JP4426929B2 - 脳卒中・無症候性脳梗塞のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ポリアミン、アクロレインの含有量又はポリアミンオキシダーゼ活性又はその蛋白質量を指標とした脳卒中・無症候性脳梗塞の診断方法に関する。更に本発明は、ポリアミン、アクロレインの含有量又はポリアミンオキシダーゼ活性又はその蛋白質量を指標として脳卒中・無症候性脳梗塞の患者をスクリーニングする方法に関する。
脳血管疾患は悪性新生物、心疾患に次ぐ死因であり、その年間死亡数は腎疾患の１０倍近く、また罹患後の後遺症は麻痺・運動不能を伴うなど、日常生活に極めて多大な支障を来たす。脳血管疾患の大半を占める脳卒中は早期発見・早期治療が困難な疾患である。また自覚症状を伴わない無症候性脳梗塞は、画像診断により偶然に発見されるケースが大半であり、血液・尿検査等に利用される診断マーカーが存在しないのが現状である。その為、画像診断などの高価な機器を必要としない、簡易で、確度の高い診断方法の開発が望まれている。
ところでポリアミンは生体内において普遍的に見出される生体アミンであり、スペルミン、スペルミジン、スペルミンなどに代表される。そしてそれらのポリアミンは細胞内に高濃度（ｍＭオーダー）に存在し、生体内において核酸と相互作用することにより細胞増殖因子として作用する。一方、ポリアミンはその代謝過程で、細胞にとって毒性の高いアクロレイン（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨＯ）を産生する。このアクロレインは細胞内ではアルデヒドデヒドロゲナーゼにより無毒化されるが、細胞外に漏出すると強い毒性を示す。
なお、慢性腎不全患者の血漿中にはポリアミンが蓄積していることから、ポリアミンは尿毒素の原因物質の一つであろうとされている。そのうえ、このポリアミンを透析により十分に取り除くことは困難であるといわれている。そこでポリアミンから誘導される毒性の本体を明らかにすることは、尿毒症のより有効な治療薬の開発につながる。
そのような観点から本発明者らは、ポリアミンよりアクロレインを生成する経路において作用しているポリアミンオキシダーゼを、アミノグアニジンを用いて阻害することを試みた。そしてその結果ポリアミンは毒性を示さなくなることが確認されている（特開２００２−２８１９９９号公報）。組織破壊を伴う疾患においては、細胞内より遊離したポリアミンが血漿中のポリアミンオキシダーゼにより酸化的脱アミノ化を受けてアクロレインが大量に産生し、生成したアクロレインが毒性に関与している可能性が極めて高い。
上記で述べたように腎疾患における尿毒症に、ポリアミンの酸化分解により発生したアクロレインが関与していることは知られていた。しかしその他の疾患、例えば脳卒中などの脳血管疾患においてアクロレインが関与しているかどうかの知見は不足していた。なお、脳卒中とは脳血管の病的過程により急激に起こる局所精神・神経症状を表すものであり、その原因疾患として重要なものには脳梗塞や脳内出血などが挙げられる。よって本発明の課題は、脳卒中などの脳血管疾患において生体内のポリアミンあるいはアクロレインの含量が量的に変化するか否かを検討することである。脳卒中患者においてアクロレインの量に変化が見られるならば、アクロレインを指標にして脳卒中・無症候性脳梗塞を診断することが可能となる。またポリアミンからアクロレインが生成する過程には血漿中のポリアミンオキシダーゼが関与しているので、脳卒中患者においてポリアミンオキシダーゼの活性及びその蛋白質量が変化しているか否かを検討することも本発明の課題である。
本発明者等は、被験者の血漿中に含まれるアクロレイン含量、ポリアミン含量およびポリアミンオキシダーゼ活性を測定し、脳梗塞・脳内出血の患者群と、健常者群あるいは他の脳疾患の患者群との間に差があるか比較を行なった。その結果、脳梗塞・脳内出血の患者群においては、健常者群あるいは他の脳疾患の患者群と比較して、血漿アクロレイン含量とポリアミンオキシダーゼ活性が明らかに高いことが認められた。その後被験者において磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）で頭部断層画像を撮影する事により、血漿アクロレイン含量とポリアミンオキシダーゼ活性が高い被験者では梗塞がある事を確認し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、脳卒中・無症候性脳梗塞の発見・予知のための診断方法を提供するものである。本発明によれば血漿中のアクロレイン量、ポリアミンオキシダーゼ活性又はポリアミンオキシダーゼの蛋白質量、ポリアミン量を測定する事により、脳卒中・無症候性脳梗塞の予知、発見をすることができる。
本発明は、血漿中のアクロレイン含有量、ポリアミン含有量、あるいはポリアミンオキシダーゼ活性又はポリアミンオキシダーゼの蛋白質量の測定を行なうことにより、脳卒中・無症候性脳梗塞の診断及び、脳卒中・無症候性脳梗塞患者のスクリーニングを行なう方法を提供するものである。本発明の知見は、ポリアミンオキシダーゼを介する酸化的脱アミノ化により生体内ポリアミンからアクロレインを生成する経路を阻害することにより、脳卒中・無症候性脳梗塞を予防したり、病状の進捗を阻止することができる可能性を示唆するものである。更に本発明の知見は、ポリアミンオキシダーゼを阻害する化合物を探索することにより、脳卒中・無症候性脳梗塞の治療薬を得ることができる可能性をも示唆するものであり、種々の応用が可能であると考えられる。
本発明において、ポリアミンの酸化分解により発生するアクロレインが脳梗塞・脳内出血の患者の血清中に多く存在する事を見出した。また脳梗塞・脳内出血の発見・予知に、血漿中のアクロレイン含量、ポリアミン含量およびポリアミンオキシダーゼ活性の上昇を用いることができる事を実証した。
よって本発明は、被験者から生体サンプルを採取し、該サンプル中におけるポリアミンの含有量又は該ポリアミンから生成されるアルデヒド体の含有量、若しくは該サンプル中におけるポリアミンオキシダーゼ活性又はポリアミンオキシダーゼの蛋白質量を測定し、得られた測定値を指標として脳卒中・無症候性脳梗塞を診断する方法である。また本発明は、被験者から生体サンプルを採取し、該サンプル中におけるポリアミンの含有量又は該ポリアミンから生成されるアルデヒド体の含有量、若しくは該サンプル中におけるポリアミンオキシダーゼ活性又はポリアミンオキシダーゼの蛋白質量を測定し、得られた測定値を指標として脳卒中・無症候性脳梗塞の患者をスクリーニングする方法である。
本発明においては被験者から、まず測定に使用する生体サンプルを採取する。本発明において使用される生体サンプルは、好ましくは下記の実施例において使用している血漿である。しかし他の生体サンプルも適宜使用することが可能であり、その様な他の生体サンプルとして、例えば尿、唾液、脳脊髄液や骨髄液などを挙げることが可能である。
なお本願明細書においてポリアミンとは、第一級アミノ基を二つ以上もつ直鎖の脂肪族炭化水素を意味するものである。知られている生体ポリアミンには、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、1.3ジアミノプロパン、カルジン、ホモスペルミジン、3-アミノプロピルカダベリン、ノルスペルミン、テルモスペルミン、カルドペンタミンなどがあるが、それらに限定されるものではない。なお本発明において好適なポリアミンはプトレッシン、スペルミジン、スペルミンである。
上記のポリアミンは酸化、アセチル化、アミノ基転移、カルバモイル化による代謝を受けるが、ポリアミンオキシダーゼはポリアミンの酸化に関与する酵素である。なお本願明細書においてポリアミンオキシダーゼとは、ジアミンまたはポリアミンを良い基質として酸化し、過酸化水素を発生する酵素を意味するものである。ポリアミンは、ポリアミンオキシダーゼによる酸化的脱アミノ化を受け、その結果アクロレインなどのアルデヒド体が生成する。なお本発明において好適なアルデヒド体はアクロレインであるが、それに限定されるものではない。
血漿中のアクロレイン含量は、アクロレイン付加アミノ酸であるFDP-リジン（Ｎ−ホルミルピペリジノ・リジン）の含有量を測定する事により同定することができる。FDP-リジンの含有量は、例えばACR-LYSINEADDUCT ELISA SYSTEM (日本油脂株式会社)を使用し、添付のマニュアルに従って測定することができる。なおアクロレイン含量はFDP-リジン以外の誘導体の形で測定することも可能である。またアクロレイン含量を直接測定することも可能であり、かかる方法は例えばAlarcon らの報告（Alarcon R. A. (1968) Anal.Chem. 40, 1704-1708）に記載されている。しかしアクロレインは他の分子との反応性が高いために、遊離の形で血中に存在する量が少ないという問題がある。そこで、FDP-リジンの形で測定することが簡便であることも併せて考えると、本発明において、FDP-リジンの形でアクロレインを測定することは好適な態様である。
具体的には、患者血清及び標準液を抗原固定化プレートに50μl/wellずつ分注し、さらに一次反応抗体液を同量加える。室温で30分静置した後、液を取り除き、洗浄液で洗浄後、二次反応抗体液を100μl/well分注する。室温で一時間静置後、洗浄液で洗浄し、発色液を加え室温で15分静置することで発色させる。プレートリーダーにより、450nmの吸光度測定をすることにより、血漿中アクロレイン量は、患者血清1ml当たりのFDP-リジン含有量（nmol/ml plasma）として表示される。
ポリアミンオキシダーゼの活性測定は、例えば下記の実施例において示す様に、10mM-Tris塩酸塩（pH7.5）、0.2mMの基質（スペルミン、スペルミジン及びプトレスシン）及び0.03mlの患者血清の反応混合液0.15mlを37℃にて48時間インキュベーションすることにより行なうことができる。0.02mlの反応混合液に最終濃度５％のトリクロロ酢酸（TCA）を加え、遠心分離する。得られた上清の一部をポリアミンのアッセイに使用する。アミンオキシダーゼ活性は患者血清1ml当たりのスペルミン分解により生成したスペルミジン量（nmol/ml plasma/48h）で表示することができる。
ポリアミンオキシダーゼの酵素活性測定方法は種々の報告において記載されており、そのような文献として、Sharminらの報告（Sharmin et al., (2001) Biochem. Biophys Res. Commun. 282, 228-235）、Sakataらの報告（Sakata et al., (2003) Biochem. Biophys Res. Commun. 305, 143-149）、Igarashiらの報告（Igarashi et al., (1986) J.Bacteriol. 166, 128-134）などを挙げることができる。かかる報告の記載を基にして当業者は適宜改変を行うことにより、ポリアミンオキシダーゼの酵素活性を測定することができる。
またポリアミンオキシダーゼの蛋白質量は、例えばポリアミンオキシダーゼに対して特異的な抗体を用いた酵素免疫測定法（ELISA）、ウエスタングブロッティング解析や免疫沈降法などによって測定することができる。かかる手法は本技術分野において公知の一般的な手法であり、当業者は適切な条件を適宜設定して上記の手法により酵素の蛋白質量を測定する事ができる。なおこれらの測定を行う際に使用されるポリアミンオキシダーゼに対する抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも良い。
ポリアミンオキシダーゼに対するポリクローナル抗体は、例えば通常のペプチド抗体作製の手法を用いてウサギをポリアミンオキシダーゼのペプチド断片で免疫することにより、得ることができる。ペプチド抗体が作製された事は、ペプチドを投与されたウサギから採血をしてその抗体価を測定することにより、抗体が十分な力価に達しているか検定を行うことによって確認する事ができる。ペプチド抗体作製の手法は種々の実験書などにも記載されており、当業者に良く知られているので、それらに記載を基に種々の改変を行ってポリアミンオキシダーゼの抗体を得ることができる。
試料に含まれるポリアミンの含有量は、高速液体クロマトグラフイー（HPLC）により測定することができる。例えばTOSOから市販されているポリアミンカラムを使用した場合には、ポリアミン類（プトレッシン、スペルミジン、スペルミン）のHPLC上のリテンションタイム（保持時間）は各々7分、12分、25分である。ポリアミン量は患者血清１ｍｌ当たりに含まれるプトレスシン、スペルミジン及びスペルミン量（nmol/ml plasma）で表示することができる。なおその他の通常のアミノ酸カラムも、適宜使用することができる。
下記の実施例においては、被験者の同意の下、磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）により、頭部断層画像を得て梗塞の有無を検討した。その結果下記の実施例に示すように、健常者群において高い値を示した被験者において、脳梗塞の所見が認められた。
よって、脳卒中の患者において血漿中のアクロレイン含量、ポリアミン含量あるいはポリアミンオキシダーゼ活性は健常者と比較して高いという本発明の知見を利用して、上記の測定値を指標として、脳卒中・無症候性脳梗塞を診断することができる。また本発明において得られた知見を利用して、上記の測定値を指標として脳卒中・無症候性脳梗塞の患者をスクリーニングすることもできる。例えば健常者群の上記の指標となる測定値の平均値と分散を統計学的に解析し、上記測定値における正常値の上限を設定する。その値を基にして、より高い値を示す被験者は脳卒中・無症候性脳梗塞である可能性が高いと診断することも可能であろう。
また本発明の知見は、血漿中のポリアミンオキシダーゼ活性を阻害することにより生体におけるアクロレインの生成を抑制することにより、脳卒中の予防や病状の進捗を阻止することができる可能性も示唆するものである。よって本発明は、脳卒中の治療に関する新たな途を開く可能性を提供するものである。
更に、脳卒中の治療に有効である可能性がある候補化合物を実験動物に投与し、該化合物が該実験動物において血漿中のポリアミンオキシダーゼを阻害する活性を有するかを測定することにより、脳卒中の治療に有効である新たな薬剤を探索できると考えられる。よって本発明は、脳卒中の治療に有効な新たな薬剤を探索するための新たな途をも提供するものである。
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1：脳梗塞患者に於ける血漿アクロレイン含有量の比較検討
脳疾患患者における血漿アクロレイン含有量を検討した。健常人、脳梗塞・脳内出血群、その他脳疾患群の３群に分けて、採取した血液のアクロレイン含有量を比較した。
脳疾患患者における血漿アクロレイン含有量を検討した。健常人、脳梗塞・脳内出血群、その他脳疾患群の３群に分けて、採取した血液のアクロレイン含有量を比較した。
血漿中アクロレイン量は、アクロレイン付加アミノ酸であるFDP-リジン（Ｎ−ホルミルピペリジノ・リジン）の含有量を測定する事で同定した。ACR-LYSINE ADDUCTELISA SYSTEM(日本油脂株式会社)を用い、添付のマニュアルに従って測定した。患者血清及び標準液を抗原固定化プレートに50μl/wellずつ分注し、更に一次反応抗体液を同量加えた。室温で30分静置後、液を取り除き、洗浄液で洗浄し、発色液を加え室温で15分静置することで発色させた。プレートリーダーにより、450nmの吸光度測定をした。血漿中アクロレイン量は患者血清1ml当たりのFDP-リジン含有量(nmol/ml plasma)で表示した。
図１に示されるように血漿アクロレイン量を反映するFDP-リジン量は、上記の３群の中で脳梗塞・脳内出血患者が最も高く、他の群に比べ有意に上昇が見られた。また慢性腎不全患者の血漿中アクロレイン量と比較しても、脳梗塞患者のFDP-リジン量は、腎不全患者と同等レベルまで上昇している事が判明した。
実施例２：脳梗塞患者における血漿アミンオキシダーゼ活性の比較検討
実施例１で用いた患者血漿中のポリアミンオキシダーゼ活性を測定した。その結果を図２に示す。血漿中のポリアミンオキシダーゼの活性は、10mM-Tris塩酸塩（pH7.5）、0.2mMの基質（スペルミン、スペルミジン及びプトレスシン）及び0.03mlの患者血清の反応混合液0.15mlを37℃にて48時間インキュベーションすることにより測定した。0.02mlの反応混合液に最終濃度5%のトリクロロ酢酸(TCA)を加え、遠心分離した。得られた上清の一部をポリアミンのアッセイに使用した。アミンオキシダーゼ活性は患者血清1ml当たりの、スペルミン分解により生成したスペルミジン量（nmol/ml plasma/48h）で表示した。
実施例１で用いた患者血漿中のポリアミンオキシダーゼ活性を測定した。その結果を図２に示す。血漿中のポリアミンオキシダーゼの活性は、10mM-Tris塩酸塩（pH7.5）、0.2mMの基質（スペルミン、スペルミジン及びプトレスシン）及び0.03mlの患者血清の反応混合液0.15mlを37℃にて48時間インキュベーションすることにより測定した。0.02mlの反応混合液に最終濃度5%のトリクロロ酢酸(TCA)を加え、遠心分離した。得られた上清の一部をポリアミンのアッセイに使用した。アミンオキシダーゼ活性は患者血清1ml当たりの、スペルミン分解により生成したスペルミジン量（nmol/ml plasma/48h）で表示した。
脳梗塞・脳内出血群の血漿中のポリアミンオキシダーゼ活性は、健常者群及びその他脳疾患群と比較して有意に上昇していた。この結果は、実施例１で比較検討した血漿中アクロレイン量と相関性を有していた。
実施例３：磁気共鳴画像診断法（MRI）による頭部断面画像解析
被験者の許可・同意を得て、MRIにより頭部の断面画像解析を行い、脳梗塞の有無を調べた。健常者（図３Ａ）、脳梗塞患者（図３Ｂ）、および病名の診断はついていないが血漿中のアクロレイン量とポリアミンオキシダーゼ活性が極めて高い値を示した被験者（図３Ｃ）におけるMRI断層写真を示す。図３Ｃに示されるように、血漿中のアクロレイン量とポリアミンオキシダーゼ活性が高かった患者では、両側前頭・側頭頂および基底核に多発性の梗塞が認められた。また脳の萎縮および動脈硬化も認められた。
被験者の許可・同意を得て、MRIにより頭部の断面画像解析を行い、脳梗塞の有無を調べた。健常者（図３Ａ）、脳梗塞患者（図３Ｂ）、および病名の診断はついていないが血漿中のアクロレイン量とポリアミンオキシダーゼ活性が極めて高い値を示した被験者（図３Ｃ）におけるMRI断層写真を示す。図３Ｃに示されるように、血漿中のアクロレイン量とポリアミンオキシダーゼ活性が高かった患者では、両側前頭・側頭頂および基底核に多発性の梗塞が認められた。また脳の萎縮および動脈硬化も認められた。
実施例4：急性期脳梗塞患者における頭部断面画像、血漿ポリアミンオキシダーゼ活
性およびアクロレイン含有量の変化についての比較検討
急性期脳梗塞患者1名について、発症当日（1日）、2日目および一週間後（７日）における頭部断面画像（MRI, CT）の変化と、それに伴う血漿ポリアミンオキシダーゼ活性およびアクロレイン含有量の変化を調べた。頭部断面画像の写真を図４に示す。発症当日では、T2強調MRIおよびCTに明瞭な梗塞像は見られなかった。一方発症当日の血漿ポリアミンオキシダーゼ活性とFDP-Lys量は、それぞれ6.6nmol SPD増加/ml血漿と18.4nmol/ml血漿であった。この結果から、血漿ポリアミンオキシダーゼ活性は健常者群の2倍程度であり、有意に高値であることが確認された。発症2日目の頭部断面画像（MRI）と一週間後の頭部断面画像（CT）では、左側頭葉に明瞭な梗塞像が認められた。発症一週間後の血漿ポリアミンオキシダーゼ活性とFDP-Lys量は、それぞれ7.2nmol SPD増加/ml血漿と23.0nmol/ml血漿であった。よって血漿ポリアミンオキシダーゼ活性の上昇と共に、血漿アクロレイン含有量の有意な増加も認められた。以上に示されるように、急性期梗塞患者においては血漿ポリアミンオキシダーゼ活性の上昇が、MRIもしくはCTにおける梗塞像の出現に先立って起こることが確認された。
性およびアクロレイン含有量の変化についての比較検討
急性期脳梗塞患者1名について、発症当日（1日）、2日目および一週間後（７日）における頭部断面画像（MRI, CT）の変化と、それに伴う血漿ポリアミンオキシダーゼ活性およびアクロレイン含有量の変化を調べた。頭部断面画像の写真を図４に示す。発症当日では、T2強調MRIおよびCTに明瞭な梗塞像は見られなかった。一方発症当日の血漿ポリアミンオキシダーゼ活性とFDP-Lys量は、それぞれ6.6nmol SPD増加/ml血漿と18.4nmol/ml血漿であった。この結果から、血漿ポリアミンオキシダーゼ活性は健常者群の2倍程度であり、有意に高値であることが確認された。発症2日目の頭部断面画像（MRI）と一週間後の頭部断面画像（CT）では、左側頭葉に明瞭な梗塞像が認められた。発症一週間後の血漿ポリアミンオキシダーゼ活性とFDP-Lys量は、それぞれ7.2nmol SPD増加/ml血漿と23.0nmol/ml血漿であった。よって血漿ポリアミンオキシダーゼ活性の上昇と共に、血漿アクロレイン含有量の有意な増加も認められた。以上に示されるように、急性期梗塞患者においては血漿ポリアミンオキシダーゼ活性の上昇が、MRIもしくはCTにおける梗塞像の出現に先立って起こることが確認された。
血漿中のアクロレイン含有量、ポリアミン含有量、あるいはポリアミンオキシダーゼ活性又はポリアミンオキシダーゼ蛋白質量の測定を行なうことからなる本発明の方法は、脳卒中・無症候性脳梗塞の診断、及び、脳卒中・無症候性脳梗塞患者のスクリーニングに有用である。また本発明の知見を利用して、ポリアミンオキシダーゼを介する酸化的脱アミノ化により生体内ポリアミンからアクロレインを生成する経路を阻害することにより、脳卒中・無症候性脳梗塞を予防したり、病状の進捗を阻止することができる可能性がある。更に本発明の知見を利用して、ポリアミンオキシダーゼを阻害する化合物を探索することにより、脳卒中・無症候性脳梗塞の治療薬を得ることができる可能性がある。
Claims (3)
- 脳卒中・無症候性脳梗塞の患者をスクリーニングする方法であって、被験者から採取されたサンプルにおける血しょう中のアクロレインの含量が健常者と比較して高いことを指標とする工程を具え、前記アクロレインの含量はアクロレイン付加アミノ酸に対する抗体を用いて測定される、方法。
- 前記アクロレインの含量は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定される、請求項１記載の方法。
- 前記アクロレイン付加アミノ酸が、Ｎ−ホルミルピペリジノ・リジン（ＦＤＰ−Ｌｙｓ）である、請求項１または２記載の方法。
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