CN116356009A - 一种miR-122-5p的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测miR‑122‑5p的制剂在制备诊断特发性肺动脉高压的试剂盒中的应用。本发明提供一种检测miR‑122‑5p的制剂在制备诊断特发性肺动脉高压的试剂盒中的应用;特发性肺动脉高压患者血浆外泌体和外周血单个核细胞中只有miR‑122‑5p均表达上调;与常氧组相比,miR‑122‑5p在缺氧的PMECs、PASMCs、PC和肺组织中显著表达,即miR‑122‑5p可作为IPAH的分子诊断标志物。
Description
技术领域
本发明涉及特发性肺动脉高压诊断技术领域,尤其涉及一种检测miR-122-5p的制剂在制备诊断特发性肺动脉高压的试剂盒中的应用。
背景技术
特发性肺动脉高压(IPAH)是一种罕见但具有破坏性的疾病,其特征是肺动脉壁血管重构,导致肺血管阻力增加,右心室肥厚,并最终导致右心衰。发病率约为6/1000000,病死率较高。据统计,全世界每年有4万多人患有肺动脉高压,死亡率高达15%。即使经过常规治疗,肺动脉高压患者3年生存率也只有55%-65%。目前市场上的药物对肺动脉高压的治疗效果并不理想。多数患者预后较差,生活质量无明显改善。因此,寻找一种准确、特异、低成本、易操作、安全的肺动脉高压诊断和有效监测方法,改善肺动脉高压患者的预后,具有重要的临床意义。虽然目前在了解肺血管过度收缩的原因方面取得了重要进展,现代化治疗逐渐改善了患者的功能和生存时间,但其具体的发病机制尚不清楚,死亡率仍然很高,在表观遗传基因调控水平上,特别是通过对非编码RNA的探索,目前还不清楚。
小分子核糖核酸(microRNA)是内源性RNA,其长度约为19nt-25nt,主要协调信使RNA的翻译抑制,减少或退化,并在重要过程中发挥作用,例如细胞生长发育、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、DNA甲基化和促进mRNA转录。microRNA(miRNA)广泛存在于人体各种组织和体液中,其中,外周血中miRNA的表达随个体生理和病理条件的改变而改变。血液miRNA的变化可以反映人类病理生理状况的变化;miRNAs可以稳定且不依赖于血液中的血细胞,血浆中的特定miRNAs可能成为诊断某些肿瘤或疾病的分子生物标志物。miRNA具有高度保守性,在外周血中稳定,易于采集和检测,使其有可能成为多种疾病的非侵入性诊断标志物。从外周血单个核细胞(PBMCs)中提取miRNA进行定量检测和比较,探索血液miRNA是诊断IPAH的新途径。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种检测miR-122-5p的制剂在制备诊断特发性肺动脉高压的试剂盒中的应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
提供一种检测miR-122-5p的制剂在制备诊断特发性肺动脉高压的试剂盒中的应用。
优选地,所述miR-122-5p为血浆外泌体中的miR-122-5p。
优选地,所述miR-122-5p为外周血单个核细胞中的miR-122-5p。
优选地,特发性肺动脉高压患者的miR-122-5p显著地表达上调。
本发明采用以上技术方案,与现有技术相比,具有如下技术效果:
本发明提供一种检测miR-122-5p的制剂在制备诊断特发性肺动脉高压的试剂盒中的应用;特发性肺动脉高压患者血浆外泌体和外周血单个核细胞中只有miR-122-5p均表达上调;与常氧组相比,miR-122-5p在缺氧的PMECs、PASMCs、PCs和肺组织中显著表达,即miR-122-5p可作为IPAH的分子诊断标志物。
附图说明
图1为PBMCs(A)和外泌体(B)中miRNA表达的火山图;
图2为采用无监督分层聚类分析IPAH和健康对照组之间差异表达的miRNAs;
图3为不同miRNA的前30个Gene Ontology(GO)富集通路主要集中在PBMCs(A)和血浆外泌体(B)中miRNA的生物学过程(Biological Process,BP)、细胞学组分(CellularComponents,CC)和分子生物学功能(Molecular Function,MF);
图4为PBMCs(A)和外泌体(B)中miRNA相关的Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes(KEGG)通路分析;
图5为PBMCs的miRNA-mRNA相互作用网络;
图6为血浆外泌体的miRNA-mRNA相互作用网络;
图7为miR-122-5p分别在缺氧和常氧下PMECs(A)、PASMCs(B)、PCs(C)中qPCR表达的比较结果,SuHx(D)和MCT(E)大鼠肺组织中与对照组中qPCR表达的比较结果,IPAH(F)患者肺组织与正常人中qPCR表达的比较结果(p Value<0.05);
图8为PBMCs(A)和血浆外泌体(B)中miR-122-5p对IPAH的ROC曲线分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,但不作为本发明的限定。
实施例
①样本选择
患者组:2010年5月至2016年4月上海市肺科医院IPAH患者6例,3男3女(平均年龄:18岁)。纳入标准:IPAH诊断依据最新NICE临床分型。排除了结缔组织病、先天性心脏病、门脉高压、肺部疾病、慢性血栓栓塞和左心疾病引起的PAH;还排除了可能影响激素代谢的急慢性疾病患者,这些疾病包括急性或慢性感染、慢性自身免疫疾病、以前确定的原发性内分泌紊乱,以及在过去或过去接受激素(甲状腺激素、合成代谢类固醇、皮质类固醇)或药物显著抑制激素生产的患者。
对照组:从健康体检中心同时选取与患者组年龄、性别匹配的健康体检者6例,3男3女(平均年龄:18岁)。纳入标准:(1)既往无其他肺部疾病及相关疾病史;(2)家庭成员无相关肺部疾病史;(3)身体健康,无药物、酒精依赖等。
本研究经我院伦理委员会批准,征得患者或其家属同意,并签署知情同意书。
②提取PBMCs
采集患者和对照组新鲜血液,在4.0mL的试管中加入肝素锂抗凝剂。根据制造商(西比奥,中国上海)的说明,采集后4小时内,使用提取试剂盒从全血中分离外周血单个核细胞(PBMCs)。
③提取血浆外泌体
2500g离心新鲜血液,室温10分钟。将血浆转移到新管中,4℃15000g离心10min,取出血小板。最终100000g离心2h后可获得外泌体。用100μL PBS重悬外泌体。
④miRNA提取及质量控制
冷冻后的血浆和细胞样本置于37℃水浴中孵育,直至完全溶解。然后,按照miRNeasy Serum/Plasma Kit和miRNeasy Mini Kit的程序提取PBMCs中的RNA。用紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的纯度和完整性。MiRNeasy血清/血浆试剂盒、MiRNeasy Mini Kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR试剂盒及引物均购自德国Qiagen公司。
根据制造商的说明,使用Trizol试剂(Invitrogen,CA,USA)从PBMCs中提取完整RNA。总RNA样本的数量和质量由NanoDrop ND-2000(Thermo,CA,USA)测定。使用Agilent2100生物分析仪(Agilent Technologies,CA,USA)评估RNA完整性。RNA完整性数(RIN)≥7的样本随后进行分析。
⑤miRNA的测定
使用mirVana miRNA分离试剂盒(Applied Biosystems,p/n AM1556,CA,USA)从IPAH和健康血液样本中提取总RNA,并使用QIAGEN RNeasy R试剂盒(QIAGEN,美因茨,德国)进行纯化。用安捷伦2100生物分析仪检测纯化后的质量。
高通量测序由Oe Biotech Biotechnology Co.(中国上海)进行。按质量将基本读取转换为顺序数据(称为原始数据/读取)。对低质量的读数进行过滤,去除含有5'引物污染物和poly(A)的读数。不使用3'适配器和插入标签进行读数,并在原始数据上读取小于15nt和大于41nt的数据以获得干净读取的原始数据。为了识别和去除非编码RNA,将干净的读取与Rfam数据库(v2.2.28+)和GenBank数据库中的小RNA对齐(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)使用BLAST(v2.2.28+)。通过与miRBase(v21)数据库进行比较来鉴定已知的miRNA(http://www.mirbase.org/),并分析不同样本中已知的miRNA表达模式。MiRDeep2(v2.0.0.8)用于分析未注释的miRNA,预测新的miRNAs。根据pre-miRNA发夹结构和miRBase数据库,鉴定出相应的miRNA新型序列。
⑥细胞培养和动物模型
肺微血管内皮细胞(PMECs)、肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)和周细胞细胞(PCs)分别在37℃、5%CO2的培养箱中与内皮细胞培养液、平滑肌细胞培养液和周细胞培养液培养。PMECs、PASMCs和PCs在37℃、5%CO2的缺氧培养箱中缺氧48h以获得缺氧诱导的细胞。
所有动物实验均经同济大学医学院动物护理与使用委员会批准。大鼠(n=6)皮下注射25mg/kg溶于羧甲基纤维素的SU5416。然后将大鼠置于10%氧气条件下4周,然后将其置于常氧条件下6周,得到SuHx造模大鼠。大鼠(n=6)皮下注射溶解于无菌盐水中的野百合碱(Monocrotaline,MCT)(60mg/kg),然后暴露于常氧条件下4周,得到MCT造模大鼠。SuHx(n=6)和MCT(n=6)实验中的对照动物分别单次注射羧甲基纤维素和生理盐水。最后,对大鼠实施安乐死,提取其肺组织,并将其保存在-80℃。
⑦RNA分离和实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)肺组织样本取自接受肺移植的IPAH患者和健康供体(对照组),并保存在-80℃直到使用。使用miRNeasy迷你试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从肺组织样本中提取总RNA,并使用NanoDrop 2000分光光度计在260/280nm处测定RNA纯度(比率=1.9:2.1)。
使用基于SYBR Green的RT-qPCR(TOYOBO,QPK201,大阪,日本)验证了miR-122-5p在PMECs、PASMCs、PCs以及大鼠和人类肺组织中的表达水平。RT-qPCR使用以下引物序列:逆转录引物,GTCGTATCCAGTGCAGGTCCGAGTATTCGCCACTGCGAGAAACA(SEQ ID NO:3);miR-122-5p,正向5’-ACACTCAGCGTGGGGAGTGCAATGG-3’(SEQ ID NO:4)和反向5’-GTGCAGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO:5);U6正向,5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO:6)和反向5’-AACGCTTCACGAATTTTGCGT-3’(SEQ ID NO:7)。
⑧统计工具和方法
以下标准用于筛选差异表达的miRNAs:p<0.05和|log2FC|>1。使用MiRanda和TargetScan共同进行统计分析,以识别和预测miRNAs靶向的差异表达的mRNAs。使用DAVID在线工具对差异表达的miRNAs-mRNAs进行功能富集分析。使用R软件包clusterProfiler对mRNA进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析。为了鉴定IPAH和健康对照组织样本之间差异表达的miRNA,使用t检验和R中的limma包,使用生物信息学软件(bioinformatics.com)绘制火山图,并使用R编写的内部程序执行其他计算程序。对于实时PCR分析,使用2-△△Ct方法,且p<0.05被认为具有统计学意义。使用SPSS进行ROC分析。
⑨结果
结合已知miRNA和新miRNA,我们鉴定了3116个miRNA。差异表达显示,与健康样本相比,IPAH中有75个显著差异表达的miRNAs(p<0.05和|log2FC|>1):62个上调的miRNAs和13个下调的miRNAs,并列出上调和下调的TOP前20个miRNAs(表1)。然后我们做了一个火山图,用R语言表示两组间miRNA表达的变化具有统计学意义(图1A)。最后,基于IPAH组与健康对照组间差异表达的miRNAs,采用无监督分层聚类分析构建热图(图2A)。
表1
我们在已知miRNA和新miRNA中鉴定了1535个miRNA。使用R语言的做火山图,显示两组之间miRNA表达的变化具有统计学意义(图1B)。其中,血浆中有90个显著差异表达的miRNA(p<0.05和|log2FC|>1):其中59个上调,21个下调。然后使用无监督分层聚类分析,基于这些差异表达的miRNAs构建热图(图2B)。列出了我们筛选出的TOP20上调和下调的miRNA(表1)。
根据表1,我们发现前20个不同上调或下调的miRNA存在重叠,只有miR-122-5p存在重叠。这可能表明,miR-122-5p可能在IPAH的发生发展中发挥重要作用。
为了进一步了解差异表达基因的功能,我们进行了GO分析。采用DAVID基因注释工具研究目的基因集在GO中的分布,阐明实验中样本基因功能差异的表达。具体来说,根据从基因注释中提取的富集调控的miRNAs,分析筛选BP、CC和MF(biological process,cellular component and molecular function)各亚组中GO失调的前30个过程。
PBMCs:为了解释被识别的miRNA可能调控的生理过程和通路,对其假定的靶基因进行GO和KEGG通路分析。不同miRNAs富集的前30个GO项主要集中在生物过程(转录、DNA模板化和转录调控、DNA模板化)、细胞成分(细胞质和细胞核)和分子功能(蛋白结合和金属离子结合)(图3A)。
血浆外泌体:为了解释被识别的miRNA可能调控的生理过程和通路,对其假定的靶基因进行GO term和KEGG通路分析。不同miRNAs富集的前30个GO项主要集中在生物过程(转录、DNA模板化和转录调控、DNA模板化)、细胞成分(细胞核和细胞质)和分子功能(金属离子结合和ATP结合)(图3B)。
总结分析:从图中可以看出,PBMCs和血浆外泌体GO富集分析的BP的TOP10高度相似,主要涉及DNA模板的转录过程及其调控过程,但也存在一些差异。如PBMCs具有GTPase活性、蛋白磷酸化和细胞抗原的正向调控,外泌体是细胞内信号转导、多细胞生物发育和G蛋白偶联受体信号通路。就CC而言,PBMCs和外泌体主要集中在核内、胞质、细胞质、质膜等,区别在于PBMCs高尔基体结构域和外泌体结构域,最后是MF,金属离子结合、ATP结合和DNA结合的表达尤为显著,差异在于PBMCs内的蛋白结合(极显著)。
KEGG通路分析显示,不同的miRNA在肿瘤的MAPK信号通路、内吞作用、局灶性黏附和通路中均有富集(图4A)。结果提示这些通路可能在IPAH的发病机制中起重要作用。KEGG通路分析显示,不同的miRNA在人乳头瘤病毒感染、钙信号通路、库欣综合征和催产素信号通路中富集(图4B)。结果提示这些通路可能在IPAH的发病机制中起重要作用。
通过比较患者和健康受试者血浆外泌体中miRNA的PBMCs和KEGG TOP20,可以发现两组均存在扩张性心肌病(DCM)、心律失常性右室心肌病(ARVC)、肥厚性心肌病(HCM)、诱导途径、昼夜节律传导和钙信号传导,但血浆外泌体的基因表达普遍高于PBMCs。此外,PBMCs中MAPK信号通路、内噬作用和黏着斑表达这两条通路也存在显著差异,这两条通路都是独立于血浆外泌体高表达的通路,即相同的通路在血浆外泌体中表达较差甚至不表达。这反映了病理PBMCs的特异性。同样,血浆外泌体的高特异性是人类乳头瘤病毒感染和库欣综合征等。
miRNA生物学的一个重要特征是,单个miRNA可以靶向数百个mRNA,从而调节整个蛋白质网络。相反,一个mRNA可以被多个miRNA靶向。我们使用Cytoscape软件绘制PBMCs和血浆外泌体的前300个miRNA-mRNA相互作用网络(图5和6),以研究它们的直接作用机制。
我们通过qPCR验证缺氧PMECs、PASMCs、PCs和肺组织中miR-122-5p的表达。在PMECs、PCs和大鼠、人的肺组织中,我们发现缺氧时miR-122-5p上调。然而,缺氧诱导的PASMCs中miR-122-5p下调。根据miRWalk数据库(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)中的miRNA信息,has-miR-122-5p序列为UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(SEQID NO:1),rat-miR-122-5p序列为UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(SEQ ID NO:2),两者高度保守。
ROC曲线分析结果中(图8和表2),使用PBMCs和血浆外泌体中的miR-122-5p表达量预测IPAH发病,曲下面积(AUC)分别为0.806和0.917,可见诊断效能较高。
表2
⑩讨论
肺动脉最初的损伤可能是遗传易感性和环境影响的结合。然而,IPAH发展的病理生理学是相同的,只是不同的生物标志物导致一系列事件,最终导致血管壁重建,这是一个重要的区别,因为了解潜在的细胞介质可以帮助指导靶向治疗。随着高通量测序、生化和计算生物学方法的出现,一些非编码RNA,如长链非编码RNA和miRNAs,被发现参与PAH的病理过程,其中一些被认为是诊断或治疗的靶点。高通量测序发现,IPAH外周血中有许多miRNAs发生改变。许多候选miRNAs可能在PAH中发挥重要作用。虽然已经在PAH中发现了大量的miRNA,但关于miRNA-mRNA相互作用在IPAH过程中的调控机制的报道很少。
基于我们的数据,我们发现只有一个miRNA(miR-122-5p)在PBMCs和血浆外泌体中共同高表达。miR-122-5p是一种重要的microRNA类型,其表达的改变可以影响下游靶基因及相关信号通路的功能改变,从而导致一系列疾病的发生发展。目前,miR-122-5p主要作用于细胞增殖、凋亡和迁移。miR-122-5p作为一种良好的高血压生物标志物,具有突出的诊断性能,其异常调节可能存在PAH的风险。另外,我们使用ROC曲线评价miR-122-5p对IPAH发病的诊断价值,无论在PBMCs和血浆外泌体中都发现有较高的诊断效能。
我们发现在BP、CC和MF中差异表达的基因显著调节GOs。我们选出了每个生物过程中最重要的10个GO。结果表明,在分子功能中,分别在转录、dna模板、细胞核和金属离子结合中富集最显著。遗憾的是,这些显著的功能在肺动脉高压疾病中尚未有详细的报道。
通过血浆外泌体和PBMCs中miRNA的表达,研究了富集途径与IPAH发病机制的关系。PBMCs中差异表达的miRNA主要与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、内吞作用和局灶性粘连有关。普遍的MAPK信号通路有四种不同的病例,以它们的MAPK层成分命名。细胞外信号相关激酶(ERK1/2),Jun氨基末端激酶(JNK1/2/3),p38-MAPK和ERK5。丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)。这些途径与细胞增殖、迁移、分化、衰老和凋亡的关系已被研究在心血管系统。MAPK通路的激活似乎是决定人微血管内皮细胞存活或经历程序性细胞死亡的关键事件对于癌症中的肿瘤细胞,多项研究证实,MAPK/ERK通路促进细胞增殖和迁移,而该通路抑制剂的加入促进肿瘤细胞的老化和凋亡。因此,我们可以推测,在肺动脉高压中,该信号通路可能对肺血管内皮细胞和平滑肌细胞有重要影响,并在整个疾病的发展包括预后中起关键作用,可作为肺动脉高压的诊断指标。此外,该信号通路主要与细胞迁移有关,是细胞迁移的必要条件。
与PBMCs中的差异miRNAs富集途径不同,血浆外泌体中的差异miRNAs主要涉及人乳头瘤病毒感染、钙信号通路和库欣综合征。其中,研究发现,在肺癌组织中已经检测到人类乳头瘤病毒感染。这项研究显示,女性暴露于人类乳头瘤病毒感染后,罹患肺癌的风险显著增加。根据相关研究,人乳头瘤病毒感染可能与肺癌的发生有关,我们推测它可能影响肺动脉高压的发病机制此外,血浆外泌体,肺动脉平滑肌细胞PASMCs细胞质Ca2+浓度的增加触发肺血管收缩,刺激PASMCs增殖,导致血管壁增厚PAH的潜在致病机制之一,是在PAH-PASMC中增强细胞内Ca2+信号,不仅诱导PASMC收缩和迁移,而且刺激PASMC增殖和抑制PASMC凋亡。
miRNA基因靶网络揭示了IPAH患者外泌体和PBMCs中不同表达的miRNA之间的关系。从PBMCs中miRNAs的靶基因网络结果,我们发现miR-122-5p的靶基因与miR-1205-5p和miR-149-5p存在重叠。miR-122-5p与miR-1205-5P的重叠靶基因为ZNF343。miR-122-5p和miR-149-5p的重叠靶基因为UNC93A。关于ZNF343和UNC93A的作用缺乏研究。miR-122-5p的作用是否通过znf343或UNC93A影响IPAH的发生,可能需要实验来验证。
我们发现,在IPAH中,miR-122-5P在PBMCs和外泌体中均上调。我们验证了miR-122-5p在缺氧的PMECs和PCs上的表达,与常氧的PMECs和PCs相比,miR-122-5p在缺氧的内皮细胞中表达上调。miR-122-5p对pc的影响在以前的报道中没有发现。但是,PMECs的结果与以前的报告一致。据报道,miR-122-5p在慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTEPH)中表达不同以往的研究中也有关于miR-122-5p的报道。此外,miR-122-5p在抑制血管分化和胶原合成中发挥了重要作用。此外,miR-122-5p在其他疾病中也有报道,miR-122-5p被报道为高血压的一个标志物。
总之,我们讨论了miRNA谱与肺动脉高压发病机制的相关性。IPAH患者组与健康组相比,PBMCs中有75个表达差异的miRNAs,其中62个表达上调,13个表达下调;血浆中有90个表达差异的miRNAs,其中59个表达上调,31个表达下调。其中,患者PBMCs和血浆外泌体中只有hmiR-122-5p的miRNA共上调。在验证结果中,我们发现与常氧相比,miR-122-5p在缺氧的PMECs、PASMCs、PCs和肺组织中显著表达。因此,无论是血浆还是PBMCs的miRNA都可能有更大的潜力作为IPAH的分子诊断标志物。这些差异的发现将有助于进一步探讨IPAH的发病机制和治疗机制。
以上所述仅为本发明较佳的实施例,并非因此限制本发明的实施方式及保护范围,对于本领域技术人员而言,应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案,均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种检测miR-122-5p的制剂在制备诊断特发性肺动脉高压的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述miR-122-5p为血浆外泌体中的miR-122-5p。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述miR-122-5p为外周血单个核细胞中的miR-122-5p。
4.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于,特发性肺动脉高压患者的miR-122-5p显著地表达上调。
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CN202210950430.4A Pending CN116356009A (zh) | 2022-08-09 | 2022-08-09 | 一种miR-122-5p的应用 |
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CN (1) | CN116356009A (zh) |
-
2022
- 2022-08-09 CN CN202210950430.4A patent/CN116356009A/zh active Pending
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