JPH11290071A - 抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ - Google Patents
抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマInfo
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- JPH11290071A JPH11290071A JP10101134A JP10113498A JPH11290071A JP H11290071 A JPH11290071 A JP H11290071A JP 10101134 A JP10101134 A JP 10101134A JP 10113498 A JP10113498 A JP 10113498A JP H11290071 A JPH11290071 A JP H11290071A
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Abstract
配糖体であるジンセノサイドRb1(GRb1)に対する
モノクローナル抗体およびそれを生産するハイブリドー
マ。このモノクロナール抗体を用いて各種人参のGRb
1を簡便に定量できる。
Description
糖体であるジンセノサイドRb1(GRb1)に対するモ
ノクローナル抗体(MAb)を産生するハイブリドーマお
よびそのMAbに関する。
ンの報告(Nature, 495-497頁、1975年)以来急速に発展
した。哺乳動物の脾臓細胞と癌細胞であるミエローマ細
胞を融合させた雑種細胞をハイブリドーマと称する。ハ
イブリドーマは用いた脾臓細胞が抗体産生能を有するこ
とから、多くの蛋白質やペプチド、ポリサッカライド、
糖蛋白の様な高分子化合物に対するMAbの生産に用い
られてきた。しかし、人参の配糖体は低分子のため通常
抗原とはなりえないので、それに対するMAbは作成さ
れていない。ジンセノサイドRb1(GRb1)(表−2
の構造式参照)は有用な薬理活性を有する人参の主要な
配糖体であり、医薬品としての候補化合物と目されてい
る物質である。しかしながら、人参中のGRb1の含有
量は少なく、その検出は容易ではない。ましてや漢方薬
中の含有量を精査するためには前処理等に多大な労力を
要する。このため前処理を必要とせず、再現性があり、
かつ高感度な評価方法が熱望されているが、未だ満足で
きる方法は見出されていない。
問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、GRb1に
対するMAbを用いることにより、人参中のジンセノサ
イド類を前処理を必要とせず高感度で再現性良く検出で
きることを見出し本発明を完成したものである。すなわ
ち、抗GRb1MAbを生産する脾臓細胞とミエローマ
細胞をポリエチレングリコールで細胞融合により、GR
b1に対するMAbを産生するハイブリドーマを作成
し、このハイブリドーマを培養することによって抗GR
b1MAbを大量に生産することができる。本抗体を用
いることによって高感度、再現性良好な、かつ前処理を
必要としない評価系を提供することが可能となった。
するハイブリドーマは以下の様にして作成することがで
きる。 (1) 抗原としてGRb1−BSA抱合体を作成し、こ
れで免疫した動物の抗体産生脾臓細胞を作成する。 (2) ミエローマ細胞を培養増殖し、調整する。 (3) 上記2種の細胞をポリエチレングリコールを媒体
として融合する。 (4) 得られたハイブリドーマをHAT培地にて選抜す
る。 (5) 抗GRb1MAb産生ハイブリドーマを選抜す
る。 (6) 選抜ハイブリドーマをクローニングする。 (7) 上記の抗体産生ハイブリドーマを培養して抗GR
b1MAbを得る。 以下これらの工程について、詳細に説明する。
し、ウシ血清アルブミン(BSA)を添加して、GRb1
−BSA抱合体(conjugate)を得る。このGR
b1−BSA抱合体で動物を免疫する。免疫法としては
フロイントのコンプリートアジュバンドを併用する手法
がとられる。動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モ
ルモット、ヒツジなどが例示される。抗体産生細胞とし
ては脾臓、リンパ節、抹消血液等から分離した細胞が使
用される。 (b) 骨髄腫細胞(ミエローマ細胞)の調整 細胞融合に使用するミエローマ細胞は特に限定されず、
各種の哺乳動物の細胞株が利用可能であるが、抗体産生
細胞の調整に用いた動物と同種の細胞株を使用するのが
好ましい。用いる細胞株は細胞融合の後に、未融合のミ
エローマ細胞が選択培地で生存できず、融合細胞である
ハイブリドーマのみが増殖可能なようにすることによっ
て、未融合細胞と融合細胞を選別することを考慮して、
特定の薬剤抵抗性を有するものが好ましい。例えば8−
アザグアニン抵抗性の細胞は、HAT培地中で生育でき
ない性質を有するため好ましい。具体的には、マウスミ
エローマ細胞株、PAI, P3−X63−Ag8,
P3−X63−Ag8−UI, P3−NSI/1−A
g4−1, X63−Ag8−6.5.3., SP2
/0−Ag14, FO, S194/5XXO, B
U.1, MPC11−45.6.,TG.1.7等が
用いられる。
DM培地等の培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞
を混合(混合比は通常1:4〜1:10)することにより
行われる。融合促進剤としては平均分子量1,000〜
6,000のポリエチレングリコール(PEG)が使用で
きる。PEGの使用濃度は通常30〜50%である。 (d) ハイブリドーマの選択的増殖 融合を終えた細胞は、10%FeS含有IMDM培地など
で適当に希釈し、遠心分離する。沈査を選択培地(例え
ばHAT培地)で浮遊し、96穴ウエルマイクロプレー
トに接種した後に、5%炭酸ガス培養装置で培養する。
選択培地で生育してくる細部はハイブリドーマである。 (e) 抗体産生ハイブリドーマの検索 抗体産生ハイブリドーマの検索は常法に従えばよく、特
に限定されない。例えばハイブリドーマの増殖した培養
液を採取し、GRb1−HSA(ヒト血清アルブミン)と
反応させ、酵素、蛍光物質、発光物質などでラベルした
2次抗体との反応により検索できる。
ル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行
い、MAb産生ハイブリドーマを得る。以上の操作によ
り抗GRb1MAb産生ハイブリドーマ9G7、9G
9、9G100、および9G80を得た。これらのハイ
ブリドーマはそれぞれGRb1に対する特異的なMAb
を産生する新規な細胞である。
ることにより、その培養上清から本発明のMAbが得ら
れる。大量に生産する方法としてはミエローマ細胞由来
動物と同種の動物にプリスタン等の鉱物油を腹腔内投与
後、ハイブリドーマを接種する。接種後、腹水を採取
し、通常の抗体分離操作により抗GRb1MAbを得
る。また、無血清培地で培養し、通常の手法で抗GRb
1MAbを得る。
タロニイ(Ouchterlony)法などの通常の方法
で測定し、IgG2bクラスのIgGでκ軽鎖を有する
ことが判明した。 また、分子量をシナピン酸をマトリ
ックスとする方法によりマルデイトフマス(matri
x−assisted laserdesorptio
n/ionization mass spectro
metry)にて測定し、148,600と決定した。
ノール0.7mlに溶かした溶液を、4mgの過ヨウ素
酸ナトリウムを水0.5mlに溶かした溶液に撹拌しな
がら添加する。1時間反応後、BSAを溶かした炭酸塩
バッファーを上記反応液に添加して、5時間撹拌反応す
る。反応後透析して17mgのGRb1−BSA抱合体
を得た。GRb1−HSA抱合体も同様にして得た。 (2) 抗原中のハプテン数の検討: 得られたGRb1
−BSA抱合体の微量をとり、過剰のアジピン酸を添加
して混合する。混合物の小量をカセットのウエルに入
れ、マルデイトフマスにて測定する。 (3) 免疫脾臓細胞の調整:GRb1−BSA抱合体5
0μgをフロイント−コンプリート−アジュバントに乳
濁化させ、BALB/C系マウスの腹腔内に投与した。
以後、2週間の間隔で50μgのGRb1−BSA抱合
体アジュバント溶液を2回同様に投与し、最後にGRb
1−BSA抱合体のみを100μg投与し免疫を完了し
た。3日後にマウスを麻酔下屠殺し、脾臓を摘出した。
脾臓を細断した後、100メッシュのナイロン網でろ過
し、脾臓の単離細胞を得た。
疫脾臓細胞に低張液(155mM塩化アンモニウム)を加
えて赤血球を溶血した後、Iscove's Modified Dulbecc
o'sMedium (IMDM)で細胞を3回洗う。マウスミエロ
ーマ細胞もIMDMで3回洗浄した。両細胞数を計測し
脾臓細胞と骨髄腫細胞を10:1の割合として遠心をす
る。上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほぐし、ポリ
エチレングリコール(PEG)4000を培地で希釈した
45%液を0.5ml滴下して融合を行った。37℃、
30秒間静置した後、IMDM(1ml)を1分間かけて
添加した。引き続き10mlを5分間かけて添加した。
1,000rpmで10分間遠心した。沈殿を10%Fe
S添加IMDMにより洗い、遠心して上清を捨てた。ヒ
ポキサンチン10-4M、アミノプテリン4x10-7Mお
よびチミジン1.5x10-5Mを加えた(HAT−)10
%FeS添加IMDMを用いて沈殿を再び浮遊させ、96
ウエルマイクロプレートに100μlずつ分注した。3
日毎に同一培地を50μl追加し、細胞の増殖を確認し
た。
イブリドーマが増殖したウエルの液を採取し、GRb1
−HSA抱合体を結合させた別のウエルに添加し、直接
ELISA(enzyme−linked immun
osorbent assay)によりGRb1に対す
るMAb産生ハイブリドーマを検索した。すなわち、9
6ウエルマイクロプレートにGRb1−HSA抱合体
0.1μg/100μl/ウエルを分注し、25℃で5
時間インキュベートしてウエルに吸着させた。このウエ
ルに培養上清を100μlずつ分注し抗原抗体反応を行
った。0.05%ツイーン20含有リン酸緩衝食塩水(T
−PBS)で3回洗浄した。パーオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウスIgG抗体1,000倍希釈液をウエルあたり
100μl添加し、1時間後にT−PBSで洗浄した。
0.003%過酸化水素、ABTS(2,2’−azin
o−bis(3−ethylbenzothiazol
ine−6−sulfonic acid)diamm
onium salt) 0.3mg/ml含有クエン酸
緩衝液を添加して発色させた。20分後プレートリーダ
ーを用いて405nmの波長で吸光度を測定した。発色
したウエルの細胞を採取した。 (6) 抗GRb1MAb産生ハイブリドーマのクローニ
ング:抗体産生ハイブリドーマを限界希釈してウエルに
分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖したハイブリド
ーマを同様に3回クローニングしてクローンを得た。 (7) 抗GRb1MAbの調整:上記の抗体産生ハイブ
リドーマを無血清培地(10μg/mlインスリン、3
5μg/mlトランスフェリン、20μMエタノールア
ミン、25nMセレニューム添加eRDF培地)で37
℃、炭酸ガス培養器で培養した。上清をプロテインGF
Fカラムを用いて精製した。すなわち、上清をトリス緩
衝液でpH7に調整し、カラムに付す。カラムを10m
Mリン酸緩衝液で洗浄後、吸着している抗体を100m
Mクエン酸緩衝液で溶出する。得られた抗体溶液はPB
S(リン酸緩衝液)に対して3回透析し、最後に凍結乾燥
して精製抗体をえた。
り、アジピン酸を添加し混合する。この混合物をマルデ
イトフマスにて測定し、純度を確認した。(図1) (9) 競合的ELISAによる定量:GRb1−HSA
抱合体溶液(1μ/ml)を100μlずつウエルに添加
し1時間反応し吸着させる。比特異的結合を除去するた
めにスキンミルク添加PBS溶液300μlを加え1時
間反応してブロッキングする。50μlの各種濃度のG
Rb120%メタノール溶液を加え、さらに抗GRb1
MAb溶液(0.418μg/ml)50μlを添加して1
時間インキュベートした。T−PBSで3回洗浄し、1
000倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウス抗体1
00μlを加え1時間反応した。1時間後にT−PBS
で洗浄した。0.003%過酸化水素、ABTS0.3m
g/ml含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。1
5分後に発色を405nmで測定。各濃度のGRb1の
吸光度から検量線を作成した。(図2)
ドRc、ジンセノサイドRd、ジンセノサイドRe、ジ
ンセノサイドRg1(表−2参照)等の人参固有のダンマ
ラン配糖体類、およびグリチルリチン、ヂギトキシン、
チクセツサポニン等ダンマラン骨格以外のアグリコンを
持つサポニンを測定した。表−1に見られる通り、GR
b1に特異的に親和性を持つ抗体であることが明らかと
なった。その他の成分には殆ど交差反応性を示さなかっ
た。 (11) 各種人参のGRb1含有量:各種人参の粉末1
0mgをメタノール1mlで5回抽出する。抽出液を合
わせて遠心にかける。上清を20%メタノールで適切な
濃度に希釈して実施例の(9)に準じて定量する。結果を
表−3に示す。 (12) 表4に示すような人参配合漢方薬と人参を含ま
ない漢方薬のエキス剤を各10mgとり、20%メタノ
ールを加え不溶物を遠心にて除去し、セッパックプレカ
ラムに付し実施例の(9)に準じて定量した。
ELISAに用いることにより、再現性が高く、高感
度、かつ前処理が不要な定量が可能となり、各種の人
参、各種人参の各器官、人参含有漢方処方等のGRb1
含有量を簡便に定量することができる。また、本法を応
用することにより多大な植物を短期間に精査することが
可能である。
ディマススペクトルである。
る。
Claims (3)
- 【請求項1】 ジンセノサイドRb1に対するモノクロ
ーナル抗体であって、下記の特性を有する抗体を産生す
るハイブリドーマ。 (1) 分子量148,600 (2) IgG2bクラスのIgG (3) κ軽鎖保有 - 【請求項2】 ジンセノサイドRb1に対するモノクロ
ーナル抗体であって、下記の特性を有する抗体。 (1) 分子量148,600 (2) IgG2bクラスのIgG (3) κ軽鎖保有 - 【請求項3】 薬用人参の主要な配糖体であるジンセノ
サイドRb1で免疫した動物脾臓細胞とミエローマ細胞
により抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを作成するに際し、抗原として過ヨウ素
酸ナトリウムで処理したジンセノサイドRb1とウシ血
清アルブミンとの抱合体を用いることを特徴とする該ハ
イブリドーマの作成法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10101134A JPH11290071A (ja) | 1998-04-13 | 1998-04-13 | 抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10101134A JPH11290071A (ja) | 1998-04-13 | 1998-04-13 | 抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11290071A true JPH11290071A (ja) | 1999-10-26 |
Family
ID=14292618
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10101134A Pending JPH11290071A (ja) | 1998-04-13 | 1998-04-13 | 抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH11290071A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002069100A (ja) * | 2000-08-29 | 2002-03-08 | Sangaku Renkei Kiko Kyushu:Kk | 抗ジンセノシドRg1モノクローナル抗体 |
-
1998
- 1998-04-13 JP JP10101134A patent/JPH11290071A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002069100A (ja) * | 2000-08-29 | 2002-03-08 | Sangaku Renkei Kiko Kyushu:Kk | 抗ジンセノシドRg1モノクローナル抗体 |
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