CN117881797A - Rna翻译状态的单细胞分析 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于分析细胞中被翻译的RNA的方法和系统。本公开还提供了用于基于细胞(包括完整的组织内的细胞)中被翻译的RNA的概况来在受试者中诊断疾病或病症的方法。本公开还提供了筛选或测试能够调节一种或多种RNA的翻译的候选试剂的方法。本公开还提供了用于在有此需要的受试者中治疗疾病或病症的方法。本公开还描述了包含寡核苷酸部分的探针对和探针组，所述探针对和探针组可用于进行本文描述的方法。另外，本公开提供了包含本文描述的任何探针的试剂盒。

Description

RNA翻译状态的单细胞分析
相关申请
本申请要求根据35U.S.C§119(e)对2021年6月29日提交的美国临时申请U.S.S.N.63/216,315的优先权，所述临时申请通过引用并入本文。
背景技术
单个细胞中的转录概况与来自相同细胞的蛋白质组概况并不是始终一一对应的。这表明，在转录后水平上存在各种机制来调控蛋白质的产生和降解，包括一些尚未表征的机制。因此，mRNA水平是估计蛋白质产生的不完美指标，并且在定义细胞状态方面可能存在偏差。用于直接定量单细胞蛋白质组的额外方法可以提供功能上更相关的基础，以解释细胞类型和细胞类型对环境的特异性应答。细胞中的蛋白质产生的准确确定可用于研究一系列生理状态，甚至可用于治疗各种疾病，而且可用于药物开发。因此，需要额外和更好的用于准确定量单个细胞中的蛋白质产生的系统。
发明内容
本文描述了用于原位核糖体分析(即，被主动翻译的感兴趣的RNA的分析)的方法、组合物、试剂盒和系统。此类系统代表了一项关键技术，其通过定量/分析主动翻译的mRNA来缩小细胞的转录组和蛋白质组之间的差距。本文描述了一种基于邻位连接的策略，以原位实现RNA翻译状态的特异性和高通量表征，以作为单细胞蛋白质组的估计。本系统利用识别缀合到寡核苷酸探针的核糖体的试剂，所述寡核苷酸探针识别与被核糖体结合的mRNA分子退火的相应探针的序列(图1)。简而言之，本系统利用包含独特的分子条形码的探针或探针组来鉴定感兴趣的mRNA内的靶序列。随后，核糖体被与所述核糖体的一部分互补的引物的寡核苷酸序列部分结合，或被核糖体特异性一级抗体结合，所述一级抗体被缀合到DNA引物的二级抗体结合。将缀合到与核糖体的一部分互补的寡核苷酸序列或缀合到二级抗体(并且因此结合到核糖体)的DNA引物与探针连接。使用探针作为引物，通过滚环扩增来扩增感兴趣的mRNA，以产生可测量的序列信号。此外，抗体可经由抗体染色来检测，以提供空间信息。通过标记核糖体和定位感兴趣的mRNA，可以通过高度选择性的RNA-核糖体共定位来提取主动翻译的mRNA的精确空间信息，这是理解健康和疾病翻译时空模式的重要读数。可以探测核糖体和mRNA之间的相互作用，以确定感兴趣的mRNA的翻译。
因此，在一个方面，本公开提供了用于分析细胞中被翻译的RNA的方法(参见例如图1、3和6)。在本文公开的方法中，可以使细胞与一个或多个探针对或探针组接触，探针对或探针组在本文中进一步描述并且可以用于扩增(例如，通过滚环扩增)由核糖体主动翻译的RNA以产生一个或多个串联扩增子。然后，可以将一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中并测序以确定转录物的身份及其在聚合物基质内的位置(例如，通过如本文所进一步描述的SEDAL测序(通过动态退火和连接进行的误差减小的测序))。使用感兴趣的转录物的位置，可以对细胞中被翻译的RNA进行分析并获得时空信息，以提升本领域对翻译位置和时机如何影响健康和疾病中的细胞功能的理解。所述方法可用于比较例如来自病变和健康组织样品的一个细胞(或多个细胞)中的RNA翻译；或可用于比较例如用试剂处理的细胞和未处理的细胞中的RNA翻译。
重要地，本文描述的方法可以包括两个探针或三个探针，以用于在翻译期间分析mRNA分子。每种方法都可用于在翻译期间分析mRNA分子，但三探针方法已经被证明能产生更好的信号噪声比。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于分析细胞中被翻译的RNA的二探针方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中每个感兴趣的RNA的身份和位置。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于分析细胞中被翻译的RNA的三探针方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中每个感兴趣的RNA的身份和位置。
本文描述的方法、组合物和系统可用于研究组织(例如，正在发育的组织、正常组织、病变组织)中的RNA翻译，可用于诊断和治疗各种疾病，可用于研究目的，以及可用于药物发现。因此，在一个方面，本公开提供了用于在受试者中诊断疾病或病症(例如，癌症)的方法。例如，本文描述的用于分析被翻译的RNA的方法可以在取自受试者(例如，被认为患有疾病或病症的受试者或处于患有疾病或病症的风险中的受试者，或健康的受试者或被认为健康的受试者)的一个细胞上或多个细胞上进行。然后，可以将细胞中各种感兴趣的RNA的表达与非病变细胞或来自非病变组织样品的细胞(例如，来自健康个体的一个细胞或来自健康个体群体的多个细胞)中相同的感兴趣的RNA的表达进行比较。细胞的RNA翻译概况(包括单个感兴趣的RNA或多个感兴趣的RNA，例如特异性疾病特征)相对于一个或多个非病变细胞的任何差异都可以指示受试者患有疾病或病症。作为对照实验，可以将一个或多个非病变细胞(例如，正常细胞)中的RNA翻译与病变细胞中的表达一起进行分析。先前也可能已经对一个或多个非病变细胞(例如，正常细胞)中的RNA翻译进行了分析，并且可以将病变细胞中的表达与非病变细胞的该参考数据进行比较。
在另一方面，本公开提供了用于筛选能够调节一种或多种感兴趣的RNA的翻译的试剂的方法。例如，可以在存在一种或多种候选试剂的情况下，在细胞中进行本文描述的用于分析被翻译的RNA的方法。然后，可以将细胞(例如，正常细胞或病变细胞)中被翻译的各种感兴趣的RNA的表达与未暴露于一种或多种候选试剂的细胞中相同的感兴趣的RNA的表达进行比较。RNA翻译概况相对于未暴露于候选试剂的细胞中的翻译的任何差异可以指示一种或多种感兴趣的RNA的翻译(或潜在的转录)受到候选试剂的调节。在一些实施方案中，已知与疾病治疗相关的特定特征(例如，被翻译的多个感兴趣的RNA的特定特征)可以用于鉴定能够以期望的方式调节翻译并因此治疗疾病的其他试剂。本文描述的方法还可以用于鉴定具有某些副作用的药物，例如，当用候选试剂或已知药物处理一个或多个细胞时，通过寻找特异性RNA翻译特征来鉴定。本文描述的方法还可以用于鉴定可用于研究细胞翻译和蛋白质产生的基础生物学的研究试剂或化学探针。
在另一方面，本公开提供了用于在受试者中治疗疾病或病症(例如，癌症)的方法。例如，本文描述的用于分析被翻译的RNA的方法可以在来自取自受试者(例如，被认为患有疾病或病症的受试者，或处于患有疾病或病症的风险中的受试者)的样品的细胞中进行。然后，可以将细胞中被翻译的一种或多种RNA的概况与来自非病变组织样品的细胞中相同的感兴趣的RNA的翻译状态进行比较。然后，如果观察到RNA翻译概况相对于非病变细胞的任何差异，则可以将用于疾病或病症的治疗施用于受试者。作为对照实验，可以将一个或多个非病变细胞中的RNA翻译与病变细胞中的RNA翻译一起进行分析。先前也可能已经对一个或多个非病变细胞(例如，正常细胞)中的RNA翻译进行了分析，并且可以将病变细胞中的翻译与非病变细胞的该参考数据进行比较。
在一个方面，本公开提供了探针对，其包含第一探针(在本文中也被称为“挂锁”探针)和第二探针(在本文中也被称为“引物”探针)，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
在另一方面，本公开提供了寡核苷酸探针组，其包含第一探针(在本文中也被称为“挂锁”探针)、第二探针(在本文中也被称为“夹板探针”或“阻断探针”)和第三探针(在本文中也被称为“引物探针”)，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补。
在另一方面，本公开提供了试剂盒(例如，包含本文公开的探针对或探针组中的任何一种的试剂盒)。在一些实施方案中，试剂盒包含多个如本文所描述的探针对或探针组，它们各自可以用于鉴定被翻译的感兴趣的特异性RNA。本文描述的试剂盒还可以包括可用于进行本文描述的方法的任何其他试剂或组分，包括但不限于细胞、酶(如连接酶和/或聚合酶)、胺修饰的核苷酸、一级抗体、二级抗体、缓冲液、试剂(包括染料、染色剂等)和用于制造聚合物基质(例如，聚丙烯酰胺基质)的单体。
在另一方面，本公开提供了用于分析细胞中的RNA翻译的系统。在一些实施方案中，此种系统包含：
a)细胞；
b)一个或多个探针对，所述探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；以及
d)计算机。
在一些实施方案中，此种系统包含：
a)细胞；
b)一个或多个探针组，所述探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
c)显微镜；以及
d)计算机。
本文描述的任何探针(即，探针对或探针组)可以用于本公开所设想的系统。
应当认识到，前述概念和下文讨论的额外概念可以以任何合适的组合来排列，因为本公开不限于这方面。进一步地，当结合附图考虑时，本公开的其他优势和新颖特性将从以下各种非限制性实施方案的详细描述中显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步证明本公开的某些方面，其可以通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文呈现的特定实施方案的详细描述来更好地理解。
图1是原位表征/分析RNA翻译的方法的示意图。DNA缀合的二级抗体用于识别紧密接近的位于相同RNA上的挂锁探针，使其能够扩增。每个挂锁探针都含有独特的条形码，其编码RNA位点的身份。条形码信息通过滚环扩增来扩增，并且通过SEDAL原位测序来解码。
图2A-2D是原位RNA翻译的单细胞分析的图像。图2A示出了与图2B(无一级抗体)、图2C(不具有缀合的DNA的二级抗体)和图2D(无二级抗体)中的阴性对照相比的主动转录的β-肌动蛋白(ACTB)RNA的检测。
图3是使用核糖体抗体和三部分DNA探针的原位核糖体分析方法的示意图。DNA缀合的二级抗体用于识别紧密接近的位于相同RNA上的挂锁探针，使得能够连接。每个挂锁探针都含有独特的条形码，其编码RNA位点的身份。条形码序列通过滚环扩增来扩增，以得到最佳的可测量信号。所述方法与标记亚细胞细胞器(例如，内质网和线粒体)的免疫荧光染色相容。
图4A-4C是使用抗40S核糖体蛋白S3(RPS3)抗体的基于核糖体蛋白抗体的原位核糖体分析的图像。图4A示出了ACTB的原位核糖体分析信号。图4B示出了使用IgG代替抗RPS3抗体的阴性对照核糖体分析信号。图4C示出了非编码RNA转移相关肺腺癌转录物1(MALAT1)的原位核糖体分析信号。
图5A-5C是使用抗60S核糖体蛋白L4(RPL4)抗体的基于核糖体蛋白抗体的原位核糖体分析的图像。图5A示出了ACTB的原位核糖体分析信号。图5B示出了使用IgG代替抗RPL4抗体的阴性对照核糖体分析信号。图5C示出了非编码RNA MALAT1的原位核糖体分析信号。
图6是使用与rRNA和mRNA杂交的三部分DNA探针的原位核糖体分析方法的示意图。rRNA杂交探针用于识别紧密接近的位于相同RNA上的挂锁探针，使得能够连接。每个挂锁探针都含有独特的条形码，其编码RNA位点的身份。条形码信息通过滚环扩增来扩增，并且通过SEDAL原位测序来解码。所述方法与标记亚细胞细胞器(例如，内质网和线粒体)的免疫荧光染色相容。
图7A-7C是基于rRNA杂交的探针的原位核糖体分析方法的图像。图7A示出了ACTB的原位核糖体分析信号。图7B示出了使用不具有与核糖体内的rRNA杂交的部分的探针的阴性对照核糖体分析信号。图7C示出了非编码RNA MALAT1的原位核糖体分析信号。
图8示出了可用于本文描述的RNA分析方法的示例性探针的详细设计。
图9A-9J示出了用于亚细胞分辨率下mRNA翻译的原位分析的RIBOmap。图9A提供了RIBOmap的示意图。在制备样品(细胞系或组织样品)之后，将条形码挂锁探针对和引物与靶向细胞内RNA杂交，并且将夹板探针经由18S rRNA与核糖体杂交。夹板探针用作邻位连接的模板，以使挂锁探针环化。夹板探针设计有3’反向dT修饰，以阻断其在滚环扩增RCA期间的延伸。然后，可以扩增完整的挂锁探针，以原位生成胺修饰的DNA扩增子。接下来，经由组织水凝胶化学将这些DNA扩增子共聚合成水凝胶，以用于原位作图。然后，可以通过周期性原位动态退火和连接进行的误差减小的测序(SEDAL)读出cDNA扩增子中的基因特异性标识符序列(标记为“条形码”)。图9B示出了三探针策略的实例。(左)三探针样品的荧光图像示出了HeLa细胞中ACTB mRNA的RIBOmap信号。(中间)没有引物或夹板探针的阴性对照样品的荧光图像示出了最小的DNA扩增子信号。(右)使用没有rRNA杂交片段的夹板探针的对照样品的荧光图像没有示出DNA扩增子信号。比例尺，10μm。图9C示出了归一化为图9B中的DAPI信号的DNA扩增子信号强度的定量。误差条，标准偏差。n＝每个条件3个图像。学生t检验，**P<0.01。图9D提供了通过靶向mRNA(ACTB)和非编码RNA(MALAT 1和vtRNA1-1)进行的RIBOmap信号验证的示意性表示。图9E提供了示出STARmap的RNA检测结果的荧光图像和RIBOmap的RNA检测结果的翻译的荧光图像。比例尺，10μm。图9F示出了归一化为图9E中示出的DAPI信号的DNA扩增子信号强度的定量。误差条，标准偏差。n＝每个条件3个图像。学生t检验，****P<0.0001。图9G提供了通过三尖杉酯碱(Harringtonine)进行的翻译调控的示意图。图9H示出了靶向ACTB mRNA的不同位点的三个SNAIL探针对。探针对1在起始密码子附近，而探针对2和探针对3分别是CDS区中起始密码子下游的115nt和405nt。图9I提供了示出在三尖杉酯碱处理前后靶向HeLa细胞中ACTB mRNA的不同区域的3个探针组的RIBOmap信号的荧光图像。比例尺，10μm。图9J示出了归一化为图9I中示出的DAPI信号的RIBOmap信号强度的定量。误差条，标准偏差。n＝每个条件3个图像。学生t检验，**P<0.01。
图10A-10K示出了RIBOmap同时测量人HeLa细胞中981个基因的亚细胞翻译。图10A提供了在HeLa/FUCCI细胞中进行RIBOmap检测以测量定位的mRNA翻译的示意图。RIBOmap读出核糖体结合的mRNA信号，并且STARmap检测靶向RNA。将细胞器染色组合在程序中，以可视化细胞核、ER和细胞形态。图10B提供了示出HeLa细胞中FUCCI荧光信号、cDNA扩增子和细胞器染色信号的同时作图的代表性图像。左，RIBOmap(上方)和STARmap(下方)的细胞的FUCCI荧光成像结果。荧光信号指示HeLa细胞的细胞周期阶段。中间，示出了981个基因的第一测序周期的最大强度投影(MAX)的代表性图像，以及代表性细胞的放大视图和代表性细胞在6个测序周期期间的单帧视图。右：代表性细胞的细胞器染色信号的放大视图。根据所提供的图例示出ER的Alexa Fluor 594缀合物的伴刀豆球蛋A(ConA)染色、细胞形态的flamingo荧光染色和细胞核的DAPI染色。图10C示出了使用以下项确定的细胞周期阶段簇的扩散图嵌入：STARmap(左上)和RIBOmap(右上)测量的41个细胞周期标志物基因的单细胞表达概况，以及单体Kusabira-Orange 2(mKO2)-hCDT1和单体Azami-Green(mAG)–hGEN FUCCI细胞周期标志物的相应单细胞蛋白荧光概况(STARmap，左下；RIBOmap，右下)。图10D示出了单细胞翻译组共变矩阵，其示出了981个测量基因的细胞间变异的成对皮尔逊相关系数，以及它们的平均表达水平。矩阵中的灰色框指示五个强相关的基因模块，并且它们中的两个模块，模块3和5，在右侧放大。参与翻译复合物并被鉴定为细胞周期标志物的基因在放大的矩阵中被注释。图10E示出了成对共定位p值的矩阵，其在RIBOmap结果(左)和STARmap结果(右)中描述了两个基因的读段读段倾向于在相同细胞中在3-μm半径的球体中共存的程度，与这些基因的表达水平一同显示。STARmap矩阵使用与RIBOmap矩阵相同的基因顺序。矩阵中的灰色框指示五个强相关的基因模块。图10F示出了可视化五个基因模块中的每一个中最显著富集的GO条目(最大3个)的条形图。图10G示出了基因模块3和基因模块4的放大矩阵。图10H示出了模块3和模块4基因的RIBOmap信号的空间分布，其覆盖在ER图像上。图像是基因点和ER信号的MAX。图10I示出了模块3基因、模块4基因和所有检测到的基因的ER定位百分比的定量。Wilcoxon符号秩检验，****P<0.0001。图10J提供了示出空间参数距离比(DR)的计算的图形。图10K提供了m6A基因和非m6A基因的核糖体结合的RNADR和RNADR值的小提琴图。Wilcoxon符号秩检验，****P<0.0001。
图11A-11N示出了小鼠脑中5,413个基因的空间分辨单细胞翻译组分析。图11A提供了用于RIBOmap的靶向小鼠冠状半脑区域的图形(标记在方框中)。图11B提供了示出在小鼠冠状半脑切片中RIBOmap对5,413个基因的定位翻译的测量的代表性图像。(左)5,413个基因的第一轮测序的最大强度投影，同时示出了所有五个通道。正方形，放大区域。(中间)三个细胞的放大视图，其示出了第一轮测序的MAX视图。(右)三个细胞的放大视图，其示出了九轮测序期间单个z帧中扩增子的空间布置。图11C提供了三种细胞类型标志物基因的RIBOmap图像，其与示出相应基因的表达模式的Allen Brain ISH图像进行比较。图11D示出了从小鼠冠状半脑收集的62,753个细胞的翻译概况的统一流形逼近和投影(UMAP)图可视化。使用Leiden聚类法鉴定了57种细胞类型。图11E提供了代表性空间细胞类型地图集。(左)突出显示了成像的冠状小鼠脑切片的不同的脑区域的示意图。(中间)使用图11D的相同代码的成像的冠状半脑区域中的代表性空间细胞类型地图集。比例尺，500μm。(右)海马和CA1区域的放大部分，其示出了不同的细胞类型和间隙。比例尺，200μm。图11F提供了示出海马神经元的胞体和突起的海马切片的方案。图11G示出了CA1区域中示出胞体读段以及神经元和神经胶质突起读段的切片。比例尺，50μm。图11H示出了5,413个基因的RIBOmap测量中个体基因的突起读段百分比，基因基于其突起读段百分比按等级排序。九个实例基因被标记为插入。图11I示出了富含翻译基因的突起的前10个显著富集的GO条目。图11J示出了富含翻译基因的胞体的前10个显著富集的GO条目。图11K-11L示出了海马区域中实例富含翻译基因的突起(图11K)和富含翻译基因的胞体(图11L)的空间翻译图，示出了胞体读段和突起读段。图11M-11N示出了海马区域中富含翻译基因的突起(M)和富含翻译基因的胞体(N)的神经胶质细胞标志物基因实例的空间翻译图，其示出了胞体读段和突起读段。
图12A-12F示出了基于抗体的RIBOmap策略的实例。图12A提供了一种用于夹板探针缀合的蛋白A/G制备的合成方案。图12B示出了HeLa细胞中ACTB mRNA的基于抗核糖体蛋白S3(RPS3)抗体的RIBOmap信号。RPS3抗体与核糖体的小单位中的RPS3蛋白结合，并且将蛋白A/G缀合的夹板探针引到翻译mRNA。然后，靶向翻译mRNA的挂锁探针可以连接并扩增以原位生成胺修饰的DNA扩增子。图12C示出了HeLa细胞中ACTB mRNA的基于抗核糖体蛋白L4(RPL4)抗体的RIBOmap信号。图12D示出了HeLa细胞中ACTB mRNA的基于抗体的RIBOmap信号的IgG对照。图12E示出了归一化为图12B-12D中的DAPI的抗体辅助RIBOmap信号强度的定量。误差条，标准偏差。n＝每个条件3个图像。学生t检验，**P<0.01，***P<0.001。图12F示出了基于rRNA探针的RIBOmap策略和基于抗体的RIBOmap策略的信号噪声比的定量比较。误差条，标准偏差。n＝每个条件3个图像。学生t检验，**P<0.01。
图13A-13B示出了细胞周期相关变异的转录组学和翻译组学解析。图13A示出了在细胞周期阶段簇嵌入上的细胞周期标志物基因表达。图13B示出了在细胞周期阶段簇嵌入上的细胞周期标志物基因翻译。
图14A-14F示出了单细胞翻译组的共变分析。图14A示出了单细胞翻译组共变矩阵中鉴定的五个模块中的每一个模块中前三个显著富集的GO条目。图14B-14D示出了单细胞翻译组共变矩阵中鉴定的放大的模块1(图14B)、模块2(图14C)和模块4(图14D)。图14E提供了示出基因模块3(G2M标志物基因)和基因模块5(G1S标志物基因)之间的相关性的放大视图。图14F提供了示出细胞周期标志物基因模块和翻译机器基因模块之间的相关性的放大视图。
图15A-15F示出了共定位基因模块的蛋白质-蛋白质相互作用分析和空间分布。图15A示出了模块3(左)和模块4(右)中基因的String蛋白质网络分析。图15B示出了核糖体结合的RNA亚细胞共定位矩阵中放大的模块1(左)、模块2(右上)和模块5(右下)。图15C示出了模块1(上方)、模块2(中间)和模块5(下方)中基因的String蛋白质网络分析。图15D示出了模块1、模块2和模块5基因的RIBOmap信号的空间分布，其覆盖在ER图像上。图15E示出了模块1基因、模块2基因、模块5基因和所有检测到的基因的ER定位百分比的定量。Wilcoxon符号秩检验，****P<0.0001。图15F示出了共变分析的层次聚类矩阵上的共定位成对相关性p值。
图16A-16C示出了RIBOmap测量与原位杂交和免疫荧光的交叉验证。图16A提供了六个实例细胞标志物基因的RIBOmap图像，其与示出相应基因的表达模式的Allen BrainISH图像进行比较。图16B-16C示出了从RIBOmap获得的翻译概况、来自Allen Brain Atlas的原位杂交(ISH)数据和来自Sst(图16B)和Nefl(图16C)的HPABrain Atlas的基于抗体的免疫荧光(IF)分析。
图17A-17B示出了RIBOmap小鼠脑数据的质量控制和细胞类型标志物表达水平。图17A提供了示出在RIBOmap小鼠脑数据集的对数变换之后每个细胞中转录物和基因的数量的直方图。垂直线表示通过中位数绝对偏差(MAD)估计的过滤阈值。图17B提供了示出RIBOmap数据集中小鼠脑的主要细胞类型的经典标志物的表达水平的UMAP。
图18A-18D示出了基于单细胞翻译分析的细胞类型聚类。图18A示出了示出1-3级细胞聚类的细胞类型的层次分类法。图18B提供了1级聚类的统一流形逼近和投影(UMAP)图可视化，以将细胞分类为神经元细胞和神经胶质细胞。图18C提供了2级聚类的UMAP图可视化，以将细胞分类为兴奋性神经元、抑制性神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞、小神经胶质细胞和血管细胞。图18D提供了与2级聚类鉴定的细胞类型对齐的代表性标志物的基因表达热图。在每个细胞的所有基因中，对每个基因的表达进行z评分。
图19A-19C提供了兴奋性神经元的基因表达和空间图。图19A提供了与兴奋性神经元亚型对齐的代表性标志物的基因表达热图。在每个细胞的所有基因中，对每个基因的表达进行z评分。图19B示出了21种兴奋性神经元亚型的UMAP图可视化。图19C提供了成像的冠状半脑区域中兴奋性神经元亚型的空间细胞图，其中放大视图示出了皮层和海马区域中的空间细胞图。
图20A-20C提供了抑制性神经元的基因表达和空间图。图20A提供了与抑制性神经元亚型对齐的代表性标志物的基因表达热图。在每个细胞的所有基因中，对每个基因的表达进行z评分。图20B示出了18种抑制性神经元亚型的UMAP图可视化。图20C示出了成像的冠状半脑区域中抑制性神经元亚型的空间细胞图，其中放大视图示出了皮层和纹状体区域中的空间细胞图。
图21A-21C提供了神经胶质细胞的基因表达和空间图。图21A提供了与神经胶质细胞亚型对齐的代表性标志物的基因表达热图。在每个细胞的所有基因中，对每个基因的表达进行z评分。图21B示出了18种神经胶质细胞亚型的UMAP图可视化。图21C提供了成像的冠状半脑区域中神经胶质细胞亚型的空间细胞图，其中放大视图示出了皮层和海马区域中的空间细胞图。
图22A-22D提供了富含翻译基因的突起的实例的空间图。图22A-22B示出了海马区域中富含翻译基因的突起(图22A)和富含翻译基因的胞体(图22B)的额外实例的翻译空间图。示出了胞体读段和突起读段。图22C-22D提供了海马区域中富含翻译基因的突起(图22C)和富含翻译基因的胞体(图22D)的额外神经胶质细胞标志物基因实例的翻译空间图。示出了胞体读段和突起读段。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了用于本发明的许多术语的一般定义：Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nded.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger etal.(eds.),Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另有说明，否则如本文所用的以下术语具有赋予它们的含义。
术语“施用(administer、administering、administration)”是指将治疗或治疗剂或者治疗或治疗剂的组合物植入、吸收到、摄入、注入、吸入或以其他方式引入受试者体内或其上。
如本文所用的术语“扩增子”是指核酸(例如，RNA)，其是扩增反应(即，产生遗传片段或靶序列的一个或多个拷贝)或复制反应的产物。扩增子可以使用例如PCR或其他聚合反应来人工形成。术语“串联扩增子”是指接合在一起形成单个核酸分子的多个扩增子。串联扩增子可以例如通过滚环扩增(RCA)来形成，其中环状寡核苷酸被扩增以产生寡核苷酸的多个线性拷贝作为包含串联的多个扩增子的单个核酸分子。
“抗体”是指属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白。术语抗体和免疫球蛋白可互换地使用。在有一些例外的情况下，哺乳动物抗体通常由基本结构单位构成，每个基本结构单位都具有两条大的重链和两条小的轻链。有若干种不同类型的抗体重链和若干种不同种类的抗体，基于这些抗体所拥有的重链将它们一起分组成不同的同种型。已知哺乳动物中的五种不同的抗体同种型(IgG、IgA、IgE、IgD和IgM)，它们发挥着不同的作用，并且有助于为它们遇到的每种不同类型的异物引导适当的免疫应答。如本文所用的术语“抗体”还涵盖抗体片段和纳米抗体，以及抗体的变体，抗体片段和纳米抗体的变体。在一些实施方案中，抗体以用于疾病或病症的治疗施用(例如，与取自受试者的细胞中被翻译的RNA的概况的变化相关的抗体)。在一些实施方案中，抗体缀合到如本文所描述的寡核苷酸探针。在某些实施方案中，抗体与核糖体结合(例如，抗体是抗40S核糖体蛋白S3(RPS3)抗体或抗60S核糖体蛋白L4(RPL4)抗体)。
术语“癌症”(包括可以使用本文描述的方法进行研究、表征、诊断和/或治疗的癌症)是指一类疾病，其特征在于增殖不受控制的异常细胞的发育，并具有浸润和破坏正常身体组织的能力。参见，例如，Stedman’s Medical Dictionary,25th ed.；Hensyled.；Williams&Wilkins:Philadelphia,1990。癌症是增殖性疾病的一个实例。示例性癌症包括但不限于听神经瘤；腺癌；肾上腺癌症；肛门癌症；血管肉瘤(例如，淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、血管内皮瘤)；阑尾癌症；良性单克隆丙种球蛋白病；胆管癌症(例如，胆管细胞癌)；膀胱癌；乳腺癌症(例如，乳腺恶性腺瘤、乳腺乳头状癌、乳癌、乳腺髓样癌)；脑癌症(例如，脑膜瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤(例如，星形胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤)、髓母细胞瘤)；支气管癌症；类癌瘤；子宫颈癌症(例如，宫颈腺癌)；绒毛膜癌；脊索瘤；颅咽管瘤；结直肠癌(例如，结肠癌、直肠癌、大肠直肠腺癌)；结缔组织癌症；上皮癌；室管膜瘤；内皮肉瘤(例如，卡波西肉瘤、多发性特发性出血性肉瘤)；子宫内膜癌(例如，子宫癌、子宫肉瘤)；食管癌(例如，食管腺癌、巴雷特腺癌)；尤因肉瘤；眼部癌症(例如，眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)；常见的高嗜酸性粒细胞增多症；胆囊癌；胃癌(例如，胃腺癌)；胃肠道间质瘤(GIST)；生殖细胞癌症；头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、口腔癌(例如，口腔鳞状细胞癌)、喉癌(例如，喉肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、口咽癌)；造血癌症(例如，白血病，如急性淋巴细胞白血病(ALL)(例如，B细胞ALL、T细胞ALL)、急性髓细胞白血病(AML)(例如，B细胞AML、T细胞AML)、慢性髓细胞白血病(CML)(例如，B细胞CML、T细胞CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)(例如，B细胞CLL、T细胞CLL))；淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤(HL)(例如，B细胞HL、T细胞HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)(例如，B细胞NHL，如弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(例如，粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、淋巴腺边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞核淋巴瘤)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(即巨球蛋白血症)、毛细胞白血病(HCL)、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤和原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；以及T细胞NHL，例如前体T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病、周围T细胞淋巴瘤(PTCL)(例如，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)(例如，蕈样肉芽肿、Sezary综合征)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、淋巴结外自然杀伤T细胞白血病、肠病型T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤)；一种或多种如上文所描述的白血病/淋巴瘤的混合物；以及多发性骨髓瘤(MM))、重链疾病(例如，α链疾病、γ链疾病、mu链疾病)；血管母细胞瘤；下咽癌；炎性肌纤维母细胞肿瘤；免疫细胞淀粉样变；肾癌(例如，肾母细胞瘤(又称维尔姆斯瘤)、肾细胞癌)；肝癌(例如，肝细胞癌(HCC)、恶性肝瘤)；肺癌(例如，支气管源性癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌)；平滑肌肉瘤(LMS)；肥大细胞增多症(例如，系统性肥大细胞增多症)；肌肉癌症；骨髓增生异常综合征(MDS)；间皮瘤；骨髓增生性疾病(MPD)(例如，真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、特发性髓样化生(AMM)(又称为骨髓纤维化(MF))、慢性特发性骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)、嗜酸性粒细胞增多症(HES))；神经母细胞瘤；神经纤维瘤(例如，神经纤维瘤病(NF)1型或2型、神经鞘瘤病(schwannomatosis))；神经内分泌癌症(例如，胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NET)、类癌瘤)；骨肉瘤(例如，骨癌)；卵巢癌(例如，囊腺癌、卵巢胚胎性癌、卵巢腺癌)；乳头状腺癌；胰腺癌(例如，胰腺腺癌、导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)、胰岛细胞瘤)；阴茎癌症(例如，阴茎和阴囊Paget疾病)；松果体瘤；原始神经外胚层肿瘤(PNT)；浆细胞瘤形成；副肿瘤综合征；上皮内肿瘤；前列腺癌(例如，前列腺腺癌)；直肠癌；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；皮肤癌(例如，鳞状细胞癌(SCC)、角化棘皮瘤(KA)、黑色素瘤、基底细胞癌(BCC))；小肠癌症(例如，阑尾癌症)；软组织肉瘤(例如，恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、脂肪肉瘤、恶性周围神经鞘瘤(MPNST)、软骨肉瘤、纤维肉瘤、肌肉瘤)；皮脂腺癌；小肠癌；汗腺癌；滑膜瘤；睾丸癌(例如，精原细胞瘤、睾丸胚胎性癌)；甲状腺癌(例如，甲状腺乳头状癌、乳头状甲状腺癌(PTC)、甲状腺髓样癌)；尿道癌；阴道癌症；以及外阴癌(例如，外阴Paget疾病)。
如本文所用的“细胞”可以存在于细胞群体中(例如，组织、样品、活检、器官或类器官中)。在一些实施方案中，细胞群体由多种不同的细胞类型构成。用于本公开的方法的细胞可以存在于生物体内，存在于衍生自生物体的单个细胞类型内，或存在于细胞类型的混合物内。包括在内的是天然存在的细胞和细胞群体、基因工程化改造的细胞系、衍生自转基因动物的细胞、来自受试者的细胞等。实际上，任何细胞类型和大小都可以被容纳在本文描述的方法和系统中。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞(例如，复合的细胞群体，如天然存在的组织)。在一些实施方案中，细胞来自人。在某些实施方案中，通过医疗程序(如活检)从受试者(例如，人)收集细胞。替代地，细胞可以是培养的群体(例如，衍生自复合群体的培养物，或衍生自细胞已分化为多个谱系的单个细胞类型的培养物)。还可以在组织样品中原位提供细胞。
设想用于本公开的方法的细胞类型包括但不限于干细胞和祖细胞(例如，胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经嵴细胞等)、内皮细胞、肌肉细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和骨骼肌细胞、间充质细胞、上皮细胞、造血细胞、淋巴细胞(如T细胞(例如，Thl T细胞、Th2 T细胞、ThO T细胞、细胞毒性T细胞))和B细胞(例如，前B细胞)、单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、脂肪细胞、免疫细胞、神经元、肝细胞和与特定器官有关的细胞(例如胸腺细胞、内分泌腺细胞、胰腺细胞、脑细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、树突状细胞及其遗传修饰的细胞)。细胞还可以是不同类型的转化或赘生性细胞(例如，不同细胞来源的恶性上皮肿瘤、不同细胞类型的淋巴瘤等)或任何种类的癌细胞(例如，来自本文公开的任何癌症)。也设想了不同来源的细胞(例如，外胚层、中胚层和内胚层)用于本公开的方法。在一些实施方案中，细胞是小神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、兴奋性神经元或抑制性神经元。在一些实施方案中，多种细胞类型的细胞存在于相同的样品内。
术语“互补”在本文中用于指包含彼此氢键结合的碱基的两个寡核苷酸序列(例如，DNA或RNA)。两个寡核苷酸序列之间的互补性程度可以从完全互补性至无互补性变化。例如，两个寡核苷酸序列可以仅彼此部分互补(例如，在本文描述的探针中，其中仅探针的一部分与另一探针或与感兴趣的RNA互补)。两个寡核苷酸序列可以例如彼此70％或更多互补、彼此75％或更多互补、彼此80％或更多互补、彼此85％或更多互补、彼此90％或更多互补、彼此95％或更多互补、彼此96％或更多互补、彼此97％或更多互补、彼此98％或更多互补、彼此99％或更多互补或彼此100％互补。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”是指DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也被称为“核苷酸”)，并且意指两个或更多个核苷酸的任何链。多核苷酸可以是嵌合混合物或衍生物或其修饰的形式，并且可以是单链的或双链的。寡核苷酸可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链处进行修饰，例如，以改进分子的稳定性、其杂交参数等。
“蛋白质”、“肽”或“多肽”包含通过肽键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。所述术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。通常，蛋白质的长度为至少三个氨基酸。蛋白质可以是指个体蛋白质或蛋白质的集合。本发明的蛋白质优选地仅含有天然氨基酸，尽管可以替代地采用本领域已知的非天然氨基酸(即，在自然界中不存在但可以并入到多肽链中的化合物)和/或氨基酸类似物。此外，蛋白质中的一个或多个氨基酸可以例如通过添加化学实体，如碳水化合物基团、羟基基团、磷酸酯基团、法尼基团、异法尼基团、脂肪酸基团、用于缀合或功能化的接头或其它修饰来修饰。蛋白质还可以是单个分子，或可以是多分子复合物。蛋白质可以是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质可以是天然存在的、重组的、合成的或这些的任何组合。蛋白质还可以是治疗性蛋白质，其作为用于疾病或病症的治疗施用(例如，与取自受试者的细胞中被翻译的RNA的概况的变化相关的蛋白质)。在某些实施方案中，蛋白质是抗体。
“转录物”或“RNA转录物”是由RNA聚合酶催化的DNA序列转录产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的互补拷贝时，其被称为初级转录物，或其可以是衍生自初级转录物的转录后加工的RNA序列并被称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”是指不具有内含子并可以被细胞翻译成多肽的RNA。“cRNA”是指从重组cDNA模板转录的互补RNA。“cDNA”是指与mRNA模板互补并从其衍生的DNA。
术语“样品”或“生物样品”是指任何样品，其包括组织样品(如组织切片、手术活检和组织的穿刺活检)；细胞样品(例如，细胞学涂片(如巴氏涂片或血液涂片)或通过显微解剖获得的细胞样品)；或细胞级分、片段或细胞器(如通过裂解细胞并通过离心或其他方式分离其组分获得)。生物样品的其他实例包括但不限于血液、血清、尿液、精液、粪便、脑脊液、间质液、粘液、眼泪、汗液、脓、活检的组织(例如，通过手术活检或穿刺活检获得)、乳头抽吸物、奶、阴道分泌物、唾液、拭子(如口拭子)或含有衍生自第一生物样品的生物分子的任何材料。在一些实施方案中，生物样品是取自受试者的手术活检，例如本文描述的任何组织的活检。在某些实施方案中，生物样品是肿瘤活检(例如，来自被诊断出患有、被怀疑患有或被认为患有癌症的受试者)。在一些实施方案中，肿瘤活检捕获原代肿瘤细胞和组织以用于直接研究。在一些实施方案中，液体活检可以用在经由传统方法(例如，FACS、亲和捕获等)从血液或其他身体流体(CNS流体、淋巴液等)捕获和/或分选的肿瘤细胞上。在一些实施方案中，样品是脑组织。在一些实施方案中，组织是心脏组织。在一些实施方案中，组织是肌肉组织。
术语“小分子”是指分子量相对较低的天然存在的或人工创造的(例如，经由化学合成)分子。通常，小分子是一种有机化合物(例如，其含有碳)。小分子可以含有多个碳-碳键、立体中心和其他官能团(例如，胺、羟基、羰基和杂环等)。在某些实施方案中，小分子的分子量不超过约1,000g/mol、不超过约900g/mol、不超过约800g/mol、不超过约700g/mol、不超过约600g/mol、不超过约500g/mol、不超过约400g/mol、不超过约300g/mol、不超过约200g/mol或不超过约100g/mol。在某些实施方案中，小分子的分子量为至少约100g/mol、至少约200g/mol、至少约300g/mol、至少约400g/mol、至少约500g/mol、至少约600g/mol、至少约700g/mol、至少约800g/mol、至少约900g/mol或至少约1,000g/mol。上述范围的组合(例如，至少约200g/mol并且不超过约500g/mol)也是可能的。在某些实施方案中，小分子是治疗性活性剂，如药物(例如，获得美国食品和药物管理局批准的分子)。小分子还可以与一个或多个金属原子和/或金属离子复合。优选的小分子具有生物活性，因为它们在动物(优选哺乳动物并且更优选人)中产生生物效应。在某些实施方案中，小分子是药物。优选地，尽管不一定，药物是已经被适当的政府机构或监管机构认为在对人或动物的使用上安全有效的药物。
设想被施用的“受试者”是指人(即，任何年龄组的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童或青少年)或成年人受试者(例如，年轻人、中年人或老年人))或非人动物。在一些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，灵长类动物(例如，食蟹猴或恒河猴)或小鼠)。术语“患者”是指需要治疗疾病的受试者。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，患者是人。人可以是处于任何发育阶段的男性或女性。“需要”治疗疾病或病症的受试者或患者包括但不限于表现出疾病或病症的任何风险因素或症状的受试者或患者。在一些实施方案中，受试者是非人实验动物(例如，小鼠、大鼠、狗或非人灵长类动物)。
治疗或治疗剂的“治疗有效量”是足以在病况的治疗中提供治疗益处的量，或足以延缓或尽量减少与病况相关的一种或多种症状的量。治疗或治疗剂的治疗有效量意指在病况的治疗中提供治疗益处的疗法单独使用或与其他疗法组合使用时的量。术语“治疗有效量”可以涵盖改进整体疗法、减少或避免病况的症状、征兆或起因和/或增强另一治疗剂的治疗效果的量。
如本文所用，“组织”是来自相同来源的一组细胞及其细胞外基质。共同地，细胞执行特定的功能。多种组织类型缔合在一起形成器官。细胞可以是不同的细胞类型。在一些实施方案中，组织是上皮组织。上皮组织由覆盖器官表面(例如，皮肤、气道、软器官、生殖道和消化道内衬的表面)的细胞形成。上皮组织执行保护功能，并且还参与分泌、排泄和吸收。上皮组织的实例包括但不限于单层鳞状上皮、复层鳞状上皮、单层立方上皮、移行上皮、假复层上皮、柱状上皮和腺上皮。在一些实施方案中，组织是结缔组织。结缔组织是由非生命材料(例如，细胞外基质)分离的细胞构成的纤维组织。结缔组织为器官提供形状并将器官保持在适当的位置。结缔组织包括纤维结缔组织、骨骼结缔组织和流体结缔组织。结缔组织的实例包括但不限于血液、骨、腱、韧带、脂肪和蜂窝组织。在一些实施方案中，组织是肌肉组织。肌肉组织是由肌肉细胞形成的一种活性可收缩组织。肌肉组织的功能是产生力并引起运动。肌肉组织包括平滑肌(例如，如器官的内衬中所发现的)、骨骼肌(例如，如通常附着到骨骼的)和心肌(例如，如心脏中所发现的，它在心脏中收缩以将血液泵送到整个生物体中)。在一些实施方案中，组织是神经组织。神经组织包括包含中枢神经系统和周围神经系统的细胞。神经组织形成脑、脊髓、颅神经和脊神经(例如，运动神经元)。在某些实施方案中，组织是脑组织。在某些实施方案中，组织是胎盘组织。在一些实施方案中，组织是心组织。
术语“翻译组”是指特定细胞或生物体中的所有开放阅读框(即，落在起始密码子和终止密码子之间的DNA序列)。在一些实施方案中，本文提供的方法、探针和试剂盒可用于研究和/或分析翻译组。
术语“治疗(treatment、treat、treating)”是指逆转、减轻、延缓本文描述的疾病(例如，癌症)的发作，或抑制其进展。在一些实施方案中，可以在疾病的一个或多个征兆或症状已经出现或已经被观察到之后施用治疗(例如，预防性地(如本文中进一步所描述的)或在怀疑患上疾病或有疾病风险时)。在其他实施方案中，可以在不存在疾病的征兆或症状的情况下施用治疗。例如，可以在症状发作之前将治疗施用于易感受试者(例如，根据受试者或受试者的家庭成员的症状史)。还可以在症状消退之后继续治疗，例如，以延缓或防止复发。在一些实施方案中，可以在使用本文公开的方法并观察到与健康细胞或组织相比细胞或组织中被表达的RNA的概况发生变化之后施用治疗。
具体实施方式
本文描述的方面不限于具体的实施方案、系统、组合物、方法或配置，并且因此当然可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，除非本文中有明确定义，否则不意在进行限制。
本公开提供了用于分析细胞中被翻译的RNA的方法、组合物和系统。本公开还提供了用于基于细胞(包括完整的组织内的细胞)中被翻译的RNA的概况来在受试者中诊断疾病或病症的方法。本公开还提供了筛选或测试能够调节一种或多种RNA的翻译的候选试剂的方法。本公开还提供了用于在有需要的受试者中治疗疾病或病症的方法。本公开还描述了可用于进行本文描述的方法的寡核苷酸探针对和探针组，以及包含本文描述的任何寡核苷酸探针的试剂盒。
用于分析细胞中被翻译的RNA的方法
在一个方面，本公开提供了用于分析细胞中被翻译的RNA的方法。在本文公开的方法中，可以使细胞与一个或多个探针对或探针组接触，探针对或探针组在本文中进一步描述并且可以用于扩增由核糖体主动翻译的RNA以产生一个或多个串联扩增子。然后，可以将一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中并测序以确定转录物的身份及其在聚合物基质内的位置(例如，通过如本文所进一步描述的SEDAL)。使用感兴趣的转录物的位置，可以对细胞中被翻译的RNA进行分析。与先前公开的方法和系统相比，本文提供的方法具有若干优势，这些优势包括但不限于在不扰乱样品中亚细胞结构、细胞形态和/或组织结构的空间信息的情况下对样品中的RNA翻译进行分析的能力。
在一些实施方案中，本公开提供了用于分析细胞中被翻译的RNA的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中每个感兴趣的RNA的身份和位置。
本文公开的方法设想了使用包含第一探针和第二探针的探针对。第二探针(在本文中也被称为“引物探针”)包含识别核糖体(即，结合到感兴趣的RNA并主动翻译感兴趣的RNA的核糖体)的部分。探针的识别核糖体的部分可以是蛋白质、肽、核酸或小分子。在一些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分是结合抗体或抗体变体或片段的试剂。在某些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分包含抗体(例如，二级抗体)或抗体变体或片段。当第二探针的识别核糖体的部分是二级抗体时，所述方法可以任选地可以进一步包含使细胞与一级抗体接触，所述一级抗体识别核糖体并被第二探针的二级抗体识别。一级抗体可以识别核糖体的任何部分，例如，核糖体的任何蛋白质、核酸(例如，rRNA)或其组合。在一些实施方案中，一级抗体是抗40S核糖体蛋白S3(RPS3)抗体(例如，抗RPS3单克隆抗体)。在一些实施方案中，抗体是抗60S核糖体蛋白L4(RPL4)抗体(例如，抗RPL4多克隆抗体)。代替抗体，本公开还设想了使用能够识别本文描述的探针上的核糖体的任何试剂。一些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分包含与核糖体内的核糖体RNA(rRNA)的一部分互补的寡核苷酸。在一些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分包含与40S小核糖体亚基的一部分(包括例如18S rRNA)或与60S大核糖体亚基的一部分(包括例如5S rRNA、28S rRNA和5.8S rNA)互补的寡核苷酸。一些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分包含与18SrRNA的一部分互补的寡核苷酸。在某些实施方案中，与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或超过30个核苷酸。在某些实施方案中，与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为约25个核苷酸。
除识别核糖体的部分之外，第二探针还包含与第一探针的一部分互补的部分。第二探针的与第一探针的一部分互补的部分的长度为3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。本公开设想了第二探针的部分的任何排列。在一些实施方案中，用于本文描述的方法的第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’或
5’-[与第一探针互补的部分]-[识别核糖体的部分]-3’；
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[表示第二寡核苷酸探针的两个部分之间的直接键合(即，磷酸二酯键)。
用于本文描述的方法的第一探针(在本文中也被称为“挂锁”探针)包括由核苷酸的特异性序列构成的寡核苷酸条形码序列。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约3至约20、约5至约15、约6至约14、约7至约13、约8至约12或约9至约11个核苷酸。第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。本文描述的寡核苷酸探针的条形码可以包含用于鉴定被翻译的感兴趣的RNA的基因特异性序列(即，每个条形码序列与特定基因或转录物相关)。条形码在与本文描述的探针类似的探针上的使用进一步描述于例如2019年10月17日公布的国际专利申请公布号WO2019/199579和Wang etal.,Science 2018,361,380中，这两个文献通过引用以其整体并入本文。
第一探针还包含与第二探针互补的寡核苷酸部分和与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，第一探针的与感兴趣的RNA互补的部分为约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸长。在一些实施方案中，第一探针为约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40个核苷酸长或更长。本公开设想了第一寡核苷酸探针的部分以任何顺序的排列。在一些实施方案中，第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-3’或
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-3’或
5’-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第二探针互补的部分]-3’或
5’-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-3’或
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-[与第二探针互补的部分]-3’或
5’-[与第二探针互补的部分]-[条形码序列]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-3’；
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[表示第一探针的两个部分之间的直接键合(即，磷酸二酯键)。
在一些实施方案中，本公开提供了用于分析细胞中被翻译的RNA的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中每个感兴趣的RNA的身份和位置。
本文公开的方法设想了使用探针组，其包含第一探针、第二探针和第三探针。与没有使用第三探针的方法的实施方案相比，第三探针(在本文中也被称为“引物探针”)的添加可以导致特异性增加和/或脱靶扩增减少。
如本文所描述，第二探针(在本文中被称为“夹板探针”或“阻断探针”)包含识别核糖体(即，结合到感兴趣的RNA并主动翻译感兴趣的RNA的核糖体)的部分。在一些实施方案中，第二探针进一步包含聚合阻断剂。聚合阻断剂的添加防止第二探针在步骤(c)的扩增中被用作引物，确保第三探针在扩增期间被用作引物。第二探针上的聚合阻断剂可以是能够防止在本文描述的方法的步骤(c)的扩增中使用第二探针作为引物的任何部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂位于第二探针的3’端。聚合阻断剂可以是例如防止聚合酶使用第二探针作为用于聚合的引物的任何化学部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂是包含阻断的3’羟基基团(例如，包含3’羟基基团上的氧保护基团)的核酸残基。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替3’羟基基团的氢。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替防止额外核苷酸被添加的3’羟基基团的任何化学部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含反向核酸残基。在一些实施方案中，聚合阻断剂是反向腺苷、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟苷或尿苷残基。在一些实施方案中，聚合阻断剂是反向胸腺嘧啶残基。
除识别核糖体的部分之外，第二探针还包含与第一探针的一部分互补的部分。在一些实施方案中，第二探针的与第一探针的一部分互补的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。在一些实施方案中，第二探针的与第一探针的一部分互补的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在某些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分和第二探针的与第一探针互补的部分通过聚-A核苷酸接头接合。在一些实施方案中，聚-A核苷酸接头的长度为20-80、30-70或40-60个核苷酸(例如，长度为约50个核苷酸)。
本公开设想了第二探针的部分的任何排列。在一些实施方案中，用于本文描述的方法的第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’或
5’-[与第一探针互补的部分]-[识别核糖体的部分]-3’；
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[表示第二寡核苷酸探针的两个部分之间的直接键合。
在一些实施方案中，第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-[聚合阻断剂]-3’；
其中]-[包含任选的核苷酸接头。
用于本文描述的方法的第一探针(在本文中也被称为“挂锁”探针)包括由核苷酸的特异性序列构成的第一寡核苷酸条形码序列和第二寡核苷酸条形码序列。在一些实施方案中，第一探针上的第一和第二寡核苷酸条形码序列包含相同的核苷酸序列。第一寡核苷酸探针的第二条形码序列的存在可以增加本文描述的方法中感兴趣的RNA的检测的特异性(即，与使用不包含第二条形码序列的第一寡核苷酸探针进行的方法相比)。在本文描述的方法中，第一寡核苷酸探针的额外寡核苷酸条形码序列的使用还可以在本文所述的减少感兴趣的RNA的非特异性扩增的方法中发挥作用。这得到了实现，因为用于本文描述的方法的第三探针的寡核苷酸条形码序列与第一探针上的第一寡核苷酸条形码序列互补，从而使用第三探针作为引物，添加了在发生扩增之前所需的额外的特异性层。第一探针的与第三探针互补的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的与第三探针互补的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
第一探针还包含与第二探针互补的寡核苷酸部分和与感兴趣的RNA互补的部分。在一些实施方案中，第一探针的与第二探针互补的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的与第二探针互补的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在某些实施方案中，第一探针的与第二探针互补的寡核苷酸部分在第一探针的5’端和3’端之间分开。在一些实施方案中，第一探针的与感兴趣的RNA互补的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的与感兴趣的RNA互补的部分为约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的长度为约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40个核苷酸长或更长。
在一些实施方案中，第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[第一条形码序列]-[与第三探针的部分互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[第二条形码序列]-3’；
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[表示第一探针的两个部分之间的直接键合(即，磷酸二酯键)。
用于本文公开的方法的第三探针(在本文中也被称为“引物”探针)包括由核苷酸的特异性序列构成的条形码序列。在一些实施方案中，第三探针的条形码序列的长度为约3至约20、约5至约15、约6至约14、约7至约13、约8至约12或约9至约11个核苷酸。在一些实施方案中，第三探针的条形码序列的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在某些实施方案中，第三探针的条形码序列的长度为约10个核苷酸。
第三探针还包含与感兴趣的RNA互补的部分和与第一探针的一部分互补的部分。在一些实施方案中，第一探针和第三探针与感兴趣的RNA的不同部分互补并结合。在一些实施方案中，第三探针的与感兴趣的RNA互补的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。在一些实施方案中，第三探针的与感兴趣的RNA互补的部分为约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸长。在一些实施方案中，第三探针为约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40个核苷酸长或更长。在一些实施方案中，第三探针的与第一探针互补的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。在一些实施方案中，第三探针的与第一探针互补的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
在一些实施方案中，第三探针包含以下结构：
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-[条形码序列]-3’
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[表示第三探针的两个部分之间的直接键合。本公开设想了第三探针的部分的任何排列。
本公开设想了在本文公开的方法中使用任何类型的细胞(例如，本文描述的任何细胞类型)。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，细胞是人细胞。本公开还设想了同时在多个细胞上进行本文描述的方法(例如，同时在超过100个细胞、超过200个细胞、超过300个细胞、超过400个细胞、超过500个细胞、超过1000个细胞、超过10,000个细胞、超过20,000个细胞、超过30,000个细胞、超过40,000个细胞或超过50,000个细胞上)。在一些实施方案中，所述方法在相同细胞类型的多个细胞上进行。在一些实施方案中，所述方法在包含不同细胞类型的细胞的多个细胞上进行。其中被翻译的RNA可以使用本文公开的方法来分析的细胞类型包括但不限于干细胞、祖细胞、神经元细胞、星形胶质细胞、树突状细胞、内皮细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞、肌肉细胞、心肌细胞、间充质细胞、上皮细胞、免疫细胞、肝细胞、平滑肌细胞和骨骼肌细胞、造血细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、脂肪细胞和神经元。在某些实施方案中，一个或多个细胞存在于完整的组织(例如，本文描述的任何组织类型)内。在某些实施方案中，完整的组织是固定的组织样品。在一些实施方案中，完整的组织包含多种细胞类型。在某些实施方案中，组织是心脏组织、淋巴结组织、肝组织、肌肉组织、骨组织、眼组织或耳组织。在某些实施方案中，组织是脑组织。
在本文描述的方法中对其基因表达进行分析的感兴趣的RNA可以是已经从细胞的基因组DNA表达的转录物。在一些实施方案中，感兴趣的RNA是mRNA。本文描述的方法可以用于一次分析细胞中被翻译的一个RNA，或同时分析多个感兴趣的RNA。在一些实施方案中，同时对细胞或多个细胞中的RNA翻译进行超过1个、超过2个、超过3个、超过4个、超过5个、超过10个、超过20个、超过30个、超过40个、超过50个、超过100个、超过200个、超过500个、超过1000个、超过2000个、超过3000个RNA、超过4000个RNA或超过5000个RNA的分析。
在本文描述的方法中，在滚环扩增之后使用聚合物基质来促进细胞中被翻译的感兴趣的RNA的测序和成像。本公开设想了各种聚合物基质的使用，并且其中可以嵌入一个或多个串联扩增子的任何聚合物基质都适用于本文描述的方法。在一些实施方案中，聚合物基质是水凝胶(即，亲水性的交联聚合物网络)。在一些实施方案中，水凝胶是聚乙烯醇水凝胶、聚乙二醇水凝胶、聚丙烯酸钠水凝胶、丙烯酸酯聚合物水凝胶或聚丙烯酰胺水凝胶。在某些实施方案中，水凝胶是聚丙烯酰胺水凝胶。此种水凝胶可以例如通过以下方式来来制备：将样品在包含丙烯酰胺和双丙烯酰胺的缓冲液中孵育，去除缓冲液，并且将样品在聚合混合物(包含例如过硫酸铵和四甲基乙二胺)中孵育。
在一些实施方案中，进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸以产生一个或多个串联扩增子的步骤进一步包括提供用反应性化学基团修饰的核苷酸(例如，胺修饰的核苷酸，如5-(3-氨基烯丙基)-dUTP)。在一些实施方案中，用反应性化学基团修饰的核苷酸占用于扩增反应的核苷酸的约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。例如，进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸以产生一个或多个串联扩增子的步骤可以进一步包括提供胺修饰的核苷酸，如5-(3-氨基烯丙基)-dUTP。在扩增过程期间，在产生一个或多个串联扩增子时，将胺修饰的核苷酸并入到它们当中。将所得扩增子用伯胺功能化，所述伯胺可以与另一相容的化学部分(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)进一步反应，以促进将串联扩增子嵌入在聚合物基质中的步骤。在一些实施方案中，将一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中的步骤包括使一个或多个串联扩增子的胺修饰的核苷酸与丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，以及将一个或多个串联扩增子和聚合物基质共聚合。
本文公开的方法还包括对嵌入在聚合物基质中的串联扩增子进行测序的步骤。在一些实施方案中，测序的步骤包括进行“通过动态退火和连接进行的误差减小的测序”(SEDAL测序)。在一些实施方案中，对特定样品进行两次、三次、四次、五次或超过五次SEDAL。SEDAL测序进一步描述于Wang,X.et al.,Three-dimensional intact-tissuesequencing of single-cell transcriptional states.Science 2018,361,380以及2019年10月17日公布的国际专利申请公布号WO 2019/199579中，这两个文献各自通过引用并入本文。简而言之，向细胞提供包含可检测标记(即，可以用于例如通过成像可视化额外寡核苷酸探针的位置的任何标记)的寡核苷酸探针。在某些实施方案中，可检测标记是发荧光的(例如，荧光团)。额外的寡核苷酸探针与第一探针的寡核苷酸条形码序列互补，并且因此与感兴趣的RNA的身份有关联，并且可以用于鉴定细胞内感兴趣的RNA的位置。
用于本文描述的方法的额外寡核苷酸探针(例如，如SEDAL测序中所使用的)可以使用本领域已知的任何合适的成像技术来读出。例如，在其中额外的寡核苷酸探针包含荧光团的实施方案中，荧光团可以使用成像来读出以鉴定感兴趣的RNA。如上文所讨论的，额外的寡核苷酸探针包含与第一寡核苷酸探针上的条形码序列互补的序列，其用于检测感兴趣的特异性RNA。通过对包含荧光团的额外寡核苷酸探针的位置进行成像，可以确定样品内感兴趣的特异性RNA的位置。在一些实施方案中，成像的步骤包括荧光成像。在某些实施方案中，成像的步骤包括共焦显微术。在某些实施方案中，成像的步骤包括落射荧光显微术。在某些实施方案中，进行两轮成像。在某些实施方案中，进行三轮成像。在某些实施方案中，进行四轮成像。在某些实施方案中，进行五轮或更多轮成像。
在一些实施方案中，本文描述的用于分析RNA翻译的方法可以与用于分析细胞内的额外分子的方法组合。例如，可以使用不包含识别核糖体的部分的探针，将非翻译RNA的表达与RNA翻译一起进行分析。也可以将其他亚细胞位置中未被主动翻译的RNA与RNA翻译一起进行分析。也可以将蛋白质表达的分析(例如，使用传统的蛋白质组学方法)与本文描述的方法以及转录组、脂质和/或小分子的分析组合。在一些实施方案中，本文提供的任何方法进一步包括以下步骤：在细胞中过表达或敲除一个或多个基因以确定所述一个或多个基因是否参与调控感兴趣的RNA的翻译。
本文描述的任何方法还可以用于确定一个或多个细胞的细胞类型和/或细胞状态。在一些实施方案中，本文提供的任何方法进一步包括以下步骤：通过将一个或多个细胞的RNA翻译概况与包含各种细胞类型的细胞的RNA翻译概况的参考数据进行比较，确定被分析的细胞的细胞类型或多个被分析的细胞的细胞类型。在一些实施方案中，本文提供的任何方法进一步包括以下步骤：通过将一个或多个细胞的RNA翻译概况与包含各种细胞状态的细胞的RNA翻译概况的参考数据进行比较，确定被分析的细胞的细胞状态或多个被分析的细胞的细胞状态。
用于在受试者中诊断疾病或病症的方法
在另一方面，本公开提供了用于在受试者中诊断疾病或病症的方法。例如，本文描述的用于分析被翻译的RNA的方法可以在取自受试者(例如，被认为患有疾病或病症的受试者或处于患有疾病或病症的风险中的受试者，或健康的受试者或被认为健康的受试者)的一个细胞或多个细胞上进行。然后，可以将细胞中各种感兴趣的RNA的表达与非病变细胞或来自非病变组织样品的细胞(例如，来自健康个体的细胞或来自健康个体群体的多个细胞)中相同的感兴趣的RNA的表达进行比较。细胞的RNA翻译概况(包括单个感兴趣的RNA或多个感兴趣的RNA的翻译概况，例如特异性疾病特征)相对于一个或多个非病变细胞的任何差异都可以指示受试者患有疾病或病症。作为对照实验，可以将一个或多个非病变细胞中的RNA翻译与病变细胞中的表达一起进行分析。先前也可能已经对一个或多个非病变细胞中的RNA翻译进行了分析，并且可以将病变细胞中的表达与非病变细胞的该参考数据进行比较。
在一些实施方案中，用于在受试者中诊断疾病或病症的方法包括以下步骤：
a)使取自所述受试者的细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定每个感兴趣的RNA的身份和位置，以对所述细胞中被翻译的RNA进行分析，
其中所述细胞的RNA翻译概况相对于一个或多个非病变细胞的差异指示所述受试者患有所述疾病或病症。
在一些实施方案中，用于在受试者中诊断疾病或病症的方法包括以下步骤：
a)使取自所述受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中每个感兴趣的RNA的身份和位置；
其中所述细胞的RNA翻译概况相对于一个或多个非病变细胞的差异指示所述受试者患有所述疾病或病症。
在一些实施方案中，作为对照实验，使用本文公开的方法，同时将一个或多个非病变细胞中被翻译的RNA与取自受试者的细胞一起进行分析。在一些实施方案中，与病变细胞中的表达进行比较的一个或多个非病变细胞中被翻译的RNA的概况包含来自先前对一个或多个非病变细胞进行所述方法时的参考数据。
本文描述的方法设想了任何疾病或病症的诊断。在一些实施方案中，疾病或病症是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝疾病、脾疾病、肺疾病、血液疾病、神经系统疾病、精神疾病、胃肠道(GI)疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢性病症、免疫病症、中枢神经系统(CNS)病症或心血管疾病。在某些实施方案中，疾病是癌症。
在一些实施方案中，细胞存在于组织(例如，上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织)中。在一些实施方案中，组织是来自受试者的组织样品。在一些实施方案中，受试者是非人实验动物(例如，小鼠、大鼠、狗或非人灵长类动物)。在一些实施方案中，受试者是家养动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，组织样品包括固定的组织样品。在某些实施方案中，组织样品是活检(例如，骨、骨髓、乳房、胃肠道、肺、肝、胰腺、前列腺、脑、神经、肾、子宫内膜、宫颈、淋巴结、肌肉或皮肤活检)。在某些实施方案中，活检是肿瘤活检。在某些实施方案中，组织是脑组织。在某些实施方案中，组织来自中枢神经系统。
用于筛选能够调节一种或多种RNA的翻译的试剂的方法
在另一方面，本公开提供了用于筛选能够调节一种或多种感兴趣的RNA的翻译的试剂的方法。例如，可以在存在一种或多种候选试剂的情况下，在细胞中进行本文描述的用于分析被翻译的RNA的方法。然后，可以将细胞(例如，正常细胞或病变细胞)中被翻译的各种感兴趣的RNA的表达与未暴露于一种或多种候选试剂的细胞中相同的感兴趣的RNA的表达进行比较。RNA翻译概况相对于未暴露于候选试剂的细胞中的翻译的任何差异可以指示一种或多种感兴趣的RNA的翻译受到候选试剂的调节。在一些实施方案中，已知与疾病治疗相关的特定特征(例如，被翻译的多个感兴趣的RNA)可以用于鉴定能够以期望的方式调节翻译的候选试剂。本文描述的方法还可以用于鉴定具有某些副作用的药物，例如，当用候选试剂或已知药物处理一个或多个细胞时，通过寻找特异性RNA翻译特征来鉴定。
在一些实施方案中，本公开提供了用于筛选能够调节一种或多种RNA的翻译的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使正在用候选试剂处理或已经用候选试剂处理的细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定每个感兴趣的RNA的身份和位置，以对所述细胞中被翻译的RNA进行分析；
其中在存在所述候选试剂的情况下被翻译的RNA的概况相对于在不存在所述候选试剂的情况下的差异指示所述候选试剂调节一种或多种RNA的翻译。
在一些实施方案中，本公开提供了用于筛选能够调节一种或多种RNA的翻译的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使正在用候选试剂处理或已经用候选试剂处理的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中结合到核糖体的每个感兴趣的RNA的身份和位置，
其中在存在所述候选试剂的情况下被翻译的RNA的概况相对于在不存在所述候选试剂的情况下的差异指示所述候选试剂调节一种或多种RNA的翻译。
在一些实施方案中，候选试剂是小分子、蛋白质、肽、核酸、脂质或碳水化合物。在一些实施方案中，候选试剂包含已知药物或FDA批准的药物。在某些实施方案中，蛋白质是抗体。在某些实施方案中，所述蛋白质是抗体片段或抗体变体。在某些实施方案中，蛋白质是受体。在某些实施方案中，蛋白质是细胞因子。在某些实施方案中，核酸是mRNA、反义RNA、miRNA、siRNA、RNA适体、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)或反义寡核苷酸(ASO)。可以使用本文描述的方法筛选任何候选试剂。特别地，可以使用本文描述的方法筛选被认为能够调节一种或多种RNA的翻译的任何候选试剂。在一些实施方案中，候选试剂对一种或多种感兴趣的RNA的翻译的调节与减少、缓解或消除疾病或病症的症状，或防止疾病或病症的发展或进展相关。在一些实施方案中，由候选试剂调节的疾病或病症是是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝疾病、脾疾病、肺疾病、血液疾病、神经系统疾病、精神疾病、胃肠道(GI)疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢性病症、免疫病症、中枢神经系统(CNS)病症或心血管疾病。在某些实施方案中，由候选试剂调节的疾病或病症是癌症。
用于在受试者中治疗疾病或病症的方法
在另一方面，本公开提供了用于在受试者中治疗疾病或病症的方法。例如，本文描述的用于分析被翻译的RNA的方法可以在来自取自受试者(例如，被认为患有疾病或病症的受试者，或处于患有疾病或病症的风险中的受试者)的样品的细胞中进行。然后，可以将细胞中被翻译的一种或多种RNA的概况与来自非病变组织样品的细胞中相同的感兴趣的RNA的翻译状态进行比较。然后，如果观察到RNA翻译概况相对于非病变细胞的任何差异，则可以将用于疾病或病症的治疗施用于受试者。作为对照实验，可以将一个或多个非病变细胞中的RNA翻译与病变细胞中的RNA翻译一起进行分析。先前也可能已经对一个或多个非病变细胞中的RNA翻译进行了分析，并且可以将病变细胞中的翻译与非病变细胞的该参考数据进行比较。
在一些实施方案中，本公开提供了用于在受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法以下步骤：
a)使正在用候选试剂处理或已经用候选试剂处理的细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定每个感兴趣的RNA的身份和位置，以对所述细胞中被翻译的RNA进行分析；
其中在存在所述候选试剂的情况下被翻译的RNA的概况相对于在不存在所述候选试剂的情况下的差异指示所述候选试剂调节一种或多种RNA的翻译。
在一些实施方案中，本公开提供了用于在受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法以下步骤：
a)使正在用候选试剂处理或已经用候选试剂处理的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，以产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中结合到核糖体的每个感兴趣的RNA的身份和位置；
其中在存在所述候选试剂的情况下被翻译的RNA的概况相对于在不存在所述候选试剂的情况下的差异指示所述候选试剂调节一种或多种RNA的翻译。
在一些实施方案中，作为对照实验，使用本文公开的方法，同时将一个或多个非病变细胞中的RNA翻译进行分析。在一些实施方案中，与病变细胞中的翻译进行比较的一个或多个非病变细胞中的RNA翻译数据包含来自先前对非病变细胞进行所述方法时的参考数据。
可以将用于疾病或病症的任何合适的治疗施用于受试者。在一些实施方案中，治疗包含施用治疗剂。在一些实施方案中，治疗包含手术。在一些实施方案中，治疗包含成像。在一些实施方案中，治疗包含进行进一步的诊断方法。在一些实施方案中，治疗包含放射疗法。在一些实施方案中，治疗剂是小分子、蛋白质、肽、核酸、脂质或碳水化合物。在一些实施方案中，治疗剂是已知药物/或FDA批准的药物。在某些实施方案中，蛋白质是抗体。在某些实施方案中，蛋白质是抗体片段或抗体变体。在某些实施方案中，蛋白质是受体或其片段或变体。在某些实施方案中，蛋白质是细胞因子。在某些实施方案中，核酸是mRNA、反义RNA、miRNA、siRNA、RNA适体、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)或反义寡核苷酸(ASO)。
本文描述的方法设想了任何疾病或病症的治疗。在一些实施方案中，疾病或病症是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝疾病、脾疾病、肺疾病、血液疾病、神经系统疾病、胃肠道(GI)疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢性病症、免疫病症、中枢神经系统(CNS)病症、神经系统病症、眼睛疾病或心血管疾病。在某些实施方案中，疾病是癌症。
在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，样品包含生物样品。在一些实施方案中，样品包含组织样品。在某些实施方案中，组织样品是活检(例如，骨、骨髓、乳房、胃肠道、肺、肝、胰腺、前列腺、脑、神经、肾、子宫内膜、宫颈、淋巴结、肌肉或皮肤活检)。在某些实施方案中，活检是肿瘤活检。在某些实施方案中，活检是实体肿瘤活检。在一些实施方案中，组织样品是脑组织样品。在某些实施方案中，组织样品是中枢神经系统组织样品。
探针
本公开还提供了用于本文描述的方法和系统的探针对和探针组。在一个方面，本公开提供了探针对，其包含第一探针(在本文中也被称为“挂锁”探针)和第二探针(在本文中也被称为“引物”探针)，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
本文描述的所有探针可以任选地在每个所列举的组分之间具有各种核苷酸长度的间隔子或接头，或寡核苷酸探针的组分可以彼此直接接合(即，通过磷酸二酯键)。本文描述的所有探针可以包含标准核苷酸，或标准核苷酸中的一些可以取代本领域已知的任何修饰的核苷酸。
本文描述的探针对包含第一探针和第二探针。第二探针包含识别核糖体(即，结合到感兴趣的RNA并主动翻译感兴趣的RNA的核糖体)的部分。在一些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分是结合抗体或抗体变体或片段的试剂。在某些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分包含抗体(例如，二级抗体)或抗体变体或片段。当第二探针的识别核糖体的部分是二级抗体时，二级抗体可以与识别核糖体的一级抗体结合。在一些实施方案中，一级抗体是抗40S核糖体蛋白S3(RPS3)抗体。在一些实施方案中，一级抗体是抗60S核糖体蛋白L4(RPL4)抗体。代替抗体，本公开还设想了使用能够识别本文描述的探针上的核糖体的任何试剂。在一些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分包含与核糖体内的核糖体RNA(rRNA)的一部分互补的寡核苷酸。在一些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分包含与40S小核糖体亚基的一部分(包括例如18S rRNA)或与60S大核糖体亚基的一部分(包括例如5S rRNA、28S rRNA和5.8S rNA)互补的寡核苷酸。在一些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分包含与18S rRNA的一部分互补的寡核苷酸。在某些实施方案中，与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或超过30个核苷酸。在某些实施方案中，与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为约25个核苷酸。
本文描述的探针对的第一探针(在本文中也被称为“挂锁”探针)包括由核苷酸的特异性序列构成的寡核苷酸条形码序列。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为约3至约20、约5至约15、约6至约14、约7至约13、约8至约12或约9至约11个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。本文描述的寡核苷酸探针的条形码可以包含用于鉴定感兴趣的RNA(即，被核糖体翻译的RNA)的基因特异性序列。
第一探针还包含与第二探针互补的部分和与感兴趣的RNA互补的部分。本公开设想了第一寡核苷酸探针的部分以任何顺序的排列。在一些实施方案中，第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-3’；
其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[表示第一探针的两个部分之间的直接键合(即，磷酸二酯键)。
除识别核糖体的部分之外，第二探针还包含与第一探针的一部分互补的部分。本公开设想了第二探针的部分的任何排列。在一些实施方案中，本文描述的探针对的第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’；
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[表示第二寡核苷酸探针的两个部分之间的直接键合。
在另一方面，本公开提供了寡核苷酸探针组，其包含第一探针(在本文中也被称为“挂锁探针”)、第二探针(在本文中也被称为“夹板探针”或“阻断探针”)和第三探针(在本文中也被称为“引物探针”)，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补。
与本文描述的探针对相比，本公开所设想的探针组包含第三探针。与没有使用第三探针的实施方案相比，第三探针的添加可以导致特异性增加和/或脱靶扩增减少。如本文所描述，第二探针包含识别核糖体(即，结合到感兴趣的RNA并主动翻译感兴趣的RNA的核糖体)的部分。在一些实施方案中，第二探针进一步包含聚合阻断剂。聚合阻断剂的添加防止第二探针在步骤(c)的扩增中被用作引物，确保第三探针在扩增期间被用作引物。第二探针上的聚合阻断剂可以是能够防止在本文描述的方法的步骤(c)的扩增中使用第二探针作为引物的任何部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂位于第二探针的3’端。聚合阻断剂可以是例如防止聚合酶使用第二探针作为用于聚合的引物的任何化学部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂是包含阻断的3’羟基基团(例如，包含3’羟基基团上的氧保护基团)的核酸残基。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替3’羟基基团的氢。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含代替防止额外核苷酸被添加的3’羟基基团的任何化学部分。在一些实施方案中，聚合阻断剂包含反向核酸残基。在一些实施方案中，聚合阻断剂是反向腺苷、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟苷或尿苷残基。在某些实施方案中，聚合阻断剂是反向胸腺嘧啶残基。
除识别核糖体的部分之外，第二探针还包含与第一探针的一部分互补的部分。在一些实施方案中，第二探针的与第一探针的一部分互补的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。在一些实施方案中，第二探针的与第一探针的一部分互补的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在某些实施方案中，第二探针的识别核糖体的部分和第二探针的与第一探针互补的部分通过聚-A核苷酸接头接合。在一些实施方案中，聚-A核苷酸接头的长度为20-80、30-70或40-60个核苷酸(例如，长度为约50个核苷酸)。
本公开设想了第二探针的部分的任何排列。在一些实施方案中，第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’；
其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[表示第二寡核苷酸探针的两个部分之间的直接键合。
在一些实施方案中，第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-[聚合阻断剂]-3’；
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。
本文描述的探针组的第一探针(在本文中也被称为“挂锁”探针)包括由核苷酸的特异性序列构成的第一寡核苷酸条形码序列和第二寡核苷酸条形码序列。在一些实施方案中，第一探针上的第一和第二寡核苷酸条形码序列包含相同的核苷酸序列。第一寡核苷酸探针的第二条形码序列可以增加本文描述的方法中感兴趣的RNA的检测的特异性(即，与使用不包含第二条形码序列的第一探针进行的方法相比)。第一寡核苷酸探针的额外寡核苷酸条形码序列的使用还可以在减少被核糖体翻译的感兴趣的RNA的非特异性扩增方面发挥作用。这得到了实现，因为第三探针的寡核苷酸条形码序列与第一探针上的第一寡核苷酸条形码序列互补，从而使用第三探针作为引物，添加了在发生扩增之前所需的额外的特异性层。在一些实施方案中，第一探针的与第三探针的一部分互补的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的与第三探针的一部分互补的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
第一探针还包含与第二探针互补的寡核苷酸部分和与感兴趣的RNA互补的部分。在一些实施方案中，第一探针的与第二探针的一部分互补的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的与第二探针的一部分互补的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在某些实施方案中，第一探针的与第二探针互补的寡核苷酸部分在第一探针的5’端和3’端之间分开。在一些实施方案中，第一探针的与感兴趣的RNA互补的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。在一些实施方案中，第一探针的与感兴趣的RNA互补的部分为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸长。在一些实施方案中，第一探针为约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40个核苷酸长。在一些实施方案中，第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[第一条形码序列]-[与第三探针的部分互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[第二条形码序列]-3’；
其中]-[包含任选的接头(例如，核苷酸接头)。在一些实施方案中，]-[表示第一探针的两个部分之间的直接键合(即，磷酸二酯键)。
本文公开的探针组的第三探针(在本文中也被称为“引物”探针)包括由核苷酸的特异性序列构成的条形码序列。在一些实施方案中，第三探针的条形码序列的长度为约3至约20、约5至约15、约6至约14、约7至约13、约8至约12或约9至约11个核苷酸。在一些实施方案中，第三探针的条形码序列的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在某些实施方案中，第三探针的条形码序列的长度为10个核苷酸。
第三探针还包含与感兴趣的RNA互补的部分和与第一探针的一部分互补的部分。在一些实施方案中，第一探针和第三探针与感兴趣的RNA的不同部分互补并结合。在一些实施方案中，第三探针的与感兴趣的RNA互补的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。在一些实施方案中，第三探针的与感兴趣的RNA互补的部分为约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸长。在一些实施方案中，第三探针为约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40个核苷酸长。在一些实施方案中，第三探针的与第一探针的一部分互补的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。在一些实施方案中，第三探针的与第一探针的一部分互补的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
在一些实施方案中，第三探针包含以下结构：
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-[条形码序列]-3’
其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，]-[表示第三探针的两个部分之间的直接键合。本公开设想了第三探针的部分的任何排列。
在一些实施方案中，本公开提供了包含如本文所描述的探针对的多个探针。在一些实施方案中，本公开提供了包含如本文所描述的探针组的多个探针。在某些实施方案中，多个探针中的每个探针对或组包含与不同感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。
试剂盒
本公开还提供了试剂盒。在一个方面，所提供的试剂盒可以包含如本文所描述的一种或多种探针。在一些实施方案中，试剂盒包含本文描述的任何探针对或多个探针对。在一些实施方案中，试剂盒包含本文描述的任何探针组或多个探针组。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含容器(例如，小瓶、安瓿、瓶子和/或分配器包装，或其他合适的容器)。试剂盒还可以包含用于进行对照实验的细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含用于进行本文公开的方法的其他试剂(例如，酶(如连接酶或聚合酶)、如本文所描述的胺修饰的核苷酸、一级抗体、二级抗体、缓冲液和/或用于制造聚合物基质(例如，聚丙烯酰胺基质)的试剂和单体)。在一些实施方案中，试剂盒可用于分析细胞中的基因和蛋白质表达。在一些实施方案中，试剂盒可用于在受试者中诊断疾病。在一些实施方案中，试剂盒可用于筛选能够调节RNA翻译的试剂。在一些实施方案中，试剂盒可用于在受试者中诊断疾病或病症。在一些实施方案中，试剂盒可用于在受试者中治疗疾病或病症。在某些实施方案中，本文描述的试剂盒进一步包括试剂盒使用说明书。
系统
在一个方面，本公开提供了用于分析细胞中被翻译的RNA的系统。在一些实施方案中，此种系统包含：
a)细胞；
b)一个或多个探针对，所述探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；以及
d)计算机。
在一些实施方案中，此种系统包含：
a)细胞；
b)一个或多个探针组，所述探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
c)显微镜；以及
d)计算机。
本文描述的任何探针(即，探针对或探针组)可以用于本公开所设想的系统。在一些实施方案中，显微镜是共焦显微镜。在一些实施方案中，系统进一步包含CPU。在一些实施方案中，系统进一步包含计算机存储器和/或储存器，或存储设备。在一些实施方案中，系统进一步包含照相机。在一些实施方案中，系统进一步包含CCD。在一些实施方案中，系统进一步包含用于进行显微镜术和/或用于图像分析的软件。在一些实施方案中，系统进一步包含连接酶。在一些实施方案中，系统进一步包含聚合酶。在一些实施方案中，系统进一步包含胺修饰的核苷酸。在一些实施方案中，系统进一步包含用于制造聚合物基质(例如，聚丙烯酰胺基质)的试剂。本公开的系统中的细胞可以属于本文公开的任何细胞类型。在一些实施方案中，系统包含多个细胞。在一些实施方案中，细胞属于不同的细胞类型。在一些实施方案中，细胞存在于组织中。在一些实施方案中，组织是受试者所提供的组织样品或来自受试者。在某些实施方案中，受试者是人。
实例
实例1：原位RNA翻译状态的单细胞分析
原位核糖体分析用于可视化β-肌动蛋白(ACTB)mRNA的主动翻译(图2A-2D)。寡核苷酸缀合的核糖体抗体将核糖体的结合转换为可扩增的引物，其可以很容易地被扩增并通过荧光方法进行检测。挂锁探针池被设计为将靶向序列段转换成独特的条形码。然后进行组合的和顺序的SEDAL测序轮次，以读出条形码并破译mRNA的身份和该mRNA上核糖体的数量。
为了进一步改进原位核糖体分析的检测特异性，开发并利用了三部分探针策略(图3)。抗核糖体抗体缀合的DNA探针在3’端被阻断，并且因此只可以用于挂锁探针连接。然后，可以使用与邻近位点杂交的引物探针来扩增完整的挂锁探针，以生成DNA扩增子。因此，只有核糖体结合的RNA才会生成cDNA扩增子，而未被核糖体结合的mRNA不能被连接或扩增。每个基因的身份被编码在挂锁和引物探针中，并通过SEDAL原位测序读出。为了获得亚细胞定位信息，将细胞器染色并入到原位核糖体分析程序中(图3)。总体而言，使用这种改进的策略可以获得具有亚细胞定位信息的高特异性原位单细胞翻译状态。
真核核糖体由小的40S亚基和大的60S亚基组成，这两个亚基总共含有大约80种结构上不同的蛋白质。利用靶向小亚基蛋白RPS3(核糖体蛋白S3)和大亚基蛋白RPL4(核糖体蛋白L4)二者的抗体来测试三探针原位核糖体分析方法。抗RPS3抗体和抗RPL4抗体都被示出为在这种方法中起作用(图4A-4C和5A-5C)。观察到使用抗RPS3抗体或抗RPL4抗体的ACTB的强原位核糖体分析信号(图4A和5A)，而使用免疫球蛋白G(IgG)作为抗体的阴性对照样品示出了弱信号(图4B和5B)。还测试了非编码转移相关肺腺癌转录物1(MALAT1)RNA，并且使用抗RPS3或抗RPL4抗体中的任一种观察到的MALAT1信号很少(图4C和5C)，这支持了这种方案将特异性地检测翻译mRNA而不是非编码RNA的假设。
本文描述的基于抗体的原位核糖体分析方法可以准确地检测核糖体结合的mRNA；然而，程序依赖于抗核糖体抗体的特异性，并且需要额外的抗体-DNA缀合步骤。由于核糖体由核糖体RNA(rRNA)和核糖体蛋白组成，因此开发了利用rRNA杂交的探针进行挂锁探针连接的程序，以避免抗体结合步骤(图6)。程序利用了本文描述的三探针策略，并且其也与本文描述的两探针策略相容。与基于抗体的方案相似，rRNA杂交的探针在3’端被阻断，并且不能用作滚环扩增的引物。与18S rRNA杂交的探针用于测试原位核糖体分析方法。已发现，与前面提及的方案相比，这种程序可给出最佳的信号噪声对比(图7A-7C)。在细胞膜附近观察到ACTB的强原位核糖体分析信号(图7A)，这与ACTB RNA的定位翻译一致。利用不具有rRNA杂交部分的探针或靶向非编码MALAT1基因的探针的阴性对照样品都示出了极小的信号(图9B和9C)。
实例2：亚细胞分辨率下的空间分辨单细胞翻译组学
mRNA翻译的精确空间控制是细胞生理学的转录后和翻译基因调控的必要部分。然而，在单个细胞中在翻译组学水平上系统研究定位的mRNA翻译仍然是一个重大挑战。因此，本文描述了RIBOmap的发展。RIBOmap是一种三维(3D)原位分析方法，用于在完整的细胞和组织中在亚细胞分辨率下同时检测数千个基因的mRNA翻译。使用RIBOmap，对人HeLa细胞中的981个基因进行作图，从而揭示了细胞周期依赖性和亚细胞定位翻译。此外，用62,753个细胞的空间细胞地图集创建成年小鼠脑组织中5,413个基因的单细胞空间翻译组。还检测到神经元和神经胶质细胞中的局部翻译。共同地，RIBOmap呈现了第一个空间分辨单细胞翻译组学技术，促进了在亚细胞架构、细胞状态和组织解剖学的背景下对定位的蛋白质合成的理解。总体而言，RIBOmap使得能够在完整的细胞和组织中同时对数千个基因的mRNA翻译进行3D单细胞原位分析。
细胞蛋白是执行细胞功能和塑造细胞类型和状态的基因表达的最终产物，并且以单细胞和空间分辨率测量全基因组翻译模式是最优先考虑的目标，其可能改变对异质细胞类型和状态中的翻译调控的理解。虽然大规模的单细胞或空间分辨蛋白质组分析仍然具有挑战性(1)，但使用mRNA水平来推断单个细胞中的相应蛋白质丰度已经是一种常见的实践。然而，基因表达在转录和翻译水平上都受到调控，并且许多研究已得出结论，mRNA和蛋白质水平之间的相关性很低(2–5)。此外，许多基因在特定的亚细胞场所经受定位翻译(6)。因此，为了全面理解翻译控制，需要用于对蛋白质合成进行可扩展的单细胞和空间分辨分析的方法。
现有的大批细胞和单细胞核糖体分析方法已经使得能够在转录组分析蛋白质翻译(7–12)。然而，这些方法无法保存亚细胞结构、细胞形态或组织结构的空间信息，从而限制了在空间水平上绘制蛋白质合成的能力。相比之下，可以通过物理坐标追踪mRNA翻译的基于成像的方法(13–19)一次限于一个基因。因此，以亚细胞分辨率在单个细胞中实现高度多路复用空间核糖体分析仍然具有挑战性。为了填补这一空白，本文描述了一种新的3D原位作图方法(RIBOmap)，其用于以亚细胞分辨率进行蛋白质和基因表达的高度多路复用绘制。用RIBOmap在完整的细胞中对981个基因的蛋白质合成进行了分析，并且开发了计算管线以分析局部翻译的亚细胞模式。RIBOmap还被应用于在亚细胞分辨率下对完整的小鼠脑组织中的5,413个基因进行分析，从而揭示了细胞类型和组织区域中蛋白质合成的空间模式。
RIBMap建立在一种靶向测序策略的基础上，所述策略使用独特的三探针设计，其选择性地检测和扩增核糖体结合的mRNA，随后进行水凝胶组织嵌入和高度多路复用原位测序读出(20)。特别地，RIBOmap三探针组包括：(1)夹板DNA探针，其与核糖体RNA(rRNA)杂交并用作夹板，以使附近的挂锁探针环化(参见下文)；(2)挂锁探针，其靶向感兴趣的特异性mRNA种类并编码基因独特标识符；以及(3)引物，其靶向相同的mRNA上的挂锁探针的相邻位点并用作引物，以使得能够通过滚环扩增(RCA)来扩增环化挂锁探针，从而产生DNA纳米球(扩增子)。重要地，引物-挂锁探针的基因特异性杂交对排除了由单个探针的非特异性杂交引起的假阳性信号(20)(图9A)。共同地，当所有三种探针都以邻位的形式存在时，RNA的信号将仅被扩增为DNA扩增子(图9B和9C)。随后使用组织-水凝胶缀合化学将DNA扩增子原位嵌入在聚丙烯酰胺水凝胶基质中(20)。然后，通过由动态退火和连接进行的误差减小的原位测序(SEDAL，图9A)解码DNA扩增子中的基因独特条形码(20)。
还设计了用于RIBOmap工作流程的替代策略，其利用了靶向核糖体蛋白的一级抗体，所述核糖体蛋白随后通过夹板缀合的蛋白A/G来检测以进行三探针扩增(图12A)。具体而言，使用抗RPS3(小40S亚基核糖体蛋白3)抗体和抗RPL4(大80S亚基核糖蛋白4)抗体来评估这种策略(图12B-12E)。基于抗体的策略的信号噪声比(SNR)在13.6-16.7的范围内。rRNA靶向策略的SNR为93±17(图12F)。
接下来，评价了RIBOmap三探针扩增对核糖体结合的mRNA的特异性。首先，使用非翻译长非编码RNA(核定位的MALAT1 RNA和细胞质定位的vtRNA1-1 RNA)作为阴性对照来测试检测特异性。对HeLa细胞中的ACTB和阴性对照RNA进行RIBOmap和先前报道的STARmap(20)成像，以分别检测核糖体结合的RNA和总RNA(图9D)。发现RIBOmap仅检测ACTB mRNA，而STARmap检测mRNA和非编码RNA二者(图9E和9F)。接下来，验证了RIBOmap在检测核糖体加载位点方面的亚转录物特异性。此处，使用三尖杉酯碱，三尖杉酯碱是一种翻译抑试剂，其将翻译起始核糖体捕获在起始密码子处，并且允许延长的核糖体逃离转录物(图9G)。三个三探针组被设计为靶向距起始密码子不同距离的亚转录物区域(-16、115和405nt)(图1H)。在三尖杉酯碱处理5分钟之后(2μg/ml终浓度)，当通过靶向起始密码子下游115或405nt的探针检测时，ACTB mRNA示出，RIBOmap信号强度显著降低(分别为p＝7.5X 10-5、4.7X 10-5，学生t检验)，而由靶向起始密子-16nt的探针生成的信号示出了很小的降低(图9I和9J)。总之，已证明RIBOmap可以特异性地检测核糖体结合的mRNA。
在对RIBOmap的SNR和特异性进行基准测试之后，通过在HeLa细胞中进行高度多路复用981基因RIBOmap实验，在单个细胞中，在亚细胞分辨率下对细胞周期依赖性和定位mRNA翻译进行了分析(图10A)。981个基因表示由细胞周期基因标志物、具有不同亚细胞模式的基因和具有不同RNA稳定性的基因构成的精选列表(21–24)。设计了一个多模式RIBOmap实验，其进一步并入细胞周期阶段和亚细胞细胞器的信息：(1)通过基于荧光泛素化的细胞周期指示剂(FUCCI)捕获每个细胞的细胞周期阶段(25,26)；(2)在FUCCI成像之后对核糖体结合的mRNA(981个基因)进行原位测序(20)；(3)最后，对细胞核、内质网和细胞形状进行染色和成像(图2B)。所有三种成像模式都通过核(DAPI)染色的共享通道来配准。为了将空间翻译组与空间转录组进行比较，使用STARmap(具有完全相同的RNA杂交序列)对同一批次的HeLa FUCCI细胞进行相同的981个基因的配对总RNA作图(图10A)。在质量控制过滤之后，总共有1,813细胞通过RIBOmap进行测序(平均每细胞1,500个核糖体结合的RNA读段)，并且总共有1,757个细胞通过STARmap进行测序(平均每细胞2,349个RNA读段)。
首先，评价了RIBOmap是否可以解析细胞周期依赖性mRNA翻译。为此，对由RIBOmap生成的单细胞翻译组学概况和由STARmap生成的单细胞转录组学概况进行单细胞轨迹分析(21)。在RIBOmap样品和STARmap样品二者中，使用已知细胞周期基因标志物的单细胞概况(21)来将单个细胞嵌入在具有拟时间值的扩散图上，以划定细胞周期进展(图10C以及图13A和13B)。对于两个数据集，RNA定义的G1、S和G2/M细胞周期阶段与FUCCI蛋白质荧光的预期细胞周期依赖性模式一致(图10C)，这证明了RIBOmap在检测细胞状态方面的能力。
在确认RIBOmap在划定细胞周期进展方面的准确性之后，通过共变分析鉴定共调控的基因模块。对基于单细胞翻译组学表达的所有基因对的成对相关性进行计算，并且使用层次聚类来鉴定单个细胞中具有高相关性系数的基因。值得注意的是，发现五个基因模块具有显著的模块内相关性和不同功能通路的富集(模块1-5，图10D以及图14A至14D)。特别地，模块3和5中的基因分别富含G2/M和G1/S细胞周期标志物基因(图10E)。这两个基因模块也是负相关的(图14E)。这一结果提供了单细胞水平证据，其支持先前的发现，即这些细胞周期标志物基因在细胞周期进展期间被共同调控，以同步执行其基因功能(27)。此外，模块2含有编码蛋白质翻译机器(如核糖体蛋白质(RPS3、RPS28和RPL37)和翻译因子(EEF2、EIF3B和ETF1))的基因(图14C)。这些基因显示与模块5(G1/S标志物基因)呈正相关，以及与模块3(G2/M标志物基因)呈负相关(图14F)。这意味着蛋白质翻译机器在G1/S期更主动地产生，以为亚细胞细胞器的物理扩展和复制提供蛋白质产生。
利用数据集的高空间分辨率，探索了RIBOmap是否可以检测亚细胞翻译模式。为了鉴定在亚细胞空间中示出共定位趋势(表现出空间邻位性)的翻译基因，生成RIBOmap中每个RNA的最近邻概况，并且通过与随机对照进行比较来评价基因共定位的显著性。使用随后的基因共定位矩阵的层次聚类，鉴定出具有高度相关的亚细胞空间组织和不同的功能富集的五个基因模块(模块1-5，图10E-10G以及图15A-15C)。其中，模块2、4和5在功能上富含膜蛋白和分泌通路(图10F和10G以及图15A和15B)，并且使用ER染色进行物理上共定位(图10H和10I以及图14D和14E)，这表明它们是ER翻译的基因。然而，模块1和3基因分别富集在有丝分裂纺锤体(例如，CDK1、NUSAP1、KIF23、SPAG5、TACC3、FAM83D)和翻译机器(例如，RPS3、RPS28、RPL36A、EEF2、DHX9)的大蛋白质复合物中(图10F和10G以及图15A和15C)。此种观察指示，蛋白质复合物的亚基可以以空间邻位的形式产生，以进行有效的组装。最后，探索了共调控的基因是否倾向于共定位以进行翻译。为此，将来自亚细胞共定位分析的共定位p值绘制到单细胞共变基因矩阵中。发现具有高单细胞共变相关性的五个基因模块也示出了强的亚细胞共定位(图16F)。这些结果暗示，功能上相关的基因组可以通过亚细胞共定位翻译进行共调控。
接下来，确定具有N6-甲基腺苷修饰(m6A)(一种关键的转录后RNA修饰(28))的RNA是否具有不同的空间翻译模式。为此，用距离比(DR)度量来定量每个基因的翻译分布，所述度量估计了每个扩增子在核膜和细胞质膜之间的相对位置(图10J)。值得注意的是，观察到m6A基因的DR值显著低于非m6A基因的DR值(图10K)，这指示m6A基因物理上被翻译为更靠近核膜。据推测，这种差异可以解释如下：m6A修饰的RNA在胞质溶胶中的寿命更短，并且因此运输时间更短(23)。共同地，RIBOmap在亚细胞水平上综合分析空间翻译组学的能力得到了证明，从而为未来对RNA加工和翻译的研究提供了前所未有的方案。
为了进一步证明RIBOmap在分析组织样品方面的空间分析能力，将这一方案应用于小鼠脑切片，以揭示原位单细胞翻译组学概况。此处，对精选自先前发表的小鼠细胞地图集单细胞测序研究(29–35)的5,413个基因的靶向基因列表进行作图。通过九轮原位测序，以90nm X 90nm X 300nm体素大小对含有多个脑区域的小鼠左半球(27.6mm2，62,753个细胞)的10μm厚冠状切片进行成像(图1A)。如所预期，与发生蛋白质翻译的胞质溶胶中的密集信号相比，在细胞核中观察到极小的RIBOmap信号(图11B)。
首先，通过将众所周知的细胞类型标志物基因(例如，Slc17a7、Gad2和Pcp4)的空间翻译模式与来自Allen Brain数据库的相应基因的原位杂交(ISH)图像进行比较来对组织RIBOmap数据进行基准测试(36)(图11C和图16A)，其中比较示出了一致的空间模式。值得注意地是，观察到特定基因的RIBOmap读段与特定脑区域中的蛋白质信号的相关性比与RNA信号(ISH)的相关性更好，如海马CA3中的Sst和CA1中的Nefl(图16B和16C)。这一结果与先前的报道一致，即核糖体分析结果比RNA-seq数据与蛋白质丰度的相关性更好(7，11，12)。接下来，使所有62,753个细胞经受脑细胞类型鉴定(图17)。此处，采用了层次聚类策略(20，31)：1级将分类细胞聚类为神经元细胞和神经胶质细胞(图18A和18B)；2级将经鉴定的兴奋性神经元、抑制性神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞、小胶质细胞和血管细胞聚类(图18A、18C和18D)；3级将经鉴定的57个不同的亚型聚类(图11D以及图19-21)。基于细胞分型结果，生成来自成像的半脑区域的空间细胞图(图11E)。这些翻译组学上定义的细胞类型的空间分布在很大程度上如所预期。例如，皮层富含层特异性兴奋性神经元(层2/3：Cplx2+，层4/5：Dkk3+，层6：Nr4a2+，层6：Pcp4+)、具有少突胶质细胞的胼胝体(Mbp+、Mal+、Cnp+、Plp1+)、具有中等有棘神经元的纹状体(Tac1+、Adora2a+、Ppp1r1b+、Penk+、Rasd2+)、具有兴奋性神经元的丘脑(Prkcd+、Synpo2+)和具有肽能神经元的下丘脑(Hap1+、Tac1+、Dlk+)。在CA1-3的锥体层和DG的颗粒层中也分别观察到区域特异性兴奋性神经元。因此，RIBOmap基于单细胞翻译组鉴定不同的脑细胞类型的潜力被证明是一种用于生成空间组织地图集的替代策略。
亚细胞定位的mRNA翻译对神经元细胞功能(37–39)和神经胶质细胞功能(40–42)都至关重要。值得注意的是，RIBOmap的亚细胞分辨率使得能够研究神经元细胞和神经胶质细胞的胞体和突起中的定位翻译。为此，将RIBOmap读段分成胞体读段(即，在由ClusterMap鉴定的细胞体区域内(43))和突起读段(即，读段的其余部分)(图11F和11G)。接下来，具有最高突起与胞体比率的前10％的基因被定义为富含翻译基因的突起，而具有最低突起与胞体比率的前10％的基因被定义为富含翻译基因的胞体(图11H)。基因本体论(GO)分析示出，富含翻译基因的突起与翻译、突触和突触后致密物质相关(图11I)。相比之下，富含翻译基因的胞体与质膜、细胞外基质和内质网相关(图11J)。这一结果进一步验证了RIBOmap在检测组织样品的亚细胞定位翻译方面的能力，因为膜和分泌蛋白预期会在胞体区域中的ER处被翻译。值得注意的是，在海马神经纤维网中观察到异常高丰度的富含翻译信号的突起，如突触后致密蛋白(例如，Shank1、Dlg4和Grik5)、翻译机器蛋白(例如，Eef2、Eef1a、Rpl3和Rps5)、运动蛋白(例如，Kif5a和Kif1a)以及钙传感器和信号传导蛋白(例如，Calm1和Camk2n1)(图11K和图22A)。作为比较，富含翻译基因的胞体在海马神经纤维网中示出了稀疏的RIBOmap信号(图11L和图22B)，如编码跨膜前体蛋白并与阿尔茨海默病相关的App，以及已知与内质网相关的Rtn4。除神经元中翻译的这些实例基因之外，还观察到神经胶质细胞标志物基因的定位翻译(图11M和11N以及图22C和22D)。对于少突胶质细胞，标志物基因Mbp和Plekhb1被鉴定为富含翻译基因的突起，而Mal和Cnp是富含翻译基因的胞体(图11M和11N以及图22C和22D)。星形胶质细胞具有许多突起，并且它们的标志物基因富集在富含翻译类别的突起中，如Gfap、Ttyh1、Apoe和Clu(图11M和图22C)。对于血管细胞，它们的标志物基因富集在富含翻译基因组的胞体中，如Ptgds、Itm2a和Bsg(图22C)。总体而言，已证明RIBOmap是研究小鼠脑组织中神经元细胞和神经胶质细胞二者的突起中的定位翻译的强有力工具。
随着RIBOmap(一种新颖的空间组学方法)的发展，可以在单细胞和亚细胞水平上对空间mRNA翻译作图。本文证明，RIBOmap通过检测981个基因在细胞周期期间的翻译并揭示人细胞中翻译RNA的不同亚细胞分布模式，为更全面地理解mRNA调控和蛋白质合成迈出了关键的一步。为了说明这一点，本公开以高3D空间分辨率展示了完整的组织样品中原位翻译组学状态的空间分析，从而生成了小鼠脑组织中翻译组定义的空间细胞图。此外，与Ribo-STAMP和TRAP方法相比，RIBOmap不依赖于遗传操纵。
材料和方法
细胞培养
人HeLa细胞从ATCC(CCL-2)获得，并且在37℃和5％CO2下在补充10％FBS的DMEM中培养。通过将药物添加到2μg/ml的最终浓度并在37℃下孵育5分钟来进行三尖杉酯碱处理。
使用慢病毒颗粒生成如先前所描述的HeLa FUCCI细胞(26)。简而言之，用pBOB-EF1-FastFUCCI-Puro(获得自Addgene，#86849)和包装质粒(psPAX2和VSVG)转染HEK 293T细胞。转染后48小时收集来自含有病毒的培养基的上清液。通过0.45μm PES过滤器过滤上清液，并且将病毒上清液用于转导HeLa细胞。在嘌呤霉素选择之后，扩增稳定的细胞系。
小鼠
所有动物程序均遵循麻省理工学院布罗德研究所和哈佛大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC)根据动物方案#0255-08-19批准的动物护理指南。动物实验按照IACUC政策和NIH指南进行。用于本研究的RIBOMap的C57BL/6(雄性，16周龄)小鼠购自TheJackson Laboratory(JAX)。
化学品和酶
化学品和酶按名称(供应商，目录号)列出：DMEM(Gibco，11995)、三尖杉酯碱(Abcam，ab141941)。Lipofectamine MessengerMAX转染试剂(Thermo Scientific，LMRNA003)。Tissue-Tek O.C.T.化合物(SAKURA，4583)。玻璃底24孔板(Cellvis，P24-1.5H-N)。玻璃底12孔板和24孔板(MatTek，P12G-1.5-14-F)。3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(Sigma，M6514)。聚-D-赖氨酸(Sigma-Aldrich，A-003-M)。16％PFA(ElectronMicroscope Sciences，15710-S)。甲醇(Sigma-Aldrich，34860-1L-R)。PBS(Gibco，10010-023)。Tween-20，10％溶液(Calbiochem，655206)。酵母tRNA(Thermo Scientific，AM7119)。SUPERase·In RNase抑制剂(Thermo Scientific，AM2696)。20xSSC(Sigma-Aldrich，S6639)。甲酰胺(Calbiochem，655206)。氧钒核糖核苷复合物(New England Biolabs，S1402S)。T4 DNA连接酶，5Weiss U/μL(Thermo Scientific，EL0012)。Phi29 DNA聚合酶(Thermo Scientific，EP0094)。10mM dNTP混合物(Thermo Scientific，18427089)。超纯BSA(Thermo Scientific，AM2618)。5-(3-氨基烯丙基)-dUTP(Thermo Scientific，AM8439)。甲基丙烯酸NHS酯，98％(Sigma-Aldrich，730300)。DMSO，无水(MolecularProbes，D12345)。丙烯酰胺溶液，40％(Bio-Rad，161-0140)。Bis溶液，2％(Bio-Rad，161-0142)。过硫酸铵(Sigma-Aldrich，A3678)。N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(Sigma-Aldrich，T9281)。OminiPur SDS，20％(Calbiochem，7991)。蛋白酶K溶液，RNA级(ThermoScientific，25530049)。热敏磷酸酶(New England Biolabs，M0289L)。DAPI(MolecularProbes，D1306)。10％Triton X-100(Sigma-Aldrich，93443)。伴刀豆球蛋白A，Alexa Fluor594缀合物(Thermo Scientific，C11253)。Flamingo荧光蛋白凝胶染色(Bio-Rad，1610490)。DL-二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich，D9779)。0.5ml 30-kDa Amicon超滤器(Millipore，UFC503024)。核糖体蛋白L4多克隆抗体(Thermo Scientific，11302-1-AP)。RPS3单克隆抗体(Thermo Scientific，66046-1-IG)。Micro-Bio-SpinTMP-6凝胶柱，Tris缓冲液(Bio-Rad，7326221)。PierceTMSM(PEG)2，No-WeighTM规格(Thermo Scientific，A35397)。ZebaTM旋转脱盐柱，7K MWCO，0.5mL(Thermo Scientific，89882)。
RIBOmap和STARmap探针设计
使用含有夹板探针和SNAIL探针的三探针策略进行RIBOmap。夹板探针由三部分组成：5’端的与18S核糖体RNA(rRNA)杂交的25nt序列、中间的50nt脱氧腺苷(dA)序列和3’端的12nt夹板-挂锁退火序列。如先前所描述，应用与18S rRNA杂交的25nt序列的设计(44)。探针靶向18S rRNA上相对非结构化且可以用于化学修饰的区域。总共设计了五种独特的探针。夹板探针的3’端被3’反向dT修饰阻断，并且不能用作RCA扩增的引物。夹板探针由Integrated DNATechnologies合成。
如先前所描述，应用SNAIL探针的设计(20)。简而言之，使用Picky 2.2来设计长度设定为40-46nt的每个SNAIL探针对的杂交序列，然后所得序列被分成两半(每半20-25nt)并且被0-2nt分开，其中两半之间的熔化温度(Tm)为最佳匹配。对于HeLa细胞981基因实验，为每个基因设计5或6个SNAIL探针对。对于小鼠脑5,433基因实验，为每个基因设计4个SNAIL探针对。SNAIL探针由IDT合成汇集。
用于细胞培养的RIBOmap和STARmap的样品制备
将HeLa FUCCI细胞在24孔板中培养，在样品收集之前用PBS洗涤，并在室温下用含300μl 1.6％PFA的PBS缓冲液固定15分钟。在固定之后，将细胞用450μl冷甲醇透化，并在-20℃下孵育一小时。然后将HeLa FUCCI细胞样品从-20℃移至室温5分钟，然后在室温下用200μl淬灭溶液(含1mg/ml酵母tRNA、0.1U/μl SUPERase·In RNase抑制剂、100mM甘氨酸、0.1％Tween-20的PBS)淬灭10分钟。在淬灭之后，将样品与200μl 1X杂交缓冲液(2xSSC、10％甲酰胺、20mM氧钒核糖核糖苷复合物、0.1mg/ml酵母tRNA、0.5％SUPERaseIn、0.1％Tween-20、以1nM每寡核苷酸汇集的SNAIL探针和以1μM每探针用于RIBOmap样品的夹板探针)在40℃下在具有石蜡膜包裹的加湿烘箱中一起孵育并振动12小时。将样品在37℃下用300μl PBSTR(含0.1U/μl SUPERase·In RNase抑制剂、0.1％Tween-20的PBS)洗涤两次，并用300μl高盐洗涤缓冲液(溶解在PBSTR中的4X SSC)洗涤一次，每次洗涤20分钟。最后，将样品在室温下用300μl PBSTR漂洗一次。
然后将样品在室温下与200μl连接混合物(含0.25U/μl T4 DNA连接酶、0.5mg/mlBSA和0.4U/μl SUPERase·In RNase抑制剂的1X T4 DNA连接酶缓冲液)轻摇孵育两小时。在连接反应之后，将样品用300μl PBSTR洗涤两次，然后与200μl滚环扩增(RCA)混合物(含0.5U/μl Phi29 DNA聚合酶、250μM dNTP、20μM 5-(3-氨基烯丙基)-dUTP、0.5mg/ml BSA和0.4U/μlSUPERase·In RNase抑制剂的1X Phi29缓冲液)在4℃下轻摇孵育30分钟并在30℃下轻摇孵育两小时。之后，将样品用PBST(含0.1％Tween-20的PBS)洗涤两次。然后进行成像以同时记录RIBOmap样品和STARmap样品的FUCCI荧光信号。随后，将样品在室温下用200μl修饰混合物(100mM碳酸氢钠缓冲液中的25mM甲基丙烯酸NHS酯的)处理一小时，然后用PBST漂洗一次。将样品在室温下与150μl单体缓冲液(含4％丙烯酰胺、0.2％双丙烯酰胺的2XSSC)一起孵育15分钟。然后抽吸缓冲液，并且将25μl聚合混合物(溶解在单体缓冲溶液中的0.2％过硫酸铵、0.2％四甲基乙二胺)添加到样品中心，并立即用Gel Slick包被的盖玻片覆盖。在室温下在N2箱中进行聚合反应一小时，然后将其用PBST洗涤两次，每次5分钟。
然后将组织-凝胶杂交体在37℃下用200μl蛋白酶K混合物(0.2mg/ml蛋白酶K、1％SDS、100mM NaCl和50mM Tris)消化一小时，然后用PBST洗涤三次，每次5分钟。随后，将样品在37℃下用200μl脱磷酸化混合物(含0.25U/μl热敏磷酸酶、0.5mg/mL BSA的1X热敏磷酸酶缓冲液)处理1小时，并用PBST洗涤三次，每次5分钟。
对于SEDA测序，每个测序周期开始于将样品在室温下用200μl剥离缓冲液(含60％甲酰胺、0.1％Triton X-100的H2O)处理两次，每次10分钟，随后用PBST洗涤三次，每次5分钟。然后，将样品在室温下与200μl测序混合物(含0.1875U/μl T4 DNA连接酶、0.5mg/mlBSA、10μM读段探针和5μM荧光寡核苷酸的1X T4 DNA连连接酶缓冲液)一起孵育至少3小时。将样品用300μl洗涤和成像缓冲液(含10％甲酰胺的2X SSC缓冲液)洗涤三次，每次10分钟，然后浸入在洗涤和成像缓冲液中以进行成像。使用Leica TCS SP8共焦显微术获取图像，所述共焦显微术具有40X油浸物镜(NA1.3)和94.64nm X 94.64nm X350 nm的体素大小。在第一轮测序时对DAPI信号进行成像。进行了六个周期的成像以检测981个基因。
在SEDAL测序之后，将样品在室温下用200μl剥离缓冲液处理三次，每次10分钟。然后将样品用PBST洗涤三次，每次5分钟，并与200μl Er染色混合物(稀释在100mM碳酸氢钠缓冲液中的0.05mg/ml伴刀豆球蛋白A)一起孵育，然后用PBST洗涤两次，每次5分钟。随后，将样品在室温下与200μl Flamingo染色混合物(含1x Flamingo Fluorescent Gel Stain的洗涤和成像缓冲液)一起孵育过夜，然后用300μl PBST洗涤三次。
用于小鼠组织的RIBOmap的样品制备
将用于本研究的小鼠用异氟烷麻醉，然后迅速断头。收集小鼠脑组织，并放置在Tissue-Tek O.C.T.化合物中。然后将O.C.T.中的脑组织冷冻在液氮中，并保持在-80℃下。对于小鼠脑组织切片，将脑组织转移到低温恒温器(Leica CM1950)中，并在-20℃下切成20μm冠状切片。将切片转移并附接到用3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯和聚-D-赖氨酸预处理的玻璃底12孔板。将脑切片在室温下用含4％PFA的PBS固定15分钟，然后用冷甲醇透化，并放置在-80℃下一小时。用于小鼠脑组织的实验程序几乎与用于HeLa细胞的实验程序相同，不同之处在于当在12孔板中制备脑组织时，所有反应体积都增加了一倍。没有对荧光蛋白进行成像程序，并且也没有涉及细胞器染色程序。使用Leica TCS SP8共焦显微术获取图像，所述共焦显微术具有63X油浸物镜(NA1.3)和90.14nm X 90.14nm X300 nm的体素大小。在第一轮测序时对DAPI信号进行成像，并进行九个成像周期以检测5,413个基因。
用于细胞培养的基于抗体的RIBOmap策略
首先制备夹板探针缀合的蛋白A/G。简而言之，将5’-硫醇修饰的夹板探针(IDT)在室温下用DL-二硫苏糖醇(DTT)活化2小时，并通过Micro Bio-SpinTMP-6凝胶柱纯化以去除过量的DTT。将蛋白A/G与聚乙二醇化SMCC交联剂[SM(PEG)2]在4℃下反应2小时，然后通过Zeba脱盐柱纯化以去除过量的交联剂。将活化的夹板探针与蛋白A/G(蛋白A/G与夹板探针的摩尔比为约1:11)在4℃下一起孵育过夜。通过使用0.5ml 30-kDa Amicon超滤器来将最终的缀合蛋白A/G洗涤五次，以去除未反应的DNA寡核苷酸。
固定步骤与用于基于rRNA探针的RIBOmap策略的固定步骤相同。对于杂交步骤，仅添加SNAIL探针而不添加夹板探针。用于这一步骤的其他试剂与用于基于rRNA探针的RIBOmap策略的其他试剂相同。在杂交之后，进行核糖体蛋白(RPS3或RPL4)抗体孵育。将细胞样品在室温下用阻断溶液(含5mg/ml BSA的PBSTR)阻断30分钟，然后在4℃下用含1:100稀释的一级抗体(RPS3或RPL4，IgG用于对照样品)的阻断溶液染色1小时。将样品在室温下用PBSTR洗涤三次，每次5分钟。然后将样品在室温下与夹板探针缀合的蛋白A/G一起孵育1小时，并在室温下用PBSTR洗涤三次，每次5分钟。连接步骤和RCA步骤与用于基于rRNA探针的RIBOmap策略的连接步骤和RCA步骤相同。然后将样品与50nM荧光寡核苷酸在PBST中一起孵育，所述荧光寡核苷酸与DNA扩增子和DAPI互补。通过成像检测DNA扩增子信号。
RIBOmap和STARmap成像预处理。
以SNR:10和10次迭代，使用CMLE算法，用Huygens Essential版本21.04(Scientific Volume Imaging，The Netherlands，svi.nl)来实现图象消旋。根据先前的报道，应用了相似的图像配准、现场调用和条形码过滤，但进行了略微调整(20)。
用于RIBOmap/STARmap细胞培养样品的数据处理
3D细胞分割：使用组合由CellProfiler v4.1.3生成的2D参考分割的策略来实现图像分割，并且使用定制的MATLAB脚本对3D染色图像进行处理。首先，创建组合扩增子通道和flamingo荧光凝胶染色图像的合成图像来表示细胞边界。将3D DAPI染色图像和合成图像二者的最大投影输入到CellProfiler v4.1.3中创建的定制管线中。使用中位数滤波器来去除图像上的高频噪声，并且使用IdentifyPrimaryObjects函数来检测细胞核。然后，基于经鉴定的细胞核，通过将IdentifySecondaryObjects函数应用于经过滤的2D合成图像来勾勒细胞边界。将输出中的细胞核和细胞分割掩模都用作以下程序中的参考分割，以创建3D分割。
对于3D分割，首先通过中位数滤波器对针对不同细胞区室的图像(细胞核的DAPI染色、细胞边界的合成图像和ER的伴刀豆球蛋白A染色)进行处理，并使用手动精选的阈值进行二值化。将具有少于200个体素的所有连接组分(对象)从二值图像中去除。然后，用半径等于10的圆盘式结构元件对图像进行放大。然后通过二值图像和来自先前步骤的2D参考细胞分割之间的按元素倍增过程来生成针对每个细胞区域的3D分割掩模。将细胞核区域从3D细胞分割掩模中去除，以创建细胞质分割。最后，通过定量3D中与每个标记区域重叠的过滤扩增子来创建每个细胞区室中的每细胞基因表达矩阵。
FUCCI细胞系的蛋白质信号定量：根据先前的报道，通过图像配准将mAG和mKO2荧光图像二者与测序图像对齐。每个蛋白质的信号水平被定量为与3D细胞核分割掩模重叠的体素的累积强度。
单个细胞的质量控制：分别基于以下指标和阈值对通过RIBOmap和STARmap两种方法测量的单个细胞概况进行过滤，以确保高质量的文库。首先，排除了通过3D分割定义的物理体积在期望范围(0.5x106至2x106个体素)之外的细胞。然后，使用每细胞转录物数量的样品特异性阈值来去除每个数据集中的异常值(RIBOmap下边界(LB)：300，上边界(UB)：3500，STARmapLB：500，UB：6000)。另外，转录物密度被定义为转录物的数量与每个细胞的物理体积之间的比率，其被用作阈值指标(LB：0.00055)以进一步排除细胞。基于细胞中表达基因的细胞的百分比(LB：10％)和基因的最大计数(RIBMapLB：2；STARmap LB：4)来过滤基因。RIBOmap和STARmap的过滤标准的差异来自对每种技术的不同预期。在过滤之后，具有897个基因的RIBOmap数据集的1,813个细胞和STARmap的1,757个细胞进入随后的分析。
共变分析：为了鉴定共变基因模块，首先将表达矩阵归一化为相同的每细胞转录物总数，然后计算每个基因对的Pearson相关性系数，以测量细胞间变异的相似性。在n_cluster被设置为10的情况下，在RIBOmap上进行采用离差平方和法(ward linkage)的层次聚类。
共定位分析：进行排列分析以揭示共定位的读段簇。给定细胞内的一个读段，记录邻近读段(3μm半径内)的基因身份。通过筛选所有细胞，获得每个邻近基因对的计数，这些计数被鉴定为观察到的计数。接下来，进行1000次排列测试，以随机打乱RNA读段的基因标记而不干扰其亚细胞位置。对于每个排列轮次，收集每个邻近基因对的计数以生成排列分布。此后，通过将观察到的计数与排列分布进行比较来推断每个基因对的单尾p值。进一步使用成对p值来构建热图(图10E)。RIBOmap样品的热图中的行和列通过层次聚类进行排序。STARmap样品的热图使用与RIBOmap相同的顺序来检测具有空间分布差异的基因模块。为了定量地比较基因模块之间的内质网(ER)定位水平，对在单细胞水平上定位于靶基因模块中的基因的ER中的读段的百分比进行了计算。将所有基因的相同百分比用作比较基线。进行Wilcoxon符号秩检验以测试统计显著性。
细胞周期和拟时间：为了构建表示细胞周期进展的拟时间轨迹，首先使用局限于周期标志物基因的细胞的表达概况(Scanpy中的评分_基因_细胞_周期函数)来鉴定细胞周期阶段(G1、G1S、G2M)。接下来，将STARmap细胞嵌入在由相同基因组的表达构建的扩散图中。在将该扩散图转换为极坐标系之后，对表示细胞周期开始的“根”细胞进行鉴定，并且根据每个细胞在极坐标上与“根”细胞的角度为每个细胞分配拟时间值。为了在相同的轨迹上为RIBMap细胞分配拟时间值，将来自两个数据集的细胞在由mAG和mKO2荧光强度定义的相同嵌入上进行配准。每个RIBOmap细胞的拟时间值被定义为STARmap中其最近邻(k＝3)的平均值。
DR计算：为了定量地分析细胞质内RNA读段的定位，计算每个细胞质读段的距离比(DR)。读段的DR值被定义为读段至细胞核边界的最短距离(d1)(通过细胞核分割来确定)，通过该距离和读段至细胞膜的最短距离(d2)(通过细胞分割来确定)的总和来归一化。使用Scipy中的欧几里得距离转换函数(distance_transform_edit)来计算由3D分割定义的每个读段和靶表面之间的最短距离。
RIBOmap脑组织样品的数据处理
使用ClusterMap的细胞分割：使用基于RNA扩增子的分割方法(ClusterMap(43))来实现单细胞信号定量。将涉及背景信号排斥、DAPI信号采样和基于密度的分割的基本处理管线应用于每个视场(FOV)。具体而言，10％的RNA信号被鉴定为局部低密度信号，并在单细胞水平定量中被排除。在设置参数dapi_grid_interval等于5的情况下，从偶联的DAPI染色图像中采样额外的信号斑，以进一步改进分割准确度。在3D分割期间，与DAPI染色相比，基于定性测试，参数cell_num_threshold被设置为0.02。算法鉴定的少于5个转录物或不与偶联DAPI染色重叠的细胞被排除在外。将所有FOV的ClusterMap信号分配合并以创建细胞与基因(cell-by-gene)矩阵。
质量控制和预处理：在单细胞水平上进行信号定量之后，使用每细胞转录物和基因的数量来排除低质量细胞。详细地，使用中位数绝对偏差(MAD)来估计每细胞过滤的读段阈值，如通过以下等式所示出的：
下边界＝中位数(每细胞读段)-4*MAD
上边界＝中位数(每细胞读段)+4*MAD
还应用了其他标准过滤策略，如：
1.细胞需要至少10个表达的基因以通过过滤；以及
2.基因需要至少10个表达的细胞以通过过滤。
在过滤之后，获得了62,753个细胞和5,413个基因的转录组概况。为了确保高质量的基因文库，在细胞中进一步排除最大计数小于3的基因，从而产生用于下游分析(如细胞类型分类)的3,995个基因。然后，通过pp.normalize_total函数(Scanpy v1.8.2)，根据每细胞转录物数量的中位数对转录组概况进行归一化。然后，用pp.log1p函数对数据进行对数转换。最后，数据矩阵通过pp.scale函数来缩放为单位方差，并且用于下游分析，如降维和无监督聚类。
细胞类型分类：应用层次聚类策略来为RIBOmap小鼠脑数据集生成三级细胞类型注释。首先，使用局限于3,995个高丰度基因的缩放矩阵来进行主成分分析(PCA)。使用函数tl.pca来计算前30个主成分，并且将它们全部用于构建k近邻算法(k-NN)图形，其中细胞基于其转录组学概况的相似性在高维空间中与其近邻连接。然后在kNN图形上应用Leiden社区检测算法来检测细胞簇。基于脑中常见细胞类型的典型标志物(即，Slc17a7、Gad1、Gad2、Plp1、Slc1a3等)的表达概况，将每个簇分类为神经元或神经胶质细胞作为它们的第一级注释。
为了分配更详细的注释，将先前描述的相同分析应用于第一级注释下的每个群体(神经元、神经胶质细胞)。在PCA之后，使用肘部方法来鉴定重要的主成分。通过绘制每个主成分的方差比(pl.pca_variance_ratio函数)，选择值最高的前10个和前15个主成分来分别对神经元和神经胶质细胞进行以下分析。对于神经元，基于其Slc17a7、Gad1和Gad2的表达概况，将其进一步分为兴奋性神经元和抑制性神经元。对于神经胶质细胞，对一些主要神经胶质细胞的多种亚型(即星形胶质细胞的Astro1、Astro2和Astro3)进行了鉴定。在这种情况下，为每个簇提供了两个注释级别；第二级注释指示其主要的神经胶质细胞类型(即，星形胶质细胞、少突胶质细胞、血管细胞等)，并且第三级注释(独特的标识符)表示主要群体内的亚型。
为了鉴定神经元细胞亚型，将相同的无监督聚类单独应用于兴奋性和抑制性神经元群体二者。具体而言，分别使用15个和10个主成分来构建兴奋性和抑制性神经元的kNN图形。大多数神经元细胞簇基于它们在脑切片中的空间表示(即，解剖区域，如L2/3、L4、CA、DG、TH等)进行注释，而一些抑制性神经元簇基于其编码不同神经元肽的基因标志物(即，Sst和Npy)进行注释。
富集翻译基因的区域的鉴定：在单细胞定量中被ClusterMap排除的RNA扩增子被处理为细胞的胞体区域之外的RNA。计算胞体区域和突起区域二者中每个基因的RNA计数，并基于每个基因的总RNA数量将其归一化为百分比。每个区域中RNA百分比最高的前10％基因被注释为富含翻译基因的区域，并且在脑切片上可视化它们的RNA空间分布。
基因本体论(GO)富集分析
DAVID数据库(DAVID.ncifcrf.gov)(45,46)用于GO富集分析。Benjamini和Hochberg错误发现率(FDR)用于调整多个超几何测试中的p值。选择来自生物过程(BP)和细胞组分(CC)的结果(FDR<0.05)作为富集GO条目。前3个最显著富集的GO条目用于共变分析和基因共定位分析，而前10个富集的条目在富含翻译基因的胞体和富含翻译基因的突起中提取。
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通过引用并入
本申请涉及各种已颁发的专利、已发布的专利申请、科学期刊文章和其他出版物，所有这些文献都通过引用并入本文。本文阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据详细描述、附图、实例和权利要求，本发明的其他特征、对象和优势将是显而易见的。
等效物和范围
在如“一个”、“一种”和“所述”等冠词中，除非有相反的指示或以其他方式从上下文中显而易见，否则可以表示一个或超过一个。除非有相反的指示或以其他方式从上下文中显而易见，否则如果一个、超过一个或所有的组成员存在于给定的产品或过程中，或在给定的产品和过程中使用，或以其他方式与给定的产品或者过程有关，则包括组的一个或多个成员“或”在其之间的实施方案或描述被视为是满足的。本发明包括其中恰好一个组成员存在于给定的产品或过程中、在给定的产品或过程中使用或以其他方式与给定的产品或过程有关的实施方案。本发明包括其中超过一个或所有的组成员存在于给定的产品或过程中、在给定的产品或过程中使用或以其他方式与给定的产品或过程有关的实施方案。
此外，本公开涵盖其中来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、元素、条款和描述性术语被并入到另一权利要求中的所有变化、组合和排列。例如，从属于另一权利要求的任何权利要求都可以被修改为包括在从属于同一基础权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个限制。在元素例如以马库什组格式被呈现为列表的情况下，还公开了元素的每个亚组，并且可以将任何元素从组中去除。应该理解，一般而言，在本发明或本发明的方面被称为包含特定元素和/或特征的情况下，本公开的某些实施方案或本公开的方面由此类元素和/或特征组成，或基本上由此类元素和/或特征组成。为了简单起见，这些实施方案没有在本文中具体阐述。还应当注意，术语“包含”和“含有”意在是开放性的，并允许包含额外的元素或步骤。在给定范围的情况下，端点包括在内。此外，除非另有指示或以其他方式从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则表示为范围的值可以假定本发明的不同实施方案中所陈述的范围内的任何具体的值或子范围，直到所述范围的下限的单位的十分之一，除非上下文清楚地另有规定。
本申请涉及各种已颁发的专利、已发布的专利申请、期刊文章和其他出版物，所有这些文献都通过引用并入本文。如果任何并入的参考文献与本说明书之间存在冲突，则以本说明书为准。此外，本发明的落在现有技术内的任何特定实施方案可以明确地被排除在任何一个或多个实施方案之外。因为此类实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使在本文中没有明确提出排除，也可以排除它们。无论任何原因，无论是否与现有技术的存在有关，本发明的任何特定实施方案都可以被排除在任何实施方案之外。
仅仅使用常规实验，本领域技术人员将识别或将能够确定本文描述的具体实施方案的许多等效物。本文描述的本实施方案的范围不意在限于上述描述，而是如所附实施方案中所阐述的。本领域普通技术人员将理解，在不偏离本发明的精神或范围的情况下，可以对本说明书进行各种改变和修改，如以下权利要求所定义的。

Claims (211)

1.用于分析细胞中被翻译的RNA的方法，所述方法包括：
a)使所述细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，从而产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中每个感兴趣的RNA的身份和位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含结合抗体或抗体变体或片段的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含抗体或抗体变体或片段。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗体是二级抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，所述方法进一步包括使所述细胞与一级抗体接触，所述一级抗体识别核糖体并且能够被所述第二探针的二级抗体结合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述一级抗体是抗40S核糖体蛋白S3(RPS3)抗体或抗60S核糖体蛋白L4(RPL4)抗体。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与所述核糖体内的rRNA的一部分互补的寡核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与18SrRNA的一部分互补的寡核苷酸。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或超过30个核苷酸。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为约25个核苷酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第二探针进一步包含聚合阻断剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚合阻断剂位于第二探针的3’端。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述聚合阻断剂包含反向核酸残基。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述反向核酸残基是反向胸腺嘧啶残基。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸条形码序列的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸条形码序列的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸探针和所述第三寡核苷酸探针与所述感兴趣的RNA的不同部分互补。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[第一条形码序列]-[与第三探针的部分互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[第二条形码序列]-3’。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述第一探针的与所述第二探针的一部分互补的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述第一探针的与所述第二探针的一部分互补的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述第一探针的与所述第二探针的一部分互补的部分在所述第一探针的5’端和3’端之间分开。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述第一探针的与所述第三探针的一部分互补的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述第一探针的与所述第三探针的一部分互补的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述第一探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述第一探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述第二探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述第二探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述第二探针的识别核糖体的部分和所述第二探针的与所述第一探针的一部分互补的部分通过聚-A核苷酸接头接合。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述聚-A核苷酸接头的长度为20-80、30-70或40-60个核苷酸。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述聚-A核苷酸接头的长度为约50个核苷酸。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述第三探针包含以下结构：
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-[条形码序列]-3’。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述第三探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述第三探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述第三探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述第三探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中同时在多个细胞中对被翻译的RNA进行分析。
38.根据权利要求37所述的方法，其中同时在超过100个细胞、超过200个细胞、超过300个细胞、超过400个细胞、超过500个细胞、超过1000个细胞、超过10,000个细胞、超过20,000个细胞、超过30,000个细胞、超过40,000个细胞或超过50,000个细胞中对被翻译的RNA进行分析。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述细胞包含多种细胞类型。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞类型选自由干细胞、祖细胞、神经元细胞、星形胶质细胞、树突状细胞、内皮细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞、肌肉细胞、心肌细胞、间充质细胞、上皮细胞、免疫细胞、肝细胞、平滑肌细胞和骨骼肌细胞、造血细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、脂肪细胞和神经元组成的组。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述细胞存在于完整的组织内。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述完整的组织是固定的组织样品。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述组织是脑组织。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中同时对超过1个、超过2个、超过3个、超过4个、超过5个、超过10个、超过20个、超过30个、超过40个、超过50个、超过100个、超过200个、超过500个、超过1000个、超过2000个、超过3000个RNA、超过4000个RNA或超过5000个RNA的翻译进行分析。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述第一探针的所述第二寡核苷酸条形码序列是用于鉴定感兴趣的RNA的基因特异性序列。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述测序的步骤包括通过动态退火和连接(SEDAL)进行的误差减小的测序。
47.根据权利要求46所述的方法，其中进行两次、三次、四次、五次或超过五次SEDAL。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述聚合物基质是水凝胶。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述水凝胶是聚乙烯醇水凝胶、聚乙二醇水凝胶、聚丙烯酸钠水凝胶、丙烯酸酯水凝胶或聚丙烯酰胺水凝胶。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述进行滚环扩增的步骤进一步包括提供胺修饰的核苷酸，其中将所述胺修饰的核苷酸并入到所述一个或多个串联扩增子中。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中的步骤包含使所述一个或多个扩增子的胺修饰的核苷酸与丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，以及将所述一个或多个串联扩增子和所述聚合物基质共聚合。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，所述方法进一步包括分析所述细胞内的额外的分子。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述额外的分子是非翻译RNA、其他亚细胞位置中的RNA、蛋白质、脂质或小分子。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的方法，所述方法进一步包括通过将一个或多个细胞的RNA翻译概况与包含各种细胞类型的细胞的RNA翻译概况的参考数据进行比较来确定被分析的细胞的细胞类型或多个被分析的细胞的细胞类型。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，所述方法进一步包括通过将一个或多个细胞的RNA翻译概况与包含各种细胞状态的细胞的RNA翻译概况的参考数据进行比较来确定被分析的细胞的细胞状态或多个被分析的细胞的细胞状态。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述细胞中过表达或敲除一个或多个基因以确定所述一个或多个基因是否参与调控所述感兴趣的RNA的翻译。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的方法，其中所述方法不扰乱亚细胞结构、细胞形态和/或组织结构的空间信息。
58.用于分析细胞中被翻译的RNA的方法，所述方法包括：
a)使所述细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，从而产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中每个感兴趣的RNA的身份和位置。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含结合抗体或抗体变体或片段的试剂。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含抗体或抗体变体或片段。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述抗体是二级抗体。
62.根据权利要求61所述的方法，所述方法进一步包括使所述细胞与一级抗体接触，所述一级抗体识别核糖体并且被所述第二探针的二级抗体识别。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述一级抗体是抗40S核糖体蛋白S3(RPS3)抗体或抗60S核糖体蛋白L4(RPL4)抗体。
64.根据权利要求58所述的方法，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与所述核糖体内的核糖体RNA(rRNA)的一部分互补的寡核苷酸。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与18SrRNA的一部分互补的寡核苷酸。
66.根据权利要求64或65所述的方法，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或超过30个核苷酸。
67.根据权利要求64至66中任一项所述的方法，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为约25个核苷酸。
68.根据权利要求58至67中任一项所述的方法，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
69.根据权利要求58至68中任一项所述的方法，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
70.根据权利要求58至69中任一项所述的方法，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-3’。
71.根据权利要求58至70中任一项所述的方法，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’。
72.根据权利要求58至71中任一项所述的方法，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列是用于鉴定感兴趣的RNA的基因特异性序列。
73.用于在受试者中诊断疾病或病症的方法，所述方法包括：
a)使取自所述受试者的细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，从而产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定每个感兴趣的RNA的身份和位置，从而对所述细胞中被翻译的RNA进行分析，
其中所述细胞的RNA翻译概况相对于一个或多个非病变细胞的差异指示所述受试者患有所述疾病或病症。
74.用于在受试者中诊断疾病或病症的方法，所述方法包括：
a)使取自所述受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，从而产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中每个感兴趣的RNA的身份和位置，
其中所述细胞的RNA翻译概况相对于一个或多个非病变细胞的差异指示所述受试者患有所述疾病或病症。
75.根据权利要求73或74所述的方法，其中作为对照实验，将一个或多个非病变细胞中被翻译的RNA与取自所述受试者的细胞一起进行分析。
76.根据权利要求73或74所述的方法，其中一个或多个非病变细胞中被翻译的RNA的概况包含参考数据。
77.根据权利要求73至76中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝疾病、脾疾病、肺疾病、血液疾病、神经系统疾病、精神疾病、胃肠道(GI)疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢性病症、免疫病症、中枢神经系统(CNS)病症或心血管疾病。
78.根据权利要求73至77中任一项所述的方法，其中所述细胞存在于组织中。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述组织是上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织。
80.根据权利要求78或79所述的方法，其中所述组织是脑组织。
81.根据权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述组织是取自受试者的组织样品。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述受试者是非人实验动物。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述非人实验动物是小鼠、大鼠、狗、猪或非人灵长类动物。
84.根据权利要求81所述的方法，其中所述受试者是人。
85.用于筛选能够调节一种或多种RNA的翻译的试剂的方法，所述方法包括：
a)使正在用候选试剂处理或已经用候选试剂处理的细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，从而产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定每个感兴趣的RNA的身份和位置，从而对所述细胞中被翻译的RNA进行分析，
其中在存在所述候选试剂的情况下被翻译的RNA的概况相对于在不存在所述候选试剂的情况下的差异指示所述候选试剂调节一种或多种RNA的翻译。
86.用于筛选能够调节一种或多种RNA的翻译的试剂的方法，所述方法包括：
a)使正在用候选试剂处理或已经用候选试剂处理的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，从而产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；以及
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中结合到核糖体的每个感兴趣的RNA的身份和位置，
其中在存在所述候选试剂的情况下被翻译的RNA的概况相对于在不存在所述候选试剂的情况下的差异指示所述候选试剂调节一种或多种RNA的翻译。
87.根据权利要求85或86所述的方法，其中所述候选试剂是小分子、蛋白质、肽、核酸、脂质或碳水化合物。
88.根据权利要求85至87中任一项所述的方法，其中所述候选试剂是已知的药物或FDA批准的药物。
89.根据权利要求87或88所述的方法，其中所述蛋白质是抗体或抗体变体或片段。
90.根据权利要求87或88所述的方法，其中所述核酸是mRNA、反义RNA、miRNA、siRNA、RNA适体、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)或反义寡核苷酸(ASO)。
91.根据权利要求85至90中任一项所述的方法，其中调节RNA翻译与减少、缓解或消除疾病或病症的症状相关。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝疾病、脾疾病、肺疾病、血液疾病、神经系统疾病、精神疾病、胃肠道(GI)疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢性病症、免疫病症、中枢神经系统(CNS)病症或心血管疾病。
93.用于在受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括：
a)使取自所述受试者的细胞与一个或多个探针对接触，其中每个探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第二探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，从而产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定结合到核糖体的每个感兴趣的RNA的身份和位置，从而对所述细胞中被翻译的RNA进行分析；以及
f)如果观察到所述细胞中被翻译的RNA的概况相对于一个或多个非病变细胞存在差异，则将用于所述疾病或病症的治疗施用于所述受试者。
94.用于在受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括：
a)使取自所述受试者的细胞与一个或多个探针组接触，其中每个探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
b)将所述第一探针的5’端和3’端连接在一起以产生环状寡核苷酸；
c)使用所述第三探针作为引物进行滚环扩增以扩增所述环状寡核苷酸，从而产生一个或多个串联扩增子；
d)将所述一个或多个串联扩增子嵌入在聚合物基质中；
e)对嵌入在所述聚合物基质中的所述串联扩增子进行测序，以确定所述细胞中结合到核糖体的每个感兴趣的RNA的身份和位置；以及
f)如果观察到所述细胞中被翻译的RNA的概况相对于一个或多个非病变细胞存在差异，则将用于所述疾病或病症的治疗施用于所述受试者。
95.根据权利要求93或94所述的方法，其中作为对照实验，同时对一个或多个非病变细胞中一种或多种RNA的翻译进行分析。
96.根据权利要求93或94所述的方法，其中一个或多个非病变细胞中一种或多种RNA的翻译的概况包含参考数据。
97.根据权利要求93至96中任一项所述的方法，其中所述治疗包括施用治疗剂、手术或放射疗法。
98.根据权利要求93至97中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是小分子、蛋白质、肽、核酸、脂质或碳水化合物。
99.根据权利要求93至98中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是已知的药物或FDA批准的药物。
100.根据权利要求98或99所述的方法，其中所述蛋白质是抗体或抗体变体或片段。
101.根据权利要求98或99所述的方法，其中所述核酸是mRNA、反义RNA、miRNA、siRNA、RNA适体、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)或反义寡核苷酸(ASO)。
102.根据权利要求93至101中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传性疾病、增殖性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、肝疾病、脾疾病、肺疾病、血液疾病、神经系统疾病、精神疾病、胃肠道(GI)疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、内分泌疾病、代谢性病症、免疫病症、中枢神经系统(CNS)病症或心血管疾病。
103.探针对，其包含第一探针和第二探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分。
104.根据权利要求103所述的探针对，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含结合抗体或抗体变体或片段的试剂。
105.根据权利要求103或104所述的探针对，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含抗体或抗体变体或片段。
106.根据权利要求105所述的探针对，其中所述抗体是二级抗体。
107.根据权利要求106所述的探针对，其中所述二级抗体与一级抗体结合，所述一级抗体识别并结合所述核糖体。
108.根据权利要求107所述的探针对，其中所述一级抗体是抗40S核糖体蛋白S3(RPS3)抗体或抗60S核糖体蛋白L4(RPL4)抗体。
109.根据权利要求103所述的探针对，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与所述核糖体内的rRNA的一部分互补的寡核苷酸。
110.根据权利要求109所述的探针对，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与18S rRNA的一部分互补的寡核苷酸。
111.根据权利要求109或110所述的探针对，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或超过30个核苷酸。
112.根据权利要求109至111中任一项所述的探针对，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为约25个核苷酸。
113.根据权利要求103至112中任一项所述的探针对，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
114.根据权利要求103至113中任一项所述的探针对，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
115.根据权利要求103至114中任一项所述的探针对，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-3’。
116.根据权利要求103至115中任一项所述的探针对，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’。
117.探针组，其包含第一探针、第二探针和第三探针，其中：
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补。
118.根据权利要求117所述的探针组，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含结合抗体或抗体变体或片段的试剂。
119.根据权利要求117或118所述的探针组，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含抗体或抗体变体或片段。
120.根据权利要求119所述的探针组，其中所述抗体是二级抗体。
121.根据权利要求120所述的探针组，其中所述二级抗体与一级抗体结合，所述一级抗体识别并结合所述核糖体。
122.根据权利要求121所述的探针组，其中所述一级抗体是抗40S核糖体蛋白S3(RPS3)抗体或抗60S核糖体蛋白L4(RPL4)抗体。
123.根据权利要求117所述的探针组，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与所述核糖体内的rRNA的一部分互补的寡核苷酸。
124.根据权利要求123所述的探针组，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与18S rRNA的一部分互补的寡核苷酸。
125.根据权利要求123或124所述的探针组，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或超过30个核苷酸。
126.根据权利要求123至125中任一项所述的探针组，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为约25个核苷酸。
127.根据权利要求117至126中任一项所述的探针组，其中所述第二探针进一步包含聚合阻断剂。
128.根据权利要求127所述的探针组，其中所述聚合阻断剂位于所述第二探针的3’端。
129.根据权利要求127或128所述的探针组，其中所述聚合阻断剂包含反向核酸残基。
130.根据权利要求129所述的探针组，其中所述反向核酸残基是反向胸腺嘧啶残基。
131.根据权利要求117至130中任一项所述的探针组，其中所述寡核苷酸条形码序列的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
132.根据权利要求117至131中任一项所述的探针组，其中所述条形码序列的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
133.根据权利要求117至132中任一项所述的探针组，其中所述第一寡核苷酸探针和所述第三寡核苷酸探针与所述感兴趣的RNA的不同部分互补。
134.根据权利要求117至133中任一项所述的探针组，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[第一条形码序列]-[与第三探针的部分互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[第二条形码序列]-3’。
135.根据权利要求117至134中任一项所述的探针组，其中所述第一探针的与所述第二探针的一部分互补的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
136.根据权利要求117至135中任一项所述的探针组，其中所述第一探针的与所述第二探针的一部分互补的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
137.根据权利要求117至136中任一项所述的探针组，其中所述第一探针的与所述第二探针的一部分互补的部分在所述第一探针的5’端和3’端之间分开。
138.根据权利要求117至137中任一项所述的探针组，其中所述第一探针的与所述第三探针的一部分互补的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
139.根据权利要求117至138中任一项所述的探针组，其中所述第一探针的与所述第三探针的一部分互补的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
140.根据权利要求117至139中任一项所述的探针组，其中所述第一探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
141.根据权利要求117至140中任一项所述的探针组，其中所述第一探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
142.根据权利要求117至141中任一项所述的探针组，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’。
143.根据权利要求117至142中任一项所述的探针组，其中所述第二探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
144.根据权利要求117至143中任一项所述的探针组，其中所述第二探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
145.根据权利要求117至144中任一项所述的探针组，其中所述第二探针的识别核糖体的部分和所述第二探针的与所述第一探针的一部分互补的部分通过聚-A核苷酸接头接合。
146.根据权利要求145所述的探针组，其中所述聚-A核苷酸接头的长度为20-80、30-70或40-60个核苷酸。
147.根据权利要求145或146所述的探针组，其中所述聚-A核苷酸接头的长度为约50个核苷酸。
148.根据权利要求117至147中任一项所述的探针组，其中所述第三探针包含以下结构：
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-[条形码序列]-3’。
149.根据权利要求117至148中任一项所述的探针组，其中所述第三探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
150.根据权利要求117至149中任一项所述的探针组，其中所述第三探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
151.根据权利要求117至150中任一项所述的探针组，其中所述第三探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
152.根据权利要求117至151中任一项所述的探针组，其中所述第三探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
153.多个探针，其包含多个根据权利要求103至116中任一项所述的探针对或多个根据权利要求117至152中任一项所述的探针组，并且其中每个探针对或探针组包含与不同的感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。
154.试剂盒，其包含根据权利要求103至116中任一项所述的探针对或根据权利要求117至152中任一项所述的探针组。
155.根据权利要求154所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含多个根据权利要求103至116中任一项所述的探针对或多个根据权利要求117至152中任一项所述的探针组，并且其中每个探针对或探针组包含与不同的感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分。
156.根据权利要求154或155所述的试剂盒，其进一步包含细胞。
157.根据权利要求154至156中任一项所述的试剂盒，其进一步包含一种或多种酶。
158.根据权利要求157所述的试剂盒，其中所述一种或多种酶包含连接酶。
159.根据权利要求157或158所述的试剂盒，其中所述一种或多种酶包含聚合酶。
160.根据权利要求154至159中任一项所述的试剂盒，其进一步包含胺修饰的核苷酸。
161.根据权利要求154至160中任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于制备聚合物基质的试剂和单体。
162.用于分析细胞中被翻译的RNA的系统，所述系统包含
a)细胞；
b)一个或多个探针对，所述探针对包含第一探针和第二探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列；并且
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；
c)显微镜；以及
d)计算机。
163.根据权利要求162所述的系统，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含结合抗体或抗体变体或片段的试剂。
164.根据权利要求162或163所述的系统，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含抗体或抗体变体或片段。
165.根据权利要求164所述的系统，其中所述抗体是二级抗体。
166.根据权利要求165所述的系统，其中所述二级抗体与一级抗体结合，所述一级抗体识别并结合所述核糖体。
167.根据权利要求166所述的系统，其中所述一级抗体是抗40S核糖体蛋白S3(RPS3)抗体或抗60S核糖体蛋白L4(RPL4)抗体。
168.根据权利要求162所述的系统，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与所述核糖体内的rRNA的一部分互补的寡核苷酸。
169.根据权利要求168所述的系统，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与18SrRNA的一部分互补的寡核苷酸。
170.根据权利要求168或169所述的系统，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或超过30个核苷酸。
171.根据权利要求168至170中任一项所述的系统，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为约25个核苷酸。
172.根据权利要求162至171中任一项所述的系统，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
173.根据权利要求162至172中任一项所述的系统，其中所述第一探针的寡核苷酸条形码序列的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
174.根据权利要求162至173中任一项所述的系统，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[条形码序列]-3’。
175.根据权利要求162至174中任一项所述的系统，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’。
176.用于分析细胞中被翻译的RNA的系统，所述系统包含
a)细胞；
b)一个或多个探针组，所述探针组包含第一探针、第二探针和第三探针，其中
i)所述第一探针包含与所述第二探针互补的寡核苷酸部分、第一寡核苷酸条形码序列、与所述第三探针的一部分互补的寡核苷酸部分、与感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分和第二寡核苷酸条形码序列；
ii)所述第二探针包含识别核糖体的部分和与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分；并且
iii)所述第三探针包含与所述感兴趣的RNA互补的寡核苷酸部分、与所述第一探针的一部分互补的寡核苷酸部分和寡核苷酸条形码序列，其中所述第三探针的寡核苷酸条形码序列与所述第一探针的第一寡核苷酸条形码序列互补；
c)显微镜；以及
d)计算机。
177.根据权利要求176所述的系统，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含结合抗体或抗体变体或片段的试剂。
178.根据权利要求176或177所述的系统，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含抗体或抗体变体或片段。
179.根据权利要求178所述的系统，其中所述抗体是二级抗体。
180.根据权利要求179所述的系统，其中所述二级抗体与一级抗体结合，所述一级抗体识别并结合所述核糖体。
181.根据权利要求180所述的系统，其中所述一级抗体是抗40S核糖体蛋白S3(RPS3)抗体或抗60S核糖体蛋白L4(RPL4)抗体。
182.根据权利要求176所述的系统，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与所述核糖体内的rRNA的一部分互补的寡核苷酸。
183.根据权利要求182所述的系统，其中所述第二探针的识别核糖体的部分包含与18SrRNA的一部分互补的寡核苷酸。
184.根据权利要求182或183所述的系统，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或超过30个核苷酸。
185.根据权利要求176至184中任一项所述的系统，其中所述与rRNA的一部分互补的寡核苷酸的长度为约25个核苷酸。
186.根据权利要求176至185中任一项所述的系统，其中所述第二探针进一步包含聚合阻断剂。
187.根据权利要求186所述的系统，其中所述聚合阻断剂位于第二探针的3’端。
188.根据权利要求186或187所述的系统，其中所述聚合阻断剂包含反向核酸残基。
189.根据权利要求188所述的系统，其中所述反向核酸残基是反向胸腺嘧啶残基。
190.根据权利要求176至189中任一项所述的系统，其中所述寡核苷酸条形码序列的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
191.根据权利要求176至190中任一项所述的系统，其中所述条形码序列的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
192.根据权利要求176至191中任一项所述的系统，其中所述第一寡核苷酸探针和所述第三寡核苷酸探针与所述感兴趣的RNA的不同部分互补。
193.根据权利要求176至192中任一项所述的系统，其中所述第一探针包含以下结构：
5’-[与第二探针互补的部分]-[第一条形码序列]-[与第三探针的部分互补的部分]-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[第二条形码序列]-3’。
194.根据权利要求176至193中任一项所述的系统，其中所述第一探针的与所述第二探针的一部分互补的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
195.根据权利要求176至194中任一项所述的系统，其中所述第一探针的与所述第二探针的一部分互补的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
196.根据权利要求176至195中任一项所述的系统，其中所述第一探针的与所述第二探针的一部分互补的部分在所述第一探针的5’端和3’端之间分开。
197.根据权利要求176至196中任一项所述的系统，其中所述第一探针的与所述第三探针的一部分互补的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
198.根据权利要求176至197中任一项所述的系统，其中所述第一探针的与所述第三探针的一部分互补的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
199.根据权利要求176至198中任一项所述的系统，其中所述第一探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
200.根据权利要求176至199中任一项所述的系统，其中所述第一探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
201.根据权利要求176至200中任一项所述的系统，其中所述第二探针包含以下结构：
5’-[识别核糖体的部分]-[与第一探针互补的部分]-3’。
202.根据权利要求176至201中任一项所述的系统，其中所述第二探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为4-20、5-19、6-18、7-17、8-16、9-15、10-14或11-13个核苷酸。
203.根据权利要求176至202中任一项所述的系统，其中所述第二探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
204.根据权利要求176至203中任一项所述的系统，其中所述第二探针的识别核糖体的部分和所述第二探针的与所述第一探针的一部分互补的部分通过聚-A核苷酸接头接合。
205.根据权利要求204所述的系统，其中所述聚-A核苷酸接头的长度为20-80、30-70或40-60个核苷酸。
206.根据权利要求204或205所述的系统，其中所述聚-A核苷酸接头的长度为约50个核苷酸。
207.根据权利要求176至206中任一项所述的系统，其中所述第三探针包含以下结构：
5’-[与感兴趣的RNA互补的部分]-[与第一探针互补的部分]-[条形码序列]-3’。
208.根据权利要求176至207中任一项所述的系统，其中所述第三探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10-30、11-29、12-28、13-27、14-26、15-25、16-24、17-23、18-22或19-21个核苷酸。
209.根据权利要求176至208中任一项所述的系统，其中所述第三探针的与所述感兴趣的RNA互补的部分的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
210.根据权利要求176至209中任一项所述的系统，其中所述第三探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为5-15、6-14、7-13、8-12或9-11个核苷酸。
211.根据权利要求176至210中任一项所述的系统，其中所述第三探针的与所述第一探针的一部分互补的部分的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
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