CN105759060A - 一种神经科中慢性神经退行性疾病特异性检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种神经科中慢性神经退行性疾病特异性检测试剂盒，所述试剂盒中的适体具有较强的结合特性和稳定性；该适体的获得是应用新的组合化学技术SELEX，以β?SNAPs为靶目标，从随机文库中筛选出了能与β?SNAPs特异性结合的适配子。本发明还涉及一种用于鉴定慢性神经退行性疾病的试剂盒，所述试剂盒能够快速鉴定慢性神经退行性疾病，可以大面积的推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种神经科中慢性神经退行性疾病特异性检测试剂盒。
背景技术
高度发达的脑是人类区别于世上其他生物的最显著标志之一。人类的记忆，认知，语言，个性和喜怒哀乐等无不与正常的脑功能密切相关。人脑一旦出现病变,这些功能就严重受损。由于脑内受损部位及病变机理的不同，病人可以表现为不同的神经症状，形成不同的神经疾病。神经退行性疾病(neurode2generativediseases)是一类慢性，进行性神经疾病。虽然这类疾病的病变部位及病因各不相同，但神经细胞退行性病变(neurodegeneration)是它们的共同点。该类疾病主要包括阿尔采默氏病(Alzheimerqsdisease,AD),帕金森病(Pakinsonqsdisease,PD)，Huntington舞蹈病(Huntingtondisease),不同类型脊髓小脑共济失调(spinalcerebellarataxias)，齿状核红核苍白球丘脑下核萎縮(dentatorubropallidoluysianatrophy)，肌萎縮侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis)及脊髓肌萎縮症(spinalmuscularatrophy)等。AD及PD主要发生于中、老年，随着人口老龄化，AD及PD的发病日益增多。目前，美国就有4百万人患有AD，每年因AD死亡的人数约十万，每年的医疗费用高达600亿美元。我国有关AD的流行病学研究尚不完善，一般认为65岁以上人群中痴呆的患病率约为4％。PD的患病率仅次于AD，主要发生于中年以上人群，65岁以上人群中患病率为2％。此外，Huntington舞蹈病，不同类型脊髓小脑共济失调，肌萎縮侧索硬化症及脊髓肌萎縮症等则可发生于不同年龄。
目前对于慢性神经退行性疾病(尤其是海绵状脑病和阿茨海默症)，在无症状期和早期发病阶段，还没有找到行之有效的检测手段。目前的检测手段仍停留在发病后组织样本的提取分析和死亡后的组织病理学检测。由于目前没有治愈运类疾病的方法，因此慢性神经退行性疾病的早期诊断对于人和动物的健康具有十分重大的意义。现有技术发现一种仅存在于脑组织中的蛋白N可溶性乙马来酷亚氨融合蛋白附着蛋白β型(β-SNAPs)，其表达和含量变化可W指示慢性神经退行性疾病的早期发生。但是现有技术的检测一般都是基于酶联免疫反应，效率不是非常高，准确性也有待提高，并且需要自备抗体，成本较高。
寡核苷酸适配子技术是近年来发展的一种新型的分子生物学技术，是采用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX)筛选获得的。SELEX技术是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，基本原理是运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，或得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers),具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高等优点，运用范围十分广泛。已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等。已有研究通过SELEX技术筛选到相应靶物质的适配子作为拮抗剂，适用于肿瘤生长时的血管内皮生长因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白和促生长因子等，已达到治疗目的。在微生物检测方面，特别是对一些未知的致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能以及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX过程筛选到与其相对应的适配子，检测靶物质，已成为该领域的研究探索热点。因此，采用selex技术，筛选特定的结合β-SNAPs的适配体，进而用于β-SNAPs的定量检测具有较好的研究前景。
发明内容
本发明的技术方案通过以下步骤实现：
本发明的目的是提供一种β-SNAPs的核酸适配体序列。
本发明中，所述的β-SNAPs的核酸适配体(序列1-22)能够特异结合β-SNAPs。
本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性结合β-SNAPs的试剂盒。
从体外合成的随机寡聚DNA文库，(5'-CGCAGCTAGAATAAGCCTAC-N36-AGATCATGAGCGAACGCAGA-3')，其中N36为36个随机寡核苷酸；从中筛选出与β-SNAPs特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物P1：CGCAGCTAGAATAAGCCTAC；引物P2：TCTGCGTTCGCTCATGATCT，进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。
本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以β-SNAPs为正筛靶标筛选与β-SNAPs特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合β-SNAPs的序列，本发明中命名为适配体β-SNAPs-1～22。序列如下：
本发明的适配子可以用于构建试剂盒，该试剂盒可以用于特异性的分离和定量检测β-SNAPs，具有分离效果快，效率高，节省时间，节约成本的功效。具有极强的应用价值。
本发明的有益效果：(1)获得了一种能够特异高效结合β-SNAPs的适配子。该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。(2)以核酸适配子为基础可以制备成为特异性检测β-SNAPs的试剂盒。
具体实施方式
实施例1:蛋白的制备
以Genbank：NP_001269947.1为模板，翻译获得相应的核苷酸序列，以人DNA为模板，以核苷酸序列的两端设计的引物扩增相应的目的基因。将PCR扩增片段与PQE30质粒分别进行双酶切(BamHI+HindIII)，使用T4DNA连接酶进行连接。将连接产物转化感受态克隆工程菌(E.coliTOPlO)，用LB-氨苄平板筛选重组子。培养重组细菌，提取质粒进行酶切和测序鉴定，获得正确构建的PQE30-rd8表达载体。使用PQE30-rd8表达载体转化表达工程菌(E.coliMl5)，筛选重组子，使LB-氨苄液体培养基培养至菌液0.D600达到0.6-0.8，加入0.lmmol/mlIPTG诱导表达，37℃继续培养菌。而后通过常规的蛋白纯化的方法，纯化得到人β-SNAPs蛋白，通过检测蛋白浓度为100mg/mL。
实施例2核酸适配体筛选
从体外合成的随机寡聚DNA文库，5'-CGCAGCTAGAATAAGCCTAC-N36-AGATCATGAGCGAACGCAGA-3'。
所用引物:
F：5，-CGCAGCTAGAATAAGCCTAC-3
R：5，-TCTGCGTTCGCTCATGATCT-3
(l)β-SNAPs蛋白溶于200μlPBS后加入96孔ELISA板中，4℃过夜。
(2)蛋白包被孔用PBS洗涤6次后，加入200μl3％BSA(购自上海生工)，孵育2小时。同时，空白96孔ELISA板中加入200μl3％BSA37℃孵育2小时。
(3)将随机ssDNA文库(首轮用量为800pmol)溶于200μl1*SHCMK，95℃变性5min。立即置于冰上10min，使其迅速降至室温，避免ssDNA复性成双链。
(4)将ssDNA加入PBS洗涤6次的空白ELISA孔中，37℃孵育2小时。
(5)上清转入PBS洗涤6次的蛋白包被孔中，37℃孵育2小时后PBS洗涤6次。
(6)结合了ssDNA的酶标孔用200μl洗脱缓冲液重悬，95℃加热5min，取上清，经过乙醇沉淀DNA，溶于Millipore水中，作为下一轮筛选的模板。
(8)取5μlPCR产物上样于5wt％琼脂糖(购自上海生工)，观察条带位置是否正确。从首轮之后，投入的ssDNA次级库的量逐渐减少，如此反复进行13个循环。
第13轮筛选产物的扩增和纯化：将第13轮筛选得到的ssDNA序列，用引物P1，引物P2进行扩增。100μlPCR扩增后体系加入500pl结合液BB(20mmol/LHepes(pH7.35)，120mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，lmmol/LCaC12，lmmol/LMgC12，l％BSA)，充分混匀。将上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中)，室温放置lmin，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液。加入700pmol漂洗WB(结合液BB+0.05％Tween20)，12000rpm离心30s，弃掉废液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。将吸附柱EC放回空收集管中，12000rpm离心2min。取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加20pmol65℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,OOOrpm离心lmin。将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心lmin。
PCR纯化产物的克隆：取1μl扩增产物，与载体PGM-T在T4DNA连接酶的作用下连接，再将其转化到感受态细胞，取适当体积均匀涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)(它们分别购自于上海生工)的LA平板，倒置培养皿，于37℃培养12-16小时进行"蓝-白斑筛选"。测序：用接种环挑取筛选平板上的单个白色菌落于含Amp的LB液体培养基，37℃培养过夜。取菌液lml于离心管中，封膜后送上海生工测序。
测序结果发现其中有22个核酸适配体序列与β-SNAPs具有非常强的亲和性，该22个序列分别是：SEQIDNO：1-22所示。
实施例2特异性高亲和力的β-SNAPs结合适配子的性能测定
将RNA适配子分别取1.5μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化1h，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度(1-200nM)的β-SNAPs蛋白37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与Β-SNAPS蛋白的解离常数。结果如下：
| 名称 | 解离常数Kd(nM) |
| β-SNAPS-1 | 11.23 --> |
| β-SNAPS-2 | 13.2 |
| β-SNAPS-3 | 12.6 |
| β-SNAPS-4 | 12.0 |
| β-SNAPS-5 | 12.8 |
| β-SNAPS-6 | 12.5 |
| β-SNAPS-7 | 14.0 |
| β-SNAPS-8 | 11.3 |
| β-SNAPS-9 | 10.8 |
| β-SNAPS-10 | 9.6 |
| β-SNAPS-11 | 9.7 |
| β-SNAPS-12 | 8.9 |
| β-SNAPS-13 | 11.3 |
| β-SNAPS-14 | 12.0 |
| β-SNAPS-15 | 12.4 |
| β-SNAPS-16 | 8.9 |
| β-SNAPS-17 | 8.7 |
| β-SNAPS-18 | 9.2 |
| β-SNAPS-19 | 11.2 |
| β-SNAPS-20 | 9.8 |
| β-SNAPS-21 | 7.9 |
| β-SNAPS-22 | 8.0 |
| PBS空白对照 | 无结合能力 |
实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析
从以上结果可以看出，本发明的22个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中也没有所述结合特性的适配子能够结合β-SNAPs蛋白。
分别采用人血白蛋白、NSF、α-SNAP、BRF蛋白和IgG与22条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与β-SNAPS蛋白结合保持较高的特异性。
将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。
实施例4临床试验分析
取46组临床血清样本，患有慢性神经退行性疾病的患者第1-44例作为实验样本，第45-46组为2例正常人。
将22个适配子分别与标准品β-SNAPs蛋白通过免疫磁珠分离的方式构建标准品检测的标准曲线。然后将46组临床血清样本分别取10μl加入到无菌离心管中，加入PBS溶液震荡溶解。分别将偶联有磁珠的22组适配子与46组的血清溶液混合孵育20分钟(一种适配子对应检测2组血清样本)，而后磁分离，即可获得相应的分离的β-SNAPs蛋白，通过标准曲线浓度检测发现，其检测的浓度与实际相符，比采用“双抗夹心法”检测试剂盒检测的浓度还要精确，由此可见，可以实现100％的定量检测效果。具有极高的准确性。其中，44组神经退行性疾病患者的β-SNAPs蛋白浓度明显高于对照的5组38％-90％，具有极大的差异显著性，结果如下：
从以上结果可以看出，β-SNAPs可以用于检测神经退行性疾病的患者，具有很好的鉴定效果和区分效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
〈110〉杜护侠
〈120〉一种神经科中慢性神经退行性疾病特异性检测试剂盒
〈210〉1
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-1
CGCAGCTAGAATAAGCCTACAATCCAACCCCTACATCTACATCACACTCCTATTCCAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉2
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-2
CGCAGCTAGAATAAGCCTACATAACTTTACTCCTATAAACCCAAACAACACACACAAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉3
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-3
CGCAGCTAGAATAAGCCTACCATTCTCATCCTCTCTCACCTACCCCTATCTCTACTAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉4
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-4
CGCAGCTAGAATAAGCCTACCCCTTTAACATATTAATCCTCACATCTTTTACATATAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉5
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-5
CGCAGCTAGAATAAGCCTACCTCAACCTTTTAAATTTTTTCCTTATACTCTCCCATAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉6
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-6
CGCAGCTAGAATAAGCCTACTCTTACACTCTCTTTTTAACCTCATCAATATTACATAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉7
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-7
CGCAGCTAGAATAAGCCTACATATCCATCACCTTCCCATATACATTCCCCAACATCAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉8
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-8
CGCAGCTAGAATAAGCCTACCTACCCAAAAATAATTATCCATATTCTACACATAATAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉9
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-9
CGCAGCTAGAATAAGCCTACTACTCATTCCCAATATTTATTAATATACTTCTAATCAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉10
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-10
CGCAGCTAGAATAAGCCTACCATCTATCCTCCATTTTCATTTACTAACCCCAAAATAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉11
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-11
CGCAGCTAGAATAAGCCTACCCCTCATCACATCCCTACACCCAAATTCACAATCCAAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉12
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-12
CGCAGCTAGAATAAGCCTACCTCAATCTTCACCTCTCATTACATTCCCTTTATCAAAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉13
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-13
CGCAGCTAGAATAAGCCTACAACTTACAATTCTCTTTTTAATCTCATACCATTATCAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉14
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-14
CGCAGCTAGAATAAGCCTACAATTTTACCTATAATAATAAATCTCTTCTATTCTTAAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉15
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-15
CGCAGCTAGAATAAGCCTACTCCAAAATCACCAACATCAAACAATCTTTTTCCTTAAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉16
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-16
CGCAGCTAGAATAAGCCTACCAAATCCTCTCATCTATTCTACCAATCTTACATTCAAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉17
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-17
CGCAGCTAGAATAAGCCTACCATCTTACATTCCTCCCTCAATTCCCTAACAACTACAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉18
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-18
CGCAGCTAGAATAAGCCTACACTACTCTCTCTCTAATCTACACCCCCACCATCTACAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉19
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-19
CGCAGCTAGAATAAGCCTACCTTTCTACATCCTCACTACCTATAAATACTACTTCTAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉20
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-20
CGCAGCTAGAATAAGCCTACTCCCCAATATCTCATTATTAACCACTTCCAAAATCTAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉21
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-21
CGCAGCTAGAATAAGCCTACAAAATACCAAATACTTATCACCCTCAACTTACATTTAGATCATGAGCGAACGCAGA
〈210〉22
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉β-SNAPs-22
CGCAGCTAGAATAAGCCTACCACTTTACACCTTTCCCAAATCCCAACAACCAATCCAGATCATGAGCGAACGCAGA
Claims (3)
1.一种慢性神经退行性疾病特异性检测试剂盒，其特征：其包含核酸适体。
2.如权利要求1所示的试剂盒，其特征在于:所述核酸适体序列如SEQIDNO：1-22任一项所示。
3.一种检测慢性神经退行性疾病的方法，其特征在于：使用权利要求1-2任一项所示的试剂盒。
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| ZHU LIN ET AL: "Downregulation of β-Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein：Proteomics-Based Identification in Early-Stage Prion Disease", 《NEURODEGENER DIS.》 * |
| 王旭 等: "适配子技术在中枢神经系统疾病中的研究进展", 《中风与神经疾病杂志》 * |
| 罗正良 等: "SELEX技术及其应用的研究进展", 《中国现代医生》 * |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |