具体实施方式
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
附图中涉及的附图标记和组成部分如下所示:
1.底板 2.样品垫
3.金胶垫 4.硝酸纤维膜层
5.吸水纸层 6.唾液
7.层析方向
实施例1免疫组化
实验材料:正常唇组织、唇癌组织;一抗为羊抗人CRISP1抗体,二抗驴抗羊Dylight594抗体。
实验方法:
组织芯片就是将大量组织样品有序地组合在一个微小基片表面,借助免疫组织化学的方法进行检测。
1、将组织用PFA固定液固定5分钟,PBS洗10分钟
2、抗原修复:用0.01M柠檬酸盐溶液暴露抗原决定族。微波炉高火3分钟加热修复液至沸腾(4分钟),再连续低火微波1分钟、两次。冷却至室温,PBS洗10分钟。用0.5%的Triton破膜10分钟。
3、封闭非特异性蛋白
1) PBS 浸泡3分钟×3次
2) 3% H2O2-甲醇(30% H2O210ml+甲醇90ml)室温浸泡30分钟
3) 自来水冲洗10分钟,PBS 浸泡3分钟×3次,甩干或纸巾吸去多余液体(勿碰到组织),用组化笔在组织周围画上圈(蒸馏水冲洗时间内配好10%封闭血清)
4) 在圆圈内组织内迅速滴入5% BSA(用PBS配制),封闭非特异性抗原(勿让组织干燥,应在纸巾吸掉水后立即加入),室温30分钟(配好一抗),扣掉封闭液,不洗。
4、一抗孵育
甩去切片上的BSA,用滤纸擦干组织周围残留BSA,直接加入已稀释的羊抗人CRISP1抗体(约60μl),放入湿盒中4℃过夜。第二天从冰箱中取出需37 ℃复温30 min。
5、二抗孵育
1) 将一抗洗掉,将玻片插入塑料玻片架,然后整个放入塑料盒中,加PBS浸泡放于微型振荡器上洗10分钟。
2) 用滤纸将圆圈周围的水吸去,加入二抗驴抗羊Dylight594抗体,室温30分钟。
3) 加PBS浸泡放于微型振荡器上洗10分钟。
6、封片
纸巾吸除多余液体,在玻片上滴管滴加DAPI封片液一滴,然后盖上盖玻片,用镊子轻轻挤压,并赶走气泡,室温放置1小时。观察。
实验结果,组织芯片免疫组化染色显示CRISP1分泌蛋白在30个唇癌组织的23个中呈明显阳性,而在正常组织中为阴性。
实施例2酶联免疫吸附实验(Elisa)
总体共90例,其中唇癌(鳞状细胞癌)病例组30例;口腔其他疾病(牙周病,牙髓病,口腔念珠菌病)组30例;健康对照人群30例。采用富含半胱氨酸分泌蛋白检测试剂盒检测,检测步骤参照富含半胱氨酸分泌蛋白定量酶联检测试剂盒使用说明书。
CRISP1的ELISA检测结果:
1. 唇癌组高于其它两组,而其他疾病组与健康人群组无差异(P=0.802)。
表1唾液 CRISP1诊断唇癌的诊断价值
诊断指标 |
AUC |
灵敏度 |
特异度 |
假阳性率 |
假阴性率 |
Youden指数 |
Urine CRISP1
10 ng/ml |
0.825 |
86.2% |
37.4% |
58.7% |
13.9% |
0.236 |
Urine
CRISP1 40 ng/ml |
0.825 |
72.7% |
85.2% |
12.7% |
27.6% |
0.579 |
(说明:AUC:ROC曲线(受试者工作特征曲线,)下面积;AUC越接近于1,说明诊断效果越好;AUC在0.5~0.7时有较低准确性,AUC在0.7~0.9时有一定准确性,AUC在0.9以上时有较高准确性。Youden指数:约登指数=灵敏度+特异度-1;Youden指数达到最大所对应的值为最佳诊断界值。)
唾液 CRISP1对唇癌的诊断价值高,其AUC 达0.825。以CRISP1 10ng/ml为诊断阈值,其对唇癌的诊断灵敏度为86.2%,特异度为37.4%,假阳性率为58.7%,假阴性率为13.9%;以CRISP1 40 ng/ml为诊断阈值,其灵敏度为72.7%,特异度为85.2%,假阳性率为12.7%,假阴性率为27.6%。唾液 CRISP1浓度40 ng/ml为最佳诊断界值;唾液 CRISP1浓度10 ng/ml可用于筛检目的。
实施例3 制备试纸的金标抗体复合物
一、胶体金制备
将100ml 0.005%-0.02%的氯金酸溶液加入圆底烧瓶中加热至沸腾,沸腾后在剧烈搅拌下迅速准确地加入新鲜配制的0.4%-2%的柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液1-2.2ml,煮沸10-25分钟后,继续搅拌冷却至室温。此过程中可以看到溶液的颜色变化是:金黄色→黑色→紫色→深蓝→鲜红色,当溶液的颜色完全变为透明的鲜红色时,即制得所需的胶体金。冷却后装入透析袋中对超纯水(1:5000)透析三次,最后将透析好的胶体金转移到干净的带旋盖的玻璃瓶中,在4℃避光的环境下保存。
二、金胶体与蛋白的连接
1、胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值,在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下,二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时,则会聚集而失去结合能力。
2、待标记蛋白溶液的制备:将待标记蛋白预先在0.003 mol/l-0.01 mol/l pH5.5-7.8 NaCl溶液中4℃透析过夜,以除去多余的盐离子。然后100000转4℃离心1h,去除聚合物。
3、待标胶体金溶液的准备:以0.05 mol/l-0.3 mol/l K2CO3调胶体金液的pH值为7.5-10.0。由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板,因此,在调节pH时,采用精密pH试纸测定为宜。
4、胶体金与标记蛋白用量之比的确定: 根据待标记蛋白的要求,将胶体金调好pH之后,分装10管,每管1ml。将标记蛋白以0.005mol/l pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5μg/ml~50μg/ml,分别取1ml,加入上述金胶溶液中,混匀。对照管只加1ml稀释液。5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2h,观察结果。对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管,均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量,即为标记该蛋白质的最低用量,在实际工作中,可适当增加10%~20%。
5、胶体金与抗CRISP1单抗的结合:将胶体金溶液以0.05 mol/l-0.3 mol/l K2CO3调pH至7.5-10.0,加入透析好的抗CRISP1单抗溶液,漩涡混合器混匀,反应10min后,加入稳定剂以防止胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5%BSA使溶液终浓度为1%;1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。
6、胶体金标记蛋白的纯化: 制备好的胶体金标记抗体复合物在900rpm/min离心15min,仔细吸出上清,沉淀物用含5%的蔗糖和0.05% Tween-20的0.002M硼酸盐缓冲溶液复溶。离心洗涤两次,最后将复合物浓缩至原体积的1/10,4℃保存。
实施例4 制备快速诊断唇癌的CRISP1试纸
请参照附图1,附图1是唇癌的CRISP1诊断试纸的结构示意图。该试纸设有底板1,底板上依次覆盖样品垫2、金胶垫3、硝酸纤维膜层4和吸水纸层5。所述底板1是PVC底板,样品垫2的材料是吸唾液玻璃纤维。金胶垫3的制作:将实施例3所制备得到的金标抗体溶液喷点在1cm宽的玻璃纤维膜上,点样量约为2ul/cm,37℃干燥。硝酸纤维膜层4的制作:将二抗喷点在硝酸纤维膜(NC膜)上,作为质控线(C线)。将抗CRISP1多克隆抗体喷点在距离质控线1cm处作为测试线(T线),点样量约为1ul/cm。所述的测试线(T线)的检测阈值为10-40 ng/ml。37℃干燥。将上述的样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层、吸水纸层依次组装在底板上,切成4mm宽的试纸条,装入检测卡中。
实施例5快速诊断唇癌的CRISP1试纸的检测
请参照附图2,附图2是唇癌的CRISP1诊断试纸的检测结果示意图。
一、试纸检测方法:
1、取50ul的待测样本(唾液)加在试纸条的加样区S处;
2、在10min后记观察记录检测结果。20min后观察的结果无效。
二、检测结果的判断:
1、阳性结果:请参照附图2A,在试纸条的测试线T线和质控线C线位置上各出现一条紫红色条带。
2、阴性结果:请参照附图2B,仅在试纸条的质控线C线上出现一条紫红色条带。
3、无效结果:请参照附图2C,在试纸条的质控线C线上未出现紫红色条带。
三、检测原理
请参照附图3,附图3是唇癌的CRISP1诊断试纸的检测过程示意图。如图所示,几滴唾液6滴在样品垫2上,因层析作用,液体沿层析方向7向吸水纸层5方向流动,当流经金胶垫3时,金标抗体便会被溶解,并与唾液中的CRISP1结合,形成金标复合物,随液体继续前移,在流经T线(检测线)时,复合物与T线上的抗CRISP1多克隆抗体结合而凝聚显色,流经C线(质控线)时,复合物与二抗结合而凝聚显色,如C线不显色则表明检测无效。若T线显色则表明病人唾液中CRISP1含量大于或等于10-40ng/ml,为阳性,表示有患唇癌的可能,若T线不显色则表明病人唾液中CRISP1含量正常。