KR20060033911A - 사이토킨 및/또는 화학치료제 또는 방사선 치료와 연계하여면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물을이용하여 면역계를 공동 상승 자극시키는 방법 - Google Patents

사이토킨 및/또는 화학치료제 또는 방사선 치료와 연계하여면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물을이용하여 면역계를 공동 상승 자극시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자의 암, 자가면역 장애, 천식, 호흡기 알레르기, 음식물 알레르기 및 감염성 질환의 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 질환의 치료를 위해 사용되는 면역자극 화합물에 의해 유발된 면역 반응을 증진시키기 위한 최적화된 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 최적화된 방법은 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 및 이뮤노머 화합물의 치료 효과와 사이토킨 면역치료 및/또는 화학치료제 및/또는 방사선의 치료 효과간의 공동 상승 작용을 제공한다.

Description

사이토킨 및/또는 화학치료제 또는 방사선 치료와 연계하여 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물을 이용하여 면역계를 공동 상승 자극시키는 방법 {SYNERGISTIC STIMULATION OF THE IMMUNE SYSTEM USING IMMUNOSTIMULATORY OLIGONUCLEOTIDES AND/OR IMMUNOMER COMPOUNDS IN CONJUNCTION WITH CYTOKINES AND/OR CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS OR RADIATION THERAPY}
본 발명은 치료제로서 이뮤노머 화합물 및 면역자극 올리고누클레오티드의 용도에 관한 것이다.
관련 문헌의 요약
최근에 여러 연구자들은 면역치료 응용에서 면역자극 치료제로서 올리고누클레오티드의 사용에 대한 유효성을 입증하였다. 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 면역자극을 유도할 수 있다는 관찰은 이들 화합물을 치료학적 도구로서 개발하고자 하는 관심을 유발하였다. 이들 노력은 천연 디누클레오티드 CpG를 포함하는 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 집중되었다. 문헌[참조: Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992)]은 CpG 디누클레오티드를 포함하는 팔린드롬을 함유하는 포스포디에스테르 올리고누클레오티드가 인터페론-알파 및 감마 합성을 유도할 수 있고 천연 킬러 활성을 증진시킴을 교시하고 있다. 크리그 등(Krieg et al.,)[문헌참조: Nature 371:546- 549(1995)]은 포스포로티오에이트 CpG-함유 올리고누클레오티드가 면역자극성임을 보고하였다. 리앙 등(Liang et al.,)[문헌참조: J. Clin. Invest. 98:1119-1129(1996)]은 당해 올리고누클레오티드가 사람 B 세포를 활성화시킴을 보고하였다. 몰도베아누 등(Moldoveanu et al.,)[문헌참조: Vaccine 16:1216-124(1998)]은 CpG-함유 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 증진시킴을 교시하고 있다. 맥클루스키(McCluskie) 및 데이비스(Davis)등[문헌참조: J. Immunol. 161:4463-4466(1998)]은 CpG-함유 올리고누클레오티드가 강력한 면역보조제로서 작용하여 B형 간염 바이러스 표면 항원에 대한 면역반응을 증진시킴을 교시하고 있다.
CpG-함유 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드를 추가로 변형시킴으로써 또한 면역반응의 조절제로서 작용하는 이의 능력에 영향을 줄 수 있다[문헌참조: Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51: 173-182; Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52: 1537-1544; Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7: 495- 502; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9: 3453-3458; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10: 1051-1054; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10: 2585-2588; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11: 2263-2267; and Kandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001) 9: 807-813]. 미국 특허 제6,426,334호는 항암제로서의 이들 화합물의 가망성을 보여준다.
면역반응이 조절될 수 있는 또 다른 수단은 사이토킨의 치료학적 용도에 의 한 것이다. 사이토킨은 면역계의 세포가 기타 세포간의 반응을 조절하기 위해 생산하는 가용성 분자이다. 따라서, 사이토킨은 체액성 및 세포성 면역의 조절제이다. T 세포가 어떻게 면역 반응을 매개하는지에 관한 이해는 당해 반응을 조절하기 위해 중요하다. CD4+ T 헬퍼(Th) 세포는 Th1 또는 Th2 경로를 따라 분화한다. Th1 경로는 세포 매개 면역을 생성시키는데 중요하고 예를 들어, γ-인터페론 및 인터류킨-2(IL-2)의 생산을 특징으로 한다. Th2 반응은 체액성 면역을 생성시키는데 중요하고 예를 들어, IL-4 및 IL-5의 생산을 특징으로 한다. Th1 반응은 감염, 예를 들어, 바이러스 감염에 대한 면역계 방어 및 신생물 세포의 제거를 위한 신체의 면역계 감시를 위해 중요한 것으로 공지되어 있다.
문헌[참조: Krieg, A., M. et al. (미국 특허 제6,429,199호) 및 Krieg, A., M. et al(미국 특허 제6,218,371호)]은 면역자극 CpG 올리고누클레오티드 및 사이토킨, 특히, GM-CSF의 동시투여를 교시하고 있다. 문헌[참조: Decker et al.(Experimental Hematology 28:558-565(2000)]은 IL-2와 CpG 올리고누클레오티드의 동시 투여가 B 만성 림프구(B-CLL) 세포에서 TNF-α 및 IL-6의 생산을 증가시키지만 정상 B-세포에서는 그렇지 않음을 입증하였다.
이들 보고는, 질환의 치료를 위해 면역자극 올리고누클레오티드의 치료학적 효과를 추가로 최적화하여 면역자극 올리고누클레오티드의 항암 활성을 증진시킬 필요가 있음을 명백하게 한다.
발명의 요약
본 발명은 환자의 암, 자가면역질환, 천식, 호흡기 알레르기, 음식물 알레르 기 및 감염성 질환의 치료에 국한되지 않으면서 이들 질환의 치료에 사용되는 면역자극 화합물에 의해 유발되는 면역반응을 증진시키기 위한 최적화된 방법, 조성물 및 치료 섭생을 제공한다. 본 발명에 따른 최적화 방법은 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드의 치료 효과와 사이토킨 면역치료 및/또는 화학치료제의 치료 효과간에 공동 상승 작용을 제공한다. 최적으로 5'말단을 제공하는 면역자극 올리고누클레오티드의 변형은 이의 항암 활성을 급격하게 증진시킨다. 당해 올리고누클레오티드는 본원에서 하나 이상의 면역자극 올리고누클레오티드를 포함할 수 있는 이뮤노머로서 언급된다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 화학치료제와 배합된 이뮤노머 화합물을 암 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이때, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물 및 화학치료제가 공동 상승 작용 치료 효과를 생성시키는, 암 환자에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 환자에서 면역 반응을 공동 상승 작용적으로 자극시키는 방법을 제공한다. 당해 방법은 본 발명에 따른 치료학적 공동 상승 작용을 하는 유효량의 하나 이상의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드 및 치료학적 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2(및/또는 동일계에서 IL-2 생산을 유도하는 제제, 예를 들어, DNA 백신 또는 IL-2를 발현하는 발현 벡터)의 배합물을 환자에게 투여함을 포함하고, 당해 배합물의 투여는 환자에서 사이토킨의 생산을 공동 상승 작용적으로 자극한다. 본 발명에 따라 공동 상승 작용적으로 자극되는 바람직한 사이토킨은 IL-12 및 인터페론-γ (IFN-γ), IFN-α, IFN-ß 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 "이뮤노머"는 올리고누클레오티드의 3' 말단에 직접 연결되거나 누클레오시드 연결을 통해 직접 연결되거나 작용화된 누클레오염기 또는 당에서 직접 연결되거나 비-누클레오티드 링커를 통해 함께 간접적으로 연결된, 2개 이상의 올리고누클레오티드를 포함하는 임의의 화합물을 의미하고, 여기서, 이뮤노머 화합물에 대해서 하나 이상의 올리고누클레오티드는 근접가능한 5'말단을 갖는 면역자극 올리고누클레오티드이다. 본 발명에 대해서, 면역자극 올리고누클레오티드는 하나 이상의 면역자극 CpG 디누클레오티드, 면역자극 도메인 또는 기타 면역자극 잔기를 포함하는 올리고누클레오티드이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "근접가능한 5' 말단"은 올리고누클레오티드의 5' 말단이 충분히 가용하여 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드를 인지하고 결합하여 면역계를 자극하는 인자들이 5' 말단에 근접함을 의미한다. 당해 면역자극 올리고누클레오티드는 2차 구조를 포함할 수 있고, 단 5'말단은 근접 가능하게 유지되어 있어야 한다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물은 CpG, C*pG, CpG* 및 C*pG*[여기서, C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C*는 2'-데옥시티미딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 기타 비천연 피리미딘 누클레오시드 또는 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린이고, G 는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G*는 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신 또는 기타 비천연 푸린 누클레오시드이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 누클레오시드 상호 연결체이다]로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역자극 디누클레오티드를 포함한다. 특정 바람직한 양태에서, 면역자극 디누클레오티드는 CpG가 아니다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물은 화학식 III의 면역자극 도메인을 포함한다:
5'-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3' Ⅲ
상기식에서,
Y는 시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시시티딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 기타 비천연 피리미딘 누클레오시드 또는 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린이고,
Z는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신, 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신 또는 기타 비천연 푸린 누클레오 시드이고,
각각의 위치에서 N1은 바람직하게 비염기성 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보누클레오시드, β-L-데옥시리보누클레오시드 및 포스포디에스테르 또는 변형된 누클레오시드 상호 연결체(이것은 길이가 약 2옴스트롱 내지 약 200옴스트롱인 링커, C2 내지 C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판에디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 누클레오시드 상호 연결체 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 메틸포스포네이트 누클레오시드 상호 연결체로부터 비제한적으로 선택된다)이에 의해 3' 말단상의 인접 누클레오시드로 연결된 누클레오시드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바람직하게 천연적으로 존재하거나 합성된 누클레오시드 또는 면역자극 잔기이고,
각각의 위치에서 Nn은 독립적으로 바람직하게 비염기성 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보누클레오시드, 2'-O-치환된 리보누클레오시드 및 변형된 누클레오시드 상호 연결체(이것은 아미노 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 누클레오시드 연결체 및 메틸포스포네이트 누클레오시드 상호 연결체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)에 의해 3'말단상에 인접한 누클레오시드로 연결된 누클레오시드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 천연적으로 존재하는 누클레오시드 또는 면역자극 잔기이고,
단, 하나 이상의 N1 또는 Nn은 면역자극 잔기이고,
n은 0 내지 30의 수이고,
3' 누클레오시드는 임의로, 면역자극성일 수 있거나 아닐 수 있는 또 다른 올리고누클레오티드로 직접 연결되거나 비-누클레오티드 링커를 통해 연결된다.
제2 측면에서, 본 발명은 화학치료제와 배합하여, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 상기된 바와 같은 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물을 포함하는 이뮤노머 접합체 및 근접 가능한 5' 말단 이외의 위치에서 면역자극 올리누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물에 접합된 암 항원을 투여함을 포함하는, 암 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 또는 면역자극 올리고누클레오티드 접합체 및/또는 이뮤노머 화합물 또는 이뮤노머 접합체, 화학치료제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 암 세포를 이온화 방사선에 감작시키는 방법을 제공한다. 당해 본 발명의 측면에 따른 방법은 포유동물에게 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 또는 이뮤노머 화합물을 투여하는 단계 및 동물을 이온화 방사선으로 치료하는 단계를 포함한다.
제5 측면에서, 본 발명은 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 하나 이상의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드를 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2(및 임의로 항원)와 배합하여 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 면역 반응을 공동 상승 작용적으로 자극시키는 방법을 제공하고 여기서, 당해 배합물의 투여는 환자에서 사이토킨의 생산을 공동 상승 작용적 으로 자극한다. 본 발명에 따라 공동 상승 작용적으로 자극되는 바람직한 사이토킨은 IL-12 및 인터페론-γ, IFN-α, IFN-β 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 발명의 제 2 측면의 특정 양태에서, 항원은 근접 가능한 5' 위치 이외의 이위치에서 이뮤노머 화합물과 작동적으로 연합되어 있다.
본 발명의 제6 측면에서, 이뮤노머 화합물이 아닌 하나 이상의 면역자극 올리고누클레오티드는 치료학적 유효량의 IL-2와 배합하여 사용하고 환자에서 사이토킨의 생산을 공동 상승 작용적으로 자극한다. 본 발명에 따라 공동 상승 작용적으로 자극되는 바람직한 사이토킨은 IL-12 및 IFN-γ, IFN-α, IFN-β 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명에 따라, 이뮤노머 화합물이 아닌 바람직한 면역자극 올리고누클레오티드는 하나 이상의 면역자극 CpG(여기서, C는 사이토신 또는 데옥시사이토신이 아니고/아니거나 G는 구아노신 또는 2-데옥시구아노신이 아니다) 디누클레오티드를 함유하는 것들을 포함한다. 이뮤노머 화합물이 아닌 본 발명의 또 다른 바람직한 면역자극 올리고누클레오티드는 CpG가 아닌 또 다른 면역자극 잔기를 함유하는 것들이다. 당해 또 다른 면역자극 잔기의 예는 비천연적으로 존재하는 염기 및/또는 당을 포함하는 누클레오시드 및 올리고누클레오티드를 안정화시키는 헤어핀 구조와 같은 올리고누클레오티드 자체의 2차 구조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
제7 측면에서, 본 발명은 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 하나 이상의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드, 치료학적 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2(및/또는 동일계에서 IL-2 생산을 유도하는 제제, 예 를 들어, DNA 백신 또는 IL-2 발현 발현 벡터) 및 임의로 항원을 포함하는 치료학적 조성물을 제공하고 여기서, 당해 배합물의 투여는 환자에서 사이토킨의 생산을 공동 상승 작용적으로 자극한다. 본 발명에 따라 공동 상승 작용적으로 자극된 바람직한 사이토킨은 IL-12 및 IFN-γ, IFN-α, IFN-β 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 모든 측면에 따른 방법 및 조성물은 면역계 조정 및 면역 기반 치료를 포함하는 사람 또는 수의학적 질환에 대한 치료 방법에 유용하다. 특히 바람직한 질환 표적 대상은 암, 감염성 질환, 천식 및 알레르기를 포함한다.
도 1은 본 발명의 대표적인 이뮤노머 화합물에 대한 도식이다.
도 2는 본 발명의 여러 대표적인 이뮤노머 화합물을 도시한다.
도 3은 본 발명의 이뮤노머의 직렬 합성에 적합한 대표적인 소분자 링커 그룹을 도시한다.
도 4는 본 발명의 이뮤노머 화합물의 병렬 합성에 적합한 대표적인 소분자 링커 그룹을 도시한다.
도 5는 본 발명의 이뮤노머 화합물의 직렬 합성을 위한 합성 도식이다. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸이고 CE = 시아노에틸이다.
도 6은 본 발명의 이뮤노머 화합물의 병렬 합성을 위한 합성 도식이다. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸이고 CE = 시아노에틸이다.
도 7A는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 올리고누클레오티드(Oligo) 1번 및 이뮤노머 2번-3번에 의한 IL-12의 유도를 나타내는 그래프이다. 이들 데이타는 근접 가능한 5' 말단을 갖지 않는 이뮤노머 2번이 단량체성 올리고 1번 보다 강한 IL-12의 유도제이고 근접 가능한 5'말단을 갖지 않는 이뮤노머 3번은 올리고 1번과 비교하여 동등하거나 보다 약한 면역 자극 생산 능력을 갖는다는 것을 시사한다.
도 7B는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 올리고 1번 및 이뮤노머 2번-3번에 의한 IL-6의 유도를 나타내는 그래프(각각 상부 대 바닥)이다. 이들 데이타는 근접 가능한 5' 말단을 갖는 이뮤노머 2번이 단량체성 올리고 1번 보다 강한 IL-6의 유도제이고 근접 가능한 5'말단을 갖지 않는 이뮤노머 3번은 올리고 1번과 비교하여 동등하거나 보다 약한 면역 자극 생산 능력을 갖는다는 것을 제안한다.
도 7C는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 올리고 1번 및 이뮤노머 2번-3번에 의한 IL-10의 유도를 나타내는 그래프(각각 상부 대 바닥)이다.
도 8A는 각각 근접 불가능하고 근접 가능한 5' 말단을 갖는 이뮤노머 5번 및 6번의 상이한 농도에서 세포 배양에서 BALB/c 마우스 비장 세포 증식의 유도를 나타내는 그래프이다.
도 8B는 CpG 모티프의 5' 플랭킹 서열에서 면역원성 화학적 변형을 갖는 올리고 4 및 이뮤노머 5번 내지 6번에 의한 BALB/c 마우스 비장의 비대를 나타내는 그래프이다. 다시, 근접가능한 5' 말단을 갖는 이뮤노머 화합물(6)은 근접가능한 5'말단을 갖지 않는 이뮤노머 5 및 단량체성 올리고 4와 비교하여 비장 비대를 보다 크게 증가시키는 능력을 갖는다.
도 9A는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 올리고 4 및 이뮤노머 7 및 8의 상이한 농도에 의한 IL-12의 유도를 나타내는 그래프이다.
도 9B는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 올리고 4 및 이뮤노머 7 및 8의 상이한 농도에 의한 IL-6의 유도를 나타내는 그래프이다.
도 9C는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 올리고 4 및 이뮤노머 7 및 8의 상이한 농도에 의한 IL-10의 유도를 나타내는 그래프이다.
도 10A는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 이뮤노머 14, 15 및 16에 의한 세포 증식 유도를 나타내는 그래프이다.
도 10B는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 이뮤노머 14 및 16의 상이한 농도에 의한 IL-12의 세포 증식 유도를 나타내는 그래프이다.
도 10C는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 이뮤노머 14 및 16의 상이한 농도에 의한 IL-6의 세포 증식 유도를 나타내는 그래프이다.
도 11A는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 올리고 4 및 17 및 이뮤노머 19 및 20에 의한 세포 증식 유도를 나타내는 그래프이다.
도 11B는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 올리고 4 및 17 및 이뮤노머 19 및 20의 상이한 농도에 의한 세포 증식 IL-12의 유도를 나타내는 그래프이다.
도11C는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 올리고 4 및 17 및 이뮤노머 19 및 20의 상이한 농도에 의한 세포 증식 IL-6의 유도를 나타내는 그래프이다.
도 12는 올리고 4 및 이뮤노머 14, 23 및 24를 사용한 BALB/c 마우스 비장 비대를 나타내는 그래프이다.
도 13은 전립선 암에 대한 누드 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 본 발명 에 따른 방법의 효과를 나타낸다.
도 14는 본 연구에 사용되는 마우스의 체중에 대한 본 발명에 따른 방법의 효과를 나타낸다.
도 15A는 BALB/c 비장세포가 올리고 1 및 IL-2로 처리된 후 IL-12 생산에 대한 공동 상승 작용 효과를 입증하는 그래프이다.
도 15B는 BALB/c 비장세포가 올리고 2 및 IL-2로 처리된 후 IL-12 생산에 대한 공동 상승 작용 효과를 입증하는 그래프이다.
도 15C는 BALB/c 비장세포가 올리고 3 및 IL-2로 처리된 후 IL-12 생산에 대한 공동 상승 작용 효과를 입증하는 그래프이다.
도 15D는 BALB/c 비장세포가 올리고 4 및 IL-2로 처리된 후 IL-12 생산에 대한 공동 상승 작용 효과를 입증하는 그래프이다.
도 16A는 BALB/c 비장세포가 올리고 1 및 IL-2로 처리된 후 IL-6 생산에 대한 효과를 입증하는 그래프이다.
도 16B는 BALB/c 비장세포가 올리고 2 및 IL-2로 처리된 후 IL-6 생산에 대한 효과를 입증하는 그래프이다.
도 16C는 BALB/c 비장세포가 올리고 3 및 IL-2로 처리된 후 IL-6 생산에 대한 효과를 입증하는 그래프이다.
도 16D는 BALB/c 비장세포가 올리고 4 및 IL-2로 처리된 후 IL-6 생산에 대한 효과를 입증하는 그래프이다.
도 17은 BALB/c 비장세포가 올리고 5 및 IL-2로 처리된 후 IL-12 생산에 대 한 공동 상승 작용 효과를 입증하는 그래프이다.
도 18A는 BALB/c 비장세포가 올리고 1 및 IL-2로 처리된 후 IFN-γ 생산에 대한 효과를 입증하는 그래프이다.
도 18B는 BALB/c 비장세포가 올리고 2 및 IL-2로 처리된 후 IFN-γ 생산에 대한 효과를 입증하는 그래프이다.
도 18C는 BALB/c 비장세포가 올리고 3 및 IL-2로 처리된 후 IFN-γ 생산에 대한 효과를 입증하는 그래프이다.
도 18D는 BALB/c 비장세포가 올리고 4 및 IL-2로 처리된 후 IFN-γ 생산에 대한 효과를 입증하는 그래프이다.
도 19는 BALB/c 비장세포가 올리고 5 및 IL-2로 처리된 후 IFN-γ 생산에 대한 효과를 입증하는 그래프이다.
본 발명은 면역 기반 치료에 사용되는 면역자극 화합물에 의해 유발되는 면역 반응을 증진시키기 위해 최적화된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 최적화된 방법은 면역자극 올리고누클레오티드 및 이뮤노머 화합물과 같은 면역자극 화합물의 치료 효과와 사이토킨 면역치료 및/또는 화학치료제의 치료 효과간의 공동 상승 작용을 유도한다. 본원에 인용된 허여된 특허, 특허원 및 참조문헌은 이의 각각이 구체적으로 및 개별적으로 참조로서 인용되는 것 처럼 동일한 정도로 참조로서 인용된다. 본원에 인용된 참조문헌과 본 명세서에 교시된 내용간에 모순이 있는 경우 후자의 교시가 발명의 목적을 위해 우선한다.
본 발명은 암 치료를 위해 면역치료 응용에 사용되는 면역자극 화합물에 의해 유발되는 항암 효과를 증진시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법에서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물은 화학치료제와 배합되어 사용되는 경우 공동 상승 작용 치료 효과를 제공한다. 당해 결과는 면역자극 올리고누클레오티드 및 이뮤노머 화합물이 면역계 세포의 세포 분열을 유발한다는 사실의 관점에서 놀라운데 그 이유는 화학치료제는 정상적으로 활발하게 분열하는 세포를 사멸시키기 때문이다.
제1 측면에서, 본 발명은 화학치료제와 배합된 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 2개 이상의 올리고누클레오티드가 함께 연결되어 이뮤노머 화합물이 하나 이상의 근접가능한 5' 말단을 갖도록 하는 이뮤노머 화합물을 투여함을 포함하는 암 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고 여기서, 하나 이상의 올리고누클레오티드는 면역자극 올리고누클레오티드이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "근접가능한 5' 말단"은 올리고누클레오티드의 5' 말단이 충분히 가용하여 이뮤노머 화합물을 인지하고 결합하며 면역계를 자극하는 인자가 근접하도록 함을 의미한다. 임의로, 5' OH는 포스페이트, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 잔기, 방향족 또는 지방족 링커, 콜레스테롤 또는 근접성을 방해하지 않는 또 다른 실체에 연결될 수 있다. 면역자극 올리고누클레오티드 및 이뮤노머 화합물은 척추동물에게 투여되는 경우 면역반응을 유도한다. 화학치료제와 배합되어 사용되는 경우, 공동 상승 작용 치료 효과가 수득된다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 바람직한 화학치료제는 제한없이, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 아드리아마이신, 시스플라틴, 무가당 클로로에틸니트로우레아, 5-플루오로우라실, 마이토마이신 C, 블레오마이신, 독소루비신, 다카바진, 탁솔, 프라길린, 멜라민 GLA, 발루비신, 카무스타인 및 폴리페르포산, MMI270, BAY 12-9566, RAS 파메실 트랜스퍼라제 억제제, 파메실 트랜스퍼라제 억제제, MMP, MTA/LY231514, LY264618/로메텍솔, 글라몰렉, CI-994, TNP-470, 하이캄틴/토포테칸, PKC412, 발스포다르/PSC833, 노반트론/미트록산트론, 메타레트/수라민, 바티마스타트, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/마르미스타트, BB2516/마르미스타트, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, 레모날 DP 2202, FK 317, 피시바니/OK432, AD 32/발루비신, 메타스트론/스트론튬 유도체, 테모다브/테모졸로미드, 에바세트/리포좀 독소루비신, 예우탁산/플라클리탁셀, 탁솔/파클리탁셀, 셀로아드/카페시타빈, 푸르툴론/독시플루리딘, 사이클로팍스/경구용 파클리탁셀, 경구용 탁소이드, SPU-077/시스플라틴, HMR 1275/플라보피리돌, CP-358 (774) /EGFR, CP-609 (754) /RAS 발암유전자 억제제, BMS-182751/경구용 백금, UFT (테가푸르/우라실), 에르가미소울/레바미솔, 에닐우라실/776C85/5FU 증진제, 캄프토/레바미솔, 캄프토사르/이리노테칸, 투모덱스/랄리트렉세드, 류스타틴/클라드리빈, 팍세스/파클리탁셀, 독실/리포좀 독소루비신, 카엘릭스/리포좀 독소루비신, 플루다라/플루다라빈, 파마루비신/에피루비신, 데포시트, ZD1839, LU 79553/비스-나프탈리미드, LU 103793/돌라스타틴, 카에틱스/리포좀 독소루비신, 겜자르/젬시타빈, ZD 0473/아노르메드, YM 116, 요딘 종자, CDK4 및 CDK2 억제제, PARP 억제제, D4809/덱시포사미드, 이페스/메스넥스/이포사미드, 부몬/테니포시드, 파라플라틴/카보플라틴, 플란티놀/시스플라틴, 베페시드/에토포사이드, ZD 9331, 탁소테레/독세탁셀, 구아닌 아라비노사이드의 프로드럭, 탁산 유사체, 니트로소우레아, 알킬화제, 예를 들어, 멜펠란 및 사이클로포스파미드, 아미노글루테티미데, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 클로로움부실, 시타라빈 HCl, 다크티노마이신, 다우노루비신 HCl, 에스트라무스틴 인산나트륨, 에토포사이드 (VP16-213), 플록수리딘, 플루오로우라실 (5-FU), 플루타미드, 하이드록시우레아 (하이드록시카바미드), 이포스파미드, 인터페론 알파-2a, 알파-2b, 류프롤리드 아세테이트 (LHRH-방출 인자 유사체), 로무스틴 (CCNU), 메클로레타민 HCl(질소 무스타드), 머캅토푸린, 메스나, 미토탄 (o. p'-DDD), 미톡산트론 HCl, 옥트레오타이드, 플리카마이신, 프로카바진 HCl, 스트렙토조신, 타목시펜 시트레이트, 티오구아닌, 티오테파, 빈블라스틴 설페이트, 암사크린 (m-AMSA), 아자시티딘, 에르트로포이에틴, 헥사메틸멜라민 (HMM), 인터류킨 2, 미토구아존 (메틸-GAG; 메틸 글리옥살 비스-구아닐하이드라존; MGBG), 펜토스타틴(2'데옥시코포르마이신), 세무스틴 (메틸-CCNU), 테니포사이드 (VM-26) 및 빈데신 설페이트를 포함한다.
본 발명의 당해 측면에 따른 방법에서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물의 투여는 제한 없이 비경구, 경구, 설하, 경피, 국소, 비강내, 에어로졸, 안내, 기관지내, 질내, 유전자 총, 피부 패치 또는 국소 크림 또는 안구 적가 또는 치약 형태를 포함하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물의 치료학적 조성물의 투여는 공지된 과정을 사용하여 질환의 증상을 감소시키거나 마커를 지명하는데 효과적인 투여량 및 시간동안 수행될 수 있다. 전신 투여되는 경우, 치료학적 조성물은 바람직하게 약 0.0001 마이크로몰 내지 약 10마이크로몰 사이의 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물의 혈액 수준을 달성하기에 충분한 투여량으로 투여된다. 국소 투여를 위해서는 이 보다 훨씬 낮은 농도가 효과적일 수 있고 보다 높은 농도가 허용될 수 있다. 바람직하게, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물의 총 투여량은 하루 환자당 약 0.0001mg 내지 하루 체중 kg당 약 200mg의 범위이다. 개체에 1회 치료 에피소드로서 치료학적 유효량의 하나 이상의 치료학적 조성물을 동시에 또는 연속적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
발명의 당해 측면의 목적을 위해, "와 배합된"이란 용어는 동일한 환자에서 동일한 질환을 치료하는 과정에 있음을 의미하고 동시 투여 및 수일간의 간격으로 일시적으로 격리된 순서를 포함하는, 임의의 순서로 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물 및/또는 화학치료제를 투여함을 포함한다. 당해 배합 치료는 또한 1회 이상으로 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물 및/또는 독립적으로 화학치료제를 투여함을 포함할 수 있다. 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물 및/또는 화학치료제의 투여는 동일하거나 상이한 경로일 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 이뮤노머 화합물은 동일하거나 상이할 수 있는 2개 이상의 면역자극 올리고누클레오티드(이뮤노머에 대하여)를 포함한다. 바람직하게, 각각의 당해 면역자극 올리고누클레오티드는 하나 이상의 근접 가능한 5'말단을 갖고 있다.
본 발명에 따른 방법의 특정 양태에서, 면역자극 올리고누클레오티드 뿐만아니라 이뮤노머 화합물은 또한 유전자에 상보적인 하나 이상의 올리고누클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적인"이란 올리고누클레오티드가 생리학적 조건하에 유전자 영역으로 하이브리드화함을 의미한다. 몇몇 양태에서, 올리고누클레오티드는 유전자의 발현을 하향조절한다. 당해 하향조절 올리고누클레오티드는 바람직하게 안티센스 올리고누클레오티드, 리보자임 올리고누클레오티드, 소형 억제 RNA 및 데코이 올리고누클레오티드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 하향조절"은 유전자의 전사 또는 유전자 생성물의 해독을 억제함을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 이뮤노머 화합물은 하나 이상의 특이적 질환 표적물을 표적화하는데 사용될 수 있고 면역계를 또한 자극한다.
특정 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물은 리보자임 또는 데코이 올리고누클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리보자임"은 촉매 활성을 갖는 올리고누클레오티드를 의미한다. 바람직하게, 리보자임은 특정 핵산 표적물에 결합하여 표적물을 절단한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "데코이 올리고누클레오티드"는 서열 특이적 방식으로 전사 인자와 결합하여 전사 활성을 억제하는 올리고누클레오티드를 의미한다. 바람직하게, 리보자임 또는 데코이 올리고누클레오티드는 제한 없이, 스템-루프 또는 헤어핀 구조를 포함하는 2차 구조를 나타낸다. 특정 양태에서, 하나 이상의 올리고누클레오티드는 폴리(I)-폴리(dC)를 포함한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 Nn 세트는 일련의 3 내지 10dGs 및/또는 Gs 또는 2'-치환된 리보 또는 아라비노 Gs를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "올리고누클레오티드"는 다수의 연결된 누클레오시드 유니트로부터 형성된 폴리누클레오시드를 의미한다. 당해 올리고누클레오티드는 게놈 또는 cDNA를 포함하는 기존의 핵산 공급원으로부터 수득될 수 있지만 바람직하게 합성 방법에 의해 제조된다. 바람직한 양태에서, 각각의 누클레오시드 유니트는 헤테로사이클릭 염기 및 펜토푸라노실, 트레할로스, 아라비노스, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노스, 2'-O-치환된 아라비노스 또는 헥소스 당 그룹을 포함한다. 누클레오시드 잔기는 임의의 다수의 공지된 누클레오시드 상호 연결체에 의해 서로 커플링될 수 있다. 당해 누클레오시드 상호 연결체는 제한없이, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카보네이트, 카보알콕시, 아세트아미데이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 브릿지된 포스포라미데이트, 브릿지된 메틸렌 포스포네이트, 브릿지된 포스포로티오에이트 및 설폰 누클레오시드 연결체를 포함한다. 용어 "올리고누클레오티드"는 또한 하나 이상의 입체특이적 누클레오시드 상호 연결체(예를 들어, (RP)-또는 (SP)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 연결체)를 갖는 폴리누클레오시드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고누클레오티드" 및 "디누클레오티드"는 연결체가 포스페이트 그룹을 포함하는지에 상관없이 표현상으로 임의의 당해 누클레오시드 상호 연결체를 갖는 폴리누클레오티드 및 디누클레오시드를 포함한다. 특정 바람직한 양태에서, 이들 누클레오시드 연결체는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트 연결체 또는 이의 조합일 수 있다.
몇몇 양태에서, 이뮤노머 화합물은 누클레오시드 잔기가 약 3 내지 약 35개이고 바람직하게는 약 4 내지 약 30개이고 보다 바람직하게는 약 4 내지 20개인 올리고누클레오티드를 포함한다. 몇몇 양태에서, 올리고누클레오티드는 약 5 또는 6개 내지 18개 또는 약 5개 또는 6개 내지 약 14개의 누클레오시드 잔기를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 정확한 수가 중요하지 않음을 의미한다. 따라서, 올리고누클레오티드중에 누클레오시드 잔기의 수는 중요하지 않고 2개 미만의 누클레오시드 잔기 또는 1개 내지 여러 추가의 누클레오시드 잔기를 갖는 올리고누클레오티드가 본 발명의 목적을 위해 상기된 양태의 각각에 대한 등가물로서 고려된다. 몇몇 양태에서, 하나 이상의 올리고누클레오티드는 11개의 누클레오티드를 갖는다.
용어 "올리고누클레오티드"는 또한 제한없이, 단백질 그룹, 친지성 그룹, 삽입 제제, 디아민, 폴산, 콜레스테롤 및 아다만탄을 포함하는 추가의 치환체를 갖는 폴리누클레오티드를 포함한다. 용어 "올리고누클레오티드"는 또한 제한없이, 펩타이드 핵산(PNA), 포스페이트 그룹(PHONA)을 갖는 펩타이드 핵산, 고정된 핵산(LNA), 모르폴리노-골격 올리고누클레오티드 및 알킬 링커 또는 아미노 링커와 함께 골격 섹션을 갖는 올리고누클레오티드를 포함하는, 임의의 다른 핵산 염기 중합체를 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물은 천연에 존재하는 누클레오시드, 변형된 누클레오시드 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 누클레오시드"는 변형된 헤테로사이클릭 염기, 변형된 당 잔기 또는 이의 배합물을 포함하는 누클레오시드이다. 몇몇 양태에서, 변형된 누클레오시드는 본원에 기재된 바와 같이 비천연 피리미딘 또는 푸린 누클레오시드이다. 몇몇 양태에서, 변형된 누클레오시드는 2'치환된 리보누클레오시드, 아라비노누클레오시드 또는 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노사이드이다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "2-치환된 리보누클레오시드"은 펜토스 잔기 2 위치에서의 하이드록실 그룹이 치환되어 2'-O-치환된 리보누클레오시드가 되는 리보누클레오시드를 포함한다. 바람직하게, 당해 치환은 1 내지 6개의 포화되거나 불포화된 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬 그룹 또는 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 아릴 그룹에 의한 것이고, 여기서, 당해 알킬 또는 아릴 그룹은 비치환되거나 예를 들어, 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카복실, 카보알콕시, 또는 아미노 그룹으로 치환될 수 있다. 당해 2'-O-치환된 리보누클레오시드의 예는 제한 없이, 2'-O-메틸리보누클레오시드 및 2'-O-메틸리보누클레오시드 및 2'-O-메톡시에틸리보누클레오시드를 포함한다.
용어 "2-치환된 리보누클레오시드"는 또한 2'-하이드록실 그룹이 1 내지 6개 포화되거나 불포화된 탄소원자를 함유하는 저급 알킬 그룹으로 대체되거나 아미노 또는 할로 그룹으로 대체된 리보누클레오시드를 포함한다. 당해 2'-치환된 리보누클레오시드의 예는 제한 없이, 2'-아미노, 2'-플루오로, 2'-알릴 및 2'-프로파르길 리보누클레오시드를 포함한다.
용어 "올리고누클레오티드"는 하이브리드 및 키메릭 올리고누클레오티드드를 포함한다. "키메릭 올리고누클레오티드"는 하나 이상의 유형의 누클레오시드 상호 연결체를 갖는 올리고누클레오티드이다. 당해 키메릭 올리고누클레오티드의 하나의 바람직한 예는 포스포로티오에이트, 포스포디에스테르 또는 포스포로디티오에이트 영역, 및 알킬포스포네이트 또는 알킬포스포노티오에이트 연결체와 같은 비이온성 연결체를 포함하는 키메릭 올리고누클레오티드이다[문헌참조: Pederson et al. 미국 특허 번호 제5,635,377호 및 제5,366,878호].
"하이브리드 올리고누클레오티드"는 하나 이상의 유형의 누클레오시드를 갖는 올리고누클레오티드이다. 당해 하이브리드 올리고누클레오티드의 하나의 바람직한 예는 리보누클레오티드 또는 2'치환된 리보누클레오티드 영역 및 데옥시리보누클레오티드 영역을 포함한다[문헌참조: Metelev and Agrawal, 미국 특허 제5,652,355호, 제6,346,614호 및 제6,143,881호].
본 발명의 목적을 위해, 용어 "면역자극 올리고누클레오티드"는 물고기, 새 또는 포유동물과 같은 척추동물에 투여되는 경우, 면역반응을 유도하는 상기된 바와 같은 올리고누클레오티드를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포유동물"은 제한 없이, 랫트, 마우스, 고양이, 개, 말, 소, 암소, 돼지, 토끼, 사람외 영장류 및 사람을 포함한다. 유용한 면역자극 올리고누클레오티드는 문헌[참조: Agrawal et al., WO 98/49288(1998년 11월 5일자로 공개됨); WO 01/12804(2001년 2월 22일자로 공개됨); WO 01/55370(2001년 8월 2일자로 공개됨); 2001년 4월 30일자로 출원된 PCT/US01/13682 및 2001년 9월 26일자로 출원된 PCT/US01/30137]에 기재되어 있다. 바람직하게, 면역자극 올리고누클레오티드는 하나 이상의 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 또는 포스포르디티오에이트 누클레오시드 상호 연결체를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 환자에서 면역 반응을 공동 상승 작용적으로 자극하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 본 발명에 따른 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 하나 이상의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드 및 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2(및/또는 동일계에서 IL-2 생산을 유도하는 제제, 예를 들어, DNA 백신 또는 IL-2 발현 발현 벡터)의 배합물을 환자에게 투여함을 포함하고 여기서, 당해 배합물의 투여는 환자에서 사이토킨의 생산을 공동 상승 작용적으로 자극한다. 바람직하게, 본 발명에 따라 공동 상승 작용적으로 자극되는 사이토킨은 IL-12 및 인터페론-γ(IFN-γ), IFN-α, IFN-β 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
용어 "공동 상승 작용을 하는 유효량"은, 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드 및 IL-2의 배합 자극 효과가 부가적 이상이도록, 즉, 배합 자극 효과가 각각의 자극 효과의 합을 기준으로 계산된 예상되는 총 자극 효과를 초과하도록 유효 기간동안 투여되는 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드의 공지된 농도 및 IL-2의 공지된 농도를 지칭하는데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사이토킨"은 면역계의 세포가 기타 세포간의 반응을 제어하기 위해 생산하는 임의의 많은 가용성 분자를 의미한다. 용어 "사이토킨"은 예를 들어, 인터류킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12등), 인터페론(예를 들어, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마), 케목킨, 조혈 성장 인자(예를 들어, 에리트로포이에틴), 종양 괴사 인자, 콜로니 자극 인자(예를 들어, G-CSF, M-CSF, GM-CSF) 및 형질전환 성장 인자(TGF-알파)를 포함한다.
본 발명에 따라, "이뮤노머"는 3'말단에서 직접 연결되거나 누클레오시드 상호 연결체를 통해 직접 또는 작용화된 핵산염기 또는 당에서 직접 연결되거나 비-누클레오티드 링커를 통해 함께 간접적으로 연결된 2개 이상의 올리고누클레오티드를 포함하는 임의의 화합물을 의미하고, 여기서, 이뮤노머 화합물에 대한 하나 이상의 올리고누클레오티드는 근접가능한 5'말단을 갖는 면역자극 올리고누클레오티드이다. 본 발명에 관하여, 면역조절 올리고누클레오티드는 하나 이상의 면역자극 "CpG" 디클레오타이드, 면역자극 도메인 또는 기타 면역자극 잔기를 포함하는 올리고누클레오티드이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "근접가능한 5' 말단"은 올리고누클레오티드의 5' 말단이 충분히 가용하여 이뮤노머 화합물 및 면역자극 올리고누클레오티드를 인지하고 결합하여 면역계를 자극하는 인자가 5' 말단에 근접할 수 있음을 의미한다.
몇몇 양태에서, 이뮤노머 화합물의 하나 이상의 면역자극 올리고누클레오티드는 화학식 5'-Pyr-Pur-3'의 면역자극 디누클레오티드를 포함하고 여기서, Pyr은 천연 또는 합성 피리미딘 누클레오시드이고 Pur은 천연 또는 합성 푸린 누클레오시드이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "피리미딘 누클레오시드"는 누클레오시드의 염기 성분이 피리미딘 염기인 누클레오시드를 의미한다. 유사하게 용어 "푸린 누클레오시드"는 누클레오시드의 염기 성분이 푸린 염기인 누클레오시드를 의미한다. 발명의 목적을 위해, "합성" 피리미딘 또는 푸린 누클레오시드는 천연적으로 존재하지 않는 피리미딘 또는 푸린 염기, 천연적으로 존재하지 않는 당 잔기 또는 이의 배합물을 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물에서 바람직한 피리미딘 누클레오시드는 화학식 (I)의 구조를 갖는다.
Figure 112006002609489-PCT00001
(I)
상기식에서,
D는 수소 결합 공여체이고,
D'는 수소, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체, 친수성 그룹, 소수성 그룹, 전자 유인 그룹 및 전자 공여 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 그룹이고,
A'는 수소 결합 수용체, 친수성 그룹, 소수성 그룹, 전자 유인 그룹 및 전자 공여 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
X는 탄소 또는 질소이고,
S'는 펜토스 또는 헥소스 당 환 또는 천연적으로 존재하지 않는 당이다.
바람직하게, 당 환은 포스페이트 잔기, 변형된 포스페이트 잔기, 또는 피리미딘 누클레오시드를 또 다른 누클레오시드 또는 누클레오시드 유사체에 연결시키기 위해 적합한 또 다른 잔기로 유도체화된다.
바람직한 수소 결합 공여체는 제한 없이, -NH-, -NH2, -SH 및 -OH를 포함한다. 바람직한 수소 결합 수용체는 제한 없이, C=O, C=S, 및 방향족 헤테로사이클의 환 질소 원자, 예를 들어, 사이토신의 N3을 포함한다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 염기 잔기는 천연적으로 존재하지 않는 피리미딘 염기이다. 바람직한 천연적으로 존재하지 않는 피리미딘 염기의 예는 제한 없이, 5-하이드록시사이토신, 5-하이드록시메틸사이토신, N4-알킬사이토신, 바람직하게 N4-에틸사이토신 및 4-티오우라실을 포함한다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 당 잔기 S'는 천연적으로 존재하지 않는 당 잔기이다. 본 발명의 목적을 위해, "천연적으로 존재하는 당 잔기"는 천연적으로 핵산의 일부로서 천연적으로 존재하는 당 잔기, 예를 들어, 리보스 및 2'-데옥시리보스이고 "천연적으로 존재하지 않는 당 잔기"는 핵산의 일부로서 천연적으로 존재하지 않는 임의의 당이지만 올리고누클레오티드에 대한 골격에 사용될 수 있는 임의의 당, 예를 들어, 헥소스이다. 아라비노스 및 아라비노스 유도체는 바람직한 당 잔기의 예이다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물에서 바람직한 면역자극 푸린 누클레오시드 유사체는 화학식 II의 구조를 갖는다.
Figure 112006002609489-PCT00002
(II)
상기식에서,
D는 수소 결합 공여체이고,
D'는 수소, 수소 결합 공여체 및 친수성 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 그룹이고,
X는 탄소 또는 질소이고,
각각의 L은 독립적으로 C, O, N 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
S'는 펜토스 또는 헥소스 당 환 또는 천연적으로 존재하지 않는 당이다.
바람직하게, 당 환은 포스페이트 잔기, 변형된 포스페이트 잔기 또는 피리미딘 누클레오시드를 또 다른 누클레오시드 또는 누클레오시드 유사체에 연결시키는데 적합한 기타 링커 잔기로 유도체화된다.
바람직한 수소 결합 공여체는 제한 없이, -NH-, -NH2, -SH 및 -OH를 포함한다. 바람직한 수소 결합 수용체는 제한 없이, C=O, C=S, -NO2 및 방향족 헤테로사이클의 환 질소 원자, 예를 들어, 구아닌의 N1을 포함한다.
몇몇 양태에서, 화학식 II의 염기 잔기는 천연적으로 존재하지 않는 푸린 염기이다. 바람직한 천연적으로 존재하지 않는 푸린 염기의 예는 제한없이, 6-티오구아닌 및 7-데아자구아닌을 포함한다. 몇몇 양태에서, 화학식 II의 당 잔기 S'는 화학식 I에 대해 상기 기재된 바와 같은 천연적으로 존재하는 당 잔기이다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물에서 면역자극 디누클레오티드는 CpG, C*pG, CpG* 및 C*pG*로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 여기서, C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C*는 2'-데옥시티미딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 기타 비천연 피리미딘 누클레오시드 또는 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G*는 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신 또는 기타 비천연 푸린 누클레오시드이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 누클레오시드 상호 연결체이다. 특정 바람직한 양태에서, 면역자극 디누클레오티드는 CpG가 아니다.
면역자극 올리고누클레오티드는 면역자극 디누클레오티드의 한 측면 또는 양 측면에 대한 면역자극 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 몇몇 양태에서, 면역자극 올리고누클레오티드는 화학식 (III)의 면역자극 도메인을 포함한다.
5'-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3' Ⅲ
상기식에서,
Y는 시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시시티딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 기타 비천연 피리미딘 누클레오시드 또는 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린이고,
Z는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신, 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신 또는 기타 비천연 푸린 누클레오시드이고,
각각의 위치에서 N1은 바람직하게 비염기성 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보누클레오시드, β-L-데옥시리보누클레오시드 및 포스포디에스테르 또는 변형된 누클레오시드 상호 연결체(이것은 길이가 약 2옴스트롱 내지 약 200옴스트롱인 링커, C2 내지 C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜 )링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판에디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 누클레오시드 상호 연결체 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 메틸포스포네이트 누클레오티드 상호 연결체로부터 제한없이 선택된다)이에 의해 3' 말단상의 인접 누클레오시드로 연결된 누클레오시드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바람직하게 천연적으로 존재하거나 합성된 누클레오시드 또는 면역자극 잔기이고,
각각의 위치에서 Nn은 바람직하게 비염기성 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보누클레오시드, 2'-O-치환된 리보누클레오시드 및 변형된 누클레오시드 상호 연결체(이것은 바람지하게 아미노 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 누클레오시드 연결체 및 메틸포스포네이트 누클레오시드 상호 연결체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)에 의해 3'말단상에 인접한 누클레오시드로 연결된 누클레오시드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 천연적으로 존재하는 누클레오시드 또는 면역자극 잔기이고,
단, 하나 이상의 N1 또는 Nn은 면역자극 잔기이고,
n은 0 내지 30의 수이고,
이뮤노머 화합물의 경우, 3' 말단은 직접 또는 비누클레오티드 잔기를 통해 면역자극성일 수 있거나 아닐 수 있는 또 다른 올리고누클레오티드에 연결된다.
몇몇 바람직한 양태에서, YZ는 아라비노시티딘 또는 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘 및 아라비노구아노신 또는 2'데옥시-2'-치환된 아라비노구아노신이다. 바람직한 면역자극 잔기는 포스페이트 골격내 변형체를 포함하고 제한없이 메틸포스포네이트, 메틸포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포티오트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 트리에스테르 프로드럭, 설폰, 설폰아미드, 설파메이트, 포름아세탈, N-메틸하이드록실아민, 카보네이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노포스포네이트, 포스포라미데이트, 특히, 1차 아미노-포스포라미데이트, N3 포스포라미데이트 및 N5 포스포르아미데이트 및 입체 특이적 연결체(예를 들어, (RP)- 또는 (SP)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트 또는 포스포트리에스테르 연결체)를 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 면역자극 잔기는 추가로, 제한없이 2'-O-메틸리보스, 2'-O-메톡시에틸리보스, 2'-O-프로파르길리보스 및 2'-데옥시-2'-플루오로리보스를 포함하는 2'-치환된 펜토스 당; 제한없이 3'-O-메틸리보스를 포함하는 3'-치환된 펜토스 당; 1,2'-디데옥시리보스; 아라비노스; 제한없이 1'-메틸아라비노스, 3'-하이드록시메틸아라비노스, 4'-하이드록시메틸아라비노스, 및 2'-치환된 아라비노스 당을 포함하는 치환된 아라비노스 당; 제한없이 1,5-언하이드로헥시톨을 포함하는 헥소스 당; 및 알파-비대칭체를 포함한다. 변형된 당이 3'-데옥시리보누클레오시드 또는 3'-O-치환된 리보누클레오시드인 양태에서, 면역자극 잔기는 2'-5' 누클레오시드 상호 연결체에 의해 인접한 누클레오시드에 부착된다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물에서 바람직한 면역자극 잔기는 추가로 기타 탄수화물 골격 변형체 및 대체물을 갖는 올리고누클레오티드를 포함하고 제한없이, 펩타이드 핵산(PNA), 포스페이트 그룹을 갖는 펩타이드 핵산(PHONA), 고정된 핵산(LNA), 모르폴리노 골격 올리고누클레오티드 및 길이가 약 2옴스트롱 내지 약 200옴스트롱인 골격 링커 부분(제한 없이, 알킬 링커 또는 아미노 링커를 포함함)을 갖는 올리고누클레오티드를 포함한다. 알킬 링커는 측쇄 또는 직쇄, 치환된 또는 비치환된 것일 수 있고 키랄적으로 순수하거나 라세믹 혼합물일 수 있다. 가장 바람직하게, 당해 알킬 링커는 약 2 내지 약 18개의 탄소원자를 갖는다. 몇몇 바람직한 양태에서, 당해 알킬 링커는 약 3 내지 약 9개의 탄소 원자를 갖는다. 몇몇 알킬 링커는 하이드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아 및 티오에테르로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 작용성 그룹을 포함한다. 몇몇 당해 작용화된 알킬 링커는 화학식 O-(CH2-CH2-O-)n(n = 1 내지 9)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커이다. 몇몇 기타 작용화된 알킬 링커는 펩타이드 또는 아미노산이다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물에서 바람직한 면역자극 잔기는 추가로 DNA 이소형를 포함하고 제한없이, β-L-데옥시리보누클레오시드 및 α-데옥시리보누클레오시드를 포함한다. 바람직한 면역자극 잔기는 3' 변형체를 포함하고 추가로 제한없이 2'-5', 2'-2', 3'-3' 및 5'-5' 연결체를 포함하는 비천연 누클레오시드 연결체 위치를 갖는 누클레오시드를 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물에서 바람직한 면역자극 잔기는 추가로, 변형된 헤테로사이클릭 염기를 갖는 누클레오시드를 포함하고, 제한없이 5-하이드록시사이토신, 5-하이드록시메틸사이토신, N4-알킬사이토신, 바람직하게 N4-에틸사이토신, 4-티오우라실, 6-티오구아닌, 7-데아자구아닌, 이노신, 니트로피롤, C5-프로피닐피리미딘 및 디아미노푸린(제한없이, 2,6-디아미노푸린을 포함함)을 포함한다.
예를 들어, 화학식 III의 면역자극 도메인에서, 제한없이 특정 설명을 목적으로, 위치 N1 또는 Nn에서 메틸포스포네이트 누클레오시드 상호 연결체는 길이가 약 2 옴스트롱 내지 약 200옴스트롱인 링커인 면역자극 잔기이고 위치 X1에서 C2 내지 C18 알킬 링커는 면역자극 잔기이고 위치 X1에서 β-L-데옥시리보뉴클레사이드는 면역자극 잔기이다. 면역자극 위치의 대표적인 위치 및 구조에 대해 하기의 표 1을 참조한다. 특정 위치에서 면역자극 잔기로서 링커에 대한 언급은 그 위치에서 누클레오시드 잔기가 이의 3'-하이드록실에서 지적된 링커로 치환됨으로써 당해 누클레오시드 및 3' 측면상에 인접한 누클레오시드 사이에 변형된 누클레오시드 상호 연결체를 생성시킴을 의미하는 것으로 이해되어야만 한다. 유사하게, 특정 위치에서 면역자극 잔기로서 변형된 누클레오시드 연결체에 대한 언급은 그 위치에서 누클레오시드 잔기가 당해 연결체에 의해 3' 측면상에 인접한 누클레오시드에 연결됨을 의미한다.
표 1.
위치 전형적인 면역자극 잔기
N1 천연적으로 존재하는 누클레오시드, 비염기성 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, β-L-데옥시리보누클레오시드 C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)연결체, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커(아미노 링커), 2'-5' 누클레오시드 상호 연결체, 메틸포스포네이트 누클레오시드 연결체
Nn 천연적으로 존재하는 누클레오시드, 비염기성 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, 2'-O-치환된 리보누클레오시드, 2'-5'누클레오시드 상호 연결체, 메틸포스포네이트 누클레오시드 상호 연결체, 단 N1 및 N2는 둘다 비염기성 연결체일 수 없다.
표 2는 상부 강화 도메인을 갖는 면역자극 올리고누클레오티드내에 면역자극 잔기의 대표적인 위치 및 구조를 보여준다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스페이서 9"는 화학식 -O-(CH2CH2-O)n-(여기서, n은 3이다)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커를 의미한다. 용어 "스페이서 18"은 화학식 -O-(CH2CH2-O)n-(여기서, n은 6이다)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C2-C18" 알킬 링커는 화학식 -O-(CH2)q-O-(여기서, q는 2 내지 18의 정수이다)의 링커를 의미한다. 따라서, 용어 "C3-링커" 및 "C3-알킬 링커"는 화학식 -O-(CH2)3-O-의 링커를 의미한다. 스페이서 9, 스페이서 18 및 C2-C18 알킬 링커 각각에 대해 링커는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 메틸포스포네이트 연결체에 의해 인접한 누클레오시드에 연결된다.
표 2.
위치 전형적인 면역자극 잔기
5'N2 천연적으로 존재하는 누클레오시드, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커
5'N1 천연적으로 존재하는 누클레오시드, β-L-데옥시리보누클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜), 비염기성 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커
3'N1 천연적으로 존재하는 누클레오시드, 1'2'-디데옥시리보스, 2'-O-메틸-리보누클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18
3'N2 천연적으로 존재하는 누클레오시드, 1',2'-디데옥시리보스, 3'-데옥시리보누클레오시드, β-L-데옥시리보누클레오시드, 2'-O-프로파르길-리보누클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 메틸포스포네이트 누클레오시드 연결체
3'N3 천연적으로 존재하는 누클레오시드, 1',2'-디데옥시리보스, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 메틸포스포네이트 누클레오시드 상호 연결체, 2'-5'누클레오시드 상호 연결체, d(G)n, 폴리I-폴리dC
3'N2 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, β-L-데옥시리보누클레오시드, C2-C18 알킬 링커, d(G)n, 폴리-폴리dC
3'N3 + 3'N4 2'-O-메톡시에틸-리보누클레오시드, 메틸포스포네이트 누클레오시드 상호 연결체, d(G)n, 폴리I-폴리dC
3'N5 +3'N6 1',2'-디데옥시리보스, C2-C18 알킬 링커, d(G)n, 폴리-폴리dC
5'N1+ 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, d(G)n, 폴리I-폴리dC
표 3은 다운스트림 강화 도메인을 갖는 면역자극 올리고뉴클레오타이내에 면역자극 잔기의 대표적인 위치 및 구조를 보여준다.
표 3.
위치 전형적인 면역자극 잔기
5'N2 메틸포스포네이트 누클레오시드 상호 연결체
5'N1 메틸포스포네이트 누클레오시드 상호 연결체
3'N1 1',2'-디데옥시리보스, 메틸포스포네이트 누클레오시드 상호 연결체, 2'-O-메틸
3'N2 1',2'-디데옥시리보스, β- L-데옥시리보누클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 메틸포스포네이트 누클레오시드 상호 연결체, 2'-O-메틸
3'N3 3'-데옥시리보누클레오시드, 3'-O-치환된 리보누클레오시드, 2'-O-프로파르길-리보누클레오시드
3'N2 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, β-L-데옥시리보누클레오시드
본 발명에 따른 방법에 사용되는 이뮤노머 화합물은 직접적으로 또는 비누클레오시드 링커를 통해 연결된 2개 이상의 올리고누클레오티드를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, "비-누클레오티드 링커"는 공유 또는 비공유 연결체에 의해 올리고누클레오티드로 연결될 수 있는 임의의 잔기이다. 바람직하게, 당해 링커는 길이가 약 2옴스트롱 내지 약 200옴스트롱이다. 여러 바람직한 링커의 예는 하기에 제시된다. 비공유 연결체는 정전기 상호작용, 소수성 상호작용, π-스택킹 상호작용 및 수소 결합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "비-누클레오티드 링커"는 예를 들어, 2개 누클레오시드의 3'-하이드록실 그룹을 직접 연결하는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 작용성 그룹과 같은 상기된 바와 같은 누클레오시드 상호 연결체를 의미하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 당해 직접적인 3'-3' 연결체는 "누클레오티드 연결체"인 것으로 고려된다.
몇몇 양태에서, 비-누클레오티드 연결체는 골드 입자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 금속이다. 몇몇 다른 양태에서, 비-누클레오티드 링커는 가용성 또는 불용성 생분해성 중합체 비드이다.
여전히 또 다른 양태에서, 비-누클레오티드 링커는 올리고누클레오티드에 부착되도록 하는 작용성 그룹을 갖는 유기 잔기이다. 당해 부착은 바람직하게 임의의 안정한 공유 연결체에 의한 것이다.
몇몇 양태에서, 비-누클레오티드 링커는 폴리펩타이드, 항체, 지질, 항원, 알레르겐 및 올리고사카라이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 생분자이다. 몇몇 다른 양태에서, 비-누클레오티드 링커는 소형 분자이다. 본 발명의 목적을 위해, 소형 분자는 분자량이 1,000Da 미만인 유기 잔기이다. 몇몇 양태에서, 소형 분자는 분자량이 750Da 미만이다.
몇몇 양태에서, 소형 분자는 지방족 또는 방향족 탄화수소이고 이중 하나는 임의로 올리고누클레오티드를 연결시키거나 여기에 부착되는 선형 사슬에서 하이드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아 및 티오우레아로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 작용성 그룹을 포함할 수 있다. 소형 분자는 사이클릭 또는 비사이클릭일 수 있다. 소형 분자 링커의 예는 아미노산, 탄수화물, 사이클로덱스트린, 아다만탄, 콜레스테롤, 합텐 및 항생제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그러나, 비-누클레오티드 링커를 기재할 목적으로, 용어 "소형 분자"는 누클레오시드를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
몇몇 양태에서, 소형 분자 링커는 화학식 HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)P-OH(여기서, o 및 p는 독립적으로 1 내지 약 6, 1 내지 약 4 또는 1 내지 약 3의 정수이다)의 글리세롤 또는 글리세롤 동족체이다. 몇몇 다른 양태에서, 소형 분자 링커는 1,3-디아미노-2-하이드록시프로판의 유도체이다. 몇몇 당해 유도체는 화학식 OH-(CH2)m-C(O)NH-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OH(여기서, m은 0 내지 약 10, 0 내지 약 6 또는 2 내지 약 6 또는 2 내지 약 4의 정수이다)을 갖는다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 이뮤노머 화합물내 몇몇 비-누클레오티드 링커는 도 1에 도시된 바와 같은 2개 이상의 올리고누클레오티드를 부착시킨다. 예를 들어, 소형 분자 링커 글리세롤은 올리고누클레오티드가 공유적으로 부착될 수 있는 3개의 하이드록실 그룹을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 몇몇 이뮤노머 화합물은 3' 말단에서 비-누클레오티드 링커에 연결된 2개 초과의 올리고누클레오티드를 포함한다. 몇몇 당해 이뮤노머 화합물은 각각 근접 가능한 5'말단을 갖는 2개 이상의 면역자극 올리고누클레오티드를 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물은 자동화 합성기 및 도 5 및 6에 도시되어 있고 추가로 실시예에서 기재된 바와 같은 포스포르아미다이트 방법을 사용하여 간편하게 합성될 수 있다. 몇몇 양태에서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물은 직렬 합성 방법에 의해 합성된다(도 5 참조). 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "직렬 합성"은 이뮤노머 화합물의 한 말단에서 개시하여 또 다른 말단으로 선형으로 진행하는 합성을 의미한다. 직렬 합성으로 동일하거나 동일하지 않은(길이, 염기 조성 및/또는 혼입된 화학적 변형체 관점에서) 단량체성 유니트를 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물에 혼입시킨다.
이뮤노머 화합물을 위한 또 다른 합성 방식은 합성이 중앙 링커 잔기로부터 외부로 진행하는 "병렬 합성"이다(도 6 참조). 고형 지지체 부착된 링커는 미국 특허 제5,912,332호에 기재된 바와 같이 병렬 합성을 위해 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어, 포스페이트가 제어된 공극 유리 지지체에 부착되어 있는 범용 고형 지지체가 사용될 수 있다.
이뮤노머 화합물의 병렬 합성은 직렬 합성 보다 여러 잇점을 갖는다: (1) 병렬 합성은 동일한 단량체성 유니트를 혼입시킬 수 있고; (2) 직렬 합성과 같지 않게, 단량체성 유니트는 동시에 합성되고 이로써 합성을 위해 요구되는 합성 단계 수 및 시간은 단량체성 유니트와 동일하고; (3) 합성 단계의 감소는 최종 이뮤노머 생성물의 순도 및 수율을 개선시킨다.
직렬 또는 병렬 합성 프로토콜에 의한 합성 말기에, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 또는 이뮤노머 화합물은 변형된 누클레오시드가 혼입되는 경우, 포스포르아미다이트 공급자에 의해 추천되는 바와 같이 농축된 암모니아 용액으로 간편하게 탈보호될 수 있다. 생성물인 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물은 바람직하게 역상 HPLC로 정제되고 탈트리틸화되고 탈염되고 투석된다.
이뮤노머 화합물의 성분으로서 사용하기에 적합하거나 본 발명의 제4 측면에 따른 면역자극 올리고누클레오티드는 본원에 참조로서 인용되는 하기의 미국 특허 및 계류중인 미국 특허원에 기재되어 있다: 미국 특허 제6,426,334호 및 제6,476,000호 및 미국 특허원 제09/770,602호, 제09/845,623호, 제09/965,116호, 제60/440,587호, 제10/361,111호, 제60/471,247호, 제60/477호. 본 발명의 바람직한 면역자극 올리고누클레오티드 및 이뮤노머 화합물은 계류중인 미국 특허원 제10/279,684호에 기재되어 있다. 표 4는 본 발명에 따른 방법에 사용되는 대표적인 이뮤노머 화합물을 보여준다. 추가의 이뮤노머 화합물은 실시예 및 미국 특허원 제10/279,684호에 기재되어 있다.
표 4. 이뮤노머 서열의 예
Figure 112006002609489-PCT00003
Figure 112006002609489-PCT00004
Figure 112006002609489-PCT00005
대칭의 보다 긴 측쇄;
Figure 112006002609489-PCT00006
대칭의 글리세롤(단) 측쇄
L= C3-알킬 링커; X = 1',2'-디데옥시리보사이드; Y= 50HdC; R= 7-데아자-dG, R= 아라비노구아노신; X1 = 글리세롤 링커;
Figure 112006002609489-PCT00007
본 발명의 추가의 측면은 2개 이상의 올리고누클레오티드를 포함하는, 2차 구조를 갖는 면역자극 핵산을 제공한다. 특정 양태에서, 면역자극 핵산은 상보적인 서열과 수소 결합함에 의해 3'말단 스템 루프 2차 구조를 갖는다. 특정 양태에서, 면역자극 활성을 감소시키는 핵산이 상보적인 서열과 수소 결합함에 의해 5' 말단 스템 루프 2차 구조를 형성한다. 이러한 측면에서, 면역자극 핵산은 화학식 I에 상세히 기재한 바와 같은 구조를 포함한다.
도메인 A-도메인 B-도메인 C (I)
도메인은 길이가 약 2 내지 약 12개의 누클레오티드일 수 있다. 도메인 A는 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, C*는 2'-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5'-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 피리미딘 누클레오시드 유사체이고, G*는 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신 또는 기타 푸린 누클레오시드 유사체이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 누클레오시드 상호 연결체이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 디누클레오티드를 함유하거나 함유하지 않는 팔린드롬 또는 자가 상보적인 도메인을 갖거나 갖지 않는 5'-3' 또는 3'-5' 또는 2'-5' DNA, RNA, RNA-DNA, DNA-RNA일 수 있다. 특정 바람직한 양태에서, 면역자극 디누클레오티드는 CpG가 아니다.
특정 양태에서, 도메인 A는 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 디누클레오티드를 갖는다.
하기 "X"에 의해 도시된 바와 같은 도메인 B는 3'-5' 연결체, 2'-5' 연결체, 3'-3' 연결체, 포스페이트 그룹, 누클레오시드일 수 있는, 도메인 A 및 C를 연결하는 링커 또는 지방족, 방향족, 아릴, 사이클릭, 키랄, 비키랄, 펩타이드, 탄수화물, 지질, 지방산, 모노-, 트리- 또는 헥사폴리에틸렌 글리콜 또는 헤테로사이클릭 잔기일 수 있는 비-누클레오시드 링커이다.
도메인 C는 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, C*는 2'-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5'-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 피리미딘 누클레오시드 유사체이고, G*는 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신 또는 기타 푸린 누클레오시드 유사체이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 누클레오시드 상호 연결체이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 디누클레오티드를 갖거나 가질 수 없는 팔린드롬 또는 자가 상보적인 서열을 갖거나 갖지 않는 5'-3' 또는 3'-5' 또는 2'-5' DNA, RNA, RNA-DNA, DNA-RNA 폴리 I-폴리 C일 수 있다. 특정 바람직한 양태에서, 면역자극 디누클레오티드는 CpG가 아니다. 특정 양태에서, 도메인 B는 바람직하게 "이뮤노머"로서 언급되는 도메인 A 및 도메인 C의 올리고누클레오티드를 연결하는 비-누클레오티드 링커이다. 특정 바람직한 양태에서, 도메인 C는 디누클레오티드 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*를 갖지 않는다.
비제한적인 예를 통해, 당해 측면의 특정 양태에서, 면역자극 핵산은 화학식 (II)에 상세히 도시된 바와 같은 구조를 갖는다.
Figure 112006002609489-PCT00008
(II)
당업자가 인지하는 바와 같이, 분자내 스템 루프의 형태로 분자의 말단에는 2차 구조 요소가 있다.
비제한적인 예를 통해, 당해 측면의 특정 양태에서, 면역자극 핵산은 화학식 III에 상세히 도시된 바와 같은 구조를 갖는다.
(Ⅲ)
2개의 말단 서열이 상보적이어서 분자내 수소 결합을 허용하는데 2개의 분자 말단이 차단되어 있음으로 화학식 III에 도시된 구조는 본원에서 "말단 이량체"로서 언급된다. 추가로, 도메인 A 및 A'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있고 도메인 B 및 B'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있고 도메인 C 및 C'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
비제한적인 예를 통해, 당해 측면의 특정 양태에서, 면역자극 핵산은 화학식 IV에 도시된 구조를 갖는다.
Figure 112006002609489-PCT00010
(IV)
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 도시된 분자의 말단은 이의 말단의 상보적인 서열이 당해 영역에 수소 결합되어 있기 때문에 2차 구조를 갖는다. 특정 양태에서, 리간드와 같은 분자는 말단에 부착되어 세포 흡수를 촉진시키거나 분자의 안정성을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 몇몇 핵산 분자의 비제한적인 예는 표 5에 도시되어 있다.
표 5.
Figure 112006002609489-PCT00011
Figure 112006002609489-PCT00012
Figure 112006002609489-PCT00013
Figure 112006002609489-PCT00014
* 상부 경우-PS; 하부 경우-PO; 굵게 표시한-2'-O-메틸-리보누클레오티드(116 및 117에서); G-2'-데옥시-7-데아자-G(118에서); G -아라G(119에서); X-C3-링커(127 및 128에서).
또한, 본 발명의 핵산 분자는 비-누클레오티드 링커에 의해 연결된 2개의 이뮤노머일 수 있다. 이들 분자의 비제한적인 대표적인 예는 표 6에 제공된다.
표 6.
Figure 112006002609489-PCT00015
Figure 112006002609489-PCT00016
* 상부 경우-PS; 하부 경우-PO; X-C3-링커; Y-테트라에틸렌글리콜 링커; Z-헥사에틸렌글리콜 링커, 굵게 표시한-2'-O-메틸리보누클레오티드(134 및 147에서); G-2'-데옥시-7-데아자-G(135에서).
또한, 추가로 비제한적인 대표적인 예는 표 7에 제공된다.
표 7.
Figure 112006002609489-PCT00017
이탤릭체는 포스포디에스테르 연결체를 나타내고 또 다른 연결체는 다르게 지적되지 않는 경우 포스포로티오에이트이다.
밑줄친 부분 = 2'-OMe-누클레오시드; X = C3 링커
R= 2'-데옥시-7-데아자구아노신 G1 = 2'-데옥시-7-데아자구아노이스.
본 발명의 또 다른 측면은 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머의 서열이 적어도 부분적으로 자가 상보적인 면역자극 핵산을 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같은 자가 상보적인 서열은 적합하게 정렬되는 경우 분자내 또는 보다 전형적으로는 분자 상호간 염기쌍을 G-C, A-T, A-U 및/또는 G-U 불안정한 쌍 사이에 형성할 수 있다. 한 양태에서, 자가 상보성의 정도는 50% 이상이다. 예를 들어, 50% 이상의 자가 상보성인 8량체는 4, 5, 6, 7 또는 8개의 G-C, A-T, A-U 및/또는 G-U의 불안정한 염기쌍을 형성할 수 있는 서열을 가질 수 있다. 그러나 당해 염기쌍은 자가 상보적인 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머의 어느 하나의 말단에 위치한 염기를 필연적으로 포함할 필요는 없다. 핵산 안정화가 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머에 중요할 수 있는 경우, 염기쌍 형성 또는 어떠한 다른 적합한 수단에 의해 이본쇄 핵산의 한 말단 또는 양 말단을 함께 클램핑하는 것이 유리할 수 있다. 자가 상보성의 정도는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머간의 정렬에 의존하고 당해 정렬은 단일 또는 다중 누클레오시드 돌출부를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 또 다른 양태에서, 자가 상보성의 정도는 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 심지어 100%이다.
비제한적인 예를 통해, 당해 측면의 특정 양태에서, 면역자극 핵산은 화학식 V에 도시된 바와 같은 구조를 갖는다.
Figure 112006002609489-PCT00018
(V)
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 도시된 이뮤노머 화합물은 도메인의 서열이 분자내 수소 결합을 허용하도록 상보적이기때문에 2차 구조를 갖는다. 도메인 A 및 A'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있고 도메인 A 및 C는 동일하거나 동일하지 않을 수 있고 도메인 A' 및 C는 동일하거나 동일하지 않을 수 있고 도메인 A' 및 C'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있고 도메인 B 및 B'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있고 도메인 C 및 C'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 더욱이, 추가의 이뮤노머는 분자간 수소 결합을 통해 결합함으로써 본 발명에 따른 이뮤노머의 하나의 쇄, 또는 다량체가 될 수 있다. n은 임의의 수의 연속 자가 상보적 이뮤노머 화합물일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적"이란 핵산과 하이브리드화할 능력을 갖고 있음을 의미한다. 당해 하이브리드화는 통상적으로 상보적 쇄 사이에 수소 결합한 결과이고 바람직하게는 왓슨-크릭 또는 후그스틴 염기쌍을 형성하지만 기타 방식의 수소 결합 및 염기 스택킹이 또한 하이브리드화를 유도할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "2차 구조"는 분자간 수소 결합을 의미한다. 분자간 수소 결합은 이본쇄 핵산 분자를 형성시킨다.
비제한적인 대표적인 핵산 분자는 표 8에 제공된다.
표 8.
Figure 112006002609489-PCT00019
Figure 112006002609489-PCT00020
정상적인 글자체는 포스포로티오에이트 연결체를 나타낸다.
G1 = 2'-데옥시-7-데아자구아노신
G2 = 아라비노구아노신
G3 = 2'-데옥시이노신
C1 = 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸푸린
C2 = 아라비노시티딘
C3 = 2'-데옥시-5-하이드록시시티딘
X = C3 링커
본 발명의 방법에 사용하기 위해 특히 바람직한 이뮤노머는 하기의 구조를 갖는다.
Figure 112006002609489-PCT00021
본 발명의 모든 측면에 따른 방법 및 조성물은 질환을 치료하기 위한 치료학적 방법에 유용하고 여기서 치료는 면역계 조정 및 면역 기반 치료를 포함한다. 특히 바람직한 질환 표적물은 암, 감염성 질환 및 알레르기를 포함한다.
특정 양태에서, 치료 방법은 암을 치료하기 위한 것이다. 암 또는 종양은 담즙관 암; 뇌암; 유방암; 경부암; 융모막암종; 결장암; 자궁암; 식도암; 위암; 상피내 신생물; 림프종; 간암; 폐암(예를 들어, 소형 세포 및 비소형 세포); 흑색종; 신경아종; 구강암; 난소암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 육종; 피부암; 고환암; 갑상선암 및 망막암 및 기타 암종 및 육종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
몇몇 양태에서, 치료학적 방법은 감염을 치료하기 위한 것이다. 비제한적인 예를 통해, 사람을 감염시키는 것으로 밝혀진 바이러스는, 레트로비리대(Retroviridae)(예를 들어, 사람 면역결핍 바이러스, 예를 들어, HIV-1 (또한 HTLV-Ⅲ, LAV 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III로서 언급됨), 및 기타 분리체, 예를 들어 HIV-LP; 피코나비리대(Picornaviridae) (예를 들어, 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스; 엔테로바이러스(enteroviruses), 사람 콕사키 바이러스(human Coxsackie viruses), 리노바이러스(rhinoviruses), 에코바이러스(echoviruses)); 칼시비리대(Calciviridae)(예를 들어, 위장염을 일으키는 종); 토가비리대(Togaviridae) (예를 들어, 말 뇌염 바이러스, 루벨라(rubella) 바이러스); 플라비리대(Flaviridae) (예를 들어, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황색 열 바이러스); 코로노리비대(Coronoviridae)(예를 들어, 코로나바이러스(coronaviruses); 라브도비라대(Rhabdoviradae) (예를 들어, 소포성 구내염 바이러스, 랍비 바이러스); 코로나비리대(Coronaviridae)(예를 들어, 코로나바이러스); 라브도비리대(Rhabdoviridae)(예를 들어, 소포성 구내염 바이러스, 랍비 바이러스); 필로비리대(Filoviridae)(예를 들어, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) (예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡 신시티알 바이러스); 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae)(예를 들어, 인플루엔자 바이러스); 분가비리대(Bungaviridae)(예를 들어. 한탄 바이러스, 분가 바이러스, 플레보바이러스 및 나이로 바이러스); 아레나 비리대 (출혈열 바이러스); 레오비리대 (예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리대; 헤파드나비리대(Hepadnaviridae)(B형 간염 바이러스); 파르보비리대(Parvovirida) (파르보바이러스(parvoviruses)); 파포바비리대(Papovaviridae)(파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리대(Adenoviridae)(대부분 아데노바이러스); 헤르페스비리대(Herpesviridae)(헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 1 및 2, 바리셀라 조스터 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 헤르페스 바이러스; 폭스비리대 (바리올라 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스); 및 트리도비리대(Iridoviridae) (예를 들어, 아프리칸 멧돼지 열 바이러스); 및 미분류 바이러스(예를 들어, 스폰지 형태의 뇌병증의 병인 제제, 델타 간염 바이러스 제제(B형 간염 바이러스에 속하는 결손체인 것으로 사료됨), A형 B형 간염 바이러스가 아닌 제제(부류 I= 내부로 전달됨; 부류 2= 비경구적으로 전달됨(즉, C형 간염 바이러스); 노르워크(Norwalk) 및 관련 바이러스 및 아스트로바이러스)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 본 발명의 치료학적 방법은 알레르기 치료에 관한 것이다. "알레르겐"은 감수성 대상체에서 알레르기 또는 천식 반응을 유도할 수 있는 물질(항원)을 의미한다. 알레르겐의 종류는 방대하고 꽃가루, 곤충 독, 동물 비듬 먼지, 진균류 포자 및 약제(예를 들어, 페니실린)를 포함할 수 있다. 천연 동물 및 식물 알레르겐의 예는 하기의 속에 특이적인 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: (캐니스 패밀리아리스(Canis familiaris)); 더마토파고이데(Dermatophagoides) (예를 들어, 더마토파고이데 파리내)); 펠리스 (펠리스 도메스티쿠스(Felis domesticus)); 암브로시아(Ambrosia)(암브로시아 아테미스폴리아); 롤륨(Lolium)(예를 들어, 롤륨 페레네(Lolium perenne) 또는 롤륨 멀티플로룸( Lolium multiflorum)); 크립토메리아(Cryptomeria)(크립토메리아 야포니카(Cryptomeria japonica)); 알테르나리아(Alternaria) (알테르나리아 알테르나타(Alternaria alternata)); 알더(Alder); 알누스(Alnus) (알누스 굴티노아사(Alnus gultinoasa)); 베툴라(Betula)(베툴라 베르루코사(Betula verrucosa)); 쿠어쿠스(Quercus)(쿠어쿠스 알바(Quercus alba)); 올레아(Olea)(올레아 유로파(Olea europa)); 아테미시아(Artemisia)(아테미시아 불가리스(Artemisia vulgaris)); 플란타고(Plantago)(예를 들어, 플란타고 란세올라타(Plantago lanceolata)); 파리에타리아(Parietaria)(예를 들어, 파리에타리아 오피시날리스(Parietaria officinalis) 또는 파리에타리아 유다이카(Parietaria judaica)); 블라텔라(Blattella)(예를 들어, 블라텔라 게르마니카(Blattella germanica)); 아피스(Apis)(예를 들어, 아피스 물티글로룸(Apis multiglorum)); 쿠프레써스(Cupressus) (예를 들어, 쿠프레써스 셈페르비렌스(Cupressus sempervirens), 쿠프레써스 아리조니카(Cupressus arizonica) 및 쿠프레써스 마크로카르파(Cupressus macrocarpa)) ; 유니페루스(Juniperus)(예를 들어, 유니페루스 사비노이데스(Juniperus sabinoides), 유니페루스 비르기니아나(Juniperus virginiana), 유니페루스 코뮤니스(Juniperus communis) 및 유니페루스 아스헤이(Junipers ashei)); 투야(Thuya) (예를 들어, 투야 오리엔탈리스(Thuya orientalis)); 카마에시파리스(Chamaecyparis)(예를 들어, 카마에시파리스 오브투사(Chamaecyparis obtusa)); 페리플라네타(Periplaneta)(예를 들어, 페리플라네타 아메리카나(Periplaneta americana)); 아그로피론(Agropyron)(예를 들어, 아그로피론 레펜스(Agropyron repens)); 세칼레(Secale)(예를 들어, 세칼레 세레알레); 트리티쿰(Triticum)(예를 들어, 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)); 닥틸리스(Dactylis)(예를 들어, 탁틸리스 글로메라타(Dactylis glomerata)); 페스투카(Festuca)(예를 들어, 페스투카 엘라티오르(Festuca elatior)); 포아(Poa)(예를 들어, 포아 프라텐시스(Poa pratensis) 또는 포아 콤프레싸(Poa compressa)); 아베나(Avena)(예를 들어, 아베나 사티바(Avena sativa)); 홀쿠스(Holcus)(예를 들어, 홀쿠스 라나투스(Holcus lanatus)); 안톡산툼(Anthoxanthum)(예를 들어, 안톡산툼 오도란툼(Anthoxanthum odoratum)); 아르헤나테룸(Arrhenatherum)(예를 들어, 아르헤나테룸 엘라티우스(Arrhenatherum elatius)); 아그로스티스(Agrostis)(예를 들어, 아그로스티스 알바(Agrostis alba)); 플레움(Phleum)(예를 들어, 플레움 프라텐세(Phleum pratense)) ; 팔라리스(Phalaris)(예를 들어, 팔라리스 아룬디카세아(Phalaris arundinacea)); 파스팔룸(Paspalum)(예를 들어, 파스팔룸 노타툼(Paspalum notatum)); 소르굼(Sorghum)(예를 들어, 소르굼 할레펜시스(Sorghum halepensis)); 및 브로무스(Bromus)(예를 들어, 브로무스 이네르미스(Bromus inermis)). 특이적 알레르겐은 상업적으로 시판될 수 있다(예를 들어, INDOOR Biotechnologies Inc., Charlottesville, VA 22903)].
제2 측면에서, 본 발명은 상기된 바와 같은 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물 및 근접 가능한 5' 말단 이외의 위치에서 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물에 접합된 항원을 포함하는, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 접합체와 배합된 화학치료제를 환자에게 투여함을 포함하는, 암 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서, 비-누클레오티드 링커는 암과 관련된 올리고누클레오티드에 접합된 항원을 포함한다. 몇몇 다른 양태에서, 항원은 3' 말단 이외의 위치에서 올리고누클레오티드에 접합된다. 몇몇 양태에서, 항원은 백신 효과를 나타낸다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "와 관련된"은 암이 존재하는 경우 항원이 존재하고 암이 부재인 경우 항원이 존재하지 않거나 감소된 양으로 존재함을 의미한다.
면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물은 항원에 공유적으로 연결되거나 항원과 작동적으로 연합된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동적으로 연관된"은 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물 및 항원 둘다의 활성을 유지하는 임의의 연합을 의미한다. 당해 작동적인 연합의 비제한적인 예는 동일한 리포좀 또는 기타 당해 전달 비히클 또는 시약의 일부를 포함한다. 추가로, 항원을 암호화하는 핵산 분자는 발현 벡터로 클로닝될 수 있고 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물과 배합되어 투여된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 바람직한 벡터는 자가 복제할 수 있고 여기에 연결된 핵산을 발현시킬 수 있는 것이다(예를 들어, 에피좀). 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 흔히 일반적으로, 이들의 벡터 형태로 염색체와 결합되지 않은 환형 이본쇄 DNA 루프로 언급되는 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이기때문에 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하고 당해 기술 분야에 공지된 기타 형태의 발현 벡터를 포함한다.
면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물이 공유적으로 항원에 연결된 양태에서, 당해 공유 연결체는 바람직하게 면역자극 올리고누클레오티드의 근접 가능한 5' 말단 이외의 임의의 위치에서 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물상에 존재한다. 예를 들어, 당해 항원은 누클레오시드 상호 연결체에 부착될 수 있거나 비-누클레오시드 링커에 부착될 수 있다. 또한, 항원 자체는 비-누클레오티드 링커일 수 있다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 면역자극 올리고누클레오티드 접합체 및/또는 이뮤노머 화합물 또는 이뮤노머 접합체, 화학치료제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생리학적으로 허용되는"이란 이뮤노머 화합물의 효과를 방해하지 않고 세포, 세포 배양물, 조직 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템과 화합성인 물질을 의미한다. 바람직하게, 생물학적 시스템은 척추동물과 같은 생존 유기체이다. 바람직한 화학치료체는 제한없이, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 아드리아마이신, 시스플라틴, 무가당 클로로에틸니트로우레아, 5-플루오로우라실, 마이토마이신 C, 블레오마이신, 독소루비신, 다카바진, 탁솔, 프라길린, 멜라민 GLA, 발루비신, 카무스타인 및 폴리페르포산, MMI270, BAY 12-9566, RAS 파메실 트랜스퍼라제 억제제, 파메실 트랜스퍼라제 억제제, MMP, MTA/LY231514, LY264618/로메텍솔, 글라몰렉, CI-994, TNP-470, 하이캄틴/토포테칸, PKC412, 발스포다르/PSC833, 노반트론/미트록산트론, 메타레트/수라민, 바티마스타트, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/마르미스타트, BB2516/마르미스타트, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, 레모날 DP 2202, FK 317, 피시바니/OK432, AD 32/발루비신, 메타스트론/스트론튬 유도체, 테모다브/테모졸로미드, 에바세트/리포좀 독소루비신, 예우탁산/플라클리탁셀, 탁솔/파클리탁셀, 셀로아드/카페시타빈, 푸르툴론/독시플루리딘, 사이클로팍스/경구용 파클리탁셀, 경구용 탁소이드, SPU-077/시스플라틴, HMR 1275/플라보피리돌, CP-358 (774) /EGFR, CP-609 (754) /RAS 발암유전자 억제제, BMS-182751/경구용 백금, UFT (테가푸르/우라실), 에르가미소울/레바미솔, 에닐우라실/776C85/5FU 증진제, 캄프토/레바미솔, 캄프토사르/이리노테칸, 투모덱스/랄리트렉세드, 류스타틴/클라드리빈, 팍세스/파클리탁셀, 독실/리포좀 독소루비신, 카엘릭스/리포좀 독소루비신, 플루다라/플루다라빈, 파마루비신/에피루비신, 데포시트, ZD1839, LU 79553/비스-나프탈리미드, LU 103793/돌라스타틴, 카에틱스/리포좀 독소루비신, 겜자르/젬시타빈, ZD 0473/아노르메드, YM 116, 요딘 종자, CDK4 및 CDK2 억제제, PARP 억제제, D4809/덱시포사미드, 이페스/메스넥스/이포사미드, 부몬/테니포시드, 파라플라틴/카보플라틴, 플란티놀/시스플라틴, 베페시드/에토포사이드, ZD 9331, 탁소테레/독세탁셀, 구아닌 아라비노사이드의 프로드럭, 탁산 유사체, 니트로소우레아, 알킬화제, 예를 들어, 멜펠란 및 사이클로포스파미드, 아미노글루테티미데, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 클로로움부실, 시타라빈 HCl, 다크티노마이신, 다우노루비신 HCl, 에스트라무스틴 인산나트륨, 에토포사이드 (VP16-213), 플록수리딘, 플루오로우라실 (5-FU), 플루타미드, 하이드록시우레아 (하이드록시카바미드), 이포스파미드, 인터페론 알파-2a, 알파-2b, 류프롤리드 아세테이트 (LHRH-방출 인자 유사체), 로무스틴 (CCNU), 메클로레타민 HCl(질소 무스타드), 머캅토푸린, 메스나, 미토탄 (o. p'-DDD), 미톡산트론 HCl, 옥트레오타이드, 플리카마이신, 프로카바진 HCl, 스트렙토조신, 타목시펜 시트레이트, 티오구아닌, 티오테파, 빈블라스틴 설페이트, 암사크린 (m-AMSA), 아자시티딘, 에르트로포이에틴, 헥사메틸멜라민 (HMM), 인터류킨 2, 미토구아존 (메틸-GAG; 메틸 글리옥살 비스-구아닐하이드라존; MGBG), 펜토스타틴(2'데옥시코포르마이신), 세무스틴 (메틸-CCNU), 테니포사이드 (VM-26) 및 빈데신 설페이트를 포함한다.
여전히 또 다른 양태에서, 당해 제제는 EFG, 항-유전자형 암 백신, Gp75 항원, GMK 흑색종 백신, MGV 갱글리오사이드 접합체 백신, Her2/new, 오바렉스(Ovarex), M-Vax, O-Vax, STn-KHL 테라토페(theratope), BLP25(MUC-1), 리포좀 유전자형 백신, 멜라신, 펩타이드 항원 백신, 독소/항원 백신, MVA계 백신, PACIS, BCG 백신, TA-HPV, TA-CIN, DISC-바이러스 및 ImmunCyst/TheraCys로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암 백신을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물과 배합된 모노클로날 항체를 환자에게 투여함을 포함하는, 암 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 항체 및 특히 모노클로날 항체 형태의 수동적 면역치료는 항암제로서 상당한 연구 및 개발을 위한 대상이 되어왔다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 단일 분자 조성물의 항체 분자를 의미한다. 모노클로날 항체 조성은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 따라서, 용어 "사람 모노클로날 항체"는 사람 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 의미한다. 항암제의 예는 파노렉스(Glaxo-Welcome), 리툭산(IDEC/Genentech/Hoffman la Roche), 밀로타르그(Mylotarg)(Wyeth), 캄파쓰(Campath)(Millennium), 제발린(Zevallin)(IDEC and Schering AG), 벡사르(Bexxar)(Corixa/GSK), 에르비툭스(Erbitux)(Imclone/BMS), 아바스틴(Genentech) 및 헤르셉틴(Herceptin)(Genetech/Hoffman la Roche)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항체는 면역학적 의미에서 암 항원과 유사한 것으로 나타난 항-유전자형 항체를 사용하는 능동적 면역치료에 사용될 수 있다. 모노클로날 항체는 재조합 DNA 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질 또는 약제학적 제형에 사용하기 위해 널리 공지된 기타 물질을 포함한다. 담체, 부형제 또는 희석제의 특징은 특정 적용을 위한 투여 경로에 의존하는 것으로 이해된다. 당해 물질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 제형의 제제는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990]에 기재되어 있다.
톨(Toll)형 수용체(RLR)는 감염 센서로서 작용하고 선천적 및 후천적 면역 반응의 활성화를 유도한다. TLR은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)으로 불리우는 광범위하게 다양한 리간드를 인지한다. 보존성 병원체 관련 분자 생성물을 인지하는 즉시, TLR은 이들의 세포내 시그날 전달 도메인, 톨/인터류킨-1 수용체(TLR) 도메인 및 다운스트림 어댑터 단백질 MyD88을 통해 숙주 방어 반응을 활성화시킨다. 수지상 세포 및 마크로파아지는 정상적으로 톨형 수용체(TLR) 리간드 및 사이토킨(예를 들어, 인터류킨-1β; IL-6 및 종양 괴사 인자, TNF)에 응답하고 이들은 또한 천연 킬러(NK) 세포를 생성시키고 T 세포가 또한 관여된다. 세균 화합물에 의한 TLR 자극 후, 선천적 면역 세포는 다양한 사이토킨을 방출한다. TLR 리간드의 몇몇 예는 지단백질; 펩티도글리캔, 자이모산(TLR2), 이본쇄 RNA, 폴리I:폴리C(TLR3), 리포폴리사카라이드, 열 쇼크 단백질, 탁솔(TLR4), 플라겔린(TLR5) 및 이미다조퀴놀린-R848, 레시퀴모드, 이미퀴모드; ssRNA(TLR7/8)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
제4 측면에서, 본 발명은 암 세포를 이온화 방사선에 감작화시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 당해 측면에 따른 방법은 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 또는 이뮤노머 화합물을 포유동물에 투여하고 동물을 이온화 방사선으로 처리함을 포함한다. 특정 바람직한 양태에서, γ방사선은 분당 1.56 Gy로 조사한다. 특정 바람직한 양태에서, 방사선 치료는 약 0.1 내지 약 10.0 Gy, 바람직하게 약 0.25 내지 약 8.0 Gy, 보다 바람직하게, 약 0.5 내지 약 5.0Gy로 조사하거나 1주동안 2번 3.0Gy를 조사하거나 1주동안 4회 또는 2, 4 및 9일째에 3회 조사한다. 특정 양태에서, 면역자극 올리고누클레오티드 또는 이뮤노머 화합물로의 전처리는 γ방사선 조사하기 약 2 내지 약 6시간 전에 한다.
제5 측면에서, 본 발명은 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2 및 항원과 배합된 치료학적 공동 상승 작용을 하는 유효량의 이뮤노머 화합물을 환자에게 투여함을 포함하는 환자내 면역반응을 공동 상승 작용적으로 자극시키는 방법을 제공하고 여기서 당해 배합물의 투여는 환자에서 공동 상승 작용적으로 사이토킨의 생산을 자극한다. 본 발명에 따라 자극된 바람직한 사이토킨은 하나 이상의 IL-12, 인터페론-γ, IFN-α 및 IFN-β를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 당해 방법은 암을 치료하기 위한 것이고 항원은 암에 특이적이거나 암과 관련된 항원이다. 몇몇 양태에서, 당해 방법은 감염 치료를 위한 것이고 항원은 감염과 관련된 항원이다. 특정 양태에서, 당해 방법은 알레르기 치료를 위한 것이고 항원은 알레르기와 관련되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "와 관련된"은 항원이, 암, 알레르겐 또는 감염성 질환이 존재하는 경우 존재하지만 암, 알레르겐 또는 감염성 질환이 부재인 경우 존재하지 않거나 감소된 양으로 존재함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 항체 또는 T 세포 항원 수용체에 의해 특이적으로 인지되고 결합되는 물질을 의미한다. 항원은 펩타이드, 단백질, 당단백질, 폴리사카라이드, 갱글리오사이드 및 지질; 이의 일부 및 이의 배합물을 포함할 수 있다. 당해 항원은 천연적으로 존재하는 항원일 수 있거나 합성된 것일 수 있다. 합텐은 "항원"의 범위내에 포함된다. 합텐은 그자체가 면역원성이 아니지만 항원성 결정인자를 함유하는 면역원성 분자와 접합되는 경우 면역원성이 부여되는 저분자량의 화합물이다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 항원은 종양 관련되고/되거나 종양 특이적인 항원이다. 비제한적인 예는 전립선 암의 존재하에 상승될 수 있는 정상적으로 소량으로 혈중에 존재하는 마커인 전립선 특이적 항원(PSA) 및 전립선 산 포스파타제(PAP); 난소암을 앓는 환자내에 상승된 수준으로 존재하고 때때로 기타 암의 존재하에 상승되는 암 항원 125(CA-125); 유방암 과정 후 및 처리에 대한 이의 반응 후 유용한 CA 15-3 및 CA 27-29; 전립선 암의 전이에 대한 마커로서 일반적으로 사용되고 또한 결장직장, 위 및 담즙관 암을 앓는 환자내에서 또한 상승되는 CA19-9; 정상적으로 소량으로 존재하지만 다양한 암을 앓는 환자의 혈중에서 상승될 수 있는 암배아 항원(CEA); 간세포 및 생식 세포(비세미노마) 암종에 대한 마커인 알파-페토단백질 및 주로 위장관의 다양한 악성종양에서 상승되는 것으로 밝혀진 갈락토실 트랜스퍼라제의 동위효소인 갈락토실 트랜스퍼라제 II를 포함한다.
본 발명의 제5 측면의 특정 양태에서, 본 발명은 상기된 바와 같이 이뮤노머 화합물을 포함하는 이뮤노머 접합체와 배합된 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2 및 항원을 환자에게 투여함을 포함하는 암 환자의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 항원은 근접 가능한 5'말단 이외의 위치에서 이뮤노머 화합물에 접합된다. 몇몇 양태에서, 이뮤노머 화합물의 비-누클레오티드 링커는 암과 관련된 항원을 포함한다. 몇몇 양태에서, 항원은 5' 말단 이외의 위치에서 이뮤노머 화합물에 접합된다. 몇몇 양태에서, 항원은 백신 효과를 나타낸다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "과 관련된"은 항원이 암이 존재하는 경우 존재하지만 암이 부재인 경우는 존재하지 않거나 감소된 양으로 존재함을 의미한다.
본 발명의 제5 측면의 몇몇 양태에서, 이뮤노머 화합물은 항원에 공유적으로 연결되거나 항원과 작동적으로 연관되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동적으로 관련된"은 이뮤노머 화합물 및 항원의 활성을 유지하는 임의의 연합을 의미한다. 당해 작동적 연합의 비제한적인 예는 동일한 리포좀 또는 기타 전달 비히클 또는 시약의 일부를 포함한다. 이뮤노머 화합물이 공유적으로 항원에 연결되는 양태에서, 당해 공유 연결체는 바람직하게 이뮤노머 화합물의 근접 가능한 5'말단 이외의 임의의 위치에서 이뮤노머 화합물상에 존재한다. 예를 들어, 항원은 누클레오시드 연결체에 부착되거나 비-누클레오시드 링커에 부착될 수 있다. 또한, 항원 자체는 비-누클레오시드 링커일 수 있다.
본 발명의 제6 측면에서, 이뮤노머 화합물이 아닌 하나 이상의 면역자극 올리고누클레오티드는 치료학적 유효량의 IL-2와 배합되어 사용되어 선택적으로 및 공동 상승 작용적으로 환자에서 사이토킨의 생산을 자극한다. 본 발명에 따라 공동 상승 작용적으로 자극된 바람직한 사이토킨은 IL-12 및 IFN-γ, IFN-α, IFN-β 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명에 따라, 이뮤노머 화합물이 아닌 바람직한 면역자극 올리고누클레오티드는 하나 이상의 면역자극 CpG 디누클레오티드(여기서, C는 사이토신 또는 데옥시사이토신이 아니고/아니거나 G는 구아노신 또는 2-데옥시구아노신이 아니다)를 함유하는 것들을 포함한다. 이뮤노머 화합물이 아닌 본 발명의 또 다른 바람직한 면역자극 올리고누클레오티드는 CpG가 아닌 반복적인 면역자극 잔기를 포함하는 것들이다. 당해 반복적인 면역자극 잔기의 예는 본원에 참조로서 인용되는 하기의 미국 특허 및 계류중인 미국 특허원에 기재된 바와 같이 올리고누클레오티드를 안정화시키는 헤어핀 구조와 같은 올리고누클레오티드 자체의 2차 구조 및 천연적으로 존재하지 않는 염기 및/또는 당을 포함하는 누클레오시드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 미국 특허원 제6,426,334호 및 제6,476,000호 및 미국 특허원 제09/770,602호, 제09/845,623호, 제09/965,116호, 제60/440,587호, 제10/361,111호, 제60/471,247호, 제60/477,608호.
본 발명의 특정 양태에서, 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드 및 IL-2 각각은 환자에게 투여하기 전에 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합된다. 특정 양태에서, 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드는 투여 전에 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 혼합되거나 본 발명의 제4 측면에 기재된 바와 같이 약제학적 조성물의 일부로서 배합된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질 또는 약제학적 제제중에 사용하기 위해 당업계에 널리 공지된 기타 물질을 포함한다. 담체, 부형제 또는 희석제의 특징은 특정 적용을 위한 투여 경로에 의존하는 것으로 이해된다. 이들 물질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 제형의 제제는 문헌[참조: Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20"Edition, ed. A. L. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins Publishing Co. , Philadelphia, PA, 19106 (ISBN: 0683306472)]에 기재되어 있다.
제7 측면에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체, 치료학적 공동 상승 작용을 하는 유효량의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드, 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2 및 임의로 항원을 포함하는 치료학적 조성물을 제공하고 여기서, 당해 치료학적 조성물의 투여는 환자에서 공동 상승 작용적으로 사이토킨의 생산을 자극한다. 본 발명에 따라 공동 상승 작용적으로 자극되는 바람직한 사이토킨은 IL-12 및 인터페론-γ, IFN-α, IFN-β 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
발명의 모든 측면은 질환의 치료에 유용하고 특히 암, 감염성 질환 및 알레르기를 치료하기 위한 면역 기반 치료에 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 질환을 "치료하는" 또는 질환의 "치료"는 개시 후 질환의 예방, 질환의 징후 또는 증상의 감소 또는 근절 및 질환 재발의 예방을 포함한다.
본 발명에 따른 방법에서, IL-2와 배합된 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드는 제한 없이, 비경구, 경구, 설하, 경피, 국소, 비강내, 에어로졸, 안내, 기관지내, 직장내, 질내, 유전자 총에 의한, 피부 패치 또는 안약 또는 치약 형태를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 이뮤노머 화합물, 면역자극 올리고누클레오티드, IL-2 또는 이의 치료학적 조성물은 치료학적 유효량을 사용하는 공지된 과정을 사용하고 질환을 치료하는데 효과적인 시간동안 투여될 수 있다.
발명의 당해 측면의 목적을 위해, "와 배합된"이란 용어는 동일한 환자에서 동일한 질환을 치료하는 과정에 있음을 의미하고 동시 투여 및 수일간의 간격으로 일시적으로 격리된 순서를 포함하는, 임의의 순서로 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물 및/또는 화학치료제를 투여함을 포함한다. 당해 배합 치료는 또한 1회 이상으로 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물 및/또는 독립적으로 화학치료제를 독립적으로 투여함을 포함할 수 있다. 이뮤노머 화합물 및 IL-2의 투여는 동일하거나 상이한 경로일 수 있다.
당업자는 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드, IL-2 또는 둘다의 당해 공동 상승 작용 효과는 본 발명에 따라 치료될 조직, 기관, 특정 질환 또는 환자에 따라 상당히 다양할 수 있음을 인지할 것이다. 추가로, 당업자는 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드 또는 IL-2의 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량이 기타 성분의 양을 미세하게 조정하고 변화시켜 저하되거나 증가될 수 있음을 인지할 것이다.
전신 투여되는 경우, 이뮤노머 화합물은 바람직하게 약 0.0001 마이크로몰 내지 약 10마이크로몰 사이의 이뮤노머 화합물의 혈액 수준을 달성하기에 충분한 투여량으로 투여된다. 국소 투여를 위해서는 이 보다 훨씬 낮은 농도가 효과적일 수 있고 보다 높은 농도가 허용될 수 있다. 바람직하게, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물의 총 투여량은 하루 환자당 약 0.0001mg 내지 하루 체중 kg당 약 200mg의 범위이다. 개체에 1회 치료 에피소드로서 치료학적으로 공동 상승 작용 유효량의 이뮤노머 화합물 또는 IL-2 각각을 동시에 또는 연속적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게, IL-2는 약 750 내지 약 75,000 유니트의 양으로 투여된다.
본 발명은 사이토킨 및/또는 화학치료제 및 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물을 포함하는 키트를 제공하고 여기서 후자는 2개 이상의 올리고누클레오티드가 함께 연결되어 이뮤노머 화합물이 하나 이상의 근접 가능한 5' 말단을 갖도록 2개 이상의 올리고누클레오티드를 포함하고 하나 이상의 올리고누클레오티드는 면역자극 올리고누클레오티드이다. 또 다른 측면에서, 키트는 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 면역자극 올리고누클레오티드 접합체 및/또는 이뮤노머 화합물 또는 이뮤노머 접합체, 사이토킨 및/또는 화학 치료제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 키트는 또한 일반적으로 한 세트의 사용 지침서를 포함한다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 구체예를 설명하고자 하는 것이지, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 면역조절 잔기를 함유하는 올리고누클레오티드의 합성
올리고누클레오티드는 도 5 및 6에 명시된 바와 같은 직렬 합성 또는 병렬 합성에 따라 자동화 DNA 합성기(Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)를 사용하여 1μmol 규모로 합성하였다.
데옥시리보누클레오시드 포스포르아미다이트는 제조원[Applied Biosystems(Foster City, CA)로부터 구입하였다. 1',2'-디데옥시리보스 포스포르아미다이트, 프로필-1-포스포르아미다이트, 2-데옥시우리딘 포스포르아미다이트, 1,3-비스-[5-(4,4-디메톡시트리틸)펜틸아미딜]-2-프로판올 포스포르아미다이트 및 메틸 포스포나미디트를 제조원[Glen Research(Sterling, VA)]으로부터 구입하였다. β-L-2'-데옥시리보누클레오시드 포스포르아미다이트, α-2'-데옥시리보누클레오시드 포스포르아미다이트, 모노-DMT-글리세롤 포스포라미티드 및 디-DMT-글리세롤 포스포르아미다이트를 제조원[ChemGenes(Ashland, MA)]으로부터 구입하였다. (4-아미노부틸)-1,3-프로판디올 포스포르아미다이트를 제조원[Clontech(Palo Alto, CA)]으로부터 구입하였다. 아라비노시티딘 포스포르아미다이트, 아라비노구아노신, 아라비노티미딘 및 아라비노우리딘을 제조원[Reliable Pharmaceutical(St. Louis, MO)]으로부터 구입하였다. 아라비노구아노신 포스포르아미다이트, 아라비노티미딘 포스포르아미다이트 및 아라비노우리딘 포스포르아미다이트를 기관[Hybridon, Inc.(Cambridge, MA)(Noronha et al.(2000)Biochem., 39:7050-7062]으로부터 합성하였다.
모든 누클레오시드 포스포르아미다이트는 31P 및 1H NMR 스펙트럼을 특징으로 하였다. 변형된 누클레오시드가 정상적인 커플링 사이클을 사용하여 특정 부위로 혼입되었다. 합성 후, 올리고누클레오티드를 농축된 수산화암모늄을 사용하여 탈보호시키고 역상 HPLC로 정제한 후, 투석하였다. 나트륨 염 형태로서 정제된 올리고누클레오티드를 사용전에 동결건조시켰다. CGE 및 MALDI-TOF MS를 사용하여 순도를 시험하였다.
실시예 2: 비장 세포 증식의 분석
비장 세포 증식의 시험관내 분석은 이전에 문헌[참조: Zhao et al., Biochem Pharma 51: 173- 182 (1996)]에 기재된 바와 같은 표준 과정을 사용하여 수행하였다. 당해 결과는 도 8A에 나타낸다. 이들 결과는 보다 높은 농도에서 2개의 근접 가능한 5' 말단을 갖는 이뮤노머 6이 어떠한 근접 가능한 5' 말단을 갖지 않는 이뮤노머 5 또는 단일 근접 가능한 5' 말단을 갖는 올리고누클레오티드 4 보다 큰 비장세포 증식을 유도함을 입증한다. 이뮤노머 6은 또한 LPS 양성 대조군보다 큰 비장세포 증식을 유발한다.
실시예 3: 생체내 비종대 분석
시험관내 결과를 생체내 모델로의 응용성을 시험하기 위해, 선택된 올리고누클레오티드를 마우스에 투여하고 비종대 정도를 면역자극 활성 수준의 지시기로서 측정하였다. 단일 용량의 5mg/kg을 BALB/c 마우스(암컷, 4 내지 6주된, Harlan Sprague Dawley Inc, Baltic, CT)의 복강내로 투여하였다. 마우스를 올리고누클레오티드 투여 72시간 후 희생시키고 비장을 수거하고 무게를 재었다. 당해 결과는 도 8B에 나타내었다. 이들 결과는 2개의 근접 가능한 5' 말단을 갖는 이뮤노머 6이 올리누클레오티드 4 및 이뮤노머 5 보다 훨씬 큰 면역자극 효과를 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 4: 사이토킨 분석
척추동물 세포, 바람직하게는 BALB/c 마우스 비장 세포 또는 사람 PBMC에서 IL-12 및 IL-16의 분비는 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 사이토킨 항체 및 사이토킨 표준물을 포함하는 요구되는 시약은 제조원[PharMingen, San Diego, CA]으로부 터 구입하였다. ELISA 플레이트(코스타르)는 4℃에서 밤새 PBSN 완충액(PBS/0.05% 나트륨 아지드, pH 9.6)중에 5㎍/ml에서 적당한 항체로 인큐베이션함에 이어서 30분동안 37℃에서 PBS/1%BSA를 사용하여 차단하였다. 세포 배양 상청액 및 사이토킨 표준물을 PBS/10% FBS로 적절히 희석하고 3중으로 플레이트에 첨가하고 2시간동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 1㎍/ml의 적당한 비오티닐화된 항체로 도포하고 25℃에서 1.5시간동안 인큐베이션하였다. 이어서 당해 플레이트를, PBS-T 완충액(PBS/0/05% 트윈 20)을 사용하여 광범위하게 세척하고 추가로 스트렙트아비딘 접합된 퍼옥시다제(Sigma, St. Louis, MO)를 첨가한 후 1.5시간동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 당해 플레이트를, Sure BlueTM(Kirkegaard and Perry) 발색 시약을 사용하여 발색시키고 정지 용액(Kirkegaard and Perry)을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 색상 변화를 Ceres 900 HDI 분광계(Bio-Tek 장치)로 측정하였다. 당해 결과는 하기 표 5A에 나타낸다.
사람 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)는 피콜-파크 밀도 구배 원심분리(Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO)에 의해 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 분리하였다. 간략하게, 헤파린화된 혈액은 원뿔 원심분리에서 히스토파크-1077(동일 용적)상에 적층시켰고 실온에서 30분동안 400 x g에서 원심분리하였다. 단핵구 세포를 함유하는 혈액 연층(buffy coat)을 주의깊게 제거하고 등장성 인산 완충 식염수(PBS)와 함께 10분동안 250 x g에서 원심분리하여 2회 세척하였다. 수득한 세포 펠렛을 이어서 L-글루타민(Media Tech, Inc., Herndon, VA)을 함유하고 10% 열 불활성화된 FCS 및 페니실린-스트렙토마이신(100U/ml)이 보충된 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다. 세포를 올리고누클레오티드의 존재 또는 부재하에 1 X 106 세포/ml/웰에서 상이한 시간 동안 24웰 플레이트에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 말기에서 상청액을 수거하고 IL-6(BD Pharmingen, San Diego, CA), IL-10(BD Pharmingen), IL-12(BioSource International, Camarillo, CA), IFN-α(BioSource International) 및 -γ(BD Pharmingen) 및 TNF-α(BD Pharmingen)을 포함하는 다양한 사이토킨에 대해 샌드위치 ELISA로 분석될때까지 -70℃에서 동결 저장하였다. 당해 결과는 하기 표 9 및 9A에 나타낸다.
모든 경우에, 세포 배양 상청액에서 IL-12 및 IL-6의 수준은 동일한 실험 조건하에 각각 IL-12 및 IL-6에 대해 작성된 표준 곡선으로부터 계산하였다. 세포 배양 상청액중에 IL-10, IFN-감마 및 TNF-α의 수준은 동일한 실험 조건하에 각각 IL-10, IFN-감마 및 TNF-α에 대해 작성된 표준 곡선으로부터 계산하였다.
표 9. 사람 PBMC 배양중에 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006002609489-PCT00022
D1 및 D2는 공여자 1 및 2이다.
표 9A. BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006002609489-PCT00023
Figure 112006002609489-PCT00024
이택릴체는 포스포디에스테르 연결체를 나타낸다.
Figure 112006002609489-PCT00025
추가로, 도 7A-C에 나타낸 결과는 2개의 근접 가능한 5' 말단을 갖는 이뮤노머 2가, 각각 하나 또는 0개의 근접 가능한 5' 말단을 갖는 올리고누클레오티드 1 또는 이뮤노머 3 보다 낮은 농도에서 IL-12 및 IL-6을 상승시키지만 IL-10을 상승시키지 못한다는 것을 입증한다.
실시예 5: 비-천연 피리미딘 또는 비-천연 푸린 누클레오시드를 함유하는 이뮤노머 화합물의 면역자극 활성
표 10 내지 12에 나타낸 바와 같이, 면역자극 활성은 면역자극 디누클레오티 드 모티프에서 비천연 피리미딘 누클레오시드 또는 비천연 푸린 누클레오시드를 갖는 다양한 길이의 이뮤노머 화합물에서 유지되었다.
표 10. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006002609489-PCT00026
표 11. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006002609489-PCT00027
표 12. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006002609489-PCT00028
실시예 6: 면역자극 활성에 대한 링커의 효과
2개의 올리고누클레오티드를 연결하는 링커 길이의 효과를 조사하기 위해, 동일한 올리고누클레오티드를 함유하지만 상이한 링커를 갖는 이뮤노머 화합물을 합성하였고 면역자극 활성에 대해 시험하였다. 표 13에 나타낸 결과는 링커 길이가 이뮤노머 화합물의 면역자극 활성에 특정 역할을 함을 제안한다. 가장 우수한 면역자극 효과는 포스페이트 전하가 산재하는 C3- 내지 C6-알킬 링커 또는 비염기성 링커를 사용하여 성취하였다.
표 13. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006002609489-PCT00029
실시예 7: 면역자극 활성에 대한 올리고누클레오티드 골격의 효과
일반적으로, 천연 포스포디에스테르 골격을 함유하는 면역자극 올리고누클레오티드는 포스포로티오에이트 골격을 갖는 동일한 길이의 올리고누클레오티드 보다 면역자극성이 적다. 이러한 보다 낮은 정도의 면역자극 활성은 부분적으로 실험 조건하에 포스포디에스테르 올리고누클레오티드가 급속하게 분해되기 때문일 수 있다. 올리고누클레오티드의 분해는 주로 3' 말단으로부터 올리고누클레오티드를 분해하는 3'-엑소뉴클레아제의 결과이다. 본 실시예의 이뮤노머 화합물은 유리된 3' 말단을 함유하지 않는다. 따라서, 포스포디에스테르 골격을 갖는 이뮤노머 화합물이 상응하는 단량체성 올리고누클레오티드 보다 실험 조건하에 보다 긴 반수명을 가져야 하고 따라서 개선된 면역자극 활성을 나타내야만 한다. 표 14에 나타낸 결과는 이러한 효과를 입증하고 이뮤노머 84 및 85는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 사이토킨 유도에 의해 측정된 바와 같이 면역자극 활성을 나타낸다.
표 14. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006002609489-PCT00030
L=C3-링커
실시예 8: 화학치료제와 배합된 이뮤노머 화합물의 생체내 항암 활성
PC3 세포를 100U/ml의 페니실린 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신의 존재하에 10% 소태 혈청(FBS)를 갖는 90% Ham's, F12K 배지에서 배양하여 사람 전립선 암 모델(PC3)을 설정하였다. 4 내지 6주된 수컷 흉선 부재 누드 마우스[Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick , MD]는 연구전에 환경 적응 을 위해 6일 동안 수용되었다. 배양된 PC3 세포를 단층 배양물로부터 수거하고 Ham's F12K 배지(10% FBS)로 2회 세척하고 FBS 부재 Ham's, F12K 배지: 마트리겔 기저 막 매트릭스(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA)(5:1;V/V)중에 재현탁시키고 마우스 각각의 좌측 서혜부 영역에 피하 주사(5 x 106 세포, 총 용적 0.2ml)하였다. 일반적인 임상적 관찰, 체중 및 종양 성장에 의해 동물을 모니터하였다. 종양 성장은 이식체의 2개의 수직의 직경을 캘리퍼스로 측정하여 모니터하였다. 종양 질량(그램 무게)을 방정식 1/2a X b2(여기서, a는 긴 직경(cm)이고 b는 짧은 직경(cm)이다)으로 계산하였다. 평균 종양 크기가 약 80mg에 도달하는 경우, 사람 암 이종이식체를 갖는 동물은 무작위로 처리군 및 대조군(그룹당 5마리)으로 나누었다. 대조군에는 단지 멸균 생리 식염수(0.9% NaCl)를 투여하였다. 생리학적 식염수에 무균적으로 용해된 이뮤노머 26 또는 194를 0.5 또는 1.0mg/kg/일로 주당 3회 피하 주사하여 투여하였다. 젬시타빈 HCl(Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN)을 0일째 및 3일째에 160mg/kg으로 복강내 주사하여 2회 투여하였다. 상세한 처리 스케줄은 다음과 같이 나타낸다.
G1: 염수
G2: 젬시타빈(160mg/kg/일, IP, 0일째 및 3일째)
G3: 26(1.0mg/kg/일, SC, 6주동안 주당 3회)
G4: 26(0.5mg/kg/일, SC, 6주동안 주당 3회)
G5: 194(1.0mg/kg/일, SC, 6주동안 주당 3회)
G6: 194(0.5mg/kg/일, SC, 6주동안 주당 3회)
G7: 26(0.5mg/kg/일, SC, 6주동안 주당 3회) + 젬시타빈(160mg/kg/일, 0일 및 3일째)
G8: 194(0.5mg/kg/일, SC, 6주동안 주당 3회) + 젬시타빈(160mg/kg/일, 0일 및 3일째)
다양한 처리 후 종양 측정은 표 15 및 도 13에 제공된다. 모든 이뮤노머 26 및 194 처리된 동물에서 종양 성장은 식염수 대조군과 비교하여 명백하게 억제되었다(p < 0.5). 이들 처리 군에는 용량-반응 관계의 경향이 있다(도 13). 26과 194간에는 어떠한 상당한 차이가 없다(표 15).
표 15. 26, 194, 젬시타빈의 처리 또는 배합 치료 후 종양 함유 마우스의 종양 질량
Figure 112006002609489-PCT00031
Figure 112006002609489-PCT00032
다양한 시간에서 처리 후 체중 측정은 표 16 및 도 14에 제공된다. 대조군 과 비교하여 26 또는 194 단독에 의한 체중 증가에는 어떠한 상당한 차이가 없다. 젬시타빈 처리된 동물은 첫주에 체중감량되고 1주 후에 회복하였다. 26 또는 194와의 배합은 젬시타빈의 부작용 프로필을 변화시키지 않았다. 어떠한 다른 임상적 이상 또는 죽음은 모든 그룹에서 관찰되지 않았다.
표 16. 26, 194 또는 식염수의 처리 후 종양 함유 세포의 체중
Figure 112006002609489-PCT00033
요약하여, 26 및 194는 어떠한 상당한 부작용 없이 사람 전립선 암 PC3 이종이식체 함유 누드 마우스에서 종양 성장을 상당히 억제하였다. 26 또는 194가 젬시타빈과 배합하여 투여되는 경우, 각각의 화합물은 부작용 프로필의 변화 없이 젬시타빈의 치료 효과를 상당히 증가시켰다. 추가로, 26 또는 194 처리에는 용량 의존적으로 반응하는 경향이 있었다.
실시예 9 화학치료제와 배합된 이뮤노머 화합물의 생체내 항암 활성
실시예 8의 실험은 젬시타빈 대신 탁소테레를 사용하여 반복하였다. 탁소테 레는 0일째 및 7일째에 투여하였다. 165는 주당 5일 투여하였다. 26 및 194는 0, 2, 4, 7, 9 및 11일째에 투여하였다. 당해 결과는 하기 표 17에 나타낸다. 이들 결과는 명백하게 이뮤노머 화합물과 탁소테레간의 공동 상승 작용을 입증한다.
표 17. 기타 화학치료제와 배합된 이뮤노머 화합물의 생체내 항암 활성
Figure 112006002609489-PCT00034
실시예 10 면역자극 올리고누클레오티드 및 IL-2의 투여
비장세포를 상기된 바와 같이 BALB/c 마우스로부터 분리하고 5 x 106 세포/ml의 밀도로 24웰 접시에 분주하였다. CpG 올리고누클레오티드를 TE 완충액(10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)중에 용해시키고 최종 농도가 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 또는 10.0㎍/ml이 되도록 마우스 비장 세포 배양물에 첨가하였다. CpG 올리고누클레오티드 유도된 시간 의존적 사이토킨 분비에서 IL-2의 역할을 연구하기 위해, 재조합 사람 IL-2(Sigma)를 실험 개시점에서 10U/ml의 농도로 첨가하였다. 이어서 세포를 시험 올리고누클레오티드의 존재하에 4, 8, 24 및 48시간동안 37℃에서 인큐베이션하고 상청액을 ELISA 분석을 위해 수거하였다. 비처리된 세포(단지 IL-2 첨가)를 대조군으로서 사용하였다.
마우스 IL-12, IL-6 및 IFN-γ의 분비는 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 사이토킨 항체 및 표준물을 포함하는 요구되는 시약은 제조원[PharMingen]으로부터 구입하였다. ELISA 플레이트(Costar)는 4℃에서 밤새 PBSN(PBS/0.05% 나트륨 아지드, pH 9.6) 완충액중에서 적당한 포획 항체와 인큐베이션함에 이어서 37℃에서 30분동안 PBS/1% BSA로 차단하였다. 세포 배양 상청액 및 사이토킨 표준물을 적당하게 PBS/1% BSA로 희석하고 플레이트에 3중으로 첨가하고 2시간동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 적당한 비오티닐화된 항체와 인큐베이션하고 1.5시간동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 당해 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 광범위하게 세척하고 이어서 추가로 스트렙트아비딘 접합된 퍼옥시다제(Sigma)를 첨가한 후 1.5시간동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 Sure BlueTM(Kirkegaard and Perry) 발색 시약으로 발색시키고 정지 용액(Kirkegaard and Perry)을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 색상 변화를 450nm에서 Ceres 900 HDI 분광계(Bio-Tek 장치)로 측정하였다. 세포 배양 상청액에서 IL-12, IL6 및 IFN-γ의 수준은 동일한 실험 조건하에 각각 IL-12, IL-6 및 IFN-γ에 대해 작성된 표준 곡선으로부터 계산하였다.
당해 연구에 사용되는 올리고누클레오티드는 표 18에 제공한다.
표 18.
Figure 112006002609489-PCT00035
당해 결과는 도 15 내지 19에 나타낸다. 서열번호 86 내지 90을 단독으로 사용하여 단지 무시할정도로 IFN-γ 생산을 자극한다는 것을 시사하는 분석은 나타나지 않는다. 당해 결과는 IL-6, IL-12 및 IFN-γ의 분비를 생성시키는데 서열번 호 86 내지 90과 IL-2간의 공동 상승 작용을 입증한다.
등가물
이전의 발명은 명백하고 이해를 목적으로 약간 상세하게 기재되었지만 당업자는 본원에 기재된 내용으로부터 형태 및 세부적으로 다양한 변화가 본 발명 및 첨부된 청구항의 진정한 범위로부터 벗어나지 않으면서 만들어 질 수 있다는 것을 인지할 것이다.

Claims (18)

  1. 종양을 갖는 포유동물에게 면역자극 올리고누클레오티드 또는 이뮤노머 화합물을 투여하고 동물을 이온화 방사선으로 처리하는 것을 포함하여, 포유동물의 암을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, γ방사선이 1.56Gy/분으로 조사되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 방사선이 1주일에 2회, 1주일에 4회 또는 2일, 4일 및 9일째에 3회 3Gy 방사선으로서 조사되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 포유동물이 γ-방사선 조사 약 2 내지 약 6시간 전에 면역자극 올리고누클레오티드 또는 이뮤노머 화합물로 전처리되는 방법.
  5. 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 하나 이상의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드 및 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2를 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  6. 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 하나 이상의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 누클레오티드 및 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2의 배합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 당해 배합물의 투여가 사이토킨의 생산을 공동 상승 작용적으로 자극시켜, 환자의 면역 반응을 자극시키는 방법.
  7. 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 하나 이상의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드 및 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2의 배합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 당해 배합물의 투여가 IL-12 및 IFN-γ, IFN-α, IFN-β 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토킨의 생산을 공동 상승 작용적으로 자극시켜, 환자의 면역 반응을 자극시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 이뮤노머 화합물이 하기 화학식의 구조를 갖는 방법:
    Figure 112006002609489-PCT00036
  9. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항원을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 항원이 암, 감염성 질환 또는 알레르기와 관련된 항원인 방법.
  11. 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 하나 이상의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드 및 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2를 포함하며, IL-12 및 IFN-γ, IFN-α, IFN-β 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토킨의 생산을 공동 상승 작용적으로 자극시키는 조성물.
  12. 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 하나 이상의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드 및 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2를 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 당해 조성물의 투여가 IL-12 및 IFN-γ, IFN-α, IFN-β 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토킨의 생산을 공동 상승 작용적으로 자극시켜, 환자의 암을 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 암과 관련된 항원을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 하나 이상의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드 및 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2를 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 당해 조성물의 투여가 IL-12 및 IFN-γ, IFN-α, IFN-β 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토킨의 생산을 공동 상승 작용적으로 자극시켜, 환자의 알레르기를 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 알레르기와 관련된 항원을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 하나 이상의 이뮤노머 화합물 또는 면역자극 올리고누클레오티드 및 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2를 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 당해 조성물의 투여가 IL-12 및 IFN-γ, IFN-α, IFN-β 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토킨의 생산을 공동 상승 작용적으로 자극시켜, 감염성 질환을 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 감염성 질환과 관련된 항원을 투여하는 것을 추가로 포함 하는 방법.
  18. 하나 이상의 면역자극 CpG 디누클레오티드(여기서, C는 사이토신 또는 데옥시사이토신이 아니고/아니거나 G는 구아노신 또는 2-데옥시구아노신이 아님)를 포함하는 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 면역자극 올리고누클레오티드 및 치료학적으로 공동 상승 작용을 하는 유효량의 IL-2를 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자의 면역반응을 자극시키는 방법.
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