CN105717304A - 一种白色念珠菌特异性检测试剂盒 - Google Patents

一种白色念珠菌特异性检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种白色念珠菌特异性检测试剂盒。该试剂盒主要含有用于特异性检测人Cdc37蛋白的适配体；本试剂盒具有较高的灵敏度，可用于检测样品中Cdc37蛋白的含量，并可为白色念珠菌引起的口腔疾病患者的早期诊断提供最直接、有效的检测方法。

Description

一种白色念珠菌特异性检测试剂盒
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种白色念珠菌特异性检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
念珠菌属于真菌界——半知菌亚门——芽孢菌纲——隐球酵母目——隐球酵母科，是双相型单细胞酵母菌。念珠菌是一种芽生的酵母状真菌，一种典型的条件致病菌。已知可以致病的常见念珠菌有：白念(Candidaalbican)、热带(Candidatropicalis)、近平滑(Candida，parapsilosis)、克鲁斯(Candidakrusei)、星状(Candidastellatoidea)、李也蒙(Candidaguilliermondii)和光滑念珠菌(Candida，glabrata)等八种在人体中，无症状时常表现为酵母细胞型；侵犯组织和出现症状时常表现菌丝型。
念珠菌是一种腐物寄生菌，广泛存在于自然界。是人体正常菌群之一，平时主要生存于人体的口腔、皮肤、粘膜、消化道、阴道及其他脏器中。正常人群白色的带菌率可高达40％；从阴道粘膜分离出来的念珠菌85％～90％为白色，而白色念珠菌(Candidaalbican)的致病性最强。
白念珠菌，又称白假丝酵母菌，常存在于人体口腔、咽喉、肠道、阴道粘膜等处，是重要的条件致病菌，在免疫功能明显下降(如器官移植、糖尿病、恶性肿瘤、血液病、严重营养不良等)，或大量使用抗菌素导致菌群失调时，该菌可引起严重的全身侵袭性感染。白念珠菌侵袭性感染的实验室诊断难度比较大，由于该菌是条件致病菌，在人体多部位栖息，经常引起浅表感染，临床分离阳性时不易判断是否致病：另外，许多深部标本无法采集，不能用培养法分离，这些都降低了诊断率。白色念珠菌(简称白念，Candidaalbicans，CA)、热带假丝酵母菌(简称热带，Candidatropicalis，CT)和光滑假丝酵母菌(简称光滑，Candidaglabrata，CG)是其中的主要致病菌，其分布广泛，感染类型多祥，已成为临床抗感染治疗的难点。
口腔念珠菌病是真菌一念珠菌属感染所引起的口腔黏膜疾病。近年来，由于抗生素和免疫抑制剂在临床上的广泛应用，发生菌群失调或免疫力降低，而使内脏、皮肤、黏膜被真菌感染者日益增多，口腔黏膜念珠菌病的发生率也相应增高。据报道，此种菌属于隐球菌科的念珠菌、高里念珠菌、假热带念珠菌，其中白色念珠菌是最主要的病原菌。
口腔念珠菌病按其主要病变部位可分为：念珠菌口炎、念珠菌唇炎、念珠菌口角炎、慢性黏膜皮肤念珠菌病。和白念珠菌感染有关的口腔疾病还有：扁平苔藓、毛舌和正中菱形舌炎。口腔念珠菌病如不加处理，可蔓延到咽喉、消化道及呼吸道，并可并发真菌性败血症、心内膜炎、脑膜炎等严重并发症。
口腔念珠菌病以局部治疗为主，但严重病例及慢性念珠菌感染常需辅以全身治疗才能奏效。目前，在治疗中以抗真菌西药药物为主，但大多为抗生素类药物，由于广谱抗生素本身可造成菌群失调(如口服四环素20天以上可有2％～3％的患者发生菌群失调)破坏人体消化道内细菌和真菌的平衡状态，能抑制有抗真菌作用的某些革兰氏阴性菌和能合成维生素B族的细菌的生长；维生素B族的缺乏也可导致细胞氧化作用的辅酶受抑，使组织抵抗力降低，因而有利于真菌生长。因此，采用此类药物治疗往往只能治标不能治本，并且甚至病情容易发生反复，而且抗生素类药物的滥用也会对人体造成损害，容易出现头痛、胃肠不适，长期用药有肝损害等副作用。
因此，在口腔念珠菌发病之前，就能够够快速鉴定所述的菌株，在治疗上具有重要的意义。
目前临床应用的念珠菌的检测方法有以下几种：
常规涂片镜检是最基本的细菌学检查方法。其优点是简便、快速和价廉，当天出结果；缺点是敏感性低，特异性差，无法辨别死菌与活菌。通常需用科玛嘉念珠菌显色培养基进一步证实。
沙氏培养基是念珠菌感染诊断较为常用的培养基，但临床上念珠菌感染症有的为混合感染，不同的念珠菌在沙氏培养基上生长均呈现白色菌落，要进一步鉴定不同的菌种，有时还必须要做念珠菌的发酵试验和芽管试验，给实验室的诊断带来很大的不便。
科玛嘉(CHROMagar)培养基培养法，该培养基含有特殊显色物质，无需通过任何仪器，仅通过观察菌落颜色即能在24～48小时(大多为48小时，30～37℃)用肉眼对念珠菌等进行定性和定量分析。但是培养所用的时间相对较长，不利于快速诊断。
另外，随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用，微生物菌种鉴定逐渐由传统的形态学观察和人工生理生化实验鉴定发展进入了基于仪器自动化分析的鉴定系统阶段。如Biolog微生物自动分析系统、API20C.ATB32C、VITEKYBC和APICandid系统等。这些快速鉴定系统大多数是应用于临床酵母菌的鉴定，如假丝酵母属、隐球酵母属等，针对性较强，能鉴定的酵母菌种类较少，其中API20C能鉴定的酵母菌种类为37种，ATB32C能鉴定的酵母菌种类为69种。虽然，目前我国已累计引进Biolog微生物自动分析系统有100余台，但主要是应用于细菌的鉴定分析，应用于酵母菌鉴定的研究成果很少。
乳胶凝集反应、放免测定以及酶联免疫吸附测定，也可以作为念珠菌的辅助检测手段，但它们的敏感性和特异性均较差。
RAPD分型法，又称任意引物聚合酶链反应(ArbitrarilyprimedPCR)，AP-PCR)，是一种以PCR为基础揭示基因组多态性的方法。该法采用随机合成的单个寡核苷酸引物。在未知模板DNA序列情况下，以低退火温度与基因DNA两条链的多个非特异位点通过错配而复性，扩增产物经琼脂凝胶电泳分离产生指纹图谱。由于不同种细菌或同种细菌的不同菌株与引物结合的退火点的亲和性、数量和位置不同，所产生的指纹图谱均有各自的特征，以此反映种系发育过程中的相互联系及不同克隆间的差异。
该方法目前在日常医院感染的监测与预防控制中占主导地位，但存在分辨率低、影响因素多、重复性较差等诸多不足。
Cdc37是特异地参与激酶成熟的分子伴侣，识别激酶的活性区域并与之结合，然后募集Hsp90，帮助激酶正确折叠。Cdc37参与了多种重要蛋白激酶的成熟过程，与口腔念珠菌的致病性有密切关系。因此，检测口腔致病菌的Cdc37蛋白即可有效的用于鉴定致病性的口腔念珠菌的存在。
系统进化指数富集技术(SELEX技术)是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)。该技术己成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速鉴定口腔念珠菌的试剂盒。
本发明的目的是通过系统进化指数富集技术(SELEX技术)筛选口腔念珠菌Cdc37蛋白的寡核苷酸适配子来替代抗体，提供一种简洁快速、高灵敏度、高特异性的Cdc37蛋白早期检测及分离纯化方法，从而快速的鉴定口腔念珠菌。
本发明的技术方案：
本发明中用于系统进化指数富集技术筛选的单链DNA随机文库及引物，由上海生工公司合成，两端为固定序列，中间为38个碱基的随机序列：5’-CCTGAACGTAGACGGAATCA(N38)TGCAGTAAGCAGTCTGACAG-3’，库容量为1014以上；
引物1：5’-CCTGAACGTAGACGGAATCA-3’；
引物2：5’-CTGTCAGACTGCTTACTGA-3’。
Cdc37蛋白其序列参见SEQIDNo：1的氨基酸序列，通过真核表达获得。
GelRed核酸染料购于Biotium公司；
硝酸纤维素滤膜购于上海生工；
寡聚核苷酸的纯化试剂购于北京天为时代公司；
PCR试剂盒和T载体购于上海生工。
一种亲和Cdc37核酸适配子，其特征在于核苷酸序列为：SEQIDNO：2-4任一所示的DNA分子。
一种上述亲和Cdc37核酸适配子，其特征在于：具有相同功能的寡核苷酸适配子同源序列占60％以上。
一种上述亲和Cdc37核酸适配子，其特征在于：衍生的RNA序列具有相同的功能。
一种上述亲和Cdc37核酸适配子，其特征在于：为能与DNA序列进行杂交的寡核苷酸序列。
一种上述亲和Cdc37核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位置删除或增加部分寡核苷酸残基所得到的寡核苷酸适配子序列具有相同的功能。
一种上述亲和Cdc37核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位置进行核苷酸种类和稀有碱基的置换后，得到的寡核苷酸适配子序列具有相同的功能。
一种上述亲和Cdc37核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位置进行磷酸化、甲基化、氨基、巯基、同位素、生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记修饰后，得到的寡核苷酸适配子序列具有相同的功能。
一种上述亲和Cdc37核酸适配子，其特征在于：用于Cdc37的检测和分离纯化，从而用于脑疾病的检测。
一种上述亲和Cdc37核酸适配子的制备方法，按以下步骤进行：1)单链DNA随机寡核苷酸文库的合成；2)利用系统进化指数富集方法对寡核苷酸文库进行筛选；3)扩增与人白蛋白特异结合的寡核苷酸；4)进行下一轮筛选，经过12轮以上筛选后获得目的寡核苷酸序列；5)克隆测序。
本发明的优点是：具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势：1)本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本；2)具有比抗体更高的亲和性和特异性；3)便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；4)重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感。因此，系统进化指数富集技术具有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例1Cdc37的制备
利用本领域常规的真核表达的方法，将SEQIDNO：1的蛋白序列进行真核表达制备获得Cdc37蛋白，蛋白浓度为100mg/mL。
实施例2合成随机单链DNA文库和引物
随机单链DNA(ssDNA)文库：5’-CCTGAACGTAGACGGAATCA(N38)TGCAGTAAGCAGTCTGACAG-3’，构建了长度为78nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为38个碱基的随机序列，库容量为IO14以上；引物1：5’-CCTGAACGTAGACGGAATCA-3’；引物2：5’-CTGTCAGACTGCTTACTGA-3’；将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100μmol/L贮存液_20℃贮存备用。
将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μgRNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与5ugCdc37蛋白，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，1.5mmol/LEDTA，0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μlDEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行9轮。得到了3个适配子，其序列分别为SEQIDNO：2-4所示。具体序列如下所示：
Cdc37-1：CTGAACGTAGACGGAATCACCTCATAGAATCCAATTTCACTGTTAACACACATAATTTGCAGTAAGCAGTCTGACAG；
Cdc37-2：CCTGAACGTAGACGGAATCATCTTAACCAACCAACACATACCACCACAATCTACAAACTGCAGTAAGCAGTCTGACAG；
Cdc37-3：CCTGAACGTAGACGGAATCACTCTCCTATACCTCTTCCTCTACTTACCATCTCCATCTTGCAGTAAGCAGTCTGACAG；
实施例3蛋白结合适配子的性能测定
将适配子分别取2.0μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化1h，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的适配子分别与不同浓度(1-200nM)的Cdc3737℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与目的蛋白的解离常数。结果如下：
名称 解离常数Kd(单位nM)
Cdc37-1 7.6
Cdc37-2 7.3
Cdc37-3 7.4
PBS空白对照 无结合能力
实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析
分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，酵母Cdc28蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，与3条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与人Cdc37蛋白结合保持较高的特异性。
将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置四周。通过RT-PCR检测，发现四周的放置其结构稳定，没有被降解。
实施例5所述适配子疾病的诊断
取6个鵝口疮患者和4个正常人的唾液，使用生理盐水稀释，加入1％SDS，获得目标样本。
将3个偶联有标记的适配子分别与6个患者以及4个正常人的样本混合40min，通过生物素分离，定量分析其中的Cdc37的含量，通过分析发现，6个患者中都检测到了Cdc37蛋白。4个正常人的血液中均没有检测到相关蛋白。由此可见，本发明的适配子能够用于诊断口腔诊断效果较好。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于口腔念珠菌检测的试剂盒，其含有能特异性检测白念珠菌的核酸适体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其含有SEQIDNo：2-4任一所述核酸适体。
3.一种检测口腔念珠菌的方法，其特征在于利用权利要求1所述的试剂盒。
4.SEQIDNo：2-4任一所述核酸适体在制备用于口腔念珠菌检测的试剂盒中的用途。
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