KR20100087359A

KR20100087359A - 면역촉진을 위한 카테나

Info

Publication number: KR20100087359A
Application number: KR1020107012451A
Authority: KR
Inventors: 마티아스 쉬로프; 부가르트 위티그; 마뉴엘 슈미트; 자닌 로르; 크리스티안 클레우쓰
Original assignee: 몰로겐 아게
Priority date: 2007-11-07
Filing date: 2008-11-07
Publication date: 2010-08-04
Also published as: MX2010004998A; TW200927148A; EA201000769A1; US20100303803A1; AU2008324384A1; WO2009059805A1; EP2058397A1; IL205543A0; BRPI0820388A2; EP2207880A1; CN101883854A; JP2011502492A; CA2703983A1

Abstract

본 발명은 인간 또는 동물 면역계의 활성을 조절하기 위한 다합체 비-코딩 핵산 분자, 이들의 생산 방법, 그리고 상기 다합체 비-코딩 핵산 분자를 포함하는 백신에 관계한다. 이들 다합체 비-코딩 핵산 분자는 최소한 2개의 상기 분자(이합체(dimer))로 구성되거나, 또는 여러 비-코딩 핵산 분자로 집합되는 비-코딩 핵산 분자일 수 있다.

Description

면역촉진을 위한 카테나{CATENATE FOR IMMUNOSTIMULATION}

본 발명은 인간과 동물 면역계의 활성의 조절을 위한 다합체 비-코딩 핵산 분자, 이들의 제조 방법, 그리고 이러한 다합체 비-코딩 핵산 분자를 포함하는 백신에 관계하는데, 여기서 다합체 비-코딩 핵산 분자는 상기 비-코딩 핵산 분자의 최소한 2개의 카테나화 분자(이합체(dimer))를 포함하는 비-코딩 핵산 분자로서 이해된다.

적응성 면역 반응(adaptive immune response)은 개별 병원균(pathogen)에 대한 특이적 림프구(lymphocyte)의 분비, 그리고 이들의 클론 확장(clonal expansion)과 분화(differentiation) 이후에 지연(3 - 5일) 시작되고, 이후 면역 기억(immunological memory)을 형성함으로써 개별 병원균에 대한 장기간 지속되는 보호를 제공하는 반면, 선천성 면역계(innate immune system)의 세포는 생식세포(germ cell) 인코딩된 수용체에 의한 보존된 병원균 연관된 분자 패턴(pathogen associated molecular pattern, PAMP)을 통하여 병원균을 인식하고, 즉시 반응한다. 상이한 반응은 상이한 종류의 세포 유형(cell type), 예를 들면, 사이토킨(cytokine)(가령, IL-1, IL-6, TNF-α)과 케모킨(chemokine)(가령, IL-8/CXCL8, MIP-1α/β, MCP-1)의 분비, 효과기 기전(effector mechanism)(식세포작용(phagocytosis), 호흡 배출(respiratory discharge), 살균제(bactericide) 물질 또는 용해 미립(lytic granule)의 유리(liberation))의 활성화, 보조-촉진 분자(co-stimulatory molecule)(CD80, CD86)의 발현, 그리고 MHC-분자의 강화된 발현에 속한다. 따라서 한편으로, 효과기 세포(effector cell)가 동원되고 활성화되며, 이들 세포는 침입한 병원균을 제거할 수 있고, 다른 한편으로, 적응성 면역계의 세포가 그들의 활성화를 위하여 필요한 신호를 수용한다.

면역 반응을 향상시키기 위하여, CpG-올리고뉴클레오티드(CpC-ODN)가 새로운 부류의 면역 조절 분자로서 이용되고 있다. 이런 비-메틸화된 CG-모티프는 세균 DNA에서 발견될 수 있고, 면역계에 대한 "위험 신호(danger signal)"를 대표한다. 병원균 연관된 분자 패턴(PAMP)으로서, 이들은 선천성 면역계의 비-특이적인 활성화를 유도한다(Krieg, Nat. Med 2003, 9: 831-835). CpG-ODN은 사이토킨 인터루킨-12, 인터페론-χ 및 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor)-α를 통하여 T_H1-기초된 면역 반응을 유도한다.

상기 CpG-ODN을 포함하는 면역 촉진 핵산 서열(immune stimulatory nucleic acid sequence, ISS)은 몇몇 염기의 길이를 갖고, 단백질의 발현을 위한 개방 해독 틀(open reading frame)을 포함하지 않는다.

ISS는 말단이 개방되거나(유리 히드록실 기와 인산염 기), 또는 합성 기(synthetic group)에 의해 보호되는 선형 핵산 분자를 나타낸다.

세포 면역 반응의 강한 촉진은 개입(intervention)이 없으면 환자에 대한 만족스런 면역 활성을 유도하지 못하는 피드백 루프(feedback loop)에 영향을 주는 것을 가능하게 한다.

CpG-DNA를 안정화시키는데 이용되는 포스포로티오에이트-골격(phosphorothioate-backbone)으로 CpC-ODN의 변형은 여러 심각한 단점을 유발한다. 특히, 이런 단점에는 두드러진 독성(Heikenwalder 2004, Levin 1999) 및 단백질에 비-특이적인 결합(Brown 1994)이 포함된다.

이로 인하여, 새로운 부류의 공유 닫힌(covalently closed) 면역 촉진 DNA가 개발되었다(WO 01/07055 / EP 1196178). 이들 DNA-분자는 5'-말단에 자기 상보성 부분(self complementary part) 및 3'-말단에 회문 중복 단부(palindromic, overlapping end)를 보유하는 2개의 화학적으로 합성된 DNA-분자로 구성되는데, 양쪽 DNA-분자의 결찰은 공유 닫힌 분자를 결과한다. 비-상보성 부분에서 CG-모티프를 포함하는 이들 DNA-분자는 CpG-ODN과 유사한 활성(B-세포 상에서 표면 분자 CD80, CD40, MHC의 강화된 발현 및 PBMC에 의한 IL-6, IFN-γ, IFN-α IL-12, TNFα의 분비)을 보이지만, 포스포로티오에이트 골격을 보유하는 CpG-ODN과 비교하여, 유도된 사이토킨의 발현 패턴(expression pattern)에 대한 차이 및 생쥐 내에서 분명하게 더욱 낮은 독성을 나타낸다. 이러한 당해 분야의 면역 촉진 DNA는 인간과 동물 면역계의 활성의 조절에 대하여, 여러 단점을 갖는다. 인간과 동물 면역계의 활성을 원하는 정도까지 조절하는, 특히 활성화시키는 것이 불가능하다. 예로써, 도 1 또는 청구항 11에 제시된 바와 같은 WO 01/07055에 따른 분자는 본 발명의 요점에서 단량체로서 지시되는, 부분적으로 단일 가닥 아령(dumbbell)-형상 공유 닫힌 DNA 분자를 형성하는 여러 데옥시리보뉴클레오티드 레스트(rest)로 구성된다. WO 01/07055에 따르면, 올리고뉴클레오티드로부터 만들어진 이들 단량체는 결찰 이전에 가열되고 이들 올리고뉴클레오티드로부터 균일한 분자를 수용하며, 각각은 아령-형상 단량체로 구성된다(WO 01/07055의 도 1을 비교한다). 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단량체 용어를 해석하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 단량체는 단량체로서 그들의 특성을 상실하지 않으면서, 여러 분자 요소, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 레스트로 구성될 수 있다(가령, 미오글로빈(myoglobin)은 153개 아미노산 단량체이다). 상기 단량체는 WO 01/07055의 도 1에 따른 아령이다. 본 발명의 요점에서 단량체는 예로써, 단일 염기(single base)로 구성되는 구조를 지시하지 않고, 자체로 여러 데옥시리보뉴클레오티드 레스트로 구성되는 뉴클레오티드로 구성되는 닫힌 아령-형상 형태를 지시한다(WO 01/07055의 도 1 또는 청구항 11을 비교한다).

이러한 당해 분야의 기술적 수준으로부터, 본 발명의 목적은 향상된 면역 반응을 개시하는 적절한 면역 촉진 DNA 분자, 이들의 제조 방법, 그리고 상기 면역 촉진 DNA-분자를 포함하는 백신을 제시하는 것이다.

본 발명의 배경에서, 면역 촉진은 면역계의 매개인자와 효과기 세포, 주로 보조 기능(helper function)을 갖는 현재 공지된 흉선 세포(thymocyte)와 세포독성 흉선세포(cytotoxic thymocyte), B-세포와 NK(natural killer)-세포, 대식세포(macrophage)와 단핵구(monocyte), 수상돌기 세포(dendritic cell)와 이들의 전구체(precursor), 그리고 면역계 내에서 기능이 아직까지 명확하게 확인되지 않은 세포 집단(cell population)이 증식, 이동, 분화 또는 활성을 위하여 핵산 분자의 이용에 의해 촉진된다는 것을 의미한다. 면역 조절은 상기 정의된 의미에서 전반적인 촉진 이외에, 시작 또는 성숙 면역 반응에 영향을 주는 지, 또는 특성에 대하여 확립된 반응(established reaction)을 변화시키는 지에 상관없이, 면역 반응의 유형 또는 특성이 영향을 받게 된다는 것을 의미한다.

본 발명에서는 저중합체 또는 다합체 비-코딩 핵산 분자를 제공함으로써 이러한 과제를 해결한다. 매우 놀랍게도, 공유 닫힌 면역 촉진 DNA의 이합체(dimer), 삼합체(trimer), 오합체(pentamer) 또는 다합체(multimer)는 지금까지 알려진 분자에 비하여 훨씬 향상된 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 다합체 분자는 아래의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:

- 5'-인산화 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계;

- 건조 잔류물이 획득될 때까지 특히, MgCl₂의 존재에서 알코올 침전(alcohol precipitation) 또는 동결 건조(lyophilisation), 그 이후에 완충액에서 재현탁(resuspension) 단계;

- T4-DNA-리가아제를 첨가하여 반응 혼합물을 생산하는 단계, 그리고

- 37℃에서 최소한 30분 동안 상기 반응 혼합물의 항온 처리(incubation) 단계.

본 발명에 따른 분자는 제조 방법에 의해 특성화될 수 있다. 이러한 제조 방법은 산물에 대한 정의로서 기능한다. 상기 방법에 의해 정의된 산물은 당해 분야, 예를 들면, WO 01/07055에 기술된 분자에 대하여 신규하다. 제조 방법으로 기술되고 청구되는 상기 분자는 구조적 특성과 기능적 특성으로 정의되고, 이들 특성은 당업자를 위한 이의 제조 방법의 적용에 기인한다. 상기 분자의 제조는 이러한 제조 방법을 이용하면 매우 정확한데, 그 이유는 구조적 특징(structural feature)에 의한 특성화가 실현가능하지 않기 때문이다. 이러한 청구된 방법은 성공적으로 수행될 수 있는데, 그 이유는 당업자를 위한 모든 필요한 설명이 개시되기 때문이다. 더 나아가, 이러한 제조 방법은 당해 분야에 공지된 방법과 상이하다. 이러한 새로운 방법의 이용은 당해 분야에 기술된 것들과 상이한 산물을 결과한다. 이는 예로써, WO 01/07055의 도 1에 따른 단량체 및 본 발명에 따른 다합체의 특성에서 분명한 차이에 의해 확인될 수 있다. 본 발명의 분자는 당해 분야의 분자들보다 면역 촉진에 훨씬 적합하다.

본 발명에 따른 분자는 또한, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 동등한 방법으로, 특히 HPLC 및 그 이후에, FPLC로 연합된 정제에 의해 정제되는 경우에, 물에 담긴 5'-인산화 올리고데옥시리보핵산을 제공함으로써 제조될 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 여러 고성능 방법, 예를 들면, HPLC 또는 FPLC의 공동으로, PAGE-정제의 등급에 유사한 정제 등급이 달성될 수 있다.

놀랍게도, 상기 방법의 단일 단계들의 연대순 배열(chronology)은 안정적으로 카테나화된 단량체 및 최소한 48개의 뉴클레오티드(24개의 뉴클레오티드를 보유하는 2개의 단량체)를 포함하는 다합체 분자로 이어진다. 형성된 분자 카테나는 유리 5'-말단 또는 3'-말단을 포함하지 않는다. 분자간 카테나화(intermolecular catenation)를 통하여 본 발명에 따른 분자를 형성하는 단량체는 아래와 같이 특성화된다:

- 최소한 8개의 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 적절한 조건 하에 상기 단량체의 다른 부분과 함께, 이중 가닥 스템(double stranded stem)을 형성하고,

- 이들 가역적 상보성 부분 사이에 최소한 4개의 뉴클레오티드가 존재하고,

- 단일 가닥 부분 내에 CG-모티프가 존재하고, 이들은 세포 구조에 의해 인식되고,

- 변형된 뉴클레오티드 역시 단일 가닥 부위(single stranded area)의 일부일 수 있고, 이들 뉴클레오티드는 지방산(fatty acid), 당(sugar) 또는 아미노산(amino acid)에 공유 연결된다.

본 발명에 따른 분자는 최소한 2개의 단량체를 포함하고, 상기한 합성 동안 형성된다. 이들 단량체는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 분자간 카테나를 형성한다. 이는 도 1(분리 이후에 겔의 사진)에서 도시된 바와 같은 저중합체(oligomer)로 불리는 이합체, 삼합체, 사합체, 오합체 또는 육합체의 형성을 결과한다.

본 발명에 따른 분자는 카테나로 정의될 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 분자 및 최소한 하나의 루프가 상이한 분자의 다른 루프에 연결되는 카테나화 분자가 서로 집합되고, 따라서 바람직하게는, 최소한 하나, 특히 바람직하게는, 여러 개의 카테나화 요소가 존재하는 것으로 의도된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 루프의 자기-상보성 부분을 보유하는 여러 분자가 서로 혼성화(hybridization)되고, 이로 인하여 본 발명에 따른 산물을 형성하는 것으로 의도된다.

이용된 서열에 따라서, 예로써, 여러 단량체 구조가 가급적, 그들의 개별 루프에 의해 카테나에 집합된 카테나화 분자가 제공될 수 있다.

다른 다합체 구조는 G-4중항(quartet) 구조이다. 구아닌(guanine)은 구아닌-구아닌 염기쌍(guanine-guanine-base pair)을 통한 4개의 H-가교-결합-측면(H-bridge-binding-side)의 지향(orientation)으로 인하여, 8개의 H-가교(bridge)를 보유하는 환형 염기 4중항(cyclic base quartet)을 형성할 수 있다. 여러 개의 연속 구아노신 뉴클레오티드를 포함하는 DNA-서열은 더욱 높은 분자 나선 구조(molecular helical structure)를 형성할 수 있는데, 이들 구아닌 염기는 독특한 주요 상호작용으로 강한 평면성(planarity)을 나타낸다. 서열 내에서 구아노신 뉴클레오티드의 위치, 숫자와 분포에 따라서, 여러 G-구조가 형성될 수 있다.

본 발명에 따른 분자는 당해 분야의 분자보다 인간 또는 동물 면역계의 활성을 더욱 효과적으로 조절, 특히 활성화시킬 수 있다. 당해 분야의 이들 분자는 공지된 면역 촉진 핵산 서열이고, 단량체 아령-형상 구조로서 작용한다. 가장 공지된 면역 조절 짧은 올리고데옥시리보핵산 서열은 메틸화되지 않은 시토신(cytosine)-구아노신-모티프를 포함한다. 이들 핵산의 생리 효과 역시 본 발명의 요점에서, 면역 조절, 또는 면역계의 활성 조절로서 이해된다. 가령, EP 1 196 178에서는 최소한 하나의 루프를 보유하는 스템으로 구성된 여러 분자를 개시하는데, 이들은 예로써, 도 1, 2와 3에서 개시된다. 본 발명의 요점에서, 이들 분자는 단량체 구조이다. 본 발명에서는 이런 단량체를 단일 분자로서 포함하지 않는다. 주의해야 할 점은 저중합체 용어가 여러 상이한 과학적 의미로 이용된다는 것이다. 저중합체는 예로써, 더욱 긴 핵산 서열, 그리고 더욱 큰 어셈블리(assembly)로 형성되는 여러 개의 동일한 또는 유사한 분자를 포함하는 구조일 수 있다. 본 발명의 요점에서 저중합체는 최소한 2 - 5개의 단량체를 포함하고 이합체 내지 오합체를 형성하는 분자 카테나를 지시한다. 이는 최대 200 kDa까지 도 1에 따른 분자량(molecular weight)에 관계한다. 본 발명의 요점에서 다합체는 예로써, EP 1 196 178에 따른 여러 스템-루프 구조이고, 여러 개의 동일한 또는 유사한 스템-루프-구조의 더욱 높은 구조(다합체)로의 어셈블리(assembly)를 나타낸다. 200 kDa 초과의 분자량을 갖는 본 발명에 따른 모든 분자는 다합체로서 표시된다. 이러한 반응을 위한 앞서 기술된 조건은 결찰 동안, 결찰 산물의 안정된 분자간 카테나화를 유도한다. 결과의 저중합체/다합체는 특수한 반응 조건 하에서만 합성 동안 확정적으로 형성될 것이다. 이미 형성된 단량체로부터 다합체를 제조하는 것은 불가능하다. 다합체를 형성하는 단량체 구조는 서로 공유 연결되지 않지만, 카테나 구조로서 연결된다. 형성된 저중합체(당업자는 다합체화(multimerization)와 연관된 저중합체의 특징이 올리고데옥시리보핵산 서열을 의도하지 않음을 인지할 것이다) 또는 다합체는 가열(heat) 또는 변성제(denaturing agent)에 대하여 안정한데, 이는 단일 분자 구조가 단순한 물리적 수단으로, 본 발명에 따른 분자로부터 달성될 수 없음을 의미한다.

놀랍게도, 이런 저중합체와 다합체 구조는 단량체 구조에 비하여 향상되고 진보된 특성을 나타내고, 비교적 단순한 방법 단계에 의해 획득될 수 있다. 이러한 어셈블리(assembly) 생산은 면역계의 조절과 관련하여 단일 분자 구조에 비하여 향상된 특성을 갖는 고도로 복잡한 구조, 예를 들면, 이합체(dimer), 오합체(pentamer) 등을 나타내는 원심분리(centrifugation), 겔 전기영동(gel electrophoresis) 또는 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)에 의해 수행될 수 있다(도 3과 4, 5를 비교한다). 이는 실험 동물(lab organism) 또는 인간에서 상이한 형태의 면역 촉진을 결과한다.

아래의 특성화에 따른 모든 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 다합체화(multimerization)의 방법에 적합하다. 아래의 서열을 포함하고, 상기 방법에 이용되는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열에 의해 특성화되는 본 발명에 따른 다합체 또는 카테나(catenate)가 바람직하다:

a) agctgtagcagcttcggggggtatcgttcttcgtgtcgttcttagctgcta-

cagctgcagctgtagcagcttcggggggtatcgttcttcgtgtcgttct-

tagctgctacagctgc (SEQ ID No. 1) 또는

b) ggggttaccaccttctatagaaaacgttcttcggggcgttcttcatcgg-

taacccctaggggttaccaccttctatagaaaacgttcttcggggcgttctt-

catcggtaaccccta (SEQ ID No. 2) 또는

c) ggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaac-

ccctaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtgg-

taaccccta (SEQ ID No. 3) 또는

d) agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtgg-

taaccctcaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgt-

tcttaggtggtaacccctg (SEQ ID No. 4) 또는

e) ggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtgg-

taaccccggcgggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttct-

taggtggtaacccgcc (SEQ ID No. 5) 또는

f) agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaaccc-

taatgggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtgg-

taacccatt (SEQ ID No. 6) 또는

g) agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtgg-

taaccctcaggggttaccacctteattggaaaacgttcttcggggcgttct-

taggtggtaacccctg (SEQ ID No. 7) 또는

h) CTAGGGGTTACCACCTACAAAAAAAAACGAAATTCGGGGCGAAGG-

GAGGTGGTAACCC (SEQ ID No. 8) 또는

i) 여기서 상기 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열은 20개 내지 400개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.

바람직한 서열의 선택은 면역계의 촉진에 극히 효과적으로 이용될 수 있는 분자로 이어진다. 이는 특징 c)에 따른 염기 서열이 각각 d) agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaaccctcaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacccctg (SEQ ID No. 4)에 따른 서열 ggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacccctaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaaccccta (SEQ ID No. 2) 내에 포함되는 지에 상관없이, 특히 바람직하다. 놀랍게도, 이들 단일 분자의 이런 서열의 존재는 본 발명에 따른 카테나-유사 조립된 분자의 향상된 형성을 결과한다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 분자는 데옥시리보뉴클레오티드의 부분적으로 단일 가닥 공유 닫힌 사슬을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 분자의 카테나화 저중합체 또는 다합체 구조 내에서, 데옥시리보뉴클레오티드의 부분적으로 단일 가닥 공유 닫힌 사슬은 이러한 사슬이 도입되는 생물체 내에서 상기 분자의 장기적인 효과를 주도한다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 분자는 염기 서열 N¹N²CGN³N⁴를 포함하는 것으로 의도되는데, 여기서 N¹N²는 GT, GG, GA, AT 또는 AA 군의 요소이고, N³N⁴는 CT 또는 TT 군의 요소이고, C는 데옥시시토신(deoxycytosine), G는 데옥시구아노신(deoxyguanosine), A는 데옥시아데노신(deoxyadenosine), 그리고 T는 데옥시티미딘(deoxythymidine)이다.

특히 바람직한 구체예에서, 염기 서열 N¹N²CGN³N⁴는 데옥시리보뉴클레오티드의 닫힌 사슬(closed chain)의 단일 가닥 부분(single stranded part) 내에 위치하는 것으로 의도된다. 특히, 이들 바람직한 분자는 면역계의 촉진 동안 매우 강한 효과를 나타낸다.

따라서 본 발명에 따른 분자는 배타적이지 않은 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 분자를 포함하고, 여기서 상기 데옥시리보핵산 분자는

- 데옥시리보뉴클레오티드의 부분적으로 단일 가닥, 아령(dumbbell)-형상, 공유 닫힌 사슬을 포함하고, 그리고

- 염기 서열 N¹N²CGN³N⁴의 하나 이상의 서열을 포함하고,

- 여기서 N¹N²는 GT, GG, GA, AT 또는 AA 군의 요소이고, N³N⁴는 CT 또는 TT 군의 요소이고, C는 데옥시시토신(deoxycytosine), G는 데옥시구아노신(deoxyguanosine), A는 데옥시아데노신(deoxyadenosine), 그리고 T는 데옥시티미딘(deoxythymidine)이고,

상기 서열은

a) GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC (SEQ ID No. 9) 또는

b) ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGAAGGTTGATCTTCATAACGTTGCCTAGATCA (SEQ ID No. 10) 또는

c) 염기 서열 AACGTTCTTCGGGGCGTT (SEQ ID No. 11)의 데옥시리보핵산 서열을 포함하는 것으로 특징된다.

이러한 적용에 따른 다합체는 상기 단량체를 포함할 수 있다.

당연히, 본 발명에 따른 분자는 공유 결합(covalent binding)에 의해 결합된 하나 이상의 치환기를 보유할 수 있다. 이런 치환기는 예로써, 펩티드(peptide), 단백질(protein), 당류(saccharide), 항원성 구조(antigenic structure), 지질(lipid), DNA 및/또는 RNA일 수 있다.

본 발명은 산물의 제조를 위한 방법의 상기한 단계 이외에, 아래의 단계를 포함하는 분자의 제조 방법에 관계한다:

- 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 정제된 물에 담긴 5'- 인산화 올리고데옥시리보핵산 서열을 제공하는 단계,

- 건조 잔류물이 획득될 때까지 동결 건조(lyophilisation), 그 이후에 완충액에서 재현탁(resuspension) 단계;

- 37℃에서 최소한 30분 동안 상기 반응 혼합물의 항온 처리(incubation) 단계, 또는

- 올리고데옥시리보핵산 서열이 염화마그네슘(magnesium chloride)의 존재에서 침전 또는 동결 건조 이후에 제공되고, T4-DNA-리가아제가 첨가되고, 획득된 반응 혼합물이 37℃에서 최소한 10분 동안, 바람직하게는, 최소한 30분 동안 항온 처리되고, 여기서 상기 올리고데옥시리보핵산은 침전 또는 동결 건조에 앞서, HPLC, 그 이후에 FPLC에 의해 정제된다.

특히 올리고데옥시리보핵산이 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로, 또는 HPLC와 FPLC의 공동으로 정제된 경우에, 염화마그네슘의 존재에서 침전 또는 동결 건조로 다합체의 제조와 관련하여 동일한 결과가 획득될 수 있다.

놀랍게도, 당해 분야에 공지된 상이한 분자 구조(WO 2007/131495 또는 WO 01/07055)가 상기 방법에 의해 획득될 수 있다. 이들 방법이 일부 단계에서만 차이를 보이지만, 이러한 상대적으로 약간의 변형이 상이한 분자의 제조를 결과한다는 점에서 더욱 놀랍다. 당해 분야에 공지된 방법(WO 01/07055 또는 WO 2007/131495)으로 획득된 구조는 그들의 특성에서 명백한 차이를 보인다. 이들 분자는 면역 촉진 효과에 관련하여 명백하게 차별될 뿐만 아니라 다른 특징, 예를 들면, 부작용(side effect)에서 차별된다. 이들 방법의 상이한 단계 이외에, 이들 바람직한 서열의 이용은 특유하고 현저한 특성을 갖는 매우 특이적인 반응 산물의 형성으로 이어진다. 상기한 방법 단계와 함께, 본 발명에 따른 서열의 이용은 당해 분야에 공지된 다합체와 관련하여 유익한 특성을 나타내는 유익한 다합체를 결과한다.

본 발명에 따른 카테나는 가급적 1+x 단일 성분, 바람직하게는, 데옥시리보뉴클레오티드의 부분적으로 단일 가닥, 아령-형상 공유 닫힌 사슬을 포함하는데, 여기서 이들 단일 성분은 스템(stem)과 루프(loop)를 보유하고, 상기 스템은 최소한 8개의 데옥시리보뉴클레오티드를 보유하고, 상기 루프는 최소한 4개의 데옥시리보뉴클레오티드를 보유하고, 상기 루프는 1 내지 6개의 CG-모티프(motif)를 보유하고, x는 일단의 모든 자연수(natural number)로부터 요소이다.

또한, 본 발명은 최소한, 본 발명에 따른 분자 및 화학치료제를 포함하는 조성물에 관계한다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 분자에 의한 면역계의 매우 효과적인 촉진은 본 발명에 따른 치료제를 공지된 화학치료제와 결합시키고, 조성물을 예로써 종양의 치료에 이용함으로써 더욱 향상될 수 있다. WO 01/07055에 따른 단량체가 면역 촉진 효과를 나타내고 화학치료제가 종양에 대한 효과를 나타내는 것으로 당업자에게 공지되어 있긴 하지만, 단량체에 의해 형성되는 중합체 또는 다합체가 화학치료제와의 조합으로, 주합(aggregation) 초과의 효과를 나타낸다는 것은 매우 놀라운 발견이다. 본 발명에 따른 조성물의 이들 요소는 기능적으로 상호작용하고 상승효과(synergistic effect)를 발생시킨다. 본 발명에 따른 조성물 내에서 결합된 이들 요소는 병원균, 특히 종양을 치료하는 동일한 목적으로 효과를 발휘한다. 각 요소는 본 발명에 따른 조성물 내에서 고립된 결과(isolated result)에 기여하지 않지만, 이들 단일 요소 간에 상호작용은 놀라운 효과로 이어진다. 본 발명에 따른 조성물은 키트(kit)로서 제공될 수 있는데, 여기서 본 발명에 따른 분자 및 당해 분야에 공지된 화학치료제는 별개로 제공된다. 따라서 바람직한 구체예에서, 이들 키트의 최소한 2가지 성분은 동시에 또는 지연 시간 방식으로 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 이러한 적용은 예로써, 화학치료제의 차후 적용이 매우 우수한 효과를 나타내도록 면역계를 활성화시킬 수 있다. 당연히, 인간 또는 동물 생물체 내로 화학치료제를 먼저 적용하고, 시간 지연 방식으로 본 발명에 따른 분자를 차후에 적용하는 것이 가능하다. 규정된 종양에 대하여, 본 발명에 따른 분자 및 화학치료제의 동시 적용이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 화학치료제(chemotherapeutic)는 항체, 알킬화제(alkylating agent), 백금 유사체(platinum analogue), 중격제(intercalating agent), 항생제(antibiotics), 유사분열 억제제(mitosis suppressor), 탁산(taxane), 국소이성질화효소 억제제(topoisomerase suppressor), 항-대사물질(anti-metabolite) 및/또는 L-아스파라기나아제(asparaginase), 히드록시카바마이드(hydroxycarbamide), 미토탄(mitotane) 및/또는 아마니틴(amanitine)으로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 알킬화제는 아래와 같이 구성된 군에서 선택된다:

- 질소 겨자 유도체(nitrogen mustard derivative), 특히

- 시클로포스파미드(cyclophosphamide),

- 이포스파미드(ifosfamide),

- 트로포스파미드(trofosfamide),

- 멜팔란(melphalan) 및/또는

- 클로람부실(chlorambucil)

- 알칼설포네이트(alkylsulfonate), 특히

- 부설판(busulfan) 및/또는

- 트레오설판(treosulfan)

- 니트로소우레아(nitrosourea), 특히

- 카르무스틴(carmustine),

- 로무스틴(lomustine),

- 니무스틴(nimustine)

- 에스트라무스틴(estramustine) 및/또는

- 스트렙토조토신(streptozotocin)

- 프로카르바진(procarbazine) 및 다카르바진(dacarbazine),

- 테모졸로미드(temozolomide) 및/또는

- 티오테파(thiotepa).

이들 알킬화제는 종양에 대한 매우 우수한 효과를 나타내고, 종양의 성장을 저해한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 백금 유사체는 아래와 같이 구성된 군에서 선택된다:

- 시스플라틴(cisplatin),

- 카르보플라틴(carboplatin) 및/또는

- 옥살리플라틴(oxaliplatin).

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 중격제는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것으로 의도된다:

- 안트라사이클린(anthracycline), 특히

- 독소루비신(doxorubicine)(아드리아마이신(adriamycin)),

- 다우노루비신(daunorubicine),

- 에피루비신(epirubicine) 및/또는

- 이다루비신(idarubicine),

- 미톡산트론(mitoxantron),

- 암사크린(amsacrine) 및/또는

- 독시플루리딘(doxifluridine).

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 항생제는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것으로 의도된다:

- 블레오마이신(bleomycine),

- 악티노마이신(actinomycine) D(닥티노마이신(dactinomycine)) 및/또는

- 미토마이신(mitomycine).

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 유사분열 억제제는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것으로 의도될 수 있다:

- 빈카 로시아(vinca rosea)의 알칼로이드, 특히

- 비노렐빈(vinorelbine),

- 빈크리스틴(vincristine)(온코빈(oncovine)),

- 빈블라스틴(vinblastine) 및/또는

- 빈데신(vindesine).

본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 탁산은 아래와 같이 구성된 군에서 선택된다:

- 파클리탁셀(paclitaxel) 및/또는

- 도세탁셀(docetaxel).

더 나아가, 바람직하게는, 국소이성질화효소 억제제는 아래와 같이 구성된 군에서 선택된다:

- 국소이성질화효소-I-저해물질, 특히

- 캄포테신(camptothecin),

- 토포테칸(topotecan) 및/또는

- 이리노테칸(irinotecan) 및/또는

- 국소이성질화효소-II-저해물질, 특히

- 에토포시드(etoposide),

- 테니포시드(teniposide).

더 나아가, 바람직하게는, 본 발명의 특정 구체예에서 항-대사물질은 아래와 같이 구성된 군에서 선택된다:

- 엽산 길항물질(folic acid antagonist), 특히

- 메토트렉세이트(methotrexate),

- 피리미딘 유사체(pyrimidine analogue), 특히

- 5-플루오르우라실(fluorouracil)

- 카페시타빈(capecitabin),

- 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside)(시타라빈(cytarabin)) 및/또는

- 젬시타빈(gemcitabin),

- 퓨린 유사체(purine analogue), 특히

- 6-티오구아닌(thiogunaine),

- 펜토스타틴(pentostatine),

- 아자티오프린(azathioprine),

- 6-메르캅토퓨린(mercaptopurine),

- 플루다라빈(fludarabin) 및/또는

- 클라드리빈(cladribine).

또한, 본 발명은 가능하면, 키트의 내용물을 결합시키는 방법에 관한 정보와 함께, 본 발명에 따른 분자 및 화학치료제를 포함하는 키트에 관계한다. 또한, 본 발명은 - 앞서 기술된 바와 같이 - 가능하면, 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 본 발명에 따른 분자 또는 조성물을 포함하는 제제에 관계한다.

또한, 본 발명은 인간 또는 동물 면역계의 조절 또는 상기한 면역계의 활성의 조절을 위한 치료제의 제조에서 상기 분자, 상기 조성물 또는 상기 제제의 용도에 관계한다. 인간 또는 동물 면역계의 조절은 각각, 면역계에 영향을 주고, 상기 면역계는 종양 또는 암을 저해하는 효과를 갖는 것으로 이해된다. 면역계의 활성의 조절은 이와 유의하게 이해되거나, 또는 종양에 대항하고 본 발명에 따른 치료제에 의해 활성이 현저하게 증가되는 면역계의 공지된 활성으로서 당업자에게 기술될 수 있다. 이러한 조절은 특히, 면역계의 효과 또는 면역계 자체의 촉진 또는 증가이다. 따라서 본 발명에 따른 치료제는 바람직한 구체예에서, T-세포 매개된 면역 반응뿐만 아니라 T-세포 독립된 면역 반응을 촉진하는데 이용될 수 있다. 이러한 과정은 본 발명의 바람직한 구체예에서, B-세포의 증식 또는 B-세포 활성화를 포함할 수 있다.

특히 바람직한 구체예에서, 면역계의 활성의 조절은 사이토킨이 분비되는, 또는 분비가 향상되는 효과로 촉진을 결과한다. 특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 분자, 또는 본 발명에 따른 조성물은 치료적(therapeutic) 또는 예방적(prophylactic) 예방접종에서 어쥬번트(adjuvant)로서 이용된다. 본 발명에 따른 치료제는 세포 성장 질환의 치료에 매우 효과적으로 이용될 수 있는데, 여기서 바람직한 구체예에서, 상기 세포 성장 질환은 종양 질환이다. 바람직하게는, 종양 질환은 코 내부(inner nose), 비동(nasal sinus), 비인두(nasopharynx), 입술(lip), 구강(oral cavity), 구강인두(oropharynx), 후두(larynx), 하인두(hypopharynx), 귀(ear), 타액선(salivary gland)의 종양, 그리고 부신경절종(paraganglioma)을 비롯한 귀-코-목구멍 부위의 종양; 비-소세포 기관지 암종(non-parvocellular bronchial carcinoma), 소세포 기관지 암종(parvocellular bronchial carcinoma), 종격(mediastinum)의 종양을 비롯한 폐의 종양; 식도(esophagus), 위(stomach), 췌장(pancreas), 간(liver), 담낭(gallbladder) 및 담도(biliary tract)의 종양, 소장(small intestine), 결장(colon)과 직장(rectal) 암종(carcinoma), 그리고 항문 암종(anal carcinoma)을 비롯한 위장관(gastrointestinal tract)의 종양; 신장(kidney), 요관(ureter), 방광(bladder), 전립선(prostate gland), 요도(urethra), 음경(penis)과 고환(testicles)의 종양을 비롯한 비뇨생식기(urogenital) 종양; 자궁경부(cervix), 질(vagina)과 음문(vulva)의 종양, 자궁암(uterine cancer), 악성 융모성 질환(malignant trophoblastic disease), 난소 암종(ovarial carcinoma), 자궁관(uterine tube)(Tuba Faloppii)의 종양, 복강(abdominal cavity)의 종양, 유방 암종(mammary carcinoma)을 비롯한 부인과 종양(gynecological tumor); 갑상선(thyroid), 부갑상선(parathyroid)과 부신 피질(adrenal cortex)의 종양, 내분비 췌장 육종(endocrine pancreas tumor), 카르시노이드 종양(carcinoid tumor)과 카르시노이드 증후군(carcinoid syndrome), 다발성 내분비 신생물(multiple endocrine neoplasia), 골과 연조직(soft-tissue) 육종, 중피종(mesothelioma), 피부 종양(skin tumor), 흑색종(가령, 피부 흑색종(cutaneous melanoma)과 안내 흑색종(intraocular melanoma)), 중추신경계의 종양을 비롯한 내분비 기관(endocrine organ)의 종양; 망막세포종(retinoblastoma), 윌름 종양(Wilms tumor), 신경섬유종증(neurofibromatosis), 신경아세포종(neuroblastoma), 유잉 육종 계통(Ewing sarcoma tumor family), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma)을 비롯한 유아기 종양; 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 피부 T 세포 림프종(cutaneous T cell lymphoma), 중추신경계의 원발성 림프종(primary lymphoma), 호지킨병(Hodgkin disease)을 비롯한 림프종; 급성 백혈병(acute leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia)과 만성 림프성 백혈병(chronic lymphatic leukemia)을 비롯한 백혈병(leukemia); 형질 세포 신생물(plasma cell neoplasm), 골수이형성 증후군(myelodysplasia syndrome), 부종양 증후군(paraneoplastic syndrome), 원인불명 원발성 종양(unknown primary tumor)으로 전이(metastasis)(CUP 증후군), 복막 선암종증(peritoneal carcinomatosis), AIDS-관련된 악성, 예를 들면, 카포시 육종(Kaposi sarcoma), AIDS-연관된 림프종, 중추신경계의 AIDS-연관된 림프종, AIDS-연관된 호지킨병 및 AIDS-연관된 항문 종양, 이식-관련된 악성을 비롯한 면역억제(immunosuppression)-관련된 악성; 뇌 전이(brain metastasis), 폐 전이(lung metastasis), 간 전이(liver metastasis), 골 전이(bone metastasis), 흉막(pleural)과 심낭(pericardial) 전이, 그리고 악성 복수(malignant ascites)를 비롯한 전이된 종양(metastasized tumor)으로 구성된 군에서 선택되는 질환이다.

본 발명에 따른 다합체 비-코딩 핵산 분자는 인간 또는 동물 면역계의 활성을 조절하는데 유효하다.

도 1. 하기 "발명을 실시하기 위한 구체적인 내용"을 참조한다.
도 2. 하기 "발명을 실시하기 위한 구체적인 내용"을 참조한다.
도 3. 하기 "발명을 실시하기 위한 구체적인 내용"을 참조한다.
도 4. 하기 "발명을 실시하기 위한 구체적인 내용"을 참조한다.
도 5. 하기 "발명을 실시하기 위한 구체적인 내용"을 참조한다.

본 발명은 하기의 실시예에 의해 예시되지만, 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 분자의 제조를 위한 실례:

a) 단량체의 제조:

서열 CCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACCCCTAGGGG TTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACC (SEQ ID No. 12)를 보유하는 5'-인산화 올리고데옥시리보뉴클레오티드(ODN)는 헤어핀 구조(hairpin structure)가 발생할 수 있도록 5분 동안 90℃로 가열하고, 이후 얼음 위에서 냉각하였다. 자기-상보성 오버행(self-complementary overhang)을 T4-DNA 리가아제(0.1 U/㎍ ODN)의 존재에서 37℃에서 24시간 동안 1 ㎎/㎖ DNA의 최종 농도로 결찰시켰다. 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서, 각 결찰 산물(ligation product)을 분리하고, T7 절단후 도 2 레인, 5와 6을 비교한다.

b) 이합체(dimer), 삼합체(trimer)와 사합체(tetramer), 소위 저중합체(oligomer)를 포함하는 분자 카테나의 제조:

1 ㎎/㎖의 농도를 갖는 올리고데옥시리보핵산 서열 CCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACCCCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACC (SEQ ID No. 13)을 0.3M 나트륨 아세테이트(sodium-acetate)(pH 5.25), 1OmM MgCl₂ 및 3배 부피의 에탄올(ethanol) abs로 침전시켰다. 원심분리(4℃, 13000rpm)하고 70% EtOH로 1회 펠릿(pellet)을 세척한 이후, ODN을 50℃에서 10분 동안 건조시켰다. 그 이후, 물에서 재현탁을 수행하였다(f.c.:1 ㎎/㎖). T4-리가아제 2.3 U/㎍ ODN의 존재에서 결찰을 37℃에서 60분 동안 수행하였다. 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서, 각 결찰 산물(ligation product)을 분리하고, T7 절단후 도 2, 레인 1과 2를 비교한다.

c) 육합체(hexamer)와 다합체를 포함하는 분자 카테나:

1 ㎎/㎖의 농도를 갖는 올리고데옥시리보핵산 서열 CTAGGGGTTACCACCTACAAAAAAAAACGAAATTCGGGGCGAAGGGAGGTGGTAACCC (SEQ ID No. 14)를 0.3M 나트륨 아세테이트(sodium-acetate)(pH 5.25), 1OmM MgCl₂ 및 3배 부피의 에탄올(ethanol) abs로 침전시켰다. 원심분리(4℃, 13000rpm)한 이후, ODN을 50℃에서 10분 동안 건조시켰다. 펠릿을 결찰에 직접 이용하고(0.5 U/㎍ ODN) 37℃에서 60분 동안 항온 처리하였다.

1% 아가로스 겔(agarose gel)에서, 각 결찰 산물(ligation product)을 분리하고, T7 절단후 도 2, 레인 3과 4를 비교한다.

도 2에 관한 설명:

결찰 혼합물(각 첫 번째 레인), 또는 T7 절단후 개별 산물(각 두 번째 레인)이 레인에 적용되었다. 단일 분자, 단량체(레인 6, T7 절단후)에 관련된 단일 띠가 관찰될 수 있다. 더욱 낮은 분자 질량으로 인하여, 이동이 더욱 빠르고, 제조 방법 b)에 따라서 제조되고 레인 1과 2에 적용되는 저중합체와 비교하여 분명하게 상이하다. 상기 단량체의 띠 위에, 이합체 내지 오합체를 나타내는 여러 띠가 관찰될 수 있다. 이에 비하여, 방법 c)에 따라서 제조된 산물은 더욱 크고, 더욱 큰 분자에 상응하는 분명하게 더욱 짧은 이동 방식을 보여준다. 레인 3과 4를 비교한다.

도 1에 관한 설명:

분자량을 결정하기 위하여, 생산된 분자를 3% 아가로즈 겔(agarose gel) 상에서 분리하였다. 겔 사진에서 좌측면 상에서, 이중-가닥 DNA의 분자 크기가 도시되는데, 이는 개별 이동 거리(migration distance)에 관련된다. 겔 사진에서 우측면 상에서, 고분자 산물이 지정된다. 레인 1 내지 3은 a)에 따라서 제조된 단량체로 적하되었다. 레인 3에서는 출발 ODN을 도시한다. 더욱 높은 분자 구조는 제조 공정의 시작 시점에서 가열에 의해 파괴되는 것으로 관찰된다. 결찰(레인 2) 및 T7 절단(레인 1) 이후, 대략 50 kDa의 분자 질량(molecular mass)을 갖는 출발 ODN과 비교하여, 단량체에 상응하는 확대된 분자가 관찰될 수 있다. 다합체 분자는 전혀 형성되지 않는 것으로 분명하게 관찰된다, 다시 말하면, 다합체 분자는 단량체 그 자체의 제조 동안 전혀 획득되지 않을 것이다. 레인 4에서는 출발 ODN을 다시 보여준다. 레인 5에서는 결찰 혼합물을 보여주고, 레인 6에서는 T7 절단후 결찰을 보여준다. 제조는 저중합체와 다합체 분자의 제조를 위하여 b)와 c)에서 기술된 바와 같은 조건에 따라서 수행된다. 단일 분자 이외에, 본 발명에 따른 원하는 분자 역시 형성되는 것으로 분명하게 관찰된다. 이합체, 다시 말하면, 2개의 카테나화 단량체 분자에 상응하는, 대략 100 kDa에서 띠가 관찰될 수 있다. 삼합체 및 사합체에서도 동일하게 관찰된다.

본 발명에 따른 분자의 기능적 증명:

본 발명에 따른 분자의 면역 촉진 특성을 증명하기 위하여 상이한 세포 배양 실험을 수행하였다. TLR9를 촉진하는 능력을 세포주 RAW 264의 뮤린 대식세포의 이용으로 조사하였다. 세포를 125000 세포/㎠으로 접종하고, 16시간후, 단량체 분자(대조로서), 그리고 본 발명에 따른 저중합체 분자(b)에 따라 제조됨) 및 다합체 분자(c)에 따라 제조됨)를 적용하였다. 7시간의 항온 처리(37℃, 5% CO₂)후, 세포를 수확하고 형광 활성 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS)로 측정하였다. 이의 결과는 도 3에 도시된 농도-효과 곡선(concentration-effect curve)을 산출하는데 이용되었다.

본 발명에 따른 분자의 효능은 단량체 단일 분자(아래쪽 곡선)와 비교하여 10의 계수(위쪽 곡선)로 증가한다. 본 발명에 따른 분자는 더욱 적은 양으로 이용되면서 훨씬 우수한 효과를 갖는다. 면역 촉진에 대한 이러한 더욱 놓은 효능은 예로써, 적용가능량(applicable amount)의 이유로 특히, 생체내에서 더욱 높은 용량에 의해 달성될 수 없는, 이들 다합체 분자에 의해 달성되는 국소적으로 더욱 높은 농도에 기인할 수 있다.

사이토킨 생산을 위한 PBMC의 촉진

촉진 분석을 수행하기 위하여, 백혈구(whole blood) 또는 소위, "연막(buffy coat)"으로부터 말초 단핵 혈액 세포(peripheral mononuclear blood cell, PBMC)를 분리하였다. 이들 분리된 세포(PBMC)를 다중-웰-평판(multi-well-plate)에 접종하였다. 첫 번째 혼합물(음성 대조(negative control)로서)은 촉진된 세포를 포함하지 않고, 두 번째 혼합물은 단량체에 비하여 촉진되고, 세 번째 혼합물은 저중합체 분자를 포함하고, 네 번째 혼합물은 다합체 분자를 포함하였다. 사이토킨 인터페론-χ 및 인터루킨 6의 분비를 세포 배양 상층액(cell culture supernatant)으로부터 ELISA로 측정하였다. 도 4와 5를 비교한다. 도 4에 따르면, 저중합체와 다합체 분자로 PBMC의 촉진은 단량체 단일 분자와 비교하여 INF-감마 분비를 2배로 증가시킨다. 여기서 이들 다합체 분자는 저중합체 분자와 비교하여 촉진에서 더욱 강한 효과를 나타낸다. 도 5에서는 촉진에 기인한 IL-6 분비를 도시한다. 단량체가 도 4에 필적하는 촉진 잠재력을 보이긴 하지만, 본 발명에 따른 분자 중의 하나는 더욱 높은 다합체이다.

아래의 서열을 포함하는 본 발명에 따른 분자가 제시된다:

a) agctgtagcagcttcggggggtatcgttcttcgtgtcgttcttagctgctacagctgcagctgtagca gcttcggggggtatcgttcttcgtgtcgttcttagctgctacagctgc (SEQ ID No. 1) 또는

b) ggggttaccaccttctatagaaaacgttcttcggggcgttcttcatcggtaacccctaggggttacc accttctatagaaaacgttcttcggggcgttcttcatcggtaaccccta (SEQ ID No. 2) 또는

c) ggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacccctaggggttacca ccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaaccccta (SEQ ID No. 3) 또는

d) agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaaccctcaggggttacca ccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacccctg (SEQ ID No. 4) 또는

e) ggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaaccccggcgggttacca ccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacccgcc (SEQ ID No. 5) 또는

f) agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaaccctaatgggttacca ccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacccatt (SEQ ID No. 6) 또는

g) agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaaccctcaggggttacca ccttcattggaaaacgttettcggggcgttcttaggtggtaacccctg (SEQ ID No. 7) 또는

h) CTAGGGGTTACCACCTACAAAAAAAAACGAAATTCGGGGCGAAGGGAGGTGGTAACCC (SEQ ID No.8) 또는

i) 여기서 상기 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열은 20개 내지 400개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.

이들 핵산 서열은 결찰에 앞서 가열되지 않고, 폴리아크릴아미드 전기영동(polyacrylamide electrophoresis)에 필적하는 정제 등급(purification grade)을 갖는다. 이는 자체적으로, 또는 HPLC 및 그 이후에, FPLC를 통한 연합된 정제에 의해 제공될 수 있다. HPLC와 FPLC의 공동은 폴리아크릴아미드 전기영동에 필적하는 정제 등급을 제공한다. 이후에, 이들 서열은 건조 잔류물이 획득될 때까지 동결 건조된다. 이후, 완충액에서 재현탁이 수행되고, T4-DNA 리가아제가 첨가되며, 그 이후에 37℃에서 40분 동안 항온 처리된다. 놀랍게도, 획득된 콘카테나(concatenate)는 생쥐에서 향상된 면역 촉진을 유도한다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 콘카테나와 화학치료제의 조합은 향상된 효과를 결과한다. 이러한 향상된 효과는 단일 성분의 효과보다 훨씬 높고 부가 효과(additive effect)를 초과한다. 화학치료제로서, 항체, 알킬화제, 백금 유사체, 중격제, 항생제, 유사분열 억제제, 탁산, 국소이성질화효소 억제제, 항-대사물질 및/또는 L-아스파라기나아제, 히드록시카바마이드, 미토탄 및/또는 아마니틴이 이용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> MOLOGEN AG <120> CATENATE FOR IMMUNOSTIMULATION <130> 80521WO <140> PCT/EP2008/009618 <141> 2008-11-07 <150> EP 07075967.5 <151> 2007-11-07 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 1 agctgtagca gcttcggggg gtatcgttct tcgtgtcgtt cttagctgct acagctgcag 60 ctgtagcagc ttcggggggt atcgttcttc gtgtcgttct tagctgctac agctgc 116 <210> 2 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 2 ggggttacca ccttctatag aaaacgttct tcggggcgtt cttcatcggt aacccctagg 60 ggttaccacc ttctatagaa aacgttcttc ggggcgttct tcatcggtaa ccccta 116 <210> 3 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 3 ggggttacca ccttcattgg aaaacgttct tcggggcgtt cttaggtggt aacccctagg 60 ggttaccacc ttcattggaa aacgttcttc ggggcgttct taggtggtaa ccccta 116 <210> 4 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 4 agggttacca ccttcattgg aaaacgttct tcggggcgtt cttaggtggt aaccctcagg 60 ggttaccacc ttcattggaa aacgttcttc ggggcgttct taggtggtaa cccctg 116 <210> 5 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 5 ggggttacca ccttcattgg aaaacgttct tcggggcgtt cttaggtggt aaccccggcg 60 ggttaccacc ttcattggaa aacgttcttc ggggcgttct taggtggtaa cccgcc 116 <210> 6 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 6 agggttacca ccttcattgg aaaacgttct tcggggcgtt cttaggtggt aaccctaatg 60 ggttaccacc ttcattggaa aacgttcttc ggggcgttct taggtggtaa cccatt 116 <210> 7 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 7 agggttacca ccttcattgg aaaacgttct tcggggcgtt cttaggtggt aaccctcagg 60 ggttaccacc ttcattggaa aacgttcttc ggggcgttct taggtggtaa cccctg 116 <210> 8 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 8 ctaggggtta ccacctacaa aaaaaaacga aattcggggc gaagggaggt ggtaaccc 58 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 9 gttcctggag acgttcttag gaacgttctc cttgacgttg gagagaac 48 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 10 accttccttg tactaacgtt gcctcaagga aggttgatct tcataacgtt gcctagatca 60 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 11 aacgttcttc ggggcgtt 18 <210> 12 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 12 cctaggggtt accaccttca ttggaaaacg ttcttcgggg cgttcttagg tggtaacccc 60 taggggttac caccttcatt ggaaaacgtt cttcggggcg ttcttaggtg gtaacc 116 <210> 13 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 13 cctaggggtt accaccttca ttggaaaacg ttcttcgggg cgttcttagg tggtaacccc 60 taggggttac caccttcatt ggaaaacgtt cttcggggcg ttcttaggtg gtaacc 116 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: circular single-stranded with stem loop structure (dumbbell), all phosphodiester <400> 14 ctaggggtta ccacctacaa aaaaaaacga aattcggggc gaagggaggt ggtaaccc 58

Claims

아래의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 인간과 동물 면역계의 활성의 조절을 위한 카테나화(catenation) 분자:
- 5'-인산화 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계;
- 건조 잔류물이 획득될 때까지 MgCl₂의 존재에서 알코올 침전(alcohol precipitation) 또는 동결 건조(lyophilisation), 그 이후에 완충액에서 재현탁(resuspension) 단계;
- T4-DNA-리가아제를 첨가하여 반응 혼합물을 생산하는 단계, 그리고
- 37℃에서 최소한 30분 동안 상기 반응 혼합물의 항온 처리(incubation) 단계.
청구항 1에 있어서, 카테나화 분자는 바람직하게는, 최소한 하나의 카테나화 요소가 존재하도록 최소한 하나의 루프 요소(loop element)가 두 번째 분자의 다른 루프 요소에 연결된, 특히, 삽입되게 연결된 분자인 것을 특징으로 하는 카테나화 분자.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열은 아래의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 카테나화 분자:
a. agctgtagcagcttcggggggtatcgttcttcgtgtcgttcttagctgctacag
ctgcagctgtagcagcttcggggggtatcgttcttcgtgtcgttcttagctgct
acagctgc, 또는
b. ggggttaccaccttctatagaaaacgttcttcggggcgttcttcatcggt
aacccctaggggttaccaccttctatagaaaacgttcttcggggcgttct
tcatcggtaaccccta, 또는
c. ggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacc
cctaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggt
aaccccta, 또는
d. agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacc
ctcaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggt
aacccctg, 또는
e. ggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacc
ccggcgggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggt
aacccgcc, 또는
f. agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacc
ctaatgggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggt
aacccatt, 또는
g. agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggttaac
cctcaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtgg
taacccctg, 또는
h. ctaggggttaccacctacaaaaaaaaacgaaattcggggcgaagggaggtggta
accc, 그리고
i. 상기 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열은 20개 내지 400개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 따른 분자 및 항체, 알킬화제(alkylating agent), 백금 유사체(platinum analogue), 중격제(intercalating agent), 항생제(antibiotics), 유사분열 억제제(mitosis suppressor), 탁산(taxane), 국소이성질화효소 억제제(topoisomerase suppressor), 항-대사물질(anti-metabolite) 및/또는 L-아스파라기나아제(asparaginase), 히드록시카바마이드(hydroxycarbamide), 미토탄(mitotane) 및/또는 아마니틴(amanitine)으로 구성된 군에서 선택되는 화학치료제(chemotherapeutic)를 포함하는 조성물.
전술한 항에 있어서, 알킬화제는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
- 질소 겨자 유도체(nitrogen mustard derivative), 특히
- 시클로포스파미드(cyclophosphamide),
- 이포스파미드(ifosfamide),
- 트로포스파미드(trofosfamide),
- 멜팔란(melphalan) 및/또는
- 클로람부실(chlorambucil)
- 알칼설포네이트(alkylsulfonate), 특히
- 부설판(busulfan) 및/또는
- 트레오설판(treosulfan)
- 니트로소우레아(nitrosourea), 특히
- 카르무스틴(carmustine),
- 로무스틴(lomustine),
- 니무스틴(nimustine)
- 에스트라무스틴(estramustine) 및/또는
- 스트렙토조토신(streptozotocin)
- 프로카르바진(procarbazine) 및 다카르바진(dacarbazine),
- 테모졸로미드(temozolomide) 및/또는
- 티오테파(thiotepa).
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 백금 유사체는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
- 시스플라틴(cisplatin),
- 카르보플라틴(carboplatin) 및/또는
- 옥살리플라틴(oxaliplatin).
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 중격제는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
- 안트라사이클린(anthracycline), 특히
- 독소루비신(doxorubicine)(아드리아마이신(adriamycin)),
- 다우노루비신(daunorubicine),
- 에피루비신(epirubicine) 및/또는
- 이다루비신(idarubicine),
- 미톡산트론(mitoxantron),
- 암사크린(amsacrine) 및/또는
- 독시플루리딘(doxifluridine).
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 항생제는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
- 블레오마이신(bleomycine),
- 악티노마이신(actinomycine) D(닥티노마이신(dactinomycine)) 및/또는
- 미토마이신(mitomycine).
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 유사분열 억제제는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
- 빈카 로시아(vinca rosea)의 알칼로이드, 특히
- 비노렐빈(vinorelbine),
- 빈크리스틴(vincristine)(온코빈(oncovine)),
- 빈블라스틴(vinblastine) 및/또는
- 빈데신(vindesine).
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 탁산은 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
- 파클리탁셀(paclitaxel) 및/또는
- 도세탁셀(docetaxel).
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 국소이성질화효소 억제제는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
- 국소이성질화효소-I-저해물질, 특히
- 캄포테신(camptothecin),
- 토포테칸(topotecan) 및/또는
- 이리노테칸(irinotecan) 및/또는
- 국소이성질화효소-II-저해물질, 특히
- 에토포시드(etoposide),
- 테니포시드(teniposide).
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 항-대사물질은 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
- 엽산 길항물질(folic acid antagonist), 특히
- 메토트렉세이트(methotrexate),
- 피리미딘 유사체(pyrimidine analogue), 특히
- 5-플루오르우라실(fluorouracil)
- 카페시타빈(capecitabin),
- 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside)(시타라빈(cytarabin)) 및/또는
- 젬시타빈(gemcitabin),
- 퓨린 유사체(purine analogue), 특히
- 6-티오구아닌(thiogunaine),
- 펜토스타틴(pentostatine),
- 아자티오프린(azathioprine),
- 6-메르캅토퓨린(mercaptopurine),
- 플루다라빈(fludarabin) 및/또는
- 클라드리빈(cladribine).
청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 따른 분자 및/또는 청구항 4 내지 12중 어느 한 항에 따른 조성물, 그리고 가능하면, 키트의 내용물을 결합시키는 방법에 관한 정보를 포함하는 키트.
약제(medicament)로서 이용되는, 청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 따른 분자, 또는 청구항 4 내지 12중 어느 한 항에 따른 조성물.
가능하면, 제약학적으로 허용되는 담체와 함께, 청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 따른 분자 및/또는 청구항 4 내지 12중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 제제(pharmaceutical).
전술한 항에 있어서, 담체는 항체, 알킬화제, 백금 유사체, 중격제, 항생제, 유사분열 억제제, 탁산, 국소이성질화효소 억제제, 항-대사물질 및/또는 L-아스파라기나아제, 히드록시카바마이드, 미토탄 및/또는 아마니틴으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.
인간 또는 동물 면역계의 조절 또는 상기 면역계의 활성의 조절을 위한 치료제(remedy)의 제조에서, 청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 따른 분자, 청구항 4 내지 12중 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 청구항 15 또는 16중 어느 한 항에 따른 제제의 용도.
전술한 항에 있어서, 조절은 면역계의 활성의 촉진 또는 증가인 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항에 있어서, 촉진은 T-세포 매개된 또는 -독립된 면역 반응(immune response)을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항에 있어서, 면역 반응은 B-세포의 증식 및/또는 B-세포 활성화를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 면역계의 촉진은 사이토킨의 분비를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 따른 분자 및/또는 청구항 4 내지 12중 어느 한 항에 따른 조성물은 치료적 또는 예방적 예방접종(vaccination)에서 어쥬번트(adjuvant)로서 이용되는 것을 특징으로 하는 용도.
세포 성장 질환(cell growth disorder)의 치료를 위한 치료제의 제조에서, 청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 따른 분자, 청구항 4 내지 12중 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 청구항 15 또는 16중 어느 한 항에 따른 제제의 용도.
전술한 항에 있어서, 세포 성장 질환은 종양 질환(tumour disease)인 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항에 있어서, 종양 질환은 코 내부(inner nose), 비동(nasal sinus), 비인두(nasopharynx), 입술(lip), 구강(oral cavity), 구강인두(oropharynx), 후두(larynx), 하인두(hypopharynx), 귀(ear), 타액선(salivary gland)의 종양, 그리고 부신경절종(paraganglioma)을 비롯한 귀-코-목구멍 부위의 종양; 비-소세포 기관지 암종(non-parvocellular bronchial carcinoma), 소세포 기관지 암종(parvocellular bronchial carcinoma), 종격(mediastinum)의 종양을 비롯한 폐의 종양; 식도(esophagus), 위(stomach), 췌장(pancreas), 간(liver), 담낭(gallbladder) 및 담도(biliary tract)의 종양, 소장(small intestine), 결장(colon)과 직장(rectal) 암종(carcinoma), 그리고 항문 암종(anal carcinoma)을 비롯한 위장관(gastrointestinal tract)의 종양; 신장(kidney), 요관(ureter), 방광(bladder), 전립선(prostate gland), 요도(urethra), 음경(penis)과 고환(testicles)의 종양을 비롯한 비뇨생식기(urogenital) 종양; 자궁경부(cervix), 질(vagina)과 음문(vulva)의 종양, 자궁암(uterine cancer), 악성 융모성 질환(malignant trophoblastic disease), 난소 암종(ovarial carcinoma), 자궁관(uterine tube)(Tuba Faloppii)의 종양, 복강(abdominal cavity)의 종양, 유방 암종(mammary carcinoma)을 비롯한 부인과 종양(gynecological tumor); 갑상선(thyroid), 부갑상선(parathyroid)과 부신 피질(adrenal cortex)의 종양, 내분비 췌장 육종(endocrine pancreas tumor), 카르시노이드 종양(carcinoid tumor)과 카르시노이드 증후군(carcinoid syndrome), 다발성 내분비 신생물(multiple endocrine neoplasia), 골과 연조직(soft-tissue) 육종, 중피종(mesothelioma), 피부 종양(skin tumor), 흑색종(가령, 피부 흑색종(cutaneous melanoma)과 안내 흑색종(intraocular melanoma)), 중추신경계의 종양을 비롯한 내분비 기관(endocrine organ)의 종양; 망막세포종(retinoblastoma), 윌름 종양(Wilms tumor), 신경섬유종증(neurofibromatosis), 신경아세포종(neuroblastoma), 유잉 육종 계통(Ewing sarcoma tumor family), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma)을 비롯한 유아기 종양; 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 피부 T 세포 림프종(cutaneous T cell lymphoma), 중추신경계의 원발성 림프종(primary lymphoma), 호지킨병(Hodgkin disease)을 비롯한 림프종; 급성 백혈병(acute leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia)과 만성 림프성 백혈병(chronic lymphatic leukemia)을 비롯한 백혈병(leukemia); 형질 세포 신생물(plasma cell neoplasm), 골수이형성 증후군(myelodysplasia syndrome), 부종양 증후군(paraneoplastic syndrome), 원인불명 원발성 종양(unknown primary tumor)으로 전이(metastasis)(CUP 증후군), 복막 선암종증(peritoneal carcinomatosis), AIDS-관련된 악성, 예를 들면, 카포시 육종(Kaposi sarcoma), AIDS-연관된 림프종, 중추신경계의 AIDS-연관된 림프종, AIDS-연관된 호지킨병 및 AIDS-연관된 항문 종양, 이식-관련된 악성을 비롯한 면역억제(immunosuppression)-관련된 악성; 뇌 전이(brain metastasis), 폐 전이(lung metastasis), 간 전이(liver metastasis), 골 전이(bone metastasis), 흉막(pleural)과 심낭(pericardial) 전이, 그리고 악성 복수(malignant ascites)를 비롯한 전이된 종양(metastasized tumor)으로 구성된 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 용도.