas;

ii) su perfil de expresion presents una alta especificidad en funcion de la celula y tejido;

iii) su perfil circulante es altamente sensible al estres celular, tanto fisiologico como patologico;

iv) pueden ser obtenidos mediante tecnicas minimamente invasivas (plasma, suero, orina y saliva, entre otros);

v) son altamente estables y presentan una vida media larga dentro de la muestra;

vi) como acidos nucleicos, los miRNA ofrecen ventajas sobre los biomarcadores utilizados en la actualidad en la practica clinica: los biomarcadores basados en peptidos pueden presentar distintas variantes de la misma molecula y estan sujetos a modificaciones post-traduccionales que dificultan su deteccion. Debido a su pequeno tamano y su composicion quimica, los miRNA son moleculas menos complejas que la mayoria de las moleculas biologicas del plasma lo que facilita su determinacion;

vii) pueden ser cuantificados con una alta sensibilidad y especificidad de forma eficiente, rentable y relativamente rapida en los laboratories clinicos actuales;

viii) pueden obtenerse perfiles globaies en un solo experimento mediante RT-qPCR, secuenciacion o microarrays.

Como se ha dicho, actualmente, no hay biomarcadores solubles para el diagnostico de la MCD secundaria a LMNA. Por tanto, seria conveniente diseiiar un metodo de identificacion de individuos con mutaciones patogenicas en LMNA basado en biomarcadores circulantes no invasivos y de facil acceso para la MCD secundaria a LMNA

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. A) Cuantificacion por RT-qPCR de los miRNA circulantes y la concentracion plasmatica de NT-proBNP en sujetos con mutaciones patogenas en LMNA responsables de MCD (LMNAMUT), controles sin mutaciones pareados por edad y sexo (LMNA^ control) y controles sin mutaciones patogenicas con MCD idiopatica (LMNAW iDCM). Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante un ANOVA utilizando la prueba Tukey para la comparacion entre cada subgrupo. * P < 0,050; ** P < 0,010; *** P < 0,001 B) Analisis de los miRNA circulantes como biomarcadores de la presencia de mutaciones patogenicas en LMNA. Se utilizaron regresiones logisticas univariadas y multivariadas para explorar la asociacton entre los miRNA circulantes y la puntuacion basada en su combinacion (utilizando los coeficientes de regresion) y la presencia de mutaciones LMNA patogenas responsables de MCD OR: Odds Ratio, Cl: Intervalo de Confianza. El area bajo una curva ROC (AUC) se utilizo para explorar la capacidad discriminativa de biomarcadores. Las diferencias en los niveles de puntuacion se analizaron mediante un ANOVA utilizando la prueba Tukey para la comparacion entre cada subgrupo utilizando. *** P <0,001 La cuantificacion relativa se realizo utilizando cel-miR-39-3p como estandar externo. El metodo 2 dCt se utilizo para analizar los niveles de expresion, donde dCt = Ctm,RNA-Ctcei.miR.3⁹. La extraccion de ARN total se realizo a partir de 200 pi de plasma. Las variables se transformaron a su logaritmo para lograr una distribucion normal.

Figura 2. A) Cuantificacion por RT-qPCR de los miRNA circulantes en controles sanos (LMNAW control) y portadores de mutaciones patogenicas en LMNA pero fenotipicamente negativo a la MCD ( LMNAmuj non-fDCM). B) Cuantificacion por RT-qPCR de los miRNA circulantes en pacientes de MCD idiopatica sin mutaciones patogenicas en el gen LMNA (LMNAWT iDCM) y en pacientes con mutaciones patogenicas en LMNA responsables de MCD y con MCD establecida (LMNAmJ fDCM). Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante la prueba T de Student para muestras independientes. P < 0,050; ** P < 0,010; *** P < 0,001 La cuantificacion relativa se realizo utilizando cel-miR-39-3p como estandar externo El metodo 2 dC! se utilizo para analizar los niveles de expresion, donde dCt = CtmiRNA-CW imR-39 - La extraccion de ARN total se realize a partir de 200 pi de plasma. Las variables se transformaron a su logaritmo para lograr una distribucion normal.

DESCRIPCION DE LA INVENCION.

Los autores de la presente invencion han identificado, por primera vez, una firma de miRNA circulantes que permiten discriminar a aquellos sujetos portadores de mutaciones en el gen LMNA asociadas a una MCD familiar Ademas, han identificado un perfil de miRNA circulantes que discrimina entre individuos sanos y portadores de la mutacion de LMNA, pero sin manifestacion de la MCD, es decir en estadio precoz. Finalmente, han descrito un grupo de miRNA circulantes que permite clasificar pacientes de MCD con diferentes etiologias incluyendo MCD idiopatica y MCD familiar secundaria a mutacion del gen LMNA.

Por tanto, un primer aspecto de la invencion se refiere al uso de los miRNA let-7a-5p, miR-142-3p, miR-145-5p y miR-454-3p, o su combinacion, para identificar los individuos portadores de mutaciones patogenicas del gen LMNA. Preferiblemente se emplean el perfil de los 4 miRNAs simultaneamente

En la presente invencion se demuestra como los niveles plasmaticos de los miRNA let-7a-5p, miR-142-3p, miR-145-5p y miR-454-3p son significativamente superiores en sujetos portadores de mutaciones patogenicas en comparacion con sujetos sanos y pacientes de MCD idiopatica sin la presencia de dicha mutacion (Fig. 1A). Tambien se observa un incremento de los niveles circulantes del miR-125a-5p en los portadores de mutaciones patogenicas en comparacion con los pacientes de MCD idiopatica (Fig. 1 A). Cabe destacar que el marcador mas comunmente utilizado en la practica clinica, denominado NT-proBNP, no mostro diferencias entre los portadores de la mutacion patogenica y los pacientes de MCD idiopatica (Fig 1A). Se realizaron anaiisis adicionales para explorar en detalle el potencial de los miRNA circulantes como biomarcadores de la presencia de mutaciones patogenicas en LMNA. Para ello, los grupos de estudio fueron dicotomizados en dos categorias segun la presencia de mutaciones patogenicas en dicho gen. Como se muestra en la Figura 1B, todos los miRNA se asocian directamente con la presencia de LMNA variantes patogenas. Ademas, se empleo el area bajo la curva ROC (AUC) para medir la capacidad discriminativa de cada miRNA individualmente y su combinacion (Fig. 1B). Todos los miRNAs analizados muestran una buena discriminacion. No obstante, la capacidad discriminativa aumenta marcadamente al combinar los cuatro miRNA circulantes. Un indice basado en los niveles circulantes de let-7a-5p, miR-142-3p, miR-145-5p y miR-454-3p (basado en los coeficientes de regresion: 2, -1, 2 y 1, respectivamente), es significativamente superior en los portadores de la mutacion patogenica en LMNA en comparacion con los dos grupos de estudio no portadores de mutaciones patogenicas, tanto control sano como MCD idiopatica.

El termino "LMNA", “lamin A/C” o “FPL”, “IDC", “LFP"; “CDDC"; “EMD2”; “FPLD"; “H G P S “LDP1”; “LMN1"; “LMNC": "MADA ”; “PR01"; “CDCD1”; “CMD1A"; “FPLD2”; “LMNL1”; “CMT2B1"; “LGMD1B”, como se usa aqui se refiere a un gen que codifica una proteina, la lamina nuclear, que consiste en una matriz bidimensional de proteinas ubicada al lado de la membrana nuclear interna. La familia de proteinas laminas conforman la matriz y estan altamente conservadas en la evolucion. Durante la mitosis, la matriz de la lamina se desmonta de manera reversible ya que las proteinas laminares estan fosforiladas. Se cree que las proteinas laminares estan involucradas en la estabilidad nuclear, la estructura de la cromatina y la expresion genica. Los laminados vertebrados consisten en dos tipos, A y B. El empalme alternative da como resultado multiples variantes de transcripcion. Las mutaciones en este gen conducen a varias enfermedades: distrofia muscular de Emery-Dreifuss, lipodistrofia parcial familiar, distrofia muscular de la cintura de miembro, miocardiopatia dilatada, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth y sindrome de progeria de Hutchinson-Gilford

A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el termino “LMNA", se refiere tanto al gen como a la proteina “LMNA” humana. En el contexto de la presente invencion, LMNA se define tambien por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la proteina LMNA, y que comprenderia diversas variantes procedentes de:

a) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacidica de la SEQ ID NO: 2,

b) moleculas de acido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotidica de a),

c) moleculas de acido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneration del codigo genetico,

d) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2. en las que el polipeptido codificado por dichos acidos nucleicos posee la actividad y las caracteristicas estructurales de la proteina LMNA Entre otras posibles secuencias nucleotidicas que codifican LMNA se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO 1

METPSQRRATRSGAQASSTPLSPTRITRLQEKEDLQELNDRLAVYIDRVRSLETENAG LRLRITESEEWSREVSGIKAAYEAELGDARKTLDSVAKERARLQLELSKVREEFKELK ARNTKKEGDLIAAQARLKDLEALLNSKEAALSTALSEKRTLEGELHDLRGQVAKLEAAL GEAKKQLQDEMLRRVDAENRLQTMKEELDFQKNIYSEELRETKRRHETRLVEIDNGK QREFESRLADALQELRAQHEDQVEQYKKELEKTYSAKLDNARQSAERNSNLVGAAH EELQQSRIRIDSLSAQLSQLQKQLAAKEAKLRDLEDSLARERDTSRRLLAEKEREMAE MRARMQQQLDEYQELLDIKLALDMEIHAYRKLLEGEEERLRLSPSPTSQRSRGRASS HSSQTQGGGSVTKKRKLESTESRSSFSQHARTSGRVAVEEVDEEGKFVRLRNKSNE DQSMGNWQIKRQNGDDPLLTYRFPPKFTLKAGQWTIWAAGAGATHSPPTDLVWKA QNTWGCGNSLRTALINSTGEEVAMRKLVRSVTWEDDEDEDGDDLLHHHHVSGSRR

SEQ ID NO: 2 GTAGTTTCCCGCCCTTGGGGGCGCGGGGACAAATTCCTTGACCCGAGGAGGATA GGGATGTGGCCTTCGGTCTTTCCTCGCAGCTCCGGGGCAAGCTAGGAGTGGGAT GGAAGTCGAGAGTCGATCCCGGAGCCCGGCCGCGGGGAGAGGTTCTCGGCAGA G AAGACAAAGCCCGCAGC AGCG AT GGGGGGAG AGCTGGGCT CTGCGT GTT GT G GGGGCCAGGAAAGGGTGCCAGGCTGGGGCTGGAACCCCCTGGCAAAGGATGGG GTCCCCTCATCCCTAAACAGCAAGCCATCTCCCCTCGCCCGCCCCCCGCCCCCCC AGTCT CGGAGATCT CAG AGGCACCGACT GGGAG ACTT GAT GTAATT GTCTT CACAA TT CT GT GAAGAT GGACTTGGTGTCT CTGCTT CACAT GAAGGGACCTGAGGTT CAG AGAGGCTAAGTAACTTTCCTAGGTCACAGAGCTGTGTTCGCGGGAGCGCCGCACC TACACCAGCCAACCCAGATCCCGAGGTCCGACAGCGCCCGGCCCAGATCCCCAC GCCTGCCAGGAGCAAGCCGAGAGCCAGCCGGCCGGCGCACTCCGACTCCGAGC AGTCTCTGTCCTTCGACCCGAGCCCCGCGCCCTTTCCGGGACCCCTGCCCCGCG GGCAGCGCTGCCAACCTGCCGGCCATGGAGACCCCGTCCCAGCGGCGCGCCAC CCGCAGCGGGGCGCAGGCCAGCTCCACTCCGCTGTCGCCCACCCGCATCACCC GGCT GCAGGAGAAGGAGGACCT GC AGGAGCT C AAT GAT CGCTTGGCGGT CTACA TCGACCGTGTGCGCTCGCTGGAAACGGAGAACGCAGGGCTGCGCCTTCGCATCA CCGAGTCTGAAGAGGTGGTCAGCCGCGAGGTGTCCGGCATCAAGGCCGCCTACG AGGCCGAGCTCGGGGATGCCCGCAAGACCCTTGACTCAGTAGCCAAGGAGCGCG CCCGCCTGCAGCTGGAGCTGAGCAAAGTGCGTGAGGAGTTTAAGGAGCTGAAAG CGCGCAATACCAAGAAGGAGGGTGACCTGATAGCTGCTCAGGCTCGGCTGAAGG ACCT GG AGGCT CT GCT GAACTCCAAGG AGGCCGC ACT G AGC ACTGCT CT CAGT G AGAAGCGCACGCTGGAGGGCGAGCTGCATGATCTGCGGGGCCAGGTGGCCAAG CTTGAGGCAGCCCTAGGTGAGGCCAAGAAGCAACTTCAGGATGAGATGCTGCGG CGGGT GGATGCT GAGAAC AGGCT GCAG ACCAT GAAGG AGGAACT GGACTT CCAG AAGAAC AT CTACAGT GAGG AGCTGCGT G AGACCAAGCGCCGT CAT GAG ACCCGA CTGGT GGAG ATT G AC AAT GGGAAGCAGCGT GAGTTT GAGAGCCGGCTGGCGG AT GCGCTGCAGGAACTGCGGGCCCAGCATGAGGACCAGGTGGAGCAGTATAAGAAG GAGCTGGAGAAGACTTATTCTGCCAAGCTGGACAATGCCAGGCAGTCTGCTGAGA GGAACAGCAACCTGGTGGGGGCTGCCCACGAGGAGCTGCAGCAGTCGCGCATC CGCATCGACAGCCTCTCTGCCCAGCTCAGCCAGCTCCAGAAGCAGCTGGCAGCC AAGGAGGCGAAGCTTCGAGACCTGGAGGACTCACTGGCCCGTGAGCGGGACAC CAGCCGGCGGCT GCTGGCGGAAAAGGAGCGGGAG AT GGCCGAGAT GCGGGCAA GGATGCAGCAGCAGCTGGACGAGTACCAGGAGCTTCTGGACATCAAGCTGGCCC T GGACAT GGAGAT CCACGCCTACCGC AAGCT CTT GGAGGGCG AGG AGGAGAGGC TACGCCTGTCCCCCAGCCCTACCTCGCAGCGCAGCCGTGGCCGTGCTTCCTCTC ACTCATCCCAGACACAGGGTGGGGGCAGCGTCACCAAAAAGCGCAAACTGGAGT CC ACT G AGAGCCGCAGCAGCTT CT CACAGCACGCACGCACTAGCGGGCGCGT GG CCGTGGAGGAGGTGGATGAGGAGGGCAAGTTTGTCCGGCTGCGCAACAAGTCCA AT G AGGACCAGTCC ATGGGC AATT GGCAGAT C AAGCGCCAG AAT GGAGAT GAT CC CTTGCTGACTTACCGGTTCCCACCAAAGTTCACCCTGAAGGCTGGGCAGGTGGTG ACGATCTGGGCTGCAGGAGCTGGGGCCACCCACAGCCCCCCTACCGACCTGGTG TGGAAGGCACAGAACACCTGGGGCTGCGGGAACAGCCTGCGTACGGCTCTCATC AACTCCACT GGGGAAGAAGTGGCCATGCGCAAGCT GGT GCGCT CAGT GACT GT G GTTGAGGACGACGAGGATGAGGATGGAGATGACCTGCTCCATCACCACCACGTGA GTGGTAGCCGCCGCTGAGGCCGAGCCTGCACTGGGGCCACCCAGCCAGGCCTG GGGGCAGCCTCTCCCCAGCCTCCCCGTGCCAAAAATCTTTTCATTAAAGAATGTTT T GGAACTTTAAAAAAAA

En la presente invencion let-7a-5p es un miRNA de secuencia SEQ ID NO 3 UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU

En la presente invencion miR-142-3p es un miRNA de secuencia SEQ ID NO:4 UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA

En la presente invencion miR-145-5p es un miRNA de secuencia SEQ ID NO:5 GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU

En la presente invencion miR-454-3p es un miRNA de secuencia SEQ ID NO:6 UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGU

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METODOS DE LA INVENClON

Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo in vitro para identificar los individuos portadores de una mutacion patogenica en LMNA, que comprende medir los 5 niveles circulantes de let-7a-5p, miR-142-3p, miR-145-5p y miR-454-3p en una muestra biologica aislada de dicho individuo, donde el incremento de la expresion de dichos niveles es indicativo de la mutacion.

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Preferiblemente, el incremento del nivel de let-7a-5p detectado en la muestra es, al menos, 1,1 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda. En una realización mas preferida, el incremento del nivel de let-7a-5p es, al menos, 1,2 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda. En una 5 realización todavia mas preferida. el incremento del nivel de let-7a-5p es, al menos, 1,3 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda.

Preferiblemente, el incremento del nivel de miR-142-3p detectado en la muestra es, al menos, 1,05 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de 0 referenda. En una realización mas preferida, el incremento del nivel de miR-142-3p es, al menos, 1,1 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda En una realización todavia mas preferida. el incremento del nivel de miR 142-3p es. al menos, 1,2 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda

Preferiblemente, el incremento del nivel de miR-145-5p detectado en la muestra es, al menos, 1,2 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda. En una realización mas preferida, el incremento del nivel de miR-145-5p es, al menos, 1.3 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda. En una realización todavia mas preferida, el incremento del nivel de miR-145-5p es, al menos, 1.4 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda

Preferiblemente, el incremento del nivel de miR-454-3p detectado en la muestra es, al menos, 1,05 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda En una realización mas preferida. el incremento del nivel de miR-454-3p es, al menos, 1,1 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda En una realización todavia mas preferida. el incremento del nivel de miR-454-3p es, al menos, 1,2 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda.

Preferiblemente, el incremento del nivel de SCORE detectado en la muestra es, al menos, 1,2 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda. En una realización mas preferida, el incremento del nivel de SCORE es, al menos, 1,3 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda. En una realización todavia mas preferida, el incremento del nivel de SCORE es, al menos, 1,4 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda.

Una "muestra biolbgica", como se define aqui, es una pequena parte de un sujeto, representativa del conjunto y puede estar constituido por una biopsia o una muestra de fluido corporal Las biopsias son pequenas piezas de tejido y pueden ser frescas, congeladas o fijas, como fijada con formalina y embebidas en parafina (formalin- fixed and paraffin embedded FFPE). Muestras de fluidos corporales puede ser sangre. plasma, suero. orina, esputo, liquido cefalorraquideo, leche. sudor, lagrimas, fluido peritoneal, sudor, lagrimas y heces o muestras de fluido ductal y pueden asimismo ser frescos, congelados o fijadas Las muestras se pueden extirpar quirurgicamente, mediante extraccion es decir, por agujas hipodermicas o de otro tipo, por microdiseccion o captura laser En la presente invention, preferiblemente la muestra es un fluido, y aun mas preferiblemente es plasma sanguineo

Por tanto, en una realization preferida de este aspecto de la invention, la muestra biologica se selecciona de entre muestras biologicas incluyen diferentes tipos de muestras de tejido, asi como muestras de fluidos biologicos, tales como sangre, plasma, suero, orina, esputo, liquido cefalorraquldeo, leche, sudor, lagrimas, fluido peritoneal, sudor, lagrimas y heces, o cualquiera de sus combinaiones Preferiblemente, dichas muestras son muestras biologicas de sangre, suero o plasma. Preferiblemente, la muestra biologica aislada es el plasma de dicho individuo.

Otro aspecto de la invention se refiere a un metodo in vitro para el dlagnostico, prediction y/o pronostico de la miocardiopatia dilatada en un individuo que comprende medir los niveles circulantes de let-7a-5p, miR-142-3p, miR-145-5p y miR-454-3p en una muestra biologica aislada de dicho individuo y, ademas, comprende, asignar a los individuos que presentan unos niveles superiores a los descritos anteriormente en esta memoria.al grupo de los individuos portadores de mutaciones patogenicas en el gen LMNA, con peor pronostico en el desarrollo de la enfermedad

En una realization preferida de este aspecto de la invencion, la muestra biologica es el plasma.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo para in vitro para identificar los individuos portadores de una mutation patogenica en LMNA, que comprende medir los niveles circulantes de let-7a-5p, miR-142-3p, miR-145-5p y miR-454-3p en una muestra biologica aislada de dicho individuo, donde el incremento de la expresion de de dichos niveles segun e ha descrito anteriormente en la memoria es indicativo de la mutation.

En otra realization preferida de este aspecto de la invencion. el nivel de expresion de uno o mas microRNAs se mide mediante perfiles de expresion de microarrays, PCR, PCR de transcriptasa inversa. PCR de tiempo real de transcriptasa inversa, PCR cuantitativa en tiempo real. PCR de punto final, PCR multiplex de punto final, cold PCR , ice cold PCR, espectrometria de masas. hibridacion in situ (ISH), hibridacion multiplex in situ o secuenciacion de acidos nucleicos. Preferiblemente, el nivel de expresion de los miRNAs puede obtener por medio de:

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(j) un metodo de perfilado genetico, tal como un microarray; y/o

(ii) un metodo que comprende PCR, tal como la PCR en tiempo real; y/o.

(iii) transferencia Northern,

Mas preferiblemente, el resultado se obtiene mediante PCR de tiempo real de transcriptasa inversa (RT-qPCR). Otras tecnicas podrias ser, pero sin limitarnos, RT combinado con LAMP, o bien alguna tecnica nueva como LASH (ligase-assisted sandwich hybridization (LASH).

En otra realización preferida de este aspecto de la invencion el individuo del que se obtiene la muestra biologica, y en el que al momento de tomar la muestra, no esta siendo tratado por miocardiopatia.

En otra realización preferida de este aspecto de la invencion la expresion de miRNA esta normalizada. Mas preferiblemente esta normalizada respecto a una miRNA externo anadido durante el proceso de aislamiento de RNA. Este miRNA es el cel-miR-39-3p, un miRNA sintetico de Caenorhabditis elegans que no tiene homologia en humanos. Se anadio en una concentracion de (1.6 * 108 copies/pL),

Una "muestra de referenda", como se usa aqui, significa una muestra obtenida de los individuos, preferiblemente dos o mas individuos, de los que se sabe que estan libres de la enfermedad (miocardiopatia, preferiblemente miocardiopatia dilatada, y mas preferiblemente miocardiopatia dilatada familiar) o, alternativamente, de la poblacion general. Los niveles adecuados de miRNAs se pueden determinar mediante la medicion de los niveles de dichos miRNAs en varios individuos adecuados, y tales niveles de referencia se pueden ajustar para poblaciones de individuos o sujetos especificos En una realización preferida, la muestra de referencia se obtiene de un grupo de individuos o sujetos sanos o de sujetos sin historia previa de padecer miocardiopatia, preferiblemente miocardiopatia dilatada, y mas preferiblemente miocardiopatia dilatada familiar. La cantidad y/o concentracion de los miRNAs en la muestra de referencia puede, preferiblemente, generarse a partir de una poblacion de dos o mas individuos: por ejemplo, la poblacion puede comprender 3, 4, 5, 10, 15, 20.

30. 40, 50 o mas individuos o sujetos.

Un "individuo" o "sujeto", como se usa aqui, se refiere a un mamifero, humano o no humano, en observacion, y mas preferiblemente un ser humano. El individuo puede ser cualquiera, un individuo predispuesto a una enfermedad (por ejemplo, miocardiopatia, preferiblemente miocardiopatia dilatada, y mas preferiblemente miocardiopatia dilatada familiar) o un individuo que padece dicha enfermedad

El termino "comparacion", tal y como se utiliza en la descripcion, se refiere pero no se limita, a la comparacion de la cantidad y/o concentracion de los miRNAs de la muestra biologica a analizar, tambien llamada muestra biologica problema, con una cantidad y/o concentracion de los miRNAs de una o varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultanea o consecutivamente, junto con la muestra biologica problema. La comparacion descrita en el metodo de la presente invencion puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.

Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el metodo de la presente invencion a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultanea o consecutivamente, junto con la muestra biologica problema. Asi, por ejemplo pero sin limitarnos, la muestra de referencia pueden ser los controles negativos, esto es, las cantidades detectadas por los metodos de la invencion en muestras de individuos que no padecen la enfermedad o en individuos con factor de riesgo de padecer la enfermedad (miocardiopatia, preferiblemente miocardiopatia dilatada, y mas preferiblemente miocardiopatia dilatada familiar)

Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo para clasificar un sujeto humano en uno de dos grupos, en e! que el grupo 1 comprende los sujetos que pueden identificarse por medio del metodo de acuerdo con el primer aspecto de la invencion, y en el que el grupo 2 representa los sujetos restantes.

Otro aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un agente terapeutico adecuado para tratar a un sujeto humano del grupo 1 que se puede identificar mediante cualquiera de los metodos de la invencion.

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KIT O DISPOSITIVO DE LA INVENCION

Otro aspecto de la invencion se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invencion, que comprende al menos un oligonucleotido capaz de hibridar con (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6), y medios para detectar dicha hibridacion.

El uso del kit o dispositivo de la invencion para identificar los individuos portadores de una mutacion patogenica en LMNA

Una secuencia totaimente complementaria (complementaria al 100%) de DNA, RNA o de cadenas de acidos nucleicos modificados, (i.e. una sonda), capaz de hibridar con la secuencia de nucleotidos de los miRNAs let-7a-5p, miR-142-3p, miR-145-5p y miR-454-3p

Opcionalmente, describir dispositivos capaces de cuantificar de forma automatica las secuencias, como se describe por ejemplo, pero sin limitarnos, en Zhang et al., 2015. Lab Chip Nov 7; 15(21 ):4217-26, en US2017233799A, Kolbert et al.,2013. PLoS ONE 8(1): e52517 or nCounter® miRNA assays

AUTOMATIZACION DEL METODO DE LA INVENCION IMPLEMENTANDOLO EN UN PROG RAMA DE ORDENADOR

Otro aspecto de la invencion se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la practica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los metodos de la invencion.

En particular, la invencion abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una serial que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio Como variante, la portadora podria ser un circuito integrado en el que va incluido el programa. estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecucion de los procesos correspondientes

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Por ejemplo, los programas podrian estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabacion magnetica, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro Alternativamente, los programas podrian estar soportados en una senal portadora transmisible. Por ejemplo, podria tratarse de una senal electrica u optica que podria transportarse a traves de cable electrico u optico, por radio o por cualesquiera otros medios.

La invencion se extiende tambien a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la practica los metodos de la invencion. Tales programas pueden tener la forma de codigo fuente, codigo objeto, una fuente intermedia de codigo y codigo objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en practica de los procesos segun la invencion. Los programas de ordenador tambien abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los metodos de la invencion (del primer o del segundo metodo de la invencion).

Otro aspecto de la invencion se refiere a una senal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los metodos de la invencion.

Los terminos "polinucleotido" y "acido nucleico" se usan aqui de manera intercambiable, refiriendose a formas polimericas de nucleotidos de cualquier longitud, tanto ribonucleotidos (ARN 6 RNA) como desoxiribonucleotidos (ADN 6 DNA). Los terminos "secuencia aminoacidica", "peptido", "oligopeptide", "polipeptido" y "proteina" se usan aqui de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimerica de aminoacidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, quimica o bioquimicamente modificados

A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas tecnicas, aditivos, componentes o pasos Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la

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invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

EJEMPLOS DE LA INVENCION

Realizamos diferentes subanalisis para evaluar en detalle el potencial de los miRNA circulantes como biomarcadores para el manejo clinico de portadores con mutaciones en LMNA. En primer lugar, comparamos la firma circulante de los miRNA seleccionados en controles sanos y los portadores de la mutacion, pero fenotipicamente negativos a MCD, es decir, sin sintomas clinicos o datos ecocardiograficos sugestivos de MCD establecida. Como se muestra en la Figura 2A, los niveles de let-7a-5p, miR-125a-5p. miR-142-3p, miR-145-5p y miR-454-3p son superiores en aquellos portadores de mutaciones patogenicas en el gen LMNA Los niveles de NT-proBNP tambien difieren estadisticamente entre ambos grupos de estudio (controles = 1,35 ± 0,24 ng / mL frente a portadores de mutaciones patogenicas = 2,04 ± 0,80 ng / mL; P = 0,013). En segundo lugar, analizamos el potencial de la misma firma de miRNA circulante para discriminar entre diferentes etiologias de MCD: MCD familiar causada por variantes patogenas en LMNA y MCD idiopatica. Como se muestra en la Figura 2B, los niveles circulantes de let-7a-5p y miR-145-5p son superiores en aquellos portadores de mutaciones. No se observan diferencias en los niveles de NT-proBNP (pacientes de MCD idiopatica = 2,29 ± 0,31 ng / mL frente a portadores de la mutacion = 2,52 ± 0,55 ng / mL, P = 0,202).

Por lo tanto, hemos descrito por primera vez un perfil de miRNA circulante como biomarcador circulante no invasivo util para el diagnostico de la MCD familiar por mutacion del gen LMNA, con capacidad diagnostica superior a la mostrada por indicadores utilizados en la practica clinica como el NT-proBNP.

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Table 2. Summary of studies measuring circulating miRNAs in dilated

cardiomyopathy._________ ______________ ______________________

miRNA miRNA

Study Study Design source Biomarker

Voellenkle 7 patietns with non-ichemic PBMC miR-29b, miR-107,

et al. 2010 DCM; 8 patients with miR-139, miR-142-ischemic cardiomyopathy; 9 3p. miR-142-5p

control subjects. Validation

in 19 patietns with nonichemic DCM; 15 patients

with ischemic

cardiomyopathy; 19 control

subjects

Fan et al 45 DCM patients; 39 age- Plasma miR-423-5p

2013 and sex- matched controls

Gupta et al 48 non-failing controls; 44 PBMC miRNA-548 family

2013 patients with relatively

stable CHF associated with

DCM. Validation in 41 non­

failing; 37 failing patient

samples

Nair et al 8 patients with diastolic Buffy miR-142-3p, miR-2013 function and preserved coat 124-5p

systolic function; 10 patients

with stable compensated

DCM; 13 patients with

decompensated congestive

heart failure; 9 normal

healthy individuals

Miyamoto 55 children <18 years old Serum miR-155, miR-636.

et al 2015 miR-646, miR-639

Enes 23 children with idiopahtic Plasma miR-147, miR-194,

CosKun et DCM, 26 healthy controls miR-205, miR-al. 2015 302a, miR-454,

miR-518f, miR-618. miR-518f,

miR-875-3p

La poblacion de estudio que recomendamos es una poblacion humana con mutacion

en el gen LMNA

En un primer paso se ha de tomar una muestra de sangre a los pacientes en ayunas

de al menos 12 horas, mediante un vaccutainer, y accediendo a la vena anterocubital.

Se debe extraer al menos 8 ml en un recipiente EDTA. Posteriormente se procedera a

su centrifugacion durante 15 minutos a 1500 g Se debe proceder a la centrifugacion

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dentro de las 2 horas posteriores a la extraccion. Una vez centrifugada, el plasma se debe aislar y congelar inmediatamente a -80°C.

En un sequndo paso, se procedera al aislamiento del ARN. El ARN total se debe de aislar a partir de 200 pi de muestras de plasma congeladas utilizando miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la normalizacion, se utiliza el m iRNAde Caenorhabditas Elegans miR-39-3p (cel-miR-39-3p), que carece de homologia de secuencia con miRNAs humanos. El cel-miR-39-3p, se anade como standard externo (1,6 * 10s copias/pl). La mezcla se suplementara con 1 pg del RNA carrier MS2 (Roche) para mejorar el rendimiento de la extraccion. El kit Spike-in (UniSp2, UniSp4. UniSp5) (Exiqon) se utilizara en todas las extracciones para monitorear la eficiencia de aislamiento de ARN La purificacion del ARN se realizara con columnas RNeasy MinElute de acuerdo con las recomendaciones del fabricante El ARN se eluyb en 14 pi de H20 libre de RNasas y se almacenara en un congelador a -80°C

En un tercer paso, se realizara el analisis de los miRNA circulantes. El ARN se transcribira de forma inversa usando el kit de sintesis de cDNA Universal II (Exiqon). Un spike-in adicional (UniSp6) (Exiqon) se ahadira a la reaccion de sintesis de cDNA para monitorizar la RT. La reaccion de RT se realizara con las siguientes condiciones: incubacion durante 60 minutos a 42°C, inactivacion durante 5 minutos a 95°C, enfriamiento inmediato a 4°C. A continuacion, el cDNA se almacenara a -20°C. La qPCR se realizra en el sistema de PCR en Tiempo Real 7900HT (Applied Biosystems) con las siguientes condiciones: 10 min a 95°C. 40 ciclos de 10 seg a 95°C y 1 min a 60°C, seguido de un analisis de la curva de disociacion. Para controlar la uniformidad de la extraccion de ARN y la eficiencia de las reacciones de RT y PCR se evaluaran los niveles de los diferentes spike-in sintetico spike-in ARN plantillas fueron analizados. El software SDS v2 3 se utilizara tanto para la determinacion del ciclo de cuantificacibn (Cq) como para el analisis de la curva de disociacion. El Cq se definio como el numero de ciclo fraccional en el que la fluorescencia superb un umbral dado La especificidad de la reaccion de PCR se corroborara por analisis de la curva de disociacion. Se utilizara el metodo ACq (miR-23a-3p - miR-451a) para confirmar que ninguna de las muestras esta afectada por hemolisis (Blondal y cols , Methods, 2013) El limite de expresion considerado fue Cq = 37. La cuantificacibn relativa se realizara utilizando el metodo 2 dCq, donde dCq = Cq |miRNA]- Cq [ce|-miR-39'.

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En un cuarto paso, con el fin de recopilar informacion sobre el diagnostico y la redundancia de cada uno de los biomarcadores unico miARN, se aplican metodos matematico estadisticos. Estos metodos incluyen, pero no se limitan a, enfoques matematicos basicos (por ejemplo, cocientes de doblado, relation serial a ruido, correlation), metodos estadisticos como pruebas de hipotesis (por ejemplo, prueba t de Wilcoxon-Mann-Whitney). ). Se utilizaron regresiones logisticas univariantes y multivariantes para explorar la asociacion entre miRNA circulantes y la presencia de mutaciones patogenicas en LMNA. El area bajo una curva ROC (AUC) se utilizo para explorar la capacidad de clasificacion de biomarcadores. El software estadistico R (www.r-project.org) fue utilizado para todos los analisis estadisticos. Las diferencias se consideraron estadisticamente significativas cuando P-valor < 0,050

Caso 1:

Un sujeto control sano ID39 (sin mutacion) presenta los siguiente niveles de let-7a-5p = 1,76 unidades arbitrarias (ua), miR-142-3p = 2,06 ua, miR-145-5p= 0,53 ua, miR-454-3p = 1,82 ua, y score = 4,34 ua, todos por debajo de los limites indicados previamente en esta memoria

Caso 2:

Un sujeto con miocardiopatla dilatada idiopatica ID32 (sin mutacion) presenta los siguiente niveles de let-7a-5p = 1,29 unidades arbitrarias (ua), miR-142-3p = 2,29 ua, miR-145-5p= 1,34 ua, miR-454-3p = 1,77 ua, y score = 4,74 ua todos por debajo de los limites indicados previamente en esta memoria

Caso 3:

Un sujeto con la mutacion ID51 presenta los siguiente niveles de let-7a-5p = 3,12 unidades arbitrarias (ua), miR-142-3p = 3,61 ua, miR-145-5p= 2,45 ua miR-454-3p = 2,51 ua, y score = 10,04 ua. todos por debajo de los limites indicados previamente en esta memoria

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1 - Un metodo in vitro para identificar los individuos portadores de una mutacion patogenica en LMNA, que comprende medir los niveles circulantes de let-7a-5p, miR-142-3p. miR-145-5p y miR-454-3p en una muestra biologica aislada de dicho individuo, donde el incremento de la expresion de dichos niveles es indicativo de la mutacion.

   2.- Un metodo in vitro para el diagnostico, prediccion y/o pronostico de la miocardiopatia dilatada en un individuo que comprende medir los niveles circulantes de let-7a-5p, miR-142-3p, miR-145-5p y miR-454-3p en una muestra biologica aislada de dicho individuo y, ademas, comprende, asignar a los individuos que presentan unos niveles superiores a 1,3, 1,2 1,4 y 1,2 veces, respectivamente, a los niveles del mismo marcador en una muestra de referenda, al grupo de los individuos portadores de mutaciones patogemcas en el gen LMNA, con peor pronostico en el desarrollo de la enfermedad.

   3 - El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la muestra biologica aislada es el plasma de dicho individuo

   4 - El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde:

   a) el incremento del nivel de let-7a-5p detectado en la muestra es, al menos, 1,05 veces, y mas preferiblemente, al menos 1,2 veces, o preferiblemente al menos 1,3 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda

   b) el incremento del nivel de miR-142-3p detectado en la muestra es, al menos, 1,05 veces, y mas preferiblemente, al menos 1,1 veces, o preferiblemente al menos 1,2 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda.

   c) el incremento del nivel de miR-145-5p detectado en la muestra es, al menos, 1,2 veces, y mas preferiblemente. al menos 1,3 veces, o preferiblemente al menos 1,4 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referenda

   d) el incremento del nivel de miR-454-3p detectado en la muestra es, al menos, 1,05 veces, y mas preferiblemente, al menos 1,1 veces, o preferiblemente al menos 1,2 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referencia.

   e) el incremento del nivel de SCORE detectado en la muestra es, al menos. 1,2 veces, y mas preferiblemente, al menos 1,3 veces, o preferiblemente al menos 1,4 veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referencia

   5 - El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde los niveles de los miRNAs se pueden obtener mediante perfiles de expresion de rmcroarrays, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR de tiempo real de transcriptasa inversa, PCR cuantitativa en tiempo real, PCR de punto final, PCR multiplex de punto final, cold PCR , ice cold PCR, espectrometria de masas, hibridacion in situ (ISH), hibridacion multiplex in situ o secuenciacion de acidos nucleicos

   6 - El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde los niveles de los miRNAs se puede obtener por medio de:

   (i) un metodo de pefilado genetico, tal como un microarray; y/o

   (ii) un metodo que comprende PCR, tal como la PCR en tiempo real; y/o

   (iii) transferencia Northern.

   1 - El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde los niveles de los miRNAs se obtienen mediante PCR de tiempo real de transcriptasa inversa (RT-qPCR).

   8 - El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el individuo del que se obtiene la muestra biologica, y en el que al momento de tomar la muestra, no esta siendo tratado por miocardiopatia

   9 - El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la expresion de miARN esta normalizada

   10 - Un metodo para clasificar un sujeto humano en uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende los sujetos que pueden identificarse por medio del metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, y en el que el grupo 2 representa los sujetos restantes.

   11,- Una composicion farmaceutica que comprende un agente terapeutico adecuado para tratar a un sujeto humano del grupo 1 que se puede identificar mediante el metodo de la reivindicación 8

   12 - Un kit o dispositivo. de ahora en adelante kit o dispositivo de la invencion, que comprende al menos un oligonucleotido capaz de hibridar con (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO 4 SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 6), y medios para detectar dicha hibridacion.

   13 - El uso del kit o dispositivo segun la reivindicación 10, para identificar los individuos portadores de una mutacion patogenica en LMNA

   14.- Una secuencia totalmente complementaria (complementaria al 100%) de DNA, RNA o de cadenas de acidos nucleicos modificados, (i.e. una sonda), capaz de hibridar con la secuencia de los miRNAs let-7a-5p, miR-142-3p, miR-145-5p y miR-454-3p.