CN115181797A

CN115181797A - MicroRNA在扩张型心肌病治疗中的应用

Info

Publication number: CN115181797A
Application number: CN202210916858.7A
Authority: CN
Inventors: 唐颢; 刘琳; 程晓雷; 简冬冬; 邢珺月; 崔存英; 李亚南; 黄丹青
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-04-19
Filing date: 2022-08-01
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2042-08-01
Also published as: CN115181797B; CN115418397B; CN115418397A

Abstract

本发明医药生物技术领域，涉及MicroRNA在扩张型心肌病治疗中的应用，所述MicroRNA为miR‑30c‑5p、miR‑126‑3p、miR‑126‑5p中的至少一种。通过实时荧光定量qPCR检测所述MicroRNA在扩张型心肌病患者和正常对照人群血清中的表达情况，发现miR‑30c‑5p、miR‑126‑3p、miR‑126‑5p在扩张型心肌病患者血清中的表达水平均显著低于正常对照人群；说明miR‑30c‑5p、miR‑126‑3p、miR‑126‑5p在扩张型心肌病患者血清中表达下调。而且，通过过表达miR‑30c‑5p、miR‑126‑3p、miR‑126‑5p能明显缓解或/和治疗扩张型心肌病引起的心损伤。因此，miR‑30c‑5p、miR‑126‑3p、miR‑126‑5p可作为药物、药物靶点或基因治疗中的靶基因，用于扩张型心肌病的预防、缓解或/和治疗。

Description

MicroRNA在扩张型心肌病治疗中的应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及MicroRNA在扩张型心肌病治疗中的应用。

背景技术

扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)是病理性心肌病的一种，是导致心衰的重要因素之一，主要表现为，在没有压力或容量过载或冠状动脉疾病足以解释功能障碍的情况下，左室(Left Ventricular)或双室(biventricular)扩张和收缩功能障碍，发病率约为1/2500-1/250。尽管治疗手段的提高，DCM患者生存率不断增高，但仍有一些病人容易发生心源性猝死和顽固性心力衰竭。DCM的发病因素众多，除基因异常，动脉疾病，心肌梗死以及其他因素(化疗药物，病毒，免疫，酒精等)引起的心肌细胞损伤均可导致疾病的发生。尽管病因众多，DCM在结构，功能，生化与分子的表型均十分相似。因此，深入探究扩张型心肌病的发病机制对于DCM的防治具有重要意义。

MicroRNA(缩写为miRNA)是22nt的短链非编码RNA，通过调控不同的靶基因，参与到机体的各种生理病理过程。多篇研究报道，miRNA通过多种机制调控心肌肥厚、心肌细胞损伤、心肌纤维化、血管生成和炎症反应，在心肌重构的发病机制中发挥核心作用。然而，miRNA是否调控参与DCM的发病过程，并能作为其分子早期诊断的标志物，有待探讨。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供MicroRNA在扩张型心肌病治疗中的应用。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种可用于扩张型心肌病辅助诊断的MicroRNA，所述MicroRNA为miR-126-3p、miR-126-5p、miR-30c-5p中的至少一种。

通过实时荧光定量QPCR检测所述MicroRNA在扩张型心肌病患者和正常对照人群血清中的表达情况，发现miR-126-3p、miR-126-5p、miR-30c-5p在扩张型心肌病患者血清中的表达水平均显著低于正常对照人群；说明miR-126-3p、miR-126-5p、miR-30c-5p在扩张型心肌病患者血清中表达下调。

本发明第二方面提供了上述第一方面所述MicroRNA作为筛选预防、缓解或/和治疗扩张型心肌病药物的药物靶标的应用。

本发明第三方面提供了上述第一方面所述MicroRNA在制备预防、缓解或/和治疗扩张型心肌病辅助诊断的药物中的应用。

本发明第四方面提供了上述第一方面所述MicroRNA的促进剂在制备预防、缓解或/和治疗扩张型心肌病辅助诊断的药物中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述促进剂为提高所述MicroRNA表达量的物质。

根据上述的应用，优选地，所述促进剂为含有所述MicroRNA基因序列的重组载体或含有所述MicroRNA基因序列的重组载体的重组细胞。

本发明第五方面提供了一种治疗扩张型心肌病的药物，所述药物中含有上述第一方面所述MicroRNA的基因序列或上述第一方面所述MicroRNA前体的基因序列或上述第一方面所述生物标志物基因表达的促进剂。

根据上述的药物，优选地，所述促进剂为提高所述生物标志物表达量的物质。

根据上述的药物，优选地，所述促进剂为含有所述上述第一方面所述MicroRNA基因序列的重组载体或含有所述生物标志物基因序列的重组载体的重组细胞。

根据上述的药物，优选地，所述药物中还含有药学上可接受的载体/辅料。

进一步，所述载体/辅料包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果如下：

本发明首次发现miR-126-3p、miR-126-5p、miR-30c-5p在扩张型心肌病患者血清中表达显著下调，具有统计学差异，而且，通过在心肌细胞中过表达miR-126-3p、miR-126-5p、miR-30c-5p，能够明显缓解扩张型心肌病导致的心肌损伤，挽救心肌细胞凋亡，因此，miR-126-3p、miR-126-5p、miR-30c-5p可作为药物、药物靶点或基因治疗中的靶基因，应用于扩张型心肌病的预防、缓解或/和治疗，能够为扩张型心肌病的防治提供新的策略，同时，也将为进一步的研究扩张型心肌病的病因病机和相应的防治策略提供新的方向。

附图说明

图1为DCM模型小鼠心脏HE染色图；其中，control代表空白对照组小鼠，DCM代表DCM模型小鼠；

图2为小鼠血清microRNA的QPCR检测结果；其中，control代表空白对照组小鼠，DCM代表DCM模型小鼠，*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，ns表示无统计学差异；

图3为人血清microRNA的QPCR检测结果；其中，control代表健康受试者，DCM代表DCM患者，**表示p≤0.01；

图4为Western Blot检测分别转染miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p的AC16细胞中FOXO3的表达水平结果图；其中，NC代表阴性对照组(即正常的AC16细胞)，miR-26a-5p表示转染miR-26a-5p的AC16细胞，miR-30c-5p表示转染miR-30c-5p的AC16细胞，miR-126-5p表示转染miR-126-5p的AC16细胞，miR-126-3p表示转染miR-126-3p的AC16细胞；

图5为同时过表达miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p的AC16细胞Dox诱导后细胞凋亡水平检测结果；其中，Vehicle+NC代表阴性对照组(未转染microRNA且不采用Dox进行诱导处理的AC16细胞)，Dox+NC代表转染阴性对照(采用Dox进行诱导处理的未转染microRNA的AC16细胞)，Dox+miRNA sets代表转染三种microRNA并加入DOX处理的AC16细胞，**表示p≤0.01；

图6为本发明构建的同时过表达三种MicroRNA载体图谱示意图；

图7为小鼠超声心动检测结果和心脏损伤标志物NT-proBNP检测结果；其中，AAV9-Ctrl表示注射AVV9空载病毒的小鼠，AAV9-miR sets表示注射AVV9-microRNA set过表达的小鼠，ns表示无统计学差异；

图8为DCM小鼠超声心动结果和心脏损伤标志物NT-proBNP检测结果；其中，AAV9-Ctrl表示注射AVV9空载病毒的小鼠，AAV9-Ctrl+DCM表示注射AVV9空载病毒和Dox的小鼠，AAV9-miR sets+DCM表示注射AVV9-microRNA set病毒和Dox的小鼠，**表示p≤0.05；

图9为DCM小鼠心脏HE染色结果，其中，AAV9-Ctrl表示注射AVV9空载病毒的小鼠，AAV9-Ctrl+DCM表示注射AVV9空载病毒和Dox的小鼠，AAV9-miR sets+DCM表示注射AVV9-microRNA set病毒和Dox的小鼠；

图10为DCM小鼠Tunel染色结果，其中，AAV9-Ctrl表示注射AVV9空载病毒的小鼠，AAV9-Ctrl+DCM表示注射AVV9空载病毒和Dox的小鼠，AAV9-miR sets+DCM表示注射AVV9-microRNA set病毒和Dox的小鼠，**表示p≤0.05。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例一：采用microRNA测序筛选用于DCM治疗的标志物

1、实验样本：

收集来自河南省阜外华中心血管病医院10例DCM患者血清(DCM组)和10例正常人血清(正常对照组)；其中，10例DCM患者血清来源于经超声诊断确诊且无家族遗传史；10例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无自身免疫性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，10例DCM患者和10例健康受试者在性别之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

血清采集：采集研究对象在空腹状态时的外周血液5ml放于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于4℃离心机中，3000rpm离心10min。然后将采血管上层的血清吸出并液氮速冻，于-80℃冰箱冷冻保存。

2、血清microRNA测序

(1)实验方法

于华大基因进行microRNA测序。其具体方法如下：

1)样本提取及检测：使用Trizol-LS试剂(ambion)按照其说明书提取样本中的RNA，使用安捷伦2100生物分析仪检测样本完整度和浓度，使用NanoDrop检测盐离子污染，这一步为文库构建和后期信息分析提供参考。

2)文库构建：

富集Small RNA：取200ng-1ug步骤1)提取的RNA样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离回收18-30nt的Small RNA。

接头连接：先进行3’接头反应，再进行5’接头反应；

反转录-PCR扩增：根据逆转录试剂盒中给出的反应体系配制溶液，具体如下：

将上述各成分按体积加入到200μl PCR管中，混匀并离心，将PCR管放入PCR仪中，进行逆转录反应：37℃，15分钟；85℃，1分钟。逆转录结束后得到的逆转录产物即cDNA。

回收PCR产物：对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收PCR后的文库目的条带，并保存于EB缓冲液中。

3)文库质检：

文库采用安捷伦2100生物分析仪检测浓度与文库长度。

4)环化：

变性打开双链PCR产物，加入环化引物，使PCR单链成环状。

5)上机测序：

使用BGISEQ-500测序平台，通过联合探针锚定聚合技术进行测序。

(2)数据处理：

原始数据去除一些低质量的数据后，获得有效数据。将有效数据与数据库(如miRbase数据库、siRNA数据库、piRNA数据库等)比对后注释。使用miRDeep2软件预测新的miRNA。使用RNAhybrid、miRnanda、TargetScan等软件预测miRNA的靶基因。使用DEGseq进行差异表达的检测，Q值≤0.001，且Log₂实验组比值≥1的miRNA认为差异明显。使用phyper进行GO分析，使用Bonferroni进行校正的P值≤0.05被认为有意义。

3、实验结果：

经筛选，最终筛选出8个与心腔扩大相关的microRNA，它们分别是miR-126-3p、miR-126-5p、miR-133a-3p、miR-24-3p、miR-26a-5p、miR-27b-3p、miR-30c-5p、miR-451a。

实施例二：QPCR检测DCM模型小鼠的microRNA水平

采用QPCR进一步在DCM模型小鼠中验证实施例1筛选到的八种microRNA的水平。

1、DCM模型小鼠的构建：

(1)小鼠选取：

选取6-7周龄的C57BL/6雄性小鼠(购自北京维通利华公司)，并在研究开始前接受适应性喂养1周。所有小鼠均在特定(温度：20-25℃；湿度：50±5％)屏障条件下，在单独的通风笼中饲养。

(2)DCM模型小鼠构建：

实验小鼠尾静脉注射Dox(阿霉素)，Dox注射剂量为5mg/kg，每周注射一次，连续注射四周，建立DCM模型小鼠。小鼠注射最后一剂Dox 4周后，取小鼠心脏组织，进行HE染色。

小鼠心脏的HE染色结果如图1所示。

由图1可知，DCM模型小鼠心脏室壁变薄、心腔变大，属于典型的DCM病症，说明小鼠DCM模型造模成功。

(3)QPCR检测DCM模型小鼠的microRNA水平：

1)实验方法：

使用Trizol-LS试剂(ambion)按照说明书提取DCM模型小鼠血清中的RNA，使用Poly(A)加尾酶试剂盒(购自诺唯赞公司，货号DD4111)依据说明书给RNA加尾。使用特异性引物CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN进行逆转录(逆转录试剂盒购自Thermo，货号为K1691)。

使用如下引物进行QPCR检测：

miR126-3p-F：gcagtcgtaccgtgagt，

miR126-3p-R：tccagtttttttttttttttcgca；

miR126-5p-F：cgcagcattattacttttggt，

miR126-5p-R：ccagtttttttttttttttcgcgta；

miR26a-5p-F：gcagttcaagtaatccaggatag，

miR26a-5p-R：ggtccagtttttttttttttttagc；

miR30c-5p-F：gcgcagtgtaaacatcctac，

miR30c-5p-R：ccagtttttttttttttttgctgaga；

miR133a-3p-F：tggtccccttcaaccag，

miR133a-3p-R：ggtccagtttttttttttttttcag；

miR27b-3p-F：gcagttcacagtggctaag，

miR27b-3p-R：tccagtttttttttttttttgcaga；

miR24-3p-F：agtggctcagttcagca，

miR24-3p-R:ccagtttttttttttttttctgttcct；

miR451a-5p-F：cgcagaaaccgttacca，

miR451a-5p-R：ggtccagtttttttttttttttaactca。

QPCR反应体系如下：

根据QPCR反应体系配制溶液。扩增程序为：95℃5分钟；40个循环：95℃15秒钟，65℃45秒钟。以U6作为内参基因。按照2^-△△CT法计算microRNA的相对表达水平。

2)实验结果：

DCM模型小鼠血清microRNA的检测结果如图2所示。

由图2可知，与空白对照组小鼠相比，DCM模型小鼠中miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p显著下调，差异具有统计学意义。

实施例三：QPCR检测DCM患者血清中四种microRNA的水平

1、实验样本：

收集来自河南省阜外华中心血管病医院54例DCM患者血清(DCM组)和46例正常人血清(正常对照组)；其中，54例DCM患者血清来源于经超声诊断确诊且无家族遗传史；46例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无自身免疫性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，54例DCM患者和46例健康受试者在性别之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

2、QPCR检测DCM患者和健康受试者血清中四种microRNA的表达水平：

1)实验方法：

QPCR检测的实验方法与实施例二相同，在此不再赘述。

2)实验结果：

QPCR检测的实验结果如图3所示。

由图3可知，与健康受试者相比，DCM患者血清中miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p显著下调，差异具有统计学意义。

实施例四：体外心肌细胞中过表达microRNA

1、体外心肌细胞中分别过表达四种microRNA：

在人类永生化心室肌细胞AC16中分别过表达miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-126-3p、miR-126-5p，然后采用Western Blot检测过表达microRNA后人类永生化心室肌细胞AC16中FOXO3的表达水平。

(1)细胞选取及培养：

实验选用的细胞为人类永生化心室肌细胞AC16。细胞的培养方法为：细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，加入100U/ml的青霉素和100μg/ml链霉素，在37℃含5％CO₂及饱和湿度的通用条件下培养。

(2)细胞转染：

待人类永生化心室肌细胞AC16生长至50％汇合度时，将miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p(购自广州市锐博生物科技有限公司)分别转染到AC16细胞中，得到过表达miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-126-3p、miR-126-5p的四种AC16细胞。

以miR-30c-5p为例，其具体的转染方法为：待人类永生化心室肌细胞AC16生长至50％汇合度时，取12pmol miR-26a-5p(广州市锐博生物科技有限公司合成)用400μl无血清培养基液体稀释，充分混匀，再加入4μl Lipofectamine^TM RNAiMAX(购自Thermo公司，货号：13778-150)转染试剂制成转染混合物，之后用振荡器将其充分混匀，离心，室温静置20分钟。将转染复合物加入到2ml 10％血清培养基中，轻柔混匀，移除细胞原有培养基，加入上述转染复合物的培养基。6小时后进行细胞换液，72小时后收取细胞，即得到miR-26a-5p的AC16细胞，用于进行后续实验。

(3)Western Blot检测：

采用Western Blot分别检测过表达miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-126-3p、miR-126-5p的四种AC16细胞中FOXO3的表达水平。

Western Blot检测的具体操作步骤如下：

1)蛋白提取及定量

弃去细胞中的培养基，用PBS清洗细胞表面两次，胰酶消化或者用细胞刮将细胞收集到离心管中，4℃、3000rpm，离心5分钟；吸弃上清，加入RIPA裂解液(含100×cocktail)200μl(以6孔板为例)，冰上裂解30分钟，每10分钟震荡混匀；4℃、12000rpm离心10分钟，弃沉淀。

将蛋白样品按一定倍数稀释后，取25μl置于96孔板中；另取25μl H₂O作空白对照，从5个不同浓度的牛血清蛋白标准液(125μg/ml，250μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml，2000μg/ml)中各取出25μl，加入96孔板中，再向各孔中加入200μl BCA反应混合液(A液:B液＝50:1)，37℃孵育30分钟，在酶标仪上检测570nm处吸收峰，根据不同浓度蛋白标准液读数拟合得到的标准曲线，然后根据样品的吸光度值计算得到样品的蛋白质浓度。

2)SDS-PAGE电泳

根据蛋白浓度，取适量细胞裂解液，加入6×SDS蛋白上样缓冲液(100mM Tris-HCl，200mM DTT pH＝6.8，4％SDS，0.01％溴酚蓝，20％甘油)，混匀后95℃孵育5分钟，上样，准备电泳。

电泳系统：

浓缩胶：4ml

30％Acr-Bis(Acr:Bis＝29:1)	0.67ml
		1M Tris-HCl,pH6.8	0.5ml
10％SDS	0.04ml
		10％AP	0.04ml
TEMED	0.004ml
		ddd H<sub>2</sub>O	2.7ml

分离胶：10ml

30％Acr-Bis(Acr:Bis＝29:1)	4ml
		1.5M Tris-HCl,pH8.8	2.5ml
10％SDS	0.1ml
		10％AP	0.1ml
TEMED	0.005ml
		ddd H<sub>2</sub>O	3.3ml

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：

Tris	15.1g
		甘氨酸	94g
10％SDS	50ml
		加ddH<sub>2</sub>O至	1000ml

样品在浓缩胶中以10V/cm，分离胶中以15V/cm的电压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm时停止电泳。

3)湿式转膜

取出凝胶，去除浓缩胶部分，裁剪与待转印凝胶大小相同的滤纸4张及硝酸纤维素膜(NC膜)1张，将膜在转膜缓冲液(48mM Tris，39mM甘氨酸，20％甲醇)浸泡5分钟以上。阴极板上整齐地堆放4张以转印缓冲液浸湿的滤纸，将凝胶对齐放于其上。将膜覆盖在凝胶上，作好标记，将另外4张浸湿的滤纸放在膜上，将阳极板盖上，整个过程注意排出气泡。根据蛋白分子量大小，采用250mA恒流转印90-120分钟。将硝酸纤维素膜取下，进行下面的杂交反应。

4)杂交和结果处理

将转印好的NC膜用TBST(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，0.5％Tween 20)漂洗5分钟。室温摇床上用含5％脱脂奶粉的TBST中封闭1小时；用TBST漂洗2次，按抗体说明书比例加入一抗(浓度0.2μg/ml)，4℃孵育过夜。室温下用TBST漂洗5分钟×4次，加入相应的HRP-标记的二抗(1:2000)或荧光标记二抗(1:2000)，室温下避光孵育1小时。TBST漂洗5分钟×4次，用ECL超敏发光液暗室曝光或者采用Odyssey双色红外激光成像系统进行扫描。使用Image-J软件，对Western Blot曝光结果进行灰度扫描并分析。

Western Blot检测结果如图4所示。

由图4可知，miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p可显著降低心肌细胞AC16中FOXO3蛋白水平，而miR-26a-5p不能。由此说明，miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p可能参与介导FOXO3的蛋白调控过程，进而在DCM疾病进程中发挥作用。

2、体外心肌细胞中同时表达三种microRNA：

在人类永生化心室肌细胞AC16中同时过表达miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p。

待人类永生化心室肌细胞AC16生长至50％汇合度时，使用Lipofectamine^TMRNAiMAX(购自Thermo公司，货号：13778-150)，将miR-26a-5p、miR-30c-5p、miR-126-3p(购自广州市锐博生物科技有限公司)按照1：1：1的比例转染到AC16细胞中，得到同时过表达miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p的AC16细胞。具体转染方法与上述转染miR-30c-5p相同，在此不再赘述。

对同时过表达miR-30c-5p、miR-126-3p、miR-126-5p的AC16细胞进行Dox(阿霉素，300nM，24小时)诱导，然后采用流式细胞术检测Dox诱导后AC16细胞的细胞凋亡。为了进行对比，本实验还设置了阴性对照(未转染microRNA且不采用Dox进行诱导处理的AC16细胞)和转染阴性对照(采用Dox进行诱导处理的未转染microRNA的AC16细胞)。具体结果如图5所示。

由图5可知，同时过表达三种microRNA可有效缓解心肌扩张细胞模型的细胞凋亡。

实施例五：小鼠中过表达microRNA对DCM的影响

1、构建同时过表达miR-30c-5p、miR-126-3p和miR-126-5p的小鼠模型

将miR-30c-5p(Ensembl中的序列号为ENSMUST00000083556.3)、miR-126-3p(Ensembl中的序列号为ENSMUST00000083606.3)和miR-126-5p(Ensembl中的序列号为ENSMUST00000083606.3)的基因序列通过基因合成的方式构建入pHBAAV-cTNT-MCS-ZsGreen载体(购自汉恒生物科技有限公司)中，得到同时过表达三种MicroRNA的载体(载体图谱示意图如图6所示)；然后对构建的同时过表达三种MicroRNA的载体进行腺病毒包装，获得腺相关病毒AVV9-microRNA set(购自汉恒生物科技有限公司)，然后通过尾静脉注射的方式将腺相关病毒AVV9-microRNA set注入小鼠，得到同时过表达miR-30c-5p、miR-126-3p和miR-126-5p的小鼠模型。

过表达microRNA基因小鼠超声心动检测和心脏损伤标志物NT-proBNP的检测：

采用带有MS400C探头的Vevo 3100系统对同时过表达miR-30c-5p、miR-126-3p和miR-126-5p的小鼠模型进行超声心动检测，计算射血分数(EF)、缩短分数(FS)和HW/TL(心重/胫骨长度比)。NT-proBNP均采用ELISA试剂盒进行检测，ELISA试剂盒的货号为No.E-EL-M0834c，购自Elabscience公司。具体检测结果如图7所示。

由图7可知，过表达miR-30c-5p、miR-126-3p和miR-126-5p不影响基线水平的小鼠心脏功能。

2、过表达microRNA基因的DCM小鼠模型构建：

小鼠尾静脉注射腺相关病毒AAV9空载或者AVV9-microRNA set(心肌细胞特异性过表达miR-30c-5p、miR-126-3p和miR-126-5p，购自汉恒生物科技有限公司)1×10¹¹PFU，四周后，尾静脉注射Dox(注射剂量为5mg/kg，1次/周，连续注射四周)，小鼠注射最后一剂Dox4周后得到过表达microRNA基因的DCM小鼠模型。

(1)过表达microRNA基因的DCM小鼠模型超声心动检测和心脏损伤标志物NT-proBNP的检测：

采用带有MS400C探头的Vevo 3100系统对同时过表达miR-30c-5p、miR-126-3p和miR-126-5p的DCM小鼠模型进行超声心动检测，计算射血分数(EF)、缩短分数(FS)和HW/TL(心重/胫骨长度比)。NT-proBNP均采用ELISA试剂盒进行检测，ELISA试剂盒的货号为No.E-EL-M0834c，购自Elabscience公司。具体检测结果如图8所示。

由图8可知，过表达miR-30c-5p、miR-126-3p和miR-126-5p能明显缓解DCM造成的心肌损伤，缓解心肌肥厚表型。

(2)过表达microRNA基因DCM小鼠心脏HE染色检测：

小鼠心脏HE染色结果如图9所示。

由图9可知，DCM小鼠模型注射AVV9-microRNA set病毒能明显缓解其心脏室壁变薄和心腔增大。

(3)过表达microRNA基因DCM小鼠心肌细胞TUNEL染色：

采用原位细胞死亡检测试剂盒(货号为No.11684795910，购自Roche公司)进行TUNEL染色检测，其具体操作按照试剂盒的说明书进行。TUNEL染色结果如图10所示。

由图10可知，注射AVV9-microRNA set病毒和Dox的小鼠心肌细胞TUNEL染色结果阳性率显著低于注射AVV9空载病毒和Dox的小鼠，说明过表达miR-30c-5p、miR-126-3p和miR-126-5p能显著缓解DCM引起的心肌细胞凋亡。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.MicroRNA作为筛选预防、缓解或/和治疗扩张型心肌病药物的药物靶标的应用，其中，所述MicroRNA为miR-126-3p、miR-126-5p、miR-30c-5p中的至少一种。

2.MicroRNA在制备预防、缓解或/和治疗扩张型心肌病辅助诊断的药物中的应用，其中，所述MicroRNA为miR-126-3p、miR-126-5p、miR-30c-5p中的至少一种。

3.MicroRNA的促进剂在制备预防、缓解或/和治疗扩张型心肌病辅助诊断的药物中的应用，其中，所述MicroRNA为miR-126-3p、miR-126-5p、miR-30c-5p中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述促进剂为提高所述MicroRNA表达量的物质。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述促进剂为含有所述MicroRNA基因序列的重组载体或含有所述MicroRNA基因序列的重组载体的重组细胞。

6.一种治疗扩张型心肌病的药物，其特征在于，所述药物中含有MicroRNA的基因序列、MicroRNA前体的基因序列或MicroRNA基因表达的促进剂，其中，所述MicroRNA为miR-126-3p、miR-126-5p、miR-30c-5p中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述促进剂为提高所述MicroRNA表达量的物质。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述促进剂为含有所述MicroRNA基因序列的重组载体或含有所述MicroRNA基因序列的重组载体的重组细胞。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物中还含有药学上可接受的载体/辅料。