JP3997576B2 - モノクローナル抗体、ハイブリッド細胞およびモノクローナル抗体の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、モノクローナル抗体及びその製造方法、特にアクロレイン（略号：ＡＣＲ）と蛋白質との反応物に対する高い特異性を有するモノクローナル抗体とその製造方法に関する。さらに詳しくは、ホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体とその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の脂質成分としては、トリグリセリド、リン脂質、コレステロールエステルあるいは遊離脂肪酸などが知られている。これらの化合物が高度不飽和脂肪酸残基を有する場合、生体に作用する様々な酸化ストレスによって、この高度不飽和脂肪酸残基が過酸化を受け、更に、過酸化分解して、脂質の過酸化分解物が生成され、様々な病態に関与していることが明らかにされつつある。
【０００３】
前記、高度不飽和脂肪酸残基を有する化合物としては、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが代表的なものである。その過酸化分解物としては、マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシノネナールおよび４−ヒドロキシヘキセナールなどのアルデヒドが知られている。これらのアルデヒドは生体内の蛋白質、ペプチドあるいはアミノ酸等と反応して付加体を形成し、様々な疾病との関与が盛んに研究されている。特に、マロンジアルデヒドあるいは４−ヒドロキシノネナールと蛋白質との付加体が動脈硬化層に多く存在することが確認されており、動脈硬化症との因果関係が非常に注目されている。
【０００４】
生体内で高度不飽和脂肪酸残基から生成するマロンジアルデヒド、４−ヒドロキシノネナールあるいは４−ヒドロキシヘキセナールなどに対して、ＡＣＲは、食用油の加熱、あるいは、ガソリンあるいはプラスチックの燃焼によって生成することが一般的に知られており、食用油あるいは食品の包装材料等に用いられているプラスチックの分解により生成して、経口などの経路で生体内に移行し、生体に対して様々な毒性を示す事が危惧されている。
また最近の研究（内田浩二ら、日本農芸化学会、１９９７年度大会講演要旨集、第８３７号、第７１巻５３頁）では、アクロレインの生体内での生成を示す報告がなされており、様々な病態との因果関係が盛んに研究されている。
このようなＡＣＲが有する生体毒性としては発癌性などが考えられており、これはＡＣＲの有する高反応性アルデヒドとしての性質によるものである〔H.Esterbauer,H.Zollner and Z.N.Scholz,Naturforsch.30,466(1975)、J.C.Gan and G.A.S.Ansari,Res.Commun.Chem.Pathol．Pharmacol.419，55,(1987)〕。具体的には、ＡＣＲは、生体内の蛋白質、ペプチドあるいはアミノ酸等が含有するアミンあるいはチオールなどの求核基と非常に反応性が高いことがその原因と考えられている。ＡＣＲとアミノ酸のアミノ基との反応は、次式（１）に示す反応機構が知られており、アミノ基１個に対してＡＣＲ２個が付加反応しホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物が生成する。
【０００５】
【化１】
【０００６】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2は蛋白質残基、ペプチド残基、もしくはＲ1＝Ｒ2＝Ｈを示す。〕
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
この様に、生体の疾病との相関が注目されているＡＣＲに関連して、蛋白質、ペプチドあるいはアミノ酸との付加体（略号：ＡＣＲ付加体）の定性あるいは定量を、免疫学あるいは生化学的に行うことが非常に重要である。臨床診断学的あるいは臨床医学的な見地からこれらを可能にする技術が強く求められているものの、具体的手段あるいは技術は未だ確立されていない。
【０００８】
そこで本発明は、ＡＣＲと蛋白質あるいはペプチドの構成アミノ酸の１つであるリジン（略号：Ｌｙｓ）の付加体に関して着目し、このＡＣＲ付加体が有するホルミルデヒドロピペリジン構造に対して認識特異性の高いモノクローナル抗体と、その製造方法の開発に取り組んだ。
【０００９】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点に鑑み鋭意検討した結果、アクロレイン（略号：ＡＣＲ）で修飾したカギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）を抗原として調製し、該抗原で免疫したマウスから得られる抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とのハイブリッド細胞が、ホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、ホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識することを特徴とする。
【００１１】
本発明のハイブリッド細胞は、次式（２）で示されるホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生することを特徴とする。
【００１２】
【化２】
【００１３】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2は蛋白質残基、ペプチド残基、もしくはＲ1＝Ｒ2＝Ｈを示す。〕
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、（１）ＡＣＲで修飾した蛋白質を抗原として調製し、（２）該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、（３）該ハイブリッド細胞を培養して培養液中からホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とする。
【００１５】
本発明の前記モノクローナル抗体およびその製造方法において、ＡＣＲで修飾されるべき蛋白質がカギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）であることが好ましい。
【００１６】
【本発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、ＡＣＲで修飾した蛋白質を調製し、これを抗原として免疫された恒温動物から得られる抗体産生細胞と、得られた抗体産生細胞を継代培養可能なミエローマ細胞とのハイブリッド細胞を調製し、このハイブリッド細胞の中から目的のモノクローナル抗体のみを産生するハイブリッド細胞をスクリーニングし、このハイブリッド細胞が抗体を産生する環境下で大量培養し、培養物から取得することにより、製造される。
【００１７】
本発明に用いることができる抗原は、蛋白質とＡＣＲの反応物であれば良く、蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン（略号：ＢＳＡ）、卵白アルブミン、リポプロテイン、カギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）などが挙げられ、好ましくはカギアナカサガイのヘモシアニンが用いられる。
【００１８】
抗原を調製するための蛋白質とＡＣＲの反応は、緩衝液中で混合攪拌して実施することができる。用いる緩衝液としては、トリス、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩緩衝液が挙げられる。その緩衝液としては、例えば、濃度が１ｍＭ〜０．２Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭのリン酸緩衝液が挙げられる。この反応の終点は、蛋白質中のアミノ酸の減少率で検出することが可能である。アミノ酸の減少率は、例えば、反応前後の試料のアミノ酸含有量を自動アミノ酸分析装置（ＪＥＯＬＪＬＣ−３００、日本分光(株)製）によって測定することによって求める。アミノ酸減少率による反応終点は、例えば、リジン減少率が２５％以上となる時点が挙げられ、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７５％以上減少する時点である。このようなリジン減少率となる反応条件は、例えば、２５〜４５℃で１〜７２時間が挙げられ、好ましくは３０〜４０℃で２〜６時間である。
【００１９】
本発明で免疫される動物は恒温動物が使用できる。該免疫動物としては、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモットであれば特に制限されないが、抗体産生細胞を融合するミエローマ細胞がマウス由来のものであるため、好ましくはマウスが使用される。
【００２０】
免疫する方法は、通常の公知の免疫方法を用いて、例えば、７ないし３０日、特に１２ないし１６日間隔で２または３回の投与が好ましい。抗原投与量は免疫される動物により異なるが、１回につき、例えば、約０．０５〜２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等を選択することができるが、好ましくは腹膜腔、皮下もしくは筋肉内に注射して行う投与形態である。さらに好ましくは、前記投与経路を２ないし３組み合わせた投与経路、例えば、腹膜腔内注射、皮下注射および筋肉内注射全ての投与経路を組み合わせる投与形態である。
【００２１】
なお、この場合、抗原は適当な緩衝液、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するナトリウムリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、上記のようなアジュバントを使用しなくとも良い。ここで、アジュバントとは抗原と共に投与した時、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
【００２２】
上記の抗原を免疫した恒温動物を７〜３０日間処置せずに飼育した後、該恒温動物の血清を少量採取し、抗体価をウエスタンブロット法、凝集法、酵素免疫測定法、一元放射状免疫拡散法等から選ばれた測定法により抗体価を測定することができる。より簡便には酵素免疫測定法により測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば、０．０１〜１ｍｇ、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｇの抗原の投与量で１もしくは２回の追加投与が行われる。最後の投与の１ないし３０日後、特に好ましくは１〜７日後に免疫した恒温動物から抗体を産生するリンパ球を含む組織を摘出する。摘出する組織は、抗体を産生するリンパ球を含む抹消リンパ系組織であればいずれでも良いが、好ましくは脾臓である。
【００２３】
得られた組織は、例えば、「単クローン抗体実験操作法入門」（講談社サイエンティフィック 安藤民衛ら １９９１年）等に記載されている方法により、継代培養可能な細胞とするために、例えば、仙台ウイルスやポリエチレングリコール存在下、ある種のガン細胞と細胞融合させて、ハイブリッド細胞を得ることができる。ここで用いられるガン細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物のガン細胞を用いることが好ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。
【００２４】
実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の技術（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ ３９：２８５〜３０８，１９８０）を用いることができる。例えば、免疫されたマウスから得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存在下で融合させ、ハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成した後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産生するハイブリッド細胞を得ることができる。
【００２５】
スクリーニングする方法としては、例えば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定法等が挙げられる。また、目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は、限界希釈法を繰り返すことにより最終的に単一のハイブリッド細胞を得ることができる。さらには、これら目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は抗体を産生する環境下で大量培養することにより抗体を製造することができる。さらに、これらの目的とする抗体を産生するハイブリッド細胞が産生した抗体は、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いる蛋白質分画、水性二層分配法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の蛋白質に関する一般的な生化学的分離方法を、単独もしくはいくつかの方法を組み合わせて使用することにより精製することができる。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体はヒトのＡＣＲ修飾蛋白質の検出だけでなく、 ヒト以外の異種の恒温動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリなどの生体中に存在するＡＣＲ修飾蛋白質の検出にも応用することができる。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【００２８】
〔実施例１〕
１．抗原の調製
カギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）（２ｍｇ／ｍｌ）とＡＣＲ（１０ｍＭ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２） １ｍｌ中で３７℃、２４時間反応させた。自動アミノ酸分析装置（ＪＥＯＬ ＪＬＣ−３００、日本分光（株）製）でＡＣＲ修飾ＫＬＨ中の減少したアミノ酸を調べたところ、リジン（略号：Ｌｙｓ）が８０％減少していた。
【００２９】
２．免疫方法
ＡＣＲ修飾ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）は等量のフロイントの完全アジュバントとよく混合してエマルジョンとし、これをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）の腹膜腔内に１００μｌ免疫した。初回免疫から１０〜１４日後、抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく混合してエマルジョンとして、追加免疫を行った。追加免疫から３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（略号：ＰＢＳ）を混合して最終免疫を行った。なお、抗体価は、追加免疫の１週間後、マウス眼孔静脈から血液を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫化学的方法で抗原に対する抗体が産生されていることを確認した。酵素免疫化学的方法では、免疫したマウスから得られた血清と比較対照となる免疫前のマウスから得られた血清の間に比較的大きな抗体価の差異が見られ、抗体価の上昇が確認された。
【００３０】
３．抗体価の確認方法
抗体価はＡＣＲと牛血清アルブミンを固相とした酵素免疫測定法により確認した。すなわち、抗原の調製に記載した方法と同様に牛血清アルブミン（略号：ＢＳＡ）とＡＣＲを反応させて、ＡＣＲ修飾ＢＳＡ（略号：ＡＣＲ−ＢＳＡ）を得た。これを９６穴イムノプレートに物理吸着させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（略号：ＴＴＢＳ）で３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、ブロッキング液と略す。）でブロッキングを行った。このプレートのウエルにマウスから得られた血清（１００μｌ／ウエル）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されているマウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴＢＳで５０００倍希釈した液（１００μｌ／ウエル）（以下、酵素標識抗体溶液と略す。）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルをＴＴＢＳで３回洗浄した後、ο−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）および過酸化水素（０．００３％）を含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μｌ／ウエル）（以下、発色液と略す。）を入れて室温で１５〜２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５０μｌ／ウエル）（以下、反応停止液と略す。）を入れることで停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。
【００３１】
４．融合細胞の調製
免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＲＰＭＩ−１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３：ＣＲＬ・１５８０）を細胞数が７：１の割合になるように混和し、培地に対して５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール１５４０溶液を徐々に加えて５分間混和した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、５分間遠心分離して上清を廃棄した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えた後、５分間遠心分離を行い上清を廃棄した。この操作を２回繰り返して細胞を洗浄し、融合細胞を調製した。
【００３２】
５．クローニング
前述の得られた融合細胞に３０ｍｌのＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁し、９６穴イムノプレートの各ウエルに１００μｌすつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的にハイブリッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）でウエル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作を２〜３回繰り返した。この培養上清を用いて２つの抗体活性に関するスクリーニングを行い、２つのスクリーニングで抗体活性が認めれれたウエル中の融合細胞を好ましいものとして選別した。抗体活性の確認されたウエルの細胞は限界希釈を行い培養し、最終的にはスクリーニングと限界希釈を繰り返すことによりＡＣＲ修飾蛋白質に対して高い抗体活性を有し、且つ単一の細胞からなるクローン７株を得た。得られた７株のクローンの内、抗体活性の強かった５Ｆ６株のモノクローナル抗体について、マウスＩｇＧサブクラスの検討を行った。培養上清を試料としてマウスＩｇＧサブクラス検定キット（商品名：Mouse monoclonal antibody isotyping kit RPN29、アマシャム社製）で抗体のサブクラスの検討を行ったところ、ＩｇＧ１、κ（カッパー）鎖であった。この培養上清の一部を用いて抗体の精製について検討したところ、硫酸アンモニウムによる塩析、あるいはプロテインＡをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを常法通り行うことにより本発明のモノクローナル抗体を精製することができた。
【００３３】
６．抗体活性に関するスクリーニング方法−１
前記で得られた培養上清を試料として用い、酵素免疫化学的方法による抗体価の確認方法と同様に、ＡＣＲ修飾ＢＳＡに対する抗体活性を評価した。
【００３４】
７．抗体活性に関するスクリーニング方法−２
１ｍｇ／ｍｌのＬＤＬ溶液０．５ｍｌと５０μＭの銅イオン（Ｃｕ2+）溶液０．１ｍｌを混合し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１ｍｌとした後、３７℃で７２時間インキュベ−トして酸化ＬＤＬを調製した。得られた酸化ＬＤＬを５０μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、９６穴イムノプレートに各ウエル当たり１００μｌを加えて物理吸着させた。この後の洗浄あるいはブロッキング工程は、酵素免疫化学的方法による抗体価の確認方法と同様に行い最終的に酸化ＬＤＬに対する抗体活性を４９２ｎｍにおける吸光度として測定した。
【００３５】
〔実施例２〕
前記実施例１で得た７株クローンから得られたＡＣＲ修飾蛋白質を認識するモノクローナル抗体の内、５Ｆ６株のモノクローナル抗体の反応特異性について確認を行った。該５Ｆ６株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年１１月１１日に寄託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５１４）として寄託されている。なお、検討に用いるモノクローナル抗体は、培養上清を希釈してそのまま用いた。
【００３６】
１． モノクローナル抗体の反応特異性の評価法−１
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートにウエル当たり１００μｌの蛋白質あるいはアルデヒド修飾蛋白質（４μｇ／ｍｌ）を加え、４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウエル当たり３００μｌのＴＴＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＴＴＢＳもしくは蒸留水で４倍希釈したブロックエース（雪印社製）をウエル当たり３００μｌ加えてブロッキングした。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌのＴＴＢＳで希釈した本モノクローナル抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で３時間インキュベートした。なお、コントロールとしてはＴＴＢＳのみを加えた。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌの酵素標識抗体溶液を加えて３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌの発色液を加えて室温で１５〜２０分間インキュベートした。ウエル当たり５０μｌの反応停止液を加えた後、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。
【００３７】
２． モノクローナル抗体の反応特異性評価法−２
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートにＡＣＲ修飾ＢＳＡを加えてプレートに物理吸着させたプレートのウエルに、本発明によるモノクローナル抗体（１μg／ｍｌ）に各種濃度のＡＣＲ誘導体を加えたものを試料とする以外は前項に記載の方法と同様にして吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。
【００３８】
３． モノクローナル抗体の反応特異性−１
前記実施例１のモノクローナル抗体に関して各種蛋白質に対する反応特異性を評価した。すなわち、ＡＣＲ、クロトンアルデヒド、２−ヘキサナール、２−オクテナール、２−ノネナール、ｎ−プロパナール、ｎ−ペンタナール、ｎ−ヘキサナール、４−ヒドロキシ−２−ペンテナール、４−ヒドロキシ−２−ヘキセナール、４−ヒドロキシ−２−オクテナール、４−ヒドロシキ−２−ノネナール、マロンジアルデヒド、ＤＬ−グリセルアルデヒド、ヒドロキシアセトン、ジヒドロキシアセトン、グリオキサールなどのアルデヒドで修飾したＢＳＡを常法により調製し、前記のモノクローナル抗体の反応特異性評価法−１により測定した。その結果を縦軸は各種アルデヒド修飾ＢＳＡ、横軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示したグラフとして図１に示した。図１に示すようにＡＣＲで修飾したＢＳＡは認識されるものの、他のアルデヒドで修飾されたＢＳＡは全く認識されなかった。
【００３９】
４． モノクローナル抗体の反応特異性−２
前記実施例１のモノクローナル抗体に関して種々のＡＣＲ誘導体に対する反応特異性を評価した。すなわち、Ｎ−α−アセチルリジン、Ｎ−α−アセチル−ε−ホルミルデヒドロピペリジノリジン、Ｎ−α−アセチルヒスチジン、Ｎ−α−アセチル−プロパナールヒスチジンを常法に従って調製し、競合物質として前記のモノクローナル抗体の反応特異性評価法−２により測定した。その結果を縦軸は競合物質の阻害率（Ｂ／Ｂ０：なお、ＢとＢ０はそれぞれ競合物質の存在下、非存在下における吸光度を示す。）、横軸は競合物質の濃度を示したグラフとして図２に示した。図２から明らかなように、ＡＣＲ誘導体中、ホルミルデヒドロピペリジン構造を有するＮ−α−アセチル−ε−ホルミルデヒドロピペリジノリジンのみが、本発明によるモノクローナル抗体と固相化されたＡＣＲ修飾ＢＳＡとの反応を阻害した。
【００４０】
〔実施例３〕
前記実施例１で得た７株クローンから得られたＡＣＲ修飾蛋白質を認識するモノクローナル抗体の内、５Ｆ６株のモノクローナル抗体を免疫組織染色に応用した。なお、検討に用いるモノクローナル抗体は、培養上清を硫酸アンモニウムによる塩析で精製したものを用いた。染色に使用する組織としては、ヒト動脈硬化病巣を用い、一般的に免疫組織染色に用いられる方法、例えば、「染色法のすべて」（医歯薬出版株式会社 １５５−１６５ １９８８年）に記載の方法に従って免疫組織染色を行った。すなわち、常法によりキシレン、５０％エタノール、７０％エタノールで連続処理し、パラフィン包埋した組織から、３．５μｍの組織切片を得た後、抗原の賦活性を行うためにプロテアーゼで処理した。その後、内因性ペルオキシダーゼを阻止するためにペルオキシダーゼブロッキング試薬Ｓ２００１（ＤＡＫＯ社製）で処理した。続いて、非特異的な反応を防止するために、リン酸緩衝生理食塩水で希釈したウサギ正常血清でブロッキングを行った。この切片に、本発明によるモノクローナル抗体を０．５〜２．０μｇ／ｍｌの濃度で含むリン酸緩衝生理食塩水を室温で１時間反応させ、洗浄を行い、続いて、ペルオキシダーゼを標識酵素とするＡＢＣ法（アビジン−ビオチン複合体法）により、組織切片中に存在する本発明によるモノクローナル抗体と反応する部位を観察した。なお、ペルオキシダーゼの検出にはジアミノベンチジン発色キット２Ｖ−０００１−１０（フナコシ社製）を用いた。本発明のモノクローナル抗体を生体組織、動脈硬化病巣に対して免疫組織染色した顕微鏡写真（オリンパス ＶＡＮＯＸ ＡＨＢＳ３；２００倍）を図３として示した。図３により明らかなようにヒト動脈硬化病巣に本発明のモノクローナル抗体で染色される部位が存在し、特に、泡沫細胞の細胞内顆粒に顕著な陽性染色が認められた。
【００４１】
〔参考例１〕
１．本モノクローナル抗体の有用性−１
１ｍｇ／ｍｌのＬＤＬ溶液０．５ｍｌと５０μＭの銅イオン（Ｃｕ2+）溶液０．１ｍｌを混合し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１ｍｌとした後、３７℃で７２時間インキュベ−トし、酸化ＬＤＬを調製した。この試料を用い、本発明のモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定を前記のモノクローナル抗体の反応特異性評価法−１により測定した。その結果を縦軸に吸光度、横軸にインキュベーション時間を採ったグラフとして図４に示した。（図４中＋Ｃｕ2+で表示）
〔比較参考例１〕
なお、比較参考例として銅イオン溶液を使用しない以外は参考例１と同様にしてモノクローナル抗体の反応特異性を測定した。同様に図４に示した。（図４中−Ｃｕ2+で表示）
【００４２】
図４によれば、銅イオン処理による酸化ＬＤＬ中には、ＡＣＲ付加体すなわちホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物が存在することが明らかであり、生体中でのＡＣＲ付加体分析への研究に有用である。一方銅イオンが存在しない系（−Ｃｕ2+）では、酸化ＬＤＬが生成せず、それ由来のＡＣＲ付加体すなわちホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物が存在しないためモノクローナル抗体が特異反応しないと推定される。
【００４３】
〔参考例２、３〕および〔比較参考例２〜４〕
２．本モノクローナル抗体の有用性−２
１０ｍＭのグルコース溶液１ｍｌ〔比較参考例２〕、１００ｍＭのグルコース溶液１ｍｌ〔比較参考例３〕、２０ｍＭのアスコルビン酸溶液１ｍｌ〔比較参考例４〕、２０ｍＭのアラキドン酸溶液１ｍｌ〔参考例２〕および４０ｍＭアラキドン酸溶液と２００ｍＭグルコース溶液の１：１混合液１ｍｌ〔参考例３〕の各溶液に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１〜４週間インキュベ−トした。この試料を用い、本発明のモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定を前記のモノクローナル抗体の反応特異性評価法−１により測定した。その結果を縦軸に吸光度、横軸にインキュベーション時間を採ったグラフとして図５に示した。
【００４４】
図５によれば、アラキドン酸系のみに、ＡＣＲ付加体すなわちホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物が存在することが明らかである。生体内での、不飽和脂肪酸であるアラキドン酸からのＡＣＲ付加体生成は未だ証明されていないが、これらの研究において本発明のモノクローナル抗体は有用であり、また、今後、ＡＣＲ付加体生成が証明されれば、本発明のモノクローナル抗体はその応用において有用となる。
【００４５】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明はホルミルデヒドロピペリジン構造を有するアクロレイン−リジン付加体を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することができる。本発明のモノクローナル抗体は、反応性の高いアルデヒドの１つであるアクロレインの生体に対する影響を明らかにするために非常に有用であり、臨床診断、臨床病理、分析等において利用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】種々のアルデヒドをＢＳＡに修飾させた修飾物に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図２】本発明のモノクローナル抗体の認識部位について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図３】本発明のモノクローナル抗体を生体組織、動脈硬化病巣に対して免疫組織染色した結果を示す顕微鏡写真である。
【図４】酸化ＬＤＬに対する本発明のモノクローナル抗体の親和性を示すグラフである。
【図５】酸化アラキドン酸に対する本発明のモノクローナル抗体の親和性を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、モノクローナル抗体及びその製造方法、特にアクロレイン（略号：ＡＣＲ）と蛋白質との反応物に対する高い特異性を有するモノクローナル抗体とその製造方法に関する。さらに詳しくは、ホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体とその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の脂質成分としては、トリグリセリド、リン脂質、コレステロールエステルあるいは遊離脂肪酸などが知られている。これらの化合物が高度不飽和脂肪酸残基を有する場合、生体に作用する様々な酸化ストレスによって、この高度不飽和脂肪酸残基が過酸化を受け、更に、過酸化分解して、脂質の過酸化分解物が生成され、様々な病態に関与していることが明らかにされつつある。
【０００３】
前記、高度不飽和脂肪酸残基を有する化合物としては、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが代表的なものである。その過酸化分解物としては、マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシノネナールおよび４−ヒドロキシヘキセナールなどのアルデヒドが知られている。これらのアルデヒドは生体内の蛋白質、ペプチドあるいはアミノ酸等と反応して付加体を形成し、様々な疾病との関与が盛んに研究されている。特に、マロンジアルデヒドあるいは４−ヒドロキシノネナールと蛋白質との付加体が動脈硬化層に多く存在することが確認されており、動脈硬化症との因果関係が非常に注目されている。
【０００４】
生体内で高度不飽和脂肪酸残基から生成するマロンジアルデヒド、４−ヒドロキシノネナールあるいは４−ヒドロキシヘキセナールなどに対して、ＡＣＲは、食用油の加熱、あるいは、ガソリンあるいはプラスチックの燃焼によって生成することが一般的に知られており、食用油あるいは食品の包装材料等に用いられているプラスチックの分解により生成して、経口などの経路で生体内に移行し、生体に対して様々な毒性を示す事が危惧されている。
また最近の研究（内田浩二ら、日本農芸化学会、１９９７年度大会講演要旨集、第８３７号、第７１巻５３頁）では、アクロレインの生体内での生成を示す報告がなされており、様々な病態との因果関係が盛んに研究されている。
このようなＡＣＲが有する生体毒性としては発癌性などが考えられており、これはＡＣＲの有する高反応性アルデヒドとしての性質によるものである〔H.Esterbauer,H.Zollner and Z.N.Scholz,Naturforsch.30,466(1975)、J.C.Gan and G.A.S.Ansari,Res.Commun.Chem.Pathol．Pharmacol.419，55,(1987)〕。具体的には、ＡＣＲは、生体内の蛋白質、ペプチドあるいはアミノ酸等が含有するアミンあるいはチオールなどの求核基と非常に反応性が高いことがその原因と考えられている。ＡＣＲとアミノ酸のアミノ基との反応は、次式（１）に示す反応機構が知られており、アミノ基１個に対してＡＣＲ２個が付加反応しホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物が生成する。
【０００５】
【化１】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2は蛋白質残基、ペプチド残基、もしくはＲ1＝Ｒ2＝Ｈを示す。〕
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
この様に、生体の疾病との相関が注目されているＡＣＲに関連して、蛋白質、ペプチドあるいはアミノ酸との付加体（略号：ＡＣＲ付加体）の定性あるいは定量を、免疫学あるいは生化学的に行うことが非常に重要である。臨床診断学的あるいは臨床医学的な見地からこれらを可能にする技術が強く求められているものの、具体的手段あるいは技術は未だ確立されていない。
【０００８】
そこで本発明は、ＡＣＲと蛋白質あるいはペプチドの構成アミノ酸の１つであるリジン（略号：Ｌｙｓ）の付加体に関して着目し、このＡＣＲ付加体が有するホルミルデヒドロピペリジン構造に対して認識特異性の高いモノクローナル抗体と、その製造方法の開発に取り組んだ。
【０００９】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点に鑑み鋭意検討した結果、アクロレイン（略号：ＡＣＲ）で修飾したカギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）を抗原として調製し、該抗原で免疫したマウスから得られる抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とのハイブリッド細胞が、ホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、ホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識することを特徴とする。
【００１１】
本発明のハイブリッド細胞は、次式（２）で示されるホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生することを特徴とする。
【００１２】
【化２】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2は蛋白質残基、ペプチド残基、もしくはＲ1＝Ｒ2＝Ｈを示す。〕
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、（１）ＡＣＲで修飾した蛋白質を抗原として調製し、（２）該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、（３）該ハイブリッド細胞を培養して培養液中からホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とする。
【００１５】
本発明の前記モノクローナル抗体およびその製造方法において、ＡＣＲで修飾されるべき蛋白質がカギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）であることが好ましい。
【００１６】
【本発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、ＡＣＲで修飾した蛋白質を調製し、これを抗原として免疫された恒温動物から得られる抗体産生細胞と、得られた抗体産生細胞を継代培養可能なミエローマ細胞とのハイブリッド細胞を調製し、このハイブリッド細胞の中から目的のモノクローナル抗体のみを産生するハイブリッド細胞をスクリーニングし、このハイブリッド細胞が抗体を産生する環境下で大量培養し、培養物から取得することにより、製造される。
【００１７】
本発明に用いることができる抗原は、蛋白質とＡＣＲの反応物であれば良く、蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン（略号：ＢＳＡ）、卵白アルブミン、リポプロテイン、カギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）などが挙げられ、好ましくはカギアナカサガイのヘモシアニンが用いられる。
【００１８】
抗原を調製するための蛋白質とＡＣＲの反応は、緩衝液中で混合攪拌して実施することができる。用いる緩衝液としては、トリス、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩緩衝液が挙げられる。その緩衝液としては、例えば、濃度が１ｍＭ〜０．２Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭのリン酸緩衝液が挙げられる。この反応の終点は、蛋白質中のアミノ酸の減少率で検出することが可能である。アミノ酸の減少率は、例えば、反応前後の試料のアミノ酸含有量を自動アミノ酸分析装置（ＪＥＯＬＪＬＣ−３００、日本分光(株)製）によって測定することによって求める。アミノ酸減少率による反応終点は、例えば、リジン減少率が２５％以上となる時点が挙げられ、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７５％以上減少する時点である。このようなリジン減少率となる反応条件は、例えば、２５〜４５℃で１〜７２時間が挙げられ、好ましくは３０〜４０℃で２〜６時間である。
【００１９】
本発明で免疫される動物は恒温動物が使用できる。該免疫動物としては、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモットであれば特に制限されないが、抗体産生細胞を融合するミエローマ細胞がマウス由来のものであるため、好ましくはマウスが使用される。
【００２０】
免疫する方法は、通常の公知の免疫方法を用いて、例えば、７ないし３０日、特に１２ないし１６日間隔で２または３回の投与が好ましい。抗原投与量は免疫される動物により異なるが、１回につき、例えば、約０．０５〜２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等を選択することができるが、好ましくは腹膜腔、皮下もしくは筋肉内に注射して行う投与形態である。さらに好ましくは、前記投与経路を２ないし３組み合わせた投与経路、例えば、腹膜腔内注射、皮下注射および筋肉内注射全ての投与経路を組み合わせる投与形態である。
【００２１】
なお、この場合、抗原は適当な緩衝液、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するナトリウムリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、上記のようなアジュバントを使用しなくとも良い。ここで、アジュバントとは抗原と共に投与した時、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
【００２２】
上記の抗原を免疫した恒温動物を７〜３０日間処置せずに飼育した後、該恒温動物の血清を少量採取し、抗体価をウエスタンブロット法、凝集法、酵素免疫測定法、一元放射状免疫拡散法等から選ばれた測定法により抗体価を測定することができる。より簡便には酵素免疫測定法により測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば、０．０１〜１ｍｇ、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｇの抗原の投与量で１もしくは２回の追加投与が行われる。最後の投与の１ないし３０日後、特に好ましくは１〜７日後に免疫した恒温動物から抗体を産生するリンパ球を含む組織を摘出する。摘出する組織は、抗体を産生するリンパ球を含む抹消リンパ系組織であればいずれでも良いが、好ましくは脾臓である。
【００２３】
得られた組織は、例えば、「単クローン抗体実験操作法入門」（講談社サイエンティフィック 安藤民衛ら １９９１年）等に記載されている方法により、継代培養可能な細胞とするために、例えば、仙台ウイルスやポリエチレングリコール存在下、ある種のガン細胞と細胞融合させて、ハイブリッド細胞を得ることができる。ここで用いられるガン細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物のガン細胞を用いることが好ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。
【００２４】
実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の技術（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ ３９：２８５〜３０８，１９８０）を用いることができる。例えば、免疫されたマウスから得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存在下で融合させ、ハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成した後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産生するハイブリッド細胞を得ることができる。
【００２５】
スクリーニングする方法としては、例えば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定法等が挙げられる。また、目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は、限界希釈法を繰り返すことにより最終的に単一のハイブリッド細胞を得ることができる。さらには、これら目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は抗体を産生する環境下で大量培養することにより抗体を製造することができる。さらに、これらの目的とする抗体を産生するハイブリッド細胞が産生した抗体は、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いる蛋白質分画、水性二層分配法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の蛋白質に関する一般的な生化学的分離方法を、単独もしくはいくつかの方法を組み合わせて使用することにより精製することができる。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体はヒトのＡＣＲ修飾蛋白質の検出だけでなく、 ヒト以外の異種の恒温動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリなどの生体中に存在するＡＣＲ修飾蛋白質の検出にも応用することができる。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【００２８】
〔実施例１〕
１．抗原の調製
カギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）（２ｍｇ／ｍｌ）とＡＣＲ（１０ｍＭ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２） １ｍｌ中で３７℃、２４時間反応させた。自動アミノ酸分析装置（ＪＥＯＬ ＪＬＣ−３００、日本分光（株）製）でＡＣＲ修飾ＫＬＨ中の減少したアミノ酸を調べたところ、リジン（略号：Ｌｙｓ）が８０％減少していた。
【００２９】
２．免疫方法
ＡＣＲ修飾ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）は等量のフロイントの完全アジュバントとよく混合してエマルジョンとし、これをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）の腹膜腔内に１００μｌ免疫した。初回免疫から１０〜１４日後、抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく混合してエマルジョンとして、追加免疫を行った。追加免疫から３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（略号：ＰＢＳ）を混合して最終免疫を行った。なお、抗体価は、追加免疫の１週間後、マウス眼孔静脈から血液を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫化学的方法で抗原に対する抗体が産生されていることを確認した。酵素免疫化学的方法では、免疫したマウスから得られた血清と比較対照となる免疫前のマウスから得られた血清の間に比較的大きな抗体価の差異が見られ、抗体価の上昇が確認された。
【００３０】
３．抗体価の確認方法
抗体価はＡＣＲと牛血清アルブミンを固相とした酵素免疫測定法により確認した。すなわち、抗原の調製に記載した方法と同様に牛血清アルブミン（略号：ＢＳＡ）とＡＣＲを反応させて、ＡＣＲ修飾ＢＳＡ（略号：ＡＣＲ−ＢＳＡ）を得た。これを９６穴イムノプレートに物理吸着させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（略号：ＴＴＢＳ）で３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、ブロッキング液と略す。）でブロッキングを行った。このプレートのウエルにマウスから得られた血清（１００μｌ／ウエル）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されているマウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴＢＳで５０００倍希釈した液（１００μｌ／ウエル）（以下、酵素標識抗体溶液と略す。）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルをＴＴＢＳで３回洗浄した後、ο−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）および過酸化水素（０．００３％）を含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μｌ／ウエル）（以下、発色液と略す。）を入れて室温で１５〜２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５０μｌ／ウエル）（以下、反応停止液と略す。）を入れることで停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。
【００３１】
４．融合細胞の調製
免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＲＰＭＩ−１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３：ＣＲＬ・１５８０）を細胞数が７：１の割合になるように混和し、培地に対して５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール１５４０溶液を徐々に加えて５分間混和した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、５分間遠心分離して上清を廃棄した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えた後、５分間遠心分離を行い上清を廃棄した。この操作を２回繰り返して細胞を洗浄し、融合細胞を調製した。
【００３２】
５．クローニング
前述の得られた融合細胞に３０ｍｌのＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁し、９６穴イムノプレートの各ウエルに１００μｌすつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的にハイブリッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）でウエル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作を２〜３回繰り返した。この培養上清を用いて２つの抗体活性に関するスクリーニングを行い、２つのスクリーニングで抗体活性が認めれれたウエル中の融合細胞を好ましいものとして選別した。抗体活性の確認されたウエルの細胞は限界希釈を行い培養し、最終的にはスクリーニングと限界希釈を繰り返すことによりＡＣＲ修飾蛋白質に対して高い抗体活性を有し、且つ単一の細胞からなるクローン７株を得た。得られた７株のクローンの内、抗体活性の強かった５Ｆ６株のモノクローナル抗体について、マウスＩｇＧサブクラスの検討を行った。培養上清を試料としてマウスＩｇＧサブクラス検定キット（商品名：Mouse monoclonal antibody isotyping kit RPN29、アマシャム社製）で抗体のサブクラスの検討を行ったところ、ＩｇＧ１、κ（カッパー）鎖であった。この培養上清の一部を用いて抗体の精製について検討したところ、硫酸アンモニウムによる塩析、あるいはプロテインＡをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを常法通り行うことにより本発明のモノクローナル抗体を精製することができた。
【００３３】
６．抗体活性に関するスクリーニング方法−１
前記で得られた培養上清を試料として用い、酵素免疫化学的方法による抗体価の確認方法と同様に、ＡＣＲ修飾ＢＳＡに対する抗体活性を評価した。
【００３４】
７．抗体活性に関するスクリーニング方法−２
１ｍｇ／ｍｌのＬＤＬ溶液０．５ｍｌと５０μＭの銅イオン（Ｃｕ2+）溶液０．１ｍｌを混合し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１ｍｌとした後、３７℃で７２時間インキュベ−トして酸化ＬＤＬを調製した。得られた酸化ＬＤＬを５０μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、９６穴イムノプレートに各ウエル当たり１００μｌを加えて物理吸着させた。この後の洗浄あるいはブロッキング工程は、酵素免疫化学的方法による抗体価の確認方法と同様に行い最終的に酸化ＬＤＬに対する抗体活性を４９２ｎｍにおける吸光度として測定した。
【００３５】
〔実施例２〕
前記実施例１で得た７株クローンから得られたＡＣＲ修飾蛋白質を認識するモノクローナル抗体の内、５Ｆ６株のモノクローナル抗体の反応特異性について確認を行った。該５Ｆ６株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年１１月１１日に寄託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５１４）として寄託されている。なお、検討に用いるモノクローナル抗体は、培養上清を希釈してそのまま用いた。
【００３６】
１． モノクローナル抗体の反応特異性の評価法−１
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートにウエル当たり１００μｌの蛋白質あるいはアルデヒド修飾蛋白質（４μｇ／ｍｌ）を加え、４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウエル当たり３００μｌのＴＴＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＴＴＢＳもしくは蒸留水で４倍希釈したブロックエース（雪印社製）をウエル当たり３００μｌ加えてブロッキングした。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌのＴＴＢＳで希釈した本モノクローナル抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で３時間インキュベートした。なお、コントロールとしてはＴＴＢＳのみを加えた。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌの酵素標識抗体溶液を加えて３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌの発色液を加えて室温で１５〜２０分間インキュベートした。ウエル当たり５０μｌの反応停止液を加えた後、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。
【００３７】
２． モノクローナル抗体の反応特異性評価法−２
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートにＡＣＲ修飾ＢＳＡを加えてプレートに物理吸着させたプレートのウエルに、本発明によるモノクローナル抗体（１μg／ｍｌ）に各種濃度のＡＣＲ誘導体を加えたものを試料とする以外は前項に記載の方法と同様にして吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。
【００３８】
３． モノクローナル抗体の反応特異性−１
前記実施例１のモノクローナル抗体に関して各種蛋白質に対する反応特異性を評価した。すなわち、ＡＣＲ、クロトンアルデヒド、２−ヘキサナール、２−オクテナール、２−ノネナール、ｎ−プロパナール、ｎ−ペンタナール、ｎ−ヘキサナール、４−ヒドロキシ−２−ペンテナール、４−ヒドロキシ−２−ヘキセナール、４−ヒドロキシ−２−オクテナール、４−ヒドロシキ−２−ノネナール、マロンジアルデヒド、ＤＬ−グリセルアルデヒド、ヒドロキシアセトン、ジヒドロキシアセトン、グリオキサールなどのアルデヒドで修飾したＢＳＡを常法により調製し、前記のモノクローナル抗体の反応特異性評価法−１により測定した。その結果を縦軸は各種アルデヒド修飾ＢＳＡ、横軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示したグラフとして図１に示した。図１に示すようにＡＣＲで修飾したＢＳＡは認識されるものの、他のアルデヒドで修飾されたＢＳＡは全く認識されなかった。
【００３９】
４． モノクローナル抗体の反応特異性−２
前記実施例１のモノクローナル抗体に関して種々のＡＣＲ誘導体に対する反応特異性を評価した。すなわち、Ｎ−α−アセチルリジン、Ｎ−α−アセチル−ε−ホルミルデヒドロピペリジノリジン、Ｎ−α−アセチルヒスチジン、Ｎ−α−アセチル−プロパナールヒスチジンを常法に従って調製し、競合物質として前記のモノクローナル抗体の反応特異性評価法−２により測定した。その結果を縦軸は競合物質の阻害率（Ｂ／Ｂ０：なお、ＢとＢ０はそれぞれ競合物質の存在下、非存在下における吸光度を示す。）、横軸は競合物質の濃度を示したグラフとして図２に示した。図２から明らかなように、ＡＣＲ誘導体中、ホルミルデヒドロピペリジン構造を有するＮ−α−アセチル−ε−ホルミルデヒドロピペリジノリジンのみが、本発明によるモノクローナル抗体と固相化されたＡＣＲ修飾ＢＳＡとの反応を阻害した。
【００４０】
〔実施例３〕
前記実施例１で得た７株クローンから得られたＡＣＲ修飾蛋白質を認識するモノクローナル抗体の内、５Ｆ６株のモノクローナル抗体を免疫組織染色に応用した。なお、検討に用いるモノクローナル抗体は、培養上清を硫酸アンモニウムによる塩析で精製したものを用いた。染色に使用する組織としては、ヒト動脈硬化病巣を用い、一般的に免疫組織染色に用いられる方法、例えば、「染色法のすべて」（医歯薬出版株式会社 １５５−１６５ １９８８年）に記載の方法に従って免疫組織染色を行った。すなわち、常法によりキシレン、５０％エタノール、７０％エタノールで連続処理し、パラフィン包埋した組織から、３．５μｍの組織切片を得た後、抗原の賦活性を行うためにプロテアーゼで処理した。その後、内因性ペルオキシダーゼを阻止するためにペルオキシダーゼブロッキング試薬Ｓ２００１（ＤＡＫＯ社製）で処理した。続いて、非特異的な反応を防止するために、リン酸緩衝生理食塩水で希釈したウサギ正常血清でブロッキングを行った。この切片に、本発明によるモノクローナル抗体を０．５〜２．０μｇ／ｍｌの濃度で含むリン酸緩衝生理食塩水を室温で１時間反応させ、洗浄を行い、続いて、ペルオキシダーゼを標識酵素とするＡＢＣ法（アビジン−ビオチン複合体法）により、組織切片中に存在する本発明によるモノクローナル抗体と反応する部位を観察した。なお、ペルオキシダーゼの検出にはジアミノベンチジン発色キット２Ｖ−０００１−１０（フナコシ社製）を用いた。本発明のモノクローナル抗体を生体組織、動脈硬化病巣に対して免疫組織染色した顕微鏡写真（オリンパス ＶＡＮＯＸ ＡＨＢＳ３；２００倍）を図３として示した。図３により明らかなようにヒト動脈硬化病巣に本発明のモノクローナル抗体で染色される部位が存在し、特に、泡沫細胞の細胞内顆粒に顕著な陽性染色が認められた。
【００４１】
〔参考例１〕
１．本モノクローナル抗体の有用性−１
１ｍｇ／ｍｌのＬＤＬ溶液０．５ｍｌと５０μＭの銅イオン（Ｃｕ2+）溶液０．１ｍｌを混合し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１ｍｌとした後、３７℃で７２時間インキュベ−トし、酸化ＬＤＬを調製した。この試料を用い、本発明のモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定を前記のモノクローナル抗体の反応特異性評価法−１により測定した。その結果を縦軸に吸光度、横軸にインキュベーション時間を採ったグラフとして図４に示した。（図４中＋Ｃｕ2+で表示）
〔比較参考例１〕
なお、比較参考例として銅イオン溶液を使用しない以外は参考例１と同様にしてモノクローナル抗体の反応特異性を測定した。同様に図４に示した。（図４中−Ｃｕ2+で表示）
【００４２】
図４によれば、銅イオン処理による酸化ＬＤＬ中には、ＡＣＲ付加体すなわちホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物が存在することが明らかであり、生体中でのＡＣＲ付加体分析への研究に有用である。一方銅イオンが存在しない系（−Ｃｕ2+）では、酸化ＬＤＬが生成せず、それ由来のＡＣＲ付加体すなわちホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物が存在しないためモノクローナル抗体が特異反応しないと推定される。
【００４３】
〔参考例２、３〕および〔比較参考例２〜４〕
２．本モノクローナル抗体の有用性−２
１０ｍＭのグルコース溶液１ｍｌ〔比較参考例２〕、１００ｍＭのグルコース溶液１ｍｌ〔比較参考例３〕、２０ｍＭのアスコルビン酸溶液１ｍｌ〔比較参考例４〕、２０ｍＭのアラキドン酸溶液１ｍｌ〔参考例２〕および４０ｍＭアラキドン酸溶液と２００ｍＭグルコース溶液の１：１混合液１ｍｌ〔参考例３〕の各溶液に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１〜４週間インキュベ−トした。この試料を用い、本発明のモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定を前記のモノクローナル抗体の反応特異性評価法−１により測定した。その結果を縦軸に吸光度、横軸にインキュベーション時間を採ったグラフとして図５に示した。
【００４４】
図５によれば、アラキドン酸系のみに、ＡＣＲ付加体すなわちホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物が存在することが明らかである。生体内での、不飽和脂肪酸であるアラキドン酸からのＡＣＲ付加体生成は未だ証明されていないが、これらの研究において本発明のモノクローナル抗体は有用であり、また、今後、ＡＣＲ付加体生成が証明されれば、本発明のモノクローナル抗体はその応用において有用となる。
【００４５】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明はホルミルデヒドロピペリジン構造を有するアクロレイン−リジン付加体を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することができる。本発明のモノクローナル抗体は、反応性の高いアルデヒドの１つであるアクロレインの生体に対する影響を明らかにするために非常に有用であり、臨床診断、臨床病理、分析等において利用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】種々のアルデヒドをＢＳＡに修飾させた修飾物に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図２】本発明のモノクローナル抗体の認識部位について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図３】本発明のモノクローナル抗体を生体組織、動脈硬化病巣に対して免疫組織染色した結果を示す顕微鏡写真である。
【図４】酸化ＬＤＬに対する本発明のモノクローナル抗体の親和性を示すグラフである。
【図５】酸化アラキドン酸に対する本発明のモノクローナル抗体の親和性を示すグラフである。
Claims (6)
- ホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体は、アクロレインで修飾した蛋白質を抗原とし、該抗原で免疫された恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたものである請求項１項記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗原は、アクロレインで修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンである請求項２記載のモノクローナル抗体。
- 請求項１、２又は３記載のモノクローナル抗体を産生することができるハイブリッド細胞。
- （１）アクロレインで修飾した蛋白質を抗原として調製し、（２）該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、（３）該ハイブリッド細胞を培養して培養液中からホルミルデヒドロピペリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
- 前記抗原は、アクロレインで修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンであることを特徴とする請求項５記載のモノクローナル抗体の製造方法。
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