CN100482673C - 使用免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物结合细胞因子和/或化疗剂或放射治疗对免疫系统的协同刺激作用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过免疫子化合物增强免疫应答的优化方法和组合物，其用于治疗疾病，例如但不限于治疗患者的癌症、自体免疫疾病、哮喘、呼吸过敏症、食物过敏症和传染性疾病。本发明中优化的方法提供了本发明免疫刺激性寡核苷酸和免疫子化合物的治疗效果与细胞因子免疫疗法和/或化疗剂和/或放射的治疗效果之间的协同作用。

Description

使用免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物结合细胞因子和/或化疗剂或放射治疗对免疫系统的协同刺激作用

相关申请

本申请要求申请日为2003年7月15日的美国临时申请No.60/487,529，以及2003年9月15日的美国临时申请No.60/503,242的优先权，其全文在此引用作为参考。

发明背景

发明领域

本发明涉及免疫子(immunomer)化合物和免疫刺激性寡核苷酸作为治疗剂的应用。

相关技术概要

近来，一些研究者已经证明了使用寡核苷酸作为免疫刺激剂在免疫治疗中应用的有效性。磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸能够诱导免疫刺激的发现已经引起了将这些化合物开发为治疗工具的兴趣。这些努力已经集中在含有天然二核苷酸CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸上。Kuramoto等，Jpn.J.Cancer Res.83：1128-1131(1992)指出含有包含CpG二核苷酸的回文序列的磷酸二酯寡核苷酸可以诱导α和γ干扰素的合成并且增强天然杀伤细胞活性。Krieg等，Nature 371：546-549(1995)公开了含有CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸具有免疫刺激性。Liang等，J.Clin.Invest.98：1119-1129(1996)公开了该寡核苷酸激活了人类B细胞。Moldoveanu等，Vaccine 16：1216-124(1998)指出含有CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸增强了对流感病毒的免疫应答。McCluskie和Davis，J.Immunol.161：4463-4466(1998)指出含有CpG的寡核苷酸作为蛋白佐剂，增强了对乙肝表面抗原的免疫应答。

含有CpG硫代磷酸酯寡核苷酸的其它修饰也能够影响它们作为免疫应答调节剂的能力。例如，可见Zhao等，Biochem.Pharmacol.(1996)51：173-182；Zhao等，Biochem Pharmacol.(1996)52：1537-1544；Zhao等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.(1997)7：495-502；Zhao等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(1999)9：3453-3458；Zhao等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2000)10：1051-1054；Yu等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2000)10：2585-2588；Yu等.，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2001)11：2263-2267；以及Kandimalla等，Bioorg.Med.Chem.(2001)9：807-813。美国专利No.6,426,334显示了这些化合物作为抗癌试剂的前景。

另一个调节免疫应答的方法是通过细胞因子的治疗性使用。细胞因子为免疫系统细胞产生的调控其它细胞间反应的可溶分子。因此，细胞因子为体液和细胞免疫的调节剂。对T细胞如何介导免疫应答的理解对于调节应答是关键的。CD4+T辅助(Th)细胞按照Th1或者Th2途径分化。Th1途径对于产生细胞介导的免疫是重要的并且表现为产生，例如，γ-干扰素和白介素-2(IL-2)。Th2应答对于产生体液免疫是重要的并且表现为产生，例如，IL-4和IL-5。已知Th1应答对于抵抗感染，例如，病毒感染的免疫系统和机体的免疫系统监督以移除肿瘤细胞很关键。

Krieg，A.，M.等(美国专利No.6,429,199)and Krieg，A.，M.等(美国专利No.6,218,371)旨在教导免疫刺激性CpG寡核苷酸和细胞因子，特别是GM-CSF的联合给药。Decker等(Experimental Hematology 28：558-565(2000))证明了IL-2和CpG寡核苷酸的联合给药增加了B-慢性淋巴细胞(B-CLL)中TNF-α和IL-6的产生，而在正常的B-细胞中则没有。

这些报道明确了还需要进一步优化免疫刺激性寡核苷酸在疾病治疗中的治疗效果和增强免疫刺激性寡核苷酸的抗癌活性。

发明概述

本发明提供为增强由免疫刺激性化合物引起的免疫应答的优化的方法、组合物和治疗用药法，以用于治疗患者疾病，例如，但不限于，治疗癌症、自身免疫疾病、哮喘、呼吸系统过敏、食物过敏和传染性疾病。本发明优化的方法提供本发明的免疫刺激性寡核苷酸的治疗效果和细胞因子免疫治疗和/或化疗剂的治疗作用之间协同作用。优化呈递5’末端的免疫刺激性寡核苷酸的修饰明显增强了其抗癌活性。该寡核苷酸在本文中表示为＂免疫子＂，其可以含有一个或多个免疫刺激性寡核苷酸。

因此，在第一个方面，本发明提供在癌症患者中治疗癌症的方法，包括对患者给药结合化疗剂的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物，其中免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物和化疗剂产生协同治疗效果。

在另一方面，本发明提供协同刺激患者免疫应答的方法。该方法包括对患者给药治疗有效协同(synergistic)量的至少一种本发明免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸和治疗有效协同量的IL-2(和/或在原位诱导IL-2产生的试剂，例如DNA疫苗或表达IL-2的表达载体)的组合，其中给药所述组合协同刺激患者细胞因子的产生。优选本发明协同刺激的细胞因子选自IL-12和干扰素-γ(IFN-γ)，IFN-α，IFN-β或其组合。

本发明中，“免疫子”意指含有至少两个寡核苷酸的任意化合物，所述两个寡核苷酸直接在其3’端，或直接通过核苷酸间连接，或直接在功能性核苷酸碱基或糖基连接，或间接通过非核苷酸连接体连接在一起，其中至少一个寡核苷酸在免疫子化合物的上下文中，为具有可接近的(accessible)5’端的免疫刺激性寡核苷酸。在本发明的上下文中，免疫刺激性寡核苷酸为含有至少一个免疫刺激性CpG二核苷酸、免疫刺激性结构域、或者其它免疫刺激性部分的寡核苷酸。本文中，术语“可接近的5’末端”表示寡核苷酸的5’末端是充分可用的，从而使得识别与结合免疫子化合物与免疫刺激性寡核苷酸，并刺激免疫系统的因子能够接近该5’末端。所述免疫刺激性寡核苷酸可能包括二级结构，只要该5’末端保持可接近的。

在一些实施例中，用于本发明所述方法的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物包括免疫刺激性二核苷酸，其选自CpG、C^*pG、CpG^*、或C^*pG^*，其中C为胞苷或2′-脱氧胞苷，C^*为2’-脱氧胸苷，阿拉伯糖胞苷，2’-脱氧-2’-取代的阿拉伯糖胞苷，2’-O-取代的阿拉伯糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，其它非天然嘧啶核苷，或1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤；G为鸟苷或2′-脱氧鸟苷，G^*为2’脱氧-7-脱氮鸟苷，2’-脱氧-6-硫代鸟苷，阿拉伯糖鸟苷，2’-脱氧-2’取代的-阿拉伯糖鸟苷，2’-O-取代的-阿拉伯糖鸟苷，或者其它的非天然的嘌呤核苷，并且p为选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的核苷酸间连接。在某些优选的实施例中，免疫刺激性二核苷酸不为CpG。

在一些实施例中，用于本发明所述方法的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物包括式(III)所示的免疫刺激性结构域：

5’-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3’             (III)

其中：

Y为胞苷，2’-脱氧胸苷，2’-脱氧胞苷，阿拉伯胞苷，2’-脱氧-2’-取代的阿拉伯糖胞苷，2’-O-取代的阿拉伯糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，其它非天然的嘧啶核苷，或者1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤；

Z为鸟苷或2′-脱氧鸟苷，为2’脱氧-7-脱氮鸟苷，2’-脱氧-6-硫代鸟苷，阿拉伯糖鸟苷，2’-脱氧-2’取代的-阿拉伯糖鸟苷，2’-O取代的-阿拉伯糖鸟苷，2’-脱氧肌苷，或者其它非天然的嘌呤核苷。

N1，每次出现，优选为天然存在的或合成的核苷或选自无碱基(abasic)核苷，阿拉伯糖核苷，2′-脱氧尿苷，α-脱氧核糖核苷，β-L-脱氧核糖核苷的免疫刺激性部分，并且通过磷酸二酯或修饰的核苷间连接在3’端连接至相邻的核苷的核苷，修饰的核苷间连接选自但不限于，具有从2埃至约200埃长度的连接体、C2-C18烷基连接体，聚(乙二醇)连接体，2-氨基丁基-1，3-丙二醇连接体，甘油基连接体，2′-5′核苷间连接，以及硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，或者甲基膦酸酯核苷间连接；

Nn，每次出现，独立地为天然存在的核苷或免疫刺激性部分，优选选自无碱基核苷，阿拉伯糖核苷，2′-脱氧尿苷，α-脱氧核糖核苷，2′-O-取代的核糖核苷，并且核苷通过修饰的核苷间连接与相邻的核苷在3′端连接，修饰的核苷酸间连接选自氨基连接体，C2-C18烷基连接体，聚(乙二醇)连接体，2-氨基丁基-1，3-丙二醇连接体，甘油基连接体，2′-5′核苷间连接，以及甲基膦酸酯核苷间连接；

条件为至少一个N1或Nn为免疫刺激性部分；

其中n为0-30的数字；

其中3’核苷任选地直接或通过非核苷酸连接体连接至另一个寡核苷酸，其可以具有或不具有免疫刺激性。

在第二方面，本发明提供治疗癌症患者癌症的方法，包括将免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子结合物(其如上文所描述的包括免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物)和在除可接近的5’端之外的位置与免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物结合的癌症抗原，与化疗剂组合给药。

在第三方面，本发明提供药物制剂，包括本发明的免疫刺激性寡核苷酸或免疫刺激性寡核苷酸结合物和/或免疫子化合物或免疫子结合物，化疗剂和生理学可接受载体。

在第四方面，本发明提供使癌细胞对电离辐射致敏的方法。本发明该方面的方法包括给药至哺乳动物本发明的免疫刺激性寡核苷酸或免疫子化合物并且用电离辐射治疗该动物。

在第五方面，本发明提供协同刺激患者的免疫应答的方法，包括给药至患者治疗有效协同量的至少一种免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸同治疗有效协同量的IL-2的组合(以及任选一种抗原)，其中所述组合的给药协同刺激患者细胞因子的产生。优选本发明协同刺激的细胞因子选自IL-12和干扰素-γ，IFN-α，IFN-β或其组合。在本发明第二方面的某些实施例中，抗原任选地与免疫子化合物在除了可接近的5’端之外的位置相连。

在本发明的第六方面，至少一种不是免疫子化合物的免疫刺激性寡核苷酸与治疗有效量的IL-2联合使用以选择性和协同刺激患者细胞因子的产生。优选本发明协同刺激的细胞因子选自IL-12和IFN-γ，IFN-α，IFN-β或其组合。依照本发明，优选的不是免疫子化合物的免疫刺激性寡核苷酸包括那些含有至少一个免疫刺激性CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸，其中C不为胞嘧啶或脱氧胞嘧啶和/或G不为鸟苷或2-脱氧鸟苷。其它优选的本发明的不是免疫子化合物的免疫刺激性寡核苷酸为含有非CpG的替代的免疫刺激性部分的那些。该替代的免疫刺激性部分的例子包括但不限于含有非天然存在的碱基和/或糖基的核苷和使得寡核苷酸稳定的寡核苷酸本身的二级结构诸如发夹结构。

在第七方面，本发明提供治疗组合物，其包括治疗有效协同量的至少一种免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸，治疗有效协同量的IL-2(和/或在原位诱导IL-2产生的试剂，例如DNA疫苗或表达IL-2的表达载体)以及可选的抗原，其中给药所述组合协同刺激患者细胞因子的产生。优选的本发明协同刺激的细胞因子选自IL-12和IFN-γ，IFN-α，IFN-β或其组合。

本发明所有方面的方法和组合物有效的用于人类或兽类疾病的治疗，包括免疫系统调节和基于免疫的治疗。特别优选的疾病靶包括癌症、传染病、哮喘和过敏症。

附图主要说明

图1为本发明的代表性免疫子化合物的图示。

图2描述了本发明几种代表性的免疫子化合物。

图3描述了适合线性合成本发明免疫子的一组有代表性的小分子连接体。

图4描述了适合平行合成本发明免疫子的一组有代表性的小分子连接体。

图5为线性合成本发明免疫子化合物的合成示意图。DMTr＝4，4′-二甲氧基三苯甲基；CE＝氰乙基。

图6为平行合成本发明免疫子化合物的合成示意图。DMTr＝4，4′--二甲氧基三苯甲基；CE＝氰乙基。

图7A为寡核苷酸(Oligo)1和免疫子2-3在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-12的图解表示法。这些数据显示含可接近的5’-端的免疫子2与单体寡核苷酸1相比是更强的IL-12诱导物，不含可接近的5’-端的免疫子3与寡核苷酸1相比具有相等的或更弱的产生免疫刺激的能力。

图7B为Oligo1和免疫子2-3(分别由顶端至底端)在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-6的图解表示法。这些数据显示含有可接近的5’-端的免疫子2与单体寡核苷酸1相比是更强的IL-6诱导物，不含有可接近的5’-端的免疫子3与寡核苷酸1相比具有相等的或更弱的产生免疫刺激的能力。

图7C为寡核苷酸1和免疫子2-3(分别由顶端至底端)在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-10的图解表示法。

图8A为通过不同浓度的分别具有非可接近的和可接近的5’-端的免疫子5和6诱导细胞培养物中BALB/c小鼠脾细胞增殖的图解表示法。

图8B为通过寡核苷酸4和免疫子5-6(其在CpG部分的5’-侧翼序列中具有免疫原性化学修饰)导致的BALB/c小鼠脾肿大的图解表示法。此外，具有可接近的5’-端的免疫子化合物(6)与不具有可接近的5’-端的免疫子5和单体寡核苷酸4相比具有更强的增加脾肿大的能力。

图9A为通过不同浓度的寡核苷酸4和免疫子7和8在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-12的图解表示法。

图9B为通过不同浓度的寡核苷酸4和免疫子7和8在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-6的图解表示法。

图9C为通过不同浓度的寡核苷酸4和免疫子7和8在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-10的图解表示法。

图10A为通过免疫子14，15和16在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导细胞增殖的图解表示法。

图10B为BALB/c小鼠脾细胞培养物中不同浓度免疫子14和16导致的IL-12诱导细胞增殖的图解表示法。

图10C为BALB/c小鼠脾细胞培养物中不同浓度免疫子14和16导致的IL-6诱导细胞增殖的图解表示法。

图11A为通过寡核苷酸4和17以及免疫子19和20在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导细胞增殖的图解表示法。

图11B为通过不同浓度寡核苷酸4和17以及免疫子19和20在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-12的细胞增殖的图解表示法。

图11C为通过不同浓度寡核苷酸4和17以及免疫子19和20在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-6的细胞增殖的图解表示法。

图12为用寡核苷酸4和免疫子14，23和24的BALB/c小鼠脾肿大图解表示法。

图13显示在前列腺癌裸小鼠模型中本发明所述方法在肿瘤生长方面的效果。

图14显示本发明所述方法对研究所用大鼠在体重方面的效果。

图15A是证明用寡核苷酸1和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IL-12产生方面的协同效果的图解表示法。

图15B是证明用寡核苷酸2和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IL-12产生方面的协同效果的图解表示法。

图15C是证明用寡核苷酸3和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IL-12产生方面的协同效果的图解表示法。

图15D是证明用寡核苷酸4和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IL-12产生方面的协同效果的图解表示法。

图16A是证明用寡核苷酸1和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IL-6产生方面的效果的图解表示法。

图16B是证明用寡核苷酸2和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IL-6产生方面的效果的图解表示法。

图16C是证明用寡核苷酸3和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IL-6产生方面的效果的图解表示法。

图16D是证明用寡核苷酸4和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IL-6产生方面的效果的图解表示法。

图17是证明用寡核苷酸5和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IL-12产生方面的协同效果的图解表示法。

图18A是证明用寡核苷酸1和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IFN-γ产生方面的效果的图解表示法。

图18B是证明用寡核苷酸2和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IFN-γ产生方面的效果的图解表示法。

图18C是证明用寡核苷酸3和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IFN-γ产生方面的效果的图解表示法。

图18D是证明用寡核苷酸4和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IFN-γ产生方面的效果的图解表示法。

图19是证明用寡核苷酸5和IL-2处理BALB/c脾细胞后在IFN-γ产生方面的效果的图解表示法。

优选实施方案的详细描述

本发明涉及增强由用于免疫治疗的免疫刺激性化合物引起的免疫应答的优化的方法和组合物。本发明所述的优化的方法导致免疫刺激性化合物，如免疫刺激性寡核苷酸和免疫子化合物的治疗作用与细胞因子免疫疗法和/或化疗剂的治疗作用之间的协同作用。本文引用的授权的专利，专利申请，以及参考文献在此通过参考引用，其效果等同于对每个都特别的和单独的指明为通过参考引用。在本文所引用的任何参考所教导的与本说明书中之间有不一致的情况时，为了本发明的目的采用后者。

本发明提供增强由用于免疫治疗应用的免疫刺激性化合物引起的抗癌效果的方法用于对癌症的治疗。按照本发明的方法，当与化疗剂联合使用时免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物提供协同治疗作用。令人惊奇的是免疫刺激性寡核苷酸和免疫子化合物引起免疫系统细胞的细胞分裂，但是化疗剂通常会杀死活跃分裂的细胞。

在第一个方面，本发明提供在癌症患者中治疗癌症的方法，包括联合化学治疗制剂对患者给药免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物，后者含有至少两个相互连接的寡核苷酸，从而所述免疫子化合物具有不止一个可接近的5’端，其中寡核苷酸中的至少一个为免疫刺激性寡核苷酸。本文中，术语“可接近的5’端”表示寡核苷酸的5’末端是充分可接近的，从而使得识别与结合免疫子化合物和刺激免疫系统的因子能够接近该5’末端。任选的，5′OH可以连接磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯部分，芳香或脂肪连接体，胆固醇，或不妨碍其可接近的可接近性的另一实体。免疫刺激性寡核苷酸和免疫子化合物当给药至脊椎动物时诱导免疫应答。当与化疗剂联合应用时，获得协同治疗作用。

优选的用于本发明所述方法的化疗剂包括但不限于吉西他滨，甲氨蝶呤，长春新碱，亚德里亚霉素，顺铂，不含糖的氯乙基亚酰基脲，5-氟尿嘧啶，丝裂霉素C，博莱霉素，阿霉素，达卡巴嗪，紫杉醇，fragyline，MeglamineGLA，戊柔比星，亚硝基脲氮芥和poliferposan，MMI270，BAY12-9566，RAS famesyl转移酶抑制剂，famesyl转移酶抑制剂，MMP，MTA/LY231514，LY264618/Lometexol，Glamolec，CI-994，TNP-470，Hycamtin/托泊替康，PKC412，伐司朴达/PSC833，诺消灵/Mitroxantrone，Metaret/苏拉灭，巴马司他，E7070，BCH-4556，CS-682，9-AC，AG3340，AG3433，Incel/VX-710，VX-853，ZD0101，ISI641，ODN 698，TA 2516/Marmistat，BB2516/Marmistat，CDP 845，D2163，PD183805，DX8951f，Lemonal DP 2202，FK 317，溶链菌(Picibanil)/OK-432，AD 32/戊柔比星，氯化锶(Metastron)/锶衍生物，Temodal/替莫唑胺，阿霉素脂质体(Evacet)/脂质阿霉素，Yewtaxan/Placlitaxel，紫杉酚/紫杉醇，希罗达(Xeload)/卡培他滨，氟铁龙/去氧氟尿苷，Cyclopax/口服紫杉醇，口服紫杉烷，SPU-077/顺铂，HMR1275/Flavopiridol，CP-358(774)/EGFR，CP-609(754)/RAS致癌基因抑制剂，BMS-182751/口服铂，UFT(喃氟啶/尿嘧啶)，左旋咪唑/左旋咪唑，恩尿嘧啶/776C85/5FU增强剂，依立替康/左旋咪唑，Camptosar/依立替康，Tumodex/Ralitrexed，克拉立平/克拉屈滨，Paxex/紫杉醇，盐酸多柔比星脂质体(Doxil)/脂质阿霉素，Caelyx/脂质阿霉素，Fludara/氟达拉滨，Pharmarubicin/表柔比星，DepoCyt，ZD1839，LU 79553/Bis-Naphtalimide，LU103793/多拉司他汀，Caetyx/脂质阿霉素，健泽(Gemzar)/2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷(Gemcitabine)，ZD 0473/Anormed，YM 116，lodine种子，CDK4 andCDK2抑制剂，PARP抑制剂，D4809/Dexifosamide，Ifes/美钠针剂(Mesnex)/异磷酰胺，卫萌(Vumon)/鬼臼噻吩甙，伯尔定/碳铂，顺铂/顺铂，足叶乙苷/足叶乙甙，ZD 9331，泰索帝/多西他奇，鸟嘌呤阿糖胞苷的前药，紫杉烷类似物，亚硝脲，诸如美法仑和环磷酰胺的烷基化试剂，氨鲁米特，门冬酰胺酶，白消安，碳铂，Chlorombucil，盐酸阿糖胞苷，更生霉素，盐酸柔红霉素，磷雌氮芥磷酸钠，足叶乙甙(VP 16-213)，氟尿嘧啶，氟尿嘧啶(5-FU)，氟他米特，羟脲(羟基脲)，异磷酰胺，干扰素α-2a，α-2b，醋酸亮丙瑞林(LHRH-释放因子类似物)，环己亚硝脲(CCNU)，盐酸氮芥(氮芥)，聚体巯嘌呤，美司钠，邻对滴滴滴(o.p′-DDD)，盐酸米托蒽醌，善得定，光辉霉素，盐酸甲基苄肼，链唑霉素，三苯氧胺柠檬酸酯，硫鸟嘌呤，塞替派，长春碱硫酸酯，安吖啶(m-AMSA)，氮杂胞苷，Erthropoietin，六甲密胺(HMM)，白介素2，丙米腙(甲基-GAG；甲基乙二醛二-丙脒腙；MGBG)，喷司他丁(2′脱氧助间型霉素)，甲环亚硝脲(甲基-CCNU)，鬼臼噻吩甙(VM-26)以及长春酰胺硫酸酯.

按照本发明的该方面的方法，免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物可以通过任何合适的途径给药，包括但不限于，非肠道给药，口服给药，舌下给药，经皮给药，局部给药，鼻腔给药，气雾剂，眼内给药，气管给药，直肠给药，阴道给药，通过基因枪，皮肤贴剂或者局部膏剂或者滴眼剂或者漱口剂形式。免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物的治疗组合物的给药可以以有效减少症状或疾病的替代标记的剂量和时间周期用公知的方法进行。当全身给药时，治疗组合物优选以达到从约0.0001微摩尔至约10微摩尔的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物的血液水平的充足剂量给药。对局部给药而言，比这个低很多的浓度可以是有效的，并且高很多的浓度也可以接受。优选地，免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物的总剂量从每个患者每天约0.0001mg至每天每公斤体重200mg。可能需要同时给药，或者作为单独的治疗事件循序给药治疗有效量的一种或几种本发明的治疗组合物。

为了本发明的这个方面的目的，术语“联合”“in combination with”是指在治疗相同的患者的相同的疾病的过程中，包括以任何顺序给药免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物和/或化疗剂，包括同时给药，以及顺序分开多至几天的时间间隔。所述联合治疗可以包括免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物，和/或独立的化疗剂的不止一种单独给药。免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物和/或化疗剂可以通过相同或不同的途径给药。

在一些实施例中，用于本发明所述方法的免疫子化合物含有两个或多个免疫刺激性寡核苷酸，(在免疫子的上下文中)，其可以是相同的或不同的。优选的，每个该免疫刺激性寡核苷酸具有至少一个可接近的5′端。

在本发明所述方法的某个实施例中，除了免疫刺激性寡核苷酸，免疫子化合物也含有与基因互补的至少一个寡核苷酸。本文中，术语“互补”是指在生理条件下寡核苷酸与基因的区域杂交。在一些实施例中，寡核苷酸下调基因的表达。所述下调寡核苷酸优选选自反义寡核苷酸，核酶寡核苷酸，小抑制性RNA和诱骗(decoy)寡核苷酸。如本文所应用的，术语“下调基因”是指抑制基因的转录或基因产物的翻译。因此，用于本发明所述方法的免疫子化合物可以用于靶向一个或多个特殊的疾病目标，同时也刺激免疫系统。

在某个实施例中，本发明方法中的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物包括核酶或诱骗寡核苷酸。如本文所应用的，术语“核酶”是指具有催化活性的寡核苷酸，优选地，核酶结合至特殊的核酸目标并且裂解目标。本文中，术语“诱骗寡核苷酸”是指以序列特异性方式结合至转录因子并且抑制转录活性的寡核苷酸。优选地，核酶或诱骗寡核苷酸显示二级结构，包括但不限于茎环或发夹结构。在某个实施例中，至少一种寡核苷酸含有poly(I)-poly(dC)。在某个实施例中，至少一个系列的Nn含有3至10个dGs和/或Gs或2’-取代的核糖或阿拉伯糖Gs的串。

为了本发明的目的，术语“寡核苷酸”是指从许多连接的核苷单元形成的多聚核苷。所述寡核苷酸可以从已有的核酸资源，包括基因组或cDNA中获得，但是优选通过合成方法生产。在优选的实施例中，每个核苷单元包括杂环碱基和呋喃戊糖基(pentofuranosyl)，海藻糖，阿拉伯糖，2’-脱氧-2’-取代的阿拉伯糖，2’-O-取代的阿拉伯糖或己糖基团。核苷残基可以通过许多公知的核苷间连接中的任一个互相配对。所述核苷间连接包括但不限于磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，烷基磷酸酯，烷基硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基磷酸酯，硅氧烷，碳酸酯，烷氧羰基(carboalkoxy)，乙酰胺化物(acetamidate)，氨基甲酸酯，吗啉代，硼烷(borano)，硫醚，桥连氨基磷酸酯，桥连亚甲基膦酸酯，桥硫代磷酸酯，以及砜核苷间连接。术语“寡核苷酸”还包括具有一个或多个立体特异性核苷间连接的多核苷(例如，(R_P)-或(S_P)-硫代磷酸酯，烷基膦酸酯或磷酸三酯连接)。如本文所应用的，术语“寡核苷酸”和“二核苷酸”清楚地意图包括具有任一所述核苷间连接的多核苷和二核苷，无论该连接是否包括磷酸酯基团。在某个优选的实施例中，这些核苷间连接可以为磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，甲基膦酸酯连接，或其组合。

在一些实施例中，免疫子化合物包括每个具有从约3至约35个核苷残基的寡核苷酸，优选从约4个至约30个核苷残基，更优选从约4个至约20个残基。在一些实施例中，寡核苷酸具有从约5或6至约18个，或从约5或6至约14个核苷残基。如本文所应用的，术语“约”意味着确切的数值并不严格。因此，为了本发明的目的，寡核苷酸中的核苷残基的数量并不严格，具有一个或两个较少的核苷残基或者一个至几个增加的核苷残基的寡核苷酸被认为是上述每个实例的等同物。在一些实施例中，一个或多个寡核苷酸具有11个核苷。

术语“寡核苷酸”还包括具有额外的取代基，所述取代基包括但不限于，蛋白质基团，亲脂基团，嵌入剂，二元胺(diamine)，叶酸，胆固醇和金刚烷的多核苷。术语“寡核苷酸”还包括任意其它的含有聚合物的核苷酸碱基(nucleobase)，包括但不限于，肽核酸(PNA)，具有磷酸酯基团的肽核酸(PHONA)，闭锁的核酸(LNA)，吗啉代-主链寡核苷酸，以及具有带有烷基连接体或氨基连接体的主链部分的寡核苷酸。

用于本发明所述方法的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物可以包括天然存在的核苷，修饰的核苷，或其混合。如本文所应用的，术语“修饰的核苷”为包含修饰的杂环碱基，修饰的糖基部分，或其组合的核苷。在一些实施例中，修饰的核苷为非天然的嘧啶或嘌呤核苷，如本文所描述的。在一些实施例中，修饰的核苷为2′-取代的核糖核苷、阿拉伯糖核苷或2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核苷。

为了本发明的目的，术语＂2′-取代的核糖核苷＂包括的在戊糖部分的2′位置的羟基基团被取代以产生′-O-取代的核糖核苷的核糖核苷。优选地，该取代用含有1-6个饱和的或不饱和的碳原子的低级烷基基团或者用具有6-10个碳原子的芳基基团取代，其中所述烷基，或芳基基团可以不被取代或可以被取代，例如，用卤素，羟基，三氟甲基，氰基，硝基，酰基，酰氧基，烷氧基，羧基，羰烷氧基(carboalkoxy)，或者氨基基团。所述2′-O-取代的核糖核苷的例子包括，但不限于2′-O-甲基核糖核苷和2′-O-甲氧基乙基核糖核苷。

术语＂2′-取代的核糖核苷＂还包括其中用含有1-6个饱和的或不饱和的碳原子，或用氨基或卤素基团替代2′-羟基基团的核糖核苷。所述2’-取代的核糖核苷的例子包括但不限于2’-氨基，2’-氟，2’-烯丙基，以及2’-炔丙基核糖核苷。

术语＂寡核苷酸＂包括杂合和或嵌合的寡核苷酸。＂嵌合的寡核苷酸＂是具有一种以上类型的核苷间连接的寡核苷酸。所述嵌合的寡核苷酸的一个优选的例子为含有硫代磷酸酯，磷酸二酯或二硫代磷酸酯区域和诸如烷基磷酸酯或烷基硫代膦酸酯连接的非离子连接的嵌合的寡核苷酸(例如可见，Pederson等美国专利号5,635,377和5,366,878)。

＂杂合寡核苷酸＂是具有一种以上类型核苷的寡核苷酸。所述杂交寡核苷酸的一个优选的例子包含核糖核苷酸或2′-取代的核糖核苷酸区域，以及脱氧核糖核苷酸区域(例如可见，Metelev and Agrawal，美国Patent No.5,652,355，6,346,614和6,143,881)。

为了本发明的目的，术语＂免疫刺激性寡核苷酸＂是指如上文所述的寡核苷酸，其当给药至脊椎动物，诸如鱼，鸟或哺乳动物时诱导免疫应答。本文中，术语＂哺乳动物＂包括但不限于大鼠，小鼠，猫，狗，马，牛，奶牛，猪，兔子，非人类灵长目动物，和人。有用的免疫刺激性寡核苷酸可以在Agrawal等，WO 98/49288，1998年11月5日公开；WO 01/12804，2001年2月22日公开；WO 01/55370，2001年8月2日公开；PCT/US01/13682，2001年4月30日申请；以及PCT/US01/30137，2001年9月26日申请的描述中找到。优选地，免疫刺激性寡核苷酸包括至少一种磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，或二硫代磷酸酯核苷间连接。

在另一方面，本发明提供协同刺激患者的免疫应答的方法。该方法包括给药患者治疗有效协同量的至少一种本发明的免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸和治疗有效协同量的IL-2(和/或在原位诱导IL-2产生的试剂，例如DNA疫苗或表达IL-2的表达载体的组合)，其中所述组合的给药协同刺激患者细胞因子的产生。优选地，本发明协同刺激的细胞因子选自IL-12和干扰素-γ(IFN-γ)，IFN-α，IFN-β或其组合。

本文所应用的术语“有效协同量”表示为一段有效时间给药免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸以及IL-2的公知浓度，其使得免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸和IL-2的组合的刺激效果强于其加和，即组合的刺激效果大于基于单个刺激效果之和计算的预期的总刺激效果。

本文中术语“细胞因子”意指免疫系统细胞产生的用于调控与其它细胞之间反应的许多可溶性分子中的任意一个。术语＂细胞因子＂包括，例如，白介素(如IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，IL-10，IL12等)，干扰素(如IFN-α.，IFN-β.，IFN-γ.)，趋化因子，造血生长因子(如红细胞生成素)，肿瘤坏死因子，集落刺激因子(如G-CSF，M-CSF，GM-CSF)和转化生长因子(TGF-α)。

本发明中，“免疫子”意指含有至少两个寡核苷酸的化合物，所述寡核苷酸直接在其3’端，或直接通过核苷酸间连接，或直接在功能化核酸碱基或糖基连接，或通过非核苷酸连接体间接连接在一起，其中至少一个寡核苷酸，在免疫子化合物的上下文中，为具有可接近的5’末端的免疫刺激性寡核苷酸。在本发明上下文中，免疫刺激性寡核苷酸是含有至少一个免疫刺激“CpG”二核苷酸、免疫刺激结构域、或其它免疫刺激部分的寡核苷酸。本文中，术语“可接近的5’末端”表示寡核苷酸的5’末端是充分可得到的，从而使得识别与结合免疫子化合物与免疫刺激性寡核苷酸、并刺激免疫系统的因子能够接近该5’末端。

在一些实例中，免疫子化合物的至少一个免疫刺激性寡核苷酸含有式5′-Pyr-Pur-3′的免疫刺激二核苷酸，其中Pyr为天然或合成的嘧啶核苷，Pur为天然或合成的嘌呤核苷。本文中，术语＂嘧啶核苷＂意指核苷的碱基组分为嘧啶碱基的核苷。类似的，术语＂嘌呤核苷＂意指核苷的碱基组分为嘌呤基的核苷。为了本发明的目的，“合成的”嘧啶或嘌呤核苷包括非天然产生的嘧啶或嘌呤碱基，非天然存在的糖部分，或其组合。

本发明方法中所用的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物中优选的嘧啶核苷具有结构(I)：

其中：

D为氢键供体；

D′选自氢、氢键供体、氢键受体、亲水基、疏水基、吸电子基团和供电子基团；

A为氢键受体或亲水基；

A’选自氢键受体、亲水基、疏水基、吸电子基团和供电子基团；

X为碳或氮；和

S′为戊糖或己糖环，或非天然存在的糖。

优选的，糖环用磷酸酯部分、修饰的磷酸酯部分、或其它适于将嘧啶核苷与其它核苷或核苷类似物加以连接的连接基团加以衍生。

优选的氢键供体包括，但不限于，-NH-，-NH₂，-SH和-OH。优选的氢键受体包括，但不限于，C＝O，C＝S，和芳香杂环的环氮原子，如胞嘧啶的N3。

在一些实例中，(I)中的碱基部分为非天然存在的嘧啶碱基。优选非天然存在的嘧啶碱基的例子包括，但不限于，5-羟基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，N4-烷基胞嘧啶，优选N4-乙基胞嘧啶，和4-硫代尿嘧啶。在一些实例中，(I)中糖部分S′为非天然存在的糖部分。为了本发明的目的，＂天然存在的糖部分＂是天然作为核苷酸一部分存在的糖部分，例如核糖和2′-脱氧核糖，，“非天然存在的糖部分”为不是天然作为核苷酸一部分存在，但能够用于寡核苷酸主链中的任意糖，例如己糖。阿拉伯糖和阿拉伯糖衍生物是优选的糖部分的例子。

本发明方法中所用的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物中优选的嘌呤核苷类似物具有结构(II)：

其中：

D为氢键供体；

D’选自氢、氢键供体或亲水基；

A为氢键受体或亲水基；

X为碳或氮；

每个L独立选自C，O，N或S；和

S′为戊糖或己糖环、或非天然存在的糖。

优选的糖环用磷酸酯部分、修饰的磷酸酯部分、或其它适于将嘧啶核苷与其它核苷或核苷类似物加以连接的连接基团加以衍生。

优选的氢键供体包括，但不限于，-NH-，-NH₂，-SH和-OH。优选的氢键受体包括，但不限于，C＝O，C＝S，-NO₂和芳香杂环的环氮原子，如鸟嘌呤的N1。

在一些实例中，(II)中碱基部分为非天然存在的嘌呤碱基。优选非天然存在的嘌呤碱基的例子包括，但不限于，6-硫代鸟嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤。在一些实例中，(II)中的糖部分S′为天然产生的糖基，如前面结构(I)中所述。

在优选的实例中，本发明方法所使用的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物中的免疫刺激二核苷酸选自CpG，C^*pG，CpG^*或C^*pG^*，其中C为胞嘧啶核苷或2′-脱氧胞嘧啶核苷，C^*为2’-脱氧胸苷，阿拉伯糖胞嘧啶核苷，2’-脱氧胸苷，2’-脱氧-2’-取代阿拉伯糖胞嘧啶核苷，2’-O-取代阿拉伯糖胞嘧啶核苷，2′-脱氧-5-羟基胞嘧啶核苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞嘧啶核苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，其它的非天然嘧啶核苷，或1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤；G为鸟苷或2′-脱氧鸟苷，G^*is2’脱氧-7-脱氮鸟苷，2’-脱氧-6-硫代鸟苷，阿拉伯糖鸟苷，2’-脱氧-2’取代-阿拉伯糖鸟苷，2’-O-取代-阿拉伯糖鸟苷，2’-脱氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，p为核苷间连接，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯。在某个优选的实例中，免疫刺激二核苷酸不是CpG。

免疫刺激性寡核苷酸可以在免疫刺激二核苷酸的一端或两端都含有免疫刺激部分。因而，在一些实例中，免疫刺激性寡核苷酸含有结构(III)的免疫刺激结构域：

5’-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3’            (III)

其中：

Y为胞苷、2’脱氧胸苷、2’脱氧胞苷、阿糖胞苷、2’-脱氧-2’-取代阿拉伯糖胞苷、2’-脱氧胸苷、2’-O-取代阿拉伯糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷、其它的非天然嘧啶核苷、或1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤；

Z为鸟苷或2′-脱氧鸟苷，2’脱氧-7脱氮鸟苷，2’-脱氧-6-硫代鸟苷、阿拉伯糖鸟苷、2’-脱氧-2’取代-阿拉伯糖鸟苷，2’-O-取代-阿拉伯糖鸟苷、2’脱氧肌苷、或其它非天然嘌呤核苷；

N1，每次出现时，优选为天然存在或合成的核苷或免疫刺激部分，其选自无碱基核苷、阿拉伯糖核苷、2′-脱氧尿苷、α-脱氧核糖核苷、β-L-脱氧核糖核苷，核苷通过磷酸二酯或修饰的核苷间连接与相邻的核苷在3’端连接，修饰的核苷间连接选自，但不限于，约2埃到约200埃长的连接体、C2-C18烷基连接体、聚乙二醇连接体、2-氨基丁基-1，3-丙二醇连接体、甘油基连接体、2′-5′核苷间连接和硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间连接；

Nn，每次出现时，优选为天然出现的核苷或免疫刺激部分，其选自无碱基核苷、阿拉伯糖核苷、2′-脱氧尿苷、α-脱氧核糖核苷、′-O-取代核糖核苷，和通过修饰的核苷间连接与相邻的核苷在3’端连接的核苷，修饰的核苷间连接优选选自氨基连接体、C2-C18烷基连接体、聚乙二醇连接体、2-氨基丁基-1，3-丙二醇连接体、甘油基连接体、2′-5′核苷间连接和甲基膦酸酯核苷间连接；

只要至少一个N1或Nn为免疫刺激部分；

其中每个n独立为从0到30间的数字；和

其中，在免疫子化合物的情况下，3’端直接或通过非核苷酸连接体与其它寡核苷酸连接，所述其它寡核苷酸可以有或没有免疫刺激性。

在一些优选的实例中，YZ为阿拉伯糖胞苷或2’-脱氧-2’-取代阿拉伯糖胞苷和阿拉伯糖鸟苷或2’脱氧-2’-取代阿拉伯糖鸟苷。优选的免疫刺激部分包括在磷酸主链中的修饰，包括，但不限于，甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三酯前药、砜、磺酰胺、氨基磺酸酯、formacetal、N-甲基羟胺，碳酸酯、氨基甲酸、吗啉代，硼烷膦酸酯(boranophosphonate)，氨基磷酸酯、特别是第一氨基-氨基磷酸酯、N3氨基磷酸酯和N5氨基磷酸酯，立体定向的连接(如(R_P)-或(S_P)-硫代磷酸酯、膦酸烷基酯或磷酸三酯连接)。

优选本发明的免疫刺激性部分进一步包含具有糖基修饰的核苷，包括但不限于，2’-取代的戊糖糖基，包括但不限于2’-O-甲基核糖，2’-O-甲氧基乙基核糖，2’-O-炔丙基核糖，和2’-脱氧-2′-氟核糖；3’-取代的戊糖糖基，包括但不限于3’-O-甲基核糖；1′，2′-二脱氧核糖；阿拉伯糖；取代的阿拉伯糖，包括但不限于1’-甲基阿拉伯糖，3’-羟甲基阿拉伯糖，4’-羟甲基-阿拉伯糖，以及2’-取代的阿拉伯糖糖基；己糖糖基，包括但不限于1，5-无水己糖醇；以及α-端基异构体。在修饰糖基为3′-脱氧核糖核苷或3′-O-取代的核糖核苷的实施例中，免疫刺激性部分通过2′-5′核苷间连接的方式被连接至相近的核苷。

优选的用于本发明所述的方法的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物中的免疫刺激性部分进一步包含具有其它碳水化合物主链修饰和替换的寡核苷酸，包括肽核酸(PNA)，含有磷酸酯基团的肽核酸(PHONA)，闭锁的核酸(LNA)，吗啉代主链寡核苷酸，以及含有具有从约2埃至约200埃长度的主链连接体部分的寡核苷酸，包括但不限于烷基连接体或氨基连接体。烷基连接体可以为支链或无支链的，取代的或未取代的，以及手性纯的或外消旋的混合物。最优选的，所述烷基连接体具有从约2至约18个碳原子。在一些优选实施例中所述烷基连接体具有从约3至约9个碳原子。一些烷基连接体包括一个或多个选自羟基，氨基，巯基，硫醚，醚，酰胺，硫酰胺，酯，脲或硫醚的功能基团。一些所述的功能性烷基连接体为式-O-(CH₂-CH₂-O-)_n(n＝1-9)的聚乙二醇连接。一些其它的功能性烷基连接体为肽或氨基酸。

优选的用于本发明所述的方法的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物中的免疫刺激性部分进一步包含DNA异构体，包括但不限于β-L-脱氧核糖核苷和α-脱氧核糖核苷。优选的免疫刺激性部分掺入了3’修饰物，并且进一步包含具有非自然的核苷间连接位置，包括但不限于2’-5’，2′-2′，3’-3’和5’-5’连接的核苷。

优选的用于本发明所述的方法的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物中的免疫刺激性部分进一步包含具有修饰的杂环碱基的核苷，包括但不限于5-羟基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，N4-烷基胞嘧啶，优选N4-乙基胞嘧啶，4-硫尿嘧啶，6-硫鸟嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，肌苷，硝基吡咯，C5-丙炔嘧啶，以及二氨基嘌呤，包括但不限于2，6-二氨基嘌呤。

通过特殊例证的方式且不限制的方式，例如，在结构(III)的免疫刺激性区域中，在位置N1或Nn的甲基膦酸酯核苷间连接为免疫刺激性部分，具有从约2埃至约200埃长度的连接体，在位置X1的C2-C18烷基连接体为免疫刺激性部分，并且在位置X1的β-L-脱氧核糖核苷为免疫刺激性部分。见下面的表1中的代表位置和免疫刺激性部分的结构。已知将连接体表示为在特殊位置的免疫刺激性部分是指在该位置的核苷残基在3′-羟基处通过所示连接体取代，因此在核苷残基和相邻的3′侧核苷之间产生修饰的核苷间连接。类似地，修饰的核苷间连接表示为特殊位置的免疫刺激性部分是指在该位置的核苷残基通过所示的连接方式被连接至3′端相邻的核苷。

表1

 

位置	典型免疫刺激性部分
		N1	天然存在的核苷，无碱基核苷，阿拉伯糖核苷，2′-脱氧尿苷，β-L-脱氧核糖核苷C2-C18烷基连接，聚乙二醇连接，2-氨基丁基-1，3-丙二醇连接(氨基连接)，2′-5′核苷间连接，甲基膦酸酯核苷间连接
Nn	天然存在的核苷，无碱基核苷，阿拉伯糖核苷，2′-脱氧尿苷，2′-O-取代的核糖核苷，2′-5′核苷间连接，甲基膦酸酯核苷间连接，只要N1和N2不都为无碱基连接

表2显示在具有上游增强区域的免疫刺激性寡核苷酸内的免疫刺激性部分的代表位置和结构。如本文所应用的，术语＂间隔体9＂是指式-O-(CH₂CH₂-O)_n-的聚乙二醇连接体，其中n为3。术语＂Spacer 18＂是指式-O-(CH₂CH₂-O)_n-的聚乙二醇连接体，其中n为6。如本文所应用的，术语＂C2-C18烷基连接体＂是指式-O-(CH₂)_q-O-的连接体，其中q为从2至18的整数。相应地，术语＂C3-连接体＂和＂C3-烷基连接体＂是指式-O-(CH₂)₃-O-的连接体。对每一个间隔体9，间隔体18，以及C2-C18烷基连接体，连接体通过磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯连接的方式连接至相邻的核苷。

表2

 

位置	典型的免疫刺激性部分
		5’N2	天然存在的核苷，2-氨基丁基-1，3-丙二醇连接体
5’N1	天然存在的核苷，β-L-脱氧核糖核苷，C2-C18烷基连接体，聚乙二醇，无碱基连接体，2-氨基丁基-1，3-丙二醇连接体
		3’N1	天然存在的核苷，1’，2’-二脱氧核糖，2’-O-甲基-核糖核苷，C2-C18烷基连接体，间隔体9，间隔体18
3’N2	天然存在的核苷，1’，2’-二脱氧核糖，3’-脱氧核糖核苷，β-L-脱氧核糖核苷，2’-O-炔丙基-核糖核苷，C2-C18烷基连接体，间隔体9，间隔体18，甲基膦酸酯核苷间连接
		3’N3	天然存在的核苷，1’，2’-二脱氧核糖，C2-C18烷基连接体，间隔体9，间隔体18，甲基膦酸酯核苷间连接，2’-5’核苷间连接，d(G)n，聚I-聚dC
3’N2+3’N3	1’，2’-二脱氧核糖，β-L-脱氧核糖核苷，C2-C18烷基连接体，d(G)n，聚I-聚dC
		3’N3+3’N4	2’-O-甲氧基乙基-核糖核苷，甲基膦酸酯核苷间连接，d(G)n，聚I-聚dC
3’N5+3’N6	1’，2’-二脱氧核糖，C2-C18烷基连接体，d(G)n，聚I-聚dC
		5’N1+3’N3	1’，2’-二脱氧核糖，d(G)n，聚I-聚dC

表3显示在具有下游增强区域的免疫刺激性寡核苷酸内的免疫刺激性部分的代表位置和结构。

表3

 

位置	典型免疫刺激性部分
		5’N2	甲基膦酸酯核苷间连接
5’N1	甲基膦酸酯核苷间连接
		3’N1	1’，2’-二脱氧核糖，甲基膦酸酯核苷间连接，2’-O-甲基
3’N2	1’，2’-二脱氧核糖，β-L-脱氧核糖核苷，C2-C18烷基连接体，间隔体9，间隔体18，2-氨基丁基-1，3-丙二醇连接体，甲基膦酸酯核苷间连接，2’-O-甲基
		3’N3	3’-脱氧核糖核苷，3′-O-取代的核糖核苷，2’-O-炔丙基-核糖核苷
3’N2+3’N3	1’，2’-二脱氧核糖，β-L-脱氧核糖核苷

用于本发明方法的免疫子化合物含有至少两个直接或通过非核苷酸连接体连接的寡核苷酸。为了本发明的目的，＂非核苷酸连接体＂为可以通过共价键或非共价键方式连接至寡核苷酸的任意部分。优选所述连接体的长度为从约2埃至约200埃。优选的连接体的几个例子在下面阐述。非共价连接包括但不限于，静电作用，疏水作用，π-堆积作用，以及氢键。术语＂非核苷酸连接体＂不意图表示核苷间连接，如上文所描述的，例如，磷酸二酯，磷代磷酸酯，或二硫代磷酸酯功能性基团，其直接连接两个核苷的3′-羟基基团。为了本发明的目的，所述直接3′-3′连接被称为＂核苷酸连接＂。

在一些实施例中，非核苷酸连接体为金属，包括但不限于，金颗粒。在一些其它实施例中，非核苷酸连接体为可溶的或不可溶的可生物降解的聚合物珠粒。

在其它一些实施例中，非核苷酸连接体为具有允许附着至寡核苷酸的功能性基团的有机部分。所述附着优选通过牢固的共价连接。

在一些实施例中，非核苷酸连接体为生物分子，包括但不限于，多肽，抗体，脂类，抗原，变态反应原，以及寡糖。在一些实施例中，非核苷酸连接体为小分子。为了本发明的目的，小分子为具有小于1,000Da的分子量的有机部分。在一些实施例中，小分子具有小于750Da的分子量。

在一些实施例中，小分子为脂肪或芳香烃，其任选的可以含有或在连接寡核苷酸的直链中或附加在其上的一个或多个选自羟基，氨基，巯基，硫醚，醚，酰胺，硫酰胺，酯，脲，以及硫脲的功能性基团。小分子可以为环状的醚，醚，酰胺，硫酰胺，酯，脲，以及硫脲的功能性基团。小分子可以为环状的或非环的。小分子连接体的例子包括但不限于，氨基酸，糖类，环糊精，金刚烷，胆固醇，半抗原和抗生素。因此，为了描述非核苷酸连接体的目的，术语＂小分子＂不意味着包含核苷。

在一些实施例中，小分子连接体为甘油或式HO-(CH₂)_o-CH(OH)-(CH₂)_p-OH的甘油同系物，其中o和p独立的为从1至约6，从1至约4，从1至约3的整数。在一些其它的实施例中，小分子连接体为1，3-二氨基-2-羟基丙烷的衍生物。一些所述的衍生物具有HO-(CH₂)_m-C(O)NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-NHC(O)-(CH₂)_m-OH的化学式，其中m为从0至约10，从0至约6，从2至约6，或从2至约4的整数。

用于本发明方法中的免疫子化合物的一些非核苷酸连接体允许连接多于两个的核苷酸，如在图1中所图示的。例如，小分子连接体甘油具有三个可以共价连接寡核苷酸的羟基基团。因此，一些本发明的免疫子化合物含有多于两个在其3′端连接至非核苷酸连接体的寡核苷酸。一些所述的免疫子化合物含有至少两个免疫刺激性寡核苷酸，每个都具有可接近的的5′端。

用于本发明所述的方法中的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物可以用自动合成装置和图5和6中所描述的并进一步在实施例中描述的亚磷酰胺法方便的合成。在一些实施例中，免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物通过线性合成方式合成(见图5)。如本文所应用的，术语“直线合成”是指从免疫子化合物的一端开始线性地进行至另一端的合成。直线合成允许或相同的或不同(在长度、碱基组合物和/或化学修饰掺入的方面)的单体单元掺入至免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物。

免疫子化合物的可选择的合成方式为＂平行合成＂，其中合成从中心连接部分外展进行(见图6)。附着至固体支持物的连接体可以用于平行合成，如美国专利号5,912,332中所描述的。可选择的，可以使用通用固体支持物，诸如附着至可控孔径的玻璃支持物的磷酸酯。

免疫子化合物的平行合成相比线性合成有几个优点：(1)平行合成允许相同单体单元的掺入；(2)与线性合成不同，两个或所有单体单元在同一时间合成，因此合成步骤的数量和合成所要求的时间与单体单元相同；以及(3)合成步骤中的还原增加了最终免疫子产物的纯度和产率。

在通过或线性合成或平行合成步骤的合成的最后，如果掺入修饰的核苷，用于本发明所述方法的免疫刺激性寡核苷酸或免疫子化合物可以用浓缩的氨水溶液或按照亚磷酰胺供应商所推荐的方便地脱保护。产物免疫刺激性的寡核苷酸和/或免疫子化合物优选通过反相HPLC纯化，脱三苯甲基，除盐以及透析来纯化。

免疫刺激性寡核苷酸适于作为免疫子化合物的组分使用，或者依照本发明的第四方面，在下述美国专利和待审美国专利申请中被描述，在此引用作为参考：美国专利号6,426,334和6,476,000；以及美国专利申请号09/770,602，09/845,623，09/965,116，60/440,587，10/361,111，60/471,247，60/477。优选的本发明的免疫刺激性寡核苷酸和免疫子化合物描述于待审美国专利申请号10/279,684中。表4显示用于本发明所述方法的代表性免疫子化合物。其它的免疫子化合物在实施例和美国专利申请No.10/279,684中描述。

表4.免疫子序列的例子

＝对称的较长分枝；

＝对称的甘油(短)分枝

L＝C3-烷基连接体；X＝1′，2′-二脱氧核糖；Y＝^5OH dC；R＝7-脱氮-dG

R＝阿拉伯糖鸟苷；X₁＝甘油连接；

本发明的另一方面提供含有至少两个寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中免疫刺激性核酸具有二级结构。在某个实施例中，免疫刺激性核酸具有通过与互补序列间的氢键构成的3’-端茎环二级结构。在某个实施例中，免疫刺激性活性降低的核酸通过与互补序列间的氢键构成5’-端茎环二级结构。在这方面，免疫刺激性核酸含有如式(I)中详述的结构。

结构域 A-结构域 B-结构域 C        (I)

结构域长度可以从约2至约12个核苷酸。结构域A可以为5’-3’或3’-5’或2’-5’DNA，RNA，RNA-DNA，DNA-RNA，其具有或不具有回文或自身互补结构域，含有或不含有至少一种选自CpG，C^*pG，C^*pG^*或CpG^*的二核苷酸，其中C为胞苷或2’-脱氧胞苷，G为尿苷或2’-脱氧尿苷，C^*为2′-脱氧胸苷，1-(2′-脱氧-β-D-核糖呋喃基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤，2’-二脱氧-5-卤代胞嘧啶，2’-脱氧-5-硝基胞嘧啶，阿拉伯糖胞苷，2′-脱氧-2′-取代的阿拉伯糖胞苷，2′-O-取代的阿拉伯糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，或其它嘧啶核苷类似物，G^*为2′-脱氧-7-脱氮鸟苷，2′-脱氧-6-硫代鸟苷，阿拉伯糖鸟苷，2′-脱氧-2′取代的-阿拉伯糖鸟苷，2′-O-取代的-阿拉伯糖鸟苷，2′-脱氧肌苷，或其它的嘌呤核苷类似物，并且p为选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，和二硫代磷酸酯的核苷间连接。在某个优选的实施例中，免疫刺激性二核苷酸不为CpG。

在某个实施例中，结构域A将具有多于一个选自CpG，C^*pG，C^*pG^*或CpG^*的二核苷酸。

结构域B，如下面用“X”所描述的，为连接结构域A和C的连接体，其可以为3’-‘5’连接，2’-5’连接，3’-3’连接，磷酸酯基团，核苷，或非核苷连接体，其可以是脂肪的，芳香的，芳香基，环的，手性的非手性的，肽，碳水化合物，脂质，脂肪酸，单-，三-或六聚乙二醇，或杂环部分。

结构域C可以为具有或不具有有回文或自身补充序列的5’-3’或3’-5’，2’-5’DNA，RNA，RNA-DNA，DNA-RNA，其可以具有或不具有选自CpG，C^*pG，C^*pG^*和CpG^*的二核苷酸，其中C为胞苷或2’-脱氧胞苷，G为鸟苷或2’-脱氧鸟苷，C^*为2′-脱氧胸苷，1-(2′-脱氧-β-D-核糖呋喃基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤，2’-二脱氧-5-卤素胞嘧啶，2’-脱氧-5-卤素胞嘧啶，阿拉伯糖胞苷，2′-脱氧-2′-取代的阿拉伯糖胞苷，2′-O-取代的阿拉伯糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，其它嘧啶核苷类似物，G^*为2′-脱氧-7-脱氮鸟苷，2′-脱氧-6-硫代尿苷，阿拉伯糖鸟苷，2′-脱氧-2′取代的-阿拉伯糖鸟苷，2′-O-取代的-阿拉伯糖鸟苷，2′-脱氧肌苷，或其它的嘌呤核苷类似物，并且p为选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，和二硫代磷酸酯的核苷间连接。在某个优选的实施例中，免疫刺激性二核苷酸不为CpG。在一些实施例中，结构域B优选为连接结构域A和结构域C的非核苷酸连接体，其被称为“免疫子”。在某优选的实施例中，结构域C不含有二核苷酸CpG，C^*pG，C^*pG^*或CpG^*。

通过非限制性实例的方式，在这方面的某个实施例中，免疫刺激性核酸将具有如式(II)中详述的结构。

本领域技术人员将会意识到，在分子的末端存在分子内茎环形式的二级结构组件。

通过非限制性实例的方式，在这方面的某个实施例中免疫刺激性核酸将具有如式(III)中详述的结构。

式(III)中详述的结构在本文被称为“末端减光器(dim聚体)”，因为两个分子的末端由于两端的序列互补产生分子间氢键而被遮挡。此外，结构域A和A’可以为或可以不为相同的，结构域B和B’可以为或可以不为相同的并且结构域C和C’可以为或可以不为相同的。

通过非限制性实例的方式，在这方面的某个实施例中，免疫刺激性核酸将具有式(IV)的结构。

本领域技术人员将意识到，所述分子的末端具有二级结构，因为其末端的互补序列通过氢键与该区域结合。在某个实施例中，诸如配体的分子可附着至末端从而促进细胞吸收或增强分子的稳定性。

本发明的一些核酸分子的非限制性的例子列于表5中。

表5

^*：大写-PS；小写-PO；粗体-2’-O-甲基-核糖核苷酸(在116和117中)；G-2’-脱氧-7-脱氮-G(在118中)；G-araG(在119中)；X-C3-连接体(在127和128中)。

可选择的，本发明的核酸分子可以为通过非核苷酸连接体连接的两个免疫子。这些分子的非限制性的代表性的例子列于表6中。

表6

^*大写-PS；小写-PO，X-C3-连接体；Y-四乙二醇链；Z-六乙二醇连接体，粗体-2’-O-甲基核糖核酸(在134和147中)；G-2’-脱氧-7-脱氮-G(在135中)。

可选择的，进一步的，非限制性的代表列于表7中。

表7.

斜线表示磷酸二酯键，如果没有其它说明的话其它键为硫代磷酸酯

下划线＝2’-OMe-核苷；X＝C3连接体

R＝2’-脱氧-7-脱氮鸟苷G₁＝2’-脱氧-7-脱氮guanoise

本发明的另一方面提供免疫刺激性核酸，其中免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子的序列为至少部分自身互补。本文所应用的自身互补序列是指碱基序列，其通过合适的排列，可以形成分子内或，更典型的分子间的G-C，A-T，A-U和/或G-U碱基配对的摇摆配对。在一个实施例中自身互补的范围为至少50％。例如至少50％自身互补的8聚体聚体可以具有能够形成4，5，6，7，或8个G-C，A-T，A-U和/或G-U摇摆碱基配对的序列。所述碱基配对可以但不必须涉及位于自身互补免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子的任何一个端点的碱基。当核酸稳定可能对免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子很重要时，将双链核酸的一个或两个端点或通过碱基配对或通过任意其它合适的方法“夹”在一起可能有益处。自身互补的程度可以依赖于免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子之间的排列(alignment)，并且所述排列可以或可以不包括单-或多-核苷突出端。在其它实施例中，自身互补的程度至少为60％，至少70％，至少80％，至少90％，或者甚至100％。

通过非限制性实例的方式，在这方面的某个实施例中免疫刺激性核酸将具有如式(V)详述的结构。

本领域技术人员将意识到，所述的免疫子化合物具有二级结构，因为结构域的序列互补产生分子间氢键。结构域A和A’可以为或可以不为相同的，结构域A和C可以为或可以不为相同的，结构域A和C’可以为或可以不为相同的，结构域A’和C可以为或可以不为相同的，结构域A’和C可以为或可以不为相同的，结构域B和B’可以为或可以不为相同的并且结构域C和C’可以为或可以不为相同的。此外，附加的免疫子可以通过分子间氢键结合由此产生本发明免疫子的链，或多聚体。n可以为连续自身互补免疫子化合物的任意数值。

如本文所应用的，术语“互补”是指具有与核酸杂交的能力。所述杂交通常是互补链之间的氢键结合的结果，优选形成Watson-Crick或Hoogsteen碱基对，尽管其它形式的氢键以及碱基堆积也能够产生杂交。

如本文所应用的，术语“二级结构”是指分子间氢键连接。分子间氢键导致双链核酸分子的形成。

非限制性的代表性的核酸分子列于表8中。

表8

 

173	5’-TCG1AACG1TTCG1-X-G1CTTG1CAAG1CT-5’
		174	5’-TCG1AACG1TTCG-X-GCTTG1CAAG1CT-5’
175	5’-TCTCACCTTCT-X-TCTTCCACTCT-5’
		176	5’-TCG2AACG2TTCG2-X-G2CTTG2CAAG2CT-5’
177	5’-TCG2AACG2TTCG-X-GCTTG2CAAG2CT-5’
		178	5’-TCG1TCG1AACG1TTCG1AGATGAT-3’
179	5’-TCG2TCG2AACG2TTCG2AGATGAT-3’
		180	5’-TCG3TCG3AACG3TTCG3AGATGAT-3’
181	5’-TC1GTC1GAAC1GTTC1GAGATGAT-3’
		182	5’-TC2GTC2GAAC2GTTC2GAGATGAT-3’
183	5’-TC3GTC3GAAC3GTTC3GAGATGAT-3’
		184	5’-TCG1AACG1TTC-X-CTTG1CAAG1CT-5’

 

184	5’-TCG1AACG1TTC-X-CTTG1CAAG1CT-5’
		185	5’-TCG1TTCG1AACG1-X-G1CAAG1CTTG1CT-5’
186	5’-TCCAACCTTCG-X-GCTTCCAACCT-5’
		187	5’-TCG1TTG1CAACG1-X-G1CAACG1TTG1CT-5’
188	5’-TCG2AACG2TTCT-X-TCTTG2CAAG2CT-5’
		189	5’-TCG1AACG2TTCG1-X-G1CTTG2CAAG1CT-5’
190	5’-TCG1AAC1GTTCG1-X-G1CTTGC1AAG1CT-5’

正常状态(normal phase)代表硫代磷酸酯连接

G₁＝2’-脱氧-7-脱氮鸟苷

G₂＝阿拉伯糖鸟苷

G₃＝2’-脱氧肌苷

C₁＝1-(2’-脱氧-β-D-核糖呋喃基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基嘌呤

C₂＝阿拉伯胞苷

C₃＝2’-脱氧-5-羟基胞苷

X＝C3连接体

用于本发明方法的特别优选的免疫子化合物具有下述结构。

按照本发明的所有方面的方法和组合物用于相关疾病的治疗，其中治疗包括免疫系统调节和以免疫为基础的治疗。特别优选的疾病目标包括癌症，传染性疾病和变态反应。

在某些实例中，治疗方法是用于癌症的治疗。癌症或肿瘤包括但不限于胆管癌；脑癌；乳腺癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内肿疡；淋巴瘤；肝癌；肺癌(如小细胞和非小细胞)；黑素瘤；成神经细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌和肾癌，以及其它的癌症和肉瘤。

在一些实例中，治疗方法是用于感染的治疗。作为非限定性的例子，被发现感染人类的病毒包括但不限于：逆转录病毒科(例如人免疫缺陷病毒，如HIV-1(也表示为HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III)，和其它隔离群，如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒，甲肝病毒；肠病毒，人柯萨奇病毒，鼻病毒，艾柯病毒)；Calciviridae(如导致肠胃炎的株)；披盖病毒科(如马脑炎病毒，风疹病毒)；Flaviridae(如登革热病毒，脑炎病毒，黄热病毒)；Coronoviridae(如冠状病毒)；弹状病毒科(如疱疹性口炎病毒，狂犬病毒)；Coronaviridae(如冠状病毒)；弹状病毒科(如疱疹性口炎病毒，狂犬病毒)；纤丝病毒科(如埃博拉病毒)；副粘病毒科(如副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸合胞体病毒)；正粘病毒科(如流感病毒)；Bungaviridae(如Hantaan病毒，bunga病毒phleboviruses和Nairo病毒)；Arena病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(如呼肠孤病毒，orbiviurses和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科；肝脱氧核糖核酸病毒科(乙肝病毒)；微小病毒科(细小病毒组)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(大部分腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2，水痘-带状疱疹病毒(CMV)，疱疹病毒；痘病毒科(天花病毒，牛痘病毒，痘病毒)；和虹彩病毒科(如非洲猪热病病毒)；和未分类的病毒(如海绵状脑病的致病因子，丁型肝炎的致病因子(认为是乙肝病毒的缺陷伴随体)，非甲型、非乙型肝炎的致病因子(类型1＝内传播；类型2＝非肠道传播(即丙型肝炎)；诺沃克因子和相关的病毒和星状病毒).

在某些实例中，本发明的治疗方法是用于过敏症的治疗。＂过敏原＂是指能够在可接近的个体中诱导过敏或或哮喘反应的物质(抗原)。过敏原的名单是庞大的，可以包括花粉、昆虫毒液、动物皮屑、真菌孢子和药物(如青霉素)。天然动物和植物过敏原的例子包括但不限于特异于下列种的蛋白：犬科(Canis familiaris)；表皮螨属(如Dermatophagoides farinae)；猫属(Felisdomesticus)；Ambrosia(Ambrosia artemiisfolia)；黑麦草属(如Lolium perenne或Lolium multiflorum)；日本柳杉(Crypto聚体ia japonica)；支链孢属(Alternaria alternata)；桤木；桤木属(Alnus gultinoasa)；桦属(Betulaverrucosa)；栎属(Quercus alba)；洋橄榄(Olea europa)；艾属(Artemisiavulgaris)；车前属(如Plantago lanceolata)；Parietaria(如Parietaria officinalis或Parietaria judaica)；小蠊属(e.g.Blattella germanica)；蜜蜂属(如Apismultiflorum)；柏木属(如Cupressus sempervirens，Cupressus arizonica和Cupressus macrocarpa)；桧属(如Juniperus sabinoides，Juniperus virginiana，Juniperus communis和Juniperus ashei)；Thuya(e.g.Thuya orientalis)；Chamaecyparis(如Chamaecyparis obtusa)；大蠊属(如Periplaneta a聚体icana)；冰草属(如Agropyron repens)；黑麦属(如Secale cereale)；小麦属(如Triticumaestivum)；Dactylis(如Dactylis glo聚体ata)；羊茅属(如Festuca elatior)；Poa(如Poa pratensis或Poa compressa)；燕麦属(如Avena sativa)；绒毛草属(如Holcus lanatus)；黄花茅(如Anthoxanthum odoratum)；Arrhenatherum(如Arrhenatherum elatius)；Agrostis(如Agrostis alba)；Phleum(如Phleumpratense)；Phalaris(如Phalaris arundinacea)；雀稗属(如Paspalum notatum)；蜀黍物(如Sorghum halepensis)；和Bromus(如Bromus inermis)。特殊的过敏原可以通过商业途径购得(如INDOOR Biotechnologies Inc.，Charlottesville，VA 22903)。

在第二个方面，本发明提供治疗癌症患者癌症的方法，包括结合免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子结合物给药患者化疗剂，所述免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子结合物含有如上所述的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物以及在可接近的5’末端以外的位置与免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物结合的抗原。在一些实例中，非核苷酸连接体包括与癌症相关的抗原，其与寡核苷酸结合。在一些其它的实例中，抗原在3′末端以外的位置与寡核苷酸结合。在一些实例中，抗原产生疫苗效果。为了本发明的目的，术语“相关”表示抗原在有癌症时存在，但在无癌症时不存在，或以降低的量存在。

在免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物与抗原共价连接，或者另外的与抗原可操作地关联。本文中，＂可操作地关联＂表示任何同时保持免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物以及抗原活性的关联。该可操作地关联的非限制性例子包括成为同一脂质体或其它这种递送载体或试剂的一部分。另外，编码抗原的核酸分子可以克隆到表达载体中，并结合免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物给药。本文中，术语“载体”表示能够传输其它与其连接的核酸的核酸分子。优选的载体是能够自我复制并表达与其连接的核酸的那些(如附加体)。能够指导与其可操作连接的基因表达的载体在本文中表示为“表达载体”。通常，用于重组DNA技术的表达载体经常为“质粒”的形式，其一般表示环状双链DNA环，其在载体形式不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以替换使用，因为质粒是载体最普遍的应用形式。然而，本发明意欲包括其它形式行使等同功能的形式，其公知于本领域至今的现有技术中。

在免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物与抗原共价连接的实例中，该共价连接优选在免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物上除免疫刺激性寡核苷酸的可接近的5’端以外的任何位置。例如，抗原可以附着于核酸间连接或可以附着于非核苷酸连接体。可选的，抗体本身可以为该非核苷酸连接体。

在第三个方面，本发明提供药学制剂，其含有本发明的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫刺激性寡核苷酸结合物和/或免疫子化合物或免疫子结合物，化疗剂和生理学可接受的载体。本文中，术语＂生理学可接受的＂表示该材料不干扰免疫子化合物的效果，并与生物系统，如细胞、细胞培养物、组织或生物体兼容。优选的，生物系统为活的生物体，如脊椎动物。优选的化疗剂包括，但不限于，吉西他滨氨甲叶酸，长春新碱，阿霉素，顺铂，无糖氯乙基亚硝基脲，5-氟尿嘧啶，丝裂霉素C，博来霉素，亚德里亚霉素，氮烯咪胺，紫杉酚，fragyline，泛影葡胺(Meglamine)GLA，戊柔比星，卡氮芥和poliferposan，MMI270，BAY 12-9566，RAS famesyl转移酶抑制剂，famesyl转移酶抑制剂，MMP，MTA/LY231514，LY264618/Lometexol，Glamolec，CI-994，TNP-470，和美新/托泊替康，PKC412，伐司朴达/PSC833，诺消灵/Mitroxantrone，Metaret/苏拉明，巴马司他，E7070，BCH-4556，CS-682，9-AC，AG3340，AG3433，Incel/VX-710，VX-853，ZD0101，ISI641，ODN 698，TA2516/Marmistat，BB2516/Marmistat，CDP 845，D2163，PD183805，DX8951f，乳杆菌制剂(Lemonal)DP 2202，FK 317，溶链菌/OK-432，AD 32/戊柔比星，氯化锶/锶衍生物，替莫多司/替莫唑胺，阿霉素脂质体/多柔比星脂质体，Yewtaxan/Placlitaxel，泰素/紫杉醇，希罗达/卡培他滨，氟铁龙/去氧氟尿苷，Cyclopax/口服紫杉醇，口服紫杉烷，SPU-077/顺铂，HMR 1275/Flavopiridol，CP-358(774)/EGFR，CP-609(754)/RAS致癌基因抑制剂，BMS-182751/口服铂，UFT(替加氟/尿嘧啶)，盐酸左旋米唑/左咪唑，恩尿嘧啶/776C85/5FU增强剂，依立替康/左咪唑，盐酸伊立替康和山梨醇注射剂(Camptosar)/伊立替康，Tumodex/Ralitrexed，克拉立平/克拉屈滨，Paxex/紫杉醇，盐酸多柔比星脂质体/多柔比星脂质体，Caelyx/多柔比星脂质体，福达华/氟达拉滨，Pharmarubicin/表柔比星，脂质体阿糖胞苷注射剂(DepoCyt)，ZD1839，LU79553/Bis-Naphtalimide，LU 103793/多拉司他汀，Caetyx/多柔比星脂质体，健择/吉西他滨，ZD0473/Anormed，YM 116，lodine种子，CDK4和CDK2抑制剂，PARP抑制剂，D4809/Dexifosamide，Ifes/美钠针剂/异环磷酰胺，替尼泊苷/替尼泊甙，伯尔定/卡铂，顺铂/顺铂，依托泊甙/鬼臼乙叉苷，ZD 9331，泰索帝/多西紫杉醇，阿拉伯糖苷鸟苷药物前体，紫杉烷类似物，亚硝基脲，烷化剂如melphelan和环磷酰胺，氨基苯乙哌啶酮，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，Chlorombucil，盐酸阿糖胞苷，更生霉素，盐酸正定霉素，雌氮芥磷酸钠，鬼臼乙叉苷(VP16-213)，氟苷，氟脲嘧啶(5-FU)，氟他胺，羟基脲(羟基尿素)，异环磷酰胺，干扰素α-2a，α-2b，亮脯利特醋酸盐(LHRH释放因子类似物)，洛莫司汀(CCNU)，盐酸氮芥(氮芥)，巯基嘌呤，美司钠，米托担(o.p′-DDD)，盐酸米托蒽醌，奥曲肽，普卡霉素，盐酸甲基苄肼，链脲菌素，三苯氧胺柠檬酸盐，硫鸟嘌呤，噻替派，长春碱硫酸盐，安吖啶(m-AMSA)，阿扎胞苷，Erthropoietin，六甲基嘧胺(HMM)，白介素2，丙米腙(甲基-GAG；甲基乙二醛二脒腙，(methyl glyoxal bis-guanyl hydrazone)MGBG)，喷司他丁(2′脱氧柯福霉素)，赛氮芥(甲基-CCNU)，替尼泊甙(VM-26)和长春地辛硫酸盐。

在又另一个实例中，制剂包括癌疫苗，其选自EFG，抗个体基因型癌疫苗，Gp75抗原，GMK黑素瘤疫苗，MGV神经节苷脂结合疫苗，Her2/new，Ovarex，M-Vax，O-Vax，L-Vax，STn-KHL癌疫苗，BLP25(MUC-1)，脂质体特异型疫苗，黑素瘤疫苗，肽抗原疫苗，毒素/抗原疫苗，MVA-vased疫苗，PACIS，BCG疫苗，TA-HPV，TA-CIN，DISC-病毒和ImmunCyst/TheraCys.

在进一步的方面，本发明提供了治疗癌症患者癌症的方法，其包括将单克隆抗体与本文所述的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物结合给药患者。以抗体，尤其是单克隆抗体形式的被动免疫疗法是大量的抗癌药物研究和开发课题。本文中所用术语“单克隆抗体”表示单一分子组分的抗体分子。单克隆抗体组合物显示对特殊抗原决定簇的单一结合特异性和亲和力。因此，术语＂人单克隆抗体＂表示显示单一结合特异性的抗体，其具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和不变的区域。抗癌药物的例子包括，但不限于，Panorex(Glaxo-Welcome)，Rituxan(IDEC/Genentech/Hoffman la Roche)，Mylotarg(Wyeth)，Campath(Millennium)，Zevalin(IDEC and Schering AG)，Bexxar(Corixa/GSK)，Erbitux(Imclone/BMS)，Avastin(Genentech)和Herceptin(Genentech/Hoffman la Roche)。抗体也可以用于使用抗个体基因型抗体的有效免疫治疗，其似乎模拟(在免疫学意义上)癌症抗原。单克隆抗体可以通过重组DNA技术领域普通技术人员公知的方法产生。

在此处，术语＂载体＂包括任意赋形剂、稀释剂、填料、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或其它本领域公知的用于药学制剂的材料。显然载体、赋形剂或稀释剂的性质依赖于特殊应用中给药的途径。含有这些材料的药学可接受制剂的制备记载于如Remington’s Pharmaceutical Sciences，18thEdition，ed.A.Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990。

Toll样受体(TLRs)功能为感染中的传感器，诱导先天和适应性免疫应答的激活。TLRs识别大量的配体，称为病原体相关分子模式(PAMPs)。在识别保守的病原相关分子产物后，TLRs通过其胞内信号区域、Toll/白介素1受体(TIR)区域和下游衔接蛋白MyD88激活宿主的防御应答。树突细胞和巨噬细胞正常应答Toll样受体(TLR)配体和也由它们产生的细胞因子(例如白细胞介素1β；IL-6和肿瘤坏死因子，TNF)；自然杀伤(NK)细胞和T细胞也参与其中。细菌化合物刺激TLR后，先天免疫细胞释放大量细胞因子。一些TLR配体的例子包括，但不限于，脂蛋白、肽聚糖、酵母聚糖(TLR2)、双链RNA、polyI:polyC(TLR3)、脂多糖、热休克蛋白、紫杉酚(TLR4)、鞭毛蛋白(TLR5)和imidazoquinolines-R848、瑞喹莫德、咪喹莫特、ssRNA(TLR7/8)。

在第四个方面，本发明提供了使癌细胞对电离辐射致敏的方法。本发明该方面的方法包括给药哺乳动物本发明的免疫刺激性寡核苷酸或免疫子化合物并通过电离辐射治疗动物。在某些优选的实例中，以1.56Gy/分钟施用γ-放射。在某些优选的实例中，施用放射治疗从约0.1到约10.0Gy，优选从约0.25到约8.0Gy，更优选从约0.5到约5.0Gy，或为3.0Gy的辐射，或者一周两次、或者一周四次、或者在第2，第4和第9天三次(three times on Days2，4 and 9)。在某些实例中，用免疫刺激性寡核苷酸或免疫子化合物的预处理是在γ-辐射前约2个到约6个小时。

在第五个方面，本发明提供了协同刺激患者免疫应答的方法，其包括将治疗有效协同量的免疫子化合物结合治疗有效协同量的IL-2，和抗原给药患者，其中给药所述组合协同刺激患者中细胞因子的产生。优选本发明刺激的细胞因子包括但不限于IL-12，干扰素-γ，IFN-α和IFN-β中一个或多个。

在某些实例中，治疗癌症的方法和抗原特异于或关联于一种癌症。在一些实例中，方法用于治疗感染，抗原是与感染相关的抗原。在某些实例中，方法是用于治疗过敏症，抗原与过敏症相关。本文中，术语“相关”表示抗原在有癌症、过敏症或传染病时存在，但在无癌症、过敏症或传染病时不存在，或以降低的量存在。

本文中，术语“抗原”表示被抗体或被T细胞抗原受体特异识别和结合的物质。抗原包括肽、蛋白、糖蛋白、多糖、神经节苷脂和脂类，其部分以及其组合。抗原可以在自然中发现或者合成。半抗原包括在“抗原”的范围内。半抗原是低分子量化合物，其本身没有免疫原性，但与含有抗原决定簇的免疫原性分子结合时表现出免疫原性。

在某些实例中，本发明方法和组合物中有效的抗原为肿瘤相关和/或肿瘤特异性的抗原。非限制性例子包括前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)，其为正常以少量存在于血液中的标记，能够在出现前列腺癌时升高；癌症抗原125(CA-125)，其在卵巢癌患者中水平升高，并在出现其它癌症时有时升高；CA 15-3和CA 27-29，其在追随乳腺癌进程以及对治疗的应答中是有用的；CA 19-9，其一般用于检查胰腺癌的扩散，并且也在结肠、胃、胆管癌患者中升高；癌胚抗原(CEA)，其正常以少量存在但能够在多种癌症的患者血液中升高；甲胎蛋白，其为肝细胞和生殖细胞(非精原细胞瘤)癌的标记；以及半乳糖基转移酶II，其为半乳糖基转移酶的同工酶，其在多种恶性、主要是胃肠癌中升高。本领域技术人员所公知的，肿瘤相关和肿瘤特异抗原是可以通过商业途径购得的。本发明还预期这些可以通过重组核酸技术生成的抗原和/或合成抗原，如肽通过本领域公知的方法产生。

在本发明第五个方面的某些实例中提供了一种治疗癌症患者癌症的方法，其包括将治疗有效协同量的IL-2结合含有前述免疫子化合物的免疫子结合物，以及抗原给药患者。在某些实例中，抗原与免疫子化合物在除可接近的5’端以外的位置结合。在一些实例中，免疫子化合物的非核苷酸连接体含有与癌症相关的抗原。在一些实例中，抗原与免疫子化合物在除其5’端以外的位置结合。在一些实例中，抗原产生疫苗效果。为了本发明的目的，术语“相关”表示抗原在有癌症时存在，但在无癌症时不存在，或以降低的量存在。

在本发明的第五方面的一些实施例中，免疫子化合物共价连接至抗原，或者其通过别的方式可操作连接抗原。如本文所应用的，术语“可操作连接”是指维持免疫子化合物和抗原的活性的任意连接。该有效连接的非限制性的实例包括作为相同的脂质体或其它该传递载体或试剂的一部分。在其中免疫子化合物共价连接至抗原的实施例中，所述共价连接优选在除了免疫子化合物的可接近的的5′端之外的免疫子化合物的任意位置。例如，抗原可以在核苷间连接被连接或可以连接至非核苷酸连接体。可选择的，抗原其本身为非核苷酸连接体。

在本发明的第六方面，至少一种不为免疫子化合物的免疫刺激性寡核苷酸用于组合治疗有效量的IL-2来选择性和协同刺激患者细胞因子的产生。优选的本发明协同刺激的细胞因子选自IL-12和IFN-γ，IFN-α，IFN-β或其组合。按照本发明，优选不为免疫子化合物的免疫刺激性寡核苷酸包括那些含有至少一种免疫刺激性CpG二核苷酸的寡核苷酸，其中C不为胞嘧啶或脱氧胞嘧啶和/或G不为鸟苷或2-脱氧鸟苷。其它优选的本发明的不为免疫子化合物的免疫刺激性寡核苷酸为那些包括替代的非CpG的免疫刺激性部分的寡核苷酸。所述替代的免疫刺激性部分的例子包括但不限于含有非天然存在的碱基和/或糖基和稳定寡核苷酸的寡核苷酸本身二级结构诸如发夹结构的核苷，如下述美国专利和临时美国专利申请中所描述的，在此引用作为参考：美国专利号6,426,334和6,476,000；以及美国专利申请号09/770,602，09/845,623，09/965,116，60/440,587，10/361,111，60/471,247，60/477,608。

在本发明的某个实施例中，在给药至患者之前每个免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸和IL-2与药学可接受载体混合。在某个实施例中，免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸在给药之前与药学可接受载体混合在一起，或者如本发明的第四方面中所描述的作为药剂组合物的一部分组合。如本文所应用的，术语＂载体＂包括任意的赋形剂，稀释剂，填充剂，盐，缓冲剂，稳定剂，溶解剂，脂质，或其它本领域公知的用于药物制剂的物质。需要知道，对于特殊的应用，载体，赋形剂或稀释剂的性质将依赖于给药的途径。药学可接受制剂的制备包括在例如，Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，20^thEdition，ed.A.L.Gennaro，Lippincott Williams& Wilkins Publishing Co.，Philadelphia，PA，19106(ISBN：0683306472)中描述的物质。

在第七方面，本发明提供含有药学可接受载体的治疗组合物，治疗有效协同量的免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸，治疗有效协同量的IL-2以及任选的抗原，其中所述治疗组合物的给药协同刺激患者细胞因子的产生。优选的按照本发明的被协同刺激的细胞因子选自IL-12和干扰素-γ，IFN-α，IFN-β或其组合。

本发明的所有方面对治疗疾病是有效的，并且特别对癌症，传染性疾病和过敏症的基于免疫的治疗有用。如本文所应用的术语疾病的“处理”或“治疗”包括：疾病的预防，发病后疾病的体征或症状的减轻或消除，以及疾病的复发的预防。

按照本发明的方法，与IL-2组合的免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸的给药可以通过任何合适途径，包括但不限于，非肠道给药，口服给药，舌下给药，经皮给药，局部给药，鼻腔给药，气雾剂，眼内给药，气管给药，直肠给药，阴道给药，通过基因枪，皮肤贴剂或者滴眼剂或者漱口剂形式。免疫子化合物，免疫刺激性寡核苷酸，IL-2或其治疗组合物的给药可以采用治疗有效协同量以治疗疾病有效的时间段用公知的方法进行。

术语“组合”是指在治疗相同的患者的相同的疾病的过程中，包括以任何顺序给药免疫子化合物和/或免疫刺激性寡核苷酸和/或IL-2，包括同时给药，以及分开多至几天的时间间隔。所述组合治疗可以包括不止一次给药免疫子化合物和/或免疫刺激性寡核苷酸，和/或独立的IL-2的给药。免疫子化合物和IL-2可以通过相同或不同的途径给药。

本领域的技术人员将意识到或者免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸，IL-2或者二者皆有的所述协同效果将随着本发明组织，器官，特殊的疾病或者需要治疗的患者的不同可能为不同的。更进一步的，本领域技术人员将意识到或者免疫子化合物或者免疫刺激性寡核苷酸，或者IL-2的治疗有效协同量可能通过其它组分的量的精细的调节和改变而降低或增加。

当全身给药时，免疫子化合物优选以达到从约0.0001微摩尔至约10微摩尔的免疫子化合物的血液水平的充足剂量给药。对局部给药而言，比这个低很多的浓度可以是有效的，并且高很多浓度的可以接受。优选地，免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物的总剂量从每个患者每天约0.0001mg至每天每公斤体重200mg。可能希望同时给药，或者将治疗有效协同量的每种免疫子化合物或IL-2作为单独治疗事件顺序给药至个体。优选的，IL-2以约750至约75,000单位的量给药。

本发明提供含有细胞因子和/或化疗剂，以及免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物的试剂盒，后者包含至少两个连接在一起的寡核苷酸，以使免疫子化合物具有多于一个的可接近的的5’端，其中至少一个寡核苷酸为免疫刺激性寡核苷酸。在另一方面，试剂盒包含按照本发明的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫刺激性寡核苷酸结合物和/或免疫子化合物或免疫子结合物，细胞因子和/或化疗剂和生理可接受载体。试剂盒通常也包括一系列使用说明。

下述实施例用于进一步阐明本发明的优选实施方式，并不用于限定本发明的范围。

实施例

实施例1：合成含有免疫调节部分的寡核苷酸

根据图5和6略述的线性合成或平行合成程序，使用自动DNA合成仪(Expedite 8909；PerSeptive Biosystems，Framingham，MA)合成1μmol大小的寡核苷酸。

从Applied Biosystems(Foster City，CA)得到脱氧核糖核酸亚磷酰胺。1’，2’-二脱氧核糖亚磷酰胺、丙基-1-亚磷酰胺、2-脱氧尿苷亚磷酰胺，1，3-二-[5-(4，4’-二甲氧三苯甲基)苯基酰胺基]-2-丙醇亚磷酰胺(1，3-bis-[5-(4，4’-dimethoxytrityl)pentylamidyl]α-propanol phosphoramidite)和甲基亚磷酰胺获自Glen Research(Sterling，VA)。β-L-2’-脱氧核糖核苷亚磷酰胺、α-2’-脱氧核糖核苷亚磷酰胺、单-DMT-甘油亚磷酰胺和二-DMT-甘油亚磷酰胺获自ChemGenes(Ashland，MA)。(4-氨基丁基)-1，3-丙二醇亚磷酰胺获自Clontech(Palo Alto，CA)。阿拉伯糖胞苷亚磷酰胺、阿拉伯糖鸟苷、阿拉伯糖胸苷和阿拉伯糖尿苷获自Reliable Pharmaceutical(St.Louis，MO)。由Hybridon，Inc.(Cambridge，MA)合成阿拉伯糖鸟苷亚磷酰胺、阿拉伯糖胸苷亚磷酰胺和阿拉伯糖尿苷亚磷酰胺(Noronha et al.(2000)Biochem.，39：7050-7062)。

所有的核苷亚磷酰胺都用³¹P和¹H NMR光谱表征。修饰的核苷酸在特殊位点用正常的偶联周期掺入。合成后，寡核苷酸用浓缩的氨水脱保护，并通过反向HPLC纯化，而后透析。纯化的钠盐形式的寡核苷酸在使用前冻干。通过CGE和MALDI-TOF MS检测纯度。

实施例2：脾细胞增殖的分析

使用以前描述的标准程序(见，如Zhao等，Biochem Pharma51：173-182(1996))在体外分析脾细胞增殖。结果显示于图8A中。该结果表明与不具有可接近的5’末端的免疫子5或具有单个可接近的5’末端的寡核苷酸4相比，具有两个可接近的5’末端的免疫子6在更高的浓度产生更多的脾细胞增殖。免疫子6也比LPS阳性对照导致了更多的脾细胞增殖。

实施例3：体内脾肿大实验

为了测试体外结果对体内模型的适用性，用所选的寡核苷酸给药小鼠并且测量脾肿大的程度作为免疫刺激活性水平的指标。以5mg/kg的单剂量向BALB/c小鼠(雌性，4-6周大，Harlan Sprague Dawley Inc，Baltic，CT)的腹膜内给药。寡核苷酸给药72小时后处死小鼠，取出脾并称重。结果显示于图8B中。该结果表明具有两个可接近的5’末端的免疫子6比寡核苷酸4或免疫子5具有明显更好的免疫刺激效果。

实施例4：细胞因子分析

通过夹心ELISA测定脊椎动物细胞，优选BALC/c小鼠脾细胞或人PBMC中IL-12和IL-6的分泌。所需的试剂(包括细胞因子抗体和细胞因子标准)从PharMingen，San Diego，CA购得。ELISA标板(Costar)与在PBSN缓冲液(PBS/0.05％叠氮化钠，pH9.6)中5μg/mL的合适抗体在4℃下温育过夜，而后用PBS/1％BSA在37℃下阻断30分钟。细胞培养上清液和细胞因子标准适当的用PBS/10％FBS稀释，加入至标板一式三份，在25℃温育2小时。标板用1μg/mL合适的生物素化抗体覆盖，并在25℃温育1.5小时。然后标板用PBS-T缓冲液(PBS/0.05％Tween20)充分洗涤，并在加入抗生蛋白链菌素结合的过氧化酶(Sigma，St.Louis，MO)后进一步于25℃中温育1.5小时。标板用Sure Blue(Kirkegaard and Perry)显色试剂显影，反应通过加入Stop Solution(Kirkegaard and Perry)终止。用Ceres 900 HDI分光光度计(Bio-Tek Instruments)测定颜色的变化。结果显示于下表5A中。

通过Ficoll-Paque密度梯度离心(Histopaque-1077，Sigma，St.Louis，MO)从健康自愿者的外周血中分离人外周血单核细胞(PBMCs)。简单的说，肝素化血液在尖底离心机中置于Histopaque-1077(等体积)上，以400 x g在室温中离心30分钟。小心的移出含有单核细胞的血沉棕黄层，用等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS)通过以250 x g离心10分钟洗涤两次。然后将获得的细胞团重新悬浮于含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(MediaTech，Inc.，Herndon，VA)中，并用10％热失活的FCS和青霉素-链霉素(100U/ml)补充。在存在或不存在寡核苷酸的情况下，细胞以1 X 10⁶个细胞/ml/孔在24孔板中培养不同的时间段。在培养阶段后，收集上清液并冷冻保存于-70℃直至用于夹心ELISA分析各种细胞因子，包括IL-6(BD Pharmingen，San Diego，CA)、IL-10(BD Pharmingen)、IL-12(BioSource International，Camarillo，CA)、IFN-α(BioSource International)和-γ(BDPharmingen)以及TNF-α(BDPharmingen)。结果显示于下表9和9A中。

在所有的实例中，细胞培养物上清液内IL-12和IL-6的水平都是分别根据相同实验条件下构建的IL-12和IL-6的标准曲线计算得到的。细胞培养物上清液内IL-10、IFN-γ和TNF-α的水平是分别根据相同实验条件下IL-10、IFN-γ和TNF-α的标准曲线计算得到的。

表9免疫子结构和在人PBMC培养物中的免疫刺激活性

D1和D2是供体1和2。

表9A免疫子结构和在BALB/c小鼠脾细胞培养物中的免疫刺激活性

斜体表示磷酸二酯连接。

另外，图7A-C显示的结果表明，与分别具有一个或没有可接近的5’末端的寡核苷酸1或免疫子3相比，具有两个可接近的5’末端的免疫子2在更低的浓度提高IL-12和IL-6，但不提高IL-10。

实施例5：含有非天然嘧啶或非天然嘌呤核苷的免疫子化合物的免疫刺激活性

如表10-12所示，在免疫刺激二核苷酸部分具有非天然嘧啶核苷或非天然嘧啶核苷的不同长度的免疫子化合物仍然保留了免疫刺激活性。

表10免疫子结构和免疫刺激活性

表11 免疫子结构和免疫刺激活性

表12 免疫子结构和免疫刺激活性

实施例6：连接体对免疫刺激活性影响

为检测连接两寡核苷酸的连接体长度的影响，合成含有相同寡核苷酸但不同连接体的免疫子化合物并用于测试免疫刺激活性。表13中的结果表明连接体长度对免疫子化合物的免疫刺激活性具有影响。使用C3-至C6-烷基连接体或具有散布的磷酸盐电荷的无碱基连接体时获得了最好的免疫刺激效果。

表13 免疫子结构和免疫刺激活性

实施例7：寡核苷酸主链对免疫刺激活性的影响

一般而言，含有天然磷酸二酯主链的免疫刺激性寡核苷酸与同样长度的具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸相比免疫刺激性更低。这种更低水平的免疫刺激活性可以部分归因于实验条件下磷酸二酯寡核苷酸的快速降解。寡核苷酸的降解主要是由3′-核酸外切酶导致的，该酶从3′端开始降解寡核苷酸。该实例中免疫子化合物不含有游离的3′端。因此，具有磷酸二酯主链的免疫子化合物与相应的单体寡核苷酸相比在实验条件下具有更长的半衰期，并因此显示出更好的免疫刺激活性。表14中的结果证明了这种影响，免疫子84和85显示了免疫刺激活性，表现为BALB/c小鼠脾细胞培养物中细胞因子的诱导。

表14 免疫子结构和免疫刺激活性

L＝C3-连接体

实施例8：免疫子化合物结合化疗剂的体内抗癌活性

在含有10％胎牛血清(FBS)的90％Ham’s，F12K培养基中，在存在100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的条件下培养PC3细胞以建立人前列腺癌模型(PC3)。4-6周大的雄性无胸腺裸小鼠(Frederick Cancer Research andDevelopment Center，Frederick，MD)在研究前先适应6天以适应环境。从单层培养物中收获培养的PC3细胞，用Ham’s，F12K培养基(10％FBS)洗两次，重新悬浮于无FBS的Ham’s，F12K培养基：Matrigel基底膜基质(BectonDickinson Labware，Bedford，MA)(5:1；V/V)，皮下注射(5 X 10⁶个细胞，总体积0.2ml)到每只小鼠的左腹股沟区域。动物通过常规的临床观测、体重和肿瘤生长进行监控。采用测径器测量植入物的两垂直直径以监测肿瘤的生长。用公式1/2a X b²计算肿瘤的质量(以克为重量)，其中‘a’是长直径(cm)，‘b’是短直径(cm)。当平均肿瘤大小达到～80mg，具有人类肿瘤异种移植物的动物被随机分为治疗组和对照组(5只动物/组)。对照组仅施以消毒的生理盐水(0.9％NaCl)。无菌溶解于生理盐水中的免疫子26或194通过皮下注射以0.5或1.0mg/kg/天的剂量给药，3个剂量/周。以160mg/kg的剂量在第0天和第3天两次腹膜内注射盐酸吉西他滨HCL(Eli Lilly and Company，Indianapolis，IN)。详细的治疗进度表如下：

G1：盐水

G2：吉西他滨(160mg/kg/天，IP，第0天和第3天)

G3：26(1.0mg/kg/天，SC，3剂量/周，6周)

G4：26(0.5mg/kg/天，SC，3剂量/周，6周)

G5：194(1.0mg/kg/天，SC，3剂量/周，6周)

G6：194(0.5mg/kg/天，SC，3剂量/周，6周)

G7：26(0.5mg/kg/天，SC，3剂量/周，6周)+吉西他滨(160mg/kg/天，第0天和第3天)

G8：194(0.5mg/kg/天，SC，3剂量/周，6周)+吉西他滨(160mg/kg/天，第0天和第3天)

表15和图13中为不同治疗后的肿瘤测量值。与盐水对照相比，在所有用免疫子26和194治疗的动物中肿瘤的生长明显被抑制(p<0.5)。在这些治疗组中有剂量响应关系的倾向(图13)。在26和194之间没有明显的区别(表15)。

表16和图14表示治疗后不同时间的体重测量值。与对照相比，在单独用26或194中体重增加没有明显不同。吉西他滨治疗的动物在第一周体重下降，在随后的一周恢复。与26或194组合没有改变吉西他滨的副作用表现。在所有组中都没有其它的临床异常或死亡。

表16 荷瘤小鼠用26、194或盐水治疗后的体重

 

天	盐水	SD	SE	吉西他滨	SD	SE	26	SD	SE	26	SD	SE
																	160mg/kg			1mg/kg			0.5mg/kg
0	24.1	2.5	1.1	23.5	0.9	0.4	23.2	1.4	0.6	23.0	2.4	1.1
													7	25.8	3.0	1.3	20.7	4.4	2.0	25.2	2.4	1.1	24.8	2.8	1.2
14	26.8	3.2	1.4	25.2	4.0	1.8	26.3	2.0	0.9	26.0	2.9	1.3
													21	28.2	3.3	1.5	27.1	3.9	1.7	27.8	2.0	0.9	27.6	2.8	1.2
28	29.4	3.5	1.6	28.1	4.3	1.9	28.6	2.6	1.1	28.0	2.7	1.2
													35	30.6	3.7	1.6	29.4	2.9	1.3	29.5	2.3	1.0	28.6	2.8	1.3
42	31.1	3.7	1.7	30.3	3.0	1.4	30.2	2.3	1.0	29.4	3.9	1.7

 

天	194	SD	SE	194	SD	SE	26+GEM	SD	SE	194+GEM	SD	SE
														1mg/kg			0.5mg/kg			0.5/160mg/kg			0.5/160mg/kg
0	22.5	1.3	0.6	24.1	1.6	0.7	21.9	1.7	0.7	23.0	0.8	0.4
													7	24.3	0.9	0.4	25.6	2.0	0.9	19.1	2.0	0.9	22.3	3.3	1.5
14	25.1	1.3	0.6	27.0	2.1	0.9	24.6	1.6	0.7	25.9	2.7	1.2
													21	26.1	1.3	0.6	27.8	1.5	0.7	26.8	1.6	0.7	27.1	2.6	1.2
28	27.2	1.5	0.7	28.3	2.2	1.0	27.2	1.6	0.7	27.7	3.2	1.4
													35	28.0	1.4	0.6	29.1	2.3	1.0	27.7	2.1	1.0	28.0	2.4	1.1
42	28.9	1.5	0.7	29.8	2.2	1.0	28.4	2.8	1.2	28.1	3.4	1.5

总之，26和194明显抑制具有人类前列腺癌PC3异种移植物的裸小鼠中肿瘤的生长，没有明显的副作用。当26或194组合吉西他滨共同施用时，每个化合物都明显增加了吉西他滨的治疗效果，而没有改变其副作用表现。另外，存在26或194治疗的剂量响应倾向。

实施例9 免疫子化合物结合化疗剂的体内抗癌活性

用泰索帝替代吉西他滨重复实施例8的实验。泰索帝在第0天和第7天给药。165每周给药5天。26和194在第0，2，4，7，9和11天给药。下表17显示结果。该结果清晰的表明免疫子化合物与泰索帝之间的协同作用。

实施例10 免疫刺激性寡核苷酸和IL-2的给药

如上所述从BALB/c小鼠分离脾细胞，以5 x 10⁶细胞/mL的密度置于24孔板中。溶解于TE缓冲液(10mM Tris-HCI，pH7.5，1mM EDTA)的CpG寡核苷酸以0.03，0.1，0.3，1.0，3.0，或10.0μg/mL的最终浓度加入小鼠脾细胞培养物中。为了研究IL-2在CpG寡核苷酸诱导的时间依赖性细胞因子分泌中的作用，在实验开始时加入浓度为10U/ml的重组人IL-2(Sigma)。在存在实验寡核苷酸的条件下将细胞于37℃培养4，8，24和48小时，收集上清液进行ELISA分析。没有处理的细胞(仅加入IL-2)作为对照。

通过夹心ELISA测定小鼠IL-12，IL-6和IFN-γ的分泌。所需的试剂(包括细胞因子抗体和标准)从PharMingen购得。ELISA标板(Costar)与PBSN(PBS/0.05％叠氮化钠，pH9.6)缓冲液中合适的捕获抗体在4℃下温育过夜，而后用PBS/1％BSA在37℃下阻断30分钟。细胞培养上清液和细胞因子标准适当的用PBS/10％BSA稀释，加入至标板，一式三份，在25℃温育2小时。洗涤标板并与合适的生物素化抗体在25℃温育1.5小时。标板用PBS/0.05％Tween 20洗涤，加入抗生蛋白链菌素结合的过氧化酶(Sigma)后进一步于25℃中温育1.5小时。标板用Sure Blue^TM(Kirkegaard and Perry)显色试剂显影，反应通过加入Stop Solution(Kirkegaard and Perry)终止。用Ceres 900 HDI Spectrophotometer(Bio-Tek Instruments)测定在450nm的颜色变化。细胞培养物上清液中IL-12，IL6和IFN-γ的水平是分别根据相同实验条件下IL-12，IL6和IFN-γ的标准曲线计算得到的。

表18 显示本研究中使用的寡核苷酸。

表18

SEQ   ID    序列                            化学

NO：

86          5’-CTATCTGACGTTCTCTGT          PS-寡核苷酸

            -3’

87          (5’-TCTGACRTTCT)₂S             R＝7-脱氮-dG，PS-

                                            寡核苷酸

88          (5’-TCTGACGTTCT)₂S             PS-寡核苷酸

89          (5’-XXCTGACGTTCTCTGT)₂         PO-寡核苷酸

            S

90          (5’-TCTGAYGTTCT)₂S             Y＝R^*，PS-寡核苷

                                            酸

结果显示于图15-19中。没有显示的实验表明单独的SEQ ID NOs 86-90对IFN-γ产生的刺激是微不足道的。该结果证明了在产生IL-6，IL-12和IFN-γ分泌中SEQ ID NOs 86-90与IL-2之间的协同作用。

等同物

虽然前述发明为了清楚和便于理解的目的进行了详细的描述，但本领域技术人员能够通过阅读本说明书了解各种形式上和细节上的变化并不脱离本发明和附加权利要求的真实范围。

Claims (28)

1.一种组合物，其包含治疗有效协同量的至少一种免疫子化合物或免疫刺激性寡核苷酸和治疗有效协同量的IL-2，其中给予所述组合物协同刺激一种或多种选自IL-12和IFN-γ，IFN-α，IFN-β或其组合的细胞因子的产生。

2.权利要求1的组合物在制备治疗患有肿瘤的哺乳动物的癌症的药物中的用途。

3.权利要求2所述的用途，其中所述治疗包括电离辐射。

4.权利要求2所述的用途，其中所述免疫子具有5’-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5’的结构，其中X为甘油连接且R为2’-脱氧-7-脱氮鸟苷。

5.权利要求3所述的用途，其中所述免疫子具有5’-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5’的结构，其中X为甘油连接且R为2’-脱氧-7-脱氮鸟苷。

6.权利要求2至5任一项所述的用途，其中所述电离辐射为1.56Gy/分钟的γ-辐射。

7.权利要求2至5任一项所述的用途，其中所述电离辐射的辐射量为3Gy，且频率为每周两次、每周四次或在第2、4和9天三次。

8.权利要求2至5任一项所述的用途，其中所述药物用于在进行γ-辐射前约2到约6小时预处理所述哺乳动物。

9.治疗有效协同量的至少一种免疫子化合物和治疗有效协同量的IL-2在制备刺激患者免疫应答的药物中的用途。

10.治疗有效协同量的至少一种免疫子化合物和治疗有效协同量的IL-2的组合在制备刺激患者免疫应答的药物中的用途，其中所述组合协同刺激细胞因子的产生。

11.治疗有效协同量的至少一种免疫子化合物和治疗有效协同量的IL-2的组合在制备刺激患者免疫应答的药物中的用途，其中所述组合协同刺激一种或多种选自IL-12和IFN-γ，IFN-α，IFN-β或其组合的细胞因子的产生。

12.权利要求2、3、9至11任一项所述的用途，其中免疫子化合物具有如下结构：

13.权利要求9至11任一项所述的用途，其中所述免疫子为5’-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5’，其中X为甘油连接且R为2’-脱氧-7-脱氮鸟苷。

14.权利要求9至13任一项所述的用途，其中所述刺激患者免疫应答的药物进一步包括抗原。

15.权利要求14的用途，其中所述抗原为与癌症、传染性疾病或过敏症相关的抗原。

16.权利要求1所述的组合物，其中所述免疫子具有5’-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5’的结构，其中X为甘油连接且R为2’-脱氧-7-脱氮鸟苷。

17.治疗有效协同量的至少一种免疫子化合物和治疗有效协同量的IL-2在制备治疗患者癌症的药物中的用途，其中所述组合物协同刺激一种或多种选自IL-12和IFN-γ，IFN-α，IFN-β或其组合的细胞因子的产生。

18.权利要求17所述的用途，其中所述治疗患者癌症的药物进一步包括与癌症相关的抗原。

19.权利要求17或18所述的用途，其中所述免疫子具有5’-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5’的结构，其中X为甘油连接且R为2’-脱氧-7-脱氮鸟苷。

20.治疗有效协同量的至少一种免疫子化合物和治疗有效协同量的IL-2在制备治疗患者过敏症的药物中的用途，其中所述组合物协同刺激一种或多种选自IL-12和IFN-γ，IFN-α，IFN-β或其组合的细胞因子的产生。

21.权利要求20所述的用途，其中所述治疗患者过敏症的药物进一步包括与所述过敏症相关的抗原。

22.权利要求20或21所述的用途，其中所述免疫子具有5’-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5’的结构，其中X为甘油连接且R为2’-脱氧-7-脱氮鸟苷。

23.治疗有效协同量的至少一种免疫子化合物和治疗有效协同量的IL-2在制备治疗患者传染性疾病的药物中的用途，其中所述组合物协同刺激一种或多种选自IL-12和IFN-γ，IFN-α，IFN-β或其组合的细胞因子的产生。

24.权利要求23所述的用途，其中所述治疗患者传染性疾病的药物进一步包括与所述传染性疾病相关的抗原。

25.权利要求23或24所述的用途，其中所述免疫子具有5’-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5’的结构，其中X为甘油连接且R为2’-脱氧-7-脱氮鸟苷。

26.治疗有效协同量的免疫刺激性寡核苷酸和治疗有效协同量的IL-2在制备刺激患者免疫应答的药物中的用途，其中所述免疫刺激性寡核苷酸包括至少一种免疫刺激性CpG二核苷酸，其中C不是胞嘧啶或脱氧胞嘧啶和/或G不是鸟苷或2-脱氧鸟苷。

27.权利要求1的组合物，其中所述免疫子化合物具有如下结构：

28.权利要求17-18、20-21和23-24中任一项的用途，其中所述免疫子化合物具有如下结构：

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