JP2763787B2 - 不均質免疫定量法 - Google Patents
不均質免疫定量法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は、免疫定量において従来技術より一層便利
な方法で効果を発揮する免疫定量技術と試薬の提供方法
に関する。より詳細には、タブレット形状の一定試薬の
提供と非結合標識反応体の固相からの放出を助けるため
の希釈液の使用に関する。更に詳細には、上澄み液から
の固相反応体の迅速分離を助長するためにタブレット状
の試薬を使用し、標識物の吸光度測定を行う非結合標識
反応体の固相からの遊離を助長するためにトリス緩衝液
が好適である希釈液を使用する、免疫定量法に関する。
な方法で効果を発揮する免疫定量技術と試薬の提供方法
に関する。より詳細には、タブレット形状の一定試薬の
提供と非結合標識反応体の固相からの放出を助けるため
の希釈液の使用に関する。更に詳細には、上澄み液から
の固相反応体の迅速分離を助長するためにタブレット状
の試薬を使用し、標識物の吸光度測定を行う非結合標識
反応体の固相からの遊離を助長するためにトリス緩衝液
が好適である希釈液を使用する、免疫定量法に関する。
従来技術 不均質免疫定量法は、最も多方面な免疫定量技術に基
づいており、最高感度範囲ならびに臨床試験のための最
大範囲の分析物寸法に適合する。
づいており、最高感度範囲ならびに臨床試験のための最
大範囲の分析物寸法に適合する。
EMIT技術のような他の技術または蛍光偏光技術は、試
験方法を自動化システムで容易に使用する可能性を示し
ている。これらのいわゆる均質技法は、不均質技法と異
なり、感度および分析物寸法において制限される。不均
質技法は現在は固相分離手順を用いている。固相は、大
寸ビードまたは管のような硬質プラスチック成分か或は
寒天ゲルのような粒子担体のいずれかであり抗体または
抗原類似体と共有結合している。この固相は、抗原抗体
反応の結果生じる二つのフラクション、即ち、〈自由〉
フラクションと〈結合〉フラクションの分離のために用
いられる。
験方法を自動化システムで容易に使用する可能性を示し
ている。これらのいわゆる均質技法は、不均質技法と異
なり、感度および分析物寸法において制限される。不均
質技法は現在は固相分離手順を用いている。固相は、大
寸ビードまたは管のような硬質プラスチック成分か或は
寒天ゲルのような粒子担体のいずれかであり抗体または
抗原類似体と共有結合している。この固相は、抗原抗体
反応の結果生じる二つのフラクション、即ち、〈自由〉
フラクションと〈結合〉フラクションの分離のために用
いられる。
現行のほとんどの不均質方法は、ELISA（エライサ
ー）技術のように酵素標識を用いており、多回の試薬添
加と多回の洗浄ステップを含んでいる。これは、煩雑で
労力を要する。
ー）技術のように酵素標識を用いており、多回の試薬添
加と多回の洗浄ステップを含んでいる。これは、煩雑で
労力を要する。
不均質方法を簡素化するために、前記技術は、同一手
順で小量および大量分析物に適用できる方法を採用して
いる。
順で小量および大量分析物に適用できる方法を採用して
いる。
大分析物の場合、選択される技法は、“サンドイッ
チ”法である。固相は、抗原−特定抗体に結合してお
り、第２の抗原−特定抗体が標識される。この方法は、
試料を固相および標識物と同時または異なる時間に混合
することを特徴とする。小分析物の場合は、ほとんど使
用されることのない競合法の手順が、それがサンドイッ
チ法の手順と類似しているため採用される。この方法
は、標識抗体と抗原類似物が共有結合されている固相を
使用する。これらの２成分は、分析物が固相に結合した
標識抗体を置換するように互いに分離するか或は反応す
る。分析物に結合していない抗体は、反相により捕獲さ
れる。この溶液は分析物に結合した抗体を含んでいる。
小寸および大寸の分析物のいずれの場合も、最初の段階
は、分析物を抗体と反応させ、次に、固相に自由抗体
（小寸分析物）または結合抗体（大寸分析物）を捕獲さ
せる。この２つの試薬は試料に同時に添加出来る。最終
的に、各場合において非結合標識分子は、生成結合量を
定量するために標識分子から分離しなければならない。
これから、さらに、試料中に最初から存在していた抗原
の量が定められる。
チ”法である。固相は、抗原−特定抗体に結合してお
り、第２の抗原−特定抗体が標識される。この方法は、
試料を固相および標識物と同時または異なる時間に混合
することを特徴とする。小分析物の場合は、ほとんど使
用されることのない競合法の手順が、それがサンドイッ
チ法の手順と類似しているため採用される。この方法
は、標識抗体と抗原類似物が共有結合されている固相を
使用する。これらの２成分は、分析物が固相に結合した
標識抗体を置換するように互いに分離するか或は反応す
る。分析物に結合していない抗体は、反相により捕獲さ
れる。この溶液は分析物に結合した抗体を含んでいる。
小寸および大寸の分析物のいずれの場合も、最初の段階
は、分析物を抗体と反応させ、次に、固相に自由抗体
（小寸分析物）または結合抗体（大寸分析物）を捕獲さ
せる。この２つの試薬は試料に同時に添加出来る。最終
的に、各場合において非結合標識分子は、生成結合量を
定量するために標識分子から分離しなければならない。
これから、さらに、試料中に最初から存在していた抗原
の量が定められる。
目的 この発明の目的は、前記の不均質方法において、より
簡単に使用できる試薬を提供し、よって分離法をより迅
速より簡便にすることにより、不均質方法を簡素化する
ことである。
簡単に使用できる試薬を提供し、よって分離法をより迅
速より簡便にすることにより、不均質方法を簡素化する
ことである。
構成 本発明は、上記目的を達成するために、少なくとも１
個の抗原または抗体を担う固相を利用し、さらに、分析
物より多く存在する標識抗原または抗体を利用し、前記
分析物を含有する試料が前記固相と前記標識抗原または
抗体と接触して前記固相および非結合標識抗原または抗
体上に免疫学的複合体を生成し、前記固相の沈殿によっ
て未反応の標識抗体が分離測定可能な不均質免疫定量法
において、前記固相をタブレットの形状で供給し、前述
のようにして接触させた固相を未反応の標識抗原または
抗体が可溶な希釈液に混合させ、前記固相を該固相自体
の自重のみにより沈殿させることを特徴とする。
個の抗原または抗体を担う固相を利用し、さらに、分析
物より多く存在する標識抗原または抗体を利用し、前記
分析物を含有する試料が前記固相と前記標識抗原または
抗体と接触して前記固相および非結合標識抗原または抗
体上に免疫学的複合体を生成し、前記固相の沈殿によっ
て未反応の標識抗体が分離測定可能な不均質免疫定量法
において、前記固相をタブレットの形状で供給し、前述
のようにして接触させた固相を未反応の標識抗原または
抗体が可溶な希釈液に混合させ、前記固相を該固相自体
の自重のみにより沈殿させることを特徴とする。
従って、この発明は、不均質免疫定量法において使用
されるタブレット状の免疫定量試薬を提供し、希釈液を
少なくとも１種、好ましくは２種、うち１種は試料の予
備希釈にもう１種は免疫学的反応後の固相処理に使用す
る。色素標識抗体およびしかるべき抗体を保持する固相
のような免疫学的試薬は、標準的な凍結乾燥技術と打錠
技術を用いて凍結乾燥しタブレットにする。これらの試
薬は次のように用いる。好ましくは予備希釈した試料と
タブレットを第１の管に加え、温置し、次に、以下に記
述する第１の管を第２の管に接続し単一のアッセンブリ
ーにする。内容物を混合し固相を沈降させ、固相い希釈
剤を添加して非結合標識試料の上澄みへの放出を促進す
る。次に、色素吸光度を適当な光度計で測定する。抗
体、抗原および固相のような免疫定量に通常用いられる
成分はどれでも採用できる。色素体物質、即ち、450nm
ないし650nmの波長範囲の吸光試料は、この発明におけ
る標識として最適である。どの色素の分子吸光率も、多
くの免疫定量試験が要求する読み取り感度が得られる程
高くないために、多くの場合、試験には高分子色素をふ
くませている。かような高分子色素は、米国特許第4,45
2,886号にすでに記載されている。
されるタブレット状の免疫定量試薬を提供し、希釈液を
少なくとも１種、好ましくは２種、うち１種は試料の予
備希釈にもう１種は免疫学的反応後の固相処理に使用す
る。色素標識抗体およびしかるべき抗体を保持する固相
のような免疫学的試薬は、標準的な凍結乾燥技術と打錠
技術を用いて凍結乾燥しタブレットにする。これらの試
薬は次のように用いる。好ましくは予備希釈した試料と
タブレットを第１の管に加え、温置し、次に、以下に記
述する第１の管を第２の管に接続し単一のアッセンブリ
ーにする。内容物を混合し固相を沈降させ、固相い希釈
剤を添加して非結合標識試料の上澄みへの放出を促進す
る。次に、色素吸光度を適当な光度計で測定する。抗
体、抗原および固相のような免疫定量に通常用いられる
成分はどれでも採用できる。色素体物質、即ち、450nm
ないし650nmの波長範囲の吸光試料は、この発明におけ
る標識として最適である。どの色素の分子吸光率も、多
くの免疫定量試験が要求する読み取り感度が得られる程
高くないために、多くの場合、試験には高分子色素をふ
くませている。かような高分子色素は、米国特許第4,45
2,886号にすでに記載されている。
抗体に直接結合している色素は、低感度試験において
用いられる。かような色素標識は、酵素標識の最終段
階、即ち、発色と反応停止の段階を削除できる。フルオ
レセイン、コンゴ赤、シカゴスカイブルー等の色素が好
適である。
用いられる。かような色素標識は、酵素標識の最終段
階、即ち、発色と反応停止の段階を削除できる。フルオ
レセイン、コンゴ赤、シカゴスカイブルー等の色素が好
適である。
この発明によれば、試薬は、好ましい単一タブレッ
ト、時には２個のタブレットに圧縮成形される。これら
の試薬は標識抗体と以下に述べる固相である。振とうせ
ずともタブレットが溶解するように、２クロム酸ナトリ
ウムおよびクエン酸のような泡立ち添加剤をタブレット
に添加する。タブレット製造時に通常使用される充填
剤、結合剤および潤滑剤のようなその他の添加物も同様
に使用される。
ト、時には２個のタブレットに圧縮成形される。これら
の試薬は標識抗体と以下に述べる固相である。振とうせ
ずともタブレットが溶解するように、２クロム酸ナトリ
ウムおよびクエン酸のような泡立ち添加剤をタブレット
に添加する。タブレット製造時に通常使用される充填
剤、結合剤および潤滑剤のようなその他の添加物も同様
に使用される。
固相材は、免疫定量分野で通常使用しているもので、
タブレットに成形出来、タブレットから放出された時に
数分以内に沈降出来る形状であれば使用できる。我々
は、膨潤ゲルが好適な寒天ゲルと最も良く適合すること
を発見した。かようなゲルは、直径が150ミクロンない
し300ミクロン、好適には175ミクロンないし225ミクロ
ンの範囲のかなり大きいビード形状をしており、凍結乾
燥でき、次に、他の試薬と共にタブレットに圧縮成形で
きる。このタブレットは、液体媒質中に入れると溶解す
るか或は泡立ち、ゲルが膨潤し、この膨潤期間中に液体
がゲルに吸収されて、抗原と抗体の反応が生じ、促進さ
れる。
タブレットに成形出来、タブレットから放出された時に
数分以内に沈降出来る形状であれば使用できる。我々
は、膨潤ゲルが好適な寒天ゲルと最も良く適合すること
を発見した。かようなゲルは、直径が150ミクロンない
し300ミクロン、好適には175ミクロンないし225ミクロ
ンの範囲のかなり大きいビード形状をしており、凍結乾
燥でき、次に、他の試薬と共にタブレットに圧縮成形で
きる。このタブレットは、液体媒質中に入れると溶解す
るか或は泡立ち、ゲルが膨潤し、この膨潤期間中に液体
がゲルに吸収されて、抗原と抗体の反応が生じ、促進さ
れる。
反応により、抗原と抗体の固相複合体が生じ間げき液
内に自由な標識物が生じる。分離するために、この発明
では、反応管内のゲルに、以下に述べる緩衝希釈液を混
合しながら加える。大径ビードは、数分以内に重力で沈
降し、管底に密集固形ゲルが形成される。このゲルの上
に、非結合標識抗体を含む溶液があり、この溶液を光度
計で直接測定でき、この際、光ビームは管底より十分上
にあるので溶液内の標識効果のみが測定される。これに
より、管からの固相を物理的に分離せずに定量分析を実
施できる。
内に自由な標識物が生じる。分離するために、この発明
では、反応管内のゲルに、以下に述べる緩衝希釈液を混
合しながら加える。大径ビードは、数分以内に重力で沈
降し、管底に密集固形ゲルが形成される。このゲルの上
に、非結合標識抗体を含む溶液があり、この溶液を光度
計で直接測定でき、この際、光ビームは管底より十分上
にあるので溶液内の標識効果のみが測定される。これに
より、管からの固相を物理的に分離せずに定量分析を実
施できる。
この発明による希釈剤は、非結合標識抗体（または、
適当な場合には、非結合標識抗原）の反応後の固相から
の解放を容易にするものである。この目的に特に適した
材料は、トリス緩衝液で、さらに詳細には、0.15モルの
トリス、0.15モルの塩化ナトリウム、0.1％のウシの血
清アルブミンと0.1％のアジ化ナトリウムを含有する、p
H8.5のトリス緩衝液である。
適当な場合には、非結合標識抗原）の反応後の固相から
の解放を容易にするものである。この目的に特に適した
材料は、トリス緩衝液で、さらに詳細には、0.15モルの
トリス、0.15モルの塩化ナトリウム、0.1％のウシの血
清アルブミンと0.1％のアジ化ナトリウムを含有する、p
H8.5のトリス緩衝液である。
打錠技術および凍結乾燥技術は、この発明の技術分野
において通常採用されているものである。例えば、冷凍
乾燥は、適当な真空下で−45℃の温度で好便に行える。
免疫定量分析において採用されている特定の試薬に応じ
適当な技術を修正し適用されることも出来よう。
において通常採用されているものである。例えば、冷凍
乾燥は、適当な真空下で−45℃の温度で好便に行える。
免疫定量分析において採用されている特定の試薬に応じ
適当な技術を修正し適用されることも出来よう。
これらの手順をさらに簡素化し未熟練者でも処理でき
るようにするために、全ての試薬を、下記の構成品と一
式にして提供する。
るようにするために、全ての試薬を、下記の構成品と一
式にして提供する。
ａ）試料（通常血清または血しょう）用希釈緩衝液を含
有している１本の反応管。この緩衝液の量は、タブレッ
ト内の寒天ゲルの量に匹敵する。
有している１本の反応管。この緩衝液の量は、タブレッ
ト内の寒天ゲルの量に匹敵する。
ｂ）１個のタブレット（時には、共に結合出来る２個の
タブレット）で、全ての活性試薬（固相および標識用高
分子）を含んでいる。
タブレット）で、全ての活性試薬（固相および標識用高
分子）を含んでいる。
ｃ）最終手順において必要な希釈緩衝液を含有する読み
取り管。
取り管。
実際に、これらの構成品と試薬は、以下に述べるよう
に使用され、使い方はサンドイッチ法および競合法の両
方に共通である。
に使用され、使い方はサンドイッチ法および競合法の両
方に共通である。
1.試料を反応管に入れ、均質になるように振とうする。
１個のタブレットを前記管に入れ、（室温ないし約37℃
の範囲の）調節温度で好適に温置する。
１個のタブレットを前記管に入れ、（室温ないし約37℃
の範囲の）調節温度で好適に温置する。
2.温置終了後、反応管を希釈管に接続し、液密な管アッ
センブリーを形成する。この管アッセンブリーをスラリ
ーを同質化するために、３回以上転倒させる。つぎに、
この管アッセンブリーをビードが沈降するまで読み取り
管を下にして静置する。ゲルを沈降させるのに必要な時
間は、一般的には、５分以内であり、通常および好まし
くは、２分以内である。管アッセンブリーは、次に、光
度計に設置し、ゲルの上を読み取ることが出来る。色素
標識の波長が450nmを、好ましくは500nmを越える場合、
読み取り管内に未だ存在する血清成分は、血清または血
しょう試料の容積が50マイクロリットルを越えなけれ
ば、重大な干渉は生じない。２クロム酸塩光度計は、他
の光学機器より、かような干渉からの読み取り誤差が少
なく有利である。色素の波長が500nmの場合、基準周波
数は600nmが望ましい。
センブリーを形成する。この管アッセンブリーをスラリ
ーを同質化するために、３回以上転倒させる。つぎに、
この管アッセンブリーをビードが沈降するまで読み取り
管を下にして静置する。ゲルを沈降させるのに必要な時
間は、一般的には、５分以内であり、通常および好まし
くは、２分以内である。管アッセンブリーは、次に、光
度計に設置し、ゲルの上を読み取ることが出来る。色素
標識の波長が450nmを、好ましくは500nmを越える場合、
読み取り管内に未だ存在する血清成分は、血清または血
しょう試料の容積が50マイクロリットルを越えなけれ
ば、重大な干渉は生じない。２クロム酸塩光度計は、他
の光学機器より、かような干渉からの読み取り誤差が少
なく有利である。色素の波長が500nmの場合、基準周波
数は600nmが望ましい。
以下の諸例は、この発明の好ましい実施例を示すもの
である。
である。
実施例 １ 色素標識抗体およびタブレット化試薬を同時間接（サ
ンドウィッチ）分析において使用。
ンドウィッチ）分析において使用。
A1アポリボタンパク質（Apo−A1）のためにフルオレセ
インで標識した親和性純化抗体と寒天ゲル上で不動化し
た捕獲抗体を用い、200ミクロンの平均直径を有する固
相担体を用いる、間接免疫分析法が開発された。
インで標識した親和性純化抗体と寒天ゲル上で不動化し
た捕獲抗体を用い、200ミクロンの平均直径を有する固
相担体を用いる、間接免疫分析法が開発された。
この固相担体と標識抗体は、−45℃で凍結乾燥され、
取扱を容易にするために、あわ立て剤を用いタブレット
状にされた。
取扱を容易にするために、あわ立て剤を用いタブレット
状にされた。
この分析は、0.15モルのトリス緩衝液、0.1モルのNaC
l（塩化ナトリウム）、0.1％のBSA（ビストリメチルシ
リルアセトアミド）および0.1％のアジ化ナトリウムに
いれた予備希釈した試料または校正剤（Calibrator）の
アリコート0.5mlの試験管に入れ、タブレットを加え10
分間37度に温置して行った。温置終了後、同一の希釈緩
衝液を加えて非結合標識抗体を固相から除去し、管を静
置し内容物を４分間沈降させてから、上澄みの吸光度を
管光度計で１ないし２秒計数測定する。非結合抗体であ
る上澄みの吸光度は、患者試料のApo−A1の濃度に反比
例している。
l（塩化ナトリウム）、0.1％のBSA（ビストリメチルシ
リルアセトアミド）および0.1％のアジ化ナトリウムに
いれた予備希釈した試料または校正剤（Calibrator）の
アリコート0.5mlの試験管に入れ、タブレットを加え10
分間37度に温置して行った。温置終了後、同一の希釈緩
衝液を加えて非結合標識抗体を固相から除去し、管を静
置し内容物を４分間沈降させてから、上澄みの吸光度を
管光度計で１ないし２秒計数測定する。非結合抗体であ
る上澄みの吸光度は、患者試料のApo−A1の濃度に反比
例している。
分析の動的範囲は50mg/dlないし180mg/dlでこの範囲
にたいし５％ないし９％の分析内分散が認められた。64
人の男性の場合の正常範囲は122mg/dl±21であり、62人
の女性の場合の正常範囲は130mg/dl±21である。この分
析は、正常者と冠状危険患者における比濁分析法と良く
相関している。36人の冠状危険患者の場合の相関係数
（Ｒ）は0.94（Ｙ＝0.877＋19.99）が得られ、88人の正
常者の場合の相関係数は0.81（Ｙ＝0.973＋10.71）が得
られた。
にたいし５％ないし９％の分析内分散が認められた。64
人の男性の場合の正常範囲は122mg/dl±21であり、62人
の女性の場合の正常範囲は130mg/dl±21である。この分
析は、正常者と冠状危険患者における比濁分析法と良く
相関している。36人の冠状危険患者の場合の相関係数
（Ｒ）は0.94（Ｙ＝0.877＋19.99）が得られ、88人の正
常者の場合の相関係数は0.81（Ｙ＝0.973＋10.71）が得
られた。
実施例 ２ テロフィリンに対する新しい免疫分析法 色素標識単クローン抗体は、テオフィリンと供役し、
実施例１に記載のように準備された固相タブレット内で
不動化する。
実施例１に記載のように準備された固相タブレット内で
不動化する。
血清または血しょう試料を反応びんに加え、テオフィ
リンのタブレットを添加し、10分間37℃で温置する。実
施例１の希釈緩衝液入り読み取り管を前記反応びんに挿
入し、この管アッセンブリーを３回反転させ、４分間沈
降させてから、管光度計で１−２秒間計数する。試料中
のテオフィリンは、上澄み中の吸光度が試料中のテオフ
ィリン量の測定値であるように固相担体上の供役物を置
換する。分析は、迅速、精密、正確であり、現場試験環
境に適している。2.5から30μg/mlの動的範囲にわたり
１日のうちの正確な試験における分散計数（CV）は、６
ないし９％で、日を異にした場合の分散係数は、５ない
し6.1％であった。
リンのタブレットを添加し、10分間37℃で温置する。実
施例１の希釈緩衝液入り読み取り管を前記反応びんに挿
入し、この管アッセンブリーを３回反転させ、４分間沈
降させてから、管光度計で１−２秒間計数する。試料中
のテオフィリンは、上澄み中の吸光度が試料中のテオフ
ィリン量の測定値であるように固相担体上の供役物を置
換する。分析は、迅速、精密、正確であり、現場試験環
境に適している。2.5から30μg/mlの動的範囲にわたり
１日のうちの正確な試験における分散計数（CV）は、６
ないし９％で、日を異にした場合の分散係数は、５ない
し6.1％であった。
血清または血しょうの良好な相関が、EMITTM比較分析
（Ｙ＝0.985x0.05,R＝0.97）とTDXTM分析（Ｙ＝1.04x0.
95,R＝0.99）の間に示された。
（Ｙ＝0.985x0.05,R＝0.97）とTDXTM分析（Ｙ＝1.04x0.
95,R＝0.99）の間に示された。
効果 以上の説明から明らかなように、本発明によると、よ
り簡単に使用できる試薬を提供することができ、よって
分離法をより迅速より簡便にすることが可能となり不均
質方法を簡素化することができる。
り簡単に使用できる試薬を提供することができ、よって
分離法をより迅速より簡便にすることが可能となり不均
質方法を簡素化することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−191765（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−29248（ＪＰ，Ａ) 国際公開86／6491（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 33/548
Claims (5)
- 【請求項１】少なくとも１個の抗原または抗体を担う固
相を利用し、さらに、分析物より多く存在する標識抗原
または抗体を利用し、前記分析物を含有する試料が前記
固相と前記標識抗原または抗体と接触して前記固相およ
び非結合標識抗原または抗体上に免疫学的複合体を生成
し、前記固相の沈殿によって未反応の標識抗体が分離測
定可能な不均質免疫定量法において、前記固相をタブレ
ットの形状で供給し、前述のようにして接触させた固相
を未反応の標識抗原または抗体が可溶な希釈液に混合さ
せ、前記固相を該固相自体の自重のみにより沈殿させる
ことを特徴とする不均質免疫定量法。 - 【請求項２】固相が寒天ゲルであることを特徴する請求
項の第１項に記載の不均質免疫定量法。 - 【請求項３】寒天ゲルが150ミクロンから300ミクロンの
範囲の直径寸法の粒子を有していることを特徴とする請
求項の第２項に記載の不均質免疫定量法。 - 【請求項４】希釈液がトリス緩衝液であることを特徴と
する請求項の第３項に記載の不均質免疫定量法。 - 【請求項５】少なくとも１本の希釈液入り反応管、固相
と抗原または抗体を含有する１個のタブレットおよび１
本の希釈液入り読み取り管よりなることを特徴とする請
求項の第１項ないし第４項のいずれか１項による免疫定
量法を実行するためのキット。
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| US20348388A | 1988-06-06 | 1988-06-06 | |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02103468A JPH02103468A (ja) | 1990-04-16 |
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|---|---|---|---|---|
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-
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