WO2015163342A1 - 脳卒中診断マーカー - Google Patents
脳卒中診断マーカー Download PDFInfo
- Publication number
- WO2015163342A1 WO2015163342A1 PCT/JP2015/062173 JP2015062173W WO2015163342A1 WO 2015163342 A1 WO2015163342 A1 WO 2015163342A1 JP 2015062173 W JP2015062173 W JP 2015062173W WO 2015163342 A1 WO2015163342 A1 WO 2015163342A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- phosphatidylinositol
- stroke
- lysophosphatidylinositol
- subject
- total number
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
- G01N27/622—Ion mobility spectrometry
- G01N27/623—Ion mobility spectrometry combined with mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Definitions
- the present invention relates to a diagnosis of stroke. Specifically, the present invention relates to the diagnosis of stroke using phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol as molecular markers.
- Stroke has been the third leading cause of death in Japan since 1980, following cancer and heart disease. Abnormalities in intracranial blood vessels that carry nutrients to the brain occur, and brain tissue caused by inflammation / exclusion caused by bleeding or ischemia It develops due to a disorder. According to the analysis of 47,782 cases registered in the Japan Stroke Data Bank, the frequency of stroke by disease type was 5.8% for transient ischemic attack (TIA), 5.1% for atherothrombotic infarction, and 22% for lacunar infarction.
- the present inventors have conducted extensive research in view of the above problems, and found that cerebral stroke can be diagnosed by using phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol in peripheral blood as a marker, and the present invention has been completed.
- the present invention provides the following. (1) There is a possibility of suffering from stroke, including a step of measuring the concentration of phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol in a test sample derived from a subject, and using the measured value as an index of suffering from stroke. How to select subjects.
- Phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol is phosphatidylinositol (32: 0), phosphatidylinositol (34: 1), phosphatidylinositol (36: 1), phosphatidylinositol (36: 4), phosphatidylinositol (36: 5) Phosphatidylinositol (38: 2), phosphatidylinositol (38: 3), phosphatidylinositol (38: 4), phosphatidylinositol (38: 6), phosphatidylinositol (40: 5), phosphatidylinositol (40: 6), phosphatidyl Inositol (40: 7), phosphatidylinositol (18: 0/20: 5), phosphatidylinositol
- the present invention is characterized in that a stroke can be easily diagnosed and the burden on the subject can be reduced.
- phosphatidylinositol 32: 0
- phosphatidylinositol 34: 1
- phosphatidylinositol 36: 4
- phosphatidylinositol 36: 5
- phosphatidylinositol 38: 2 in the subject group and the stroke patient group.
- FIG. 6A shows the ROC curve of phosphatidylinositol (36: 5).
- FIG. 6B shows the ROC curve of phosphatidylinositol (40: 5).
- FIG. 6C shows the ROC curve of phosphatidylinositol (40: 6).
- FIG. 7 shows relative values of lysophosphatidylinositol (18: 0), lysophosphatidylinositol (18: 1), and lysophosphatidylinositol (20: 5) concentrations in the subject group and the stroke patient group.
- FIG. 8 shows the ROC curve of lysophosphatidylinositol (20: 5).
- FIG. 9 shows the relative values of phosphatidylinositol (18: 0/20: 5) and phosphatidylinositol (16: 0/22: 5) concentrations in the subject group and the stroke patient group.
- FIG. 10 shows the ROC curve of HDL cholesterol.
- the feature of the above method of the present invention is that the concentration of phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol in a test sample derived from a subject is used as a molecular marker.
- Test samples collected from subjects include urine, whole blood, plasma, serum, or blood-derived samples, but samples that can be prepared from peripheral blood are preferred from the viewpoint of simplicity.
- Peripheral blood may be collected from any part of the subject, but is typically collected from a vein. For example, by collecting peripheral blood from the arm vein, the present invention can be carried out easily and with less burden on the subject.
- plasma is separated from the collected peripheral blood, and the concentration of phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol in the plasma is measured.
- the phosphatidylinositol to be measured in the present invention is one of acidic phospholipids having inositol as a polar group, and may be abbreviated as PI.
- PI acidic phospholipids having inositol as a polar group
- molecular species depending on the combination of the 1st and 2nd fatty acids. For example, when the total number of carbon atoms of the fatty acid ester-bonded at the 1 and 2 positions is predicted to be 38 and the total number of double bonds is 4 based on the molecular weight estimated from the result of mass spectrometry analysis of the molecular species of phosphatidylinositol. And phosphatidylinositol (38: 4).
- the phosphatidylinositol to be measured in the present invention is selected from the following phosphatidylinositols (1) to (14).
- phosphatidylinositol ( 34: 1) (sn-1, carbon number of fatty acid residue at position 2, phosphatidylinositol whose total number of double bonds is 34, 1) (3) From the molecular weight estimated from the result of analysis by mass spectrometry, the total number of carbon atoms of fatty acids ester-bonded at positions 1 and 2 is estimated to be 36 and the total number of double bonds is 1, so that phosphatidylinositol ( 36: 1) (sn-1, carbon number of fatty acid residue at position 2, phosphatidylinositol where the sum of double bonds is 36, 1) (4) From the molecular weight estimated from the results of analysis by mass spectrometry, the total number of carbon atoms of fatty acids ester-bonded at positions 1 and 2 is estimated to be 36 and the total number of double bonds is 4, so that phosphatidylinositol ( 36: 4) (sn-1, carbon number of fatty acid residue at position 2, phosphatid
- phosphatidylinositol ( 36: 5) (sn-1, carbon number of fatty acid residue at position 2, phosphatidylinositol where the sum of double bonds is 36, 5) (6) From the molecular weight estimated from the results of analysis by mass spectrometry, the total number of carbon atoms of fatty acids ester-bonded at positions 1 and 2 is 38, and the total number of double bonds is predicted to be 2.
- phosphatidylinositol 38: 4 (sn-1, the number of carbon atoms of the fatty acid residue at the 2-position, and the sum of double bonds is 38, 4 phosphatidylinositol) (9) From the molecular weight estimated from the results of analysis by mass spectrometry, the total number of carbon atoms of fatty acids ester-bonded at positions 1 and 2 is estimated to be 38, and the total number of double bonds is predicted to be 6.
- phosphatidylinositol 38: 6) (sn-1, phosphatidylinositol with the number of carbon atoms of the fatty acid residue at the 2-position and the sum of double bonds being 38, 6) (10) From the molecular weight estimated from the result of analysis by mass spectrometry, the total number of carbon atoms of fatty acids ester-bonded at positions 1 and 2 is estimated to be 40 and the total number of double bonds is predicted to be 5.
- phosphatidylinositol ( 40: 5) (sn-1, phosphatidylinositol in which the number of carbon atoms of the fatty acid residue at position 2 and the sum of double bonds is 40, 5) (11) From the molecular weight estimated from the results of analysis by mass spectrometry, the total number of carbon atoms of fatty acids ester-bonded at positions 1 and 2 is estimated to be 40, and the total number of double bonds is estimated to be 6.
- phosphatidylinositol ( 40: 6) (sn-1, phosphatidylinositol in which the number of carbon atoms of the fatty acid residue at position 2 and the sum of double bonds is 40, 6) (12) From the molecular weight estimated from the results of analysis by mass spectrometry, the total number of carbon atoms of fatty acids ester-bonded at positions 1 and 2 is predicted to be 40 and the total number of double bonds is 7.
- phosphatidylinositol ( 40: 7) (sn-1, the number of carbon atoms of the fatty acid residue at the 2-position, the sum of double bonds is 40, 7 phosphatidylinositol) (13)
- the total number of carbon atoms of the fatty acid ester-bonded at positions 1 and 2 is predicted to be 38, and the total number of double bonds is predicted to be 5. It is expected that the total number of carbon atoms of one fatty acid ester-bonded at the 1-position or 2-position is 18, the number of double bonds is 0, the total number of carbon atoms of the other fatty acid is 20, and the number of double bonds is 5.
- phosphatidylinositol (18: 0/20: 5) (sn-1, phosphatidylinositol in which the number of carbon atoms and the number of double bonds of the 2-position fatty acid residue is 18 and 0 and 20 and 5, respectively)
- the total number of carbon atoms of fatty acids ester-bonded at positions 1 and 2 is predicted to be 38 and the total number of double bonds is 5. It is expected that the total number of carbon atoms of one fatty acid ester-bonded at the 1-position or 2-position is 16, the number of double bonds is 0, the total number of carbon atoms of the other fatty acid is 22, and the number of double bonds is 5.
- phosphatidylinositol (16: 0/22: 5) (sn-1, phosphatidylinositol in which the number of carbon atoms and the number of double bonds in the 2-position fatty acid residue is 16 and 0, and 22 and 5, respectively)
- the lysophosphatidylinositol to be measured in the present invention is selected from the following lysophosphatidylinositols (1) to (3).
- Monoclonal antibodies can be produced by the methods described above.
- the concentration of phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol can also be measured by using an antibody against phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol.
- a known means such as Western blot using an antibody or ELISA can be used.
- the antibody is preferably labeled with a detectable / quantitative label. As labels, radioactive labels, fluorescent labels, and the like are known, and can be appropriately selected and used. From the convenience of detection, biotinylated antibodies are preferred.
- the concentration of phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol in the test sample obtained from the subject is compared with a reference value, and if the concentration is smaller than the reference value, the subject is selected as a subject who may have a stroke. Will be.
- a person skilled in the art can set another reference value according to the purpose. For example, an average value or a median value of the concentration of phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol in a test sample of an appropriate number of controls that are statistically significant can be used as the reference value.
- the control person is a subject not afflicted with a stroke, preferably a healthy subject. In any case, those skilled in the art can appropriately set an appropriate reference value according to the purpose.
- Stroke means an abnormality in the blood vessel in the skull that carries nutrients to the brain, and it means damage to the brain tissue due to inflammation / exclusion due to bleeding or ischemia.
- TIA transient ischemic attack
- atherothrombotic infarction 5.1% for atherothrombotic infarction
- lacunar infarction 7.8%
- cardiogenic cerebral embolism 19.2%
- other cerebral infarction 5.1%, hypertensive cerebral hemorrhage 13.7%, cerebral hemorrhage (other) 3.0%, subarachnoid hemorrhage 6.4% (Stroke Treatment Guidelines 2009 p.2, Japan Stroke Society).
- kits comprising an antibody that specifically recognizes phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol is provided.
- kits more generally include one or more components necessary to perform the assay.
- the components can be standards, reagents (diluents, buffers, etc.), containers and / or devices.
- the present invention also includes a step of measuring the concentration of phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol in a test sample derived from a subject, wherein the concentration of phosphatidylinositol or lysophosphatidylinositol in the test sample is smaller than a reference value.
- the present invention relates to a method for selecting a subject who may suffer from a stroke, wherein the subject judges that the subject may suffer from a stroke.
- a subject may be affected by a stroke means that the subject may be affected after the examination.
- the subjects were stroke patients, and patient-derived plasma samples provided by Proteogenex were used.
- the control group was adults without stroke. This experiment was conducted with the approval of the Ethics Committee for Human Tissue and Gene Utilization Research of Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd. Blood was collected, dispensed with written consent and stored frozen at -80 ° C.
- the concentration of phosphatidylinositol (36: 1) in the peripheral blood of the subject was quantified using a liquid chromatograph mass spectrometer (hereinafter also referred to as LC / MS).
- LC / MS liquid chromatograph mass spectrometer
- the relative values of the amount of phosphatidylinositol (36: 1) in the plasma of the control group and the stroke patient group are summarized in FIG.
- the relative value of phosphatidylinositol (36: 1) in the plasma of the control group was taken as 100.
- the concentration of phosphatidylinositol (36: 1) decreased by about 41% compared with the control group, and a significant difference was observed (P ⁇ 0.0005).
- phosphatidylinositol (36: 1) in plasma was compared between 20 control groups and 40 stroke patient groups in the same manner as in Example 1.
- the subjects were stroke patients, and patient-derived plasma samples provided by Tissue Solutions were used.
- the control group was adults without stroke. This experiment was conducted with the approval of the Ethics Committee for Human Tissue and Gene Utilization Research of Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd. Blood was collected, dispensed with written consent and stored frozen at -80 ° C.
- the relative values of the amount of phosphatidylinositol (36: 1) in the plasma of the control group and the stroke patient group are summarized in FIG.
- the relative value of phosphatidylinositol (36: 1) in the plasma of the control group was taken as 100.
- the concentration of phosphatidylinositol (36: 1) decreased by about 50% compared to the control group, and a significant difference was observed (P ⁇ 0.0001).
- phosphatidylinositol other than phosphatidylinositol (36: 1) could be used as a molecular marker for stroke was also verified using the sample of Example 2 in the same manner as in Example 1.
- the relative value of the amount of each phosphatidylinositol in the plasma of the stroke patient group is summarized in FIG. 5, where the relative value of each phosphatidylinositol in the plasma of the control group is 100.
- the concentration of these phosphatidylinositols was significantly reduced compared to the control group, and it was revealed that these phosphatidylinositols can also be used as molecular markers for stroke.
- lysophosphatidylinositol can be used as a molecular marker for stroke was verified by the same method as in Example 1 using the sample in Example 2.
- the relative value of each lysophosphatidylinositol in the plasma of the control group is taken as 100, and the relative value of the amount of each lysophosphatidylinositol in the plasma of the stroke patient group is summarized in FIG.
- the concentration of these lysophosphatidylinositols was significantly reduced compared to the control group, and it was revealed that these lysophosphatidylinositols can also be used as molecular markers for stroke.
- Example 2 can be distinguished by a method in which each can be distinguished. It was verified whether it could be used as a molecular marker for stroke. Specifically, after adding an internal standard solution to plasma from each subject, an organic solvent was added to remove protein, and the supernatant was collected by stirring and centrifugation. This supernatant was measured by LC / MS / MS, and phosphatidylinositol in blood was quantified.
- Nexera (Shimadzu Corporation) -API5000 (AB SCIEX) was used for the LC / MS / MS system. After separation and elution of blood components under reverse phase conditions, detection was performed by electrospray ionization method and negative ion mode.
- Analyst (AB SCIEX) analyzes the peak areas of phosphatidylinositol (18: 0/20: 5), phosphatidylinositol (16: 0/22: 5) and internal standard, and calculates the area ratio. Then, phosphatidylinositol (18: 0/20: 5) and phosphatidylinositol (16: 0/22: 5) in plasma were quantified. The results are summarized in FIG.
- the concentrations of phosphatidylinositol (18: 0/20: 5) and phosphatidylinositol (16: 0/22: 5) were decreased by about 75% and about 35%, respectively, compared with the control group. Admitted.
- HDL cholesterol levels were measured between 20 control groups and 40 stroke patient groups.
- concentration of HDL cholesterol was measured using an HDL-cholesrelol measurement kit (Colles Test (R) N HDL, Sekisui Medical Co., Ltd.).
- the measurement results were subjected to ROC analysis, and the results are summarized in FIG.
- the AUC was 0.801.
- phosphatidylinositol (36: 1), phosphatidylinositol (36: 5), phosphatidylinositol (40: 5), phosphatidylinositol (40: 6), and lysophosphatidylinositol (20: 5) are more It proved to be excellent as a molecular marker.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本発明は、脳卒中の診断に関する。詳細には、本発明は、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールを分子マーカーとする脳卒中の診断に関する。
Description
本発明は、脳卒中の診断に関する。詳細には、本発明は、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールを分子マーカーとする脳卒中の診断に関する。
脳卒中は1980年以降、日本人の死亡原因として癌、心疾患についで第3位であり、脳に栄養を運ぶ頭蓋内の血管に異常が発生し、出血による炎症・圧排または虚血による脳組織の障害により発症する。日本脳卒中データバンクに登録された47,782例の解析では脳卒中の病型別頻度は、一過性虚血発作(TIA)5.8%、アテローム血栓性梗塞5.1%、ラクナ梗塞22.7%、心原性脳塞栓症19.2%、その他の脳梗塞5.1%、高血圧性脳出血13.7%、脳出血(その他)3.0%、クモ膜下出血6.4%となっており(非特許文献1)、虚血性疾患の中でも動脈硬化の破綻が直接の発症要因となる冠動脈疾患と比較して、動脈硬化以外の要因での発症が約半数存在する点が特徴である。
脳卒中は、心筋梗塞と比較して3~10倍の発症率であり(非特許文献1)、仮に救命されたとしても脳卒中後遺症による障害を抱えた生活を余儀なくされ、介護が必要な寝たきりになる疾患の第一位である点が大きな社会的課題である。
脳卒中の診断は、問診・病歴聴取、神経学的診察および一般臨床検査を経て、最終的には頭部CTまたはMRIによる画像診断により、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血など基本病型の診断が行われる。
しかし、脳卒中を特異的に診断する生化学的マーカーはこれまでに知られていない。
脳卒中治療ガイドライン2009 p.2,日本脳卒中学会
簡便な方法で、脳卒中を診断するための手段・方法を開発することが本発明の課題である。
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を行い、末梢血中のホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールをマーカーにすることで、脳卒中を診断できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
(1)被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中を罹患していることの指標とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別方法。
(2)ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)である、(1)に記載の方法。
(3)前記測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患している可能性があると判断する、(1)または(2)記載の方法。
(4)被験試料が血液である、(1)~(3)いずれかに記載の方法。
(5)前記測定が質量分析またはホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)と特異的に結合する抗体もしくは抗体断片を用いて行うものである、(1)~(4)いずれかに記載の方法。
(6)(1)~(5)いずれかに記載の方法に使用するためのキット。
(7)ホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)と特異的に結合する抗体もしくは抗体断片を含有することを特徴とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別キット。
(8)ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの脳卒中のマーカーとしての使用。
(9)ホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)の脳卒中のマーカーとしての使用。
(10)被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中の罹患リスクの指標とする、脳卒中を罹患する可能性がある被験者の選別方法。
(11)ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)である、(10)に記載の方法。
(12)前記測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患する可能性があると判断する、(10)または(11)に記載の方法。
(13)被験試料が血液である、(10)~(12)いずれかに記載の方法。
(14)前記測定が質量分析またはホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)と特異的に結合する抗体もしくは抗体断片を用いて行うものである、(10)~(13)いずれかに記載の方法。
(15)(10)~(14)いずれかに記載の方法に使用するためのキット。
などを提供する。
(1)被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中を罹患していることの指標とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別方法。
(2)ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)である、(1)に記載の方法。
(3)前記測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患している可能性があると判断する、(1)または(2)記載の方法。
(4)被験試料が血液である、(1)~(3)いずれかに記載の方法。
(5)前記測定が質量分析またはホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)と特異的に結合する抗体もしくは抗体断片を用いて行うものである、(1)~(4)いずれかに記載の方法。
(6)(1)~(5)いずれかに記載の方法に使用するためのキット。
(7)ホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)と特異的に結合する抗体もしくは抗体断片を含有することを特徴とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別キット。
(8)ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの脳卒中のマーカーとしての使用。
(9)ホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)の脳卒中のマーカーとしての使用。
(10)被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中の罹患リスクの指標とする、脳卒中を罹患する可能性がある被験者の選別方法。
(11)ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)である、(10)に記載の方法。
(12)前記測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患する可能性があると判断する、(10)または(11)に記載の方法。
(13)被験試料が血液である、(10)~(12)いずれかに記載の方法。
(14)前記測定が質量分析またはホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)と特異的に結合する抗体もしくは抗体断片を用いて行うものである、(10)~(13)いずれかに記載の方法。
(15)(10)~(14)いずれかに記載の方法に使用するためのキット。
などを提供する。
本発明は、簡単に脳卒中を診断することができ、しかも被験者の負担が少なくて済むことを特徴としている。
本発明は、1の態様において、被験者が脳卒中に罹患している可能性の有無を判断する方法を提供する。該方法は、被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中を罹患していることの指標とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別方法に関するものである。また、本発明は、被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトール濃度を測定する工程を含み、ここで、被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトール濃度が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患している可能性があると判断する、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別方法に関するものである。
本発明の上記方法の特徴は、被験者由来の被験試料中のホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を分子マーカーとして用いることである。被験者から採取する被験試料は、尿、全血、血漿、血清、または血液に由来するものが含まれるが、簡便性の観点から末梢血から調製できる試料が好ましい。末梢血は被験者のいずれの部位から採取してもよいが、静脈からの採取が一般的である。例えば、腕静脈から末梢血を採取することにより、本発明を簡便かつ被験者への負担を少なくして実施できる。好ましくは、採取した末梢血から血漿を分離し、血漿中のホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する。
本発明における測定対象のホスファチジルイノシトールは、極性基にイノシトールをもつ酸性リン脂質の1つであり、PIと略記されることもある。1位、2位の脂肪酸の組み合わせの違いによって多種類の分子種が存在する。例えば、ホスファチジルイノシトールの分子種を質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38、2重結合の合計が4と予測された場合、ホスファチジルイノシトール(38:4)という表記を行う。
また、タンデム質量分析法によるフラグメントイオンの解析から1位あるいは2位にエステル結合した各脂肪酸の炭素数と2重結合の数が特定できる場合、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:4)という表記を行う。
また、タンデム質量分析法によるフラグメントイオンの解析から1位あるいは2位にエステル結合した各脂肪酸の炭素数と2重結合の数が特定できる場合、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:4)という表記を行う。
本発明における測定対象のホスファチジルイノシトールは、以下の(1)~(14)のホスファチジルイノシトールから選択される。
(1)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が32で、2重結合の合計が0と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(32:0)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、32、0のホスファチジルイノシトール)
(2)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が34で、2重結合の合計が1と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(34:1)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、34、1のホスファチジルイノシトール)
(3)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が36で、2重結合の合計が1と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(36:1)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、36、1のホスファチジルイノシトール)
(4)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が36で、2重結合の合計が4と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(36:4)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、36、4のホスファチジルイノシトール)
(5)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が36で、2重結合の合計が5と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(36:5)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、36、5のホスファチジルイノシトール)
(6)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が2と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(38:2)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、38、2のホスファチジルイノシトール)
(7)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が3と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(38:3)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、38、3のホスファチジルイノシトール)
(8)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が4と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(38:4)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、38、4のホスファチジルイノシトール)
(9)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が6と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(38:6)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、38、6のホスファチジルイノシトール)
(10)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が40で、2重結合の合計が5と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(40:5)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、40、5のホスファチジルイノシトール)
(11)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が40で、2重結合の合計が6と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(40:6)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、40、6のホスファチジルイノシトール)
(12)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が40で、2重結合の合計が7と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(40:7)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、40、7のホスファチジルイノシトール)
(13)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が5と予測され、フラグメントイオンの解析から1位あるいは2位にエステル結合した一方の脂肪酸の炭素数の合計が18、二重結合の数が0、他方の脂肪酸の炭素数の合計が20、二重結合の数が5と予想されるので、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数と二重結合の数が、それぞれ18と0、20と5のホスファチジルイノシトール)
(14)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が5と予測され、フラグメントイオンの解析から1位あるいは2位にエステル結合した一方の脂肪酸の炭素数の合計が16、二重結合の数が0、他方の脂肪酸の炭素数の合計が22、二重結合の数が5と予想されるので、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数と二重結合の数が、それぞれ16と0、22と5のホスファチジルイノシトール)
(1)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が32で、2重結合の合計が0と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(32:0)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、32、0のホスファチジルイノシトール)
(2)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が34で、2重結合の合計が1と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(34:1)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、34、1のホスファチジルイノシトール)
(3)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が36で、2重結合の合計が1と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(36:1)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、36、1のホスファチジルイノシトール)
(4)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が36で、2重結合の合計が4と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(36:4)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、36、4のホスファチジルイノシトール)
(5)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が36で、2重結合の合計が5と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(36:5)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、36、5のホスファチジルイノシトール)
(6)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が2と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(38:2)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、38、2のホスファチジルイノシトール)
(7)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が3と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(38:3)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、38、3のホスファチジルイノシトール)
(8)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が4と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(38:4)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、38、4のホスファチジルイノシトール)
(9)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が6と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(38:6)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、38、6のホスファチジルイノシトール)
(10)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が40で、2重結合の合計が5と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(40:5)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、40、5のホスファチジルイノシトール)
(11)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が40で、2重結合の合計が6と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(40:6)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、40、6のホスファチジルイノシトール)
(12)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が40で、2重結合の合計が7と予測されるので、ホスファチジルイノシトール(40:7)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、40、7のホスファチジルイノシトール)
(13)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が5と予測され、フラグメントイオンの解析から1位あるいは2位にエステル結合した一方の脂肪酸の炭素数の合計が18、二重結合の数が0、他方の脂肪酸の炭素数の合計が20、二重結合の数が5と予想されるので、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数と二重結合の数が、それぞれ18と0、20と5のホスファチジルイノシトール)
(14)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が38で、2重結合の合計が5と予測され、フラグメントイオンの解析から1位あるいは2位にエステル結合した一方の脂肪酸の炭素数の合計が16、二重結合の数が0、他方の脂肪酸の炭素数の合計が22、二重結合の数が5と予想されるので、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)(sn-1、2位の脂肪酸残基の炭素数と二重結合の数が、それぞれ16と0、22と5のホスファチジルイノシトール)
本発明における測定対象の1つのホスファチジルイノシトール(36:1)の例を図1に示す。
本発明における測定対象のリゾホスファチジルイノシトールは、極性基にイノシトールをもつ酸性リン脂質の1つであり、LPIと略記されることもある。含有する脂肪酸の違いによって多種類の分子種が存在する。例えば、リゾホスファチジルイノシトールの分子種を質量分析で解析した結果から推定される分子量より、エステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が18、2重結合の合計が1と予測された場合、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)という表記を行う。
本発明における測定対象のリゾホスファチジルイノシトールは、以下の(1)~(3)のリゾホスファチジルイノシトールから選択される。
(1)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、エステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が18で、2重結合の合計が0と予測されるので、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)(脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、18、0のリゾホスファチジルイノシトール)
(2)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、エステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が18で、2重結合の合計が1と予測されるので、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)(脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、18、1のリゾホスファチジルイノシトール)。
(3)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、エステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が20で、2重結合の合計が5と予測されるので、リゾホスファチジルイノシトール(20:5)(脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、20、5のリゾホスファチジルイノシトール)。
(1)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、エステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が18で、2重結合の合計が0と予測されるので、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)(脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、18、0のリゾホスファチジルイノシトール)
(2)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、エステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が18で、2重結合の合計が1と予測されるので、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)(脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、18、1のリゾホスファチジルイノシトール)。
(3)質量分析で解析した結果から推定される分子量より、エステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が20で、2重結合の合計が5と予測されるので、リゾホスファチジルイノシトール(20:5)(脂肪酸残基の炭素数、二重結合の総和が、20、5のリゾホスファチジルイノシトール)。
ホスファチジルイノシトールおよびリゾホスファチジルイノシトールの濃度の測定は、Journal of Separation Science、2012年、第35巻、1845-1853ページまたはAnalytical Biochemistry、2008年、第375巻、124-131ページなどを参照して、質量分析をすることにより行う。
抗体は、免疫原にホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールを用いて調製することができる。ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールは、低分子化合物であるため単独で免疫原として抗体を産生することは難しいと考えられることから、キャリアタンパクと複合体を調製することが望ましい。免疫原で免疫される哺乳動物としては、一般には、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどが用いられる。免疫方法は一般的方法により、例えば免疫原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射などにより投与することにより行い得る。免疫後に哺乳動物から抗血清を採血し、ポリクローナル抗体を作製、あるいは形質細胞(免疫細胞)を採取し、例えば、「分子細胞生物学基礎実験法」(南江堂 堀江武一ら 1994)等に記載されている方法により、モノクローナル抗体を作製することができる。
また、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールに対する抗体を用いることによって、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定することもできる。このような測定には、抗体を用いるウェスタンブロットやELISAなどの公知の手段を用いることができる。抗体には検出・定量可能な標識を付すことが好ましい。標識としては放射性標識、蛍光標識などが知られており、適宜選択して用いることができる。検出の利便性から、ビオチン化された抗体などが好ましい。
また、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールに対する抗体を用いることによって、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定することもできる。このような測定には、抗体を用いるウェスタンブロットやELISAなどの公知の手段を用いることができる。抗体には検出・定量可能な標識を付すことが好ましい。標識としては放射性標識、蛍光標識などが知られており、適宜選択して用いることができる。検出の利便性から、ビオチン化された抗体などが好ましい。
次いで、被験者から得られた被験試料中のホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を基準値と比較し、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患している可能性がある被験者として選別されることになる。基準値は、当業者であれば目的に応じて別の基準値を設定することが出来る。
例えば、統計学上有意となるような適切な数の対照者の被験試料中のホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度の平均値や中央値なども基準値として用いることができる。対照者は、脳卒中に罹患していない被験者であり、好ましくは健康な被験者である。
いずれにしても、当業者であれば目的に応じて、適宜適当な基準値を設定することが出来る。
例えば、統計学上有意となるような適切な数の対照者の被験試料中のホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度の平均値や中央値なども基準値として用いることができる。対照者は、脳卒中に罹患していない被験者であり、好ましくは健康な被験者である。
いずれにしても、当業者であれば目的に応じて、適宜適当な基準値を設定することが出来る。
被験者が脳卒中に罹患している可能性とは、被験者が検査時に脳卒中に罹病している可能性がある場合のことを意味する。
脳卒中は、脳に栄養を運ぶ頭蓋内の血管に異常が発生し、出血による炎症・圧排または虚血による脳組織の障害を意味する。日本脳卒中データバンクに登録された47,782例の解析では脳卒中の病型別頻度は、一過性虚血発作(TIA)5.8%、アテローム血栓性梗塞5.1%、ラクナ梗塞22.7%、心原性脳塞栓症19.2%、その他の脳梗塞5.1%、高血圧性脳出血13.7%、脳出血(その他)3.0%、クモ膜下出血6.4%である(脳卒中治療ガイドライン2009 p.2,日本脳卒中学会)。
本発明は、もう1つの態様において、被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中を罹患していることの指標とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別方法に使用するキットを提供する。
具体的には、ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールを特異的に認識する抗体を含有することを特徴とするキットを提供する。このようなキットは、更に一般的にアッセイを実行するために必要な1つ以上の構成要素を含む。構成要素は、標準品、試薬(希釈液、緩衝液など)、容器及び/又は装置であり得る。
本発明は、1の態様において、被験者が脳卒中に罹患するリスクの有無を判断する方法を提供する。該方法は、被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中の罹患リスクの指標とする、脳卒中を罹患する可能性がある被験者の選別方法に関するものである。また、本発明は、被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、ここで、被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患する可能性があると判断する、脳卒中を罹患する可能性がある被験者の選別方法に関するものである。
被験者が脳卒中に罹患する可能性があるとは、被験者が検査時以降に罹患する可能性がある場合のことを意味する。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
末梢血中のホスファチジルイノシトール(36:1)を分子マーカーとして用いる脳卒中の診断
脳卒中における新規マーカーとしてのホスファチジルイノシトール(36:1)の性能を調べるために、血漿中のホスファチジルイノシトール(36:1)の濃度を対照者群20名及び脳卒中の患者群10名の間で比較した。
脳卒中における新規マーカーとしてのホスファチジルイノシトール(36:1)の性能を調べるために、血漿中のホスファチジルイノシトール(36:1)の濃度を対照者群20名及び脳卒中の患者群10名の間で比較した。
対象は脳卒中患者であり、Proteogenex社より提供される患者由来血漿試料を用いた。対照群は脳卒中に罹患していない成人とした。この実験は塩野義製薬株式会社のヒト組織・遺伝子利用研究倫理委員会の審査承認を得て行った。血液は文書で同意を得て採血、分注して-80℃にて凍結保存した。
被験者の末梢血中のホスファチジルイノシトール(36:1)の濃度は、液体クロマトグラフ質量分析計(以下、LC/MSともいう)を用いて定量した。
以下、本発明者らが、末梢血中のホスファチジルイノシトール(36:1)の濃度を定量するために使用したLC/MSの系を具体的に示す。
以下、本発明者らが、末梢血中のホスファチジルイノシトール(36:1)の濃度を定量するために使用したLC/MSの系を具体的に示す。
各対象からの血漿に内部標準溶液を加えた後、有機溶媒を加え除タンパク処理し、撹拌・遠心して上清を回収した。この上清をLC/MSにて測定し、血中のホスファチジルイノシトール(36:1)を定量した。LC/MSシステムには、Ultra Performance Liquid Chromatography(Waters)‐LTQ Orbitrap(Thermo Scientific)を用いた。逆相条件下で血中成分を分離・溶出した後、エレクトロスプレーイオン化法、ネガティブイオンモードにより検出を行った。Xcalibur(Thermo Scientific)にて、ホスファチジルイノシトール(36:1)および内部標準物質のピークエリアを解析し、そのエリア比を算出することで、血漿中のホスファチジルイノシトール(36:1)を定量した。
対照群および脳卒中患者群の血漿中のホスファチジルイノシトール(36:1)の量の相対値を図2にまとめた。対照群の血漿中のホスファチジルイノシトール(36:1)の相対値を100とした。
脳卒中患者群では、対照群に対しホスファチジルイノシトール(36:1)の濃度が約41% 減少し、有意差が認められた(P<0.0005)。
脳卒中患者群では、対照群に対しホスファチジルイノシトール(36:1)の濃度が約41% 減少し、有意差が認められた(P<0.0005)。
末梢血中のホスファチジルイノシトール(36:1)を分子マーカーとして用いる脳卒中の診断の検証
更に、ホスファチジルイノシトール(36:1)の脳卒中の分子マーカーとしての有用性を検証するため、血漿中のホスファチジルイノシトール(36:1)の濃度を対照者群20名及び脳卒中の患者群40名の間で、実施例1と同様の方法で比較した。
更に、ホスファチジルイノシトール(36:1)の脳卒中の分子マーカーとしての有用性を検証するため、血漿中のホスファチジルイノシトール(36:1)の濃度を対照者群20名及び脳卒中の患者群40名の間で、実施例1と同様の方法で比較した。
対象は脳卒中患者であり、Tissue Solutions社より提供される患者由来血漿試料を用いた。対照群は脳卒中に罹患していない成人とした。この実験は塩野義製薬株式会社のヒト組織・遺伝子利用研究倫理委員会の審査承認を得て行った。血液は文書で同意を得て採血、分注して-80℃にて凍結保存した。
対照群および脳卒中患者群の血漿中のホスファチジルイノシトール(36:1)の量の相対値を図3にまとめた。対照群の血漿中のホスファチジルイノシトール(36:1)の相対値を100とした。
脳卒中患者群では、対照群に対しホスファチジルイノシトール(36:1)の濃度が約50% 減少し、有意差が認められた(P<0.0001)。
脳卒中患者群では、対照群に対しホスファチジルイノシトール(36:1)の濃度が約50% 減少し、有意差が認められた(P<0.0001)。
実施例2で得られた結果について、ROC解析を行い、結果を図4にまとめた。AUCは0.896であった。
ホスファチジルイノシトール(36:1)以外の、ホスファチジルイノシトールも同様に脳卒中の分子マーカーとして利用できないかを、実施例2のサンプルを用いて、実施例1と同様の方法で検証した。
対照群の血漿中の各ホスファチジルイノシトールの相対値を100として、脳卒中患者群の血漿中の各ホスファチジルイノシトールの量の相対値を図5にまとめた。
脳卒中患者群では、対照群に対しこれらのホスファチジルイノシトールの濃度が有意に減少しており、これらのホスファチジルイノシトールについても脳卒中の分子マーカーとして利用できることが明らかになった。
対照群の血漿中の各ホスファチジルイノシトールの相対値を100として、脳卒中患者群の血漿中の各ホスファチジルイノシトールの量の相対値を図5にまとめた。
脳卒中患者群では、対照群に対しこれらのホスファチジルイノシトールの濃度が有意に減少しており、これらのホスファチジルイノシトールについても脳卒中の分子マーカーとして利用できることが明らかになった。
実施例4で得られたホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)の結果について、ROC解析を行い、結果を図6A~図6Cにまとめた。AUCはホスファチジルイノシトール(36:5)が0.965、ホスファチジルイノシトール(40:5)が0.821、ホスファチジルイノシトール(40:6)が0.839であった。
また、リゾホスファチジルイノシトールも同様に脳卒中の分子マーカーとして利用できないかを、実施例2のサンプルを用いて、実施例1と同様の方法で、検証した。
対照群の血漿中の各リゾホスファチジルイノシトールの相対値を100として、脳卒中患者群の血漿中の各リゾホスファチジルイノシトールの量の相対値を図7にまとめた。
脳卒中患者群では、対照群に対しこれらのリゾホスファチジルイノシトールの濃度が有意に減少しており、これらのリゾホスファチジルイノシトールについても脳卒中の分子マーカーとして利用できることが明らかになった。
対照群の血漿中の各リゾホスファチジルイノシトールの相対値を100として、脳卒中患者群の血漿中の各リゾホスファチジルイノシトールの量の相対値を図7にまとめた。
脳卒中患者群では、対照群に対しこれらのリゾホスファチジルイノシトールの濃度が有意に減少しており、これらのリゾホスファチジルイノシトールについても脳卒中の分子マーカーとして利用できることが明らかになった。
実施例6で得られたリゾホスファチジルイノシトール(20:5)の結果について、ROC解析を行い、結果を図8にまとめた。AUCは0.863であった。
また、ホスファチジルイノシトール(38:5)については、1,2位にエステル結合した脂肪酸の炭素数・2重結合について複数の組み合わせが考えられるので、それぞれが区別できる方法で、実施例2のサンプルを用いて、脳卒中の分子マーカーとして利用できないかを検証した。
具体的には、各対象からの血漿に内部標準溶液を加えた後、有機溶媒を加え除タンパク処理し、撹拌・遠心して上清を回収した。この上清をLC/MS/MSにて測定し、血中のホスファチジルイノシトールを定量した。LC/MS/MSシステムには、Nexera(島津製作所)‐API5000(AB SCIEX)を用いた。逆相条件下で血中成分を分離・溶出した後、エレクトロスプレーイオン化法、ネガティブイオンモードにより検出を行った。Analyst(AB SCIEX)にて、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)および内部標準物質のピークエリアを解析し、そのエリア比を算出することで、血漿中のホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)を定量した。結果を図9にまとめた。
脳卒中患者群では、対照群に対しホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)の濃度が、それぞれ約75%、約35%減少し、有意差が認められた。
具体的には、各対象からの血漿に内部標準溶液を加えた後、有機溶媒を加え除タンパク処理し、撹拌・遠心して上清を回収した。この上清をLC/MS/MSにて測定し、血中のホスファチジルイノシトールを定量した。LC/MS/MSシステムには、Nexera(島津製作所)‐API5000(AB SCIEX)を用いた。逆相条件下で血中成分を分離・溶出した後、エレクトロスプレーイオン化法、ネガティブイオンモードにより検出を行った。Analyst(AB SCIEX)にて、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)および内部標準物質のピークエリアを解析し、そのエリア比を算出することで、血漿中のホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)を定量した。結果を図9にまとめた。
脳卒中患者群では、対照群に対しホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)の濃度が、それぞれ約75%、約35%減少し、有意差が認められた。
実施例2のサンプルを用いて、HDLコレステロール濃度を対照者群20名及び脳卒中の患者群40名の間で測定した。HDLコレステロールの濃度の測定は、HDL-コレスレロール測定キット(コレステスト(R)N HDL、積水メディカル株式会社)を用いて行った。
測定結果について、ROC解析を行い、結果を図9にまとめた。AUCは0.801であった。このことから、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、リゾホスファチジルイノシトール(20:5)の方が、脳卒中の分子マーカーとして、優れていることが判明した。
測定結果について、ROC解析を行い、結果を図9にまとめた。AUCは0.801であった。このことから、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、リゾホスファチジルイノシトール(20:5)の方が、脳卒中の分子マーカーとして、優れていることが判明した。
以上より、ホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)は、末梢血で定量可能な脳卒中の分子マーカーとして使用可能であることが確認された。
本発明は、医薬品の分野、特に脳卒中の診断のための体外診断用医薬品分野において利用可能である。
Claims (6)
- 被験者由来の被験試料におけるホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定する工程を含み、その測定値を脳卒中を罹患していることの指標とする、脳卒中を罹患している可能性がある被験者の選別方法。
- ホスファチジルイノシトールまたはリゾホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)である、請求項1に記載の方法。
- 前記測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者が脳卒中を罹患している可能性があると判断する、請求項1または2に記載の方法。
- 被験試料が血液である、請求項1から請求項3のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から請求項4のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
- ホスファチジルイノシトール(32:0)、ホスファチジルイノシトール(34:1)、ホスファチジルイノシトール(36:1)、ホスファチジルイノシトール(36:4)、ホスファチジルイノシトール(36:5)、ホスファチジルイノシトール(38:2)、ホスファチジルイノシトール(38:3)、ホスファチジルイノシトール(38:4)、ホスファチジルイノシトール(38:6)、ホスファチジルイノシトール(40:5)、ホスファチジルイノシトール(40:6)、ホスファチジルイノシトール(40:7)、ホスファチジルイノシトール(18:0/20:5)、ホスファチジルイノシトール(16:0/22:5)、リゾホスファチジルイノシトール(18:0)、リゾホスファチジルイノシトール(18:1)またはリゾホスファチジルイノシトール(20:5)の脳卒中のマーカーとしての使用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016514960A JPWO2015163342A1 (ja) | 2014-04-23 | 2015-04-22 | 脳卒中診断マーカー |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014-088954 | 2014-04-23 | ||
JP2014088954 | 2014-04-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2015163342A1 true WO2015163342A1 (ja) | 2015-10-29 |
Family
ID=54332505
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2015/062173 WO2015163342A1 (ja) | 2014-04-23 | 2015-04-22 | 脳卒中診断マーカー |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2015163342A1 (ja) |
WO (1) | WO2015163342A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017069135A1 (ja) * | 2015-10-20 | 2017-04-27 | 塩野義製薬株式会社 | 冠動脈疾患の診断マーカー |
WO2017155100A1 (en) * | 2016-03-11 | 2017-09-14 | Okinawa Institute Of Science And Technology School Corporation | A method, an apparatus, a system and a kit for determining the extent of aging |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005304476A (ja) * | 2004-03-25 | 2005-11-04 | Kazue Igarashi | ポリアミン、アクロレインの含有量又はポリアミンオキシダーゼ活性又はその蛋白質量を指標とした脳卒中・無症候性脳梗塞の診断方法 |
-
2015
- 2015-04-22 WO PCT/JP2015/062173 patent/WO2015163342A1/ja active Application Filing
- 2015-04-22 JP JP2016514960A patent/JPWO2015163342A1/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005304476A (ja) * | 2004-03-25 | 2005-11-04 | Kazue Igarashi | ポリアミン、アクロレインの含有量又はポリアミンオキシダーゼ活性又はその蛋白質量を指標とした脳卒中・無症候性脳梗塞の診断方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MASAHIKO IKEDA ET AL.: "Phospholipid Metabolism in Platelets from Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rats and Wistar Kyoto Rats", J. PHARMACOBIO. DYN., vol. 15, no. 2, February 1992 (1992-02-01), pages 49 - 57, XP055233058 * |
YASUHISA KITAGAWA ET AL.: "Nokosoku ni Okeru Ko Phosphatidylinositol Kotai to Ko Phosphatidylserine Kotai ni Kansuru Kento", JAPANESE JOURNAL OF STROKE, vol. 23, no. 1, 25 March 2001 (2001-03-25), pages 83 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017069135A1 (ja) * | 2015-10-20 | 2017-04-27 | 塩野義製薬株式会社 | 冠動脈疾患の診断マーカー |
EP3373014A4 (en) * | 2015-10-20 | 2019-08-14 | MedImmune, LLC | MARKER FOR THE DIAGNOSIS OF CORONAROPATHY |
EP3859342A1 (en) * | 2015-10-20 | 2021-08-04 | MedImmune, LLC | Diagnostic marker for coronary artery disease |
WO2017155100A1 (en) * | 2016-03-11 | 2017-09-14 | Okinawa Institute Of Science And Technology School Corporation | A method, an apparatus, a system and a kit for determining the extent of aging |
JP2019509489A (ja) * | 2016-03-11 | 2019-04-04 | 学校法人沖縄科学技術大学院大学学園 | 老化度を決定するための方法、装置、システム及びキット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2015163342A1 (ja) | 2017-04-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230393133A1 (en) | Blood biomarker that predicts persistent cognitive dysfunction after concussion | |
Meyer et al. | Plasma p‐tau231, p‐tau181, PET biomarkers, and cognitive change in older adults | |
US9175346B2 (en) | Evaluation method for arteriosclerosis | |
JP2018513368A (ja) | 認知力低下のリスクを予測するための方法 | |
Anada et al. | Panel of serum protein biomarkers to grade the severity of traumatic brain injury | |
He | Implementation of proteomics in clinical trials | |
Anand et al. | Serum biomarkers predictive of pre-eclampsia | |
JP6113798B2 (ja) | 認知機能障害疾患のバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いる認知機能障害疾患の検出方法 | |
WO2015163342A1 (ja) | 脳卒中診断マーカー | |
US20150338412A1 (en) | Composition for diagnosis of lung cancer and diagnosis kit for lung cancer | |
Choi et al. | Endogenous Aβ peptide promote Aβ oligomerization tendency of spiked synthetic Aβ in Alzheimer's disease plasma | |
JP2022516991A (ja) | マルチプレックスアッセイおよびその使用方法 | |
US20210231682A1 (en) | Compositions and methods for treating vascular disease in selected patients | |
US20240069040A1 (en) | Detection of a relapse in a multiple sclerosis patient | |
Long et al. | Clinical features of Chinese patients with multiple sclerosis with aquaporin-4 antibodies in cerebrospinal fluid but not serum | |
JP6830899B2 (ja) | 冠動脈疾患の診断マーカー | |
WO2019012667A1 (ja) | 認知機能障害疾患のバイオマーカー及び該バイオマーカーを用いる認知機能障害疾患の検出方法 | |
EP2772759B1 (en) | Composition for diagnosis of lung cancer | |
Bae et al. | Serum Ceruloplasmin as a Potential Clinical Biomarker in Atopic Dermatitis | |
JP6193942B2 (ja) | 認知機能障害疾患のバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いる認知機能障害疾患の検出方法 | |
JP7336097B2 (ja) | 乳がんに関するペプチドマーカー | |
JP2014020941A (ja) | 大腸癌のマーカーおよびそれを用いた診断 | |
Parvizi et al. | Promising diagnostic accuracy of plasma Gfap and Nfl within the ad continuum | |
JP2017215150A (ja) | 膀胱癌マーカー及びその使用 | |
Begcevic | Proteomic-based Signature of Brain-related Proteins as Novel Candidate Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 15782760 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2016514960 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 15782760 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |