CN106053845A - 一种唇癌特异性检测的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性检测唇癌的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人富含半脫氨酸分泌蛋白1具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获唾液中的富含半脫氨酸分泌蛋白1蛋白，通过其含量的变化来检测唇癌，将其制备成为相应的试剂盒，将用于唇癌的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低的好处。

Description

一种唇癌特异性检测的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测唇癌的试剂盒及其检测方法。

背景技术

唇癌是指发生于上下口唇的恶性肿瘤为口腔常见恶性肿瘤之一，在口腔癌中占第立位，占全身恶性肿瘤的0.1％～0.5％，占口腔恶性肿瘤的7.1％～15.0％，欧美国家唇癌患者较多，占口腔癌的20％～30％。一般下唇比上唇易受累，约90％～95％发生在下唇红缘部，而且W下唇的外1/3处为多见。男性患者居多，男女之比为7:1。高发年龄为50～70岁。唇癌绝大多数为高分化之鱗状细胞癌，多在良性费生物的病变基础上发生，其生长速度较慢，预后较好，一般5年生存率为70％W上，本病的病因可能与局部长期受异物刺激，强烈的紫外线照射有关。口唇上皮角化、白斑、巧费、肉芽肿及裂口等长期不愈，亦可导致癌变。

现有技术已知，唾液富含半脫氨酸分泌蛋白1浓度为10-40ng即可诊断为唇癌。因此，检测半脫氨酸分泌蛋白1的浓度变得极为重要。

核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1c Evolut1on of L1gands by Exponent1al enr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异结合CRISP1的核酸适体及其试剂盒。

本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。

所述核酸适体与CRISP1蛋白具有较好的亲和能力。

还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。

所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：

a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

所述核酸适体可用于制备检测CRISP1的试剂盒。

利用本发明的核酸适体，可以捕获中唾液中的中的CRISP1，从而用于相关口腔癌筛查。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、CRISP1蛋白的获得

将Genbank：EAX04350所示的CRISP1基因通过本领域常规的真核表达方式进行表达，获得了相应的目的多肽蛋白。

实施例2核酸适体的筛选和制备

设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括41个核苷酸的随机核酸文库如下：

5‘-TGGCACCTACGATCTAAGGCA(N41)GGACTACCAATGCAACGTCAC-3’；N41代表41个随机核苷酸。

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug CRISP1蛋白，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行12轮。得到了15个适配子，其序列分别为SEQ ID NO:1-15所示。具体序列如下所示：

CRISP1-1：

TGGCACCTACGATCTAAGGCAATCCCATATATGTTCCACACACTCGCAACTTATCCGCTACAGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-2：

TGGCACCTACGATCTAAGGCATTCCGCCATAAATAAGATTCACATCACGACATCGATCACACGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-3：

TGGCACCTACGATCTAAGGCACTTAATCAACATATCTCTTCTGTATTCTCTCCACGCATACAGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-4：

TGGCACCTACGATCTAAGGCAACGTCTCCAATCCGCACTTATAATTATGTTCTTACCTAAGAGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-5：

TGGCACCTACGATCTAAGGCACGCTCATCACCATCTCCTACCTATATACATCACCTTCGCCTGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-6：

TGGCACCTACGATCTAAGGCACATATCATCCTCCATACACGACCAACCACTCCGTCTTCACTGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-7：

TGGCACCTACGATCTAAGGCAAACAAACACTCTCGCACATTACCTTATTTATCAAGAATATAGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-8：

TGGCACCTACGATCTAAGGCACCGCTTATCTACACTAAATACAATTTCCTCCTCACCCTCCAGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-9：

TGGCACCTACGATCTAAGGCACACGCCTCCAATATCAACTTAATAATACACCACTAATTTCTGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-10：

TGGCACCTACGATCTAAGGCACACACGCCACTTATACAACAATCCAACCGCCTACCACTACTGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-11：

TGGCACCTACGATCTAAGGCATAGCATCACTACTCGCTATTTCCTATAATCCTAGCCTTATAGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-12：

TGGCACCTACGATCTAAGGCACTAGAAACTCCAACACATACACACACAGACCCGCTCCATAAGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-13：

TGGCACCTACGATCTAAGGCATCGCATAACGCTCCACAATATTAACATACTTCTCTTCTTATGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-14：

TGGCACCTACGATCTAAGGCATCATAATATTCGCTCACTCTAATCATACATTATCTTCTTGTGGACTACCAATGCAACGTCAC

CRISP1-15：

TGGCACCTACGATCTAAGGCAATAATATTCGCTCACTATAATCAACATTATCTTCTTGTTCTGGACTACCAATGCAACGTCAC

实施例3蛋白结合适配子的性能测定

将适配子分别取2.0μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的适配子分别与不同浓度(1-200nM)的CRISP137℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与目的蛋白的解离常数。结果如下：

名称	解离常数Kd(单位nM)
		CRISP1-1	9.9
CRISP1-2	9.7
		CRISP1-3	9.8
CRISP1-4	9.6
		CRISP1-5	9.4
CRISP1-6	9.3
		CRISP1-7	9.4
CRISP1-8	9.6
		CRISP1-9	9.0
CRISP1-10	9.7
		CRISP1-11	9.6
CRISP1-12	9.7
		CRISP1-13	9.0
CRISP1-14	8.9
		CRISP1-15	8.8
PBS空白对照	无结合能力

实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析

分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，COCH蛋白，CRISP1蛋白，与15条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与CRISP1蛋白结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例5所述适配子疾病的诊断

取9个唇癌患者和3个正常人的唾液分泌物，使用生理盐水稀释，获得目标样本。

将15个偶联有标记的适配子分别与9个患者以及3个正常人的分泌物混合30min，通过生物素分离，定量分析其中的CRISP1蛋白的含量，通过分析发现，9个口腔癌患者中CRISP1蛋白的含量显著增加，超过了规定的阈值。达到了唇癌的诊断标准。由此可见，其诊断效果较好。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉陈博

〈120〉一种特异性诊断唇癌的试剂盒

〈160〉15

〈210〉1

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-1

TGGCACCTACGATCTAAGGCAATCCCATATATGTTCCACACACTCGCAACTTATCCGCTACAGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉2

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-2

TGGCACCTACGATCTAAGGCATTCCGCCATAAATAAGATTCACATCACGACATCGATCACACGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉3

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-3

TGGCACCTACGATCTAAGGCACTTAATCAACATATCTCTTCTGTATTCTCTCCACGCATACAGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉4

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-4

TGGCACCTACGATCTAAGGCAACGTCTCCAATCCGCACTTATAATTATGTTCTTACCTAAGAGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉5

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-5

TGGCACCTACGATCTAAGGCACGCTCATCACCATCTCCTACCTATATACATCACCTTCGCCTGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉6

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-6

TGGCACCTACGATCTAAGGCACATATCATCCTCCATACACGACCAACCACTCCGTCTTCACTGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉7

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-7

TGGCACCTACGATCTAAGGCAAACAAACACTCTCGCACATTACCTTATTTATCAAGAATATAGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉8

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-8

TGGCACCTACGATCTAAGGCACCGCTTATCTACACTAAATACAATTTCCTCCTCACCCTCCAGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉9

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-9

TGGCACCTACGATCTAAGGCACACGCCTCCAATATCAACTTAATAATACACCACTAATTTCTGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉10

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-10

TGGCACCTACGATCTAAGGCACACACGCCACTTATACAACAATCCAACCGCCTACCACTACTGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉11

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-11

TGGCACCTACGATCTAAGGCATAGCATCACTACTCGCTATTTCCTATAATCCTAGCCTTATAGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉12

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-12

TGGCACCTACGATCTAAGGCACTAGAAACTCCAACACATACACACACAGACCCGCTCCATAAGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉13

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-13

TGGCACCTACGATCTAAGGCATCGCATAACGCTCCACAATATTAACATACTTCTCTTCTTATGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉14

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-14

TGGCACCTACGATCTAAGGCATCATAATATTCGCTCACTCTAATCATACATTATCTTCTTGTGGACTACCAATGCAACGTCAC

〈210〉15

〈211〉 83

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CRISP1-15

TGGCACCTACGATCTAAGGCAATAATATTCGCTCACTATAATCAACATTATCTTCTTGTTCTGGACTACCAATGCAACGTCAC

Claims (3)

1.一种用于唇癌检测的试剂盒，其含有能特异性与CRISP1蛋白特异性结合的核酸适体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体的序列如SEQ ID No：14所述。

3.一种检测唇癌的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。