WO2006070740A1 - アルツハイマー病の検査方法 - Google Patents

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WO2006070740A1
WO2006070740A1 PCT/JP2005/023781 JP2005023781W WO2006070740A1 WO 2006070740 A1 WO2006070740 A1 WO 2006070740A1 JP 2005023781 W JP2005023781 W JP 2005023781W WO 2006070740 A1 WO2006070740 A1 WO 2006070740A1
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amyloid
alzheimer
protein
disease
polymerization
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PCT/JP2005/023781
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Masahito Yamada
Kenjiro Ono
Hironobu Naiki
Original Assignee
National University Corporation Kanazawa University
University Of Fukui
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining Alzheimer's disease for accurately and simply examining Alzheimer's disease.
  • Alzheimer's disease is a major cause of progressive mental disorders in the elderly in developed countries.
  • Neurofibrillary tangles such as abnormalities in neuronal structural proteins and the appearance of phosphorylated tau, amyloid protein peptide production ⁇ Characterized by neuropathological lesions such as senile plaque formation due to deposition and tissue destruction and inflammatory response, and loss of neuronal cells.
  • amyloid protein polymerization and deposition due to fibrosis There are various causes for the progression of Alzheimer's disease, one of which is amyloid protein polymerization and deposition due to fibrosis.
  • Amyloid protein is usually produced intracellularly and can be detected not only in Alzheimer's disease patients but also in normal plasma and cerebrospinal fluid (CSF), but non-Alzheimer's disease patients do not have amyloid ⁇ protein deposition or Only in patients with Alzheimer's disease, an increase in amyloid / 3 protein production or a decrease in amyloid ⁇ protein metabolism 'excretion occurs at an early stage, followed by polymerization of amyloid ⁇ protein, massive deposition of amyloid plaques, etc. Progressive dementia symptoms.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • amyloid 3 protein, apolipoprotein E (apolipoprotein E: apoE), apolipoprotein J (apolipoprotein J: apoJ), serum amyloid P component (serum amyrloid P com ponent: SAP), transthyretin (TTR), ⁇ 1-antichymotrypsin (ACT), ⁇ -2 macroglobulin ( ⁇ 2 ⁇ ), etc.
  • SAP serum amyloid P component
  • TTR transthyretin
  • ACT ⁇ 1-antichymotrypsin
  • ⁇ 2 ⁇ macroglobulin
  • a sample such as blood is collected from a patient, and a polypeptide specific for a dementia patient contained in the specimen is obtained.
  • a test method for dementia has been proposed in which a polypeptide specific to a dementia patient contained in a specimen is measured by immunoassay using an antigen-antibody reaction with an antibody against the polypeptide (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-2001). — See 193661, etc.). According to this method, it is said that dementia such as Alzheimer's disease can be examined with a small amount of specimen.
  • An amyloid in the sample comprising: contacting the sample with an aggregating amyloid amyloid i3 protein peptide having a fluorescent label covalently bound thereto; and detecting the fluorescent label bound to the sample as indicating amyloid aggregation
  • a method for detecting or monitoring agglutination has been proposed, and for example, it has been proposed to be performed for diagnosing Alzheimer's disease (see, for example, JP-A-2001-50504).
  • amyloid / 3 protein as a polypeptide specific to a dementia patient (Alzheimer's disease patient). Since the / 3 protein is also present in healthy individuals, it must be said that it is insufficient in terms of accuracy to use it as a marker for the detection of Alzheimer's disease. [0008]
  • amyloid i3 protein that has been fluorescently labeled in advance is aggregated, but the bound fluorescent label may have some influence on the aggregation characteristics of amyloid protein. Sex cannot be denied, and the problem remains in terms of accuracy.
  • the sample is, for example, any brain tissue such as cerebral cortex, cerebellum and hippocampal tissue, tissue such as vascular tissue or neuron, etc. It is difficult to say that this is a simple test method that places a heavy burden on the patient. Furthermore, prior to the test, it requires a large amount of fluorescently labeled amyloid protein, which causes various inconveniences such as an increase in cost and a complicated test.
  • the present invention has been proposed in view of such conventional circumstances, and an object thereof is to provide an Alzheimer's disease testing method capable of simply and accurately testing Alzheimer's disease.
  • amyloid protein proceeds in the brain of Alzheimer's disease patients, and there are various theories as the cause of non-deposition in the brain of non-Alzheimer's disease patients, for example, amyloid ⁇
  • amyloid ⁇ examples thereof include an increase in the concentration or activity of a protein polymerization accelerator, a decrease in the concentration or activity of a polymerization inhibitor of amyloid protein, the presence of a polymerization reaction nucleus of amyloid protein, and the like.
  • the brain of Alzheimer's disease patients Therefore, it can be said that the environment suitable for the polymerization of amyloid protein is better than the brain of non-Alzheimer's disease patients.
  • a test solution is prepared by mixing an appropriate amount (for example, 5% by volume or more) of a phosphate buffer solution, and then mixed with an amyloid ⁇ protein solution containing amyloid ⁇ protein and heated to the same level as human body temperature.
  • the degree of polymerization of amyloid ⁇ protein between patients with Alzheimer's disease and non-Alzheimer's disease by maintaining and promoting the polymerization reaction of amyloid protein and ensuring sufficient reaction time until the reaction reaches equilibrium. It was possible to make a difference.
  • a reaction solution obtained by mixing amyloid ⁇ protein, a body fluid collected from a subject and a buffer solution is reacted, and the polymerization reaction of the amyloid ⁇ protein is in an equilibrium state. After reaching the value, the degree of polymerization of the amyloid protein is examined.
  • the polymerization reaction of amyloid protein proceeds in the presence of a body fluid and an appropriate amount of buffer solution, the polymerization promoting factor of amyloid protein, the polymerization inhibitor of amyloid protein, the polymerization reaction nucleus of amyloid protein contained in the body fluid of the subject
  • the degree of polymerization of amyloid protein varies depending on the presence of lysate. For example, if the reaction is carried out using body fluids of Alzheimer's disease patients, the degree of polymerization will ultimately be higher than that of non-Alzheimer's disease patients. (A long length) ⁇ -amyloid fibrils are formed or a large amount of / 3 amyloid fibrils are generated.
  • the present invention uses a bodily fluid that can be easily collected as a sample, the burden on a subject such as an Alzheimer's disease patient is small, and the test can be performed very simply. Although it is conceivable to examine the degree of polymerization of amyloid / 3 protein using brain tissue collected from a patient, collecting brain tissue is not practical because it is extremely burdensome for the patient and lacks convenience.
  • the degree of polymerization of amyloid / 3 protein is determined after the polymerization reaction reaches equilibrium. It is very important to investigate, for example, even if it is investigated at the beginning of the reaction or in the middle of the reaction. But the force Wisniewski T et al.'S report does not consider this point at all. According to a report by Wisniewski T et al., Amyloid / 3 protein is polymerized for up to 70 hours in the presence of CSF, but there is no difference in the degree of polymerization between Alzheimer's disease patients and non-Alzheimer's disease patients. Therefore, it was concluded that the reaction test was stopped before the polymerization reaction reached equilibrium.
  • an appropriate amount of buffer solution is added to the reaction solution with the aim of causing a difference in the degree of polymerization of amyloid ⁇ protein between Alzheimer's disease patients and non-Alzheimer's disease patients.
  • CSF and amyloid protein are simply mixed, and there is no description about adding a buffer solution.
  • the reaction solution after the reaction is mixed with a fluorescent dye, and the degree of coloration of the reaction solution is detected, thereby detecting the polymerization of the amyloid protein.
  • a fluorescent dye after the polymerization reaction of amyloid protein and detecting the degree of luminescence, the function of the polymerization inhibitor of amyloid ⁇ protein (eg, apolipoprotein ⁇ or apolipoprotein J) contained in the body fluid of the subject is weakened. Therefore, it is possible to accurately determine whether or not the patient has Alzheimer's disease.
  • the fluorescent dye is preferably thioflavin T or a derivative thereof.
  • Thioflavin T or its derivative specifically binds to ⁇ -amyloid fibril, which is a polymer of amyloid / 3 protein, and Depending on the degree of synthesis, for example, the molecular weight and the amount of i3 amyloid fibrils, the color develops. Therefore, by using thioflavin T or a derivative thereof as a fluorescent dye, the degree of ⁇ -amyloid fibril formation can be measured more accurately and easily, and the accuracy of Alzheimer's disease detection can be increased.
  • the Alzheimer's disease detection method according to the present invention is extremely accurate as compared with the conventional detection method, and has the advantage that the burden on the patient when collecting a sample (specimen) is small. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a test method for Alzheimer's disease that is accurate and simple and is very useful for early detection and early treatment of Alzheimer's disease. Furthermore, according to the method for examining Alzheimer's disease according to the present invention, it is also possible to grasp the degree of progression of dementia.
  • Fig. 1 is a characteristic diagram showing the relationship between the progress of the polymerization reaction of amyloid / 3 protein and the fluorescence intensity due to thioflavin ⁇ in the reaction solution.
  • Fig. 1 ⁇ ⁇ ⁇ is ⁇ ⁇ ⁇ / 3 as amyloid j3 protein.
  • Fig. 1B is a characteristic diagram when Aj3 (1-42) is used as amyloid / 3 protein.
  • FIG. 6 is a plot of the final fluorescence equilibrium value at that time.
  • Fig. 2 f shows the formation level of f ⁇ (1-40) on day 9 of incubation
  • Fig. 2B shows the formation level of f A (1-42) after 24 hours of incubation.
  • the horizontal bar is the average value of each, and ⁇ ⁇ 0 ⁇ 001.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the correlation between the final fluorescence equilibrium value of f ⁇ formation after incubation with CSF of patients with Alzheimer's disease and the clinical dementia assessment (CDR).
  • FIG. 4 is an electron micrograph of the reaction solution before or after polymerization
  • A is a photo after reaction of a reaction solution not containing CSF
  • B is a polymerization of reaction solution containing CSF of an Alzheimer's disease patient.
  • a photograph after the assembly C is a photograph after polymerization of a reaction solution containing CSF of a patient with non-Alzheimer's disease
  • D is a photograph of a reaction solution containing CSF of a patient with Alzheimer's disease before polymerization.
  • the horizontal bar in the photo represents a length of 250 nm.
  • the screening method for Alzheimer's disease to which the present invention is applied basically comprises incubating a reaction solution in which amyloid j3 protein, a body fluid collected from a subject and a buffer are mixed, and polymerizing amyloid ⁇ protein. After the reaction reaches an equilibrium state, the degree of polymerization of the produced ⁇ -amyloid fibrils, that is, amyloid protein is examined.
  • the degree of polymerization of the amyloid protein can be determined by, for example, mixing the reaction solution after reaction with a fluorescent dye and detecting the degree of coloration of the reaction solution, or by microscopically examining ⁇ -amyloid fibrils that are reaction products in the reaction solution. It is judged by observing using etc. At this time, for example, a correlation between the degree of color development such as color intensity and the presence or absence of Alzheimer's disease is obtained in advance, and it can be determined from the measured color intensity whether Alzheimer's disease or not.
  • a reaction solution is prepared by mixing amyloid protein, a body fluid collected from a subject, and a buffer solution.
  • a reaction solution is prepared by preparing a test solution in which a body fluid collected from a subject is mixed with an appropriate amount of a buffer solution, and mixing the test solution with an amyloid protein solution containing amyloid ⁇ protein. Can do.
  • the human body fluid as a sample has an advantage that the invasion at the time of collection is smaller than that of brain tissue or the like.
  • body fluid any body fluid that can be collected from subjects such as Alzheimer's disease patients can be used.
  • blood or cerebrospina 1 fluid (CSF) should be used because it is easy to collect.
  • CSF cerebrospina 1 fluid
  • the blood may be blood components such as plasma and serum separated from whole blood in addition to whole blood.
  • the environment is very close to the brain tissue, and it is preferable to use cerebrospinal fluid because a more accurate examination is realized.
  • blood components such as plasma and serum separated from whole blood.
  • a neutral to weakly alkaline buffer solution such as a phosphate buffer solution
  • a buffer in the reaction solution facilitates the polymerization reaction between the body fluid and amyloid protein, and minute changes in the body fluid environment, such as the weakening of fibrosis inhibitors contained in the body fluid, indicate the degree of polymerization. It is amplified as a difference and can be tested more accurately.
  • the test solution obtained by mixing the buffer solution with the collected body fluid is 5 to 50 buffer solutions. It is preferable to include the product%. When the content of the buffer solution in the reaction solution is less than 5% by volume, the buffer solution may be insufficient and the polymerization reaction may occur.
  • the content of the buffer solution in the test solution is preferably 50% by volume or less. If the content of the buffer in the reaction solution exceeds the above range, the amount of amyloid fibrils produced may become excessive.
  • the reaction solution is kept warm to the human body temperature in order to reduce the variation in the amount of amyloid fibrils produced by the polymerization reaction.
  • the buffer may contain 50% by volume or more.
  • the amyloid j3 protein may be either natural amyloid j3 protein or synthetic amyloid / 3 protein, but it is particularly preferable to use synthetic amyloid / 3 protein.
  • amyloid j3 protein for example, amyloid j3 protein consisting of 40 amino acids, amyloid j3 protein consisting of 42 amino acids, etc. are known.
  • the amyloid / 3 protein consisting of 42 amino acids is advantageous in that the time to completion of the polymerization reaction can be shortened to about 1/10 compared to the case where amyloid j3 protein consisting of 40 amino acids is used.
  • the amyloid protein is mixed with the test solution, for example, as an amyloid i3 protein solution adjusted to pH 6 to 12 by being dissolved in dilute aqueous ammonia.
  • Dilute ammonia water can easily dissolve amyloid protein.
  • weak alkaline solutions such as dilute ammonia water, amyloid protein is completely in the monomer state, so amyloid ⁇ protein is dissolved in an aqueous ammonia solution to reduce dispersion in the polymerization reaction process. Can be small.
  • the concentration of amyloid protein in the reaction solution is preferably 5 ⁇ to 100 ⁇ . If the amyloid ⁇ protein content is less than the above range, the ⁇ amyloid fibril production is too small. Conversely, if the amyloid ⁇ protein content exceeds the above range, the ⁇ amyloid fibril production is too high and quantitative measurement is performed by fluorescence. Becomes difficult. However, in this case as well, it is possible to use a solution with an amyloid / 3 protein concentration of 100 ⁇ or more by lowering the polymerization reaction temperature, but the time until the polymerization reaction reaches an equilibrium state becomes longer. There may be a large variation in the amount of amyloid fibrils produced.
  • a reaction solution obtained by mixing amyloid / 3 protein, body fluid collected from the subject and a buffer solution is reacted to proceed the polymerization reaction of amyloid / 3 protein.
  • Example of polymerization reaction of amyloid / 3 protein For example, it is carried out by incubating a reaction solution prepared by mixing a test solution containing a body fluid and a buffer solution and an amyloid; 3 protein solution for a predetermined time under conditions where amyloid protein can be polymerized.
  • the reaction solution is preferably heated to 35 ° C to 40 ° C.
  • the polymerization reaction of amyloid / 3 protein can proceed even at room temperature, but by incubating the reaction solution under conditions close to the living body such as the above temperature range, the fibrosis inhibitor contained in the body fluid is weakened. Minor changes in the body fluid environment, such as condition, are greatly amplified as the degree of polymerization. As a result, it is possible to more accurately determine whether the disease is Alzheimer's disease. Further, by performing incubation of the reaction solution within the above temperature range, it is possible to reduce the variation in the amount of j3 amyloid fibrils produced.
  • the pH of the reaction solution during the polymerization reaction is preferably pH 7.3 to pH 7.7.
  • the reaction solution becomes a condition close to that of a living body, and minute changes in the body fluid environment, such as the weakening of fibrosis inhibiting factors contained in the solution, are greatly affected by differences in the degree of polymerization. Amplified. As a result, it is possible to more accurately determine whether Alzheimer's disease is present.
  • variation in the amount of amyloid fibrils produced can be reduced.
  • ⁇ -amyloid fibrils is explained by, for example, a polymerization nucleus-dependent polymerization model consisting of a polymerization nucleation reaction phase and a fiber elongation phase.
  • the polymerization nucleation reaction is difficult to occur thermodynamically and is the overall rate-determining step, but once the polymer that forms the polymerization nuclei is formed, it shifts to the fiber elongation reaction, which is the primary reaction model, that is, Polymerization proceeds rapidly by amyloid i3 protein binding to the nuclei or fiber stumps already present in the reaction solution while changing the conformation, and ⁇ -amyloid fibrils are formed.
  • Polymerization nucleation reaction and fiber elongation reaction occur easily not only in vivo but also in a buffer solution in a test tube.
  • the degree of polymerization of amyloid j3 protein refers to the length, molecular weight, number of products, and amount of ⁇ -amyloid fibrils that are produced.
  • the degree of polymerization of amyloid / 3 protein is determined by, for example, mixing the reaction solution after the reaction with a fluorescent dye. In combination, it is preferable to investigate by detecting the degree of color development of the fluorescent dye.
  • the influence of the amyloid i3 protein polymerization rate is eliminated by bringing the reaction solution into contact with the fluorescent dye after the reaction that has reached the equilibrium state during the polymerization reaction of the amyloid protein, and accurate detection is achieved. It becomes possible.
  • the time required for the polymerization reaction of amyloid / 3 protein to reach an equilibrium state varies depending on the reaction conditions, but when amyloid / 3 protein consisting of 42 amino acids is used, for example, 12 For example, if an amyloid / 3 protein consisting of 40 amino acids is used for more than an hour, it should be, for example, 7 days or more.
  • the color intensity is expressed as sigmoid.
  • a curve is drawn and eventually equilibrium is reached, for example, by the consumption of ⁇ -amyloid protein in the reaction solution.
  • This final color intensity indicates the degree of polymerization of ⁇ -amyloid fibrils that are finally formed by the polymerization reaction of amyloid / 3 protein.
  • factors that inhibit amyloid protein polymerization and amyloid protein polymerization It changes according to increase / decrease of factors to be promoted, ie, body fluid environment.
  • the color intensity when the color intensity reaches equilibrium, it means that the polymerization reaction of amyloid protein has reached equilibrium. Therefore, when the reaction solution after the reaction for at least the time when the emission intensity reaches equilibrium is mixed with the fluorescent dye, the fluorescent dye is bound to the ⁇ amyloid fibril, and the degree of color development in the reaction solution is detected. Since the color intensity of is significantly higher than the color intensity of patients with non-Alzheimer's disease, it is possible to determine whether Alzheimer's disease or not based on this information.
  • the fluorescent dye for detecting ⁇ -amyloid fibrils it is preferable to use thioflavin cocoon.
  • a derivative of thioflavin cocoon obtained by substituting a part of thioflavin cocoon with any group can be used as long as it has binding ability to / 3 amyloid fibrils and coloring ability.
  • thioflavin ⁇ or its derivative is a ⁇ -amyloid fibril that can be deposited in nerve cells, that is, a force S that binds to amyloid / 3 protein that has been polymerized to some extent, S Therefore, it has a unique property that it does not bind to amyloid / 3 protein in the state of monomer or oligomer with low polymerization degree. Therefore, measure the fluorescence intensity of thioflavin T or its derivatives added to the reaction solution after the polymerization reaction. By means of this, it is possible to accurately determine the level of amyloid fibril formation and the presence or absence of Alzheimer's disease. If fluorescent dyes other than thioflavin ⁇ or its derivatives are used, the accuracy of the test may be reduced.
  • the degree of polymerization of the amyloid j3 protein after the reaction is determined by, for example, reacting a reaction solution obtained by mixing amyloid j3 protein and a body fluid collected from a subject for a predetermined time, and then, for example, an electron microscope, a fluorescence It can also be examined by directly observing the reaction solution using a microscope or the like. Since the number and form of amyloid / 3 fibers that are ultimately produced differ between Alzheimer's disease patients and non-Alzheimer's disease patients, this is observed and compared by comparing Alzheimer's disease patients and non-Alzheimer's disease patients. This makes it possible to determine whether or not the patient has Alzheimer's disease.
  • the amyloid ⁇ protein was polymerized in the body fluid mixed with the buffer solution, and after the polymerization reaction of amyloid ⁇ protein reached an equilibrium state, the degree of polymerization of amyloid / 3 protein was examined.
  • factors that control polymerization such as factors that suppress the polymerization of amyloid protein in (body fluid), factors that promote the polymerization of amyloid protein, and the like are indirectly grasped. Therefore, it is possible to accurately test whether the body fluid is an environment in which amyloid protein polymerization can occur, that is, whether the subject has Alzheimer's disease.
  • the test method of the present invention uses a bodily fluid that can be easily collected from a subject, and thus is very simple with little burden on the subject, and is useful for early examination and early treatment of Alzheimer's disease. is there. Furthermore, since clinical studies have confirmed that there is a correlation between the degree of amyloid protein polymerization and the degree of progression of dementia in body fluids mixed with buffer solutions, Alzheimer's disease to which the present invention has been applied has been confirmed. The degree of progression of dementia can be ascertained by the examination method.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • CDR clinical dementia assessment
  • Non-Alzheimer's disease patients 17 Japanese women and 23 Japanese men (average age: 70. 1 year, 60-83 years old) were investigated.
  • Non-Alzheimer's disease patients are diagnosed as follows. Cerebral infarction (1 patient), Parkinson's disease (1 patient), cerebral cortex basal ganglia degeneration (7 patients), progressive supranuclear paralysis (3 patients), diffuse Lewy body disease (2 patients), Creutz Felt 'Jakob's disease (1 person), multiple system atrophy (2 persons), exercise two Euron disease including amyotrophic lateral sclerosis (6 persons), multiple sclerosis (1 person), myasthenia gravis ( 1), Meningitis (2), Myalgia (3), Epilepsy (1), Hepatic encephalopathy (1), ADH inappropriate secretion syndrome (1), Acute lymphoma (1) Peripheral neuropathy (6 patients).
  • CSF was collected from both Alzheimer's and non-Alzheimer's patients as described above. CSF was collected by normal lumbar puncture, centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes, then aliquoted and stored at 80 ° C until analysis.
  • a (1-42) The level of amyloid protein consisting of 42 amino acids in CSF (hereinafter referred to as A (1-42)) was measured by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). 21F12, a monoclonal antibody (Mab) specific for the C-terminus of ⁇ (1-42) as a capture agent, and a piotinylated monoclonal anti-A / 3 (1-42) N-terminal antibody for detection A certain 3D6 was used (INNOTEST ⁇ -amyloid (l-42); Innogenetics, Gent, Belgium) (Vanderstichele et al. (1998), Andreasen et al. (1999)). A / 3 (1-40) was not cross-reactive. CSF samples and standard samples were assayed in duplicate.
  • the total tau concentration in CSF was determined by a sensitive sandwich ELISA using Mab. ATI 20 was used as a capture antibody, and two Mabs (HT7 and BT2) that recognize different epitopes were used as detection antibodies. (INNOTEST hTAU-ag; Innogenetics, Gent, Belgium (Vanderstichele et al. (1993); Blennow et al. (1995)). CSF samples and standard samples were assayed in duplicate.
  • amyloid protein As the amyloid protein, A ⁇ (1-40) (lot number 530108, Peptide Institute Inc,) and A j3 (1-42) (lot 'number 521205, P mark tide Institute Inc) are used, , Four. They were dissolved in 0.02% ammonia solution in the C chamber, adjusted to a concentration of 500 ⁇ (2.2 mg / mL) and 250 ⁇ , respectively, and stored at _80 ° C. The fresh A / 3 (1-40) and Aj3 (1-42) obtained here were thawed as necessary and subjected to the following experiment.
  • the reaction tube was placed in a DNA thermorecycler (PJ480, Perkin Elmer Cetus, Emeryville, California) and heated up from 4 ° C to 37 ° C at the fastest speed. Incubation was performed for 0 to 9 days. After a predetermined time, the reaction tube was ice-cooled to stop the reaction. During the incubation, the reaction tube was allowed to stand. 5 was taken from each reaction tube and measured with a fluorescence spectrometer. Each measurement was performed three times, and the average value was obtained.
  • PJ480 Perkin Elmer Cetus, Emeryville, California
  • the fluorescence intensity was measured using a fluorescence spectrophotometer (Hitachi F-2500) as described by Naiki and Nakakuki (1996).
  • ⁇ amyloid fibrils formed by polymerization of A (1-40) hereinafter referred to as f ⁇ (1-40)
  • ⁇ amyloid fibrils formed by polymerization of A (1-42) hereinafter referred to as f ⁇ (1 -42) was measured using an excitation wavelength of 445 nm and a fluorescence wavelength of 490 nm.
  • the measurement sample solution contains 5 ⁇ Thioflavin T (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) and 50 mM glycine-sodium hydroxide buffer ( ⁇ 8.5).
  • ROC (recei ver operating characteristic) curve analysis was performed using the result values of Alzheimer's disease patients and non-Alzheimer's disease patients, and the area under the ROC curve (A UC) was calculated and f after incubation
  • the final fluorescence equilibrium values of A j3 (1-40) and f A j3 (1-42), A j3 (1-42) and tau levels in CSF were determined.
  • FA j3 (1-40) and fA / 3 (1-42) The final fluorescence equilibrium value indicates the degree of polymerization of the formed f A.
  • SystatversionlO.O SPSS, Chicago, IL
  • SE standard error
  • sensitivity, characteristics, and correct diagnosis rate were calculated by Hanley and McNeil methods. .
  • Fig. 1A shows the correlation between the incubation time of A / 3 (1-40) and the fluorescence intensity of thioflavin T in the reaction solution
  • Fig. 1B shows the polymerization time of A / 3 (1-42) and the fluorescence of the reaction solution.
  • a correlation diagram with intensity is shown.
  • the fluorescence intensity of thioflavin T after incubation of A (1-40) or A (1-42) had a unique sigmoid curve. This curve is consistent with a polymerization nucleus-dependent polymerization model (Jarrett and Lansbury (1993); Naiki et al. (1997)).
  • f A / 3 (1-40) and f A / 3 (1-42) were stained with the red dye Congo Red, a typical orange-green double-polarized light was observed by observation with a polarizing microscope.
  • FIG. 2 shows the fluorescence of thioflavin T on day 9 of incubation (fA j3 (1-40)) or 24 hours of incubation (f A / 3 (1-42)) in patients with non-Alzheimer's disease.
  • the final fluorescence equilibrium value with thioflavin T in the formation of f A (1-40) is 3.25 ⁇ 1.04 (mean soil standard deviation), not in CSF of Alzheimer's disease patients.
  • the CSF of Alzheimer's disease patients was 1.63 ⁇ 0.27, which was significantly higher in Alzheimer's disease patients (P ⁇ 0.001).
  • fA j3 (l-42) formation is also 9.00 ⁇ 1.55 for the CSF of Alzheimer's disease patients and 5.69 ⁇ 1. 5 for the CSF of non-Alzheimer's disease patients. Similar to the formation of f A j3 (1-40), the Alzheimer's disease patients showed significantly higher values (p ⁇ 0.001).
  • the AUC value obtained by ROC analysis is the fA of CSF of Alzheimer's disease patients.
  • the cutoff value of the final fluorescence equilibrium value for f A (1-42) formation is set to 7.36, the sensitivity, specificity, and correctness rate are 92.5%, 92.5%, and 92, respectively. ⁇ It was 5%.
  • the test method according to the present invention is more effective in testing and diagnosing Alzheimer's disease than, for example, the measurement of A (1-42) level in CSF and the measurement method of tau level, which have recently been used as an auxiliary diagnosis method for Alzheimer's disease. It was shown to be excellent.
  • FIG. 3 shows the correlation between the final fluorescence equilibrium value of fA j3 formation after incubation with CSF of Alzheimer's disease patients and the clinical dementia assessment (CDR).
  • CDR clinical dementia assessment
  • FIG. 4B shows an electron micrograph of CSF from an Alzheimer's disease patient
  • Fig. 4C shows an electron micrograph of CSF from a non-Alzheimer's disease patient.
  • FIG. 4C is a photograph of a reaction solution containing CSF from an Alzheimer's disease patient before polymerization. In the case of CSF of non-Alzheimer's disease patients, the same morphology as in Fig. 4D was observed.

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Abstract

【課題】　アルツハイマー病の簡便且つ正確な検査を可能とする。 【解決手段】　アミロイドβ蛋白と被験者から採取した体液と緩衝液とを混合した反応溶液を反応させ、アミロイドβ蛋白の重合反応が平衡状態に到達した後、アミロイドβ蛋白の重合の程度を調べる。例えば、反応後の前記反応溶液と蛍光色素とを混合し、反応溶液の発色の程度を検出することにより、前記アミロイドβ蛋白の重合の程度を調べる。前記蛍光色素がチオフラビンＴ又はその誘導体である。前記体液が脳脊髄液、血液又は血液成分である。  

Description

明 細 書
アルツハイマー病の検查方法
技術分野
[0001] 本発明は、アルツハイマー病を正確且つ簡便に検查するためのアルツハイマー病 の検査方法に関する。
背景技術
[0002] アルツハイマー病は、先進国における高齢者の進行性精神障害の主な原因であり 、神経細胞内構造蛋白の異常やリン酸化タウの出現等の神経原線維変化、アミロイ ド 蛋白ペプチドの生成 ·沈着及び組織の崩壊と炎症反応による老人斑の形成、神 経細胞の消失といった神経病理学的な病変を特徴としている。アルツハイマー病の 進行の原因としては様々なものが考えられているが、そのうちの 1つに、アミロイド 蛋白の重合、線維化による沈着が挙げられている。アミロイド 蛋白は、通常細胞内 で生産され、アルツハイマー病患者だけでなく健常者の血漿や脳脊髄液 (CSF)から も検出可能だが、非アルツハイマー病患者ではアミロイド β蛋白の沈着は起こらない か、あるいは少量であり、アルツハイマー病患者でのみアミロイド /3蛋白の産生の増 加又はアミロイド β蛋白代謝'排泄の減少が初期段階で起こり、その後アミロイド β蛋 白の重合、アミロイド斑の大量の沈着等が起こり、進行的に痴呆症状が経過する。
[0003] アルツハイマー病等の痴呆の検查としては、従来から CTスキャン、 MRI等の頭部 画像検査が広く行われてレ、る力 単独でアルツハイマー病の診断精度と特異性との 両者を満足するものは存在しない。そのため、実際の検查では、複数の検查を組み 合わせて実施しているのが現状である。また、頭部の脳の形態画像検查は、脳の形 態学的変化に基づく間接的なものであり、必ずしも痴呆症を正確に検查することはで きず、特に形態学的変化の現れる前のアルツハイマー病の早期発見に対しては全く 無力である。
[0004] このような事情から、アルツハイマー病を正確且つ早期に発見する技術に注目が集 まっている。近年、アミロイド ;3蛋白の他、アポリポ蛋白 E (apolipoprotein E : apoE)、 アポリポ蛋白 J (apolipoprotein J : apoJ)、血清アミロイド P成分 (serum amyrloid P com ponent： SAP) ,トランスサイレチン（transthyretin:TTR)、 α 1—抗キモトリプシン（ α 1 -antichymotrypsin： ACT) , α— 2マクログロブリン ( α 2— macrogrobulin : α 2Μ)等、 アルツハイマー病に関連のある微量分子が CSF中から多数見出され、このような微 量分子を検查用マーカーとする研究等も行われている。し力、しながら、これら微量分 子は CSF中に微量しか含有されないため感度が不十分であり、また、アルッハイマ 一病との因果関係が現状では必ずしも明確ではない等の問題がある。
[0005] そこで、より正確な検查技術の開発が望まれており、例えば、患者から血液等の検 体を採取し、該検体中に含まれる痴呆症患者に特異的なポリペプチドと、該ポリぺプ チドに対する抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定により、検体中に含まれる 痴呆症患者に特異的なポリペプチドを測定する痴呆症の検査方法が提案されている (例えば特開 2000— 193661号公報等参照）。この方法によれば、少量の検体でァ ルツハイマー病等の痴呆症を検查できるとされる。また、試料に蛍光標識が共有結 合された凝集性アミロイドアミロイド i3蛋白質ペプチドを接触させる段階と、アミロイド 凝集を示すものとして該試料に結合した該蛍光標識を検出する段階とを含む試料中 のアミロイド凝集を検出又はモニターするための方法が提案され、例えばァルツハイ マー病等を診断するために実施されることが提案されている（例えば特表 2001— 51 5044号公報等参照）。
[0006] なお、 CSFの存在により βアミロイド線維形成がインビトロで抑制されるとの報告が れ飞レヽる (f列 は、 Wisniewski T,Castano E, Ghiso J, Frangione B.し rerobrospinai fluid inhibits Alzheimerbeta-amyloid fibril formation in vitro. Ann Neurol 1993; 34: 6 31-3等参照。）。この報告においては、人工合成したアミロイド 蛋白とリン酸塩緩衝 液又は CSF (アルツハイマー病患者又は健常者）とを 1： 1で混合し、室温で最長 70 時間放置し、チオフラビン Tを用いた蛍光分光定量法を利用して線維化したアミロイ ド j3蛋白を定量している。
[0007] し力、しながら、前記特開 2000— 193661号公報記載の検查方法は、痴呆症患者（ アルツハイマー病患者）に特異的なポリペプチドとしてアミロイド /3蛋白を挙げている が、アミロイド /3蛋白は健常者にも存在する蛋白であることから、これをァルツハイマ 一病の検查マーカーに用いることは正確さの面で不十分であると言わざるを得なレ、。 [0008] また、特表 2001— 515044号公報記載の方法では、予め蛍光標識したアミロイド i3蛋白を凝集させているが、結合された蛍光標識がアミロイド 蛋白の凝集特性に 何らかの影響を及ぼしている可能性を否定できず、やはり正確さの面で問題を残して いる。さらに、特表 2001— 515044号公報記載の方法では、試料として、例えば、大 脳皮質、小脳及び海馬組織といった任意の脳組織、血管組織又はニューロン等の 組織等の使用を前提としており、試料採取に際し患者の負担が大きぐ簡便な検査 方法とは言い難い。さらに、検査に先立ち蛍光標識アミロイド 蛋白の大量合成を必 要とし、コストが上昇したり、検査が煩雑となる等の様々な不都合がある。
[0009] さらに、 Wisniewski Tらの報告においては、アルツハイマー病患者の CSF、非ァノレ ッハイマー病患者の CSF、又はリン酸塩緩衝液の存在下でアミロイド β蛋白を重合 させているものの、 CSFとリン酸塩緩衝液とで j3アミロイド線維形成の程度が異なるこ とを確認するにとどまり、アルツハイマー病患者及び非アルツハイマー病患者のいず れの CSFにおいても得られる結果に差異はなぐアルツハイマー病の検査へ応用す ることについては記載も示唆もされていなレ、。アルツハイマー病の発症メカニズムの 解明 ·検討等の基礎医学研究分野においては、 Wisniewski Tらの報告のように人工 合成したアミロイド β蛋白をリン酸塩緩衝液中で自発的に重合させる実験手法が利 用されている力 この実際のアルツハイマー病の検査等の臨床医学研究分野への応 用につレ、てはこれまで全く想定されたことがなレ、。
[0010] そこで本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、アルッハイマ 一病を簡便且つ正確に検査し得るアルツハイマー病の検査方法を提供することを目 的とする。
発明の開示
課題を解決するための手段
[0011] アルツハイマー病患者の脳中ではアミロイド 蛋白の重合及び沈着が進み、非ァ ルツハイマー病患者の脳では沈着しない原因としては諸説ある力 S、例えばアルッハ イマ一病患者の脳中でのアミロイド β蛋白の重合促進因子の濃度又は活性度の上 昇、アミロイド 蛋白の重合抑制因子の濃度又は活性度の減少、アミロイド 蛋白の 重合反応核の存在等が挙げられる。いずれにせよ、アルツハイマー病患者の脳にお いては、非アルツハイマー病患者の脳に比べ、アミロイド 蛋白の重合に適した環境 が整えられているといえる。そこで本発明者らは、脳脊髄液や血液等の体液が脳組 織の環境を反映しているものと考え、検討を進めた結果、被験者から採取した体液に 線維化を起こりやすくするために適量 (例えば 5体積％以上）のリン酸塩緩衝液を混 合して検査溶液を調製し、これにアミロイド β蛋白を含むアミロイド β蛋白溶液を混合 するとともにヒトの体温と同程度に加温'保持してアミロイド 蛋白の重合反応を促進 し、反応が平衡状態に到達するまで反応時間を充分に確保することによって、ァルツ ハイマー病患者と非アルツハイマー病患者との間にアミロイド β蛋白の重合の程度 の差を生じせしめることを可能とした。この差の情報に基づいてアルツハイマー病患 者と非アルツハイマー病患者とに対し実際に本発明の検查を実施したところ、ァルツ ハイマー病であるか否かの判断が可能となるという臨床的知見を得、本発明を完成さ せるに至った。
[0012] すなわち、本発明に係るアルツハイマー病の検査方法は、アミロイド β蛋白と被験 者から採取した体液と緩衝液とを混合した反応溶液を反応させ、前記アミロイド β蛋 白の重合反応が平衡状態に到達した後、前記アミロイド 蛋白の重合の程度を調べ ることを特 ί数とする。
[0013] 体液と適量の緩衝液等の存在下でアミロイド 蛋白の重合反応を進めると、被験者 の体液に含まれるアミロイド 蛋白の重合促進因子、アミロイド 蛋白の重合抑制因 子、アミロイド 蛋白の重合反応核の存在等に応じてアミロイド 蛋白の重合 (線維 ィ匕）の程度が異なり、例えばアルツハイマー病患者の体液を用いて反応を進めると、 非アルツハイマー病患者の体液に比べて最終的に重合度の高い（長さの長い） βァ ミロイド線維が形成されたり、大量の /3アミロイド線維が生成されたりする。これは、本 発明者らによって初めて確認された事実である。ここで、例えば反応初期のアミロイド /3蛋白の重合の程度を調べたとしても、アルツハイマー病患者の体液と非アルッハ イマ一病患者の体液とで差はほとんどないため、重合反応が平衡状態に到達した後 に、最終的に得られるアミロイド 蛋白の重合の程度（ アミロイド線維の長さ、生成 数、生成量等）を調べることが重要である。これにより、被験者の体液がアミロイド 蛋 白の重合が起こりやすレ、環境か否力 \すなわちアルツハイマー病であるか否かが正 確に判断される。
[0014] また、本発明は、採取が容易な体液を試料として用いるため、アルツハイマー病患 者等の被験者の負担が小さぐかつ極めて簡便に検査を実施できる。患者から採取 した脳組織等を用いてアミロイド /3蛋白の重合の程度を調べることも考えられるが、 脳組織の採取は患者の負担が極めて大きぐ簡便さを欠いており、実用的でない。
[0015] なお、先にも述べたように、アルツハイマー病患者と非アルツハイマー病患者とを判 別するためには、重合反応が平衡状態に到達した後でアミロイド /3蛋白の重合の程 度を調べることが極めて重要であり、例えば反応初期や反応の途中で調べたとしても 意味はない。ところ力 Wisniewski Tらの報告は、この点について全く考慮していない 。 Wisniewski Tらの報告においては、 CSFの存在下でアミロイド /3蛋白を最長で 70 時間重合反応させてレ、るが、アルツハイマー病患者と非アルツハイマー病患者とで は重合の程度に差はなぐ CSFにはアミロイド /3蛋白の重合阻害因子が含まれてい ると結論づけ、重合反応が平衡状態に到達する前に反応試験を中止したものと考え られる。
[0016] また、本発明では、アルツハイマー病患者と非アルツハイマー病患者との間にアミ ロイド β蛋白の重合の程度の差を生じせしめることを狙って適量の緩衝液を反応溶 液に加えている力 前述の WisniewskiTらの報告においては CSFとアミロイド 蛋白 とを単純に混合しているのみであり、緩衝液を加えることに関する記載は見あたらな レ、。
[0017] また、本発明に係るアルツハイマー病の検査方法は、反応後の前記反応溶液と蛍 光色素とを混合し、反応溶液の発色の程度を検出することにより、前記アミロイド 蛋 白の重合の程度を調べることが好ましレ、。アミロイド 蛋白の重合反応後に蛍光色素 を加え、発光の程度を検出することにより、被験者の体液中に含まれるアミロイド β蛋 白の重合抑制因子（例えばアポリポ蛋白 Εやアポリポ蛋白 J等）の働きが弱まってレ、る か否か等、すなわちすなわちアルツハイマー病であるか否かが正確に判断できる。
[0018] さらに、本発明に係るアルツハイマー病の検查方法は、前記蛍光色素がチオフラビ ン T又はその誘導体であることが好ましい。チオフラビン T又はその誘導体は、アミ口 イド /3蛋白の重合体である βアミロイド線維に特異的に結合し、アミロイド /3蛋白の重 合の程度、例えば i3アミロイド線維の分子量や生成量に応じて発色する性質を有す る。このため、蛍光色素としてチオフラビン T又はその誘導体を用いることにより、 βァ ミロイド線維の形成の度合いがより正確かつ簡単に計測され、アルツハイマー病の検 查の正確さを高めることができる。
発明の効果
[0019] 本発明に係るアルツハイマー病の検查方法は、従来の検查方法に比べ極めて正 確であり、また、試料 (検体)採取時の患者への負担が小さいという利点を有する。し たがって、本発明によれば、正確且つ簡便であり、アルツハイマー病の早期発見及 び早期治療に非常に有用なアルツハイマー病の検査方法を提供することが可能で ある。さらに、本発明に係るアルツハイマー病の検査方法によれば、痴呆の進行の程 度を把握することも可能である。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]図 1は、アミロイド /3蛋白の重合反応の進行と反応溶液のチオフラビン Τによる 蛍光強度との関係を示す特性図であり、図 1 Αはアミロイド j3蛋白として Α /3 (1-40)を 用いた場合の特性図、図 1Bはアミロイド /3蛋白として A j3 (1-42)を用いた場合の特 十生図である。
[図 2]図 2は、アルツハイマー病患者（n=40)及び非アルツハイマー病患者（n=40) の CSF存在下で A β (1-40)又は Α β (1-42)を重合させたときの最終蛍光平衡値をプ ロットした図である。図 2Αはインキュベート 9日目の f Α （1-40)の形成レベルを示す 図、図 2Bはインキュベート 24時間目の f A （1-42)の形成レベルを示す図である。横 棒は夫々の平均値であり、 ρ< 0· 001である。
[図 3]図 3は、アルツハイマー病患者の CSFを用いてインキュベートした後の f Α 形 成の最終蛍光平衡値と臨床痴呆評価（CDR)との相関を示す特性図である。
[図 4]図 4は、重合アツセィ前又は後の反応溶液の電子顕微鏡写真であり、 Aは CSF を含まない反応溶液のアツセィ後の写真、 Bはアルツハイマー病患者の CSFを含む 反応溶液の重合アツセィ後の写真、 Cは非アルツハイマー病患者の CSFを含む反応 溶液の重合アツセィ後の写真、 Dはアルツハイマー病患者の CSFを含む反応溶液の 重合アツセィ前の写真である。写真中の横棒は長さ 250nmを表す。 発明を実施するための最良の形態
[0021] 以下、本発明を適用したアルツハイマー病の検查方法について、図面を参照しな 力 ¾詳細に説明する。
[0022] 本発明を適用したアルツハイマー病の検查方法は、基本的には、アミロイド j3蛋白 と被験者から採取した体液と緩衝液とを混合した反応溶液をインキュベートし、アミ口 イド β蛋白の重合反応が平衡状態に到達した後、生成した βアミロイド線維、すなわ ちアミロイド 蛋白の重合の程度を調べるものである。アミロイド 蛋白の重合の程度 は、例えば、反応後の前記反応溶液と蛍光色素とを混合し、反応溶液の発色の程度 を検出するか、又は反応溶液中の反応生成物である βアミロイド線維を顕微鏡等を 用いて観察することにより判断される。このとき、例えば、発色強度等の発色の程度と アルツハイマー病の有無等との相関を予め求めておき、測定した発色強度から前記 相関に基づきアルツハイマー病であるか否かを判断できる。
[0023] 本発明では、先ず、アミロイド 蛋白と被験者から採取した体液と緩衝液とを混合し て反応溶液を調製する。具体的には、被験者から採取した体液と適量の緩衝液とを 混合した検査溶液を調製し、この検査溶液とアミロイド β蛋白を含むアミロイド 蛋白 溶液とを混合することにより、反応溶液を調製することができる。
[0024] 試料となるヒト体液は、脳組織等に比べ、採取時の侵襲が小さいという利点がある。
体液としては、アルツハイマー病患者等の被験者から採取可能なあらゆる体液を使 用可能であるが、採取が容易であることから、例えば血液や、脳脊髄液（cerebrospina 1 fluid : CSF)等を用いることが好ましレ、。血液としては、全血の他、全血から分離され る血漿や血清等の血液成分でもよい。特に、脳組織に非常に近い環境であると推測 され、より正確な検査が実現されることから、脳脊髄液を用いることが好ましい。血液 の場合は、全血から分離される血漿や血清等の血液成分を用いることが好ましい。
[0025] 緩衝液としては、中性から弱アルカリ性の緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液等を用い ること力 Sできる。反応溶液中に緩衝液を含ませることにより、体液とアミロイド 蛋白の 重合反応が起きやすくなり、体液中に含まれる線維化阻害因子の弱まり具合等の体 液環境の微小な変化が重合の程度の差として増幅され、より正確な検査を行うことが できる。緩衝液と採取した体液とを混合して得られる検査溶液は、緩衝液を 5〜 50体 積％含むことが好ましい。反応溶液中の緩衝液の含有量が 5体積％未満である場合 、緩衝液が不足し、重合反応が起こりに《なるおそれがある。また、前記検査溶液中 の緩衝液の含有量は、 50体積％以下であることが好ましい。反応溶液中の緩衝液の 含有量が前記範囲を上回ると、アミロイド線維の生成量が過剰となるおそれがある。 なお本発明では重合反応による アミロイド線維生成量のバラツキを小さくするため 、反応溶液をヒト体温程度に加温'保持しているが、重合反応中の溶液温度をこれよ り低温にしたい場合には、緩衝液を 50体積％以上含有させてもよい。
[0026] アミロイド j3蛋白としては、天然アミロイド j3蛋白、合成アミロイド /3蛋白のいずれで もよレ、が、特に合成アミロイド /3蛋白を用いることが好ましレ、。アミロイド j3蛋白として は、例えば 40個のアミノ酸からなるアミロイド j3蛋白、 42個のアミノ酸からなるアミロイ ド j3蛋白等が知られてレ、る力 本発明はレ、ずれを用いてもょレ、。 42個のアミノ酸から なるアミロイド /3蛋白は、 40個のアミノ酸からなるアミロイド j3蛋白を用いた場合に比 ベて、重合反応終了までの時間を 1/10程度に短縮できる点で有利である。
[0027] アミロイド 蛋白は、希薄アンモニア水に溶解されることにより例えば pH6〜： 12に 調整されたアミロイド i3蛋白溶液として、前記検査溶液と混合される。希薄アンモニア 水は、アミロイド 蛋白を容易に溶解することができる。また、希薄アンモニア水のよう な弱アルカリ溶液中ではアミロイド 蛋白が完全にモノマーの状態で存在するため、 アミロイド β蛋白をアンモニア水溶液に溶解しておくことにより、重合反応過程での結 果のばらつきを小さくすることができる。
[0028] 反応溶液中のアミロイド 蛋白濃度は 5 μ Μ〜： 100 μ Μであることが好ましい。アミ ロイド β蛋白含有量が前記範囲未満だと βアミロイド線維生成量が少なすぎ、逆にァ ミロイド β蛋白含有量が前記範囲を上回る場合、 βアミロイド線維生成量が多すぎて 蛍光発光による定量測定が困難になる。ただし、この場合も重合反応温度の低温化 によりアミロイド /3蛋白濃度が 100 μ Μ以上の溶液を使用することは可能であるが、 重合反応が平衡状態に達するまでの時間が長くなることや βアミロイド線維生成量の バラツキが大きくなるおそれがある。
[0029] 次に、アミロイド /3蛋白と被験者力 採取した体液と緩衝液とを混合した反応溶液を 反応させ、アミロイド /3蛋白の重合反応を進める。アミロイド /3蛋白の重合反応は、例 えば体液及び緩衝液を含む検査溶液とアミロイド ;3蛋白溶液とを混合することにより 調製した反応溶液を、アミロイド 蛋白が重合可能な条件で、所定時間、インキュべ ートすることにより行われる。
[0030] 重合反応の際、反応溶液を 35°C〜40°Cに加温することが好ましい。アミロイド /3蛋 白の重合反応は室温でも進行させることはできるが、前記温度範囲のような生体に近 い条件で反応溶液をインキュベートすることにより、体液中に含まれる線維化阻害因 子の弱まり具合等、体液環境の微小な変化が重合の程度の差として大きく増幅され る。この結果、アルツハイマー病か否かの判断をより正確に行うことができる。また、反 応溶液のインキュベートを前記温度範囲内で行うことで、 j3アミロイド線維の生成量 のバラツキを小さくすることができる。
[0031] また、重合反応の際の反応溶液の pHは、 pH7. 3〜pH7. 7とすることが好ましレ、。
反応溶液の pHを前記範囲内とすることにより、反応溶液が生体に近い条件となり、 液中に含まれる線維化阻害因子の弱まり具合等、体液環境の微小な変化が重合の 程度の差として大きく増幅される。この結果、アルツハイマー病か否かの判断をより正 確に行うことができる。また、反応溶液の pHを前記範囲内とすることで、 アミロイド 線維の生成量のバラツキを小さくすることができる。
[0032] なお、 βアミロイド線維の生成機構は、例えば、重合核形成反応相と線維伸長相と 力 なる重合核依存性重合モデルによって説明される。このモデルによると、重合核 形成反応は熱力学的に起り難く全体の律速段階となっているが、いったん重合核と なる重合体が形成されると、線維伸長反応に移り、一次反応モデル、すなわち重合 核又は既に反応溶液中に存在する線維断端にアミロイド i3蛋白が立体構造を変化さ せながら次々と結合することによって重合が速やかに進行し、 βアミロイド線維が形 成するとされる。重合核形成反応及び線維伸長反応は、生体内ばかりでなぐ試験 管内の緩衝液等中でも容易に起こる。
[0033] 次に、アミロイド /3蛋白の重合反応が平衡状態に到達した後、インキュベートを終 了し、反応溶液中のアミロイド /3蛋白の重合の程度を調べる。アミロイド j3蛋白の重 合の程度とは、生成する βアミロイド線維の長さ、分子量、生成数、生成量等のことで ある。アミロイド /3蛋白の重合の程度は、例えば反応後の反応溶液と蛍光色素とを混 合し、蛍光色素の発色の程度を検出することによって調べることが好ましい。本発明 では、アミロイド 蛋白の重合反応途上ではなぐ反応が平衡状態に到達した後の反 応溶液と蛍光色素とを接触させることにより、アミロイド i3蛋白重合速度の影響が排 除され、正確な検出が可能となる。なお、アミロイド /3蛋白の重合反応が平衡状態に 到達するまでの時間は、反応条件等に応じて異なってくるが、 42個のアミノ酸からな るアミロイド /3蛋白を用いた場合には例えば 12時間以上、 40個のアミノ酸からなるァ ミロイド /3蛋白を用いた場合には例えば 7日間以上とする。
[0034] ここで、反応溶液に後述の βアミロイド線維検出用蛍光色素をカ卩えることにより様々 な反応時間における発色強度を測定し、各反応時間での発色強度をプロットすると、 発色強度はシグモイド曲線を描き、最終的には例えば反応溶液中の βアミロイド蛋 白が消費されることにより、平衡に到達する。この最終的な発色強度は、アミロイド /3 蛋白の重合反応により最終的に形成される βアミロイド線維の重合の程度を示すも のであり、例えばアミロイド 蛋白の重合を抑制する因子やアミロイド 蛋白の重合を 促進する因子等の増減、すなわち体液の環境に応じて変化するものである。つまり、 発色強度が平衡に到達したことは、アミロイド 蛋白の重合反応が平衡状態に到達 したことを意味する。したがって、発光強度が平衡に到達する時間以上反応させた後 の反応溶液と蛍光色素とを混合して βアミロイド線維に蛍光色素を結合させ、反応溶 液の発色の程度を検出すると、アルツハイマー病患者の発色強度は非ァルツハイマ 一病患者の発色強度に比べ有意に高くなるため、この情報に基づきアルツハイマー 病であるか否かの判断が可能となる。
[0035] βアミロイド線維の検出用蛍光色素としては、チオフラビン Τを用いることが好ましい 。また、チオフラビン Τの一部を任意の基で置換してなるチオフラビン Τの誘導体も、 /3アミロイド線維に対する結合能及び発色能を有するものであれば使用可能である。 詳細な理由は必ずしも明確ではなレ、が、チオフラビン Τ又はその誘導体は、神経細 胞に沈着可能な βアミロイド線維、すなわちある程度重合の進んだ状態のアミロイド /3蛋白には結合する力 S、一方で、モノマー又は重合度の低いオリゴマーの状態のァ ミロイド /3蛋白には結合しないという特異な性質を有する。したがって、重合反応後に 反応溶液等に添加したチオフラビン T又はその誘導体の蛍光強度等を測定すること により、 ；3アミロイド線維の形成レベル、ひいてはアルツハイマー病の有無が正確に 判断される。チオフラビン τ又はその誘導体以外の蛍光色素を用いた場合、検査の 正確性が低下するおそれがある。
[0036] また、反応後のアミロイド j3蛋白の重合の程度は、例えば、アミロイド j3蛋白と被験 者から採取した体液とを混合した反応溶液を所定時間反応させた後、例えば電子顕 微鏡、蛍光顕微鏡等を用いて反応溶液を直接観察する方法によって調べることもで きる。アルツハイマー病患者と非アルツハイマー病患者とで最終的に生成するアミ口 イド /3線維の数や形態等が異なるため、これを観察し、アルツハイマー病患者と非ァ ルツハイマー病患者とで比較することによって、アルツハイマー病であるか否かの判 断が可能となる。
[0037] 以上のように、緩衝液を混合した体液中でアミロイド β蛋白を重合させ、アミロイド β 蛋白の重合反応が平衡状態に到達した後にアミロイド /3蛋白の重合の程度を調べる ことにより、検体（体液）中のアミロイド 蛋白の重合を抑制する因子、アミロイド 蛋 白の重合を促進する因子等、重合を制御する因子の影響等が間接的に把握される。 したがって、体液がアミロイド 蛋白の重合を起こし得る環境であるか否力、すなわち 、被験者がアルツハイマー病である否かを正確に検査することができる。
[0038] また、本発明の検査方法は、被験者から容易に採取可能な体液を試料とするため 、被験者の負担が小さく非常に簡便であり、アルツハイマー病の早期検査及び早期 治療のうえで有用である。さらに、緩衝液を混合した体液中でのアミロイド 蛋白の重 合の程度と痴呆の進行の程度との間に相関のあることが臨床試験により確かめられ ているため、本発明を適用したアルツハイマー病の検査方法により痴呆の進行の程 度も把握可能である。
実施例
[0039] 以下、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する 。なお、本発明は以下の実施例の記載に限定されるものではない。
[0040] 本実施例では、アルツハイマー病患者と非アルツハイマー病患者とから得た脳脊 髄液（CSF)を用いて実験を行った。さらに、臨床痴呆評価（CDR)と βアミロイド線 維の形成の程度との相関につレヽても検討した。 [0041] アルツハイマー病患者としては、 22人の日本人女性及び 18人の日本人男性（平均 年齢 71 · 7歳、 60歳〜 86歳）を調査した。なお、これらの患者は、 Diagnostic and Sta tistical ManuaHVの基準と Maclhannその他（1984)により出版された NINCDS-ADR DA基準を満たしている。また、遺伝連鎖のある患者は除外されている。軽度認識障 害（CDR = 0. 5)患者については、病状が進行し、後で基準を満たした場合にはァ ルツハイマー病患者に含めた。
[0042] 非アルツハイマー病患者としては、 17人の日本人女性及び 23人の日本人男性（平 均年齢 70. 1歳、 60歳〜 83歳）を調査した。非アルツハイマー病患者は、以下のよう に診断されている。すなわち、脳梗塞（1名）、パーキンソン病（1名）、大脳皮質基底 核変性症（7名）、進行性核上性麻痺（3名）、びまん性レビー小体病（2名）、クロイツ フェルト 'ヤコブ病（1名）、多系統萎縮症（2名）、筋萎縮性側索硬化症を含む運動二 ユーロン疾患（6名）、多発性硬化症（1名）、重症筋無力症（1名）、髄膜炎（2名）、筋 疼痛（3名）、てんかん（1名）、肝性脳症（1名）、 ADH不適切分泌症候群（1名）、悪 性リンパ腫（1名）、末梢性ニューロパシー（6名）である。
[0043] 書面での同意を患者又は家族から得た後、以上のようなアルツハイマー病患者及 び非アルツハイマー病患者の両者から CSFを採取した。 CSFは、通常の腰椎穿刺 によって採取され、 1500rpmで 10分間遠心分離を行った後、等分され、分析まで 80°Cで保存された。
[0044] CSF中の 42アミノ酸からなるアミロイド 蛋白（以下、 A （1-42)と称する。）のレべ ノレは、サンドイッチ酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA)によって測定した。捕獲剤と しての Α β (1-42)の C末端に特異的なモノクローナル抗体（Mab)である 21F12、及 び、検出にピオチン化モノクローナル抗 A /3 (1-42)N末端抗体である 3D6を用いた（I NNOTEST β -amyloid(l-42); Innogenetics, Gent, Belgium) (Vanderstichele等（1998 )、 Andreasen等（1999) )。 A /3 (1-40)に交差反応性はなかった。 CSF試料及び標準 試料は、 2重に検定した。
[0045] CSF中の総タウ濃度は、 Mabを用いた高感度サンドイッチ ELISAによって決定し た。捕獲抗体としては ATI 20、検出抗体としては異なるェピトープを認識する 2種の Mab (HT7及び BT2)を用いた。（INNOTEST hTAU-ag; Innogenetics, Gent, Belgium ) (Vanderstichele等（1993)； Blennow等（1995) )。 CSF試料及び標準試料は、 2重 に検定した。
[0046] アミロイド 蛋白としては、 A β (1-40) (ロット ·ナンバー 530108、 Peptide Institute Inc ，）及び A j3 (1-42) (ロット'ナンバー 521205、 P印 tide Institute Inc)を用レ、、 4。Cの室内 において 0. 02%アンモニア溶液中に溶解し、それぞれ濃度 500 μ Μ (2. 2mg/m L)及び濃度 250 μ Μに調整し、 _80°Cで保存した。ここで得られた新鮮な A /3 (1-4 0)及び A j3 (l-42)を、必要に応じて解凍し、以下の実験に供した。
[0047] 重合アツセィは、既報（Naiki等（1998) )に従い実施した。先ず、 50 1^の八]3 (1_4 0)又は 25 μ Μの Α /3 (1_42)、 50mMのリン酸塩緩衝液（ρΗ7. 5)、 lOOmMの NaCl 、及び 0又は 78体積％の CSFを含む反応混合物を調製した。この反応混合物のうち 30mLを、オイルフリーの PCRチューブ（サイズ； 0. 5mL、コードナンバー 9046、 Ta kara Shozo Co.Ltd.,Otsu Japan)に入れた。反応チューブを DNAサーマノレサイクラ 一 (PJ480, Perkin Elmer Cetus, Emeryville, California)中に入れ、 4°Cから 37°Cまで最 速で昇温させた。 0〜9日間インキュベートし、所定時間の経過後、反応チューブを 氷冷して反応を停止させた。インキュベート中、反応チューブは静置させた。各反応 チューブから 5 を分取し、蛍光分光計で測定を行った。各々 3回の測定を行い、 平均値を求めた。
[0048] 蛍光強度の測定は、 Naiki及び Nakakuki (1996)等によって記述されるように、蛍光 分光光度計（日立 F— 2500)を用いて行った。 A （1-40)が重合してなる βアミロイド 線維（以下、 f Α （1-40)と称する。）及び A （1-42)が重合してなる βアミロイド線維（ 以下、 f Α （1-42)と称する。）の蛍光強度は、 445nmの励起波長及び 490nmの蛍 光波長を用いて測定した。測定試料溶液は、 5 μ Μのチオフラビン T (和光純薬工業 、大阪、 日本）及び 50mMのグリシン—水酸化ナトリウム緩衝液（ρΗ8. 5)を含むもの である。
[0049] アルツハイマー病患者及び非アルツハイマー病患者の結果値を用いて ROC (recei ver operating characteristic)カーブ分析を行レヽ、 ROCカーブの下の領域の面積（A UC)を算出し、インキュベート後の f A j3 (1-40)及び f A j3 (1-42)の最終蛍光平衡値、 CSF中の A j3 (1-42)及びタウレベルを決定した。なお、 fA j3 (1-40)及び fA /3 (1-42) の最終蛍光平衡値は、形成された f A の重合度を示すものである。 ROCカーブ分 析及び AUCの算出には、 SystatversionlO.O(SPSS，Chicago，IL)を使用し、 Hanley及び McNeilの手法により、 AUC、標準エラー（SE)、感度、特性及び正診率を求めた。
[0050] 本実施例におけるアルツハイマー病患者と非アルツハイマー病患者とのチオフラビ ン Tの蛍光レべノレの比較は、 Welch補正した unpaired t testに基づいて行った。 Pears on相関係数及び Spearman相関係数を計算し、相関分析を行った。 0. 05より p値が 小さい場合、有意であるとみなす。
[0051] 以下、実験結果について説明する。
先ず、図 1Aに A /3 (1-40)のインキュベート時間と反応溶液のチオフラビン Tによる 蛍光強度との相関図を、図 1Bに A /3 (1-42)の重合時間と反応溶液の蛍光強度との 相関図を示す。なお、図 1中、黒丸（秦）は CSF未添カ卩（0%)の場合 (n= 10)、白丸 (〇）は反応混合物中にアルツハイマー病患者の CSFを 78体積％含有する場合 (n = 40)、白角（口）は、反応混合物中に非アルツハイマー病患者の CSFを 78体積％ 含有する場合 (n=40)を表す。
[0052] 図 1 Aから明らかなように、アルツハイマー病患者から得られた CSF (AD— CSF) 及び非ァルッハィマー病患者カら得られたCSF (non—AD— CSF)の両方とも、 fA i3 (1-40)形成の最終蛍光平衡値を減少させた。また、図 1Bに示すように、 CSFによ る重合抑制効果は、 fA j3 (1-42)においても観察された。すなわち、非アルツハイマー 病患者の〇3 （11011—八0—〇3?)は、アルツハイマー病患者の CSF (AD— CSF) より、 f A （1-40)形成及び f A （1-42)形成に対する抑制効果は強いものであった。
[0053] なお、図 1に示すように、 A （1-40)又は A （1-42)のインキュベート後のチオフラビ ン Tの蛍光強度は、独特のシグモイド曲線を描いていた。この曲線は、重合核依存性 重合モデルと一致している（Jarrett及び Lansbury (1993)； Naiki等（1997) )。なお、 f A /3 (1-40)及び f A /3 (1-42)を赤色色素コンゴレッドで染色したところ、偏光顕微鏡で の観察では典型的な橙緑色の複偏光を示した。
[0054] また、図 2に、インキュベート 9日目（fA j3 (1-40))、又はインキュベート 24時間目（f A /3 (1-42))のチオフラビン Tによる蛍光を、非アルツハイマー病患者 (n=40)及び アルツハイマー病患者（n=40)のそれぞれについてプロットした図を示す。 [0055] 図 2Aに示すように、 f A （1-40)形成におけるチオフラビン Tによる最終蛍光平衡 値は、アルツハイマー病患者の CSFでは 3. 25 ± 1. 04 (平均値土標準偏差）、非ァ ルツハイマー病患者の CSFでは 1. 63 ± 0. 27であり、有意にアルツハイマー病患 者の方が高い値を示した（P< 0. 001)。また、図 2Bに示すように、 fA j3 (l-42)形成 についても、アルツハイマー病患者の CSFでは 9. 00 ± 1. 55であり、非ァルツハイ マー病患者の CSFでは 5. 69 ± 1. 02であり、 f A j3 (1-40)形成と同様に、有意にァ ルツハイマー病患者の方が高レ、値を示した（p < 0. 001)。
[0056] また、 ROC分析によって得られる AUC値は、アルツハイマー病患者の CSFの fA
/3 (1-40)の最終蛍光平衡値は 0. 966 (SE = 0. 018)、 fA /3 (1_42)の最終蛍光平衡 値は 0. 980 (SE = 0. 017)であり、 A /3 (ト 42) (0. 867、 SE = 0. 042)及びタウ（0. 81、 SE = 0. 049)で得られる AUC値より高値であった。 fA /3 (1_40)形成の最終蛍 光平衡値のカットオフ値を 2. 11に設定すると、感度、特異性及び正診率は、それぞ れ 95%、 90%及び 92. 5%であった。同様に、 f A （1-42)形成の最終蛍光平衡値 のカットオフ値を 7. 36に設定すると、感度、特異性及び正診率は、それぞれ 92. 5 %、 92. 5%及び 92· 5%であった。
[0057] 以上のように、 CSF存在下でアミロイド 蛋白の重合を進め、形成した アミロイド 線維をチオフラビン T等の蛍光色素で検出することによって、精度、特異性及び正診 率のいずれにおいても優れ、アルツハイマー病の正確な検査が可能となることが明ら かとなつた。すなわち、本発明による検査方法は、例えば近年アルツハイマー病の補 助診断法として利用されている CSF中の A （1-42)レベルの測定やタウレベルの測 定法に比べ、アルツハイマー病の検査及び診断上優れていることが示された。
[0058] また、図 3にアルツハイマー病患者の CSFを用いたインキュベート後の fA j3形成の 最終蛍光平衡値と臨床痴呆評価（CDR)との相関を示す。図 3に示すように、ァルツ ハイマー病患者の CSFを用いたインキュベート後の f A /3 (1-42)形成の最終蛍光平 衡値と CDRとの間には有意な相関があった (rs = 0. 398、 p< 0. 05)。以上のように 、痴呆の全般的な進行度の評価の 1つである CDRと、アルツハイマー病患者の CSF を用いたインキュベート後の fA /3 (1-42)形成の最終蛍光平衡値との間に相関がある こと力ら、本発明のアルツハイマー病の検查方法によれば、痴呆の進行の程度も測 定可能であることが明らかとなった。
[0059] 次に、重合アツセィ後の反応溶液を電子顕微鏡で分析した結果について、図 4を 参照しながら説明する。 50 μ Μの A ;3 (1-40)、 50mMのリン酸塩緩衝液（ρΗ7· 5)、 及び lOOmMの NaClを含む反応混合物を調製し、 37°Cで 9日間インキュベートした 後の反応溶液の電子顕微鏡写真を、図 4Aに示す。 CSF未添加でインキュベートし た場合、図 4Aに示すように明瞭な小線維が観察された。この小線維は、周期約 220 nm、幅約 7nmの無分枝らせん状フィラメント構造であると考えられる。
[0060] また、 5O 1 MのA J3 (l_40)、 50mMのリン酸塩緩衝液（pH7. 5)、 lOOmMの NaC 1、及びアルツハイマー病患者又は非アルツハイマー病患者の CSF (78。/0)を含む反 応混合物を調製し、 37°Cで 9日間インキュベートした。アルツハイマー病患者の CSF を用いた場合の電子顕微鏡写真を図 4Bに、非アルツハイマー病患者の CSFを用い た場合の電子顕微鏡写真を図 4Cに示す。アルツハイマー病患者の CSFを添加しィ ンキュペートした場合、図 4Bに示すように、短くせん断された多数の小線維が観察さ れた。同様の形態は、他の 2名のアルツハイマー病患者の CSFを用いた場合にも観 察された。一方、非アルツハイマー病患者の CSFを添カ卩しインキュベートした場合、 図 4Cに示すように、小さい不定形の凝集体が時折観察された力 小線維はほとんど 観察されな力 た。同様の形態は、他の 2名の非アルツハイマー病患者の CSFを用 レ、た場合にも観察された。なお、データは示さないが、 A （1-42)を用いて検討を行 つたところ、 A （1-40)と同じ結果が得られた。図 4Dは、アルツハイマー病患者の CS Fを含む反応溶液の重合アツセィ前の写真である。非アルツハイマー病患者の CSF の場合も、図 4Dと同様の形態が見られた。
[0061] 以上のように、アルツハイマー病患者の CSFを用いてアミロイド j3蛋白の重合を進 めた場合と非アルツハイマー病患者の CSFを用いてアミロイド /3蛋白の重合を進め た場合とで最終的に異なる形態の線維が形成され、電子顕微鏡で程度を調べた結 果をアルツハイマー病の検査に利用可能であるとわ力、つた。

Claims

請求の範囲
[1] アミロイド 蛋白と被験者から採取した体液と緩衝液とを混合して反応溶液を調製 し、前記反応溶液中で前記アミロイド β蛋白を重合反応させ、前記重合反応が平衡 状態に到達した後、前記アミロイド /3蛋白の重合の程度を調べることを特徴とするァ ルツハイマー病の検查方法。
[2] 平衡状態に到達した後の前記反応溶液と蛍光色素とを混合し、当該反応溶液の発 色の程度を検出することにより、前記アミロイド 蛋白の重合の程度を調べることを特 徴とする請求項 1記載のアルツハイマー病の検査方法。
[3] 前記蛍光色素がチオフラビン T又はその誘導体であることを特徴とする請求項 2記 載のアルツハイマー病の検査方法。
[4] 前記体液が脳脊髄液、血液又は血液成分であることを特徴とする請求項 1〜3のい ずれか 1項記載のアルツハイマー病の検査方法。
[5] 前記反応溶液中の前記アミロイド 蛋白濃度が 5 μ Μ〜： 100 μ Μであることを特徴 とする請求項 1〜4のいずれ力 1項記載のアルツハイマー病の検査方法。
[6] 前記体液と前記緩衝液とを混合した検査溶液に前記アミロイド i3蛋白を含むアミ口 イド /3蛋白溶液を混合して前記反応溶液を調製することを特徴とする請求項:!〜 5の いずれか 1項記載のアルツハイマー病の検查方法。
[7] 前記検査溶液が前記緩衝液を 5〜50体積％含むことを特徴とする請求項 6記載の アルツハイマー病の検查方法。
[8] 前記アミロイド β蛋白溶夜がアンモニア水溶夜にアミロイド j3蛋白を溶角军したもので あることを特徴とする請求項 6又は 7記載のアルツハイマー病の検查方法。
[9] 前記重合反応の際、前記反応溶液を 35°C〜40°Cに加温することを特徴とする請 求項 1〜8のいずれ力 4項記載のアルツハイマー病の検查方法。
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