CN113219114A - 一种河豚毒素的快速高效纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从河豚内脏组织中，快捷高效地提取和纯化河豚毒素方法。该方法在提取过程使用超声结合有机溶剂和滤膜去除杂质，利用河豚毒素抗体的特异性和磁珠的磁分离特性，实现快速高效地纯化河豚毒素。洗脱液透析后冷冻干燥，可获得90%以上纯度河豚毒素干粉。使用本发明的方法，可以在一个小时内完成吸附和洗脱过程，纯化过程步骤少、操作简单，解决了目前河豚毒素提取步骤繁琐、效率低、需要昂贵设备问题，可降低成本和环境污染。

Description

一种河豚毒素的快速高效纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种化学物质的提取纯化领域，尤其涉及一种可以快捷、高效地从河豚内脏组织中纯化河豚毒素的方法。

背景技术

河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）是一种非蛋白类神经毒素，存在于河豚和其他生物体内，是一种笼形结构的原酸酯类生物碱。毒性极强，通过选择性阻断 Na + 通道的机理，对中毒者造成神经和肢体麻痹，严重者可致呼吸停止甚至死亡。TTX 主要存在于河豚内脏、卵巢、血液和眼睛等部位，卵巢和肝脏中的 TTX 含量最高，肠道和皮肤次之，肌肉低毒或无毒。

传统的 TTX 制备以河豚内脏为原料，样品在酸性条件下提取，通过多种层析柱去除杂质，经多次重结晶和浓缩步骤获取高纯度的产品。

TTX的提取一般分为两步, 即提取步骤：从河豚鱼组织中提取河豚毒素粗品，和纯化精制步骤：从河豚毒素粗品中精制高纯度河豚毒素。TTX粗提液的纯化精制工艺一般采用沉淀离心法去除杂蛋白，然后用活性炭或吸附树脂去除杂质，最后再通过各类层析柱进行纯化，结晶精制后得到高纯度TTX。

公开发明专利CN 104311569A使用匀浆、透析、反相十弱阴离子层析吸附除去杂质、弱阳离子交换浓缩纯化河豚毒素，然后冷冻干燥获得纯度河豚毒素干粉，但该方法所制备TTX纯度较低为80%，且操作繁琐耗时长。

公开发明专利CN101891751B采用氨基酸作助溶剂增加TTX在水中的溶解性，提供了一种生产纯度较高、杂质较少河豚毒素的方法，但该方法存在制备周期长、不适用于大规模产业化生产等缺陷。

公开发明专利CN107441128A在常规乙酸法获得粗提液后，增加脱脂/活性炭脱色和大孔吸附剂纯化步骤，再进行微滤/超滤和纳滤处理制备TTX粗品，最后进行结晶精制获得纯度>97%的TTX。该方法虽然产率高纯度高，但存在操作步骤繁琐/耗时长缺陷。

上述这些提取和纯化TTX方法都包含很多步骤，例如醋酸提取液的脱脂和过滤、离子交换树脂或活性炭吸附/沉淀结晶等等。从河豚组织样品中提取TTX是一个缓慢的过程，随着步骤的增加和工艺的重复处理，往往伴有TTX的大量损失和失活。TTX在强酸性和强碱性条件下的水相中非常不稳定，LC/MS/MS分析发现TTX在弱酸性条件下处理8小时也会失去5-30%的活性。

综上所述，尽管提取、提纯河豚毒素的方法很多，但这些方法都存在着一定的缺陷，如活性炭吸附、高效液相法存在设备昂贵、技术要求高、步骤繁琐等问题。因此，现有的TTX分离纯化技术还有待进一步发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快捷、高效地提取和纯化TTX方法，其可在简单地实验条件下，不需要昂贵设备，高效率地分离纯化河豚内脏组织中的TTX，解决当前TTX提取工艺复杂、成本高、操作繁琐耗时长问题。本发明技术方案包括以下步骤：

（1）称取绞碎的河豚卵巢组织，加入0.5~2.5%乙酸水溶液和有机溶剂混匀后超声5~10min。以8000~10000rpm/min转速离心，用注射器抽取水相溶液收集于离心管中，加入等体积有机溶剂混匀后再次离心，抽取水相溶液过0.45nm滤膜回收滤液，得到TTX提取液。

（2）TTX提取液中加入1mg免疫磁珠，混合反应5~20min，用磁力架吸附磁珠，加入等体积PBS洗涤2次，再加入等体积NaCl溶液洗涤2次。

（3）加入等体积洗脱液室温反应2~10min，回收洗脱液，重复洗脱2~3次。

（4）将回收的洗脱液用纯水透析，冷冻干燥制备冻干粉。

所述的步骤1中有机溶剂，优选己烷和甲醇溶液。

所述步骤2中的免疫磁珠，为偶联了鼠系TTX特异性单抗的磁珠。即磁珠1mg，用MEST洗涤3次后，加入EDC和NHS（W：W，1:5），在500 µL MEST溶液中反应30~60min。用BST溶液洗涤磁珠2~3次，加入TTX特异性抗体（80~150µg）反应2~4小时；用BST洗涤3次后，加入含有0.5~3% BSA的BST溶液500µL反应30~60min，洗涤后保存于4℃冰箱中。

所诉的步骤3中的洗脱液，优选含有NaCl的Tris-HCl溶液。作为优选，所述的NaCl浓度为0.1~0.7M，pH为7~8。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1）充分利用了磁珠的快速磁分离特性，以及TTX与其单克隆抗体间的特异性结合特性，只需要一个磁分离架就可以实现TTX的特异性捕捉，不需要大量试剂，节省了成本，方便操作者使用。

2）利用免疫磁珠悬浮液可以充分和提取液中的TTX接触特性，大幅度提高了免疫磁珠对TTX的捕捉能力，从而有效地提高了TTX的纯化效率。

3）经免疫磁珠特异性吸附捕获的TTX，只需要加入洗脱液，经透析和冷冻干燥即可获得纯度较高的TTX。本发明方法操作简便，步骤少，后续不同做其它处理就可以直接用于高效液相色谱检测，节省了操作者的时间和费用。

附图说明

图1为本发明方法纯化的TTX高效液相色谱图

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1：河豚毒素的提取

将5g河豚鱼卵巢组织捣碎、匀浆，加入50ml的2%醋酸和己烷等体积混合溶液，混合均匀后在超声15分钟，8000rpm/min离心15分钟。抽取水相溶液收集于离心管中，加入等体积的己烷溶液混匀后再次离心，抽取水相溶液，用0.45nm滤膜回收滤液，得到TTX提取液。

实施例2：免疫磁珠的制备

本发明制备免疫磁珠的一个优选实施方案如下：取磁珠5mg，用MEST缓冲液洗涤3次后，加入EDC和NHS（W/W，1:5），在500 µL MEST溶液中反应40min。用BST溶液洗涤磁珠2次，加入500µg TTX特异性抗体反应2小时；用BST洗涤3次后，加入含有1% BSA的BST溶液500µL反应30min，洗涤后保存于4℃冰箱中。

实施例3：免疫磁珠吸附和纯化提取液中的河豚毒素

卵巢的TTX提取液解冻后用PBS稀释5倍，加入2mg免疫磁珠混合均匀，20度反应5min，将反应管置于磁分离架或者磁铁上，弃上清，加入PBS溶液洗涤3次，加入0.1M NaCl溶液洗涤2次，加入1M含有 0.6M NaCl的Tris-HCl溶液，pH7.5 ，20度反应5min，用磁分离架回收上清溶液，重复操作2次，合并回收的上清溶液，-20℃冷冻保存。

Claims (4)

1.一种河豚毒素的快速高效纯化的方法，其特征在于如下方面：

1）将河豚鱼卵巢组织捣碎、匀浆，加入0.5~2.5％乙酸水溶液和有机溶剂混匀后超声5~10min，以8000~10000rpm/min转速离心，用注射器抽取水相溶液收集于离心管中，加入等体积有机溶剂混匀后再次离心，抽取水相溶液，过0.45nm滤膜回收滤液，得到TTX提取液。

2）将得到的TTX提取液中加入1mg免疫磁珠，混合反应5~20min，用磁力架吸附磁珠，加入等体积PBS洗涤2次，再加入等体积NaCl溶液洗涤2次。

3）加入等体积洗脱液室温反应2~10min，回收洗脱液，重复洗脱2~3次。

4）将回收的洗脱液用池水透析，冷冻干燥制备冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种河豚毒素的快速高效纯化的方法，其特征在于：步骤一中，所述的有机溶剂为己烷和甲醇溶液。

3.根据权利要求1所述的一种河豚毒素的快速高效纯化的方法，其特征在于：步骤二中，所述的免疫磁珠，为偶联了鼠系TTX特异性单抗的磁珠。即磁珠1mg，用MEST洗涤3次后，加入EDC和NHS（W：W，1:5），在500 µL MEST溶液中反应30~60min。用BST溶液洗涤磁珠2~3次，加入TTX特异性抗体（80~150µg）反应2~4小时；用BST洗涤3次后，加入含有0.5~3% BSA的BST溶液500µL反应30~60min，洗涤后保存于4℃冰箱中，制成免疫磁珠。

4.根据权利要求1所述的要走红河豚毒素的快速高效纯化方法，其特征在于：步骤三中，所述的洗脱液为含有NaCl的Tris-HCl溶液，NaCl浓度为0.1~0.7M，pH为7~8。

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